b*tk*lere gen transfer*nde kullanılan vektörler

BİTKİLERE GEN TRANSFERİNDE
KULLANILAN DOĞRUDAN
YÖNTEMLER
İÇERİK
•
Mikroenjeksiyon
•
Makroenjeksiyon
•
Kimyasal Yöntemlerle Gen Transferi
•
Lipozomlarla Gen Transferi
•
Elektroforez
•
Mikrolazer
•
Polen Tüpü Yolu İle Gen Transferi
•
Zigotik Embriyoya DNA Emdirilmesi
•
Silikon Karbid Fiberler Aracılı DNA Transferi
•
Sonikasyon
•
Desikasyon
Feyza Tufan, İstanbul Üniversitesi
2
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
•
En kesin biçimde hücrenin istenilen bölmesine DNA’nın enjeksiyonu
•
Mikroenjeksiyon, mikroskop altında, kapiller mikropipet aracılığıyla nükleus
veya sitoplazma içerisine DNA’nın aktarımı
•
Hedef; protoplastlar, izole edilmiş hücreler, kallus, meristemler, zigotik
mikrospor türevli proembriyolar gibi çok hücreli dokular
ve
3
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
Aktarım sırasında hücreler sabitlenmelidir:
•
Vakum yoluyla hücreleri tutan tutucu pipetin kullanımı
•
Hücrelerin poli-L-lisin kaplı cama bağlanması
•
Hücreleri agaroz, agar veya sodyum alginat içine koymak
•
Bu çözümlerin hiçbirinin kullanışlılığı kanıtlanmamıştır (Poli-L-lisin bazı
türler için toksik olabilir. Toksisiteden sakınmak için agaroza konulabilir
ama agoroz çok ince bir tabaka olsa bile manüplasyon alanında
görünebilirliği azaltır).
4
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
Bu işlem, mikromanipulatör gerektirir:
•
DNA mikromanipülatör sistemine bağlı kapiller mikropipet aracılığıyla
doğrudan hücrenin çekirdeğine aktarılır (Mikropipet aracılığıyla genetik
materyali içeren sıvının çıkışı için hidrostatik basınç kullanılır).
•
Mikropipetin hareketi mikroskopla görsel olarak kontrol edilir.
MİKROMANİPÜLATÖR
SİSTEM ŞEMASI:
(1) Inverted mikroskop
(2) Su basınçlı mikromanipülatör kumandası
(3) Mikroenjektör
(4) Hareketli masa
(5) Uzaktan kontrollü, su basınçlı mikrosürücü
(6) Yardımcı hafif ağırlıklı manipülatör
(7) Mikroiğne tutucu
(8) Video kamera için yaklaştırıcı mercek
6
MİKROMANİPÜLATÖR
7
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
8
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
•
Bu yöntem ilk olarak 1980 yılında başarılı bir şekilde uygulandı. Capecchi,
kültüre edilmiş memeli hücrelerinin hem sitoplazma hem de nükleusu
içerisine DNA’yı mikroenjekte etti. DNA’nın doğrudan nukleus içine
mikroenjeksiyonu, sitoplazma içi enjeksiyondan daha yüksek seviyede gen
ekspresyonuyla sonuçlandı.
•
1980 yılında, Gordon ve ark, transgenik fare üretmek için plazmid DNA’sını
döllenmiş fare oositlerinin pronükleusu içerisine mikroenjekte etti.
9
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
•
Mikroenjeksiyon çoğunlukla hayvan hücrelerinin transformasyonunda
kullanılır. Bu yöntemi bitki hücrelerine uygulamak hayvan hücrelerine
uygulamaktan daha zordur:
10
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
•
Bitki hücreleri hücre duvarı içerir
(Kalın tabaka lignin ve selüloz
içermesi nedeniyle mikroiğnelerle
aktarımı zorlaştırır). Protoplastın
(enzimatik veya mekanik yollarla
hücre duvarı uzaklaştırılmış bitki
hücresi) mikroenjeksiyonu teorik
olarak bu kısıtlandırmayı ortadan
kaldırır.
11
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
•
Bununla
birlikte
vakuol
birçok
hidrolaz ve toksik bileşik içermesi
nedeniyle vakuolden sitoplazmaya
hidrolazlar ve diğer toksik bileşenlerin
ayrılması protoplastın hızlı ölümüne
neden olabililir. Mikroenjeksiyondan
önce protoplast yaşayabilirliği için
hiçbir önemi olmayan vakuolleri
uzaklaştırmak mümkün olmasına
karşın, onların kaybı bitkinin bölünme
ve rejenerasyon yeteneğini anlamlı
derecede azaltır.
12
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
• 1986 yılında Crossway ve ark. tarafından tütün
protoplastlarında sitoplazmik aktarıma karşı nükleus içine
aktarımın etkinliği incelendi. Nuklear mikroenjeksiyonda
entegrasyon sıklığı %14, sitoplazmik mikroenjeksiyonda %6
bulundu.
13
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
• Bitki hücrelerinin hücresel fonksiyonlarının ve plastid
fizyolojisinin çalışılması için güçlü bir araç olmuştur.
14
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
GFP kodlayan DNA’nın soğan hücresi içerisine
aktarımı. Enjeksiyondan 2 gün sonra yeşil boya
görülebilir. Yabancı DNA’nın soğan genomu
içerisine başarılı şekilde aktarımı
Patates kallus hücresi içerisine mikroenjeksiyon
15
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
Tütün yaprak kloroplastına GFP’nin mikroenjeksiyonu
16
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
OLUMLU YÖNLERİ
•
DNA’nın bitki hücresi içerisine doğrudan ve kesin
olanağı)
aktarımı (Görsel kontrol
•
DNA miktarı kontrol edilebilir
•
Genellikle, yüksek transformasyon etkinliği (%14-66) (Enjeksiyonun
gerçekleştirildiği tüm hücreler DNA içerir, bununla birlikte transforme olan
hücrelerin sayısı sınırlıdır.)
•
•
•
İşaret genleri yoluyla transformantların seçimindan kaçınılır
Çeşitli hücre ve dokularda kullanılabilir
17
MİKROENJEKSİYON YÖNTEMİ
OLUMSUZ YÖNLERİ
•
Kavramsal olarak, mikroinjeksiyon en basit gen aktarım yöntemi olmakla
birlikte uygulaması zordur.
•
Yöntem çok yavaş - Tek seferde tek bir hücreye aktarım
•
Zahmetli - Çalışan kişinin el becerisini ve deneyimini gerektirir.
•
Pahalı mikromanipulatör gerektirir
•
Tek bir hücreden bitkinin rejenerasyonu
https://www.youtube.com/watch?v=puPuFAaXyU0
18
MAKROENJEKSİYON
•
Aktarılmak istenen DNA’yı taşıyan plazmid solüsyonunun fideciklere
enjeksiyonu ile gen aktarımı
•
1987 yılında Pena ve ark. çavdarın (Secale cereale) olgunlaşmamış çiçek
meristeminin altındaki gövde bölgesine nptII işaret geni enjekte edilmiştir ve
enjeksiyon yapılmış bitkiden elde edilen tohumlar kanamisine direnç
bakımından seçilmişlerdir.
•
Bu yöntem, diğer tahıllarda başarılı olarak uygulanamamıştır.
19
KİMYASAL YÖNTEMLERLE
GEN TRANSFERİ
•
En geniş çapta kullanılan kimyasal Polietilen glikol (PEG)’dür.
•
PEG iyonik olmayan ve suda çözünebilen bir polimerdir.
•
PEG gibi kimyasal maddeler protoplastların plazma membranının
geçirgenliğini geri dönüşümlü olarak arttırabilir. Bu sayede, DNA’nın nukleus
içine girmesi ve genom içerisine entegre olması gerçekleşir.
(PEG ayrıca, lipozom alınımını teşvik eder ve elektroporasyonun
artırır.)
etkinliğini
20
KİMYASAL YÖNTEMLERLE
GEN TRANSFERİ
PEG aracılı transformasyon;
•
İzole edilen protoplastlar aktarılmak istenen DNA ile karıştırılır ve ardından
divalent katyon içeren bir tamponda çözünmüş olan %14-20 PEG eklenir ve
daha sonra bu karışım inkübe edilir (Protoplastlar divalent katyonların
yokluğunda kararsızdırlar). Protoplastlar yıkanır ve daha sonra kültürleme
için petri kaplarına aktarılır.
•
(Birçok çalışmada, PEG aracılı transformasyonda Ca+2 ve Mg+2 etkinlikleri
karşılaştırmış, Mg+2 daha üstün bulunmuştur.)
21
KİMYASAL YÖNTEMLERLE
GEN TRANSFERİ
•
Önemli parametreler:
•
Karışımdaki PEG konsantrasyonu
•
Kullanılan tuzların bileşimi ve konsantrasyonu
•
Solüsyonun pH’sı
•
Yabancı DNA’nın konsantrasyonu
•
Kullanılan DNA molekülünün formu ve boyutu
•
Bitki türü
•
Kültürleme koşulları
22
KİMYASAL YÖNTEMLERLE
GEN TRANSFERİ
OLUMLU YÖNLERİ:
•
•
•
•
Basit bir yöntem
Birçok örneğe eşzamanlı uygulama
Ucuz (Pahalı olmayan ekipman)
Geniş çapta bitki türlerine kolayca uygulanabilir
OLUMSUZ YÖNLERİ:
• Protoplastların kullanımını gerektirdiği için elverişsizdir
(Protoplastların yaşayabilirliği düşük)
• Düşük transformasyon etkinliği (%1-2)
• Rejenerasyon güçlüğü
23
LİPOZOMLARLA GEN
TRANSFERİ
•
Lipozomlar; yapay olarak üretilen çift
tabakalı fosfolipid kürecikleri
•
1960’lı yıllarda keşfedildi.
•
Fosfolipid molekülleri sulu ortamda
kendiliğinden lipozomları oluşturur.
24
LİPOZOMLARLA GEN
TRANSFERİ
•
Lipozomların farklı materyalleri kapsüle
etme
yetenekleri
ve
lipozom
teknolojisindeki gelişmeler, aktif ajanların
hücre içerisine alınımında lipozomların
kullanılmasında bir artışa yol açmıştır
(antikanser ilaçları,
aşı
adjuvanı,
antienfektif ajanlar; gen aktarımı)
(Lipozomların hücrelerle füzyonu PEG gibi
kimyasallarla teşvik edilir )
25
LİPOZOMLARLA GEN
TRANSFERİ
26
LİPOZOMLARLA GEN
TRANSFERİ
DNA taşıyan lipozomların bitki protoplastlarının
hücre zarı ile füzyonu sonucu bitkilere gen
aktarımı gerçekleşebilmektedir.
Lipozomların hücre zarı ile füzyonu ve endositoz
sayesinde DNA molekülünün hücre içine alınımı
gerçekleşir.
Lipozom aracılı transformasyon, transformasyon
karşımında katyonlar gibi pozitif yüklü ajanlar
veya katyonik lipozom preparatları kullanılarak
gerçekleştirilir.
27
LİPOZOMLARLA GEN
TRANSFERİ
OLUMLU YÖNLERİ:
• DNA’nın lipozomlar tarafından korunması nedeniyle büyük boyutlu
plazmidlerin (19 kb’den büyük) entegrasyonu etkin biçimde
gerçekleşir.
• DNA/RNA’nın nükleaz sindiriminden korunması (kapsüllenme
yoluyla)
• Düşük hücre toksisitesi
• Düşük maliyet
• Çeşitli bitki hücre tiplerine uygulanabilir.
OLUMSUZ YÖNLERİ:
• Zahmetli ve düşük etkinlikli
28
MİKROLAZER
• Lazer ışığının hücre zarı ve duvarında delik oluşumuna yol açaması
ile ortamdaki DNA’nın hücre içerisine aktarımının gerçekleşmesi
• Olumsuz yönü; DNA’nın hücre duvarına absorbsiyonu sonucu
DNA’nın hücre içerisine giremeyişi
• Diğer doğrudan yöntemlerin
alternatif bir yöntem
uygulanamayacağı
durumlarda
29
Agrobacterium
tumefaciens Aracılığı ile
Gen Aktarımı
En genel anlamıyla bitkilere gen aktarımı;
fonksiyonel olarak belirlenmiş doğal ya da
sentetik nukleik asit dizilerinin bitki hücrelerine
genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak
aktarılmasıdır. Genetik transformasyon olarak
adlandırılan bu süreç:
yabancı nukleik asit molekülünün hücreye girişi
(insersiyon )
genoma bağlanması (entegrasyon) ,
genin anlatımın yapması (ekspresyon; ifade)
yavru döllere aktarımı aşamalarından oluşur.
Agrobacterium ,toprakta
doğal olarak yaşayan ,
gram negatif , spor
oluşturmayan , hareketli ,
çubuk şekilli (Basil ) bir
bakteri olup , yaralanmış
dokulardan organizmaya
girerek tümör benzeri
dokular oluşturur.
Başta böğürtlen, ahududu,
tüm meyve ağaçları , pek
çok çalı formu ve
asmalarda , özellikle
hanımeli ve gülgiller gibi
odunsular , papatya ,yıldız
çiçekleri , krizantem gibi
otsular ve sebzeler olmak
üzere yaklaşık 10 000
dikotilde ve otlar ve
tahıllar gibi
monokotillerde taç tümör
(crown gall) oluşumuna
neden olur.
A.tumefaciens ‘in taç tümör
oluşurmasının nedeni sahip
olduğu Ti (Tumour İnducing=
tümör oluşumunu teşvik eden)
plazmid ‘in T-DNA bölgesini
bitki genomuna entegre
etmesidir.
Ti plazmid 4 bölgeden oluşmuştur.
Vir bölgesi  T-DNA aktarımı için gerekli
Ori bölgesi replikasyon orijin noktası
Opin bölgesi bakteri metabolizması için gerekli
olan proteinlerin ,octopin ve nopalinin
katabolizmasından sorumlu gen bölgesi.
T-DNA bölgesi  24 bp’lık sağ ve sol sonlanma
bölgeleriyle sınırlandırılmış , bitki büyüme
düzenleyici ve opin genlerini taşıyan , bitkilerde
tümör oluşumdan sorumlu bölge.
T-DNA AKTARIMINDA
GEREKLİ OLAN ÖĞELER
1) T-DNA bölgesi
2) Vir genleri
3) Kromozomal genler
T-DNA’nın bir bitki hücresine
aktarımı 4 aşamada gerçekleşir:
1.Agrobacterium’un bitki
hücrelerine tutunması ve koloni
oluşturması
2.Virulens genlerin uyarılması
3.T-DNA transferi
4.T-DNA’nın bitki genomuna
entegrasyonu
Tİ PLAZMİDİN BİTKİLERE GEN AKTARIMINDA
KULLANILMASI
www.youtube.com/watch?v=L7qnY_GqytM&t=9s
POLEN TÜPÜ YOLU İLE GEN
TRANSFERİ
•
Tozlaşmanın ardından DNA’nın kesilmiş
stigma yüzeyine uygulanması ile gen
transferinin
gerçekleşmesi
(DNA’nın
polen tüpünden geçerek ovule varması).
•
İlk olarak pirinç transformasyonunda
uygulandı (Oldukça yüksek sıklıkta
transgenik bitki elde edildi).
•
Sonraları, buğday, soya, Petunia hybrida
ve karpuz gibi diğer türler için de
kullanıldı.
37
ZİGOTİK EMBRİYOYA DNA
EMDİRİLMESİ
• İzole edilen embriyoların DNA solüsyonu ile muamelesi sonrasında
DNA transferinin gerçekleşmesi
• Embriyoları izole etmek için uygulanan işlemlerin belirli ölçülerde
hücrelere zarar vermesi ile DNA’nın hücrelere girişinin kolaylaşması
• Yeterli düzeyde geçici gen anlatımı elde edilememiştir.
38
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
• Silikon karbid sert seramik bir maddedir ve kırıldığı zaman kolayca
keskin kenarlar oluşmaktadır.
• Silikon karbid fiberler 10-80 µm uzunluğunda ve 0.6 µm
mikrofiberlerdir.
çapında
39
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
• Bitki materyali (süspansiyon kültüründeki hücreler, embriyolar ve
kalluslar gibi) DNA ve silikon karbit fiberler içeren tampon içerisine
aktarılır ve daha sonra kuvvetli bir biçimde karıştırılır.
• Silikon karbid fiberler ve süspansiyon hücreleri arasındaki
çarpışma sonucu fiberler hücre duvarına ve plazma membranına
delik açılmasına neden olur ve böylece DNA’nın hücre içerisine
girişi sağlanır ve bitki hücrelerinin kararlı transformasyonu
gerçekleşir.
40
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
•
Scanning elektron mikroskobu ile fiber muameli bitki hücrelerinde bu ince
fiberlerin hücre duvarını penetre etme yeteneğini açıkıça gösterilmektedir.
Embriyonik mısır kallusunun silikon karbid
fiberler aracılı transformasyonunun
41
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
•
1994 yılında Frame; silikon karbid fiberler aracılığıyla embriyonik mısır
süspansiyon kültürü hücrelerini bakteriyel bar ve gus genleri taşıyan
plazmid DNA’sıyla transforme etti.
•
Transforme edilmiş hücreler bialafos herbisidi içeren besiyerinde seçildi.
•
Analiz edilen tüm bialafos dirençli kallus hatlarında bar geninin girişi ve
pat enziminin etkinliği onaylandı.
•
Verimli transgenik mısır bitkileri rejenere edildi
•
Herhangi bir türdeki transgenik bitki üretiminin ilk raporudur.
42
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
Fiberler aracılı mısır transformasyonu:
(a) Işık mikroskobu altında, süspansiyon
hücrelerinin silikon karbid fiberler aracılı
transformasyonu
(b) Transformasyondan sonra
geçici GUS ekspresyonu
hücrelerde
(c) Bialafos dirençli kallus
(d) Püskül oluşumu
(e) Fiberler aracılı transforme edilen mısır
bitkisi
(f) Herbisit püskürtülmesinden 2 hafta sonra
R1 soyu (Transforme olmamış kontrol
bitkileri 4 gün içinde şiddetli nekrosis
gösterdi ve kısa sürede öldü, transgenik
bitkiler ise yeşil ve sağlıklı).
43
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
• Fiberler kullanılarak;
• Mısır, tütün, pirinç, buğday, Lolium multiflorum, Lolium perenne,
Festuca arundinacea ve Agrostis stolonifera’nın transformasyonu
gerçekleşti.
44
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
Bu yöntemin etkinliği:
–
–
–
–
Fiberin boyutuna
Vorteksleme parametrelerine
Bitki materyaline
Bitki hücrelerinin karakteristiğine
45
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
OLUMLU YÖNLERİ
• Hızlı
• Kolay
• Ucuz yöntem
• Çeşitli bitki materyalleri için kullanışlı
• Hücre duvarını uzaklaştırmaya gerek yok
46
SİLİKON KARBİD FİBERLER
ARACILI DNA TRANSFERİ
OLUMSUZ YÖNLERİ
• Düşük transformasyon etkinliği
• Hücrelerde meydana gelen hasar rejenerasyon yeteneğini olumsuz
etkiler.
• Laboratuvar çalışmaları sırasında çok fazla özenli önlem
protokollerine uyma gereği vardır (Fiberleri solumak önemli solunum
hastalıklarına neden olabilir).
47
Biyolistik
Elektroporasyon
SONİKASYON
• Ses dalgalarının hücreler arası ve hücre zarında boşluklar
açarak serbest DNA parçalarının hücre içerisine girişini
sağlayan bir yöntem
50
SONİKASYON
• 1990 yılında Joersbo ve Brunstedt tarafından rapor edildi:
• 35 S promotörüyle birleşen CAT (kloramfenikol asetil transferaz)
geni içeren plazmidin varlığında 20 kHz ultrasona kısa maruz
bırakma uygulanması yoluyla şeker pancarı ve tütün protoplastlarına
DNA girişi gerçekleşti.
• Hafif sonikasyon (20 KHz ultrason) DNA aktarımını kolaylaştırmak
için kullanıldı.
• Bu yöntem, aynı materyal için elektroporasyon yönteminden daha
üstün bulundu (Elektroporasyon sisteminden daha kolay bir
yöntem).
https://www.youtube.com/watch?v=RDTX-Le6zqI
51
DESİKASYON
Dokuların:
• Önce soldurulması
• Daha sonra aktarılmak istenen DNA’nın da bulunduğu
bir ortamda tekrar su alımı
• DNA’nın hücre içerisine aktarımı
52
SONUÇ
•
Bitkilerde gen transferi, bazı özel gen dizilerinin bitki hücrelerine genetik
mühendisliği yöntemleri kullanılarak aktarılmasıdır.
•
Bu gen transfer yöntemleri, nükleik asitlerin sırasıyla bitki hücre duvarından,
plazma ve nukleus zarından geçerek hücrenin canlılığına zarar vermeyecek
şekilde geliştirilmiştir.
•
Doğrudan gen transfer yöntemlerinin Agrobacterium sistemine göre
üstünlükleri; çeşitli bitki türlerine uygulanabilmesi ve aktarılan genin
anlatımının kısa bir süre içerisinde saptanabilmesidir.
•
Bitkilere gen aktarımı ile; çeşitli çevresel baskılara, bakteriyel, viral ve fungal
hastalıklara, herbisitler ve pestisitler gibi çeşitli kimyasal bileşiklere
dayanıklılık özelliği kazandırılması
•
Tahılların besin kalitesinin arttırılması, bitkilerin sekonder metabolitler,
antibiyotikler ve aşılar gibi ilaç endüstrisinde kullanılan maddeleri bol
miktarda üretmeleri
53