PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)

Polimerase Chain Reaction
Hazırlayan: Bilge Ertekin
PCR (Polimeraz Zincir
Reaksiyonu)
PCR tekniği Cetus firmasının insan genetiği
departmanında çalışan araştırmacı Kary Mullis
tarafından 1985’te bulunmuş ve patenti
alınmıştır. PCR; ilk defa, aynı yıl R. Saiki, K.
Mullis ve arkadaşları tarafından orak hücre
anemisinin
tanısının
konulmasında
uygulanmıştır. Kary Mullis 1993 yılında bu
çalışma ile Nobel ödülünü kazanmıştır.
PCR
PCR, herhangi bir organizmaya ait genomik
DNA’ daki özgül bölgelerin çoğaltılmasını
(amplifikasyonunu ) sağlayan basit ama çok
başarılı bir invitro DNA sentezi yöntemidir.
PCR ile bir genin büyük miktarlarda kopyası
üretilebilmektedir.
DNA hibridizasyon yönteminde sadece söz
konusu materyaldeki mevcut DNA veya
RNA moleküllerinin saptanması
amaçlanırken PCR’da genetik materyalin
çoğaltılmasından sonra varlığı saptanması
esas alınır.
PCR yönteminin bu özelliği DNA
moleküllerinin tanınmasını kolaylaştırır.
PCR;
• DNA’ nın dizi analizi ve DNA
haritalamasında
• Genetik hastalık teşhisinde ( orak hücre
anemisi, kistik fibrozis, fragile X sendromu,
AIDS, lösemi v.b. )
• DNA parmak analizinde
• İnsan evrimi araştırmalarında
• İnsan Genom Projesi’ ndeki araştırmalarda
• Allellik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile
doku transplantasyonu için doku tipinin
belirlenmesinde
• Adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesinde (
analık babalık tayini )
• Tarımda ( tohum saflığının belirlenmesi )
• Sistematik ve evolüsyon çalışmalarında ( doğadaki
çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki
polimorfizmin belirlenmesinde )
• Hatta Mısır’ daki mumyalardan DNA klonlamasında
da kullanılmaktadır.
PCR
PCR da 30-40 döngüde tekrarlanan 3 ana
basamak vardır. Bu basamaklar reaksiyon
karışımını içeren tüpleri kısa bir zamanda
ısıtıp soğutabilen otomatik bir dönüştürücü’de
(cycler) yapılır.
PCR
reaksiyonu
için
gerekenler;
deoksinükleotidtrifosfatlar (dATP,dGTP,dCTP
ve dTTP), DNA polimeraz primerler, kalıp ve
magnezyum içeren PCR tamponudur.
PCR’ın 3 basamağı
şunlardır;
1) Denatürasyon:
Amplifiye edilecek çift iplikçikli DNA zinciri
yüksek sıcaklığa (94 C) maruz bırakılarak tek
iplikçikli hale dönüştürülür.
2) Annealing:
Primerlerin DNA’ daki hedef bölgelerle özgül
hibridizasyonuna olanak verecek sıcaklıkta annealing
reaksiyonu
Primerlerin ayrılmış DNA zincirleri üzerinde
komplementer oldukları bölgelere eşleşip kalıp DNA
zinciri ile primer arasında hidrojen bağlarının
oluşmasının sağlanacağı bir sıcaklık derecesi vardır.
Tm ( erime noktası ) adını alan bu sıcaklık
derecesi primer dizisinin baz içeriğine göre
değişir. Primerdeki G ve C sayısı artıkça Tm
derecesi de artar.
Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) Annealing
sıcaklığı genellikle Tm değerinin 5 C aşağısı
alınarak belirlenir.
3) Extension:
72 C Taq polimeraz enziminin ideal çalışma
sıcaklığıdır. Bu sıcaklıkta primerler uzar ve
tamamlayıcı zincir sentezi olur.
Reaksiyonun özgülüğü çok iyi tanımlanmış primer
oligonükleotidlerin (50-100 nükleotidden oluşan )
seçilmesiyle sağlanır. Bunlar amplifiye edilecek
DNA’ya bağlanacak olan bağlanma bölgesine
komplementer yapıda kısa tek sarmal DNA
molekülleridir. Primerler çiftler halinde biri çift zincir
DNA’yı oluşturan zincirlerinden birine, diğeri de o
zincirin komplementerine eşleşecek şekilde farklı
dizilimlerde tasarlanır. Amplifikasyon için DNA
dizisinin bilinmesi gerekli değildir. Birleşme
bölgelerinin dizisinin bilinmesi yeterlidir.
Reaksiyon için ısıya dayanıklı bir enzim Taq DNA
polimeraz Klenow fragmenti kullanılırken,
günümüzde “Thermus aquaticus” termofilik
bakterisinden izole edilen ve ısıya dayanıklı enzim
Taq polimeraz kullanılmaktadır.
Çünkü bu enzim 94 C de inkübe edildikten sonra bile
aktivitesini kaybetmez. Oysa E-coli den elde edilen
DNA polimeraz I yüksek sıcaklıkta inaktive olur ve
her cycle enzimi yenilemek gerekir.
DNA polimeraz enzimleri bir DNA
sentezleyebilmek için komplementerini
sentezleyeceği bir kalıp DNA molekülüne,
substrat olarak dNTP’ lere ve kalıp zincirine
eşleşmiş primerin 3 OH grubuna ihtiyaç
duyarlar.
PCR için saf DNA kullanılmaya gerek yoktur.
Kaba hücre özütü, total DNA preparatı, bir
damla kan ya da sperm başarılı bir PCR için
başlangıç materyali olabilir.
Enzim bu bileşenlerin bir araya geldiği uygun
tampon sisteminde ve uygun sıcaklıkta primerin 3
OH grubuna serbest dNTP’ lerin 5a -fosfat gruplarını
3-5 fosfodiester bağı ile kovalent olarak
bağlar.Tamponlar, enzim için gerekli olan
elektrolitleri ve koenzimleri sağlar.
Yine polimeraz enzimleri aktiviteler için serbest
magnezyum iyonlarına gereksinim gösterir.Bu
yüzden magnezyum içeren tamponlar kullanılır.
Başlangıçtaki DNA molekülü sayısı PCR’ ın kaç
döngü uygulanacağını belirler. 1 – 100 kopya DNA
molekülü ile başlanıyorsa 30 – 45 döngü, 1.000 –
100.000 ile başlanıyorsa 20 – 30 döngü yeterlidir. Bir
döngü sonucunda başlangıçta n olan DNA zincir
sayısı 2 n’ e yükselir. Döngüler arka arkaya çok kez
tekrarlanırken herbir döngünün ürünü, bir sonrakinde
kalıp olarak kullanıldığı için her döngüde istenen
DNA segmentinin miktarı 2 katına çıkar.
Bu şekilde 25-30 kez tekrarlanan
reaksiyonlar zinciri sonucunda örnekte
başlangıçta belki de sadece bir olan DNA
sayısı birkaç saat içinde milyon kez
çoğalarak hibridizasyon yöntemlerinden
biriyle işaretli prob DNA yardımıyla kolayca
saptanabilir.
Hedef genetik materyalin, RNA virüslerinde
olduğu gibi, RNA molekülü olması durumunda
ise önce revers trnskriptase enzimi kullanılarak
RNA molekülüne komplementer DNA (c DNA)
molekülü sentezlenir. C DNA iplikçiği RNA
iplikçiğinden ayrıldıktan sonra DNA polimeraz 1
enzimi kullanılarak c DNA iplikçiğine
komlementer DNA iplikçiği sentezlenir ve
molekül çift sarmal DNA molekülüne dönüşür. Bu
aşamadan sonra PCR aşamaları takip edilerek
DNA molekülü çoğaltılır.
Bazı durumlarda DNA sarmalları arsında stabil
sekonder yapı oluşabileceği için DNA çoğalması
gerçekleşmeyebilir. Örneğin çoğaltılacak olan
bölgenin G-C oranı yüksekse bu olabilir.
Döngü sayısı arttıkça hem enzimin tanıması
gereken DNA moleküllerindeki artış hem de
tekrar tekrar ısıtma sonucu enzim aktivitesinde
düşüş nedeniyle verim düşmektedir.
Buna ilaveten ısıya dayanıklı olmayan
enzim kullanılmışsa her döngüde ortama
ilave edilen enzim reaksiyon ortamını
değiştirerek enzimin katalitik aktivitesini
etkilemektedir.
PCR, çok duyarlı bir yöntem olmakla birlikte bu
yöntemde farklı kaynaklardan gelen DNA
moleküllerinin test ortamını kontamine etmesi
söz konusu olabilmektedir. Bunun sonucunda
reaksiyonda hedef mikroorganizmaya ait
olmayan DNA moleküllerinin de çoğaltılması
hataya neden olmaktadır.
Bu tip bir DNA kontaminasyonunun önlenmesi
amacıyla reaksiyon karışımının steril şartlarda
hazırlanması gerekmektedir.
Teşekkürler…