SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı)
advertisement
AŞILAR VE ÜRETİM TEKNOLOJİLERİ Hazırlayan Yard.Doç.Dr.Gülay Büyükköroğlu AŞILAR yaşayan veya ölmüş antijenik organizmaları bakteri toksinlerini Toksoitleri bakterilerin ve virüslerin belirli bölgelerinden alınmış antijenik materyalleri içeren • uygulandıkları organizmada belirli bir enfeksiyon veya intoksikasyon etkenine karşı özgül ve etkin bağışıklık sağlayan • • • • farmasötik preparatlar Dünyada, 2 milyon kişi/yıl aşı ile korunurken, 2 milyon kişi/yıl aşı ile korunabilir hastalıklardan ölüyor AŞILAR • hastalıktan, hastalığın neden olabileceği komplikasyonlardan korur • hastalığa neden olan mikroorganizmanın bir kişiden diğerine yayılımını önler • aşılanmamış bireyleri ve dolayısıyla TÜM TOPLUMU korur aşılama ile Çiçek Difteri Tetanoz Sarı humma Boğmaca Çocuk felci Kızamık Kabakulak Kızamıkçık Haemophilus influenzae Tip B’nin neden olduğu hastalıklar Aşılamanın tarihçesi • • 7. yüzyılda bazı Hintli Budistler yılan zehirini içerek onun etkilerine karşı bağışıklık geliştirmeye çalışmışlardır. 10. yüzyıldan 17. yüzyıla kadar Cin’de çiçek hastalığına karşı; – Çiçek geçiren hastanın toz haline getirilmiş yara kabuklarının buruna tampon şeklinde uygulanması – Çiçek geçiren hastanın toz haline getirilmiş yara kabuklarının burnuna çekilmesi – Çiçek geçiren bir hastanın iç çamaşırlarının sağlıklı çocuğa giydirilmesi – Çiçek geçiren hastanın döküntülerinin içerdiği sıvının sıvandığı bir pamuğun buruna tamponlanması • gibi dört tip aşılama tekniğinin geliştirildiği bilinmektedir. 16. yüzyılda Hindistan’da sağlıklı kişilerin kollarında, iğne ile çizmek suretiyle açılmış küçük kesiklerin üzerine kurumuş çiçek döküntülerinin tatbiki ile çiçek hastalığına karşı bağışıklık sağlama Jenner’in keşfine kadar uygulanmıştır. 20. yy başlarında aşılama Canlı aşı Jenner’ın orijinal Çiçek aşısı Pasteur’ün kuduz aşısı Ölü aşı kolera tifo veba 20. yy başlarında aşılama Canlı aşı Jenner’ın orijinal Çiçek aşısı Pasteur’ün kuduz aşısı Ölü aşı kolera tifo veba 20. yy başlarında aşılama Canlı aşı Jenner’ın orijinal Çiçek aşısı Pasteur’ün kuduz aşısı Ölü aşı kolera tifo veba AŞI TİPLERİ • Bakteri aşıları • Virüs aşıları – – – – Canlı virüs aşıları Öldürülmüş virüs aşıları Virüs altbirim aşıları Viral polipeptidler • Alt birim aşılar • Rekombinant aşılar • DNA aşıları Bakteri Aşıları • Canlı veya ölü bakterilerden hazırlanan aşılardır • Öldürme işlemi ısı veya kimyasal maddelerle muamele sonucu gerçekleştirilmektedir • Bakteri aşıları arasında ticari olarak mevcut olan tek canlı aşı tüberkülozun önlenmesi için kullanılan BCG aşısıdır Virüs Aşılar • Bazı virüslerin neden olduğu infeksiyonların önlenmesinde etkili olan aşılardır • Canlı virüsler, öldürülmüş virüsler, virüs altbirimleri veya viral polipeptidler kullanılabilmektedir Virüs Aşılar • Canlı virüs aşıları • Hastalık yapma etkisi azaltılmış virüsler kullanılmaktadır • Bu aşılar infeksiyonun doğal seyri sırasında tek doz uygulama ile antikor oluşumunu sağlayabilmekte • Sitotoksik hücreleri indükleyebilmektedirler • Yarılanma ömürleri kısadır Virüs Aşılar • Öldürülmüş virüs aşıları • Tüm virüsün ısı ya da kimyasal maddelerle inaktivasyonu yoluyla, hastalık yapma etkisinin giderilmesiyle hazırlanırlar • Vücuda enjekte edildikleri zaman virüsün yalnız yüzey antijenlerine karşı antikorlar oluşmasını sağlarlar • Hücre aracılı yanıtın zayıf olması ve aşırı duyarlılık oluşturabilmeleri istenmeyen yanlarıdır Virüs Aşılar • Virüs altbirim aşıları • Virüslerden elde edilen saflandırılmış proteinlerdir (viral reseptörler) • Öldürülmüş aşılar ile aynı özelliklere sahiptirler • Adeno-virüslere karşı uygundurlar Virüs Aşılar • • • • Viral polipeptidler Virüs reseptörlerinin polipeptid zincirleridir Öldürülmüş aşılar ile aynı özelliklere sahiptirler Hepatit B virüsüne karşı kullanılan aşı bu gruba örnektir İmmün Sistem • İmmünite, Latince “immunis=vergiden muaf” sözcüğünden türetilmiş, konağın hastalıklara karşı muafiyetini, yani direncini belirtmek için kullanılan sözcüktür • Çok genel kapsamda immünite (bağışıklık) hastalıktan korunma, özellikle de infeksiyöz hastalıklardan korunma anlamına gelir • Bunun için vücudun yabancı etkenlere karşı gösterdiği tepkilerin tümüne kollektif olarak immün yanıt (bağışıklık yanıtı) denir İmmün Sistem Ana işlevi, bizi yabancı ve zararlı maddelerden, mikroorganizmalardan, toksinlerden ve malign hücrelerden korumaktır Dış ve iç ortamlardan kaynaklanan etkenlere karşı yaşayan organizmaların korunması, immün sistemin ancak devamlı bir gelişim halinde olması ile sağlanabilir Böylece immün sistem, endojen maddelere karşı yıkıcı cevapları inaktif hale getirmeyi ve komşu dokularda gelişebilecek hasarları öğrenmiştir Birçok ümmin cevap sınırlı bir süre devam eder ve aşırı reaksiyonların önlenmesi için düzenleyici mekanizmalarla kısıtlanır İmmün Sistem İmmün sistemin esas görevi tehlikeli etkileri yararlı olanlardan ayırmasıdır İmmün Sistem İmmün sistemin esas görevi tehlikeli etkileri yararlı olanlardan ayırmasıdır • İmmün sistemin kendine karşı yıkıcı olaylardan kaçınması tolerans olarak adlandırılır • Primer lenfoid organlarda mevcut oto antijenlere karşı yönlendirilmiş lenfositlerin bir çoğu santral tolerans denilen bir olayla ortadan kaldırılır • Priferik tolerans ise daha nadir endojen yapılarda veya vücudun belli bölgelerinde gelişen bir diğer mekanizmadır İmmün Yanıt – doğal-doğuştan (innate) var olan (Nonspesifik İmmün Sistem) bağışıklık – geliştirilebilir (adaptif) bağışıklık (Spesifik İmmün Sistem) Doğal (innate) Bağışıklık Sistemi Organizma bir patojene maruz kaldığında öncelikle geliştirilen immün sistem kısmını oluşturabilen hücre grubunun görev aldığı sistemidir Bunlar; • Fagositik hücreler (makrofajlar, mast hücreleri) • T-helper hücreleri • Natural Killer (NK, katil hücreler) hücreleri Doğal (innate) Bağışıklık Sistemi • • • Doğuştan savunma mekanizmaları etkili patojenden bağımsız olarak geliştiklerinden nonspesifik olarak tanımlanır Spesifik gelişimleri için hiçbir bireysel hücre klonu gerekmediğinden bunlara nonklonal savunma mekanizmaları denir İnflamatuar cevap, çözünür ve hücresel komponentlerin kompleks etkileşimi ile olay yerinde savunma güçlerinin konsantrasyonunun artmasını sağlar Doğal (innate) Bağışıklık Sistemi • • • Doğuştan savunma mekanizmaları etkili patojenden bağımsız olarak geliştiklerinden nonspesifik olarak tanımlanır Spesifik gelişimleri için hiçbir bireysel hücre klonu gerekmediğinden bunlara nonklonal savunma mekanizmaları denir İnflamatuar cevap, çözünür ve hücresel komponentlerin kompleks etkileşimi ile olay yerinde savunma güçlerinin konsantrasyonunun artmasını sağlar – • • • Bu olaydaki ilk basamak kan damarlarının dilatasyonunu sağlayarak kapiller geçirgenliğini arttıran mediatör salınımıdır İnfeksiyon bölgesi daha sonra granülositler tarafından infiltre edilir ve reaksiyonun ileri aşamasında ise makrofajlar granülositlerin yerini alır Granülositler patojenlerin çoğunun ortadan kaldırıldığı ‘ilk savunma basamağını’ oluştururlar Geri kalan patojenler ile ilk savunma basamağının artıkları makrofajlarca fagosite edilir Geliştirilebilir (adaptif) Bağışıklık Sistemi • Daha özel ve etkili immün yanıt oluşturmak üzere geliştirilen bağışıklıktır • Doğal bağışıklık sisteminin geliştirilmiş şekli olup sadece omurgalılarda mevcuttur • B ve T lenfositleri en önemli hücreleridir • Hücresel ve Humoral bağışıklık olmak üzere iki şekilde gelişir Geliştirilebilir (adaptif) Bağışıklık Sistemi • Spesifik bir stokin ortamında, vücut daha humoral ya da daha hücresel bir savunma çizgisine doğru ilerleyeceğine karar verir • Antijen prezente eden hücrelerin (APC) lenfoid organlara göçü sistemik immün cavabın ilk tetikleyicisidir sonrasında bellek cevabı oluşur • Bu hücre sistemleri antijenlere karşı ileri derecede spesifik reaksiyonlar meydana getirerek klonal genişleme ile adı geçen antijenlere çok etkin bir cevap ve bellek oluştururlar Hücresel bağışıklık • T lenfosit hücrelerinin bakterileri önce duyarlılıkla tespit etmeleri ve sonrasında fagosite etmeleriyle yok edilmesine dayalı hücresel bağışıklıktır Humoral bağışıklık B lenfosit hücrelerinin sentezledikleri antikorlar aracılığı ile patojenleri, bakterileri yok eden salgısal bağışıklık olarak da tanımlanan sistemdir • Fagositik makrofajlar ve dentritik hücreler gibi antijen prezente eden hücreler (APC) • T helper hücreleri • B lenfosit hücreleri • Plazma hücreleri • MHC II (major histocompatibility complex) gibi hücre grupları • Sitokinler, immünoglobünler gibi moleküller görev almaktadır Mekanizma • Antijen vücuda girdiğinde, antijen prezente eden hücreler (APC) tarafından tanınır ve taşıdıkları MHC class II aracılığı ile T helper lenfosit hücrelerle konjuge olmasını sağlar • Buna bağlı olarak T helper lenfositler aktive olurlar ve bu hücrelerden sitokinler salınmaya başlar • Sitokinler ile B lenfosit hücrelerinin uyarılması sonucu B lenfositler antijen spesifik plazma hücrelerine dönüşürler ve matür hücrelerden immunoglobünlerin (Ig) salınması gerçekleşir • Böylece antijenler, üretilen bu Ig’ler yani antikorlar tarafından sarılarak inaktive edilip parçalanarak yok edilir Mekanizma • Kazanılmış immün yanıtta antijeni tanımada antikorlar en geniş çeşitlilikte antijenik yapıyı tanıyabilen, farklı antijenik yapıları ayırt edebilen ve antijenlere güçlü bağlanabilen tek moleküldür • Antikorlar, salgısal immün yanıtın en etkili kolunu oluşturur • İmmün sistem çok sayıda farklı özgüllükte antikor üretebilir • İnsanda immün sistem 108’den fazla antijene özgül çeşitlilikte antikor üretebilir • Bu antikorlar yapı olarak birbirlerine yakın yapısal özellik gösterirler Antikor nedir? • Yabancı ve enfeksiyon etmeni ajanlara bağlanıp onları yok etmek için , vücuttaki B-lenfositleri tarafından üretilen protein yapıda moleküllerdir. • Organizmalarda yabancı maddelere (antijenlere) karşı gelişen tepkinin en önemli unsuru antikorlardır. Antikor nerede üretilir? • B hücreleri ; kemik iliğinde “Bone marrow” oluşurlar. • Her bir B hücresinin membranında antijen bağlayan reseptör (Antikor) bulunur. • Antikorlar, özdeş yapıda 2 hafif, 2 ağır polipeptid zincirinden oluşan proteinlerdir. • Her bir ağır zincir hafif zincire ve diğer ağır zincire disülfit bağlarıyla bağlıdır. Antikorun yapısı: • Antikor (Immunoglobulin) 2 hafif, 2 ağır zincir olmak üzere 4 altbirimden olusan proteindir. • Hem hafif, hem de ağır zincir bir adet C (sabit) “Constant”, bir adet V (degisken) “Variable” altbirim içerir. • V altbirimi antijenin tanınmasından sorumludur. • Bütün bir Ig geni, V ve C gen parçalarının somatik rekombinasyonla biraraya gelmesiyle olusur. Antikorun yapısı: • Kol uzantılarında bulunan FAb (Antijen Bağlayıcı Bölge) ile antijenlere bağlanırlar. • “Y” şeklindeki molekülün boyun kısmında bulunan Fc almaç bölgesiyse, immün sistemin hücreleriyle etkileşir. • Fab bölgesiyle bakteriye bağlanan antikor, Fc bölgesiyle mikrop yok edici hücreleri kendilerine çekerek, bakterinin parçalanmasını sağlar. 1) Her bir antikorun sadece tek bir antijene bağlanma özgüllüğü göstermesi 2) Bazı antijenlerin bağışıklık sistemini bir kez uyarmaları sonrasında o hastalık için ömür boyu dayanıklılık sağlaması (Örneğin; kızamık ve suçiçeği gibi çocuk hastalıklarına karşı vücudun ürettiği antikorlar, hayat boyu bu hastalıklara karşı vücutta direnç oluşmasını sağlar). • Antijen-antikor reaksiyonu bağışıklık sağlayıcı birçok yöntemin geliştirilmesine yol açmış durumdadır. • Bunlardan en yoğun kullanılan ve güncel olanı ELISA. • ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay = enzime bağlı bağışıklık test) iki değişik antikorun kullanıldığı ve araştırılan antijenin varlığını renk değişimiyle gösteren bir test yöntemidir. • Bir antijen (bakteri, virüs, hücre veya molekül) “epitop” adı verilen birçok antijenik bölge içerir. • Her epitop ayrı bir antikor tipi tarafından tanınır. Bir antijen organizmaya girdiğinde her epitop için bir grup B-lenfosit hücresi özgül antikor üretmeye ve bölünerek çoğalmaya başlarlar. Böylece her epitop için özgül antikor üreten bir B-lenfosit kolonisi oluşur. Bir antijene karşı değişik B-lenfosit kolonileri oluştuğu için elde edilen antikora “poliklonal” (çok kolonili) antikor adı verilir. • Monoklonal antikorlar(mAb):Tek bir B-lenfosit hücresi tarafından üretilen antikorlardır. mAb tarihçe: • 1975 yılında Cambridge Üniversitesi’nden G. Köhler ve C. Milstein’ın geliştirdikleri yeni bir teknik, bir tek epitopa özgü (monoklonal) antikorların bol miktarlarda elde edilebilmelerine olanak sağlamıştır. • Bu tekniğe hibridoma teknolojisi adı verilmiştir. • Bu buluşlarıyla 1984 yılında FizyolojiTıp Nobel Ödülüne layık görülmüşlerdir. Georges J.F. Köhler César Milstein Hibridoma teknolojisinin temelinde üç bilgi bulunur: 1- B-lenfositler tek bir epitopa özgü antikor üretip salgılayan, yaşam süreleri birkaç günle sınırlı kan hücreleridir. 2- Tümör hücreleri bölünerek çoğalma kontrolünü kaybetmiş, hızla üreyen ölümsüz hücrelerdir. 3- Belli koşullarda aynı organizmaya ait değişik hücreler birleştirilerek her iki hücrenin özelliklerini taşıyabilen melez hücreler (hibridoma) elde edilebilir. Hibridoma Tekniği: • Monoklonal antikor elde etmek için kullanılan melezleme tekniği, yararlı özelliklere sahip iki hücrenin birleştirilmesi ile gerçekleşir. • Hücre kültüründe hızla çoğalabilen, ölümsüzlük özelliği kazanmış myeloma (kanser) hücreleri ile aktif olarak istediğimiz antikoru üreten bağışık bir hayvanın dalak lenfositleri birleştirilir. • Sonuçta, kompleks bir antijenin tek bir belirleyici grubuna (epitop) karşı monoklonal antikor üreten ölümsüz hibrit hücreler elde edilir. 1- Fare, antijene karsı antikor üretimini ortaya çıkarmak için ilgili antijen ile immünize edilir, 2a- Dalaktan, antikor üreten B lenfosit hücreleri izole edilir, 2b-İnsan kemik iligi kanser hücresi olan myeloma hücreleri toplanır, 3-Hibridoma oluşturmak için PEG aracılığı ile hücreler birleştirilir. Birleşmeyen hücreler ölür, 4- Hibridomalar kültür plaklarında bölünmek üzere bırakılırlar, 5-Antikor sentezleyen klonlar ELISA yöntemi ile belirlenir, 6-Hibridomalar invitro (hücre kültürü) veya invivo (farede acid fluid oluşumu) koşullarda geniş ölçekte üretilir, 7-Fare asid sıvıdan veya kültür üst sıvılarından antikorların saflaştırılması. 1.HGPRT( hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase )(büyüme için seçici HAT besiyerine ihtiyaç duyar) enziminden yoksun ölümsüz miyeloma hücreleri ile antijen X ile immünize edilen bir hayvandan alınan, antikor üreten normal dalak hücreleri ile birleştirilir. Dalak hücreleri HGPRT üretebilir. 2.HAT besiyeri üzerine yayıldığında; birleşmemiş hücreler , aynı zamanda HGPRT bağımlı metabolik yolla pürinleri yapamadıkları için mutant myeloma hücreleri ve kültürde sınırlı yaşam süreleri olduğu için dalak hücreleri büyümez.Dolayısıyla sadece birleşmiş hücreler HAT besiyeri üzerinde büyür ;hibridoma denen klonları oluşturur.Her hibridoma tek tip antikor üretir. 3. Her bir klon test edilir , X antijenini tanıyanları tanımlamak için.İstenen antikoru üreten hibridoma tanımlandıktan sonra , bu klon ,büyük miktarlarda antikor eldesi için kültüre edilir. • Ancak bu özel hibridomalar, insan bağışıklık sistemi tarafından “yabancı” (antijen) olarak algılanan fare kökenli antikorların oluşumuna neden olurlar. • Fare antikoru aşılanan hastalarda genellikle, eklem bölgelerinde şişlik ve kızarıklıklarla kendini gösteren HAMA cevabı (insanda anti-fare antikorlarının oluşumu) görülür. • Böbrek yetmezliğine de neden olan HAMA, yaşamsal tehlike oluşturmasının yanısıra, verilen antikorların vücut tarafından yok edilmesine de yol açar. • Bu nedenle, hem HAMA cevabının oluşmasını hem de fare antikorlarının bağışıklık sistemi tarafından vakitsiz bir şekilde etkisizleştirilmesini önlemek amacıyla, fare antikorlarının “insanlaştırılması” için çeşitli teknikler geliştirilmiş bulunuyor. • Fare monoklonal antikorlarının insanlaştırılması ve tamamen insansı olan monoklonal antikorların geliştirilmesi, immün cevap oluşturmamaları nedeniyle önemlidir. • Bu nedenle ticari firmaların neredeyse tamamınca üretilen antikorların insanlaştırılması ya da tamamen insansı hale getirilmesi üzerinde yoğunlaşılmaktadır. Günümüzde oluşturulabilen antikor tipleri: • Murine(mouse) mAb: Tamamıyla fareden üretilen antikorlar (℅ 100 fare proteini). • Kimerik mAb:Değişken bölümleri fare kaynağından , sabit bölümleri insan kaynağından oluşturulan antikorlar (℅ 33 fare proteini) • Humanized mAb: Sadece antijen-bağlayıcı bölgesi ( ayrıca ‘CDR’= ‘complementarity-determining regions’ olarak da isimlendirilir) fareden ,geri kalan değişken ve sabit bölgeleri insan kaynağından oluşturulan antikorlar (℅ 5-10 fare proteini). • Human mAb: Tamamıyla insan kaynağından gelen antikorlar(℅ 100 insan proteini). MONOKLONAL ANTİKORLARIN KULLANIM ALANLARI: 1. Hastalıkların teşhisinde, 2.Hastalıkların tedavisinde, 3. Hastalıklardan korunmada (pasif bağışıklık), 4. Antijenlerin saflaştırılmasında, 5. Tanı kitlerinin hazırlanmasında, 6. Araştırma ve teşhis çalışmalarında, 7. Tümörle ilgili çalışmalarda, 8. Aşı suşlarının hazırlanmasında. Farmasötik Yaklaşım • Üretim • • • • Sentetik aşılar haricindeki diğer aşılar mikroorganizmalar ya da hayvan hücreleri türevleridir İstenilen aşı bileşenlerinin ekspresyonu için bu mikro organizmalar veya hayvan hücreleri genetik olarak modifiye edilir Hayvan hücreleri virüslerin üretilmesi ve bazı alt birim aşıların bileşenlerinin üretilmesi için kullanılır Kültür ortamına aşı bileşenlerinin salınmasını da mümkün kılar Hücre kaynaklı aşıların üretilmesinde üç aşama vardır • Kültür hazırlama (Cultivation=Yetiştirme) • Downstream processing (sonraki işlem) • Formülasyon Cultivation • • • • • • • Ekilecek suşun seçimi aşı üretiminde en önemli aşamadır Cultivasyon süresince antijeni sentezleyecek özelliklerini kaybetmemeleri gerekmektedir (Genetik kararlılık) Ekilen suşların üretimleri ve kontrolleri GMP koşullarına uymalıdır Bakteri ve mayaların cultivasyonu fermantörler ve bioreaktörlerle kolaylıkla sağlanabilmektedir Hayvan hücrelerinin cultivasyonu oldukça komplikedir – Oksijenkonsatrasyonu ve sürtünme gibi çevresel faktörlere hassastırlar – Kültür ortamının bileşenleri gelişimlerinde etkendir Her iki suş için medium komposizyonu, pH ve çözünmüş oksijen gibi cultivasyon koşulları ve hasat zamanı iyi belirlenmelidir Cultivasyon için seçilen koşullar Büyük ölçekte cultivasyon sonrasında aşı bileşenlerini etkilememelidir Airlift Bioreactor Stirred-tank bioreactor3 Stirred-tank bioreactor • • • • • Cultivasyondan sonra aşı bileşenleri bakteri, maya veya hayvan hücrelerinden ve diğer istenmeyen hücre bileşenleri veya ürünleri (proteinler gibi)nden ayrılmalıdır Uygulanacak olan downstream prosesi için – hücre tipi – Aşı bileşeninin lokalizasyonu( hücre içinde ya da salınmış olması) – Aşı komponentinin fizikokimyasal özellikleri önemlidir Eğer aşı bileşeni mikroorganizmaya ya da hücreye bağlı ise; mikroorganizma ve hücre toplanmalıdır Eğer aşı bileşeni salgılanıyor ise; hücre içermeyen sıvı toplanmalıdır Her iki ürün için de filtrasyon ve santrifügasyon yöntemleri sıklıkla kullanılmaktadır Hücre bağlantılı aşı bileşenlerinin eldesi için • Hücre fiziksel, kimyasal ve enzimatik yöntemlerle ekstakte edilir • Hücresel artıklar santrifügasyon ya da filtrasyon yöntemi ile ayrıştırılır Hücreden bağımsız bileşenler için • Kolon kromotografisi • Organik solventle ekstraksiyon • Çöktürme • İnaktivasyon aşaması uygulanır Bu aşamalardan sonra elde edilen bulk materyal saflaştırılır ve formülasyon için hazırdır • • • Modern aşı üretiminde tutarlılık en büyük önemi taşımaktadır Her lot’da ürün kalitesi aynı olmaya zorlanmalıdır GMP kuralları çok sıkı uygulanmalı ve her üretim safhası Valide edilmelidir – İyi yazılmış standart prosedürler olmalı – Her üretimde ürünün verilerini içeren geniş bilgiler olmalı – Her üretilen ürün bir önceki ürün ile karşılaştırılmalı Aşı Formülasyonu • Aşı Formülasyonu; • Çözücü bileşenleri, Tuzlar, koruyucular ve stabilizanları içermelidir • Bu bileşenler aşı komponenti ile olumsuz etkileşim göstermemelidir • Saklama koşullarını etkilememeli ve uygulamada sorun oluşturmamalıdırlar • Koruyucular; Tımerosal, Fenoksietanol, SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) İnsanlara uygulama için beyin dokusu aşılarının üretiminde genellikle tavşanlar kullanılmaktadır. Bunula birlikte koyun ve keçilerde tercih edilebilmektedir. Bu tip aşılar fenol ile inaktive ve fosfat tamponunda süspanse edilerek hazırlanan aşıdır Aşı formülü • Bu tip virüs aşılarının insanlara uygulamalarında tavşan, koyun ve keçi gibi hayvanların beyinleri kuduz virusü ile infekte edilir • İnfekte beyin dokularınden elde edilen virüsler fosfat tamponunda fikslenir ve bu şekilde oluşturulan 2 mL süspansiyonda inaktive kuduz virüsü %5’den az olmamalıdır SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Kaynak Virüslerin Hazırlanması Virüs Suşu • Üretimde kullanılan suş yüksek antijeniteye sahip diğer virüslerden elde edilen suşlardır. Elde edilen suş PV suşu (Pasteur Vaccine) olarak adlandırılır Virüs suşunun korunması • Aşı üretimi için kullanılan kaynak virüsler tavşan beyni aracılığıyla pasajlanır • Steril su içerisindeki %10’luk infekte tavşan beyni süspansiyonunun 0.25 mL’lik miktarının tavşan beynine intraserebral injeksiyonundan sonra 5-7 gün içinde tavşanlarda felç meydana gelmektedir • Bu beyinlerden elde edilen beyin dokularının %10’luk süspansiyonları ampul ya da ağzı sıkı kapalı camlarda -70°C’lik kuru buzlu ortamda ya da en az -15°C’lik ortamlarda saklanması uygundur • Virüs suşunun özgüllüğü periyodik olarak farelerde sokak virüsüne (Street virüs;doğal yolla infekte edilmiş hayvanlardan elde edilen virüs) karşı koruyuculuğu kanıtlanan anti-kuduz hiperimmün serumu ile titrasyon yapılarak test edilir. SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) %10’luk kaynak virüsünün üretimi • İntraserebral olarak kuduz virüsü tavşan beynine inoküle edilir ve enfekte edilen tavşanlar ölmeden önce tamamiyle felç durumundayken beyinleri alınır • Çıkarılan beyinler steril distile su içerisinde hemen dondurulur ve çalışma anına kadar kuru buzda saklanır SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) İnokulasyon ve Harvest İnokulumun hazırlanması ve inokulasyon tekniği • Kaynak virüs ün %10’luk süspansiyonunun 10-1 dilüsyon olduğu düşünülmektedir ve bu süspansiyondan distile su ve %2’lik at serumu içinde tekrar dilüsyon yapılarak bir virüs süspansiyonu hazırlanır SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Farelerin öldürülmesi • Nefes almaya devam eden fakat tamamiyle felç durumundaki tavşanların göz damarına 20mL intravenöz hava enjeksiyonu yapılır • Ölüm 1-2 dk içerisinde gerçekleşir. Yeni öldürülmüş tavşan beyinleri aşı üretimi için kullanılmaktadır • Kuduz hastalığından ya da başka nedenlerle ölmüş hayvanlar kesinlikle kullanılmaz. Otopsi • Uygun olmayan tavşanların kullanımını önlemek için beynin çıkarılmasını takiben hayvanlara otopsi yapılır • Bütün otopsi bilgileri kayıt altında tutulmalıdır • Vücudun herhangi bir yerinde koksidiyoz (kanlı ishal) belirtileri gösteren tavşanlar, koksidiyozun kuduz hastalığından daha fazla felç etkisi gösterebilmesinden dolayı kullanılmamalıdır SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Beyin harvesti • Tavşanlar %5’lik fenol ya da uygun bir antiseptik solüsyon ile yıkanmalıdır • Dekapitasyon (başını kesme) mümkün olduğunca omuzlara yakın yapılmalıdır • Uygun bir tutucuyla bağlı kesilen baş etanollü iyot ile temizlenmeli ve beynin çıkartılması için steril odaya götürülmelidir • Kafa derisi ve kafatası dikkatlice temizlendikten sonra çıkrılan beyinden alınan küçük bir parçada bakteriel sterilite için test edilir. Testin pozitif çıkması halinde beyin kullaılmaz • Eğer çıkarılan beyin uygun ise hemen -15°C’nin altında kullanılıncaya kadar saklanır SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) %40’lık aşı süspansiyonu üretimi Emülsifikasyon • Dondurulmuş beyinler tartılır ve içinde yeterli miktarda fenol bulunan 2 litrelik fosfat tamponu içerisine yerleştirilir • Çözünen beyinler daha sonra uygun cihazlarla emülsifiye edilir. • Emülsifikasyon sırasında aşırı ısınmayı önlemek için buzlu ortam kullanılır Dilüsyon • Fosfat tamponu; 0.5M sodyum dihidrojen fosfat, 0.5 M potasyum dihidrojen fosfat ve %0.85 sodyum klorür içerir, pH:7 ye ayarlanır. • %40’lık doku süspansiyonda %0.5’lik fenol bulunmaktadır. Beynin ağırlığı önemlidir. • Fenol içeren süspansiyon fenolün antijeniteye hasar vermesi sebebi ile dondurulmaması gerekmektedir SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) İnkübasyondan önce beyin dokusundan virüs titrasyonu • %40’lık doku süspansiyonu tartılır ve 10-6,10-7 ve 10-8’e dilüe edilerek 11-15 gramlık farelerde intra serebral olarak enjekte edilerek titrasyon yapılır. Titre (LD50) en az 10-6 olmalıdır. İnkübasyon • %0.5 fenol içeren emülsifiye aşı 1 saat 20°-30°C’lik su banyosunda 1 saat bekletilir ve daha sonra 20°-30°C’lik inkübatörde mekanik olarak karıştırılarak inaktive olana kadar bekletilir • İnaktivasyon için gerekli inkübasyon süresi beyin dokusunun emülsifikasyon metoduna (parçacık büyüklüğü) ve virüs suşlarının çeşitliliğine göre değişmektedir • Süre laboratuvar deneyimlerine göre belirlenebilir SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Aşı süspansiyonunda sterilite tayini • Aşı kütlesinde sterilite testi sıvı tiyoglikolat besiyerinde yapılmaktadır • Her bir kaptan en az 10mL örneklem alınarak yapılır • Örnekler besiyeri ile daha düşük dilüsyonlara ayrılır ve 30°-32°C’de en az 7 gün inkübe edilir • İnkübasyona süresinde herhangi bir üreme olup olmadığı değerlendirilir • İnkübasyona süresi sonunda bütün kaplar hafifçe çalkalandıktan sonra her bir kaptan 1 mL örnek alınarak yeni steril bir test besiyerine aktarılır ve 7 gün daha inkübasyona bırakılır kontaminasyon görülen aşı örnekleri yeniden teste maruz bırakılır. SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Aşı süspansiyonunda zararsızlık testi • Zararsızlık testi aşı süspansiyonu içinde canlı virüs olup olmadığını kontrol etmek için hem tavşanlarda hem de farelerde uygulanır • Eğer aşı üretimi başka hayvanlarda yapılmış ise test içinde bu hayvanlar ve fareler kullanılmalıdır • Test için en az iki tür hayvan kullanılmalıdır • Bu test için aşı süspansiyonu bulunan her kaptan bir örneklem yapabilecek kadar örnek alınır • Test uygulamasında en az %5 beyin örneği içerecek şekilde tavşanlarda 0.25mL, 18-20g ağırlığındaki farelere ise 0.03 mL örnek intraserebral olarak enjekte edilir • En az 14 gün boyunca tavşan ya da çalışılan diğer hayvanlarda santral sinir sistemi ya da diğer semptomlar açısından izlenir SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Aşının son hali Aşı süspansiyonun uygulanan tüm testler uygun çıkması halinde aşılar son dolum kaplarına aktarılır ve etiketlenir. Daha sonra diğer testler için örneklem alınabilir. Bu testler; Analitik testler; toplam katı, fenol konsantrasyonu, pH ve tiomersal ya da diğer koruyucu konsantrasyonları incelenir Genel güvenlik testi; yanlışlıkla eklenen herhangi bir toksik maddenin belirlenmesi için dilüe edilmemiş kaplardan rastgele seçim yapılır. Yaklaşık 20g ağırlığındaki farelere 0.5mL ya da 350g ağırlığındaki kobaylara parenteral enjeksiyon sonunda belirgin herhangi bir işaret ya da ölüm göstermemelidir. Testin uygulamasında en az iki hayvan türü seçilmeli ve uygulama süresi en az 7 gün olmalıdır. Sterilite testi; sterilite testi için tüm kaplardan örneklemi sağlayabilecek en az 20 adet örnek seçilmelidir. Eğer kaplarda 1 mL ya da daha az örnek var ise tüm kap test için kullanılmalıdır. Daha fazla örnek var ise test edilecek miktar ya en büyük tez doz ya da 1mL olmalıdır. Aşı süspansiyonunda Sterilite testi konusunda anlatılan sıvı tiyoglikolat besiyerine ek olarak Sabouraud’s besiuyeri küf kontaminasyonunun belirlenmesi için eklenmelidir. Bu test için uygulama sıcaklığı 20°-25°C’de 10-21 gün arasında yapılmalıdır. SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı) Tarihlendirme • Son kullanım tarihi yayın tarihi ya da üretim tarihinden sonra 6 ayı geçmemelidir • Üretim tarihi en son etkinlik testinden de geçildiği gündür • Yayın tarihi üretim tarihinden sonra 3 aylık dönem olabilir ve bu zaman sürecinde aşılar 2-5°C’de üretici tarafından saklanır • Fenollü kuduz aşılarının dondurulması etkinliği bozacağından aşılar 2-5°C’de saklanmalıdır FERMİ-TİP AŞI Fermi tip aşının avantajı hazırlama kolaylığıdır. Tam bir etkinlik testinin yapılamayacağı zamanlarda kalıntı virülansın titresinden etkinlik kabaca değerlendirilebildiği için hızlıca üretilebilmektedir. Bununla birlikte bazı laboratuvarlar inaktive edilmiş aşı üretiminde değişiklik yapmışlardır. Örneğin Paris’teki Pasteur Enstitüsü Fermi-Tip aşının üretimini 1967’den sonra tamamen bırakmıştır. Fakat Etiyopya’da bu aşının üretimi hala devam etmektedir. Ve şu an da dondurularak kurutulmuş β-propiyolaktonla inaktive edilmiş yüksek etkinliğe sahip, daha uzun saklanabilen ve tropik ülkelerdeki yüksek ısıya dayanıklı aşılar üretilmektedir. FERMİ-TİP AŞI Aşı formülü • Bu aşılar, kuduz virüsü ile karıştırılarak koyun ya da keçi beyinine inokulasyonu sonucu elde edilen %5’lik beyin dokusu süspansiyonlarıdır • Bu süspansiyonlar başlangıçta %1’lik daha sonra final konsantrasyonu %0.5 olacak şekilde fenol ile muamele edilmiştir • Fermi-tip aşılar inaktive aşılar olarak sınıflandırılmakla birlikte inaktive virüsün yanında aktif virüs de belirgin miktarlarda bulunmaktadır • Böylece atenüe-inaktive bir aşı modeli ortaya çıkmaktadır Aşı üretimi • Bu tip aşıların üretimi aynı semple tip aşı gibi belirli miktarlarda kuduz virüsünün koyun ya da keçi beynine inokulasyonundan sonra beynin çıkartılması ve sterilite ve infektivite testlerinin yapımını içermektedir FERMİ-TİP AŞI İnaktivasyon • Fosfat tamponu içindeki %10’luk beyin dokusu ve %1’lik fenolün homojen karışımı 22°C’lik etüvde 24 saat karıştırılır • İnaktivasyon 22°C’nin altında gerçekleşmez. 24 saat sonunda inaktive olan aşı 4 gün boyunca 4°C’de saklanır ve daha sonra %5 beyin dokusu ve %0.5 fenol olacak şekilde dilüsyon yapılır. • Aşıların kaplara doldurulma aşamasında süspansiyonlar sürekli çalkalanır FERMİ-TİP AŞI Hazırlanan aşılarda yapılan testler • Hazırlanan aşılardaki virülans kalıntısı farelerde test edilmelidir • Bu test fenol eklenmesinden sonra 9 gün boyunca yapılmalıdır • Acil durumlarda bu süre kısaltılabilir fakat iki günden az olmamalıdır • Test edilecek aşı örneği düşük hızda santrifüj uygulanır ve süpernanat 101, 10-2 ve 10-3 olacak şekilde serum fizyolojik ile dilüe edilir • Her bir dilüsyon en az 5 fareden oluşan bir gruba intraserebral olarak verildikten sonra 15 gün boyunca hayvanlar felç gibi semptomlar ya da ölüm açısından izlenir • Sterilite, etkinlik ve analitik testlerde yine semple tipi aşılardaki gibi uygulanır. Tarihlendirme • Son kullanım tarihi yayın tarihinden itibarinden 5 aydır ve bu süre zarfında aşılar 2-5°C’de saklanmalıdır • Daha düşük ısılarda saklamak tavsiye edilmez. İklim şartlarına göre son kullanım tarihi 2-3 aya kadar düşebilmektedir. FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI • A. Rusya’da kullanılan Metot Aşı içeriği • Aşılar kuduz virüsü ile karıştırılmış %5 beyin dokusu, en fazla %0.25 fenol ve %3.75 sukroz içeren dondurularak kurutulmuş maddelerdir. Kaynak virüs üretimi • Bu virüs Pastör suşundan orijin alan bir kuduz virüsüdür • Virüs tavşan beyninde üretildikten sonra hemen çıkarılır ve beyin porsiyonlar halinde %50’lik gliserolde +4°C’de ya da saf gliserolde -40°C’de saklanmalıdır • Koyunlar infekte edilmeden önce tavşan beyin dokuları gliserolün uzaklaştırılması için et sulu-pepton besiyerinde ya da pH 7.2’lik distile su ile yıkanır • Dokular daha sonra homojen olarak parçalanır ve 10-2’lik dilüsyonlar hazırlanır • Sterilite testleri uygulanır FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Koyunların Hazırlanması ve İnfeksiyonu • Aşı üretimi için sağlıklı 4-12 aylık koyunlar kullanılmaktadır • Koyunlar infeksiyonun olmadığı kanıtlanmış bölgelerden seçilir ve çalışmaya başlamadan önce 30 gün karantinada bekletilir • Uygun koyunların kafatasında küçük bir delik açılarak buradan kuduz virüsü enjeksiyonu yapılır • Enjeksiyonu takiben 80-144 saat içerisinde kuduz virüsünün klinik göstergeleri başlamaktadır • Bundan sonra koyun boynu kırılarak öldürülür derisi ve kasları ayrıldıktan sonra %5’lik fenolle muamele edilir • Serebrospinal kanal steril bir pamuk vasıtasıyla kapatılır ve steril kaplara aktarılır • Patalojik incelemeler yapılır FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Beynin Çıkarılması • Normal olarak koyunun kesilmesinden hemen sonra aşıların hazırlanması gerekmektedir • Eğer hemen hazırlanamayacaksa en fazla 12 saat 2-4°c’de bekletilebilir • Kafatası açıldıktan sonra alkol ile muamele edilir ve küçük parçalara ayrılır, kaplara koyularak tartılır • Beyinden alınan küçük parçalarda sterilite testi de yapılır. Aşının Hazırlanması • Beyin dokusu parçaları sterilize edilmiş parçalayıcı bir cihaza alınarak %1’lik tuz, fenol içeren distile su içerisinde 10-12 dk kadar parçalanır • Parçalanan süspansiyon filtrasyona tabi tutulur. %1 fenol içeren %20’lik aşı süspansiyonu günde 2-3 kez çalkalamak şartıyla 14 gün boyunca 22°C’de inkübasyona bıralıkarak inaktivasyon sağlanır • Süspansiyona %15’lik sükroz eklenir. Oluşan yeni süspansiyon ampüllere aktarılır daha sonra dondurularak kurutulur FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Hazırlanan Aşılarda Yapılan Testler • Fiziksek özelliklerin belirlenmesi (görünüş ve çözünebilirlik) (aşılar 1-2 dakika içinde çözünmelidir) • Sterilite testi (her bir partiden 10 ampülde yapılmalıdır) • Rekonstitüsyon (sulandırma) sıvısında sterilite testi • Yeniden sulandırılan sıvıda ve santrifüj sonrasında süpernanat ve pellette bakteriyel kontaminasyon testi Farelerde güvenlik testi; %5’lik aşıdan 5.5 mL subkutan enjeksiyon sonunda farelerde 5 günde ölüm ya da herhangi bir infiltrasyon gözlenmemelidir. Virülans kalıntısı testi: ampül içerisindeki kuru aşı üzerine 1.5mL su eklendikten sonra santrifüj yapılır. Süpernatant sıvısı dilüsyonlara ayrıldıktan sonra 6 fareye intraserebral olarak verilir. 14 gün boyunca fareler gözlemlenir. • Etkinlik testi • Nem içeriğinin tayin edilmesi Tarihlendirme • Son kullanma tarihi etkinlik testinden sonra 2 yıldır FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI B. Patör enstitüsünde kullanılan methot • Bu aşılar kararlı virüs suşuyla infekte edilen çok genç koyunların beyinlerinden hazırlanmaktadır • Kararlı virüs β-propiyolakton ile inaktive edilir • Tüm çalışmalar antiseptik koşullarda mümkünse kapalı ortamlarda yapılmalıdır • β-propiyolakton kullanılan dozda bakterisidal özelliktedir ama bunun yeterli olmadığı durumlarda gerekli antimikrobiyallerde kullanılabilir FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Kararlı Virüs suşunun üretimi • Genç koyunlara inoküle edilecek virüs suşunun yüksek antijeniteye sahip olmalı ve periyodik kontroller yapılmalıdır • Ya orijinal Patör suşu ya da ondan türeyen suşlar kullanılmalıdır • Pastör enstitüsünde kullanılan suş liyofilize VP11 ( Pastör virüs no:11) ‘dir • Her yıl yaklaşık 2 kg ağırlığındaki bir miktar tavşan bu suş ile intraserebral olarak inoküle edilmektedi • İnfekte olan ve paraliz halindeki hayvanlar hemen çalışmaya alınmaktadır • %2 at serumu içeren distile su içerisinde dilüe edildikten sonra ampül içerisine doldurulur ve -20°C’de saklanır. FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Kuduz koyun beyninin hazırlanması • Çalışma için genellikle 1-2 aylık koyunlar kullanılmaktadır. Çalışma anına kadar koyunlar uzman bir veteriner gözetiminde karantinada tutulur • İnokülasyondan iki gün önce uygulama yapılacak yer türlerden temizlenir ve belli aralarla tentürdiyot ile silinir • 10-1 dilüsyonluk inokülasyon sıvısı çözündürüldükten hemen sonra bekletilmeden ön lobun sol tarafında dikkatice açılan delikten 0.5mL olarak enjekte edilir • Koyunlar özel izolasyon odalarına götürülür. İnokülasyonu takiben 5 gün sonra hayvanlarda denge problemlerinin ilk izleri görünmeye başlar • 6. Günde paraliz görüldükten sonra koyunun başı kesilir. Tüm kanın akıtılmasından sonra derisi soyulur ve alevde dış taraftaki etlerinin yakma işlemi gerçekleştirilir. • Dikkatice beyin çıkartıldıktan sonra steril bir kaba koyulur ve -25°C’de saklanır. • Beyinden küçük parçalar alınarak virüs titresi ölçümü ve sterilite testleri yapılır • Sterilite testi aerobik ve anaerobik organizmaların tesbiti için Bonnel&Raby besiyerinde yapılır • Virüs titrasyonu ölçümü ise 14-16g ağırlığındaki beyaz farelere intraserebral inokulasyonu ile yapılır. Titre yaklaşık 0.03 mL için LD50 10-5.5 olmalıdır. Steril ve uygun titeye sahip beyin örnekleri 1 yıla kadar -25°C’de saklanır FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Aşı hazırlanması Aşı hazırlanmasında aşağıda içeriği belirtilen tampon kullanılmaktadır. Sodyum klorit Sodyum dihidrojen fosfat dihitrat Sodyum hidroksit Distile su • • • • 5.85g 6.24g 1.62g km 1000mL Tampon pH’sı 7.2 olmalıdır. Liyofilize tozlar bu tampon ile yeniden sulandırılmadan önce tampona 75 g sukroz eklenmelidir Dolaptan alınan yaklaşık 400g koyun beyni hızla çözündürülerek aşağıda resimde görülen düzenekteki parçalayıcı içerisine koyulur, üzerine bir kısım tampon eklenerek parçalama işlemi gerçekleştirilir Homojeniasyon işlemi bittikten sonra kütle sukrozlu tampon bulunan şişeye basınçlı hava altında aktarılır Daha sonra aşı süspansiyonu naylon filtreden geçirilierek steril toplama şişesine aktarılır. Burada toplanan örnekler içinde distile su bulunan ve β-propiyolaktonla muamele edilecek şişeye aktarılır. Şişeye koyulan süspansiyon üzerine eklenen β-propiyolakton’dan sonra şişe hızlıca birkaç saniye çalkalanır daha sonra şişe 22-25°C’de 3 saat inaktivasyona bırakılır. FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI fenollü koyun beyni aşısının hazırlanmasında kullanılan düzenek FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Süre sonunda oluşan emülsiyonun içeriği; Kuduz koyun beyni Sodyum klorit Sodyum dihidrojen fosfat dihitrat 0.624g Sodyum hidroksit Sukroz 7.5g Distile su • • 10g 0.585g 0.162g km 100mL β-propiyolakton süreç içerisinde hızlıca hidroliz olacak ve tümüyle toksik olmayan βpropiyonik ve hidrakrilik asit türevlerine dönüşecektir Emülsiyon oluşturma aşamasında eklenen β-propiyolakton yeterli bakterisidal etkiye sahip olmadığından fenol eklenmesi gereklidir FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Çözünürlük ve Liyofilizasyon • Aşı emülsiyonu dolaptan çıkarıldıktan sonra hemen 10mL’lik bir şişe içerisinde 2.5mL ile çözündürülür ve homojen bir şekilde -40°’de dondurulur • Bu sıcaklıktaki kap vakum cihazına alınır, ısı yavaş bir şekilde +22°C’ye çıkartılırken liyofilizasyon işlemi gerçekleştirilir Yeniden sulandırma ve Dozajlama • Liyofilize tozlar içerisine 5mL distile su koyularak yavaşça çalkalanır. Yeniden sulandırma işlemi kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmelidir • Aşı subkutan olarak yetişkinlerde günlük 2.5mL ve çocuklarda 1mL olacak şekilde verilmelidir Tarihlendirme • Düzgün bir şekilde liyofilize edilen ve azot gazı ile kapatılan kaplar 2 yıl süre ile saklanabilir FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Hazırlanan aşı üzerinde yapılan testler pH’nın belirlenmesi: pH 6.6 ve 7.0 arasında olmalıdır sterilite testi: Liyofilize toz içeren her 10 şişeye 5mL distile eklendikten sonra yapılmalıdır. Aerobik ve anaerobik organizmaların belirlenmesi: her şişeden alınan 3mL ‘lik örnek iki ayrı Bonnel&Raby soyum hidrojen sülfit besiyeri içeren tüpe aktarılır. Bir tüp 37°C’de, diğer tüp 22°C’de inkübasyona bırakılır. Daha sonra bu tüp içerikleri agar-agar besiyerine aktarılarak bir hafta gözlem yapılır. Mantar ve maya belirlenmesi: şişeden alınan 2mL örnek Segrétain malt ekstraktı içeren besiyerine aktarılır ve laboratuvar ortamında 2 hafta izlenir. Virüs inaktivasyon testi: test aşı emülsiyonuna fenol eklemeden β-propiyolakton ile inaktivasyondan 3 saat sonra gerçekleştirilir. Şişenin kapağını açmak kontaminasyonu artırabileceğinden özel bir tüp vasıtasıyla şişe içinden örnek alınır. Bu örnekler 14-16g ağırlığındaki 20 fareye intraserebral olarak verilir ve 14 gün boyunca gözlemlenir. 4 günden önce ölüm olmamalı ve bütün hayvanlar bu süreçten fazla yaşamalıdır. Eğer olağan dışı durumlar gözlenirse test daha çok liyofilize toz ile 40 hayvan üstünden yeniden tekrarlanır. Bütün hayvanlar yaşamalıdır aksi takdirde hazırlanan aşılar elemine edilir. FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ KOYUN BEYNİ AŞILARI Etkinlik ve stabilite testi: Habel testi uygulanır. Birinci testte +4°Cde bekletilen liyofilize aşılar farelere inoküle edilirken diğer testte 1 hafta boyunca +37°C’de bekletilen aşılarla fareler immünize edilir. Her iki testte de aşılar LD50 103 ‘e karşı korumalıdır. Kontaminantların belirlenmesi: iki genç koyun 0.5mL yeniden sulandırılmış aşı ile intraserebral olarak inokule edilir ve hayvanlar 3 hafta boyunca izlenir. Bu süreç zarfında hayvanlar sağlıklı kalmalıdır aksi takdirde test 4 hayvan üzerinden tekrarlanır. β-propiyolakton titrasyonu: β-propiyolakton tuzlu su içerisinde hemen hidrolize olacağı için titresini ölçülmesi önemlidir. En azından %80 aktif olarak bulunmalıdır. Aksi takdirde aşının son hazırlanma aşamasına kadar β-propiyolakton kalmaz. Bu titrasyonun belirlenmesi içinde Tylor&Bessing’in geliştirdiği yöntem kullanılmaktadır. Bu yöntemde test örneği içerisine koyulan çeşitli çözeltilerle titrasyon yapılır ve indikatör olarak nişasta kullanılır. Artık fenol içeriğinin belirlenmesi: kontaminasyonu önlemek amacı ile koyulan fenolün çoğu liyofilizasyon işlemleri sırasında elemine edilmektedir fakat yine de artıkların kalıp kalmadığı ya da ne kadar kaldığının belirlenmesi gereklidir. Kabul edilebilir aralık %0.1 gramdır. Testte aşı örneğine FolinCiocalteu ajanı eklenmesi ve bir takım laboratuvar işlemleri yapılmaktadır. Sonuta örnek için spektrofotometrede konsnatrasyonu bilinen fenol içeriğine karşı okuma yapılır. YENİDOĞAN RAT BEYİN AŞILARI Aşı hazırlamada en önemli noktalardan birisi aşının sadece optimum koşullarda değil bir takım çevre değişikliklerinde de etkinliğini uzun süre devam ettirebilmesidir. Bu özellikle acil durumlarda istenilen yere istenildiği anda antikuduz aşılarının gönderilebilmesinde dikkat çekmektedir. Sıvı antikuduz aşılarının saklama koşulları son kullanma tarihlerini de etkilediği için uzun süreli muahafazaları ve taşınmaları zordur. Bu nedenle dondurarak kurutma yöntemi bakteri ve virüs aşıları için uzun zamandır kullanılmaktadır. İlk deneme 1964 yılında Moskova’da gerçekleştirilmiş ve o günden beri sıvı aşılar içerisine stabilizör olarak sukroz eklenerek liyofilize edilmektedir. Fakat liyofilizasyonunda bazı komplikasyonlara neden olabildiğini saptanmıştır. Bu nedenle araştırmacılar yenidoğan rat beyinlerinde alerjensiz aşı üretim metodu geliştirmişlerdir. YENİDOĞAN RAT BEYİN AŞILARI Aşı hazırlanması • Liyofilize antikuduz aşı üretiminde 4-8 günlük yenidoğan ratlar kullanılmaktadır • İnfekte tavşandan alınan steril beyin süspansiyonu 1:100 dilüsyon olacak şekilde 0.03 mL dozda intraserebral olarak enjekte edilir • Yaklaşık 70-74 saat sonra hayvanlarda kuduz belirtileri görülmeye başlanır • Bu belirtilerden sonra hayvanlar öldürülür ve beyinleri çıkartılarak fenollü distile su içerisine koyulur • Ratlardan çıkarılan beynin bir kısmı sterilite testi için şekerli broth besiyerine alınır • Test tamamlanıncaya kadar da beyin +4°C’de tutulur • Test uygun çıkarda fenol içeren distile suda beyin homojenize edilir • Oluşan süspansiyon 22°C’de 14 gün boyunca virüs inaktivasyonu için inkübatörde çalkalayarak tutulur • Beyin süspansiyonunda bulunan virüs konsantrasyonu yenidoğan ratlarda daha yüksek olmaktadır. İnaktivasyonun başladığı ilk 3 günde infektivite yüksektir fakat daha sonraki günlerde düşer. YENİDOĞAN RAT BEYİN AŞILARI Dondurarak kurutma • Süspansiyon inaktivasyondan sonra %30 sukroz’lu distile ile dilüe edilir • Final konsantasryonda beyin süspansiyonu %10 olurken sukroz konsantasronu %7.5 olacaktır • Bu dilüsyonlar daha sonra dikkatlice ampullere doldurulduktan sonra ampuller -40°C ya da -50°C’de vakum altında dondurulurlar • Bu işlem yaklaşık 26-29 saat kadar sürer. İşlem sonunda ampullerde nem içeriği tayini yapılır Yapılan testler • Örnekler üzerinde sıvı aşılardaki gibi sterilite, güvenlik, infektivite ve immünojenite testleri gerçekleştirilir. Bunun için kuru toz üzerine 3mL serum fizyolojik eklenir. Tarihlendirme • Dondurularak kurutulmuş aşı üretimden sonra +37°’de 6ay , +4°C’de 18 ay saklanabilir. YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI Aşı formülü • Her 2mL’lik dozda, inaktive edilmiş virüs içeren 20g yenidoğan fare beyni, 1:1000 konsantrasyonunda fenol ve 1:10000 oranında tiomersal içermektedir. Virüs suşu • Bu aşının hazırlanması için kuduz virüsünün 3 suşu kullanılır. Kaynak hazırlanması • Kaynak stoklar daha önce kuduz virüsü ile inokule edilmiş yetişkin fare beyinlerinden elde edilen %20’lik süspansiyonlardan hazırlanırlar. Bu süspansiyonlar 0.5mL hacimlerde liyofilize edilir ve -20°C’de 5 yıl saklanabilirler. Çalışma süspansiyonunun hazırlanması • Her bir suşla infekte edilmiş yetişkin fare beyni %2 at serumlu, her mL’sinde 200IU penisilin ve 200µg spreptomisin içeren distile su içerisinde %20’lik süspansiyon hazırlanır. Hazırlanan süspansiyonlar küçük şişelerde -30°C’den -70°C’ye düşen sıcaklıklarda saklanır. YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI Viral kontaminantlar için testler • Aşı süspansiyonlarının kuduz virüsünden daha çok nörotropik virüslerle kontamine olup olmadığının belirlenmesi için; 1:10 dilüsyonluk süspansiyondan 0.5mL alınarak dilüe edilmemiş antikuduz hiperimmün serum ile 90 dakika 37°C’de inkübasyona bırakılır • Serumlar fareler dışında diğer hayvanlarda oluşan virüs ile immünize tavşan ya da atlarda hazırlanmaktadır • Serum içeren süspansiyon karışımı intraserebral olarak 8 yenidoğan faresine 0.01mL dozda, 3-4 haftalık farelere de 0.03mL dozda inoküle edilir • İnoküle hayvanlar bu aşamadan sonra 30 gün yaşamalıdır. İnokulum hazırlama • İnokulum hazırlamak için çalışma süspansiyonundan elde edilen süpernatant sıvı kısım steril olmalıdır ve içerik olarak LD50 100 oluncaya kadar dilüe edilir. YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI İnokulasyon ve Harvest • En fazla 4 günlük olan yenidoğan farelere 0.01mL inokulum intraserebral olarak inokule edilir • Virüs canlılığını belirlemek için 14-16g’lık 10 fareye 0.03mL intraserebral olarak enjekte edilir • 14 gün içinde bütün fareler kuduz belirtilerini göstermelidir • Bu süreç zarfında fareler sağlıklı kalmış ise enjeksiyon tekrarlanmalıdır. • Yaklaşık inokulasyondan 96 saat sonra (inkübasyona bitiminden 1 gün önce) tüm fareler eter ya da kloroform kullanılarak öldürülür • Beyin hijyenik koşullar altında dikkatlice çıkarılır • Elde edilen beyinler tartılır. Tartımlarda genellikle 0.20 ile 0.25 g beyin dokusu elde edilir. Eğer materyal hemen kullanılmayacaksa -20 ya da -30°C’de saklanmalıdır. YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI Aşının hazırlanması • Aşının hazırlanmasından hemen önce beyin dokuları kısım kısım oda ısısında çözündürülür • Soğuk distile su içine aktarılan dokular parçalayıcıya aktarılarak homojen bir karışım oluncaya kadar parçalanır. Virüs Titrasyonu • Süpernatant sıvısındaki virüs titrasyonu farelere seri dilüsyonlar halinde intraserebral inokulasyon ile belirlenir • Kabul edilebilir virüs titrasyonu 106.3 ve 107.3 olarak belirlenmiştir. Viral kontaminantları belirleme testi • Çalışma süspansiyonunda yapılan testlerle aynıdır. YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI Bakteriyal kontaminantları belirleme testi • UV ışını ile inaktivasyondan önce bakteriyal kontaminantların olup olmadığı belirlenir • 9mL tiyoglukat broth içeren 5 ayrı tüpe süspansiyondan 1 mL inoküle edilir • Birinci tüp el ile çalkalandıktan sonra ikinci seri bir 5 tüpe bu tüplerden 1’er mL aktarılır • Bu dilüe etme işlemi dilüsyon oranı 10-6 olana kadar devam edilir • Tüm tüpler 7 gün boyunca gözlemlenir • İnsanlara uygulama aşamasında gözlenecek bakteriyel büyüme 10-2 dilüsyonu geçmemelidir • UV ışını bakteriyel kontaminasyonu engelleme gücü olsa bile yüksek kontaminasyon durumları tehlikelidir. İnaktivasyon • %10’luk süspansiyona iki kat soğuk distile su koyularak %5’lik süspansiyon elde edilir. Bu süspansiyona daha sonra UV ışınına maruz bırakılır. YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI Güvenlik testi • 18-20g ağırlığındaki 10 fare UV ışınından geçirilmiş 0.03mL aşı ile intraserebral olarak inoküle edilir • İki adet tavşanda 0.25mL aşı ile inoküle edilir. İnoküle edilen tüm hayvanlar en az iki hafta boyunca izlenir. Bu süreç içinde hiçbir hayvanda kuduz belirtisi ya da santral sinir sistemi ile ilgili semptomlar göstermemelidir. Aşıda son dilüsyon • UV ışınından hemen sonra %5’lik aşı süspansiyonuna yeterli miktarda tiomersal ve fenol bulunan distile su ile 4 kat dilüe edilir. Fenol tiyomersal steriliteyi sağlamanın yanında sinir dokusu enzimlerine karşı antijenlerden korunmak için kullanılır. Aşı kütlesinde sterilite testi • Her bir flasktan alınan 1mL örnek 4 tüp tiyoglukat broth ve 4 tüp Sabouraud’s agar’a inoküle edilir. tüplerin bir kısmı 7 gün boyunca 37°C’de, diğer kısmı 22°C’de inkübasyona bırakılarak gözlemlenir. Etkinlik testi • İmmünojenik etkinlik Habel testi ile ya da uygun referans standart ulaşılabilirse NIH testine göre belirlenir. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI Aşı formülü • Bu aşı doğumdan sonra 24 saat geçmeden kuduz virüsü ile inoküle edilen yenidoğan tavşan beyninin UV’den geçirilmiş %5’lik süspansiyonudur • Bu süspansiyon %2 Mcllvain tamponu (pH:7.2) ve %5 laktoz içermektedir • 2mL’lik tek dozluk liyofilize tozlar halinde bulunur ve sulandırılırken %0.01 tiomersal bulunan distile su kullanılır YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI Virüs • Kuduz virüsünü Pastör suşu kullanılır • Suş 2 ayda bir yetişkin tavşan beyninde pasajlanır • İnfekte beyinler %70’lik gliserolde -15°C’de saklanır • Denetim altındaki tavşanlar, %2’lik at serumunda tutulan infekte yetişkin tavşan beyninin %0.1’lik süspansiyonu ile intraserebral olarak inoküle edilir • Hayvanlar inokülasyonun 6. ya da 7. gününde tam felç belirtileri gösterdiğinde öldürülür • Beyinleri çıkarılır ve sterilite testi için örnekler alınır • Diğer işlemler için beklerken birkaç dakikalığına %70’lik gliserolde 15°C’de saklanabilir. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI İnokulum • İnokulum son stok virüslerden elde edilir. çıkarılan beyin distile suda yıkanır • %2’lik at serumu içeren distile su içerisinde emülsifiye edilerek %10’luk süspansiyon elde edilir • %10’luk süspansiyon sterilite testi için kullanılır. Ayrıca küçük parçalar halinde havasız ortamlarda -70°C’de saklanır ve kaynak virüs olarak kullanılır • Taze inokulum, her bir %10’luk süspansiyondan %2’lik at serumu ile 10-3 dilüsyon yapılarak hazırlanır. İnokulasyon • İnokulasyon için denetim altındaki yenidoğan tavşanlar kullanılmaktadır • Tavşanlar annelerinden ayrı olarak 30-32°C’lik havalandırmalı inkübatörlerde tutulurlar • Süt ve yumurtadan oluşan yiyeceklerle oral olarak pipet ile günde 2 kez beslenirler • Yenidoğan tavşanlar kulak ve göz arasında kalan bölgeden kafatasına açılan bir delikten 24 saat geçmeden kuduz virüsü ile inoküle edilirler. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI Harvest • İnfekte tavşanlar inokulasyonun 3. gününden itibaren felç belirtileri göstermeye başlarlar • 4. Ve 5. günde tam bir paraliz olan tavşanlar karbondioksit gazı ile öldürülürler. Bu zaman içinde kendileri ölen hayvanlar kesinlikle kullanılmaz • Kafatası dikkatlice ayrılan tavşanların beyinleri küçük steril kaplara aktarılır ve bakteriyolojik testleri gerçekleştirilir • Kontamine beyinler çalışmadan çıkarılır. Uygun kısımlar geciktirilmeden cam şişe içerisinde 20°C’ye alınır. Aşının Hazırlanması • Çalışmaya başlamadan ilk önce çıkarılan beyinler darası alınmış şişe ile birlikte tartılır ve çözünmesi beklenir • Şişenin etrafı pamukla sarılır ve el ile şişe birkaç dakika çalkalanır. Daha sonra şişe içerisine eklenen % 2’lik Mcllvain tamponu içerisinde 1 saat çalkalayıcı üzerinde homojenizasyon yapılır • Daha sonra eklenen Mc Ilvain tamponu ile son süspansiyon %10’luk hale getirilir. Hazırlanan süspansiyonlar UV ışık altında inaktive edilir • İnaktive edilen aşı süspansiyonundan sterilite ve güvenlik testleri için örnekler alınır. Daha sonra 2mL’lik süspansiyonlar halinde ampullere doldurulur ve liyofilize edilir. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI Mc Ilvain tamponu hazırlanması (%2) • Çözelti A: 21g Sitrik asit 1000mL distile su içerisinde çözündürülür. • Çözelti B: 35.6g Sodyum hidrojen fosfat 1000mL su içerisinde çözündürülür. • 17.65mL Çözelti A’dan 82.35mL çözelti B’den alınarak karıştırılır. Bu karışım üzerine 50 kat distile su eklenerek %2’lik tampon hazırlanır. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI Virüs Süspansiyonunun Test Edilmesi Kimlik belirleme • 1:10 oranında inaktive edilmiş kuduz serumu ile 1:10 oranında virüs süspansiyonu 37°C’de su banyosunda 1 saat inkübasyona bırakılır • 11-14g ağırlığındaki 5 fare 0.03mL süspansiyon ile inokule edilir • Bir diğer grup fare ise normal serum ile karıştırılmış virüs süspansiyonu ile inokule edilir • ilk gruptaki 5 fareden en az 4’ü yaşarken ikinci gruptaki tüm fareler ölmelidir. Virüs titrasyonu • UV ışınından önce, virüs süspansiyonu %2’lik normal at serumu içeren distile su içerisinde 10-3,10-4, 10-5, 10-6 ve 10-7 olacak şekilde dilüe edilir ve her dilüsyon için 10 fare inokule edilir. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI UV Işınından geçirilmiş Aşı Süspansiyonunda Testler Sterilite testi • Örnek içinden 30mL test için kullanılır. Tarozzi besiyeri içeren 2 ayrı tüpe birkaç damla virüs süspansiyonu inokule edilir • Sabouraud besiyeri içeren 6 tüpe de 1’ermL örnek inokule edilir • Bu 6 tüpten bir tanesi de ek olarak 50 CFU(Colony Forming Unıty) Candida albicans ile inokule edilir. sıvı tiyoglukat içeren 2 ayrı flaska da aşı kütlesinden inokulasyon yapılır. • Aşılar 37°C’de 7 gün Tarozzi besiyerinde, 18-25°C’de 14 gün Sabauraud besiyerinde ve 30°C’de 7 gün tiyoglukat besiyerinde tutulur. Büyüme kontrolü Candida albicans ile yapılır Güvenlik testi • 18-20 g ağırlığındaki 10 fare ve 1.5-2kg ağırlığındaki 2 tavşan intarserebral olarak UV ışınından geçirilmiş aşı ile inokule edilir • inokule edilen tüm hayvanlar en az iki hafta boyunca ne felç belirtisi ne de sinir sistemi ile ilgili bir hastalık göstermemelidir. YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI Liyofilize Aşıda Yapılan Testler Sterilite testi; Son taşıyıcı kapları içerisindeki liyofilize tozlarda gerçekleştirilir. Örnek olarak en az 10 kap seçilir ve distile su ile sulandırılır. Sulandırılan aşı süspansiyonları tiyoglukat, Tarozzi ve Sabouraud besiyerine inokule edilir ve bakteriyolojik büyüme gözlemlenir. Zararsızlık testi; 20g ağırlığındaki 4 fare ve 350g ağırlığındaki 2 kobay intraperitonel olarak yeniden sulandırılan aşı süspansiyonu ile inokule edilir. Tüm hayvanlar en az 7 gün herhangi bir hastalık belirtisi göstermemelidirler. Etkinlik testi; NIH testi ile yapılır. Yeniden Sulandırma Ve Dozajlama; Liyofilize aşı içinde %0.01 tiomersal içeren 2mL distile su ile sulandırılır. 2mL’lik doz, %5 beyin dokusu içermektedir ve 14 günlük doz olarak kullanılır. Saklama; Liyofilize aşılar üretici tarafından -10°C’de en fazla 18 ay saklanabilir. Son kullanım tarihi yayın tarihinden itibaren 6°C’nin altında saklandığı sürece 6 ay’dır. Serolojik Cevap; İnsanlarda 14 günlük tedaviye karşı antikor cevabı nötralizasyon ya da kantitatif indirekt immünofloresans yöntemi ile test edilmelidir. Tedavi edilen tüm hastalarda belirgin bir cevap olmalıdır. • çeviri 1.flv Monoklonal Antikorlar • Yard.Doç.Dr. Gülay Büyükköroğlu • • Hazırlayan ANADOLU ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ FARMASÖTİK BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI
