Avery, MacLeod, and McCarty Deneyi

BİO 304 Moleküler Genetik
Dr. Hatice Mergen
Genetik Materyalin Özellikleri
Replikasyon
Bilgi depolama
Depolanmış bilgiyi ifade etme
Mutasyonlar ile varyasyon sağlama
Genetik Materyal hangi moleküldür?-Protein mi?
DNA mı?
•
•
•
•
•
•
1. Hücrelerin kuru ağırlığının % 50’sini proteinler oluşturur.
2. Tetranükleotid hipotezi : 1900’lerin başından ortalarına
kadar kabul edilmiş bir hipotezdir.
– *1868-Friedrick Miescher, hücrelerin stoplazmasından
çekirdeklerini ayırmış ve bunlardan “nüklein” olarak
adlandırdığı asidik bir madde elde etmiştir.
– Nüklein çok miktarda fosfor içerirken hiç protein
yapısında yer alan kükürdü hiç içermez.
(Phoebus Levine, 1910)
– 4 nükleotid tekrarı 1:1:1:1 oranı,
– tek kovalent bağla bağlı tekrarlar basit olduğundan
varyasyon için uygun değildi
– Proteinler 20 aa içeriyordu ve farklılık için uygundu
– Sonuç olarak bu spekülasyon için protein görüşü ağır
basmıştır ancak
3. 1940’lardan önce çoğu genetikçi aktarım genetiği ve
mutasyon çalışmaları ile uğraşmıştır. Bu nedenle genetik
materyal nedir kaygısı geri plana itilmiştir.
1910-1930 tetranükleotid hipotezi geçerli
1940- Chargaff’s Rules- birçok organizma için 1:1:1:1 oranı
doğru değildir.
Genetik Materyal DNA’dır
• Frederick Griffith- 1927 yılında İngiliz Sağlık Bakanlığı
memuru iken
Diplococcus pneumoniae ile yaptığı
transformasyon deneylerinde ilk kanıtları ortaya koymuştur.
• Avery, MacLeod, ve McCarty (1944)-”transformasyon
prensibi”nin kimyasal doğası ile ilgili makaleleri DNA’nın
genetik materyal olarak kabul edilmesinde ilk adım
olmuştur.
• Hershey ve Chase (1952)-bakteriyofaj T2 deneylerinde
DNA’nın genetik materyal olduğunu ikinci kez
ispatlamıştır.
Frederick Griffith’s Transformation Experiment - 1928
•
Diplococcus pneumoniae- insan ve sıçanda zatürre etkeni
•
Virülant (hastalık oluşturma etkeni)- polisakkarit kapsül yapısı
içerir.Fagosirtik hücrelerce kolay parçalanmaz. Agar kültüründe parlak, düz
(smooth:S) koloniler oluşturur.
•
Avirülant -Kapsülsüz, hayvanın dolaşım sisteminde fagositik hücreler
tarafından hızla alınıp parçalanır. Pürüzlü (rough:R) koloniler oluşturur.
•
Her bir diplococcus suşu serotip olarak adlandırılır. Serotipin özelliği kalın,
ypışkan kapsüldeki polisakkarit içeriğinin ayrıntılı kimyasal yapısından
kaynaklanır. İmmunolojik teknikler ile tanımlanırlar ve romen rakamı ile
gösterilirler.
• Tip I ve II Amerikadaki en yaygın zatürre etkeni
• Griffith Tip II ve III’ü kullanmıştır.
Fig. 2.2: Frederick Griffith’s Transformation Experiment - 1928
“transforming principle” demonstrated with Streptococcus pneumoniae
Griffith hypothesized that the transforming agent was a “IIIS” protein.
• Ölü sıçanların kanındaki IIIS bakteriler , polisakkarit kapsül açısından,
ısı ile öldürülmüş hücrelerden elde edilen IIIS suşuna benziyordu.
• Canlı, avirülant IIR bakterilerin zerk edildiği kontrol sıçan sağlıklı İSE
– 1.IIS hücrelerinin mutasyona uğrama olasılığı ortadan kalkar
– 2. Canlı IIR ve ısı ile öldürülmüş IIIS hücreleri arasında bir
etkileşim olmalıdır.
» Bu etkileşimi “transformasyon” olarak adlandırdı.
Transformasyon gerçekleştiren ana maddenin
polisakkarit kapsülün bir kısmı yada kapsül
sentezinde rol alan bir bileşik olabileceğini önerdi.
• Griffith’in çalışmaları
• 1931- in vitro test tüpünde Dowson
tarafından
• 1933- Alloway ve ark tarafından
doğrulandı.
Oswald T. Avery’s Transformation Experiment - 1944
• Transformasyon yapan maddeyi saf olarak elde etmiş ve bu molekülün
DNA olduğunu kanıtlamışlardır.
• İzolasyon için, IIIS virülant hücreleri büyük ölçekli (50-75 litre) olarak
üretmişlerdir.
• Santrifüj-->ısı ile öldürme işlemi-->homojenizasyon-->
transformasyon kapasitesinde olduğu düşünülen çözünür süzüntü-->
kloroform--> proteinleri süzüntüden ayırma-->enzimatik olarak
polisakkaritleri ayırma-->etanol ile çöktürme-->ipliksi çökelek (10-25
mg aktif faktör)
• RNAase, Proteaz, Dnase ile muamele
Avery, MacLeod, and McCarty Deneyi
Oswald T. Avery’s Transformation Experiment - 1944
“IIIS” DNA Griffith’s sonuçlarındaki genetik materyaldir (RNA
değil).
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Avery ve arkadaşları yayınladıkları makalede
• “Sunulan kanıtlar, deoksiriboz tipinde bir nükleik asidin, Pneumococcus
Tip III’de transformasyon
desteklemektedir” demişlerdir.
prensibinin
temel
birimi
olduğu
• Bu tip nükleik asitler yalnız yapısal olarak önemli değil, aynı zamanda
pnömokok hücrelerinin karakteristik özelliklerini ve biyokimyasal
yapılarını da saptamada fonksiyoneldir.
• Transformasyon maddesi bir dizi enzimatik reaksiyon ile IIR hücreleri ile
etkileşime girerek IIIS kapsül polisakkaritinin sentezine yol açmaktadır.
• Transformasyon bir kez gerçekleşince kapsül polisakkariti diğer
kuşaklarda da sentezlenir yani transformasyon kalıtsaldır.
Hershey-Chase Bacteriophage Experiment - 1953
E.colinin
konakçısı
olduğu
virüslerden T2 fajı ile çalışmışlardır.
Kısaca faj olarak adlandırılan virüs,
çekirdek (kor) DNA’yı çevreleyen
protein bir kılıf içerir. Altıgen bir baş
ve kuyruk kısmı vardır.
Fig. 2.4
Structure of T2 phage
Fig. 2.5: Life cycle of virulent T2 phage:
• Hershey ve Chase faj üremesini tanımlamak için yaptıkları
deneylerde şu sonuçları elde ettiler.
• T2 fajları yaklaşık % 50 protein ve % 50 DNA içeriyordu.
• Enfeksiyon fajın kuyruk liflerinin bakteri hücresine
yapışması ile başlıyordu.
• Yeni virüs partikülleri bakteri hücresinde üretiliyordu.
• Görünüşe göre fajın DNA ve/veya protein bileşeni bakteri
hücresine girerek viral üremeyi yönlendiriyordu. Bu
bileşen hangisi idi?
Fig. 2-6: Hershey-Chase Bacteriophage Experiment - 1953
1.
•
Bunun için
E.coli
hücreleri
32P
yada 35S bulunan
ortamlarda üretilip ardından t2 virüsü ile
enfekte edilirse sırasıyla radyoaktif
işaretli DNA ve proteinler ortaya çıkar.
•
•
Label DNA with 32P
Label Protein with 35S (Şekil a 1,2
)
3.
İki farklı tipte işaretlenen T2 fajı ile E.c
oli enfekte edilir.
4.
32P
bakteri ve progeny fajında
gözlenirken, 35S bakteride bulunmaz
ancak faj çökeltisinde gözlenir.
1969: Alfred Hershey
Hershey-Chase Experiment
• Hershey ve Chase’in deney sonuçlarına göre;
• Fajın protein kısmı konakçı hücrenin dışında kalmaktave
yeni fajların oluşumunu yönlendirememektedir.
• Faj DNA’sı ise konakçı hücreye girer ve fajın çoğalmasını
sağlar.
• Kalıtsal materyal DNA’dır.
Transfeksiyon Deneyleri
•
•
•
Hershey-Chase sonrası bakteri virüsleri ile yapılan çalışmalar;
1957- E. Coli+lizozim= bakteri hücre duvarı yıkılır, sadece hücre zarı kalır
( Bu yapıya sferoplast yada protoplast denir)
•
John Spizizen ve Dean Fraser, sferoplastlar kullanıldığında, parçalanmış T2
partiküllerinin de faj üremesini başlatabileceğini göstermişlerdir.
•
1960- George Guthrie ve ark. OX 174 fajından DNA (halkasal, 5386 bç)
saflaştırıp E coli protoplastlarına ilave etmişlerdir. Tam bir bütünlüğe saip
oX174 bakteriyofajlarını elde etmişlerdir. Böylece olgun virüs üretimi için
gerekli bilgiyi DNA’nın tek başına taşıdığı kesin olarak gösterilmiştir.
•
Sadece viral nükleik asit kullanılarak başlatılan bu enfeksiyon işlemine
“transfeksiyon” denir.
DNA’nın ökaryotlarda genetik materyal olduğunun kanıtları
• Indirekt
– DNA’nın Dağılımı
– Mutasyon oluşturma
• Direkt
– Recombinant DNA Technology
– Transgenics