talasem de prenatal tanıda kar ıla ılan güçlükler ve prenatal tanı

5. Uluslararası Talasemi Yazokulu
5th International Thalassemia Summerschool
TALASEMDE PRENATAL TANIDA KARILAILAN GÜÇLÜKLER VE
PRENATAL TANI YÖNTEMLERNDE GELMELER
Prof. Dr. Ferda Özkınay
Hacettepe University Department of Pediatrics, Pediatric Hematology Unit, Ankara, Turkey
e-mail: f.ferda.ozkinay@ege.edu.tr
ABSTRACT
Prenatal diagnosis is the defining of abnormalities before birth using prenatal diagnostic tests.
The type of genetic prenatal test depends on the inheritance pattern of the genetic disease.
Thalassemias are autosomal recessively inherited monogenic diseases. Therefore molecular
genetic tests are performed for the prenatal diagnosis of them.
Although numerous molecular DNA analysis techniques have been developed there are, still, a
number of difficulties in their rutine prenatal applications for thalassemia.
The problems encountered in the management of prenatal diagnosis of thalassemia can be
divided into two groups in our country : 1. Socio-economic problems 2. Scientific problems.
Main socio-economic problems are:
not to have a health insurance
not to accept being a carrier of a genetic disease
difficulties in finding an appropriate health care center for molecular diagnosis
reluctance to having molecular test despite knowing their carrier situation
not to accept invasive prenatal procedure
to be against pregnancy termination in case of diagnosis affected fetus
Scientific problems in thalassemia prenatal diagnosis are:
Insufficient genetic counseling during initial diagnostic procedure (in first step health care centers)
Insufficiency in the health care service of tertiary health care centers due to the difficulties in
finding educated physicians who have ability to perform all prenatal diagnostic procedures for
thalassemia.
Difficulties in the interpretation of the molecular test results
Difficulties in excluding maternal contamination
Different conventional molecular techniques have been performed in thalassemia prenatal
diagnosis in molecular laboratories. Among those allele specific oligonucleotide probe (ASO),
amplification refractory muatation system (ARMS), restriction enzyme analysis and sequencing are
the most commonly used techniques. Each technique has its own advantages and
disadvantages. In some cases to use more than one technique is required for the diagnosis.
Recently a number of new techniques have been introduced to the area of prenatal diagnosis for
thalassemia. Microarray systems, multiple ligation probe analysis (MLPA), real time PCR are the
respectively new, rapid and accurate techniques that make the molecular diagnosis easier in
ordinary cases and possible in some difficult.
Since the conventional invasive procedures performed to obtain fetal material may cause fetal
loss, an intensive effort has been spent to develop noninvasive technique. Different scientific
groups have tried to develop molecular diagnostic methods for genetic disease using Cell-free
fetal DNA and fetal cells in the maternal circulation. Promising results have been obtained for beta
thalassemia molecular diagnosis in some of these studies.
53
PROF. DR. FERDA ÖZKINAY
Prenatal Tanı, doumdan sonra oluma olasılıı olan herhangi bir anomalinin doumdan önce
prenatal tanı testleri yardımıyla tanımlanmasıdır.
Doum öncesi tanıda kullanılacak genetik testin cinsi, fetusun risk içinde olduu genetik hastalıın
kalıtım biçimine göre deiir.
Tablo: Genetik hastalık grupları ve bu gruplara göre kullanılan genetik tanı testleri
Genetik Hasalıklar
Tanı Yöntemleri
Tek gen hastalıkları
Moleküler genetik
Kromozom bozuklukları
Sitogenetik,
moleküler
moleküler genetik
Moleküler genetik
Multifaktöriyel-poligenik kalıtılan hastalıklar
sitogenetik,
Mitokondrial kalıtımla geçen hastalıklar
Moleküler genetik
Somatik mutasyonlar
Sitogenetik,
moleküler
moleküler genetik
sitogenetik,
Talasemiler genetik hastalık grupları içinde tek gen hastalıkları grubuna gire. Tek gen hastalıkları
Mendel kurallarına göre kalıtılan hastalıklardır. Talasemiler otozomal resesif kalıtılır. Ancak son
yıllarda moleküler çalımalarla nadir olarak otozomal dominant kalıtılan talasemi aileleri de tarif
edilmektedir. Hem hem de talaseminin aır formları yaam kalitesini oldukça bozan ve yaam
süresini kısaltan klinik tablo oluturdukları için doum öncesi tanı ile gebelik terminasyonuna
gidilmesi etik kabul gören hastalıklardır. Talasemilerin tanısı ve prenatal tanısında moleküler genetik
analiz yöntemleri kullanılır.
Fetus günümüzde hakları olan bir hasta konumuna gelmitir. Pek çok genetik hastalıkta olduu
gibi talasemi riski taıyan fetüsde de yapılacak her türlü prenatal giriim ve tanı için izlenecek yol
etik ve yasal olmalıdır.
Talasemide kullanılan prenatal tanı yöntemleri oldukça gelitirilmi olmasına ramen, uygulamada
birçok güçlükle karılaılabilmektedir.
Ülkemizde talasemide prenatal tanıda karılaılan güçlükler iki ana grupta özetlenilebilir:
a. Sosyal ve ekonomik güçlükler
b. Bilimsel güçlükler
54
TALASEMDE PRENATAL TANIDA KARILAILAN GÜÇLÜKLER VE PRENATAL TANI YÖNTEMLERNDE GELMELER
Bu iki grubu kesin bir ekilde birbirinden ayırmak mümkün deildir. Birçok durumda birbiri ile
etkileim içindedirler.
A. Ülkemizde talasemi prenatal tanısında karılaılan sosyal ve ekonomik güçlükler
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Salık güvenlik kurumuna dahil olmama
Genetik hastalık taıyıcılıını kabullenmemek
Salık kuruluuna ulamada güçlük
Taıyıcı olduklarını bildikleri halde mutasyon analizi yaptırmayı ihmal etme
Prenatal tanı ilemini kabul etmeme
Hasta fetus için gebelik terminasyonuna karı olma
B. Ülkemizde talasemi prenatal tanısında karılaılan bilimsel güçlükler
1- Prenatal tanı öncesi genetik danıma almada güçlükler
Talasemi için taıyıcılık riski, taıyıcıların hasta çocuk sahibi olma riskleri hakkında birinci basamak
salık hizmetleri kapsamında bilgi verilebilmeli, prenatal tanı planlanması durumunda ise olgular
uzman bir ekipten genetik danıma almalıdır.
Bu amaçla bütün tıp fakültelerinde ayrıntılı olarak talasemi konusuna önem verilmeli, birinci
basamakta hizmet veren pratisyen hekimler sorunun farkında olarak, yapılacakların neler olduunu
bilerek tıp fakültesinden mezun olmalıdır. Bu konudaki eitimin standardizasyonu fakülteler arası
eitim konseyi toplantılarında tartıılarak organize edilebilir.
Genetik danıma, genetik hastalık riski taıyan kii ve yakınlarının, hastalıın özellikleri, hasta olma,
hastalıı taıma veya sonraki kuaklara geçirme olasılıkları hastalıın önlenmesi hastalıktan
kaçınma yolları ve varsa tedavisi konularında bilgilendirilmesidir. Genetik danıma basamakları: 1.
öykü alma ve aile aacı çizme, 2. Klinik muayene, 3. Kesin tanı ve tanının dorulanması, 3.
Danıana danıman tarafından bilgi verilmesi, 5. izlem dir. Öykü alma ve aile aacı çizme
basamaında talasemi için ailenin kökeni, ailede talasemi ve benzeri tablo gösteren kiilerin olup
olmadıı soruturulur. Evrensel semboller kullanılarak çizilen aile aacı en az üç kuaı içermelidir.
yi çizilen bir aile aacı doru risk hesaplaması yapmayı ve risk içinde olanların belirlenmesini
salar. Ülkemizde birnci basamak için aile aacı oluturma eitimi yeterli görünmemektedir.
Ayrıca birçok tıp fakültesinde genetik ve özellikle moleküler genetik dersleri, yeterli olmadıı veya
klinik tablolar ile iliki yeterli olarak anlatılamadıı için talasemi ailesi ile ilk karılaan kii olan
pratisyen hekim, temel moleküler kavramları anlamakta ve aileye aktarmakta bazı zorluklar
yaamaktadır. Örnein bileik heterozigotluk (compound heterozygosity) iki gen kopyasında ayrı
mutasyonların taınması demektir ve her iki kopya da bozuk protein kodladıı için hastalık tablosu
ortaya çıkar. Bu durumun birinci basmakta hizmet veren hekimlere kavratılması gerekir.
55
PROF. DR. FERDA ÖZKINAY
I
I
II
ekil 1. deal bir aile aacı en az üç kuaı kapsamalıdır.
Birinci basamakta talasemide akrabalık olduunda taıyıcı çiftlerde aynı mutasyon olma olasılıı
yüksek olmakla birlikte toplumumuzda taıyıcılık yüksek olduu için farklı mutasyonlar da
taınabilecei bilinmeli. Her iki taıyıcı ete de mutlaka mutasyon tayini yapılmalıdır. Ayrıca çocuk
planlayan taıyıcı çiftlerde mutasyonun bilinmesi zorunludur. Çiftlerde mutasyon analizi ideal olarak
gebe kalmadan önce yapılır. Bazı hastalarda mutasyon analizleri uzun sürebilir ve gebelik
esnasında yapılması gebeliin ilerlemesine ve eer hasta bir fetus var ise terminasyonun etik ve
yasal dönemlerde yapılamamasına neden olabilir.
2-Prenatal tanı uygulanacak olguların ayrıntılı genetik danıma ve ilemler için uygun
merkez bulamamaları
Prenatal tanı uygulanacak çiftler, talasemide deneyimli
- Hematolog
- Genetik uzmanı
- Kadın - doum uzmanı
- Psikolog
bulunan bir ekip tarafından deerlendirilmeli ve izlenmelidir. Ülkemizde talasemide deneyimli böyle
ekiplerin bulunduu merkez sayısı imdilik yeterli olmamakla birlikte, bu konuda organizasyon
çalımaları sürmektedir.
Prenatal tanı uygulanacak olan çiftler mutlaka genetik uzmanından genetik danıma almalıdır.
Prenatal genetik danımada,
• Talasemi için fetal materyal elde edilme seçenekleri
• Uygulanacak ilemin riskleri
• DNA analizi yanında sitogenetik çalımanın önemi
• Sonuçla ilgili olasılıklar
anlatılır.
Fetal materyal elde etmede klasik olarak koriyonik villus biyopsisi (CVS), amniyosentez,
kordosentez gibi invazif yöntemler kullanılır. CVS 9-12 gebelik haftasında, amniyosentez 14-16.
gebelik haftasında, kordosentez ise 18-22 gebelik haftasında yapılır. Erken gebelikte yapıldıı için,
talasemi için fetal materyal elde etmede en uygun ilem CVS olarak kabul edilir. Bu ilemler bu
56
TALASEMDE PRENATAL TANIDA KARILAILAN GÜÇLÜKLER VE PRENATAL TANI YÖNTEMLERNDE GELMELER
konuda deneyimli bir kadın hastalıkları ve doum uzmanı tarafından yapılmalıdır. Ülkemizde bu
ilemlerin tümünün her merkezde uygulanamadıı, özellikle CVS yapılmasında yeterli eitimli
uzman olmadıı görülmektedir.
Bazı aileler çeitli nedenlerle son yıllarda uygulanmaya balayan preimplantasyon genetik tanıyı
(PGT) seçmek istemektedir. Talasemi için PGT uygulatyan merkezlerin sayısı çok azdır. PGT ilemi
özel genetik danımayı ve bu konuda eitim almı bir ekip çalıması gerektirir.
3-Talasemide moleküler genetik yorumlama zorlukları
Prenatal genetik danımada globin genleri ve düzenleyici bölgelerindeki kompleks yapılanmaların
fenotipi etkileyebilecei söylenmelidir. Hem hem de globin zincirlerini kodlayan genlerin
bulunduu bölgeler karmaık bir yapıya sahiptir. Bu bölgelerde pseudogenler ve embriyonal
dönemden postnatal yaamın sonuna kadar deiik dönemlerde aktif olan ve olmayan genler
vardır. Fenotipi etkileyen bazı moleküler ilikilerin açıklanması için literatür henüz yetersizdir ve
yayınlanmı olgu sayısı azdır. Ayrıca kesin tanıya ulamak ve genetik danıma için en ileri düzeyde
veri toplamak için izlenecek yol haritasını uygulamada olanaklar yetersizdir. Talasemilerde tanıda
izlenecek yol haritası tablo 2 de verilmitir.
Tablo 2: Talasemide hemoatolojik çalımalarda yol haritası
MCV
MCH
Hb
>78
>27
A
A2<%3
Normal
< 78
< 27
A
A2>%3,5
F %0.1-7
< 78
< 27
A
A2<%3,5
Taıyıcı
Fe tayini
Sık mutasyonlar
için DNA analizi
Fe eksiklii
< =78
< =27
A
A2<%3
F %2-30
Kantitaif HbF, F
hücre daılımı
Normal
HbH inkülizyonları
gen analizi
Demiri tamamla
Tekrar test yap
talasemi
HPFH
talasemi
taıyıcısı
Dorulayıcı test
Oraklama+
HbS
DNA analizi
Tanımlanmamı
mutasyonların
analizi
Varyant Hb
Oraklama -
Hb C,D,E
Hb O Arab
Hb Lepore
talasemi
taıyıcısı
Dier
Gerekirse
leri
aratırma
gen analizi
+ tal. taıyıcı
taıyıcı
Normal Hb A2
Tablo 2 de verilen yol haritasında tanı için yapılması önerilen tetkiklerin hepsinin, eksiksiz olarak
yapılabildii merkez sayısı ülkemizde çok azdır.
Talasemide mutasyon saptanamaması riski düürmekle birlikte ortadan kaldırmaz. globin gen
bölgesinde >1000 deiiklik tarif edilmitir. Birçok laboratuar bunların tümünü test edememektedir.
Prenatal genetik danıma sırasında ayrıca %100 sensitif ve %100 dorulukta test olmadıı
57
PROF. DR. FERDA ÖZKINAY
belirtilmelidir. Moleküler tanıda DNA dizi analizi gold standart olarak belirtilmektedir. Fakat, özellikle
teknik nedenlerle heterozigotları tanımak zor olabilir. Nadiren talasemiler globin genlerinden farklı
bölgelerdeki defektler sonucu olabilir ve dizisi yapılan bölgede bulunmayabilir, ayrıca bir alleldeki
büyük delesyonlar veya primer balanma bölgesindeki delesyon/nokta mutasyonları nedeniyle
PCR ile DNA çoalmayabilir ve yanlı tanıya yol açar.
Prenatal genetik danımada genotipe göre fenotipi tahmin zorlukları olduunu yukarıda belirtmitik.
Beta talasemide fenotipi etkileyen moleküler özellikleri 3 grupta toplamak mümkündür. 1. Primer: globin gen mutasyonları 2. Sekonder:Globin sentezinde rol alan dier genler. 3. Tersiyer: Globin
sentezi dıında hastalıın komplikasyonları üzerine etkili genler
Primer olarak beta talasemi mutasyonun kendi özellii fenotipi etkiler. Mutasyonlar gizli, hafif ve
aır mutasyon olarak taıyıcılardaki duruma göre sıralanmakla birlikte, bazen ortaya çıkacak
tabloyu önceden tahmin zor olabilir. Hafif ya da gizli iki mutasyon bileik heterozigotluk durumunda
aır tablo yapabilir. Örnek: IVS2-645 / Poly A AATAA >AATAGAAynı mutasyon kombinasyonu
hafiften aıra deien tablo yapabilir. Aynı mutasyon kombinasyonu farklı hastalarda hafiften aıra
deien tablo yapabilir. Örnek: HbE/ talasemi. Dominant exon 3 mutasyonlarında tabloda
diseritropoezden, aır hemolitik anemiye kadar deiebilir.
Sekonder olarak fenotipi etkileyen faktörler globin zincirlerini kodlayan genlerin moleküler yapısıdır.
globin gen delesyonları klinik tabloyu hafifletir. Örnek: HbE/ talasemi. globin gen
mutasyonları klinik tabloyu deitirir Örnek: G geni
-158 C – T promotor mutasyonu
hematopoetik stresde HbF sentezini arttırır. 6. kromozom üzerinde ve X kromozomu üzerinde globin sentezini etkileyen transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin yapısı da fenotipi etkiler.
Tersiyer olarak hastalıın gidiini, komplikasyonları etkileyen çeitli metabolik sistemlerle ilgili
genlerdir. Örnein bunlar arasında bilirubin metabolizmasında rol oynayan, UGT1 geni (TA)7
polimorfizmi, Fe metabolizmasında rol oynayan C282Y gen polimorfizmleri,
kemik
metabolizmasında önemli olan vitamin D reseptör (VDR) geni, östrojen reseptör (ESR) geni,
kollagen genleri polimorfizmleri ve ICAM, HLA, TNF gibi genlerin polimorfizmleri sayılabilir.
Bütün bu sayılan fenotipik spektrum üzerine etki eden faktörler talasemilerde prenatal genetik
danımayı zorlatırmaktadır. Bunlarda hangi ölçüde bahsedilmesi gerektii ve testlerde kullanılması
gerektii henüz bilinmemektedir.
4- Prenatal tanıda anne kontaminasyonu
Prenatal moleküler tanıda özellikle fetal materyal olarak CVS kullanıldıında anne hücrelerinin
kontaminasyonu nedeniyle anne DNA sını çoaltmak ve yanlı olarak hasta veya homozigot
normal bir fetus için annenin genotipini vermek olasılıı vardır. Bunu ortadan kaldırmak için
koriyonik villuslar mikroskop altında anne hücrelerinden iyi ayıklanmalı, çoaltılan DNA da STR
veya VNTR markerleri ile kontaminasyon mutlaka elimine edilmelidir.
Talasemide DNA Analizinde Kulanılan Bazı Yöntemler
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ASO (allel spesifik oligonükleotid)-prob metodu (DB(dot blot), RDB (Reverse dot blot))
ARMS ( Amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi)
Restriksiyon enzim analizi (RFLP)
DNA Dizi Analizi
Gap-PCR
Southern Blot Analizi
Single strand confirmational polymorphism (SSCP)
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
Heterodupleks analizi
58
TALASEMDE PRENATAL TANIDA KARILAILAN GÜÇLÜKLER VE PRENATAL TANI YÖNTEMLERNDE GELMELER
•
•
•
DNA mikroarray uygulamaları
MLPA (multipl ligasyon prob analizi)
Real time PCR
Talasemi tanı/prenatal tanısında kullanılan yöntemlerin herbirinin avantaj ve dezavantajları vardır.
Bu metotlardan en sık olarak kullanılanları ASO-prob metotları, özellikle RDB (Reverse dot blot)
metodu, ARMS metodu ve DNA dizi analizi metotlarıdır. Her laboratuar kendi deneyimine göre
benzer testlerden birini seçmektedir. Ancak bazı olgularda tanı için birden çok yöntemi kullanmak
gerekebilir. Beta talasemi moleküler tanısında izlenen yol, genellikle, önce RDB, ARMS gibi
yöntemlerle bilinen mutasyonlar taramak, eer mutasyon bulunamaz ise mutasyonun en içindeki
lokalizasyonunu belirlemek için SSCP, DGGE yöntemlerini kullanmak ve mutasyon olduu
saptanan bölgeye dizi analizi uygulamaktır. Otomatize ve hızlı dizi analizi cihazlarının olduu bazı
laboratuarlarda dizi analizi ilk uygulanan yöntem olabilmektedir.
Gen içindeki ve komu bölgelerdeki büyük delesyonlar dizi analizi ile saptanamaz. Bu durumda
Gap-PCR, Southern Blot veya MLPA yöntemlerini uygulamak gerekir.
Yeni yöntemlerden biri olan MLPA yönteminin delesyonların ve duplikasyonların analizinde pratik
bir teknik olduu belirtilmektedir. MLPA yöntemi ile brçok bögedeki delesyonu birden aramak
mümkündür. Ancak delesyonun kesin sınırları nı anlamada yetersizdir.
MLPA da kullanılan problar iki bölümden oluur 1) Sentetik oligonükleotid 2) Faj M13’ den elde
edilen tek zincirli DNA. Her prob hedef DNA dizisini tanıyan özel bir dizi içerir ve her prob üniversal
problarla çolatılır probda bulunan Stuffer adı verilen özgün dizinin uzunluu her probda farklıdır ve
elektroforezle ayrılmayı salar. Genomik DNA nın bu problarla PCR ilemine tabi tutulmasından
sonra kapiller elektroforez yapılır ve özel bir program yardımı ile elektroforez sonuçları
deerlendirilir.
Son yıllarda beta talasemi moleküler tanısında yaygın kullanılmaya balayan, güvenilir
yöntemlerden biri de real time PCR dır. Bu metod real time PCR ile elde edilen erime
erisi (melting Curve) analizine dayanır.. Farklı dizilerin ayırımı hibridizasyon ısılarına
dayanarak yapılır. Kısa sürede doru yanıt alınır.
Moleküler analizlerde çok büyük ilerleme salayan microarray platformları çok sayıda
mutasyonun aynı anda bakılmasına ya da birden fazla hastayı aynı anda deerlendirmeye
olanak veren sistemlerdir . Beta talasemi tanısında da bu sistemlerin kullanıma girdii
görülmektedir.
Noninvazif prenatal tanı
Birçok genetik hastalıkta olduu gibi talasemi prenatal tanısında da fetal materyal invazif
yöntemlerle elde edilmektedir ve her bir yöntemin belli oranda (CVS için 1/200-300)
salam fetusun kaybı riski vardır. Bu nedenle nonivazif yöntemlerle fetal materyal elde
etme çalımaları hızla devam etmektedir. Bu konuda ilk çalımalar 1975 yılında
balamıtır. Bu dönemde anne kanında dolaan fetal hücreler izole edilmeye çalıılmıtır.
Daha sonra 1997 de ilk kez anne kanında serbest fetal DNA olduu gösterilmitir.
Günümüzde dünyanın birçok yerinde farklı gruplar bu konu üzerinde çalımaktadır. Anne
kanında dolaan serbest fetal DNA nın zenginletirilerek izole edilmesi ve farklı moleküler
analiz tekniklerinin uygulanması ile, bileik heterozigotluk riski olan fetusda babada
bulunan mutasyonun tanımlanmasının baarıyla yapıldıı çalımalar mevcuttur. Yöntem
uzun ura gerektiren, zor, pahalı ve henüz çok geni serilerde uygulanmı bir yöntem
olmasa da gelecekte birçok genetik hastalıın tanısında uygulanacaı öngörülmektedir.
59
PROF. DR. FERDA ÖZKINAY
KAYNAKLAR
1.
Weatherall D J.PHENOTYPE–GENOTYPE RELATIONSHIPS IN MONOGENIC DISEASE: LESSONS FROM THE
2.
Old JM. Screening and genetic diagnosis of hemoglobin disorders. Blood Reviews..2003;17, 43-53
THALASSAEMIAS. Nature rew. 2001 ( 2):345-354.
3.
Clark BE, Thein SL. ,Molecular diagnosis of haemoglobin disorders. Clin. Lab. Haem. 2004, 26, 159–176
4.
Xıaofeng GU, and Yıtao ZENG. A Review of the Molecular Diagnosis of Thalassemia. Hematology, 2002 Vol. 7 (4), pp.
5.
Georgi D. E. DOMINANTLY INHERITED b-THALASSEMIA, Hemoglobin, 2007, 31 (2):193–207.
203–209
6.
Kutlar F. DIAGNOSTIC APPROACH TO HEMOGLOBINOPATHIES. Hemoglobin, 31 (2):243–250, 2007
7.
Birgens H. Rolf L.D The thalassaemia syndromes. Scand J Clin Lab Invest 2007; 67: 11–26
8.
Hahn S, Yan Zhong X, Holzgreve W. Recent progress in non-invasive prenatal diagnosis. Neonatal Medicine (2008)
9.
Galbiati S, Foglieni B, Travi M et al.Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reaction as a key point
13, 57-62
for non-invasive prenatal diagnosis of b-thalassemia. Haematologica 2008 Apr; 93(4):610-614.
10. Thein SL. Genetic modifiers of b-thalassemia. Haematologica 2005; 90:649-660
11. Vrettou C, Traeger-Synodinos J, Tzetis M,et al.Rapid Screening of Multiple _-Globin GeneMutations by Real-Time
PCR on the LightCycler: Application to Carrier Screening and Prenatal Diagnosis of Thalassemia Syndromes. Clinical
Chemistry 2003, 49:5.769–776
12. Tadmouri Go, Tüzmen , Özçelik H. Molecular and population genetic analysis of b-thalassemia in Turkey .Am. J.
Hematol. 1998, 57;215-220.
13. Tungwiwat W et al. Application of maternal plasma DNA analysis for noninvasive prenatal diagnosis of Hb Ethalassemia. Translational research.2007.06.006-31.9
14. Li, Y. et al. Detection of paternally inherited fetal point mutations for b-thalassemia using size-fractioned cell-free DNA
in maternal plasma. JAMA 2005, 293, 843-9.
60