ın vitro araştırma yöntemleri

IN VİTRO ARAŞTIRMA
YÖNTEMLERİ
Prof. Dr. Hasan Bayram
Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi
Göğüs Hastalıkları AD
E-posta: bayram@gantep.edu.tr
Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008
Amaç
• Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve
kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi
olma
• Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre
kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi
sahibi olma
• Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar
ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi
olma
• Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve
kullanmaları konusunda teşvik etme
Sunu Akışı
• Giriş;
– Araştırma laboratuarı
– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Özet
Sunu Akışı
• Giriş;
– Araştırma laboratuarı
– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Özet
İn Vitro Araştırma Laboratuarı
•
•
•
•
Nasıl kurulur?
Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK
Profesyonel destek
Personel; biyolog, teknisyen, asistan
İn vitro yöntemler nerede kullanılır?
• İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi;
– Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs.
– Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL
– Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava
yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu
• İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde
edilmesi ve incelenmesi
– Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler,
eozinofil vs
– Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre
kültürleri vs
İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır?
• Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs
• Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya
titreşimi, elektriksel direnç, permabilite
• Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue
• Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot
• Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi:
PCR, RT-PCR
• Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya
• Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre)
ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)
Sunu Akışı
• Giriş;
– Araştırma laboratuarı
– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Özet
Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay (ELISA)/Enzyme
ImmunoAssay (EIA)
(Substrat)
(‘enzime bağlı
secondary ab’)
(‘detecting ab’)
(Nümune)
(‘capture ab’)
ELİSA
ImmunoSito/Histokimya
Enzimatik Yöntem
Floresan Yöntemi
‘Blotting’ (leke)
• Southern blot; DNA dizisi
(sequence,sekans)
• Western blot; protein antibody ile
• Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile
• Southwestern blot: DNA bağlı protein
• Far-western blot: Protein, non-antibody
protein ile
http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
Western Blot (Immunoblot)
•Doku homojenatı/ekstraktı, hücre
•Spesifik proteini, düzeyini belirlemek
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Microarray (Mikrodizi)
• DNA microarray’leri; cDNA microarray,
oligonucleotide microarrays
• Protein mikroarray
• Tissue mikroarray
• Transfection mikroarray (hücre microarray)
• Kimyasal bileşik mikroarray
• Antibody mikroarray
• Gene Chip Analizleri
DNA Mikroarray
•Gen/genom chip, DNA chip, gen array
•Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA
spotlarının bir kolleksiyonu
•Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da
ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı
kullanırlar.
Genomic
•Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması
•Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans)
tespitine dayalı çalışmalar
Proteomic
•‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır
• Genel olarak protein çalışmaları
(yapı ve fonksiyonları)
• ‘Proteome’; ‘protein’ ve ‘genome’ dan oluşur.
•Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler
Small Interfering RNA (siRNA)
•‘short interfering RNA’ veya ‘silencing RNA’
• Spesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda
çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur.
• siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek
Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down)
kullanılabilir
Flow Cytometry
• DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs)
• Apopitozis çalışmalarında
• Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde
(CD markerları)
• Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs)
• Kromozom analiz ve tespitinde
• RNA çalışmalarında
• Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda
http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/
support/training/online/ITF/index.shtml
Akım Sitometri (Flow Cytometry)
•Tek dalga ışın
demeti(lazer)
sıvı akımına yönlendirilir
•Çevredeki detektörler ışığın
kırılma yönü, yaydığı
floresan ışığının tespitiyle
hücre/partiküllerin
belirlenmesi esasına
dayanır
Hücre Siklüs Ölçümü
Sunu Akışı
• Giriş;
– Araştırma laboratuarı
– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Özet
Hücre Kültürleri
• İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik
sorunları
• Uygun çalışma modeli
• Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb
• Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser
• Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel
irritanlar (hava kirliliği), biomas
• Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, β2agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs
Hücre Dizileri (‘Cell line’)
• Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale
getirilirler (viruslar, SMV40);
– BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri)
– 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri)
• Kanserleşmiş hücreler kullanılır
– A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri)
NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection
• DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine
• Tek katman (‘monolayer’) oluşturur
A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri)
(Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)
Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4μm)
Hücre Canlılığı - MTT
SF
FCS
%10
5
10
50
100
200
400
Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)
24 saat
2.0
Optik Dansite
DEP’nin A549 hücre
canlılığı üzerine etkisi
***p<0.0001 - 0μg/ml DEP
1.5
* *
1.0
*
0.5
*
48 saat
* *
1.5
*
*
*
1.0
0.5
(%10)
72 saat
1.5
*
1.0
*
*
0.5
(%10)
50
10
0
20
0
40
0
10
00
20
00
5
10
0
50
10
0
20
0
40
0
10
00
20
00
10
0
5
Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)
FC
S
0.0
0.0
FC
S
Optik Dansite
*
Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)
2.0
Optik Dansite
2.0
50
10
0
20
0
40
0
10
00
20
00
(%10)
5
10
0
FC
S
0.0
Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)
DEP (10-1000μg/ml) ile 72s İnkübasyonun
A549’dan Sitokin Salınımına Etkisi
15
5000
3000
2000
1000
*
10
5
Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)
10
00
40
0
20
0
10
0
50
10
0
Se
ru
m
40
0
20
0
10
0
50
10
0
0
0
Se
ru
m
IL-8 (pg/ml)
GM-CSF (pg/ml)
*
4000
Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)
DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre
proliferasyonuna etkisi
100
Serum Free
800
600
Number
400
***
DEP (10μg/ml)
FCS (10%)
SF
200
75
**
50
0
Percent of cells
1000
G0G1
G2M
S-Phase
0
50
100
150
200
Channels (FL2-H)
*** ***
25
250
**
*
0
G0/1
S
G2/M
Cell cycle compartments
Bayram H et al, Eur Respir J 2006
DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre
apoptozisine etkisi
Hücrelerin %'si
100
*
SF
**
70
FCS(10%)
SF
DEP (10μg/ml)
40
30
20
*
*
*P<0.05 and
**P<0.005 vs SF
10
0
LL(A-/P-) LR(A+/P-) UR(A+/P+) UL(A-/P+)
Kuadrantlar
Bayram H et al, Eur Respir J 2006
DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein
ekspresyonuna etkisi
p21 (% of βactin)
150
DEP (μg/ml)
0
100
1
10
10%
FCS
p21CIP1/WAF1
β-actin
*
50
**
0
10% FCS
0
1
10
*P<0.05 and
**P<0.01 vs 0μg/ml DEP
p21 mRNA (% GAPDH)
DEP (10μg/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549
hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi
400
*P<0.05 vs SF
300
*
200
100
0
0
1
DEP(μg/ml)
10
Sunu Akışı
• Giriş;
– Araştırma laboratuarı
– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Özet
Primer Hücreler-Avantajlar
• İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve
fenotipik benzerlik
• Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt
olarak elde edilebilirler
Primer Hücre Kültürü-
Dezavantajlar
• Elde edilmeleri daha zor
• Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar
• Etik sorunlar
Doku - Hücre Kaynağı
• Cerrahi eksplant
– Pnömonektomi, Lobektomi
– Transplant akciğeri
•
•
•
•
•
Biyopsi
Fırçalama (epitel hücreler)
Enzimatik digestion,
Disseksiyon
Hazır, ticari olarak
Akciğerin Primer Hücre Kültürleri
•
•
•
•
Düz kas hücreleri
Fibroblast kültürleri
Alveolar epitel hücreleri
Bronş epitel hücreleri
Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri
• Fırçalama,
• Enzimatik digestion,
• Disseksiyon
Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu
Kültür Vasatı
• ‘Medium 199’
–
–
–
–
–
–
–
Foetal bovine serum (2.5ml)
1ml bovine pancreatic insulin (2.5 μg/ml)
1ml human transferrin (2.5 μg/ml)
1ml epidermal growth factor (20μg/ml)
1ml hydrocortisone (0.36 μg/ml)
1ml L-glutamine (0.02mg/ml)
1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon
• 100ml tamamlanır ve 0.2μm por çap filtreden
geçirilir
Kültür Kapları
6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik
kültür kapı (Becton Dickinson,UK)
9mm çaplı 24 gözlü, 0.45μm por
çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı
24-Kuyucuklu Plate
1. Hafta
3. Hafta
(Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)
Hücrelerin DEP ile İnkübasyon
Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi
DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi
Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998.
Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş
epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı
pg/μg selüler protein
1000
(log.)
Non-ast.
p<0.05
100
Ast.
p<0.003
p<0.002
10
1
0,1
0,01
YK
IL-8
GM-CSF
RANTES
sICAM-1
Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.
İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği
%5 CO2
İn Air
NO2
Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği
Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronş
epitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi
Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.
Sunu Akışı
• Giriş;
– Araştırma laboratuarı
– Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri
• Hücre dizilerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve
araştırmalarda kullanımı
• Özet
Özet
• Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı
• İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda
kullanılabilirler
• Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri
yapılabilir
• Solunum yolu hücrelerinin
– Fizyolojik
– Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi
– Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında
kullanılabilir
Yorum
• Bütün dünyada yaygın olarak
kullanılan in vitro araştırma
yöntemlerinden yararlanmalıyız
Sabrınız İçin Teşekkür Ederim