biyomoleküler algılamaya yönelik elektrokimyasal sensörlerin

T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOMOLEKÜLER ALGILAMAYA YÖNELİK
ELEKTROKİMYASAL SENSÖRLERİN
TASARIMI VE UYGULAMALARI
Analitik Kimya Programı
Doktora Tezi
Uzman Eczacı
Hakan KARADENİZ
Danışman
Doç. Dr. K. Arzum ERDEM GÜRSAN
İzmir
2008
II
III
ÖNSÖZ
Çalışmalarımdaki değerli katkılarından dolayı başta, danışmanım Sayın
Doç. Dr. K. Arzum ERDEM GÜRSAN olmak üzere, Analitik Kimya Anabilim dalı
başkanı Sayın Prof. Dr. M. Şengün ÖZSÖZ ve Anabilim Dalındaki diğer Öğretim
Üyelerine teşekkür eder, saygılarımı sunarım.
Çalışmalarım sırasında maddi destek sağlayan Türkiye Bilimsel ve Teknolojik
Araştırma Merkezi (TÜBİTAK) ve Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fon
Saymanlığına, doktora eğitimim boyunca maddi ve manevi destek sağlayan
TÜBİTAK- Yurt İçi Doktora Burs Programı’na teşekkür ederim.
Her zaman desteklerini gördüğüm değerli çalışma arkadaşlarıma ve manevi
desteğini hiçbir zaman esirgemeyen aileme teşekkür ederim.
İzmir
Mayıs 2008
Uzm. Ecz. Hakan KARADENİZ
IV
İÇİNDEKİLER
I.BÖLÜM..............................................................................................................1
GENELBİLGİLER..............................................................................................11
1. ELEKTROKİMYA .........................................................................................11
1.1.Elektrokimyasal tabakalar:....................................................................... 12
1.2. Elektrokimyasal tabakaların elektrisel olarak incelenmesi : .................... 13
1.3. Elektrokimyasal bir olayda kütle aktarım yolları...................................... 14
1.4. Elektroanalitik yöntemler ........................................................................ 15
1.4.1. Voltametri ve esasları..................................................................... 16
1.4.2. Voltametride kullanılan uyarma sinyalleri ....................................... 17
1.4.3. Voltametrik cihazlar ....................................................................... 19
1.4.4. Voltametride kullanılan referans elektrotlar .................................... 21
1.4.5. Voltametride kullanılan çalışma elektrotları: ................................... 22
1.4.5.1. Karbon elektrotlar..................................................................23
1.4.5.2. Metal elektrotlar....................................................................26
1.4.6. Voltametrik akımlar……………………………...................................27
1.4.7. Elektrokimyasal bir olayda faradayik işlemler..................................27
1.4.8. Voltametrik teknikler :.......................................................................28
1.4.8.1. Dönüşümlü Voltametri : ........................................................ 28
1.4.8.2 Diferansiyel Puls Polarografisi :............................................ 30
2. BİYOSENSÖR…............................................................................................32
2.1. Biyosensör Çeşitleri:............................................................................. 33
2.2. İdeal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler…......................33
2.3. Biyosensör tasarımında kullanılan moleküller ve yapıları.......................35
V
2.3.1. Nükleik asitler ve DNA:..................................................................35
2.3.1.1. DNA ile ilgili bazı terimlerin tanımlamaları.............................39
2.3.1.1.1. DNA baz dizilişlerinin yazılımı ile ilgili temel…………..
bilgiler………………………………………………………………………………….39
2.3.1.1.2. İnterkalasyon….........................................................40
2.3.1.1.3. Nükleik asit hibridizasyonu…....................................40
2.4. DNA biyosensörleri:.............................................................................. 41
2.4.1. DNA biyosensörlerinin sınıflandırılması……………………….........42
2.4.2. DNA biyosensörlerinde prob dizilerinin elektrot yüzeyine tutturulma
yolları………………………………………………….............................................46
2.4.2.1 Pasif adsorbsiyon yoluyla prob tutturulması (ıslak…………..
adsorbsiyon yöntemi)………………………………………………………………..46
2.4.2.2. Elektrostatik yolla prob tutturulması..................................46
2.4.2.3. Kovalent yolla prob tutturulması………..….......................47
2.4.2.4. Avidin-biyotin etkileşimi nedeniyle streptavidin kaplı yüzeye
biyotinle işaretlenmiş prob tutturulması………………………………………...….47
2.4.3. Elektrokimyasal genosensörler ile DNA dizi algılama yöntemleri…47
2.4.3.1. İndikatöre dayalı DNA dizi algılama yöntemleri.................48
2.4.3.1.1. İnterkalatör madde ile…………………...….………48
2.4.3.1.2. DNA bazları ile etkileşen molekül ile…..................49
2.4.3.2. İndikatörsüz DNA dizi algılama yöntemleri........................50
3. NANOTEKNOLOJİ....................................................................................... 52
3.1. Nanoteknolojinin kullanım alanları….……………………………………...53
4. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) .......................................................... 56
5. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) ................................................... 58
VI
6. DNA çip teknolojisi ....................................................................................... 59
II. BÖLÜM.........................................................................................................61
GEREÇ VE YÖNTEM .......................................................................................61
2.1. Kullanılan cihazlar……….............................................................………….62
2.2. Kullanılan kimyasal maddeler…….........................................................….61
2.2.1. Echinomisin (ECHI) hakkında genel bilgi........………………………..62
2.2.2. Kullanılan çözeltilerin hazırlanışı…………….………………………….63
2.2.2.1. Oligonükleotit çözeltilerinin hazırlanışı…...………..…………63
2.2.2.1.1
Ag-NP’lere
dayalı
deneylerinde
kullanılan
oligonükleotit dizileri……………………………………………………….………...63
2.2.2.1.2. Manyetik partiküllere dayalı deneylerinde kullanılan
oligonükleotit dizileri………………………………………………………………….63
2.2.2.1.3.
MWCNT-SPE
sistemine
dayalı
deneylerinde
kullanılan oligonükleotit dizileri……………………………………………………...63
2.2.2.2.Tampon çözeltilerin hazırlanışı. ............................................64
2.3. Kullanılan yöntem…………….....................................................................66
2.3.1. Kullanılan elektrotların hazırlanışı...... ...............................................67
2.3.1.1. Kalem ucu grafit (PGE) elektrodunun hazırlanışı .................67
2.3.1.2. CNT modifiye SPE hazırlanışı............... ...........................67
2.4. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine
yönelik çalışma………………….……………………………………………...…….68
2.4.1.
Gümüş
nanopartiküllerin
(Ag-NP)
sentezi
ve
mikroskobik
karakterizasyonu………………..……………………………………......................69
2.4.2. Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesi.......................69
VII
2.4.2.1. Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri
(CV) tekniği ile incelenmesi….…………………………………….........................70
2.4.2.2. Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls
voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi…..…………………………………........70
2.4.3. Ag-NP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması
ve DNA'nın elektrokimyasal tayini……..…………………………………………...71
2.4.4.
DNA
konsantrasyonundaki
değişimin
Ag-NP
ve
guanin
yükseltgenme sinyaline dayalı yanıta olan etkisinin incelenmesi……………....71
2.4.5. Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesi.................72
2.4.6. Ag-NP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan
etkisinin
incelenmesi……………………………………………………………………………72
2.5. Manyetik partiküllere (MB) dayalı elektrokimyasal DNA hibridizasyonun
indikatörlü
ve
indikatörsüz
sistemle
elektrokimyasal
tayinine
yönelik
çalışmalar…….…………..…………………………………………………..............72
2.5.1. ECHI'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesi….....................72
2.5.1.1. ECHI'nin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri
(CV) tekniği ile incelenmesi….………………………………………………….......72
2.5.1.2. ECHI'nin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls
voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi…..……………………………………….73
2.5.2. Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz
elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini………...............................................74
2.5.2.1. ECHI sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayini…………..………………………………………………..…..76
2.5.2.2.
Guanin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini……………………………………….....76
VIII
2.5.2.3.
Adenin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini…………..……………………………...76
2.6. Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE)
kullanılarak DNA hibridizasyonun elektrokimyasal tayinine yönelik çalışma…..77
2.6.1. MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin
Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonu…............................77
2.6.2. MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin
tutturulması ve DNA'nın elektrokimyasal tayini……………………………………77
2.6.3. MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob
konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisinin incelenmesi…………………...79
2.6.4. MWCNT-SPE yüzeyine HBV DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal
tayinine yönelik çalışma……………………….…………………………………….79
2.6.5. HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalar….............80
2.6.6. Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıta olan
etkisinin incelenmesi…………………………...…………………………………….80
III. BÖLÜM.........................................................................................................81
BULGULAR ......................................................................................................81
3.1. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine
yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ……………………..…………………..……….81
3.1.1. Ag-NP'lerin mikroskobik karakterizasyonunda elde edilen bulgular...81
3.1.2. Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde edilen
bulgular……………………………………………………………………….............83
3.1.3. Ag-NP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin tutturulması
ve DNA'nın elektrokimyasal tayininde elde edilen bulgular……...……………..85
IX
3.1.4. DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin yükseltgenme
sinyaline etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular………..........................86
3.1.5. Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde elde
edilen bulgular……..………………………………………………………….……...87
3.1.6.
Ag-NP
konsantrasyonundaki
değişimin
yanıta
olan
etkisinin
incelenmesinde elde edilen bulgular ……………………………………………....88
3.2. Manyetik partiküllere(MB) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve
indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular….......................90
3.2.1.
ECHI'nin
elektrokimyasal
davranışının
incelenmesine
ilişkin
bulgular………………………………………………………………………………..91
3.2.2. Manyetik partiküllere (MB)
dayalı indikatörlü ve indikatörsüz
elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayinine ilişkin bulgular……….. .................91
3.2.3. ECHI'nin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular…..........................................................92
3.2.4. Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular………..................................................94
3.2.5. Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular…..........................................................95
3.3. Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE) ile
DNA hibridizasyonun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular….......................97
3.3.1. MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin
taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna ilişkin bulgular …97
3.3.2. MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin
tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular……………….98
X
3.3.3. MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob
konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisine ilişkin bulgular……………….100
3.3.4.
MWCNT-SPE
yüzeyinde
HBV
DNA
hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular …………..…….....101
3.3.5. HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalarda elde
edilen bulgular…………………………………………………………………........102
3.3.6. Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıtına olan
etkisinin incelenmesine ilişkin bulgular………..................................................103
IV. BÖLÜM .....................................................................................................105
TARTIŞMA…………........................................................................................105
4.1. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA analizine
yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ile ilgili tartışma…………..………………..…105
4.1.1. Ag-NP'lerin mikroskobik karakterizasyonunda elde edilen bulgular ile
ilgili tartışma………………………………………………………………...……….105
4.1.2. Ag-NP'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde edilen
bulgular ile ilgili tartışma…………………………………………………………...105
4.1.3. Ag-NP yüzeyine tutturulan DNA konsantrasyonundaki değişimin yanıta
olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma ………….106
4.1.4. Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde elde edilen
bulgular ile ilgili tartışma ……..……………..……………….…………………….106
4.1.5.
Ag-NP
konsantrasyonundaki
değişimin
yanıta
olan
etkisinin
incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma ……………..…………...106
4.2. Manyetik partiküllere(MB) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve
indikatörsüz
sistemle
elektrokimyasal
tayinine
ilişkin
bulgular
ile
ilgili
tartışma………………………………………………………………………………107
XI
4.2.1. ECHI'nin elektrokimyasal davranışının incelenmesine ilişkin bulgular
ile ilgili tartışma …………………………………………………………………..…107
4.2.2 Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun indikatörlü ve
indikatörsüz
sistemle
elektrokimyasal
tayinine
ilişkin
bulgular
ile
ilgili
tartışma………………………………………………………………………………107
4.2.3. ECHI'nin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma …….........................108
4.2.4. Guanin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine ilşkin bulgular ile ilgili tartışma ….…...……...............109
4.2.5. Adenin sinyalindeki değişim üzerinden DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine ilşkin bulgular ile ilgili tartışma ……......…….............110
4.3. Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot (MWCNT-SPE) ile
DNA
hibridizasyonun
elektrokimyasal
tayinine
ilişkin
bulgular
ile
ilgili
tartışma………………………………………………………………………………111
4.3.1. MWCNT-SPE ve DNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin
taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna ilişkin bulgular ile
ilgili tartışma …………………………...……………………………………………111
4.3.2. MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin
tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili
tartışma ……………………………………………………………………………...111
4.3.3. MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA prob
konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisine ilişkin bulgular ile ilgili
tartışma ….…………………………………………………………………………..112
4.3.4. MWCNT-SPE yüzeyinde HBV DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal
tayinine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ile ilgili tartışma …………..………..113
XII
4.3.5. HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalarda elde
edilen bulgular ile ilgili tartışma........................................................................114
4.3.6. Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon yanıtına olan
etkisinin incelenmesine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma...................................114
V. BÖLÜM ......................................................................................................116
SONUÇ VE ÖNERİLER..................................................................................116
ÖZET...............................................................................................................120
ABSTRACT.....................................................................................................122
YARARLANILAN KAYNAKLAR....................................................................124
Arş. Gör. Uzm. Ecz. Hakan KARADENİZ’in Özgeçmişi...............................144
XIII
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1: Elektrot yüzeyindeki tabakaların şematik olarak gösterilmesi…………12
Şekil 2: Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka………………………..14
Şekil 3: Elektrokimyasal bir olayda kütle aktarım yollarının şema ile
gösterilmesi…………………………………………………………………………...15
Şekil 4: Voltametride kullanılan potansiyel uyarma sinyalleri…………………...18
Şekil 5: Üçlü elektrot sistemi içeren potansiyostatın şematize edilmesi……….19
Şekil 6: Üçlü elektrot sisteminin şematize edilmesi………………………………20
Şekil 7: Kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen
potansiyel aralıkları…………………………………………………………………..23
Şekil8: Grafit tozunda bulunan karbon moleküllerinin dizilimi…………………..24
Şekil 9: Karbon pastası elektrodu………………………………………………….24
Şekil 10: Perde baskılı karbon (Grafit) elektrot…………………………………...25
Şekil 11: Kalem Grafit Elektrot ve grafit elektrodun yüzeyinin taramalı elektron
mikroskobu (SEM) ile görüntülenmesi…………………………………..…………26
Şekil 12: Altın elektrot…………………………………………..…………………..26
Şekil 13: (a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilimin zamana
karşı grafiği ; (b) Dönüşümlü voltametride elde edilen akım-gerilim eğrisi….....29
Şekil 14: Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri; (a) Analog
cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali; (b)
Diferansiyel puls voltametrisinde elde edilen bir voltamogram………………….31
Şekil 15: DNA Çift Sarmal Yapısı………………………………………………….37
Şekil 16: DNA yapısında bulunan baz, şeker ve fosfat gruplarının şematize
edilmesi………………………………………………………………………………..38
XIV
Şekil 17: Düzlemsel yapıya sahip bir molekülün çift sarmal DNA baz çiftleri
arasına yerleşmesi (interkalasyon)…………………………………………………40
Şekil 18: Nükleik asit hibridizasyonu………………………………………………41
Şekil 19: İnterkalatör bir hibridizasyon indikatörü ile DNA dizi algılanması; (1)
indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm…………………...……………49
Şekil 20: DNA bazlarından biriyle etkileşen bir hibridizasyon indikatörü ile DNA
dizi algılanması; (1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm………...50
Şekil 21: İndikatörsüz DNA dizi algılama yöntemi; (1) elektrokimyasal ölçüm..51
Şekil 22: Karbon nanotüpler (CNT); (A) tek duvarlı ve (B) çok duvarlı………..54
Şekil 23: Taramalı elektron mikroskobunun (SEM) şematik görünüşü………..58
Şekil 24: Affimetrix firmasına ait mikroarray görünümü…………………………60
Şekil 25: Nanopartiküllerin TEM görüntüsü ( x 50.000 büyütme)………………81
Şekil 26: Çözeltideki gümüş nanopartiküllerin SEM görüntüsü (x 20.000
büyütme)………………………………………………………………………………82
Şekil 27: Ag-NP’lerin partikül büyüklüğü dağılımı………………………………..83
Şekil 28: (A) Dönüşümlü voltametri (CV) ve (B) diferansiyel puls voltametrisi
(DPV) tekniği kullanılarak, Ag-NP’lerin elektrokimyasal davranışlarını gösteren
voltamogramlar……………………………………………………………………….84
Şekil 29: Amino ile işaretlenmiş DNA varlığında elde edilen, (NP) gümüş ve (G)
guanin oksidasyon sinyallerini ve (K) sadece ABS tamponu içinde alınan ölçüm
sinyalini gösteren voltamogram (kontrol)…………………………………………..85
Şekil 30: Amino işaretli DNA oligonükleotidlerinin farklı konsantrasyonlarında
gözlenen
gümüş ve guanin sinyalleri: (A) Histogramda nanopartiküllerin
yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda metalik gümüşün (a)
guaninin
(b)
yükseltgenme
sinyalleri
gösterilmektedir.
(B)
Grafikte
XV
nanopartiküllerin
yüzeyine
DNA
tutturulmasının
varlığında/yokluğunda,
gümüşün (NP) ve guaninin (G) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir…..…87
Şekil 31: Farklı tampon çözeltilerinin yanıt üzerine olan etkisini gösteren
histogram.
Nanopartiküllerin
yüzeyine
DNA
tutturulmasının
varlığında/yokluğunda gümüşün ve guaninin yükseltgenme sinyalleri….……...88
Şekil 32: Çeşitli oranlarda seyreltilmiş gümüş nanopartiküllerin yanıta olan
etkisi: (a) DNA yokluğunda, (b) 50 µg/mL DNA varlığında Ag-NP’lerin
yükseltgenme sinyali ve (c) guanin yükseltgenme sinyali……………………….89
Şekil 33.
(A) ECHI’nin dönüşümlü voltametri tekniği ile elde edilen
voltamogramı; (a) ECHI sinyali (b) ECHI içermeyen PBS tamponundan gelen
sinyal (kontrol); (B) Farklı ECHI konsantrasyonlarında diferansiyel puls
voltametri tekniği ile ölçülen ECHI sinyallerine ait konsantrasyon-akım eğrisi...91
Şekil 34. Hibridizasyon varlığında ölçülen (E) ECHI, (G) guanin ve (A) adenin
sinyallerini gösteren voltamogram; (1) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu
varlığında elde edilen sinyaller, (2) sadece prob varlığında elde edilen
sinyaller………………………………………………………………………………..92
Şekil 35: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen ECHI sinyallerini gösteren (A)
DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram. ……..……………..93
Şekil 36: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) DPV
tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) Hibridizasyon varlığında ölçülen
guanin sinyallerini gösteren histogram….…………………………………………95
XVI
Şekil 37: Hibridizasyon varlığında ölçülen adenin sinyallerini gösteren (A) DPV
tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) Hibridizasyon varlığında ölçülen
adenin sinyallerini gösteren histogram ………………………………...…………96
Şekil 38: SEM görüntüleri; MWCNT-SPE, (a) hızlandırma potansiyeli 20,0 KV,
çözünürlük 200 µm; (b) hızlandırma potansiyeli 30,0 KV, çözünürlük 500 nm;
yüzeyine 100 µg/ml dsDNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE, (c) hızlandırma
potansiyeli 10,0 KV, çözünürlük 100 µm; (d) hızlandırma potansiyeli 10,0 KV,
çözünürlük 10 µm…………………………………………………………………….98
Şekil 39: (a) DNA içermeyen ve kovalent bağlanma çözeltisi varlığında elde
edilen sinyal (kontrol); (b) boş ABS………………………………………………...99
Şekil 40: (a) 20 µg/mL amino işaretli DNA prob varlığında elde edilen
yükseltgenme sinyali; (b) boş ABS………………………………………………100
Şekil 41: Farklı konsantrasyonlarda amino işaretli DNA prob dizisi kullanılarak
DPV tekniği ile ölçülen guanin sinyallerini gösteren
(A) voltamogramlar ve (B)
histogram……………………………………………………………..……………..101
Şekil 42: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) DPV
tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram….……………………….102
Şekil 43: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren (A) DPV
tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram…...……………………...103
Şekil 44: Hedef DNA konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi ve
kalibrasyon eğrisi……………………………………………………………………104
I. BÖLÜM
GİRİŞ
Moleküler algılama yöntemlerinde kaydedilen gelişmeler ve yeni teknolojik
ürünlerle sonuçlanabilecek çalışmaların hızla ortaya çıkması sonucunda,
biyomoleküler algılamaya yönelik yeni teknolojilerin oluşturulması gündeme
gelmiştir. Aslında her şey bir canlı hücresindeki “genetik şifre” olarak
tanımlanan deoksiribonükleik asitin (DNA), 1953 yılında Watson ve Crick
tarafından bulunmasıyla başlamıştır (32). Hücre çekirdeğinde yer alan DNA, bir
insanın göz renginden ten rengine, vücut yapısından boyuna kadar çeşitli
fiziksel özelliklerini belirlemenin yanı sıra, sağlığı ve yaşam süresi gibi kişinin
genetik yapısı konusunda önemli rol oynayan bir biyomoleküldür.
Günümüzde kullanılmakta olan klasik metotlarla yapılan tayinler genellikle
genlerin doğrudan baz dizisi analizi veya DNA hibridizasyonun tespiti esasına
dayalıdır. Bu yöntemlerin bazılarında radyoaktif boyalar kullanılmaktadır. Fakat
bu boyar maddelerin kullanılması, kullanım güçlüğü, yüksek maliyet ve
radyasyona maruz kalınması gibi nedenlerle önemli sakıncalar doğurmaktadır
(122). Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğinin kullanıldığı
yöntemler, yüksek maliyet ve sürenin uzunluğu nedeniyle rutin analizler için
uygun değildir. Jel elektroforezi tekniği ise çok toksik olan etidyum bromür
maddesinin kullanımı nedeniyle sakıncalıdır. Son dönemlerde, bilinen klasik
yöntemlere alternatif olacak elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin tasarımı
gündeme gelmiştir. Elektrokimyasal sensörlerin yapılarına enzim, doku, nükleik
asit vb. gibi biyolojik maddeler eklendiği zaman elektrokimyasal sensörlerin en
yaygın kullanım alanlarından biri olan “BİYOSENSÖRLER” oluşur. “Biyo”
2
(biyolojik kökenli) ve “sensör” (algılayıcı) kelimelerinden oluşan biyosensör,
biyomoleküllerin çeşitli ortamlarda izlenmesinde, kalitatif ve/veya kantitatif
tayinini mümkün kılan cihaz olarak tanımlanabilir. Biyosensör tasarımında
mutlaka bir biyolojik malzeme kullanılır ve gerçekleşen biyomoleküler
etkileşimin sonucunda çok seçici, çok hassas ve çok daha hızlı ölçüm
yapabilmektedir.
Nükleik asitlerden oluşan tanıma yüzeyleri, analitik kimya alanında her
geçen gün daha ilgi çekici konular halini almaktadır (8,147,148). Bu gelişme ile
elektrokimyasal
DNA
biyosensörlerinin
(genosensörlerin=
gene
dayalı
sensörlerin) gelecekte hasta başında yapılacak doktor gözetimindeki analizlerde
çok önemli bir rol oynayacağı düşünülmektedir (134). Elektrokimyasal
yöntemlerle birlikte DNA’nın nitel ve nicel analizini yapma amacına yönelik
tasarlanan
(10-12,17-19,64,104,105,137)
biyosensörlerde
tanıma
yüzey
katmanı olarak DNA kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (18,19,22,23,27,
87,92,107,122,148).
Moleküler
teknolojisindeki
tanı
yöntemlerindeki
gelişmelerin
eklenmesi
ilerlemelere
sonucunda,
mikrofabrikasyon
mikroçip
teknolojisi
gündeme gelmiş ve bu teknoloji, insan genom projesinin tamamlanması ile ivme
kazanmıştır. Mikroçip teknolojisi ile binlerce gen veya ürünleri (RNA ve
proteinler gibi) arasındaki ilişkiyi bir çip (yonga) üzerinde, eş zamanlı olarak
araştırabilmek ve genetik şifremizi taşıyan nükleik asitlerin nasıl çalıştığımızı
anlamamız mümkün olacaktır. Klinikte ve hasta başında gerçekleştirilecek DNA
analizlerinde kullanılacak küçük boyutlarda ve tüm sağlık ekibinin kolayca
kullanabileceği yeni cihazların tasarımları, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki bazı
büyük firmalar tarafından başlatılmıştır. 1994 yılında S. Mikkelsen’in dizi seçici
3
DNA sensörleri ile yapmış olduğu kalıtsal hastalıkların tayini projesi Amerika
Birleşik Devletleri tarafından korunmaya alınmış olup, kullandığı teknolojinin
lisansını Clinical Micro Sensors Inc. (CMS) adlı Amerikan şirketi satın almış ve
böylelikle DNA çiplerinin hayata geçirilmesi için ilk çalışmalar başlamıştır. Başta
Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere, dünya üzerinde birçok firma tarafından
DNA çiplerine yönelik araştırmalar yürütülmekte, ve özellikle nanoteknolojinin
gündeme gelmesiyle çalışmalar yoğun bir şekilde bu yönde devam etmektedir.
(33,91,92,122).
Nanoteknoloji, nanometre ölçeğindeki fiziksel, kimyasal ve biyolojik
olayların anlaşılması, kontrolü ve üretimi amacıyla, fonksiyonel malzemlerin,
cihazların ve sistemlerin geliştirilmesini amaçlayan disiplinlerarası bir bilim
dalıdır. Nanoteknolojinin günümüzde diğer bilim dallarına sağladığı avantajlar
ve bunu takiben hemen hemen her alanda hızlı bir ilerlemenin kaydedilmesi
sonucunda,
bilim
ve
teknolojide
yeni
ufuklar
açılmaya
başlanmıştır.
Nanoteknoloji ile üretilen nanopartikül, nanotüp ve nanokablolar gibi gelişmiş
fizikokimyasal özelliklere sahip nanomalzemeler, biyomoleküler algılamaya
yönelik elektrokimyasal sensörlerin daha seçici ve daha hassas bir şekilde
geliştirilebilmesi
açısından
büyük
önem
taşımaktadır
(16,24,46,48,55,58,68,73,82,85,89,90,96,102,118,120,153).
Nanometre
büyüklüğündeki nanomalzemeler sensör tasarımlarında; (1) enzim, DNA ve
protein vb. gibi biyolojik moleküllerin elektrot yüzeyine doğrudan bağlanmasını
kolaylaştırmak,
biyomalzemeleri
(2)
elektrokimyasal
nanobarkotlarla
reaksiyonları
etiketlemek,
hızlandırmak,
(4)
(3)
biyomoleküler
etkileşim/tanıma reaksiyonu sonucunda oluşan sinyalin duyarlılığını arttırmak,
ve (5) tanıma yüzeyi ve/veya çevirici bölümün küçültülebilmesi sayesinde,
4
biyosensörlerinde
boyut
olarak
minyatürize
edilebilmesi
amacıyla
kullanılmaktadır (42,46,77,85,90,96,109,116,130,135,136,153).
Çalışmanın konusu ve amaçları:
Son 10 yılda, nanopartiküller, nanotüpler ve diğer nanomalzemelere
dayalı
sensörlere
artan
bir
(7,24,46,48,58,68,69,82,89,109,120).
Çeşitli
nanopartikül
ve
yüzeyine
tutturulması
ilgi
bulunmaktadır
tekniklerle
bunların
nükleik
asitlerin
elektrokimyasal
sensör
teknolojisinde kullanılmaları yaygınlaşmaktadır (4,29,44,47,57,102,138,140143,150,151,155). Wang ve arkadaşları tarafından DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayini streptavidin kaplı altın (Au) nanopartiküller kullanılarak
gerçekleştirilmiştir
(150).
Authier
ve
arkadaşları
tarafından,
PCR
amplikonlarından human cytomegalovirus virüsün elektrokimyasal tayini, altın
nanopartikül ile işaretlenmiş DNA prob kullanılarak yapılmıştır (4). Cai ve
arkadaşları tarafından gümüş nanopartiküllere dayalı DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayini, asit çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (57).
Ayrıca, nanopartiküllere dayalı DNA analizinin etkin manyetik ayırma
sayesinde
gerçekleştirilebildiğine
dair
kayıtlar
literatürde
mevcuttur
(138,141,142). Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik ayırma sayesinde
seçimli bir DNA analizinin kullanılan nanopartikülden gelen gümüş sinyalinin
+0.28
V’da,
perde
baskılı
gerçekleştirilebildiği
gösterilmiştir
çalışmasında
DNA
ise,
kullanılmıştır (142).
analizi
elektrotlar
(151).
için
ile
Wang
ölçülmesiyle
ve
kadmiyum
başarıyla
arkadaşlarının
sülfür
diğer
nanopartikülleri
5
Çalışmamızın ilk bölümünde, gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) tutturulmuş
DNA’nın elektrokimyasal tayini, hem gümüşün hem de DNA’nın elektroaktif bazı
olan guaninin yükseltgenme sinyali tek kullanımlık kalem grafit elektrot (PGE)
ölçülerek gösterildi. Gümüş nanopartiküllere dayalı bir yöntemle elektrokimyasal
DNA analizi, hem metal nanopartikülden gelen sinyal (herhangi bir katalizör ya
da asidik çözelti kullanılmadan) hem de guanin sinyali ölçülerek ilk defa
çalışmamızda başarıyla gerçekleştirilmiştir ve literatürde bu konuda bir kayda
rastlanılmamıştır. Kullanılan bu nanopartiküllerin mikroskobik karakterizasyonu,
transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM)
ile, elektrokimyasal davranışları ise dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel
puls voltametri (DPV) teknikleri kullanılarak incelendi. Gümüş nanopartikül
yüzeyine tutturulmuş amino işaretli kısa DNA dizilerini (oligonükleotitlerin) içeren
örneğin içersine tek kullanımlık grafit sensörün daldırılması ve pasif adsorpsiyon
yöntemiyle nanopartikül ile işaretli DNA’nın elektrot yüzeyine
tutturulma
basamağını, aynı ölçüm aralığında gümüş ve guanin sinyallerinin ölçülmesi
işlemi izledi. Ayrıca, gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulan DNA dizisinin
konsantrasyonu ve DNA dizisinin çeşitli fonksiyonel gruplarla işaretlenmesi,
kullanılan Ag-NP konsantrasyonu ve tampon çözeltinin etkisi gibi deneysel
parametrelerdeki farklılığın yanıta olan etkisi araştırıldı.
Elektrokimyasal DNA hibridizasyon sensörleri, çeşitli bulaşıcı hastalıkların
erken tanısında kullanılabilir (103,134) ve bu analitik cihazlar yardımıyla, dizi
seçimli hibridizasyon olayları, doğrudan guanin/adenin yükseltgenme sinyali
üzerinden (44,47,140,143), ya da DNA bazları ile kompleks oluşturan bazı
antibiyotikler, metal kompleksleri gibi elektroaktif hibridizasyon indikatörleri
kullanılarak (24,48,55,58,68,76,82,102,118) tayin edilebilir.
6
Manyetik partiküllere dayalı etkin ayırma ve elektrokimyasal sensörlerinin
birlikte kullanıldığı çift tabaka tekniklerinin kullanımına, son 10 yıldır artan bir ilgi
bulunmaktadır
(44,108,123,138,140,143,145).
Bu
çalışmalarda
kullanılan
partiküller, paramanyetik partiküller olup, sıvı fazdan küçük bir mıknatıs
yardımıyla kolayca ayrılabilmekte ve mıknatıs çözeltiden uzaklaştırıldığında,
partiküller sıvı faz içinde tekrar kolayca dağılabilmektedir (44,108). Dizi seçimli
DNA hibridizasyonu, enzimle işaretli (108,138) ve herhangi bir işaretlemenin
olmadığı sistemlerde (46,143), ya da metal nanopartiküllerle kombine
tasarımlanmış manyetik partiküllere dayalı elektrokimyasal sensörler (123,140)
ile etkin manyetik ayırma sayesinde ve düşük tayin sınırları içersinde analiz
edilebilmektedir. Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik partiküllere dayalı
bir yöntemle göğüs kanseri genindeki 1 no’lu mutasyonun (BRCA1)
elektrokimyasal tayinine yönelik bir sensör teknolojisi rapor edilmiştir (143).
Wang ve arkadaşlarının bir diğer çalışmasında ise aynı genin elektrokimyasal
tayini, streptavidin-alkalen fosfataz enzimine dayalı biyomanyetik yöntem
kullanılarak gerçekleştirilmiştir (138).
Antitümör etkili bir antibiyotik ilaç olan Echinomisin (ECHI) (131) bisinterkalasyon ile çift sarmal ve tek sarmal DNA (dsDNA ve ssDNA) ile
etkileşmesi, damlayan civa elektrodu (HMDE) ile incelenmiştir (64). Jelen ve
arkadaşları tarafından gerçekleştirilen bu çalışmada (64), dsDNA ve ssDNA
varlığında ölçülen ECHI indirgenme sinyalleri arasında anlamlı bir farklanma
olduğu, dolayısıyla ECHI’nin, DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayininde
kullanılabilecek ümit verici bir indikatör olabileceği rapor edilmiştir. Karadeniz ve
arkadaşları tarafından, altın elektrot yüzeyine tutturulmuş kısa DNA dizilerine
dayalı hibridizasyonun tayininde, ECHI’nin hibridizasyon indikatörü olarak
7
kullanılabilirliği başarıyla gösterilmiştir. Bu çalışma, literatürde bir çok çalışmada
hibridizasyon indikatörü olarak kullanıldığı rapor edilen
[Co(phen)3]3+
(23)
varlığında, aynı deneysel koşullarda tekrarlanmış ve elde edilen sonuçlar
birbiriyle karşılaştırıldıktan sonra, ECHI’nin bir hibridizasyon indikatörü olarak
üstünlükleri ortaya konulmuştur (76).
Çalışmamızın ikinci bölümünde, streptavidin-biotin etkileşmesine dayalı
manyetik partiküllerin yüzeyinde DNA hibridizasyonu, hem elektroaktif indikatör
olan ECHI’nin sinyali, hem de guanin ve adenin sinyallerinin DPV tekniği
kullanılarak
ölçülmesiyle
elektrokimyasal
gerçekleştirildi.
hibridizasyon
tayini,
Manyetik
literatürde
ilk
partiküllere
defa
dayalı
ECHI’ye
ait
yükseltgenme sinyali üzerinden bu çalışmada gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, tek
kullanımlık grafit elektroda ve biyomoleküler algılamaya dayalı geliştirilen
sensör teknolojisinde, DNA hibridizasyon tayini için izlenen ECHI, guanin ve
adenin’e ait yükseltgenme sinyallerinin aynı ölçüm aralığında gösterilmesi ilk
defa çalışmamızda gerçekleştirilmiştir ve literatürde bu konuda bir kayda
rastlanılmamıştır. Öncelikle, ECHI’nın elektrokimyasal davranışı grafit elektrot
kullanılarak dönüşümlü voltametri tekniği ile incelendi. DNA hibridizasyonunun
tayinindeki seçimlilik, hedef dizi yerine, rastgele dizi (NC) ve bir bazı hedeften
farklı dizi (MM) kullanılmasıyla araştırıldı.
Nanopartikül, nanotüp ve nanokablolar gibi gelişmiş fizikokimyasal
özelliklere sahip nanomalzemeler, elektrokimyasal sensörlerin daha seçici ve
daha hassas bir şekilde geliştirilebilmesi açısından büyük önem taşımaktadır
(16,24,46,48,55,58,68,73,82,85,89,90,96,102,118,120,153). Sensörlerin çevirici
kısımlarının karbon nanotüp (CNT) gibi nanomalzemelerle tasarımı sonrasında,
genişletilmiş yüzey alanına sahip olması, elektron transferinin hızlı olması ve
8
uzun ömürlü olması nedeniyle, geliştirilen CNT’e dayalı elektrokimyasal
sensörün
DNA
analizlerine
yönelik
kullanımı,
giderek
yaygınlaşmaya
başlamıştır. (46,55,82,90,109,130,144).
BRCA1 DNA geninin elektrokimyasal tayini, Wang ve arkadaşları
tarafından (144), çok duvarlı CNT (MWCNT) modifiye edilmiş camsı karbon
elektrot (GCE) kullanılarak, 100 fmol gibi düşük bir tayin sınırı ile
gerçekleştirimiştir. Nükleik asitlerin elektrokimyasal tayini, karbon nanotüp pasta
elektrodu kullanılarak gösterilmiştir (111). Ayrıca, yüksek hassasiyet ve düşük
maliyete sahip CNT modifiye edilmiş kalem grafit elektrot (CNT-PGE) tasarımı,
literatürde ilk defa Erdem ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiş (46) ve bu
çalışmada,
elektrokimyasal
DNA
analizi
ile
birlikte
dizi
seçimli
DNA
hibridizasyonu herhangi bir indikatör kullanılmaksızın, guanin sinyalindeki
değişim izlenerek başarıyla tayin edilmiştir .
Son yıllarda tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrotlar çok yaygın
şekilde kullanım alanı bulmuştur. Özellikle DNA biyosensör teknolojisinin
geleceği olan DNA mikroçip teknolojisine uygulanabilirliği açısından oldukça
başarılı
sonuçlar
veren
bu
elektrotlar
geleceğin
elektrotları
olarak
gösterilmektedir (21). Perde baskılı elektrotların tekrarlanabilir sonuçlar vermesi
ve 20-40 µL gibi çok düşük miktarlarda örnek kullanılması gibi avantajlarının
yanında, diğer elektrotlara kıyasla uzun fabrikasyon süresi ve yüksek maliyete
sahip olması gibi dezavantajları bulunmaktadır.
MWCNT modifiye perde baskılı elektrot (SPE) ile tek sarmal DNA (ssDNA)
ve maya tRNA’sının elektrokimyasal tayini, Ye ve arkadaşları tarafından
gerçekleştirilmiştir (154). Ayrıca diğer bir çalışmada, SWCNT-SPE’ye dayalı
amperometrik glukoz biyosensörü tasarımlanmıştır (121).
9
Çalışmamızın
son
bölümünde,
herhangi
bir
elektroaktif
indikatör
kullanılmaksızın DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini, karbon nanotüp
modifiye perde baskılı elektrotlar (MWCNT-SPE) ile gerçekleştirildi. MWCNTSPE yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu, DNA yokluğunda ve varlığında
incelendi.
Elektrot
immobilizasyonu
yüzeyine
incelemek
için,
optimum
amino
konsantrasyondaki
ile
işaretlenmiş
DNA’nın
DNA
prob
konsantrasyon farklılığının yanıt üzerindeki etkisi araştırıldı. Dizi seçimli
hibridizasyonunun CNT’e dayalı elektrokimyasal sensör teknolojisine yönelik bir
uygulamasını göstermek amacıyla, Hepatit B virüsünü (HBV) temsil eden
spesifik kısa DNA dizileri (oligonükleotitler) kullanıldı. Çok az bir örnek ile
MWCNT-SPE yüzeyinde gerçekleştirilen HBV DNA hibridizasyonun tayini, HBV
prob ile hedef dizi arasındaki hibridizasyon sonucunda guanin yükseltgenme
sinyalinin, DPV tekniği ile ölçülmesiyle gerçekleştirildi. Ayrıca, tayin sınırı,
seçimlilik ve tekrarlanabilirlik gibi deneysel parametreler incelendi.
Tek kullanımlık grafit elektrot sistemine dayalı çalışmamızın birinci
bölümünde, gümüş nanopartiküller ile işaretlenmiş DNA’nın tayini, ikinci
bölümünde manyetik partiküller kullanılarak indikatörlü ve indikatörsüz DNA
hibridizasyonu tayini, ve çalışmamızın karbon nanotüp modifiye perde baskılı
elektrot sistemine dayalı üçüncü bölümünde, HBV DNA hibridizasyonunun
indikatörsüz olarak elektrokimyasal tayini gerçekleştirildi.
Tez çalışmamızda farklı elektrokimyasal sensör teknolojileri ile
biyomoleküler algılamaya yönelik uygulamaları, çift sarmal DNA (dsDNA) ve
kısa DNA dizileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Böylece gelecekte kimya,
malzeme bilimi, moleküler biyoloji vb. birçok bilim alanın kapsamında; kısacası,
10
multidisipliner
bir
alanda
tasarımlanabilecek
ve
kullanabilecek
sensör
teknolojisine katkı sağlanabilmesi amaçlanmıştır.
Malzeme biliminin ürettiği ve güncel uygulamalar olarak literatürde
karşımıza çıkan nanopartiküller, manyetik partiküller ve karbon nanotüplerin
elektrokimyasal sensör teknolojisine getirdiği avantajlar kullanılarak; (1)
boyutları küçültülerek hassasiyetleri arttırılmış olan malzemelere dayalı
elektrokimyasal sensör teknolojilerinin tasarım ve uygulamalarını göstermek ve
(2) multidisipliner alanda araştırma yapacak araştırmacılara kaynak oluşturacak
bir tez çalışması hedeflenmiştir. Çalışmamızda tasarımlanan biyomoleküler
algılamaya yönelik elektrokimyasal sensör teknolojisinin hazırlık aşamasının
kolay olması, güvenilir ve seçimli sonuçlar vermesi, kullanılan malzemenin
özelliği sebebiyle küçültülmeye ve seri üretime uygulanabilir olması sebebiyle,
gelecekte piyasaya sürülecek DNA çip teknolojisine öncülük edeceği ümit
edilmektedir.
11
GENEL BİLGİLER
1. ELEKTROKİMYA
Madde ile elektrik enerjisi arasındaki etkileşmeyi, bu etkileşimin
sonucunda oluşan kimyasal enerjinin fiziksel enerjiye dönüşümü gibi kimyasal
ve fiziksel değişimleri inceleyen bilim dalı, elektrokimya olarak tanımlanır (1).
Elektrokimyasal tepkimeler, yükseltgenme-indirgenme türü tepkimelerdir,
elektron transferi söz konusudur ve elektrokimyasal hücre adı verilen bir
hücrede yürütülür.
Analizi yapılacak çözelti, bir elektrokimyasal hücrenin parçası olduğunda
çözeltinin elektrokimyasal özelliklerine dayanan bir grup kantitatif analitik
yöntemin incelenmesi “elektroanalitik kimya”nın kapsamına girmektedir.
Elektroanalitik
teknikler
çok
düşük
tayin
sınırlarına
ulaşabilirler
ve
elektrokimyasal yöntemlerin uygulanabildiği sistemler hakkında, bilgileri de
içeren çok fazla sistemi karakterize eden bilgiler verirler.
Elektroanalitik
yöntemler
diğer
analiz
yöntemlerine
göre
bazı
üstünlüklere sahiptirler. Birincisi, elektrokimyasal ölçümler çoğu kez bir
elemente,
moleküle
veya
tepkime
sonunda
oluşan
ürüne
özel
bir
yükseltgenme basamağı için spesifiktir. Elektroanalitik yöntemlerin ikinci bir
önemli üstünlüğü de, kullanılan cihazların nispeten ucuz olmasıdır (1, 14).
Bir elektrokimyasal tepkimenin oluşabilmesi için, incelenen maddeyi içeren
bir çözelti, maddenin kimyasal dönüşüme uğradığı elektrot sistemi ve bu
elektrotları birbirine bağlayan bir çevirim sistemi gereklidir. Çözelti olarak
elektriksel iletkenliği sağlamak amacıyla tampon çözelti kullanılır. Çeşitli
elektrolitik yöntemler ile doğru akım (DC), diferansiyel puls (DPV), dönüşümlü
12
voltametri (CV) vb. de belirli potansiyel aralığında tarama yapılarak meydana
gelen akım şiddeti ölçülür. Akım, difüzyona bağlı olarak oluştuğundan dolayı
burada ölçülen difüzyon akımıdır. Difüzyon, elektrot yüzeyinin yakınındaki
difüzyon tabakasında oluşur ve akımın şiddeti, difüzyon hızı ile doğru orantılıdır.
1.1. Elektrokimyasal Tabakalar
Elektrokimyasal ölçüm yapılırken elektrot yüzeyi ile analizlenecek örnek
çözeltisi arasında heterojen tabakalar meydana gelmektedir. Bunun nedeni,
elektrot, kendisine bitişik olan çözelti tabakasındaki bir türe elektron verebilmesi
veya o tabakadan elektron alabilmesidir. Genel olarak karıştırılan sistemlerdeki
heterojen tabakaların bileşimi Şekil 1’de görülmektedir:
Şekil 1: Elektrot yüzeyindeki tabakaların şematik olarak gösterilmesi.
13
Türbülent akış tabakası: Elektrottan uzak çözelti yığınında gözlenir.
Laminar akış bölgesi: Yüzeye yaklaştığında bir laminer akışa geçiş olur.
Laminar akışta sıvı tabakaları elektrot yüzeyine paralel bir yönde birbiri üzerine
kayarlar.
Nernst difüzyon tabakası: Elektrot yüzeyinden δ cm uzakta, laminer akımının
hızı sıvı ile elektrot arasındaki sürtünmeden dolayı sıfıra yaklaşır ve bunun
sonucunda da elektrot çevresindeki ince, durgun bir çözelti tabakası oluşur.
Genellikle bu çözelti tabakası, 10-2 – 10-3 cm kalınlığında olabilir.
1.2. Elektrokimyasal Tabakaların Elektriksel Olarak İncelenmesi
Elektroda pozitif bir potansiyel uygulandıktan hemen sonra eğer
elektrodun yüzeyinde reaksiyona girebilecek aktif bir tür yoksa, hızlı olarak sıfıra
düşecek anlık bir akım dalgası oluşacaktır. Bu akım her iki elektrodun da
yüzeyinde bir negatif yük fazlalığı (veya eksikliği) yaratan bir yükleme akımıdır.
Fakat, iyonik hareketliliğin bir sonucu olarak elektrotlara bitişik olan çözelti
tabakalarında derhal bir zıt yüklenme oluşur. Bu etkileşim Şekil-2a’da
gösterilmektedir. Elektrodun yüzeyinde, uygulanan pozitif potansiyelin bir
sonucu olarak pozitif yük fazlalığı oluşmuştur. Yüklü çözelti tabakası iki
kısımdan oluşmaktadır :
1- bir yoğun iç tabaka (d0 ‘dan d1’ e), bu tabakada elektrot yüzeyinden
uzaklaşıldıkça ortaya çıkan potansiyel mesafe ile doğru orantılı olarak azalır,
2- bir difüze tabaka (d1 ‘dan d2’ e), burada elektrot yüzeyinden
uzaklaşıldıkça ortaya çıkan potansiyel üstel olarak azalır (Şekil-2b). Elektrot
yüzeyindeki ve yüzeye bitişik çözeltideki bu yük topluluğu bir elektriksel çift
tabaka olarak adlandırılır.
14
Şekil 2: Elektrot yüzeyinde oluşan elektriksel çift tabaka
1.3. Elektrokimyasal Bir Olayda Kütle Aktarım Yolları
Bir elektrokimyasal hücrenin çalışması sırasında maddenin elektrot
yüzeyine aktarım yolları üç şekilde gerçekleşmektedir (115). Bu kütle aktarım
yolları:
1- Elektriksel göç (MİGRASYON): Elektriksel alanın etkisi ile oluşan bir
aktarım yoludur.
2- Karıştırma (KONVEKSİYON): Karıştırma veya titreştirme sonucunda
oluşan kütle aktarım yoludur.
3- Difüzyon: Elektrot yüzeyindeki sıvı filmi ile çözelti arasındaki
konsantrasyon farklarından kaynaklanan bir kütle aktarım yoludur. Deneysel
koşullara bağlı olarak bunlardan bir tanesi veya birkaçı kütle aktarımına katkıda
bulunabilir.
15
Şekil 3: Elektrokimyasal bir olayda kütle aktarım yollarının şema ile
gösterilmesi.
1.4. Elektroanalitik Yöntemler
Çok çeşitli elektroanalitik yöntemler önerilmektedir. Bunlardan en yaygın
kullanılanlar aşağıda gösterilmektedir. Bu yöntemler ara yüzeyde gerçekleşen
yöntemler ve tüm analiz ortamında gerçekleşen yöntemler olarak ikiye ayrılırlar.
Ara yüzeylerde gerçekleştirilen yöntemlerin daha genel bir kullanım alanı
vardır. Ara yüzey yöntemleri, elektrot yüzeyleri ve bu yüzeylere hemen bitişik
olan
ince
çözelti
tabakası
arasındaki
ara
yüzeyde
oluşan
olaylara
dayanmaktadır. Tüm analiz ortamı yöntemleri aksine çözeltinin tamamında
oluşan olaylara dayalıdır ve ara yüzey etkilerinden kaçınmak için her yola
başvurulur.
16
Ara yüzey yöntemleri, elektrokimyasal hücrelerin akımın varlığında veya
yokluğunda işleyişine göre statik ve dinamik olmak üzere iki ana sınıfa ayrılırlar.
1.4.1. Voltametri ve Esasları
Elektroda uygulanan gerilimin bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesine
dayanan elektrokimyasal yönteme voltametri denir (1). Uygulanan gerilimin
ölçülen
akım
değerlerine
karşı
çizilen
grafiğine
voltamogram
denir.
Voltametride, herhangi bir maddenin elektrokimyasal davranışını incelemek için
elektroda uygulanabilecek gerilim aralığının sınırları, kullanılan çalışma
elektrodunun ve kullanılan çözücü ve elektrolit türlerine bağlıdır.
Tarihsel olarak, voltametri Çekoslavak kimyacı Jaroslav Heyrovsky
tarafından 1920’lerin başında geliştirilen ve voltametrinin özel bir tipi olan
17
polarografi tekniğine dayanarak geliştirilmiştir (1). Voltametrinin hala önemli bir
kolu olan polarografinin diğer voltametrik tekniklerden en büyük farkı, çalışma
elektrodu olarak bir damlayan cıva elektrodun (DCE) kullanılmasıdır.
Voltametri, inorganik, fiziko ve biyokimyacılar tarafından çeşitli ortamlarda
oluşan yükseltgenme ve indirgenme işlemlerinin incelenmesi, yüzeydeki
adsorpsiyon işlemlerinin araştırılması ve kimyasal olarak modifiye edilmiş
elektrot
yüzeylerinde
gerçekleşen
elektron
aktarım
mekanizmalarının
aydınlatılması gibi analitik olmayan amaçlar için de oldukça yaygın bir şekilde
kullanılmaktadır.
1.4.2. Voltametride Kullanılan Uyarma Sinyalleri
Elektrokimyasal hücreye değiştirilebilir potansiyelde sinyaller uygulanır. Bu
uyarma sinyalleri, karakteristik akım cevaplarını oluşturur (1). Voltametride en
çok kullanılan dört uyarma sinyalinin şekli, şekil 4’de verilmiştir. Bunlar; doğrusal
taramalı, diferansiyel puls, kare dalga ve üçgen dalgadır.
18
Şekil 4: Voltametride kullanılan potansiyel uyarma sinyalleri.
19
1.4.3. Voltametrik Cihazlar
Voltametrik
analizde
kullanılan
sistem,
elektrokimyasal
hücre,
analizlenecek madde ve destek elektrolit adı verilen çözelti içersine daldırılmış
üç elektrottan oluşan sistemin potensiyostata bağlanmasıyla hazırlanmıştır.
Şekil 5: Üçlü elektrot sistemi içeren potansiyostatın şematize edilmesi.
20
Şekil 6: Üçlü elektrot sisteminin şematize edilmesi.
Üçlü elektrot sistemi, çalışma elektrodu, referans elektrot ve yardımcı
elektrottan oluşmaktadır.
1) Çalışma elektrodu: Yüzeyinde analizlenecek maddenin yükseltgendiği veya
indirgendiği elektrottur. Biyosensör tasarımında çalışmanın amacına göre
değişkenlik gösterebilir.
2) Referans elektrot: Referans elektrot, potansiyeli deney süresince sabit
kalan bir elektrottur. Ag/AgCl referans elektrot veya doygun kalomel elektrot
(DKE) kullanılabilir.
3) Yardımcı elektrot: Pt bir tel veya bir civa havuzu şeklinde olan ve elektriğin
çözelti içinden çalışma elektrotuna aktarılmasını sağlayan karşıt elektrottur. Bu
elektrot, çalışma elektrotu ile bir çift oluşturan, fakat ölçülen potansiyelin
büyüklüğünün tayininde rol oynamayan bir elektrottur.
21
1.4.4. Voltametride Kullanılan Referans Elektrodlar (Karşılaştırma
Elektrotları)
Çalışılan çözeltinin bileşimine duyarsız olan ve elektrokimyasal çalışmalar
sırasında
potansiyeli
dış
ortamdan
etkilenmeyen
elektrotlardır
(1,49,112,115,122).
Elektrokimyada ilk olarak Standart Hidrojen Elektrot (SHE) referans
elektrot olarak kullanılmıştır. Fakat hazırlanması zor bir elektrot olduğu için
kullanımı çok yaygın değildir.
Kullanılan referans elektrot çeşitleri şunlardır;
Kalomel Referans Elektrot: Kalomel (Hg2Cl2) ve metalik civadan
oluşmuş bir karışım ve KCl çözeltisinden oluşur. Bu elektrodun potansiyeli,
klorür iyonlarının aktifliğine bağlıdır. Hazırlanışı çok kolaydır.
En yaygın olan ve içersinde doygun KCl çözeltisi bulunan Doygun Kalomel
Elektrot (DKE)’tur. Potansiyeli, Standart Hidrojen elektroduna (SHE) göre 250C
de + 0,244 V olarak bulunmuştur. Diğer kalomel elektrotlara oranla sıcaklık
katsayısı daha büyüktür.
Gümüş-Gümüş Klorür Referans Elektrot: En yaygın kullanılan referans
elektrotlardan biri olan gümüş-gümüş klörür referans elektrot, bir gümüş telin,
elektrolitik yoldan AgCl ile kaplanması ile klorür iyonu
içeren bir çözeltiye
daldırılarak ile elde edilir.
Doygun KCl çözeltisi kullanıldığı zaman standart hidrojen elektroduna göre
potansiyeli, +0,222 V dur.
22
Civa-Civa(1)Sülfat Referans Elektrot: Bu elektrot, doygun kalomel
elektroda benzemektedir. Potansiyeli, sülfat iyonlarının aktifliği ile belirlenir.
Bir referans elektrot, kolay hazırlanabilmeli, potansiyelin sıcaklıkla değişim
katsayısı küçük olmalı, belli bir akım aralığında tersinir davranmalı; yani içinden
küçük akımlar geçtiğinde bile gerilimi sabit kalmalıdır. Polarize edilemeyen bir
elektrot olmalı, potansiyeli zamanla değişmemeli, doğru ve tekrarlanabilen bir
potansiyel değeri hızlı bir şekilde okumalıdır.
1.4.5. Voltametride Kullanılan Çalışma Elektrotları
Çalışma elektrodunun yapımında kullanılan iletken malzeme, platin ya da
altın gibi inert bir metal; karbon, pirolitik grafit ya da camsı karbon; kalay oksit ya
da indiyum oksit gibi yarı-iletken veya bir civa filmi ile kaplanmış bir metal
olabilir. Bu elektrotlar çeşitli şekil ve büyüklükte olabilmektedirler ve biyosensör
tasarımı için en uygun şekilde geliştirilmektedirler.
Bu tür elektrotların kullanıldığı potansiyel aralığının tespiti çok önemlidir.
Özellikle de bu potansiyel aralığı, sulu çözeltilerde sadece elektrot malzemesine
değil, aynı zamanda bu elektrotların daldırıldığı çözeltinin bileşimine bağlı olarak
da değişir. Pozitif potansiyel sınırları genellikle moleküler oksijen verecek
şekilde, suyun yükseltgenmesi sonunda oluşan büyük akımlarca belirlenir.
Negatif potansiyel sınırları yine suyun indirgenmesi sonunda oluşan hidrojenden
kaynaklanır.
23
Şekil 7: Kullanılan çalışma ortamına göre çalışma elektrotları için seçilen
potansiyel aralıkları.
1.4.5.1. Karbon Elektrotlar
Karbon elektrotlar, özellikle çok ucuz olmaları ve geniş bir potansiyel
aralığında çalışma yapılmasına olanak verdiğinden dolayı elektrokimyasal
analizlerde sık kullanılır. Ancak, karbonun yüksek bir yüzey aktivitesi vardır ve
bu nedenle organik bileşikler tarafından kolayca kirletilebilir. Hidrojen, hidroksil
ve
karboksil
grupları
ve
hatta
kinonlar
karbon
yüzeyinde
bağlar
oluşabilmektedir. Bu fonksiyonel grupların varlığı nedeniyle karbon yüzeyine
birçok değişik madde tutturulabilir.
Elektrokimya alanında çok önemli olan karbon elektrotlarının tüm
çeşitlerinde yüzeylerinin düzgün bir şekilde hazırlanması gereklidir.
24
Karbon elektrotların çeşitleri:
Karbon Pastası Elektrodu (CPE): Grafit tozunda bulunan karbon
moleküllerinin düzlemsel ve aromatik halkalar halinde dizilimi Şekil 8' de
görülmektedir. Zayıf π bağları ile birbirine bağlanmış olan bu tabakalar arasında
hızlı bir elektron alışverişi olabilmektedir. Şekli 9 bir karbon pasta elektrodunun
genel gösterimidir.
CPE, ucuz olması, yüzey yenilenmesinin kolay olması, düşük artık akımlar
oluşturması nedeniyle tercih edilmektedir. Bağlayıcı madde olarak, Nujol
(mineral yağ), parafin yağı, silikon yağı ve bromonaftalen kullanılmaktadır.
Elektrot aktivitesine pasta bileşiminin büyük etkisi vardır. Bağlayıcı organik sıvı
oranı arttıkça, elektron transfer hızı azalmaktadır. Önemli bir sakınca olarak
CPE, organik madde içeren bir çözeltiye daldırıldığı zaman karbon pastası
çözeltide dağılabilir. (18,106,119).
Şekil 8: Grafit tozunda bulunan karbon
elektrodu.
Şekil 9: Karbon pastası
moleküllerinin dizilimi.
25
Perde baskılı karbon (grafit) elektrotlar (SPCE):
Son yıllarda tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrotlar çok yaygın
şekilde kullanım alanı bulmuştur. Özellikle DNA biyosensör teknolojisinin
geleceği olan DNA mikroçip teknolojisine uygulanabilirliği açısından oldukça
başarılı
sonuçlar
veren
bu
elektrotlar
geleceğin
elektrotları
olarak
gösterilmektedir (21). Tek kullanımlık bu elektrotların iyi tekrarlanabilirliğe sahip
olması ve 20-40 µL gibi çok düşük miktarlarda örnek kullanılması gibi
avantajlarının yanında, diğer elektrotlara kıyasla uzun fabrikasyon süresi ve
yüksek maliyete sahip olması gibi dezavantajları bulunmaktadır.
Şekil 10: Perde baskılı karbon (Grafit) elektrot.
Kalem Grafit Elektrot (PGE):
Grafit uç içeren kalem elektrodun tekrarlanabilirliğinin daha iyi olması,
daha düşük tayin sınırı, ucuz ve tek kullanımlık olması sebebiyle bu elektrodun
kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (74,143).
26
Şekil 11: Kalem Grafit Elektrot ve grafit elektrodun yüzeyinin taramalı
elektron mikroskobu (SEM) ile görüntülenmesi.
1.4.5.2. Metal elektrotlar:
Platin ve altın (21,60,81,98,99) en çok tercih edilen elektrot tipleridir. Bu
elektrotlar yüksek elektron transfer kinetiklerine ve geniş bir pozitif potansiyel
aralığına sahiptirler.
Şekil 12: Altın elektrot.
27
1.4.6. Voltametrik Akımlar
Elektrot sistemine gerilim uygulandığında kapasitif akım ve Faradayik akım
olmak üzere iki çeşit akım oluşur.
1- Kapasitif akım (ic) : Bir elektrodun bir elektrolit çözeltisine daldırılması
ve negatif yükle yüklenmesiyle çözeltideki pozitif yüklü iyonlar elektroda doğru
çekilir. Böylece ara yüzeyde bir gerilim farkı oluşur. Ters işaretli yüklerin ara
yüzeyin iki tarafında birikmesi ile bu bölgede bir elektriksel çift tabaka oluşur.
Oluşan bu çift tabaka, bir kapasitör gibi davranır. Bu kapasitörü yüklemek için
ortamda yükseltgenecek veya indirgenecek madde olmasa dahi bir akım oluşur.
Bu akım reaksiyona bağlı değildir; sistemden kaynaklanır ki bu akıma kapasitif
akım denir. Ne kadar düşük olursa, o kadar duyar ölçüm yapılır. Kapasitif akım
fon akımın oluşmasına neden olan etkenlerden biridir.
2- Faradayik akım (if): Reaksiyondan kaynaklanan (analiz edilecek
maddeden) akımdır.
i = if + ic
olduğundan ic azalırsa duyarlılık artar.
Genellikle 10-3 M ve üstünde; ic < if dir ve çalışılabilir. 10-4 M da kısmen
iyi sonuç alınır. 10-5 M ve üstünde ; ic >> if olduğu için çalışılamaz.
1.4.7. Elektrokimyasal Bir Olayda Faradayik İşlemler
Çözelti ve elektrot arasındaki yüzeyden akımın iletimi sırasında,
elektrotlardan birinde yükseltgenme reaksiyonları olurken, diğerinde indirgenme
reaksiyonu meydana gelir. Bu reaksiyonlarda ;
O + ne- ↔ R
O ve R’nin, sırasıyla, redoks çiftinin, yükseltgenmiş ve indirgenmiş şeklini ifade
ettiği tepkime ile gösterilmektedir. Termodinamik kurallarla kontrol edilen
sistemlerde,
elektrot
potansiyeli,
elektroaktif
türün
elektrot
yüzeyindeki
28
derişiminin
[Co(0,t)
ve
CR(0,t)],
Nernst
Denklemine
(eşitlik
1.1)
göre
saptanmasında kullanılabilir.
(1.1)
E0 = Redoks tepkimesi için standart potansiyel
R = Gaz sabiti (8.314 JK-1mol-1)
T = Sıcaklık (0K)
n = Reaksiyonda transfer edilen elektron sayısı
F = Faraday sabiti (96487 coulombs)
Elektrot ara yüzeyinde meydana gelen redoks tepkimesi sırasında akım,
elektronların doğrudan aktarımı yoluyla iletilir. Bir elektrottaki kimyasal madde
miktarının geçen akımla doğru orantılı olduğunu ifade eden bu tip işlemlere,
faradayik işlemler, bu şekilde oluşan akımlara da faradayik akımlar adı verilir.
Analizlenecek madde ve ürünlerin konsantrasyonları yalnızca elektrot
yüzeyinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak ve Nerst tabakası içinde değişir.
1.4.8. Voltametrik Teknikler
1.4.8.1. Dönüşümlü Voltametri
Bu teknikle, gerilimin bir fonksiyonu olarak akım ölçülür. Sürekli değişen
potansiyel değerlerine karşı belirli bir aralıkta akımdaki değişim grafiğe
geçirilerek dönüşümlü voltamogram elde edilir. Dönüşümlü voltametri ile
durgun sistemde ve üçlü elektrot sistemiyle çalışılır. Burada hızı difüzyon tayin
eder.
Analitin
yükseltgenmesi
ve
indirgenmesi
voltamogramda
29
gözlenebilmektedir. İlk olarak, potansiyel bir maksimuma kadar artar, daha
sonra başlangıç değerine yine doğrusal olarak geri döner.
Şekil 13: (a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilimin
zamana karşı grafiği ; (b) Dönüşümlü voltametride elde edilen akım-gerilim
eğrisi.
Doğru akımdaki gibi kapasitif akımın en küçük olduğu bölgede çalışılır.
Duyarlılık 10-5 M ile sınırlıdır. Dönüşümlü voltametri, miktar tayini için uygun bir
yöntem değildir, analizlenecek maddenin hangi potansiyelde nasıl davrandığı
hakkında bilgi verir.
Dönüşümlü voltamogramların şekli ve yapısında, seçilen potansiyel
aralığının yanısıra, seçilen tarama hızının ve kaç defa tarama yapıldığının da
etkisi vardır.
Bir dönüşümlü voltamogramdaki indirgenme ve yükseltgenme arasındaki
gerilim farkı ∆Ep ile ifade edilir.
∆E
p
=
57
mV
n
30
∆Ep bu değere ne kadar yakın ise, tepkime reversible (tersinir); ne kadar
uzaksa irreversible (tersinmez) olarak adlandırılır.
1.4.8.2. Diferansiyel Puls Voltametrisi
Bu teknikle, yarı-dalga potansiyelleri 0,04 – 0,05 V kadar farklı olan
maddeler için bile birbirinden farklı konumlarda pik maksimumları elde
edilebilmektedir. Diferansiyel puls polarografisi, çok duyarlı bir yöntemdir ve
tayin sınırı 10-7-10-8 M arasındadır.
10 mV'luk veya 50 mV'luk bir puls civa damlasına uygulanır. Uygulanan
pulsun belli bir zaman öncesi ve sonrasında, puls başına elde edilen akımdaki
fark (∆i), doğrusal olarak artan potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilir.
Gözlenen diferansiyel eğri pik şeklinde olup, yüksekliği konsantrasyonla
doğru orantılıdır.
31
Şekil 14: Diferansiyel puls polarografisi için uyarma sinyalleri; (a) Analog
cihazlarda diferansiyel puls voltametrisi için kullanılan uyarma sinyali; (b)
Diferansiyel puls voltametrisinde elde edilen bir voltamogram.
Faradayik akımın yüksek, faradayik olmayan yükleme akımının ise düşük
değerde olması duyarlılığın artmasıyla açıklanabilir. Örneğin potansiyel aniden
50 mV arttırıldığında, elektrodu çevreleyen yüzey tabakasında, eğer elektroaktif
bir tür varsa, analizlenecek madde konsantrasyonunu yeni potansiyel tarafından
istenen seviyeye düşürecek bir akım artışı gözlenir. Ancak bu potansiyel için
gerekli olan denge konsantrasyonuna erişilince, akım difüzyonu karşılayacak bir
seviyeye düşer ki buna difüzyon kontrollü akım denir. Puls polarografisinde
akım ölçümü, bu akım artışı tamamen sona ermeden önce yapılır. Toplam
akım, difüzyon akımından büyüktür. Damla değiştiğinde, çözelti yeniden
analizlenecek madde yönünden homojen hale gelmektedir.
32
Gerilim pulsu ilk uygulandığı zaman damla üzerinde yük artışı nedeniyle
faradayik olmayan akımda da bir dalgalanma olur. Bu akım zamanla azalır ve
yüzey alanının çok az değiştiği damla ömrünün sonuna doğru sıfıra yaklaşır.
Dolayısıyla akımı bu anda ölçmek suretiyle faradayik olmayan artık akım büyük
oranda azaltılır ve sinyal/gürültü oranı artar. Bunun sonucunda duyarlılık da
artar.
Elektrokimya’nın
pek
çok
uygulama
alanı
vardır.
Bunlardan
biri
Biyosensörlerdir.
2. BİYOSENSÖR
Biyosensörler, biyolojik tepkimelerde hedef maddeleri algılamak için
kullanılan küçük cihazlardır. Birbiri içine geçmiş biri biyokimyasal, diğeri
elektrokimyasal özellikteki iki çeviriciden oluşmaktadır. Biyokimyasal kısmın
görevi analizlenecek maddeyle etkileşerek onu tanımaktır. Bu tanıma olayının
sonucunda bir biyokimyasal ürün de oluşabilmektedir. Biyosensörün ikinci kısmı
olan elektrokimyasal kısım ise bu tanıma olayını ölçülebilir bir sayısal değere
çevirmekle görevlidir (20,26,129).
Şema 1: (I) Biyosensör yapısının şematize edilmesi ve (II) biyosensör
yüzeyinde gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonların gösterilmesi.
33
2.1. Biyosensör Çeşitleri
2.2. İdeal Bir Biyosensörün Sahip Olması Gereken Özellikler
İdeal
bir
biyosensörün
sahip
olması
gereken
özellikler
aşağıda
sıralanmaktadır (59).
Seçicilik: İdeal bir biyosensörde en önemli parametrelerden birisi, seçicilik
özelliğidir. Eğer yeterli seçicilik mevcut değilse, bu eksiği giderecek uzun
işlemler eklenmesi gerekir.
Kullanım ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli
faktör, biyolojik çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Bu durum ayrıca,
biyosensörün
kalibrasyon
sıklığı,
stabilite,
tekrarlanabilirlik
gibi
diğer
parametreleri de etkilemektedir.
Kalibrasyon gereksinmesi: İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek
duymaması, ya da en az kalibrasyona gereksinmesi istenir. Fakat bu özellik,
teorikte planlandığı gibi değildir, pratikte gerçekleştirilememiştir. Kullanım
ömürleri boyunca biyosensörler, sıklıkla kalibre edilmelidirler.
34
Tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için, elektrodun aynı koşullar
altında arka arkaya yapılan ölçümlerde hemen hemen aynı değerlerin okunması
istenir. Pratikte pek mümkün olmayan bu durum göz önüne alınarak, yapılan
çalışmalarda
tekrarlanabilirlik
parametresi
mutlaka
incelenmelidir.
Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa, biyosensörün uygulamalarının o denli iyi
olduğundan söz edilebilir.
Kararlılık: Elektrot kararlılığının yüksek olması ideal biyosensörler için
gereklidir. Kararlılık,
kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına
bağlıdır; ayrıca pH, ısı, nem, ortamdaki oksijen konsantrasyonu gibi
parametrelerden de etkilenmektedir.
Yüksek duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin
yalnız
belirli
maddelere
karşı
duyarlı
olması,
ideal
biyosensörlerin
özelliklerindendir.
Yeterli düzeyde tayin sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının
belirli bir konsantrasyon değerinin altında olması gerekmektedir. Belirtilen bu
sınır, elektrot yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin tayin edilecek maddeye
afinitesi, immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir.
Geniş ölçüm aralığı: Biyosensör uygulamalarında ölçüm aralığı olarak
adlandırılan bölge biyosensörlerden alınan akım-konsantrasyon eğrilerinin
lineer olduğu konsantrasyon aralığıdır.
Hızlı cevap zamanı:
Bir biyosensör elektrodunun cevap zamanı elde
edilen akım-zaman eğrilerinden anlaşılabilir. Örneğin elde edilen eğride
basamakların şekli basık ve genişse cevap zamanı uzun (yavaş), tersi söz
konusu ise cevap zamanı kısa (hızlı)'dır.
35
Hızlı
geriye
dönme
zamanı:
Geriye
dönme
zamanı,
örneğin
amperometrik çalışmalarda, ilk örnekten ne kadar süre sonra ikinci örneğin
ölçülebileceğini belirler. Yani ilk örneğin ilavesinden sonra sabit akım değerleri
kısa sürede gözlenebiliyorsa, ikinci örnekte aynı süre sonra ilave edilebilecektir.
Basitlik ve ucuzluk: Tasarımı basit ve ucuz, kullanımı rahat biyosensörler
ideal biyosensörlerdir. Bu nedenle ilk biyosensörlerdeki karmaşık ve de pahalı
olan
yapılar,
daha
sonra
basitleştirilmiş
ve
mümkün
olduğunca
da
ucuzlaştırılmıştır.
Küçültülebilirlik
ve
sterilize
edilebilirlik:
Elektrotlarının
sterilize
edilebilmesi ve boyutlarının küçültülmesi biyosensör tasarımında önemlidir.
Buna karşın, biyosensör yapısına giren biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığı,
sterilizasyonu kısıtlayan en önemli parametredir.
2.3. Biyosensör Tasarımında Kullanılan Moleküller ve Yapıları
2.3.1. Nükleik Asitler ve DNA
Nükleik asitlerin primer yapısı, belirli tür ve sayıdaki nükleotidlerin belirli bir
diziliş sırasına göre 3'-5' fosfodiester bağları ile birbirlerine bağlanarak
polinükleotid zinciri oluşturmaları sonucu oluşmaktadır (30-32,114). Molekül
içerisindeki nükleotid bağlarını parçalayan nükleaz enzimlerine endonükleaz,
iki
uçtan
parçalayalanlara
ise
ekzonükleaz
adı
verilmektedir.
DNA
(Deoksiribonükleik asit) moleküllerine ait X-ışınları difraksiyon verilerinden ve
Chargaff tarafından DNA molekülünde adenin (A) ve timin (T) miktarları ile
guanin (G) ve sitozin (C) miktarlarının eşit olduğu belirlenmiştir. Buna
dayanarak Watson, Crick ve Wilkins tarafından 1950 yıllarında DNA yapısı için
çift zincirli heliks şeklindeki yapı modeli önerilmiştir. Bazları arasında yer alan
hidrojen bağları tarafından çift sarmal DNA molekülünün iki zinciri birarada
36
tutulmaktadır. Çift zincirli sarmalda bazlar sarmal iç kısımda, fosfat ve şeker
omurgası ise dış kısımda yer aldığı için, sarmalın iç kısmı hidrofobik, dış kısmı
ise hidrofilik özelliktedir. Pürin ve pirimidin nükleotidleri arasındaki eşleşmeler
son derece spesifiktir (A-T ve G-C şeklinde). Bu sayede, DNA yapısında yer
alan bir polinükleotid zinciri daima ikinci zincirin tamamlayıcısı olduğundan, bir
zincirdeki baz dizisi verildiğinde, ikinci zincirdeki baz dizisi bulunabilmektedir.
DNA ısıtıldığında, heliks yapısı bozularak ikiye ayrılır. Denatürasyon adı verilen
DNA heliks yapısının bozulması 260 nm dalga boyunda absorpsiyon ölçülerek
gözlemlenebilmektedir. G ve C arasında üç hidrojen bağı (G≡C) bulunduğundan
yüksek derişimde G ve C içeren DNA, iki hidrojen bağı taşıyan A ve T (A=T)
bulunduran DNA yapısına göre daha yüksek sıcaklıkta denatüre olmaktadır.
Uygun şartlar altında çift zincirli DNA tekrar oluşabilir, bu işlem renatürasyon
olarak isimlendirilir.
37
Şekil 15: DNA çift sarmal yapısı
Çift sarmal şeklindeki molekülün bir zinciri 5'
ise
3'
3' yönüne doğru, diğeri
5' yönüne doğru olduğu için ters yönde paraleldir. Heliks içinde, iki
zincirin arasındaki üç boyutlu sistemdeki ilişki, büyük oluk (majör) ve küçük oluk
(minör) oluşturmak şeklindedir. Molekülündeki zincirler, çift sarmalın dış
yüzeyindedir. Bu zincirlerden her biri kovalent bağlılığı sağlayan fosfodiester
köprülerinin bulunduğu fosfat ve pentoz gruplarından oluşmuştur. DNA çift
sarmalın her iki zinciri, pürin ve pirimidin bazlarının arasındaki hidrojen bağları
ile bir arada tutulmaktadır.
38
Şekil 16: DNA yapısında bulunan baz, şeker ve fosfat gruplarının
şematize edilmesi.
Watson ve Crick tarafından 1953 yılında önerilen ilk DNA yapısı, sağa
doğru yönelmiş, her dönüşte 10 nükleotidi bulunan ve küçük oluğa mükemmel
yerleşen bağlı su ile stabilize olabilen yapıya sahiptir. DNA dehidrate edildiği
zaman, yapısal değişikliğe uğrayarak A-DNA adını almaktadır. A-DNA da sağa
doğru yöneliktir ve her dönüşünde 11 nükleotid bulunmaktadır. Çift sarmalın
çapı, pentoz gruplarının yapılanmasıyla genişlemektedir. Bu durumun bir
sonucu olarak DNA’nın boyu kısalmaktadır (32).
39
2.3.1.1. DNA İle İlgili Bazı Terimlerin Tanımlamaları
2.3.1.1.1. DNA Baz Dizilerinin Yazılımı İle İlgili Temel Bilgiler: (30)
Oligonükleotit: Birden fazla nükleotidin yan yana gelmesiyle oluşur.
Dinükleotitler; İki nükleotidin yan yana gelmesiyle oluşur.
Trinükleotitler; üç nükleotidin yan yana gelmesiyle oluşur.
Tekrarlayan
oligonükleotidler:
Polimer
içindeki
tekrarlayan
oligonükleotidler, tekrarlayan tek bir bazı, tekrarlayan iki bazı ve ya üç bazı ifade
eder. Tekrarlayan mononükleotide poly (A), dinükleotide poly (AT), trinükleotide
poly (GAT) örnek verilebilir.
Çift sarmal tekrarlayan polimerler: Nokta ile ayrılarak ifade edilen baz
çiftlerinden oluşan ve 5’
Örneğin,
3’ polaritesine sahip polimerlerdir.
mononükleotit
gösterilişine,
poly(A).poly(T)
(veya
poly(Da).poly(Dt) şeklinde gösterilebilir), dinükleotid’e poly(AT).poly(AT),
trinükleotid’e poly (GAT). Poly (ATC) örnek verilebilir.
Baz çifti: Birbirinin karşılığı olan iki bazı ifade eder ve gösterilirken nokta
ile ayrılır. Örneğin, A.T veya G.C baz çiftleri gibi.
Prob: Baz dizisi belli olan oligonükleotit.
Hedef dizi (Target): Prob dizisinin tam karşılığı olan oligonükleotit.
Yanlış eşleşen dizi (Mismatch-MM): Bir bazı veya birden fazla bazı
hedef dizisiden farklı olan oligonükleotit.
Rastgele dizi (Non complementary-NC): Hedef dizisiden tamamen
farklı baz dizilimine sahip oligonükleotit.
40
2.3.1.1.2.
İnterkalasyon
Düzlemsel bir halka sistemine sahip olan bazı maddelerin DNA baz çiftleri
arasına yerleşerek, güçlü bir şekilde bağlanması olayıdır (9,50). Maddenin
yapısına bağlı olarak, bu etkileşim dönüşümlü ya da dönüşümsüz şekilde
gerçekleşmektedir (149). İnterkalasyon, DNA' da zincir kırılmasına yol açarak ve
DNA senteziyle DNA' ya bağımlı RNA sentezini bozmaktadır. Bu maddeler
Topoizomeraz (II) enzimini inhibe ederler. İnterkalasyon yapabilen bazı ilaçların
etki mekanizmaları, bu şekilde açıklanmaktadır.
Şekil 17: Düzlemsel yapıya sahip bir molekülün çift sarmal DNA baz çiftleri
arasına yerleşmesi (interkalasyon).
2.3.1.1.3. Nükleik Asit (DNA) Hibridizasyonu:
Nükleik asit hibridizasyonu, baz çiftlerinin özel hibridizasyon koşullarına
bağlı olarak kararlı bir dupleks molekülü oluşturmasıdır (8).
41
Şekil 18: Nükleik asit hibridizasyonu.
2.4. DNA BİYOSENSÖRLERİ (GENOSENSÖRLER, GENE DAYALI
SENSÖRLER)
Biyosensör tasarımında kullanılan dizi tanıma yüzeyleri, Analitik Kimya
alanında yeni ve ilgi çekicidir (106,113,119,133). Bu tür tanıma yüzeyleri, sahip
olduğumuz bilinen elektrokimyasal biyosensörlere yeni boyutlar kazandıracak
ve gelecekte hasta başında veya doktor gözetimindeki analizlerde önemli bir rol
oynayacaktır (133).
Tanıma
biyosensörleri
yüzeyi
olarak
DNA’nın
(genosensörler;
gene
kullanıldığı
dayalı
biyosensörlere
sensörler)
adı
DNA
verilir
(92,93,105,110,132). DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının
izlenmesinde (81,137) veya bu yüzey ile etkileşime giren analizlenecek
maddelerin (karsinojen madeler, ilaçlar, vb.) tayininde kullanılabilir (13,40,41).
42
2.4.1. DNA Biyosensörlerinin sınıflandırılması
Günümüze dek tasarımı yapılan genosensörlerde iki temel konu üzerine
yoğunlaşma görülmektedir; madde DNA etkileşmesine dayalı genosensörler ve
DNA hibridizasyonuna dayalı genosensörler.
Kimyasal maddeler veya radyasyon ile DNA’nın etkileşmesi, maddelerin
DNA’ya
kovalent
bağlanması
veya
kovalent
olmayan
bağlanmalar
(interkalasyon) ile sonuçlanabilir. Hibridizasyon tanısına yönelik genosensörler
ise
çeşitli
bulaşıcı
ve
kalıtsal
hastalıkların,
mutasyonların
ve
mikroorganizmaların tayininde önemli rol oynamaktadır.
Genosensörlerin sınıflandırılması şu şekildedir;
A. Madde-DNA etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri
İlaç, toksik maddeler vb. gibi bazı kimyasal maddelerin DNA ile
etkileşimini inceleyerek ilaç tasarımı, çevresel toksik madde analizleri ve çeşitli
kimyasal savaş ajanlarının tayininde kullanılmaktadır.
İlaç-DNA etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri
İlaç molekülleri ile DNA’nın etkileşmesi ve bu etkileşimin tayini
(5,28,43,45,75,94,117,125,), elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin uygulama
alanına yeni bir boyut getirmiştir. Yeni sentezlenen ilaçların DNA ile
etkileşmesinin
tayini,
kısa
sürede
ve
hassas
şekilde
biyosensörlerle
gerçekleştirilebilmektedir.
İlaç molekülünün dsDNA ile etkileşimi; negatif yüklü şeker-fosfat grubu
ile elektrostatik olarak etkileşim, çift sarmalın büyük ve küçük oluklarına
bağlanma veya interkalasyonla olabilmektedir. Özellikle etkisini DNA’ya
bağlanarak gösteren antikanser ilaçların etki mekanizmasının aydınlatılması
mümkün olmaktadır.
43
Elektrokimyasal biyosensörlerle yapılan ilaç-DNA etkileşmesine dayalı
çalışmalarda; (1) DNA ile etkileşen ilacın kendi sinyalindeki değişim ve elde
edilen sinyalde bir azalma veya artma gözlenmesi, (2) DNA bazları guanin veya
adenin sinyalindeki değişim üzerinden duyarlı bir tayin yapılabilmektedir. Yeni
antibiyotik, antiviral, antitümör ilaç ve antisens oligonükleotitlerine dayalı ilaç
hedefleme çalışmalarına yön vermek veya bir ilaç hammaddesinin detaylı
analizinin duyarlı şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak gibi amaçlarla maddeDNA
etkileşmesine
dayalı
biyosensörler
geliştirme
çalışmaları
devam
etmektedir (13,40,41).
Antikanser etkili bir ilaç olan Epuribisin’in çift sarmal ve tek sarmal DNA
ile olan etkileşmesi karbon pastası elektrodu (CPE) ile incelenmiştir (41).
Antitümör etkili bir antibiyotik ilaç olan Echinomisin (ECHI) (54,76)’nin
çift sarmal ve tek sarmal DNA ile etkileşmesi damlayan cıva elektrodu (HMDE)
ile incelenmiştir (64). Ayrıca, kısa DNA dizilerine dayalı hibridizasyonun
tayininde, ECHI’nin hibridizasyon indikatörü olarak kullanılabilirliği altın elektrot
kullanılarak araştırılmıştır (76).
Antitümör etkili bir antibiyotik ilaç olan Mitomisin C (MC) çift sarmal DNA
ile olan etkileşmesi perde baskılı karbon elektrot (SPCE) ve tek kullanımlık
kalem grafit elektrot (PGE) ile incelenmiştir (100). Ayrıca, yeni bir ilaç dağıtım
sistemi olan mikroemülsiyon içerisine yüklenmiş MC’nin çift sarmal DNA ile
olan etkileşimi PGE ile incelenmiştir (75).
Nanoteknoloji
alanındaki
yeni
gelişmeler
ile
birlikte
ilaç-DNA
etkileşmesinin tayininde kullanılan elektrokimyasal DNA biyosensörlerinde
uygulanmaya başlanmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (46,97,124). Guo ve
arkadaşları tarafından, klorpromazin (CPR) ve DNA arasındaki etkileşimin
44
elektrokimyasal DNA biyosensörleri ile tayininde MWCNT modifiye edilmiş
altın elektrot kullanılmıştır (56). Bir antikanser ilaç olan dakarbazin (DCBN)’nin
etkileşim
tayininde
ise
titanyum
dioksit
nanopartiküller
kullanılarak
elektrokimyasal tayin Song ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir (124).
Kanser hücrelerinde berberin adlı ilacın dsDNA ile olan etkileşimi, MWCNT
kullanılarak perde baskılı elektrotlar (SPE) ile tayin edilmiştir (97).
Toksik madde-DNA etkileşmesine dayalı DNA biyosensörleri
Toprak, su ve hava gibi çevresel örneklerin analizlerinde (25) DNA
biyosensörü kullanımı son yıllarda yaygınlaşmaktadır. Toksik etkisi incelenecek
madde, DNA ile sensör yüzeyinde veya çözelti bazında etkileşimi sonrasında,
elde edilen sinyal farklanmaları incelenmektedir (78).
Kimyasal savaş ajanlarının tayinine yönelik biyosensörler
Kimyasal silah amacıyla kullanılan maddeler de benzer şekilde
biyosensörlerle
maddelerin
tayin
edilebilir.
Özellikle
DNA’ya
verdikleri
büyük
organofosfat
hasar,
bileşimine
biyosensör
sahip
kullanarak
saptanabilmektedir ve bu alanda Wang ve arkadaşları akışa enjeksiyon yöntemi
kullanarak nitroaromatik patlayıcılar ve organofosfatlı sinir gazlarının tayinini tek
kanal mikroçip sisteminde gerçekleştirmişlerdir (146).
45
B. DNA hibridizasyonuna dayalı DNA biyosensörleri
DNA hibridizasyon tayini için tasarımı yapılacak biyosensörlerin;
hedefteki tek bazdaki farklılığı yakalamaya imkan verecek şekilde seçimliliğe ve
düşük tayin sınırına sahip olması gerekmektedir.
1.
Bulaşıcı
ve
kalıtsal
hastalıkların
tanısına
yönelik
DNA
biyosensörleri
İnsan, virüs ve bakteri DNA’sının baz dizilimlerinin aydınlatılmasıyla pek
çok katılımsal hastalığa sebep olan mutasyonlar artık saptanabilmektedir.
Diziye özgü DNA biyosensörleri, bir çevirim sistemi ile beraber DNA probundan
oluşmuştur. Tek sarmal kısa oligonükleotit içeren ve aranan hedefin baz
dizisinin karşılığı olan problar çözelti içerisinde kendisine seçimli bağlanacak
kısmı seçerler ve hibritleşirler (60). Bu bağlanmanın tasarımı yapılan
biyosensörlerle kısa sürede ve yüksek duyarlılıkta algılanması mümkün
olmaktadır.
Elektrokimyasal
DNA
biyosensörleri
kullanılarak
gerçekleştirilen
elektrokimyasal ölçümlerde hibritin oluştuğu elektrot, bir elektroaktif indikatör ile
etkileştirilir ve indikatörün hibrite bağlanma düzeyi belirlenir. Hibridizasyon
oluşumundan sonra bu hibritle etkileşen indikatörün neden olduğu artan veya
azalan elektrokimyasal yanıt, hibridizasyon tayinine yönelik bir sinyal olarak
kabul edilir (79,84,139). Ayrıca çeşitli analizlerde DNA’nın elektroaktif
bazlarından hareketle indikatörsüz tayinler de yapılabilmektedir (47,83).
Mikroorganizmaların tayinine yönelik DNA biyosensörleri
Toprak, hava, su ve gıdalar içine karışan, hem doğal kaynakları hem de
insan sağlığını tehtid ederek çeşitli hastalıklara yol açan mikroorganizmaların
tayini için biyosensör tasarımları mevcuttur (53,69). Elektrokimyasal DNA
46
hibridizasyon tayini hastalık tayinlerine benzer şekilde gıda maddelerindeki
mikroorganizmaların
tanısı
indikatörlü
ve
indikatörsüz
olarak
gerçekleştirilebilmektedir. Bu amaçla tayini yapılacak mikroorganizmanın gen
haritasına göre problar seçilir (37). Çözelti ortamında prob ve hedef birbirini
tanıyarak hibritleşir ve bu şekilde tayin yapılır.
2.4.2. DNA biyosensörlerinde prob dizilerinin elektrot yüzeyine
tutturulma yolları
DNA biyosensörlerinde 15-30 bazlı kısa DNA dizileri (oligonükleotitler),
prob olarak elektrot yüzeyine tutturulmaktadır (36,46,76). Hibridizasyon tayinin
daha kolay gerçekleşmesi için, prob dizisinin elektrot yüzeyine güçlü ve düzenli
bir şekilde bağlanması hedeflenmektedir.
2.4.2.1.
Pasif
adsorbsiyon
yoluyla
prob
tutturulması
(ıslak
adsorbsiyon yöntemi)
Kullanılan elektrodun, prob içeren analiz çözelti içersine daldırılarak
probun elektrot yüzeyine adsorbe olması ilkesine dayanır (34,47,102). Basit ve
otomasyona uygulanabilirliği kolay olan bir yöntemdir. Pahalı kimyasal madde
kullanımı ve elektrokimyasal potansiyel uygulama basamaklarının ortadan
kaldırılması nedeniyle ucuzdur ve tayin süresi de kısalmaktadır.
2.4.2.2. Elektrostatik yolla prob tutturulması
Elektrot yüzeyine pozitif (+) potansiyel uygulanarak, negatif (-) yüklü fosfat
omurgasına sahip olan DNA’nın elektriksel çekim kuvvetleri sayesinde, elektrot
yüzeyine paralel olarak tutunması ilkesine dayanır (100). Pahalı kimyasal
maddeler kullanılmaması nedeniyle maliyeti düşük bir yöntemdir.
47
2.4.2.3. Kovalent yolla prob tutturulması
Prob dizilerinin elektrot yüzeyine kovalent bağlanma ajanları kullanılarak,
kovalent olarak tutturulması ilkesine dayanır (76,91,99). Bu şekilde yapılan
tutturma işlemi ile elektrot yüzeyinde daha düzenli ve daha dayanıklı bir prob
tabakası oluşmaktadır, bu da hibridizasyon tayininde çok önemli bir rol
oynamaktadır. Ancak pahalı kimyasal maddeler kullanılması ve diğer
yöntemlere oranla daha uzun bir işlem olması gibi dezavantajları bulunmaktadır.
2.4.2.4. Avidin-Biyotin etkileşimi nedeniyle streptavidin kaplı yüzeye
biyotinle işaretlenmiş prob tutturulması
Streptavidin ile kaplanmış çeşitli elektrot yüzeylerine ya da manyetik
partiküller gibi yüzeyler üzerine, biyotin ile işaretlenmiş problar, streptavidin ve
biyotin arasındaki güçlü afinite nedeniyle spesifik bir şekilde tutturulmaktadır
(21,47,48,98,138).
2.4.3.
Elektrokimyasal
Genosensörler
ile
DNA
Dizi
Algılama
Yöntemleri
Elektrokimyasal genosensörler, aranan hedefin baz dizisinin karşılığı olan
15-30 baz gibi kısa bir baz dizimine sahip olan sentetik tek sarmallı DNA
(ssDNA) oligomerin (veya “PROB“ olarak isimlendirilir), elektrot yüzeyine
bağlanmasına dayanmaktadır. Hedefi içeren bir örnek çözeltisine sensörün
uygulanması ile elektrot yüzeyinde hibrit oluşur. Elektrokimyasal ölçümlerde
elektrot yüzeyinde oluşan hibrit iki yöntemle tayin edilir; bunlardan ilki bir
elektroaktif indikatör aracılığıyla (örneğin bir redoks-aktif anyonik metal
kompleksi) yapılan tayindir. Bu yöntemde yüzeyinde hibrit oluşan elektrot
indikatörü içeren çözeltiye daldırılır ve indikatörün hibrite bağlanma düzeyi
belirlenir (35-40,66,72,79,86). Diğer yöntem ise DNA bazlarından en elektroaktif
48
olan
guanin
bazının
+1,0
V’da
verdiği
yükseltgenme
sinyalinin
farklılanmasından yola çıkılarak yapılan tayindir (2,15,51,65,70,80,81).
2.4.3.1. İndikatöre Dayalı Genosensörler ile Dizi Algılama Yöntemleri
İndikatöre dayalı DNA dizi algılanması, DNA’ya interkale olabilen (metal
kompleksleri, antibiyotikler)
(6,22,23) veya DNA dizisindeki bazlarla özgün
olarak etkileşen (Metilen mavisi, Ru(bpy)33+, vb.) elektroaktif maddeler
(indikatör) ile tayin edilebilmektedir (35-38,52,126,). Elektrokimyasal çeviriciler,
hibridizasyon
olayını
analitik
sinyale
çevirmede
etkin
bir
şekilde
kullanılmaktadır.
Elektrot yüzeyinde oluşan hibrit ile etkileşen indikatörün neden olduğu
artan veya azalan elektrokimyasal yanıt ile hibridizasyonun tayini gerçekleştirilir
(95,98,99).
Elektroaktif bir maddenin indikatör olarak kullanılabilmesi için ssDNA ve
dsDNA ile etkileşimi sonucu alınan yanıtlar arasında anlamlı bir fark olması
gerekmektedir.
2.4.3.1.1. İnterkalatör molekül ile:
İnterkalasyon; bir maddenin DNA çift sarmalı arasına girip birikmesidir. Bu
durumda, çift sarmal DNA (dsDNA) ile etkileşimden sonra alınan madde sinyali
maddenin birikmesinden dolayı tek sarmal DNA (ssDNA) ile etkileşimden sonra
alınan madde sinyaline göre oldukça yüksektir (3,6,22,35,36).
49
Şekil 19: İnterkalatör bir hibridizasyon indikatörü ile DNA dizi algılanması;
(1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm.
2.4.3.1.2. DNA bazları ile etkileşen bir molekül ile:
Hibridizasyon indikatörü olarak kullanılan madde DNA’nın bazlarından
biriyle (özellikle Guanin) etkileşiyor olabilir. Bu durumda, tek sarmal DNA
(ssDNA)
’da
bazlar
açıkta
olduğundan
dolayı
alınan
madde
sinyali,
hibridizasyondan sonra oluşan çift sarmal DNA (dsDNA) ’da bazlar kapalı
50
olduğundan dolayı alınan madde sinyaline oranla oldukça yüksektir (21,35-37,
70,71,81).
Şekil 20: DNA bazlarından biriyle etkileşen bir hibridizasyon indikatörü ile
DNA dizi algılanması; (1) indikatör ile etkileşme, (2) elektrokimyasal ölçüm.
2.4.3.2. İndikatörsüz DNA Dizi Algılama Yöntemleri:
Elektrot yüzeyine tutturulan tek sarmal prob diziye
Guaninlerin
verdiği
elektrokimyasal
yanıt
ile,
probun
(ssDNA) ait
komplementeriyle
birleşmesinden sonra oluşan çift sarmal DNA’ ya ait guaninlerden alınan
51
elektrokimyasal yanıt arasında önemli bir farklılanma vardır. Bu farklılanmadan
hareketle hibridizasyonun tayini gerçekleştirilir (51,67,80-82,127).
Şekil 21: İndikatörsüz DNA dizi algılama yöntemi; (1) elektrokimyasal
ölçüm.
Son dönemlerde nanoteknolojinin ve dolayısıyla nanomalzemelerin
elektrokimyasal DNA biyosensörlerinde kullanımına artan bir ilgi bulunmaktadır
(42,77,109,116,130,135,136).
52
3. NANOTEKNOLOJİ
Nanoteknoloji, maddenin nanometre ölçeğinde yani atomsal, moleküler
ve supramoleküler yapılar düzeyinde denetlenmesi yoluyla yeni malzeme, cihaz
ve sistemlerin tasarlanmasını ve üretilmesini konu alan bir teknoloji dalıdır.
Maddeleri moleküler ya da nanometre düzeyinde ele alan bir mühendislik bilimi
olan nanoteknoloji, daha güçlü ve daha hafif elektronik materyallerin kullanıldığı
yeni bir süreç vaat ederek bilim insanlarının son yıllarda umutlarını arttırmaya
devam etmektedir. Bilim adamları, gün geçtikçe çalışmalarında daha küçük
boyutlara yönelmeye, daha az yer kaplayan, daha az enerji harcayarak daha
hızlı çalışabilecek aygıtlar hazırlamaya çalışmışlardır.
Bir aygıtta kullanılan malzemenin boyutu küçüldükçe, çalışma hızı da
artar ve o malzemenin yeni fiziksel özellikleri ortaya çıkar. Boyutlar nanometre
ölçeklerine yaklaşırken, malzemenin fiziksel özellikleri kuantum mekaniğinin
kontrolüne girip, elektron durumlarının fazı ve enerji spektrumunun kesikli yapısı
daha belirgin hale gelmektedir. Daha da önemlisi, malzemeyi oluşturan atom
sayıları yüz civarına inince, atomsal yapının geometrisi, hatta atom sayısının
kendisi bile fiziksel özelliklerin belirlenmesinde etken olmaktadır. Örneğin; yarı
iletken olarak bilinen ve çağımızın en önemli malzemesi olan silisyumdan
yapılan bir telin çapı nanometreye yaklaşırken tel iletken bir karakter
sergilemektedir.
Nanoteknolojinin uygulama amaçları:
1)
Nanometre ölçekli yapıların analizi,
2)
Nanometre boyutunda yapıların fiziksel özelliklerinin anlaşılması,
3)
Nanometre ölçekli yapıların imalatı,
4)
Nano hassasiyetli cihazların geliştirilmesi,
53
5)
Nano ölçekli cihazların geliştirilmesi,
6)
Uygun yöntemler kullanılarak nanoskopik ve makroskopik dünya
arasındaki bağın kurulması.
3.1. Nanoteknolojinin Kullanım Alanları
* Mikrosensörlerin, mikromakinaların, optoelektronik elemanların imalatı ve
uygun şekilde bir araya getirilmesinde,
* Lazer yapımında,
* Manyetikleştirilmiş nano katmanları en ufak değişiklikleri farkedecek
şekilde bir çip içine integre edilip, trafik sensörü olarak uçak ve otomobilleri
tanımada ve manyetik alanlarına bakarak tiplerini de belirleyebilmede,
* Medikal alanında: Mikrocerrahide (göz, beyin vb.), diagnostik kitlerde,
yüzey karakterizasyonu ve modifikasyonu, mikroorganizmaların taşınmasında,
kanserli hücrelerin tedavisinde,
* DNA modifikasyonu gibi yüzey immobilizasyon tekniklerinde,
* Kozmetik sanayisinde,
* Dokumada kullanılacak olan elektronik fiberler sayesinde, istenildiğinde
renk değiştirebilen, vücudumuzu zararlı ışınlardan koruyan hatta özel polimerler
sayesinde terin emilip vücudumuzun kuru kalmasını sağlayan, su tutmayan
giysilerin üretiminde,
* Mikromakinalar sayesinde de bilgisayar teknolojisinde,
* Kapasitör, transistör ve fotodiyot yapımında,
* Güneş pillerinde,
* İlaç endüstrisinde,
* Yüksek çözünürlüğe sahip ölçü aletlerinin yapımında uygulama alanları
bulunmaktadır.
54
Uygulamaya
konulacak
projeler
arasında,
2012
yılında
yapımı
tamamlanacak olan uzay asansörü ve moleküler nanoteknoloji gibi birçok alan
da bulunmaktadır.
Son 10 yılda, nanopartiküller, nanotüpler ve diğer nanomalzemelere
dayalı
sensörlere
artan
bir
ilgi
bulunmaktadır
(7,24,46,48,58,68,69,82,89,109,120).
Nanoteknolojinin en güncel konularından biri karbon nanotüplerdir.
Karbon nanotüpler üstün elektronik ve mekanik özelliklere sahip grafit silindirik
boru veya karbon atomlarının birleşmesiyle oluşan futbol topu şeklinde
yapılardır. Bu topların diğer atom veya moleküllerle yaptığı bileşiklere “fulleren”
denir.
Nanotüpler çelikten daha serttir ve plastik kadar esnektir. Elektriği
şimdiye kadar keşfedilen tüm maddelere göre daha iyi iletirler. CNT’ler fiziksel
yapılarına göre iki şekilde sınıflandırılırlar; (a) Tek duvarlı CNT’ler (SWCNT) ve
(b) Çok duvarlı CNT’ler (MWCNT).
Şekil 22: Karbon nanotüpler (CNT); (A) tek duvarlı ve (B) çok duvarlı.
55
Karbon nanotüplerin üretiminde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bu
yöntemlerin en önemlileri; lazer buharlaştırma yöntemi ve ark buharlaştırma
yöntemidir.
Bunların
dışında,
mekanik
öğütme
ve
diğer
yöntemler
bulunmaktadır.
Çeşitli tekniklerle nükleik asitlerin nanopartikül yüzeyine tutturulması ve
bunların elektrokimyasal sensör teknolojisinde kullanılmaları yaygınlaşmaktadır
(4,29,44,47,57,102,138,140-143,150,151,155). Wang ve arkadaşları tarafından
DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini streptavidin kaplı altın (Au)
nanopartiküller kullanılarak gerçekleştirilmiştir (150). Authier ve arkadaşları
tarafından,
PCR
amplikonlarından
human
cytomegalovirus
virüsün
elektrokimyasal tayini, altın nanopartikül ile işaretlenmiş DNA prob kullanılarak
yapılmıştır (4). Cai ve arkadaşları tarafından gümüş nanopartiküllere dayalı
DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini, asit çözeltisi kullanılarak
gerçekleştirilmiştir (57).
Ayrıca, nanopartiküllere dayalı DNA analizinin etkin manyetik ayırma
sayesinde
gerçekleştirilebildiğine
dair
kayıtlar
literatürde
mevcuttur
(138,141,142). Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik ayırma sayesinde
seçimli bir DNA analizinin kullanılan nanopartikülden gelen gümüş sinyalinin
+0.28
V’da,
perde
baskılı
gerçekleştirilebildiği
gösterilmiştir
çalışmasında
DNA
ise,
analizi
elektrotlar
(151).
için
ile
Wang
ölçülmesiyle
ve
kadmiyum
başarıyla
arkadaşlarının
sülfür
diğer
nanopartikülleri
kullanılmıştır (142).
Manyetik partiküllere dayalı etkin ayırma ve elektrokimyasal sensörlerinin
birlikte kullanıldığı çift tabaka tekniklerinin kullanımına, son 10 yıldır artan bir ilgi
bulunmaktadır
(44,108,123,138,140,143,145).
Bu
çalışmalarda
kullanılan
56
partiküller, paramanyetik partiküller olup, sıvı fazdan küçük bir mıknatıs
yardımıyla kolayca ayrılabilmekte ve mıknatıs çözeltiden uzaklaştırıldığında,
partiküller sıvı faz içinde tekrar kolayca dağılabilmektedir (44,108). Dizi seçimli
DNA hibridizasyonu, enzimle işaretli (108,138) ve herhangi bir işaretlemenin
olmadığı sistemlerde (46,143), ya da metal nanopartiküllerle kombine
tasarımlanmış manyetik partiküllere dayalı elektrokimyasal sensörler (123,140)
ile etkin manyetik ayırma sayesinde ve düşük tayin sınırları içersinde analiz
edilebilmektedir. Wang ve arkadaşları tarafından, manyetik partiküllere dayalı
bir yöntemle göğüs kanseri genindeki 1 no’lu mutasyonun (BRCA1)
elektrokimyasal tayinine yönelik bir sensör teknolojisi rapor edilmiştir (143).
Wang ve arkadaşlarının bir diğer çalışmasında ise aynı genin elektrokimyasal
tayini, streptavidin-alkalen fosfataz enzimine dayalı biyomanyetik yöntem
kullanılarak gerçekleştirilmiştir (138).
4. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM)
İnsan gözünün çok ince ayrıntıları görebilme olanağı sınırlıdır. Bu nedenle
görüntü iletimini sağlayan ışık yollarının merceklerle değiştirilerek, daha küçük
ayrıntıların görülebilmesine olanak sağlayan optik cihazlar geliştirilmiştir. Ancak
bu cihazlar, gerek büyütme miktarlarının sınırlı oluşu gerekse elde edilen
görüntü üzerinde işlem yapma imkânının olmayışı nedeniyle araştırmacıları bu
temel üzerinde yeni sistemler geliştirmeye itmiştir. Elektronik ve optik
sistemlerin birlikte kullanımı ile yüksek büyütmelerde üzerinde işlem ve analizler
yapılabilen görüntülerin elde edildiği cihazlar geliştirilmiştir.
Elektro-optik prensipler çerçevesinde tasarlanmış taramalı elektron
mikroskobu (Scanning Electron Microscope-SEM), bu amaca hizmet eden
cihazlardan birisidir (62). Taramalı Elektron Mikroskobu, birçok dalda araştırma-
57
geliştirme
çalışmalarında
kullanımı
yanında,
mikro
elektronikte
yonga
üretiminde, sanayinin değişik kollarında hata analizlerinde, biyolojik bilimlerde,
tıp ve kriminal uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Taramalı Elektron Mikroskobunda (SEM) görüntü, yüksek voltaj ile
hızlandırılmış elektronların numune üzerine odaklanması, bu elektron demetinin
numune yüzeyinde taratılması sırasında elektron ve numune atomları arasında
oluşan
çeşitli
girişimler
sonucunda
meydana
gelen
etkilerin
uygun
algılayıcılarda toplanması ve sinyal güçlendiricilerinden geçirildikten sonra bir
katot ışınları tüpünün ekranına aktarılmasıyla elde edilir. Modern sistemlerde bu
algılayıcılardan gelen sinyaller dijital sinyallere çevrilip bilgisayar monitörüne
verilmektedir. Gerek ayırım gücü (resolution), gerek odak derinliği (depth of
focus) gerekse görüntü ve analizi birleştirebilme özelliği, taramalı elektron
mikroskobunun kullanım alanını genişletmektedir.
Taramalı
Elektron
Mikroskobu
Optik
Kolon,
Numune
Hücresi
Görüntüleme Sistemi olmak üzere üç temel kısımdan oluşmaktadır (Şekil 23).
ve
58
Şekil 23: Taramalı elektron mikroskobunun (SEM) şematik görünüşü.
5. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)
Bu mikroskopta elektron ışını çok ince bir örneğe yönlendirilir (62).
Elektron mikroskobunda, projeksiyon mercekleri olarak adlandırılan mercekler
gerçek görüntüyü flouresans ya da fotografik film üzerine düşürmelidir, çünkü
gözümüz elektron görüntüsünü doğrudan göremez. TEM için kullanılan örnekler
çok ince olmalıdır. 10-20 nm kadar incelikte örnekler, özel yöntemlerle
hazırlanabilmektedir.
59
6. DNA çip teknolojisi:
Moleküler
teknolojisindeki
tanı
yöntemlerindeki
gelişmelerin
eklenmesi
ilerlemelere
sonucunda,
mikrofabrikasyon
mikroçip
teknolojisi
gündeme gelmiş ve bu teknoloji, insan genom projesinin tamamlanması ile ivme
kazanmıştır. Mikroçip teknolojisi ile binlerce gen veya ürünleri (RNA ve
proteinler gibi) arasındaki ilişkiyi bir çip (yonga) üzerinde, eş zamanlı olarak
araştırabilmek ve genetik şifremizi taşıyan nükleik asitlerin nasıl çalıştığımızı
anlamamız mümkün olacaktır. Klinikte ve hasta başında gerçekleştirilecek DNA
analizlerinde kullanılacak küçük boyutlarda ve tüm sağlık ekibinin kolayca
kullanabileceği yeni cihazların tasarımları, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki bazı
büyük firmalar tarafından başlatılmıştır. 1994 yılında S. Mikkelsen’in dizi seçici
DNA sensörleri ile yapmış olduğu kalıtsal hastalıkların tayini projesi Amerika
Birleşik Devletleri tarafından korunmaya alınmış olup, kullandığı teknolojinin
lisansını Clinical Micro Sensors Inc. (CMS) adlı Amerikan şirketi satın almış ve
böylelikle DNA çiplerinin hayata geçirilmesi için ilk çalışmalar başlamıştır. Başta
Amerika Birleşik Devletleri olmak üzere, dünya üzerinde birçok firma tarafından
DNA çiplerine yönelik araştırmalar yürütülmekte, ve özellikle nanoteknolojinin
gündeme gelmesiyle çalışmalar yoğun bir şekilde bu yönde devam etmektedir.
Mikroarray teknolojisi, DNA’ların çipler, küçük cam slayd veya naylon
membran
üzerinde
hibridizasyonla,
genlerin
ekspresyon
düzeylerinin
belirlenmesi için kullanılan bir yöntemdir. Genel olarak üç farklı mikroarray
çeşidi
bulunmaktadır:
mikrodizilimleri,
cam
naylon
üzerine
membran
sentezlenen
üzerine
cDNA
sentezlenen
cDNA
mikrodizilimleri
ve
oligonükleotide dizilimler (DNA çipleri) dir. 1995’de Standford Üniversitesi
tarafından geliştirilen cDNA mikroarrayleri cam üzerine UV-maskelemesi veya
60
ışıkla aktif olan kimyasal kullanılarak direkt olarak sentezlenmiş ve sabitlenmiş
kısa cDNA dizilerini içermektedir. Oligonükleotit arraylar ise, Affimetrix firması
tarafından geliştirildiler; bu yüzden Affimetrix veya DNA çipleri olarak da anılırlar
(63). In situ olarak cam slayd veya slikon yüzeyler üzerine sentezlenmiş
oligolardan
(mRNA
ve/veya
cDNA)
oluşurlar.
DNA
çipleri
mikroarrayleri gibi fotolitografi tekniği kullanılarak hazırlanırlar.
Şekil 24. Affimetrix firmasına ait mikroarray görünümü.
de
cDNA
61
BÖLÜM II
GEREÇ ve YÖNTEM
2.1. Kullanılan Cihazlar
Deneyler ve ölçümler sırasında kullanılan tüm cihaz ve donanımlar:
Terazi (Mettler Toledo AB204-S)
Ses titreşimli temizleyici (Bandelin Sonorex)
pH-metre (Orion 420A)
Manyetik karıştırıcı (Biosan MS 3000)
Vorteks (Biosan V1)
Potansiyostat (AUTOLAB 302, GPES 4,9 yazılımlı; Eco Chemie)
MCB 1200 Biyomanyetik ayırma platformu (Sigris)
Ag/AgCl referans elektrot (BAS)
Platin tel (Yardımcı elektrot olarak kullanıldı)
2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Echinomisin (Sigma)
Asetik asit ( %99-100) (Merck)
Hidroklorik asit (%37)
(Merck)
Sodyum Hidroksit
(Merck)
Dipotasyummonohidrojenfosfat (Riedel-de Haen)
Potasyumdihidrojenfosfat (Riedel-de Haen)
Tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Sigma)
Sodyum klorür (Sigma)
EDTA disodyum tuzu (Sigma)
Lityum klorür (Sigma)
62
N-Hidroksisüksinimit (NHS) (Sigma)
Etilkarbodiimit (1-etil-3-dietil aminopropil karbodiimid hidroklorür) (EDC)
(Sigma)
Buzağı timus bezinden elde edilen DNA [=Calf Thymus DNA; çift sarmal
DNA (ctdsDNA)].
Tüm çalışmalarda ultra saf su kullanıldı. Deneysel çalışmalar oda
sıcaklığında (25,0 ± 0,5 ) °C’ de gerçekleştirildi.
2.2.1. Echinomisin (ECHI) Hakkında Genel Bilgi:
Açık kimyasal formül:
Kapalı Kimyasal formül: C51H64N12O12S2
Kimyasal özellikleri: DMSO’da ve etanolda iyi, suda az çözünür.
Molekül ağırlığı: 1.101,27 gr/mol
Diğer isimleri: Quinomisin A
Farmakolojik Özellikleri: Bisiklik peptit yapısında olan ECHI, antimikrobiyal ve
antitümör aktivitesi gösteren kinoksalin grubu antibiyotiklerden birisidir (131).
63
Çift sarmal DNA ile etkileştiği ve bis-interkalasyon ile dsDNA’ya bağlandığı
(152) rapor edilmiştir.
2.2.2. Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı
2.2.2.1. Oligonükleotit Çözeltilerinin Hazırlanışı:
Çalışmalarımızda kullanılan oligonükleotit dizileri TIB Molbiol (Almanya)
firmasından liyofilize toz halinde temin edildi. Stok çözeltiler Tris-EDTA (pH 7,4)
tamponu ile hazırlandı.
2.2.2.1.1. Ag-NP’lere dayalı deneylerde kullanılan oligonükleotit
dizileri:
Amino ile işaretlenmiş DNA (ODN-DNA):
5’- NH2 –(CH2)6-gAg ggT gTC TgA Agg Agg ggg– 3’
2.2.2.1.2
Manyetik
partiküllere
dayalı
deneylerde
kullanılan
deneylerde
kullanılan
oligonükleotit dizileri:
Biyotin ile işaretlenmiş prob:
5’-biyotin- TTT TTT TTT CgA TCg Ag-3’
Hedef:
5’- CTC gAT CgA AAA AAA AA-3’
Rastgele dizi (NC):
5’- TgA AAC gAT TAT gAT AC- 3’
Bir bazı hedeften farklı dizi (MM):
5’- CTC gAT CgA AgA AAA AA- 3’
2.2.2.1.3
MWCNT-SPE
sistemine
dayalı
oligonükleotit dizileri:
Amino ile işaretlenmiş prob:
5’- NH2 –(CH2)6 -gAg ggT gTC TgA Agg Agg ggg– 3’
64
Bu çalışmada kullanılan Hepatit B virüsünü (HBV) temsil eden prob dizisi
daha önce yapılan çalışmalarda (2,37,38,44,48) belirtildiği gibi HBV’yi temsil
eden gen haritasından seçildi ve bu dizide guanin bazının olmaması
indikatörsüz hibridizasyon tayini açısından çalışmaya avantaj kazandırdı. Prob
dizisinin
elektrot
yüzeyine
daha
düzgün
bir
şekilde
bağlanması
ve
hibridizasyonun sterik açıdan daha verimli bir şekilde gerçekleşmesi amacıyla,
çalışmamızda amino hekzan ile işaretlenmiş prob dizisi kullanıldı.
Kullanılan diziler;
HBV prob:
5’ –NH2 –(CH2)6 -AAT ACC ACA TCA TCC ATA TA– 3’
Hedef:
5’ –TAT ATg gAT gAT gTg gTA TT– 3’
Tek bazı farklı hedef dizi (MM):
5’ –TAT cTg gAT gAT gTg gTA TT– 3’
Rastgele dizi (NC):
5’ –AAT ACC TgT ATT CCT CgC CTg TC– 3’
Tüm oligonükleotit stok çözeltileri Tris-EDTA tampon çözeltisi (pH 7,4) ile
1000 µg/mL konsantrasyonunda hazırlandı ve sıfır derecenin altında saklandı.
2.2.2.2. Tampon Çözeltilerin Hazırlanışı:
Tüm tampon çözeltilerin hazırlanışında ultra saf su kullandı. Tampon
çözeltiler hazırlandıktan sonra plastik şişelerde, buzdolabında saklandı.
0,05 M fosfat tampon çözeltisinin hazırlanışı (pH 7,4; PBS):
Ölçümler sırasında kullanılan 0,05 M fosfat tampon çözeltisi litresinde 1,36
g (0,01 mol) KH2PO4, 6,96 g (0,04 mol) K2HPO4 ve 1,168 g NaCl (0,02 mol)
65
içermektedir. Hazırlanan tampon çözeltisinin pH değeri yaklaşık 7,4 olmaktadır.
Çözeltinin pH’sı gerekliyse, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl ilavesiyle pHmetre
ile 7,4’e ayarlanır.
0,50 M asetat tampon çözeltisinin hazırlanışı (pH 4,8; ABS):
Kullanılan 0,50 M asetat tampon çözeltisi litresinde 0,2722 g sodyum
asetat trihidrat, 0,1154 mL asetik asit ve 1,168 g NaCl (0,02 mol) içermektedir.
Çözeltinin pH'sının 4,8 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl
ilavesiyle, pHmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi.
0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin hazırlanışı (pH 7,0; TBS):
Kullanılan 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisi litresinde 3,152 g Trizma HCl
ve 1,168 g NaCl (0,02 mol)
içermektedir. Çözeltinin pH'sının 7,0 değerine
ayarlanması, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl ilavesiyle, pHmetre ile ölçülerek
gerçekleştirildi.
0,01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA tampon çözeltisinin hazırlanışı (pH 8,0;
Tris-EDTA):
Kullanılan 0,01 M Tris-HCl, 1 mM EDTA tampon çözeltisi litresinde 1,576 g
Trizma HCl ve 0,372 g EDTA içermektedir. Çözeltinin pH'sının 8,0 değerine
ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, pHmetre ile ölçülerek
gerçekleştirildi.
0,075 M Sodyum sitrat tampon çözeltisinin hazırlanışı (pH 7,0 ve 8,0;
NaCB):
Kullanılan 0,075 M sodyum sitrat tampon çözeltisinin litresinde 22,06 g
trisodyum sitrat dihidrat ve 43,88 g NaCl (0,75 mol) içermektedir. Çözeltinin
66
pH'sının 7,0 veya 8,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl
ilavesiyle, pHmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi.
0,1 M TTL tampon çözeltisi (pH 8,0):
Kullanılan 0,1 M Tris-HCl çözeltisi litresinde 15,76 g Trizma HCl, 4,239 g
LiCl ve % 0,1 oranında yüzey aktif madde olan Tween 20 içermektedir.
Çözeltinin pH'sının 8,0 değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl
ilavesiyle, pHmetre ile ölçülerek gerçekleştirildi.
0,25 M TT tampon çözeltisi (pH 8,0):
Kullanılan 0,25 M Tris-HCl çözeltisi litresinde 39,4 g Trizma HCl ve % 0,1
oranında yüzey aktif madde olan Tween 20 içermektedir. Çözeltinin pH'sının 8,0
değerine ayarlanması, 0,1 N NaOH ve/veya 0,1 N HCl ilavesiyle, pHmetre ile
ölçülerek gerçekleştirildi.
2.3. Kullanılan yöntem:
Kullanılan elektrotların aktivasyonu ve elektrot yüzeyine DNA ve/veya
oligonükleotitlerin tutturulması, hibridizasyon işlemlerine ilişkin basamaklarda,
mevcut literatürlerde (37,43,44,101,105) rapor edilen yol izlenmiştir.
67
2.3.1. Kullanılan elektrotların hazırlanışı:
2.3.1.1. Kalem Ucu Grafit Elektrot (PGE) Hazırlanışı:
Çalışmada kullanılan kalem grafit elektrot, Tombo kalem uçlarının 3.0 cm
boyutunda kesilmesiyle hazırlandı (101,143). Elektrokimyasal hücre içerisinde
1.0 cm kalacak şekilde kalem içerisine yerleştirildi.
2.3.1.2. CNT modifiye SPE:
Perde baskılı elektrot 3,4 x 1,0 x 0,05 cm (Uzunluk x Genişlik x
Yükseklik) boyutlarında olup üç kısımdan oluşmaktadır; (a) yüzeyi karboksil
gruplarıyla zenginleştirilmiş çok duvarlı karbon nanotüp içeren grafit çalışma
elektrodu, (b) grafit yardımcı elektrot ve (c) Ag/AgCl referans elektrot. Grafit
çalışma elektrodu yüzeyi 4.0 mm çapındadır. Kullanılan çok duvarlı karbon
nanotüplerin çapı 10 nm, boyları ise 1-2 µm civarındadır. Bu tek kullanımlık
perde baskılı elektrotlar Dropsens (Oviedo-Asturias, İspanya) firmasından temin
edildi ve elektrotların potansiyostata bağlantısı özel bir DropSens bağlayıcısı
(DSC) ile sağlandı (61).
68
2.4. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA
analizine yönelik çalışma:
1,0 mM Ag-NP stok çözeltisi NaCB ile hazırlandı. Çalışma ortamı olarak
ABS kullanıldı. Bu çalışmada 2.2.2.1.1’de belirtilen oligonükleotit dizileri
kullanıldı.
Şema
2:
Gümüş
nanopartiküllerin
(Ag-NPs)
yüzeyine
DNA’nın
tutturulması ve tek kullanımlık kalem grafit elektrotlar kullanılarak DNA’nın
elektrokimyasal algılanmasında takip edilen basamaklar; (1) amino işaretli DNA’
nın Ag-NP üzerine tutturulması, (2) Ag-NP ile işaretlenmiş DNA’nın PGE
yüzeyine pasif adsorpsiyonu (3) üçlü elektrot sistemi bağlantısı ile voltametrik
olarak gümüş ve guanin sinyallerinin ölçülmesi.
69
2.4.1.
Gümüş nanopartiküllerin (Ag-NP) sentezi ve mikroskobik
karaterizasyonu:
Çalışmada kullanılan gümüş nanopartiküller (Ag-NP) Porto Üniversitesi
Fen Fakültesi Kimya Bölümünde, kolloidal altın ve gümüş partikül (128) sentezi
için Turkevich tarafından geliştirilen yönteme göre yapılmış ve tarafımıza temin
edilmiştir. 5 mg gümüş (gümüş nitrat olarak) içeren sulu çözelti devamlı
karıştırılarak kaynama noktasına kadar ısıtıldı. Bu noktada % 1’lik (a/a) sodyum
sitrat çözeltisinden 5 mL ilave edildi. Yaklaşık 45 dakika sonra açık yeşil bir
çözelti elde edildi. Hazırlanan bu nanopartiküller, karanlıkta saklanmak suretiyle
birkaç ay süreyle kullanılabilir. Ag-NP’lerin karakterizasyonu, transmisyon
elektron mikroskobu (TEM) (JEOL 200M OS-1, Agar Scientific, İngiltere) ile
Porto üniversitesinde yapıldı.
Nanopartiküllerin partikül büyüklüğü tayini ve taramalı elektron mikroskobu
(SEM) (JEOL JSM 6301F, Agar Scientific, İngiltere) ile karekterizasyonu, Porto
Üniversitesi
Fen
Fakültesi’nde
yapılmıştır.
TEM
ve
SEM
görüntüleri,
nanopartiküller hazırlandıktan sonra izlendi ve 3 ile 5 ay süresince partikül
büyüklüğünde
herhangi
bir
değişim
gözlenmedi.
Ayrıca,
gümüş
nanopartiküllerin stabilitesi, UV-Vis spektrofotometre tekniği kullanılarak ölçüldü
(50,51) ve herhangi bir farklılık gözlenmedi.
2.4.2. Ag-NP’lerin elektrokimyasal davranışının incelenmesi:
Ag-NP’lerin elektrokimyasal davranışlarını göstermek amacıyla, dönüşümlü
voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) yöntemleri kullanıldı.
70
2.4.2.1.
Ag-NP’lerin
elektrokimyasal
davranışının
dönüşümlü
voltametri (CV) tekniği ile incelenmesi:
PGE’nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M ABS içersinde +1,4 V uygulanarak
30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi.
PGE yüzeyine Ag-NP immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE,
NaCB içinde hazırlanmış 1,0 mM NP stok çözeltisi içine daldırıldı.
Ölçüm: -0,1 V ile +1,0 V arasında 100 mV/s tarama hızıyla, 50 mV’luk
puls genliğinde tarama yapılarak, ABS içersinde ölçüm gerçekleştirildi ve
gümüşe ait yükseltgenme sinyali incelendi.
2.4.2.2. Ag-NP’lerin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls
voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi:
PGE’nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M ABS içersinde +1,4 V uygulanarak
30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi.
PGE yüzeyine Ag-NP immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE,
NaCB içinde hazırlanmış 1,0 mM NP stok çözeltisi içine daldırıldı ve potansiyel
uygulanmadan 5 dakika boyunca karıştırıldı. Daha sonra immobilize edilmiş
PGE, NaCB ile 10 saniye süreyle yıkandı.
Ölçüm: -0,2 V ile +1,4 V arasında, 30 mV/s tarama hızıyla, 50 mV’luk
puls genliğinde tarama yapılarak ABS içersinde ölçüm gerçekleştirildi ve
gümüşe ait yükseltgenme sinyali incelendi.
71
2.4.3. AgNP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin
tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayini:
1,0 mM Ag-NP stok çözeltisi içersinde 50 µg/mL amino ile işaretlenmiş
ODN-DNA hazırlandı ve bu karışım 5 dakika boyunca vortekste 500 rpm hızı ile
karıştırıldı. NP üzerine DNA immobilizasyonu için, ODN-DNA ve NP karışımı
içeren viyaller, 1 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bekletildi.
Aktive edilmiş PGE’ler, ODN-DNA ve NP karışım çözeltisinden 110 µL
içeren viyallere daldırıldı ve pasif adsorbsiyon prosedürüne (72,99) göre,
elektrotlar bu viyaller içinde 60 dakika süreyle bekletildi. Daha sonra PGE’ler 10
saniye boyunca NaCB ile yıkandı.
Ölçüm:
-0,2 V ile +1,4 V arasında, 30 mV/s tarama hızıyla, 50 mV’luk puls
genliğinde tarama yapılarak ABS içersinde ölçüm yapılarak, gümüş ve guaninin
yükseltgenme sinyalleri incelendi.
Gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulacak kısa DNA dizisinin ne tür bir
işaretleme içermesi konusunda bilgi edinmek amacıyla, işaretsiz DNA dizisi
veya tiyol grubu ile işaretlenmiş farklı türdeki kısa DNA dizileri ile aynı çalışma
tekrarlandı.
2.4.4. DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin
yükseltgenme sinyaline olan etkisinin incelenmesi:
Bu çalışmada yüzeyi aktive edilmiş PGE kullanıldı. Yöntem 2.4.3.’deki
koşullarda gerçekleştirildi. 0-60 µg/mL aralığındaki DNA konsantrasyonlarında
elde edilen sinyal farklılıkları incelendi.
72
2.4.5. Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesi:
Bu çalışmada yüzeyi aktive edilmiş PGE kullanıldı. Yöntem 2.4.3.’deki
koşullarda gerçekleştirildi. Ölçüm tamponu olarak ABS veya NaCB kullanıldı ve
farklı pH’lara sahip tampon değişiminin yanıta olan etkisi incelendi.
2.4.6. AgNP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin
incelenmesi:
Bu çalışmada yüzeyi aktive edilmiş PGE kullanıldı. Yöntem 2.4.3.’deki
koşullarda gerçekleştirildi. Çalışmada AgNP stok çözeltisi ile birlikte 1:2 ile 1:50
oranları arasında seyreltilmiş, değişen konsantrasyonlarda AgNP kullanıldı ve
nanopartikül konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi incelendi.
2.5. Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun
indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine yönelik
çalışmalar:
2.5.1. ECHI’nin elektrokimyasal davranışının incelenmesi:
ECHI stok çözeltisi, 2.620 mM konsantrasyonunda olacak şekilde
metanol
ile
hazırlandı.
ECHI’nin
elektrokimyasal
davranışı,
dönüşümlü
voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) teknikleri ile PGE
kullanılarak incelendi.
2.5.1.1. ECHI’nin elektrokimyasal davranışının dönüşümlü voltametri
(CV) tekniği ile incelenmesi:
PGE’nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M PBS içersinde +1,4 V uygulanarak
30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi.
PGE yüzeyine ECHI immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, TBS
içinde hazırlanmış 5 µM ECHI çözeltisi içine daldırıldı ve 5 dakika süreyle
73
potansiyel uygulanmadan karıştırıldı. Daha sonra yüzeyine ECHI tutturulmuş
PGE, 10 saniye süre ile TBS ile yıkandı.
Ölçüm: -0,25 V ile -1,2 V arasında 100 mV/s tarama hızı tarama
yapılarak PBS içersinde ölçüm gerçekleştirildi ve ECHI’ye ait yükseltgenme
sinyali incelendi.
2.5.1.2. ECHI’nin elektrokimyasal davranışının diferansiyel puls
voltametri (DPV) tekniği ile incelenmesi:
PGE’nin aktivasyonu: PGE, 0,05 M PBS içersinde +1,4 V uygulanarak
30 saniye süre ile karıştırılmayan ortamda aktive edildi.
PGE yüzeyine ECHI immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmiş PGE, TBS
içinde hazırlanmış 0,1-10 µM arasında değişen farklı konsantrasyonlardaki
ECHI çözeltisi içine daldırıldı ve 5 dakika süreyle potansiyel uygulanmadan
karıştırıldı. Daha sonra yüzeyine ECHI tutturulmuş PGE, 10 saniye süre ile TBS
ile yıkandı.
Ölçüm: -0,8 V ile -0,2 V arasında 100 mV/s tarama hızıyla ölçüm
gerçekleştirildi ve ECHI’ye ait yükseltgenme sinyali incelendi.
74
2.5.2. Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz
elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini:
Bu çalışmada 2.2.3.1.2’de belirtilen oligonükleotit dizileri ve çalışma
ortamı olarak çeşitli tampon çözeltileri kullanıldı. Piyasada mevcut streptavidin
ile kaplı ve büyüklüğü 2,8 µm olan manyetik partiküller (Dynal Biotech ASA,
Norveç) ile deneyler gerçekleştirildi.
Şema 3. Manyetik partiküllere dayalı indikatörlü ve indikatörsüz
elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayini: (1) streptavidin kaplı manyetik
partiküllerin yüzeyine biyotin ile işaretli DNA probun immobilizasyonu; (2)
hedef/NC/MM varlığında hibridizasyon; (3) ECHI akümülasyonu; (4) manyetik
partikül yüzeyinde oluşan DNA hibritlerini partiküllerden ayırmak için alkali ile
muamele edilmesi; (5) pasif adsorbsiyon ile örneklerin elektrot yüzeyine
tutturulması; (6) ECHI ve DNA’nın elektroaktif bazları; guanine ve adenin’in
yükseltgenme sinyallerinin tek kullanımlık sensör; kalem grafit elektrot (PGE) ile
elektrokimyasal ölçümü.
75
Prob kaplı manyetik partiküllerin hazılanması ve manyetik partikül
yüzeyinde DNA hibridizasyonu:
Prob kaplı manyetik partiküllerin hazırlanması, MCB 1200 Biyomanyetik
ayırma platformu (Sigris, ABD) manyetik ayıracı kullanılarak aşağıdaki prosedür
izlenerek yapıldı (44,143);
5 µL streptavidin ile kaplı manyetik parküller 1,5 mL’lik santrifüj tüpüne
transfer edildi. Manyetik partiküller (MB), 90 µL TTL tampon çözeltisi ile yıkandı
ve 25 µL TTL tampon çözeltisinde dağıtıldı. 25 µL biyotinli prob ilave edildi ve
15 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılarak inkübe edildi. İmmobilize
edilmiş prob ayrıldı ve iki defa 90 µL TT tampon çözeltisi ile yıkandı ve hesaplı
miktarda hedef/MM/NC dizileri içeren 40 µL hibridizasyon çözeltisi (sodyum
sitrat tamponu (NaCB) (pH 7,00) içinde dağıtıldı. Hibridizasyon basamağı 20
dakika boyunca oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Manyetik partikülleri içeren
örnekler daha sonra 90 µL NCB ile yıkandı.
İndikatör bağlanması:
Hibridize edilmiş manyetik partiküller 5 µM ECHI içeren 50 µL TBS içinde
dağıtıldı ve indikatör oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırılarak hibridize
edilmiş manyetik partiküllere akümüle edildi ve 90 µL PBS ile yıkandı. Alkali ile
muamelesi için örnek, 25 µL 0,05 M NaOH çözeltisi ile 5 dakika boyunca
karıştırıldı.
Alkali muamelesi basamağından sonra, 25 µL örnek 85 µL PBS içeren
viyal içine transfer edildi. Daha sonra PGE’ler pasif adsorpsiyon basamağı için
15 dakika boyunca bu viyallere daldırıldı. Elektrotlar daha sonra 5 saniye
boyunca TBS ile yıkandı. DPV ölçümü için, PGE’ler PBS içeren elektrokimyasal
hücredeki üçlü elektrot sistemine yerleştirildi.
76
Ölçüm:
ECHI ve DNA bazları, guanine ve adenin’in yükseltgenme sinyalleri, -0,80
to +1,40 V arasında, 30 mV/s tarama hızıyla, 50 mV’luk puls genliğinde DPV
tekniğiyle tarama yapılarak ölçüldü.
2.5.2.1.
ECHI’nin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini:
Yöntem 2.5.2’de anlatıldığı koşullarda gerçekleştirildi. Hibridizasyon
tayini için -0,65 V civarında gözlenen ECHI’ye ait yükseltgenme sinyali
incelendi.
2.5.2.2.
Guanin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini:
Yöntem 2.5.2’de anlatıldığı koşullarda gerçekleştirildi. Hibridizasyon
tayini için +1,0 V civarında gözlenen guanine ait yükseltgenme sinyali incelendi.
2.5.2.3.
Adenin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayini:
Yöntem 2.5.2’de anlatıldığı koşullarda gerçekleştirildi. Hibridizasyon
tayini için +1,2 V civarında gözlenen adenine ait yükseltgenme sinyali incelendi.
77
2.6. Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrot
(MWCNT-SPE)
kullanılarak
DNA
hibridizasyonunun
elektrokimyasal
tayinine yönelik çalışma:
2.6.1.
MWCNT-SPE
ve
DNA
modifiye
edilmiş
MWCNT-SPE
yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonu:
MWCNT-SPE yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu alan emisyonu
taramalı elektron mikroskobu (hızlandırma potansiyel aralığı 10 – 30 KV) (FESEM; Quanta 400 FEI, Japan) ile Orta Doğu Teknik Üniversitesi (ODTU)
Merkezi Laboratuvarında uzman personel tarafından gerçekleştirildi.
Benzer şekilde yüzeyine 1 saat süreyle 100 µg/mL konsantrasyonda
dsDNA tutturulmuş MWCNT-SPE yüzeyinin mikroskobik karakterizasyonu,
yukarıda belirtilen aynı koşullarda gerçekleştirildi.
2.6.2. MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA
dizisinin tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayini:
Karboksil gruplarınca zengin MWCNT-SPE yüzeyine amino işaretli kısa
DNA dizisinin doğrudan ya da kovalent bağlayıcı ajan kullanılarak bağlanmasını
belirlemek amacıyla, MWCNT-SPE yüzeyine taze hazırlanmış kovalent
bağlanma çözeltisinden (8 mM NHS ve 5mM EDC olacak şekilde litresinde
0,921 g NHS ve 0,959 g EDC içeren ve PBS ile hazırlanan çözelti; EDC-NHS),
40 µL damlatılarak 1 saat bekletildi. Daha sonra elektrot PBS çözeltisi ile 5
saniye boyunca yıkandı. MWCNT-SPE yüzeyine 40 µL ABS damlatılarak, DPV
yöntemi ile, +0,4 V ile +1,3 V arasında, 30 mV/s tarama hızıyla, 50 mV’luk puls
genliğinde DPV tekniği ile tarama yapılarak ölçüm yapıldı.
78
Şema 4: MWCNT-SPE yüzeyinde DNA immobilizasyonun elektrokimyasal
tayini: (1) MWCNT-SPE yüzeyine amino işaretli DNA immobilizasyonu (a:
referans elektrot; b: çalışma elektrodu; c: yardımcı elektrot); (2) yıkama
basamağı; (3) MWCNT-SPE’nin potansiyostata bağlanması; ve (4) DPV tekniği
ile guanin yükseltgenme sinyaline bağlı elektrokimyasal ölçüm.
79
2.6.3. MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA
prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisinin incelenmesi:
Bu çalışmada MWCNT-SPE kullanıldı. MWCNT-SPE yüzeyine değişen
konsantrasyonlarda amino ile işaretli DNA probu içeren 40 µL örnek
damlatılarak 20 dakika bekletildi. Daha sonra elektrot ABS ile 5 saniye boyunca
yıkandı ve elektrokimyasal ölçüm gerçekleştirildi. Ortamdaki DNA miktarı 5
µg/mL’den 40 µg/mL’ye arttırıldı ve bu konsantrasyon değişiminin yanıta olan
etkisi incelendi.
2.6.4.
MWCNT-SPE
yüzeyinde
HBV
DNA
hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine yönelik çalışma:
Bu çalışmada 2.2.3.1.3’de belirtilen oligonükleotit dizileri kullanıldı.
Çalışma ortamı olarak ABS kullanıldı.
CNT-SPE yüzeyine HBV DNA prob immobilizasyonu:
MWCNT-SPE yüzeyine 20 µg/mL HBV DNA probu içeren 40 µL örnek
damlatılarak 20 dakika bekletildi. Daha sonra elektrot ABS ile 5 saniye boyunca
yıkandı.
Prob immobilize edilmiş CNT-SPE yüzeyinde DNA hibridizasyonu:
40 µg/mL hedef/NC/MM dizi içeren 40 µL örnek MWCNT-SPE yüzeyine
damlatılarak hibridizasyon basamağı için 30 dakika süreyle bekletildi. Daha
sonra elektrot ABS ile 5 saniye boyunca yıkandı.
Ölçüm:
MWCNT-SPE yüzeyine 40 µL ABS damlatılarak guanine yükseltgenme
sinyali, DPV yöntemi ile, +0,4 V ile +1,3 V arasında, 30 mV/s tarama hızıyla, 50
mV’luk puls genliğinde DPV tekniği ile tarama yapılarak ölçüldü.
80
2.6.5. HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalar:
Yöntem 2.6.4’deki gibi aynı koşullarda gerçekleştirildi. Hedef ile rastgele
(NC) dizilerin 1:1 karışımını, veya hedef ile çift sarmal DNA (dsDNA)’nın 1:1
karışımlarını
içeren
örnekler,
“karışım
çözeltileri”
olarak
kullanıldı.
Hibridizasyon tayini için guanine ait yükseltgenme sinyali incelendi.
2.6.6. Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon
yanıtına olan etkisinin incelenmesi:
Yöntem 2.6.4’deki gibi aynı koşullarda gerçekleştirildi. Ortamdaki hedef
dizi miktarı 5 µg/mL’den 80 µg/mL’ye arttırıldı ve bu konsantrasyon değişiminin
yanıta olan etkisi incelendi.
81
BÖLÜM III
BULGULAR
3.1. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA
analizine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular:
3.1.1. Ag-NP’lerin mikroskobik karaterizasyonunda elde edilen
bulgular:
Yöntem
2.4.1’de
anlatıldığı
gibi
yapıldı.
Ag-NP’lerin
mikroskobik
karaterizasyonu, TEM ve SEM cihazları kullanılarak gerçekleştirildi. Elde edilen
görüntüler şekil 25 ve şekil 26’da gösterildi.
Şekil 25: Nanopartiküllerin TEM görüntüsü ( x 50.000 büyütme).
82
Şekil 26: Çözeltideki gümüş nanopartiküllerin SEM görüntüsü (x 20.000
büyütme).
TEM görüntüsünden hareketle partikül büyüklüğü tayini yapıldı ve elde
edilen histogram şekil 27’de gösterildi.
83
Şekil 27: Ag-NP’lerin partikül büyüklüğü dağılımı.
3.1.2. Ag-NP’lerin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde
edilen bulgular:
Yöntem, 2.4.2.1 ve 2.4.2.2’de anlatıldığı gibi yapıldı. Ag-NP’lerin
elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel puls
voltametri (DPV) yöntemleri ile incelediğimizde elde edilen voltamogramlar
sırasıyla, şekil 28A ve şekil 28B’de gösterildi.
84
Şekil 28: (A) Dönüşümlü voltametri (CV) ve (B) diferansiyel puls
voltametrisi
(DPV)
tekniği
kullanılarak,
davranışlarını gösteren voltamogramlar.
Ag-NP’lerin
elektrokimyasal
85
3.1.3 AgNP üzerine amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin
tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayininde elde edilen bulgular:
Yöntem, 2.4.3’de anlatıldığı gibi yapıldı. AgNP üzerine amino işaretli kısa
DNA dizisinin tutturulması ve elektrokimyasal tayininde elde edilen gümüş ve
guanin yükseltgenme sinyalleri, şekil 29’da gösterildi.
Şekil 29: Amino ile işaretlenmiş DNA varlığında elde edilen, (NP) gümüş
ve (G) guanin oksidasyon sinyallerini ve (K) sadece ABS tamponu içinde
ölçülen sinyali gösteren voltamogram (kontrol).
86
Gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulacak DNA dizisinin ne tür bir
işaretleme içermesi konusunda bilgi edinmek amacıyla, işaretsiz DNA dizisi
veya tiyol grubu ile işaretlenmiş farklı türdeki kısa DNA dizileri ile aynı çalışma
tekrarlandı.
3.1.4. DNA konsantrasyonundaki değişimin Ag-NP ve guanin
yükseltgenme sinyaline olan etkisinin incelenmesinde elde edilen
bulgular:
Yöntem, 2.4.4’de anlatıldığı gibi yapıldı. Ag-NP konsantrasyonu sabit
tutularak yüzeyine tutturulan amino işaretli DNA prob dizisinin konsantrasyonu
0-60 µg/mL konsantrasyon aralığında arttırıldığı zaman elde edilen histogram
ve grafikler sırasıyla, şekil 30A ve şekil 30B’de gösterildi.
87
Şekil
30:
Amino
işaretli
DNA
oligonükleotidlerinin
farklı
konsantrasyonlarında gözlenen gümüş ve guanin sinyalleri: (A) Histogramda
nanopartiküllerin yüzeyine DNA tutturulmasının varlığında/yokluğunda metalik
gümüşün (a) guaninin (b) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir. (B) Grafikte
nanopartiküllerin
yüzeyine
DNA
tutturulmasının
varlığında/yokluğunda,
gümüşün (NP) ve guaninin (G) yükseltgenme sinyalleri gösterilmektedir.
3.1.5. Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde
elde edilen bulgular:
Yöntem, 2.4.5’de anlatıldığı gibi yapıldı. Ölçüm tamponu olarak, ABS
veya NaCB kullanıldığı zaman elde edilen gümüş ve guanin yükseltgenme
sinyallerindeki değişimi gösteren histogram, şekil 31’de gösterildi.
88
Şekil 31: Farklı tampon çözeltilerinin yanıt üzerine olan etkisini gösteren
histogram.
Nanopartiküllerin
yüzeyine
DNA
tutturulmasının
varlığında/yokluğunda gümüşün ve guaninin yükseltgenme sinyalleri: (a) Ag-NP
yükseltgenme sinyali, (b) 50 µg/mL DNA varlığında Ag-NP yükseltgenme
sinyali, (c) guanin yükseltgenme sinyali.
3.1.6. Ag-NP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin
incelenmesinde elde edilen bulgular:
Yöntem 2.4.6’de anlatıldığı gibi yapıldı. Nanopartiküllerin yüzeyine DNA
tutturulmasının
varlığında/yokluğunda
hem
gümüşün
hem
de
guaninin
yükseltgenme sinyalleri, ABS tamponunda elde edildi. DNA konsantrasyonu
sabit tutularak AgNP konsantrasyonu, stok çözeltisi ile birlikte 1:2 ile 1:50
oranları arasında seyreltilerek kullanıldığında elde edilen gümüş ve guanin
sinyallerindeki değişimi gösteren histogram, şekil 32’de gösterildi.
89
Şekil 32: Çeşitli oranlarda seyreltilmiş gümüş nanopartiküllerin yanıta
olan etkisi: (a) DNA yokluğunda, (b) 50 µg/mL DNA varlığında Ag-NP’lerin
yükseltgenme sinyali ve (c) guanin yükseltgenme sinyali.
90
3.2. Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun
indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin
bulgular:
3.2.1. ECHI’nin elektrokimyasal davranışının incelenmesine ilişkin
bulgular:
Yöntem, 2.5.1.1 ve 2.5.2.1’de anlatıldığı gibi yapıldı.
Hibridizasyon
indikatörü ECHI’nin elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri (CV)
tekniği ile PGE kullanılarak incelendiğinde, elde edilen voltamogram, şekil
33A’da gösterildi.
Farklı ECHI konsantrasyonlarında diferansiyel puls voltametri (DPV)
tekniği ile PGE kullanılarak ölçülen ECHI sinyallerine ait konsantrasyon-akım
eğrisi, şekil 33B’de gösterildi.
91
Şekil 33.
(A) ECHI’nin dönüşümlü voltametri tekniği ile elde edilen
voltamogramı; (a) ECHI sinyali (b) ECHI içermeyen PBS tamponundan gelen
sinyal (kontrol); (B) Farklı ECHI konsantrasyonlarında diferansiyel puls
voltametri tekniği ile ölçülen ECHI yükseltgenme sinyallerine ait konsantrasyonakım eğrisi.
3.2.2. Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz
elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayinine ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.5.2’de anlatıldığı gibi yapıldı. DNA hibridizasyonunun MB’lere
dayalı indikatörlü ve indikatörsüz elektrokimyasal tayininde elde edilen ECHI,
guanin ve adenine ait yükseltgenme sinyallerinin aynı ölçüm skalasında
gösterildiği voltamogram şekil 34’de gösterildi.
92
Şekil 34. Hibridizasyon varlığında ölçülen (E) ECHI, (G) guanin ve (A)
adenin
sinyallerini
gösteren
voltamogram;
(1)
prob
ile
hedef
dizinin
hibridizasyonu varlığında elde edilen sinyaller, (2) sadece prob varlığında elde
edilen sinyaller.
3.2.3.
ECHI’nin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.5.2.1’de anlatıldığı gibi yapıldı. Streptavidin ile kaplı MB
yüzeyine tutturulmuş biyotin ile işaretlenmiş prob ile hedef/MM/NC arasında
gerçekleşen hibridizasyonun tayini için, -0,65 V civarında gözlenen ECHI’ye ait
yükseltgenme sinyali incelendiği zaman, elde edilen voltamogram ve histogram
sırasıyla şekil 35 A ve şekil 35 B’de gösterildi.
93
Şekil 35: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen ECHI sinyallerini gösteren
DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) % akım oranını gösteren
histogram: (a) prob ile hedef dizinin hibridizasyonu, (b) prob ile bir bazı hedeften
farklı dizinin (MM) hibridizasyonu, (c) prob ile rastgele dizinin (NC)
hibridizasyonu, (d) sadece prob, (e) ortamda DNA yokken elde edilen ECHI
sinyali ve (f) ECHI ve DNA içermeyen, sadece PBS tamponu içeren örnek
(kontrol).
94
3.2.4.
Guanin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.5.2.2’de anlatıldığı gibi yapıldı. Streptavidin ile kaplı MB
yüzeyine tutturulmuş biyotin ile işaretlenmiş prob ile hedef/MM/NC arasında
gerçekleşen hibridizasyonun tayini için, +1,0 V civarında gözlenen guanine ait
yükseltgenme sinyali incelendiği zaman elde edilen voltamogram ve histogram
sırasıyla şekil 36A ve şekil 36B’de gösterildi.
95
Şekil 36: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini
gösteren DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar: (a) prob ile hedef dizinin
hibridizasyonu, (b) prob ile bir bazı hedeften farklı dizinin (MM) hibridizasyonu,
(c) prob ile rastgele dizinin (NC) hibridizasyonu, (d) sadece prob, (e) ECHI ve
DNA içermeyen, sadece PBS tamponu içeren örnek
(kontrol); (B)
Hibridizasyon varlığında % akım oranını gösteren histogram; (a) prob ile hedef
dizinin hibridizasyonu, (b) sadece prob.
3.2.5.
Adenin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.5.2.3’de anlatıldığı gibi yapıldı. Streptavidin ile kaplı MB
yüzeyine tutturulmuş biyotin ile işaretlenmiş prob ile hedef/MM/NC arasında
gerçekleşen hibridizasyonun tayini için, +1,2 V civarında gözlenen adenin
bazına ait yükseltgenme sinyali incelendiği zaman elde edilen voltamogram ve
histogram sırasıyla şekil 37A ve şekil 37B’de gösterildi.
96
Şekil 37: (A) Hibridizasyon varlığında ölçülen adenin sinyallerini
gösteren DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar: (a) prob ile hedef dizinin
hibridizasyonu, (b) prob ile bir bazı hedeften farklı dizinin (MM) hibridizasyonu,
(c) prob ile rastgele dizinin (NC) hibridizasyonu, (d) sadece prob, (e) ECHI ve
DNA içermeyen, sadece PBS tamponu içeren örnek (kontrol). (B) Hibridizasyon
varlığında % akım oranını gösteren
hibridizasyonu, (b) sadece prob.
histogram; (a) prob ile hedef dizinin
97
3.3. Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrotlar
(MWCNT-SPE) ile DNA hibridizayonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin
bulgular:
3.3.1.
MWCNT-SPE
ve
DNA
modifiye
edilmiş
MWCNT-SPE
yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna
ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.6.1’de anlatıldığı gibi yapıldı. MWCNT-SPE ve DNA modifiye
edilmiş MWCNT-SPE yüzeylerinin SEM ile karakterizasyonunda elde edilen
görüntüler, şekil 38’de gösterildi.
98
Şekil 38: SEM görüntüleri; MWCNT-SPE, (a) hızlandırma potansiyeli 20,0
KV, çözünürlük 200 µm; (b) hızlandırma potansiyeli 30,0 KV, çözünürlük 500
nm; yüzeyine 100 µg/ml dsDNA modifiye edilmiş MWCNT-SPE, (c) hızlandırma
potansiyeli 10,0 KV, çözünürlük 100 µm; (d) hızlandırma potansiyeli 10,0 KV,
çözünürlük 10 µm.
3.3.2. MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA
dizisinin tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular:
Amino işaretli kısa DNA dizisinin karboksil gruplarla zenginleştirilmiş
MWCNT-SPE yüzeyine doğrudan ya da kovalent bağlanma çözeltisi yardımıyla
tutturulmasına karar vermek amacıyla, yöntem 2.6.2’de anlatıldığı gibi yapıldı ve
kovalent bağlanma çözeltisi varlığında elde edilen voltamogram şekil 39’da
gösterildi.
99
Şekil 39: (a) DNA içermeyen ve kovalent bağlanma çözeltisi varlığında
elde edilen sinyal (kontrol); (b) sadece ABS.
Amino işaretli kısa DNA dizisinin karboksil gruplarla zenginleştirilmiş
MWCNT-SPE yüzeyine doğrudan tutturulmasıyla elde edilen voltamogram şekil
40’da gösterildi.
100
Şekil 40: (a) 20 µg/mL amino işaretli DNA prob varlığında elde edilen
yükseltgenme sinyali; (b) sadece ABS.
3.3.3. MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA
prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisine ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.6.3’de anlatıldığı gibi yapıldı. MWCNT-SPE yüzeyine
tutturulan amino işaretli DNA prob , 5-40 µg/mL aralığında değişen
konsantrasyonlarda
konsantrasyon
arttırılarak,
değişimin
yanıta
elektrot
olan
yüzeyine
etkisi
incelendi
voltamogram ve histogram şekil 41A ve 41B’de gösterildi.
tutturuldu.
ve
elde
DNA
edilen
101
Şekil 41: Farklı konsantrasyonlarda amino işaretli DNA prob dizisi
kullanılarak
DPV
tekniği
ile
ölçülen
guanin
sinyallerini
gösteren
(A) voltamogramlar ve (B) histogram; (a) 5, (b) 10, (c) 20 and (d) 40 µg/mL (e)
sadece ABS.
3.3.4.
MWCNT-SPE
yüzeyinde
HBV
DNA
hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.6.4’de anlatıldığı gibi yapıldı. MWCNT-SPE yüzeyine
tutturulmuş HBV prob ile hedef/MM/NC arasında gerçekleşen hibridizasyonun
tayini için, +1,0 V civarında gözlenen guanine ait yükseltgenme sinyali
incelendiği zaman elde edilen voltamogram ve histogram sırasıyla, şekil 42A ve
şekil 42B’de gösterildi.
102
Şekil 42: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren
(A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram; (a) sadece ABS,
(b) sadece HBV prob, (c) HBV prob ile rastgele dizinin (NC) hibridizasyonu, (d)
HBV prob ile bir bazı hedeften farklı dizinin hibridizasyonu, (e) HBV prob ile
hedef dizinin hibridizasyonu.
3.3.5. HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalarda
elde edilen bulgular:
Yöntem, 2.6.5’de anlatıldığı gibi yapıldı. MWCNT-SPE yüzeyine
tutturulmuş HBV probun, hedefi içerem karışım çözeltilerinde hibridizasyon
seçimliliğine yönelik çalışmalarda, +1,0 V civarında gözlenen guanin sinyaline
ait voltamogram ve histogram şekil 43’de gösterildi. Hedef ile rastgele (NC)
dizilerin 1:1 karışımını, veya hedef ile çift sarmal DNA (dsDNA)’nın 1:1
karışımlarını içeren örnekler, “karışım çözeltileri” olarak kullanıldı.
103
Şekil 43: Hibridizasyon varlığında ölçülen guanin sinyallerini gösteren
(A) DPV tekniği ile elde edilen voltamogramlar, (B) histogram; (a) HBV prob ile
hedef dizinin hibridizasyonu, (b) 1:1 oranında hedef dizi ve rastgele dizi (NC)
içeren örneğin HBV prob ile hibridizasyonu, (c)
1:1 oranında hedef dizi ve
dsDNA içeren örneğin HBV prob ile hibridizasyonu.
3.3.6. Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon
yanıtına olan etkisinin incelenmesine ilişkin bulgular:
Yöntem, 2.6.6’da anlatıldığı gibi yapıldı. MWCNT-SPE yüzeyinde
hibridizasyonun tayininde, ortamdaki hedef DNA konsantrasyonunun 5-80 µg/ml
aralığında arttırılarak, hedef DNA konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi
incelendi ve elde edilen kalibrasyon eğrisi şekil 44’de gösterildi.
104
Şekil 44: Hedef DNA konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisi ve
kalibrasyon eğrisi.
105
BÖLÜM IV
TARTIŞMA
4.1. Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) dayalı elektrokimyasal DNA
analizine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ile ilgili tartışma:
4.1.1. Ag-NP’lerin mikroskobik karakterizasyonunda elde edilen
bulgular ile ilgili tartışma:
TEM görüntüsü ve partikül büyüklüğü ölçümden elde edilen sonuçlar
incelendiğinde, çoğunlukla dairesel olduğu görülen partiküllerin ortalama yarı
çapı 66 ±16 nm olarak ölçüldü.
4.1.2. Ag-NP’nin elektrokimyasal davranışının incelenmesinde elde
edilen bulgular ile ilgili tartışma:
DNA’nın metalik nanopartikül yüzeyine immobilizasyonundan sonra,
metalik gümüş ve DNA’nın elektroaktif bazı olan Guaninin yükseltgenme
sinyalleri, voltametrik olarak, sırasıyla +131 mV ve +1000 mV’da ölçüldü (şekil
29).
Gümüş nanopartikül yüzeyine tutturulacak DNA dizisinin ne tür bir
işaretleme içermesi konusunda bilgi edinmek amacıyla, işaretsiz DNA dizisi ile
amino grubu veya tiyol grubu ile işaretlenmiş farklı türdeki DNA dizileri
kullanıldı. Farklı diziler kullanarak geliştirilen bu yeni yöntemin guanin
sinyalindeki artış ve sonuçların tekrarlanabilirliği açısından performansı
incelendi. Amino grubu ile işaretlenmiş DNA dizisi ile elde edilen sinyallerin,
diğerleriyle elde edilen sinyallere kıyasla, daha yüksek olması ve daha
106
tekrarlanabilir olması nedeniyle, çalışmamızdaki diğer deneylerde amino grubu
ile işaretlenmiş DNA dizisinin kullanılmasının uygun olacağı saptandı.
4.1.3.
Ag-NP
yüzeyine
tutturulan
DNA
konsantrasyonundaki
değişimin yanıta olan etkisinin incelenmesinde elde edilen bulgular ile
ilgili tartışma:
DNA konsantrasyonundaki değişimin gümüş ve guanin sinyalleri üzerine
etkisi incelendiğinde, 50 µg/mL DNA konsantrasyon değerine kadar guanin
sinyalinde aşamalı şekilde bir artış olduğu, daha sonra artışın sabit kaldığı
gözlendi (şekil 30B ‘de “G” ile gösterildi). Fakat, aynı konsantrasyon aralığında,
metalik gümüş nanopartikülünden (Ag-NP) gelen sinyalin azaldığı ve daha
sonra azalmanın sabit kaldığı gözlendi (şekil 30B ‘de “NP” ile gösterildi).
Dolayısıyla, gümüş nanopartikül yüzeyinin DNA ile kaplanabilmesi için optimum
DNA prob konsantrasyonunun 50 µg/mL olduğuna karar verildi.
4.1.4. Farklı tampon çözeltilerinin yanıta etkisinin incelenmesinde
elde edilen bulgular ile ilgili tartışma:
Şekil 31’de farklı tampon çözeltilerinde hazırlanmış nanopartikül-DNA
konjugatından elde edilen sinyallerin kıyaslanması gösterildi. Bu amaçla, ABS
(pH 4,80) ve NaCB (pH 8,00) çözeltileri kullanıldı. Daha yüksek sinyal ve daha
iyi
tekraralanabilir
sonuçlar,
ABS
ortamında
elde
edildi.
Dolayısıyla,
nanopartikül-DNA konjugatı hazırlanmasında ve ölçümlerde ABS (pH 4,80)
tamponunun kullanılmasının uygun olacağı saptandı.
4.1.5. AgNP konsantrasyonundaki değişimin yanıta olan etkisinin
incelenmesinde elde edilen bulgular ile ilgili tartışma:
Ayrıca metalik gümüş nanopartikülün miktarının DNA sensörünün
yanıtına olan etkisi incelendi. Bu amaçla, 1:50 den 1:2 oranına kadar farklı
107
oranlarda seyreltilmiş olan nanopartikül stok çözeltisi ile çalışıldı. Metalik
gümüşten gelen sinyaldeki azalmanın, aşamalı bir şekilde arttığı ve guanin
sinyalinde ise 1:20 oranından büyük değerlerde azalmanın olduğu gözlendi.
Dolayısıyla,
nanopartikül-DNA
konjugatı
hazırlanmasında
1:20
oranında
seyreltilmiş Ag-NP kullanılmasının uygun olacağı saptandı.
Bu çalışmada sunulan DNA algılamasına yönelik ve nanopartiküllere
dayalı elektrokimyasal sensör teknolojisi, daha önce literatürde rapor edilen
gümüş veya başka metal nanopartiküllerin kullanıldığı yöntemlere kıyasla
(4,29,57,141,142,150,151,155), daha kolay ve hızlıdır. Ayrıca DNA’nın NP
yüzeyine
tutturulması
zaman
alıcı
bir
yüzey
kimyası
işlemine
gerek
duymamaktadır. Bu yöntemin, literatürde rapor edilen diğer yöntemlere
(4,29,57,141,142,150,151,155), göre en önemli avantajlarından biri ise, metalik
gümüşün yükseltgenme sinyalini ölçmek için, metal iyonunu nanopartikülden
çözmek amacıyla katalizör ya da asidik çözelti kullanılması gibi ilave bir
basamağa ihtiyaç duyulmamasıdır. Diğer bir avantajı ise, aynı ölçüm skalasında
hem gümüş, hem de DNA’nın guanin bazına ait elektrokimyasal sinyallerin
ölçülmesini mümkün kılmasıdır.
4.2. Manyetik partiküllere (MB) dayalı DNA hibridizasyonunun
indikatörlü ve indikatörsüz sistemle elektrokimyasal tayinine ilişkin
bulgular ile ilgili tartışma:
4.2.1. ECHI’nin elektrokimyasal davranışının incelenmesine ilişkin
bulgular ile ilgili tartışma:
Elektroaktif bir indikatör olan ECHI’nin elektrokimyasal davranışı, PGE ile
dönüşümlü
voltametri
(CV)
tekniği
kullanılarak
yükseltgenme sinyali, -600 mV’da ölçüldü (şekil 33A).
incelendi.
ECHI’nin
108
0,1-10 µM ECHI konsantrasyon aralığında DPV tekniği kullanılarak PGE
ile
ölçülen
akım
değerleri,
şekil
33B’de
gösterildi.
Optimum
ECHI
konsantrasyonu, 5 µM olarak saptandı ve DNA hibridizasyon tayinine yönelik
çalışmalarda, bu konsantrasyon değerinin kullanılmasına karar verildi.
4.2.2. Manyetik partiküllere (MB) dayalı indikatörlü ve indikatörsüz
elektrokimyasal DNA hibridizasyon tayinine ilişkin bulgular ile ilgili
tartışma:
Streptavidin ile kaplı manyetik partiküllere tutturulmuş biyotin ile
işaretlenmiş
prob
ile
hedefi
arasında
gerçekleşen
hibridizasyon
öncesinde/sonrasında elde edilen ve aynı ölçüm skalasında gösterilen ECHI
(E), guanin (G) ve adenine (A) ait yükseltgenme sinyalleri sırasıyla, -600 mV,
+ 950 mV ve +1200 mV civarında ölçüldü ve şekil 34’de gösterildi.
4.2.3.
ECHI’nin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular ile ilgili
tartışma:
Şekil 35A’da prob dizi ile hedef, rastgele dizi (NC) ya da bir bazı hedeften
farklı dizi (MM) hibridizasyonu sonucunda elde edilen ECHI’ye ait yükseltgenme
sinyalleri görülmektedir. Hibrit ile elde edilen sinyal sadece prob ile elde edilen
sinyalden daha yüksektir. Prob ile NC hibridizasyonunda elde edilen
sinyalin(Şekil 35A-c), sadece prob ile elde edilen sinyale yakın büyüklükte
olduğu gözlendi. Prob ile MM hibridizasyonunda elde edilen sinyalin (Şekil 35Ab), prob sinyalinden daha yüksek olmasına rağmen, hibrit sinyaline kıyasla daha
düşük olduğu görüldü.
109
Şekil 35B’de verilen histogramda, prob ile hedef/NC/MM hibridizasyonu
sonucunda elde edilen ECHI’ye ait yükseltgenme sinyallerine ait % akım
oranları gösterildi.
ECHI’nin hibridizasyon indikatörü olarak kullanılabilirliği, literatürde ilk
defa bu çalışmada yükseltgenme sinyalindeki değişimler izlenerek gösterildi.
ECHI’nin çift sarmal DNA ile bis-interkalasyonla etkileşmesi sonucunda, daha
kuvvetli bağlanması ve hibridizasyon sonucunda daha yüksek sinyalin elde
edildiği gözlendi.
20 µg/mL konsantrasyonda hedef ile yapılan hibridizasyonuna yönelik
tekrarlanabilirlik çalışmasında, ECHI yükseltgenme sinyali üzerinden DPV
tekniği ile ölçümü yapıldığında (n=3), bağıl standart sapması % 8,6 olan 2120
nA düzeyinde anlamlı bir sinyal elde edildi. Tayin sınırı S/N=3’den, 1,8 nM
olarak hesaplandı.
4.2.4.
Guanin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma:
Şekil 36A’da prob ile hedef/NC/MM ile hibridizasyonu sonucunda elde
edilen guanin yükseltgenme sinyalleri görülmektedir. Hibrit ile elde edilen sinyal
prob ile elde edilen sinyalden yüksektir. Prob ile NC hibridizasyonunda elde
edilen sinyalin büyüklüğü (Şekil 36A-c), sadece prob ile elde edilen sinyal ile
yaklaşık olarak aynı büyüklükte olduğu gözlendi. MM dizisinde toplam üç guanin
bazı, buna karşın hedef dizisinde iki guanin bazının mevcut olmasına rağmen,
prob ile MM hibridizasyonunda elde edilen guanin sinyalinin büyüklüğü (Şekil
36A-b) incelendiğinde, prob sinyalinden daha yüksek, fakat hibrit sinyaline
kıyasla %50 oranında daha düşük olduğu görüldü. Ayrıca, şekil 35B’de sadece
prob sinyali ve prob ile hedef dizi hibridizasyonu sonucunda elde edilen guanin
110
yükseltgenme sinyallerine ait % akım oranlarını gösteren histogram yer
almaktadır.
20 µg/mL konsantrasyonda hedef ile yapılan hibridizasyonuna yönelik
tekrarlanabilirlik çalışmasında, guanin yükseltgenme sinyali üzerinden DPV
tekniği ile ölçümü yapıldığında (n=3), bağıl standart sapması % 9,1 olan 340 nA
düzeyinde anlamlı bir sinyal elde edildi. Tayin sınırı S/N=3’den, 11 nM olarak
hesaplandı.
4.2.5.
Adenin
sinyalindeki
değişim
üzerinden
DNA
hibridizasyonunun tayinine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma:
Benzer şekilde prob ile hedef/NC/MM ile hibridizasyonu sonucunda elde
edilen adenin yükseltgenme sinyalleri Şekil 37A’da gösterildi ve prob ile hedef
arasında hibridizasyon sonucunda gözlenen guanin sinyaline benzer şekilde
yüksek bir adenin sinyali gözlendi (Şekil37A-a). Ayrıca prob ile NC veya prob ile
MM hibridizasyonu sonucunda, herhangi bir adenin sinyali görülmedi.
Manyetik partiküllere dayalı tek kullanımlık grafit sensörle gerçekleştirilen
bu çalışmada hibridizasyona yönelik elde edilen sonuçlar, antitümör etkili bir
antibiyotik ilaç olan ECHI’nin çift sarmal ve tek sarmal DNA ile etkileşmesine
yönelik damlayan civa elektrodu (64) ve altın elektrodu (76) ile yapılan
çalışmaların sonuçları ile kıyaslandığında, geliştirilen sensör teknolojisinin daha
kolay, daha ucuz, daha duyarlı ve kullanılan etkin manyetik ayırma sayesinde
daha seçimli olduğu görüldü.
20 µg/mL konsantrasyonda hedef ile yapılan hibridizasyonuna yönelik
tekrarlanabilirlik çalışmasında, adenin yükseltgenme sinyali üzerinden DPV
tekniği ile ölçümü yapıldığında (n=3), bağıl standart sapması % 12 olan 180 nA
111
düzeyinde anlamlı bir sinyal elde edildi. Tayin sınırı S/N=3’den, 20 nM olarak
hesaplandı.
4.3. Karbon nanotüp modifiye edilmiş perde baskılı elektrotlar
(MWCNT-SPE) ile DNA hibridizayonunun elektrokimyasal tayinine ilişkin
bulgular ile ilgili tartışma:
4.3.1.
MWCNT-SPE
ve
DNA
modifiye
edilmiş
MWCNT-SPE
yüzeylerinin taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterizasyonuna
ilişkin bulgular ile ilgili tartışma:
MWCNT-SPE
ve
yüzeyine
dsDNA
tutturulmuş
MWCNT-SPE
elektrotlarının SEM ile karekterizasyonunda elde edilen görüntüler, Şekil 38’de
gösterildi. Şekil 38-a ve 38-b’de düşük ve yüksek çözünürlükte elde edilen
görüntülere bakıldığında, elektrot yüzeyinin homojen bir şekilde, grafit ve CNT
karışımı ile kaplandığı görüldü. MWCNT yüzeyine, 1 saat süreyle dsDNA
tutturulmasından sonra elde edilen görüntülere bakıldığı zaman (Şekil 38-c ve
38-d), boş MWCNT elektrot yüzeyinden daha farklı olduğu ve yüzeye DNA’nın
tutturulması
nedeniyle,
grafit
ile
CNT
karışımının
net
bir
şekilde
görüntülenemediği anlaşıldı.
4.3.2. MWCNT-SPE yüzeyine amino ile işaretlenmiş kısa DNA
dizisinin tutturulması ve DNA’nın elektrokimyasal tayinine ilişkin bulgular
ile ilgili tartışma:
Yüzeyi MWCNT ile modifiye edilmiş SPE’lerı temin ettiğimiz Dropsens
firmasının
geliştirdiği
elektrotları
kıyaslama
çalışmalarında,
dönüşümlü
voltametri tekniği kullanılarak dopamin ve hidrokinon’un elektrokimyasal
yanıtları incelenmiştir (61). Elektrot yüzeyine CNT’nin modifikasyon öncesinde
ve
sonrasında,
ölçülen
maddelerin
sinyalleri
incelendiğinde,
daha
iyi
112
tanımlanmış ve 2-3 kat daha yüksek sinyallerin CNT-SPE’ler ile elde edildiği
saptanmıştır (61).
Bu çalışmada Dropsens firmasından temin ettiğimiz MWCNT-SPE’ların,
DNA’nın algılanması ve DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayininde
kullanılabilirliği
araştırıldı
ve
MWCNT
yüzeyinin
karboksil
gruplarıyla
zenginleştirilmiş olması nedeniyle, amino işaretli DNA dizisi kullanıldı. DNA’nın
MWCNT
yüzeyine
kovalent
bağlayıcı
ajan
yardımıyla
tutturulabilmesi
araştırıldığında, ortamda henüz DNA yokken kovalent bağlanma çözeltisine ait
+0,92 V civarında gözlenen yaklaşık 6500 nA civarında yüksek bir sinyal
gözlendi. MWCNT yüzeyinde kovalent bağlama çözeltisinde gözlenen sinyal ile
DNA’dan gelen guanin sinyalin oldukça yakın pik potansiyeline sahip olması
sebebiyle, amino işaretli DNA’nın elektrot yüzeyine tutturulması amacıyla,
kovalent bağlanma çözeltisi kullanılamayacağına karar verildi.
4.3.3. MWCNT-SPE yüzeyine tutturulan amino ile işaretlenmiş DNA
prob konsantrasyon değişiminin yanıta olan etkisine ilişkin bulgular ile
ilgili tartışma:
13 guanin bazı içeren amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisi, karboksil
gruplarıyla zenginleştirilmiş olan MWCNT yüzeyine herhangi bir kovalent
bağlayıcı ajan kullanılmadan tutturuldu ve artan DNA konsantrasyonlarında elde
edilen guanin yükseltgenme sinyallerindeki değişim, şekil 41’de gösterildi.
Gözlenen guanin sinyallerindeki değişim incelendiğinde, 5 µg/mL’den 20
µg/ml konsantrasyona kadar bir artış gözlendi. 20 µg/mL ile 40 µg/mL
konsantrasyon aralığında bir azalma gözlendi. Hibridizasyon çalışması için
uygun prob konsantrasyonu, 20 µg/mL olarak saptandı.
113
Literatürdeki mevcut CNT modifiye SPE kullanılarak yapılan DNA analiz
çalışmalarına kıyasla (150), çalışmamızda DNA analizine yönelik kullanılan
MWCNT-SPE yüzeyine daha düşük konsantrasyonda DNA tutturuldu.
20 µg/mL konsantrasyonda amino ile işaretlenmiş kısa DNA dizisinin
elektrot
yüzeyine
tutturulması
ve
guanin
sinyali
üzerinden
DNA’nın
elektrokimyasal algılanmasına ilişkin tekrarlanabilirlik çalışmasında (n=3), bağıl
standart sapması % 2,65 olan anlamlı sinyaller elde edildi. Ayrıca bu çalışmada
DNA’nın elektrokimyasal algılanmasına yönelik MWCNT modifiye elektrotlar
kullanılarak,
diğer
nanomalzemelere
dayalı
elektrotlara
kıyasla
(46,55,57,68,144) çok daha tekrarlanabilir sonuçlar elde edildi. Karbon
nanotüpler ile kaplı tek kullanımlık elektrotlarla daha tekrarlanabilir ve daha
yüksek duyarlılığa sahip sonuçların elde edilmesi sonucunda, bu elektrotların
dizi seçimli DNA hibridizasyonunun elektrokimyasal tayininde kullanılmasına
oldukça elverişli olduğuna karar verildi.
4.3.4.
MWCNT-SPE
yüzeyinde
HBV
DNA
hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmaya ilişkin bulgular ile ilgili
tartışma:
HBV’yi temsil eden prob dizisinin guanin bazı içermemesi nedeniyle,
sadece prob içeren örnekte alınan ölçümde, +1,0 V’da guanin yükseltgenme
sinyali gözlenmedi (şekil 42A-b). Bu önemli detay, HBV DNA hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayininde hibrit varlığında gözlenen guanin sinyali üzerinden
(şekil 42A-e), indikatörsüz bir şekilde tayin edilebilmesi avantajını getirmektedir.
Prob ile MM hibridizasyonunda hibrit sinyali ile kıyaslandığında, % 50 oranında
daha düşük guanin yükseltgenme sinyali gözlendi.
114
HBV prob dizisinin guanin bazı içermemesine bağlı olarak guanin bazının
sentetik analoğu ve pahalı bir işaretleyici olan inosin bazının prob dizisinde yer
almaması, sensörümüze üstünlük kazandırmıştır. Böylece, literatürde daha
önce rapor edilen inosin ile işaretlenmiş DNA dizilerine dayalı çalışmalara
kıyasla, çalışmamızda kullandığımız probun inosin ile işaretlemesine gerek
kalmadan (102,140,143) hibridizasyon tayini guanin sinyali üzerinden doğrudan
yapılmıştır.
4.3.5. HBV DNA hibridizasyonunda seçimlilik ile ilgili çalışmalarda
elde edilen bulgular ile ilgili tartışma:
Yüzeyine amino ile işaretlenmiş HBV prob immobilize edilmiş MWCNTSPE ile hibridizasyon seçimliliği araştırıldığında, ortamda hedefle birlikte 1:1
oranında NC içeren, veya aynı oranda hedef ile çift sarmal DNA içeren karışım
örneklerinde, hibrit sinyallerine yakın büyüklükte sinyaller elde edildi ve
MWCNT-SPE HBV sensörü ile hedef DNA dizisinin seçimlilikle algılanabildiği
elektrokimyasal olarak gösterildi.
4.3.6. Hedef dizi konsantrasyonundaki değişimin hibridizasyon
yanıtına olan etkisinin incelenmesine ilişkin bulgular ile ilgili tartışma:
Farklı hedef konsantrasyonlarda gerçekleşen hibridizasyona ait ölçülen
guanin sinyalleri ve kalibrasyon eğrisi, Şekil 44’de gösterildi. 5 ile 40 µg/mL
hedef konsantrasyonları arasında ve 30 dakika hibridizasyon süresi sonrasında
ölçülen
guanin
sinyallerinde
düzgün
bir
artış
gözlendi.
Hedef
dizi
konsantrasyonu 80 µg/mL veya daha yüksek bir konsantrasyona arttırıldığı
zaman, elektrot yüzeyindeki HBV prob ile gerçekleşen hibridizasyon olayının
verimli bir şekilde gerçekleşemediği ve bu yüzden sinyalde düzgün bir artışın
gözlenmediğine karar verildi.
115
Şekil
44’de
gösterilen
ve
doğrusal
olan
kalibrasyon
eğrisinden
(y=103,4x + 14,6 ve R2=0,9938), tayin sınırı 96 x 10-9 mol/L olarak bulundu (88).
Literatürde HBV DNA’nın elektrokimyasal sensörlerle tayinine ilişkin
mevcut çalışmaların sonuçları ile kıyaslandığında (37,38,44,48), çalışmamızda
kullanılan nanomalzemeye dayalı tek kullanımlık MWCNT sensörüyle HBV DNA
hibridizasyon tayininin, herhangi bir indikatör kullanılmaksızın, daha kısa
sürede, daha düşük tayin sınırında, seçimli ve güvenilir bir şekilde, başarıyla
elektrokimyasal olarak tayin edilebileceği gösterildi.
116
BÖLÜM V
SONUÇ ve ÖNERİLER
Tek kullanımlık sensör teknolojisine dayalı DNA analizlerine yönelik
çalışmalarımızın birinci bölümünde, gümüş nanopartiküller ile işaretlenmiş
DNA’nın tayini, ikinci bölümünde manyetik partiküller kullanılarak indikatörlü ve
indikatörsüz DNA hibridizasyonu tayini, ve çalışmamızın karbon nanotüp
modifiye perde baskılı elektrot sistemine dayalı üçüncü bölümünde, Hepatit B
virüsünü temsil eden (HBV) DNA dizisine dayalı hibridizasyonunun indikatörsüz
olarak elektrokimyasal tayini gerçekleştirildi.
Gümüş nanopartiküllere (Ag-NP) tutturulmuş DNA’nın elektrokimyasal
tayini, hem gümüşün hem de DNA’nın elektroaktif bazı olan guaninin
yükseltgenme sinyali aynı ölçüm aralığında tek kullanımlık kalem grafit elektrot
(PGE)
ile
ölçülerek
gösterilebilmiştir.
Nanopartiküllerin
mikroskobik
karakterizasyonu transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve taramalı elektron
mikroskobu (SEM) teknikleri ile, elektrokimyasal davranışları ise dönüşümlü
voltametri (CV) ve diferansiyel puls voltametri (DPV) teknikleri kullanılarak
incelenmiştir. Gümüş nanopartiküllere dayalı olan yöntemle elektrokimyasal
DNA analizinin metal nanopartikülden gelen sinyalin herhangi bir katalizör ya da
asidik çözelti kullanılmadan ölçülmesiyle, ilk defa bu çalışmada başarıyla
gerçekleştirilmiştir.
işaretlenmiş
kısa
Ayrıca,
DNA
nanopartikül
dizisinin
yüzeyine
tutturulan
konsantrasyonu,
amino
kullanılan
ile
Ag-NP
konsantrasyonu ve farklı tampon çözeltilerinin etkisi incelenmiş ve geliştirilen
sensör teknolojisi ile daha tekrarlanabilir ve daha duyarlı sonuçlar elde
edilmiştir. Bu çalışmada sunulan DNA algılamasına yönelik ve nanopartiküllere
117
dayalı elektrokimyasal sensör teknolojisi, daha önce literatürde rapor edilen
gümüş veya başka metal nanopartiküllerin kullanıldığı yöntemlere kıyasla
(4,29,57,141,142,150,151,155), daha kolay ve hızlıdır. Ayrıca DNA’nın NP
yüzeyine
tutturulması
zaman
alıcı
bir
yüzey
kimyası
işlemine
gerek
duymamaktadır. Bu yöntemin, literatürde rapor edilen diğer yöntemlere
(4,29,57,141,142,150,151,155) göre en önemli avantajlarından biri ise, metalik
gümüşün yükseltgenme sinyalini ölçmek için, metal iyonunu nanopartikülden
çözmek amacıyla katalizör ya da asidik çözelti kullanılması gibi ilave bir
basamağa ihtiyaç duyulmamasıdır. Diğer bir avantajı ise, aynı ölçüm skalasında
hem gümüş, hem de DNA’nın guanin bazına ait elektrokimyasal sinyallerin
ölçülmesini mümkün kılmasıdır.
Streptavidin-biotin etkileşmesi sonucunda manyetik partiküller yüzeyinde
DNA hibridizasyonu ve tek kullanımlık kalem grafit elektrot (PGE) ile
hibridizasyon tayini, hem elektroaktif indikatör olan ECHI’nin sinyali, hem de
guanin
ve
adenin
sinyallerinin
DPV
tekniği
kullanılarak
ölçülmesiye
gerçekleştirilmiştir. Manyetik partiküllere dayalı elektrokimyasal hibridizasyon
tayini, literatürde ilk defa ECHI’ye ait yükseltgenme sinyali üzerinden bu
çalışmada gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, tek kullanımlık grafit elektroda ve
biyomoleküler algılamaya dayalı geliştirilen sensör teknolojisinde, DNA
hibridizasyon tayini için izlenen ECHI, guanin ve adenin’e ait yükseltgenme
sinyallerinin aynı ölçüm aralığında gösterilmesi ilk defa çalışmamızda
gerçekleştirilmiştir ve literatürde bu konuda bir kayda rastlanılmamıştır.
Çalışmada hibridizasyona yönelik elde edilen sonuçlar, antitümör etkili bir
antibiyotik ilaç olan ECHI’nin çift sarmal ve tek sarmal DNA ile etkileşmesine
yönelik damlayan civa elektrodu (64) ve altın elektrodu (76) ile yapılan
118
çalışmaların sonuçları ile kıyaslandığında, geliştirilen sensör teknolojisinin daha
kolay, daha ucuz, daha duyarlı ve kullanılan etkin manyetik ayırma sayesinde
daha seçimli olduğu görülmüştür.
Nanomalzemeye dayalı tasarımlanmış sensörlerin dizi seçimli DNA
hibridizasyonunda uygulamalarına yönelik çalışamalara bakıldığında, herhangi
bir
elektroaktif
indikatör
kullanılmaksızın
HBV
DNA
hibridizasyonunun
elektrokimyasal tayini, karbon nanotüp modifiye perde baskılı grafit elektrotlar
(MWCNT-SPE) ile gerçekleştirilmiştir. Ülkemizde bu tür nanomalzemeye dayalı
perde
baskılı
elektrotların
üretilmesine
uygun
bir
teknolojinin
henüz
geliştirilmemiş olması sebebiyle elektrotlar, İspanya’daki Dropsens firmasından
temin edilmiştir. Firmanın SPE ve MWCNT-SPE kullanarak dopamin ve
hidrokinon gibi çeşitli maddelerin sinyallerini kıyasladığı çalışmalara bakıldığı
zaman, MWCNT-SPE ile daha iyi tanımlanmış ve 2-3 kat daha yüksek
sinyallerin elde edildiği saptanmıştır (61). Dolayısıyla çalışmamızda, sinyali
daha iyi tanımlanmış ve arttırılmış olarak algılayabilen MWCNT-SPE’ler
kullanılarak,
DNA’nın
elektrokimyasal
tayini
gerçekleştirilmiştir
ve
DNA
analizinde, SPE ile MWCNT-SPE’larının elektrokimyasal sinyal davranışlarını
gösteren herhangi bir kıyaslama çalışmasının yapılmasına gerek duyulmamıştır.
Çalışmamızda, mikroskopik karekterizasyonu gerçekleştirilen MWCNT-SPE
yüzeyinde gerçekleştirilecek DNA hibridizasyonunun verimliliği için optimum
prob DNA konsantrasyonu bulunmuş ve hibridizasyonda seçimlilik parametreleri
incelenmiştir.
Elde
edilen
sonuçlar,
literatürdeki
mevcut
çalışmalarla
kıyaslandığında (154), daha düşük DNA konsantrasyonunda daha duyarlı
sonuçların tekrarlanabilir bir şekilde elde edildiği görülmüştür. 40 µL gibi çok az
miktarda örnek ile MWCNT-SPE yüzeyinde gerçekleştirilen HBV DNA
119
hibridizasyonun tayini, HBV prob ile hedef dizi arasındaki hibridizasyon
sonucunda, guanin yükseltgenme sinyalinin DPV tekniği ile ölçülmesiyle
gerçekleştirilmiştir. Literatürde HBV DNA’nın elektrokimyasal sensörlerle
tayinine ilişkin mevcut çalışmaların sonuçları ile kıyaslandığında (37,38,44,48),
çalışmamızda kullanılan nanomalzemeye dayalı tek kullanımlık MWCNT
sensörüyle
HBV
DNA
hibridizasyon
tayininin,
herhangi
bir
indikatör
kullanılmaksızın, daha kısa sürede, daha düşük tayin sınırında, daha seçimli ve
güvenilir bir şekilde, başarıyla elektrokimyasal olarak tayin edilebileceği
gösterilmiştir.
Çalışmaların tümünde tek kullanımlık grafit sensör teknolojisinin kullanımı,
DNA analizinde incelenecek elektrokimyasal sinyallerin daha duyarlı bir şekilde,
daha tekrarlanabilir ve daha seri bir şekilde ölçülmesini olanaklı kılmıştır.
Çalışmada geliştirilen DNA algılamasına yönelik elektrokimyasal sensör
teknolojileri ile elde edilen sonuçlara bakıldığında, mikroçip teknolojisine yönelik
tasarımlanabilir olduklarına karar verilmiştir.
Sonuç olarak, tez çalışmamızda nanopartikül, manyetik partikül ve
karbon nanotüp gibi farklı malzemelere dayalı geliştirilen elektrokimyasal sensör
teknolojileri ile biyomoleküler algılamaya yönelik uygulamalar, tez kapsamında
daha duyarlı, seçimli ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Böylece
gelecekte kimya, malzeme bilimi, moleküler biyoloji vb. birçok bilim alanın
kapsamında;
kısacası,
multidisipliner
bir
alanda
tasarımlanabilecek
kullanabilecek sensör teknolojilerine katkı sağlanabileceği düşünülmektedir.
ve
120
ÖZET
Biyomoleküler Algılamaya Yönelik Elektrokimyasal Sensörlerin
Tasarımı ve Uygulamaları
Moleküler algılama yöntemlerindeki gelişmeler ve yeni teknolojik ürünlerle
sonuçlanabilecek çalışmaların hızla ortaya çıkması sonucunda, biyomoleküler
algılamaya yönelik yeni teknolojilerin oluşturulması gündeme gelmiştir.
Elektrokimyasal
DNA
sensör
teknolojilerinde,
nanopartiküller,
manyetik
partiküller, karbon nanotüpler gibi farklı malzemelerin kullanımına artan bir ilgi
bulunmaktadır.
Çalışmamızın
ilk
bölümünde,
gümüş
nanopartiküllere
(Ag-NP)
tutturulmuş DNA’nın elektrokimyasal tayini, gümüş ve guaninin yükseltgenme
sinyallerinin tek kullanımlık grafit elektrot (PGE) ile aynı ölçüm aralığında
ölçülmesiyle, literatürde ilk defa bu çalışmada gerçekleştirilmiştir. Ag-NP’lerin
elektrokimyasal davranışları, dönüşümlü voltametri (CV) ve diferansiyel puls
voltametri (DPV) teknikleriyle incelenmiştir. Ag-NP konsantrasyonu, DNA
konsantrasyonu ve tampon çözeltinin etkisi araştırılmıştır.
Çalışmamızın ikinci bölümünde, manyetik partiküllere dayalı DNA
hibridizasyonunun tayini, hem elektroaktif indikatör ECHI, hem de guanin ve
adenin’e ait yükseltgenme sinyallerinin DPV tekniği ve PGE kullanılarak, aynı
ölçüm
aralığında
ölçülmesiyle,
literatürde
ilk
defa
bu
çalışmada
gerçekleştirilmiştir. ECHI’nın elektrokimyasal davranışı, CV ve DPV teknikleriyle
incelenmiştir. Hibridizasyondaki seçimlilik, rastgele dizi (NC) ve bir bazı
hedeften farklı dizilerin (MM) kullanılmasıyla araştırılmıştır.
121
Çalışmamızın son bölümünde, Hepatit B virüsüne (HBV) dayalı
hibridizasyonunun indikatörsüz tayini, karbon nanotüp modifiye perde baskılı
elektrotlarla
(MWCNT-SPE)
DPV
tekniği
kullanılarak,
guanin
sinyalinin
ölçülmesiyle gerçekleştirilmiştir. HBV prob konsantrasyon farklılığının yanıta
etkisi, tayin sınırı, tekrarlanabilirlik gibi deneysel parametreler araştırılmıştır.
Nanopartiküller, manyetik partiküller ve karbon nanotüplere dayalı
elektrokimyasal sensör teknolojisiyle elde edilen tekrarlanabilir sonuçlar, duyarlı
ve hızlı bir şekilde DNA analizini mümkün kılmaktadır. Tasarımlanan
biyomoleküler algılamaya yönelik elektrokimyasal DNA sensör teknolojilerinin
her birinin hazırlık aşamasının kolay olması, tekrarlanabilir, duyarlı ve seçimli
sonuçlar vermesi, kullanılan malzemenin özelliği sebebiyle küçültülmeye ve seri
üretime uygulanabilecek olması sebebiyle, gelecekte DNA çip teknolojisine
öncülük edebileceği ümit edilmektedir.
122
ABSTRACT
The Design and Applications of Electrochemical Sensors
for Biomolecular Recognation
As a result of developments in molecular recognition methods and the
rapid appearance of the studies which will be concluded with new technologic
products, the design of new technologies for biomolecular recognition was
come into question. There is a growing interest in using different materials such
as; nanoparticles, magnetic particles, carbon nanotubes in electrochemical DNA
sensor technologies.
In the first part of our study, the electrochemical detection of DNA
attached onto silver nanoparticles (Ag-NP) was performed at the first time in the
literature in this study by measuring the oxidation signals of silver and guanine
in the same measurument scale with disposable graphite electrode (PGE). The
electrochemical behaviour of Ag-NPs was investigated by cyclic voltammetry
(CV) and differential pulse voltammetry (DPV) techniques. The effects of Ag-NP
concentration, DNA concentration and buffer solution were explored.
In the second part of our study, the detection of DNA hybridization
based on magnetic particles was performed at the first time in the literature in
this study by measuring both an oxidation signal of electroactive indicator ECHI,
and the ones of guanine and adenine in the same measurument scale by using
DPV technique and PGE. The electrochemical behaviour of ECHI was
investigated by CV and DPV technique. The selectivity in hybridization was
explored by using non-complementary (NC) and single-base mismatch (MM)
oligonucleotides.
123
In the last part of our study, the detection of hybridization based on
Hepatitis B virus (HBV) was performed measuring the guanine signal by using
carbon nanotube modified screen-printed electrodes (MWCNT-SPE) and DPV
technique. The experimental parameters such as; the effect of different HBV
probe concentration to the response, detection limit, reproducibility were
explored.
The reproducible results which were obtained by electrochemical sensor
technology based on nanoparticles, magnetic particles and carbon nanotubes,
enable DNA analysis sensitively and rapidly. Each of the electrochemical DNA
sensor technologies designed for biomolecular recognition will lead to DNA chip
technology in future, due to easy preparation, resulting with reproducible,
sensitive and selective results, and being able to miniaturize and applicable for
serial manufacture because of the properties of material.
124
YARARLANILAN KAYNAKLAR
1. Analitik Kimyanın Temelleri, Skoog, D. A., West, D. A., Holler, F. J.,
Çeviri editörleri; Prof. Dr. Esma Kılıç, Prof. Dr. Fitnat Köseoğlu (1996).
Bilim Yayıncılık, 7. Baskı, 303-495.
2. Ariksoysal, D.O., Karadeniz, H., Erdem, A., Sengonul, A., Sayiner, A.A.,
Ozsoz, M. (2005). Label-free electrochemical hybridization genosensor
for the detection of hepatitis B virus genotype on the development of
lamivudine resistance, Anal. Chem., 77 (15): 4908-4917.
3. Arkin, M.R., Stemp, E.D.A., Holmlin, R.E., Barton, J.K., Hörmann, A.,
Olson, E. J. O., Barbara, P.F., (1996). Rates of DNA mediated electron
transfer between metallointercalators, Science, 273: 475-480.
4. Authier, L., Grossiord, C., Brossier, P., Limoges, B. (2001). Gold
Nanoparticle-Based Quantitative Electrochemical Detection of Amplified
Human Cytomegalovirus DNA Using Disposable Microband Electrodes,
Anal. Chem., 73: 4450-4456.
5. Barry, J.P., Norwood, C., Vouros, P. (1996). Detection and identification
of Benzo[a]pyrene diol epoxide adducts to DNA utilizing capillary
electrophoresis-electrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 68: 14321438.
6. Barton, J. K., Goldberg, J. M., Kumar, C. V. , Turro, N. J. (1986). Binding
modes and base spesificity of tris (phenantroline) ruthenium (II)
enantiomers with nucleic acids: tunning the stereoselectivity, J. Am.
Chem. Soc., 108: 2081-2088.
7. Bauer, L.A., Birenbaum, N.S., Meyer, G.J. (2004). Biological applications
of high aspect ratio nanoparticles, J. Mater. Chem., 14: 517-526.
125
8. Bej, A. K. (1996). Chapter 1: Nucleic acid hybridizations: principles and
strategies, Nucleic acid analysis: Principles and Bioapplications;
Dangler,C. A., Wiley-Liss (Ed), Inc., s. 1-29.
9. Bertino, J. R. (1992). Antineoplastic Drugs, Textbook of Pharmacology,
Smith, C. M. and Reynard, A. M., Section IX - Cancer Chemotheraphy;
W. B. Saunders Company, USA; 957-958.
10. Brabec, V. (1983). Conformational changes in DNA induced by its
adsorption at negatively charged surfaces - The effects of base
composition in DNA and the chemical nature of the adsorbent,
Bioelectrochem. Bioenerg., 11: 245-255.
11. Brabec, V., Dryhurst, G. (1978). Electrochemical behaviour of natural
and biosynthetic polynucleotides at the pyrolytic graphite electrode
a
new probe for studies of polynucleotide structure and reactions,
Electroanal. Chem., 89: 161-173.
12. Brabec, V., Koudelka, J. (1980). Oxidation of deoxyribonucleic acid at
carbon electrodes. The effect of the quality of the deoxyribonucleic acid
sample, Bioelectrochem. Bioenerg., 7: 793-805.
13. Brett, A.M. Oliveira, Serrano, S.H.P., Gutz, I., La-Scalea, M.A., Cruz, M.
L. (1997). Voltammetric behaviour of nitroimidazoles at a DNA-biosensor,
Electroanalysis, 9: 1132-1137.
14. Brett, C. M. A., Brett, A. M. (1992). Electrochemistry, Oxford University
Press, 3. baskı
15. Brett, A. M. O., Piedade, J. A. P., Serrano, S. H. P., (2000),
Electrochemical oxidation of 8-oxoguanine, Electroanal., 12: 969-973.
126
16. Cai, H., Cao, X., Jiang, Y., He, P., Fang, Y. (2003). Carbon nanotubeenhanced electrochemical DNA biosensor for DNA hybridization
detection, Anal. Bioanal. Chem., 375(2): 287-293.
17. Cai, X., Rivas, G., Farias, P. A. M., Shiraishi, H., Wang, J., Fojta, M.,
Palecek, E. (1996). Trace measurements of plasmid DNAs by adsorptive
stripping potentiometry at carbon paste electrodes, Bioelectrochem.
Bioenerg., 40: 41-47.
18. Cai, X., Rivas, G., Farias, P. A. M., Shiraishi, H., Wang, J., Palecek, E.
(1996). Evaluation of different carbon electrodes for adsorptive stripping
analysis of nucleic acids, Electroanalysis, 8 (8-9): 753-758.
19. Cai, X., Rivas, G., Shirashi, H., Farias, P., Wang, J., Tomschik, M.,
Jelen, F., Palecek, E. (1997). Electrochemical analysis of formation of
polynucleotide complexes in solution and at electrode surfaces, Anal.
Chim. Acta, 344: 65-76.
20. Camman, K., Lemke, U., Rohen, A., Sander, J., Wilken, H., Winter, B.
(1991). Chemical Sensors and Biosensors-Principles and Applications,
Angew. Chem. Int. De. Engl., 30: 516-539.
21. Carpini,
G.,
Lucarelli,
F.,
Marrazza,
G.,
Mascini,
M.
(2004).
Oligonucleotide-modified screen-printed gold electrodes for enzymeamplified sensing of nucleic acids, Biosens. Bioelectron., 20 (2): 167175.
22. Carter, M. T. and Bard, A. J. (1987). Voltammetric studies of the
interaction of tris (1,10-phenanthroline) cobalt (III) with DNA, J. Am.
Chem. Soc., 109: 7528-7530.
127
23. Carter, M. T., Rodriguez, M., Bard, A. J. (1989). Voltammetric studies of
the interaction of metal chelates with DNA. 2. Tris chelated complexes of
Cobalt (III) and Iron (II) with 1,10-phenantroline and 2, 2’-Bipyridine, J.
Am. Chem. Soc., 111: 8901-8911.
24. Chen, R. J., Zhang, Y., Wang, D., Dai H. (2001). Noncovalent Sidewall
Functionalization of Single-Walled Carbon Nanotubes for Protein
Immobilization, J. Amer. Chem. Soc., 123: 3838-3839.
25. Chiti, G., Marrazza, G., Macsini, M. (2001). Electrochemical DNA
biosensor for enviromental monitoring, Anal. Chim. Acta., 427: 155-161.
26. Coulet, P. R. (1991). What is a Biosensor?, Chapter 1;
Biosensor
principles and applications, L.J.Blum, P.R. Coulet (Ed), M. Dekker Inc.,
New York, s. 1-6.
27. Deforce, D. L. D., Ryniers, F. P. K., Van den Eeckhout, E. G., Lemiere,
F. Esmans, E.L. (1996). Analysis of DNA adducts in DNA hydrolysates
by capillary zone electrophoresis and capillary zone electrophoresiselectrospray mass spectrometry, Anal. Chem., 68: 3575-3584.
28. Denissenko, M.F., Pao, A., Tang, M.S., Pfeifer, G.P. (1996). Preferential
formation of Benzo[a]pyrene adducts at lung cancer mutational hotpots in
p53, Science, 274: 430-432.
29. Dequaire, M., Degrand, C., Limoges, B. (2000). An Electrochemical
Metalloimmunoassay Based on a Colloidal Gold Label, Anal. Chem., 72:
5521-5528
30. Dervan, P. B. (1986). Design of Sequence-spesific DNA-binding
molecules, Science, 232: 464-471.
128
31. Dervan, P. B. (1998). Sequence specific recognition of double helical
DNA. A synthetic approach, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol.2:
Ed. Eckstein, F. and Lilley, D.M.J., Springer-Verlag, Berlin, s. 49-64.
32. DNA structure and Function; Chapter 1- Introduction to the Structure,
properties, and reactions of DNA; R. R. Sinden (Ed), Academic Press,
California, 1994, s. 1-57.
33. D’Orazio, P. (2003). Biosensors in clinical chemistry, Clinica Chimica
Acta, 334: 41-69.
34. Erdem,
A.
(2007).
Chapter
19:
Genosensor
technology
for
electrochemical sensing of nucleic acids by using different transducers.
Comprehensive Analytical Chemistry, 49: 403-411.
35. Erdem, A., Meriç B., Kerman K., Dalbastı T., Ozsoz M. (1999). Detection
of interaction between metal complex indicator and DNA by using
electrochemical biosensor, Electroanal., 11: 1372-1376.
36. Erdem, A., Kerman K., Meric B., Ozkan, D., Kara, P., Ozsoz M. (2002).
DNA biosensor for microcystis spp. Sequence detection by using
methylene blue and ruthenium complexes as hybridisation labels, Turk.
J. Chem., 26: 851-862.
37. Erdem, A., Kerman K., Meriç B., Akarca U.S., Ozsoz M. (1999). DNA
electrochemical biosensor for the detection of short DNA sequences
related to the hepatitis B virus, Electroanal., 11: 586-588.
38. Erdem, A., Kerman K., Meriç B., Akarca U.S., Ozsoz M. (2000). Novel
hybridization indicator methylene blue for the electrochemical detection
of short DNA sequences related to the hepatitis B virus, Anal. Chim.
Acta, 422: 139-149.
129
39. Erdem A., Kerman K., Meriç B.,Ozsoz, M. (2001). Methylene blue as a
novel electrochemical hybridization indicator, Electroanal., 13(3): 219223.
40. Erdem, A., Kosmider, B., Osiecka, R., Zyner, E., Ochocki, J., Ozsoz, M.
(2005). Electrochemical genosensing of the interaction between the
potential
chemotherapeutic
agent,
cis-bis(3-aminoflavone)
dichloroplatinum(II) and DNA in comparison with cis-DDP, J. Pharm. and
Biomed. Anal., 38: 645-652.
41. Erdem, A, Ozsoz, M. (2001). Interaction of the anticancer drug epirubicin
with DNA, Anal. Chim. Acta, 437: 107-114.
42. Erdem, A. (2007). A review: Nanomaterial-based electrochemical DNA
sensing strategies, Talanta, 74: 318-325.
43. Erdem, A.,
Ozsoz, M. (2001). Voltammetry of the anticancer drug
mitoxantrone and DNA, Turk. J. Chem, 25: 469-475.
44. Erdem, A., Ariksoysal, D. O., Karadeniz, H., Kara, P., Sengonul, A.,
Sayiner, A. A., Ozsoz, M. (2005). Electrochemical genomagnetic assay
for the detection of hepatitis B virus DNA in polymerase chain reaction
amplicons by using disposable sensor technology, Electrochem.
Commun., 7: 815-820.
45. Erdem, A., Ozsoz, M., (2002). A review: Electrochemical DNA
biosensors based on DNA-drug interactions, Electroanal., 14: 965-974.
46. Erdem, A., Papakonstantinou, P., Murphy, H. (2006). Direct DNA
Hybridization at Disposable Graphite Electrodes Modified with Carbon
Nanotubes, Anal. Chem., 78: 6656-6659.
130
47. Erdem, A., Pividori, M. I., Lermo, A., Bonanni, A., del Valle, M., Alegret,
S. (2006). Genomagnetic assay based on label-free electrochemical
detection using magneto-composite electrodes, Sensors and Actuators
B-Chemical, 114: 591-598.
48. Erdem, A., Sayar, F., Karadeniz, H., Guven, G., Ozsoz, M., Piskin, E.
(2007). Development of Streptavidin Carrying Magnetic Nanoparticles
and Their Applications in Electrochemical Nucleic Acid Sensor Systems,
Electroanal., 19: 798-804.
49. Evans, A. (1991). Potentiometry and ISE, ACOL, London, s. 106-198.
50. Farmakoloji - İlaç uygulamalarında temel kavramlar, (1992). 63.Bölüm:
Antikanser İlaçlar, Prof. Dr. İ. Dökmeci (Ed), Nobel Tıp Kitabevleri, s.
819-848.
51. Floch, F., Ho, H.-A., Harding-Lepage, P., Leclerc, M. (2005). New
ferrocene-functionalized
cationic
polythiophene
for
label-free
electrochemical DNA detection, NSTI Nanotechnology Conference and
Trade Show - NSTI Nanotech 2005 Technical Proceedings, s. 374-375.
52. Fojta, M., Havran, L., Fulneckova, J., Kubicaova, T. (2000). Adsorptive
transfer stripping AC voltammetry DNA complexes with intercalators,
Electroanal., 12: 926-934.
53. Garcia-Canas, V., Cifuentes, A., Gonzales, R. (2004). Detection of
genetically modified organisms in foods by DNA amplification techniques,
Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44: 425-436.
131
54. Gulmez, B., Karadeniz, H., Erdem, A., Ozsoz, M. (2007). Procedure 27:
Electrochemical detection of calf tyhmus double-stranded DNA and
single-stranded
DNA
by
using
a
disposable
graphite
sensor,
Comprehensive Analytical Chemistry, 49: e195-e202.
55. Guo, M., Chen, J., Liu, D., Nie, L., Yao, S. (2004). Electrochemical
characteristics of the immobilization of calf thymus DNA molecules on
multi-walled carbon nanotubes, Bioelectrochem., 62: 29-35.
56. Guo, M., Chen, J., Liu, D., Nie, L., Yao, S., (2004). Electrostatic
assembly of calf thymus DNA on multi-walled carbon nanotube modified
gold electrode and its interaction with chlorpromazine hydrochloride,
Electrochim. Acta, 49: 2637-2643.
57. Cai, H., Xu, Y., Zhu, N., He, P., Fang, Y. (2002). An electrochemical DNA
hybridization detection assay based on a silver nanoparticle label,
Analyst, 127: 803-808.
58. Hahm, J., Lieber, C. M. (2004). Direct Ultrasensitive Electrical Detection
of DNA and DNA Sequence Variations Using Nanowire Nanosensors,
Nano Lett., 4: 51-54.
59. Hall, E. A. H.(1990). Biosensors, Ch.1: Biosensors in context, Open
University Press, İngiltere; s. 3-30.
60. Herne, T.M., Tarlov, M.J. (1997). Characterization of DNA probes
immobilized on gold surfaces, J. Am. Chem. Soc., 119: 8916-8920.
61. http://www.dropsens.com
62. http://www.mos.org/sln/SEM&TEM/
63. http://www.affymetrix.com/products/arrays
132
64. Jelen, F., Erdem, A., Palecek, E. (2002). Cyclic voltammetry of
Echinomycin and its interaction with double-stranded and single-stranded
DNA adsorbed at the electrode, Bioelectrochem., 55: 165-167.
65. Jelen, F., Tomschik, M., Palecek, E. (1997). Adsorptive stripping squarewave voltammetry of DNA, J. Electroanal. Chem., 423: 141-148.
66. Johnston, D.H., Glasgow, K.C., Thorp, H.H. (1995). Electrochemical
measurument of the solvent accessibility of nucleobases using electron
transfer between DNA and Metal complexes, J. Am. Chem. Soc., 117:
8933-8938.
67. Ju, H.X., Zhao, H. (2005). Electrochemical biosensors for DNA analysis,
Frontiers in Bioscience, 10: 37-46.
68. Kai, W., K., Fei, J., Bai, W., Hu, S. (2003). Anal. Bioanal. Chem. 376:
205-209.
69. Kalogianni, D.P., Koraki, T., Chiristopoulos, T.K., Ioannou, P.C. (2006).
Nanoparticle-based DNA biosensor for visual detection of genetically
modified organisms, Biosens. and Bioelectron., 21(7): 1069-1076.
70. Kara, P., Kerman, K., Ozkan, D., Meric, B., Erdem, A., Nielsen, P.E.,
Ozsoz, M. (2002). Label free and label based electrochemical detection
of hybridization by using methylene blue and peptide nucleic acid probes
at chitosan modified carbon paste electrodes, Electroanal., 14 (23): 1-6.
71. Kara, P., Kerman, K., Ozkan, D., Meric, B., Erdem, A., Ozkan, Z., Ozsoz,
M. (2002). Electrochemical genosensor for the detection of interaction
between methylene blue and DNA, Electrochem. Commun., 4: 705-709.
133
72. Kara, P., Meric, B., Zeytinoglu, A., Ozsoz, M. (2004). Electrochemical
DNA biosensor for the detection and discrimination of herpes simplex
Type I and Type II viruses from PCR amplified real samples, Anal. Chim.
Acta, 518 (1-2): 69-76.
73. Karadeniz, H., Erdem, A., Caliskan, A., Pereira, C.M., Pereira, E.M.,
Ribiero, J.A. (2007). Electrochemical sensing of silver tags labelled DNA
immobilized
onto
disposable
graphite
electrodes,
Electrochem.
Commun., 9: 2167-2173.
74. Karadeniz, H., Gulmez, B., Sahinci, F., Erdem, A., Irem Kaya, G., Unver,
N., Kivcak, B., Ozsoz, M. (2003). Disposable electrochemical biosensor
for the detection of the interaction between DNA and lycorine based on
guanine and adenine signals, J. Pharm. and Biomed. Anal., 33: 295-302.
75. Karadeniz,
H.,
Alparslan,
L.,
Erdem,
A.,
Karasulu,
E.
(2007).
Electrochemical investigation of interaction between Mitomycin C in a
novel drug-delivery system, J. Pharm. and Biomed. Anal., 45: 322-326.
76. Karadeniz, H., Gulmez, B., Erdem, A., Jelen, F., Ozsoz, M., Palecek, E.
(2006). Echinomycin and and cobalt-phenanthroline as redox indicators
of DNA hybridization at gold electrodes, Front. Biosci., 11: 1870-1877.
77. Katz,
E.,
Willner,
I.,
Wang,
J.
(2004).
Electroanalytical
and
Bioelectroanalytical Systems Based on Metal and Semiconductor
Nanoparticles, Electroanal., 16: 19-44.
78. Kerman, K., Meric, B., Ozkan, D., Kara, P., Erdem, A., Ozsoz, M. (2001).
Electrochemical DNA biosensor for the determination of benzo[a]pyreneDNA adducts, Anal. Chim. Acta., 450: 45-52.
134
79. Kerman, K., Meric, B., Ozkan, D., Kara., P., Jelen F., Karadeniz H.,
Ozkan Z., Ozsoz M. (2004). Dna Sensing On Mercury And Carbon
Electrodes By Using Meldola Blue As The Electrochemically Active
Intercalator, Turk. J. Chem., 28: 1-11.
80. Kerman, K., Morita, Y., Takamura, Y., Ozsoz, M., Tamiya, E. (2004).
DNA-directed attachment of carbon nanotubes for enhanced label-free
electrochemical detection of DNA hybridization, Electroanal.,16(20):
1667-1672.
81. Kerman, K., Morita, Y., Takamura, Y., Tamiya, E. (2003). Label-free
electrochemical detection of DNA hybridization on gold electrode,
Electrochem. Commun., 5 (10): 887-891.
82. Koehne, J.E., Chen, H., Cassell, A.M., Ye, Q., Han, J., Meyyappan, M.,
Li, J. (2004). Miniaturized Multiplex Label-Free Electronic Chip for Rapid
Nucleic Acid Analysis Based on Carbon Nanotube Nanoelectrode Arrays
Clin. Chem., 50: 1886-1893.
83. Lucarelli, F., Marrazza, G., Palchetti, I., Cesaretti, S., Mascini, M. (2002).
Coupling of an indicator-free electrochemical DNA biosensor with
polymerase chain reaction for the detection of DNA sequences related to
the apolipoprotein E, Anal. Chim. Acta, 469: 93-99.
84. Lucarelli,
F.,
Palchetti,
I.,
Marazza,
G.,
Mascini,
M.
(2002).
Electrochemical DNA biosensor as a screening tool for the detection of
toxicants in water and wastewater samples, Talanta, 56: 949-957.
85. Luo, X. L., Morrin, A., Killard, A. J., Smyth, M. R. (2006). Application of
Nanoparticles in Electrochemical Sensors and Biosensors, Electroanal.,
18: 319-326.
135
86. Marin, D., Perez, P., Teijeiro, C., Palecek, E. (1998). Interactions of
surface-confied DNA with acid-activated mitomycin C, Biophysl Chem.,
75: 87-95.
87. Mascini, M. (2001). Affinity electrochemical biosensors for the pollution
control, Pure Appl. Chem., 73(1): 23-30.
88. Mc Creery, R. (1990). Electroanalytical Chemistry, Bard, A.J., Dekker, M.
(Ed). New York, s. 221-374.
89. Mc Farland, A.D., Van Duyne, R.P. (2003). Single Silver Nanoparticles
as Real-Time Optical Sensors with Zeptomole Sensitivity, Nano. Lett., 3:
1057-1062.
90. Merkoçi, A., Pumera, M., Llopis, X., Pérez, B., Vale, M., Alegret, S.
(2005).
New
materials
for
electrochemical
sensing
VI:
Carbon
nanotubes, Trends Anal. Chem., 24: 826-838.
91. Mikkelsen, S.R. (1994). Sequence-selective DNA Sensors for the
diagnosis of inherited diseases (Voltametric), A.B.D Patent no: 5,312,527
(05/ 17/1994).
92. Mikkelsen, S.R. (1996). Electrochemical biosensors for DNA sequence
detection- a review, Electroanal., 8 (1): 15-19.
93. Modern Drug Discovery (1999). Milestones of antisense oligonucleotide
therapeutics, J.F. Ryan (Ed), Washington DC, 1-2: sayfa 68.
94. Molinier-Jumel, C., Malfoy, B., Reynaud, J. A. and Aubel-Sadron, G.
(1978).
Electrohemical
study
of
DNA-Anthracyclines
interactions,
Biochemical and Biophysical Research Communications, 84 (2): 441449.
136
95. Motti, C., Dainese, E., Mascini, M., Minnuni, M., De Santis, P., Cozzani,
I. (2000). The use of biotechnology in agriculture and the methods for the
detection of genetically modified organisms (GMOS) in food, Italian J.
Biochem., 49: 64-72.
96. Musameh, M., Wang, J., Merkoci, A., Lin, Y. (2002). Low-potential stable
NADH detection at carbon-nanotube-modified glassy carbon electrodes,
Electrochem. Commun., 4: 743-746.
97. Ovadekova, R., Jantova, S., Letasiova, S., Stepanek, I., Labuda, J.
(2006). Nanostructured electrochemical DNA biosensors for detection of
the effect of berberine on DNA from cancer cells, Anal Bioanal Chem.
386 (7-8): 2055-2062.
98. Ozkan, D., Erdem, A., Kara, P., Kerman, K., Gooding, J.J., Nielsen, P.E.,
Ozsoz, M. (2002). Voltammetric determination of DNA hybridization
using methylene blue and self-assembled alkanethiol monolayer on gold
electrodes, Anal. Chim. Acta, 462 (1): 39-47.
99. Ozkan, D., Erdem, A., Kara, P., Kerman, K., Gooding, J.J., Nielsen, P.E.,
Ozsoz, M. (2002). Electrochemical detection of hybridization using
peptide nucleic acids and methylene blue on self-assembled alkanethiol
monolayer modified gold electrodes, Electrochem. Commun., 4 (10):
796-802.
100. Ozkan, D., Karadeniz, H., Erdem, A., Macsini, M., Ozsoz, M. (2004).
Electrochemical genosensor for Mitomycin C-DNA interaction based on
guanine signal, J. Pharma. and Biomed. Anal., 35(4): 905-912.
137
101. Ozsoz M., Erdem A., Kara P., Kerman K., Ozkan D. (2002).
Electrochemical biosensor for the detection of interaction between
arsenic trioxide and DNA based on guanine signal, Electroanal., 15: 613619.
102. Ozsoz, M., Erdem, A., Kerman, K., Ozkan, D., Tugrul, B., Topcuoglu,
N., Erken, H., Taylan, M. (2003). Electrochemical Genosensor Based on
Colloidal Gold Nanoparticles for the Detection of Factor V Leiden
Mutation Using Disposable Pencil Graphite Electrodes, Anal. Chem., 75:
2181-2187.
103. Palecek, E., Fojta, M. (2001). DNA hybridization and Damage
Anal.Chem., 73: 75A-83A.
104. Palecek,
E.
(1988).
Adsorptive
transfer
stripping
voltammetry:
determination of nanogram quantities of DNA immobilized at the
electrode surface, Anal. Biochem., 170: 421-431.
105. Palecek, E. (1988). New trends in electrochemical analysis of nucleic
acids, Bioelectrochem. Bioenerg., 20: 179-194.
106. Palecek,
E.
(1995).
Nucleic
acids:
electrochemical
and
immunochemical methods, Encyclopedia of Analytical Science ( Alan
Townshend (Ed)), London, Academic press, Vol. 6: s. 3600-3609.
107. Palecek, E. (1996). From Polarography of DNA to Microanalysis with
Nucleic Acid Modified Electrodes, Electroanal., 8 (1): 7-14.
108. Palecek, E., Kizek, R., Havran, L., Billova, S., Fojta, M. (2002).
Electrochemical enzyme-linked immunoassay in a DNA hybridization
sensor, Anal. Chim. Acta, 469: 73-83.
138
109. Patolsky, F., Lieber, C.M. (2005). Nanowire nanosensors, Materials
Today, 8(4): 20-28.
110. Paz, M. M., Das, A., Tomasz, M. (1999). Mitomycin C linked to DNA
minor groove binding and cros-linking properties and in vitro antitumor
activity, Bioorganic&Medicinal Chemistry, 7: 2713-2726.
111. Pedano, M. L., Rivas, G. A. (2004). Adsorption and electrooxidation of
nucleic acids at carbon nanotubes paste electrodes, Electrochem.
Commun., 6: 10-16.
112. Pietrzyk, D.J., Frank, C. W. (1979). Analytical Chemistry, 2.Baskı,
Academic press: s. 226- 239.
113. Pividori, M. I., Merkoçi, A., Alegret, S.
(2000). Electrochemical
genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducer
surfaces and detection methods, Biosensors and Bioelectronics, 15: 291303.
114. Plambeck, J. A., Lown, J. W. (1984). Electrochemical Studies of
antitumor antibiotics: V. An electrochemical method of measurement of
the binding of Doxorubicin and Daunorubicin derivatives to DNA, J.
Electrochem. Soc., 131 (11): 2556-2563.
115. Prof. Dr. A. Yıldız, Prof. Dr. Ö. Genç, (1993). Enstrümental Analiz,
Hacettepe Yayınları, A-64, s. 289-384.
116. Pumera, M., Sanchez, S., Ichinose, I., Tang, J. (2007). Electrochemical
nanobiosensors, Sensors and Actuators B Chem., 123: 1195-1205.
139
117. Querioz, M.R.P., Castanheira E.M.S., Carvalho, M.S.D., Abreu, A.S.,
Ferreira, P.M.T., Karadeniz, H., Erdem, A. (2008). New tetracyclic
heteroaromatic compounds based on dehydroamino acids: photophysical
and electrochemical studies of interaction with DNA, Tetrahedron, 2:
382-391.
118. Ravindran, S., Chaudhary, S., Colburn, B., Ozkan, M., Ozkan, C.S.
(2003). Covalent Coupling of Quantum Dots to Multiwalled Carbon
Nanotubes for Electronic Device Applications. Nano. Lett., 3: 447-453.
119. Richardson, C. L., Springfield, G. E. S., Intercalation inhibition assay for
compounds that interact with DNA or RNA, Amerikan patent no;
4,257,774 / 24 Mart 1981).
120. Salem, A.K., Chao, J., Leong, K.W., Searson, P.C. (2004). ReceptorMediated Self-Assembly of Multi-Component Magnetic Nanowires, Adv.
Mater., 16: 268-271.
121. Sato, N., Okuma, H. (2008). Development of single-wall carbon
nanotubes modified screen-printed electrode using a ferrocene-modified
cationic surfactant for amperometric glucose biosensor applications,
Sensors and Actuators B: Chem, 129: 188-194.
122. Service, R. F. (1998). New focus: Microchip arrays put DNA on the
spot, Science, 282: 396-399.
123. Sole, S., Merkoci, A., Alegret, S. (2001). New materials for
electrochemical sensing III. Beads, Trends Anal. Chem., 20: 102-110.
124. Song, M., Zhang, R., Wang, X., (2006). Nano-titanium Dioxide
Enhanced Biosensing of the Interaction of Dacarbazine with DNA and
DNA bases, Materials letters, 60: 2143-2147.
140
125. Steinbach, P. B., Hurtubise, R. J. (2000). Fluorescence of tetrols, tetrols
complexed
with
DNA
and
benzo[a]pyrene-DNA
adducts
in
methanol/water solutions, Appl. Spect., 54: 287-293.
126. Takeuchi, K. J., Thompson, M. S., Pipes, D. W., Meyer, T. J. (1984).
Redox and spectral properties of monooxo polypyridyl complexes of
ruthenium and osmium in Aqueous media, Inorg. Chem., 23: 1845-1851.
127. Tomschik, M., Jelen, F., Havran, L., Trnkova, L., Nielsen, P. E.,
Palecek, E. (1999). Reduction and oxidation of peptide nucleic acid and
DNA at mercury and carbon electrodes, J. Electroanal. Chem., 476: 7180.
128. Turkovich, J., Stevenson, P.C., Hillier, J. (1951). A Study of the
Nucleation and Growth Processes in the Synthesis of Colloidal Gold,
Discuss. Faraday Soc., 11: 55-75.
129. Turner, A. P. F. (1987). Biosensors: Fundamentals and Applications,
Turner, A. P. F., Karube, I. and Wilson, G. S. (Ed); Oxford University
Press, Oxford, s. v-vii.
130. Vaseashta, A., Nanostructured Materials Based Next Generation
Devices and Sensors, Nanostructured and Advanced Materials, in A.
Vaseashta, D. Dimova-Malinovska, J. M. Marshall (Ed.), Springer, 2005,
s. 1-30.
131. Walkein., G., Laurence, P., Michael, J. (1976). The binding of
Echinomycin to deoxyribonucleic acid, J. Biochem., 157: 721-740.
132. Wang, A.H.J. (1987). Interactions between antitumor drugs and DNA,
Nucleic Acids and Molecular Biology, (Ed; Eckstein, F., Lilley, D.M.J.,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg - Germany) 1: s. 52-69.
141
133. Wang, J. (1997). DNA electrochemical biosensors for environmental
monitoring. A Review, Anal. Chim.Acta , 347: 1-9.
134. Wang, J. (2000). SURVEY AND SUMMARY: From DNA biosensors to
gene chips, Nucl. Acids Res., 28: 3011-3016.
135. Wang, J. (2005). Nanomaterial-Based Amplified Transduction of
Biomolecular Interactions, Small, 1(11): 1036-1043.
136. Wang, J. (2005). Nanomaterial-based electrochemical biosensors,
Analyst, 130: 421-426.
137. Wang, J., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H. (1996). Stripping
potentiometric transduction of DNA hybridization processes, Anal. Chim.
Acta, 326: 141-147.
138. Wang, J., Xu, D., Erdem, A., Polsky, R., Salazar, M. A. (2002).
Genomagnetic
electrochemical
assays
of
DNA
hybridization,
Talanta, 56: 931-938.
139. Wang, J., Fernandes, J.R., Kubota, L.T. (1998). Polishable and
renewable DNA hybridization biosensors, Anal. Chem., 70: 3699-3702.
140. Wang, J., Flechsig, G.-U., Erdem, A., Korbut, O., Grundler, P. (2004).
Label-free DNA Hybridization Based on Coupling of a Heated Carbon
Paste Electrode with Magnetic Separations, Electroanal., 16: 928-931.
141. Wang, J., Guodong, L., Merkoci, A. (2003). Particle-based detection of
DNA hybridization using electrochemical stripping measurements of an
iron tracer, Anal. Chim. Acta, 482: 149-155.
142. Wang, J., Guodong, L., Polsky, R., Merkoci, A. (2002). Electrochemical
stripping detection of DNA hybridization based on cadmium sulfide
nanoparticle tags, Electrochem. Commun., 4: 722-726.
142
143. Wang, J., Kawde, A. N. , Erdem, A., Salazar, M. (2001). Magnetic beadbased label-free electrochemical detection of DNA hybridization, Analyst,
126: 2020-2024.
144. Wang, J., Kawde, A.N., Musameh, M., (2003). Carbon-NanotubeModified
Glassy
Carbon
Electrochemical
Electrodes
Detection
of
for
Amplified
DNA
Label-Free
Hybridization,
Analyst, 128: 912-916.
145. Wang, J., Liu, G.D., Merkoci, A. (2003). Particle-based detection of
DNA hybridization using electrochemical stripping measurements of an
iron tracer, Anal. Chim. Acta, 482: 149-155.
146. Wang, J., Pumera, M., Chatrathi, M.P., Escarpa, A., Musameh, M.
(2002). Single channel microchip for fast screening and detailed of
nitroaromatic explosives or organophosphate nevre agents, Anal. Chem.,
74: 1187-1191.
147. Wang, J., Rivas, G., Cai, X., Palecek, E., Nielsen, P., Shiraishi, H.,
Dontha, N., Luo, D., Parrado, C., Chicharro, M., Farias, P. A. M., Valera,
F. S., Grant, D. H., Ozsoz, M., Flair, M. N. (1997). DNA electrochemical
biosensors for enviromental monitoring-A review, Anal. Chim. Acta, 347:
1-8.
148. Wang, J., Rivas, G., Fernandes, J. R., Jiang, M., Paz, J. L. L., Waymire,
R., Nielsen, T. W., Getts, R. C. (1998). Adsorption and detection of DNA
dendrimers at carbon electrodes, Electroanal., 10(8): 553-556.
149. Wang, J., Rivas, G., Luo, D., Cai, X., Valera, F. S., Dontha, N., Farias,
P. A. M., Shiraishi, H. (1996).
DNA Biosensor for the detection of
hydrazines, Anal. Chem., 68: 2251-2254.
143
150. Wang, J., Xu, D., Kawde, A.-N., Polsky, R. (2001). Metal NanoparticleBased Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA
Hybridization, Anal. Chem. 73: 5576-5581.
151. Wang, J., Xu, D., Polsky, R. (2002). Magnetically-Induced Solid-State
Electrochemical Detection of DNA Hybridization, J. Amer. Chem. Soc.
124: 4208-4209.
152. Waring, M.J., Wakelin, L.P. (1974). Echinomycin: A biofunctional
intercalating antibiotic, Nature, 252: 653-657.
153. Wildgoose, G.G., Banks, C.E., Leventis, H.C., Compton, R.G. (2006).
Microchim. Acta, 152: 187-193.
154. Ye, Y., Ju, H. (2005). Rapid Detection of ssDNA and RNA Using MultiWalled
Carbon
Nanotube
Modified
Screen-Printed
Electrodes,
Biosensors and Bioelectronics, 21: 735-741.
155. Zhu, N., Zhang, A., Wang, Q., He, P., Fang, Y. (2004). Lead Sulfide
Nanoparticle as Oligonucleotides Labels for Electrochemical Stripping
Detection of DNA Hybridization, Electroanal., 16: 577-582.
144
Arş. Gör. Uzm. Ecz. Hakan KARADENİZ’in Özgeçmişi
Doğum Tarihi: 20.07.1979
Doğum Yeri: İzmir
Yabancı Dil: İngilizce (iyi), ÜDS: 76.250
Eğitim:
İlk öğrenimi: Mustafa Urcan İlkokulu ( 1986-1991)
Orta ve lise öğrenimi: İzmir Özel Türk Koleji ( 1991-1997)
Lisans Eğitimi:
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ( Eylül 1998 – Haziran 2002 ).
(Okul birincisi)
Yüksek Lisans Eğitimi:
Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Analitik Kimya Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Programı (Ekim 2002 – Eylül 2004).
Yüksek Lisans tezi:
DNA analizlerine yönelik elektrokimyasal genosensörün tasarımı ve
uygulamaları (Eylül 2003-Eylül 2004).
Danışman öğretim üyesi: Doç. Dr. K. Arzum ERDEM
Doktora Eğitimi
Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Analitik Kimya Anabilim Dalı
Doktora Programı (Ekim 2004-Halen devam etmektedir).
Doktora tezi:
Biyomoleküler
Algılamaya
Yönelik
Elektrokimyasal
Sensörlerin
Tasarımı ve Uygulamaları (Nisan 2006- Halen devam etmektedir).
Danışman öğretim üyesi: Doç. Dr. K. Arzum ERDEM GÜRSAN
Kazandığı Burslar:
TÜBİTAK -Yurt İçi Yüksek Lisans Bursu (Ekim 2003- Eylül 2004)
TÜBİTAK -Yurt İçi Doktora
etmektedir)
Bursu (Mart 2005- halen devam
145
Görevli Olduğu Proje Çalışmaları:
1. Kalıtsal ve bulaşıcı hastalıkların elektrokimyasal DNA biyosensörleriyle
saptanması (TÜBİTAK projesi - Proje No: TBAG-2161, araştırmacı, Ağustos
2002- Ocak 2005).
2. Elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin (Genosensörlerin) tasarımında
kullanılan yeni teknikler ve uygulamaları (TÜBİTAK projesi - Proje No: TBAG2233); araştırmacı, Ocak 2003-Ocak 2005.
3.
Nanomalzemelere
biyomoleküler
dayalı
algılamaya
elektrokimyasal
yönelik
sensörlerin
uygulamaları
tasarımı
(TÜBİTAK
ve
projesi);
araştırmacı, Eylül 2006- halen devam etmektedir.
4. “Biyoelektrokatalitik aktivitenin manyetik alanlar ile kontrolü”-“Control of
bioelectrocatalytic activity by means of magnetic fields” (K. İrlandaİngiltere’de Ulster Üniversitesi NIBEC Enstitüsü’nde Dr. P. Papakonstantinou
–
Ege
Üniversitesi
Eczacılık
Fakültesi’nde
Dr.
A.
Erdem
Gürsan
yürütücülüğünde devam eden Royal Society destekli International Joint
Project); araştırmacı, 2007-halen devam etmektedir.
Yurt dışında katıldığı projeler:
1. 13/09/2003-30/09/2003 tarihleri arasında Çek Cumhuriyeti Biyobilimler
Akademisi Biyofizik Enstitüsü’nde Prof. Dr. Emil PALECEK gözetiminde
“Değişik teknikler kullanılarak yeni elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin
dizaynı” konusunda araştırmalara katıldım.
2. 02/08/2004-26/08/2004, 04/08/2005-25/08/2005 ve 02/08/2006-26/08/2006
tarihleri
arasında
Çek
Cumhuriyeti
Biyobilimler
Akademisi
Biyofizik
Enstitüsü’nde Prof. Dr. Emil PALECEK ve Dr. Frantisek JELEN gözetiminde
“DNA sensörlerinin araştırma ve geliştirilmesinde Protein ve Nükleik Asitlerin
elektrokimyası” konusunda araştırmalara katıldım.
3. K. İrlanda-İngiltere’de Ulster Üniversitesi NIBEC Enstitüsü’nde Dr. P.
Papakonstantinou – Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’nde Dr. A. Erdem
Gürsan yürütücülüğünde devam eden Royal Society destekli International
Joint Project: “Biyoelektrokatalitik aktivitenin manyetik alanlar ile kontrolü”
konulu projedeki araştırmalara katılmak üzere 12/01/2008-31/01/2008
tarihleri arasında, NIBEC Enstitüsü, K. İrlanda-İngiltere’de bulundum.
146
YAYINLAR
1.
HAKAN KARADENIZ, BESTE GULMEZ, FERIT SAHINCI, ARZUM
ERDEM, G. IREM KAYA, NEHIR UNVER, BIJEN KIVCAK, MEHMET
OZSOZ, “Disposable electrochemical biosensor for the detection of the
interaction between DNA and Lycorine based on Guanine and Adenine
signals”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis , 35,
2003,298-302.
2. OZKAN DILSAT, KARA PINAR, KARADENIZ HAKAN, OZKAN ZEYNEP,
ERDEM
ARZUM,
JELEN
FRANTİSEK,
KERMAN
KAGAN,
OZSOZ
MEHMET, “Electrochemical Detection Of Specific DNA Sequences From
PCR Amplicons On Carbon And Mercury Electrodes Using Meldola’s Blue As
An Intercalator”, Turkish Journal of Chemistry, 28, 2004, 523-533.
3.
DILSAT OZKAN, HAKAN KARADENIZ, ARZUM ERDEM, MARCO
MASCINI, MEHMET OZSOZ, ’’Electrochemical genosensor for Mitomycin CDNA interaction based on Guanine signal’’, Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 35, 2004, 905-912.
4. MEHMET OZSOZ, ARZUM ERDEM, KAGAN KERMAN, BURCU MERIC,
DILSAT OZKAN, PINAR KARA, HAKAN KARADENIZ, ‘’Allele-specific
genotyping by using electrochemical Guanine and Gold oxidation signals’’,
Bioelectrochemistry, 67, 2005, 199-203.
5. ARZUM ERDEM, DILSAT OZKAN ARIKSOYSAL, HAKAN KARADENIZ,
PINAR KARA, AYLIN SENGONUL, A. ARZU SAYINER, MEHMET OZSOZ,
“Electrochemical Genomagnetic Assay For The Detection Of Hepatitis B
Virus DNA In Polymerase Chain Amplicons By Using Disposable Sensor
Technolgy”, Electrochemistry Communications, 2005, 7(8), 815-820.
6. DILSAT ARIKSOYSAL, HAKAN KARADENIZ, ARZUM ERDEM, AYLIN
SENGONUL, ARZU SAYINER, MEHMET OZOZ, “Label-free electrochemical
hybridization genosensor for the detection of hepatitis B virus genotype on
the development of Lamivudine resistance”, Analytical Chemistry, 77(15),
2005, 4908-4917.
147
7. HAKAN KARADENIZ, BESTE GULMEZ, ARZUM ERDEM, FRANTISEK
JELEN, EMIL PALECEK, “Echinomycin and cobalt-phenanthroline as redox
indicators of DNA hybridization at gold electrodes”, Frontiers in Bioscience,
11, 2006, 1870-1877.
8.
HAKAN
KARADENIZ,
LEVENT
ALPARSLAN,
ARZUM
ERDEM,
ERCUMENT KARASULU, “Electrochemical investigation of interaction
between mitomycin C and DNA in a novel drug-delivery system”, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 45, 2007, 322-326.
9. ARZUM ERDEM, FILIZ SAYAR, HAKAN KARADENİZ, GULDEM
GUVEN, MEHMET OZSOZ, ERHAN PISKIN, “Development of Streptavidin
Carrying Magnetic Nanoparticles and Their Applications in Electrochemical
Nucleic Acid Sensor Systems”, Electroanalysis 19, 2007, 798 - 804.
10. HAKAN KARADENIZ, ARZUM ERDEM, AYFER CALISKAN, CARLOS
M. PEREIRA, ELISA M. PEREIRA, JOSE A. RIBERIO, “Electrochemical
Sensing of Silver Tag Labelled DNA immobilized onto Disposable Graphite
Electrodes”, Electrochemical Communications, 9, 2007, 2167-2173.
11. BESTE GULMEZ, HAKAN KARADENIZ, ARZUM ERDEM, MEHMET
OZSOZ,
” Procedure 27; Electrochemical detection of calf thymus double-
stranded and single-stranded DNA by using a disposable graphite sensor”,
Comprehensive Analytical Chemistry, Alegret and Merkoçi (Eds),
ELSEVIER, 49, 2007, p. e195-e202.
12. MARIA-JOAO R. P. QUERIOZ, ELISABETE M. S. CASTANHEIRA, M.
SOLANGE D. CARVALHO, ANA S. ABREU, PAULA M. T. FERREIRA,
HAKAN KARADENIZ, ARZUM
compounds
based
on
ERDEM, “New tetracyclic heteroaromatic
dehydroamino
acids:
photophysical
and
electrochemical studies of interaction with DNA”, Tetrahedron 2, 2008, 382391.
148
Bildiriler
1. ARZUM ERDEM, KAGAN KERMAN, BURCU MERIC, DILSAT OZKAN,
MEHMET
OZSOZ,
VOLKAN
ARMAGAN,
SECIL
GUR,
HAKAN
KARADENIZ, ZEYNEP AY, HALE TURKAN, DENIZ YURDAKUL, " Polifenol
Oksidaz İçeren Mantar Dokusunu Enzim Kaynağı Olarak Kullanan
Biyosensör ile Amperometrik Fenol Tayini ve Metal İnhibisyonunun EDTA ile
Eliminasyonu ", E. Ü. Eczacılık Fakültesi 2inci Sınıf Öğrencileri, Biyomed-6 –
6. Uluslar arası Katılımlı Biyomedikal Bilim ve Teknoloji Sempozyumu,
06-08 Ekim 1999, Otel Ege Sağlık, İzmir, posterli bildiri, Bildiri Özetleri
Kitabı, P-47.
2.
Hakan KARADENIZ, Volkan ARMAGAN, Arzum ERDEM, Kagan
KERMAN, Burcu MERIC, Dilsat OZKAN, Mehmet OZSOZ, "Elektrokimyasal
DNA biyosensörleri" , E. Ü. Eczacılık Fakültesi 2inci Sınıf Öğrencileri, 2inci
Ulusal Veterinerlik Hekimlik Öğrenci Kongresi, İstanbul Üniversitesi,
Veteriner Hekimlik Fakültesi, 13-15 Mayıs 2000, İstanbul, sözlü bildiri,
Bildiri Özetleri Kitabı.
3.
PINAR KARA, DILSAT OZKAN, ARZUM ERDEM, KAGAN KERMAN,
SACIDE PEHLIVAN, FERDA OZKINAY, DUYGU UNUVAR, GULCIN ITIRLI,
HAKAN KARADENIZ, MEHMET OZSOZ, “İndikatörsüz elektrokimyasal
genosensör ile akondroplazi G380R mutasyonunun allel özgül genotip tayini,
Proje
Sergisi
02-Ege
Üniversitesi
Bilim–Teknoloji
Uygulama
ve
Araştırma Merkezi(EBİLTEM), 04-15 Kasım 2002, İzmir, proje sergisi.
•
Bu çalışma Proje Sergisi 2002'de Biyolojik Bilimler Dalında birincilik
ödülüne layık görülmüştür.
4.
PINAR KARA, DILSAT OZKAN, ARZUM ERDEM, KAGAN KERMAN,
SACIDE PEHLIVAN, FERDA OZKINAY, DUYGU UNUVAR, GULCIN ITIRLI,
HAKAN KARADENIZ, MEHMET OZSOZ, “İndikatörsüz elektrokimyasal
genosensör ile akondroplazi G380R mutasyonunun allel özgül genotip tayini,
III. Bilimsel Araştırma Forumu, Ege Üniversitesi Tıp fakültesi, Bornovaİzmir, 10-14 Mart 2003.
* Bu çalışma III. Bilimsel Araştırma Forumu’nda Prof. Dr.
Ramazan AKŞİT
görülmüştür.
onuruna verilen Bilimsel Araştırma Ödülüne layık
149
5. HAKAN KARADENİZ, BESTE GÜLMEZ, FERİT ŞAHİNCİ, ARZUM
ERDEM, G. İREM KAYA, NEHİR ÜNVER, BİJEN KIVÇAK, MEHMET
ÖZSÖZ, ‘’ Potansiyel antiviral etkili doğal bileşik Lycorine’in DNA ile
etkileşmesinin elektrokimyasal biyosensörlerle tayini’’, Proje Sergisi 03-Ege
Üniversitesi
Bilim–Teknoloji
Uygulama
ve
Araştırma
Merkezi
(EBİLTEM), 10-21 Kasım 2003, İzmir, proje sergisi.
•
Bu çalışma Proje Sergisi 2003'de Biyolojik Bilimler Dalında
üçüncülük ödülüne layık görülmüştür.
6. MEHMET OZSOZ, ARZUM ERDEM, DİLŞAT ÖZKAN, PINAR KARA,
HAKAN
KARADENİZ,
BURCU
KARAŞAHİN,
‘’Elektrokimyasal
DNA
Biyosensörleri ve Yeni Gelişmeler ‘’, II. Uluslar arası katılımlı Moleküler
Tanı ve Uygulamaları
Sempozyumu, Ege Üniversitesi Eczacılık
Fakültesi, Bornova-İzmir, 10-14 Mayıs 2004.
7. ZEYNEP SOYER, FERIT SAHINCI, HAKAN KARADENIZ, ARZUM
ERDEM, “Electrochemical Determination of Interaction Between DNA and
Imidazole Derivates “I-3 and I-12””, 2nd International Meeting on Medicinal
and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-2, 10-14 Ekim 2004, Antalya.
8. ZEYNEP SOYER, FERIT SAHINCI, HAKAN KARADENIZ, MEHMET
OZSOZ, “The Detection of Some Phthalimide Derivates and DNA Interaction
by Using Electrochemical DNA Biosensor”, 2nd International Meeting on
Medicinal and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-2, 10-14 Ekim 2004,
Antalya.
9. MEHMET OZSOZ, PINAR KARA, AYŞIN ZEYTİNOĞLU, ARZUM
ERDEM,
DİLŞAT
OZKAN,
HAKAN
KARADENİZ,
“Elektrokimyasal
Genosensör Teknolojisi ile Herpes Symplex Tip1 ve Tip2 Virüslerinin
Birbirinden Ayırımı”, Proje Sergisi 04-Ege Üniversitesi Bilim–Teknoloji
Uygulama ve Araştırma Merkezi (EBİLTEM), 01-12 Kasım 2004, İzmir,
proje sergisi.
•
Bu çalışma Proje Sergisi 2004'de Biyolojik Bilimler Dalında birincilik
ödülüne layık görülmüştür.
150
10. MEHMET OZSOZ, ARZUM ERDEM, DİLŞAT OZKAN, PINAR KARA,
HAKAN
KARADENİZ,
“Antikanser
İlaç
Mitomisin
C’nin
DNA
ile
Etkileşmesinin Elektrokimyasal Genosensörlerle Tayini”, Proje Sergisi 04Ege Üniversitesi Bilim–Teknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi
(EBİLTEM), 01-12 Kasım 2004, İzmir, proje sergisi.
•
Bu çalışma Proje Sergisi 2004'de Biyolojik Bilimler Dalında
mansiyon ödülüne layık görülmüştür.
11. VAROL PABUÇCUOĞLU, ARZUM ERDEM, ZEYNEP SOYER, HAKAN
KARADENİZ, “Bazı Ftalimit Türevi Bileşiklerin Sentezi ve Bu Bileşiklerin
DNA ile Olan Etkileşimlerinin Elektrokimyasal Biyosensörlerle İncelenmesi”,
Proje
Sergisi
04-Ege
Üniversitesi
Bilim–Teknoloji
Uygulama
ve
Araştırma Merkezi (EBİLTEM), 01-12 Kasım 2004, İzmir, proje sergisi.
12. HAKAN KARADENİZ, ARZUM ERDEM, MEHMET ÖZSÖZ, “Antikanser
İlaç-
DNA
Etkileşmesinin
Tayininde
Kullanılan
Elektrokimyasal
Genosensörler”, Multidisipliner Kanser Araştırma Sempozyumu, 12-15
Mart 2006, Uludağ, Bursa, sözlü bildiri.
•
Bu sözlü bildiri Multidisipliner Kanser Araştırma Sempozyumu’nda
en başarılı sözlü sunum ödülüne layık görülmüştür.
13. HAKAN KARADENIZ, ARZUM ERDEM FRANTISEK JELEN, MEHMET
OZSOZ,
EMIL
PALECEK,
“Novel
Electrochemical
Redox
Indicator,
Echinomycin for Detection of DNA Hybridization on Gold Surfaces”, 8th
International
Symposium
on
Pharmaceutical
Sciences,
Ankara
Üniversitesi Eczacılık Fakültesi 13-16 Haziran 2006, Ankara, sözlü
bildiri.
14. ARZUM ERDEM, HAKAN KARADENIZ, F. SAYAR, G. GÜVEN,
MEHMET OZSOZ, ERHAN PISKIN, “Electrochemical Biosensor Technology
Combined with Magnetic Particles”, 8th International Symposium on
Pharmaceutical Sciences, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi 13-16
Haziran 2006, Ankara, posterli bildiri.
15.
HAKAN
KARADENİZ,
ARZUM
ERDEM,
MEHMET
OZSOZ,
“Development of Disposable Genosensor Used for Electrochemical Detection
of DNA and Drug-DNA Interactions”, 8th International Symposium on
Pharmaceutical Sciences, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi 13-16
Haziran 2006, Ankara, posterli bildiri.
151
16. HAKAN KARADENiZ, BESTE GULMEZ, ARZUM ERDEM, FRANTISEK
JELEN, MEHMET OZSOZ, EMIL PALECEK “Antitümör Aktiviteye Sahip
Antibiyotik, Echinomisin’in Elektrokimyasal Genosensör Tasarımında kullanımı”
7. Elektrokimya Günleri, Hacettepe Üniversitesi, Kimya Bölümü, 28-30
Haziran 2006, Ankara, sözlü bildiri.
17. S. NUR TOPKAYA, SİNEM BALTACI, AYFER ÇALIŞKAN, SEMA
GÜMÜŞÇÜ, HAKAN KARADENİZ, ARZUM ERDEM, MEHMET ÖZSÖZ,
“İlaç-DNA Etkileşmelerinin Elektrokimyasal Algılanmasına Yönelik Tek
Kullanımlık Sensörlerin Geliştirilmesi ve Uygulamaları”, 13. Ulusal Biyoloji
Öğrenci Kongresi, Ege Üniversitesi, 20-23 Eylül 2006, İzmir, posterli
bildiri.
18. LEVENT ALPARSLAN, HAKAN KARADENİZ, ARZUM ERDEM, ERCÜMENT
KARASULU, “Preparation of Mitomycin C Loaded Microemulsion and
Detection of Interaction Between Mitomycin C and DNA by Using
Electrochemical Genosensor”,13. Uluslar arası Farmasötik Teknoloji
Sempozyumu, 10-13 Eylül 2006, Antalya posterli bildiri.
19.
ARZUM
ERDEM,
HAKAN
KARADENİZ,
AYFER
ÇALIŞKAN,
“Genosensor Technology Combined with Nanomaterials for Monitoring of
Drug-DNA Interactions and DNA Hybridization“, ESF-EMBO Biological
Surfaces and Interfaces Symposium, 01-06 Temmuz 2007, Barcelona,
posterli bildiri.
20.
ARZUM
ERDEM,
HAKAN
KARADENİZ,
AYFER
ÇALIŞKAN,
“Nanomalzemelere Dayalı Elektrokimyasal DNA Biyosensör Teknolojisi“,
Proje Pazarı 2007, Ege Üniversitesi Bilim–Teknoloji Uygulama ve
Araştırma Merkezi (EBİLTEM), İzmir, posterli bildiri.
21.
ARZUM
ERDEM,
HAKAN
KARADENİZ,
AYFER
ÇALIŞKAN,
“Electrochemical Monitoring of DNA Interactions by Genosensors Combined
with Nanoparticles“, International Symposium on Nanotechnology in
Environmental Protection and Pollution, 11-13 Aralık 2007, Florida,
Amerika Birleşik Devletleri, posterli bildiri.
22.
HAKAN
KARADENİZ,
AYFER
ÇALIŞKAN,
ARZUM
ERDEM,
“Electrochemical Monitoring of Metal Nanoparticle Labeled DNA and DNA
Hybridization by Disposable Sensor Technology”, NanoTRIV, 09-13 Haziran
2008, İstanbul Teknik Üniversitesi, İstanbul, sözlü bildiri.
152
Katıldığı toplantılar ve kurslar
1. FEBS (Federation of European Biochemistry Societies) tarafından
desteklenen ‘’The Design and Building of Quartz Crystal Microbalance(QCM)
Biosensors’’ adlı ‘’İleri Pratik Kurs’’, Hacettepe Üniversitesi Kimya
Mühendisliği Bölümü, Beytepe-Ankara, 20-27 Haziran 2004.
2. FEBS (Federation of European Biochemistry Societies) tarafından
desteklenen “Biology Meets Chemistry” adlı kongre, Sepetses Adası, Atina,
Temmuz 2005.
3. Türk Eczacılar Birliği Eczacılık Akademisi tarafından desteklenen
“Genobilim Çalıştayı”, Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Bölümü, Kasım
2005.
4. FEBS (Federation of European Biochemistry Societies) tarafından
desteklenen “Microarray and Genosensor Techniques in Biomedical
Applications” adlı pratik kurs, Prag, Çek Cumhuriyeti, 22-30 Eylül 2006.
5. ESF-EMBO (European Science Foundation-European Molecular Biology
Organization) tarafından desteklenen “Biological Surfaces and Interfaces“
adlı sempozyum, Costa Brava, Barselona, İspanya, 01-06 Temmuz 2007.
6. FEBS (Federation of European Biochemistry Societies) tarafından
desteklenen ‘’QCM, SPR/Elipsometer, AFM as Novel Biosensors and
Imaging Systems’’ adlı ‘’Pratik Kurs’’, Hacettepe Üniversitesi Kimya
Mühendisliği Bölümü, Beytepe-Ankara, 22-29 Haziran 2008.
Düzenlediği toplantılar
1. II. Uluslar arası katılımlı Moleküler Tanı ve Uygulamaları Sempozyumu,
Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Bornova-İzmir, 10-14 Mayıs 2004.
Organizasyon Komitesi: Prof. Dr. Erçin Erciyas, Prof. Dr. Mehmet Şengün
Özsöz, Doç. Dr. K. Arzum Erdem, Arş. Gör. Dilşat Özkan, Arş. Gör. Pınar
Kara, Arş. Gör. Hakan Karadeniz, Arş. Gör. Burcu Karaşahin.