ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK
advertisement
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Mehmet Tahir HÜSUNET Delphinidin chloride BİLEŞİĞİNİN ANTİGENOTOKSİK ETKİLERİ IN VITRO BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2015 GENOTOKSİK VE ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Delphinidin chloride BİLEŞİĞİNİN IN VITRO GENOTOKSİK VE ANTİGENOTOKSİK ETKİLERİ Mehmet Tahir HÜSUNET YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 25/12/2015 Tarihinde Aşağıdaki Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir. …….............................. Jüri Üyeleri Tarafından ……...................................... ………….............…………. Prof. Dr. Hasan Basri İLA Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Doç. Dr. Ahmet KAYRALDIZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof.Dr. Mustafa GÖK Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FLY-2014-2688 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir. ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ Delphinidin chloride BİLEŞİĞİNİN IN VITRO GENOTOKSİK VE ANTİGENOTOKSİK ETKİLERİ Mehmet Tahir HÜSUNET ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Hasan Basri İLA Yıl: 2015, Sayfa: 87 Jüri : Prof. Dr. Hasan Basri İLA : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ : Doç. Dr. Ahmet KAYRALDIZ Bu çalışmanın amacı, birçok bitkideki antosiyanidin bileşeni olan delphinidin chloride’in insan periferal lenfositlerinde in vitro genotoksik/antigenotoksik ve sitotoksik etkilerini araştırmaktır. Çalışmada delphinidin chloride’in 25, 50, 75 ve 100 μM’lık konsantrasyonları 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde denenmiştir. Ayrıca test maddesine ilaveten bilinen bir klastojenik ajan (MMC) kullanılarak olası antigenotoksik potansiyel saptanmaya çalışılmıştır. Delphinidin chloride’in genotoksik/antigenotoksik etkisi, kromozom anormalliği (KA) ve mikronükleus (MN) testleriyle, sitotoksik etkisi de mitotik indeks (MI) ve nükleer bölünme indeksinin (NBI) saptanmasıyla belirlenmiştir. Ayrıca total oksidan ve total antioksidan seviyeleri spektrofotometrik yöntemle saptanmıştır. Çalışmamızda tek başına delphinidin chloride, sağlıklı insan periferal lenfositlerinde hiç bir konsantrasyon ve sürede kromozom aberasyonu ve MN oluşumunu önemli düzeyde etkilememiştir. Öte yandan delphinidin chloride MMC’nin neden olduğu KA bulgularını 24 saatlik muamelede önemli şekilde baskılamıştır. Test maddesi mitotik indeks ve nükleus bölünme indekslerini bütün konsantrasyon ve sürelerde (24 ve 48 saat) hiçbir şekilde etkilemediği ortaya çıkmıştır. Delphinidin chloride bütün konsantrasyon ve sürelerde (24 ve 48 saat) toplam oksidan seviyesini (TOS) sadece en yüksek konsantrasyonda artırmış. Toplam antioksidan seviyesini (TAS) ise bütün konsantrasyon ve sürelerde (24 ve 48 saat) en düşük konsantrasyon hariç bütün varyantlarda önemli düzeyde yükseltmiştir. Sonuç olarak test maddesi özellikle 24 saatlik uygulamalarda oksidatif stresi anlamlı şekilde azaltmıştır. Anahtar Kelimeler: Delphinidin chloride, Genotoksisite, Antigenotoksisite, Kromozom Anormalliği, Mikronukleus I ABSTRACT Msc THESIS IN VITRO GENOTOXIC AND ANTIGENOTOXIC EFFECTS OF Delphinidin chloride COMPOUND Mehmet Tahir HÜSUNET DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor Jury : Prof. Dr. Hasan Basri İLA Year: 2015, Pages: 87 : Prof. Dr. Hasan Basri İLA : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ : Assoc. Prof. Dr. Ahmet KAYRALDIZ The aim of this study was to investigate in vitro genotoxic and antigenotoxic effect of Delphinidin Cloride which is main compound of colour pigment of various plants in human peripheral blood lymphocytes. In the study, 25, 50, 75 and 100 μM concentrations of Delphinidin Cloride were tested for 24 or 48 hours treatment periods. Furthermore a known clastogenic agent (MMC) were used to detect possible antigenotoxic potential in addition to test substance. Genotoxic and antigenotoxic effect of Delphinidin Cloride was determined with chromosome aberration (CA) and micronucleus tests and cytotoxic effect of Delphinidin Cloride was determined with mitotic index (MI) and nuclear division index (NDI). Also, total oxidant and antioxidant values were determined by spectrophotometric method. In our study, Delphinidin Cloride with alone did not affect CA and MN formation in human peripheral blood lymphocytes both all concentrations and treatment periods. On the other hand Delphinidin Chloride significantly decreased CA findings in 24 hours treatment caused by MMC. Test substance did not affect mitotic index (MI) and nuclear division index (NDI) both all concentrations and treatment periods. Delphinidin Chloride increased total oxidant capacity only the highest concentration for 24 and 48 hours treatment period. Total antioxidant capacity increased significantly both all concentrations and treatment periods except the lowest concentration. As a result, test substance significant changes in oxidative stress index especially for 24 hours period treatment. Keywords: Delphinidin chloride, Genotoxicity, Antigenotoxicity, Chromosome Aberration, Micronucleus II TEŞEKKÜR Hem tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve tamamlanması sürecinde bana rehberlik eden, ilgi ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen hem de hayata dair tecrübelerini benimle paylaşarak ufkumu genişleten sayın danışman hocam Prof. Dr. Hasan Basri İLA’ya en samimi duygularla teşekkür ederim. Yardımlarından dolayı Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ’a, laboratuvar çalışmalarım esnasında yardımlarını esirgemeyen Uzman Biyolog Taygun TİMOÇİN’e, Uzman Biyolog Rima ÇELİK’e, Uzman Biyolog Tuba DÖRDÜ’ye, Uzman Biyolog Esra ÖZDEMİR ve Uzman Biyolog Mostafa NOORİZADEH TAZEKAND’a çok teşekkür ederim. Çalışmalarım süresince kendi laboratuvarı imkânlarını sunan sayın Prof. Dr. Sadık DİNÇER’e ve yardımcı asistanı Esra YİĞİTTEKİN’e, projemi destekleyen Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ile Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü yöneticilerine çok teşekkür ederim. Ayrıca tezimi 2210 C Öncelikli Alanlar kapsamında değerlendirip burs desteği sağlayan TÜBİTAK- BİDEB’e teşekkür ederim. Hem tez sürecinde hem de hayatımın her anında maddi ve manevi yardımlarını esirgemeyen benim için çok değerli olan başta annem ve babam olmak üzere ailemin her bir ferdine en içten teşekkürlerimi sunarım. III İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ ................................................................................................................................. I ABSTRACT ................................................................................................................. II TEŞEKKÜR ............................................................................................................... III İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... IV ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ..................................................................................................... X SİMGELER VE KISALTMALAR ........................................................................... XII 1. GİRİŞ ....................................................................................................................... 1 1.1. Gıda Güvenliği ve Gıda Katkı Maddelerinin Tarihçesi ................................... 2 1.2. Gıda Katkı Maddesi.......................................................................................... 3 1.2.1. Antosiyaninler (E 163) ........................................................................... 4 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR...................................................................................... 11 2.1. Polifenoller ..................................................................................................... 11 2.1.1. Flavonoidler ......................................................................................... 13 2.1.1.1. Antosiyaninler ........................................................................... 14 2.1.1.2. Antosiyanidinler ........................................................................ 16 2.1.1.2.(1). Belli Başlı Antosiyanidinler ..................................... 17 2.1.1.2.(1).a Aurantinidin ................................................. 17 2.1.1.2.(1).b Capensinidin ................................................ 17 2.1.1.2.(1).c Cyanidin ....................................................... 17 2.1.1.2.(1).d Delphinidin .................................................. 19 2.1.1.2.(1).e Europinidin .................................................. 23 2.1.1.2.(1).f Hirsutidin...................................................... 23 2.1.1.2.(1).g Malvidin....................................................... 23 2.1.1.2.(1).ğ Pelargonidin ................................................. 24 2.1.1.2.(1).h Peonidin ....................................................... 25 2.1.1.2.(1).ı Petunidin ....................................................... 26 2.1.1.2.(1).i Pulchellidin ................................................... 26 2.1.1.2.(1).j Rosinidin....................................................... 26 IV 3. MATERYAL VE METOD .................................................................................... 27 3.1. Materyal.......................................................................................................... 27 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ............................................................ 27 3.1.1.1. Delphinidin Chloride (Test Maddesi) ..................................... 27 3.1.1.2. Entellan (Merck No: 7961) ..................................................... 28 3.1.1.3. Etil Alkol (Sigma No: 32205) ................................................. 29 3.1.1.4. Fiksatif .................................................................................... 29 3.1.1.5. Giemsa (Merck No: 9204)....................................................... 29 3.1.1.6. Hipotonik Eriyik...................................................................... 30 3.1.1.7. Kolşisin (Sigma No: C9754) ................................................... 30 3.1.1.8. Kromozom Medyumu (PB-Max No: 12552-013) ................... 30 3.1.1.9. Mitomisin C (MMC) (Sigma No: Y0000378) ........................ 31 3.1.1.10. Nitrik Asit (HNO3 Sigma 438073) ......................................... 31 3.1.1.11. Sitokalasin B (Sigma).............................................................. 32 3.1.1.12. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) .................................... 32 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları ............................................................. 33 3.1.2.1. Benmari (Su Banyosu) .............................................................. 33 3.1.2.2. Flow Kabin (Steril Kabin) ......................................................... 33 3.1.2.3. Hassas Terazi............................................................................. 33 3.1.2.4. İnkübatör ................................................................................... 33 3.1.2.5. Manyetik Karıştırıcılı Isıtıcı ...................................................... 34 3.1.2.6. Mikroskop ................................................................................. 34 3.1.2.7. Otoklav ...................................................................................... 34 3.1.2.8. pH Metre ................................................................................... 34 3.1.2.9. Santrifüj ..................................................................................... 34 3.1.2.9. Vorteks ...................................................................................... 35 3.1.3. Lamların Temizlenmesi........................................................................ 35 3.1.4. Sterilizasyon ......................................................................................... 35 3.2. Metod.............................................................................................................. 35 V 3.2.1. Kromozom Anormalliklerinin (KA) Saptanması Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İnceleme .......................................................................... 35 3.2.1.1. Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması ... 36 3.2.2. Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması ............................................................................................ 38 3.2.2.1. Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması .......... 37 3.2.2.2. Mitotik İndeksin (MI) Saptanması ............................................ 38 3.2.3. Mikronukleus (MN) Oluşumunu Belirlemek Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler ...................................................................... 39 3.2.3.1. Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması Aşaması ..................................................................................... 39 3.2.3.2. Preparatların Boyanması ........................................................... 40 3.2.3.3. Mikroskobik İnceleme............................................................... 41 3.2.4. Toplam Oksidan (TOS) ve Antioksidan Seviyesi (TAS) Ölçümü ....... 43 3.2.5. Mikroskopta Fotoğraf Çekme .............................................................. 43 3.2.6. İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi ........................... 44 4. BULGULAR VE TARTIŞMA ............................................................................. 45 4.1. Bulgular ........................................................................................................... 45 4.1.1. Delphinidin Chloride’in Kromozom Aberasyonu (KA) Oluşumu Üzerine Etkisi ....................................................................................... 45 4.1.2. Delphinidin Chlorid’in Mikronukleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkileri .................................................................................................. 51 4.1.3. Delpinidin Chlorid’in Oksidatif Stres Oluşumu Üzerine Etkileri ........ 54 4.1.4. Delphinidin Chloride’in Hücre Bölünmesi Üzerindeki Etkileri........... 57 4.2. Tartışma .......................................................................................................... 58 4.2.1. Delphinidin Chloride’in Genotoksik/Antigenotoksik ve Antioksidan Etkisi ..................................................................................................... 58 4.2.2. Delphinidin Chloride’in Hücre Bölünmesi Üzerine Etkileri ................ 59 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER .............................................................................. 63 VI KAYNAKLAR .......................................................................................................... 65 ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................... 89 VII ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. Seçilmiş antosiyanidinler ve moleküler yapıları (IUPAC 1997) ............ 17 Çizelge 4.1. Farklı Konsantrasyonda Delphinidin Chlorid ile 24 veya 48 Saat Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri Anormal Hücre Yüzdesi ve KA/Hücre Oranı ....... 50 Çizelge 4.2. Farklı Konsantrasyonlarda Delphinidin Chlorid ile 24 veya 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Mikronukleuslu Binukleer Hücre* ‰’si , Nükleer Bölünme İndeksi (NBI) ve Mitotik İndeks (MI) ................................................................................ 52 Çizelge 4.3. Delphinidin Chlorid’in İnsan Periferal Lenfosit Kültüründe Oluşturduğu Toplam Oksidan Seviye (TOS), Toplam Antioksidan Seviye (TAS) ve Oksidatif Stres İndeksi (OSI) ...................................... 56 VIII IX ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Delphinidine moleküler formülü ...............................................................28 Şekil 3.2. Kolşisin’in açık formulü ............................................................................30 Şekil 3.3. Mitomycin C’nin açık formülü ..................................................................31 Şekil 3.4. Sitokalasin B’nin açık formülü ..................................................................32 Şekil 3.5. Bir (a) ve iki (b) nükleus içeren hücreler (x400). ......................................42 Şekil 3.6. Üç (a) ve dört (b) nükleus içeren hücreler (x400)......................................42 Şekil 4.1. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi kırıklar (x1000) (100 µM, 48saat, ♂)...................................................................................................45 Şekil 4.2. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi kırık (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) ...............................................................................................................46 Şekil 4.3. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) ..............................................................................................................46 Şekil 4.4. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) ..............................................................................................................47 Şekil 4.5. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) ..............................................................................................................47 Şekil 4.6. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi fragment (x1000) (100 µM, 48saat, ♂)...................................................................................................48 Şekil 4.7. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile 24 saat muamele edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde ortaya çıkan anormal hücre bulguları ...........49 Şekil 4.8. Pozitif kontrol MMC ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronukleus oluşumu (x1000) (0,25 µL/mL, 48saat, ♂) .............................................................................................................53 X Şekil 4.9. Pozitif kontrol MMC ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronukleus oluşumu (x1000) (0,25 µL/mL, 48saat, ♀) .............................................................................................................53 Şekil 4.10. Delphinidin chloride ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde ortaya çıkan oksidatif stres indeksi (OSI) bulguları .........................................................................................57 XI SİMGELER VE KISALTMALAR ♂ : Erkek cinsiyet ♀ : Dişi cinsiyet °C : Santigrat derece µg : Mikrogram µg/mL : Mikrogram/mililitre μg/μL : Mikrogram/mikrolitre µM : Mikromolar ark. : Arkadaşları atm : Atmosfer BrdUrd : 5'-Bromo-2'-deoxyuridine CE : Chromatid Exchange cm : Santimetre ÇK : Çözücü kontrol dk. : Dakika DNA : Deoksiribonükleik asit EGFR : Epidermal büyüme faktörü reseptörlerinin FAO : Gıda ve Tarım Örgütü FDA : Food and Drug Administration (Gıda ve İlaç Dairesi) g : Gram HPLC : Human Promyelocytic Leukemia Cells (İnsan Promiyelositik Lösemi Hücreleri) HTC 116 : Cell line human colon carcinoma (insan kolon karsinom hücre hattı) IPCS : The International Programme on Chemical Safety (Uluslararası Kimyasal Güvenlik Programı) HNO3 : Nitrik asit KA : Kromozom aberasyonu KCl : Potasyum klorür KCl : Potasyum klorür KOH : Potasyum Hidroksit XII M.Ö. : Milattan Önce M.S. : Milattan Sonra mg/kg : Miligram/kilogram MgCl2 : Magnezyum klorür MI : Mitotik indeks mL : Mililitre MMP : Matrix metalloproteinases (matris metalloproteinaz) NaCl : Sodyum klorür NBI : Nukleus Bölünme İndeksi ng/μL : Nanogram/mikrolitre nm : Nanometre nM : Nanomolar NSCLC : Non–small cell lung cancer (küçük olmayan akciğer kanseri hücreleri) OIE : Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü OSI : Oksidatif stres indeksi pH : Power of Hydrogen (Hidrojenin Gücü) PK : Pozitif Kontrol RNA : Ribonukleik asit RNT : Reaktif nitrojen türleri ROT : Reaktif oksijen türleri rpm : Revolutions per minute (Dakikadaki devir sayısı) STAT1 : Signal transducers and activators of transcription (Sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörler) TAS : Total antioksidan seviyesi TNFα : Tümör nekroz faktörü alfa TOS :Total oksidan seviyesi UV : Ultraviyole VEGF : Vascular endothelial growth factor (Vasküler endotelyal büyüme faktör) WHO : World Health Organisation (Dünya Sağlık Örgütü) XIII 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET 1. GİRİŞ Doğa, ihtiyaç duyduğumuz tüm ham maddelerin kaynağıdır. Eski zamanlarda ilaçların çoğu, ekonomik değeri olan ve az miktarda yan etkiye sahip doğal kaynaklardan elde edilmiştir (Patel ve ark., 2013). Dönüp geriye baktığımızda bu durumu masalsı anlatılar ve insanüstü güçlerin tasvirinde de görmekteyiz. Mitolojide bitkiler, tanrıların insana verdiği en değerli armağan olarak ele alınmıştır. Buna göre bütün bitkiler insanın hizmetindedir ve insanın varoluşundan itibaren bitkilerle olan ilişkisi başlamıştır (Özdemir, 2015) İnsanlar yazılı tarih öncesinde bitkileri yiyecek olarak ve tedavi amacıyla kullanmıştır. Zaman içerisinde deneme yanılma yolu ile bazı bitkilerin hastalıkları iyileştirmede yardımcı olduğunu, bazılarının da zehirlenmeye ve hatta ölüme neden olduğunu keşfetmiştir (Cömert ve Dinç, 2014). Dünyada sayısı 750.000 – 1.000.000 arasında olduğu tahmin edilen bitki türünün 500.000 kadarı tanımlanıp isimlendirilmiştir. Her yıl 2000 civarında yeni tohumlu bitki türü tanımlanmaktadır. Yurdumuzda bulunan bitki türü sayısının 10.000’e yakın olduğu bilinmektedir (Kaya, 2010). Bu rakam, ülkemizin bitki çeşitliliği açısından ne derece zengin olduğunu açıkça göstermektedir (Özatkan, 2009). Dünya Sağlık Örgütü raporuna göre, dünya üzerinde tıbbi amaçlarla kullanılan yaklaşık 70.000 bitkinin 21.000 kadarı ilaç sanayinde kullanılmaktadır. Ülkemizde çoğu doğal yetişen türlerin sadece 1.000 kadarı tıbbi amaçla kullanılmaktadır. Farmakope 1ye kayıtlı bitki sayısı ise 200’den fazladır (Kaya, 2010). Bitkilerden en çok gıda ve tedavi edici olarak yararlanılmakla beraber; yakıt, yapı malzemesi, süs eşyası yapımı, boyar madde ve birtakım inançsal amaçlarla da kullanımları bulunmaktadır. Gıda amaçlı kullanılan bitkilerin belirlenebileceği ve bilgi toplaması için en uygun dönem ilkbahar ve kış aylarıdır. Yaz ve sonbahar mevsimleri ise; bitki toplama, presleme, tohum örnekleri alınması için uygundur. Ayrıca bu dönem; ekin biçimi, harman ve sonrası işlemleri izlemek, kışlık yakacak İlaç üretiminde kullanılan etkin ve yardımcı maddelerin nitel ve nicel çözümleme yöntemlerinin yer aldığı yasal ve bilimsel olarak uyulması gereken ulusal ve uluslararası kuralları ve yöntemleri içeren resmî kitap (http://www.tdk.gov.tr/index.php?option=com_gts&kelime=FARMAKOPE). 1 1 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET ve kış aylarında kullanılmak üzere hayvan yemi olan bitkileri toplamak gibi değişik etkinliklerin sürdürüldüğü bir dönem olarak da önemlidir (Cömert ve Dinç, 2014). Bitkilerin kullanım alanları içerisinde, insan ve hayvanların besinsel ihtiyaçların karşılanması alanının en yoğun alan olduğunu söyleyebiliriz. Ayrıca geçmişte ve günümüzde çeşitli amaçlarla endüstriyel işlemlerden geçirilen bazı hayvansal gıdalarda da bitki kökenli takviyelerin kullanılması zaruri bir hal almıştır. Gıda güvenliğinin temin edilmesi açısından bitkisel katkıların önemi yadsınamaz bir gerçektir. Bu fiili durumun daha iyi anlaşılması açısından konuyla ilgili kısa detayların verilmesi gıda güvenliğinin önemini daha anlaşılır hale getirecektir. 1.1. Gıda Güvenliği ve Gıda Katkı Maddelerinin Tarihçesi Gıda güvenliği tarihi insanlık tarihi kadar eskidir. Gıda güvenliğinin, milattan önce (MÖ) 8.000’den itibaren ilk olarak bazı hayvan türlerinin evcilleştirilmesiyle başladığı düşünülmektedir. MÖ 3.000-900 yıllarında et ürünleri tuzlanmış, odun tütsüsüne tutularak kurutulmuş peynir, balmumu ile sıvanarak uzun süre korunmuştur. Hayvancılıkta ileri olan Babil ve Sümerler tarafından süt, dar boğazlı kaplarda güvenli şekilde saklanmıştır (MÖ 3.000). Mısırlılar MÖ 1.500 yıllarında ilk defa yiyeceklerinde renklendirici kullanmışlardır. Musa peygamber kasaplık hayvanların etleriyle ilgili sağlık koruma kuralları koymuştur. Roma imparatorluğu, gıda güvenliğini sağlamak için sağlık kontrolünü yapacak polis teşkilatı kurmuştur (MÖ 400). Hun’lar da etin uzun süre dayanması için; sucuk, pastırma ve kavurma yapılarak saklanabileceğini bulmuşlardır. (MÖ 220). Kızılderililer eti dondurarak saklamışlardır. MÖ 50 yıllarında, tuz, odun tütsüsü ve özellikle baharatın lezzet verici olarak kullanımı artmıştır. Milattan sonra (MS) 772 yılında; Türkler eti kavurarak, sütü kurutarak saklamışlardır (Dede Korkut Destanında geçmektedir). Etlerin kesim ve pazarlanmasında yapılan resmi kontrollerin Avrupa’da yaygınlaşması 1580 yıllarına denk gelir. Fransa’da balıkların bayatlığını gizlemek amacıyla, gıda boyaları kullanımı 1662 yılında yasaklanmıştır. Aniline purple (anilin moru) bileşiğinin yapay boya maddesi olarak kullanımına 1856 yılında başlanmıştır. Amerika ve İspanya savaşında, savaştaki askerlerinin gıda güvenliği için “Besin 2 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET Kontrolü dalında lisansüstü eğitim yapmış Veteriner Hekimlerin olması” gereği konusunda anlaşmaya varılmıştır (1889). Türkiye Cumhuriyetinde ilk modern mezbaha Karaağaç’ta (Kocaeli) kurulmuştur (12 Temmuz 1923). Sağlık Bakanlığınca “Belediye Kanunu çıkarılmıştır”. Buna göre nüfusu 10.000 üzeri belediyelerin Sağlık Bakanlığı sorumluluğunda gıda kontrolü yapabilecekleri hususu yürürlüğe girmiştir (1930). “Türk Standartları Enstitüsü” kurulmuş ve bu birime gıda maddeleri standartları hazırlama ve yayınlama yetkisi de verilmiştir (22 Kasım 1960). Son yıllardaki küreselleşmeye bağlı oluşabilecek sağlık sorunlarının önüne geçebilmek için FAO (Gıda ve Tarım Örgütü), WHO (Dünya Sağlık Örgütü), OIE (Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü) ve WTO (Dünya Ticaret Örgütü) gibi kuruluşlar harekete geçmiştir. Bu kuruluşlar kendilerine bağlı üniversite, sanayi kuruluşları ve diğer kurumlarla işbirliği yaparak bünyelerindeki bilimsel komiteler tarafından yapılan çalışmalar ve hazırlanan raporlar sonucunda aldığı kararları, ülkeler arası uyulması gereken kurallar haline getirmekte ve aynı zamanda gıda güvenliğinin temelini oluşturmaktadır (Serpen, 2007; Binokay ve Boğa, 2010). 1.2. Gıda Katkı Maddesi Halk Sağlığı Anabilim Dalının yaptığı tanıma göre gıda katkı maddeleri “Tek başına gıda olarak kullanılmayan ve gıdanın tipik bir bileşeni olmayan besleyici değeri olsun veya olmasın, imalat, işleme, hazırlama, uygulama, paketleme, ambalajlama, taşıma, muhafaza ve depo aşamalarında, gıdalara teknolojik amaçla katılan ya da bu gıdaların içinde veya yan ürünlerinde doğrudan veya dolaylı olarak bir bileşeni haline gelen veya bunların karakteristiklerini değiştiren maddeler” olarak tanımlanmaktadır (MERMER, 2006). Bu gün ise durum oldukça farklıdır. Bilim ve teknoloji ile gelen her yenilik beraberinde biraz daha fazla risk taşımaktadır. Gıda sektörüne yeni ve üstün teknolojilerin kazandırdığı değişik üretim teknikleri, buna göre ürünlerin çeşitlenmesi, tüketici beğenisinin değişmesi ve bilinçlenmesi, mevsimlik gıdaların yılın her döneminde tüketilme eğilimlerinin artması, ürünlerde raf ömrünün 3 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET uzatılması kalitede standardizasyon zorunluluğu, daralan gıda kaynaklarının rasyonel kullanımı gibi hususlar, gıda endüstrisinde kullanılan tekniklerin yanı sıra gıda katkı maddelerinin kullanımını zorunlu hale getirmiştir (Erdoğan, 2007). Bu nedenle gıda sektöründe kullanılan gıda boyalarının da dâhil olduğu katkı maddelerine her geçen gün yenileri eklenmektedir. Yukarıda bahsedilen sebeplerden dolayı Türk Gıda Kodeksi Gıda Katkı Maddeleri Yönetmeliği (Resmi Gazete, 30 Haziran 2013 Pazar, Sayı: 28693) ile endüstriyel işleme tabi tutulmuş ürünlerde kullanılacak gıda katkı maddeleri standartlarının son halini vermiştir. Bu yönetmeliğe göre her bir gıda katkı maddesi için Avrupa Birliği tarafından onaylanarak belirlenen kod (E kodu) numarasına göre farklı gruplar oluşturulmuştur. Gıda katkı maddeleri içerisinde önemli bir yer tutan renk maddeleri işlenmiş gıdalarda işleme süreci esnasında kaybedilen rengin geliştirilmesi amacıyla tercih edilmektedir. Gıda renk pigmentleri içerisinde yer alan antsiyan(in)ler bu amaçla kullanılan en önemli grubu teşkil etmektedir. 1.2.1. Antosiyaninler (E 163) Yunanca da Anthos = çiçek ve kyanos mavi anlamına gelen kelimelerden türemiş olan antosiyaninler rengi pH ile değişen kırmızı, mor ya da mavi renkte gözüken ve suda çözünen vakuolde bulunan pigmentlerden ibarettir. Fenilpropanoid yolağı ile sentezlenen ve flavonoid olarak adlandırılan bir ana gruba aittirler. Antosiyaninler neredeyse tatsız, kokusuz ve hafif buruk bir his veren tada sahiptirler. Antosiyaninler daha çok yaprak, sap, kök, çiçek ve meyve de dâhil olmak üzere yüksek bitkilerin bütün dokularında meydana gelebilir. Antosiyaninlerin şekersiz muadilleri ise antosiyanidinler olarak adlandırılırlar (Andersen, 2001). Antosiyaninler E163 koduyla bilinen yaygın bitki pigmentleridir turşu ve zeytin hariç korunmuş sebze ve kırmızı meyvelerde, meyve aromalı kahvaltılık tahıllarda, kırmızı damarlı peynirde, balık ezmesi ve kabuklu ezmesinde, ön pişirme yapılmış kabuklularda, tütsülenmiş balık gibi gıdalarda uygun konsantrasyonlarda güvenle kullanılabileceği belirtilmiştir (30 Haz. 2013 tarih ve 28693 sayılı resmi gazete genelge eki). Daha önce tanımlanmış bazı antosiyaninlerin adı, kodu ve sahip 4 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET olduğu renkler aşağıda listelenmiştir. Cyanidin (E163a) kırmızı renkli pigment Delhinidin (E163b) mavi renkli pigment Malvidin (E163c) pembe renkli pigment Pelargonidin (E163d) turuncu renkli pigment Peonidin (E163e) kırmızı-kahverengi renkli pigment Petunidin (E163f) koyu kırmızı renkli pigment Üzüm kabuğu özütü (E163(i)) Antosiyan karışımı (E163(ii)) Frenk üzümü özütü (E163(iii)) Yukarıda belirtildiği gibi bazı işlenmiş gıdalarda doğal renk verici olarak kullanılan bu pigmentler gıdanın rengini; işleme, depolama, paketleme ve dağıtımdan etkilenerek, görsel kabul edilebilirliğinin zarar görmesi durumunda gıdanın orijinal görünümünü geri kazandırması, gıdayı görsel olarak daha cazip hale getirmesi ve renksiz gıdaya renk vermesi amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır. Dolayısıyla antosiyaninler canlı renklerinden ötürü gıda endüstrisinde doğal boyalar olarak kullanılmaktadır (Azevedo ve ark., 2007; Ichiyanagi ve ark., 2008). Bunlar doğal olarak meyveler, sebzeler ve bitki türevli çay ve şarap gibi içeceklerde görülmekte olup aynı zamanda sağlık için faydalı olduğu bilinmektedir. Antosiyanidinler son on yılda sağlığa faydalı yönleri ve farklı farmakolojik aktiviteleri nedeniyle bilim insanlarının dikkatini çekmiştir (Dimitrovi ve Jakovac, 2010). Antosiyanidinler esas olarak delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin ve malvidinden oluşur ve bitkilerdeki antosiyanin çoğu aglikonları temsil eder (Hou ve ark., 2004). Bu çalışmada test maddesi olarak seçilen delfinidin (E163b) (2-(3, 4, 5trihydroxyphenyl) chromenylium-3,5, 7-triol) bir difenilpropan tabanlı polifenolik halka yapısında olup meyve ve çiçeklerin epidermal doku katmanlarının içinde mevcuttur. Yukarıdaki listede de görüldüğü gibi delphinidin, temel bitki pigmenti olan antosiyanin grubuna dâhil olup aynı zamanda bir antioksidandır (Afaq ve ark., 2007). Delfinidin, Viola tricolor (hercai menekşe) ve Delphinium (hezaren çiçeği, saray çiçeği) cinsi bitkilerin çiçeklerinde mavi tonları veren bir pigmenttir. Aynı zamanda Cabernet Sauvignon şarabının üretildiği kokulu üzümde mavi-kırmızı 5 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET rengini verir (Ribéreau-Gayon ve Ribéreau-Gayon, 1958) Delfinidin, neredeyse tüm diğer antosiyaninler gibi, pH duyarlı olup asidik çözelti içinde kırmızı, bazik çözelti içinde ise mavi renge dönüşür. Delfinidinden türetilen birçok glikozit bilinmektedir. Bunlardan myrtillin (delfinidin-3-O-glucoside) ve tulipanin (delfinidin-3-O- rutinozid) frenküzümü posasında bulunabilir. Violdelphin (6-O-(4 3-rutinosid-7-O(delfinidin-(6-O-(4-hidroksibenzoil)-β-D-glukozil) oksibenzoil)-β-D-glikozid) ise Aconitum chinense (Kaplanboğan otu) çiçeğinin mavi mor renginden sorumludur (Takeda ve ark., 1994). Test maddesi de dâhil biyoaktif bileşiklerin genotoksik/antigenotoksik ya da mutajenik/antimutajenik potansiyellerinin ortaya çıkarılması için daha önce yapılan birçok çalışmada genelde birbiriyle benzer veya az da olsa farklı sonuçlar elde edilmiştir. Bunlardan bir bölümüne ait bulgular aşağıda kısaca özetlenmiştir. Steroller, karotenoidler, polifenol ve antosiyaninler gibi bitki bileşenlerini içeren farklı gıda ürünlerinin gelişimi sağlık açısından spesifik faydalara sahip olduğundan son yıllarda gıda bilimi ve teknolojisi büyük bir ilgi odağı olmuştur (Ávila ve ark., 2009). Bitkilerdeki fitobileşenlerin geniş bir farmakolojik aktiviteye sahip olduğu rapor edilmiştir. Benzoic-pirone türevi flavanoidler 15 karbon atomlu iskelete sahiptir. Flavanoidlerin farklı sınıfları olan flavanonlar, flavonlar, flavanollar, izoflavanoidler, antosiyaninler ve flavanlar, heterosiklik oksijen halkaları etrafındaki kendi yapısal karakteristiklerine bağlı olarak birbirlerinden farklılıklar göstermektedirler. Flavanoidler Ultraviyole (UV) ışığı soğurma yeteneğinden dolayı, hücreyi DNA hasarına karşı koruyabilir ve kardiyovasküler hastalıkların riskini azaltabilir (Schmitt ve Stopper, 2001). Kateşinler, antosiyanidinler ve glukozidazantosiyaninler flavonidal bileşenleri bitki materyalleri içinde mevcut ve sağlık için faydalı özellikler göstermiştir. Flavonoidler çiçeklerde, sarının tonları kırmızı ve turuncu gibi bitki kısımlarının farklı renklerinden sorumludur (Patel ve ark., 2013). Tüketilebilir bitkiler içinde 4.000 fazla flavonoid rapor edilmiştir ve bunlar insan diyetinde düzenli olarak kullanılmaktadır. Flavonoid bileşenlerinin en yaygın bulunduğu sınıflar içinde sebzeler, tıbbi bitkiler, kabuklu yemişler ve meyveler ile kahve, çay ve kırmızı şarap gibi içecek sayılabilir ve bunlar yaygın bir şekilde diyet yoluyla bünyeye alınır (Patel ve ark., 2012; Patel ve ark. 2014). 6 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET Antosiyaninler; kanser, diyabet, mutasyon ve kardiyovasküler hastalıklar gibi çeşitli rahatsızlıklardan korunmada önemli bir rol oynamaktadır. Antosiyaninler antioksidan, antiproliferatif, antianjiogenik ve antiinflamatuar aktivite göstermektedir (Hou ve ark. 2004; Miguel, 2011). Beslenme geleneğine bağlı olarak, insanlarda günlük alınan antosiyanin miktarı birkaç miligramdan yüzlerce miligrama çıktığı tahmin edilmektedir (Hou ve ark. 2004; Miguel, 2011). Daha önce yapılmış sınırlı sayıda çalışmaların sonuçlarına göre delphinidinin antioksidan, antimutajenik, antienflamatuvar ve antianjiogenik özellikleri mevcuttur. Delphinidinin yukarıda bahsedilen aktivite etkinliğini; vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör-2 fosforilasyon inhibisyonu, trombosit-türevi büyüme faktörü ligand/reseptör sinyal inhibisyonu, kanser hücresi proliferasyonu ve Met reseptör fosforilasyon modülasyonu aracılığıyla gerçekleşmektedir (Dimitrovi ve Jakovac, 2010; Feng ve ark. 2010; Kumoro ve ark., 2010). Delphinidin son zamanlarda destekleyici kanser ilacı gibi tüketilen birçok parlak renkli meyvelerde, sebzelerde ve diyet takviyelerinde bulunmuştur (Cvorovic ve ark., 2010; Suzuki ve ark., 2011). Bitki özütleri, gıda katkı maddeleri, gıda boyaları ya da herhangi bir ilaç etken maddesinin genotoksisite, antigenotoksisite ve/veya sitotoksisite açısından riskli olup olmadığının belirlenebilmesi için genellikle akut veya kronik sitotoksisite testleri tercih edilmektedir. Bu amaçla kardeş kromatit değişimi (KKD), kromozom aberasyonu (KA), mikronukleus (MN) testi, RAPD-PCR (Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA-Polimeraz Zincir Reaksiyonları) Ames testi, total oksidan/antioksidan seviyeleri, hayvan doku kültürü, comet analizi gibi pek çok test yapılmaktadır (Kayraldız ve ark. 2010; Tazehkand ve Topaktaş, 2015; Karatepe ve ark. 2015; Timocin ve İla, 2015; Alam-Escamilla ve ark., 2015). Yaygın bir şekilde tamir edilmeyen veya yanlış tamir edilmiş DNA ve çift zincir kırıklarının kromozom aberasyonu oluşumuna yol açtığı kabul edilmektedir. Yüksek ökaryotların DNA’sındaki endojen nedenler veya ekzojen ajanlar tarafından uyarılmış çift zincir kırıkları prensip olarak ya homolog olmayan uç birleşmesi yahut yönlendirilmiş homoloji ile tamir edilebilir. Çift zincir kırığında hangi onarım yolağının seçileceğinin esası tam olarak bilinmemekle birlikte bu tercihin muhtemelen uyarıcı ajan veya yaşanan sürece bağlı olabileceği ifade edilmiştir. 7 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET (Iliakis ve ark., 2004). İnsanların iyonize radyasyona maruz kalması ve diğer genotoksik ajanların önemli biyolojik sonuçlarından biri kromozomal aberasyonlardır. Periferal kan lenfositlerinde önemli bir düzeyde yükselmiş KA frekanslarına sahip insanlarda kanser gelişim riskinin yükselmiş olduğunu epidemiyolojik çalışmalar, göstermiştir (Bonassi ve ark. 1995; Hagmar ve ark., 1998; Obe ve ark., 2002). Etiyolojik açıdan sorgulandığında birçok kanser türünün spesifik KA tipleri ile ilişkili olduğu ortaya çıkmıştır (Mitelman ve ark., 1997). Morfolojik nükleer anormalliklerin oluşumu ilk olarak balık eritrositlerinde tanımlanmıştır (Carrasco ve ark., 2011). Çok kapsamlı bir şekilde yapılan sitogenetik araştırmalar radyasyonun çeşitli kromozomal hasarlara neden olduğu ortaya konmuştur. İnsan lenfosit mikronukleus analizleri genotoksisite testinin yanı sıra tüm kromozom kayıpları ve kırıkları, kromozom hasarının değerlendirilmesi için doğru ve güvenilir bir yöntemdir. Kültürü yapılmış insan lenfositlerinin mikronukleus sıklığı, dolaşımda olan lenfositlerin yaşam boyunca biriktirdiği genetik hasarı ortaya çıkarmak için önemli ipuçları vermektedir (Fenech, 1993). γ–radyasyonuna maruz kalan kanser hastalarının lenfositlerindeki MN sıklığı ve morfolojik hücresel değişimlerin, radyasyon dozuna ve süresine bağlı olarak kontrol grubundakilerden oldukça yüksek olduğu tespit edilmiş ve fark istatistiksel olarak önemli (P<0.01) bulunmuştur. Bu kişilerin lenfositlerinde voküolizasyon, membran kusurları ve sitoplazmik granülasyonda artış gibi morfolojik değişmeler olduğu belirlenmiştir (Çavuşoğlu ve ark., 2009). Son zamanlarda genotoksisitenin saptanmasında kullanılan enstrümanlardan birisi olarak karşımıza çıkan rasgele çoğaltılmış polimorfik DNA-PCR (RAPD: Random amplified polymorphic DNA-Polymerase chain reaction) yöntemi genotoksinler tarafından indüklenen DNA hasarlarını belirlemede kullanılan yeni bir test olarak kabul edilebilir. RAPD-PCR önceleri DNA haritalama, taksonomi ve filogenetik çalışmalarda kullanılmıştır (Williams ve ark., 1990). Ancak daha sonraları DNA hasarları ve mutasyonları da bu yöntemle belirlenebileceği düşünülmüştür. Sonraki çalışmalarda RAPD yöntemi ile kimyasalların (Savva ve ark., 1994; Atienzar ve ark., 1999; Becerril ve ark., 1999; Atienzar ve ark., 2001; Atienzar ve ark., 2002a; Atienzar ve ark., 2002b), iyonize ve non-iyonize 8 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET radyasyonların (Kuroda ve ark., 1999; Atienzar ve ark., 2000; Jones ve Kortenkamp, 2000; Theodorakis, 2001) DNA üzerindeki etkilerinin belirlenmesinde güvenle kullanılabileceği gösterilmiştir. RAPD metodu kullanımında esas avantaj olarak; testin hızlılığı ve herhangi bir organizmanın nükleotid enformasyonuna, hücre siklusuna, karyotipine ve DNA hasar çeşitliliğine bakılmaksızın tam genom düzeyinde mutasyonları ortaya çıkarabilmesi (Atienzar ve ark., 2002c) gibi özellikleri testin popülaritesini artırmaktadır. DNA hasarları ya da mutasyonlarla sonuçlanan çeşitli DNA etkilerinin sonucunda RAPD profilinde bant kayıpları, yeni bantların oluşması, var olan bantların yoğunluğun azalması ya da artması gibi durumlar gözlemlenebilir (Uzonur ve ark., 2004). Herhangi bir organizmada metabolik ve fizyolojik faaliyetler sürecinde olağan bir şekilde reaktif oksijen ve nitrojen türleri açığa çıkmaktadır. Bu reaktif türler, normalde organizmanın sahip olduğu enzimatik ve/veya enzimatik olmayan antioksidan mekanizmalar tarafından zararsız hale getirilmektedir. Ancak endojen ve eksojen nedenlerle antioksidanların yetersiz kaldığı durumlarda ise sistemdeki oksidan seviyesinde artışlar ortaya çıkar ve oksidan-antioksidan dengesi oksidan yönünde yükselme eğilimi gösterir ve bu sonuç oksidatif stres olarak adlandırılır. Bu durumun birçok hastalık ve moleküler bozukluğun etiyopatogenezinde (hastalığın oluşum ve gelişim nedenleri) yer aldığı söylenebilir. Vücudun oluşan oksidan durumlara karşı kendi redoks dengelerini sürdürebilmesinde kan dokusu çok önemli rol oynamaktadır (Yao ve ark., 1998; Akdemir, 2011). Total antioksidan seviyesinin ölçümü, antioksidanların tek tek ölçümünden daha belirleyici bilgiler verebilir. Plazma ve vücut sıvılarında bulunan bütün antioksidanların toplam etkisi TAS olarak isimlendirilir. Bu yüzden kanın antioksidan durumunu belirlemede bireysel antioksidanlar yerine bunların toplam antioksidan değerini veren TAS ölçümü yaygınlaşmaktadır (Ghiselli ve ark. 2000; Akdemir, 2011). Mevcut durumu ortaya çıkarmak için bireydeki toplam oksidan seviyesi (TOS) ve toplam antioksidan seviyesi (TAS) değerleri belirlenerek oksidatif stres indeksi (OSI) tespit edilmektedir. Oksidatif stres, organizmadaki nükleik asitler dâhil bütün moleküllerde birçok negatif etkilenmelere yol açarak bununla bağlantılı çeşitli hastalıklara neden 9 1. GİRİŞ Mehmet Tahir HÜSUNET olmaktadır. Çeşitli kaynaklardan türevlenmiş birçok oksidana maruz kalan genomda bu etkiler sonucunda çeşitli tiplerde tanımlanmış hasarlar ortaya çıkmaktadır. Bu hasarlar, özellikle 8-oxo-2′deoxyguanosine gibi baz oksidasyonları (Cooke ve ark., 2003), DNA tek ve çift iplik kırıkları (Toyokuni ve Sagripanti, 1993) ve DNAprotein çapraz bağlanmaları (Bau ve ark., 2002) şeklinde görülmektedir. Aynı zamanda hücre döngüsü düzenlenmesinde oksidatif hasarlara bağlı olarak DNA alterasyonları ortaya çıkmaktadır (Pizarro ve ark., 2009). Ayrıca yaş artışıyla birlikte reaktif türlerin neden olduğu kanser vakaları sıklığının da arttığı belirtilmektedir (Halliwell, 2007). Öte yandan oksitleyici türlerin bu olumsuz etkilerinin yanında apoptoza yol açacak ölçüde DNA fragmentasyonuna sebep olması bu ajanların tümör tedavisinde kullanılma potansiyelini düşündürmektedir. Zaten önceki çalışmaların ilgili bölümlerinde de belirtildiği gibi bu etkilerin varlığı vurgulanmaya çalışılmıştır. Bu çalışmada test maddesi olan delphinidin chloride bileşiğinin özellikle gıda endüstrisinde kullanımındaki potansiyel avantajlar ile kullanım yoğunluğunun göz önüne alındığında ve bu madde ile ilgili yapılmış genotoksisite çalışmalarının tatminkâr düzeyde olmaması yaptığımız bu çalışmanın önemini artırmaktadır. Özetle bu proje işlenmiş gıdalarda renklendirici madde olarak kullanılan delphinidin chloride bileşiğinin genotoksik/antigenotoksik ve sitotoksik etkilerinin olup olmadığını saptamak maksadıyla yapılmıştır. Bu çalışmada kültüre alınmış insan periferal lenfositlerinde in vitro kromozom aberasyonu ve mikronukleus testi yapılmıştır. Ayrıca kültür ortamından elde edilen süpernatant ile total oksidan ve total antioksidan ölçümü yapılarak oksidatif stres indeksleri (OSI) saptanmıştır. Çalışmalardan elde edilen bulgular istatistiki olarak değerlendirilip daha önce yapılan benzer çalışmaların sonuçlarıyla karşılaştırılmıştır. 10 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan delphinidin chloride, antosiyanidin grubuna dâhildir. Antosiyanidinler ise antosiyanin pigmentlerinin şekersiz türevidir. Antosiyaninler fenilpropanoid yolu üzerinden sentezlenen ve flavonoid adı verilen moleküllerin bir alt sınıfına aittir (Andersen 2001). Flavonoidler ise insan diyetindeki polifenolik bileşiklerin en yaygın grubu olup çok sayıda bitkinin birçok dokusunda bulunmaktadır (Spencer 2008). Yukarıdaki açıklamadan anlaşılacağı üzere antosiyanidin grubu, bir üstte bulunan flavonoidler grubuna, flavonoidler ise en tepede bulunan polifenolik bileşikler sınıfına ait biyoaktif bileşiklerdir. Polifenol bileşiklerin özelliklerini ve bu maddelerle yapılan geotoksisite, antigenotoksisite, kanserojenite, antikanserojenite, oksidan ve antioksidan etkileri belirleme çalışmalarını şu şekilde özetleyebiliriz. 2.1. Polifenoller Polifenoller (polyhydroxyphenols olarak da bilinir) temel olarak doğal yapısal bir sınıf olup ayrıca sentetik veya yarı sentetik, organik kimyasal fenolik birimler ile de karakterize edilen geniş bir ailedir. Bu fenolik yapıların çeşit ve karakteri; benzersiz fiziksel, kimyasal ve biyolojik (metabolik, toksik, terapötik, vs.) özelliklerin temelini oluşturmaktadır. Tannik asit ve ellagitannin ilk akla gelen fenolik bileşiklerdir. Polifenollerin bir alt kümesi olması bakımından “tanen”lerin tarihsel bir önemi vardır (Wikipedia-Polyphenols). Çeşitli bitki türlerinde 8.000’den fazla olmak üzere polifenolik bileşik tanımlanmıştır. Bitkisel fenolik bileşiklerin tamamı fenilalanin ya da şikimik asit öncüsünden sentezlenmektedir (Kondratyuk ve Pezzuto 2004). Önemli oranda polifenol içeren bitkiler arasında kuş üzümü, böğürtlen, ahududu, çilek, baklagiller, yerba mate (Paraguay çayı), yer fıstığı, yeşilçay, asitsiz zeytinyağı, kakao, erik, armut, kiraz, nar, üzüm, elma, portakal gibi meyveler ile brokoli, lahana, maydanoz, soğan gibi sebzeler sayılabilir. Arı sütü, bal ve polen ile 11 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET her türlü hububat alternatif polifenol kaynağıdır (Polifenoller, 2015). Bitkilerin dışında en yoğun ve bol miktarda polifenol hümik asitlerde bulunmaktadır. Bu moleküllerde birden fazla fenol halkası bulunmaktadır. Polifenoller genelde bitkilerde bulunur ve bitkilerin renklenmelerinden, örneğin sonbahardaki yaprak renklerinden sorumludurlar. Antioksidan özelliklerinden dolayı insan sağlığına muhtemel faydaları vardır. Antioksidan polifenollerin oksidatif stresi (reaktif oksijen ile meydana gelen stres) azaltmalarından dolayı kardiyovasküler hastalık ve kanser risklerini azalttığına dair bulgular vardır (Arts ve Hollman, 2005). Bu bileşiklerin Alzheimer hastalığının başlangıcını da geciktirdiği belirtilmiştir (Wikipedia, polifenol 2015). Uzak doğuda yaygın tüketimi olan yeşil çayın, erken aşama prostat kanserinde veya riski olanlarda umut verici bir koruyucu ajan olabileceği düşünülmektedir (Johnson ve ark. 2010). Benzer bir derlemede polifenollerin oral kanser oluş sıklığını azalttığı ifade edilmiştir. Bu etkilerini hücre ölümünü uyararak ve/veya tümör gelişimi, invazyon ve metastazı engelleyerek gösterdiği belirtilmiştir (Ding ve ark. 2013). Polifenollerce zengin üzüm çekirdeği özütünün sindirim sırasında sisteme dâhil edilmesinin mide bölmesi ve bağırsak diyalisatlarında ortaya çıkan oksidasyon ürün miktarını önemli ölçüde azalttığı (p <0.05) ifade edilmiştir (Maestre ve ark. 2013). Benzer şekilde yeşil çayın koruyucu özelliği, içeriğindeki aktif bileşenlerden kaynaklanmaktadır. Bu bileşikler polifenoller ve flavonoidlerdir. Yeşil çay içeriğindeki polifenoller reaktif oksijen ve nitrojen türlerini bağlayarak ayrıca süperoksit dismutaz, glutatyon redüktaz, glutation-S-redüktaz, katalaz ve kinon redüktaz gibi hücre içinde bulunan (endojen) antioksidan enzimlerin sentezini tetikleyerek antioksidan aktivite göstermektedir. Benzer veriler literatürde pek çok çalışma tarafından doğrulanmıştır (Yang ve ark., 2004; Sağır ve ark. 2013). Farklı bir çalışmada (Sağır ve ark., 2013) 1,4 dioksan bileşiğinin toksik etkilerine karşı yeşil çayın koruyucu etkilerini saptamışlardır. Bu çalışmada fizyolojik parametrelerin indikatörü olarak vücut ağırlığı, genotoksik parametrelerin indikatörleri olarak ise mikronükleus (MN) ve kromozomal anormallik (KA) bulgularını kullanılmıştır. Test maddesi olarak kullanılan 1,4 dioksan uygulamasının kontrol grubuna göre vücut ağırlığında istatistiksel açıdan önemli bir azalmaya, MN ve KA sıklığında ise bir artışa neden olduğu belirlenmiştir. Yeşil çay uygulaması ise 1,4 dioksanın söz 12 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET konusu olumsuz etkilerini iyileştirerek, kontrol grubu düzeyinde olmasa bile, vücut ağırlığında tekrar bir artışa, MN ve kromozomal anormallik sıklıklarında ise bir azalmaya neden olmuştur. Sonuç olarak yeşil çay uygulamasının yakın gelecekte kimyasallar tarafından sebep olunan toksisitenin azaltılmasında “toksisite sınırlayıcı” bir antioksidan olarak kullanılabileceği rapor edilmiştir. 2.1.1. Flavonoidler Polifenollerin içinde en çok çalışılan grup flavonoidlerdir. Latince sarı anlamına gelen “flavus” kelimesinden türeyen flavonoid (ya da biyoflavonoid) bitki sekonder metabolitlerinin önemli bir sınıfıdır. Bu üst grup kimyasal olarak iki fenil halkası (A ve B) ve heterosiklik halkadan (C) ibaret 15-karbon iskeletli genel bir yapıya sahiptir (McNaught ve ark. 1997). Kırmızı soğan, maydanoz, yaban mersini ve diğer dutsu meyveler, siyah çay, yeşil çay ve oolong çayı, muz, tüm narenciye çeşitleri, Ginkgo biloba, kırmızı şarap ve koyu çikolata (kakao oranı %70 ve daha yüksek olanlarda) yüksek flavonoid içeriğine sahip gıdalar içinde sayılabilir (USDA). Yaygın görüşün aksine, flavonoidler insan vücudu tarafından çok zayıf bir şekilde emilir (% 5'ten az) ve emilenlerin büyük bir çoğunluğu hızla metabolize edilirek atılır (EFSA 2010, Lotito ve Frei 2006, Williams ve ark. 2004). Mevcut bulgular, flavonoidlerin düşük ve ihmal edilebilir düzeyde antioksidan aktiviteye sahip olduğunu düşündürmektedir. Flavonoidlerce zengin gıdaların tüketiminden sonra kan antioksidan kapasitesindeki artış doğrudan flavonoidler nedeniyle olmayıp, flavonoid depolimerizasyonu sonucu ortaya çıkan ürik asitten kaynaklandığı ifade edilmektedir (Stauth 2007). Bir önceki çalışmanın sonuçlarıyla benzer şekilde karsinojen benzo[a]pyrene (BaP) muamelesi öncesi flavanol dihydromyricetin ve alpha-naphthoflavone ile ön muamele edilen hayvanlarda özellikle ince bağırsak distal bölmesinde oluşturulan BaP-DNA eklentileri önemli seviyede yükseldiği ortaya çıkmıştır (Hodek ve ark. 2014). Asteraceae ailesine ait Heterotheca inuloides bitki türünden elde edilen metanolik ve asetonik özütün Salmonella typhimurium TA98 suşunda mutajenik özellik gösterirken, TA100 ve TA102 suşlarında aynı etkiyi 13 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET göstermediği anlaşılmıştır. Öte yandan metanolik özüt, norfloksasin, benzo[a]piren ve 2-aminoanthracene tarafından oluşturulan mutajeniteyi azaltmaktadır. Metanolik özütün ana bileşenlerinden biri kuersetin, mutajenik/antimutajenik şeklinde ikili etki göstermektedir ve sitokrom P450 (CYP) 1A’nın inhibitörüdür. Bitkinin antigenotoksik özelliğinin, antioksidan karakteriyle ilintili olabileceği rapor edilmiştir (Ruiz-Pérez ve ark. 2014). Melekotu (Angelica keiskei) bitkisinden elde edilmiş iki çeşit aktif (4-hydroxyderricin ve xanthoangelol) flavonoidle yapılan genotoksisite çalışmalarında (bakteri geri mutasyon testi, kromozom aberasyon testi ve in vivo mikronukleus testi) negatif sonuçlar bulunmuştur (Maronpot, 2015). Akrilamid tarafından indüklenen genel toksisite, genotoksisite ve üreme toksisitesine karşı çilek, üzüm ve yabanmersini özütlerinin belirgin şekilde antitoksik etkisi vardır. Özellikle de antosiyaninler gibi bol bulunan fenolikler toksisitenin engellenmesine katkıda bulunabilir (Zhao ve ark. 2015). Metilciva (methyl mercury) tarafından oluşturulan olumsuz sağlık etkilerine karşı diyette bulunan flavonoidlerden birisi olan chrysin’in, insan sağlığını koruyabileceği belirtilmiştir (Manzolli ve ark. 2015). Bir flavonoid tipi olan isoflavon irilone, mitotik iğ ipliği yapısını bozarak güçlü anöjenik etki, mitotik duraklama, asimetrik hücre bölünmesinin neden olduğu kromozom kaybı ve nükleer fragmentasyon gibi mitotik hasarlar göstermektedir (Scheffler ve ark. 2015). Yonca yaprağından izole edilen medicarpin ve millepurpan isoflavonoidleri pro-apoptotik niteliğe sahiptir ve çoklu ilaç direncine sahip P388 leukemia hücrelerinde kemoterapinin sitotoksisitesini kuvvetlendirmektedir. Bu flavonoidler kemoterapi ilacı olarak kullanılabilir ya da sensibilizatör (duyarlayıcı) olarak çoklu ilaç direncine sahip kanser hücrelerinde kemoterapi ilaçlarının sitotoksisitesini artırmak için tercih edilebilir (Gatouillat ve ark. 2015). Çeşitli bitkilerde doğal yoldan meydana gelmiş 5000’den fazla flavonoid türevi bileşik karakterize edilmiş olup kimyasal yapılarına göre aşağıdaki alt gruplara ayrılmıştır (Ververidis, 2007). 2.1.1.1. Antosiyaninler Yunanca da Anthos = çiçek ve kyanos mavi anlamına gelen kelimelerden 14 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET türemiş isme sahip olan antosiyaninler, pH değişimine bağlı olarak kırmızı, mor ya da mavi renkte görünen suda çözünen vakuolde bulunan pigmentlerdir. Bunlar, fenilpropanoid yolu ile sentezlenen flavonoid moleküllerinin bir üst sınıfına aittir; kokusuz ve neredeyse tatsız olup hafif buruk bir tat hissi vermektedirler. Antosiyaninler yaprak, gövde, kök, çiçek ve meyve dâhil olmak üzere yüksek bitkilerin bütün dokularında meydana gelmektedir. Antosiyaninlerin şekersiz türevleri ise antosiyanidinler olarak adlandırılırlar (Andersen, 2001). Antosiyaninler E163 koduyla bilinen yaygın bitki pigmentleri olup turşu ve zeytin hariç korunmuş sebze ve kırmızı meyvelerde, meyve aromalı kahvaltılık tahıllarda, kırmızı damarlı peynirde, balık ezmesi ve kabuklu ezmesinde, ön pişirme yapılmış kabuklularda, tütsülenmiş balık gibi gıdalarda uygun konsantrasyonlarda güvenle kullanılabileceği belirtilmiştir (30 Haz. 2013 tarih ve 28693 sayılı resmi gazete genelge eki). Yukarıda belirtildiği gibi bazı işlenmiş gıdalarda doğal renk verici preparat olarak kullanılan bu pigmentler gıdanın renginin; işleme, depolama, paketleme ve dağıtımdan etkilenerek, görsel kabul edilebilirliğinin zarar görmesi durumunda gıdanın orijinal görünümünü geri kazandırması, gıdayı görsel olarak daha cazip hale getirmesi ve renksiz gıdaya renk vermesi amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır. Basit ekstraksiyon prosedürleriyle on farklı tür üzümün antosiyaninlerini izole eden Sugui ve ark. (1999) beş kırmızı üzüm çeşidinin farklı bir kütle spektrumu sergilediğini ve ayrıca en bol bulunan antosiyaninlerin ise cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin ve malvidin olduğunu tespit etmiştir. Fonksiyonel gıdaların hem yararlı etkilerini hem de toksik etkilerini değerlendirmek amacıyla Glei ve ark. (2003) in vitro koşullardaki insan hücrelerinde yeşil çay ve siyah havucun su özütlerinin anahtar bileşenlerinden olan antosiyanidinlerle analizler yapmıştır. Bu bileşenler insan kolon kanseri hücreleri (HT29 klon 19A) üzerinde değerlendirilmiştir. Çalışmada yapılan in vitro analizlerin başlıca amacı subtoksik dozları belirlemek olup in vitro çalışmalar aynı zamanda kompleks örnekler ve tek bileşenlerin kıyaslanmasına izin vermektedir. LC–MS/MS datalarına göre yabanmersini özütlerindeki antosiyaninlerin ana bileşeni delphinidin, petunidin ve malvidin olduğu rapor edilmiştir (Lohachoompol ve ark. 2008). Antosiyaninlerin yapısındaki farklılık (5 aglikon olan malvidin, cyanidin, 15 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET delphinidin, peonidin ve petunidin) kendi hidroksil gruplarının bağlanma şekli ve metilasyon derecesi ile ilişkilidir (Mazza, 1995; Clifford, 2000). 2.1.1.2. Antosiyanidinler Antosiyanidinler oksonium iyonunun bir türü olan flavilium iyonu veya 2fenilkromenliumden oluşan antosiyaninlerin şekersiz formlarıdır (antosiyaninlerin aglikon formudur). Polimetin boyalarının büyük bir grubunu oluşturmaktadırlar. Özellikle antosiyanidinler 2-fenilkromenilium katyonunun tuz türevleri olup flavilium katyonu olarak da bilinmektedir. Flaviliyum katyonunun karşı iyonu çoğunlukla klorittir. Antosiyanidinler bu pozitif yükünden dolayı diğer flavonoidlerden ayrılırlar. Antosiyanidinlerin stabilitesi pH’ya bağlıdır. Düşük pH’da (asidik ortam) renkli antosiyanidinler mevcuttur ancak yüksek pH’da (bazik ortam) renksiz “kalkon” formları ortaya çıkmaktadır (IUPAC, 1997). Gelişmiş bitkilerde yaygın olarak altı antosiyanidin [(cyanidin (50%), pelargonidin (12%), peonidin (12%), delphinidin (12%), petunidin (7%)] ve malvidin (7%)) bulunmaktadır (Cooke ve ark., 2005; He ve Guisti, 2010). Antosiyaninler genelde kompleks karışımlar halinde bulunurlar. Üzüm özütleri delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin ve malvidin’in glukozitleri, asetil glukozitler ve kumaril glukozitlerine sahip olabilirler (Peterson ve ark., 1998). Merlot üzümlerinden elde edilen kırmızı şarapların analizinde, (−) epicatechingallate 3.95 mg/L, resveratrol 5.70 mg/L, anthocyaninler 624 mg/L ve tanenler 2.93 g/L içermektedir. Takip eden bileşikler ise (−) epicatechin, coumarins, cyanidin chloride, malvidin chloride ve delphinidin chloride’in tespit sınırının altında olduğu belirlenmiştir (Estruch ve ark., 2004). Antosiyanidinleri saptamak için yapılan diğer bir çalışmada, kırmızı şarap ve üzümsü meyvelerde yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) metodu uygulanmıştır. Çalışma sonucunda yabanmersini (Vaccinium myrtillus), siyah kuş üzümü (Ribes nigrum), çilek, cabernet sauvignon (Vitis vinifera) ve kırmızı şarap içeriğinde delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin, ve malvidin olduğu belirlenmiştir (Nyman ve Kumpulainen, 2001). 16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET Çizelge 2.1: Seçilmiş antosiyanidinler ve moleküler yapıları (IUPAC 1997) Anthocyanidin Temel yapısı (R4' = −OH) R3' R5' −H R3 R5 R6 R7 −OH −OH −OH −OH Aurantinidin −H Capensinidin −OCH3 −OCH3 −OH −OCH3 −H −OH Cyanidin −OH −H −OH −OH −H −OH Delphinidin −OH −OH −OH −OH −H −OH Europinidin −OCH3 −OH −OH −OCH3 −H −OH Hirsutidin −OCH3 −OCH3 −OH −OH −OH −OCH3 Malvidin −OCH3 −OCH3 −OH −OH −H −OH Pelargonidin −H −H −OH −OH −H −OH Peonidin −OCH3 −H −OH −OH −H −OH Petunidin −OH −OCH3 −OH −OH −H −OH Pulchellidin −OH −OH −OH −OCH3 −H −OH Rosinidin −OCH3 −H −OH −OH −H −OCH3 2.1.1.2.(1) Belli Başlı Antosiyanidinler 2.1.1.2.(1).a. Aurantinidin Aurantinidin suda çözünebilen kırmızı bir bitki boyasıdır. Antosiyanidin sınıfının bir üyesidir ve pelargonidinin hidroksi türevidir. Aurantinidin Impatiens aurantiaca’da (Balsaminaceae) bulunduğu rapor edilmiştir. Ayrıca Alstroemeria genusun da kültürü yapılmaktadır (wikipedia-aurantinidin). 2.1.1.2.(1).b. Capensinidin Capensinidin bir O-metillenmiş antosiyanindir. Capensinidin suda çözünebilir mavi-kırmızı bir bitki boyasıdır. Malvinidinin 5-metoksi analogodur. Plumbago capensis’den elde edildiği rapor edilmiştir (wikipedia-capensinidin). 2.1.1.2.(1).c. Cyanidin Antosiyanidin özel bir üyesi (antosiyaninlerin glokozit olarak isimlendirilen versiyonu) cyanidin doğal organik bir bileşiktir. Etli ve zarlı kabuksuz meyvelerin 17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET çoğunda bulunur. Bunlar; üzümler, yabanmersini, böğürtlen, çay üzümü, vişne-kiraz, kızılcık (keçi yemişi), siyah mürver ağacı, alıç, loganberi (ahududu ve böğürtlen melezi bir bitki), acai çileği ve ahudududur (wikipedia-cyanidin, 2015). Ayrıca elma, erik, kırmızılahana ve kırmızı soğanda bulanabilir. Ciyanidinin karakteristik rengi kırmızımsı-mordur. Ancak bu renkler pH ile değişebilir. pH<3’teki çözeltiler kırmızı renkli, pH 7-8’de mor-menekşe, pH>11’de ise mavi renklidir. Bazı meyvelerin kök ve tohumlarında en yüksek konsantrasyonda cyanidin bulunmuştur. Ciyanidin diğer antosiyaninler gibi antioksidan ve radikal temizleme etkisi olduğu bilinmektedir. Aynı zamanda hücreleri oksidatif hasardan korur, kanser ve kardiyovasküler hastalıkların riskini azaltır. Diğer çalışmalar ciyanidinin diyet ile alımının sağlıksız diyet etkilerini inhibe etmesiyle obezite gelişimini engelleyebildiğini göstermiştir (Tsuda ve ark., 2004; Sasaki ve ark., 2007; Johnson ve kelly, 2015). Diğer çalışmalar ciyanidinin antienflematuar etkiler sağlamanın yanı sıra diyabet gelişimini engellediğini de göstermiştir (He ve ark., 2005; Sasaki ve ark., 2007). Diğer ön çalışmalar laboratuar testleri ile ispatlanmamasına rağmen ciyanidinin glukozit türevi, kanser terapisinde rol alabileceğini göstermiştir (Chen ve ark., 2006; Tulio ve ark., 2008; He ve ark., 2012). Fimognari ve ark (2004) göre, cyanidin 3-O-betaglucopyranoside (Cy-g) tek başına (100 µg/mL) genotoksik değilken aynı miktar replikasyon indeksini %50 oranında düşürmüştür. İlaveten ethyl methanesulfonate (EMS), colchicine (COL), H 2 O 2 tarafından uyarılan mikronukleus frekansı Cy-g tarafından azaltılmış ve tek başına Cy-g uygulanan kültürlerde apoptoz ortaya çıkmıştır. Bu sonuçlara göre araştırmacılar ajanın in vitro şartlarda antigenotoksik etkiye sahip olduğunu ve potansiyel kemoterapi ajanı olarak kullanılabileceği ifade etmişlerdir. Başka bir çalışmada 50 µM Ochratoxin A (OTA) ile muamele edilmiş hücrelere çeşitli konsantrasyonlarda (0.125, 0.250 mM) cyanidin 3-O-beta-Dglucoside (C3G) ilavesinin serbest radikal oluşumunu ve genomik DNA hasarını anlamlı seviyede azalttığı rapor edilmiştir (Russo ve ark 2005). Farklı bir çalışmada pelargonidin ve cyanidin’in çevresel toksinler tarafından oluşturulan genotoksik stresi azaltmada önemli rol oynayabileceği gösterilmiştir (Khandelwal ve Abraham 2014a). Aynı araştırıcıların yaptığı farklı bir çalışmada cyanidin ve pelargonidin’in cisplatin tarafından oluşturulan kromozom hasarlarını önemli düzeyde düşürdüğü 18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET cyclophosphamide ve procarbazine tarafından yaratılan apoptozu seviyesini de azalttığı bulunmuştur. Bu çalışmanın sonuçlarına göre antosiyanidinler, DNA hasarı ve apoptozu indükleyerek sitotoksisite gösteren antikanser ilaçlarının etkinliğini azaltabilir (Khandelwal ve Abraham 2014b). 2.1.1.2.(1).d. Delphinidin Delphinidin (ayrıca delphinidine olarak da bilinir) bir antosiyanidindir (wikipedia-delphinidin, 2015). Başlıca bir bitki pigmenti ve antioksidan niteliktedir (Afaq ve ark., 2007). Delphinidin, Viola tricolor (hercai menekşe) ve Delphinium (hezaren çiçeği) cinslerinde çiçeğe mavi tonlarda renk verir. Ayrıca Cabernet Sauvignon (siyah üzümün) ürünlerinde mavi-kırmızı rengini verir ve yabanmersini ile concord üzümlerinin yanı sıra narda da bulanabilir (Ribéreau-Gayon, ve Ribéreau-Gayon, 1958). Delphinidin hemen hemen tüm diğer antosiyanidinlere benzer tarzda pH’ya duyarlıdır ve asidik çözeltilerde kırmızı, bazik çözeltilerde maviye dönüşür. Bilinen birkaç glukozit delphinidin türevidir. Myrtillin (delphinidin-3-Oglucoside) ve tulipanin (delphinidin-3-O-rutinoside) kuş üzümü posasında bulunabilir. Aconitum chinense (kurtboğan, bıldırcın otu)’nin eflatuni mavi çiçek renginden violdelphin (delphinidin 3-rutinozit-7-O-(6-O-(4-(6-O-(4-hidroksibenzoil)β-D-glukozil)oksibenzoil)-β-D-glukozit) sorumludur (Takeda ve ark., 1994; Nishizak ve ark., 2013). Patlıcanın mor renginden nasunin (delphinidin-3-(p- cumaroilrutinozit)-5-glukozit) sorumludur (Noda ve ark., 2000). Genellikle taç yapraklardaki mavi çiçek rengi, delphinidine dayanan bir antosiyaninin varlığından kaynaklanmaktadır. Tüm antosiyaninler asidik pH’da endotermik reaksiyon gösterirken, delphinidinin de aralarında bulunduğu bazı aglikonlar fizyolojik pH’da, ekzotermik olarak gözlemlenmiştir (Cahyana ve ark., 2013). Başka bir çalışmada delphinidininin farklı çözücülerdeki (su, metanol, etanol ve aseton) çözünürlüğü atmosferik basınç altında ve çeşitli sıcaklıklarda (298-343 K) spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Tüm sıcaklıklarda delphinidin’in en iyi çözünürlüğü metanolde daha sonra sırasıyla 19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET su, ethanol ve asetonda olduğu anlaşılmıştır. Tüm çözücüler için hesaplanmış çözünürlüklerin çalışılan sıcaklık aralığında deneysel verilerle uyumlu olduğu rapor edilmiştir (Kumoro ve ark., 2010). Dephinidinin yukarıda belirtilen özelliklerinin yanısıra, sağlıklı ya da kanser hücre hatları üzerine olan sitotoksik, mutajenik, apoptotik ve oksidatif etkileri de dikkat çekicidir. Bu konuda yapılan araştırmalardan birisinde delphinidin DNA tamir testinde zayıf pozitif bulunmasıyla birlikte önemli ölçüde çerçeve kayması yahut nokta mutasyonuna sebep olmamıştır. İlaveten Saccharomyces cerevisiae organizmasının D5 suşunda mutasyon frekansını çok hafif düzeyde artırmıştır. Benzer şekilde V79 Çin hamster hücrelerinde etkili bir mikronukleus indükleyicisi olduğu ortaya konmuştur. Bu testlerde metabolik aktivasyon için test ortamına S9 mix eklenmesi toksisite yahut mutajenite üzerine çok düşük bir etki göstermiştir (Ferguson ve ark., 1985). Delphinidin, fibrosarkom (HT-1080) hücreleri tarafından salgılanan ve hücre dışı matrisi ayrıştıran matris metalloproteinaz (MMP)-2 ve MMP-9 enzimlerinin aktivitesini belli belirsiz düzeyde inhibe ederek tümör yayılma sürecinin durdurulmasında kısmen etkili olabileceği ifade edilmiştir (Nagase ve ark., 1998). Meiers ve ark. (2001) tarafından yapılan başka bir çalışmada in vitro koşullarda mikromolar düzeylerde cyanidin ve delphinidin yönünden zengin gıdaların insan tümör (epidermoid karsinoma) hücrelerinin gelişimini durdurduğu bulunmuştur. Bu sonuç epidermal büyüme faktörü reseptörlerinin (EGFR) inhibisyonuyla elde edilir. Farklı bir çalışmada yabanmersini özütlerinden izole edilen saf haldeki delphinidine ve malvidin gibi glikozitlerin in vitro şartlarda HL60 (insan promyelocytic leukemia) hücrelerinde apoptozu indüklediği ve insan kolon karsinoma (HCT116) hücrelerinde büyümeyi inhibe ettiği saptanmıştır (Katsube ve ark 2003). Ayrıca vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ile uyarılmış insan kordon (göbek) bağı endotelyal hücrelerinin göç ve proliferasyonu delphinidin tarafından kuvvetli bir şekilde bastırılarak in vivo ve in vitro anjiogenezin önlenmiştir (Favot ve ark. 2003). Delphinidin normal insan fibroblast hücreleriyle, rahim ve kolon adenokarsinom hücrelerinde büyümeyi engellemiş olup ajan tarafından indüklenen apoptozun varlığı morfolojik ve biyokimyasal (nükleer kondensasyon ve fragmentasyon gibi) bulgularla teyit edilmiştir. Bundan başka apoptotik hücrelerdeki mitokondrial membran potansiyeli 20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET delphinidin muamelesi ardından önemli düzeyde kaybolmuştur (Lazze ve ark. 2004). Ajanın aynı zamanda insan topoizomeraz I ve II enzimlerinin katalitik aktivitelerini izoformları arasında herhangi bir ayrım yapmaksızın kuvvetli bir şekilde inhibe ettiği bulunmuştur (Habermeyer ve ark. 2005). Bazı antosiyanidinler ile yapılan çalışmada delphinidin molekülünün en güçlü anjiyogenez inhibitörü olduğu saptanmıştır. In vivo şartlarda delphinidin fare “Matrigel plug assay” sınamasında damar oluşumunu uyaran fibroblast büyüme faktörünü baskılama yeteneğine sahiptir. Delphinidin’in doğal bir VEGFR (vascular endothelial growth factor reseptör) inhibitörü olduğu belirtilmiştir (Lamy ve ark. 2006). Patlıcan (Solanum melanogena) bitkisinden özütlenen ve saflaştırılan delphinidin (10 ve 20 mg/kg v.a.) mikronukleus testinde, farelerin polikromatik mikronukleus frekansını eritrositlerde önemli siklofosfamid seviyede tarafından azaltmıştır. Ayrıca indüklenen delphinidin uygulamasının açık bir mutajenik ya da genotoksik etkisi de saptanmamıştır (Azevedo ve ark. 2007). Kanserli olmayan (iyi huylu) insan meme epitel hücre hattında karsinojen benzo[a]pyrene (BP) bileşiğinin neden olduğu DNA eklenti oluşumları 0.6 µM konsantrasyonundaki delphinidinle anlamlı şekilde engellenmiştir (Singletary ve ark. 2007). Benzer şekilde delphinidin (5-40 µM; 48 saat) meme kanseri (AU-565 ve MCF-10A) hücrelerinde apoptozu indükleyerek büyümeyi geriletmiştir (Afaq ve ark. 2008). Başka bir çalışmanın sonuçlarına göre delphinidin ve cyanidin sadece metastatik kolorektal kanseri hücre hatlarında sitotoksik etki göstermiştir ve anılan bu antosiyanidinlere en fazla hassasiyet gösteren hücre hattı ise çoklu ilaç direncine sahip kolon kanseri LoVo/ADR hücre hattı olduğu ortaya çıkmıştır (Cvorovic ve ark. 2010). İçinde delphinidinin de olduğu bir grup polifenolün etki mekanizmaları ile ilgili edinilen yeni bilgiler, bunların cilt fotoproteksiyonunda ve insandaki fotokarsinogenezin önlenmesinde etkili olarak kullanılabileceğini ortaya koymaktadır (Afaq ve Katiyar, 2011). Dut antosiyanidinlerinin (delphinidin dâhil) karışım halinde kullanımı büyük hücreli akciğer kanseri (NSCLC) hücre hattındaki invazyon ve migrasyonun baskılanmasını, hücre döngü duraklamasını ve apoptozu, tek başına kullanıma göre daha fazla uyarmıştır (Kausar ve ark. 2012). Derisinin altına insan NSCLC (Non-small-cell lung carcinoma) hücreleri implante edilmiş timus bezi eksik farelere delphinidin 21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET muamelesi, kontrol farelerine göre (i) tümör gelişimini anlamlı seviyede inhibe etmiş, (ii) hücre proliferasyon ve anjiogenez markerlarının ifadesini azaltmış ve (iii) apoptozu indüklemiştir (Pal ve ark. 2013). Son zamanlarda yapılmış yeni bir çalışmada gallik asit ve delphinidin-3-glukozit ajanlarının fibrosarkoma hücre hattında seçici sitotoksisite gösterdiği ve gallik asit, delphinidin ve pelargonidin-3glukositlerin anılan hücre hattında yayılmayı engelleyici aktivitelerinin olduğu ifade edilmiştir (Filipiak ve ark. 2014). Glioksalaz l (GLO l), metilglioksalın (MG) detoksifikasyonu için hız sınırlayıcı bir enzim ve apoptozisi indükleyebilen bir glukoliz yan ürünüdür. GLO l normal hücrelerde az ama çoğu tümör hücresinde oldukça fazla eksprese olduğu (ifade edildiği) bilindiği için bu enzimin inhibitörlerinin yeni bir anti kanser ilaç olması beklenmektedir. Bu çalışmada delphinidinin de dâhil olduğu antosiyanidinlerin insan GLO l enzimini inhibe etme yeteneği test edilmiştir. Bunların arasında delphinidin insan GLO l üzerine en yüksek inhibitör etki potansiyeline sahiptir. Üstelik yalnızca delphinidin HL-60 hücrelerinde doz ve zaman bağımlı apoptozu indüklemiştir. Ayrıca bu çalışmada sayısal benzetim analizleri delphinidin, cyanidin ve pelargonidin’in enzimin aktif bölgeleri bağlama modları aracılığıyla delphinidin’in insan GLO l enzimine bağlanması için bir farmakofor 1 belirlenmiştir. Bu sonuçlar, delphinidinin GLO l inhibe edici yeni anti kanser ilaçlarının geliştirilmesi için kullanışlı bir öncü bileşik olduğunu göstermiştir (Takasawa ve ark., 2010). Bio-dönüşüm için seçilen suşlar, ilerleyen enzimatik potansiyellerini araştırmak için delphinidin ve malvinidin glukozitlerinin metabolitleri için Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus casei suşlarının en yüksek hücre-zarf ilişkili b-glukozidaz faaliyet gösterdiği belirlenmiştir. Delphinidinin kimyasal bozulması başlıca gallik asit oluşumuna yol açtığı ve delphinidin iskeletinin bölünen halkasından büyük stabil fenolik asidin türediği Ávila ve ark. (2009) tarafından rapor edilmiştir. Myricetin ve delphinidin STAT1’i (Sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörler) bloke eder böylece ROS (reaktif oksijen türleri) tarafından tümör nekroz Bir ilaç molekülünde biyolojik etkiden sorumlu olduğu düşünülen ve hedef bölge ile en iyi şekilde etkileşerek biyolojik cevabı başlatmak için gerekli özelliklere sahip olan grup. 1 22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET faktörü alfa’nın (TNFa) trankripsiyonunu indükleyerek inhibe eder (Quinton ve ark., 2012). Delphinidin gibi pozitif olarak yüklü flavonoidler DNA sarmalı üzerine, quersetin ya da kaempferol gibi nötr flavonoidlerin DNA iskeletindeki fosfatlarla güçlü elektrostatik etkileşiminden dolayı daha stabil bir etkiye sahiptir (Zhou, 2001; Kanakis, 2006; Hosseinimehr, 2010). Bir antosiyanidin olan delphinidin son derece metastatik olan insan prostat kanser (PCa) hücrelerinde androjen bağımsız ya da androjenden etkilenmeyen tarzda kaspaz aktivasyonu yoluyla apoptozu indüklemiştir. Bu etki NFκB sinyallemesinin inhibisyonu yoluyla da olabilir. Benzer şekilde delphinidin ile muamele edilmiş farelerdeki NF-κB/p65, Bcl2, Ki67 ve PCNA gen anlatımının anlamlı seviyede azaldığı gösterilmiştir (Hafeez ve ark., 2008). 2.1.1.2.(1).e. Europinidin O-metillenmiş bir antosiyanidindir. Suda çözünebilir ve mavimsi kırmızı bir bitki boyasıdır (wikipedia Europinidin ,2015). Nadiren O-metillenmiş bir flavonoid delphinidinin türevi olabilir. Plumbago ve Ceratostigma türlerinin bazılarında bulunabilir (Harborne,1967). 2.1.1.2.(1).f. Hirsutidin Antosiyaninlerin kimyasal bileşenlerinden olan hirsutidin O-metillenmiş bir antosiyanidindir. Catharanthus roseusun (Cezayir menekşesi) taç yaprak ve kallus kültüründe bulunabilen önemli bileşenlerden biridir (Piova ve ark., 1998; Wikipedia hirsutidin 2015). Hirsutidinin 3-O-(6-O-p-coumaroil) glukoziti Catharanthus roseusda (Cezayir menekşesi) bulunmaktadır (Piova ve Filippini, 2007). 2.1.1.2.(1).g. Malvidin Malvidin O-metillenmiş bir antosiyanidindir. Başlıca bitki pigmenti olarak glukozitleri doğada oldukça bol miktarda bulunur. Malvidin, malvinidine ile 23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET karıştırılmamalıdır. Malvidin, primulaceae familyasından çuha çiçeği bitkisi taç yapraklarında mavi renk oluşumundan sorumludur. Farekulağı (Anagallis monelli) bitkisi çiçeklerinde yüksek konsantrasyonda malvidin bulundurur. Başlıca kırmızı şarap renginden sorumludur ve Vitis vinifera malvidin kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kuş kirazı (Aronia sp.) ya da saskatoon (Amelanchier alnifolia) gibi etli ve zarlı kabuksuz meyvelerde bulunur (Mazza, 2005a; Bakowska-barczak, 2007; Phytochemicals, 2015). Malvidin az oranda asidik ve nötr çözeltilerde karakteristik olarak kırmızı renkli, bazik çözeltilerde ise mavi renklidir. Malvidin insan monocytic leukemia hücrelerinde G2/M geçişini durdurarak sitotoksik etki göstermiş ve apoptozu indüklemiştir (Hyun ve Chung 2004). Farklı bir çalışmada malvidin muamelesi insan gastrik adenokarsinom hücrelerinde p38 kinaz ifadesini önemli düzeyde artırmış ERK aktivitesini ise inhibe etmiştir. Ayrıca malvidin kaspaz-3 aktivitesini bloke etmektedir. Malvidinin ilgili hücreler üzerine olan sitotoksik etkisi nekrozdan ziyade apoptoz indüksiyonu ile gerçekleşmektedir (Shih ve ark. 2005). 2.1.1.2.(1).ğ. Pelargonidin Pelargonidin bir bitki pigment olarak bütün antosiyanidinler gibi antioksidanttır. Karakteristik olarak turuncu rengini verir. Pelargonidin kırmızı sardunya (Geraniaceae) çiçeğinde bulunmaktadır. Devetabanında (Araceae) baskın pigmenttir ve kırmızı renk oluşumundan sorumludur. Mavi farekulağının (Anagallis monelli, Myrsinaceae) turuncu renkli çiçekleri yüksek konsantrasyonda pelargonidin pigmentine sahiptir. Pelargonidin olgun ahududu ve çileğin yanı sıra yabanmersini, böğürtlen ayrıca kızılcık ve kuş kirazı gibi etli ve zarlı kabuksuz meyvelerde bulunabilir. Bunların dışında erik ve narda bulunur. Barbunya fasulyesinde büyük miktarda bulunmaktadır (Mazza ve ark., 2005b; Lin ve ark., 2008). Östrojenik aktiviteye sahip bir antosiyanidin olan pelargonidin insan promyelositik leukemia hücrelerinde antioksidatif ve antigenotoksik özellikler göstermiştir (Abraham ve ark. 2007). Doğada en bol bulunan antosiyanidinlerden birisi olan pelargonidin askorbik asitle kombine kullanıldığında fitokimyasalların tek başına kullanımından daha fazla antinitrozasyon etkisi göstermiştir. Sonuç olarak pelargonidin çevresel risk 24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET faktörlerinin neden olduğu genotoksik stresi azaltma yönünde etkiler göstermiştir (Khandelwal ve Abraham 2014). 2.1.1.2.(1).h. Peonidin Peonidin O-metillenmiş bir antosiyanidin üyesi ve başlıca bir bitki pigmentidir. Şakayık gibi çiçeklere eflatuni kırmızı tonlarda renk verir. Gündüzsefası bitkisinin mavi çiçeklerinde bulunur. Çoğu antosiyanidinler gibi pH’ya duyarlıdır ve pH yükseldiğinde rengi kırmızıdan maviye dönüşür çünkü antosiyanidinler son derece konjuge kromoforlardır. pH değiştiğinde konjugasyonun boyutu değişir. Molekül tarafından ışık enerjisinin farklı dalga boyları absorbe edilir. (Doğal antosiyanidinler çok düşük pH ortamında oldukça stabildir ve pH 8’de renksiz olmaktadır.) Çoğu antosiyanidinin aksine peonidin, pH 2’de kiraz kırmızısı, pH 3’de sarımsı pembe, pH 5’de üzüm kırmızı-moru ve pH 8’de ise koyu mavi olmaktadır. Yüksek pH’da stabil olabilmekte ve parlak gündüzsefası (Ipomoea tricolor) bitkisinden izole edilmektedir. Peonidinin olağandışı renk stabilitesinden dolayı kafeil-asetil tamponlanmış formülü gıda boyalarında kullanılmak üzere patenti alınmıştır. Çoğu antosiyanidin gibi kanser hücreleri, özellikle metastatik insan meme kanseri hücreleri üzerine, inhibitör ve apoptotik etki potansiyeli göstermiştir (Kwon ve ark., 2007). Peonidin miktarının meyve boyutu ve ürün verimi arasında ters orantılı olduğu bulunmuştur (Vorsa ve ark., 2002). Peonidin en fazla bulunduğu besin kaynağı ham kızılcık olup her 100 gr kızılcık meyvesi 42 mg, yaban mersini, erik, üzüm ve kirazda her 100 gr meyve için 5-12 mg arasında değişen önemli miktarlarda peonidin içerir. Sadece taze meyvede önemli derecede peonidin olduğu belirlenmiştir; dondurulmuş yaban mersininde hemen hemen hiç saptanmamıştır. Ayrıca ham siyah pirinç ve siyah muzdan da izole edilmiştir (Truong ve ark, 2009). İçinde peonidin de dahil bir grup antosiyanin/antosiyanidin’in fare leukaemic monosit macrofaj hücre hattında (RAW 264.7 macrophages) sitotoksisite yaratmaksızın nitrik oksit (NO) üretimi üzerine güçlü bloke edici özelliği olduğu saptanmıştır (Wang ve Mazza 2002). Lim ve ark. (2013) yaptığı bir çalışmaya göre insan kolon SW480 kanser hücrelerinde, peonidin-3-glukozid (0-40 μM) doza bağlı 25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Mehmet Tahir HÜSUNET tarzda hücre sayısında önemli azalmaya neden olmuştur. Bu sonuç hücre döngünün G1 fazındaki sitotoksik olmayan sitostatik duraklamadan kaynaklanmaktadır. Peonidin’in kanser hücreleri üzerine olan etkilerini araştıran farklı bir çalışmada tedavi gören HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2) pozitif meme kanseri hastalarında siyah pirinçten elde edilen peonidin-3-glukozid tumor büyüklüğü ve hacminde önemli azalmalar sağlamıştır (Liu ve ark. 2013). 2.1.1.2.(1).ı. Petunidin Petunidin O-metillenmiş bir antosiyanidindir. Antosiyanidinlerin özel bir türü ve doğal organik bir bileşiktir. Suda çözünebilen koyu kırmızı ya da mor renkli olan pigment çoğu kırmızı dut, kuş kirazı (Aronia sp), Saskatoon dutu (etli ve zarlı kabuksuz meyve, Amelanchier alnifolia), ya da farklı üzüm türlerinde (örneğin; Vitis vinifera, Vitis rotundifolia) bulunur. Ayrıca çoğu çiçekte taç yaprakların renklenmesinden sorumludur. Bu pigment güneş ışığına maruz kaldığında indigo rose (mor) domates koyu mor renklerinin büyük bir kısmını verir. Molekülün ismi petunia kelimesinden türemiştir (wikipedia-Petunidin, 2015). Molekül 200 microg/mL konsantrasyonunda insan meme kanseri hücre hattında tümör gelişimini %53 oranında inhibe temiştir (Zhang ve ark 2005). 2.1.1.2.(1).i. Pulchellidin Pulchellidin O-metillenmiş bir antosiyanidindir. Pulchellidin mavi-kırmızı bir bitki pigmentidir. Plumbago pulchella (Dişotu) bitkisinde bulunabilir (wikipediapulchellidin, 2015). 2.1.1.2.(1).j. Rosinidin Rosinidin O-metillenmiş bir antosiyanidindir. Catharanthus roseus bitkisinin çiçeklerinde bulunan bir bitki pigmentidir ve Primula rosea bitkisinde düşük konsantrasyonda bulunur (lwashina, 2000; Toki ve ark., 2008). 26 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3. MATERYAL VE METOT Bu çalışmadaki deneylerin tamamı in vitro koşullarda yapılmıştır. Çalışmada test maddesi olarak antosiyanidin alt bileşiklerinden olan delphinidin chloride, deney materyali olarak da sigara, alkol alışkanlığı olmayan ve herhangi bir ilaç kullanmayan, yaşları birbirine yakın (22-24 yaşlarında) sağlıklı ve gönüllü bir kadın ve bir erkekten alınan heparinize edilmiş periferik kan kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan periferal kanın donörden alım öncesi ve sonrası süreçler, “Ç.Ü.T.F. Etik Kurul” izni çerçevesinde yapılmıştır. 3.1. Materyal 3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 3.1.1.1. Delphinidin Chloride (Test Maddesi) Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan delphinidin 3,5,7-trihydroxy-2(3,4,5-trihydroxyphenyl)-1-benzopyrylium chloride, benzopyrylium bileşiğinin klorit tuzudur. Test maddesi patlıcan kabuğu, üzüm, vişne, kiraz, erik, nar, kırmızı, lahana, çilek, turp gibi birçok meyve, sebze ve bitkide doğal bir renk pigmenti oluşturmaktadır. Bu bileşik, delphinidin türevleri içeren meyve ve çiçeklerden hidroliz ürünü olarak elde edilirler. Delphinidin koyu kırmızı/mor renkte bir toz haline getirilerek ticarileştirilmiştir. Bileşik su içinde hidroklorik asiti serbest bırakan bir yapıya sahip olup higroskopik (nem çekici) özellik taşımaktadır. Test maddesi flavonoidlerin ait olduğu doğal kimyasal sınıfından antosiyaninlerin bir üyesidir. Delphinidin chloride etanol, dimetil sülfoksit (DMSO) ve dimetil formamid gibi organik çözücülerde çözünebilir. Delphinidin chloride’in anılan bu çözeltilerdeki çözünürlüğü 30 mg/ml’dir. Bileşiğin stabilitesi için -20 ºC’de saklanmalı ve iki yıldan fazla tutulmamalıdır. Delphinidin chloride’in suda çözünürlüğü oldukça azdır. Suda çözmek için önce etanolde çözünmeli daha sonra seyreltilmelidir. Delphinidin chloride’in etanol:PBS (1:1) pH 7.2’de yaklaşık çözünürlüğü 0.5 mg/mL’dir. Sulu 27 3. MATERYAL VE METOT çözeltilerde hazırlanmış Mehmet Tahir HÜSUNET delphinidin chloride çözeltileri 24 saatten fazla bekletilmemelidir. Kimyasal IUPAC Adı: 2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)chromenylium-3,5,7-triol Diğer Adları: 3,5,7-trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-1 benzopyryliuchloride; 3,5,7-trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-1-benzo- pyryliumchloride; 3’,4’,5,5’,7-hexahydroxy flavyliumchloride, Delphinidin; Delfinidol Chloride; Delphinidine; Delphinidol; Ephdine; IdB 1056 Kapalı Formülü: C 15 H 11 CIO 7 Açık Formülü: Şekil 3.1 Molekül Ağırlığı: 338.7 Saflık düzeyi: ≥%97 Sinonim: Ephdine Kararlılık: 2 yıl, -20 °C’saklanmalı Şekil 3.1 Delphinidine’in molekülünün açık formülü Cas No: 528-53-0 EINECS No: 208-437-0 Çözünürlük: DMSO, etanol dimetil formamid içinde Tedarik Şekli: Katı kristal Üretici Firma: Cayman Chemical 3.1.1.2. Entellan (Merck No: 7961) Entellan, çeşitli sentetik reçinelerden oluşan akıcı ve şeffaf bir yapıdadır. Kuruduktan sonra hava kabarcığı oluşturmayan preparat kapatma solüsyonudur. Preparatın üzerine bir enjektör yardımıyla damla veya şerit halinde aktarılır. Preparatların uzun süre korunması için lam ve lamelin birbirlerine daimi olarak yapıştırılmasında kullanılmıştır. 28 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.1.1.3. Etil Alkol (Sigma No: 32205) Deneyin birçok aşamasında sterilizasyon amaçlı %70’lik etil alkol hazırlanarak yüzeylerin ve kullanılan araç-gereç ve materyalin temizlenmesinde kullanılmıştır. 3.1.1.4. Fiksatif Kromozom anormalliği (KA) deneyinde glasiyel asetik asit:metil alkol (1:3 v/v) ile hazırlanan Carnoy fiksatifi kullanılmıştır. Mikronukleus (MN) deneyleri içinse iki farklı fiksatif hazırlanmıştır. Birinci fiksatif; 1 hacim glasial asetik asit 5 hacim metanol ile karıştırıldıktan sonra elde edilen çözelti 1/1 oranında %0.9 NaCl ile karıştırılarak (1:5:6 v/v/v) hazırlanmıştır. İkinci fiksatif; yukarıda bahsedilen 1/5 glasial asit/alkol karışımına %0.9’luk NaCl ilave edilmeden kullanılmıştır (Kayraldız ve ark., 2010). Fiksatif kullanılmadan iki saat önce hazırlanmakta ve soğuması için +4ºC’de saklanmıştır. Her deney için preparat yapım işleminden iki saat önce taze olarak hazırlanmış ve +4ºC’de saklanmıştır. 3.1.1.5. Giemsa (Merck No: 9204) Giemsa boyası DNA’daki fosfat grupları için spesifik olup DNA’nın adenintimin (A-T) açısından yoğun olduğu bölgelere kolay bir şekilde bağlanarak DNA’nın boyanmasını sağlar. Giemsa boyası içeriği; boya metilen mavisi, eozin ve azure B’nin karışımından oluşmakta, gliserol ve metanol içinde hazırlanmaktadır. Preparatların boyanmasında kullanılan giemsa boyası ticari olarak üretilen hazır formülü satın alınmıştır. %5’lik Sorensen tamponu A (pH 4.8) ve %5’lik Sorensen tamponu B (pH 9.3) içinde taze hazırlanmış boya eriyiği, filtre edildikten sonra %5’lik giemsa %85 distile su ile tamamlanarak kromozomların ve mikronukleus testinde nukleusların boyanması için kullanılmıştır. 29 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.1.1.6. Hipotonik Eriyik Çalışmada %0.4’lük KCI (Merck No: P9333) hipotonik çözelti olarak kullanılmıştır. Çözelti bidistile su içerisinde stok halinde hazırlanarak, kapalı cam şişe içerisinde (+4°C) saklanmıştır. Yapılan her deneyden yaklaşık iki saat önce yeterli miktarda hipotonik eriyik alınmış, inkübatörde 37°C’ye kadar ısıtılarak kullanılmıştır. Hipotonik çözeltinin yoğunluğu hücre plazmasının yoğunluğundan daha az olduğu için lenfositlerin şişmesini ve preparasyonun kaliteli olmasını sağlamaktır. 3.1.1.7. Kolşisin (Sigma No: C9754) Kolşisin saf kristal tuz halinde (Colchicine) hazır olarak satın alınmıştır. Bu kimyasal madde bir alkoloiddir. Kolşisin mitotik iğ ipliklerinin oluşumunu engellediği için kromozomların kutuplara çekilmesini engeller. Böylece incelenecek kromozomların metafaz evresinde kalması sağlanır. Kolşisin çözeltisi distile su içerisinde hazırlanır ve kromozom medyumunun her mililitresinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06 µg/mL) 2.5 mL’lik kromozom medyumuna inkübasyonun sona ermesinden iki saat önce 10 µg hacim içerisinde ilave edilmiştir. Kolşisin’in kimyasal teknik özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Colchicine Kapalı formülü: C 22 H 25 NO 6 Açık formülü: Şekil 3.3. Molekül ağırlığı: 399.4 Etil asetat içeriği: %3.4 Şekil 3.2. Kolşisin’in açık formülü Kloroform içeriği: < %0.1 3.1.1.8. Kromozom Medyumu (PB-Max No: 12552-013) Bu çalışmada Gibco marka (PB-Max) kromozom medyumu hücre kültürü için kullanılmıştır. PB-Max içerisinde fetal buzağı serumu (BSA), L-glutamine, 30 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET gentamicin sulfate ve phytohemagglutinin gibi maddeler bulunmaktadır. Bu kromozom medyumu steril kültür tüplerine 2.5 mL olacak şekilde steril ortamda paylaştırılmış ve deney için bu miktarlar kullanılmıştır. Arta kalan paylaştırılmış kromozom medyumu -20 ºC’de saklanmıştır. 3.1.1.9. Mitomisin C (MMC) (Sigma No: Y0000378) Bu çalışmada kuvvetli bir mutajen olduğu bilinen mitomisin C, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Mitomisin C steril saf suda çözülerek stok çözelti hazırlandıktan sonra kültür tüplerine son konsantrasyonu 0.25 µg/mL olacak şekilde 10 µl içerisinde ilave edilmiştir. Kimyasal adı: 6-Amino-1,1a,2,8,8a,8b-hexahydro-8-(hydroxymethyl)-8a- methoxy- 5-methyl-azirino[2',3':3,4] pyrrolo[1,2-a]indole-4,7-dionecarbamate (ester) Kapalı formülü: C 15 H 18 N 4 O 5 Açık formülü: Şekil 3.4. Molekül ağırlığı: 334.33 g/mol Erime noktası: >360ºC CAS No: 50-07-7 Şekil 3.3. Mitomycin C’nin açık formülü 3.1.1.10. Nitrik Asit (HNO 3 Sigma 438073) Kuvvetli bir asit olan nitrik asit ve HNO 3 formülüyle gösterilir. Nitrik asitin konsantrasyonu arttıkça tehlikesi artar bu yüzden istenilen konsantrasyon dikkatli bir şekilde hazırlanmalıdır. MN ve KA testlerinde kullandığımız lamları temizlemek amacıyla 1N HNO 3 çözeltisi kullanılmıştır. Lam temizleme solüsyonu laboratuarda ağzı kapalı uygun plastik bir kapta saklanarak her defasında tekrar tekrar kullanılmıştır. 31 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.1.1.11. Sitokalasin B (Sigma) Mikronukleus (MN) testinde, hücre bölünmesi sırasında sitokinezi durdurarak iki nukleuslu hücreler elde etmek amacıyla kullanılmıştır. Çözeltinin son konsantrasyonu 6 µg/mL olacak şekilde %50’lik alkol içerisinde çözünerek hazırlanmıştır. Kimyasal adı: Cytochalasin B Kapalı formülü: C 29 H 37 NO 5 Açık formülü: Şekil 3.5. Molekül ağırlığı: 479.61 g/mol Erime noktası: 218-223ºC Şekil 3.4. Sitokalasin B’nin açık formülü Kaynama noktası: 218-223ºC Saflık düzeyi: %98 CAS No: 14930-9 Sigma No: C-6762 3.1.1.12. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) Ortamın pH dengesini düzenlemek için kullanılan bu tampon, kardeş kromatid değişimini incelemek amacıyla preparat boyama sırasında preparatlar tampon karışımı içerisinde ultraviyole (UV) lambası ile ışınlandırılmaktadır. Bu çalışmada sorensen tamponu sadece %5’lik Giemsa boyası hazırlanmasında da kullanılmıştır. Bu çözelti, Tampon A ve Tampon B olarak iki stok çözelti halinde hazırlanmakta ve çalışmanın amacına göre uygun oranlarda birbirleriyle karıştırılarak kullanılmıştır. Tamponların Hazırlanışı: Tampon A: 11.34 gr KH 2 PO 4 250 mL saf su içinde eritilmiştir (pH=4.8). Tampon B: 14.83 gr Na 2 HPO 4 .12H 2 O 250 mL saf su içinde eritilmiştir (pH=9.3). 32 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET %5’lik Giemsa boyası tampon A, tampon B ve Giemsa boyasından 5’er ml, distile sudan 85 ml alınarak hazırlanmış ve boya eriği filtre kağıdından süzüldükten sonra kullanılmıştır. 3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları 3.1.2.1. Benmari (Su Banyosu) Isıyı homojen bir şekilde dağıtma özelliğinden dolayı DNA izolasyonu aşamasında örneklerin gerekli sıcaklıkta inkübasyonu için Nüve BM 302 marka su banyosu kullanılmıştır. 3.1.2.2. Flow Kabin (Steril Kabin) Kromozom medyumunu hücre kültür tüplerine paylaştırma, kan ekimi, steril test çözeltilerini hazırlama ve kültür tüplerindeki hücrelerin test maddesi ile muamelesi sırasında steril ortamın sağlanması için flow kabin kullanılmıştır. Kullandığımız flow kabin % 99.9 partikül tutma özellikli filtreye sahiptir. Ayrıca 1500 m3/h emiş kapasiteli, hem UV hem de floresan lambası olan ve çalışma alanı şeffaf cam paravanla sınırlandırılmış steril ortam oluşturan bir alettir. 3.1.2.3. Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve 0.0001 gr hassasiyetindeki Gec Avery marka terazi katı kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır. 3.1.2.4. İnkübatör Hücre kültürlerinin inkübasyonunda ve çözeltilerin 37 ºC’de sabit sıcaklıkta tutulmasında 0 - 100 ºC ayarlanabilir Incucell marka inkübatör kullanılmıştır. 33 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.1.2.5. Manyetik Karıştırıcılı Isıtıcı Bazı çözeltileri hazırlamak için Chiltern Hotplate HS31 marka karıştırma devri ve ısıtma sıcaklığı ayarlanabilir manyetik karıştırıcılı ısıtıcı tabla kullanılmıştır. 3.1.2.6. Mikroskop Preparat incelemeleri sırasında immersiyon objektifli (100X) ve koordinat cetveli olan Olympus marka bioküler ışık mikroskobu kullanılmıştır. Fotoğraflar ise digital fotoğraf makinalı Olympus BX51 marka bilgisayar bağlantılı mikroskopta çekilmiştir. 3.1.2.7. Otoklav Kullanılan deney ekipmanlarının ve çözeltilerin sterilizasyonu Hirayama marka otoklav ile sağlanmıştır. Sterilizasyon işlemi, 121 ºC sıcaklık ve 1.2 atm basınçta 20 dk. süre ile gerçekleştirilmiştir. 3.1.2.8. pH Metre Deneyde kullanılan özeltilerin pH değerlerini belirlemek için WTW 315i (Germany) marka pH metre kullanılmıştır. 3.1.2.9. Santrifüj MN ve KA deneylerinde kültürdeki lenfositleri çöktürmek için rotor çapı 21 cm olan ve 4000 rpm’e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk.’lık zaman ayarlayıcı, 34 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET açılabilir başlığa sahip ve 28 tüp kapasiteli Hettic Universal marka santrifüj kullanılmıştır. 3.1.2.10. Vorteks Örneklerin karıştırılması için farklı hız kademeleri olan Velp Scientifica marka vorteks cihazı kullanılmıştır. 3.1.3. Lamların Temizlenmesi MN ve KA testleri için yapılan hücre kültürünün süresinin bitimesinden 1-2 gün önce çift tarafı rodajlı olan lamlar şalelere yerleştirilerek üzerlerine 1 N nitrik asit (HNO 3 ) ilave edilmiştir. Şalelerin ağzı kapatılarak bu şekilde 24 saat bekletildikten sonra lamlar yarım saat akan çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. Daha sonra 3-4 defa saf sudan geçirildikten sonra içinde lam bulunan şaleler saf su ile doldurularak buzdolabında (+4˚C) saklanmıştır. 3.1.4. Sterilizasyon Deney aşamasında kullanılan cam malzemeler, pipet uçları, ependorf tüpler, PCR tüpleri vs. tüm araç gereçler alüminyum folyo ile sarıldıktan sonra otoklav bandı ile bağlanmıştır. Daha sonra 121 ºC sıcaklık ve 1.2 atm basınçta 20 dk. süre ile sterilizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. 3.2 Metot 3.2.1.Kromozom Anormalliklerinin (KA) Saptanması Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İnceleme 35 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET Bu tür deneysel çalışmaların planlanması, uygulanması ve yorumlanmasında uluslararası yönergelerde belirtilen standartlara göre hareket edilme zorunluluğu bulunmaktadır. Bundan dolayı test maddesi delpdinidin chloride’in insan lenfositlerindeki genotoksik etkilerinin olup olmadığının araştırıldığı bu çalışmada, Albertini ve ark. (2000)’ları tarafından yayınlanan Uluslararası Kimyasal Güvenlik Programı (The International Programme on Chemical Safety = IPCS) yönergesi dikkate alınmıştır. 3.2.1.1 Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması Bu çalışmada KA’yı belirlemek için hücre kültürünün yapılması ve preparatların hazırlanması Evans (1984), Perry ve Thompson (1984)’un metotları dikkate alınarak gerçekleştirilmiştir. Yaşları birbirine yakın (22 ve 24 yaşlarında), sağlıklı, sigara ve alkol alışkanlığı olmayan ilaç kullanmayan gönüllü bir bayan ve bir erkekten alınan 1/10 heparinize edilmiş periferik kanın 0.2 mL’si (10 ml’lik enjektör ile 6 damla) 2.5 mL kromozom medyumuna (PB-Max) ilave edilmiştir (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991). Kandan 6 damla (0.2 ml) ilave edildikten sonra tüpler 72 saat boyunca 37°C’deki inkübatörde kültüre alınmıştır. Delphinidin chlorid’in genotoksik etkisini ortaya çıkarmak için, ön çalışmalarla belirlenen toksik olmayan dört konsantrasyonunu (25 µM, 50 µM, 75 µM ve 100 µM) dimetilsülfoksit (DMSO) çözülerek toplam hacim 3 µL olacak şekilde, kültürün başlangıcından 48 veya 24 saat sonra kültür tüplerine ilave edilmiş ve hücrelerin test maddesiyle 24 veya 48 saat boyunca muamele edilmeleri sağlanmıştır. Ayrıca çözücü kontrol veya pozitif kontrol tüplerine de kültürün bitiminden 24 veya 48 saat önce DMSO (3 µL/2.7 mL) veya MMC (0.25 µg/mL) ilave edilmişlerdir. MMC’nin etkisine karşı delphinidin chloride’in etkisini ortaya çıkarmak için de ayrı bir kültür serisinde her bir kültür tüpüne test maddesine ilaveten MMC (0.25 µg/mL) eklenmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (yani kültürün 70. saatinde) hücreleri metafaz evresinde durdurmak için her tüpe hazırlanan kolşisin çözeltisinden (0.06 μg/mL) olacak şekilde 10 μl ilave edilmiş ve her muamele sonrası tüpler hafifçe sallanarak ilave edilen maddenin iyice dağılması sağlanmıştır. Kültür süresi olan 72. saatin 36 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET bitiminde tüplerdeki hücreler 2000 devir/dk (rpm)’da 5 dk. süreyle açılır başlıklı santrifüjde santrifüj edilerek çöktürülmüştür. Süpernatant (üst faz), total oksidan ve total antioksidan seviyeleri (TOS ve TAS) ölçümü için sızdırmaz 2 mL ependorf tüplere aktarılmış ve -80 ºC’de saklanmıştır. Dipte kalan ve hücreleri içeren 0.5-0.7 mL’lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra üstüne ılık (37°C) hipotonik çözelti (%0,4 KCl) ilave edilmiştir. Hücrelerde kümeleşmeyi engellemek için hipotonik çözelti (%0,4 KCl) ilavesi damla damla ve yavaşça karıştırılarak yapılmıştır. Her tüpe yaklaşık 10 mL hipotonik çözelti (%0,4 KCl) ilave edildikten sonra kapatılarak 8 dk. süresince inkübatörde 37°C’de hücrelerin şişmeleri için hücre süspansiyonu bekletilmiştir. Sürenin sonunda inkübatörden çıkarılan tüpler 10 dk. 1200 devir/dk santrifüj edilerek süpernatant atılmıştır. Ardından taze hazırlanmış soğuk fiksatif (1/3, asetik asit/metanol) damla damla ve yavaşça karıştırarak her tüpe yaklaşık 10 mL olacak şekilde ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm’de 10 dk. çöktürülmüş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar aynı şekilde fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem toplamda 3 kere aynı şekilde tekrarlanmış ve 3. fiksatif muamelesinin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvıda berraklaşma olmamışsa tekrar fiksatif muamelesine devam edilmiştir. Her fiksatif ilavesinden sonra tüpler santrifüj edilerek üst faz dikkatli bir şekilde atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte 0.5-0.7 mL sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra daimi preparat hazırlama işlemine geçilmiştir. Tüpün dibinde toplanan hücreler pastör pipeti ile hava verilerek homojen halde dağılması sağlanmıştır. Pipet içine 4-5 damla alacak şekilde bu hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Daha önceden özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pastör pipeti ile daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında bekletilen lamların üzerine 50 cm yükseklikten farklı alanlara hücre süspansiyonu damlatılarak (her lama 3-4 damla) hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Lamların soğuk olması kromozomların yapışmasını kolaylaştırmaktadır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar 37 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET kurumak üzere 24 saat oda sıcaklığında üzeri toz olmayacak şekilde kapatılarak bekletilmiştir. 3.2.2. Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması 3.2.2.1. Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması Bir bayan ve bir erkekten hazırlanan preparatlardan iyi dağılmış kromozomlara sahip 100 metafaz (2 kişiden toplam 200 metafaz) kromozomal anormallikleri saptamak amacıyla incelenmiştir. İncelenen hücreler içinde gözlediğimiz kromozom yapı ve sayı anormallikleri Uluslararası İnsan Sitogenetik Adlandırma Sistemine (ISCN= International System for Human Cytogenetic Nomenclature) uygun olarak değerlendirilmiş ve isimlendirilmiştir (Paz-y-Mino ve ark., 2002). Her bir kişiye ait preparatlarda incelenen bu 100 hücre içinde hücre başına düşen yapısal ve sayısal kromozom anormalliklerinin sayısı ile anormallik içeren hücrelerin yüzdesi (KA/hücre) hesaplanmıştır. Bu çalışmada gap (açık renk kromatid bölgesi) yapısal bir anormallik olarak değerlendirilmemiştir. Gap ile kromatid ve kromozom tipi kırıklar arasındaki yapısal fark, Kauderer ve ark. (1991) göre ayırt edilmiştir. Buna göre kromatidin birinde (kromatid tipi gap) veya her ikisinde (kromozom tipi gap) görülen boyanmamış bölge bir kromatidin genişliğine eşit veya ondan daha az ise bu gap olarak kabul edilmiştir. Kırıklarda ise boyanmayan bölgeler kromatidin genişliğinden daha fazladır. İşte bu gözlemsel ölçülere göre gap ve kromatid ve kromozom kırıkları ayrı ayrı belirlenmiştir. Bu durumu Mace ve ark. (1978) ise gap bölgesinde DNA ipliğinde kırık olmadığını elektron mikroskobu fotoğraflarıyla ispatlamıştır. Bu çalışmada incelemeler yapılırken kromatid kırığı ve tek kol birleşmesi gibi anormallikler kromatid tipi anormallik olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca bunun dışında kromozom kırığı, kardeş kromatid birleşmesi, kromatid değişimi, halka kromozomu ve disentrik kromozom oluşumu gibi anormallikler de kromozom tipi anormallikler olarak değerlendirilmiştir. 38 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.2.2.2. Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Delphinidin chloride’nin mitoz bölünme üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla mitotik indeks hesaplanmıştır. Bunun için her muameleye ait preparatlardan toplam 3.000 hücre (2 kişide toplam 6.000 hücre) incelenmiş ve bu hücreler arasındaki metafaz evresinde olan hücreler belirlenerek kaydedilmiştir. Her bir preparat için 3.000 hücre içerisinde, toplam metafaz evresindeki hücrenin oranı yüzde cinsinden hesaplanarak mitotik indeks belirlenmiştir. 3.2.3 Mikronukleus (MN) Oluşumunu Belirlemek Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler 3.2.3.1. Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması Aşaması Mikronükleus testi için hücre kültürünün yapılması Rothfuss ve ark. (2000)’nın tarafından geliştirilen yöntem bazı değişiklikler yapılarak kullanılmıştır. Sağlıklı, sigara ve alkol alışkanlığı olmayan ve ilaç kullanmayan yaşları birbirine yakın (22 ve 24 yaş) sağlıklı ve gönüllü bir bayan ve bir erkekten alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan örnekleri 2.5 mL’lik kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 mL) ekilmiştir (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991). Daha sonra kan ekimi yapılan hücre kültürü inkübatörde 37±0.5°C’de 68 saat boyunca inkübe edilmiştir. Delphinidin chloride’in genotoksik etkisini incelemek için, daha önce belirlenmiş olan konsantrasyonlardaki (25 µM, 50 µM, 75 µM ve 100 µM) delphinidin chloride dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde çözülerek toplam hacim 3 µL olacak şekilde kültür tüplerine ilave edilerek hücrelerin 24 veya 48 saat boyunca muamele edilmeleri sağlanmıştır. MMC’nin etkisine karşı delphinidin chloride’in etkisini ortaya çıkarabilmek için de kültür tüplerine test maddesine ilaveten MMC (0.25 µg/mL) eklenmiştir. İki nukleuslu hücre oluşumunu sağlamak için kültürün 44. saatinde her bir tüpe 10 µl içerisinde 6 μg/mL olacak şekilde sitokalasin B ilave 39 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET edilmiştir. Ayrıca çözücü kontrol (DMSO) ve pozitif (0.25 µg/mL MMC) kontrol tüplerine de kültürün bitmesinden 24 veya 48 saat önce DMSO (3 µl/2.7 mL) ve MMC (0.25 µg/mL) ilave edilmiştir. Kültür süresi bittikten sonra (68. saat) kültür tüpleri 2000 rpm’de 5 dk. santrifüj edilerek, süpernatant (üst faz) uzaklaştırılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri içeren 0.5-0.7 mL’lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere ılık (37°C) hipotonik çözeltiden %0.4’lük KCI her tüpe (yaklaşık 10 mL) yavaş yavaş ilave edilerek 5 dk. süreyle 37°C inkübatörde bekletilmiştir. Sürenin sonunda inkübatörden çıkarılan tüpler 10 dk. 1200 devir/dakika santrifüj edilip hücreler çöktürülerek süpernatant uzaklaştırılmıştır. Bu işlemin ardından her bir tüpe yaklaşık 10 mL soğuk fiksatif dikkatli bir şekilde yavaşça ve karıştırarak ilave edilmiştir. Birinci fiksatif; 1 hacim asetik asit 5 hacim metil alkol karışımının 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. Birinci fiksatif eklendikten sonra oda sıcaklığında 15 dk. bu fiksatifle oda sıcaklığında muamele edilerek süre sonunda hücreler 1200 devir/dak. 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra tüplere birinci fiksatiften farklı bir fiksatif (1 hacim asetik asit 5 hacim metil alkol) ilave edilerek bu işlem iki kere daha aynı şekilde tekrarlanmıştır. Her fiksatif ilavesinden sonra hücreler santrifüj edilerek üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte 0.5-0.7 mL sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra her bir tüpün dibinde toplanmış olan hücreler ile preparatları hazırlamak üzere resüspanse edilmiştir. Daha sonra hücre süspansiyonu buzdolabında bekletilen soğuk ve temiz lamlar üzerine 10-20 cm yükseklikten damlatılarak preparatlar hazırlanmıştır. 3.2.3.2 Preparatların Boyanması Hazırlanan preparatlar içerisinde Sorensen tampon A ve sorensen tampon B ile hazırlanmış %5’lik Giemsa boyası ile boyanmıştır. 5 mL tampon A, 5 mL tampon B ve 5 mL Giemsa boyasından alındıktan sonra üzerleri saf su ile 100 mL’ye tamamlanarak %5’lik Giemsa boyası hazırlanmıştır (pH=6.8). Sonra hazırlanan bu boya dik bir şale içine kaba filtre kâğıtları ile süzüldükten sonra boyanın üzerinde kalan film tabaka küçük filtre kâğıtları ile birkaç kez temizlenmiştir. Preparatlar direkt olarak boya içerisine konmuş ve boyanın üretim tarihine bağlı olarak yaklaşık 40 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 5- 8 dk. boya içerisinde bekletilmiştir. Bu işlemin sonunda preparatlar boyadan alınıp üç ayrı kaptaki saf su içinden geçirilerek preparatların üzerindeki fazla boyanın uzaklaşması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette uygun zeminlere yerleştirilip üzeri kapatılarak kurumaya bırakılmıştır. Kuruyan preparatların üzerine entellan damlatılarak ya da şerit halinde çekilerek önceden 1 N HNO 3 ile temizlenmiş olan lameller ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan kuruduktan sonra hazırlanan bu daimi preparatların mikroskobik incelemeleri yapılmıştır. 3.2.3.3 Mikroskobik İnceleme Hazırlanmış olan MN daimi preparatları Olympus marka binoküler ışık mikroskobunda 40X’lık objektif ile incelenmiştir (10x40=400 kat büyütmede). Preparatlar incelenirken hazırlanan her bir preparattan 1000 adet iki nukleuslu hücre olacak şekilde (2 kişiden toplam 2000 binükleer) hücre incelenmiş ve içerisindeki mikronukleuslu olanlar belirlenmiştir. Mikronukleuslu olan binükleer hücre sayısı toplam binükleer (1000 adet) hücre sayısına oranlanarak mikronukleuslu binükleer hücre yüzdesi bulumuştur. Ayrıca hazırlanan her bir preparattan 1000 adet hücre sayılarak, bu hücreler arasından bir, iki, üç ve dört nukleuslu olan hücrelerin sayıları tespit edilmiştir (Şekil 3.6, Şekil 3.7). Bu oran esas alınarak Nukleus Bölünme Indeksi (NBI) hesaplanmıştır (Fenech, 2000). NBI hesaplanırken işlemler aşağıdaki formüle göre yapılmıştır; NBI= (1xN1 + 2xN2 + 3xN3 + 4xN4) / N N1: Bir nükleuslu hücre sayısı N2: İki nükleuslu hücre sayısı N3: Üç nükleuslu hücre sayısı N4: Dört nükleuslu hücre sayısı N: Sayılan toplam hücre 41 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET Şekil 3.5. Bir (a) ve iki (b) nükleus içeren hücreler (x400). Şekil 3.6. Üç (a) ve dört (b) nükleus içeren hücreler (x400). 42 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.2.4. Toplam Oksidan (TOS) ve Antioksidan Seviyesi (TAS) Ölçümü TOS ve TAS değerlerini ölçmek için 72 saat muamele edilmiş hücre kültürlerinin birinci santrifüjü sonunda alınan ve -80 ºC’de saklanan süpernatantlar kullanılmıştır. TOS değerlerinin ölçülme prensibi, numune içindeki mevcut oksidanların, divalent demiri (ferrous iyon = Fe+2) trivalent demire (ferric iyon = Fe+3) okside etme esasına dayanmaktadır. Ferrik iyon asidik bir tampon varlığında kromojenle renkli bir kompleks oluşturur. Numunede var olan oksitleyici moleküllerin miktarıyla orantılı olan bu renk değişimi spektrofotometrik olarak ölçülmektedir. Test hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ile kalibre edilir. Sonuçlar litre başına mikromolar hidrojen peroksite (H 2 O 2 ) eşdeğer (µmol eşdeğeri H 2 O 2 /L) şekilde ifade edilmektedir (Erel, 2005). TAS değerlerinin ölçülmesi ise yapısı oldukça kararlı ve karakteristik bir rengi olan ABTS (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sülfonik asit)) radikal katyonunun antioksidanlar tarafından renginin ağartılması prensibine dayanmaktadır. Ölçüm sonuçları mmol Trolox eşdeğeri/L şeklinde ifade belirtilmiştir (Erel, 2004). Oksidatif stres indeksinin (OSI) hesaplanması aşagıdaki gibidir: OSI (rastgele ünit) = TOS (µmol H 2 O 2 eşdeğer/L) / TAS (µmol Trolox eşdeğer/L) (Harma ve ark, 2003; Kösecik ve ark, 2005; Yumru ve ark,2009). TAS ve TOS değerleri, ticari faaliyet gösteren Baran Medikal (Ankara) (ISO 14001:2004 Çevre Yönetim Standardı sertifikasına sahip, Sertif. No: T14.001.09) laboratuarlarına dışardan hizmet alımı şeklinde yapılmıştır. 3.2.5. Mikroskopta Fotoğraf Çekme Tezde kullanılan fotoğraflar Olympus marka trinoküler mikroskoba bağlı dijital fotoğraf makinesinde 1000 kat büyütmede çekilmiştir (Olympus CX31RTSF, 7.1 Megapixel). Bu çalışmada KA testinde sık rastlanan ve çeşitli anormalliklerin, MN testinde mikronukleuslu binukleer hücrelerin ve 1, 2, 3, 4 nukleuslu hücrelerin fotoğrafları çekilmiştir. 43 3. MATERYAL VE METOT Mehmet Tahir HÜSUNET 3.2.6. İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi Mikroskobik inceleme sonucunda elde edilen KA, MI, MN ve NBI parametrelerine ait verilerin normal dağılım gösterip göstermediği KolmogorovSmirnov (K-S) testi ile kontrol edilmiştir. KA, MI, MN, NBI ve OSI parametrelerine ait verilerin istatistik analizleri Anova Dunnet Testi ile yapılmıştır. 44 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Bulgular 4.1.1. Delphinidin Chloride’in Kromozom Aberasyonu (KA) Oluşumu Üzerine Etkisi Artan konsantrasyondaki (25, 50, 75 ve 100 μM) delphinidin chloride ile 24 veya 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde çeşitli tip ve sayıda kromozom anormallikleri (KA) saptanmıştır. Belirlenen anormalliklerin iyi görünenlerinden bir kısmı fotoğraflanmıştır (şekil 4.1. - Şekil 4.6.). Kromozomal anormallikler içerisinde en sık rastlananı kromatid (Bʹ) tipi kırıklardır (Şekil 4.1.). Bu tip anormalliği; kromozom kırığı (Bʹʹ), kromatid değişimi (KD) (Şekil 4.4.), kromatid tipi fragmet (Fʹ) (Şekil 4.6.), kromozom tipi fragment (Fʹʹ), sister union (SU) ve translokasyon (T) anormallikleri takip etmektedir (Çizelge 4.1). Şekil 4.1. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi kırıklar (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) 45 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Şekil 4.2. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi kırık (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) Şekil 4.3. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (x1000) (100 µM, 48 saat, ♂) 46 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Şekil 4.4. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) Şekil 4.5. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde kromatid değişimi (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) 47 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Şekil 4.6. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi fragment (x1000) (100 µM, 48saat, ♂) Muamele edilmiş kültürlerde, delphinidin chloride’in klastojenik etkisiyle bağlantılı olarak ortaya çıkan kromozom anormalliği (KA) bulguları ile kontrol ve çözücü kontrolden (ÇK, DMSO) elde edilen KA bulguları arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmada test maddesinin hiçbir konsantrasyonu ve uygulama süresinde, anormal hücre yüzdelerini ve hücre başına düşen anormallik (KA/hücre) oranlarını önemli düzeyde etkilemediği anlaşılmıştır (P>0.05) (Çizelge 4.1.). Muameleler sonucu ortaya çıkan dalgalanmalar güven sınırları içinde kaldığı için istatistiksel anlam bulunmamıştır. Bir hücre döngüsü (24 saat) boyunca test maddesine maruz kalan kültürlerde çeşitli oranlarda KA bulgularına rastlanmıştır. Bu periyottaki muamelede en düşük KA oranı, en düşük konsantrasyonda (25 µM), en yüksek KA oranı (4,0±1,0) ise 75 µM konsantrasyonda rastlanmıştır. Test maddesinin farklı konsantrasyonlarında tespit edilen hücre başına düşen anormallik (KA/Hücre) oranları da, KA bulgularıyla aynı düzlemde çıkmıştır (Çizelge 4.1.). İki hücre döngüsü (48 saat) boyunca test maddesine maruz kalan kültürlerde saptanan KA bulgularında bir dizi önemsiz dalgalanmalar gözlenmekle birlikte konsantrasyon arttıkça KA bulgularında 48 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET azalmalar dikkat çekmiştir. En düşük KA en yüksek konsantrasyonda rastlanmıştır. En fazla kromozom anormalliğine ise 50 µM konsantrasyonda rastlanmıştır. Hücre başına düşen anormallik oranı küçük farklara rağmen benzerlikler göstermektedir. Test maddesinin antigenotoksisite potansiyeli ortaya çıkarmaya yönelik olarak yapılan çalışmalarda test maddesine ilaveten etkili miktardaki MMC muamelenin (24 saat) bütün konsantrasyonlarında delphinidin chloride, mitomycin C (MMC)’nin neden olduğu KA frekansını önemli ölçüde azaltmıştır (P<0.01). Test maddesi, MMC’nin oluşturduğu normallik oranını yaklaşık %50 gibi yüksek bir düzeyde azaltmıştır (Şekil 4.7.). KA/Hücre frekansı da anormal hücre frekansıyla paralellikler göstermiştir. Test maddesi ile yapılan 48 saatlik muamelenin bütün konsantrasyonlarında ise hem anormal hücre hem de KA/Hücre bulgularında herhangi bir istatistiksel önem saptanmamış olup antigenotoksisite yönünden dikkate değer bir sonuç bulunmamıştır (P>0.05). Bu periyotta en düşük KA oranı yine en yüksek konsantrasyonda gözlenmiştir (Çizelge 4.1.). Anormal Hücre (%) 35 30 25 d2 20 d2 d2 d2 15 10 5 0 MMC (PK) 25 µM+MMC 50 µM+MMC 75 µM+MMC 100 µM+MMC Şekil 4.7. Delphinidin chloride ilaveten MMC ile 24 saat muamele edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde ortaya çıkan anormal hücre bulguları. 49 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Çizelge 4.1. Farklı Konsantrasyonda Delphinidin Chlorid ile 24 veya 48 Saat Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri Anormal Hücre Yüzdesi ve KA/Hücre Oranı* Anormallik Çeşitleri Muamele Test Maddesi Süre (Saat) Kons. (µM) Bʹ Bʹʹ Fʹ Fʹʹ T KD SU Anormal Hücre Yüzdesi ± SH KA/Hücre ± SH Kontrol - - 2 - 1 - - - 1,5 ± 0,5 0,015 ± 0,01 DMSO (ÇK) 24 3 µL 2 2 1 - - - - 2,5 ± 1,5 0,025 ± 0,02 MMC (PK) 24 0.25 µg/mL 37 25 13 6 - 4 - 30,5 ± 5,5 0,425 ± 0,03 Delp. Chlr. 24 25 3 3 4 - - - - 0,5 ± 0,5 c 3 0,050 ± 0,05 c 3 50 2 0 1 - - - - 1,5 ± 0,5 c 2 0,015 ± 0,01 c 3 75 1 2 2 1 - - - 4,0 ± 1,0 c 2 0,040 ± 0,01 c 3 100 3 - - - - - - 1,5 ± 1,5 c 2 0,015 ± 0,02 c 3 3 µL - 2 1 - - - - 1,5 ± 0,5 0,015 ± 0,01 61 14 - - 27 - 47,5 ± 7,5 a 2 0,995 ± 0,03a 1 DMSO 48 MMC 48 0.25 µg/mL 59 Delp. Chlr. DMSO +MMC Delp. Chlr.+MMC DMSO +MMC ** Delp.Chlr. +MMC ** 48 24 24 48 48 25 4 1 - - - - - 2,5 ± 0,5 c 3 0,025 ± 0,01 c 3 50 3 5 - - - - - 4,0 ± 1,0 c 3 0,040 ± 0,01 c 3 75 4 4 - - - - - 2,5 ± 1,5 c 3 0,040 ± 0,03 c 3 100 3 µL+0.25 µg/mL 25 3 1 1 - - - - 2,0 ± 0,0 c 3 0,025 ± 0,01 c 3 41 44 - - - 8 - 33,0 ± 3,0 0,465 ± 0,06 13 12 3 - - 5 - 15,5 ± 0,5 d 2 0,165 ± 0,01 d 2 50 15 18 3 - - 7 - 16,5 ± 0,5 d 2 0,215 ± 0,03 d 2 75 19 10 1 - - 1 - 13,5 ± 2,5 d 2 0,155 ± 0,04 d 2 100 3 µL+0.25 µg/mL a 25 b 15 17 1 - - 4 - 16,0 ± 2,0 d 2 0,185 ± 0,03 d 2 21 19 1 1 1 17 2 39,0 ± 1,0a 1 0,310 ± 0,04 26 20 - - - 17 - 43,0 ± 27,0a 1 1,060 ± 0,89a 1 50 57 40 4 - - 13 - 43,5 ± 1,5a 1 0,570 ± 0,01 68 21 8 1 - 14 - 64,0 ± 21,0a 3 0,560 ± 0,13 36 43 2 - - 8 - 25,5 ± 16,5 0,445 ± 0,36 75 100 c d * Toplam 200 adet iyi dağılmış metafaz değerlendirilmiştir. ** Sitotoksik etki (a:56, b: 124, c:175, d: 111 metafaz sayılmıştır). Bʹ: Kromatid kırığı, Bʹʹ: Kromozom kırığı, F’: Kromatit fragmenti, F’’:Kromozom fragmenti, T: Translokasyon, KD: Kromatid değişimi, SU: Sister union. a: kontrol ile; b: çözücü kontrol ile; c: pozitif kontrol ile; d: çk + pk ile aradaki fark önemlidir. a1b1c1: P<0.05; a2b2c2: P<0.01; a3b3c3: P<0.001 50 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET 4.1.2. Delphinidin Chlorid’in Mikronukleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkileri 4 farklı konsantrasyonda delphinidin chlorid’in (25, 50, 75 ve 100 μM) 24 veya 48 saat süreyle muamele edilen insan periferal lenfositlerinde klastojenik yahut anöjenik etkilerden dolayı değişik büyüklükte mikronukleus (MN) oluşumu (Şekil 4.8 – Şekil 4.9) saptanmıştır. Kontrol ve çözücü kontrol (DMSO) hücrelerinde saptanan mikronukleuslu hücreler ile test maddesi muamelesi sonucu saptananlar arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmada test maddesinin hiçbir konsantrasyon ve muamele süresinde MN oluşum frekansını, kontrollere (muamelesiz ve çözücü kontrol) göre önemli düzeyde artırmadığı bulunmuştur (Çizelge 4.2.). En fazla MN artışı; 50 µM test maddesinin 48 saatlik muamelesinde ortaya çıkmıştır. Test maddesinin antigenotoksik etkilerin değerlendirildiği karşılaştırmalarda ortama ilaveten (0.06 µg/ml) konsantrasyonda MMC verilmiştir. Bu karşılaştırmada sadece 48 saatlik muamelenin 50 ve 75 µM konsantrasyonlarda saptanan mikronukleus frekansında kendi kontrolüne (MMC) göre önemli düşüşler gözlenmiştir (Çizelge 4.2.). Bu derişimlerdeki önemli MN azalmasının, delphinidin chlorid’in antigenotoksik etkisiyle bağlantılı olduğu değerlendirilmektedir. Bu kısımdaki sonuçlar topluca özetlenecek olursa, test maddesi mikronukleus oluşumunu önemli düzeyde arttırmamış olup bu durum çalışmadaki kromozom anormalliği bulgularıyla benzerlik göstermektedir. Ancak MN testinin 48 saatteki bazı muamelelerinde (50 ve 75 µM) delphinidin chlorid’in antigenotoksik potansiyeli ortaya çıkmışken, KA testinde bu etki 24 saat süresince muamele edilen bütün derişimlerde saptanmıştır. Buna göre test maddesinin genotoksik etkisi incelenirken MN ve KA bulgularının birbirlerine benzer olduğu anlaşılmıştır. Ancak bulgular her iki testle (MN ve KA) antigenotoksisite yönünden değerlendirildiğinde hücrelerin ajana farklı muamele sürelerinde (24 ve 48 saat) farklı tepkiler verdiği anlaşılmıştır. 51 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Çizelge 4.2. Farklı Konsantrasyonlarda Delphinidin Chlorid ile 24 veya 48 Saat Muamele Edilen İnsan Periferal Lenfositlerinde Mikronukleuslu Binukleer Hücre* ‰’si , Nükleer Bölünme İndeksi (NBI) ve Mitotik İndeks (MI) Mumaele Test Maddesi Kontrol DMSO (ÇK) MMC (PK) Delp. Chlr. DMSO MMC Delp. Chlr. Süre (Saat) Kons. (µM) - - 24 3 µL DMSO+ MMC** NBI ± SH 1 2 3 1,5 ± 0,5 1166 597 153 84 1,578 ± 0,074 4,0 ± 3,0 1120 713 99 69 1,559 ± 0,059 1239 741 15 5 1,393 ± 0,020 24 0.25 µg/mL 14,0 ± 1,0 MI ± SH 4 4,62 ± 0,19 4,07 ± 0,59 1,90 ± 0,57a 1 25 1,5 ± 0,5 c 2 1130 710 88 62 1,531 ± 0,004 4,26 ± 1,30 50 1,5 ± 1,5 c 2 1177 620 105 98 1,562 ± 0,157 3,96 ± 0,60 75 3,0 ± 3,0 c 1 924 905 79 92 1,670 ± 0,038 2,83 ± 0,13 100 2,0 ± 1,0 c 2 1213 695 42 50 1,465 ± 0,032 3,20 ± 0,17 1,5 ± 0,5 3 µL 48 0.25 µg/mL 53,5 ± 26,5 1186 668 89 57 1,509 ± 0,089 2,85 ± 0,79 1609 343 33 25 0,5 ± 0,5 c 3 1227 602 93 15 1,227 ± 0,081a 2 1,13 ± 0,07a 2 78 1,511 ± 0,014 c 1 4,75 ± 1,18 c 1 50 3,5 ± 1,5 c 3 1149 678 71 102 1,563 ± 0,080 c 1 3,35 ± 0,82 75 2,5 ± 0,5 c 3 1259 575 80 86 1,497 ± 0,019 c 1 3,05 ± 0,29 100 2,5 ± 0,5 c 3 3 µL + 0.25 16,5 ± 0,5 µg/mL 11,5 ± 10,5 25 1259 643 67 31 1,435 ± 0,026 3,87 ± 0,37 1112 855 28 12 1,477 ± 0,010 1,58 ± 0,15a 2 1202 758 26 14 1,426 ± 0,007 2,15 ± 0,42a 1 24 48 48 DMSO+ 24 MMC Delp. Chlr. + MMC ‰ MN’li Nukleus Sayısına binükler Göre Hücre Dağılımı hücre± SH 24 48 Delp. Chlr. + 48 MMC ** 50 20,0 ± 0,0 1090 867 31 12 1,483 ± 0,001 2,16 ± 0,30a 1 75 10,5 ± 9,5 954 1006 28 12 1,549 ± 0,107 1,93 ± 0,23a 1 1139 851 6 4 1,438 ± 0,011 2,70 ± 0,47 1562 421 10 7 1,231 ± 0,003a 2 0,30 ± 0,00a 1 1716 273 6 5 1,150 ± 0,007a 3 0,85 ± 0,35a 3 4 1,146 ± 0,002a 3 1,26 ± 0,30a 2 1,073 ± 0,050 1 a3d1 1,10 ± 0,06a 2 1 1,133 ± 0,030a 3 0,72 ± 0,32a 3 100 7,5 ± 1,5 3 µL + 0.25 190,5 ± 3,5a 3 µg/mL a 55,5 ± 33,5 d 1 25 50 33,0 ± 30,0 d 1 1723 267 6 75 b 24,0 ± 20,0 d 1 1861 133 5 100 72,0 ± 37,0 a 1 1745 246 8 *: Toplam 2000 adet binükleer interfaz değerlendirilmiştir. ** Sitotoksik etkiden dolayı (a:1841, b: 1610 binükleer hücre sayılmıştır). a: Kontrole göre aradaki fark önemlidir; b: Çözücü kontrole göre aradaki fark önemlidir; c: MMC’ye göre aradaki fark önemlidir ve d: çk + pk ile fark a1b1c1: P<0.05; a2b2c2: P<0.01; a3b3c3: P<0.001 52 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Şekil 4.8. Pozitif kontrol MMC ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronukleus oluşumu (x1000) (0,25 µL/mL, 48saat, ♂) Şekil 4.9. Pozitif kontrol MMC ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronukleus oluşumu (x1000) (0,25 µL/mL, 48saat, ♀) 53 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET 4.1.3 Delpinidin Chlorid’in Oksidatif Stres Oluşumu Üzerine Etkileri Delphinidin chlorid’in 25, 50, 75 ve 100 µM konsantrasyonları ile 24 veya 48 saat muamele edilen kan kültür ortamının toplam oksidan (TOS) ve toplam antioksidan seviye (TAS) değerleri ölçülerek oksidatif stres indeksleri (OSI) hesaplanmıştır (Çizelge 4.3). Yapılan spektrofotometrik ölçümlerde toplam oksidan (TOS) değerleri toplu halde kontrollerle karşılaştırıldığında en yüksek konsantrasyonda (100 µM) hem 24 saat hem de 48 saatte kontrole göre önemli seviyede yüksek bulunmuştur (P<0.01). Hatta yüksek konsantrasyonun 48 saatlik muamelesinde ölçülen değer (7,725±0,13) pozitif kontrolden bile yüksek çıkmıştır. Bu konsantrasyonun dışında kalan muamelelerde saptanan TOS değerlerinin tamamında önemli olmayan yükselmemeler göstermekle birlikte kontroller düzeyinde bulunmuştur. Ayrıca elde edilen bulgularda konsantrasyon-etki ilişkisi belirlenmemiştir (Çizelge 4.3.). Delphinidin chloride’e ilaveten MMC uygulanan kültürlerde 24 saatlik muamelede süresinde sadece en yüksek konsantrasyonda (100 µM) saptanan TOS değeri (7,236±0,64) kendi kontrolüne göre anlamlı düzeyde yüksek (P<0.05) bulunmuştur. Öteki varyantlar hafif yükselmeler göstermekle birlikte kontrol düzeyinde kalmıştır. İki hücre döngüsü kadar (48 saat) muamele süresinde saptanan TOS değerlerinin tamamı çeşitli düzeylerde istatistiksel anlam göstermiştir. Bu periyotta da en fazla artış yine 100 µM konsantrasyonda saptanmıştır (Çizelge 4.3.). Test maddesi istisnasız bütün konsantrasyon ve uygulama sürelerinde toplam antioksidan seviyeyi (TAS) önemli düzeyde yükseltmiştir. Tek başına delphinidin chloride 24 saat uygulanan kültürlerde elde edilen antioksidan kapasite en düşük konsantrasyon hariç her üç kontrolden de çok önemli düzeyde (P<0.001) yüksek bulunmuştur. En düşük test maddesi konsantrasyonundaki anlamlı TAS artışı diğerlerine göre nispeten düşük kalmıştır. Ajanın 48 saat uygulandığı kültürlerde TAS artış eğiliminde görece azalmalar ortaya çıkmıştır. Bu muamele periyodunda en düşük konsantrasyondaki artış anlamlı olmamakla birlikte diğer varyantlardaki artışlar bariz ve dikkat çekicidir (Çizelge 4.3.). Ayrıca verilerde konsantrasyon-etki ilişkisi saptanmamıştır. 54 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Test maddesine ilaveten pozitif kontrolün (MMC) uygulanan kültürlerden elde edilen TAS değerlerinin tamamı kendi kontrolüne göre çok önemli düzeyde artışlar göstermiştir. Bu uygulama tipinde muamele süresine bağlı belirgin farklılıklar gözlenmemiştir. TAS artışının en fazla olduğu muamele, en yüksek konsantrasyon (24 saat) iken, en düşük kaldığı varyant ise en düşük test maddesi konsantrasyonu (48 saat) olmuştur (Çizelge 4.3.). 55 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET Çizelge 4.3. Delphinidin Chlorid’in İnsan Periferal Lenfosit Kültüründe Oluşturduğu Toplam Oksidan Seviye (TOS), Toplam Antioksidan Seviye (TAS) ve Oksidatif Stres İndeksi (OSI) Muamele Test Maddesi Süre Kons. (Saat) (µM) TOS ± SH TAS ± SH OSI ± SH Kontrol - - 3,891 ± 0,58 0,593 ± 0,015 6,545 ± 0,80 a 3 DMSO (ÇK) 24 3 µL 6,165 ± 0,39 0,558 ± 0,036 11,14 ± 1,42 MMC (PK) 24 0.25 µg/mL 4,193 ± 0,70 0,588 ± 0,024 7,101 ± 0,90 7,020 ± 1,31 Delp. Chlr. 24 DMSO 48 MMC 48 Delp. Chlr. 48 DMSO+MMC 24 Delp. Chlr. + MMC 24 DMSO+MMC Delp. Chlr. + MMC 48 48 25 5,000 ± 1,05 0,709 ± 0,018 b 1 c 1 50 4,841 ± 0,76 0,902 ± 0,023 a 3 b 3 c 3 5,350 ± 0,70 b 1 75 5,838 ± 0,76 1,230 ± 0,021 a 3 b 3 c 3 4,737 ± 0,54 b 1 100 7,694 ± 0,81 a 2 1,931 ± 0,026 a 3 b 3 c 3 3,981 ± 0,37 b 2 3 µL 5,808 ± 0,11 0,558 ± 0,015 10,420 ± 0,09a 3 0.25 µg/mL 3,928 ± 0,66 0,561 ± 0,015 6,975 ± 0,98 6,769 ± 0,64 b 1 25 4,982 ± 0,74 0,736 ± 0,040 50 4,852 ± 0,83 0,844 ± 0,017 a 3 b 1 c 1 5,735 ± 0,87 b 2 75 5,789 ± 0,85 1,135 ± 0,043 a 3 b 3 c 3 5,081 ± 0,56 b 2 100 7,725 ± 0,13 a 2 c 1 1,816 ± 0,077 a 3 b 3 c 3 4,266 ± 0,25 b 2 3 µL + 0.25 3,194 ± 0,97 0,377 ± 0,083 a 2 9,510 ± 4,67 a 2 µg/mL 25 5,341 ± 0,58 0,780 ± 0,003 a 1 d 2 6,854 ± 0,77 50 4,716 ± 0,55 0,937 ± 0,018 a 3 d 3 5,048 ± 0,67 75 6,072 ± 0,86 1,239 ± 0,015 a 3 d 3 4,893 ± 0,64 100 7,236 ± 0,64 a 1 d 1 1,923 ± 0,045 a 3 d 3 3 µL + 0.25 1,584 ± 0,07 0,378 ± 0,048 a 2 µg/mL 25 4,644 ± 0,86 d 1 0,755 ± 0,013 a 1 d 3 3,758 ± 0,24 4,237 ± 0,34 6,140 ± 1,04 50 5,324 ± 0,49 d 2 0,871 ± 0,012 a 3 d 3 6,105 ± 0,48 75 5,762 ± 0,42 d 2 1,148 ± 0,002 a 3 d 3 5,020 ± 0,37 100 7,539 ± 0,36 a 1 d 3 1,803 ± 0,048 a 3 d 3 4,190 ± 0,31 a: Kontrole göre aradaki fark önemlidir; b: Çözücü kontrole göre aradaki fark önemlidir; c: MMC’ye göre aradaki fark önemlidir ve d: çk + pk arasındaki ile fark önemlidir. a 1 b 1 c 1 : P≤0.05; a 2 b 2 c 2 : P≤0.01; a 3 b 3 c 3 : P≤0.001 Test maddesinin tek başına belirgin bir oksidatif stres yaratmadığı gözlenmiştir. Aksine DMSO kaynaklı oksidatif stresi azaltıcı yönde etkiler göstermiştir (Şekil 4.10.). Delphinidin chloride tek başına uygulandığında en düşük konsantrasyon (24 saat) hariç tamamında oksidatif stres indeksinin (OSI) çözücü kontrole göre önemli düzeyde düşük (P<0.05) olduğu bulunmuştur. Delphinidin 56 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET chloride ilaveten MMC uygulandığı varyantlarda belirlenen OSI değerleri kendi kontrolü sınırları içinde kalmış olup önemli farklar göstermemiştir (Çizelge 4.3.). OSI 12 10 b1 8 b1 b2 b1 b2 6 b2 b2 4 2 0 ÇK 25 µM 50 µM 24 Saat 75 µM 100 µM 48 Saat Şekil 4.10. Delphinidin chloride ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal kan lenfositlerinde ortaya çıkan oksidatif stres indeksi (OSI) bulguları. 4.1.4 Delphinidin Chloride’in Hücre Bölünmesi Üzerindeki Etkileri İnsan periferal lenfositlerinin delphinidin chlorid’in 25, 50, 75 ve 100 µM konsantrasyonları ile 24 veya 48 saat süreyle muamelesi sonucunda saptanan ortalama nükleus bölünme indeksi (NBI) ve mitotik indeks (MI) değerlerinin kontrollerle yapılan karşılaştırmalarında büyük benzerlik çıkmıştır (Çizelge 4.2.). Tek başına delphinidin chloride uygulanan kültürlerdeki NBI değerlerinin tamamı uygulama süresinden bağımsız olarak kontrol ve çözücü kontrol verilerinden önemli farklılık göstermemiştir (P>0.05). Bunula birlikte en düşük NBI bulgusu en yüksek konsantrasyonda (100 µM, 48 saat) saptanmıştır. Test maddesine ilaveten MMC verilen kültürlerde bir muamele (75 µM, 48 saat) hariç diğerlerinde ortaya çıkan NBI dalgalanmalarının önemsiz olduğu anlaşılmıştır. İlgili muameledeki NBI değeri incelemede saptanan en düşük değer (1,073±0,05) olarak çizelgede (Çizelge 4.2.) yerini almıştır (P<0,05). Test maddesinin tek başına uygulandığında kültürlerde hesaplanan mitotik indeks (MI) verileri incelendiğinde konsantrasyonlarda artışına bağlı olarak önemli olmayan düşüşler (P>0.05) göstermiştir. Hem 24 saatlik muamelede hem de 48 saatlik muamelede en düşük MI değeri 75 µM konsantrasyonda saptanmıştır. En 57 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET düşük konsantrasyonda ise kontrol düzeyinde MI bulunmuştur. Test maddesine ilaveten MMC uygulanan kültürlerde 24 saatlik uygulamada en düşük MI değeri yine 75 µM konsantrasyonda saptanmıştır. Muamelenin 48 saat uygulandığı kültürlerde mitotik indeks daha fazla etkilenmiştir. Bu muamele süresinde (48 saat) belirlenen en düşük MI değeri en yüksek (100 µM ) konsantrasyonda gözlenmiştir (Çizelge 4.2.). Mitotik indeks için saptanan değerler her ne kadar küçük dalgalanmalar gösterse de veriler güven sınırları içinde kalmıştır. 4.2. TARTIŞMA 4.2.1. Delphinidin Chloride’in Genotoksik/Antigenotoksik ve Antioksidan Etkisi Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan delphinidin chloride birçok bitkinin çiçek meyve ve bunlardan başka diğer bazı organlarına rengini veren mavimor renkteki pigmenttir. Çeşitli etkilere sahip olmasına rağmen (bak sayfa 17) kısa süreli genotoksisite testleri bakımından ajana ait yetersiz verilerin olması konunun araştırılmasını zorunlu hale getirmiştir. Ajanın özellikle genotoksik, antigenotoksik ve sitotoksik potansiyeli büyük ölçüde belirsizliğini sürdürmektedir. Bizim yaptığımız in vitro testlerle bu durum bir ölçüde olsa aydınlatılmıştır. Bizim sonuçlarımıza göre tek başına delphinidin chloride, test edilen hiçbir konsantrasyonda ve periyotta kromozom hasarlarını artırmamış, mikronukleus oluşumunu indüklememiştir. Öte yandan bilinen bir klastojen ajan olan mitomycin C’nin sebep olduğu genotoksik etkileri ise belirli ölçülerde bertaraf edilmiştir. Bizim çalışmamızda çözücü kontrol olarak kullanılan DMSO oksidatif yönden ilginç sonuçlar vermiştir. Verilere göre DMSO total oksidan seviyeyi iki kata yakın artırırken herhangi bir TAS uyarımı göstermeyerek yüksek OSI değerine ulaşmıştır. Farklı bir çalışmada DMSO’nun oksidatif etkisi maya hücrelerinde de (Saccharomyces cerevisiae wt ırkı EG-103) gözlenmiştir (Sadowska-Bartosz ve ark. 2013). Bizim bulgularımıza göre test maddesi, tek başına kullanıldığında gözlenen DMSO kaynaklı oksidatif stresi büyük ölçüde etkisiz hale getirmiştir. Dolayısıyla oksidatif stresin neden olduğu muhtemel genotoksisite, test maddesi tarafından 58 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET (antioksidan mekanizma uyarımı) nispeten hafifletilerek mevcut sonuçların ortaya çıkmasına neden olmuştur. Bizim bulgularımıza benzer tarzda, delphinidin dâhil bazı antosiyaninlerin tert-butyl-hydroperoxide (TBHP) tarafından oluşturulan DNA hasarına karşı koruyucu etki gösterdiği rapor edilmiştir (Lazzé ve ark. 2003). Benzer çalışmada patlıcan (Solanum melanogena) bitkisinden özütlenen ve saflaştırılan delphinidin’in (10 ve 20 mg/kg v.a.) mikronukleus testinde, farelerin polikromatik eritrositlerde siklofosfamid tarafından indüklenen mikronukleus frekansını önemli seviyede azalttığı açıklanmıştır. Ayrıca tek başına delphinidin uygulamasının açık bir mutajenik ya da genotoksik etkisi de saptanmamıştır (Azevedo ve ark. 2007). Benzer bulgular Singletary ve ark. (2007) tarafından yapılan çalışmada elde edilmiştir. Bu çalışmaya göre kanserli olmayan (iyi huylu) insan meme epitel hücre hattında karsinojen nitelikte benzo[a]pyrene (BP) bileşiğinin neden olduğu DNA eklenti oluşumları, 0.6 µM konsantrasyondaki delphinidinle anlamlı şekilde engellenmiştir. İnsan kolon karsinoma hücre (HT29) hattında menadione tarafından indüklenen oksidatif DNA hasarına karşı delphinidinin açık bir koruyucu özellik gösterdiği (Fritz ve ark. 2008) ve bu yönüyle bizim bulgularımıza benzediği söylenebilir. Ancak, ortamda katalaz yoksa delphinidin’in antioksidan özellikten yoksun kaldığı aynı çalışmada belirtilmiştir. Başka bir çalışmada delphinidin in vitro şartlarda konsantrasyona bağlı tarzda, topoisomerase II zehirlerinin DNA üzerine olan etkisine karşı koruyucu olduğu açıklanmıştır (Esselen ve ark. 2009). Koruyucu etkiye bir başka örnek, sıçanlarda siklofosfamid tarafından uyarılan DNA hasarına karşı delphinidinin önemli koruyucu özelliğinin saptandığı çalışmadır (Khandelwal ve Abraham 2014). 4.2.2. Delphinidin Chloride’in Hücre Bölünmesi Üzerine Etkileri Test maddesinin hücre bölünmesi ve hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için mitotik indeks (MI) ve nükleer bölünme indeksi (NBI) saptanmıştır. Bizim sonuçlarımıza göre test maddesi delphinidin chloride ne mitotik indeksi ne de bir varyant hariç (test maddesi+MMC, 75 µM, 48 saat) nükleer bölünme indeksini önemli düzeyde etkilememiştir. Bu verilere göre çalışmada test 59 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET edilen ajanın ne sitotoksik ne de antiproliferatif bir potansiyele sahip olmadığı sonucu ortaya çıkmıştır. Delphinidin chloride’in sitotoksik etkisiyle ilintili olan apoptotik, antikanser ve antitümoral etkilerin araştırıldığı bazı çalışmalarda genellikle benzer sitotoksik etki sonuçları da elde edilmiştir. Bunlara göre; delphinidin, fibrosarkom (HT-1080) hücreleri tarafından salgılanan ve hücre dışı matrisi ayrıştıran matris metalloproteinaz (MMP)-2 ve MMP-9 enzimlerinin aktivitesini belli belirsiz düzeyde inhibe ederek tümör yayılma sürecinin durdurulmasında kısmen etkili olabileceği ifade edilmiştir (Nagase ve ark. 1998). Meiers ve ark (2001) tarafından yapılan başka bir çalışmada in vitro koşullarda mikromolar düzeylerde delphinidin yönünden zengin gıdaların insan tümör (epidermoid karsinoma) hücrelerinin gelişimini durdurduğu bulunmuştur. Bu sonuç epidermal büyüme faktörü reseptörlerinin (EGFR) inhibisyonuyla elde edilir. Ayrıca vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ile uyarılmış insan kordon (göbek bağı) endotelyal hücrelerinin göç ve proliferasyonu delphinidin tarafından kuvvetli bir şekilde bastırılarak in vivo ve in vitro anjiogenezin üstesinden gelinmiştir (Favot ve ark. 2003). Farklı bir çalışmada yabanmersini özütlerinden izole edilen saf haldeki delphinidine gibi glikozitlerin in vitro şartlarda HL60 (insan promyelocytic leukemia) hücrelerinde apoptozu indüklediği ve insan kolon karsinoma (HCT116) hücrelerinde büyümeyi inhibe ettiği saptanmıştır (Katsube ve ark 2003). Delphinidin, normal insan fibroblast hücreleri, rahim ve kolon adenokarsinom hücrelerinde büyümeyi engellemiştir. Ajan tarafından indüklenen apoptozun varlığı morfolojik ve biyokimyasal (nükleer kondensasyon ve fragmentasyon gibi) bulgularla teyit edilmiştir. Bundan başka apoptotik hücrelerdeki mitokondrial membran potansiyeli delphinidin muamelesi ardından önemli düzeyde kaybolmuştur (Lazze ve ark. 2004). Ajanın aynı zamanda insan topoizomeraz I ve II enzimlerinin katalitik aktivitelerini izoformları arasında herhangi bir ayrım yapmaksızın kuvvetli bir şekilde inhibe ettiği bulunmuştur (Habermeyer ve ark. 2005). Bazı antosiyanidinler ile yapılan çalışmada delphinidin molekülünün en güçlü anjiyogenez inhibitörü olduğu saptanmıştır. In vivo şartlarda delphinidin fare “Matrigel plug assay” sınamasında damar oluşumunu uyaran fibroblast growth faktörü baskılama yeteneğine sahiptir. Delphinidin’in doğal bir VEGFR (vascular 60 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET endothelial growth factor reseptör) inhibitörü olduğu belirtilmiştir (Lamy ve ark. 2006). Benzer şekilde delphinidin (5-40 microM; 48 saat) meme kanseri (AU-565 ve MCF-10A) hücrelerinde apoptozu indükleyerek büyümeyi geriletmiştir (Afaq ve ark. 2007). Bir antosiyanidin olan delphinidin son derece metastatik olan insan prostat kanser (PCa) hücrelerinde androjen bağımsız ya da androjenden etkilenmeyen tarzda kaspaz aktivasyonu yoluyla apoptozu indüklemiştir. Bu etki NFκB sinyallemesinin inhibisyonu yoluyla da olabilir. Benzer şekilde delphinidin muamele edilmiş farelerdeki NF-κB/p65, Bcl2, Ki67 ve PCNA gen anlatımının anlamlı seviyede azaldığı gösterilmiştir. (Hafeez ve ark., 2008). Başka bir çalışmanın sonuçlarına göre delphinidin sadece metastatik kolorektal kanser hücre hatlarında sitotoksik etki göstermiştir ve anılan bu antosiyanidinlere en fazla hassasiyet gösteren hücre hattı ise çoklu ilaç direncine sahip kolon kanseri LoVo/ADR hücre hattı olduğu ortaya çıkmıştır (Cvorovic ve ark. 2010). Glioksalaz l (GLO l), metilglioksalın (MG) detoksifikasyonu için hız sınırlayıcı bir enzim ve apoptozisi indükleyebilen bir glukoliz yan ürünüdür. GLO l normal hücrelerde az ama çoğu tümör hücresinde oldukça fazla eksprese olduğu (ifade edildiği) bilindiği için bu enzimin inhibitörlerinin yeni bir anti kanser ilaç olması beklenmektedir. Bu çalışmada delphinidinin de dâhil olduğu antosiyanidinlerin insan GLO l enzimini inhibe etme yeteneği test edilmiştir. Bunların arasında delphinidin insan GLO l üzerine en yüksek inhibitör etki potansiyeline sahip olduğu görülmüştür. Üstelik delphinidin HL-60 hücrelerinde doz ve zaman bağımlı apoptozu indüklemiştir (Takasawa ve ark., 2010). İçinde delphinidinin de olduğu bir grup polifenolün etki mekanizmaları ile ilgili edinilen yeni bilgiler, fotokarsinogenezin bunların önlenmesinde cilt etkili fotoproteksiyonunda olarak ve insandaki kullanılabileceğini ortaya koymaktadır (Afaq ve Katiyar 2011). Dut antosiyanidinlerinin (delphinidin dâhil) karışım halinde kullanıldığında, büyük hücreli akciğer kanseri (NSCLC) hücre hattındaki invazyon ve migrasyonun baskılanmasını, hücre döngü duraklamasını ve apoptozu indüklemiştir. Ayrıca karışım olarak kullanım sitotoksisiteyi, tek başına kullanıma göre daha fazla uyarmıştır (Kausar ve ark. 2012). Myricetin ve delphinidin STAT1’i bloke eder böylece ROS (reaktif oksijen türleri) tarafından tümör nekroz faktörü alfa’nın (TNFα) trankripsiyonunu indükleyerek inhibe eder (Quinton ve ark., 61 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Mehmet Tahir HÜSUNET 2012). Derisinin altına insan NSCLC (Non-small-cell lung carcinoma) hücreleri implante edilmiş timus bezi eksik farelere delphinidin muamelesi, kontrol farelerine göre (i) tümör gelişimini anlamlı seviyede inhibe etmiş, (ii) hücre proliferasyon ve anjiogenez markerlarının ifadesini azaltmış ve (iii) apoptozu indüklemiştir (Pal ve ark. 2013). Son zamanlarda yapılmış yeni bir çalışmada delphinidin-3-glukozit ajanının fibrosarkoma hücre hattında seçici sitotoksisite gösterdiği ve anılan hücre hattında yayılmayı engelleyici aktivitesinin olduğu ifade edilmiştir (Filipiak ve ark. 2014). Özetle bizim sonuçlar ve önceki yapılan çalışmaların sonuçları büyük ölçüde birbirini destekler niteliktedir. Bizim sonuçlarımıza göre delphinidin chloride’in antigenotoksik ve antioksidatif potansiyelinin olduğunu göstermiştir. Ancak bizim sonuçlarda test maddesinin anlamlı sitotoksisite etkisinin olduğu belirlenmemiştir. Bu fark çalışmada hücre tipinden kaynaklanmış olabilir. Çünkü önceki çalışmaların tamamına yakını tümör ya da mutant hücre hatlarıyla gerçekleştirilmişken biz çalışmamızı sağlıklı lenfosit hücrelerinde gerçekleştirdik. Bu da test maddesinin in vitro şartlarda sağlıklı hücreler üzerine sitotoksik etkiler göstermediği anlamına gelmektedir. 62 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Mehmet Tahir HÜSUNET 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bu yüksek lisans tez çalışmasında test maddesi olarak kullanılan delphinidin chloride molekülü test edilen hiçbir konsantrasyon ve sürede kromozom anormalliği ve mikronukleus oluşumu gibi genotoksisite parametreleri üzerinde belirgin bir etki göstermemiştir. Bu sonucun aksine bilinen klastojenik ajanın genotoksik etkilerini belli muamelelerde minimize etmiştir. Bu sonuçların moleküler genotoksisite testleriyle teyit edilmesi test maddesinin genotoksik potansiyeliyle ilgili bilgilere önemli katkılar sağlayacaktır. Test maddesinin sitotoksik potansiyeli hakkında fikir edinmek için belirlenen mitotik indeks ve nükleus bölünme indekslerinin, kontroldekinden farklı olmadığı saptanmıştır. Bu sonuçlara göre delphinidin chloride’in sağlıklı lenfosit hücrelerine herhangi bir sitotoksik etki göstermediği kanaati doğmuştur. Delphinidin chloride tek başına kullanıldığında bir varyant (25 µM, 24 saat) hariç bütün konsantrasyon ve sürelerde oksidatif stresi çarpıcı şekilde azaltmıştır. Bu sonuç, ortamdaki oksidan etkilerden ziyade antioksidan mekanizmanın şiddetli bir şekilde uyarılmasından kaynaklandığı değerlendirilmektedir. Test maddesine ilaveten MMC kullanıldığı varyantlarda ise herhangi bir oksidatif etki ya da tersi bir bulguya rastlanmamıştır. Bu durum muhtemelen ortaya çıkan standart hatanın yüksek olmasından kaynaklanmaktadır. Ancak deneklerin (donör) standardize edilerek sayıca artırılması bulguyu kesinleştirecektir. Bu çalışmadan elde ettiğimiz bulgular dikkatle irdelendiğinde delphinidin chloride sağlıklı hücrelerde genotoksik, sitotoksik ve oksidatif etkilere neden olmamakta, aksine bilinen genotoksik ajanın etkilerini ise belli ölçülerde baskılamaktadır. Test maddesinin özellikle antioksidan/antigenotoksik niteliği ve sağlıklı hücreler üzerine herhangi bir sitotoksik etki göstermemesi onu gelecek vadeden moleküller kategorisine sokmaktadır. Bizim çalışmamıza ilaveten farklı test sistemleri ve/veya farklı hücre tiplerinin (kanser hücre hatları vs.) kullanılması ve özellikle de yapılacak in vivo deneylerden saptanacak bulgular, delphinidin chloride’in antiproliferatif ve sitotoksik etkisinin olup olmadığını kesin olarak ortaya koyacağı düşüncesindeyiz. 63 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Mehmet Tahir HÜSUNET 64 KAYNAKLAR ABRAHAM, S.K., SCHUPP, N., SCHMID, U., STOPPER, H., 2007. Antigenotoxic effects of the phytoestrogen pelargonidin chloride and the polyphenol chlorogenic acid. Mol Nutr Food Res. Jul, 51(7):880-7. AFAQ, F. ve KATIYAR, S. K., 2011. Polyphenols: skin photoprotection and inhibition of photocarcinogenesis. Mini Rev Med Chem 11(14): 12001215. AFAQ, F., SYED, D. N., MALIK, A., HADI, N., SARFARAZ, S., KWEON, M.-H., KHAN, N., ZAID, M. A., MUKHTAR, H., 2007. Delphinidin, an Anthocyanidin in Pigmented Fruits and Vegetables, Protects Human HaCaT Keratinocytes and Mouse Skin Against UVB-Mediated Oxidative Stress and Apoptosis. Journal of Investigative Dermatology, 127 (1): 222–232. AFAQ, F., ZAMAN, N., KHAN, N., SYED, D.N., SARFARAZ, S., ZAİD, M.A. AND MUKHTAR, H., 2008. Inhibition of epidermal growth factor receptor signaling pathway by delphinidin, an anthocyanidin in pigmented fruits and vegetables. Int. J. Cancer: 123, 1508–1515. AKDEMİR, K., 2011. Sigara İçen Hiperlipidemik Hastalara Uygulanan Cerrahisiz Periodontal Tedavinin Dişeti Oluğu Sıvısı Ve Serumdaki Biyokimyasal Parametreler Üzerine Etkisi. Selçuk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Periodontoloji Anabilim Dalı. Doktora Tezi 79 Sayfa. ALAM-ESCAMILLA, D., MUÑIZ, E.E., SOLIS-VILLEGAZ, E., ELIZONDO, G. And VEGA L., 2015. Genotoxic and cytostatic effects of 6-pentadecyl salicylic anacardic acid in transformed cell lines and peripheral blood mononuclear cells. Mutation Research 777: 43–53. ALBERTINI, R. J., ANDERSON, D., DOUGLAS, G. R., HAGMAR, L., HEMMINKI, K., MERLO, F., NATARAJAN, A. T., NORPPA, H., SHUKER, D. E., TICE, R., WATERS, M. D. and AITIO, A., 2000. IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of 65 carcinogens in humans. International Programme on Chemical Safety. Mutat. Res. 463(2): 111-172. ANDERSEN, Ø. M., 2001. Anthocyanins. Encyclopedia of Life Sciences. eLS. John Wiley & Sons, Ltd. ISBN 0470016175. ANNA PIOVAN, A., FILIPPINI, R., 2007. Anthocyanins in Catharanthus roseus in vivo and in vitro: a review. Phytochem Rev., 6:235–242. ARTS, I.C.W. and HOLLMAN, P.C.H., 2005. Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies1–4. Am J Clin Nutr, 81(31):17–25. ATIENZAR, F. A., BILLINGHURST, Z. ve DEPLEDGE, M. H., 2002a. 4-nnonylphenol and 17-beta estradiol may induce common DNA effects in developing barnacle larvae. Environmental Pollution, 120(3):735738. ATIENZAR, F. A., CHEUNG, V. V., JHA, A. N. ve DEPLEDGE, M. H., 2001. Fitness parameters and DNA effects are sensitive indicators of copperinduced toxicity in Daphnia magna. Toxicol Sci, 59(2):241-250. ATIENZAR, F. A., CONRADI, M., EVENDEN, A. J., JHA, A. N. ve DEPLEDGE, M. H., 1999. Qualitative assessment of genotoxicity using random amplified polymorphic DNA: Comparison of genomic template stability with key fitness parameters in Daphnia magna exposed to benzo[a]pyrene. Environmental Toxicology and Chemistry, 18(10):2275-2282. ATIENZAR, F. A., CORDI, B., DONKIN, M. E., EVENDEN, A. J., JHA, A. N. ve DEPLEDGE, M. H., 2000. Comparison of ultraviolet-induced genotoxicity detected by random amplified polymorphic DNA with chlorophyll fluorescence and growth in a marine macroalgae, Palmaria palmata. Aquatic Toxicology, 50(1-2):1-12. ATIENZAR, F. A., EVENDEN, A. J., JHA, A. N. ve DEPLEDGE, M. H., 2002b. Use of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations: possible implications of confounding factors. Biomarkers, 7(1):94-101. 66 ATIENZAR, F. A., VENIER, P., JHA, A. N. ve DEPLEDGE, M. H., 2002c. Evaluation of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations. Mutation ResearchGenetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 521(1-2):151163. ÁVILA, M., HIDALGO, M., SÁNCHEZ-MORENO, C., PELAEZ, C., REQUENA, T. and DE PASCUAL-TERESA, S., 2009. Bioconversion of anthocyanin glycosides by Bifidobacteria and Lactobacillus. Food Research International 42, 1453–1461. AZEVEDO, L., LIMA, P.L.A., GOMES, J.C., STRINGHETA, P.C., RIBEIRO, D.A. and SALVADORI D.M.F. ,2007. Differential response related to genotoxicity between eggplant (Solanum melanogena) skin aqueous extract and its main purified anthocyanin (delphinidin) in vivo. Food and Chemical Toxicology, 45: 852–858. BAKOWSKA-BARCZAK, A. M., MARIANCHUK, M., KOLODZIEJCZYK, P., 2007. Survey of bioactive components in Western Canadian berries. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 85 (11): 1139–52. BAU, D. T., WANG, T. S., CHUNG, C. H., WANG, A. S. S. ve JAN, K. Y., 2002. Oxidative DNA adducts and DNA-protein cross-links are the major DNA lesions induced by arsenite. Environmental Health Perspectives, 110(753-756. BECERRIL, C., FERRERO, M., SANZ, F. ve CASTANO, A., 1999. Detection of mitomycin C-induced genetic damage in fish cells by use of RAPD. Mutagenesis, 14(5):449-456. BİNOKAY, S. ve BOĞA, A. 2010. Gıda Katkı Maddeleri ve Sağlığımıza Etkileri. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalı, ADANA, ARŞİV: 19: 141. BONASSI, S., ABBONDANDOLO, A., CAMURRI, L., DAL PRA, L., DE FERRARI, M., DEGRASSI, F., FORNI, A., LAMBERTI, L., LANDO, C., PADOVANI, P., 1995. Are chromosome aberrations in 67 circulating lymphocytes predictive of future cancer onset in humans? Preliminary results of an Italian cohort study. Cancer Genet. Cytogenet. 79: 133–135. CAHYANA, Y., H. GORDON, M. H., 2013. Interaction of anthocyanins with human serum albumin: Influence of pH and chemical structure on binding. Food Chemistry 141: 2278–2. CARRASCO, K.R., TILBURY, K.L., MYERS, M.S., 2011. Assessment of the Piscine Micronucleus Test as an in situ Biological indicator of Chemical Contaminant Effects. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 47(11): 2123-2136. CHEN, P.N., CHU, S.N., CHIOU, H.L., KUO, W.H., CHIANG, C.L., HSIEH, Y.S., 2006. "Mulberry anthocyanins, cyanidin 3-rutinoside and cyanidin 3glucoside, exhibited an inhibitory effect on the migration and invasion of a human lung cancer cell line". Cancer Letters 235 (2): 248–259. CLIFFORD, M. N. 2000. Anthocyanins – Nature, occurrence and dietary burden. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 1063–1072. COOKE, D., STEWARD, W.P., 2005.Anthocyanins GESCHER, from fruits and A.J., MARCZYLO, vegetables—does T., bright coloursignal cancer chemopreventive activity?. Eur. J. Cancer 4: 1931–1940. COOKE, M. S., EVANS, M. D., DIZDAROGLU, M. ve LUNEC, J., 2003. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J, 17(10):1195-1214. CÖMERT, M., DİNÇ, H., 2014. Şifalı Bitkilerin Gençler Tarafından Bilinirliği. Journal of Tourism and Gastronomy Studies, 2(3): 23-27. CVOROVIC, J., TRAMER, F., GRANZOTTO, M., CANDUSSIO, L., DECORTİ, G. and PASSAMONTİ, S. 2010. Oxidative stress-based cytotoxicity of delphinidin and cyanidin in colon cancer cells. Archives of Biochemistry and Biophysics, 501: 151–157. CYANIDIN.http://www.phytochemicals.info/phytochemicals/cyanidin.php (ERİŞİM Tarihi: 2015). 68 ÇAVUŞOĞLU, K., ÇAKIR ARICA, Ş., KURTMAN, C., 2009. The Frequency of Micronuclei and Morphological Effects on White Blood Cells Following Radiotherapy. F.Ü.Sağ.Bil.Tıp Derg. 23 (1): 15 – 20. DIMITROVI, R. and JAKOVAC, H., 2010. Antifibrotic activity of anthocyanidin delphinidin in carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. Toxicology , 272: 1–10. DING, Y., YAO, H., YAO, Y., FAI, L. Y. AND ZHANG, Z., 2013. Protection of Dietary Polyphenols against Oral Cancer. Nutrients, 5(6): 2173–2191. DURANTE, M., BONASSI, S., GEORGE, K., CUCINOTTA, F.A., 2001. Risk Estimation Based on Chromosomal Aberrations Induced by Radiation. RADIATION RESEARCH, 156: 662–667. EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies (NDA)2, 3 European Food Safety Authority (EFSA)., 2010. Parma, Italy. ERDOĞAN, Ş., 2007. Ankara Piyasasında Satışa Sunulan Bazı Gıdalarda Sentetik Boya Miktarlarının Araştırılması. Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Besin Analizleri ve Beslenme Bilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi 120 sayfa. EREL, O., 2004. A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation. Clinical Biochemistry, 37: 277 – 285. ESSELEN, M., FRITZ, J., HUTTER, M., MARKO, D., 2009. Delphinidin modulates the DNA-damaging properties of topoisomerase II poisons. Chem Res Toxicol., 22(3):554-64. ESTRUCH, R., SACANELLA, E., BADIA, E., ANTÚNEZ, E., NICOLÁS, J.M., FERNÁNDEZ-SOLÁ, J., ROTILIO, D., GAETANO, G.D., RUBİN, E., URBANO-MÁRQUEZ, A., 2004. Different effects of red wine and gin consumption on inflammatory biomarkers of atherosclerosis: a prospective randomized crossover trial Effects of wine on inflammatory markers. Atherosclerosis, 175: 117–123. EVANS, H. J., 1984. Human peripheral blood lymphocytes for the analysis of chromosome aberrations in mutagen tests. Handbook of Mutagenicity 69 Test Procedures. In: Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C. (Eds.), Second edition. Elsevier Science Publishers, BV,pp. 405-427. FAVOT, L., MARTIN, S., KERAVIS, T., ANDRIANTSITOHAINA, R. ve LUGNIER, C., 2003. Involvement of cyclin-dependent pathway in the inhibitory effect of delphinidin on angiogenesis. Cardiovasc Res 59(2): 479-487. FENECH, M., 2002. Biomarkers of genetic damage for cancer epidemiology. Toxicology, 181-182: 411-416. FENECH, M. The cytokinesis-block micronucleus technique: A detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations., 1993. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 285(1):35-44. FENG, R., WANG, S.Y., SHI, Y.H., FAN, J. and YIN, X.M., 2010. Delphinidin Induces Necrosis in Hepatocellular Carcinoma Cells in the Presence of 3-Methyladenine, an Autophagy Inhibitor. J. Agric. Food Chem., 58: 3957–3964. FERGUSON, L. R., VAN ZIJL, P., HOLLOWAY, W.D. ve JONES, W.T., 1985., Condensed tannins induce micronuclei in cultured V79 Chinese hamster cells. Mutat Res 158(1-2): 89-95. FILIPIAK, K., HIDALGO, M., SILVAN, J. M., FABRE, B., CARBAJO, R. J., PINEDA-LUCENA, A., RAMOS, A., DE PASCUAL-TERESA, B. ve DE PASCUAL-TERESA, S., 2014. Dietary gallic acid and anthocyanin cytotoxicity on human fibrosarcoma HT1080 cells. A study on the mode of action. Food Funct 5(2): 381-389. FIMOGNARI, C., BERTI, F., CANTELLI-FORTI, G., HRELIA, P., 2004. Effect of cyanidin 3-O-beta-glucopyranoside on micronucleus induction in cultured human lymphocytes by four different mutagens. Environ Mol Mutagen, 43(1):45-52. 70 FRITZ, J., ROTH, M., HOLBACH, P., ESSELEN, M., MARKO, D., 2008. Impact of delphinidin on the maintenance of DNA integrity in human colon carcinoma cells. J Agric Food Chem., 56(19):8891-6. GATOUILLAT, G., MAGID, A. A., BERTIN, E., EL BTAOURI, H., MORJANI, H., LAVAUD, C., MADOULET, C., 2015. Medicarpin and millepurpan, two flavonoids isolated from Medicago sativa, induce apoptosis and overcome multidrug resistance in leukemia P388 cells. Phytomedicine, 22(13):1186-94. GHISELLI, A., SERAFINI, M., NATELLA, F., SCACCINI, C., 2000. Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data. Free Radic Biol Med., 29: 1106-14. GIDA GÜVENLİĞİ DERNEĞİ (Turkis Food http://www.ggd.org.tr/sss2.php?bolum=249 Safety Association): (Erişim tarihi:Kasım 2015). GLEI, M., MATUSCHEK, M., STEINER, C., BOHM, V., PERSIN , C., POOLZOBEL, B.L., 2003. Initial in vitro toxicity testing of functional foods rich in catechins and anthocyanins in human cells. Toxicology in vitro, 17: 723–729. HABERMEYER, M., FRITZ, J., BARTHELMES, H. U., CHRISTENSEN, M. O., LARSEN, M. K., BOEGE, F. ve MARKO, D., 2005. Anthocyanidins modulate the activity of human DNA topoisomerases I and II and affect cellular DNA integrity. Chem Res Toxicol 18(9): 1395-1404. HAFEEZ, B.B., SIDDIQUI, I.A., ASIM, M., MALIK, A., AFAQ, F., VADHAMI, V.M., SALEEM, M., DİN, M. AND MUKHTAR, H., 2008. A Dietary Anthocyanidin Delphinidin Induces Apoptosis of Human Prostate Cancer PC3 Cells İn vitro and In vivo: Involvement of Nuclear Factor-KB Signaling. Cancer Res., 68: (20). HAGMAR, L., BONASSI, S., STROMBERG, U., MIKOCZY, Z., LANDO, C., HANSTEEN, I.L., MONTAGUD, A.H., KNUDSEN, L., NORPPA, H., REUTERWALL, C., TİNNERBERG, H., BROGGER, A., FORNİ, A., HOGSTEDT, B., LAMBERT, B., MİTELMAN, F., 71 NORDENSON, I., SALOMAA, S., SKERFEVİNG, S., 1998. Cancer predictive value of cytogenetic markers used in occupational health surveillance programs: a report from an ongoing study by the European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and Health. Mutat. Res. 405: 171–178. HALLIWELL, B., 2007. Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochemical Journal, 401:1-11. HARBORNE, J.B., 1967. Comparative biochemistry of the flavonoids- IV. Phytochemistry, 6 (10): 1415. HE, F., LIANG, N. N., MU, L., PAN, Q. H., WANG, J., REEVES, M. J. AND DUAN, C. Q., 2012. Anthocyanins and Their Variation in Red Wines I. Monomeric Anthocyanins and Their Color Expression. Molecules, 17: 1571-1601. HE, J., GUISTI, M.M., 2010. Anthocyanins: natural colorants withhealth-promoting properties. Annu. Rev. Food Sci. Technol., 1,163–187. HE, Y.H., XIAO, C., WANG, Y.S., ZHAO, L.H., ZHAO, H.Y., TONG, Y., ZHOU, J., JİA, H.W., LU, C., Lİ, X.M., LU, A.P., 2005. Antioxidant and antiinflammatory effects of cyanidin from cherries on rat adjuvantinduced arthritis. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 30 (20): 1602–5. HODEK, P., FOUSOVA, P., BRABENCOVA, E., MOSEROVA, M., PAVEK, P., ANZENBACHEROVA, E., BROTANEK, J., HUDECEK, J., FREİ, E., STİBOROVA, M., 2014. Effect of dihydromyricetin on benzo[a]pyrene activation in rats. Neuro Endocrinol Lett, 35(2):15868. HOSSEINIMEHR, S.j., 2010. Flavonoids and genomic instability induced by ionizing radiation. Drug Discovery Today, 15: 21-22. HOU, D.X., KAI, K., LI, J.J., LIN, S., TERAHARA, N., WAKAMATSU, M., FUJII, M., YOUNG, M.R. and COLBURN, N., 2004. Anthocyanidins inhibit activator protein 1 activity and cell transformation: structureactivity relationship and molecular mechanisms. Carcinogenesis, 25(1): 29-36. 72 http://news.bbc.co.uk/2/hi/health/5298404.stm (ERİŞİM Tarihi: 2015). HYUN, J. W., CHUNG, H. S., 2004 Cyanidin and Malvidin from Oryza sativa cv. Heugjinjubyeo mediate cytotoxicity against human monocytic leukemia cells by arrest of G(2)/M phase and induction of apoptosis. J Agric Food Chem, 52(8):2213-7. ICHIYANAGI, T., SHIDA, Y., RAHMAN, M.M., SEKIYA, M., HATANO, Y., MATSUMOTO, H., HİRAYAMA, M., KONİSHİ, T. and IKESHİRO, Y., 2008. Effect on both aglycone and sugar moiety towards Phase II metabolism of anthocyanins. Food Chemistry 110: 493–500. ILIAKIS, G., WANG, H., PERRAULT, A.R., BOECKER, W., ROSIDI, B., WİNDHOFER, F., WU, W., GUAN, J., TERZOUDI, G., and PANTELIASC, G., 2004. Mechanisms of DNA double strand break repair and chromosome aberration formation. Cytogenet Genome Res 104: 14–20. IUPAC ., 1997. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (). XML on-line corrected version: http://goldbook.iupac.org (2006-) created by M. Nic, J. Jirat, B. Kosata; updates compiled by A. Jenkins. ISBN 0-9678550-9-8. doi:10.1351/goldbook. Last update: 2014-02-24; version: 2.3.3. IWASHINA, T., 2000. The Structure and Distribution of the Flavonoids in Plants., Journal of Plant Research, 113(3): 287-299. JOHNSON, J.J., BAILEY, H.H. AND MUKHTAR, H., 2010 Green tea polyphenols for prostate cancer chemoprevention: A translational perspective . Phytomedicine. Jan; 17(1): 3–13. JOHNSON, KELLY. "Health Benefits of Cyanidin"., 2015. JONES, C. ve KORTENKAMP, A., 2000. RAPD library fingerprinting of bacterial and human DNA: Applications in mutation detection. Teratogenesis Carcinogenesis and Mutagenesis, 20(2):49-63. 73 JONES, Q. R. D., WARFORD, J., RUPASINGHE, H. P. V., AND ROBERTSON, G. S., 2012. Target-based selection of flavonoids for neurodegenerative disorders. Trends in Pharmacological Sciences November, Vol. 33, No. 11. KANAKIS, C.D., TARANTILIS, P.A., POLISSIOU, M.G., AND TAJMIR-RIAHI, H.A., 2006. Interaction of Antioxidant Flavonoids with tRNA: Intercalation or External Binding and Comparison with FlavonoidDNA Adducts. DNA AND CELL BIOLOGY, 25(2): 116–123. KARATEPE, R., AKAL, Z.U. and ALPSOY, L., 2015. Genotoxıc And Cytotoxıc Effects Of Prunus Armenıaca Seed Extract In Vıtro. Fresenıus Envıronmental Bulletın, 24(8): 2549-2555. KATSUBE, N., IWASHITA, K., TSUSHIDA, T., YAMAKI, K. ve KOBORI, M., 2003. Induction of apoptosis in cancer cells by Bilberry (Vaccinium myrtillus) and the anthocyanins. J Agric Food Chem 51(1): 68-75. KAUDERER, B., ZAMITH, H., PAUMGARTTEN, F. J. and SPEIT, G., 1991. Evaluation of the mutagenicity of beta-myrcene in mammalian cells in vitro. Environ Mol Mutagen, 18(1): 28-34. KAUSAR, H., JEYABALAN, J., AQIL, F., CHABBA, D., SIDANA, J., SINGH, I. P. ve GUPTA, R. C., 2012. Berry anthocyanidins synergistically suppress growth and invasive potential of human non-small-cell lung cancer cells. Cancer Lett 325(1): 54-62. KAYA, A., 2010. Tıbbi Bitkiler ve Etnobatik Çalışmalar. Anadolu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Botanik Anabilim Dalı. Bitkilerle Tedavi Sempozyumu, Haziran, 5-6, Zetinburnu, Türkiye. KAYRALDIZ, A., YAVUZ KOCAMAN, A., RENCUZOĞULLARI, E., İSTİFLİ, E.S., İLA, H.B., TOPAKTAŞ, M. and DAĞLIOĞLU, Y.K., 2010. The genotoxic and antigenotoxic effects of Aloe vera leaf extract in vivo and in vitro. Turk J Biol, 34: 235-246. KELLY, J., 2015.Health Benefits of Cyanidin. KHANDELWAL, N., ABRAHAM, S. K., 2014a. Intake of anthocyanidins pelargonidin and cyanidin reduces genotoxic stress in mice induced by 74 diepoxybutane, urethane and endogenous nitrosation. Environ Toxicol Pharmacol, 37(2):837-43. KHANDELWAL, N., ABRAHAM, S. K., 2014b Protective effects of common anthocyanidins against genotoxic damage induced by chemotherapeutic drugs in mice. Planta Med, 80(15):1278-83. KONDRATYUK, T. P., PEZZUTO, J. M., 2004. Natural Product Polyphenols of Relevance to Human Health. Pharm Biol, 42:46–63. KUMORO, A.C., RETNOWATI, D.S. and BUDIYATI C.S., 2010. Solubility of Delphinidin in Water and Various Organic Solvents between (298.15 and 343.15) K. J. Chem. Eng. Data, 55: 2603–2606. KURODA, S., YANO, H., KOGA-BAN, Y., TABEI, Y., TAKAIWA, F., KAYANO, T. ve TANAKA, H., 1999. Identification of DNA polymorphism induced by X-ray and UV irradiation in plant cells. Jarq-Japan Agricultural Research Quarterly, 33(4):223-226. KWON, J.Y., LEE, K. W., HUR, H. J., LEE, H. J., 2007. Peonidin Inhibits PhorbolEster-Induced COX-2 Expression and Transformation in JB6 P+ Cells by Blocking Phosphorylation of ERK-1 and -2. Annals of the New York Academy of Sciences 1095 (1): 513–520. LAMY, S., BLANCHETTE, M., MICHAUD-LEVESQUE, J., LAFLEUR, R., DUROCHER, Y., MOGHRABİ, A., BARRETTE, S., GİNGRAS, D., BÉLİVEAU, R., 2006. Delphinidin, a dietary anthocyanidin, inhibits vascular endothelial growth factor receptor-2 phosphorylation. Carcinogenesis, 27(5):989-96. LAZZE, M. C., SAVIO, M., PIZZALA, R., CAZZALINI, O., PERUCCA, P., SCOVASSI, A. I., STIVALA, L. A. ve BIANCHI, L., 2004. Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines. Carcinogenesis 25(8): 1427-1433. LAZZÉ, M.C., PIZZALA, R., SAVIO, M., STIVALA, L.A., PROSPERI, E., BIANCHI, L., 2003. Anthocyanins protect against DNA damage induced by tert-butyl-hydroperoxide in rat smooth muscle and hepatoma cells. Mutat Res., 535(1):103-15. 75 LEE, Y.C., YANG, V.C. and WANG, T.S., 2007. Use of RAPD to detect sodium arsenite-induced DNA damage in human lymphoblastoid cells. Toxicology 239: 108–115. LIM, S., XU, J., KIM, J., CHEN, T. Y., SU, X., STANDARD, J., CAREY, E., GRİFFİN, J., HERNDON, B., KATZ, B., TOMİCH, J., WANG, W., 2013. Role of anthocyanin-enriched purple-fleshed sweet potato p40 in colorectal cancer prevention. Mol Nutr Food Res, 57(11):1908-17. LIN, L. Z., HARNLY, J. M., PASTOR-CORRALES, M. S., LUTHRIA, D. L., 2008. The polyphenolic profiles of common bean (Phaseolus vulgaris L.). Food Chemistry, 107: 399. LIU, W., XU, J., WU, S., LIU, Y., YU, X., CHEN, J., TANG, X., WANG, Z., ZHU, X., Lİ, X., 2013. Selective anti-proliferation of HER2-positive breast cancer cells by anthocyanins identified by high-throughput screening. PLoS One, 8(12):e81586. LOHACHOOMPOL, V., MULHOLLAND, M., SRZEDNICKI, G., CRASKE, J., 2008. Determination of anthocyanins in various cultivars of highbush and rabbiteye blueberries. Food Chemistry, 111: 249–254. LOTITO, S. B., FREI, B., 2006. Consumption of flavonoid-rich foods and increased plasma antioxidant capacity in humans: cause, consequence, or epiphenomenon?. Free Radic. Biol. Med, 41 (12): 1727–46. MACE, ML JR., DASKAL, Y. and WRAY, W., 1978. Scanning electron microscopy of chromosome aberrations. Mutat. Res., 52:199-206. MAESTRE, R., DOUGLASS, J. D., KODUKULA, S., MEDINA, I. AND STORCH, J.,2013. Alterations in the Intestinal Assimilation of Oxidized PUFAs Are Ameliorated by a Polyphenol-Rich Grape Seed Extract in an İn vitro Model and Caco-2 Cells1,2,3. J Nutr, 143(3): 295–301. MANZOLLI, E. S., SERPELONI, J. M., GROTTO, D., BASTOS, J. K., ANTUNES, L. M., BARBOSA JUNIOR, F., BARCELOS, G. R., 2015. Protective effects of the flavonoid chrysin against methylmercury-induced genotoxicity and alterations of antioxidant status, in vivo. Oxid Med Cell Longev. 76 MARONPOT, R. R., 2015 Toxicological assessment of Ashitaba Chalcone. Food Chem Toxicol, 77:111-9. MAZZA, G., 2005. Compositional and functional properties of saskatoon berry and blueberry. Int. J. Fruit Sci., 5 (3): 99–118. MAZZA, G., 2005b. Compositional and Functional Properties of Saskatoon Berry and Blueberry. International Journal of Fruit Science, 5 (3): 101. MAZZA, G., FRANCIS, F. J. 1995. Anthocyanins in grapes and grape products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35, 341–371. MCNAUGHT, A. D., WILKINSON, A., IUPAC., 1997. IUPAC Compendium of Chemical Terminology. Flavonoids (isoflavonoids and neoflavonoids) (2 ed.), Oxford: Blackwell Scientific. MEIERS, S., KEMENY, M., WEYAND, U., GASTPAR, R., VON ANGERER, E. ve MARKO, D., 2001. The anthocyanidins cyanidin and delphinidin are potent inhibitors of the epidermal growth-factor receptor. J Agric Food Chem 49(2): 958-962. MERMER, G. http://www.halksagligi.med.ege.edu.tr/seminerler/2006- 07/Gida_Katki_Maddeleri_GM.pdf) (Erişim tarihi: Kasım 2015) MIGUEL, M.G., 2011. Anthocyanins: Antioxidant and/or anti-inflammatory activities. Journal of Applied Pharmaceutical Science 01 (06), 07-15. MITELMAN, F., MERTENS, F., JOHANSSON, B. A., 1997. breakpoint map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia. Nat. Genet. 15: 417–474. MOSTAFA, N.T. and MEHMET, T., 2015. The in vitro genotoxic and cytotoxic effects of remeron on human peripheral blood lymphocytes. Drug and Chemical Toxicology, 38(3): 266-271. NAGASE, H., SASAKI, K., KITO, H., HAGA, A. ve SATO, T., 1998. Inhibitory effect of delphinidin from Solanum melongena on human fibrosarcoma HT-1080 invasiveness in vitro. Planta Med 64(3): 216219. NISHIZAKI, Y., YASUNAGA, M., OKAMOTO, E., OKAMOTO, M., HIROSE, Y., YAMAGUCHI, M., OZEKI, Y. AND SASAKIA, N., 2013. p77 Hydroxybenzoyl-Glucose Is a Zwitter Donor for the Biosynthesis of 7-Polyacylated Anthocyanin in Delphinium. The Plant Cell, 25: 4150– 4165. NODA, Y., KNEYUKI, T., IGARASHI, K., MORI, A. AND PACKER, L., 2000. Antioxidant activity of nasunin, an anthocyanin in eggplant peels. Toxicology, 148(2-3) 119-123. NYMAN, A. and KUMPULAINEN, T.J., 2001. Determination of Anthocyanidins in Berries and Red Wine by High-Performance Liquid Chromatography. J. Agric. Food Chem., 49: 4183−4187. OBE, G., PFEIFFER., SAVAGE, J.R.K., JOHANNES, C., GOEDECKE, W., JEPPESEN, P., NATARAJAN, A.T., MATÍNEZ-LÓPEZ , W., FOLLE, G.A., DRETS, M.E. 2002., Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. Mutation Research 504: 17– 36. ÖZATKAN, G., 2009. Kızılcahamam İlçesi Halk İlaçları. Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakognozi Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi – 130 sayfa. ÖZDEMİR, E., 2015. 1,8-Cineole (Eucalyptol) Bileşiğinin İn Vitro Genotoksik Etkileri. Ç.Ü Fen Edebiyat Fakültesi- Yüksek Lisans Tezi 99 Sayfa. PAL, H. C., SHARMA, S., STRICKLAND, L. R., AGARWAL, J., ATHAR, M., ELMETS, C. A. ve AFAQ, F., 2013. Delphinidin reduces cell proliferation and induces apoptosis of non-small-cell lung cancer cells by targeting EGFR/VEGFR2 signaling pathways. PLoS One 8(10): e77270. PATEL, D.K., KUMAR, R., SAIRAM, K. and HEMALATHA, S., 2012. Pharmacologically tested aldose reductase inhibitors isolated from plant sources—A concise report. Chinese Journal of Natural Medicines,10(5): 0388 – 0340. PATEL, K., JAIN, A., PATEL, D.K., 2013. Medicinal significance, pharmacological activities, and analytical aspects of anthocyanidins ‘delphinidin’: A concise report. Journal of Acute Disease, 169-178. 78 PATEL, K., SING, G.K. and PATEL, D.K., 2014. A Review on Pharmacological and Analytical Aspects of Naringenin. The Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine Press and SpringerVerlag Berlin Heidelberg. PAZ-Y-MINO, C., BUSTAMANTE, G., SANCHEZ, M. E. and LEONE, P. E., 2002. Cytogenetic monitoring in a population occupationally exposed to pesticides in Ecuador. Environ Health Perspect, 110(11): 10771080. PERRY, P. and THOMPSON, E. J., 1984. The methodology of sister chromatid exchanges, in: B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols and C. Ramel (Eds.), Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition. Elsevier, Amsterdam, pp. 459–529. PETERSON, J. DWYER, J. FLAVONOIDS: DIETARY OCCURRENCE AND BIOCHEMICAL ACTIVITY., 1998. Nutrition Research, 18(12): 1995-2018. PIOVAN, A., FILIPPINI, R., FAVRETTO, R., 1998. Characterization of the anthocyanins of Catharanthus roseus (L.) G. Don in vivo and in vitro by electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapıd Communıcatıons In Mass Spectrometry, 12: 361–367. PIZARRO, J. G., FOLCH, J., VAZQUEZ DE LA TORRE, A., VERDAGUER, E., JUNYENT, F., JORDAN, J., PALLAS, M. ve CAMINS, A., 2009. Oxidative stress-induced DNA damage and cell cycle regulation in B65 dopaminergic cell line. Free Radic Res, 43(10):985-994. POLIFENOL. http://www.phytochemicals.info/phytochemicals/malvidin.php. (ERİŞİM Tarihi: 2015). POLIFENOLLER. http://www.annals.org/cgi/content/abstract/145/5/333 (ERİŞİM Tarihi: 2015). QUIDEAU S., 2006. Flavonoids. Chemistry, Biochemistry and Applications. Edited by Øyvind M. Andersen and Kenneth R. Markham. QUINTON, L.J., BLAHNA, M.T., JONES, M.R., ALLEN, E., FERRARI, J.D., HILLIARD,K.L, ZHANG, X., 79 SABHARWAL, V., ALGÜL, H., AKIRA, S., SCHMID, R.M., PELTON, S.I., SPIRA, A. AND MIZGERD, J.P., 2012. Hepatocyte-specific mutation of both NF-κB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest., 122(5): 1758–1763. RENCÜZOĞULLARI, E. and TOPAKTAŞ, M., 1991. The relationship between quantities of bromodeoxyuridine and human peripheral blood with determination of the best differential staining of sister chromatids using Chromosome Medium-B. Fen and Mühendislik Bilimleri Dergisi, 5(3): 19-24. RIBÉREAU-GAYON, J., RIBÉREAU-GAYON, P., (1958). The Anthocyans and Leucoanthocyans of Grapes and Wines. American Journal of Enology and Viticulture 9: 1–9. ROTHFUSS, A., SCHUTZ, P., BOCHUM, S., VOLM, T., ELBERHARD, E.,KREINBERG, R., VOGEL, V. and SPEIT, G., 2000. Induced micronucleus frequencies in peripheral lymphocytes as a screening test for carries of a BRCA1 mutation in breast cancer families. Cancer Res., 60:390-394. RUIZ-PÉREZ, N. J., ARRIAGA-ALBA, M., SÁNCHEZ-NAVARRETE, J., CAMACHO-CARRANZA, R., HERNÁNDEZ-OJEDA, S., ESPINOSA-AGUIRRE, J.J., 2014. Mutagenic and antimutagenic effects of Heterotheca inuloides. Sci Rep., 23;4:6743. RUSSO, A., LA FAUCI, L., ACQUAVIVA, R., CAMPISI, A., RACITI, G., SCIFO, C., RENIS, M., GALVANO, G., VANELLA, A., GALVANO, F., 2005. Ochratoxin A-induced DNA damage in human fibroblast: protective effect of cyanidin 3-O-beta-d-glucoside. J Nutr Biochem., 16(1):31-7. SADOWSKA-BARTOSZ, I., PĄCZKA, A., MOŁOŃ, M., BARTOSZ, G., 2013. Dimethyl sulfoxide induces oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res., (8):820-30. SAĞIR, S., ÇAVUŞOĞLU, K., YAPAR, K., 2013. 1,4-Dioksan Verilen Swıss Albino Farelerde(♀) Yeşil Çayın Bazı Fizyolojik Ve Genotoksik 80 Parametreler Üzerine Koruyucu Etkisi (Investıgatıon Of Physıologıcal And Genotoxıc Effects Of 1,4 Dıoxane On Swıss Albıno Mıce). EÜFBED - Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 6(2): 145-155. SASAKI, R., NISHIMURA, N., HOSHINO, H., ISA, Y., KADOWAKI, M., ICHI, T., TANAKA, A., NISHIUMI, S., FUKUDA, I., ASHIDA, H.,HORIO, F., TSUDA, T., 2007. "Cyanidin 3-glucoside ameliorates hyperglycemia and insulin sensitivity due to downregulation of retinol binding protein 4 expression in diabetic mice". Biochemical Pharmacology 74 (11): 1619–27. SAVVA D., CASTELLANI S., MATTEI N., RENZONI A. ve WALKER C.H., 1994. The use of PCR and DNA fingerprints to detect the genotoxic effects of environmental chemicals (6th International Conference, Delphi, Greece), in: S.P. Varnavas (Ed.), Environmental Contamination, CEP Consultants, Edinburgh, 105–110. SCHEFFLER, A., ALBRECHT, A. E., ESCH, H. L., LEHMANN, L., 2015. Mutagenic potential of the isoflavone irilone in cultured V79 cells. Toxicol Lett., 16;234(2):81-91. SCHMITT, E. AND STOPPER, H., 2001., Estrogenic Activity of Naturally Occurring Anthocyanidins. NUTRITION AND CANCER, 41(1&2):145–149. SERPEN, A., 2007., AB Sürecinde Türkiye’de gıda güvenliğinin dünü, bugünü ve yaşanmakta ola kargaşanın değerlendirilmesi. Hayvancılıkta Performans Dergisi, Sayı: 108 – 109. SHIH, P. H., YEH, C. T., YEN, G. C., 2005. Effects of anthocyanidin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cells. Food Chem Toxicol., 43(10):1557-66. SINGLETARY, K. W., JUNG, K. J. ve GIUSTI, M., 2007. Anthocyanin-rich grape extract blocks breast cell DNA damage. J Med Food 10(2): 244-251. SPENCER, J. P., 2008. Flavonoids: modulators of brain function?. British Journal of Nutrition, 99: 60–77. 81 STAUTH, D., 2007. Studies force new view on biology of flavonoids. EurekAlert!, Adapted from a news release issued by Oregon State University. SUGUI, J.A., WOOD, K.V., YANG, Z., BONHAM,C.C. and NİCHOLSON, R.L., 1999. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry Analysis of Grape Anthocyanins. Am. J. Enol. Vitic, 50 (2): 199-203. SUZUKI, R., TANAKA, M., TAKANASHI, M., HUSSAIN, A., YUAN, B., TOYODA, H. and KURODA, M., 2011. Anthocyanidins-enriched bilberry extracts inhibit 3T3-L1 adipocyte differentiation via the insulin pathway. Nutrition & Metabolism, 8:14. TAKASAWA, R., SAEKI, K., TAO, A., YOSHIMORI, A., UCHIRO, H., FUJIWARA, M., TANUMA, S.I., 2010. Delphinidin, a dietary anthocyanidin in berry fruits, inhibits human glyoxalase I. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18: 7029–7033. TAKEDA, K., SATO, S., KOBAYASHI, H., KANAITSUKA, Y., UENO, M., KINOSHITA, T., TAZAKI, H. ve FUJIMORI, T., 1994. The anthocyanin responsible for purplish blue flower colour of Aconitum chinense. Phytochemistry 36(3): 613-616. TAZEHKAND, M.N. AND TOPAKTAS, M., 2015. The in vitro genotoxic and cytotoxic effects of remeron on human peripheral blood lymphocytes. Drug and Chemical Toxicology, 38(3): 266-271. THEODORAKIS, C. W., 2001. Integration of genotoxic and population genetic endpoints in biomonitoring and risk assessment. Ecotoxicology, 10(4):245-256. THEODORAKIS, W.C., ELBL, T., SHUGART, L.R., 1999. Genetic ecotoxicology IV: survival and DNA strand breakage is dependent on genotype in radionuclide-exposed mosquitofish. Aquatic Toxicology, 45: 279– 291. TIMOCIN, T. AND ILA, H.B., 2015. Investigation of flurbiprofen genotoxicity and cytotoxicity in rat bone marrow cells. Drug and Chemical Toxicology, 38(3): 355-360. 82 TOKI K, SAITO N, IRIE Y, TATSUZAWA F, SHIGIHARA A, HONDA T., 2008. 7-O-Methylated anthocyanidin glycosides from Catharanthus roseus. Phytochemistry, 69 (5): 1215–1219. TOYOKUNI, S. AND SAGRIPANTI, J. L., 1993. Induction of oxidative single- and double-strand breaks in DNA by ferric citrate. Free Radic Biol Med, 15(2):117-123. TRUONG, V. D., DEIGHTON, N., THOMPSON, R. T., MCFEETERS, R. F., DEAN, L. O., PECOTA, K. V. AND YENCHO, G. C., 2009. Characterization of Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by HPLC-DAD/ESI-MS/MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 404-410. TSUDA, T., UENO, Y., AOKI, H., KODA, T., HORIO, F., TAKAHASHI, N., KAWADA, T., OSAWA, T., 2004. Anthocyanin enhances adipocytokine secretion and adipocyte-specific gene expression in isolated rat adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 316 (1): 149–57. TULIO, A. Z., REESE, R. Z., WYZGOSKI, F. J., RINALDI, P. L., FU, R., SCHEERENS, J. C., AND MILLER, A. R., 2008. Cyanidin 3- Rutinoside and Cyanidin 3-Xylosylrutinoside as Primary Phenolic Antioxidants in Black Raspberry". Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (6): 1880–1888. USDA’s Database on the Flavonoid Content (https://en.wikipedia.org/wiki/Flavonoid#cite_note-ars.usda-7). UZONUR, I., ABASIYANIK, M.F., ÇAM, S., ÇOBANLI, K., ELMAS, A., ERDOĞAN, H., HIZAL, Ş., KARABULUT, D.S., ÖZDEMİR, M., YEŞİL, F.A. and PETEK, M., 2004. A Prelımınary Report On Target Organ Genotoxıcıty Bıomonıtorıng By An “Improved Random Amplıfıed Polymorphıc Dna” Assay*. Fresenius Environmental Bulletin, 13(12): 1453 – 1456. VERVERIDIS, F., TRANTAS, E., DOUGLAS, C., VOLLMER, G., KRETZSCHMAR, G., PANOPOULOS, N., 2007. Biotechnology of 83 flavonoids and other phenylpropanoid-derived natural products. Part I: Chemical diversity, impacts on plant biology and human health. Biotechnology Journal, 2 (10): 1214–34. VORSA, N., POLASHOCK, N. J., CUNNINGHAM, D., RODERICK, R.. HOWELL, A., 2002. Evaluatıon Of Fruıt Chemıstry In Cranberry Germplasm: Potentıal For Breedıng Varıetıes Wıth Enhanced Health Constıtuents. ISHS Acta Horticulturae 574: VII International Symposium on Vaccinium Culture. WANG, J., MAZZA, G., 2002 Inhibitory effects of anthocyanins and other phenolic compounds on nitric oxide production in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem., 50(4):850-7. WIKIPEDIA-AURANTINIDIN. https://en.wikipedia.org/wiki/Aurantinidin. ERİŞİM Tarihi: 2015). WIKIPEDIA-CAPENSINIDIN. https://en.wikipedia.org/wiki/Capensinidin. (ERİŞİM Tarihi: 2015). WIKIPEDIA-DELPHINIDIN. https://en.wikipedia.org/wiki/Delphinidin (ERİŞİM Tarihi: 2015). WIKIPEDIA-EUROPINIDIN. Europinidin on www.food-info.net (ERİŞİM Tarihi: 2015). WIKIPEDIA-HIRSUTIDIN. https://en.wikipedia.org/wiki/Hirsutidin (ERİŞİM Tarihi: 2015). WIKIPEDIA-PETUNIDIN. https://en.wikipedia.org/wiki/Petunidin (ERİŞİM Tarihi: 2015). WIKIPEDIA-POLYPHENOLS (https://en.wikipedia.org/wiki/Polyphenol#cite_noteQuideau-1). WIKIPEDIA-PULCHELLIDIN http://metabolomics.jp/wiki/FL7ABGNS0001. (ERİŞİM Tarihi: 2015). WILLIAMS, J. G. K., KUBELIK, A. R., LIVAK, K. J., RAFALSKI, J. A. ve TINGEY, S. V., 1990. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic-Markers. Nucleic Acids Research, 18(22):6531-6535. 84 WILLIAMS, R.J., SPENCER, J.P., RICE-EVANS, C., 2004. Flavonoids: antioxidants or signalling molecules?. Free Radical Biology & Medicine 36 (7): 838–49. YANG Y.C., LU, F.H. WU, J.S., WU, C.H., CHANG, C.J., 2004. The Protective Effect of Habitual Tea Consumption on Hypertension. ARCH INTERN MED., 164: 1534-1540. YAO, J.K., REDDY, R., MCELHINNY, L.G., VAN KAMEN, D.P., 1998. Reduced status of plsma total antioxidant capacity in schizophrenia. Schizophr Res, 32: 1-8. ZHANG. Y., VAREED, S. K., NAIR, M. G., 2005. Human tumor cell growth inhibition by nontoxic anthocyanidins, the pigments in fruits and vegetables. Life Sci., 76(13):1465-72. ZHAO, M., LIU, X., LUO, Y., GUO, H., HU, X., CHEN, F., 2015. Evaluation of protective effect of freeze-dried strawberry, grape, and blueberry powder on acrylamide toxicity in mice. J Food Sci., 80(4):869-74. ZHOU, J., WANG, L.F., WANG, J.Y., TANG, N., 2001. Synthesis, characterization, antioxidative and antitumor activities of solid quercetin rare earth(III) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry, 83: 41–48. 85 86 ÖZGEÇMİŞ 26/04/1987 yılında Silvan’da doğdu. İlk ve orta öğrenimini Diyarbakır, lise öğrenimini ise Ankara’da tamamladı. 2008 yılında başladığı Cumhuriyet Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü’nden 2012 yılında mezun oldu ve aynı yıl Gaziantep Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında yüksek lisans öğrenimine başladı. Şubat 2014’te Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında yüksek lisans bölümüne yatay geçiş yaptı. 87
