Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR: Polymerase Chain Reaction)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PCR: Polymerase Chain Reaction)
Ayten AŞKIN KILINÇ
Veteriner Hekim
PCR nedir?
DNA Polimeraz enzimi kullanılarak DNA’nın
spesifik bir parçasının in vitro (bir tüp içerisinde)
yöntemle çoğaltılmasıdır.
İlk kez 1985 yılında PCR ile ilgili bilgiler Kary Mullis
adlı bir biyokimyacı tarafından ortaya konmuştur. Bu
buluşundan dolayı K. Mullis, 1993yılı Nobel Kimya
Ödülünü kazanmıştır.
PCR ABD'de Cetus
şirketinde çalışan Henry A.
Erlich, Kary Mullis ve
Randall K. Saiki tarafından
geliştirilmiştir.
Kullanım Alanları:
Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın
tanısı
Prenatal tanıda
Klinik örneklerde patojen organizmaların
saptanması
Adli tıpta
Onkogenesisin araştırılmasında
Klonlamada, gen tanısı araştırmalarında
Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde
DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA
örneklerinin oluşturulmasında
Bilinmeyen dizi tayininde
Evrimin aydınlatılmasında
İn vitro fertilization yapılan tek hücrede,
implantasyon öncesi genetik testlerin
yapılmasında
DNA-protein interaksiyonunun
araştırılmasında
Avantajı:
 PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya
olanak sağlamaktadır.
 Yöntem hassas ve hızlıdır.
 Bir çok durumda radyoaktivite
kullanımını gereksiz hale getirmiştir.
Dezavantajı:
 Pahalı laboratuar
ekipmanlarına ihtiyaç
vardır.
 Uzman personel
gerektirir.
Kullanılan sarf
malzemeler pahalıdır.
Kontaminasyona bağlı
hatalı sonuçlar alınabilir.
Verimli bir PCR için ;
-Denatürasyon,
-Primerlerin bağlanması,
-Primerlerin uzaması,
-Döngü sayısı,
-Thermal cycler’ın iniş-çıkış sürelerinin,
optimizasyonu ve standardizasyonu
yapılmalıdır.
PCR tekniği, temel olarak üç basamaktan oluşmaktadır.
• Denatürasyon: 92-98°C’de 3-5 dakika
DNA zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika
ön ısıtma yapmak gerekebilir.
• Bağlanma (Annealing): 50-52 °C’de, 3-5 dakika
• Uzama (Extension- Elongation): 70-74 °C’de, 2 dakika
PCR sonucunda elde edilen ürün, çoğaltılması
hedeflenen DNA parçası ile iki primerin toplam uzunluğu
kadardır.
Üç basamaktan (denaturation, annealing,
primer extension) oluşan işlem, bir PCR devrini temsil
eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar
edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni
DNA parçacığı çoğaltılır. PCR sonucunda elde edilen
DNA parçacıkları agaroz veya poliakrilamit jellerde
yürütüldükten sonra, ethidium bromide (EtBr) veya
gümüş nitrat (GN) ile boyanarak gözlemlenir.
PCR boyunca biriken ürünlerin boyu, iki primerin boyu
ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin
toplamı kadardır.
Matematiksel olarak amplifikasyon;
(2n-2n)X ile hesaplanır.
n=döngü sayısı
2n= birinci ve ikinci döngü sonucunda oluşan boyları
bilinmeyen ürünler
X= orijinal kalıbın kopya sayısı
Her döngü %100 verimle çalışsa 20 döngü sonunda 220
kat ürün oluşur.
PCR’ın Temel Öğeleri:
Kalıp olarak kullanılan
DNA molekülü
PCR’de; genomik
DNA’lar, plazmid ve faj
DNA’ları çeşitli genler ve
hatta herhangi bir DNA
parçası kalıp olarak
kullanılabilir.
PCR’da kalıp olarak
DNA’nın yanı sıra RNA’da
kullanılabilir.
 DNA polimeraz enzimi
DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı
bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp
iplikteki
baz
bilgisini
kullanarak
dört
çeşit
deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid
zincirin sentezini kataliz eder.
Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp
moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA
parçalarına (primerlere) gerek duyarlar.
Sentezin yönü, 5’ uçtan 3’ uca doğru olup, primerin
serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki dNTP’lerin nükleofilik
etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni
DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır.
Primerler
Gen çoğaltılması dahil
PCR’nin birçok uygulaması için
kalıp
DNA’ya
tamamen
tamamlayıcı olan primerlere
ihtiyaç vardır.
Genel olarak kullanılan
kalıp ile yüksek oranda
bağlanma sağlamak üzere
primerler
20-30
nükleotid
uzunluğundadır.
 dNTP karışımı
Deoksirübonükleozid trifosfatlar (dATP, dGTP, dTTP,
dCTP) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım
halinde ticari olarak sağlanır.
Optimal dNTP konsantrasyonu;
1. MgCl2 konsantrasyonuna
2. Reaksiyon koşullarına
3. Primer konsantrasyonuna
4. Çoğaltılmış ürünün boyuna
5. PCR döngü sayısına bağlıdır. Yapılacak PCR için en uygun
dNTP konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir.
Tampon ve MgCl2
PCR’de en çok kullanılan tampon Taq/Amplitaq enzimlerine
özgü olan tampondur. Diğer enzimler içinde benzeri tamponlar
bulunur.
MgCl2 ’ nin reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonu
değişebilmekle birlikte genellikle 0,5-5,0 mM’lıkdeğerlerarasında
çalışılır.
+2
Mg iyonları;
1. dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar.
2. Polimeraz aktivitesini stimüle(uyarmak) ederler
3. Çift iplikli DNA’nın Tm değerini arttırırlar
4. Primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu yüzden MgCl2’ün PCR’nin
özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır.
Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mM’lık
+2
değerler tercih edilir. Düşük Mg konsantrasyonu; ürün oluşumunda
+2
azalmaya, yüksek Mg konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün
birikimine yol açar. MgCl2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca
MgCl2 kullanımına gerek yoktur.
PCR OPTİMİZASYONU
PCR uygulaması için uygun bir şekilde ayarlanmazsa
bazı problemlerle karşılaşılabilmektedir. Bu problemler;
1. PCR’dan beklenen ürün ya az alınır yada hiç alınmaz.
2. Primerlerin yanlış bağlanmasından dolayı spesifik
olmayan bantlar oluşabilir.
3. Primerler yanlış şekilde uzayabilir.
4. Primer-dimer oluşumu ortaya çıkabilir ve bu oluşumlar
çoğaltma işlemini yavaşlatır.
5. Yeni sentezlenen DNA dizilerinde mutasyon veya
istenilenden farklı diziler ortaya çıkabilir.
PCR Çalışma Şartlarını
Etkileyen Faktörler
Enzim Konsantrasyonu: Diğer PCR şartları
optimum seviyede olduğu zaman 100 µl
reaksiyon için önerilen Taq DNA polimeraz
enzim konsantrasyonu 1-2.5 ünitedir. Enzim
konsantrasyonu düşük olursa elde edilecek
ürün (DNA) az olur. Enzim konsantrasyonu
yüksek olursa spesifik olmayan bantlar ortaya
çıkabilir.
Magnezyum Konsantrasyonu: Çünkü Mg
konsantrasyonu primerlerin açılan DNA zincirlerine
yapışmasını, kalıp DNA’nın açılma sıcaklığını, PCR
sonucunda elde edilen DNA kalitesini, primer-dimer
bağ oluşumlarını, enzim aktivitesi ve güvenilirliğini
etkilemektedir. Ayrıca, Taq DNA polimeraz enziminin
iyi bir şekilde çalışabilmesi için; kalıp DNA, primerler
ve nükleotid bazları üzerinde serbest Mg iyonlarının
bulunması gerekir. Bu yüzden 0.5-2.5 mM arasında Mg
iyonlarının dNTP konsantrasyonu içerisinde bulunması
gerekmektedir.
Deoksinükleotid Trifosfatlar (Deoxynucleotide
Triphosphates=dNTPs): Her bir deoksinükleotid (A, G, C, T)
konsantrasyonu 20- 200 µM arasında olduğunda genellikle
PCR uygulamalarından iyi sonuç alınabilmektedir. Bu dört
bazın konsantrasyon içerisindeki oranı eşit olmalıdır.
Başlangıç stok solüsyonu 10 mM kadar seyreltildikten
sonra, küçük hacimlere ayrılarak –20oC ‘de saklanmalıdır.
dNTP konsantrasyonunun yüksek olması yeni sentezlenen
DNA dizilerinde istenilenden farklı dizilerin
(misincorporation) hatalı olarak ortaya çıkmasına sebep
olabilir. Bu yüzden mümkün olduğu kadar düşük
konsantrasyonda dNTP’leri kullanmak PCR spesifikliğini ve
güvenilirliğini artırmaktadır.
Diğer Reaksiyon Unsurları: PCR uygulamalarında
genel olarak 10-50 mM arasında Tris-HCl tampon
çözeltisi (pH 8.3-8.8) kullanılır. Bu tampon çözeltinin
20oC de pH’sı 6.8 ile 7.8 arasında değişir. PCR karışımı
içerisine 50 mM KCl ilave edilirse primer bağlanmasını
kolaylaştırır. Fakat 50 mM’ın üzerindeki KCl veya 50
mM NaCl Taq DNA polimeraz aktivitesini engeller.
Ayrıca, PCR solüsyonuna Jelatin (gelatin), bovine
serum albumin veya Tween 20 deterjanı eklenirse
enzimin daha iyi çalışmasına yardımcı olurlar. Fakat bu
maddeler eklenmeden de PCR protokolleri çok iyi bir
şekilde çalışabilmektedir.
PCR ÇEŞİTLERİ
Yuvalanmış (nested) PCR: Özgün olmayan ürünlerin
oluşumunu engelleyen, yüksek özgünlükte bir PCR
yöntemi. Bu yönteme göre ardarda 2 PCR yapılır. İlk
PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumuyla sonuçlanır.
2. PCR ise ilk PCR sonucu çoğaltılmış DNA’nın iç
kısımlarına ait dizileri içeren ‘NESTED’ primerleri ile
yapılır. İlk PCR ürünleri 2. PCR için kalıp olarak
kullanılır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün
ürünler elde edilir.
Anchored (Demirlenmiş) PCR: Çoğaltılacak olan
DNA’nın sadece bir bölgesinin bilindiği
durumda uygulanır. Bilinen bölgeden
yaralanılarak ilgilenilen DNA parçasının
çoğaltılmasıdır. Çoğaltılacak DNA bilinen bir
diziye bağlanır ve bu bilinen dizi 2. primer
bölgesi olarak kullanılır.
Geri (revers) Transkripsiyon PCR: RNA PCR
olarak da adlandırılan RT-PCR, iki aşamalı olup.
RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri
transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA’nın da
standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını
kapsar.
Asimetrik PCR: Asimetrik PCR yöntemi, fazla miktarda
çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılır.
Bu PCR çeşidinde, kullanılan iki primerden biri
miktarca diğerinden çok daha fazladır. Bu nedenle
asimetrik PCR sonucu ipliklerden biri diğerinden çok
daha fazla miktarda artar. Asimetrik PCR herhangi bir
kalıp ipliğe uygulanabilir ancak tek iplikli ürünün fazla
miktarda üretilememesi gibi bir sorunla karşılaşılabilir.
Bu nedenle çoğunlukla klasik PCR ile önce çift iplikli
hedef DNA çoğaltılır, ardından asimetrik PCR
uygulamasıyla kalıp yeniden çoğaltılarak tek iplikli
ürün yeterli miktarda üretilir.
Ters (ınvers) PCR (IPCR): Bilinen bir DNA dizisinden
yararlanılarak bu DNA’nın her iki ucundaki bilinmeyen
bölgelerin çoğaltılması için kullanılır. Bilinen diziyi
içeren DNA önce restriksiyon enzim kesimi ile doğrusal
ve sonra bilinen DNA’yı içerecek şekilde halkasal hale
getirilir. Ardından bilinen DNA dizilerine ikinci bir
restriksiyon kesimi uygulanmasıyla tekrar doğrusal
olarak elde edilen DNA molekülü bilinen dizilere
uygun olarak tasarlanan primerler yardımıyla
çoğaltılır. Böylece dizisi bilinmeyen DNA parçası
çoğaltılmış olur.
In Situ PCR: Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku
parçaları içindeki kalıp DNA’nın PCR ile çoğaltılması
işlemidir. Bu yöntem viral DNA’nın ve tek kopyalı
genlerin saptanmasında veya RT-PCR ile birlikte viral
RNA ve transkriptlerin belirlenmesinde kullanılır. İn
situ PCR, hücre içine PCR bileşenlerinin girişine izin
vermek üzere hücre membranları yarı geçirgen hale
getirildikten sonra fikse edilmiş hücre veya dokularda
kullanılır.
Çoklu (Multipleks) PCR: Bir PCR ile birden fazla hedef
dizinin birlikte çoğaltılmasıdır. Çoklu PCR, birden fazla
bölgeye bağlanan multipleks primerler ile
gerçekleştirilir. Bu PCR gen delesyonlarının
haritalanması, küçük delesyonların, çerçeve kayması
ve nokta mutasyonların analizinde kullanılan bir
yöntem olduğundan kistik fibrozis gibi genetik
hastalıkların tanısında kullanılabilir.
Real Time PCR:
Son yıllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri
sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas
ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, gerçek zamanlı (real-time)
PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine
neden olmuştur. “Real-time” PCR’da ürünlerin analizi
reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel
elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında
görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek
kalmamaktadır. “Real-time” PCR ürünlerinin niteliksel ve
sayısal analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan
boyalardan ya da diziye özgün problardan
yararlanılmaktadır.
KAYNAKLAR
• http://www.dilekbalik.com/seminer/doktora_ylisans/eakbulut
.pdf
• http://atlasbiyo.com/dosyalar/konferans/15506cc8d91e01.pd
f
• http://bys.trakya.edu.tr/file/open/44259122
• http://www.derim.com.tr/download/article-file/52904
• KAHYA S., BUYUKCANGAZ E., CARLI K.T. Polimeraz Zincir
Reaksiyonu (PCR) Optimizasyonu. Uludag Univ. J. Fac. Vet.
Med. 32 (2013), 1: 31-38
• ÇARHAN A., ERCAN E., YALÇINKAYA T. Dijital PZR ve kullanım
alanları. Turk Hij Den Biyol Derg, 2016; 73(2): 183 - 198