genç ve senesent mezenkimal kök hücre sekretomlarının kanser
advertisement
1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMLARININ KANSER HÜCRE HATLARINA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Hazırlayan Mustafa Burak ACAR Danışman Doç. Dr. Servet ÖZCAN Prof. Dr. Umberto GALDERISI Yüksek Lisans Tezi Temmuz 2015 KAYSERİ 2 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMLARININ KANSER HÜCRE HATLARINA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ (Yüksek Lisans Tezi) Hazırlayan Mustafa Burak ACAR Danışman Doç. Dr. Servet ÖZCAN Prof. Dr. Umberto GALDERISI Bu çalışma; Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından FYL-2015-5616 kodlu proje ile desteklenmiştir. Temmuz 2015 KAYSERİ iv ÖNSÖZ / TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca farklı bakış açıları ve bilimsel katkılarıyla beni aydınlatan ve yardımlarını esirgemeyen ve bu günlere gelmemde en büyük katkı sahibi sayın danışman hocalarım Doç.Dr. Servet ÖZCAN ve Prof. Dr. Umberto GALDERISI’ye teşekkür ederim. Tezin yapılmasında büyük katkıları olan Genom ve Kök Hücre Merkezi yöneticileri ile çalışanlarına, çalışmalarım süresince desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen laboratuvar arkadaşlarıma desteklerinden dolayı teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarım sırasında yanımda olan desteğini hiç esirgemeyen ve bilgi birikimleri ile yardımcı olan değerli arkadaşlarım Dr. Güler TOPRAK, Dr. Dilek CEYLAN, Dr. Nicola ALESSIO, Dr. Ahmet Raşit ÖZTÜRK, Moleküler Biyolog Eda MERT, Yüksek Biyolog Dilek BAHAR, Biyolog Ebru İBİŞ’e, hayatım boyunca yanımda olan ve ideallerimi gerçekleştirmemi sağlayan babam, annem, kardeşlerim ve ev arkadaşlarıma sonsuz teşekkür ederim. Ayrıca bu tez çalışmasına maddi destek veren Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne (Proje No: FYL-2015-5616) teşekkür ederim. Mustafa Burak ACAR Kayseri, Temmuz 2015 v GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMLARININ KANSER HÜCRE HATLARINA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Mustafa Burak ACAR Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Temmuz 2015 Danışmanlar: Doç.Dr. Servet ÖZCAN, Prof. Dr. Umberto GALDERISI ÖZET Senesens hücre bölünmesini durduran, ancak hücrelerin metabolik aktivitelerine devam ettiği, dejeneratif bir süreçtir. Mezenkimal kök hücreler (MKH) birçok dokuda bulunur ve sekrete ettikleri moleküller ile nişteki hücrelerin regülasyonunda önemli rol oynarlar. Senesent MKH’ler, kendi mikro çevrelerinde senesens ile ilişkili molekülleri salgılar. Bu moleküller ortamda bulunan diğer hücreleri (kök hücre, kanser vb.) farklı şekillerde etkiler. Bu çalışmada mezenkimal kök hücre kültürünün erken ve geç safhasında, sekretom içeren koşullandırılmış besiyeri (KBY) toplanmıştır. KBY sağlıklı (genç) MKH’lerin ve kanser hücre hatlarının besiyerlerine eklenmiştir. Senesens, apoptoz, mitokondri membran potansiyeli ve proliferasyon testleri yapılarak, sekretomun genç kök hücrelere ve kanser hücre hatlarına biyolojik etkileri incelenmiştir. Elde edilen bulgular, MKH sekretomunun en fazla genç MKH’lere etki ettiğini göstermektedir. Farklı koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen MKH grupları arasındaki farklar her testte anlamlı bulunmuştur. Senesent MKH sekretomunun içeriği kanser hücrelerinin genelinde senesens mekanizmasını aktive etmiştir. Kolon kanseri hücrelerinin apoptoz testinde senesent MKH sekretomundan etkilendiği gözlemlenmiştir. Diğer hücre hatlarının apoptoz testleride, kronik myeloid lösemi (KML) ve meme kanseri hücre gruplarında anlamlı farklar bulunmamıştır. Mitokondri membran potansiyeli incelenirken, sekretomun KML hücrelerinin membran depolarizasyonunu arttırdığı gözlenmiştir. Proliferasyon testinde meme kanseri hücrelerinin senesent MKH sekromu ile kültüre edildiğinde proliferasyon kapasitesi artmıştır. Sonuç olarak, MKH sekretomunun mikroçevresinde bulunan hücrelerin biyolojik mekanizmalarını etkileyen moleküller içerdiği ve bu moleküllerin kanser hücre hatlarının farklı mekanizmalarını (apoptoz, senesens vb.) etkilediği gözlenmektedir. Sekretomun mekanizma ve etkinin boyutu kanser hücresinin kökeni ve hücre tipine (tutunan, yüzen) göre değişkenlik göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Senesens, sekretom, kök hücre, kanser vi INVESTIGATION OF YOUNG AND SENESCENT MESENCHYMAL STEM CELL SECRETOME EFFECTS ON CANCER CELL LINES Mustafa Burak ACAR Erciyes University, Institute of Natural and Applied Sciences M.Sc. Thesis, July 2015 Supervisors: Doç.Dr. Servet ÖZCAN, Prof. Dr. Umberto GALDERISI ABSTRACT Senesence is a degenerative progress in which cells stops cell dividing yet these cells continue their metabolic activity. Mesenchymal stem cells (MSCs) exist in many tissues and play an important role in the regulation of cells in a niche with their secreted molecules. Senescent MSCs secrete molecules related to senescence in their micro environment. In a tissue these molecules may effect other cells (stem cell, cancer cell etc.) either positive or negative manner. In this study; conditional media (CM) which includes secretome was collected from MSCs at early and late stage of culture. CM was added to the culture medium of young MSCs and cancer cell lines. Effects of secretome to young MSCs and cancer cell lines was investigated by performing senescence, apoptosis, mitochondrial membrane potential and proliferation tests. The findings show that the secretome of MSCs effects mostly young MSCs. Differences between MSCs groups that incubated with different conditional media was found to be significant for every test. Molecules that present in senescent MSCs secretome activated senescence mechanism in all of cancer cell lines used in this study. It was observed that; apoptosis mechanism of colorectal cancer cells was effected by senescent MSCs secretome. However in the apoptosis test of other cell lines there were no significant differences between groups. While investigating the mitochondrial membran potential; it was observed that the secretome of senescent MSCs increased mitochondrial membrane depolarization of CML cells. In the proliferation test, proliferation capacity of breast cancer cells were increased when they were incubated with senescent MSCs secretome. In conclusion, secretome of MSCs contains molecules which effects biological mechanisms of other cells which were present in their micro environment and these molecules effected different mechanism (apoptosis, senescence etc.) of cancer cell lines. The mechanisms that effected by secretome and the extend of their effect can be changed with the parameters like origin of cancer cells and type (adherent, floating) of cell. Key words: Senescence, secretome, stem cell, cancer vii İÇİNDEKİLER GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMLARININ KANSER HÜCRE HATLARINA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK ..................................................................................... i YÖNERGEYE UYGUNLUK ...........................................................................................ii KABUL ONAY ...............................................................................................................iii ÖNSÖZ / TEŞEKKÜR .................................................................................................... iv ÖZET................................................................................................................................. v ABSTRACT ..................................................................................................................... vi İÇİNDEKİLER ...............................................................................................................vii KISALTMA VE SİMGELER .......................................................................................... xi TABLOLAR LİSTESİ ...................................................................................................xiii ŞEKİLLER LİSTESİ ..................................................................................................... xiv GİRİŞ ............................................................................................................................... 1 1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER 1.1. Senesens ................................................................................................................ 3 1.1.1. Senesens Nedir? ........................................................................................... 3 1.1.1.1 Replikatif (Kronik) Senesens ............................................................... 4 1.1.1.2. Prematüre Hücresel (Akut) Senesens................................................. 5 1.1.2. Hücresel Senesens Belirteçleri ............................................................... 6 1.1.2.1. Sekretomdaki Senesens Mesajı [Senescence Messaging Secretome (SMS-ing)] .............................................................................................. 7 1.2. Kök Hücre ............................................................................................................ 9 1.2.1. Mezenkimal Kök Hücre (MKH)................................................................. 9 1.2.1.1. Mezenkimal Kök Hücre Elde Edilen Dokular .................................. 9 1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücre Karakteristik Özellikleri ......................... 10 1.2.1.2.1. Morfoloji ..................................................................................... 10 viii 1.2.1.2.2. Yüzey Belirteçleri ....................................................................... 11 1.2.1.2.3. Farklılaşma Kapasiteleri ........................................................... 11 1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Parakrin Etkisi ................................. 11 1.2.1.3. Mezenkimal Kök Hücrelerin Tıpta Kullanımı ................................ 12 1.3. Kanser................................................................................................................. 13 1.3.1. Meme Kanseri ............................................................................................ 14 1.3.2. Kolon Kanseri ............................................................................................ 15 1.3.3. Kronik Myeloid Lösemi ............................................................................ 17 1.3.4. Çalışmada Kullanılan Hücre Hatları ....................................................... 18 1.3.4.1. MCF-7 (İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı) .................................... 18 1.3.4.2. DLD-1 (İnsan Kolon Kanseri Hücre Hattı) ..................................... 18 1.3.4.3. K562 (İnsan Kronik Myeloid Lösemi Hücre Hattı) ........................ 19 1.4. Hücre Kültürü ................................................................................................... 19 1.4.1. Hücre Kültürünün Tarihçesi .................................................................... 19 1.4.2. Hücre Kültürü İçin Gerekli Ekipmanlar ................................................ 20 1.4.3. Hücre Kültürü Kimyasalları .................................................................... 20 1.4.3.1. Mediumlar .......................................................................................... 20 1.4.3.1.1. Medium İçeriğindeki Maddeler ................................................ 21 1.4.3.1.1.1. Tuzlar................................................................................... 21 1.4.3.1.1.2. Vitaminler ........................................................................... 21 1.4.3.1.1.3. Glukoz.................................................................................. 21 1.4.3.1.2. Medium İçeriğine Dahil Edilen Diğer Maddeler..................... 22 1.4.3.1.2.1. Serum ................................................................................... 22 1.4.3.1.2.2. Aminoasitler ........................................................................ 22 1.4.3.1.2.3. Antibiyotikler ...................................................................... 22 1.4.3.1.2.4. Hormonlar ve Büyüme Faktörleri .................................... 22 1.4.3.2. PBS (Fosfatla Tamponlanmış Tuz Çözeltisi) ....................................... 22 1.4.3.3. Tripsin...................................................................................................... 23 1.5. Testler ................................................................................................................. 23 ix 1.5.1. Testler Senesense Bağlı Beta-Galaktozidaz Aktivitesi Tespiti............... 23 1.5.2. Apoptoz Testi ............................................................................................. 23 1.5.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi .................................................. 24 1.5.4. Proliferasyon Testi ..................................................................................... 24 2. BÖLÜM GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Mezenkimal Kök Hücrelerin Eldesi ..................................................................... 25 2.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültürü .................................................................. 25 2.2.1. Besiyeri Hazırlanması .................................................................................... 25 2.2.2. Hücre Kültürü Basamakları.......................................................................... 25 2.3. Mezenkimal Kök Hücrelerde Replikatif Senesens Oluşturulması .................... 26 2.4. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilecek MKH’lerin Senesens Testleri ........... 26 2.5. Koşullandırılmış Besiyeri Hazırlanması .............................................................. 27 2.6. Genç MKH’lere Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri ............... 27 2.6.1. Senesens Testi ................................................................................................. 27 2.6.2. Apoptoz Testi .................................................................................................. 28 2.6.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi ....................................................... 28 2.6.4. Proliferasyon Testi ......................................................................................... 29 2.7. Kanser Hücre Hatlarının Hazırlanması .............................................................. 29 2.7.1. Besiyeri Hazırlanması .................................................................................... 29 2.7.2. Kültür Basamakları ....................................................................................... 29 2.8. Kanser Hücre Hatlarına Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri . 30 2.8.1. Senesens Testi ................................................................................................. 30 2.8.2. Apoptoz Testi .................................................................................................. 31 2.8.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi ....................................................... 31 2.8.4. Proliferasyon Testi ......................................................................................... 31 2.9. İstatistiksel Analiz .................................................................................................. 32 x 3. BÖLÜM BULGULAR 3.1. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testlerinden Elde Edilen Bulgular ...................................................................................................... 33 3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Testlerinden Elde Edilen Bulgular ...................................................................................................... 34 3.3. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testlerinden Elde Edilen Bulgular.............................................................................................. 36 3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran Potansiyeli Testlerinden Elde Edilen Bulgular ................................................... 37 3.5. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon Testlerinden Elde Edilen Bulgular ....................................................................... 39 4. BÖLÜM TARTIŞMA - SONUÇ VE ÖNERİLER 4.1. Tartışma .................................................................................................................. 42 4.2. Sonuç ve Öneriler ................................................................................................... 52 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 53 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 59 xi KISALTMA VE SİMGELER Sembol Anlamı 7-AAD 7-Aminoactinomycin D APC Anaphase Promoting Complex ATM Ataxia Telangiectasia Mutated bFGF Basic Fibroblast Growth Factor CML Chronic Myleoid Leukemia DCC Deleted in Colorectal Cancer DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimetil Sülfoksit (Dimethyl Sulfoxide) DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline EGF Epidermal Growth Factor FBS Fetal Bovine Serum HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) IFN Interferon IGFBP Insullin Like Growth Factor Binding Protein IL Interleukin K3[Fe(CN)6] Potasyum Ferrisiyanür K4[Fe(CN)6] Potasyum Ferrosiyanür KML Kronik Myleoid Lösemi MKH Mezenkimal Kök Hücre MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) NaHCO3 Sodyum Bikarbonat PAI Plasminogen Activator Inhibitör PDGF Platelet Derived Growth Factor PE Fosfatidil-Etanolamin (Phosphatidylethanolamine) PS Fosfatidil-Serin (Phosphatidylserine) xii RB Retinoblastoma SAHF Senescence Associated Heterochromatin Foci SASP Senescence Associated Secretory Phenotype SDF Stromal Cell Derived Factor STK Serological Thymidine Kinase TGF- β Transforming Growth Factor- Beta VEGF Vascular Endothelial Growth Factor X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside) β-Gal Beta-galaktozidaz xiii TABLOLAR LİSTESİ Tablo 3.1. KBY Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testi Sonuçları ........................... 33 Tablo 3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Senesens Test Sonuçları .................................................................................................... 34 Tablo 3.3. Senesens Testi – T-Test p Değerleri .......................................................... 35 Tablo 3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testi Sonuçları .................................................................................................... 36 Tablo 3.5. Apoptoz Testi Apoptotik Hücre– T-Test p Değerleri ................................ 36 Tablo 3.6. Apoptoz Testi Ölü Hücre– T-Test p Değerleri .......................................... 36 Tablo 3.7. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran Potansiyeli Testi Sonuçları ........................................................ 38 Tablo 3.8. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi – T-Test p Değerleri ................... 38 Tablo 3.9. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon Testi Sonuçları ........................................................................................... 39 Tablo 3.10. MTT Testi 24.saat – T-Test p Değerleri .................................................... 40 Tablo 3.11. MTT Testi 48.saat – T-Test p Değerleri .................................................... 40 xiv ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1.1. Senesens’in sebepleri ve sonuçları ................................................................... 4 Şekil 1.2. Kronik ve akut senesens mekanizmlarının izlediği yolaklar ............................ 6 Şekil 1.3. Senesens mekanizmasının önemli molekülleri ................................................. 8 Şekil 3.1. Genç mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü ................................... 33 Şekil 3.2. Senesent mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü ............................. 34 1 GİRİŞ Senesens metabolizma hızı yüksek, mitotik olarak aktif, sıkça yenilenmeye ihtiyacı olan dokuları etkileyen, iç ve dış faktörlerin sebep olduğu sistemik, dejeneratif bir yaşlanma sürecidir. Bu süreçte doku içerisinde, dokunun profilini belirleyen hücrelerde moleküler değişimler meydana gelir. Hücresel senesens hücre döngüsünün kalıcı olarak durduğu bir süreçtir. Senesens sürecine giren hücrelerin DNA içeriği tipik olarak hücre döngüsünün G1 fazındaki hücrelerin DNA içeriği gibi kalır ancak bu hücreler metabolik olarak aktiftirler. Senesens süreci, dokunun rejenerasyon özelliğini büyük ölçüde azaltır [1]. Hücresel senesens, ilk başlarda hücre içi bir mekanizma olarak değerlendirilmekte iken son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu yaşlanma sürecinin esasında hücrelerin mikro çevrelerine salgıladıkları moleküllerle de düzenlendiğini göstermektedir [1]. Doku içerisinde doku profilini düzenleyen kök hücreler, bu yaşlanma sürecinden etkilenir. Senesens sürecine girmiş bir kök hücre dokuya salgıladığı moleküllerle dokunun diğer hücrelerine etki edebilir. Bu etki farklı şekillerde olabilir. Salgılanan faktörler, dokunun sağlıklı hücrelerini senesens sürecine sokabilir. Bu durum dokuda yaşlanmaya sebep olur. Salgılanan moleküler, hasarlı komşu hücreleri uyararak neoplastik dönüşüme gitmelerine engel olurlar. Böylece tümör oluşumu engelerler. Ancak senesens sürecinde salgılanan faktörler, tümör oluşumunun erken safhalarında baskılayıcı bir rol üstlenmesine rağmen, geç safhalarda tümör gelişimini destekleyen bir etken olabilirler [2]. Yaşlanma süreci dokuda yer alan kök hücreleri de etkilemektedir. Bu kök hücreler salgıladıkları faktörler ile doku profilini belirler, dokunun büyümesinde ve yenilenmesinde önemli rol oynarlar [1]. Bu hücrelerin en önemlilerinden biri mezenkimal kök hücrelerdir. Mezenkimal kök hücreler (MKH) organizmada birçok dokuda bulunurlar, dokunun büyümesinde ve hasarlı dokunun yenilenmesinde önemli rol oynarlar. MKH’lerin tedavi edici potansiyelleri yüksek olduğundan tıpta kullanımı oldukça fazladır. Ayrıca bilimsel araştırmalar açısından MKH’ler; izolasyonu, kültürü ve 2 manipülasyonu kolay olan bir hücre tipidir. Kemik iliği ve yağ doku başta olmak üzere birçok dokudan kolaylıkla elde edilebilirler [3]. Senesens MKH’lerin proliferasyon kapasitelerini sınırlandırır, böylece hücrelerin bölünme süreleri uzar, telomeraz aktivitesini kaybeder ve senesense bağlı betagalaktozidaz aktivitesi artar. MKH’ler parakrin etki potansiyeli yüksek hücreler olduğundan, senesens sürecine girdikleri zaman bulundukları dokuya senesens ile ilgili faktörler salgılarlar. Bu faktörler, dokudaki diğer hücreleri ve dolayısıyla dokunun karakteristik özelliklerini etkiler [4]. Bu çalışmada genç MKH’lerden ve uzun süre kültüre edilerek senesens mekanizması aktif olmuş MKH’lerden elde edilen ve bu hücrelerin salgıladığı faktörleri içerdiği öngörülen koşullandırılmış besiyerleri toplanmıştır. Bu koşullandırılmış besiyerleri, MCF-7 (İnsan meme kanseri hücre hattı), DLD-1 (insan kolon kanseri hücre hattı) ve K562 (İnsan kronik myeloid lösemi hücre hattı) kanser hücre hatlarının besiyerlerine eklenmiş, daha sonra kanser hücre hatları testlere tabii tutulmuştur. Elde edilen koşullandırılmış besiyerleri ayrıca genç MKH’lerin kültür ortamına da eklenip aynı testler tekrarlanmıştır. Böylece, MKH’lerin hem genç, hem de senesent durumda iken salgıladığı faktörlerin, kanser hücreleri üzerine ve genç MKH’ler üzerine biyolojik etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 3 1. BÖLÜM GENEL BİLGİLER 1.1. Senesens 1.1.1. Senesens Nedir? Hücresel senesens; hücre bölünmesinin kalıcı olarak durduğu, hücreyi strese sokan iç ve dış faktörler tarafından tetiklenen fizyolojik bir program olarak tanımlanmaktadır. Bu faktörler telomer kısalması, oksidatif stres, onkojenik aktivite, DNA hasarı ve ya aynı mikro çevredeki senesent hücrelerin parakrin etkileri olabilir. Senesens zamanla hücrede fonksiyon kaybına sebep olur ve dokunun kendini yenileme kapasitesinde azalmaya neden olur [5]. Öte yandan senesens tümör gelişimini durdurur. Senesent hücreler bölünme yeteneğini kaybetse de metabolik olarak aktiftirler [6]. Hücreler kültür ortamında belli bir bölünme sayısından sonra senesense girer. Örneğin fibroblastlar kültürde 50 bölünmeden sonra senesent hale gelirler. Bu şekilde aktive olan senesens mekanizması replikatif senesens veya Hayflick Limiti olarak isimlendirilir [7]. Replikatif senesens dışında farklı senesens türleri vardır. Uyarılmış senesens bunlardan biridir. Senesent olmayan bir hücrenin serbest radikallere yada kemoterapi ilaçlarına maruz kalarak senesens mekanizmasının aktive olması, uyarılmış senesens olarak tanımlanır. Hidrojen peroksit, cisplatin ve doxorubicin en çok bilinen senesens uyarıcı ajanlardır [8]. Diğer senesens mekanizması ise onkojenik aktivite sonucu uyarılmış senesenstir. Bu senesens mekanizması; onkogenlerin aktive olması sonucu ya da tümör baskılayıcı genlerde fonksiyon kaybı olması gibi durumlarda aktive olur ve tümör baskılayıcı bir mekanizma olarak kabul edilir [9]. Senesens mekanizmasının sebepleri ve sonuçları Şekil 1.1’de gösterilmiştir. Senesent hücreler ölçüt olarak aşırı şekilde büyürler, birden fazla çekirdekleri bulunabilir. Oldukça fazla β-gal aktivitesi sonucunda lizozom sayısında artış gözlenir [10]. Kalitatif 4 ölçüt olarak senesent hücrelerin belirlenmesinde pH:6’daki beta-galaktozidaz aktivitesi temel alınır. X-gal, 4-MUG gibi beta-galaktozidaz substratları kullanılarak boyama veya flüoresan ışıma açığa çıkaran reaksiyonlar ile hücredeki beta-galaktozidaz miktarı belirlenir [11]. Şekil 1.1. Senesens’in sebepleri ve sonuçları [2]. 1.1.1.1 Replikatif (Kronik) Senesens İnsana ait dokulardan bağımsız hücreler elde edildiğinde bu hücrelerin proliferasyon kapasiteleri 3 fazda incelenmiştir. İlk faz birinci pasajdan önceki çoğalma evresidir. İkinci faz hızlı bir şekilde hücrelerin çoğaldığı birinci pasaj sonrası evre, 3. faz ise çoğalmanın azaldığı ve durduğu evredir. Hücrenin yaşamaya ve metabolik aktivitelerini gerçekleştirmeye devam ettiği halde, proliferasyon kapasitesinin azaldığı bu evre hücresel senesens olarak isimlendirilmiştir [7]. Ökaryortik, doğrusal DNA’nın ucunda, yapının bütünlüğünü koruyan telomerler bulunmaktadır. Kültürdeki hücrelerin telomerlerinde her bölünme sonrasında kısalma meydana gelir. Bunun sebebi kesintili zincirde son Okazaki frangentinden sonra gelen primerin çıkarılmasından sonra, ligaz enziminin boşluğu kapatamamasıdır. Bu durumu telomeraz enzimi düzeltir. Ancak telomeraz enzim aktivitesi her bölünmede azalır. 5 Böylece hücre her bölünmede Hayflick Limiti’ne biraz daha yaklaşır. Yani replikatif senesens, DNA replikasyonu ile birlikte gelen bir durumdur. Telomerler kısalarak minimum boyuta geldiklerinde kromozomal DNA’yı koruyan yapıları bozulur. Dahası senesent hücrelerde ATM ve ATR gibi kinazlar aktive olur. Bu mekanizma G1 fazı kontrol proteini p53’ün de dahil olduğu hücre döngüsü ile ilgili proteinleri fosforile ederek bölünmeyi durdurur. Bu şekilde hücre kendine hasarı düzeltmek için fırsat sağlar. Eğer hasar düzeltilemiyorsa hücre senesense ve apoptoza girer [12]. Replikatif senesens p53’e ek olarak p21, RB (Retinoblastoma) tümör baskılayıcı gen ailesi ve onların sinyal partneri p16INK4A ( RB genlerinin 5’ kısmında çalışan siklinbağımlı kinaz inhibitörü) ile de bağlantılıdır. p53 ve RB- p16INK4A yolakları, insan hücrelerinin senesens mekanizmasında önemli rol oynarlar [12]. 1.1.1.2. Prematüre Hücresel (Akut) Senesens Senesens telomer fonksiyonundaki bozulmalarla meydana gelebileceği gibi, farklı koşullar tarafından da uyarılabilir. Bu tür senesens mekanizması prematüre hücresel senesens olarak adlandırılır [12]. Prematüre senesens türlerinden ilki stres ile uyarılmış senesenstir. Hücrelerde senesens mekanizmasını uyaran etken kimyasal ajanlar (doxorubicin, cisplatin), yüksek besin ve büyüme faktörü konsantrasyonu, serbest radikaller (hidrojen peroksit) veya hücre çevreleyen diğer hücreler olabilir. Fare embriyonik fibroblastlarının yaşam sürelerinin serum içermeyen ve diğer büyüme faktörleriyle desteklenen besiyerinde arttığı gözlenmiştir [12]. Onkogen-uyarılmış senesens (OIS) ise onkogen aktivasyonuna karşı verilen güçlü bir anti-proliferatif bir cevaptır. Tümör oluşumunu erken aşamada baskılar. ARF- p53 ve RB- p16INK4A sinyal yolakları OIS’te önemlidirler (Şekil 1.2) [9,12]. Onkogen mutasyonu veya aşırı ifadesine benzer olarak, tümör baskılayıcı genlerdeki fonksiyon kaybı da senesens mekanizmasını tetikleyebilir. PTEN ve NF1 bu duruma örnek teşkil eder. PTEN proteininin (p53’ün uyarılmasını sağlar.) olmadığı durumda fare embriyonik fibroblastlarında senesens mekanizması aktive olmaktadır. Benzer olarak NF1 fonksiyon kaybında RAS aktivitesi artar. Bu durum senesense sebep olmaktadır [12]. 6 Şekil 1.2. Kronik ve akut senesens mekanizmlarının izlediği yolaklar [9]. 1.1.2. Hücresel Senesens Belirteçleri Hücre döngüsünün durması hücresel senesensin önemli belirteçlerinden biridir. Hücre döngüsü kontrol proteinleri hasarlı hücrelerin hücre döngüsünü dururarak, tümör oluşumuna engel olurlar. Senesent hücreler genellikle G1 fazında kalırlar [12]. Bir diğer belirteç morfolojik değişikliklerdir. Senesent hücreler giderek büyür ve çok çekirdekli olurlar. Lizozom miktarı bu hücrelerde artar. [12]. Hücresel senesensin en önemli belirteci β-gal aktivitesidir. β-gal substratları kullanılarak yapılan boyamalarla, senesent hücreler kalitatif olarak belirlenebilir [12]. Senesens ayrıca kromozom yapısındaki değişikliklerle de alakalı bir durumdur. Normal hücrelerde, DNA boyaları ile boyandığında homojen desenler gözlenirken, senesent 7 hücreler heterojen şekilde boyanır. Heterojen bir desen gösteren bu bölgeler senesense bağlı heterokromatik bölgelerdir (SAHF) [12]. Hücrelerin salgıladıkları sitokin ve kemokinler de senesens mekanizmasının önemli elemanlarıdır. Bu salgılar genel olarak SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) olarak isimlendirilir [12]. 1.1.2.1. Sekretomdaki Senesens Mesajı [Senescence Messaging Secretome (SMSing)] Senesens mekanizması ilk başlarda, hücre içi bir mekanizma olarak düşünülmekteyken, son yapılan çalışmalarla; hücresel senesensin, hücreler dışı matriks içeriğindeki değişimlerle ilgili olduğunu ortaya koyulmuştur. Örneğin insülin benzeri büyüme faktörü bağlanma proteini 3 (IGFBP3), 1 (IGFBP1) ve plazminojen aktivatör inhibitörü 1’in (PAI1) dahil olduğu salgılanan faktörlerin ekspresyonu senesenste değişiklik gösterir. Sonuç olarak, daha önce bahsedilen faktörler, peptitler, proteinler ve hücreler dışı matriks bileşenleri, senesens mekanizmasının aktive olmasıyla güçlü bir şekilde uyarılır. Senesens oluşumuna katılan ve senesens oluşması için bolca bulunması gereken birkaç anahtar faktör rapor edilmiştir. Bunlardan bazıları Wnt, IGF1, plazmin ve interlökin (IL) ve TGF-β’dır. Literatürde bulunan veriler bu faktörlerin öncelikli fonksiyonlarının hücreler arasında iletişim sağlanmak olduğunu öngörmektedir. Ancak son yapılan çalışmalar bu faktörlerin sekretomda bulunan senesens mesajı olduğunu kanıtlar niteliktedir [9]. Yani bu faktörler senesent hücrelere kendi mikro çevreleri ile iletişime geçme olanağı sağlar. Eğer ki bu senesent hücre, parakrin etkisi yüksek, doku profilini belirleyen bir kök hücre ise; salgılanan senesens mesajı dokulardaki diğer hücreleri de etkiler. Sekretomda bulunan senesens mesajının senesens oluşumunda etkili olduğundan bahsedilmektedir. Farklı hücre tiplerinde senesens mekanizmasının uyarılması, salgılanan faktörlerin etkili olduğu birkaç sisteme bağlıdır. Bu faktörler insülin benzeri büyüme faktörü bağlanma proteini (IGFBP), interlökin (IL) ailesi, plazmojen aktivatör inhibitörü ve TGF-β’dır. IGF sinyal sistemi ve IGFBP’ler ve PAI1-plazmin sistemi senesens mekanizmasında kilit rol oynarlar. TGF-β hücresel senesens oluşumunu 8 uyarırken, WNT2 bu uyarılmayı inhibe eder. IGF’ler ve interferonlar (IFN) da bu şekilde karşılıklı çalışan moleküllerdir (Şekil 1.3) [9]. Şekil 1.3. Senesens mekanizmasının önemli molekülleri [9]. Sekretomdaki senesens mesajının, hücre içi senesens yolaklarını nasıl etkilediği önemli bir konudur. Moleküler mekanizmanın tamamı oldukça karışık bir tablo oluşturur. Ancak salgılanmış faktörler ile hücre içi senesens mekanizmasında rol oynayan iki kritik molekül vardır [9]. Bunlar RB yolağı inhibitörleri INK4A ve INK4B’dir. INK4B senesens ile alakalı salgılanmış faktörlerin potansiyel hedefidir. INK4B’nin ekpresyonu, TGF- β ve IL-6 gibi senesens mekanizmasını uyaran faktörlerin varlığında artar. Bu faktörlerin azalmasıyla INK4B’in de ifadesi azalır [9]. Sekretomdaki bazı faktörler de p53 yolağını etkiler. p53 tümör baskılayıcı protein IGFBP3 ve IGFBP5 için sinyal hedefidir. TGF- β’nın p53 üzerinde etkisi yoktur. Bu durum bu sitokin için önemli bir eksiklik teşkil eder [9]. Benzer durum p53’ün hedefi olan PAI1 içinde geçerlidir. Salgılanan faktörlerden IL-6 ve WNT2 ise, p53 yolağından bağımsız olarak çalışır. Tüm bu kanıtlar salgılanan faktörler hücre içi senesens mekanizmasını kontrol eden INK4A-RB ve p53 yolaklarını etkileyerek hücresel senesens mekanizmasının durumunu belirleyebilir [9]. 9 1.2. Kök Hücre Kök hücre hiyerarşik olarak çeşitli hücre tiplerine farklılaşma potansiyeli olan, bölünerek kendini yenileme ve çoğalma potansiyeline sahip, çok hücreli canlıların doku ve organlarını oluşturan temel hücrelerdir. Memelilerde kök hücrelerin iki yaygın tipi vardır. Bunlardan birincisi embriyonun blastokist evresinde, iç hücre kitlesini oluşturan embriyonik hücrelerdir. Bu hücrelere “pluripotent hücreler” adı verilir ve gelişmiş bir organizmanın her tabakasında (mezodermal, endodermal ve ekdodermal) yer alan, hücreleri ve dokuları oluşturabilme potansiyeline sahiptirler. Daha düşük dönüşme potansiyeline sahip bir diğer kök hücre tipi ise; organizmanın her dokusunda yer alan multipotent kök hücrelerdir. Multipotent kök hücreler, bulundukları dokunun onarımı ve yenilenmesinde görev alırlar [13]. 1.2.1. Mezenkimal Kök Hücre (MKH) İlk olarak 1924 yılında Aleksander Maximow tarafından fark edilmiştir. Maximow, kanda bulunan ve farklılaşma yeteneği olan bu hücrelere mezenkimal kök hücreler adını vermiştir. 1960'lı yıllarda Ernest McCulloch ve James Till, mezenkimal kök hücre araştırmalarını ilerleterek kültür ortamında çoğaltmayı başardılar. Mezenkimal kök hücreler (MKH), çeşitli hücrelere farklılaşma yeteneği olan multipotent stromal kök hücrelerdir. Mezenkimal kök hücreler, iskelet kası hücrelerini, kan, vasküler ve ürogenital sistemi ve vücut bağ dokusunu meydana getiren, mezodermal orjinli primordiyal hücrelerdir. Kemik doku, kıkırdak doku ve yağ doku gibi hücre çeşitlerine farklılaşabilirler. Hematopoetik kökenli olmayan MKH’ler, hem mezenkimal hem de mezenkimal olmayan hücre hatlarına farklılaşabilen, multipotent kök hücre benzeri hücreler olarak değerlendirilmektedir. MKH’ler görevleri bakımından oldukça dikkat çekicidir. Aslında MKH’ler mezenkimal dokulardaki farklılaşmanın yanı sıra hematopoezisi destekler ve çok sayıda organ ve dokunun homeostatik dengesinin korunmasında görev alır. Bulundukları dokudan ayrılıp hasarlı olan dokulara geçerek hasarlı dokunun tamirini yaparlar [3]. 1.2.1.1. Mezenkimal Kök Hücre Elde Edilen Dokular Mezenkimal kök hücrelerin elde edildiği, kemik iliği, yağ doku, diş pulpası göbek kordonu gibi çeşitli dokular vardır. Bu doku çeşitlerinden en çok kullanılanlar yağ doku ve kemik iliğidir. 10 Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler uzun zamandır bilinen ve tıpta tedavi amaçlı kullanılan hücrelerdir. Uyluk kemiği gibi büyük kemiklerin iç boşluğunda bulunan ilik alınıp çeşitli yöntemlerle mezenkimal kök hücreler izole edilir ve kültüre edilir. Kemik iliği kaynaklı MKH’ler fibroblast benzeri bir morfolojiye sahiptir [14]. Yağ doku mezenkimal kök hücre izolasyonu için uygun olan bir diğer dokudur. Hatta MKH elde edilen dokular arasında en zengin kaynaktır. 1 gram yağ dokuda, 1 gram kemik iliğine oranla 500 kat daha fazla kök hücre bulunabilir [14]. Bir diğer MKH kaynağı ise diş pulpasıdır. Dişin kemik tabakası kırıldıktan sonra içinden çıkan öz kısmı önce fiziksel daha sonra enzimatik olarak parçalanır ve kültüre edilir. Ancak elde edilen kök hücre sayısı yağ doku ve kemik iliğine göre çok daha azdır. MKH izolasyonunda genellikle yağ doku ve kemik iliği gibi kaynaklar kullanılsa da, göbek kordonundan da MKH elde edilebilmektedir. En genç ve ilkel MKH’ler göbek kordonunun Wharton Peltesi (WP) adı verilen jelatinsi kısmından izole edilir. Göbek bağı doğumdan sonra kolaylıkla alınıp bu hücrelerin kültürü yapılabilmektedir. Göbek kordonunun bu kısmı benzersiz bir MKH populasyonu içerir. Bu MKH’lerin bağışıklık ve kök hücre özellikleri yetişkin dokulardaki kök hücrelere kıyasla daha güçlü bir şekilde ifade edilir [14]. Göbek kordonunun WP bölümünden elde edilen MKH’ler, kemik iliği ve yağ doku gibi yetişkin dokulardan elde edilen MKH’lere oranla proliferasyon özelliğine ve daha fazla immün-baskılayıcı özelliğe sahiptir. Ayrıca bu hücreler, terapötik olarak daha aktiftirler [15]. Bütün bu bahsedilen MKH kaynakları dışında, MKH’ler deri, kas, amniyotik membran, saç folikülleri, karaciğer, pankreas gibi birçok organ ve dokudan elde edilebilir [14]. 1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücre Karakteristik Özellikleri 1.2.1.2.1. Morfoloji Mezenkimal kök hücreler, kültür ortamında plastik yüzeye tutunan hücrelerdir. Uzun ve ince fibroblast benzeri bir yapı veya düz yassılaşmış olmak üzere iki tip morfoloji gösterebilirler [3]. Hücrelerin morfolojisi izole edildikleri doku ve organizmaya göre farklılık gösterebilir. Hücreler genellikle kromatin partikülleriyle çevrelenmiş bir çekirdek içerir. Hücrenin geri kalan kısmı; golgi aygıtı, endoplazmik retikulum, mitokondri ve poliribozomlar ihtiva eder [16]. 11 1.2.1.2.2. Yüzey Belirteçleri Mezenkimal kök hücrelerin karakterizasyonu genellikle yüzey belirteçleri ile karakterize edilir. MKH’ler için pozitif yüzey belirteçlerinden bazıları CD44, CD71, CD90 ve CD105’tir. Karakterizasyon için sık kullanılan negatif yüzey belirteçleri ise CD34, CD45, CD104 ve CD106’dır. Yüzey belirteçlerin iki farklı metot ile belirlenir. Bunlardan ilki immunositokimyasal boyamadır. Bu yöntemde fikse edilmiş hücreler, yüzey belirteçlerine bağlanan antibadiler ile boyanıp mikroskop altında incelenir. İkinci yöntem ise akım sitometri cihazında (FACS), yüzey belirteçleri, antibadilerle boyanmış hücrelerin incelenmesidir [4]. 1.2.1.2.3. Farklılaşma Kapasiteleri Kültür ortamında MKH’ler kolaylıkla farklı hücrelere farklılaşabilirler. Örneğin fare mezenkimal kök hücreleri deksametazon, askorbik asit ve β-gliserofosfat varlığında kemik doku hücrelerine, amfoterisin-b varlığında kas hücrelerine farklılaşırlar. İnsan mezenkimal kök hücreleri deksametazon, insülin ve indometasin varlığında yağ hücrelerine, TGF-β3 varlığında, 3 boyutlu kültürde kıkırdak doku hücrelerine farklılaşırlar. Yine insan mezenkimal kök hücreleri izobütilmetilksantin ve dibütilsiklikamp varlığında nöron benzeri hücrelere farklılaşırlar [3]. Mezenkimal hücreler farklılaştıktan sonra, Alkalin fosfataz, Alizarin Red, Oil Red ve Von Kossa gibi boyama metotları ile farklılaşmaları belirlenebilir [3]. 1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Parakrin Etkisi Parakrin sinyal iletimi, bir hücrenin salgıladığı sinyal molekülünün kendi mikro çevresinde bulunan hücreler etki etmesidir. Özellikle çok hücreli organizmalarda gelişimi düzenleyen birçok büyüme faktörü kısa mesafede etkilidir, dolayısıyla parakrin sinyal iletimi sayesinde taşınır. Bu sinyaller, sinyalin üretildiği hücreden uzaklara yayılmak suretiyle bir yoğunluk gradiyenti oluşturur ve hedef hücrenin uzaklığına bağlı olarak farklı hücresel yanıtlar uyarır. Mezenkimal kök hücreler de birçok işi sekrete ettikleri aktif moleküller sayesinde gerçekleştirirler. Yapılan araştırmalar MKH’lerin doku onarımı üzerinde etkili olduğunu desteklemektedir ve bu hücrelerin tümör büyümesini teşvik edici etkilerinin dolaylı olarak parakrin aktivitelerine bağlı olduğu kabul edilmektedir [17]. Bunun yanı sıra son çalışmalar MKH’lerin doku onarımı için önemli 12 olabilecek faktörleri salgılayarak dokuyu değiştirebileceğini öne sürmektedir. Örneğin immünyetmezliği olan akut miyokardial infarktüs geçirmiş farelere insan MKH’leri verildiğinde, enjeksiyondan sonra 3 hafta süresince donör hücrelere rastlanmamasına rağmen, farelerin kalp fonksiyonlarında iyileşmeler görülmüştür [18]. Ayrıca osteogenezite problemi olan ve MKH tedavisi alan çocukların büyüme hızı, kemik mineral yoğunluğu ve hareket etmelerinde önemli iyileşmeler tespit edilmiştir [19]. Hasarlı dokunun tamirinin, dolaşıma katılan MKH’ler tarafından yapıldığının tespiti yeni fark edilmiş bir durumdur. Bu MKH’ler hasarlı bölgenin iyileştirilmesi için, dokuya özgü kök hücreleri etkileyecek büyüme faktörlerini salgılar [20]. MKH’lerin tüm bu onarıcı fonksiyonlarının yanında, organizma için bazı dezavantajları da mevcuttur. MKH’ler tümör hücresini, endotelyal hücreleri ve düz kas hücrelerini etkileyecek büyüme faktörleri üreterek veya VEGF, PDGF, bFGF, SDF-1 gibi anjiojenik büyüme faktörlerini salgılayarak tümör dokusuna damar sağlayabilir [21]. Yapılan son çalışmalar MKH ve bu hücreden türevlenen hücre tiplerinin, karsinoma hücre davranışına ait kritik belirteçlerinden biri olan prostaglandin E(2) ve sitokinleri açığa çıkarma yeteneği sayesinde tümörün ilerlemesine imkan sağlayan bir kanser kök hücre nişi meydana getirebildiklerini göstermiştir [22]. 1.2.1.3. Mezenkimal Kök Hücrelerin Tıpta Kullanımı Mezenkimal kök hücreler yetişkin kök hücrelerin, klinik uygulamalarda çeşitli doku mühendisliği uygulamalarında ümit vadeden benzersiz bir türüdür. Bu hücreler insan vücudunun çeşitli yerlerinden, özellikle kemik iliği ve yağ dokudan kolayca izole edilebilir [23]. Gerektiğinde bulundukları dokudan ayrılıp, hasarlı dokuya hareket ederek, bu dokunun tamirini, salgıladıkları faktörler ile gerçekleştirebilirler, hatta yüksek farklılaşma potansiyelleri ile dokudaki hücrelere farklılaşarak yapıya katkıda bulunurlar [23]. MKH’lerin tüm bu özellikleri, bu hücrelerin tıpta ve doku mühendisliğinde önemli bir araç olmasını sağlamaktadır. MKH’ler hastalara intravenöz enjeksiyon ile veya hasarlı dokuya direkt enjeksiyon ile verilebilir. MKH’ler; GVHD, lösemi gibi birçok sistemik veya onkojenik hastalığın yanı sıra, ortopedik rahatsızlıklarda da hastaya uygulanabilir. Hastaya uygulanacak MKH’ler izole steril ortamlarda üretilir, kalite kontrol ve mikrobiyolojik testleri yapıldıktan sonra hastaya verilir. 13 1.3. Kanser Hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını kontrol eden mekanizmalarda meydana gelen hasar sonucunda, hücrelerin kontrolsüz bir biçimde çoğalması olayına kanser denir. Dünyada her yıl 100.000 insandan 100-350’si kanser yüzünden hayatını kaybetmektedir [13]. Hücrenin gelişimi boyunca karmaşık genetik kontrol sistemleri, hücre oluşumu ve ölümü arasındaki dengeyi sağlar. Organizmadaki bazı hücre tipleri, doku yenileme stratejisi olarak, bölünme ve çoğalma yolunu izlerler. Bu hücreler belli bir süre yaşadıktan sonra ölür ve kaybolurlar. Sıklıkla bölünen ve çoğalan hücrelerdeki kontrol mekanizmalarının bozulması tümör oluşumuna neden olmaktadır [13]. Genetik kontrol mekanizmalarının bozulması genellikle kimyasallar, hormonlar, viral ve iyonize radyasyon gibi etkenler aracılığıyla olur. Bu tür etkenler ile DNA’da oluşan hasar, tamir mekanizmaları tarafından düzeltilmez ise hücreler neoplastik dönüşüme uğrar. Kanserleşme iki geniş gen gurubundaki mutasyonlar ile ilişkilidir. Bunlar protoonkogenler ve tümör baskılayıcı genlerdir. Proto-onkogenler, normalde hücre büyümesini teşvik eden genlerdir. Bu genlerde meydana gelen mutasyonlar genin onkogen’e dönüşmesine ve gen ürününün aşırı şekilde ifade edilmesine sebep olur. Tümör baskılayıcı genler ise büyümeyi sınırlandıran genlerdir. Bu genlerde meydana gelen mutasyonlar, genin baskılayıcı özelliğini kaldırır ve olağan dışı hücre bölünmesinin önü açılmış olur. Örneğin; insan tümör hücrelerinin yarısında, transkripsiyonel düzenleme için anahtar rol oynayan bir proteini kodlayan p53 tümör baskılayıcı geni mutasyona uğramıştır. Hücre döngüsünün kontrolünde G1 fazı önemli bir kontrol noktasıdır. Bu aşamada hasarlı DNA’ya sahip hücreler S fazına geçemezler. DNA’sında hasar bulunan hücrelerin G1 fazında kalmasını p53 proteini sağlar. Kanser ile ilgili bir diğer gen grubu ise koruyucu genlerdir [13]. Kanserin genetik temelinde daha önce bahsettiğimiz genlerde meydana gelen mutasyonlar vardır. Proto-onkogenleri onkogenlere dönüştüren kazandırıcı mutasyonlar bunlara örnektir. Bu mutasyonların oluşumunda dört farklı mekanizma bilinmektedir. Bu mekanizmalardan ilki aktif veya hiperaktif protein ürünü oluşmasına sebep olan nokta mutasyonlarıdır. Diğeri kromozomal yer değiştirmelerdir. Bir diğeri büyüme düzenleyici bir genin farklı bir genin promotoru altına girmesine sebep olan yer değiştirmelerdir. Bu 14 mutasyon genin aşırı şekilde ifade edilmesine neden olur. Sonuncu mekanizma ise bu proto-onkogenlerin kopyasının oluşmasıdır [13]. Bazı virüsler genomlarında onkogenler içerir ve bu onkogenlerin enfekte ettiği canlının genomuma girmesini sağlayarak kanser oluşturabilirler. Virüsler var olan protoonkogenleri de aktifleştirebilirler [13]. Tümör baskılayıcı genlerdeki fonksiyon kaybı mutasyonları da kanser oluşumuna neden olur. Hücre bölünmesinin kontrol dışına çıkmasını engelleyen bu genlerin ürettiği proteinlerden en önemlileri şunlardır; Hücre döngüsünü düzenleyen hücre içi proteinler; p16 ve Rb Hücre çoğalmasını inhibe eden, reseptörler ya da sinyal değiştiriciler; TGF-β DNA’nın hasarlı olduğu ya da anormal kromozomların olduğu durumlarda, hücre döngüsünü durduran, kontrol noktası proteinleri; p53 Apoptozu ilerleten proteinler Koruyucu genler tarafından kodlanan, DNA tamirinde görevli olan enzimler. Oksidatif strese sebep olan serbest radikaller, kimyasal ajanlar, virüsler, onkogenler ve tümör baskılayıcı genlerde meydana gelen bozukluklar gibi iç ve dış etmenler oldukça karmaşık olan kanser mekanizmasını aktifleştirir [13]. Tümör oluşumunu engelleyen senesens ve apoptoz mekanizmaları, organizmada her gün oluşan yüzlerce hasarlı hücreyi ortadan kaldırarak dengenin bozulmasını engeller. Bu çalışma ile farklı dokulara ait kanser hücrelerinin, kendileri ile aynı mikro çevreyi paylaşan kök hücrelerin salgıladığı, senesens veya apoptoz mesajlarına nasıl tepki verdiğini incelenecektir. Böylece dış faktörlerin neoblastik dönüşüme uğramış bir hücreyi nasıl etkilediği sorularına yanıt verilmeye çalışılacaktır. 1.3.1. Meme Kanseri Meme kanseri, meme hücrelerinden gelişen kanser türüdür. Dünya da en sık görülen ikinci kanserdir. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre her 8 kadından biri meme 15 kanseri riski taşımaktadır. Erken tanı koyulan hastalarda yaşama şansı %95’tir. Her yıl yaklaşık 45000 kadın meme kanserinden dolayı hayatını kaybetmektedir [24]. Meme kanseri gelişimin arttıran risk faktörleri arasına; obezite, fiziksel egzersiz azlığı, alkol kullanımı, menapoz sırasında hormon tedavisi, ve iyonize radyasyon gibi bir çok faktör dahil edilebilir. Geç çocuk sahibi olma veya hiç olmama da meme kanseri riskini arttıran önemli bir faktördür [25]. BRCA1 ve BRCA2 genleri dahil olmak üzere bazı genler meme kanseri ile bağlantılıdır. Vakaların yaklaşık %10’luk kısmına, bu hastalık genetik olarak miras kalmıştır. Bu hastalar BRCA1 ve BRCA2 gen mutasyonu taşırlar. Bazı diğer genlerdeki mutasyonlar da meme kanserine sebep olabilirler. Örneğin; p53 genindeki mutasyon SBLA (Sarcoma, breast, leukaemia and adrenal gland) sendromuna sebep olabilir. Bu sendrom sonucunda meme kanseri gelişebilir [26]. p53 tümör baskılayıcı bir gen olup p16 geni ile birlikte senesens oluşumunda önemli role sahiptirler. ATM, STK1, PTEN gibi diğer mutasyonlar da meme kanseri oluşumunda rol alabilirler. Araştırıcılar meme kanserinin genetik olarak 4 farklı tipinin bulunduğunu ve her tipinin farklı kanser türlerine yol açacak genetik değişikliklerin göstergesi olduğunu belirtmektedirler [27]. Meme kanserinin tanısı genellikle kanserin etkilediği bölgeden biyopsi ile parça alınarak, mikroskobik inceleme yapılması sonucu yapılmaktadır. Meme kanseri riski taşıyan kadınların fiziksel olarak kendilerini kontrol etmeleri de önerilmektedir. Meme kanserinin tedavisinde hastalığın evresine bağlı olarak farklı yöntemler kullanılır. Bu yöntemlerden biri ameliyat ile kanserli dokunun uzaklaştırılmasıdır. Bir diğer tedavi yöntemi ise; hormon terapisidir. Monoklonal antibadilerle bazı faktörlerin ifadesini engelleyerek hücrelerin büyümesinin durdurulması da diğer bir tedavi yöntemidir. Diğer kanser türlerinde olduğu gibi radyasyon ve kemoterapi de tedavi yöntemlerinden biridir [28]. 1.3.2. Kolon Kanseri Kalın bağırsak, rektum ve apandistte görülen kanser türüdür. Kalın bağırsakta meydana gelen adenom poliplerden oluşur. Dışkıda kan görülmesi, kilo kaybı ve aşırı yorgunluk kolon kanserinin belirtilerinden bazılarıdır. Her yıl yaklaşık bir milyon insan kolon kanserine yakalanmaktadır [24, 29]. 16 Risk faktörleri arasında obezite, alkol kullanımı, aşırı kırmızı et tüketimi, yetersiz fiziksel egzersiz ve sigara kullanımı başta gelmektedir. En sık görülen kanserler arasında üçüncü sıradadır [24]. Kolon kanseri; Wnt sinyal yolağındaki mutasyonların sonucu neoplastik dönüşüme giden, epitelyal hücrelerden köken almaktadır. Bu mutasyonlar ebeveynlerden bireye geçebilir ve ya sonradan kazanılabilir. Bu kanser türünde en çok görülen mutasyon APC proteinini üreten genin mutasyonudur. APC proteini β-katenin üretimini bloklayan proteindir. APC geninde mutasyon olduğunda hücrede β-katenin birikimi başlar. β-katenin çekirdek etrafında birikip DNA’ya bağlanır ve bazı transkripsiyon faktörlerini aktive ederek bazı genlerin aşırı ifade edilmesine sebep olur. Böylece kanser oluşumuna sebep olur. Kolon kanserinde TGF- β ve DCC (Deleted in Colorectal Cancer) aralarında olduğu diğer faktörler de etkilidir. TP53 mutasyonu ile p53 yolağının inaktivasyonu da kolon kanserinde ki bir diğer kritik durumdur [30, 31]. Kolon kanserinde epigenetik değişiklikler genetik mutasyonlara göre daha fazladır. Vogelstein ve arkadaşları tarafından “sürücü” olarak tanımlanan birkaç onkogen mutasyonu ve tümör baskılayıcı gen mutasyonunun yanında 60’a yakın “ yolcu” olarak tanımladıkları mutasyon belirlenmiştir. Kolon kanserindeki epigenetik değişiklikler yüzlerce geni etkileyebilir. Örneğin 20-25 nükleotit uzunluğundaki, miRNA olarak isimledirilen küçük RNA tipleri, protein kodlamamalarına rağmen, protein kodlayan genlerin ifadesini azaltabilirler. miRNA’ların ifadesi de epigenetik olarak değişmiş olabilir. Kolon kanserinde miR-137’yi kodlayan DNA sekansının Guanin-Sitozin adalarındaki (CpG) metilasyon, genin ifadesini azaltır. Bu durum kolon kanserinde sık görülen bir olaydır ve kolon kanserlerinin %81’inde görülmektedir. miR-137 500 geni etkileyebilir [30, 32]. Kolon kanserinin tanısı, kolonoskopi, bilgisayarlı tomografi veya lezyon bulunan bölgeden örnek alınması ile yapılır. Pozitron emisyon tomografisi veya Magnetik rezonans görüntüleme metotları da, bazı kritik vakalarda kullanılan görüntüleme metotlarıdır [29]. Tedavi yöntemlerinin başında, kalın bağırsaktaki kanserli bölgenin operasyon ile uzaklaştırılması gelmektedirErken safha kolon kanserlerinde genellikle kemoterapi 17 önerilir. Kolon kanseri hastalarına radyasyon tedavisi ve hastalığın ilerlemesini durdurmayı amaçlayan hafifletici tedaviler de uygulanmaktadır [29]. 1.3.3. Kronik Myeloid Lösemi Lösemi; beyaz kan hücrelerinin anormal şekilde çoğalması ile kendini gösteren bir hastalıktır. Çok sayıdaki kanser hücresinin, ilikteki normal hücrelerin yerini almasıyla, kan pulcukları ve lökositlerin sayısında azalma meydana gelir. Bu durumda hasta potansiyel enfeksiyonlara karşı savunmasız kalır. Sonraki aşamalarda alyuvarların sayısında azalamaya ve solunum yetmezliğine sebep olabilir. Löseminin genel belirtileri; yorgunluk, ateş ve bazı nörolojik bozukluklardır. Dalak ve karaciğerde büyüme gözlenebilir. Birçok vakada hastalarda hiçbir belirti gözlenmez. Hastalık rutin laboratuar testleri sırasında tesadüfen bulunabilir [33]. Kronik Myeloid Lösemi; genellikle yetişkinlerde görülen beyaz kan hücresi kanseridir. Bu hastalık aşırı büyümüş ve çoğalmış myeloid hücreler ile karakterize olur. Philadelphia kromozomu olarak adlandırılan kromozomdaki translokasyon sonucu, granulositleri oluşturan kemik iliği kök hücrelerinde meydana gelen bozukluk KML’ye sebep olmaktadır. Tirozin kinaz inhibitörü ilaçlarla tedavi edilmektedir. Ancak kanserli hücreler uzun vadede ilaçlara karşı direnç kazanmaktadır [34]. KML erkekler arasında kadınlara oranla daha yaygındır. İyonize radyasyona maruz kalmak en önemli risk faktörüdür. Hiroşima ve Nagasaki’de atom bombası patlamalarından sonra hayatta kalanlarda lösemi oranı yüksektir. Hastalık patlamalardan yaklaşık 10 yıl sonra büyük bir artış göstermiştir [34]. KML; philadelphia kromozomu olarak bilinen kromozomdaki translokasyondan kaynaklanan genetik bir bozukluktur. 9. ve 22. kromozomların parçaları KML hastalarında yer değiştirmiştir. Bu yer değiştirmenin sonucu 22. kromozomdan BCR geni 9. kromozomdan ABL geni ile birleşir. Kromozom parçalarının anormal birleşmesi ile oluşan BCR-ABL geni bir protein kodlar. BCR-ABL proteini olarak isimlendirilen bu protein interlökin-3 reseptörünün (CD123) beta alt ünitesi ile etkileşime girer. Hücre döngüsünü kontrol eden kaskad proteinlerini aktive ederek hücre döngüsünü hızlandırır. Dahası BCR-ABL, DNA hasar tamir mekanizmalarını inhibe eder. Bu durum daha karmaşık genetik bozukluklara yol açar [34]. 18 KML tanısı genellikle kan sayımını ile yapılmaktadır. KML’de granülositlerin tüm tiplerinin sayısında artış beklenir. Hastalığın tanısında kemik iliği biyopsisi de sık kullanılan bir metottur. Philadelphia kromozom’nun var olup olmadığın belirlemek için sitogenetik yöntemler kullanılabilir. BCR-ABL füzyon geninin var olup olmadığını belirlemek amacıyla Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ya da flüoresans in situ hibridizasyon (FISH) yöntemleri kullanılabilir [34]. KML tedavisinde geçmişte; hidroksiüre, alkilleyici ajanlar, interferon alfa 2b, steroidler kullanılmıştır. Bu tedavi gereçleri 2000’li yıllarda yerini tirozin kinaz inhibitörlerine bırakmışlardır. Bu inhibitörler BCR-ABL proteinini hedef almaktadır. Bu yeni nesil ilaçların ilki Imatinib’dir. Ancak hastaların bir bölümünde kanser hücreleri Imatinib’e karşı direnç gelişmiştir [35]. Imatinib direncinin üstesinden gelmek için iki ilaç geliştirilmiştir. Bunlardan biri birçok onkojenik proteini bloklayan ve BCR-ABL proteinin kısmen inhibe eden Dasatinib’tir. Diğeri ise 2010 yılında geliştirilen Nilotinib’tir. Ancak bu iki ilaçta tam olarak direnç mekanizmasının üstesinden gelememiştir. İlaç direncinin moleküler mekanizması incelendiğine, BCR-ABL’in yapısında T315I olarak bilinen kısmi bir mutasyon görülmektedir. [35, 36]. 1.3.4. Çalışmada Kullanılan Hücre Hatları 1.3.4.1. MCF-7 (İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı) Meme bezlerinde oluşan adenokarsinomdur. İlk olarak 1970 yılında 69 yaşındaki Kafkas kökenli bir kadından izole edilmiştir. Epitelyal kökenli, plastik yüzeye yapışan hücrelerdir. Bu hücrelerde WNT7B onkogeninin ve IGFBP -2, IGFBP-4 ve IGFBP-5 (insülin benzeri büyüme faktörü bağlanma proteini) genlerinin ifadesi fazladır. MCF7’ların büyümeleri tümör nekroz faktör alfa ile inhibe edilir [37]. 1.3.4.2. DLD-1 (İnsan Kolon Kanseri Hücre Hattı) Epitelyal kökenli, plastik yüzeye tutunan hücrelerdir. Kalın bağırsakta oluşan adenokarsinomlardan izole edilmiştir. D.L. Dexter tarafından ilk olarak 1977’de izole edilmiştir. DLD-1 hücreleri önemli bir tümör baskılayıcı olan p53 antijen ifadesi açısından pozitiftir. Ancak aminoasit dizisini 241. pozisyonunda değişikliğe neden olan bir nokta mutasyonu içermektedir [38] . 19 1.3.4.3. K562 (İnsan Kronik Myeloid Lösemi Hücre Hattı) İlk olarak 53 yaşında bir kadından izole edilmiştir. Lenfoblastik morfolojiye sahip, kemik iliği kökenli hücrelerdir. K562 hücreleri kültür kabına tutunmayan yüzücü hücrelerdir [39]. Bu hücreler kendiliğinden diğer granülosit tiplerine farklılaşma özelliğine sahiptir. K562’ler BCR-ABL füzyon genini bulundurur. Bazı çalışmalara BCR-ABL proteininin yüzey tutunma moleküllerinin ifadesini azalttığından, bu hücrelerin plastik yüzeye tutunma özellikleri olmadığını belirtse de, bir takım araştırmalar tam tersine BCRABL’in aşırı ifade edilmesi, hücrelerin plastik yüzeye tutunma kapasitelerini arttırdığını göstermektedir [40]. 1.4. Hücre Kültürü Bir dokunun mekanik, kimyasal ve/veya enzimatik yöntemler ile parçalanıp bağımsız hücrelerinin izole edilerek, bu hücrelerin in vitro koşullarda yaşatılmasına hücre kültürü denir [41]. İn vitro koşullarda kültüre edilen hücreler, in vivo koşullardaki özelliklerini göstermeye devam ederler. Böylece bir canlıya ait hücrelerin farklı koşullara, kimyasallara veya ilaçlara nasıl tepki vereceği hakkında, canlı dışında yapılan deneylerle cevap verilebilir [13]. Ayrıca hücre biyolojisi araştırmaları için kültüre edilmiş hücreler, kontrol edilebilir olduğundan ve homojen popülasyon ile çalışmaya olanak sağladığından tam organizmalara kıyasla daha çok avantaja sahiptirler. Hücre kültürünün, deneysel önemine ek olarak, kök hücre olarak tanımlanan ve hastalık tedavisinde veya hasarlı dokuların onarımında önem arz eden hücrelerin, canlı dışında yüksek miktarlarda üretilip hastaya verilmesi açısından da büyük önemi vardır [41]. 1.4.1. Hücre Kültürünün Tarihçesi Hücre kültürü çalışmaları 20. Yüzyılın başlarında, sistemik varyasyonlardan bağımsız deneyler yapmak için tekniklerin geliştirilmesiyle ortaya çıkmıştır. 1907 yılında Ross Harrison, kurbağa embriyosundan aldığı doku parçalarını kültüre etmiş ve üstelik sinir fibrillerini de yaşatmayı başarmıştır. Harrison büyük ihtimalle soğuk kanlı bir canlı olduğundan ve inkübasyon gerektirmediğinden kurbağayı tercih etmiştir. 1912’de Carrel ve Burrows izole ettikleri kalp kas hücrelerini 3 hafta boyunca kasılıp gevşeyebilecek şekilde kültüre etmişlerdir. Yine Carrel 1923’te fibroblastik hücreleri kültüre etmiştir. 20 1952 yılında Dulbecco kültüre edilen hücreleri pasajlamak için tripsin kullanmaya başlamıştır. 1991 yılında Caplan yetişkin mezenkimal kök hücreleri kültüre etmiştir. Thompson 1998 yılında insan embriyonik hücrelerini kültüre etmiştir. 2007 yılında Shinya Yamanaka belirlediği transkripsiyon faktörleri ile hücreleri transfekte ederek, somatik bir hücreden indüklenmiş pluripotent kök hücre elde etmeyi başarmıştır [42]. Bu çalışmalarla birlikte hücre kültürü çalışmalarını bugünkü haline getiren pek çok araştırma yapılmıştır[41]. 1.4.2. Hücre Kültürü İçin Gerekli Ekipmanlar Hücre kültürü diğer biyolojik deneylerin gerçekleştirildiği ortamlarda yapılamaz. Hücre kültüründe işlemlerin yapıldığı steril bir ortam ve hazırlık alanı olmalıdır. Hücre kültürü yapılacak alanın büyüklüğü ve bu alanda çalışan kişi sayısı da önemlidir. Diğer taraftan hücre kültürü malzemelerinin depolanacağı alan da önem arz etmektedir. Hücre kültürünü laboratuarının temel ekipmanları steril kabin, hücrelerin yaşaması için gerekli olan %5 CO2 ve 37 OC’lik ortamı sağlayan karbondioksit inkübatörü, kültür kabının tabanına yapışmış olan hücreleri görebilmek için gerekli olan invert mikroskop, hücre yıkama sırasında kullanılan santrifüj, uzun vadeli hücre saklamada kullanılan azot tankı, kültür malzemelerinin saklanmasında kullanılan +4OC soğutucu, -20 OC ve -80 OC derece dondurucu en temel hücre kültürü laboratuarı ekipmanlarıdır. 1.4.3. Hücre Kültürü Kimyasalları 1.4.3.1. Mediumlar Mediumlar hücrelerin yaşaması için gerekli olan besiyerleridir. Hücreler bu besiyerleri içerisinde askıda, yüzerek yaşayabilir ya da kültür kabının tabanına tutunan hücrelerin üstü bu besiyerleri ile kaplanarak hücrelerin beslenmesi sağlanır. Hücrelerin kültüre edilmesinde mediumların hidrojen iyonu konsantrasyonu önemlidir. Hücreler genellikle pH:7.4’te yaşarlar. Mediumlar içerisinde pH indikatörü olarak fenol kırmızısı kullanılır. Medium pH’sının artıp azalmasına göre fenol kırmızısı mediumun rengini değiştirir. Asidik pH’da medium rengi sarıya yaklaşır. Bazik pH’da ise medium koyu kırmızı, pembe bir renk alır [41]. 21 Mediumlarda diğer önemli birleşenler ise CO2, NaHCO3 ve HEPES’tir. Karbondioksit medium içerisinde gaz halde iken çözünür. Medium içerisinde laktik asitin birikmesi sonucu pH düşer. Ortamın pH’dengesini korumak adına medium içerine bu birleşenler eklenir. HEPES bunlar arasında en çok kullanılan tampon birleşenlerden biridirdir. Mediumun oksijen yoğunluğu bir diğer önemli kriterdir. Ancak oksijenin medium içersindeki yoğunluğu farklı hücre tiplerinde farklı etkiler yapar. Hücre kültürü mediumlarının sıcaklıkları, hücreleri etkileyen önemli bir unsurdur. Memeli hücreleri genellikle -196OC’de donmuş olarak saklanabilirler. +4OC’de birkaç gün canlılıklarını koruyabilirler. Memeli hücreleri için en uygun kültür sıcaklığı 37OC’dir. Hücre kültüründe kullanılan mediumlar soğutucularda saklandığından, hücrelerin üzerine koyulmadan önce sıcaklıklarının bu sıcaklığa yaklaştırılması kültürdeki hücrelerin canlılığı açısından önem arz etmektedir [41]. 1.4.3.1.1. Medium İçeriğindeki Maddeler 1.4.3.1.1.1. Tuzlar Tuzlar mediumun osmolaritesine katkıda bulunan birleşendir. Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO43-, HCO3- mediumların içeriğinde bulunan tuzlardan bazılarıdır. Bu tuzlardan özellikle Ca2+ hücre-hücre etkileşiminde önemli rol oynadığından dolayı, hücrelerin büyüme gelişmesinde önemli bir role sahiptir [41]. 1.4.3.1.1.2. Vitaminler B grubu vitaminler, folik asit, inositol, biotin, nikotinamit, A, D, E, K vitaminleri hücre külütürü mediumlarında bulunan vitaminlerdir. Bu vitaminlerin hücre metabolizasında önemli yeri olduğundan, besi yeri içerisindeki konsantrasyonu hayati öneme sahiptir [41]. 1.4.3.1.1.3. Glukoz Glukoz bilindiği üzere hücresel anlamda temel enerji kaynağıdır. Mediumlar içersinde farklı konsantrasyonlarda bulunur. Hücre tipine göre farklı glukoz yoğunluğu olan mediumlar kullanılır [41]. 22 1.4.3.1.2. Medium İçeriğine Dahil Edilen Diğer Maddeler 1.4.3.1.2.1. Serum Serumlar büyüme faktörleri ihtiva ettiğinden hücrelerin büyümesini ve gelişmesini desteklerler. Hücre tipine ve fizyolojik durumuna göre farklı oranlarda mediuma eklenir. Serumlar genellikle büyükbaş hayvanlardan, atlardan veya insanlardan elde edilebilir [41]. 1.4.3.1.2.2. Aminoasitler Aminoasitler hücrelerin yaşaması ve büyümesinde önemli rolü olan maddelerdir. Aminoasitler bazal mediumların içinde bulunabileceği gibi sonradan da eklenebilirler. En çok kullanılan aminoasit glutamindir. Glutamin yarı ömrü kısa olan bir aminoasit olduğundan uzun süre kullanılmayan mediumlara eklemek gerekebilir [41]. 1.4.3.1.2.3. Antibiyotikler İn vitro hücre kültüründe hücreler doğal ortamından uzakta, bir bağışıklık sistemi tarafından koruma altından olmadığından, kültürün aseptik koşullarda yapılması ve besiyerinin steril olması önem arz etmektedir. Bakteri ve fungus kontaminasyonundan hücreleri korumak amacıyla hücre kültürü mediumlarına antibiyotikler eklenir. Sıklıkla kullanılan antibiyotikler; penisilin, streptomisin, gentamisin ve amfoterisin’dir [41]. 1.4.3.1.2.4. Hormonlar ve Büyüme Faktörleri Büyüme faktörleri hücre kültürü mediumlarına eklenen bir diğer malzemelerdir. Hücre kültüründe sıklıkla kullanılmazlar ancak bazı hücrelerin büyümesini ve gelişmesini desteklemek için mediuma eklenebilirler. b-FGF ve EGF en sık kullanılan büyüme faktörleridir [41]. 1.4.3.2. PBS (Fosfatla Tamponlanmış Tuz Çözeltisi) PBS hücre kültüründe, genellikle yıkama işlemleri sırasında kullanılır. Tripsinizasyondan önce hücrelerin üzerinde bulunan serum artıklarını uzaklaştırmak, tripsinizasyondan sonra ise hücre solüsyonunda bulunan tripsini seyreltmek için kullanılır. Hücre kültüründe kullanılan iki tipi vardır. İlki kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS’tir. Bu PBS yıkama işlemleri sırasında kullanılır. Diğeri ise kalsiyum ve magnezyum içeren PBS’tir. Bu PBS hücre izolasyonu sırasında kollajenaz enzimi ile birlikte kullanılır. 23 Yıkama işlemlerinde kalsiyum ve magnezyum gibi +2 değerlikli iyon içeren PBS kullanılmaz. Bunu sebebi tripsin enziminin kalsiyum ve magnezyum varlığında çalışmamasıdır [41]. 1.4.3.3. Tripsin Plastik yüzeye tutunan hücreleri, tutundukları yüzeyden ayırmak için kullanılan bir enzimdir. Tripsin ile hücrelerin temas ettiği süre önemlidir. Bu süre fazla uzun tutulursa, membran yüzeyinde bulunan protein yapılar parçalanır. Bu durum hücrenin plastik yüzeye tutunmasını ve dolayısıyla canlılığını etkiler. Tripsin enzimin durdurmak için tripsin inhibitörü ya da bol miktarda protein içeren bir bileşen olan serum (FBS vb.) kullanılır [41]. 1.5. Testler 1.5.1. Testler Senesense Bağlı Beta-Galaktozidaz Aktivitesi Tespiti Bu çalışmada senesent hücreleri belirlemek amacıyla beta-galaktozidaz (β-gal) boyamasından yararlanılmıştır. Senesent hücrelerin karakteristik özelliklerinden biri de lizozomal enzimlerin artmasıyla, lizozom miktarındaki artıştır. β-gal’de bu enzimlerden biridir. Senesense bağlı β-gal aktivitesi pH:6’da gözlenebilen ve kültürdeki senesent memeli hücrelerini belirlemeye yarayan sitokimyasal bir boyama metodudur. Bu metotta β-gal ile tepkimeye girdiğinde çözünemeyen mavi renkte ürün oluşturan bir substrat olan X-gal kullanılır. Glutaraldehit ile fikse edilen hücreler boyama solüsyonu içinde inkübe edilerek, senesent hücrelerde mavi renk oluşumu gözlenir [11]. 1.5.2. Apoptoz Testi Bu çalışmada farklı durumlardaki MKH’lerden toplanmış olan koşullandırılmış besiyerinin hücrelerde apoptoz oranını ne ölçüde değiştireceğini bulmak için Muse Cell Analyzer cihazına ait Annexin V/Dead Cell kiti kullanılmıştır. Annexin V; hücre yüzeyinde bulunan ve apoptoz veya hücre ölümü gibi durumlarda kanıt olarak gösterilen fosfatidilserin (PS) ve fosfatidiletanolamin (PE) moleküllerini belirlemeye yarayan bir işaretçidir [43]. Ayrıca bu kitin içinde ölü hücreleri boyamayan yarayan 7-AAD boyası vardır. 7-AAD hasarlı fosfolipid zardan geçip DNA’ya bağlanan bir moleküldür. Mikro santrifüj tüpünde bulunan hücreler Annexin ile muamele edilip akım sitometri temelli bir cihaz olan Muse Cell Analyzer’da incelenmiş ve apoptoz yüzdesi belirlenir. 24 1.5.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi Mitokondri bilindiği üzere hücrenin enerji ihtiyacını karşılayan önemli bir organeldir. Ayrıca serbest radikallerin en çok bulunduğu organeldir. Buna ilave olarak mitokondri hücre ölümü ve apoptoz mekanizmasının önemli bileşenlerini de içerir. Mitokondri bu bileşenlerin değişimine karşı oldukça hassastır [44]. Mitokondriyal solunum sırasında, mitokondri zarı boyunca enerji birikimi meydana gelir ve bu enerji birikimi ATP üretiminde önemli olan mitokondriyal trans-membran potansiyelini meydana getirir. Apoptoz ve nekrotik hücre ölümünde mitokondriyal membran potansiyelinde değişiklikler gözlenir [45]. Mitokondriyal iç membranın depolarizasyonu, mitokondri fonksiyon bozukluğunun ve apoptozun güvenilir bir göstergesidir. Bu sebepten dolayı, çalışmada yapılan bir diğer test ise mitokondri membran potansiyeli testidir. Üretici firmanın MitoPotential (Muse-Millipore) boyası iç membran ile etkileşime geçtiğinde; eğer membran potansiyeli yüksek ise, boya da yüksek bir flüoresan ışıma yapar. Membran potansiyeli düşükse, yani membran depolarize durumda ise, flüoresan ışımanın miktarı az olur. Flüorsan ışıma yapan bu boyanın yanı sıra 7-amino aktinomisin D (7-AAD) bu testte kullanılmıştır. 7-AAD hücre zarını bütünlüğü bozulduğunda sitozole giren ve dolayısıyla ölü veya apoptotik hücreleri boyayan bir maddedir. Bu test; mitokondri potansiyeli ölü ve canlı hücrelerde karşılaştırmaya imkan sağlar [46]. Hücreler bu boyalar ile inkübe edildikten sonra Muse Cell Analyzer’da incenir. 1.5.4. Proliferasyon Testi Bu çalışmada hücrelerin proliferasyon potansiyellerini belirlemek amacıyla MTT testi kullanılmıştır. Bu test temel olarak 96 kuyucuklu plaklara ekilmiş hücrelerin üzerine belli zaman aralıklarında 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromid (MTT) olarak adlandırılan kimyasalın eklenmesi ve canlı hücrelerin bu maddeyi işlemesi ile ortaya çıkan kristallerin çözülmesiyle oluşan sıvının spektrofotometre ile incelenip kantitatif bir sonuç elde edilmesine ilkesine dayanmaktadır. MTT boyasının tetrazolium halkasının, canlı hücrelerin mitokondriyal aktivitesi sonucu parçalanması ile MTT; renkli, suda çözünmeyen formazan kristallerine dönüşür. Bu reaksiyon mitokondriyal bir enzim olan süksinatdehidrogenaz enziminin aktivitesine bağlıdır. Oluşan formazan kristalinin miktarı, canlı hücre sayısı ile doğrudan ilişkilidir. Daha sonra oluşan bu kristaller DMSO veya izopropanol gibi çözücüler ile çözülerek incelenir [47]. 25 2. BÖLÜM GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Mezenkimal Kök Hücrelerin Eldesi Çalışmada kullanılan mezenkimal kök hücreler, Prof. Dr. Umberto GALDERISI’nin, Second University of Naples, İtalya’daki laboratuarından temin edilmiştir. [MKH’ler; Severino ve arkadaşlarının “Insulin-like growth factor binding proteins 4 and 7 released by senescent cells promote premature senescence in mesenchymal stem cells” başlıklı (doi:10.1038/cddis.2013.445) çalışmada kullanılan karakterize edilmiş hücrelerdir.] 2.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültürü 2.2.1. Besiyeri Hazırlanması Mezenkimal Kök Hücreler için %10 FBS (Biological Industries), %1 L-glutamin (Gibco) ve %1 Penisilin-Streptomisin (PAA) içeren düşük glukozlu DMEM (1 g/L glukoz) (Biological Industries) besiyeri hazırlandı. 2.2.2. Hücre Kültürü Basamakları Sıvı azot tankında donmuş halde saklanan hücreler su banyosunda ısıtılarak çözüldü. 1,5 mL dondurma solüsyonu içerisinde bulunan hücrelere 8,5 mL kendi besiyeri eklenerek dondurma solüsyonu seyreltildi. Böylece dondurma solüsyonunda bulunan DMSO’nun (dimetil sülfoksit) hücrelere zarar vermesi engellendi. Hücreler 350x g’de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant atıldı. Pellet 10 mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS’te (Biological Industries) çözüldü. Tekrar 350x g’de 5 dakika santrifüj yapıldı. Süpernatant uzaklaştırılıp, pellet besiyeri ile çözüldü. Neubauer lamında hücre sayımı yapıldıktan sonra 75 cm2’lik kültür kabına 10 ml besiyeri içerisinde 4-5x105 hücre olacak şekilde ekim yapıldı. Hücreler %5 CO2 içeren 37 OC’lik inkübatöre kaldırıldı. Hücreler her gün gözlenerek büyümeleri ve çoğalmaları kontrol edildi. Hücreler %80 yoğunluğa ulaşınca pasaj yapılmak üzere besiyeri uzaklaştırıldı. Hücreler DPBS ile iki 26 kez yıkandı ve serum artıklarından arındırıldı. 5-6 mL Tripsin (PAA) eklenerek 4 dakika 37 C’de inkübe edildi. Hücreler kültür kabından ayrıldıktan sonra, tripsinizasyon O işlemini durdurmak için eklenen tripsin miktarının %10’u kadar FBS veya aynı miktarda FBS içeren besiyeri hücrelerin üzerine eklendi. Hücreler falkon tüplere alınarak santrifüj yapıldı. Süpernatant uzaklaştırıldı. Hücreler DPBS ile iki santrifüj edilerek yıkandı. Hücrelerin bir kısmı alanı genişletmek amacıyla farklı kültür kaplarına ekildi. Bir kısmı sonraki çalışmalarda kullanılmak amacıyla donduruldu. Hücreler dondurulurken %70 FBS, %20 DMEM ve %10 DMSO içeren dondurma solüsyonu kullanıldı. Hücreler 2 mL’lik kryo tüplerde sırayla 1 saat -20 OC’de, 1 gün -80 OC’de (Myster Frosty Container içerisinde) bekletildi. Daha sonra uzun süreli saklama için -196 OC’lik sıvı azot tankına alındı. Pasajlama işlemi hücrelerin yoğunluğu kültür kabında %85-90’a her ulaştığında yapıldı. 2.3. Mezenkimal Kök Hücrelerde Replikatif Senesens Oluşturulması Kültürün erken safhalarındaki mezenkimal kök hücreler kültür kabındaki yoğunluğu %90’a her ulaştığında pasajlanarak 30 gün boyunca kültüre edildi. Kültürün 20. gününden sonra, senesens fenotipi gözlemlenmeye başlandı. 2.4. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilecek MKH’lerin Senesens Testleri Boyama Solüsyonu: K₃[Fe(CN)₆] (Potasyum ferrisiyanür) ve K4[Fe(CN)6] (Potasyum ferrosiyanür) (Sigma) çözelti içindeki konsantrasyonları 5 mM olacak şekilde ve MgCl2 1 M stok solüsyonu, çözelti içindeki konsantrasyonu 2 mM olacak şekilde PBS içine eklendi. X-gal Stok Solüsyonu: Toz halindeki X-gal (Thermo), N,N-Dimetilformamit içinde konsantrasyonu 40 mg/mL olacak şekilde çözüldü. Uzun süreli saklama amacıyla -80 OC dondurucuya kaldırıldı. Tam Boyama Solüsyonu: 19.5 mL boyama solüsyonuna 500 µL X-gal stok solüsyonu eklenerek toplamda 20 mL tam boyama solüsyonu elde edildi. Fiksatif Solüsyonu: %0.2 glutaraldehit elde etmek için %25 Glutaraldehit’ten (Sigma) 160 µL alınarak 19.84 mL PBS’e eklendi. Toplamda 20 mL fiksatif solüsyonu elde edildi. Hücreler 6 kuyucuklu plağın, 3 kuyucuğuna genç hücreler, 3 kuyucuğuna kültürde en az 30 gün geçirmiş senesent hücreler, her kuyucuğa yaklaşık 1x105 hücre gelecek şekilde 27 ekildi. Bir gün sonra hücreler tutununca, besiyeri uzaklaştırıldı, hücreler DPBS ile yıkandı. Her kuyucuğa %0.2 glutaraldehit (Sigma) eklendi ve 15 dakika inkübe edilerek hücreler fikse edildi. İnkübasyon sırasında önceden hazırlanmış X-gal stok solüyonu, boyama solüsyonuna eklenerek tam boyama solüyonu oluşturuldu. İnkübasyondan sonra glutaraldehit uzaklaştırıldı. Hücreler 2 kez DPBS ile yıkandı. Tam boyama solüyonu eklendi ve plağın etrafı parafilmle çevrilerek hava alması engellendi. 18 saat 37 OC’de inkübe edildi. 18 saat sonunda her kuyucukta toplam 3 alanda 100’er hücre sayılarak senesens yüzdesi belirlendi [11]. 2.5. Koşullandırılmış Besiyeri Hazırlanması Bu çalışmada mezenkimal kök hücrelerden iki defa koşullandırılmış besiyeri toplanmıştır. İlk olarak kültürün erken aşamalarında hücreler senesent değil iken (genç), ikinci olarak ise kültürün başlangıcından 30 gün sonra (senesent) hücrelerden koşullandırılmış besiyeri toplandı. Koşullandırılmış besiyeri toplamak için 75 cm2’lik kültür kaplarına ekilen hücreler %70 yoğunluğa ulaşana kadar inkübe edildi. Yeterli yoğunluğa ulaşan hücreler DPBS ile iki kez yıkandı. Hücrelerin bulunduğu kültür kabına serum içermeyen, %1 Penisilin- Streptomisin ve %1 L-glutamin içeren DMEM besiyeri eklendi. Hücreler 24 saat inkübe edildi. 24 saat sonunda eklenen besiyeri falkon tüplerde toplandı. Besiyeri +4 OC’de, 10 000x g’de 10 dakika santrifüj edilerek içersindeki kültürden kalabilecek partiküller uzaklaştırıldı. Hücreler sterilizasyon amaçlı olarak, protein bağlama kapasitesi az olan, 0.22 µm’lik filtrelerden (Millipore) geçirildi. Elde edilen koşullandırılmış besiyeri mikro santrifüj tüplerine ayrıldı ve uzun süreli saklama için -80 OC’lik dondurucuya kaldırıldı [48]. 2.6. Genç MKH’lere Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri 2.6.1. Senesens Testi Genç MKH’ler 6 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 1x105 hücre gelecek şekilde ekildi ve 1 gün tutunmaları için inkübe edildi. Ertesi gün kuyucukların içindeki besiyerlerinin %50’si alındı. 6 kuyucuklu plağın 2 kuyucuğuna kontrol besiyeri (koşullandırılmamış MKH besiyeri), 2 kuyucuğuna genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 2 kuyucuğuna da senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. Başka bir kuyucuğa kontrol amaçlı 28 olarak hiç uygulama yapılmadı. Hücreler 48 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler DPBS ile yıkandı. %0.2 glutaraldehit ile 15 dakika fikse edildi. 15 dakika sonra glutaraldehit uzaklştırıldı. Tam boyama solüyonunda 18 saat inkübe edildi. 18 saatin sonunda tam boyama solüsyonu uzaklaştırıldı ve hücrelerin üzeri %50 gliserol ile kaplandı. Her kuyucukta 300 hücre sayılarak senesent hücrelerin yüzdesi belirlendi. Senesens testi 3 tekrarlı olarak yapıldı [11].. 2.6.2. Apoptoz Testi Genç MKH’ler 25 cm2’lik kültür kabına her kültür kabında 2,5x105 hücre olacak şekilde ekildi. Tutunmaları için 1 gün inkübe edildi. Hücreler tutunduktan sonra; kültür kaplarının içindeki besiyerlerinin %50’si alındı ve kültür kaplarının birine kontrol besiyeri, birine genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve birine de senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. Bir kültür kabına da hiç bir uygulama yapılmadı. Hücreler 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonucunda hücreler kültür kaplarından tripsinizasyon ile alındı. DPBS ile 2 kez yıkandı ve üretici firmanın talimatlarına uygun olacak şekilde; en az %1 FBS içeren 100 µL hücre solüsyonuna, 100 µL Annexin V/Dead Cell Reagent (Muse-Millipore) eklenip 20 dk oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki hücreler Muse Cell Analyzer cihazında ayarlama yapmak, kapı belirlemek için kullanıldı. Diğer hücreler Muse Cell Analyzer cihazında incelendi. Apoptoz testi 3 farklı örnek ile her örnek iki kez okutularak yapıldı [43]. 2.6.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi Genç MKH’ler 25 cm2’lik kültür kabına her kültür kabında 2,5x105 hücre olacak şekilde ekildi. Tutunmaları için 1 gün inkübe edildi. Hücreler tutunduktan sonra; kültür kaplarının içindeki besiyerlerinin %50’si alındı ve kültür kabının birine kontrol besiyeri, birine genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve birine de senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. Bir kültür kabına da hiç bir uygulama yapılmadı. Hücreler 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonucunda hücreler kültür kaplarından tripsinizasyon ile alındı. DPBS ile 2 kez yıkandı ve üretici firmanın talimatlarına uygun olacak şekilde; MitoPotential Reagent, Assay Buffer (Muse-Millipore) ile 1/1000 oranında seyreltildikten sonra 100 µL hücre solüsyonuna 95 µL olacak şekilde eklendi ve 20 dakika 37 OC’de inkübe edildi. İnkübasyondan sonra örneklerin üzerine 5 µL 7-AAD (Muse-Millipore) eklendi ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki hücreler 29 Muse Cell Analyzer cihazında ayarlama yapmak için kullanıldı. Muse Cell Analyzer cihazında örnekler incelendi. Mitokondri membran potansiyeli testi 3 farklı örnek ile her örnek iki kez okutularak yapıldı [44-46]. 2.6.4. Proliferasyon Testi Hücrelerin proliferasyon oranlarını belirlemek amacı ile MTT testi yapıldı. Bu amaçla 96 kuyucuklu plakların 54 kuyucuğuna her kuyucuğa 2000 hücre gelecek şekilde ekim yapıldı. Hücreler tutunduktan sonra kuyucuklardaki besiyerlerinin yarısı alınarak; 18 kuyucuğa kontrol besiyeri, 18 kuyucuğa genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 18 kuyucuğa da senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. Hücrelerin üzerine besiyeri eklendikten sonra 0.saatte, 24.saatte ve 48.saatte her 18 kuyucuğa, son konsantrasyonu 1 mg/mL olacak şekilde MTT (Serva) solüsyonu eklendi. Kuyucukların tamamına MTT eklenmesinden en az 4 saat sonra kuyucuk içindeki besiyeri-MTT karışımı uzaklaştırıldı. Oluşan kristaller DMSO ile çözüldü. Glomax Elisa Reader (Promega) cihazında 560nm ve 750nm olmak üzere çift dalga boyunda spektrofotometrik ölçüm yapıldı. Proliferasyon testi 3 farklı örnek ile 6 tekrarlı olarak yapıldı [47]. 2.7. Kanser Hücre Hatlarının Hazırlanması 2.7.1. Besiyeri Hazırlanması MCF-7 hücre hattı için; %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin, %1 L-Glutamin, %0,11 Sodyum pirüvat (Sigma) ve %0,2 insulin (PAA) içeren DMEM yüksek glukozlu (4,5 g/L) Besiyeri (Lonza) kullanıldı. K562 ve DLD-1 hücre hatları için; %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin, %1 L-Glutamin içeren RPMI 1640 (Biological Industries) besiyeri kullanıldı. 2.7.2. Kültür Basamakları Kullanılacak kanser hücreleri sıvı azot tankından çıkarılarak, su banyosunda eritildi. Her bir kanser hücresi kendi besiyeri ile seyreltilerek dondurma solüsyonunda kullanılan DMSO’nun etkisi azaltıldı. Hücreler 350x g’de 5 dakika santrifüj yapıldı. Süpernatant uzaklaştırılıp, DPBS ile bir kez daha yıkama yapıldı. Son yıkamadan sonra hücreler 225 cm2’lik kültür kabında kendi besiyerlerinde ekim yapıldı. 30 Hücreler testler için kullanılacağı zaman, tripsin ile kültür kaplarından kaldırıldı, DPBS ile 2 kez yıkanıp test yapılacak kültür kaplarına veya çok kuyucuklu plaklara ekildi. Artan hücreler sonra ki çalışmalarda kullanılmak amacıyla dondurma solüsyonu içinde dondurularak uzun süreli saklamak için -196 OC azot tankına koyuldu. 2.8. Kanser Hücre Hatlarına Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri 2.8.1. Senesens Testi MCF-7 ve DLD-1 kanser hücre hatları, kültür kabına tutunan hücreler, K562 hücre hattı ise yüzen hücreler olduğu için, boyama iki farklı metot ile yapıldı. MCF-7 ve DLD-1 hücreleri 6 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 1x105 hücre gelecek şekilde ekim yapıldı ve tutunmaları beklendi. Hücreler tutunduktan sonra kuyucukların içindeki besiyerlerinin %50’si alındı. 6 kuyucuklu plağın 2 kuyucuğuna kontrol besiyeri (koşullandırılmamış MKH besiyeri), 2 kuyucuğuna genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 2 kuyucuğuna da senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. 48 saat inkübasyondan sonra hücreler yıkandı ve 15 dakika boyunca fikse edildi. Fiksasyondan sonra hücreler iki kez DPBS ile yıkanıp tam boyama solüsyonunda, etrafı parafilm ile çevrilerek 18 saat inkübe edildi. Bu aşamadan sonra kuyuculara gliserol eklendi. Her kuyucukta 300 hücre sayılarak senesens yüzdesi belirlendi [11]. K562 hücre hattı 6 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 1x105 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücreler tutunmayan hücreler olduğu için aynı gün koşullandırılmış besiyerleri, diğer iki hücre hattında olduğu gibi kuyucuklara eklendi. 48 saat inkübasyondan sonra hücreler mikro santrifüj tüplerine alındı. 350x g’de 5 dakika santrifüj yapılarak besiyeri uzaklaştırıldı. DPBS ile yıkandıktan sonra, tüplerin içinde %0.2 glutaraldehit eklenerek fiksasyon işlemi yapıldı. Fiksasyon işlemi sırasında X-gal ve boyama solüsyonu birleştirilip tam boyama solüsyonu hazırlandı. Fiksasyondan sonra hücreler iki kez DPBS ile yıkandı. Tam boyama solüsyonu tüplere eklendi ve 18 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra tam boyama solüsyonu santrifüj edilerek süpernatant atıldı. Böylece tam boyama solüsyonu uzaklaştırıldı. Hücreler 1 kez DPBS ile yıkandı. Hücre pelleti yaklaşık 50 µL DPBS ile çözüldü. Lam üzerine hücre solüsyonu damlatıldı ve antifade (Invitrogen) eklenip lamel ile (her lam üzerinde iki lamel olacak şekilde) kapatıldı. Kuruması beklendikten sonra sayım yapıldı. Her lam üzerinde toplamda 600 hücre sayılarak senesens yüzdesi belirlendi [11]. 31 2.8.2. Apoptoz Testi Kanser hücre hatları 25 cm2’lik kültür kaplarına her kültür kabına 2.5x105 hücre gelecek şekilde ekildi. MCF-7 ve DLD-1 kanser hücre hatlarının tutunması için 1 gün beklendi ve kontrol besiyeri ile genç ve senesent MKH’lere ait koşullandırılmış besiyerleri eklendi. K562 hücre hattının bulunduğu kültür kaplarına ekimin yapıldığı gün koşullandırılmış besiyerleri eklendi. Her hücre hattı için hiçbir uygulama yapılmamış kültür kabı ayrıldı. Hücreler Annexin V/Dead Cell Reagent (Muse-Millipore) ile muamele edilip 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki hücreler Muse Cell Analyzer cihazında test ayarları yapmak, kapı belirlemek için kullanıldı. Uygulama yapılan hücreler cihazda okutularak apoptoz yüzdesi belirlendi. Apoptoz testi 3 farklı örnek 2 kez okutularak gerçekleştirildi [43]. 2.8.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi Kanser hücre hatları 25 cm2’lik kültür kaplarına her kültür kabına 2,5x105 hücre gelecek şekilde ekildi. MCF-7 ve DLD-1 kanser hücre hatlarının tutunması için 1 gün beklendi ve kontrol besiyeri ile genç ve senesent MKH’lere ait koşullandırılmış besiyerleri eklendi. K562 hücre hattının bulunduğu kültür kaplarına ekimin yapıldığı gün koşullandırılmış besiyerleri eklendi. Her hücre hattı için hiçbir uygulama yapılmamış kültür kabı ayrıldı. MCF-7 ve DLD-1 hücreleri tripsinizasyon işlemi ile kültür kabından alındı. K562 hücre hattı için tripsinizasyon işlemi gerekli olmadığından santrifüj ile besiyeri uzaklaşıtırıldı. DPBS ile yıkama aşamasından sonra üretici firmanın talimatları doğrultusunda; MitoPotential Reagent, Assay Buffer (Muse-Millipore) ile 1/1000 oranında seyreltilerek, 100 µL hücre solüsyonuna 95 µL olacak şekilde eklendi ve 20 dakika 37OC’de inkübe edildi. İnkübasyondan sonra örneklerin üzerine 5 µL 7-AAD (Muse-Millipore) eklendi ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki hücreler Muse Cell Analyzer cihazında ayarlama yapmak için kullanıldı. Muse Cell Analyzer cihazında örnekler incelendi. Mitotik indeks testi 3 farklı örnek ile her örnek iki kez okutularak yapıldı [44-46]. 2.8.4. Proliferasyon Testi Kanser hücre hatları 96 kuyucuklu plakların 54 kuyucuğuna her kuyucuğa 2000 hücre gelecek şekilde ekim yapıldı. MCF-7 ve DLD-1 hücreleri tutunduktan sonra 32 kuyucuklardaki besiyerlerinin yarısı alınarak; 18 kuyucuğa kontrol besiyeri, 18 kuyucuğa genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 18 kuyucuğa da senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. K562 hücreleri tutunmayan hücreler olduğundan, ekim yapıldıktan sonra besiyerinin alınması söz konusu değildir. Ekim sırasında koşullandırılmış besiyerleri ve K562 besiyeri yarı yarıya karıştırılarak kuyucuklara hücre ekimi yapıldı. Hücrelerin üzerine koşullandırılmış besiyeri eklendikten sonra 0.saatte, 24.saatte ve 48.saatte 18 kuyucuğa son konsantrasyonu 1mg/ml olacak şekilde MTT solüsyonu eklendi. Kuyucukların tamamına MTT eklenmesinden en az 4 saat sonra kuyucuk içindeki besiyeri-MTT karışımı uzaklaştırıldı. K562 hücreleri besiyeri-MTT karışımı uzaklaştırılmadan önce 1000x g’de 10 dakika santrifüj edildi. Oluşan kristaller dibe çöktürüldü. Besiyeri-MTT karışımı evaporatör (Eppendorf) ile uzaklaştırıldı. Oluşan kristaller DMSO ile çözüldü. Promega Glomax Elisa Reader cihazında 560 nm ve 750 nm olmak üzere çift dalga boyunda spektrofotometrik ölçüm yapıldı. Proliferasyon testi her hücre hattı için 3 farklı örnek ile 6 tekrarlı olarak yapıldı [47]. 2.9. İstatistiksel Analiz Bu çalışmada yapılan testlerinden elde edilen bulgularda, gruplar arasındaki farkların anlamlılığını belirlemek için T-test (Microsoft Excel) kullanıldı. p < 0.05 anlamlılık düzeyi kabul edilmiştir. [0.01 <= p < 0.05 (*): İstatistiksel anlamlılık. 0.001 <= p < 0.01 (**):Yüksek düzey istatistiksel anlamlılık. p < 0.001 (***): Çok yüksek düzey istatistiksel anlamlılık. 0.05 <= p <0.10 (*): Sınırda anlamlılık. p > 0.10: İstatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunamamıştır.] 33 3. BÖLÜM BULGULAR 3.1. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testlerinden Elde Edilen Bulgular Bu çalışmada mezenkimal kök hücrelerden, kültürün erken ve geç safhalarında koşullandırılmış besiyeri (KBY) toplanmıştır. Koşullandırılmış besiyeri elde edilen MKH’ler senesense bağlı beta-galaktozidaz aktivitesini belirlemek için sitokimyasal yöntemler ile boyanmıştır (Şekil 3.1 ve Şekil 3.2). Boyama sonucu mavi hücreler sayılarak senesens yüzdesi belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar Tablo 3.1’de gösterilmiştir. Tablo 3.1. KBY Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testi Sonuçları Genç MKH β-Gal Pozitif Hücre Yüzdesi: %3.03 Yaşlı MKH β-Gal Pozitif Hücre Yüzdesi: %74.3 Şekil 3.1. Genç mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü 34 Şekil 3.2. Senesent mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü 3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Testlerinden Elde Edilen Bulgular Mezenkimal kök hücrelerin farklı kültür evrelerinde elde edilmiş koşullandırılmış besiyerleri, genç MKH’lerin ve kanser hücrelerinin besiyerlerine %50 oranında eklenerek, bu koşullandırılmış besiyerinin ihtiva ettiği sekretomun genç MKH’lerin ve kanser hücrelerinin senesens mekanizmasına etkileri değerlendirilmiştir. Senesense bağlı β-galaktozidaz aktivitesini belirlemek için sitokimyasal yöntemler ile boyanmıştır. Boyama sonucu mavi hücreler sayılarak senesens yüzdesi belirlenmiştir. Elde edilen sonuçların ortalamaları Tablo 3.2’de gösterilmiştir. İstatistiksel analiz sonuçları Tablo 3.3’te gösterilmiştir. Tablo 3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Senesens Test Sonuçları Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i inkübe edilen hücreler ile inkübe edilen hücreler Ortalama β-Gal Pozitif Ortalama β-Gal Ortalama β-Gal Hücre Yüzdesi Pozitif Hücre Yüzdesi Pozitif Hücre Yüzdesi %1.62 %2.51 %11.50 Kontrol Hücre Genç MKH K562 %14.11 %19.00 %30.33 DLD-1 %11.39 %13.94 %15.11 MCF-7 %16.83 %14.61 %22.22 35 Tablo 3.3. Senesens Testi – T-Test p Değerleri Senesens Testi – T-Test p Değerleri Kontrol-Genç Kontrol-Senesent Genç-Senesent MKH 0.055884 * 0.0041 ** 0.00391 ** K562 0.101742 0.008586 ** 0.000644 *** DLD-1 0.052812 * 0.038891 * 0.162897 MCF-7 0.01078 * 0.00668 ** 0.001318 ** Bu sonuçlara göre genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen mezenkimal kök hücrelerin senesens yüzdesi kontrol grubunun senesens yüzdesi ile yakındır. Senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile muamele edilen MKH’lerin senesens oranında yaklaşık %10’luk artış gözlenmiştir. İstatistik analiz sonucunda gruplar arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.3). Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen K562 hücrelerinin senesens yüzdesi, kontrol grubunun senesens yüzdesi ile kıyaslandığında artış gözlenmiştir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen K562 hücrelerinin senesens yüzdelerinde artış gözlenmiştir. Bu grup ile diğer iki grup arasında anlamlı farklılıklar bulunmuştur (Tablo 3.3). Genç MKH ve senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen DLD-1 hücrelerinin senesens yüzdelerinde kontrol grubuna göre düşük bir artış gözlenmiştir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücreler ve kontrol grubu arasında anlamlı farklılıklar gözlenmiştir (Tablo 3.3). DLD-1 hücrelerinin senesens testlerinde genç MKH ve senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen hücreler arasında anlamlı farklılıklar bulunamamıştır (Tablo 3.3). Genç MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MCF-7 hücrelerinde senesens yüzdesi kontrol grubuna göre az miktarda artış göstermiştir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MCF-7 hücrelerinin senesens yüzdesinde, hem kontrol grubuna göre hemde genç grubuna göre artış gözlenmiştir. İstatistik analiz sonucunda meme kanseri hücre hattı için tüm gruplar arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.3). 36 3.3. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testlerinden Elde Edilen Bulgular MKH’lerin erken ve geç kültür evrelerinde elde edilmiş besiyerleri, genç MKH’lerin besiyerlerine ve kanser hücrelerinin besiyerlerine %50 oranında eklenmiştir. 48 saat inkübasyondan sonra Annexin V boyanan hücreler Muse Cell Analyzer cihazında ölçülmüştür. Apoptoz yüzdesi ortalamaları, Tablo 3.4’te gösterilmiştir. İstatistiksel analiz sonuçları, Tablo 3.5 ve Tablo 3.6’da gösterilmiştir. Tablo 3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testi Sonuçları Hücre Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i ile Kontrol inkübe edilen hücreler inkübe edilen hücreler Ölü Apoptotik Ölü Apoptotik Ölü Apoptotik Genç MKH %0.02 %0.54 %0 %1.52 %0.17 %12.96 K562 %6.51 %4.17 %7.44 %3.70 %10.56 %3.62 DLD-1 %1.63 %5.68 %1.53 %4.97 %2.06 %11.02 MCF-7 %14.49 %5.26 %15.00 %4.31 %10.55 %3.00 Tablo 3.5. Apoptoz Testi Apoptotik Hücre– T-Test p Değerleri Apoptoz Testi Apoptotik Hücre– T-Test p Değerleri Kontrol-Genç Kontrol-Senesent Genç-Senesent MKH 0.030414 * 0.005783 ** 0.005768 ** K562 0.225059 0.215799 0.427163 DLD-1 0.275222 0.019149 * 0.013593 * MCF-7 0.200493 0.008733 ** 0.133996 Tablo 3.6. Apoptoz Testi Ölü Hücre– T-Test p Değerleri Apoptoz Testi Ölü Hücre– T-Test p Değerleri Kontrol-Genç Kontrol-Senesent Genç-Senesent MKH 0.211325 0.121305 0.1003 K562 0.145846 0.07529 * 0.110625 DLD-1 0.420684 0.217562 0.05694 * MCF-7 0.448916 0.063571 * 0.155207 37 Elde edilen sonuçlara göre kontrol grubu besiyeri ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen MKH’lerin apoptoz yüzdesi yakınlık göstermektedir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen MKH’lerin apoptoz yüzdesinde kontrol grubuna göre %12’lik artış gözlenmektedir. Senesent grubunun apoptoz oranı, genç grubunun apoptoz oranından yaklaşık %10 daha düşüktür. Bu üç grup arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.5). MKH’lerin ölü hücre oranları arasında anlamlı farklar yoktur (Tablo 3.6). Bulgular K562 hücrelerinin apoptoz oranının üç grupta da birbirine yakın olduğu göstermektedir. İstatistik analiz sonucu elde edilen bulgulara göre gruplar arasında anlamlı farklılıklar gözlemlenememiştir (Tablo 3.5). K562 hücrelerinin canlılık testinde ise kontrol grubu ve senesent grubu arasında fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.6). DLD-1 hücrelerinde apoptoz oranı kontrol grubu ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde yakınlık göstermektedir. Kontrol grubu ile genç MKH besiyerinde inkübe edilen hücreler arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur. Senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde ise apoptoz oranı artış göstermiştir. Bu grup ile kontrol grubu arasındaki fark anlamlıdır (Tablo 3.5). DLD-1 hücrelerinin canlılık testinde genç grubu ve senesent grubu arasında fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.6). MCF-7 hücrelerinde apoptoz oranı kontrol grubunda diğer gruplara göre daha fazladır. Ancak genel olarak baktığımızda apoptoz oranının oldukça düşük olduğu gözlenmektedir. Kontrol grubu ve senesent MKH besiyeri ile inkübe edilen hücreler arasındaki fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.5). MCF-7 hücrelerinin canlılık testinde ise kontrol grubu ve senesent grubu arasında fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.6). 3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran Potansiyeli Testlerinden Elde Edilen Bulgular Mezenkimal kök hücrelerin farklı kültür evrelerinde elde edilmiş besiyerleri, genç mezenkimal kök hücrelerin besiyerlerine ve kanser hücrelerinin besiyerlerine %50 oranında eklenmiştir. 48 saat inkübasyondan MitoPotential boyası ve 7-AAD ile boyanıp Muse Cell Analyzer’da incelenmiştir. Yapılan incelemeler sonucunda elde edilen depolarize (mitokondri membran potansiyeli düşük) hücre yüzdelerinin ortalamaları Tablo 3.7’te gösterilmiştir. İstatistiksel analiz sonuçları Tablo 3.8’de gösterilmiştir. 38 Tablo 3.7. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran Potansiyeli Testi Sonuçları Hücre Kontrol Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i ile inkübe edilen hücreler Depolarize Hücre Depolarize inkübe edilen hücreler Hücre Depolarize Yüzdesi Yüzdesi Yüzdesi Genç MKH %14.00 %22.92 %28.62 K562 %25.20 %27.27 %31.38 DLD-1 %13.87 %17.76 %15.44 MCF-7 %37.39 %43.31 %41.88 Hücre Tablo 3.8. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi – T-Test p Değerleri Mitokondri Membran Potansiyeli Testi – T-Test p Değerleri Kontrol-Genç Kontrol-Senesent Genç-Senesent MKH 0.035222 * 0.00541 ** 0.092511 * K562 0.172429 0.025445 * 0.006743 ** DLD-1 0.099426 * 0.321043 0.21617 MCF-7 0.246918 0.294284 0.311399 Elde edilen sonuçlara göre genç MKH ve senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen MKH’lerin mitokondri membran depolarizasyonu kontrol grubuna göre artış göstermiştir. Mitokondri membran depolarizasyonu en fazla senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlenmiştir. İstatistiksel analiz sonucunda tüm gruplar arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.8). K562 hücrelerinde mitokondri membran depolarizasyonu en fazla senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlenmiştir. Genç MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücrelerin mitokondri membran depolarizasyonu yüzdelerinde de kontrol grubuna göre artış söz konusudur. İstatistiksel analizlere göre kontrol grubu ile diğer iki grup arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.8). 39 DLD-1 hücrelerinde mitokondri membran depolarizasyonu 3 grupta da yakınlık göstermekle beraber en yüksek oran genç MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen hücrelerde gözlenmiştir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen hücrelerin depolarizasyon yüzdesi, genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelere oranla daha düşüktür. Yapılan istatistiksel analizlere göre sadece kontrol grubu ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücreler arasındaki fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.8). MCF-7 hücrelerinde tüm gruplarda mitokondri membran depolarizasyonu yüksektir. Ancak en yüksek yüzde DLD-1 hücrelerinde olduğu gibi genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlemlenmektedir. Gruplar arasında farklar anlamlı bulunmamıştır (Tablo 3.8). 3.5. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon Testlerinden Elde Edilen Bulgular Genç MKH’ler ve kanser hücreleri 96 kuyucuklu plaklara ekilmiş, üzerine 24 saat sonra koşullandırılmış besiyeri eklenmiştir. 0 saat, 24 saat ve 48 saat inkübasyondan sonra kuyucuklara MTT eklenmiştir. Oluşan formazan kristalleri DMSO ile çözülmüş ve spektrofotometrik ölçüm yapılmıştır. Koşullandırılmış besiyerinin eklendiği saatte (0.saat) kuyucuklardaki hücre yoğunluğu %100 alınarak hesaplama yapılmış ve 24. ile 48. saatlerdeki kuyucuklardaki canlı hücre yüzdeleri bulunmuştur. Proliferasyon testlerine ait sonuçların ortalamaları Tablo 3.9’da gösterilmiştir. İstatistiksel analiz sonuçlar Tablo 3.10 ve Tablo 3.11’de gösterilmiştir. Tablo 3.9. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon Testi Sonuçları Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i ile Kontrol inkübe edilen hücreler inkübe edilen hücreler 48.saat 24. saat 48.saat 24. saat 48.saat Genç MKH 82.79209 47.6757 81.00809 63.31503 96.50879 74.08146 K562 103.2889 120.115 106.389 136.0877 106.055 132.2175 DLD-1 96.04655 87.5266 109.2232 102.3001 101.5178 95.61689 MCF-7 87.38739 71.31477 92.99182 84.6161 94.49084 77.59756 Hücre 24. saat 40 Tablo 3.10. MTT Testi 24.saat – T-Test p Değerleri MTT Testi 24.saat – T-Test p Değerleri Kontrol-Genç Kontrol-Senesent Genç-Senesent MKH 0.381673 0.056042 * 0.037423 * K562 0.412209 0.390342 0.490722 DLD-1 0.031003 * 0.147076 0.081005 * MCF-7 0.274981 0.231942 0.425806 Tablo 3.11. MTT Testi 48.saat – T-Test p Değerleri MTT Testi 48.saat – T-Test p Değerleri Kontrol-Genç Kontrol-Senesent Genç-Senesent MKH 0.011088 * 0.000556 *** 0.031114 * K562 0.225578 0.180735 0.429176 DLD-1 0.033058 * 0.097268 * 0.007067 ** MCF-7 0.00063 *** 0.035232 * 0.027665 * Mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon testlerinden elde edilen sonuçlara göre koşullandırılmış besiyerlerinin eklenmesinden 24 saat sonra tüm grupların canlı hücre yüzdesi azalmıştır. Ancak azalma oranı en fazla kontrol grubunda, en az senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerdedir. Kontrol grubu ile diğer gruplar arasında anlamlı farklar bulunmuştur. Koşullandırılmış besiyeri eklendikten 48 saat sonra ise kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi yarı yarıya azalmıştır. Bu azalma oranı yine en fazla kontrol grubunda, en az senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerdedir. Yapılan istatistiksel analiz tüm gruplar arasında anlamlı farklar olduğunu göstermektedir (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11). K562 hücrelerinin proliferasyon testlerinden elde edilen sonuçlara göre koşullandırılmış besiyerinin eklenmesinden 24 saat sonra canlı hücre yüzdelerinde önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. 48 saat sonra hücre yüzdelerinde artış gözlenmiştir. Artış oranı en az kontrol grubunda, en fazla genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde görülmüştür. Gruplar arasında anlamlı farklar bulunamamıştır (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11). 41 DLD-1 hücrelerinin proliferasyon testlerinden elde edilen sonuçlara göre koşullandırılmış besiyerinin eklenmesinden 24 saat sonra kontrol grubunun canlı hücre yüzdesinde azalma gözlenmiştir. Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerin yüzdesinde artış gözlemlenirken senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerin yüzdesinde değişiklik olmamıştır. İstatistiksel analiz sonucunda bütün gruplar arasındaki sonuçlar anlamlı bulunmuştur. Koşullandırılmış besiyerinin eklenmesinden 48 saat sonra kontrol grubunun canlı hücre yüzdesinde azalma görülmektedir. 24. saatte artan genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerin yüzdesi, 48. saate tekrar azalma göstermiştir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen canlı hücrelerin yüzdesinde 48. saatte 24 saat öncesine göre küçük bir azalma gözlenmektedir. Yapılan istatistiksel analiz; kontrol grubu ile genç MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücreler arasında ve genç MKH ile senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücreler arasındaki farkların anlamlı olduğunu göstermiştir (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11). MCF-7 hücrelerine yapılan proliferasyon testleri sonucunda koşullandırılmış besiyeri eklendikten 24 saat sonra canlı hücre yüzdelerinde azalma gözlenmiştir. Azalma oranları birbirine yakın olmakla beraber, en çok azalma kontrol grubunda gözlenmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda 24. saatteki hücre oranları arasında anlamlı farklılıklar bulunamamıştır. Koşullandırılmış besiyeri eklendikten 48 saat sonra hücrelerinin yüzdesi daha da azalmıştır. 48. saat sonunda en düşük hücre yüzdesi kontrol grubunda, en yüksek hücre yüzdesi genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlenmiştir. İstatistiksel analizler tüm gruplar arasında anlamlı farklılıklar olduğu göstermektedir (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11). 4. BÖLÜM TARTIŞMA – SONUÇ VE ÖNERİLER 4.1. Tartışma Mezenkimal kök hücrelerin salgıladıkları protein ve peptit yapıdaki faktörlerin ve hatta RNA’ların, hücrenin bulunduğu mikro çevreye etki ettiği bilinmektedir. Bu parakrin etki sonucunda nişte bulunan diğer hücrelerin fonksiyonları düzenlemektedir [17]. Senesens hücrenin sağlıklı hücreye göre aşırı büyümesi, proliferasyonunun durması, hücrede birden fazla çekirdek bulunması, lizozom miktarındaki artış ve buna bağlı olarak β-galaktozidaz miktarındaki artış ile karakterize edilir [2]. Bu hücreler, bölünme için birçok kriteri sağlamasına rağmen telomer kısalması, genetik materyalde oluşan hasar gibi sebeplerden, kontrol mekanizmaları tarafından engellenerek hücre bölünmesinin G1 fazından S fazına geçiş yapamaz ve bölünemezler. Bu kontrol proteinlerine örnek olarak p53 proteini verilebilir. Tümör baskılayıcı p53 geninin hasar almasında bu mekanizma ortadan kalkar ve hücre kontrolsüz bölünerek neoplastik dönüşüme girer [5, 9]. Senesens mekanizması da doku profilini belirleyen hücrelerce tetiklenebilen bir mekanizmadır. Senesens mekanizması, aktive olmuş bir mezenkimal kök hücre çevresine senesens mesajını veren moleküller salgılar. Bu moleküller dokudaki diğer hücreleri senesense girmeleri için uyarır. Senesens hasarlı hücrelerin büyümesini inhibe eden bir mekanizma olduğu gibi, sağlıklı hücreler üzerinde de olumsuz etki yapabilirler. Alzheimer, pulmoner fibrozis ve arteroskleroz gibi yaşa bağlı hastalıklardan etkilenen dokularda, oldukça fazla senesent hücreye rastlanmıştır. Bu durum dokunun yaşlanmasının ve bu tür hastalıkların ortaya çıkmasının sebebi olarak, senesent hücreleri salgıladığı faktörleri işaret etmektedir [49]. Ayrıca dokuda neoplastik dönüşüme uğramış hücreler varsa, bu hücreler dokunun diğer hücrelerinden farklı şekilde etkilenebilirler. Senesent hücrelerin salgıladığı moleküller tümör oluşumunun erken aşamasında 43 neoblastik dönüşümü baskılarken, geç aşamalarda tümör hücrelerinin büyümesini desteklemektedir [9]. Tümör baskılayıcı mekanizmaları çalışan sağlıklı hücrelerde senesens mekanizmasından sonraki adım apoptozdur. Apoptoz hücre ölümünden önceki son aşamadır. Hücre membranında bulunan fosfatidil-serin moleküllerinin miktarındaki artış ile doğru orantılıdır. Fosfatidil-serin (PS) miktarındaki artış, hücrenin apoptoza girdiğini çevredeki hücrelere apoptoza girdiğini haber verir [50]. Bu mesaj, kendinin ortadan kaldırılması için diğer hücrelere bir uyarı olarak nitelendirilebilir. Apoptozun bir diğer göstergesi ise mitokondri membran potansiyelinin düşüşü ile hücrenin enerji üretmede sıkıntıya girmesidir. Hücre enerji üretiminde sıkıntı yaşadığı zaman, apoptoza girer ve fosfatidil-serin ifadesi artar. Tüm bu mekanizmalar aktif hale geldiğinde hücre bölünmesi durur ve proliferasyon azalır [51]. Kaynaklardan elde edilen bilgiler doğrultusunda, senesent MKH’lerce salgılanan moleküllerin dokuda bulunan diğer hücrelerde senesens ve apoptoz mekanizmalarının harekete geçirmesi, mitokondri membran potansiyelini ve proliferasyonu azaltması beklenmektedir. Ancak senesent MKH sekretomu kanser hücrelerinde tam tersi etki de yapabilir. Yapılan bu çalışma ile genç ve senesent MKH sekretomlarının kanser hücrelerine nasıl etki ettiğini gözlemlemek ve bu etkinin hücrelerin hangi biyolojik mekanizmasına olacağını belirlemek amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda genç ve senesent mezenkimal kök hücrelerden elde edilen bu hücrelerin salgıladığı molekülleri içeren koşullandırılmış besiyerileri, kanser hücrelerinin kültür ortamına katılmıştır. Çalışmada her hücre için 3 grup üzerinde incelemeler yapılmıştır. Bu gruplardan sadece hücreye özgü besiyeri ve serumsuz MKH besiyeri karışımında inkübe edilenler kontrol grubu, genç MKH’lerin koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilenler genç grubu ve kültürde 30 gün geçirmiş MKH’lerin besiyerinde inkübe edilen hücreler ise senesent grubu olarak isimlendirilmiştir. Bu karışık besiyerleri içerisinde belli bir süre inkübe edilen kanser hücrelerine senesens, apoptoz, mitokondri membran potansiyeli ve proliferasyon testleri yapılmıştır. Ayrıca koşullandırılmış besiyeri elde edilecek MKH’lere, kültürde 30 gün geçirdikten sonra beta-galaktozidaz boyama yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, kültürde geçirilen sürenin MKH’lerde senesens mekanizmasını aktive ettiği gözlenmiştir. 44 Kültürde geçirilen zaman sonucunda aktive olan senesens mekanizması replikatif senensens olarak adlandırılmıştır [9]. Bu senesens mekanizmasına kronik senesens adı da verilir [8]. Koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücreler kültürden sonra β-galaktozidaz boyama yapılmıştır. Bu test sonucuna göre mezenkimal kök hücrelerin sekretomunun yine mezenkimal kök hücreler üzerinde etkisi gözlemlenmiştir. Kontrol grubunun senesens yüzdesi %1.62, genç grubunun senesens yüzdesi %2.51 ve senesent grubunun senesens yüzdesi ise %11.50 olarak belirlenmiştir. Kontrol besiyerinde ve genç MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MKH’lerin senesens oranları birbirine yakınken, senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen hücrelerin senesens oranında artış gözlenmiştir. Bu durum senesent MKH’lerce salgılanan sekretomun bir başka MKH’de senesens mekanizmasını aktive ettiği şeklinde değerlendirilebilir. Doku fenotipini belirleyen bu hücrelerin nişteki somatik hücrelere etki ettiği kadar, diğer kök hücreleri de etkilediği düşünülebilir. Senesent bir kök hücreden, senesens mesajı içeren sekretomu alan bir başka kök hücre de senesens mekanizmasına özgü moleküller salgılamaya başlar [2]. Bu durum senesens mesajının artarak devam ettiği anlamına gelebelir. Böylece dokunun tamamında bulunan hücreler senesens mesajını alabilirler. MKH’lerin apoptoz testleri de senesens testlerine benzer bir durum göstermektedir. Kontrol grubu apoptoz oranı %0,54 ve genç grubu apoptoz oranı %1,52 seviyesinde iken; senesent grubu apoptoz oranının %12,96 seviyesine çıktığı görülmektedir. MKH’lerin ölü hücre oranları ise oldukça düşüktür. Ölü hücre yüzdelerine bakıldığında kontrol grubunda %0.02, genç grubunda %0 ve senesent grubunda %0.17 oranları görülmektedir. Apoptoz oranının senesens oranı ile paralel bir durum göstermesi bu iki mekanizmanın birbiri ile bağlantılı olduğunu düşündürmektedir. Apoptoz ve senesens mekanizmaları birbirini takip eden mekanizmalar olabileceği gibi, eş zamanlı ilerleyen süreçler de olabilir. Eğer bu iki sürecin birbirini takip eden iki mekanizma olduğu varsayımı ile; senesens mekanizması aktive olmuş hücreler, bu mekanizmayı aktive eden etken değişmediği taktirde apoptoza girmekte olduğu ifade edilebilir [52]. Bu durum MKH’lerin, senesent bir hücreden alınan, senesens molekülleri ile başlayan ve apoptoz hatta hücre ölümüne gidebilen bir mekanizmadan etkilendiklerini sonucunu ortaya çıkarabilir. Canlı dokusunda bulunan MKH’lerin söz konusu mekanizmaları takip etmesi, dokuda meydana gelen hücre kaybını dolayısıyla dokunun kendini yenileme kapasitesini 45 kaybetmesini gözler önüne sermektedir [53]. Diğer bir olasılık olan apoptoz ve senesens süreçlerinin eş zamanlı mekanizmalar olma durumu ise ancak tek hücre çalışmalarıyla belirlenebilir. Yani çalışmada kullanılan iki farklı metot, aynı hücre grubunu hedef aldığından, bu grup içerisinde bulunan herhangi bir hücre, hem apoptoz hem de senesens belirteçlerini ifade ediyor olabilir [54]. Mitokondri membran potansiyeli hücrenin fizyolojik durumu hakkında bilgi veren bir diğer önemli parametredir [44]. Mitokondri membranının yükü hücrenin enerji üretebilme kapasitesi hakkında önemli ipuçları vermektedir. Apoptoza giren ve hücre ölümüne yaklaşan hücrelerde mitokondri membran potansiyelinin düştüğü gözlenmektedir [52, 53]. MKH’ler üzerinde yapılan mitokondri membran potansiyeli testleri sonucunda kontrol grubu hücrelerinde depolarizasyon yüzdesi %14 iken genç grubunda depolarizasyon yüzdesi %22.92 seviyesine yükselmiştir. senesent grubunda depolarizasyon yüzdesi ise %28.62 olarak ölçülmüştür. Bu durum senesent MKH’lerin mikro çevrelerindeki diğer MKH’lerin mitokondriyal membran potansiyelin önemli derecede etkilediğini göstermektedir. Senesent bir kök hücreye yakın olan başka bir kök hücre enerji üretebilme kapasitesini belli ölçüde kaybetmektedir. Bu durum hücrenin apoptoza girmesine neden olabilmektedir [45, 54]. Ortaya çıkan tablo bize; senesens, apoptoz mekanizmasında mitokondri membran potansiyelinin senesens moleküllerinden etkilenebilen bir parametre olduğunu, apoptoz mekanizmasının önemli bir parçası olduğunu ve hücre ölümüne sebep olan etkenlerden biri olduğunu düşündürmektedir. Senesens mekanizması aktive olmuş hücreler artık bölünmeye devam etmezler. Yani bir diğer deyişle proliferasyon kapasiteleri düşer [2]. MKH’lere yapılan prolifereasyon testlerinde, kültürün başlangıcında tüm gruplardaki hücre yüzdesi %100 olarak kabul edildiğinde, kontrol grubu hücrelerinin 24.saatte %82.79 olan canlı hücre yüzdesinin 48.saatte %47.67’ye düştüğü gözlenmiştir. Genç grubunda ise 24.saatte %81 olan canlı hücre yüzdesi 48.saatte %63.31 olarak ölçülmüştür. Senesent grubunda 24.saate %96.50 olan canlı hücre yüzdesi, 48.saatte %74,08’e düşmüştür. Beklenen sonuçlar 48.saatte en düşük canlı hücre yüzdesinin senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin bulunduğu kuyucuklarda olmasıdır. Ancak 96 kuyucuklu plakların her bir kuyucuğunun yüzey alanı çok küçük olduğundan, beklenen sonuçların tam tersi bir tablo ortaya çıktığı düşünülmektedir. Karşılaşılan durum şu şekilde açıklanabilir. Kontrol grubu ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin bulunduğunu 46 grubun proliferasyon kapasiteleri, senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerin bulunduğu gruptan daha yüksek olduğu için ilk saatlerde hızla bölünmeye başlamışlardır. Ancak kuyucuklardaki alanın azlığı, yoğunluğu artan hücrelerin ölmeye başlamasına sebep olmuştur. Bu durumda hızlı bölünen hücreler erken ölmeye başlamışlar, geç bölünen hücreler ise alan azlığını daha geç hissedeceklerinden yaşamaya devam etmişlerdir. Böylece proliferasyon kapasitesi yüksek kontrol grubu ve genç grubu hızlı bir şekilde bölünmüşler ve kısa sürede alan yetersizliğinden ölmeye başlamışlardır. Bu durum 48.saatte kontrol grubunun canlı hücre yüzdesindeki ani düşüşten anlaşılabilir. Senesent grubunun ise proliferasyon kapasitesi düşük hücrelerden oluştuğu için, alan yetersizliğini hissedecek kadar fazla çoğalamadıkları ve hücreler canlılıklarını korumaya devam ettiği düşünülebilir [9]. Test sonuçlarına göre senesent bir kök hücrenin sekretomu, kök hücrenin kendi mikro çevresinde bulunan kök hücrelerin proliferasyon kapasitesini etkilemektedir. Dokudaki kök hücrelerin proliferasyon kapasitesinin düşmesi dokunun yenilenebilirliği açısından önemli bir dezavantajdır [49]. Bir kronik myleoid lösemi hücresi olan K562’ler de senesent hücrelerin koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edildikleri zaman sekretomda bulunan senesens mesajından etkilendikleri gözlemlenmiştir. Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen K562’ler ve kontrol grubu arasında anlamlı farklılık görülmemektedir. Kontrol grubu senesens yüzdesi %14.11 iken genç grubunun senesens yüzdesi %19 olarak ölçümüştür Ancak senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen K562 hücrelerinin senesens yüzdesi kontrol grubuna göre önemli bir artış göstermiştir. Senesent grubunda bulunan hücrelerin senesens yüzdesi %30.33’dür. Yani senesens mekanizmasının bir göstergesi olan β-galaktozidaz miktarının arttığı gözlenmiştir. Bu durum kronik myeloid lösemi hücrelerinin senesent MKH’lerin sekrete ettikleri faktörlerden etkilendiği anlamına gelebilir. K562 hücrelerinin apoptoz testleri sonucunda elde edilen veriler 3 grup arasında anlamlı farklılıklar olmadığını göstermektedir. MKH’lerin sekrete ettikleri faktörler sayesinde senesens mekanizması aktive olmuş K562 hücrelerinin apoptoza girmedikleri gözlenmiştir. Ancak ölü hücre yüzdelerini dikkate alırsak, gruplar arasında az da olsa farklılıklar göze çarpmaktadır. Kontrol grubunda %6.51, genç grubunda %7.44 ve 47 senesent grubunda %10.56 olarak belirlenen ölü hücre oranları, MKH sekretomunun K562 hücrelerinin canlılığı üzerinde etkili olduğunu göstermektedir. Kronik myeloid lösemi hücrelerinin mitotik indeks testlerinden elde edilen sonuçlar senesens testleri ile orantılıdır. Bu sonuçlara göre; kontrol grubunun depolarizasyon yüzdesi %25.20 iken bu oran genç grubunda %27.27’ye senesent grubunda ise %31.38’e yükseldiği gözlenmektedir. K562 hücrelerinin mitokondri membran potansiyelinin MKH sekretomundan etkilendiği ve bu hücrelerin mitokondri membran potansiyelinin azaldığı gözlenmektedir. K562 hücrelerinin proliferasyon testleri sonucuna göre 24. saate ve 48. saatte gruplar arasında anlamlı farklar gözlemlenmemiştir. 24 saat sonunda kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi %103.28 iken genç grubunda %106.38 ve 30.gün grubunda bu oran %106.05’tir. 48 saat sonra kontrol grubunda kontrol grubunun canlı hücre yüzdesi %120.11 iken, genç grubunda %136.08 ve senesent grubunda %132.21 seviyesine yükselmiştir. Bu hücrelerin yüzen hücreler olması ve kuyucuklar içinde alan sıkıntısı yaşamamaları, K562 hücrelerinin tutunan hücrelere oranla daha çok çoğalmalarını açıklayabilir. Sekretomun kronik myeloid lösemi hücrelerininin mitokondri membran potansiyelini düşürmesine ve bu hücrelerde senesens yüzdesinde artışa sebep olmasına rağmen, apoptoz mekanizmasını tetiklememiştir. Ayrıca proliferasyon testlerine bakıldığında gruplar arasında anlamlı farklar görülmemiştir. Bu doğrultuda genç veya senesent MKH sekretomunun K562 proliferasyonu üzerine önemli bir etkisi görülmediği söylenebilir [52]. Kolon kanseri DLD1 hücreleri MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edildikten sonra yapılan senesens testinin sonuçlarına göre, bu kanser hücreleri senesent MKH’lerin sekretomundan etkilendiği ve senesens oranlarının arttığı gözlenmiştir. Ancak bu artış miktarı çok fazla değildir. Kontrol grubunun senesens yüzdesi %11.39 iken, genç grubunda %13.94, senesent grubunda ise %15.11’tir. MKH sekretomunun bu hücrelerin senesens mekanizmasını etkilediğini söylemek mümkündür ancak bu etki MKH ve ya K562 hücreleri üzerindeki etki kadar net değildir. DLD-1 hücrelerinin apoptoz testlerinden elde edilen verilere göre, kontrol grubunda apoptoz yüzdesi %5.68, genç grubunda apoptoz yüzdesi %4.97 ve senesent grubunda 48 apoptoz yüzdesi ise %11.02’dir. Bu durumda senesent MKH’lerin salgıladığı moleküllerin DLD-1 hücrelerinde apoptoz mekanizmasını aktive ettiği söylenebilir. Bu etki senesens oranı ile paralellik göstermektedir. Ancak MKH’lerin sekrete ettikleri moleküller kolon kanseri hücrelerinde senesens mekanizmasından daha çok apoptoz mekanizmasını harekete geçirmişlerdir. Ölü hücre yüzdelerine baktığımızda kontrol grubunda %1.63, genç grubunda %4.97 ve senesent grubunda %2.06 oranları görülmektedir. DLD-1 hücrelerinin canlılığının MKH sekretomunun varlığından önemli oranda etkilenmediği söylenebilir. Kolon kanseri hücrelerinin mitokondriyal membran potansiyeli testleri kontrol grubunda %13.87, genç grubunda %17.76 ve senesent grubunda %15.44 depolarize hücre olduğunu göstermektedir. Bu verilere göre; genç MKH sekretomunun kolon kanseri hücrelerinin enerji üretebilme potansiyelini düşürdüğünü söyleyebiliriz. DLD-1 hücrelerinin proliferasyon testlerine göre 24. saatte kontrol grubu canlı hücre yüzdesi %96.04, genç grubunda canlı hücre yüzdesi %109.22 ve senesent grubunda canlı hücre yüzdesi ise %101.51’dir. 48 saat sonra ise kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi %87.52, genç grubunda %102.30 ve senesent grubunda ise %95.61’tir. Bu sonuçlara bakılarak kültürün ilk gününde senesent MKH sekretomu DLD-1 hücrelerinin proliferasyonunu desteklediğini söylemek mümkündür. Kontrol grubunda ve senesent grubunda ise önemli değişiklikler gözlenmemektedir. 48. saatte ise tüm grupların canlı hücre yüzdesinde 24. saate göre düşüş gözlenmektedir. Bu düşüş MKH’lerde olduğu gibi alan darlığı ile ilişkilendirilebilir. DLD-1 hücrelerinin testlerinden elde edilen sonuçlara genel olarak bakacak olursak, MKH sekretomunun DLD-1 hücrelerinin apoptoz mekanizmasını etkilediğini ancak bu durumun mitokondri zar potansiyeli ve hücre proliferasyonu ile ilişkilendirilemeyeceğini söyleyebiliriz. DLD-1 hücrelerinin senesens mekanizmaları MKH sekretomundan etkilenmektedir. Ancak test sonuçlarına göre, bu etkileşim MKH-K562 ve MKH-MKH etkileşiminde olduğu kadar net değildir. Bu durum senesens mekanizması çerçevesinde salgılanan faktörlerin hücrenin köken aldığı dokuya göre farklılık gösterip gösteremeyeceği sorusunu akla getirmektedir. Epitelyal kökenli DLD-1 hücrelerinin, bulundukları dokuda MKH’ler ile sık karşılaşmamalarından dolayı bu hücrelerin MKH sekretomunda bulunan senesens mesajından daha az etkilenebileceği ihtimalini göz önüne sermektedir [52]. 49 Meme kanseri hücreleri MCF-7’ler de DLD-1 hücreleri gibi epitel kökenli kanser hücreleridir. MCF-7 hücrelerinin senesens testlerine göre kontrol grubunun senesens yüzdesi %16.83, genç grubunun senesens yüzdesi %14.61 ve senesent grubunun senesens yüzdesi ise %22.22’dir. Bu sonuçlar MCF-7 hücrelerinin senesens mekanizmalarının senesent MKH sekretomundan etkilendiğini göstermektedir. Kontrol grubu ile 1. gün grubu arasında anlamlı bir fark yoktur. MCF-7 hücrelerinin apoptoz testi sonuçlarına göre apoptotik hücre yüzdesi kontrol grubunda %5.26, genç grubunda %4.31 ve senesent grubunda %3 olarak belirlenmiştir. Bu durum MCF-7 hücrelerinin apoptoz mekanizmalarının MKH sekretomundan etkilenmediğini göstermektedir. Ancak gruplar içindeki ölü hücre yüzdelerini göz önüne aldığımızda diğer üç hücre tipine kıyasla daha fazla ölü hücre olduğu görülmüştür. Ölü hücre oranları kontrol grubunda %14.49, genç grubunda %15 ve senesent grubunda %10.55 olarak belirlenmiştir. Ölü hücre oranları dikkate alarak, senesent MKH sekretomunun MCF-7 hücrelerinde canlılığı desteklediğini söyleyenebilir [52]. MCF-7 hücrelerinin mitokondri membran potansiyeli testlerine göre depolarize hücre yüzdesi kontrol grubunda % 37.39, genç grubunda %43.31 ve senesent grubunda ise %41.88’dir. Bu sonuçlar arasında anlamlı farklılıklar olmaması apoptoz mekanizmasının önemli bir parametresi olan mitokondri membran potansiyelinin de MKH sekretomundan etkilenmediği sonucunu ortaya çıkarabilir. Ancak apoptoz testinin temel birleşeni olarak kullanılan fosfatidil-serin miktarının az olmasına rağmen depolarize hücre miktarının yüksek olması ilgi çekici bir durumdur. MCF-7 hücrelerinin proliferasyon testlerine bakacak olursak 24. saate kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi kontrol grubunda %87.38, genç grubunda %92.99 ve senesent grubunda %94.49 olarak belirlenmiştir. 48.saatin sonunda ise bu oranlar kontrol grubunda %71.31, genç grubunda %84.61 ve senesent grubunda %77.59 olarak ölçülmüştür. Kontrol grubundaki düşüş, hücre bölünmesinin hızlı bir şekilde devam edip, alan sıkıntısının ortaya çıkmasıyla açıklanabilir. Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerin proliferasyonunun yavaşladığını, böylece canlı hücre sayılarının yüksek kaldığını söyleyebiliriz. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MCF-7 hücreleri ise genç grubundaki hücrelere göre daha fazla bölünerek kısıtlı alanda canlılıklarını koruyamamışlardır. Bu durumda senesent MKH koşullandırılmış 50 besiyerinin MCF-7 hücrelerinde proliferasyonu desteklediği söylenebilir [52]. Bu veriler ve apoptoz testindeki ölü hücre oranlarının tutarlı olduğu görülmektedir. MCF-7 hücrelerinin senesens mekanizmalarının, senesent MKH sekretomu ile harekete geçtiği söylenebilir. Ancak MKH sekretomunun, bu hücrelerin mitokondri membran potansiyeli ve apoptoz mekanizmasına etkisi gözlemlenememiştir. Senesent MKH’lerin sekretomu MCF-7 kanser hücrelerinde canlılığı ve proliferasyonu desteklediği söylenebilir [52]. Bu durum literatürde yer alan bilgiler göz önüne alındığında, MCF-7 hücrelerinin metastatik bölgede bulunan bir adenokarsinom olmasını dikkate alarak, neoplastik dönüşümün geç safhalarında, senesent MKH’lerin kanser gelişimini hızlandırmış olabileceği ihtimalini ortaya çıkarmaktadır [2, 49]. 4.2. Sonuç ve Öneriler Mezenkimal kök hücrelerin farklı durumlarda salgıladıkları moleküllerin, çevredeki diğer kök hücreleri etkilediğini söylemek mümkündür. Bu durumda moleküller vasıtasıyla iletilen senesens mesajının diğer kök hücrelerde de aynı etkiyi yaptığı söylenebilir [2]. Böyle bir durumda dokudaki senesent kök hücrelerin sayısının artması, buna bağlı olarak parakrin etki ile nişe salgılanan moleküllerin miktarında artış olması beklenir. Böylece dokunun tamamındaki hücrelerde sekretomun etkisi altında kalacaktır. Dolayısıyla doku profilinde değişiklikler olması mümkündür. Senesent bir mezenkimal kök hücre, parakrin etkisi sayesinde dokunun kaderini belirleyebilir [49]. Genç veya senesent MKH’nin bulunduğu nişte bulunan kanser hücrelerininde sekretomdaki moleküllerden etkilendiğini söylemek mümkündür. Ancak bu moleküller, farklı hücrelerin, farklı mekanizmalarına etki etmektedir. Söz konusu moleküllerin etki edeceği mekanizma, kanser hücresinin kökenine göre değişkenlik göstermektedir. Örneğin; senesent MKH sekretomu, kronik myeloid lösemi hücrelerinin senesens mekanizmasını aktive ederken, epitelyal kökenli kanser hücre hatlarının senesens mekanizması üzerinde, yapılan çalışma ile gözlemlenebilen bir etkisi yoktur. Apoptoz mekanizmasında ise kolon kanseri hücrelerinin senesent MKH sekretomundan etkilendiği gözlenirken, diğer hücre hatlarının apoptoz mekanizmalarında değişkenlik gözlenmemiştir. Mitokondri membran potansiyeli göz önüne alındığında kronik myleoid lösemi hücrelerinde senesent MKH sekretomu ile enerji üretebilme kapasitelerinde azlama görülmektedir. Epitelyal kökenli hücrelerde, MKH sekretomunun mitokondri 51 membran potansiyeline etkisi gözlenmemektedir. K562 ve MCF-7 hücrelerinde, mitokondri membran depolarizasyonunun yüksek olmasına rağmen, apoptoz oranındaki azlık ilgi çekici bir durumdur. Test sonuçlarına göre; MCF-7 ve K562 hücreleri mitokondri membran potansiyelinin düşük olmasına rağmen apoptoz belirteci olan fosfatidil-serin ifadeleri oldukça azdır. Bu durum olası bir kaç senaryoyu akla getirmektedir. İlki bu iki mekanizma arasında bulunan yolakların çalışmasının uzun sürmesi olabilir. İkinci ve daha mümkün olan senaryo ise bu yolakların bir şekilde inhibe edilmiş olabileceğidir. Fosfatidil-serin ifadesini, çevredeki hücrelere gönderilen ve hücrenin kendisinin apoptoza girdiğini ve ortadan kaldırılması gerektiği belirten bir mesaj olduğunu düşünürsek, kanser hücrelerinin bu mesajı bloke ederek hayatta kalmaya devam etmeleri olasıdır. Bahsedilen durum kanser hücrelerinin kendini kamufle etmek için kullandığı bir mekanizma olabilir. Bir diğer olasılık ise bu kanser hücrelerinin enerji ihtiyacını farklı bir yolla karşılıyor olabilecekleridir. Bazı kanser hücreleri, enerji ihtiyaçlarını karşılamk için mitokondride piruvatın oksidayonundan ziyade, sitozolde glikolizi takip eden laktik asit fermantasyonunu tercih ederler. Onkolojide bu durum Warburg Etkisi olarak olarak bilinir [55, 56]. Senesent MKH sekretomu sağlıklı hücrelerin proliferasyonunu azaltırken, meme kanseri hücrelerinde proliferasyonu desteklediği gözlemlenmiştir. MCF-7 hücrelerinin metastatik bölgeden izole edilen hücreler olduğunu düşünürsek, karşılaşılan bu sonuç doğaldır. Daha önce yapılan çalışmalarda göstermektedir ki, senesent MKH’ler tümör gelişiminin geç safhalarında, kanser hücrelerini desteklemektedir. Bu durum senesens mekanizmasının dezavantajıdır [1]. MTT yönteminin, kanser hücreleri gibi çok çabuk çoğalan hücrelerde uygulandığında alan sıkıntısı yaratma durumu olduğundan, Ki67 gibi farklı proliferasyon belirteçleri ile daha net sonuçlar elde edilebilir. Kullanılan kanser hücre hatları üzerinde hücre döngüsü testleri uygulanarak, kanser hücrelerinin bölünmenin hangi fazında olduğunu öğrenmek, p53 gibi kontrol noktası proteinlerinin çalışıp çalışmadığı hakkında önemli veriler sunabilir. Yine p53, p16, p21 gibi genlerin ifadeleri RT-PCR metoduyla incelenip hücrelerin fizyolojik mekanizmaları hakkında önemli bilgiler elde edilebilir. 52 Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, kanser hücreleri ile MKH sekretomu arasındaki ilişki hakkında önemli ipuçları vermektedir. MKH sekretomunun içeriğindeki protein/peptit karakterdeki moleküllerün tanımlaması yapılarak, bulunan moleküller arasındaki yolaklar keşfedilebilir. Böylece MKH sekretomunun etki mekanizması çok daha net bir şekilde gözler önüne serilebilir. Bilindiği üzere çalışmada MKH sekretomu toplanıp kanser hücrelerine uygulanmıştır. Ancak bu kanser hücrelerinin nişte MKH’ler ile iletişim halinde olduğunu göz önüne alırsak, bu durumun sekretomda değişikliklere sebep olabileceği söylenebilir. Yani kanser hücresini tanımayan naif bir MKH ile kanser hücresinin ne olduğunu bilen bir MKH’nin salgıladığı faktörlerde değişiklikler olması söz konusudur. Aynı şekilde kanser hücresinin salgıladığı moleküller MKH üzerine etki edip, salgı profilinde değişikliklere yol açması oldukça mümkün görünmektedir. Diğer bir nokta ise, kanser tedavisinde kullanılan kemoterapi ilaçlarının farklı senesens mekanizmalarını aktive etmesidir. MKH ve kanser hücresinin bulunduğu bir ortama bu kemoterapi ajanlarının girmesi, hem hücrelere, hem de salgıladıkları faktörlere etki edecektir. Böyle bir durumda dolaylı etkiler ortaya çıkacaktır. Çok daha kapsamlı çalışmalar ile bu konulara ışık tutulabilir. Bu tez çalışmasıyla, MKH sekretomunun kanser hücrelerine etkisine dair önemli bilgiler elde edilmiştir. Ancak elde edilen bilgilerden çok daha fazla bilimsel sorular ortaya çıkarmıştır. Ortaya çıkan bu sorular, önemli projelerin ortaya çıkmasına yol açacaktır. 53 KAYNAKLAR 1. Rando, T.A., 2006. Stem cells, ageing and the quest for immortality. Nature, 441 (7097): 1080-1086. 2. Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F., 2007. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, 8 (9): 729-740. 3. Nardi, N.B, da Silva Meirelles, L., 2006. Mesenschymal stem cells: isolation, in vitro expansion and characterization, pp 249-282. In: Stem Cells, Handbook of Experimental Pharmacology (Eds. A.M. Wobus, K. Boheler) Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 269 pp. 4. Forte, A., Finicelli, M., Grossi, M., Vicchio, M., Alessio, N., Santè, P., De Feo, M., Cotrufo, M., Berrino, L., Rossi, F., Galderisi, U., Cipollaro, M., 2009. DNA damage and repair in a model of rat vascular injury. Clinical Science, 118 (7): 473-485. 5. Roninson I.B., 2003. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research, 63 (11): 2705-2715. 6. Tollefsbol, T.O., 2007. Techniques for analysis of biological aging. Methods Molecular Biology 371: 1-7. 7. Hayflick, L., Moorhead, P.S., 1961. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research, 25: 585–621. 8. Crescenzi, E., Palumbo, G., de Boer, J., Brady, H.J., 2008. Ataxia telangiectasia mutated and p21CIP1 modulate cell survival of drug-induced senescent tumor cells: implications for chemotherapy. Clinical Cancer Research, 14 (6): 1877-1887. 9. Kuilman, T., Peeper, D.S., 2009. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nature Reviews, Cancer, 9 (2): 81-94. 10. Acosta, J.C., Gil, J., 2012. Senescence: anew weapon for cancer therapy. Trends in Cell Biology, 22 (4): 211-219. 11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J.D., Campisi, J., Toussaint, O., 2009. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols, 4 (12): 17981806. 12. Kuilman, T., Michaloglu, C., Mooi, W.J., Peeper, D.S., 2010. The essence of senescence. Genes and Development, 24 (22): 2463-2479. 54 13. Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H., 2011. Moleküler Hücre Biyolojisi Altıncı Baskıdan Çeviri (Çev Ed. Geçkil, H., Özmen, M., Yeşilada, Ö.,). Palme Yayıncılık, Ankara, 1150 pp. 14. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H., 2012. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: basic biological properties and clinical applications, Stem Cells International, 2012 (2012):1-9. 15. Kim, D.W., Staples, M., Shinozuka, K., Pantcheva, P., Kang, S.D., Borlongan, C.V., 2013. Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characteization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications, International Journal of Molecular Sciences, 14 (6): 11692-11712. 16. Netter, F.H., 1987. Muscoloskeletal system: anatomy, physiology and metabolic disorders. Ciba-Geigy Corporation, New Jersey. 134 pp. 17. Phinney, D.G., Prockop D.J., 2007. Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: transdifferentiation and modes of tissue repair—current views. Stem Cells, 25 (11): 2896-2902. 18. Iso, Y., Spees, J.L., Serrano, C., Bakondi, B., Pochampally, R., Song, Y.H., Sobel, B.E., Delafontaine, P., Prockop, D.J., 2007. Multipotent human stromal cells improve cardiac function after myocardial infraction in mice without long-term engraftment. Biochemical and Biophysical Research Communications, 354 (3): 700-706. 19. Horvitz, E.M., Gordon, P.L., Koo, W.K., Marx, J.C., Neel, M.D., McNall, R.Y., Muul, L., Hofmann, T., 2002. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99 (13): 8932-8937. 20. Caplan, A.I., 2007. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. Journal of Cellular Physiology, 213 (2): 341-347. 21. Galderisi, U., Giordano, A., Paggi, G.P., 2010. The bad and the good of mesenchymal stem cells in cancer: Booster of tumor growth and vehicles for targeted delivery of anticancer agent. World Journal of Stem Cell, 2 (1): 5-12. 55 22. Li, H.J., Reinhardt, F., Herschman, H.R., Weinberg, R.A., 2012. Cancer-stimulated mesenchymal stem cells crete a carcinoma stem cell niche via prostaglandin E2 signaling. Cancer Discovery, 2 (9): 840-855. 23. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., 2013. Mesenchymal stem cells, pp 513-524. In: Handbook of Stem Cell Volume 1 Pluripotent Stem Cell. (Eds. A. Ayala, R. Lanza) Elsevier Inc, San Diego, 524 pp. 24. Stewwart, B.W., Wild, C.P., 2014. World Cancer Report, Chapter 5. World Health Organization (WHO), 630 pp. 25. Breast cancer treatment, 2014. National Cancer Institute (NCI) (Web sayfası: http://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-treatment-pdq#section/all Erişim Tarihi: Kasım 2014). 26. Gage, M., Wattendorf, D., Henry, L.R., 2012. Translational advances regarding hereditary breast cancer syndromes. Journal of Surgical Oncology, 105 (5): 444– 51. 27. Lin, A.W., Barradas, M., Stone, J.C., van Aelst, L., Serrano, M., Lowe, S.W., 1998. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signalling. Genes and Development, 12 (19): 3008-3019. 28. Jones, K.L., Buzdar, A.U., 2004. A review of adjuvant hormonal therapy in breast cancer. Endocrine-Related Cancer, 11: 391-406. 29. General Information About Colon Cancer, 2014. National Cancer Institute (NCI) (Web sayfası: http://www.cancer.gov/types/colorectal/patient/colon-treatment-pdq Erişim Tarihi: Kasım 2014). 30. Vogelstein, B., Papadopoulos, N., Velculescu, V.E., Zhou, S., Diaz Jr, L.A., Kinzler, K.W., 2013. Cancer genome landscapes. Science, 339 (6127): 1546–1558. 31. Markowitz, S.D., Bertagnolli, M.M., 2009. Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer. The New England. Journal of Medicine, 361 (25): 2449–2460. 56 32. Balaguer, F., Link, A., Lozano, J.J., Cuatrecasas, M., Nagasaka, T., Boland, C.R., Goel, A., 2010. Epigenetic silencing of miR-137 is an early event in colorectal carcinogenesis. Cancer Research, 70 (16): 6609–6618. 33. What You Need To Know About Leukemia, 2014. National Cancer Institute (NCI) (Web sayfası: http://www.cancer.gov/publications/patient-education/wyntk- leukemia/AllPages Erişim Tarihi: Kasım 2014). 34. Provan, D., Gribben, J.G., 2010. Chapter 7: Chronic myelogenous leukemia. In: Molecular Hematology (3rd ed.). Wiley-Blackwell, Singapore, 76 pp. 35. Jabbour, E., Cortes, J.E., Giles, F.J., O'Brien, S., Kantarjian, H.M., 2007. Current and emerging treatment options in chronic myeloid leukemia. Cancer, 109 (11): 2171– 2181. 36. Kimura, S., Ashihara, E., Maekawa, T., 2006. New tyrosine kinase inhibitors in the treatment of chronic myeloid leukemia. Current Pharmaceutical Biotechnology, 7 (5): 371–379. 37. Huguet, E.L., McMahon, J,A,, McMahon, A.P., Bicknell, R., Harris, A.L., 1994. Differential expression of human Wnt genes 2, 3, 4, and 7B in human breast cell lines and normal and disease states of human breast tissue. Cancer Research, 54 (10): 2615-2621. 38. Trainer, D.L., Kline, T., McCabe, F.L., Faucette, L.F., Feild, J., Chaikin, M., Anzano, M., Rieman, D., Hoffstein, S., Li, D.J., 1988. Biological characterization and oncogene expression in human colorectal carcinoma cell lines. International Journal of Cancer, 41 (2): 287-296. 39. Klein, E., Ben-Bassat, H., Neumann, H., Ralph, P., Zeuthen, J., Polliack, A., Vánky, F., 1976. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. International Journal of Cancer, 18 (4): 421–431. 40. Jongen-Lavrencic, M., Salesse, S., Delwel, R., Verfaillie, C.M., 2005. BCR/ABLmediated downregulation of genes implicated in cell adhesion and motility leads to impaired migration toward CCR7 ligands CCL19 and CCL21 in primary BCR/ABL-positive cells. Leukemia, 19 (3): 373-380. 57 41. Freshney, R.I., Culture of Animal Cells Sixth Edition. Wiley-Blackwell, New Jersey, 796 pp. 42. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S.. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 131 (5): 861–872. 43. Koopman, G., Reutelingsperger, C.P., Kuijten, G.A., Keehnen R.M., Pals, S.T., van Oers, M.H., 1994. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, 84 (5): 1415–1422. 44. Finkel, E., 2001 The mitochondrion: is it central to apoptosis?. Science, 292: 624626. 45. Zamzami, N., Kroemer, G., 2001. The mitochondrion in apoptosis: how Pandora's box opens. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2: 67-71. 46. Wang, X., 2001. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes and Development, 15: 2922-2933. 47. Mosmann, T., 1983. Rapid colorometric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 65 (1-2): 55-63. 48. Dowell, J. A., Johnson, J. A., Li, L., 2009. Identification of astrocyte secreted proteins with a combination of shotgun proteomics and bioinformatics, Journal of Proteome Research, 8: 4135–4143. 49. van Deursen, J.M., 2014. The role of senescent cells in ageing. Nature, 509 (7501): 439-446. 50. Elmore, S., 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology, 35 (4): 495-516. 51. Bratton, D.L., Fadok, V.A., Richter, D.A., Kailey, J.M., Guthrie, L.A., Henson, P.M., 1997. Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires calciummediated nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the aminophospholipid translocase. The Journal of Biochemistry, 272 (42): 26159-26165. 58 52. Coppe, J.P., Desprez, P.Y., Krtolica, A., Campisi, J., 2009. The senescence-associated secretory phenotype: The dark side of tumor supression. The Annual Review of Pathology: Mechanism of Disease, 5: 99-118. 53. Ashkenazi, A., Salvesen, G., 2014. Regulated cell death signaling and mechanisms. The Annual Review of Pathology: Mechanism of Disease, 30: 20.1-20.20 54. Vicencio, J.M., Galluzzi, L., Tajeddine, N., Ortiz, C., Criollo, A., Tasdemir, E., Morselli, E., Ben Younes, A., Maiuri, M.C., Lavandero, S., Kroemer, G., 2008. Senescence, apoptosis or autophagy? When a damaged cell must decide its path--a mini-review. Gerontology, 54 (2): 92-99 55. Gatenby, R.A., Gillies, R.J., 2004. Why do cancer have high aerobic glycosis. Nature Reviews Cancer, 4: 891-899. 56. Kim, J.W., Dang, C.V., 2006. Cancer’s molecular sweet tooth and Warburg Effect. Cancer Research, 66 (18) : 8927-8930 59 ÖZGEÇMİŞ KİŞİSEL BİLGİLER Adı, Soyadı: Mustafa Burak ACAR Uyruğu: Türkiye (TC) Doğum Tarihi ve Yeri: 18 Mayıs 1989, Boğazlıyan Medeni Durumu: Bekar Tel: +90 545 979 1905 e-mail: mbrkcr@gmail.com Yazışma Adresi: Mevlana Mah. Turgut Özal Cad. Akasya Ap 14/55 Talas/KAYSERİ EĞİTİM Derece Kurum Lisans E.Ü. Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü/KAYSERİ Lise İngilizce 2012 Yozgat Anadolu Lisesi YOZGAT YABANCI DİL Mezuniyet Tarihi 2007
