Slayt 1 - Gıda ArGe Proje Pazarı

Development of food additive from exopolysaccharides (EPSs) are active on
cancer and immune system which are derived from probiotic bacteria
Probiyotik bakterilerden elde edilen, kanser ve bağışıklık sistemi üzerinde etkin
ekzopolisakkaritlerin (EPS) gıda katkı maddesi olarak geliştirilmesi
Serap Niğdelioğlu, Ümmügülsüm Tükenmez, Belma Aslım
Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Ankara, Türkiye
serapnigdelioglu@hotmail.com
AMAÇ-GİRİŞ
Before the treatment of the cancer and inflammatory diseases,
alternative and different approaches to the prevention of the
disease are fairly important. Therefore, in addition to the
development of novel therapeutical cancer medicines, R&D
studies focusing on the natural foodstuff providing protection
against such diseases gained interest. The object of this study
was to purify the EPS of Lactobacillus isolates as well as to
determine their anticarcinogenic, immune system regulatory,
antigenotoxic and antimutagenic effects. Besides the addition
of probiotic bacteria into foods as a digestion regulator, it may
be possible to develop new foodstuff into which probiotic
bacteria or EPS derived from such bacteria are added.
Kanser ve inflamatuvar hastalıkların tedavisinden önce,
hastalığın önlenmesine yönelik alternatif ve farklı yaklaşımlar
oldukça önemlidir. Bu nedenle, tedavi edici yeni kanser
ilaçlarının geliştirilmesinin yanı sıra, bu tip hastalıklardan
koruyucu doğal gıdaların geliştirilmesine yönelik AR-GE
çalışmalarına ilgi artmıştır. Araştırmalarda bir çok olumlu sonuç
elde edilmesine rağmen, probiyotik bakteri kullanımına bağlı
sonuçların stabil olmadığı görülmüştür.
EPS’ler, kolorektal adenokarsinoma hücreleri
antiproliferatif etki bakımından incelenmiştir.
üzerinde
Elisa reader cihazı (Epoch)
Aynı zamanda EPS’lerin tek hücre jel elektroforezi ile insan
lenfositleri üzerindeki genotoksik ve antigenotoksik etkisi
floresan mikroskop ile değerlendirilmiştir.
Son yıllarda birçok yararlı etkisi ispatlanmış olan probiyotik
bakterilere alternatif olarak EPS’ler, kanserli hücre üzerine
gösterdikleri antiproliferatif, apoptozis ve farklılaşmayı
indükleyici, anjiyogenezi baskılayıcı, ilaç direncini azaltıcı
etkileri ile dikkat çekmektedir. Ayrıca EPS’lerin immün sistem
üzerinde düzenleyici ve dengeleyici etkileri bulunmaktadır.
Gıda endüstrisinde de stabilizatör, emülsifiye edici, kalınlaştırıcı
ajan olarak, kullanılmaktadır. Son yıllarda probiyotik bakteri
katkılı gıdalar çok yaygın olmasına rağmen, bu bakterilerin
kullanımlarında istenilen sonuçların alınmadığı da bir gerçektir.
Bu çalışmanın amacı, probiyotik olarak öne çıkan Lactobacillus
izolatlarından
elde
edilen
EPS’lerin
saflaştırılması,
antikanserojenik, immün sistem düzenleyici, antigenotoksik ve
antimutajenik etkilerinin belirlenerek kanserden koruyucu ve
bağışıklık düzenleyici bir gıda katkı maddesi elde etmektir.
Probiyotik bakterilerin sindirimi düzenleyici olarak gıdalara
katılmasının dışında, yüksek EPS üretici probiyotik
bakterilerden elde edilen EPS’lerin ilave edildiği yeni
fonksiyonel gıda ürünlerinin geliştirilmesi mümkün olabilecektir.
Il-8, IL-10 kiti (invitrogen)
Çalışmada, EPS’lerin mutajenik ve genotoksik etkisi
belirlenmezken, hidrojen peroksit ve sodyum azid ile
oluşturulan mutajeniteye karşı antigenotoksik ve antimutajenik
etkisi belirlenmiştir
Ames testi
EPS’lerin kanser hücrelerine olan apoptotik etkisi de Bax,
Bcl2, Kaspaz 3 ve Kaspaz 9 genlerinin ekspresyonları ile
ilişkili olarak real time PCR’da belirlenmiştir. Anlamlı çıkan
genlerin ekspresyonları protein düzeyinde western blot ile
belirlenmiştir.
YAKLAŞIM (MATERYAL VE YÖNTEM)
Çalışmada probiyotik özellikleri ile öne çıkmış ve moleküler
düzeyde tanımlanmış yüksek EPS üreticisi probiyotik bakteriler
kullanılmıştır.
XCell SureLock™; iBlot® (İnvitrogen)
Real time PCR cihazı (Biorad)
BEKLENEN SONUÇLAR
Dönen evaporatör cihazı (Buchi)
Liyafilizatör cihazı (Sigma)
Yapılan çalışmada Salmonella typhimurium TA100 suşu ile NaN3
(Sodyum azid) mutajenine karşı EPS’nin; zayıf antimutajenik etki
gösterdiği belirlenmiştir. S. typhimurium TA98 suşu ile H2O2
(hidrojen peroksit) mutajenine karşı EPS’nin güçlü antimutajenik
etki gösterdiği belirlenmiştir.
Floresan mikroskobu (Leica)
EPS’lerin immün antiinflamatuvar etkileri IL-8 ve IL-10
seviyeleri ölçülerek belirlenmiştir.
Saflaştırılmış liyofilize halde uygulamalarda kullanılan EPS
TNF-α ile uyarılan kanser hücrelerinde IL-8 seviyesi kontrole
göre %30 oranında baskılanmıştır. Hücrelerden salınan IL-10
seviyesi ise 48 pg/mL’den 68 pg/mL’ye yükselmiştir.
Çalışma kapsamında kullanılan tüm EPS’lerin HT-29 hücrelerine
24 saatlik muamelesi sonucunda hücre canlılığındaki değişiklik
MTT testi ile belirlenmiş, sonuçlar aşağıdaki grafikte belirtilmiştir.
Yüksek EPS üreticisi L. plantarum GD2, L. rhamnosus E9, L.
brevis LB63 suşlarından elde edilen EPS’ler antiproliferatif etki
göstermiştir.
Özellikle antiapoptotik genleri baskılayarak, proapoptotik genleri
indükleyerek kolon kanser hücrelerini apoptoza götürmüştür.
GD2, E9, LB63 suşlarının EPS uygulaması ise Bax genin
ekspresyonunda kontrole göre sırasıyla 0.88, 0.95, 0.59 kat
artırdığı, Kaspaz 3 geninin ekspresyonunu sırası ile 4.68, 2.64 ve
2.12 kat artırdığı, Kaspaz 9 geninin ekspresyonunu sırası ile
2.77, 1.04 ve 0.84 kat artırdığı belirlenmiştir. GD2 suşunun
EPS’si Bcl2 gen ekspresyonunda değişiklik göstermemiş, E9,
LB63 suşlarının EPS uygulaması ise Bcl2 geninin
ekspresyonunu azaltmıştır. Apoptoz kitiyle yapılan çalışma
sonuçları da kullanılan EPS’lerin HT-29 hücre hattı üzerine
apoptotik etki gösterdiğini desteklemiştir.
Ülkemizde son yıllarda bağırsak düzenleyici olarak probiyotik
katkılı gıda ürünleri yaygın kullanılmalarına rağmen kanser veya
inflamatuvar hastalıklardan koruyucu gıdaların geliştirilmediği ve
kullanılmadığı görülmektedir. Bu çalışma sonucunda elde
edilecek veriler doğrultusunda, monomer kompozisyonu, molekül
ağırlığı ve bağ yapısı belirlenmiş EPS’lerin, kanseri önleyebilen
ve bağışıklık sistemini aktive eden özellikleri ile gıdalarda
kullanımı mümkün olabilecektir. Aynı zamanda antikanser etkisi
belirlenen EPS’ler, toksik, genotoksik, mutajenik etkilerinin
olmaması nedeniyle gıdalarda güvenli katkı maddesi olarak da
kullanılabilecektir.
EPS’lerin H2O2 ile muamele
edilmiş lenfosit hücrelerine
karşı gösterdiği genetik hasarı
önleyici etkisinin belirlenmesi
Gıda katkı maddelerinin genellikle düşük yağ içerikli, mutajenik,
genotoksik, sitotoksik etkisi olmayan, doğal kaynaklı, düşük
maliyetli ürünler olması tercih edilmektedir. Bu nedenle,
probiyotiklere ait EPS’ler uygulanabilir alternatif bir ajan olup,
fermente süt ürünlerinin kıvamlarını, yapılarını iyileştirmek
amacıyla da kullanılabilir. EPS aynı zamanda süt ürünlerinin raf
ömrünü arttıran bir bileşiktir. Probiyotik olarak aktif olan bu
bileşiklerin tümör oluşumunu engelleyici, bağışıklık sistemini
destekleyici özelliklerinin de bulunmasından dolayı, sağlığı
destekleyici gıda ürünleri üretilerek artan tüketici talebi
karşılanabilecektir. Bu çalışma Gazi Üniversitesi BAP Birimi
tarafından 46/2012-03 kodlu proje ile desteklenmiş olup, aynı
zamanda devam eden 115R282 kodlu TÜBİTAK projesi
tarafından desteklenmektedir.