Yeni nesil dizileme prensipleri
advertisement
1 2 3 4 5 6 7 8 Yeni Nesil Dizileme Prensipleri Doç.Dr.Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD 9 NGS • Yeni Nesil Dizi Analizi • Next Generation Sequencing • Massively Parallel Sequencing • Second Generation Sequencing • Paired End Sequencing Tarihçe • En yaygın sekanslama teknolojisi – Sanger sekanslama – 1000-1200 bç • HGP – Shotgun sekanslama • DNA’ nın enzimatik ya da mekanik olarak fragmanlara ayrılıp sekanslama vektörlerine klonlanması • Bireysel olarak okunan overlap diziler sayesinde insanın tüm genomu dizilendi • Massively Parallel Sequencing’ in temeli Tarihçe • • • • 1977- Sanger sekanslama 1990- HPRT geni klonlandı 1996- ABI 310 piyasaya çıktı 1998-ABI 3700 piyasaya çıktı – HGP çoğunlukla bu cihaz ile gerçekleştirildi • 2001- ilk insan DNA’ sı konsensus dizisi • • Sanger Lander et al., 2001; Venter et al., 2001 • 2004- Roche 454 • 2007- İlk diploid insan genomu • • • • Craig Venter whole-genome shotgun sequencing Levy et al., 2007 2008- İkinci diploid insan genomu • • • • James D Watson Roche 454 Wheeler et al., 2008 1,5 milyon $ Shendure J et al. Nature Biotechnology, 2008 NGS-2015 Steinbock LJ et al., Nanotechnology, 2015 NGS İkinci Nesil Sekanslama Teknolojileri • Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer – 454 sequencing • ABI SOLiD analyzer • Illumina Genome Analyzer – Solexa technology Bench-top Sequencers İllumina Solexa Teknolojisi İllumina Solexa Teknolojisi İllumina Solexa Teknolojisi Sequencing By Synthesis (SBS) 3’ 5’ Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Remove unincorporated bases A T G C C G T Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat T A C A Detect signal C G A T T A G A C T C C G A G C T C G A T 5’ All four labelled nucleotides in one reaction High accuracy Base-by-base sequencing No problems with homopolymer repeats Clonal Single Molecule Array™ Technology 40 MILLION CLUSTERS PER FLOW CELL 20 MICRONS 100 MICRONS Base Calling TG C TAC GAT … 1 2 3 4 5 6 7 TTTTTTTGT… 8 9 İllumina SBS Teknolojisi MiSeq Uygulamalar • DNA – – – – Targeted Resequencing De Novo Sequencing Whole Exome Sequencing (WES) Whole Genome Sequencing (WGS) • RNA – – – – Targeted Resequencing mRNA Sequencing Small RNA Sequencing Total RNA Sequencing • Methylation Sequencing Hedef Zenginleştirme Metodları Meldrum C et al. Clin Biochem Rev 2011 MiSeq MiSeq Örnek Hazırlama Indeksleme PCR-Sample Pooling Havuz 1 Havuz 2 Havuz 3 1+2+3+4+5 Havuz 4 Havuz 5 Pool 1 Grup No GEN ADI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Pool 2 Grup No 1 2 3 4 5 P o o l 1 BTD HBB PTPN11 MEFV SRD5A2 OXT OXT OXTR NPC1 GCK MC4R NPC2 CFTR VHL LOXL1 HNF1A BCKDHB SLC6A8 CD40 CD40L BRCA1 BRCA2 EPM2A RET GEN ADI BTD HBB PTPN11 MEFV SRD5A2 22 23 24 25 Pool 2 Grup No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Pool 3 Grup No 1 2 3 P o o l 2 BRCA2 EPM2A RET GEN ADI BTD HBB PTPN11 MEFV SRD5A2 OXT OXT OXTR NPC1 GCK MC4R NPC2 GBA GDF6 LOXL1 HNF1A GCDH SLC6A8 CD40 CD40L BRCA1 BRCA2 LPL RET WFS1 GEN ADI BTD AR FGFR2 24 25 26 27 Pool 3 Grup No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 P o o l 3 RET WFS1 GEN ADI BTD AR FGFR2 MEFV WFS1 OXT OXT OXTR NPC1 GCK MC4R NPC2 CAV3 SF1 LOXL1 HNF1A RMRP TACİ CTSK BRCA1 BRCA2 SERPİNA1 EPM2A ELA2 RET MiSeq Örnek Yükleme NGS Akış Şeması Sekanslama Alingment Görüntü işleme Varyant deteksiyonu Okuma Filtreleme Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013 NGS Dosya Türleri Wangs S et al. Genomics and Informatics , 2013 NGS Dosya Türleri • FASTAQ – NGS raw datası – FASTA sekans+kalite datası – Wellcome Trust Sanger tarafından bulundu • SAM/BAM – Sequence Alignment/Map – FASTAQ’ nun align edilmiş hali – Varyant saptama algoritmalarına hazır format – Kodlama şekilleri farklı NGS Dosya Türleri • VCF – Variant Calling Format – Align edilmiş dizideki varyantları gösterir – Manifest dosyaya göre MiSeq Kalite Kontrol MiSeq Kalite Kontrol MiSeq Kalite Kontrol MiSeq Analiz MiSeq Analiz MiSeq Analiz BRCA2 Geni K2729N BTD Geni c.617_619delTTG Sistemik Artefakt NGS ve Nadir Hastalıklar Booycott et al. Nat Rev Genet, 2013 Varyant Saptama Oranı • WES – Ortalama 12.000 varyant • %90 veritabanlarında kayıtlı • WGS – Ortalama 5 milyon varyant • 144.000 yeni Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013 Kalıtılan Mutasyon Algoritması Boycott et al. Nat Rev Genet, 2013 www.omictools.com Üçüncü Nesil Sekanslama • Helicos – HeliScope • Dünyadaki ilk DNA mikroskobu • Pacific Biosciences – SMRT (Single Molecule Real Time) sequencer – DNA polimeraz flow cell’ e bağlı – Her nükleotid eklenmesinde ışıma Dördüncü Nesil Sekanslama • Nanopore DNA sequencer • Nükleotid etiketleme ve tespiti yok • Ekzonükleazla kesilen baz nanopordan geçer • Polimerizasyon yok • 15 dakikada WGS • Çok düşük maliyet Ku CS et al. Expert Rev. Med. Devices, 2013 Oxford Nanopore Technologies
