Untitled - Gazi Üniversitesi Açık Arşiv
advertisement
MİYOKARDİYAL İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARINDA RESVERATROLÜN mPTP KANALLARI ARACILIKLI ETKİ MEKANİZMASININ İNCELENMESİ Gürhan CEBE YÜKSEK LİSANS FARMAKOLOJİ (ECZ) ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MAYIS 2015 iv MİYOKARDİYAL İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARINDA RESVERATROLÜN mPTP KANALLARI ARACILIKLI ETKİ MEKANİZMASININ İNCELENMESİ (Yüksek Lisans Tezi) Gürhan CEBE GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Mayıs 2015 ÖZET Resveratrolün iskemi-reperfüzyon hasarına karşı kalpteki koruyucu etkinliği yapılan pek çok çalışma ile gösterilmiştir. Iskemi-reperfüzyon sırasında mPTP'nin açılışı mitokondriyal şişme, ATP tükenmesi, oksidatif fosforilasyon ve apoptozis/nekroza neden olur. Bu çalışmanın amacı bir mPTP açıcısı olan atraktilosidin, resveratrolün kalp koruyucu etkisi üzerindeki etkinliğini araştırmaktır. Bu doğrultuda 250-300g Wistar sıçanlar ketamin hidroklorür ve ksilazin ile anesteziye edilerek toraks hızlıca açılmış ve kalp oksijenlenmiş buzlu Krebs-Heinseleit solüsyonuna alınmıştır. Sonrasında kalp hızlıca Langendorff cihazına asılmıştır. Kalpler dört guruba ayrılmıştır: Birinci grupta (kontrol) kalbin izolasyonundan sonra 25 dakikalık dengelenme periyodunda retrograt perfüzyon uygulanmıştır. İkinci grupta (resveratrol), 15 dakikalık dengelenme periyodundan sonra farmakolojik önkoşullama oluşturmak amacıyla 10 dakika resveratrol (10 µM) perfüzyonu uygulanmıştır. Üçüncü grupta (atraktilosid), 15 dakikalık dengelenme periyodundan sonra 10 dakika atraktilosid (100 µM) perfüzyonu uygulanmıştır. Dördüncü grupta (atraktilosid + resveratrol), 5 dakikalık dengelenme periyodundan sonra kalbe 10’ar dakika ayrı ayrı atraktilosid (3, 10, 30 and 100 µM) ve resveratrol (10 µM) perfüzyonu uygulanmıştır. Bütün gruplar için 30 dakika iskemi sonrası 120 dakika reperfüzyon yapılmıştır. İnfarkt alan, Sol Ventrikül Gelişen Basıncı (SVGB), Sol Ventrikül Diyastol Sonu Basıncı (SVDSB), ±dP/dtmax ve Hız Basınç Ürünü (RPP) değerlendirilmiştir. Kalpler reperfüzyonun sonunda infarkt alan değerlendirmesi yapabilmek amacıyla TTC ile boyanmıştır. Hemodinamik parametreler su dolu lateks balon kullanılarak MP35 kayıt sistemi ile ölçülmüş ve değerlendirilmiştir. Resveratrol uygulaması infarkt alan, SVGB, SVDSB, ±dP/dtmax ve RPP değerlerini kontrole göre anlamlı şekilde düzeltmiştir. Atraktilosid 30 µM ve 100 µM konsantrasyonlarda resveratrolün SVGB, SVDSB, ±dP/dtmax ve RPP değerlerinde iskemi-reperfüzyon hasarına karşı sağladığı etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır. Bu sonuçlar atraktilosid gibi mPTP açıcılarının resveratrolün koruyucu etkisini ortadan kaldırabileceğini ve tersi, resveratrolün atraktilosid ile indüklenen mPTP açılmasını tersine çevirebileceğini göstermiştir. Resveratrol mPTP inhibitörü olarak, mPTP açılmasının neden olduğu miyokardiyal iskemireperfüzyon hasarını engellemek için kullanılabilir. Bilim Kodu Anahtar Kelimeler Sayfa Adedi Danışman : 1018.1 : Resveratrol, atraktilosid, mPTP kanalları, önkoşullama, iskemireperfüzyon : 74 : Prof. Dr. Fatma AKAR v INVESTIGATION OF mPTP PORE MEDIATED MECHANISM OF ACTION OF RESVERATROL ON MYOCARDIAL ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY (M. Sc. Thesis) Gürhan CEBE GAZİ UNIVERSITY INSTITUTE OF HEALTH SCIENCES May 2015 ABSTRACT Many studies have shown that resveratrol has cardioprotective effect against ischemiareperfusion injury. Opening of mPTP during ischemia-reperfusion causes mitochondrial swelling, ATP depletion, oxidative phosphorylation and apoptosis/necrosis. The aim of this study is to investigate the effects of atractyloside (ATR), mPTP opener, on cardioprotective effects of resveratrol. For this aim 250-300g Wistar rat anesthetized with ketamine hydrochloride and xylazine then thorax was immediately opened and heart was placed in oxygenized ice-cold Krebs-Heinseleit solution Then heart was mounted on Langendorff apparatus quickly. Hearts were assigned into four groups: In the first group (control), after isolation of the hearts 25 min stabilization with retrograde perfusion was applied. In the second group (resveratrol), after 15 min stabilization period 10 min resveratrol (10 µM) perfusion was applied in order to induce chemical preconditioning. In the third group (atractilocide) after 15 min stabilization period 10 min atractyloside (100 µM) perfusion was applied. In the fourth group (atractyloside + resveratrol), after 5 min stabilization period, heart was perfused with atractyloside (3, 10, 30 and 100 µM) and resveratrol (10 µM) separately for 10 min. For all these groups, 30 min global ischemia was followed by 120 min reperfusion. Infarct size Left Ventricular Development Pressure (LVDP), Left Ventricular End-Diastolic Pressure (LVEDP), ±dP/dtmax, Rate Pressure Product (RPP) were evaluated. Hearts were dyed with TTC at the end of reperfusion in order to evaluate infarct size. Hemodynamic parameters were measured and evaluated by MP35 recording system with water-filled latex balloon. Resveratrol administration significantly improved infarcts area, LVDP, LVEDP, ± dP/dtmax, and RPP values compared to the control group. Coadministration with atractyloside 30 µM and 100 µM significantly eliminate resveratrolinduced effect against ischemia-reperfusion injury on LVEDP, ±dP/dtmax and RPP. These results demostrate that mPTP openers as atractyloside may eliminate the protective effect of resveratrol and vice versa, resveratrol reversed the mPTP opening induced by atractyloside. Resveratrol can be used to prevent mPTP opening induced myocardial ischemia reperfusion injury as a mPTP inhibitor. Science Code Key Words Page Number Supervisor : 1018.1 : Resveratrol, atractyloside, mPTP channel, preconditioning, ischemia-reperfusion : 74 : Prof. Dr. Fatma AKAR vi TEŞEKKÜR Sadece tez hazırlama sürecinde değil, hayatım boyunca yaşamımın her anından beni destekleyen, yüreklendiren, kararlarıma saygı duyan ve bana huzurlu bir ortam sağlayan, sabırla ve sevgiyle varlığını yanımda hissettiren, emeklerini ömrüm boyunca ödeyemeyeceğim eşim Ecz. Evren CEBE ’ye, yaptığı fedakârlıklar için, sonsuz teşekkür ederim. Tüm yaşamımda en büyük motivasyon ve huzur kaynağım olan bana baba olmayı armağan eden canım oğlum Kayra İlter CEBE ’ye, sonsuz teşekkür ederim. Çalışmalarım boyunca benden desteğini esirgemeyen, tecrübeleri ile her türlü yardımda bulunan, değerli katkılarıyla beni yönlendiren danışmanlarım Prof. Dr. Nilüfer Nermin TURAN ve Prof. Dr. Fatma AKAR ’a, teşekkürlerimi sunarım. Yüksek Lisansım sırasında bilgilerini ve emeklerini benden esirgemeyen değerli hocalarım; başta Anabilim Dalı Başkanım Prof. Dr. Sayın Nurettin ABACIOĞLU’na, Prof. Dr. Mustafa ARK ’a, Doç. Dr. Orhan ULUDAĞ ’a ve Doç. Dr. Bilgen Başgut'a kendilerinden öğrendiklerim ışığında bu tezi yazdığımı belirterek çok teşekkür ederim. Çalışmalarımın her aşamasında beni destekleyen, Öğrencilik hayatım ve tez dönemim boyunca benden maddi manevi desteğini esirgemeyen, bana olan güvenlerini her zaman hissettiren annem Nevriye CEBE ve babam Gürol Kemal CEBE ’ye sonsuz teşekkür ederim. Benim ve eşimin yükünü hafifletmek için ellerinden geleni yapan, desteklerini her an hissettiğim Fatma DEMİR ’e ve Cemal DEMİR ’e sonsuz teşekkür ederim. Tez dönemim boyunca bana, her türlü yardımda bulunan ve destekleyen arkadaşlarım Ecz. Gizem ARDIÇ ’a ve Arş. Gör. Elif Derya ÖZDEMİR ‘e teşekkür ederim. Çalışmamın değişik aşamalarında yardımı geçen zikredemediğim bütün arkadaşlarıma teşekkür ederim. ancak burada ismini vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ................................................................................................................ iv ABSTRACT ..................................................................................................... v TEŞEKKÜR ...................................................................................................... vi İÇİNDEKİLER .................................................................................................. vii ŞEKİLLERİN LİSTESİ ...................................................................................... x RESİMLERİN LİSTESİ ..................................................................................... xi SİMGELER VE KISALTMALAR ....................................................................... xii 1. GİRİŞ ......................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................................... 5 2.1. Miyokard Fizyolojisi ............................................................................... 5 2.2. Kalbin Kontraksiyonu ............................................................................... 6 2.3. Miyokardiyal İskemi-Reperfüzyon.......................................................... 13 2.3.1. Oksidatif stres ............................................................................ 14 2.3.2. Nitrik oksit .................................................................................. 14 2.3.3. pH paradoksu ............................................................................ 15 2.3.4. Kalsiyum yüklenmesi ................................................................. 15 2.3.5. Akut inflamatuvar cevap ............................................................. 15 2.3.6. Mitokondriyal permeability transizyon poru ................................ 16 2.3.7. Renin-anjiyotensin-aldesteron sistemi ....................................... 17 2.4. Kardiyak Koruma Mekanizmaları........................................................... 17 2.4.1. İskemik önkoşullama.................................................................. 17 2.4.2. İskemik ardkoşullama ................................................................ 20 viii Sayfa 2.4.3. Farmakolojik koşullama ............................................................. 21 2.5. Resveratrol ............................................................................................ 24 2.6. Atraktilosid ............................................................................................. 26 3. GEREÇ ve YÖNTEM ............................................................................. 29 3.1. Gereçler ................................................................................................ 29 3.1.1. Kullanılan deney hayvanları ....................................................... 29 3.1.2. Kullanılan kimyasal maddeler .................................................... 29 3.1.3. Kullanılan aletler ........................................................................ 30 3.2. Yöntem .................................................................................................. 30 3.2.1. Sıçan izole kalp preparatını hazırlanması ve ölçülen hemodinamik parametreler .................................................................. 30 3.2.2. Deney protokolü ......................................................................... 31 3.2.3. İnfarkt alan değerlendirilmesi ..................................................... 33 3.2.4. İstatistiksel analiz ....................................................................... 33 4. ARAŞTIRMA BULGULARI.................................................................... 35 4.1. İnfarkt Alan ........................................................................................... 35 4.2. Hemodinamik Parametreler ................................................................... 37 4.2.1. Sol ventrikül gelişen basıncı ...................................................... 37 4.2.2. Sol ventrikül diyastol sonu basıncı ............................................. 40 4.2.3. -dP/dtmax, +dP/dtmax değerleri ..................................................... 42 4.2.4. Hız basınç ürünü ........................................................................ 46 5. TARTIŞMA................................................................................................ 49 6. SONUÇ...................................................................................................... 55 KAYNAKLAR .................................................................................................... 57 EKLER.............................................................................................................. 71 ix Sayfa EK-1 ................................................................................................................. 72 ÖZGEÇMİŞ ...................................................................................................... 73 x ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Kalp ve dolaşım fizyolojisi ................................................................. 5 Şekil 2.2. Aktinin ve Miyozinin moleküler yapısı ............................................... 7 Şekil 2.3. Kalp kası kontraksiyon döngüsü ....................................................... 9 Şekil 2.4. Kalp miyositlerinin transmembran aksiyon potansiyeli fazları elektriksel EKG kaydı ....................................................................... 10 Şekil 2.5. İskemik önkoşullama ve ardkoşullamanın oluşum mekanizmaları .... 19 Şekil 2.6. İskemi-repefüzyon hasarında mPTP kanallarının açılmasının etkisi ve çeşitli kalp koruyucu ajanların bu hasara nasıl engelledikleri ....... 24 Şekil 3.1. Deney protokolü................................................................................ 32 Şekil 4.1. Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve atraktilosidin farklı dozlarının Resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında infarkt alan üzerine etkilerinin karşılaştırılması ................................................................................ 35 Şekil 4.2. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında SVGB üzerine etkisinin karşılaştırılması .... 38 Şekil 4.3. Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte kullanıldığı gruplardaki SVGB kayıtları............ 39 Şekil 4.4. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında SVDSB üzerine etkisinin karşılaştırılması .. 41 Şekil 4.5. kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında -dP/dtmax üzerine etkisinin karşılaştırılması. 43 Şekil 4.6. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında +dP/dtmax üzerine etkisinin karşılaştırılması 45 Şekil 4.7. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında hız basınç ürünü üzerine etkisinin karşılaştırılması ................................................................................ 47 xi RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 4.1. Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasını tekiben 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında TTC boyası ile boyanan kalp örnekleri.................................................................. 36 xii SİMGELER ve KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklamalar kDa Kilodalton Nm Nanometre μM Mikro Molar ΔΨm Mitokondrial Membran Potansiyeli Kısaltmalar Açıklamalar +dP/dtmax İnotropizm İndeksi 3-NP 3-Nitropropiyonik Asit ADO Adenozin ADP Adenozin Difosfat AMP579 Cyclopentanecarboxamide,4-[4-[[(1R)-1-[(3-chloro-2thienyl)methyl]propyl]amino]-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-7-yl]-N-ethyl-2,3-dihydroxy-,(1S,2R,3S,4R) ATP Adenozin trifosfat ATPaz Adenozin Trifosfataz BKA Bongkrekic Asit Ca+2 Kalsiyum cGMP Siklik 3.5 Guanosin Monofosfat CK Kreatin Kinaz CK-MB Kreatin Kinaz Kas Beyin Fraksiyonu CsA Siklosporin A DNA Deoksiribo Nükleik Asit –dP/dtmax Gevşeme İndeksi eNOS Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz ERK1/2 Ekstraselüler sinyal-regüle kinaz kaskadı H+ Hidrojen HCO3- Bikarbonat xiii Kısaltmalar Açıklamalar iNOS İndüklenebilir Nitrik Oksit Sentaz ATP Adenozin Trifosfat KATP ATP’ye Duyarlı Potasyum Kanalları KKH Koroner Kalp Hastalığı LDH Laktat Dehidrojenaz L-NOARG L-NG-nitro Arjinin MAP Kinaz Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz mKATP Mitokondriyal ATP’ye Duyarlı Potasyum Kanalları MPG Mitokondrial Permabilite Geçişi mPTP Mitokondriyal Permeability Transizyon Poru NAD(P)H Nikotinamid Adenin Dinükleotit Fosfat NECA 5'-N-Ethylcarboxamidoadenosine NO Nitrik Oksit NOS Nitrik Oksit Sentaz PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PKC Protein Kinaz C PKC-ε Protein Kinaz C-ε PKG Protein Kinaz G RISK Reperfüzyon Salvage Kinaz ROT Reaktif Oksijen Türevleri TNF-α Tümör Nekrozis Faktör-α 1 1. GİRİŞ Günümüzde kardiyovasküler hastalıklar ölümlerin tamamının %50’sinden sorumlu olmaları nedeniyle sağlık açısından en önemli risk faktörüdür [1]. Bunlar arasında, iskemik kalp hastalığı morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, 2020 yılında küresel ölümlerin başlıca büyük nedeni olacaktır [1]. Murphy ve arkadaşları tarafından hazırlanan ve 2011 yılında yayınlanan 2009 yılı ulusal yaşam istatistikleri raporuna göre 2009 yılında Amerika Birleşik Devletlerinde (ABD) yaklaşık 600.000 kişi kalp hastalıkları nedeniyle hayatını kaybetmiştir, bu Amerika Birleşik Devletlerinde gerçekleşen ölüm vakalarının yaklaşık %25’i dir [2]. Kalp hastalıkları hem erkekler hem de kadınlar için bir numaralı ölüm nedenidir. Aynı rapora göre 2009 yılında ABD gerçekleşen kalp hastalıkları kaynaklı ölümlerin yarısından fazlası erkek popülasyondandır [2]. Koroner kalp hastalığı yılda yaklaşık 385,000 kişinin ölümüne neden olmasıyla en çok görülen kalp rahatsızlığıdır [2]. Lloyd-Jones ve arkadaşlarının yaptığı bir başka araştırmaya göre 40 yaşından sonra yaşam boyu Koroner Kalp Hastalığı (KKH) gelişme riski erkekler için %49 ve kadınlar için %32'dir [3]. Her yıl yaklaşık 635.000 Amerikalı ilk defa kalp krizi geçirirken (ilk defa hastaneye başvuran miyokart infaktüs veya koroner kalp hastalığına bağlı ölüm olarak tanımlanmıştır), 280.000 Amerikalı ise tekrarlayan bir kalp krizi geçirmektedir [4]. İlk ve tekrarlayan Miyokart İnfaktüs vakalarının yaklaşık % 21’inin sessiz miyokart infaktüs olduğu varsayılmaktadır [5]. Bu bilgiler ışığında kardiyoprotektif ve terapötik etkinliği yüksek tedaviler konusundan araştırmalar artarak devam etmektedir. Medikal ilaç tedavileri (trombolitik, antienflamatuar ilaçlar vb.) [6, 7] cerrahi tedavi yöntemleri (perkutan transluminal koroner anjiyoplasti, koroner arter by-pass greftleme) [8] preinfarkt anjina [9], iskemik veya farmakolojik önkoşullama ve ardkoşullama [10, 11] gibi tedavi yaklaşımlarıyla kalp hastalıklarının önlenmesine ve tedavisine çalışmaktadır. 2 Reperfüzyon, iskemiye maruz kalan doku ya da organların yeniden kanlanması ve oksijenlenmesi olayıdır. Reperfüzyon hasarı ise, iskemi periyodunu izleyen yeniden kanlanma döneminde doku ya da organlarda meydana gelen hasar olarak tanımlanır [12]. Son yıllarda geliştirilen kardiyoprotektif tedavi yöntemlerinden biri de iskemik veya farmakolojik olarak oluşturulan koşullamadır. Yoğun laboratuar ve klinik araştırmaların konusu olan miyokardiyal önkoşullama ve miyokardiyal ardkoşullama iskemik kalp hastalıklarının patofizyolojisinin anlaşılması ve kardiyoprotektif tedavi alanında önemli gelişmeler arasındadır [13]. İskemik önkoşullama, tek veya tekrarlayan kısa süreli sublethal iskemi-reperfüzyon dönemleri, sonrasında gerçekleşecek uzun süreli lethal bir iskemi epizoduna karşı oluşacak hücresel hasarı azaltan koruyucu bir method olarak tanımlanmaktadır [14– 16]. İskemi sonrasında kalp koruyucu farmakolojik ajanlarla veya miyokardiyal iskemi ve reperfüzyonun birbirini izleyen kısa periyotlarının uygulanmasıyla iskemik periyodun sonunda oluşan infarkt alan boyutunda azalma ise ardkoşullama olarak tanımlanır [13, 17–19]. Ardkoşullamanın etkinliği ile ilgili yapılan çalışmalar; Endojen adenozin varlığı ve adenozin reseptör alt tiplerinin aktivasyonu, NO/Siklik 3.5 Guanosin Monofosfat (cGMP) yolağının rolü, Mitokondriyal Adenozin Trifosfata (ATP) Duyarlı Potasyum Kanallarının (mKATP) kanallarının katılımı, Reperfüzyon Salvage Kinaz (RISK) yolağının aktivasyonu, reperfüzyonda mitokondriyal permeability transizyon porunun (mPTP) açılmasının inhibisyonu olmak üzere beş mekanizmanın rolünün olduğunu göstermiştir [20]. Çeşitli kimyasal maddelerin ardkoşullamayı taklit ettiğinin anlaşılmasının ardından farmakolojik önkoşullama ve ardkoşullama kavramları gündeme gelmiştir [21]. İskemi öncesinde Adenozin A1 agonistleri ve ATP’ye Duyarlı Potasyum Kanal (KATP) açıcıları gibi farmakolojik ajanların uygulanması ile iskemi-reperfüzyon hasarının azaltılmasını hedeflenmiştir. Bu farmakolojik ajanlar “önkoşullamayı ve 3 ardkoşullamayı taklit ediciler” olarak isimlendirilmişlerdir [22, 23]. Bunlardan biri de resveratroldür. Üzüm tanelerinde bol miktarda bulunan resveratrol (3,4,5-trihidroksistilben) polifenol yapısında doğal bir antioksidan maddedir. Güney Fransa’da yağlı diyet ve sigara tüketimine rağmen bol tüketilen şarap nedeniyle kalp hastalıklarının görülme sıklığının diğer ülkelere göre düşük olması nedeniyle bu durum Fransız paradoksu olarak adlandırılır [24]. Resveratrolün toksisitesinin düşük olması ve çoklu koruyucu mekanizması ile klinikte kullanıma uygun bir ajandır. Uzun süreli resveratrol uygulamasının incelendiği çalışmalarda miyokard infarktüsünün neden olduğu aritmiyi, kardiyak hipertrofiyi ve yaşam süresini üzerine iyileştirici etki gösterdiği gözlemlenmiştir. Resveratrol etkisinin kardiyak miyositler üzerinde kalsiyum kanallarını bloke etmesi ve KATP kanallarını açması ile olduğu gösterilmiştir [25, 26]. Bizim bu araştırmadaki amacımız, miyokardiyal iskemiye karşı koruyucu etkinliği gösterilmiş olan resveratrolün muhtemel koruyucu mekanizma yolaklarından biri olan mPTP kanalları aracılıklı etki mekanizmasını araştırmaktır. 4 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Miyokard Fizyolojisi Kalp, vücut dokularına besin taşınması, vücudun bir kısmından başka bir kısmına hormonların taşınması, atık ürünlerin uzaklaştırılması gibi önemli görevleri yerine getirerek hayatta kalmayı sağlayan dolaşım sisteminde pompa gibi çalışarak kanın vücutta dolaşmasını sağlamaktadır [27]. Kalp yan yana çalışan iki bölümden oluşan bir pompa gibi çalışmaktadır. Sağ kalp vena cava inferior ve vena cava superior ile oksijenden fakir kanı organlardan alıp akciğerlere pulmoner arter ile pompalarken, sol kalp oksijenlenmiş kanı pulmoner ven ile akciğerlerden alıp aort yolu ile yeniden organlara ulaştırır [27]. Kalbin her iki bölümü giriş (atrium) ve çıkış (ventrikül) olmak üzere iki boşluktan oluşur. Atriumlar ventriküllere kan taşınmasına yardımcı olan öncül pompalardır. Ventriküller, asıl pompalama gücünü sağlayarak kanın sağ ventrikülden pulmoner dolaşıma, sol ventrikülden periferik dolaşıma girmesini sağlar (Şekil 2.1) [27]. Şekil 2.1. Kalp ve dolaşım fizyolojisi Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology, 12th Edition’dan alınmış ve Türkçeleştirilmiştir. 6 Atrium kası, ventrikül kası, uyarıcı ve iletici olarak özelleşmiş kas lifleri olmak üzere üç tip kastan oluşmuştur. Atrium ve ventrikül kas lifleri kasılma süresinin daha uzun olması haricinde, iskelet kasları ile aynı şekilde kasılırlar. Özel uyarıcı ve iletken lifler, az miktarda kasılabilir fibril içerdiğinden çok zayıfça kasılırlar. Kalbin ritmik atışını kontrol eden bir uyarıcı sistemi sağlamak amacıyla, aksiyon potansiyelleri şeklinde otomatik ritmik elektriksel boşalma sağlarlar ya da aksiyon potansiyelini kas boyunca yayılmasını sağlamak üzere iletirler [27]. Atriyoventriküler kapaklar (triküspit ve mitral kapaklar) sistol sırasında atriumlara ventriküllerden kanın geri akmasını önler ve semilunar kapaklar (aort ve pulmoner arter kapaklar) diyastol sırasında ventriküller içine aort ve pulmoner arterlerden kanın geri dönmesin önler. Bu sayede kalp içinde kanın tek yönlü akışı sağlanır [27]. Kalp atım hızı, kontraksiyon kuvveti gibi parametreler sinir sistemi tarafından yönetilir, ancak kalp otomatisiteye (kendi atımını başlatma yeteneği) ve ritmisiteye (pacemaker etkinliğinin düzenliliği) sahip olduğu için vücuttan uzaklaştırıldığında da çalişmaya devam eder [28]. 2.2. Kalbin Kontraksiyonu Kalp kas hücreleri arasında interkale diskler hücre zarlarını birbirinden ayırır. Bu disklerin elektrik direnci çok düşüktür ve aksiyon potansiyelinin kalp kasında yayılmasını, bu sayede kalp kas liflerinin aynı anda kasılmasını sağlar [27]. Kalp hücresinin sitoplazmasının çoğu, kalın miyozin flamentleri (çapı yaklaşık 15 nm) ve ince aktin flamentleri (çap olarak yaklaşık 7 nm) olmak üzere iki tip silindirik flament demetinden meydana gelen myofibrillerden oluşur. Her myofibril sarkomer denilen ve iskelet ve kalp kasının çizgili bir görünümünden sorumlu olan kasılma birimlerinin bir parçası olarak düzenlenmiştir [29]. Kalp aksiyon potansiyelinin bir uçtan bir uca yayıldığı iki sinsisyumdan oluşur. Aksiyon potansiyelleri, atrium duvarlarını oluşturan atrium sinsisyumundan ventrikül duvarlarını oluşturan ventrikül sinsisyumuna özelleşmiş bir ileti sistemi ile iletilir. Bu sayede ventriküller atriumlardan bir süre sonra kasılır [27]. 7 Şekil 2.2. Aktinin ve Miyozinin moleküler yapısı Human physiology / Stuart Ira Fox. - 12th Edition’dan alınmış ve Türkçeleştirilmiştir [30]. 8 Miyozin flamenti; heliks yapısında, bir çift büyük ağır zincir ve iki çift hafif zincir olmak üzere altı farklı polipeptid zincirden oluşmuş büyük bir protein (~ 480 kDa) olan miyozin molekülerinden oluşmuştur [27]. Miyozin molekülerini oluşturan iki ağır zincir birbiri etrafına spiral olarak sarılır ve miyozin molekülünün bir ucunda uçları kıvrılarak miyozin başı denilen globüler polipeptid yapıyı oluşturlar. Bu nedenle miyozin molekülünün bir ucunda iki serbest baş vardır ve sarmalın devam eden kısmına kuyruk denir. Miyozinin baş kısmı ATP’yi hidrolize eden ATPaz aktivitesine sahiptir ve kalsiyum varlığında sarkomer kontraksiyonunu sağlar [27, 30]. 9 Şekil 2.3. Kalp kası kontraksiyon döngüsü Netter’s essential physiology / Susan E. Mulroney, Adam K. Myers; illustrations by Frank H. Netter; contributing illustrators, Carlos A.G. Machado, John A. Craig, James A. Perkins.—1st Edition’dan alınmış ve Türkçeleştirilmiştir [31] 10 Aktin flamentlerileri başlıca tropomiyozin ve troponin ailesi proteinlerle ilişkili aktinden oluşur. Tropomiyozin dimerleri ise Troponin-T, Troponin-I ve Troponin-C olmak üzere üç alt üniteden oluşur. Troponin-T tropomiyozine bağlanır, troponin-I tropomiyozin tarafından aktine miyozin bağlanmasının inhibisyonunu kolaylaştırır. Troponin-C’ye Ca+2 bağlanır. Troponin-C’ye Ca+2 bağlanması aktin filamenti üzerinde tropomiyozinin hareketini sağlar ve sarkomer kontraksiyonunu sağlar [28]. Şekil 2.4. Kalp miyositlerinin transmembran aksiyon potansiyeli fazları elektriksel EKG kaydı Roberts, R. (2006)’dan modifiye edilerek Türkçeleştirilmiştir [32]. 11 Kalp miyositlerinin transmembran aksiyon potansiyeli beş fazı içerir [28]: Faz 0: (Hızlı depolarizasyon veya upstroke fazı) His-Purkinje hücresinde Voltaja duyarlı Na+ kanallarından içeri doğru hızlı bir Na+ girişi ile depolarizasyon gerçekleşir sinüs nodu hücrelerinde, Na+ yerine içeri doğru hızlı bir Ca+2 akımı gözlemlenir. Faz 0: (Hızlı depolarizasyon veya upstroke fazı) His-Purkinje hücresinde voltaja duyarlı Na+ kanallarından içeri doğru hızlı bir Na+ girişi ile depolarizasyon gerçekleşir Sinüs nodu hücrelerinde, Na+ yerine içeri doğru hızlı bir Ca+2 akımı gözlemlenir. Faz 1: (Hızlı inisyal repolarizasyon fazı) Aksiyon potansiyeli pik değere ulaştığında (+20 mV), Voltaja duyarlı Na+ kanallarının kapanıp, transmembran K+ kanallarının açılması ve K+ çıkışının artması ile gerçekleşen erken kısmi bir repolarizasyondur. Faz 2 (Plato fazı): Bu fazda hızlı K+ kanalları kapanır ve K+ çıkışı azalır, Ca+2 permeabilitesi artar (voltaja duyarlı Ca+2 kanallarının açılması ile) hücre içine Ca+2 girişi gerçekleşir. Faz 3 (Hızlı terminal repolarizasyon fazı): Ca+2 kanalları kapanır ve yavaş K+ kanalları açılır. Hücre dışına K+ çıkışı, hücre içine Ca+2 girişinden fazladır. Faz 4 (Dinlenme fazı): Tamamen repolarize olan hücrenin dinlenme potansiyelidir. Hücre içinden K+’un dışarı çıkması ile membran potansiyeli -90 mV düzeyine geri döner. Eksitasyonda voltaja duyarlı kalsiyum kanalları hücre içine Ca+2 alınması için açılırlar ve bu durum sarkoplazmik retikülümdan Ca+2 salınımını tetikler. Yükselmiş hücre içi Ca+2 miyoflamentlerinin kontraksiyonunu sağlar [27]. Ca+2’nin sarkoplazmik retikuluma geri pompalanması ve sarkolemma boyunca hücre içi Ca+2 ile hücre dışı Na+’un karşılıklı değişimi sonucu sitozolik Ca+2 seviyelerine yeniden gelinmesi ile gevşeme gerçekleşir [27]. 12 Çok sayıda işlevi olabileceği düşünülen vasküler endotelde birçok kimyasal maddelerin sentezlenip yıkıldığı, bu maddelerin fazlalığının veya eksikliğinin patolojik durumlara neden olabileceği düşünülmektedir [28, 33]. Kalp kas hücrelerinde bir aksiyon potansiyeli oluştuğunda, kalp kasının zarı üzerinde ilerlerken aynı zamanda transfers (T) tübüllerin zarları boyunca kalp kası lifinin iç kısımlarına doğru da yayılır. T tübüllerindeki aksiyon potansiyelleri longitudinal sarkoplazmik tübüllerin zarlarını etkiler ve sarkoplazmik retikulum’da depolanmış olan Ca+2 hücre sarkoplazması içine salgılanır. Hücre içinde konsantrasyonu artan Ca+2 miyofibrillerin içine difüze olur ve kontraksiyonunu başlatır [27, 28]. Miyokard çizgili iskelet kaslarında olduğu gibi miyozin çapraz bağlarının aktin flamenti ile etkileşmesi sonucunda aktin filamentlerinin miyozin filamentlerinin arasında kayması sonucunda kasılır [27]. Sarkoplazmik retikulum fonksiyonu iskemi-reperfüzyon ve kalp yetmezliğinde bozularak kontraktil fonksiyonunun bozulmasına neden olabilir [27]. Ayrıca, kalp kasının sarkoplazmik retikulumu tam bir kasılma sağlayacak kadar kalsiyum içermediği için aksiyon potansiyeli sırasında T tübüllerinden de sarkoplazmaya Ca+2 difüzyonu gerçekleşerek miyokardın kasılma gücünü arttır [27]. T tübüllerinin uçları hücre zarından geçerek kalp kasının interstisyumuna açıldığı için, miyokardın kasılma kuvveti, büyük ölçüde, hücre dışı sıvılardaki Ca+2’un konsantrasyonuna bağlıdır [27]. Plato fazının sonunda sarkoplazmadaki Ca+2 sarkoplazmik retikuluma geri alınırken, T tübülleri aracılığı ile de interstisyuma pompalanır ve yeni bir aksiyon potansiyeli oluşuncaya kadar kalp kasında kasılma durur [27]. Kalp kası, aksiyon potansiyeli oluştuktan birkaç milisaniye sonra kasılır ve aksiyon potansiyelinin son bulmasından birkaç milisaniye sonrasına kadar kasılmaya devam eder. Kalp kasında kasılmanın süresini aksiyon potansiyelinin süresi belirler ve atriyum kasında yaklaşık 0.2 saniye, ventrikül kasında ise yaklaşık 0.3 saniyedir [27]. 13 2.3. Miyokardiyal İskemi-Reperfüzyon Dünya genelinde en önemli ölüm nedenlerinin başında koroner arter hastalığı bulunmaktadır [34]. 2009 yılında Amerika Birleşik Devletlerinde gerçekleşen her 6 ölüm vakasından yaklaşık 1’inin nedeni koroner arter hastalığıdır. Koroner arter hastalığının patofizyolojik olarak ana göstergelerinden biri akut miyokardiyal iskemireperfüzyon hasarıdır [35]. Hipoksi aerobik oksidatif solunumu etkileyen, son derece önemli ve genel bir hücre zedelenme ve ölüm nedenidir. Hipoksinin en önemli nedeni, arteriyel ya da venöz kan akımı bozukluğuna bağlı organ ve dokunun yetersiz perfüzyonuna yol açan iskemidir [12, 36]. Reperfüzyon, iskemiye maruz kalan doku ya da organların yeniden kanlanması ve oksijenlenmesi olayıdır. Reperfüzyon hasarı ise, iskemi periyodunu izleyen yeniden kanlanma döneminde doku ya da organlarda meydana gelen hasar olarak tanımlanır [12, 36]. İskemik dokunun canlılığını koruyabilmesi için reperfüzyon çok önemlidir ancak reperfüzyon bazı morfolojik değişikliklere, enzim yıkımının artmasına, ventriküler fibrilasyon gibi ventriküler aritmiye, hatta canlı hücrelerin ölümüne yol açabilmektedir [37]. Miyokardiyal reperfüzyon hasarı ise, iskemi sonrasında henüz sağlam olan miyositlerin reperfüzyon ile tetiklenen olaylar neticesinde hasar görmesi olarak ifade edilmektedir [38]. Miyokardiyal reperfüzyon hasarı, ilk defa Jennings ve arkadaşları tarafından 1960 yılında reperfüze iskemik köpek miyokardlarının özelliklerinin belirlenmesi ile gösterilmiştir [39]. İskemi ve reperfüzyon sonucu oluşan miyokard sersemlemesi (miyokardiyal stunning), kronik kontraktil disfonksiyon (hibernation), önkoşullama ve reperfüzyon aritmileri incelemek için değişik deneysel yöntemler kullanılmaktadır [22, 40]. Miyokard dokusunda kan akımının aniden kesilmesi sonucu gerçekleşen iskemi birçok olaya neden olur. Miyositlerde iskemi ile gelişen oksijen yetersizliği anaerobik glikolize neden olur ve sitozol pH‘sı düşer. Bu pH düşüşü intraselüler sodyum, hidrojen ve kalsiyum iyon birikimini başlatır. Na+ - H+ değiştirici ve Na+ - HCO3- 14 taşıyıcısının yer aldığı sodyuma bağlı pH düzenleyici mekanizmalar harekete geçip intraselüler sodyumun birikmesine neden olur. Bu sodyum konsantrasyonundaki artış Na+ - Ca+2 değişimi ile sarkoplazmik retiküler Ca+2’de artışa yol açar. Reperfüzyonun ilk dakikaları boyunca devam eden aşırı Ca +2 birikimi ve Ca+2ATPaz’ın yetersiz miktarda Ca+2 alımı ile sarkoplazmik retikulum depo kapasitesini aşar ve miyofibriler hiperkontraktibilite, adenozin trifosfat tükenmesi ve mitokondriyal hücre hasarı meydana gelir [41–43]. Miyokardiyal reperfüzyon hasarına neden olan birçok olay vardır. Bu nedenlerin başlıcaları oksidatif stres, Nitrik Oksit (NO), pH paradoksu, kalsiyum yüklenmesi, akut inflamatuvar cevap, terapötik hipotermi, renin-anjiyotensin-aldesteron sistemi, mitokondrial Permeabilite Transizyon Poru (mPTP) olarak sayılabilir [34]. 2.3.1 Oksidatif stres İskemi sonrasında reperfüzyon gerçekleştikten sonra oksijenlenen dokuda Reaktif Oksijen Türevleri (ROT) nedeniyle endotel hasarı meydana gelmektedir ve ROT’nin iskemi-reperfüzyon hasarının en önemli nedeni olduğu kabul edilmektedir [44]. Reperfüzyonun başında serbest radikal oluşumu belirgin derecede yükselir. Oksijenden üretilen en önemli reaktif oksijen türevleri; peroksit anyonu, hidrojen peroksit, hidroksil radikali, peroksinitrit anyonudur. Bu serbest radikaller memran hasarına, DNA yıkımına, lipit ve protein peroksidasyonuna ve sonrasın apoptozis ve hücre ölümüne neden olmaktadırlar [45, 46]. Reperfüzyonun nötrofil birikiminin inhibisyonu, süperoksit radikallerinin inaktivasyonu ve koroner kan akımı gelişimi gibi kardiyak koruma etkileri oksidatif stres ile ortadan kalkar. NO’in ve hücre içi sinyal moleküllerinin vücutta kullanılabilirliği azalır [47]. 2.3.2. Nitrik oksit Reperfüzyon hasarının en önemli hücresel elemanı polimorfonükleer lökositlerden olan nötrofillerdir [12]. İskemi-reperfüzyon ile zarar gören endotelyumdan NO sentezi belirgin derecede azalır. NO gibi güçlü inhibitör etkisi olan bir ajanın eksikliği 15 nötrofillerin aktivasyonunun kolaylaşmasına ve doku hasarının artmasına yol açabilir. Reperfüzyondan önce NO ve NO donörlerinin uygulanması infarkt alanı ve iskemi-reperfüzyonun neden olduğu endotel fonksiyon kaybı gibi miyokardiyal hasarı azaltılabildiği gösterilmiştir [34]. Yüksek konsantrasyonda NO kardiyak miyosit fonksiyonunu deprese ederek, iskemi-reperfüzyonu takiben inflamatuvar süreçleri uyararak, mitokondriyal solunumu bozarak, nekroza ve apoptozise neden olarak miyokarda zarar verir. Düşük konsatrasyondaki NO ise kardiyak miyosit fonksiyonunu arttırarak, iskemireperfüzyonu takiben platelet agregasyonunu ve nötrofil-endotelyum etkileşmelerini azaltarak miyokardiyal koruma sağlar [48]. 2.3.3. pH paradoksu İskemi sırasında düşen pH‘nın reperfüzyonda tekrar normal düzeye getirilmeye çalışılması ölümcül reperfüzyon hasarına katkı sağlar ve bu pH paradoksu olarak bilinir. Ortama laktik asit salınmasında Na+ - H+ değiştirici kanalı ve Na+ - HCO3taşıyıcı rol oynar [49]. 2.3.4. Kalsiyum yüklenmesi Reperfüzyonun ilk dakikaları boyunca devam eden aşırı Ca +2 birikimi ve Ca+2ATPaz’ın yetersiz miktarda Ca+2 ile sarkoplazmik retikulum depo kapasitesinin aşılması neticesinde miyofibrilerde hiperkontraktibilite ve adenozin trifosfat tükenmesi sonucu mitokondri hasarı ve kardiyomiyosit ölümünü meydana getirir [43, 50]. 2.3.5. Akut inflamatuvar cevap Hücre inflamasyonu reperfüzyonda doku hasarına neden olan faktörlerden biridir. Reperfüzyon inflamatuar cevabın en önemli iki bileşeni olan nötrofiller ve endotelyum arasında bir dizi olayı tetiklemektedir. Herhangi bir inflamatuar uyarı olmadığında nötrofiller serbestçe dolaşır ve endotel ile etkileşime girmezler. İnflamasyon sırasında, endotele infiltre olan nötrofiller serbest oksijen radikalleri ve 16 proteazları salgılayarak, permeabilitenin artması ve endotel hücrelerinin zarar görmesine neden olurlar. Hücre içinde bulunan serbest radikal temizleyiciler, serbest radikallerin oluşturduğu hasarı azaltırlar [51]. Serbest radikal temizleyiciler hücre içinde bulunduğu için hücre dışında gelişen hasarı önleyememektedir. Serbest radikal temizleyicilerin ve serbest radikal inhibe edici ajanların uygulanması hücre dışında gelişen hasarı önlemek için bir tedavi seçeneği olabilir. Yapılan çalışmalar nötrofillerin aktivasyonu ve dokuya bağlanma derecesi ile dokudaki nekroz ve apoptozis arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir [52]. 2.3.6. Mitokondriyal permeability transizyon poru mPTP, iç mitokondriyal membranda bulunan seçici olmayan, yüksek oranda geçirgenliğe sahip ve fizyolojik koşullarda kapalı olan bir kanaldır [53]. Mitokondriyal fonksiyonların ortadan kalkmasına yol açan, mPTP'nin açılması, reperfüzyon esnasında gerçekleşen miyositlerin nekrozunda iskemi- önemli bir mekanizmadır. mPTP açılması oksidatif fosforilasyon ve mitokondriyal membran potansiyelini bozar ve bu durum ATP tükenmesi ve hücre ölümüyle sonuçlanır. Miyokardiyal iskemi sırasında mPTP kanalları, oksidatif strese, fizyolojik pH’nın değişmesine, ATP tükenmesine, mitokondriyal Ca+2’un aşırı yüklenmesine tepki olarak kapanır ve miyokardiyal reperfüzyondan sonra açılır [54]. mPTP'nin moleküler yapısı tam olarak açıklanmamış olmasına rağmen, son çalışmalar, her mPTP alt birimlerinin rollerini ve doğrudan mPTP ile etkileşen çeşitli proteinlerin fonksiyonlarını karakterize etmiştir. Birden çok sağ kalım sinyal yolağı mPTP'yi hedefler ve açılmasını engeller. Farmakolojik ya da genetik manipülasyonlar kullanılmasıyla mPTP’nin açılmasının doğrudan önlenmesinin iskemi-reperfüzyon sonrasında infakt alanı azalttığı in vivo olarak gösterilmiştir [53]. Bu nedenle mPTP kanallarının açılmasının engellenmesi ölümcül reperfüzyon hasarından kalbin korunması için önemli yeni bir tedavi yaklaşımıdır. 17 2.3.7. Renin-anjiyotensin-aldesteron sistemi Renin anjiyotensin aldesteron sisteminin ürünü olan anjiyotensin II, miyositlerde hücre içi kalsiyum miktarında artışa ve diyastolik fonksiyonları bozarak koroner vazokonstrüksiyona yol açarak reperfüzyonda gelişen hasara katkıda bulunur [55]. 2.4. Kardiyak Koruma Mekanizmaları 2.4.1. İskemik önkoşullama İskemik önkoşullama, tek veya tekrarlayan kısa süreli iskemik periyotların daha uzun süreli iskemik periyotlarda gelişebilecek hücre, doku veya organ hasarına karşı belirgin bir direnç oluşturması ile gerçekleşen koruyucu bir mekanizmadır [56]. Önkoşullama nekrozu geciktirerek daha az miyokard hücresinin reperfüzyon hasarına uğramasını sağlar [57]. İskemik önkoşullama ilk kez 1986 yılında Murry ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır [58]. Daha sonraki yıllarda yapılan çalışmalarda iskemik önkoşullamanın miyokardiyal nekroza [59–61] karşı koruyucu etkisinin yanında aritmi [62, 63] miyokardiyal sersemleme [64], koroner endotelyal hasar [65] ve mikrovasküler fonksiyon bozukluğuna [66, 67] karşıda koruyucu etkileri olduğu gösterilmiştir [56]. Önkoşullama ile iki farklı dönemde kalp koruması gerçekleşmektedir. İlk dönem (erken dönem, akut dönem, klasik dönem, korumanın birinci penceresi), iskemiden sonra dakikalar içinde oluşmakta ve etkisi 1-3 saate kadar sürmektedir. İlk dönem geçici fakat önemli bir koruma sağlar ve oluşmasında protein sentezine gerek yoktur. Geç dönem (gecikmiş dönem, korumanın ikinci penceresi), önkoşullamadan 24 saat sonra belirginleşir. Geç dönemin koruyucu etkisi 72-96 saate kadar sürebilir ve bu dönemde protein sentezine gerek vardır [68, 69]. Önkoşullama ile iskemik faz boyunca otakoidler salınır ve reseptörlerini aktive ederek NO aracılı sinyal yolu ile mKATP’nin açılmasını sağlarlar. Reperfüzyon fazında oksijenle karşılaşması sonucunda mitokondri tarafından tekrar ROT’nin oluşmasına yol açar. Önkoşullama ön tedavi gerektiren bir uygulama olduğundan klinik uygulamaları sınırlıdır [33]. 18 Önkoşullama iskemisinin en uygun süresi türlere göre farklılık göstermektedir. Anesteziye köpekte [70] 5 dakikalık koroner oklüzyonun 1, 6 ve 12 siklusu karşılaştırılmış, koruma açısından bir fark görülmemiştir. İn vivo sıçan [48, 71] ve domuz [72] modellerinde ise, infarkt alanın önkoşullama stimulusuna göre değiştiği gösterilmiştir. Tavşanlarda da üç defa uygulanan 5 dk iskemi 10 dk reperfüzyon siklusunun, bir defa uygulamaya göre daha etkili olduğu gösterilmiştir [73]. Adenozin, bradikinin ve opioid reseptörlerinin aynı anda aktivasyonu ve kısa süreli iskemi-reperfüzyon boyunca reaktif oksijen türlerinin ortama salınması iskemik önkoşullamayı tetikler [74]. 19 Şekil 2.5. İskemik önkoşullama ve ardkoşullamanın oluşum mekanizmaları Ardkoşullanmanın olası mekanizmalarını ve bu mekanizmalar aracılığıyla, hücre ölümünün ne şekilde önüne geçilebileceğini son çalışmalar ışığında özetleyen basit bir şematik diyagramdır. ROT, sitokinler, nötrofiller ve doku faktörü gibi proinflamatuar uyaranların inhibisyonu, inflamatuar ve oksidan yanıtları azaltabilir. Adenozin, NO ve opioid gibi endojen faktörlerin SK tarafından korunması, alt mekanizmaları tetikleyebilir. PI3K ve MEK1/2, ERK1/2 aktivasyonu sonucunda eNOS aracılığı ile KATP kanalları açılır ve mPTP kapanır. mPTP açılımının engellenmesi ile mitokonri dışına Ca+2 çıkışı olarak mitoCa+2 azalır ve osmotik şişmenin yanı sıra dış mitokondriyal membrandaki kollaps ve rüptürün, dolayısıyla hücre nekrozunun önüne geçilmiş olur. mPTP’nin kapanışı ile ayrıca proapoptotik proteinlerin sitoplazmaya salınımı engellenir. Bu sayede sitokrom c’nin, apoptotik Proteaz-Aktive edici Faktör-1’e bağlanması inhibe edilerek, kaspaz kaskadının aktifleşmesinin de önüne geçilmiş olur. Bu da apoptoz, nekroz ve inflamasyonu azalttığından, sonuç olarak hücre ölümü inhibe edilmiş olur [75, 76]. Şengül İ, Şengül D Review (2012)’den alınmıştır. 20 Adenozin (ADO), Bradikinin gibi moleküllerin tetiklemesiyle başlayan iskemik önkoşullamada, Protein Kinaz C (PKC) aktivasyonu ve NO oluşumu kritik öneme sahiptir [77, 78]. İskemi gibi kalpte ATP düzeyini düşüren bir olay gerçekleştiğinde kalpteki KATP kanalları aktive olur ve hücrenin dışından içine potasyum iyonunun akışı gerçekleşir, repolarizasyon hızlanır, bu etki ile voltaj bağımlı kanallardan akışın azalması hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu azaltarak iskemik hasarı azaltır. Bu KATP kanallarının kalbi iskemik hasardan korumadaki rolünü gösterir [79]. Diğer bir görüş ise KATP kanal aktivasyonunun bir uç efektör olmadığı, sonrasında aydınlatılamamış birçok mekanizmayı harekete geçirdiğidir [80]. Önkoşullamada bradikinin ve adenozin tarafından Endotelyal Nitrik Oksit Sentazın (eNOS) uyarılması ile NO salınımı gerçekleşir ve NO, dönüştüğü peroksinitrit aracılığı ile doğrudan ya da PKC aktivasyonuna yol açarak KATP kanallarının açılmasını sağlar [81]. Tavşan ve keçi kalbinde yapılan önkoşullama çalışmalarında Nitrik Oksit Sentaz (NOS) inhibitörü önkoşullamanın koruyuculuğunun azaldığı gözlenmiştir [82, 83]. 2.4.2. İskemik ardkoşullama İskemik önkoşullama, tek ya da birden fazla tekrarlayan kısa süreli iskemireperfüzyon dönemlerinin, daha sonra gerçekleşecek ve hasara neden olacak uzun süreli iskemi-reperfüzyon dönemlerine karşı koruyucu bir yöntemdir [14]. İskemik önkoşullamaya benzer bir rejimle; maruz kalınan iskemiden “hemen önce” yerine, “hemen sonra” kısa süreli tekrarlayan iskemi-reperfüzyon epizodlarının uygulaması ilk kez 2003’te Vinten-Johansen grubu tarafından çalışılmış olup, 45 dakikalık iskemiden sonra 3 defa 30’ar saniye iskemi-reperfüzyon periyotları gerçekleştirerek köpek miyokard hasarının %47’ den %11’ e düştüğünü gösterilmiştir [84]. Güçlü bir endojen mekanizma olan bu fenomen “Ardkoşullama” olarak adlandırılmıştır [75]. 21 Ardkoşullamada; mPTP kapanması, eNOS, NO, guanil siklaz, KATP kanalları ve adenozin mekanizmaları üzerinden miyokardın korunmasını sağlanmaktadır [85]. Adenozin A1, A2, A3 olmak üzere üç reseptörü bulunan bütün hücrelerde doğrudan ya da ATP ’nin hidrolizi sonucu oluşan lokal bir hormondur [86]. Adenozinin reseptör alt tiplerinin farmakolojik olarak aktive edilmesinin miyokardial reperfüzyonda koruma sağladığı gösterilmiştir [87, 88]. Williams ve arkadaşlarının tavşan kalbinde yaptıkları çalışmada NOS inhibitörü olan L-N-nitro-arjinin-metil ester uygulanması ardkoşullamanın koruyucu etkisini azaltmıştır [82]. İskemi boyunca kapalı olan mPTP’ler, reperfüzyonun erken döneminde açılan porlardır. Aktif oksijen radikallerinin ve kalsiyumun hücrede konsantrasyonları düşürülmese dahi, mPTP açılmasının inhibisyonu kalp koruyucu etki göstermektedir [89]. Protein Kinaz G (PKG) mitokondrial Protein Kinaz C-ε (PKC-ε) yi fosforilize ederek, mPTP kanallarının açılmasını mKATP kanalları, matrix alkanizasyon ve mitokondrial aktif oksijen radikallerini kapsayan ara adımlar üzerinden engeller [89–91]. 2.4.3. Farmakolojik koşullama Kardiyak koruma mekanizmaları olan önkoşullama ve ardkoşullama ile ilgili bir diğer terim iskemik önkoşullama ve ardkoşullamaya benzer etki gösteren farmakolojik ajanlarla gerçekleştirilen farmakolojik (kimyasal) önkoşullama ve ardkoşullamadır. Farmakolojik önkoşullama kardiyak koruma ve nöro koruma için pratik bir stratejidir [92, 93]. Farmakolojik önkoşullama, terimi ilk olarak Riepe ve Ludolph tarafından beyinde 3-nitropropiyonik asit (3-NP) kullanarak, hipoksik tolerans indüksiyonu için kullanılmıştır [92]. 22 Turan ve arkadaşlarının yaptığı çalışmalarda 3-NP ile gerçekleştirilen farmakolojik önkoşullamanın sıçan kalbinde infarkt alanı azaltarak iskemi-reperfüzyon hasarına karşı koruyucu etkisininin olduğu gösterilmiştir [94, 95]. Farmakolojik önkoşullamada yararlı etki görülen ajanlar opiodler (morfin gibi), PKC analogları, KATP kanal açıcıları (pinasidil, kromakalim, diazoksit, nikorandil, levosimendan gibi) adenozin, adenozin agonistleri (AMP579, NECA), ve NO dönörleridir. Bu ajanların hepsinin ciddi yan etkileri olmasından dolayı klinikte kullanımı sınırlıdır. Bir KATP kanal açıcısı olan diazoksit hayvanlarda yapılan çalışmalarında iskemik önkoşullamaya benzer etkiler oluştururken insanda hipotansiyona neden olmaktadır. Bu nedenle nicorandil ve adenozin önkoşullayıcı ajan olarak kullanılamamaktadır. Farmakolojik önkoşullayıcı ajanlar klinikte; kararsız anjina pektoriste, koroner arter by-pass cerrahisinde, kalp transplantasyonunda ve antiaritmik ilaçlarla kontrol altına alınamamış stabil anjinalı hastalarda kullanılabilir [96, 97]. Farmakolojik ardkoşullamanın terapötik potansiyelini gösteren çok sayıda pre klinik (hücresel) ve klinik araştırma bulunmaktadır [98]. Örneğin Kurian ve arkadaşlarının sıçan kalbinde yaptıkları çalışmada Desmodium gangeticum ekstresinin farmakolojik ardkoşullama ile kalpte koruyucu etki yaptığı gösterilmiştir [99]. Klinikte ise Huang ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada hastalar üç guruba ayrılmış isoflurane ile önkoşullama, propofol ile ardkoşullama ve iki tedavinin birlikte kullanıldığı hastalarda iskemi reperfüzyon hasarına karşı bu tedavilerin koruma sağladıkları gösterilmiştir. Özellikle her iki farmakolojik ajanı kullanan hasta gurubunda sinerjik bir etkinin olduğu gösterilmiştir [100]. NO ve proteinlerin S-nitrozillenmesinin farmakolojik önkoşullamada olduğu gibi ardkoşullamada da önemli rollerinin olduğu Penna ve arkadaşları tarafından izole sıçan kalbinde gösterilmiştir [101, 102]. 23 Farmakolojik ardkoşullama için kullanılan çeşitli ajanlar hakkında birçok yayın bulunmaktadır. Örneğin NO ve proteinlerin S-nitrozillenmesinin farmakolojik önkoşullamada olduğu gibi ardkoşullamada da önemli rollerinin olduğu gösterilmiştir [103]. Farmakolojik önkoşullamada da kullanılan adenozin analogları, NO dönörleri, opioidler ve bunlardan farkı olarak insülin, statinlar gibi ajanlar ile yapılmış farmakolojik ardkoşullama çalışmaları mevcuttur. İnhalasyon anesteziklerinden sevofluranın farmakolojik ardkoşullayıcı etkisi olduğu görülmüştür [104]. İskemik ardkoşullamanın taklit edilmesi amaçlanan bu ajanlardan hiç birinin şu an için klinik kullanımı yoktur [21]. İskemik ardkoşullama yerine infüzyon olarak uygulanan fosfodiesteraz-5 inhibitorleri olan vardenafil ve sildenafil’in geniş bir doz aralığında kalp koruyucu etkinliği gözlemlenmiştir. İnsanda kullanılan maksimum dozlarının yarısı ile iskemik ardkoşullama ile karşılaştırılabilir tam koruma gözlemlenmiştir. Erektil disfonksiyon tedavisinde karşılaşılan hemodinamik yan etkileri ortaya çıkaran dozun altındaki konsantrasyonlarda dahi kalp koruyucu etkisinin varlığı kanıtlanmıştır ve bu farmakolojik ardkoşullamanın klinikte kullanılabilirliği açısından önemli bir bulgudur [105]. Farmakolojik önkoşullamada ve ardkoşullamada kullanılabilecek yeni farmakolojik ajanların geliştirilebileceği bir çerçeve sağlayabilmek ve kardiyak koruma temellerini anlamak için mekanistik çalışmalara gerek vardır [106]. 24 Şekil 2.6. İskemi-repefüzyon hasarında mPTP kanallarının açılmasının etkisi ve çeşitli kalp koruyucu ajanların bu hasara nasıl engelledikleri ⤑ iskemide temel olarak meydana gelen değişiklikleri göstermektedir. → kesik çizgili olarak reperfüzyon sırasında öncelikle meydana gelen değişiklikleri göstermektedir. ➡ kalp koruyucu ajanların etki yerlerini göstermektedir [107, 108] Halestrap, AP (2009)’ dan alınmış ve Türkçeleştirilmiştir. 2.5. Resveratrol Quiñones ve arkadaşları tarafından kaleme alınan bir derlemede resveratrolün de içinde bulunduğu polifenolik bileşiklerin kardiyovasküler hastalıklar üzerindeki olumlu etkilerinden bahsedilmiştir [109]. Üzüm tanelerinde bol miktarda bulunan resveratrol (3,4,5-trihidroksistilben) polifenol yapısında doğal bir antioksidan maddedir. Güney Fransa’da yağlı diyet ve sigara tüketimine rağmen bol tüketilen şarap nedeniyle kalp hastalıklarının görülme 25 sıklığının diğer ülkelere göre düşüktür ve bu durum Fransız paradoksu olarak adlandırılır [24]. Resveratrolün doğal antioksidan etkisi rolü; fenton reaksiyonu ürünleri tarafından indüklenen lipid peroksidasyonunun inhibisyonu, koenzim Q ile yarışarak ROT oluşum yerinde oksidatif zincir kompleksini azaltmak ve mitokondride oluşan superoksit radikalini yakalamak olmak üzere üç farklı mekanizma ile açıklanmaktadır [110]. Resveratrolün iskemi-reperfüzyon hasarına karşı kalbi koruduğunu sıçan kalbinde yapılan çalışmalar ile göstermiştir [111]. Turan ve arkadaşlarının tavşan spinal kord iskemisinde resveratrol ile yaptıkları farmakolojik önkoşullama çalışmasında, resveratrolün oksidatif stresi azaltarak NO salınımını artırdığı ve spinal kordu iskemi-reperfüzyon hasarından koruduğunu gösterilmiştir [112]. Resveratrol damar duvarındaki cGMP miktarını ve NOS aktivitesini indükleyerek NO miktarını arttırır. Buda NO/cGMP yolağı ile damar gevşemesini sağlar. Resveratrolün sıçan aortunda noradrenalin ve fenilefrinin oluşturduğu kasılmaları önemli derecede inhibe ettiği gösterilmiştir [113]. Akar ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada resveratrolün (70 µM) noradrenalin ile kantrakte edilmiş safen ven ve internal meme arterinde yaklaşık %35 gevşemeye sebep olduğunu ve endotel tabakası uzaklaştırılmış ya da L-NOARG (NOS inhibitörü) önceden verilen insan meme arterinde ve saphen vende resveretrolün oluşturduğu gevşemenin ortadan kalktığını göstermişlerdir [114]. Resveratrolün endotel bağımlı vazodilatör etkisi süperoksit radikallerinin oluşumunda ana kaynaklardan biri olan vasküler Nikotinamid Adenin Dinükleotit Fosfat (NAD(P)H) oksidaz inhibitör etkisine bağlanmıştır [115]. Akar ve arkadaşları nitrat toleransı oluşturulmuş insan meme arteri dokusunda 1-10 µM Resveratrolün NAD(P)H ile sitümule edilen veya bazal süperoksit oluşumunu neredeyse ortadan kaldırdığını göstermişlerdir [116]. 26 Bu etki mekanizmaları dışında Lin ve arkadaşları sıçanlarda yaptıkları bir çalışmada travmatik beyin hasarını önlemede resveratrolün etkisinin mPTP kanaları üzerinden olduğu gösterilmişlerdir [117]. 2.6. Atraktilosid Atraktilosid, Atractylis gummifera ve diğer devedikenlerinden izole edilen son derece toksik bir glikozittir. Mitokondriyal translokazı inhibe ederek mitokondriyal membranda adenozin nükleotidlerin oksidatif fosforilasyonunu engeller. Ayrıca bilinen bir mPTP açıcısıdır [118]. Husainy ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada mPTP kanallarının iskemireperfüzyonun farklı zamanlarında inhibe edilmesinin ve açılmasının etkisi araştırılmıştır. Bunun için atraktilosidin birçok çalışmada da kullanılan 50 μM konsantrasyonu kullanılmıştır. İskemi öncesinde atraktilosid uygulamasının miyokard hasarını (Kreatin Kinaz (CK) salınımını) ve hücre ölümünü kontrole kıyasla belirgin derecede arttırdığı, reoksijenasyon sırasında atraktailosid uygulamasının CK salınımını belirgin şekilde arttırırken nekrotik veya apoptotik hücre ölümünü etkilemediği görülmüştür. Reoksijenasyonun ilk 10 dakikasında atraktailosid uygulanmasının hem CK salınmasını hem de hücre ölümünü gerek iskemik önkoşullama gerek mPTP inhibitörü olan Siklosporin A (CsA) ve Bongkrekic Asitin (BKA) etkinliği ile kıyaslanabilir şekilde azalttığı gözlemlenmiştir. Aynı etki reoksijenasyonun 10. dakikasından sonraki uygulamalarda ve reoksijenasyon öncesi uygulamalarda dakikasındaki görülmemiştir. Bu aktivitesindeki kaspaz-3 sonuç reoksijenasyonun mPTP’nin rolüne ilk on bağlanmıştır. Reoksijenasyonun ilk on dakikasında CsA ile sağlanan mPTP inhibisyonu ile kaspaz-3 aktivitesi kontrole göre iskemik önkoşullama ile kıyaslanabilir şekilde azalırken aynı perioddaki atraktilosid uygulaması ile kaspaz-3 aktivitesinde belirgi artış gözlemlenmiştir [119]. İskemi-reperfüzyon kaynaklı hasar ve sıçan ventriküler miyokardın korunması mPTP'nin, açık veya kapalı durumuna bağlıdır. Paradoksal olarak, bu reoksijenasyonun ilk 10 dakika esnasında kanalların hem açık hem de kapalı olması 27 kalbin İskemi-reperfüzyon kaynaklı hasara karşı korunmasında iskemik önkoşullamaya benzerliği açısından kritik bir öneme sahip olduğu görülmektedir. Reperfüzyon sırasında mPTP açılması miyosit ölümünün önemli belirleyicilerindendir. mPTP'nin açılmasının, iç mitokondriyal zarı boyut olarak 1500 Da ya kadar olan moleküllere geçirgen hale getirmesi sonucunda mitokondrial matris şişmesi, dış membran yırtılma ve sitokrom c serbest bırakılması ve diğer proapoptotik faktörlerin oluşmasına neden olur ve apoptotik yolağı başlatır [120, 121]. Buna ek olarak, ilişkilendirilmiş mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ayrılması (uncoupling), mitokondriyal zarın çökme potansiyeline ve enerji tükenmesine neden olur. Devam etmesi halinde ise, hücre nekrozuna neden olur [122]. Birçok araştırmacı, erken reperfüzyon esnasında mPTP inhibisyonunun kalp koruyucu olduğunu göstermiştir [123, 124]. Yadav Narayan ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada her iki cinsiyetten olan Wistar sıçanlarda diyetle hiperlipidemi oluşturulmuş farmakolojik ve iskemik önkoşullamanın hiperlipidemik ratlarda kardiyoprotektif etkisi incelenmiştir. Gerek hiperlipidemik olmayan ratlarda önkoşullama olmaksızın atraktilosid (20 μM) uygulaması, gerekse iskemik önkoşullama yapılmış normal ratlarda, farklı kimyasal ajanların kullanıldığı önkoşullama uygulanmış ve önkoşullamanın son döngüsünde yapılan atraktilosid uygulaması hiperlipidemik ratlarda olduğu gibi infakt alanı arttırmıştır [125]. Laktat Dehidrojenaz (LDH) ve CK’ın miyokarda bağlı salınımı (CKMB) artmıştır [126]. LDH salınımındaki artış matemetiksel olarak iskemi-reperfüzyon hasarı ile ilişkilendirilmiş olmasından hareketle atraktilosidin önkoşullamanın iskemi reperfüzyon-hasarını önleyici etkisini azalttığını söyleyebiliriz [125]. 28 29 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Gereçler 3.1.1. Kullanılan deney hayvanları Gazi Üniversitesi Rektörlüğü Deney Hayvanları Etik Kurul Başkanlığından G.Ü.ET10.047 kod numarası ile etik kurul izni alınmıştır. Deneylerde Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkez Başkanlığı Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezinden temin edilen Wistar cinsi 300-350g ağırlığında erkek ratlar kullanılmıştır. 3.1.2. Kullanılan kimyasal maddeler Ketamin hidroklorür (Pfizer), Ksilazin (Alfasan), Heparin (Mustafa Nevzat), Atraktilosid (Sigma-Aldrich), Resveratrol (Sigma-Aldrich), Trifeniltetrazolium klorür (TTC) (Sigma-Aldrich), NaH2PO4 (Merck), Na2HPO4 (Merck), Formol (SigmaAldrich), NaCl (Merck), NaHCO3 (Merck), Glukoz (Merck), KCl (Merck), KH2PO4 (Merck), CaCl2 (Merck), MgSO4 (Merck), Absolü etanol (Merck-Resveratrolü çözmek için kullanılmıştır). Krebs-Heinsleit Çözeltisi (pH7.4) NaCl 118,0 mM NaHCO3 25,0 mM Glukoz 11,0 mM KCl 4,5 mM KH2PO4 4,4 mM CaCl2 1,4 mM MgSO4 1,2 mM 30 3.1.3. Kullanılan aletler %95 O2, %5 CO2 içeren gaz karışım tüpü Cerrahi malzeme (Makas, pens, buldog) Hassas terazi (Shimadzu) Kan Basıncı Transducer (Commat Ltd., Türkiye) Langendorff cihazı (MAY LS06 seri no:3006-005) Mikropipet (Eppendorff Research) MP 35 veri kayıt sistemi (Biopac systems, INC) pH metre (JENCO) Sirkülatör (MAY WBC 3044V3) Vortex (Firlabo) 3.2. Yöntem 3.2.1. Sıçan izole kalp preparatını hazırlanması ve ölçülen hemodinamik parametreler Deney hayvanları ksilazin (10 mg/kg) ve ketamin hidroklorür (50 mg/kg) ile intraperitonal enjeksiyonla anesteziye edilmiş, femoral ven yoluyla (500 IU/kg) heparin verildikten sonra toraks hızla açılarak kalp çıkartılmış ve buzlu KrebsHeinseleit çözeltisinin içerisine alınmıştır. İzole edilen kalp, hızlı bir şekilde %95 O 2, %5 CO2 gaz karışımı ile havalandırılan 37°C sıcaklığındaki Krebs-Heinseleit çözeltisi ile retrograd olarak perfüze edilmek üzere sabit basınçlı Langendorff cihazına aorttan asılmıştır. Krebs Henseleit rezervuarı, perfüzyon boyunca istenilen sabit basınç (100 cm H20=75 mmHg) sağlamak için izole organ banyosundan 100 cm yukarıda olacak şekilde yerleştirilmiştir. Kalbin sol ventrikülüne yerleştirilen su dolu bir lateks balon yardımıyla sol ventrikül basıncı ölçülmüştür. Deneyler sırasında, transducer aracılığıyla, veri kayıt sistemi (MP35 biopac systems, INC) yardımıyla perfüzyon basıncı, sol ventrikül sistolik ve diyastolik basıncı eş zamanlı olarak kaydedilmiştir. Deney süresince Sol Ventrikül Gelişen Basıncı (SVGB), Sol Ventrikül Diyastol Sonu Basıncı (SVDSB), kalp atım hızı ölçülmüştür. SVGB, ventriküler sistolik basınçdan ventriküler diyastolik basıncın 31 çıkartılması ile hesaplamıştır. Ayrıca Kalbin iş gücünü gösteren Hız Basınç Ürünü (RPP) hesaplanarak değerlendirilmiştir. Pozitif ve negatif diferansiye basınçlar SVGB’nin türevi alınarak biopac MP35 veri kayıt sistemi tarafından hesaplanmıştır. +dP/dtmax (kontraksiyon hızının göstergesidir ve inotropizm indeksi olarak kullanılmaktadır) ve –dP/dtmax (gevşeme indeksi olarak kullanılmaktadır) [127]. 3.2.2. Deney protokolü Araştırmamızda hayvanlar dört gruba ayrılmıştır. Grup 1 (Kontrol): 25 dakikalık dengeleme periyodunu takiben 30 dakikalık global iskemi ve ardından 120 dakikalık reperfüzyon yapılmıştır. Grup 2 (Resveratrol): 15 dakikalık dengeleme periyodunu takiben 10 dakika 10 µM konsantrasyonda resveratrol infüzyon ile verilmiştir. Ardından 30 dakika global iskemi 120 dakika reperfüzyon yapılmıştır. Grup 3 (Atraktilosid): 15 dakikalık dengeleme periyodunu takiben 10 dakika 100 µM konsantrasyonda atraktilosid infüzyon ile verilmiştir. Ardından 30 dakika global iskemi 120 dakika reperfüzyon yapılmıştır. Grup 4 (Atraktilosid+Resveratrol): 5 dakikalık Krebs perfüzyonu ile dengeleme periyodundan sonra 10 dakika Krebs Henseleit çözeltisi içerisinde kalp kendi çalışma hızına bağlı olarak 3, 10, 30 ve 100 µM konsantrasyonda Atraktilosid ile 10 dakika, ardından Krebs Henseleit çözeltisi içerisinde 10 µM resveratrol perfüze edilmiş ardından 30 dk’lık global iskemi 120 dakika reperfüzyon yapılmıştır. Her bir deney boyunca perfüzyon basıncı, SVGB, SVDSB ve kalp atım hızı, kaydedilmiştir. ±dP/dtmax SVGB ‘nin türevi alınarak biopac MP35 veri kayıt sistemi tarafından hesaplanmıştır. 32 İnfarkt Alan Ölçümü Grup 1: Kontrol 10 dk 15 dk 30 dk 120 dk Grup 2 ve 3: Resveratrol veya Atraktilosid 15 dk 10 dk 30 dk 120 dk Resveratrol veya Atraktilosid perfüzyonu Grup 4: Resveratrol + Atraktilosid 5 dk 10 dk 10 dk 30 dk 120 dk Resveratrol perfüzyonu Atraktilosid perfüzyonu Şekil 3.1. Deney protokolü Açık alan; perfüzyon periyodu, kapalı alan, iskemi periyodu, taralı alan; reperfüzyon periyodudur 33 Tüm deney gruplarında iskemi öncesi, iskemi sonrası reperfüzyonun 30. dakika, 60. dakika ve 120. dakikalarındaki perfüzyon basıncı ve sol ventrikül basıncı değerleri oransal olarak karşılaştırılmıştır. 3.2.3. İnfarkt alan değerlendirilmesi Hazırlanan 1 L 0,1 M NaH2PO4 ve 2 L 0,1 M Na2HPO4’ın karıştırılması ile hazırlanan ve pH’sı 7,4’e ayarlanmış, fosfat tamponunda çözülerek %1 ‘lik Trifeniltetrazolyum Klorür (TTC) çözeltisi hazırlanır. Kalpler reperfüzyondan sonra Langendorf düzeneğinde %1’lik TTC içeren fosfat tamponu ile 37°C’de 20 dk süreyle infüze edilerek boyanır. Dokuda nekrotik alanlar soluk sarımsı renkte gözlemlenirken, canlılığını koruyan bölge ise TTC ile koyu kırmızı renkte boyanır. Lagendorf düzeneğinden alınıp alimunyum folyoya sarılarak -20°C ‘de dondurulan kalpler, bistüri ile 2-3 mm kalınlıkta olacak şekilde dilimlenir. Kalp dilimleri % 10 formol çözeltisinde boyayı fiske etmek amacıyla 30 dk bekletilir. Boyama işlemini takiben infarkt alan iki cam levhanın arasına yerleştirilen ve fotograflanan kalplerde Image J bilgisayar programı yardımı ile 100xinfarkt alan/tüm alan eşitliği ile oransal olarak hesaplanır. 3.2.4. İstatistiksel analiz Tüm gruplarda elde edilen infarkt alan, SVGB, SVDSB, ±dP/dtmax ve hız basınç ürünü değerleri, % cevabın ortalaması ± standart hatası şeklinde ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki anlamlılık tek yönlü varyans analizi (ANOVA), post hoc trst olarak TUKEY testi yapılarak karşılaştırıldı ve P<0,05 olan değerler anlamlı kabul edildi. 34 35 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. İnfarkt Alan Resveratrolün 10 µM uygulaması 30 dakika iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrası infarkt alan büyüklüğünü kontrole göre anlamlı olarak azaltmıştır. Atraktilosid 30 µM ve 100 µM konsantrasyonda, resveratrolün oluşturduğu bu koruyucu etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Resim 4.1). 60 Kontol 55 Res (10µM) * Atr (100µM) + Res 50 45 Atr (30µM) + Res * Atr (10µM) + Res 40 Atr (3µM) + Res 35 Arbitrary Unit 30 25 20 #* 15 10 # # 5 0 Şekil 4.1. Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında infarkt alan üzerine etkilerinin karşılaştırılması n=3-12, * resveratrole göre, # kontrole göre, anlamlı p<0,05 36 Resim 4.1. Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasını tekiben 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında TTC boyası ile boyanan kalp örnekleri 37 4.2. Hemodinamik Parametreler 4.2.1. Sol ventrikül gelişen basıncı Kontrol grubunda iskemi sonrası azalan sol ventrikül gelişen basıncını (SVGB) resveratrol (10 µM) kontrole göre iskemi sonrası yani reperfüzyon süresince anlamlı olarak düzeltmiştir (Şekil 4.2). Atraktilosid uygulandığı bütün konsantrasyonlarda, resveratrolün oluşturduğu koruyucu etkiyi gerek iskemi öncesi gerekse iskemi sonrası anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır. (Şekil 4.2). 38 38 Kontol Res (10µM) 120 Atr (100µM) + Res Atr (30µM) + Res SVGB (Başlangıcın %) 100 80 60 * * * * Atr (10µM) + Res Atr (3µM) + Res # * * * 40 20 # # * * * * * * * 0 30 60 İskemi 90 120 180(dk) Reperfüzyon Şekil 4.2. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında SVGB üzerine etkisinin karşılaştırılması n=4-13, * resveratrole göre, # kontrole göre anlamlı, p<0,05 39 Şekil 4.3. Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte kullanıldığı gruplardaki SVGB kayıtları 40 4.2.2. Sol ventrikül diyastol sonu basıncı Resveratrolün (10 µM) uygulaması 30 dakika iskemi sonrasında reperfüzyon süresince sol ventrikül diyastol sonu basıncını (SVDSB) kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir (Şekil 4.4). Atraktilosid sadece 30 µM ve 100 µM konsantrasyonda uygulandığında, resveratrolün oluşturduğu koruyucu etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 4.4). 41 350 * SVDSB (Başlangıcın %) 300 250 * * 200 * # # 150 * * Kontol Res (10µM) Atr (100µM) + Res Atr (30µM) + Res Atr (10µM) + Res Atr (3µM) + Res * # # 100 50 0 30 60 İskemi 90 120 180 (dk) Reperfüzyon Şekil 4.4. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında SVDSB üzerine etkisinin karşılaştırılması n=3-18,* resveratrole göre, # kontrole göre anlamlı P<0,05 41 42 4.2.3. ± dP/dtmax değerleri - dP/dtmax Değerleri Resveratrol (10 µM) uygulaması 30 dakika iskemi sonrasında reperfüzyon süresince sonrasında -dP/dtmax değerini reperfüzyon süresince kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir (Şekil 4.5). Atraktilosid iskemi öncesi 3, 10, 30 ve 100 µM konsantrasyonlarda, iskemi sonrası ise 30 µM ve 100 µM konsantrasyonda uygulandığında, resveratrolün oluşturduğu bu etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 4.5). 43 Kontol 120 Res (10µM) # 100 Atr (100µM)+Res # Atr (30µM) + Res Atr (10µM) + Res -dP/dtmax (Başlangıcın %) 80 # 60 40 20 * * * * * * * * Atr (3µM) + Res * * * 0 30 60 İskemi 90 120 180 (dk) Reperfüzyon Şekil 4.5. Kontrol, resveratrol ve atraktilosidin farklı dozlarının resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında -dP/dtmax üzerine etkisinin karşılaştırılması n=3-17, * resveratrole göre, # kontrole göre anlamlı p<0,05 43 44 + dP/dtmax Değerleri Resveratrol (10 µM) uygulaması 30 dakika iskemi sonrasında reperfüzyon süresince sonrasında +dP/dtmax değerini reperfüzyon süresince kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir (Şekil 4.6). Atraktilosid gerek iskemi öncesi gerekse iskemi sonrası 3, 10, 30 ve 100 µM konsantrasyonlarda resveratrolün oluşturduğu koruyucu etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 4.6). 45 120 # +dP/dtmax (Başlangıcın %) 100 80 60 40 20 0 * * * * * * * * * * * 30 60 İskemi # 90 Kontol Res (10µM) Atr (100µM) + Res Atr (30µM) + Res Atr (10µM) + Res Atr (3µM) + Res # * 120 * * * * 180 (dk) Reperfüzyon Şekil 4.6. Kontrol, Resveratrol ve Atraktilosidin farklı dozlarının Resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında +dP/dtmax üzerine etkisinin karşılaştırılması n=3-12,* resveratrole göre, # kontrole göre anlamlı p<0,05 45 46 4.2.4. Hız basınç ürünü Kalbin iş gücünü gösteren hız basıç ürünü sistolik kan basıncı ile kalp atım hızının çarpılması ile hesaplanır. Resveratrolün (10 µM) uygulaması 30 dakika iskemi sonrasında reperfüzyon süresince hız basınç ürününü kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir (Şekil 4.7). Atraktilosid 30 µM ve 100 µM konsantrasyonda uygulandığında, resveratrolün oluşturduğu koruyucu etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 4.7). 47 Kontol 140 Res (10µM) Atr (100µM) + Res Hız Basınç Ürünü (Başlangıcın %) 120 Atr (30µM) + Res # 100 Atr (10µM) + Res # 80 60 * * ** ** 90 120 40 Atr (3µM) + Res # * * 20 0 30 60 İskemi 180 (dk) Reperfüzyon Şekil 4.7. Kontrol, Resveratrol ve Atraktilosidin farklı dozlarının Resveratrol ile birlikte uygulanmasının 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında hız basınç ürünü üzerine etkisinin karşılaştırılması n=3-15,* resveratrole göre, # kontrole göre anlamlı p<0,05 47 48 49 5. TARTIŞMA Bu araştırmamızda resveratrolün miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarında oluşturduğu koruyucu etkide mPTP kanallarının rolünü inceledik. Araştırmamızda iskemi öncesi uygulanan resveratrolün 30 dakikalık miyokardiyal iskemi ve 120 dakikalık reperfüzyon sonrasında gerek infarkt alanda gerekse hemodinamik parametrelerin korunmasında kontrol grubuna göre anlamlı koruma oluşturmuştur. Resveratrol kontrol grubunda azalmış olan SVGB’nı ve artmış olan SVDSB’nın iskemi öncesi değerlerinde kalmasını sağlamıştır. Resveratrolun oluşturduğu bu koruyucu etkide mPTP kanallarının etkilerini araştırmak için mPTP kanal açıcısı atraktilosidin 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM olmak üzere dört farklı dozunu kullandık. Atraktilosid infarkt alanda 30 µM ve 100 µM konsantrasyonlarda, resveratrolün yaptığı korumayı ortadan kaldırmıştır. Atraktilosid uygulandığı bütün konsantrasyonlarda, resveratrolün reperfüzyon sırasında SVGB’da oluşturduğu koruyucu etkiyi ortadan kaldırmıştır. Ayrıca atraktilosid 30 µM ve 100 µM konsantrasyonlarda uygulandığında, resveratrolün reperfüzyon sırasında SVDSB’da oluşturduğu koruyucu etkiyi ortadan kaldırmıştır. Atraktilosid aynı konsantrasyonlarda uygulandığında resveratrolün reperfüzyon sırasında ±dP/dt max ve hız basınç ürününde oluşturduğu koruyucu etkiyi geri çevirmiştir. Resveratrolün miyokardiyal iskemi reperfüzyon hasarına karşı koruyucu etki yaptığını gösteren farklı alanlarda birçok çalışma bulunmaktadır. Örneğin, Dolinsky ve arkadaşlarının farelerde yaptıkları çalışmada aerobik egzersiz ve resveratrol’ün doksorubisin kaynaklı kardiyak hasarı hafiflettiği gösterilmiştir [128]. Resveratrolün farmakolojik önkoşullama dışında da kalp koruyucu etkinliği ile ilgili Pınarlı ve arkadaşları sıçanlarda yaptıkları çalışmada resveratrol ve adipoz doku kaynaklı kök hücrelerin doksorubisin kardiyotoksitesinin tedavisinde etkili olduğu gösterilmiştir [129]. Militaru ve arkadaşları tarafından yapılan bir klinik çalışmada ise kararlı anjinası olan hastalarda resveratrol ve kalsiyum fruktoborat içeren gıda takviyelerinin olumlu etkilerinin olduğu gösterilmiştir [130]. Bizim çalışmamızda da resveratrol iskemi-reperfüzyon hasarını infarkt parametrelerde yaptığı düzeltmeler ile geri çevirmiştir. alan ve hemodinamik 50 İskemi-reperfuzyondan sonra miyokardiyal nekroz, iskemik ve reperfüzyon hasarının bir kombinasyonu olarak ortaya çıkar. Hasarın büyüklüğünü ve şiddetini iskemik dokudaki kan akışı, iskeminin süresi ve hayvan türü gibi faktörler değiştirmektedir. Miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının oluşmasında çok sayıda yolak rol almaktadır. Bunlardan biri de mPTP’dir. mPTP kanalları her iki mitokondriyal membranda yayıldığı düşünülen spesifik olmayan, hücre ölümü ile ilişkili mitokondriyal geçirgenlikteki artışa aracılık eden bir kanaldır [124, 131, 132]. mPTP kanalları 1.5 kD’a kadar çözünen maddeler için geçirgendir. Bu ΔΨm dağılmasına ve ATP üretiminin inhibisyonuna neden olan iç zar boyunca H+ dengelenmesini sağlar. Eşlik eden su akışı, dış membranın güçsüz olduğu bir noktadan yırtılması ile sonuçlanan mitokondri şişmesine neden olur. mPTP redoks, Ca+2, voltaj, adenin nükleotid ve pH duyarlıdır [124, 131, 132]. Özellikle matriks ve ROT’ndeki artışlar, kanalların açılmasını uyarırken adenin nükleotidler kanalların açılmasını inhibe eder. Birçok kalp hastalığı, özellikle de iskemi-reperfüzyon hasarı, mPTP kanallarının aktivitesini arttıran Ca +2, oksidatif stres, mPTP inhibitörlerindeki azalma (örneğin; ATP/ Adenozin Difosfat (ADP)) gibi faktörlerdeki artış ile ilişkilendirilmiştir [124, 131–133]. Ayrıca, yapılan çalışmalar mPTP kanallarının inhibisyonunun miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı [121, 134–136], Ca+2 kaynaklı kardiyomiyopati [137], diyabetik kardiyomiyopati [138], kas distrofisi [139], ve anti-kanser ajanlardan kaynaklanan kardiyotoksik etki [140], gibi çeşitli kardiyak patolojilerin neden olduğu kardiyak miyosit kaybını azalttığını göstermiştir. Ne yazık ki, mPTP’lerin kardiyovasküler hastalıklarda rolünü anlamamız ile ilgili bu önemli gelişmelere rağmen, mPTP kanallarının kesin moleküler yapısı bilinmemektedir. Daha önceki pek çok çalışmalarda mPTP’lerin açılmasının mitokondrial fonksiyon kaybına ve buna bağlı olarak meydana gelen kardiyomiyosit nekrozunda rol oynayan majör mekanizmalardan biri olduğu gösterilmiştir [141–144]. Mitokondri sadece hücresel prosesler için gerekli enerjinin sağlanmasında değil aynı zamanda apoptozis yolu ile programlanmış hücre ölümünde de rol oynar. Yeterli ATP seviyesi sağlanamadığı zaman nekrozdan dolayı hücreler ölür ve kaspaz kaskadının aktivasyonu ile başlayan moleküler sinyal yolaklarının aktivasyonu ile apoptosiz meydana gelir. Mitokondriyal ve reseptör yolakları tarafından başlatılan nekroz ve 51 apoptoz, akut ve kronik kardiyak hastalıkların her ikisinde de meydana gelir [145]. Örneğin deneysel akut miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı iskeminin süresi ve diğer faktörlere bağlı olarak irreversible mitokondrial hasarın tetiklediği mitokondrial apoptotik yolakların aktivasyonu hem nekroza hem de apoptozise neden olur [145]. Kardiyak iskemi reperfüzyon hasarında mPTP’nin rol oynayabileceği ilk defa Crompton ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir [146]. İskemiyi takiben reperfüzyonda mitokondrial permabilite geçişi (MPG) meydana gelmektedir. Bu geçiş iskemi-reperfüzyon hasarının oluşmasında önemli bir nedenidir. İskemireperfüzyon hasarının geri döndürülebilmesi için mitokondirinin bütün fonksiyonlarının geri dönmesi gerekmektedir [147, 148]. Apoptozisde mPTP’nin rolü henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak konu ile ilgili çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. mPTP’nin açılması mitokondriyal şişmeye, mitokondrial membranın yırtılmasına neden olur. Bunun sonucunda sitozole sitokrom C’nin salınımı ile apoptozis oluşumu tetiklenir. Bununla birlikte mitokondrial apoptozize neden olan kanal mPTP’den bağımsız olarak sitokrom C’nin salınımını sağlar. Apoptozis için gerekli olan ATP, mPTP nin açılımı ile azalır. Apoptozise mPTP’nin katılımı hücrenin enerji durumuna bağlı olabilir [131, 149]. G-protein bağlantılı reseptörler ve sitokin reseptörleri tarafından aktive edilen prosurvival sinyal yolaklarının pek çoğu mPTP nin hedefidir. İskemi-reperfüzyon hasarının oluşmasında mPTP’nin rolü bilinmesine karşılık henüz klinikte kardiyak korumada kullanılamamaktadır [135, 150, 151]. Bunun için öncelikle mPTP açılmasını regüle eden mekanizmaların anlaşılması ve bunun nasıl regüle edileceğinin bilinmesi gerekmektedir. Biz bu çalışmamızda kardiyak koruyucu etkisi gösterilmiş olan resveratrolün miyokardiyal iskemireperfüzyon hasarının azaltılmasında mPTP kanallarının etkisinin olup olmadığını araştırdık. Çalışmamızda resveratrolün oluşturduğu koruyucu etkide mPTP kanallarının rolü olduğunu kasılma ve gevşeme cevaplarının mPTP kanal açıcısı atraktilosid uygulaması sonrasında doz bağımlı olarak artması ile gösterdik. Ancak resveratrolün oluşturduğu bu koruyucu etkiyi mPTP kanallarının kapanmasını ve/veya açılmasını engellenmesi üzerinden olup olmadığı bu tez kapsamında değerlendirilmemiştir. 52 mPTP’nin kardiyak hasar üzerindeki etkilerini inceleyen çalışmalar bulunmaktadır. Örneğin, Husainy ve arkadaşlarının sıçanlarda yaptıkları bir çalışmada iskemireperfüzyon hasarında mPTP’nin ventrikül miyokardında oluşan hasarda önemli rol oynadığı, özellikle reperfüzyonun ilk 10 dakikasında mPTP’nin açık veya kapalı olmasının oluşan hasarda etkisinin olduğu gösterilmiştir [119]. Duan ve arkadaşlarının sıçanlarda yaptıkları ve iskemik ardkoşullama ile mPTP inhibitörü olan siklosporin A ile farmakolojik ardkoşullamayı karşılaştırdıkları çalışmada siklosporin A ile farmakolojik ardkoşullamanın klinikte kullanımı mümkün olmayan iskemik ardkoşullamaya göre daha etkili olduğunu göstermişlerdir [152]. Yine Duan ve arkadaşlarının sıçanlarda yaptıkları bir diğer çalışmada reperfüzyon sırasında koruyucu etkinliği bilinen geçici asidoz modelini taklit ederek asit tamponu ile asit tamponu içinde resveratrol perfüzyonunun etkilerini karşılaştırılmışlardır. Her iki gurupta da iskemi-reperfüzyon hasarında kontrole göre anlamlı koruyucu etkinliğinin olduğu gösterilmiştir ve bu etkinlik mPTP kanallarının açılmasının inhibisyonu ile ilişkilendirilmiştir [153]. Bizim çalışmamızda da mPTP kanal açıcısı atraktilosid kontrol kalplerde oluşan iskemi/reperfüzyon hasarına benzer doz bağımlı bir etki göstermiştir. Gao ve arkadaşlarının 2005 yılında yaptıkları çalışmada kardiyak korumada tümör nekrozis faktör-α (TNF-α)’nın koruyucu etkisinde mPTP ve Ca ile aktive edilen potasyum kanallarının rolü araştırılmıştır. Bu çalışmada 30 dakikalık bölgesel iskemiyi takiben 120 dakika reperfüzyon öncesi TNF-α uygulanmış ve hız basınç ürünü, SVDSB ve infarkt alan ölçümleri yapılmıştır. Bu çalışmada bizim çalışmamıza uygun olarak mPTP kanal açıcısı atraktilosid (20 μM/litre), bizim çalışmamızdan farklı olarak reperfüzyon sırasında uygulanmıştır. Bu çalışmada Atraktilosid, TNF-α ve kalsiyum kanal açıcısı NS1619’un infarkt alanının büyüklüğünde yaptığı azaltmayı geri çevirmiştir. Bizim çalışmamızda da atraktilosid resveratrolün infarkt alanın büyüklüğünde oluşturduğu koruyucu etkiyi geri çevirmiştir. Bu çalışmada TNF-α ve NS1619, kontrol kalplerde iskemi-reperfüzyon sonrası artmış olan SVDSB’ını geri çevirmişlerdir. Atraktilosid gerek TNF-α nın gerekse NS1619’un SVDSB’ında yapmış olduğu bu koruyucu etkiyi ortadan kaldırmıştır [154]. Bizim çalışmamızda da atraktilosid resveratrolün SVDSB’ ında yapmış olduğu koruyucu etkiyi ortadan kaldırmıştır. 53 Gao ve arkadaşlarının izole sıçan kalbinde yaptıkları bir diğer çalışmada pueraria lobata bitkisinin kökünden elde edilen biyoaktif izoflovanoid olan puerarin bileşiğinin mitokondrial transmembran por ve/veya kanalları üzerinden oluşturduğu miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı üzerindeki etkilerini hem izole perfüze kalpte hem de izole ventriküler miyosit preparatlarında incelemişlerdir. Çalışmada puerarin iskemiden 5 dakika önce uygulanmıştır. Atraktilolosid (20 μM/L) reperfüzyonun ilk 20 dakikasında uygulanmıştır. Puerarinin iskemi-reperfüzyon sonrası kalbin bozulan hız basınç ürünü, SVDSB’ını, ±dP/dtmax değerlerini düzeltmiş ve atraktilosid bu düzeltmeyi ortadan kaldırmıştır. İzole ventriküler miyositlerinde yapılan deneylerde de atraktilosid puerarinin hücre ölümü ve mitokondrial membranın depolarizasyonu üzerinde yapmış olduğu düzeltmeyi geri çevirmiştir [155]. Bu çalışma gerek teknik olarak gerekse etkinliği araştırılan puerarinin kimyasal yapısı açısından bizim çalışmamızla büyük benzerlik göstermektedir. Zira bizim çalışmamızda kullandığımız resveratrolde flavonoid yapısındadır. Bizim çalışmamızda da resveratrolün iskemi-reperfüzyon hasarında oluşturduğu koruyucu etki atraktilosid tarafından ortadan kaldırmıştır. Bu çalışmada mPTP kanallarının hücre hasarındaki etkisinden yola çıkarak resveratrolün oluşturduğu kardiyak korumada mPTP kanallarının etkisinin olup olamadığını araştırdık. Atraktilosid doz bağımlı olarak resveratrolün oluşturduğu koruyucu etkiyi ortadan kaldırmıştır. 30µM ve 100µM dozlarda resveratrol’ün oluşturduğu koruyucu etkiyi ortadan kaldırırken, 3µM ve 10µM dozlarda bu etki gözlenmemiştir. 54 55 6. SONUÇ Araştırmamızda mPTP’nin resveratrolün miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarına karşı oluşturduğu koruyucu etkisindeki rolünü araştırdık. Çalışmamızın sonucunda infarkt alan, SVGB, SVDSB, ± dP/dtmax ve hız basınç ürünü değerlerini incelediğimizde; resveratrolün 10µM konsantrasyonda uygulanmasının kontrole göre anlamlı olarak koruyucu etkinliğinin olduğunu bulduk. Ayrıca resveratrol ile birlikte 30 µM ve 100 µM konsantrasyonda atraktilosid uygulamasının doz bağımlı bir şekilde resveratrolün infarkt alan, SVGB, SVDSB, ±dP/dtmax değerlerinde oluşturduğu korumayı anlamlı olarak azalttığını bulduk. Bu bulgular ışığında resveratrolün atraktilosidin indüklediği mPTP’nin açılmasını engellediği ve resveratrolün miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarına karşı oluşturduğu korumada mPTP‘nin rolü olduğunu söyleyebiliriz. Bu da bize resveratrol gibi mPTP açılmasını engelleyen ajanların miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının önlenmesinde ve/veya azaltılmasında kullanılabileceğini göstermektedir. 56 57 KAYNAKLAR 1. Ostadal, B. (2009). The past, the present and the future of experimental research on myocardial ischemia and protection. Pharmacological reports : PR 61, 3–12. 2. Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., and Minin, A. M. (2011). National Vital Statistics Reports Deaths : Final Data for 2009. 60. 3. Lloyd-Jones, D. M., Larson, M. G., Beiser, A., and Levy, D. (1999). Lifetime risk of developing coronary heart disease. Lancet 353, 89–92. 4. Go, A. S., Mozaffarian, D., Roger, V. L., Benjamin, E. J., Berry, J. D., Borden, W. B., Bravata, D. M., Dai, S., Ford, E. S., Fox, C. S., et al. (2013). Heart disease and stroke statistics--2013 update: a report from the American Heart Association. Circulation 127, e6–e245. 5. Boland, L. L., Folsom, A. R., Sorlie, P. D., Taylor, H. A., Rosamond, W. D., Chambless, L. E., and Cooper, L. S. (2002). Occurrence of unrecognized myocardial infarction in subjects aged 45 to 65 years (the ARIC study). The American Journal of Cardiology 90, 927–31. 6. Naderi, R., Imani, A., Faghihi, M., and Moghimian, M. (2010). Phenylephrine induces early and late cardioprotection through mitochondrial permeability transition pore in the isolated rat heart. The Journal of surgical research 164, e37–42. 7. Ross, A. M., Gibbons, R. J., Stone, G. W., Kloner, R. a., and Alexander, R. W. (2005). A Randomized, Double-Blinded, Placebo-Controlled Multicenter Trial of Adenosine as an Adjunct to Reperfusion in the Treatment of Acute Myocardial Infarction (AMISTAD-II). Journal of the American College of Cardiology 45, 1775–80. 8. Goy, J.-J., Eeckhout, E., Moret, C., Burnand, B., Vogt, P., Stauffer, J.-C., Hurni, M., Stumpe, F., Ruchat, P., von Segesser, L., et al. (1999). Five-Year Outcome in Patients With Isolated Proximal Left Anterior Descending Coronary Artery Stenosis Treated by Angioplasty or Left Internal Mammary Artery Grafting : A Prospective Trial. Circulation 99, 3255–9. 9. Li, Y., Whittaker, P., and Kloner, R. A. (1992). The transient nature of the effect of ischemic preconditioning on myocardial infarct size and ventricular arrhythmia. American Heart Journal 123, 346–53. 10. Hausenloy, D. (2003). The mitochondrial permeability transition pore: its fundamental role in mediating cell death during ischaemia and reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 35, 339–41. 58 11. Hausenloy, D. J., and Yellon, D. M. (2004). New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway. Cardiovascular research 61, 448–60. 12. Akkoç, H. (2008). Miyokardiyal İskemi Reperfüzyon Hasarı. Dicle Tıp Dergisi 35, 211–15. 13. Huffmyer, J., and Raphael, J. (2009). Physiology and pharmacology of myocardial preconditioning and postconditioning. Seminars in cardiothoracic and vascular anesthesia 13, 5–18. 14. Nakano, A., Cohen, M. V, and Downey, J. M. (2000). Ischemic preconditioning. Pharmacology & Therapeutics 86, 263–75. 15. Yellon, D. M., and Downey, J. M. (2003). Preconditioning the myocardium: from cellular physiology to clinical cardiology. Physiological reviews 83, 1113–51. 16. Iliodromitis, E. K., Lazou, A., and Kremastinos, D. T. (2007). Ischemic preconditioning: protection against myocardial necrosis and apoptosis. Vascular health and risk management 3, 629–37. 17. Vinten-Johansen, J., Yellon, D. M., and Opie, L. H. (2005). Postconditioning: a simple, clinically applicable procedure to improve revascularization in acute myocardial infarction. Circulation 112, 2085–8. 18. Laskey, W. K., and Schevchuck, A. (2013). Postconditioning during percutaneous coronary intervention in acute myocardial infarction: continued difficulty in translation. Circulation 128, 1858–60. 19. Staat, P., Rioufol, G., Piot, C., Cottin, Y., Cung, T. T., L’Huillier, I., Aupetit, J.F., Bonnefoy, E., Finet, G., André-Fouët, X., et al. (2005). Postconditioning the human heart. Circulation 112, 2143–8. 20. Toller, W., and Stranz, C. (2006). Levosimendan, a new inotropic and vasodilator agent. Anesthesiology. 21. Vinten-Johansen, J., Zhao, Z.-Q., Zatta, A. J., Kin, H., Halkos, M. E., and Kerendi, F. (2005). Postconditioning--A new link in nature’s armor against myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic research in cardiology 100, 295–310. 22. Kloner, R. a., Bolli, R., Marban, E., Reinlib, L., and Braunwald, E. (1998). Medical and Cellular Implications of Stunning, Hibernation, and Preconditioning : An NHLBI Workshop. Circulation 97, 1848–67. 23. Yellon, D. M., and Dana, A. (2000). The Preconditioning Phenomenon : A Tool for the Scientist or a Clinical Reality? Circulation Research 87, 543–50. 59 24. Renaud, S. C., Guéguen, R., Schenker, J., and d’Houtaud, A. (1998). Alcohol and mortality in middle-aged men from eastern France. Epidemiology (Cambridge, Mass.) 9, 184–8. 25. Chen, W.-P., Su, M.-J., and Hung, L.-M. (2007). In vitro electrophysiological mechanisms for antiarrhythmic efficacy of resveratrol, a red wine antioxidant. European journal of pharmacology 554, 196–204. 26. Chen, Y.-R., Yi, F.-F., Li, X.-Y., Wang, C.-Y., Chen, L., Yang, X.-C., Su, P.-X., and Cai, J. (2008). Resveratrol attenuates ventricular arrhythmias and improves the long-term survival in rats with myocardial infarction. Cardiovascular drugs and therapy / sponsored by the International Society of Cardiovascular Pharmacotherapy 22, 479–85. 27. Hall, J. J. E., Guyton, A. A. C., Missisipi, J., and Ph, D. (2011). Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology (12th Edn). 28. Koeppen, B. M., and Stanton, B. A. (2009). Berne and Levy Physiology, 6th Edition. 29. Cooper, G. M., and Hausman, R. E. (2004). The Cell: A Molecular Approach (ASM Press). 30. Fox, S. (2012). Human Physiology (McGraw-Hill Education). 31. Mulroney, S. E., and Myers, A. K. (2009). Netter’s Essential Physiology (SAUNDERS W B Company). 32. Roberts, R. (2006). Genomics and cardiac arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology 47, 9–21. 33. Vanhoutte, P. M., Rubanyi, G. M., Miller, V. M., and Houston, D. S. (1986). Modulation of vascular smooth muscle contraction by the endothelium. Annual review of physiology 48, 307–20. 34. Yellon, D. M., and Hausenloy, D. J. (2007). Myocardial Reperfusion Injury. New England Journal of Medicine 357, 1121–35. 35. Hausenloy, D. J., and Yellon, D. M. (2009). Preconditioning and postconditioning: underlying mechanisms and clinical application. Atherosclerosis 204, 334–41. 36. Anderson, W. A. D., Damjanov, I., and Kissane, J. M. (1996). Anderson&s pathology. 1 (Mosby). 37. Aksulu, H. E., Ercan, Z. S., and Türker, R. K. (1985). Further studies on the antiarrhythmic effect of iloprost. Archives internationales de pharmacodynamie et de thérapie 277, 223–34. 60 38. Kloner, E. B. and R. A. (1985). Myocardial Reperfusion: A Double-edged Sword? journal of clinical investication 76, 1713–19. 39. Jennings, R. B., Sommers, H. M., Smyth, G. A., Flack, H. A., and Linn, H. (1960). Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog. Archives of pathology 70, 68–78. 40. Kloner, R. a., and Jennings, R. B. (2001). Consequences of Brief Ischemia: Stunning, Preconditioning, and Their Clinical Implications: Part 1. Circulation 104, 2981–9. 41. Webster, K. A. (2012). Mitochondrial membrane permeabilization and cell death during myocardial infarction: roles of calcium and reactive oxygen species. Future cardiology 8, 863–84. 42. Sanada, S., Komuro, I., and Kitakaze, M. (2011). Pathophysiology of myocardial reperfusion injury : preconditioning , postconditioning , and translational aspects of protective measures. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 301, H1723–41. 43. Abdallah, Y., Gkatzoflia, a, Pieper, H., Zoga, E., Walther, S., Kasseckert, S., Schäfer, M., Schlüter, K. D., Piper, H. M., and Schäfer, C. (2005). Mechanism of cGMP-mediated protection in a cellular model of myocardial reperfusion injury. Cardiovascular research 66, 123–31. 44. Zweiers, J. L. (1988). Measurement of Superoxide-derived Free Radicals in the Reperfused Heart. The Journal of biological chemistry 263, 1353–7. 45. Reiter, R. J., and Tan, D.-X. (2003). Melatonin: a novel protective agent against oxidative injury of the ischemic/reperfused heart. Cardiovascular research 58, 10–9. 46. Verma, S. (2002). Fundamentals of Reperfusion Injury for the Clinical Cardiologist. Circulation 105, 2332–6. 47. Penna, C., Mancardi, D., Rastaldo, R., and Pagliaro, P. (2009). Cardioprotection: a radical view Free radicals in pre and postconditioning. Biochimica et biophysica acta 1787, 781–93. 48. Sumeray, M. S., Rees, D. D., and Yellon, D. M. (2000). Infarct size and nitric oxide synthase in murine myocardium. Journal of molecular and cellular cardiology 32, 35–42. 49. Tani, M., and Neely, J. R. (1989). Role of intracellular Na+ in Ca2+ overload and depressed recovery of ventricular function of reperfused ischemic rat hearts. Possible involvement of H+-Na+ and Na+-Ca2+ exchange. Circulation Research 65, 1045–56. 50. Kusuoka, H., Porterfield, J. K., Weisman, H. F., Weisfeldt, M. L., and Marban, E. (1987). Pathophysiology and pathogenesis of stunned myocardium. 61 Depressed Ca2+ activation of contraction as a consequence of reperfusioninduced cellular calcium overload in ferret hearts. The Journal of clinical investigation 79, 950–61. 51. Zikria, B. (1994). A biophysical approach: sealing of capillary leak by intravenous biodegradable macromolecules. Reperfusion Injuries and Clinical Capillary Leak Syndrome (Zikria BA, Oz MO, Carlson RW, Eds), Futura Publishing Co, Armonk, NY, 547–600. 52. Zhao, Z. Q., Nakamura, M., Wang, N. P., Wilcox, J. N., Shearer, S., Ronson, R. S., Guyton, R. a, and Vinten-Johansen, J. (2000). Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death. Cardiovascular research 45, 651–60. 53. Miura, T., and Tanno, M. (2012). The mPTP and its regulatory proteins: final common targets of signalling pathways for protection against necrosis. Cardiovascular research 94, 181–9. 54. Kim, J.-S., Jin, Y., and Lemasters, J. J. (2006). Reactive oxygen species, but not Ca2+ overloading, trigger pH- and mitochondrial permeability transitiondependent death of adult rat myocytes after ischemia-reperfusion. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 290, H2024–34. 55. Neves, L. a, Almeida, a P., Khosla, M. C., Campagnole-Santos, M. J., and Santos, R. a (1997). Effect of angiotensin-(1-7) on reperfusion arrhythmias in isolated rat hearts. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas médicas e biológicas / Sociedade Brasileira de Biofísica ... [et al.] 30, 801–9. 56. Akkoç, H. (2007). İskemik Önkoşullama Mekanizmaları. Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Dergisi 90, 165–76. 57. Yellon, D. M., Baxter, G. F., Garcia-Dorado, D., Heusch, G., and Sumeray, M. S. (1998). Ischaemic preconditioning: present position and future directions. Cardiovascular research 37, 21–33. 58. Murry, C. E., Jennings, R. B., and Reimer, K. A. (1986). Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation 74, 1124–36. 59. Przyklenk, K., Bauer, B., Ovize, M., Kloner, R. a., and Whittaker, P. (1993). Regional ischemic “preconditioning” protects remote virgin myocardium from subsequent sustained coronary occlusion. Circulation 87, 893–9. 60. Lawson, C. S., and Downey, J. M. (1993). Preconditioning: state of the art myocardial protection. Cardiovascular Research 27, 542–50. 61. Roberta A. Gottlieb, Donna L. Gruol, Jessica Y. Zhu, and R. L. E. (1996). Preconditioning in Rabbit Cardiomyocytes Role of pH, Vacuolar Proton ATPase, and Apoptosis. The Journal of clinical investigation 97, 2391–8. Hacettepe 62 62. Hagar, J. M., Hale, S. L., and Kloner, R. a. (1991). Effect of preconditioning ischemia on reperfusion arrhythmias after coronary artery occlusion and reperfusion in the rat. Circulation Research 68, 61–8. 63. Shiki, K., and Hearse, D. J. (1987). Preconditioning of ischemic myocardium: reperfusion-induced arrhythmias. The American journal of physiology 253, H1470–6. 64. Sun, J. Z., Tang, X. L., Knowlton, a a, Park, S. W., Qiu, Y., and Bolli, R. (1995). Late preconditioning against myocardial stunning. An endogenous protective mechanism that confers resistance to postischemic dysfunction 24 h after brief ischemia in conscious pigs. The Journal of clinical investigation 95, 388–403. 65. DeFily, D. V, and Chilian, W. M. (1993). Preconditioning protects coronary arteriolar endothelium from ischemia-reperfusion injury. The American journal of physiology 265, H700–6. 66. Richard, V., Kaeffer, N., Tron, C., and Thuillez, C. (1994). Ischemic preconditioning protects against coronary endothelial dysfunction induced by ischemia and reperfusion. Circulation 89, 1254–61. 67. Cutrn, J. C., Perrelli, M.-G., Cavalieri, B., Peralta, C., Rosell Catafau, J., and Poli, G. (2002). Microvascular dysfunction induced by reperfusion injury and protective effect of ischemic preconditioning. Free Radical Biology and Medicine 33, 1200–8. 68. Carroll, R., and Yellon, D. M. (1999). Myocardial adaptation to ischaemia – the preconditioning phenomenon. International Journal of Cardiology 68, S93–S101. 69. Schulz, R., Cohen, M. V, Behrends, M., Downey, J. M., and Heusch, G. (2001). Signal transduction of ischemic preconditioning. Cardiovascular research 52, 181–98. 70. Li, G. C., Vasquez, J. a., Gallagher, K. P., and Lucchesi, B. R. (1990). Myocardial protection with preconditioning. Circulation 82, 609–19. 71. Barbosa, V., Sievers, R. E., Zaugg, C. E., and Wolfe, C. L. (1996). Preconditioning ischemia time determines the degree of glycogen depletion and infarct size reduction in rat hearts. American heart journal 131, 224–30. 72. Schulz, R., Post, H., Vahlhaus, C., and Heusch, G. (1998). Ischemic Preconditioning in Pigs: A Graded Phenomenon : Its Relation to Adenosine and Bradykinin. Circulation 98, 1022–9. 73. Sandhu, R., Diaz, R. J., Mao, G. D., and Wilson, G. J. (1997). Ischemic Preconditioning : Differences in Protection and Susceptibility to Blockade With Single-Cycle Versus Multicycle Transient Ischemia. Circulation 96, 984–95. 63 74. Cohen, M. V., Yang, X.-M., Liu, G. S., Heusch, G., and Downey, J. M. (2001). Acetylcholine, Bradykinin, Opioids, and Phenylephrine, but not Adenosine, Trigger Preconditioning by Generating Free Radicals and Opening Mitochondrial KATP Channels. Circulation Research 89, 273–8. 75. İ. Şengül, D. Şengül Review, D. (2012). İskemik Ön Koşullanma ve Sonradan Koşullanma Mekanizmalarından Biri Olarak Kalsiyum. DÜZCE TIP DERGİSİ 14, 74–9. 76. İ. Şengül, D. Şengül Review, D. (2012). Place of Mitochondrial PotassiumATP Channels in The Mechanism of Effect of Ischemic Conditionings. Journal of Clinical and Analytical Medicine 3, 370–3. 77. Pagliaro, P., Gattullo, D., Rastaldo, R., and Losano, G. (2001). Ischemic preconditioning: from the first to the second window of protection. Life sciences 69, 1–15. 78. Kandilci HB, G. B. (2005). Akciğerlerde İskemi-Reperfüzyon Hasarı ve İskemik Önkoşullama. Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi 1, 35–49. 79. O’Rourke, B. (2000). Myocardial KATP Channels in Preconditioning. Circulation Research 87, 845–55. 80. Kowaltowski, A. J., Seetharaman, S., Paucek, P., Garlid, K. D., Alicia, J., and Bioenergetic, K. D. G. (2001). Bioenergetic consequences of opening the ATP-sensitive K ϩ channel of heart mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 8921, 649–57. 81. Csonka, C., Csont, T., Onody, A., and Ferdinandy, P. (2001). Preconditioning decreases ischemia/reperfusion-induced peroxynitrite formation. Biochemical and biophysical research communications 285, 1217–9. 82. Williams, M. W., Taft, C. S., Ramnauth, S., Zhao, Z. -q., and Vinten-Johansen, J. (1995). Endogenous nitric oxide (NO) protects against ischaemiareperfusion injury in the rabbit. Cardiovascular Research 30, 79–86. 83. Pagliaro, P., Penna, C., and Gattullo, D. (1999). The effects of ischemic preconditioning on resting coronary flow and reactive hyperemia: involvement of A1 adenosine receptors. Life sciences 64, 1071–8. 84. Zhao, Z.-Q., Corvera, J. S., Halkos, M. E., Kerendi, F., Wang, N.-P., Guyton, R. a, and Vinten-Johansen, J. (2003). Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 285, H579–88. 85. TÜ., G. (2006). Alt Ekstremite İskelet Kasında İskemi/Reperfüzyon Hasarı Üzerine İskemik Önkoşullama Ve İskemik Ardkoşullamanın Etkisinin Rat 64 Modelinde Araştırılması. Üniversitesi; Uzmanlık Tezi. Aydın: Aydın Menderes 86. SO., K. (1993). Tıbbi Farmakoloji. 6. Baskı(cilt 13), Ankara: Feryal Basımevi; 87. Kin, H., Zatta, A. J., Lofye, M. T., Amerson, B. S., Halkos, M. E., Kerendi, F., Zhao, Z.-Q., Guyton, R. A., Headrick, J. P., and Vinten-Johansen, J. (2005). Postconditioning reduces infarct size via adenosine receptor activation by endogenous adenosine. Cardiovascular research 67, 124–33. 88. Xu, Z., Yang, X. M., Cohen, M. V, Neumann, T., Heusch, G., and Downey, J. M. (2000). Limitation of infarct size in rabbit hearts by the novel adenosine receptor agonist AMP 579 administered at reperfusion. Journal of molecular and cellular cardiology 32, 2339–47. 89. Costa, A. D. T., Jakob, R., Costa, C. L., Andrukhiv, K., West, I. C., and Garlid, K. D. (2006). The mechanism by which the mitochondrial ATP-sensitive K+ channel opening and H2O2 inhibit the mitochondrial permeability transition. The Journal of biological chemistry 281, 20801–8. 90. Jabůrek, M., Costa, A. D. T., Burton, J. R., Costa, C. L., and Garlid, K. D. (2006). Mitochondrial PKC epsilon and mitochondrial ATP-sensitive K+ channel copurify and coreconstitute to form a functioning signaling module in proteoliposomes. Circulation research 99, 878–83. 91. Andrukhiv, A., Costa, A. D., West, I. C., and Garlid, K. D. (2006). Opening mitoKATP increases superoxide generation from complex I of the electron transport chain. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 291, H2067–74. 92. Riepe, M. W., and Ludolph, A. C. (1997). Chemical preconditioning: a cytoprotective strategy. Molecular and cellular biochemistry 174, 249–54. 93. Horiguchi, T., Kis, B., Rajapakse, N., Shimizu, K., and Busija, D. W. (2003). Opening of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels is a trigger of 3nitropropionic acid-induced tolerance to transient focal cerebral ischemia in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation 34, 1015–20. 94. Turan, N., Csonka, C., Csont, T., Giricz, Z., Fodor, G., Bencsik, P., Gyöngyösi, M., Cakici, I., and Ferdinandy, P. (2006). The role of peroxynitrite in chemical preconditioning with 3-nitropropionic acid in rat hearts. Cardiovascular research 70, 384–90. 95. Turan, N. N., Basgut, B., Aypar, E., Ark, M., Iskit, A. B., and Cakici, I. (2008). Chemical preconditioning effect of 3-nitropropionic acid in anesthetized rat heart. Life sciences 82, 928–33. 65 96. Evrengül H, Turhan H, T. H. (2005). İskemik Ön koşullamanın Antiaritmik Etkisi ve Klinik önemi. Türk Aritmi, Pacemaker ve Elektrofizyoloji Dergisi 3, 98–106. 97. Hsu, A., and Gross, J. (2004). Opioid induced cardioprotection occurs via glycogen synthase kinase beta inhibition during reperfusion in intact rat heart. Circulation research 94, 960–6. 98. Wiegant, F. a C., Prins, H. a B., and Van Wijk, R. (2011). Postconditioning hormesis put in perspective: an overview of experimental and clinical studies. Dose-response : a publication of International Hormesis Society 9, 209– 24. 99. Kurian, G. A., and Paddikkala, J. (2012). Methanol extract of Desmodium gangeticum DC root mimetic post-conditioning effect in isolated perfused rat heart by stimulating muscarinic receptors. Asian Pacific journal of tropical medicine 5, 448–54. 100. Huang, Z., Zhong, X., Irwin, M. G., Ji, S., Wong, G. T., Liu, Y., Xia, Z.-Y., Finegan, B. a, and Xia, Z. (2011). Synergy of isoflurane preconditioning and propofol postconditioning reduces myocardial reperfusion injury in patients. Clinical science (London, England : 1979) 121, 57–69. 101. Penna, C., Perrelli, M.-G., Tullio, F., Moro, F., Parisella, M. L., Merlino, A., and Pagliaro, P. (2011). Post-ischemic early acidosis in cardiac postconditioning modifies the activity of antioxidant enzymes, reduces nitration, and favors protein S-nitrosylation. Pflügers Archiv : European journal of physiology 462, 219–33. 102. Penna, C., Perrelli, M.-G., Tullio, F., Angotti, C., Camporeale, A., Poli, V., and Pagliaro, P. (2013). Diazoxide postconditioning induces mitochondrial protein S-Nitrosylation and a redox-sensitive mitochondrial phosphorylation/translocation of RISK elements: no role for SAFE. Basic research in cardiology 108, 371. 103. Penna, C., Angotti, C., and Pagliaro, P. (2014). Protein S-nitrosylation in preconditioning and postconditioning. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J.) online, 1–16. 104. Obal, D., Dettwiler, S., Favoccia, C., Scharbatke, H., Preckel, B., and Schlack, W. (2005). The influence of mitochondrial KATP-channels in the cardioprotection of preconditioning and postconditioning by sevoflurane in the rat in vivo. Anesthesia and analgesia 101, 1252–60. 105. Ebner, B., Ebner, A., Reetz, A., Böhme, S., Schauer, A., Strasser, R. H., and Weinbrenner, C. (2013). Pharmacological postconditioning by bolus injection of phosphodiesterase-5 inhibitors vardenafil and sildenafil. Molecular and cellular biochemistry 379, 43–9. 66 106. Santiago Garcia, Q. I. (2013). Myocardial Protection through Pre- and PostConditioning: A Review of Mechanisms, Clinical Trials and Future Directions. Journal of Cardiovascular Diseases & Diagnosis 01, 1–5. 107. Lee, J. W., Shim, Y. H., and Halestrap, A. P. (2009). Mitochondrial Permeability Transition Pore and Cardioprotection Against Ischemiareperfusion Injury. Journal of the Korean Medical Association 52, 1007– 19. 108. Halestrap, A. P. (2009). Mitochondria and reperfusion injury of the heart--a holey death but not beyond salvation. Journal of bioenergetics and biomembranes 41, 113–21. 109. Quiñones, M., Miguel, M., and Aleixandre, A. (2013). Beneficial effects of polyphenols on cardiovascular disease. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society 68, 125–31. 110. De la Lastra, C. A., and Villegas, I. (2007). Resveratrol as an antioxidant and pro-oxidant agent: mechanisms and clinical implications. Biochemical Society transactions 35, 1156–60. 111. Das, S., Cordis, G. A., Maulik, N., and Das, D. K. (2005). Pharmacological preconditioning with resveratrol: role of CREB-dependent Bcl-2 signaling via adenosine A3 receptor activation. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 288, H328–35. 112. Kiziltepe, U., Turan, N. N. D., Han, U., Ulus, a T., and Akar, F. (2004). Resveratrol, a red wine polyphenol, protects spinal cord from ischemiareperfusion injury. Journal of vascular surgery 40, 138–45. 113. Chen, C. K., and Pace-Asciak, C. R. (1996). Vasorelaxing activity of resveratrol and quercetin in isolated rat aorta. General pharmacology 27, 363–6. 114. Rakici, O., Kiziltepe, U., Coskun, B., Aslamaci, S., and Akar, F. (2005). Effects of resveratrol on vascular tone and endothelial function of human saphenous vein and internal mammary artery. International journal of cardiology 105, 209–15. 115. Orallo, F., Alvarez, E., Camiña, M., Leiro, J. M., Gómez, E., and Fernández, P. (2002). The possible implication of trans-Resveratrol in the cardioprotective effects of long-term moderate wine consumption. Molecular pharmacology 61, 294–302. 116. Coskun, B., Soylemez, S., Parlar, A. I., Tulga Ulus, A., Fehmi Katircioglu, S., and Akar, F. (2006). Effect of resveratrol on nitrate tolerance in isolated human internal mammary artery. Journal of cardiovascular pharmacology 47, 437–45. 67 117. Lin, C.-J., Chen, T.-H., Yang, L.-Y., and Shih, C.-M. (2014). Resveratrol protects astrocytes against traumatic brain injury through inhibiting apoptotic and autophagic cell death. Cell death & disease 5, e1147. 118. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M., Mani-Babu, S., and Duchen, M. R. (2004). Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 287, H841–9. 119. Husainy, M. A., Dickenson, J. M., and Galiñanes, M. (2012). The MPTP status during early reoxygenation is critical for cardioprotection. The Journal of surgical research 174, 62–72. 120. Crompton, M., Virji, S., Doyle, V., Johnson, N., and Ward, J. M. (1999). The mitochondrial permeability transition pore. Biochemical Society symposium 66, 167–79. 121. Di Lisa, F., Menabò, R., Canton, M., Barile, M., and Bernardi, P. (2001). Opening of the mitochondrial permeability transition pore causes depletion of mitochondrial and cytosolic NAD+ and is a causative event in the death of myocytes in postischemic reperfusion of the heart. The Journal of biological chemistry 276, 2571–5. 122. Malekova, L., Kominkova, V., Ferko, M., Stefanik, P., Krizanova, O., Ziegelhöffer, A., Szewczyk, A., and Ondrias, K. (2007). Bongkrekic acid and atractyloside inhibits chloride channels from mitochondrial membranes of rat heart. Biochimica et biophysica acta 1767, 31–44. 123. Park, S.-S., Zhao, H., Jang, Y., Mueller, R. A., and Xu, Z. (2006). N6-(3iodobenzyl)-adenosine-5’-N-methylcarboxamide confers cardioprotection at reperfusion by inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening via glycogen synthase kinase 3 beta. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 318, 124–31. 124. Halestrap, A. P., Clarke, S. J., and Javadov, S. a (2004). Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion--a target for cardioprotection. Cardiovascular research 61, 372–85. 125. Yadav, H. N., Singh, M., and Sharma, P. L. (2010). Modulation of the cardioprotective effect of ischemic preconditioning in hyperlipidaemic rat heart. European journal of pharmacology 643, 78–83. 126. Wang, L., Cherednichenko, G., Hernandez, L., Halow, J., Camacho, S. A., Figueredo, V., and Schaefer, S. (2001). Preconditioning limits mitochondrial Ca2+ during ischemia in rat hearts: role of KATP channels. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280, H2321–8. 127. Ulker, S., McKeown, P. P., and Bayraktutan, U. (2002). Aprotinin impairs coronary endothelial function and down-regulates endothelial NOS in rat 68 coronary microvascular endothelial cells. Cardiovascular research 55, 830– 7. 128. Dolinsky, V. W., Rogan, K. J., Sung, M. M., Zordoky, B. N., Haykowsky, M. J., Young, M. E., Jones, L. W., and Dyck, J. R. B. (2013). Both aerobic exercise and resveratrol supplementation attenuate doxorubicin-induced cardiac injury in mice. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 305, E243–53. 129. Pınarlı, F. A., Turan, N. N., Pınarlı, F. G., Okur, A., Sönmez, D., Ulus, T., Oğuz, A., Karadeniz, C., and Delibaşı, T. (2013). Resveratrol and adiposederived mesenchymal stem cells are effective in the prevention and treatment of doxorubicin cardiotoxicity in rats. Pediatric hematology and oncology 30, 226–38. 130. Militaru, C., Donoiu, I., Craciun, A., Scorei, I. D., Bulearca, A. M., and Scorei, R. I. (2013). Oral resveratrol and calcium fructoborate supplementation in subjects with stable angina pectoris: effects on lipid profiles, inflammation markers, and quality of life. Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif.) 29, 178–83. 131. Kroemer, G., Galluzzi, L., and Brenner, C. (2007). Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiological reviews 87, 99–163. 132. Di Lisa, F., Canton, M., Menabò, R., Kaludercic, N., and Bernardi, P. (2007). Mitochondria and cardioprotection. Heart failure reviews 12, 249–60. 133. Murphy, E., and Steenbergen, C. (2008). Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiological reviews 88, 581–609. 134. Clarke, S. J., McStay, G. P., and Halestrap, A. P. (2002). Sanglifehrin A acts as a potent inhibitor of the mitochondrial permeability transition and reperfusion injury of the heart by binding to cyclophilin-D at a different site from cyclosporin A. The Journal of biological chemistry 277, 34793–9. 135. Baines, C. P., Kaiser, R. A., Purcell, N. H., Blair, N. S., Osinska, H., Hambleton, M. A., Brunskill, E. W., Sayen, M. R., Gottlieb, R. A., Dorn, G. W., et al. (2005). Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death. Nature 434, 658–62. 136. Hausenloy, D. (2003). Inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening at reperfusion protects against ischaemia–reperfusion injury. Cardiovascular Research 60, 617–25. 137. Nakayama, H., Chen, X., Baines, C. P., Klevitsky, R., Zhang, X., Zhang, H., Jaleel, N., Chua, B. H. L., Hewett, T. E., Robbins, J., et al. (2007). Ca2+- and mitochondrial-dependent cardiomyocyte necrosis as a primary mediator of heart failure. The Journal of clinical investigation 117, 2431–44. 69 138. Oliveira, P. J., Seiça, R., Coxito, P. M., Rolo, A. P., Palmeira, C. M., Santos, M. S., and Moreno, A. J. M. (2003). Enhanced permeability transition explains the reduced calcium uptake in cardiac mitochondria from streptozotocininduced diabetic rats. FEBS letters 554, 511–4. 139. Millay, D. P., Sargent, M. A., Osinska, H., Baines, C. P., Barton, E. R., Vuagniaux, G., Sweeney, H. L., Robbins, J., and Molkentin, J. D. (2008). Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrial-dependent necrosis attenuates muscular dystrophy. Nature medicine 14, 442–7. 140. Kerkelä, R., Grazette, L., Yacobi, R., Iliescu, C., Patten, R., Beahm, C., Walters, B., Shevtsov, S., Pesant, S., Clubb, F. J., et al. (2006). Cardiotoxicity of the cancer therapeutic agent imatinib mesylate. Nature medicine 12, 908– 16. 141. Rodríguez-Sinovas, A., Abdallah, Y., Piper, H. M., and Garcia-Dorado, D. (2007). Reperfusion injury as a therapeutic challenge in patients with acute myocardial infarction. Heart failure reviews 12, 207–16. 142. Halestrap, A. P. (2010). A pore way to die: the role of mitochondria in reperfusion injury and cardioprotection. Biochemical Society transactions 38, 841–60. 143. Miura, T., Tanno, M., and Sato, T. (2010). Mitochondrial kinase signalling pathways in myocardial protection from ischaemia/reperfusion-induced necrosis. Cardiovascular research 88, 7–15. 144. Di Lisa, F., and Bernardi, P. (2006). Mitochondria and ischemia-reperfusion injury of the heart: fixing a hole. Cardiovascular research 70, 191–9. 145. Borutaite, V., and Brown, G. C. (2003). Mitochondria in apoptosis of ischemic heart. FEBS letters 541, 1–5. 146. Crompton, M., Costi, A., and Hayat, L. (1987). Evidence for the presence of a reversible Ca2+-dependent pore activated by oxidative stress in heart mitochondria. The Biochemical journal 245, 915–8. 147. Griffiths, E. J., and Halestrap, A. P. (1995). Mitochondrial non-specific pores remain closed during cardiac ischaemia, but open upon reperfusion. The Biochemical journal 307 ( Pt 1, 93–8. 148. Halestrap, A. P., Kerr, P. M., Javadov, S., and Woodfield, K. Y. (1998). Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart. Biochimica et biophysica acta 1366, 79–94. 149. Peixoto, P. M., Ryu, S.-Y., and Kinnally, K. W. (2010). Mitochondrial ion channels as therapeutic targets. FEBS letters 584, 2142–52. 70 150. Nakagawa, T., Shimizu, S., Watanabe, T., Yamaguchi, O., Otsu, K., Yamagata, H., Inohara, H., Kubo, T., and Tsujimoto, Y. (2005). Cyclophilin Ddependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death. Nature 434, 652–8. 151. Argaud, L., Gateau-Roesch, O., Muntean, D., Chalabreysse, L., Loufouat, J., Robert, D., and Ovize, M. (2005). Specific inhibition of the mitochondrial permeability transition prevents lethal reperfusion injury. Journal of molecular and cellular cardiology 38, 367–74. 152. Duan, X., Ji, B., Yu, K., Liu, J., Hei, F., and Long, C. (2011). Pharmacological postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury: the role of mitochondrial permeability transition pore. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992) 57, 197–202. 153. Duan, X., Ji, B., Yu, K., Hei, F., Liu, J., and Long, C. (2011). Acidic buffer or plus cyclosporine a postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury. Perfusion 26, 245–52. 154. Gao, Q., Zhang, S.-Z., Cao, C.-M., Bruce, I. C., and Xia, Q. (2005). The mitochondrial permeability transition pore and the Ca2+-activated K+ channel contribute to the cardioprotection conferred by tumor necrosis factor-alpha. Cytokine 32, 199–205. 155. Gao, Q., Pan, H.-Y., Qiu, S., Lu, Y., Bruce, I. C., Luo, J.-H., and Xia, Q. (2006). Atractyloside and 5-hydroxydecanoate block the protective effect of puerarin in isolated rat heart. Life sciences 79, 217–24. 71 EKLER 72 EK-1. Etik Kurul İzni 73 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : CEBE, Gürhan Uyruğu : T.C. Doğum tarihi ve yeri : 17.03.1976, Ankara Medeni hali : Evli Telefon : 0 (312) 585 68 62 Mobil : 0 (533) 277 27 38 e-posta : gurhan.cebe@saglik.gov.tr Eğitim Derece Eğitim Birimi Yüksek Lisans Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Mezuniyet tarihi Enstitüsü/Farmakoloji Devam Ediyor Lisans Ankara Üniversitesi/Eczacılık 1999 Lise TED Ankara Koleji 1994 İş Deneyimi Yıl 03.2015 - Halen Yer Türkiye İlaç ve Tıbbi cihaz Kurumu Görev Eczacı 03.2014 - 03.2015 Sağlık Araştırmaları Genel Müdürlüğü Eczacı 02.2012 - 03.2014 Türkiye İlaç ve Tıbbi cihaz Kurumu Eczacı 09.2010 - 02.2012 Ankara Numune Eğitim ve Ar. Has. Eczacı 02.2010 - 09.2010 Kırıkkale Haci Hidayet Doğruer KDHÇHH Eczacı 03.2009 - 02.2010 Keskin Devlet Hastanesi Eczacı 04.2008 - 03.2009 Anatolia İlaç ve Sağlık Ürünleri LTD Medikal Müdür 01.2002 - 06.2006 Servier İlaç ve Araştırma AŞ Medikal Delege 03.2001 - 01.2002 Türk Ecacıları Birliği Eczacı 74 Yabancı Dil İngilizce Yayınlar 1. Ardic, G., Cebe, G., & Turan, N. N. (2013). Cardioprotective Mechanism of Resveratrol: Mitochondrial Permeability Transition Pore. The FASEB Journal,27(1_MeetingAbstracts), 652-15. Hobiler Müzik, bilgisayar teknolojileri, bas gitar GAZİ GELECEKTİR...
