TC ANKARA ÜN VERS TES BL MSEL ARAŞTIRMA PROJES KES N
advertisement
T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU KARADENİZ BÖLGESİ SIĞIRLARININ SİDİK KESESİ TÜMÖRLERİNDE PATOMORFOLOJİK VE İMMUNOPATOLOJİK İNCELEMELER Proje Yöneticisi Prof. Dr. İ. AYHAN ÖZKUL Yardımcı Araştırıcılar Doç. Dr. Sevil Atalay VURAL Dr. Ziya HİÇYILMAZ Arş. Gör. Dr. Hikmet KELEŞ PROJE NO:BAP-2004-0810-067 BAŞLAMA TARİHİ: Temmuz 2004 BİTİŞ TARİHİ: Eylül 2007 RAPOR TARİHİ: Ekim 2007 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara-“2007” İÇİNDEKİLER Sayfa I. Türkçe ve İngilizce Özet 1-2 II. Amaç ve Kapsam 3 III. Materyal ve Yöntem 4 IV. Bulgular 6 V. Sonuç ve Öneriler 10 VI. Kaynaklar 18 VII.Ekler 22 VIII. Resimler 23 I. ÖZET Karadeniz Bölgesi Sığırlarının Sidik Kesesi Tümörlerinde Patomorfolojik ve İmmunopatolojik İncelemeler Çalışmada Karadeniz ve Marmara Bölgesinin çeşitli il ve ilçelerinden sağlanan enzootik hematürili sığırların sidik keselerinde histopatolojik olarak saptanan, proliferatif ve tümöral değişikliklerin bazı tümör belirteçleri ile vermiş olduğu reaksiyonların saptanması; bu hayvanlarda transisyonel epitelde sık görülen ve tanısında güçlük çekilen hiperplazi ile papillom arasındaki ayırımının yapılması ve prekanseröz değişikliklerin saptanması amaçlanmıştır. Bu amaçla değişik ırk ve cinsiyette 223 adet tümör şüpheli sidik kesesi kullanıldı. Histopatolojik incelemeler sonucunda bu keselerin 181’inde tümöre rastlandı. Keselerin 29’unda epitelyal yada mezenkimal tipte tek bir tümör gözlenirken 152 kesede epitelyal ve/veya mezenkimal kökenli birden fazla tümörün bulunduğu dikkati çekti. Bu keselerin 38’inde epitelyal, 71’inde mezenşimal, 72’sinde ise hem epitelyal hem de mezenşimal kökenli tümörler saptandı. Tanımlanan tümörler çoğunlukla sidik kesesinin korpusuna, daha sonra da sırasıyla kesenin trigonumuna, lateral duvarına ve verteksine lokalize olmuştu. Epitelyal kökenli olan benign tümörlerin 96’sı papillom, malign tümörlerin ise 47’si transisyonel hücreli kanser (TCC) idi. Mezenşimal kökenli olan benign tümörlerin 81’i fibrom, malign tümörlerin ise 24’ü hemangiosarkomdan ibaretti. İmmunohistolojik incelemelerde; histopatolojik incelemeler sırasında normal ve hiperplazik transisyonel epitel, epitelyal kökenli tümörlerden papillom, karsinoma insitu ve pagetoid hücreli tümör olgularının ayırımında URO 9, URO 10, p53 ve sitokeratinden; damarlaşma ve damar dokusu tümörleri için VEGF ve Faktör VIII’den yararlanıldı. Epitelyal kökenli olan tümörler URO 10, p53 protein ve CK20 reagenzleri ile, mezenşimal kökenli olanlar ise bilhassa VEGF ve faktör VIII reagenzleri ile boyandı. Hiperplazi ve papillom tanılı keselerde URO 10 ile pozitif URO 9 ile negatif boyanmaların elde edilmesi sonucunda bunlar kanser olarak değerlendirildi. Anahtar Sözcükler : İmmunohistokimya, patoloji, sığır, sidik kesesi, tümör 1 II. SUMMARY Pathomorphological and Immunohistochemical Studies of Tumors of the Urinary Bladder in Cattle in the Black Sea Region of Turkey It was evaluated at bovine urinary bladder with enzootic hematuria obtained from some cities and provinces in Blacksea and Marmara regions slaughterhouses in the study. It was aimed that detection of proliferative and neoplastic changes with some tumor reagents and also making a differentiation between normal epithelium, hyperplasic epithelium and papillom. It was used 223 urinary bladders on different breed, age and sex. It was encountered to tumors histopathologically in 181 of the bladders. While 29 of them were only seen on one type (epithelial-38 cases or mesenchimal-71 cases) tumor, 152 of them were seen on more type (epithelial and/or mesenchymal type, 72 cases) tumors. The tumors were generally localized in corpus, respectively the others, in trigonum, lateral side and vertex of urinary bladder. The 96 of epithelial benign tumors were papillom and 47 of epithelial malign tumors were Transitional Cell Tumor (TCC). The 81 of mesenchymal benign tumors were fibrom and the 24 of mesenchymal malign tumors were hemangiosarcomas. Immunohistologically, it was made the distinction of normal and hyperplasic transitional epithelium, papillom, in situ carcinoma and pagetoid cell tumors by using URO 9, URO 10, p53 and cytokeratins (CK7 and 20). It was also applied to detect the vascularisation and the tumors of blood vessels by using Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Factor VIII. The epithelial type tumors were immunopositive using antibodies againts URO 10, p53 protein and CK 20. The mesenchymal types were immunopositive with VEGF and Factor VIII and they were evaluated as cancer. The urinary bladders diagnosed as hyperplasia and papillom, were negative stained with URO 10 on contrary to URO 9. Key Words: Cattle, immunohistochemistry, pathology, tumor, urinary bladder 2 II. AMAÇ VE KAPSAM Sığırların sidik kesesi tümörleri çoğunlukla kronik enzootik hematüri (hematüria vesicalis bovis, hematüria cancerogenes bovis) olarak bilinen sidik kesesinde kanama, persiste anemi ve hematüri ile karakterize bir sendromla birlikte görülür (Pamukçu, 1957; Pamukçu, 1974; Maxie, 1985; Özkul ve Aydın, 1996). Hematüri, dünyanın hemen her tarafında özellikle de eğrelti otunun (Pteridium aquilinum) yetiştiği yerlerde ve sıklıkla iki yaşın üzerindeki sığırlarda gözlenir (Pamukçu, 1955; Pamukçu, 1963; Pamukçu ve ark., 1966; Pamukçu, 1974; Pamukçu ve Bryan, 1976; Maxie, 1985). Hayvanlar bu otu ilkbaharda merada diğer otlarla, kış aylarında ise ya samanla birlikte ya da yataklık olarak kullanıldığında yiyerek tüketirler (Göksoy, 1966). Doğal olgularda sidik kesesinde tümörlerin oluşabilmesi için eğrelti otunun az miktarlarda (2 gr/kg) ve uzun süreli alınması gerektiği ortaya çıkmıştır (Pamukçu, 1955; Pamukçu ve Bryan, 1976). Az miktarlarda uzun süreyle eğrelti otu tüketen hayvanlarda proliferatif ve tümöral değişiklikler şekillenmektedir. Şekillenen tümörlerin lokalizasyonu ve tipleri farklılık göstermekte; bazen bir hayvanda sidik kesesinin farklı bölgelerinde lokalize olan birden fazla sayıda ve farklı tipte mezenşimal ya da epitelyal kökenli tümörlere de rastlanabilmektedir (Pamukçu, 1957; Kotliar ve ark., 1995; Özkul ve Aydın, 1996; Soslow ve ark., 1996). Yurdumuzda özellikle Karadeniz’e kıyısı olan ve Kırklareli’den Rize’ye kadar uzanan illerde doğal bitki örtüsü olarak bulunan eğrelti otuna bağlı olarak gelişen hastalık ilk kez Esin ve Artun (1949) tarafından bildirilmiş, daha sonra çeşitli araştırıcılar (Akçay, 1949; Altan ve Esin, 1950; Pamukçu, 1963; Özkul ve Aydın, 1996) tarafından detaylı olarak değerlendirilmiştir. İnsanlarda nedeni bilinmeyen sidik kesesi tümörleri sıklıkla şekillenmekte, bu tümörlerin biyolojik gelişimleri ise alışılan histopatolojik görünümlerle tahmin edilememektedir. Bu nedenle, diğer sistem tümörlerinde de kullanılan, immunohistokimyasal incelemelerle sidik kesesi tümörlerinde hücre proliferasyon aktiviteleri ya da hücre siklusu düzenleyicisi olan proteinler veya tümör tiplerini ayırt etme immunhistolojik reagenzlerle saptanmaktadır (Kotliar ve ark., 1995; Soslow ve ark., 1996; Foresman ve Messing, 1997; Inagaki ve ark., 1997; Tsuji ve ark., 1997; 3 Borzacchiello ve ark., 2001). Ayrıca, bunlarla tümörün derecelendirilmesi yapılmakta, prognozu tahmin edilebilmekte (Inagaki ve ark., 1997; Tsuji ve ark., 1997) ve elde edilen sonuçlara göre de uygun tedavi yöntemleri uygulanarak hastanın yaşam kalitesi artırılabilmektedir. Veteriner Hekimlikte ise bilhassa Yurdumuzda farklı sistem tümörlerinde, bazı özel çalışmalar dışında, rutin immunohistokimyasal boyamalar ve bunların sonucunda tümörlerin derecelendirilmesi ve prognozu hakkında yorumlama yapılmamaktadır. Bu çalışmada Karadeniz ve Marmara Bölgesi’nin çeşitli il ve ilçelerinden sağlanan enzootik hematürili sığırların sidik keselerinde histopatolojik olarak saptanan, proliferatif ve tümöral değişikliklerin bazı tümör belirteçleri ile vermiş olduğu reaksiyonların saptanması; bu hayvanlarda transisyonel epitelde sık görülen ve tanısında güçlük çekilen hiperplazi ile papillom ve prekanseröz değişiklikler arasındaki ayırımının yapılması amaçlanmıştır. III. MATERYAL VE YÖNTEM III.1. Materyal Çalışmanın materyali; Rize, Trabzon, Giresun, Ordu, Samsun, Sinop, Kastamonu, Bartın, Zonguldak, Karabük, Adapazarı, İzmit, İstanbul ve Kırklareli illeri ve ilçelerine ait mezbahalarda kesilen sığırlara ait sidik keselerinden ibaretti. Bu hayvanlara ait 793 adet sidik kesesi incelendi ve bunların 223 adedinde tümörden şüphelenildi. Şüpheli görülen dokular % 10’luk tamponlu formol içerisine konularak Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’na getirildi. III.2. Yöntem Makroskobik İncelemeler Makroskobik olarak tümörden şüpheli bulunan sidik keseleri alındıkları bölgelere göre kodlandıktan sonra daha önceden hazırlanmış olan ve her kese için ayrı ayrı düzenlenen, şematik sidik kesesi şekli bulunan, kartlar üzerine tümör ya da tümörler ile neoplastik olmayan lezyonların lokalizasyonları, adedi, şekli, rengi, kıvamı, büyüklükleri not edildi ve her kesede lezyonlara ilgili makroskobik resimler çekildi. 4 Histopatolojik İncelemeler: Toplanan ve tespiti yapılmış olan tümör şüpheli sidik kesesi örnekleri küçültülerek rutin doku takibine alındı ve parafinde bloklandı. Her bloktan 5 µm kalınlığında kesitler alınarak, hematoksilen-eozin (HE), Masson’un trikrom ve van Gieson boyaları ile boyandı (Luna, 1968) ve ışık mikroskobunda (DM 4000B, Leica) değerlendirilerek mikroskobik olarak dijital fotoğraf makinesi (Leica DFC280) ile görüntülendi. Tanımlanan tümörlerin histolojik klasifikasyonu Dünya Sağlık Teşkilatı’ndan yararlanılarak yapıldı (Pamukçu, 1974). İmmunhistokimyasal İncelemeler: Tümörlü sidik keselerinden histopatolojik incelemeler için hazırlanmış olan parafin bloklardan 3-aminopropyltriethoxysilane (APES) ile kaplanmış adhezivli lamlara alınan doku kesitlerine immunoperoksidaz yöntemi (Avidin-Biotin Peroxidase Complex [ABPC]) uygulandı. Kesitler ksilollerde deparafinize, dereceli alkol serilerinde de dehidre edildikten sonra oda ısısında 5 dakika % 3’lük hidrojen peroksitte tutuldu. P53 proteini ile boyanan kesitler 90°C’de 20 dakika mikrodalgada antigen retrieval solusyonu (Dako) ile (pH 6.0) muamele edilirken diğer reagenzlerde bu basamak atlandı. Nemli kamaraya alınan kesitlerin üzerlerine birer damla normal keçi serumu damlatılarak oda ısısında 20 dakika bekletildi. Bunu izleyen aşamada da kesitlere p53 protein, URO-9, URO-10, faktör VIII, sitokeratin 7 ile 20 ve vasküler endotelyal growth faktör (VEGF) antiserumu (Tablo 1) damlatılıp, 60 dakika oda ısısında inkube edildi. Daha sonra Biotinize sekonder antikor ve Streptavidin-peroksidaz (Universal LSAB-2 Kiti/Dako) damlatılıp oda ısısında 20’şer dakika tutuldu. Nihayet kesitler 3-amino-9-etilkarbazol (AECDako)’den oluşan kromojende kontrollü olarak bekletildi. Kesitler normal keçi serumunun kullanıldığı aşama hariç hematoksilenle boyanıncaya kadar fosfatlı bufferla (pH 7.4) yıkandı. Aynı zamanda URO 9 ve 10 hariç diğer tüm reagenzlerde tripsin enzimi uygulanmıştır. Mayer’in hematoksilen boyasında 1 dakika karşıt boyamaya tabi tutulup çeşme suyu altında yıkandı; üzerlerine su bazlı yapıştırıcı damlatılarak lamelle kapatıldı. Kontrol için ayrılan doku kesitlerine de benzer prosedür uygulandı. Ancak primer antikor yerine normal tavşan serumu kullanıldı. İmmunoperoksidaz yönteme göre bu 5 şekilde hazırlanan doku kesitleri inceleninceye kadar oda sıcaklığında ve karanlıkta muhafaza edildi. Tablo 1. Kullanılan tümör reagenzlerinin temin edildikleri yerler ve sulandırmaları Antikor URO 9 URO 10 CK 7 CK 20 p53 protein Factor VIII VEGF Ab-1 Firma Bioquote Bioquote DAKO DAKO DAKO DAKO LabVision Klon Om5 T43 PAb240 19-22kDa Katalog no 8090-01 8091-01 M3566 - Sulandırma 1/250 1/250 1/250 1/250 1/500 1/250 1/500 IV. BULGULAR IV.1. Makroskobik ve Histopatolojik Bulgular: Makroskobik olarak 14 farklı il ve/veya ilçeye ait 23 mezbahada toplam 793 adet sığıra ait sidik keseleri incelendi. Bu mezbahaların 5’inden elde edilen sidik keselerinde herhangi bir lezyon saptanmazken geriye kalan mezbahalarda incelenen keselerin 223’ünde (%28.12) lezyonlar mevcuttu ve bunların mikroskobik incelenmesinde 181 adedine tümör tanısı konuldu. İllere göre tümörlerin görülme sıklığı Şekil 1’de gösterildi. Bu tümörlerin çoğunluğu öncelikle sidik kesesinin korpusuna, daha sonra da sırasıyla kesenin trigonumuna, lateral duvarına ve verteksine lokalize olmuştu (Şekil 2). Kimi sidik keselerinde birden fazla sayıda tümörün, kesenin değişik yerlerine yerleştiği dikkati çekti. Ayrıca, mikroskobik olarak bunların 30’u propria mukozanın derinlerine kadar invaze ve infiltre olmuştu. Tablo 2’de tümör tiplerine göre sidik keselerindeki lokalizasyonlar ayrıntılı olarak verildi. 6 Tablo 2. Tümörlerin lokalize oldukları sidik kesesi bölümleri, invazyonları ve sayıları. İdrar kesesi bölümleri Mikroskobik Verteks Korpus Lateral Duvar Trigonum İnvazyon İnfiltrasyon 36 29 7 96 81 32 31 24 11 46 30 10 - - 10 34 17 14 - 2 - 1 - - - - 5 2 1 14 2 7 3 1 6 1 3 1 - 1 1 1 Mikzomatöz değişiklik 4 13 6 7 - - TCC Hemangiosarkom Hemangioendotelyoma Malignum 12 14 53 37 23 18 28 17 8 15 8 2 6 11 9 10 4 4 Fibromyosarkom 1 - - - - - 5 132 19 3 403 3 146 6 178 28 19 Tümör tipleri Papillom Fibrom Hemangioma kapillare Hemangioma kavernosum Hemangioendotelyoma benignum Mikzom Fibromikzom Fibromatöz degişiklik Karsinoma insitu Pagetoid hücreli tümör Toplam Mikroskobik olarak tümör tanısı konulanların 38’i (%20.99) yalnız epitelyal; 71’i (%39.23) yalnız mezenşimal; 72’si (%39.78) ise hem epitelyal hem de mezenşimal kökenli tümörlerden ibaretti (Tablo 3). Tablo 3. Kökenlerine göre tümör tipleri ve görülme sıklıkları Köken Epitelyal Mezenşimal Epitelyal-Mezenşimal Adet 38 71 72 Yüzde 20,99 39,23 39,78 Epitelyal kökenli olan benign tümörlerin 96’sı papillom, malign tümörlerin ise 47’si transisyonel hücreli kanser (TCC) idi. Mezenşimal kökenli olan benign tümörlerin 81’i fibrom, malign tümörlerin ise 24’ü hemangiosarkomdan ibaretti. Kas ve bağ dokusundan köken alan tümörlerin ayırımında Masson’un trikrom ve van Gieson 7 boyalarından faydalanıldı. Saptanan diğer tümör tipleri ile beraber tümoral olmayan patolojik bulgular Tablo 4’de detaylı olarak gösterilmiştir. Tablo 4. İdrar kesesi tümörlerinin histopatolojik sınıflandırılması** Tümör Tipleri Adet* Benign Olgular 258 Papillom 96 Fibrom 81 Hemangioma kapillare 26 Hemangioma kavernozum 21 Hemangio-endotelyoma benignum 1 Mikzom 10 Fibromikzom 4 Fibromatöz değişiklikler 7 Mikzomatöz değişiklikler 12 Hiperplazi 120 Noduler hiperplazi 78 Papiller hiperplazi 42 Malign Olgular 96 Transisyonel hücreli kanser 47 Hemangio-endotelyoma malignum 9 Angiosarkom 24 Fibromyosarkom 1 Karsinoma insitu 9 Pagetoid hücreli tümör 6 Yüzde* 142,54 53,03 44,75 14,36 11,60 0,55 5,52 2,21 3,87 6,63 66,30 43,10 23,20 53,04 25,97 4,98 13,26 0,55 4,98 3,30 *Yukarıdaki tabloda belirtilen tümörler 181 adet sidik kesinden alınmakla birlikte bir kesede çoğunlukla birden fazla tümör şekillendiğinden her bir tümör ayrı ayrı değerlendirilmiş ve tümörlere göre yüzde hesaplamaları 181 kese üzerinden yapılmıştır. ** Yangısal değişiklikler, kanama ve ödem hemen her olguda değişen şiddette gözlendiği için ayrıntılı olarak tabloda belirtilmemiştir. Diğer taraftan bu tümörlerin %13.26’sı (24 adet) fibromatozis olup mezenşimal kökenli tümörlerin %33.80’ini; %8.29’u (15 adet) papillomatozis olup epitelyal kökenli tümörlerin %39.47’sini oluşturuyordu. Aynı zamanda tek bir kesede %3.31 (6 adet) oranında sadece fibromatozis veya papillomatozise rastlanılmıştır. Bunlar ise epitelyal ve mezenşimal kökenli tümörlerin %8.33’ünü oluşturuyordu. Yine %0.55 (1 adet) oranında ise fibromatozis ve miksomatozis birlikte saptanmıştır. Papillomatozis olgularında makroskobik olarak bir kesede 2-10 adet papillom; fibromatozis olgularında ise yine bir kesede 2-26 adet fibrom görülmüştür. 8 İncelenen bu tümörlerden bilhassa malign karakterde olanlarda hidropik dejenerasyon, yer yer kolonik metaplazi, bez metaplazisi ve neoplastik epitel hücreleri arasında kistlere ilişkin değişiklikler de gözlenmekteydi. IV.2. İmmunohistolojik Bulgular: Rutin histopatolojik incelemelerde, tanıda güçlükle karşılaşılan olguların tanısını doğrulamak ya da tanı koymak için çeşitli tümör reagenzlerinden faydalanılarak immunohistolojik incelemeler yapılmıştır. Ancak, tümör saptanan olguların da hepsinde birebir immunohistolojik değerlendirilmeye gidilmemiştir. Bu amaçla histopatolojik incelemeler sırasında normal ve hiperplazik transisyonel epitel, epitelyal kökenli tümörlerden papillom, karsinoma insitu ve pagetoid hücreli tümör olgularının ayırımında URO 9 (30 adet) , URO 10 (35 adet), p53 protein (1 adet) ve sitokeratinden (CK 7 ve CK 20’den 16’şar adet); damarlaşma ve damar dokusu tümörleri için VEGF (18 adet) ve Faktör VIII’den (18 adet) yararlanılmıştır. URO 9’la yapılan boyamalarda hiperplazi ve papillom olgularından seçilen preparatlarda diffuz ya da granüler tarzda kırmızı-kahverenkli immunpozitif boyanmalar elde edilirken; hiperplazi tanısı konan ve URO 9 negatif olgularda URO 10 ile benzer görünümde boyanmalar elde edilmiştir. Bu nedenle URO 10 pozitif reaksiyon veren vakalar TCC olarak değerlendirilmiştir. Yine aynı durumun karsinoma in situ tanısı konan olgularda da mevcut olduğu gözlenmiştir. TCC ve karsinoma in situ olguları CK 7 ile hepsinde negatifken, CK20 ile TCC ve karsinoma insitu’ların hepsinde yine granüler ya da diffuz görünümlü immunpozitif boyanmalar görüldü. URO 10 ve sitokeratinlerle boyanan karsinoma insitu şüpheli olgular TCC olarak değerlendirildi. VEGF ile çeşitli damar dokusu tümörlerinde yapılan boyamalarda hem neoplastik endotel hücrelerinde hem de damarlaşma olarak düşünülen bölgelerdeki endotel hücrelerinde çok belirgin immunpozitiflik saptandı. Faktör VIII ile çeşitli damar dokusu tümörlerine yapılan boyamalarda malign damar dokusu tümörlerinde VEGF’de olduğu gibi endotel hücrelerinde çok belirgin immunpozitiflik saptandı. Ancak, faktör VIII’in farklı tipte isimlendirilen damar dokusu tümörlerinin birbirinden ayırımında yardımcı olmadığı görüldü. 9 Malign karakterli tümörlere uygulanan p53 protein boyamasında çok belirgin bir boyanma elde edilmedi. Gözlenen boyanmalar çok hafif ya da şüpheli olarak değerlendirildi. Makroskobik ve mikroskobik incelemede bir kesede gözlenen tümoral olmayan lezyonlar ve/veya tek tümörler; Resim 1-11’da, multiple tümörler ise Resim 12-15’te gösterilmiştir. V. SONUÇ ve ÖNERİLER Sığır sidik kesesi tümörleri, çoğunlukla kronik enzootik hematüri ile birlikte görülür. Bu hastalık kompleksi Türkiye’de ilk defa Esin ve Artun (1949) tarafından bildirilmiş, daha sonra çeşitli araştırıcılarca detaylı olarak incelenmiştir (Akçay, 1949; Altan ve Esin, 1950; Pamukçu, 1963; Yalçıner, 1970; Özkul ve Aydın, 1996). Hastalık endemik olarak sıklıkla dağlık ve ormanlık bölgelerde görülmektedir. Türkiye’de de buna en uygun bölge Karadeniz Bölgesi olup bu bölge denizden yaklaşık 200-1500 m yükseklikteki ormanlık alanı kapsamaktadır (Pamukçu, 1955; Pamukçu, 1957; Göksoy, 1968). Hastalığa her mevsimde ve genellikle 2 yaşın üzerindeki sığırlarda, ırk predispozisyonu göstermeksizin, rastlanır (Pamukçu, 1955; Pamukçu, 1957; Göksoy, 1968; Pinto ve ark., 2004). Çeşitli araştırıcılarca (Peixoto ve ark., 2003, Pinto ve ark., 2004) eğrelti otunun gittikçe artan ciddi problemlere sebep olduğu ve sürülerin %28’inden fazlasının (Pinto ve ark., 2004) bazen da % 90’ının (Georgiev, 1955) bu ottan etkilendiği belirtilmiştir. Ciddi ekonomik kayıplara sebep olan bu hastalığın etiyolojisine ilgili pek çok çalışma yapılmıştır. Geçmiş yıllarda hastalığın viral bir ajan, özellikle de papilloma virus, tarafından oluşturulduğu bildirilmiş (Pamukçu, 1955; Olson ve ark., 1962; Olson ve ark., 1965; Campo, 1995), daha sonraları ise boya fabrikalarında çalışan insanlarda sıklıkla sidik kesesi tümörlerine rastlanmasından hareket edilerek bazı aromatik aminlerin hastalığa sebep olduğu ortaya konulmuştur (Bonser ve ark., 1952; Bonser ve ark., 1956). Hayvanlarda ise sığırlarda gelişen doğal olguların yanı sıra farelere yedirme deneyleri ile de desteklenen en geçerli sebebin eğrelti otu olduğu kabul edilmektedir 10 (Yalçıner, 1970; Pamukçu, 1974; Peixoto ve ark., 2003; Pinto ve ark., 2004). Eğrelti otu (Pteridium aquilinum), genç yaprakları siyanogenetik glikozid içeren ve bazı hayvan türlerinde thiamin eksikliğine yol açan radyomimetik etkili toksik bir bitkidir (Naftalin ve Cushnie, 1954a; Thomas, 1963; Göksoy, 1968). Hayvanlar normalde bu bitkiyi tüketmezler, daha çok aç kalan hayvanlar tarafından tüketilen bitkiyi ahırdaki hayvanlar kış aylarında ya samanla birlikte ya da yataklık olarak kullanıldığında aç kaldıkları zaman tüketirler (Göksoy, 1968). Merada eğrelti otu yiyen hayvanlarda tüketilen ot miktarına ve süresine bağlı olarak zehirlenme meydana gelir. Bu değişikliklere otun içerdiği quersetin, shikimik asit, prunasin, akuilid A gibi karsinojen maddelerin özellikle de ana karsinojen madde olan ptaquiloside (a norsesquiterpenoid glycoside)’in sebep olduğu varsayılmaktadır (Göksoy, 1968; Pamukçu ve ark., 1967; Pamukçu, 1974). Hatta bu otu tüketen ineklerin sütünü içen insanlarda özellikle sütün ptaquiloside içermesi nedeniyle özofagus ve mide kanserleri bildirilmiştir (Alonso-Amelot ve ark., 1996; Shahin ve ark., 1999). Pamukçu ve ark. (1966) ise eğrelti otu yedirilen sığır idrarından hazırlanan ekstraktı kullanarak farelerde sidik kesesi tümörü meydana getirmişlerdir. Akut eğrelti otu zehirlenmesinde seroza, mukoza ve çeşitli organlarda peteşiyel ve ekimotik kanamalar (Naftalin ve Cushnie, 1954a; Naftalin ve Cushnie, 1954b; Göksoy, 1968); kronik eğrelti otu zehirlenmesinde ise sidik kesesinde proliferatif ve neoplastik değişiklikler meydana gelmektedir (Dilmen, 1961; Göksoy, 1968; Peixoto ve ark., 2003). Bugün için bu otun doğal olarak sidik kesesinde doğrudan tümör oluşturduğu kanıtlanmıştır (Smith, 1997). Saptanan tümörler hem epitelyal hem de mezenşimal kökenlidir. Hatta bir kesede bir veya daha çok kökenleri aynı ve/veya farklı tümör tiplerinin kombinasyonu görülmektedir (Tokarnia ve ark, 2000; Peixoto ve ark., 2003,, Göksoy, 1968). Çalışmada %20,99 epitelyal, %39,23 mezenşimal ve %39,78 oranında da epitelyal ve mezenşimal kökenli tümörlere rastlanmıştır. Mikroskobik incelemede özellikle epitelyal kökenli tümörlerin papillom, adenom, TCC olduğu ve insan sidik kesesi tümörleri ile benzediği saptanmıştır (Göksoy, 1968, Pamukçu, 1974; Peixoto ve ark., 2003). Mezenşimal kökenli tümörlerin ise daha çok fibrom, hemangiom ve sarkom olduğu görülmüştür (Göksoy, 1968; Pamukçu, 1974; Peixoto ve ark., 2003,). Eğrelti otu tüketen sığırlarda sıklıkla tümoral ve 11 tümoral olmayan patolojik bulgulara rastlamışlardır. Çalışmada ise makroskobik olarak 793 hayvan incelenmiş bunların 223 adedinden (%28.12) örnekleme yapılmıştır. Bunların da 181’inde (%81.67) mikroskobik olarak tümör tespit edilmiştir. Bu tümörlerin 38’i (%20.99) epitelyal; 71’i (%39.23) mezenşimal; 72’si (%39.78) ise hem epitelyal hem de mezenşimal kökenli bulunmuştur. Epitelyal benign tümörlerin en sık görüleni papillom olup %53,03 ( 96 adet) oranında saptandı. Epitelyal malign tümörlerin ise en sık görüleni %25,97 (47 adet) oranında gözlenen TCC’den ibaretti. Mezenşimal benign tümörlerin en sık gözleneni %44,75 (81 adet) oranında fibrom, mezenşimal malign tümörlerin en sık gözleneni ise %18,78 (34 adet) oranındaki damar dokusu tümörleri idi. Bunlardan %13.26’sı (24 adet) fibromatozis olup mezenşimal kökenli tümörlerin %33.80’ini; %8.29’u (15 adet) ise papillomatozis olup epitelyal kökenli tümörlerin %39.47’sini oluşturuyordu. Aynı zamanda tek bir kesede fibromatozis ve papillomatozis şeklinde %3.31 (6 adet) oranında rastlanılmıştır. Bunlar ise epitelyal ve mezenşimal kökenli tümörlerin %8.33’ünden ibaretti. Yine %0.55 (1 adet) oranında fibromatozis ve miksomatozis birlikte saptanmıştır. Papillomatozis olgularında makroskobik olarak bir kesede 2-10 adet papillom; fibromatozis olgularında ise bir kesede 2-26 adet fibrom görülmüştür. Saptanan tüm tümörlerin çoğunlukla sidik kesesinin korpusuna lokalize olduğu dikkati çekmiştir. Saptanan malign karakterli tümörlerden 28’i propria mukozanın derinlerine kadar invaze olmuştu. Histopatolojik incelemelerde, literatürde (Peixoto ve ark., 2003) belirtildiği şekilde, tümörlerin dışında tümoral olmayan patolojik bulgular (hiperplazi, damarlaşma, yangısal değişiklikler, ödem ve kanama) dikkatimizi çekti. Yangısal değişiklikler fokal ya da multifokal alanlar halinde lenfosit, makrofaj ve yer yer de plazma hücrelerinden ibaretti. Pinto ve ark. (2004) inceledikleri sığırlarda tümoral değişikliklerin % 89 oranında olduğunu bunun da % 71.8’inin malign karakter taşıdığını bildirmişler, tüm tümörlerin % 49.3’ünün TCC olduğunu kaydetmişlerdir. Özkul ve Aydın (1996) ise TCC’ye % 14.6 oranında rastlamışlardır. Çalışmada tümörlerin kökeni ayırt edilmeksizin %53,04 malign karakterde, %132,02 da benign karakterde olduğu saptandı. Bazı olgularda neoplastik değişikliklerin çevre dokulara metastazlarına da rastlanmaktadır. Ancak çalışmada sadece sidik keseleri değerlendirildiğinden diğer doku metastazları ve böbrek lezyonları incelenmemiştir. İnsan hekimliğinde sıklıkla nedeni 12 bilinmeksizin bu tümörler şekillenmektedir ve bunların biyolojik gelişimleri alışılan histopatolojik görünümlerle tahmin edilememektedir. Bu nedenle de bazı reagenzler kullanarak immunohistokimyasal incelemelerden faydalanmaktadırlar. Bu incelemelerden tümörün tanısını koymada, tümörün derecelendirilmesinde ve prognozun tahmin edilmesinde yararlanılmaktadır (Inagakı ve ark., 1997; Tsuji ve ark., 1997). Elde edilen sonuçlara göre de uygun tedavi yöntemleriyle hastanın yaşatılmasına çalışılmaktadır. Hatta kimi zaman sidik kesesine metastaz yapan farklı sistem tümörlerinin ayırımında ve klasifikasyonunda da bu tür incelemelerden yararlanılmaktadır (Soslow ve ark., 1996). Veteriner hekimlikte ise bilhassa yurdumuzda farklı sistem tümörlerinde bazı özel çalışmalar dışında rutin immunohistokimyasal boyamalar ve bunların sonucunda tümörlerin derecelendirilmesi ve prognozu hakkında yorumlama yapılmamaktadır. Bu çalışmada imkanlar dahilinde elde edilen bazı reagenzleri kullanarak, Karadeniz ve Marmara Bölgesi’nin çeşitli il ve ilçelerinde mezbahada kesilen enzootik hematürili sığırlardan elde edilen sidik keselerinde histopatolojik olarak saptanan, proliferatif ve tümöral değişikliklerin immunohistolojik reagenzlerle verdikleri reaksiyonların saptanması amaçlanmıştır. Hatta mümkün olduğu oranda bu hayvanlarda transisyonel epitelde sık görülen ve tanıda güçlük çekilen hiperplazi ile papillom arasındaki ayırımın yapılmasına da çalışılmıştır. Bu amaçla URO-9, URO-10, p53 protein, sitokeratin, faktör VIII ve VEGF anti-serumundan faydalanılmıştır. Prognostik faktörlerden p53 proteini fare sarkoma hücrelerinde saptanan spesifik hücresel bir onkoproteindir (deLeo ve ark., 1979). Günümüzde sadece tümörlü dokularda değil normal dokularda da bulunduğu ortaya konmuştur. Bu nedenle p53 proteini wild type (normal) p53 proteini” ve “mutant p53 proteini” olarak iki grupta değerlendirilmektedir. Bunlardan “wild type (normal) p53 proteini”nin yarılanma ömrü çok kısadır (6-30 saniye) ve dokuda immunohistokimyasal olarak saptanacak kadar birikimi olmaz. “Mutant p53 proteini”nin ise aksine yarılanma ömrü uzundur ve birikim göstererek hücre çekirdeğinde kolaylıkla saptanabilir. Mutant formları resesif tümör supresör genin karakteristiklerine sahip olup, dominant onkogen olarak rol oynayabilir. p53 geni ise 13 tümör oluşumunu baskılayan bir gendir. Bu gende oluşan değişiklikler pekçok tümörde sitogenetik, moleküler ve immunohistokimyasal metotlarla saptanmaktadır (Mayr ve ark., 1999; Poller ve ark., 1993). Özellikle immunohistokimyasal metotlarla p53 proteininin saptanması, p53 genindeki mutasyonun göstergesidir, yüksek dereceli (grade) ve yüksek proliferasyon indeksli malign tümörlerde ekspresyonu çok fazladır (Mayr ve ark., 1999; Cote and Taylor, 1994). Çalışmada p53 protein boyaması malign karakterli özellikle epitelyal karakterli tümörlerde yapılmıştır. Ancak, literatürlerde belirtilenlerin aksine rutin boyamada malignite derecesi yüksek olarak düşünülen tümörlerde saptanan boyanma şiddetinde belirgin bir farklılık gözlenmemiştir. İmmunohistokimyasal yöntemler büyük oranda sidik kesesinde saptanan tümörlerin diğer sistemlere ilgili metastatik bir tümör olup olmadığını anlamada ya da tek hücre mikro-metastazlarını ortaya koymada ya da normal yapının malign veya henüz çok belirgin olmayan malignitenin saptanmasında da büyük oranda yardımcıdır. Bunlardan URO 9 ve 10 (Cote and Taylor, 1994). normal sidik kesesi epiteli ile iyi diferensiye non-invaziv ve invaziv sidik kesesi kanserinin ayırımında yararlıdır. URO 9 normal epitel ile iyi diferensiye tümörleri URO10 ise sadece invaziv tümörleri boyar. Bir tümörde URO 9 ile belirgin reaksiyon olması ve üstelik fokal alanlar halinde URO10 pozitif alanlar içermesi agresif bir gelişimi ifade eder (Cote and Taylor, 1994). Bu reagenzler hem frozen kesitlerde hem de parafin kesitlerde kullanılabilmektedir. Nitekim bu projede URO9 ve URO10 varlığı parafin kesitlerde aranmıştır. Genel olarak kanser tanısı konan olgularda çok belirgin URO10 pozitifliği saptanması bu görüşleri destekler nitelikteydi. Ancak bizim için önemli olan TCC tanısı konulanlardan ziyade hiperplazi veya papillom tanısı koyduklarımızda malignitenin olup olmadığını saptamaktı. Bu amaçla URO 9 ve URO10 ile birlikte hem normal sidik kesesi epitelinde, hem hiperplazi hem de papillom olgularında kullanılmıştır. Hematoksilen-eozin ile hiperplazi ve papillom olarak değerlendirilen bu olgulara immunohistokimyasal olarak URO 9 ve URO 10 boyamaları yapılmış, URO 10 pozitif olanlara kanser tanısı konulmuştur. Ancak, boyanma özellikleri genel olarak değerlendirildiğinde çok yoğun ve şiddetli boyanmalara rastlanmamış olup bu durum reagenzlerin daha çok insanlara ait 14 tümörlerde kullanılıyor olmasına yorumlanmış, bu reagenzlerin farklı hayvan türlerinde de çalışılmasının gerektiği kanaatine varılmıştır. Keratin, hemen her epitel hücresinde yer alan intrasellüler filamental bir proteindir. Bir seri gen grubu tarafından kodlanır ve molekül ağırlığı yaklaşık 44-68 kd’dir. Molekül ağırlıkları ve izoelektrik pH değerlerine göre çeşitli alt türleri vardır ve bunlar farklı farklı epitellerde yer alırlar. CK 7 glanduler ve transisyonel epitelin bir kısmında bulunan ancak yassı epitelde bulunmayan tip 2 (nötral bazik) bir sitokeratindir. Ovaryum, akciğer ve meme epitelinde eksprese edilir. CK 20 ise esas olarak mide ve barsak epitelinde, urotelyumda ve Merkel hücreli tümörlerde bulunan tip 1 (asidik) bir sitokeratindir. Bu bölümlere ilgili şekillenen kanserlerde eksprese edilir. CK7 ve 20 özellikle indiferensiye epitel hücrelerini pozitif boyarlar. İdrar kesesinin transisyonel epiteli farklı sitokeratinler içerir (Cote and Taylor, 1994). Bunların içerisinde uroteliyal tümörleri ayırt etmek için CK7 ve 20’den faydalanılır (Harnden ve ark., 1995; Bassily ve ark., 2000; Bostwick ve ark., 2002; Meuten, 2002). Ancak bu bu reagenzlerin uygulanacağı dokularda fikzasyon ve bloklama işlemleri önemlidir. Yoğun olarak kriostat kesitlerinde saptanmış olan keratin parafin kesitlerde proteolitik enzim uygulamasıyla saptanmıştır. Çalışmada parafin kesitlerde sitokeratin 7 ve 20 kullanılmış olup tripsin enzimi uygulanmıştır. Boyama sonuçlarında sadece CK20’ye ilgili pozitiflik elde edilmiştir. Tümörler, çeşitli anjiyojenik faktörler salgılatarak anjiyogenezisi uyarır ve yeni oluşan kan damarları tümör hücrelerinin çoğalmasını ve metastazını hızlandırır. Yeni damarların oluşumunun birçok düzenleyicisi vardır. En önemli düzenleyicilerinden biri Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF)’dür. VEGF endotel hücresinin proliferasyonuna, diferensiyasyonuna ve migrasyonuna sebep olur. VEGF geni, 8 ekzon ve 7 introndan oluşmaktadır. Gen 14 kb’lık kodlama bölgesini kapsamış olup 6. kromozom (6p21.3) üzerinde bulunur. VEGF molekülü 45 kDa’luk , homodimerik, heparin-bağımlı bir glikoproteindir. VEGF’nin çeşitli alt grubu tanımlanmıştır: VEGF A, B, C, D, E, ya da aminoasit sayılarına göre VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206 ve VEGF145 gibi izoformları bulunmaktadır. Vasküler geçirgenlik faktörü olarak da bilinen VEGF-A’nın tümör anjiyogenezisinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bunu 15 takiben, VEGF gen ailesinin 3 yeni üyesi olan VEGF-B, VEGF-C ve VEGF-D keşfedilmiş ve tanımlanmıştır. VEGF, aktivitesini üç reseptör ile gerçekleştirir. Tirozin kinaz yapısında olan bu reseptörleri VEGF-R1 (flt-1), VEGF-R2 (flk-1/KDR) ve VEGFR3 (flt-4)’dür. Bunlardan VEGF-R1 ve R2 endotel hücreleri üzerinde, VEGF-R3 ise lenf damarları üzerinde bulunur. VEGF reseptörlerinin aktivasyonu; fosfoinositol-3 kinaz, fosfolipaz-C ve ras GTPaz aktivatör proteinleri gibi bir dizi hücre içi sinyal iletim proteinini fosforile ederek endotel hücrelerinin çoğalma, göç ve farklılaşmasına neden olur. Özellikle meme kanserlerinde VEGF ifadelenmesi ile tümör mikrovaskülarizasyonu, malignite ve metastaz arasında ilişki bulunmuştur. Bu genin 5’ bölgesi analiz edildiğinde bireyler arasında VEGF ifadelenmesi bakımından oldukça varyasyon vardır. Bu çeşitlilik birçok polimorfizmlerin varlığını göstermektedir. Bu gendeki polimorfik bölgeler anjiyogenezisin kritik rol oynadığı bazı hastalıklarda protein üretimi ile ilişkili bulunmuştur. VEGF-C, tirozin kinaz reseptörlerinden olan ve öncelikle lenf damarlarının endotelinde ifadelenen VEGF reseptör-3 (Flt-4) ve VEGF reseptör 2 (Flk-1)’nin ligandıdır. Yakın zamanlarda, VEGF-C ifadelenmesini gastrik, meme, tiroid ve servikal kanserlerin tümör invazyonu ve lenf düğümü metastazı ile ilişkili bulan çalışmalar yapılmıştır. Çalışmada VEGF Ab-1 tipi ile hem farklı tümörlerde hem de damar dokusu tümörlerinde boyamalar yapılmış ve damar endotellerinde çok belirgin boyanmalar saptanmıştır (Cote and Taylor, 1994). Diğer taraftan faktör VIII’de endotel hücre belirleyicisi olarak kullanılan bir reagenzdir. Özellikle endotel hücrelerinden köken alan tümörlerde faydalanılmaktadır (von Beust ve ark., 1988; Ferrer ve ark., 1995). Ancak zayıf diferensiye angiosarkomlarla lenfangiosarkom veya hemangiosarkomlar arasında ayrımı saptama açısından yetersiz kalmaktadır. Çalışmada damar dokusu kökenli tümörlerde, özellikle de malign karakterde olanlarda, çok yoğun boyanmalar elde edilmiştir. Fakat bu yoğunluk damar dokusu tipine göre çok belirgin bir farklılık arz etmemiştir. Sonuç olarak bu proje kapsamında Rize, Trabzon, Giresun, Ordu, Samsun, Sinop, Kastamonu, Bartın, Zonguldak, Karabük, Adapazarı, İzmit, İstanbul ve Kırklareli illeri ve bu illere bağlı ilçelerdeki mezbahalarda yapılan incelemeler sonucunda, kronik 16 enzootik hematüri vakalarının daha önceki çalışmalara nazaran oldukça azaldığı dikkati çekmiştir. Ancak, Batı Karadeniz bölgesine ait il ve/veya ilçe mezbahalarında elde edilen materyallerin ya çok azı tümör içermekteydi ya da hiç neoplastik değişiklikler saptanmadı. Gerek bölgedeki Tarım İl Müdürlükleri’nde görevli gerekse de serbest çalışan Veteriner Hekimlerle de yapılan görüşmeler sonunda bu düşüşün nedenlerine yönelik olarak aşağıdaki sonuçlara varılmıştır: • Bölgede serbest Veteriner Hekimliğin yaygınlaşması, • Eğrelti otunun kronik enzootik hematüri’ye neden olduğu anlaşıldıktan sonra bölgedeki yetiştiricilerin, serbest ve Tarım İl Müdürlükleri’nde görevli olarak çalışan Veteriner Hekimlerce konu ile ilgili olarak yeterince bilgilendirildiği, • Hayvan rasyonlarının konsantre yem ile desteklenmesi nedeniyle merada otlayan hayvanların, normal şartlarda tüketmedikleri ancak diğer otların arasında tesadüfen eğrelti otunu artık çok az miktarlarda tükettikleri ve yine aynı nedenle ahırlarda altlık olarak kullanılan eğrelti otunun hayvanlar tarafından tüketilmediği, • Bu bölgede eskiden tarım gücü olarak kullanılan sığır ve mandaların yerini motorlu araçların alması bu hayvanların yaşam süresinin kısalmasına ve dolayısıyla tümör oluşumu için gerekli olan sürenin olmamasına bağlı olarak sayıda bir azalma olduğu, • Bu sorunun profesyonel işletmelere henüz geçememiş birkaç başlık aile işletmelerindeki hayvanlarda daha çok görüldüğü, Diğer taraftan projede ilk kez Türkiye’de eğrelti otuna bağlı şekillenen neoplastik ve bazı nonneoplastik değişikliklerde çeşitli reagenzler kullanılarak immunohistokimyasal incelemeler yapılmıştır. Ayrıca, yine projede URO 9 ve URO 10 kullanılarak normal epitel, hiperplazik epitel ve papillom tanımlarının doğruluğunun araştırılmasının da ilk olması ayrıcalıktır. Bugün özellikle İnsan Hekimliğinde sidik kesesi tümörlerinin prognozu, tanısı, rekürrensini araştırmak için kullanılan bu reagenzlerden Veteriner Hekimlikte de yararlanılabilecek olması ve diğer araştırıcılara ışık tutacak nitelikte olmasının projeyi önemli ve yararlı kılmaktadır. 17 VI. KAYNAKLAR 1. AKÇAY, Ş. (1949). Rapor No. 532. Ziraat Vekaleti, Ankara, 1-5. 2. ALONSO-AMELOT, M.E., CASTILLO, U., SMITH, B.L., LAUREN, D.R. (1996). Bracken Ptaquiloside in Milk. Nature, 382:587. 3. ALTAN, Y. ve ESİN, İ. (1950). Bolu’da Görülen Kan İşeme Hastalığı Hakkında Rapor. Türk. Vet. Hek. Dern. Derg., 20:217-222. 4. BASSILY NH, VALLOROSI CJ, AKDAS G, MONTIE JE, RUBIN MA. (2000). Coordinate Expression of Cytokeratins 7 and 20 in Prostate Adenocarcinoma and Bladder Urothelial Carcinoma. Am J Clin Pathol., 113(3):383-388. 5. BONSER, G.M., BRADSHAN, L., CLAYSON, D.B., JULL, J.W. (1956). Further Study of the Carcinogenesis Properties of Ortho Hydroxy-Amines and Related Compound by Bladder Implantation in the Mouse. Br J Cancer, 19:539-546. 6. BONSER, G.M., CLAYSON, D.B., JULL, J.W. and PYRAH, L.N. (1952). The Carcinogenic Properties of 2-amino-1-naphthol hydrochloride and its Parent amine 2naphthylamine. Br J Cancer, 6(4):412-424. 7. BORZACCHIELLO, G., AMBROSIO, P., GALATI, P., POGGIALI, F., VENUTI, A., ROPERTO, P. (2001). The Pategoid Variant of Urothelial Carcinoma in Situ of Urinary Bladder in a Cow. Vet. Pathol., 38:113-116. 8. BOSTWICK, D.G., QUIAN, J. and RAMNANI, D.M. (2002). Prostate and Bladder. In: Diagnostic Immunohistochemistry. Ed: DABBS, D.J. Churchill Livingstone, New York, N.Y. pp:407-458. 9. CAMPO, M.S. (1997). Bovine Papillomavirus and Cancer. Vet J., 154(3):175-188. 10. Cote, R. J., Taylor, C.R. (1994). Immunomicroscopy: A diagnostic Tool For teh Surgical Pathologist. Tumors of …………….. WB Saunders Company, 2nd edition, Chapter ……., 2….-2….. 11. DILMEN, S. (1961). Hematuria Vesicalis Bovis Chronica’nın Eğrelti Out ile (P. aquiline) İlgisi Üzerinde Araştırma. A.Ü. Vet. Fak. Derg., 2:122-142. 12. ESİN, İ., ARTUN, H. Niksar İlçesi Sığırlarında Görülen Mahiyeti Meçhul Hastalık. Türk Vet. Hek. Der. Derg., 19:54-56, (1949). “Alınmıştır” Yalçıner, Ş. Eğrelti otunun (pteris aquilina) kanserojenik etkisinin sıçanlar üzerinde araştırılması. Doktora tezi, Ankara, (1970). 18 13. FERRER, L., FONDEVILA, D., RABANAL, R.M. and VILAFRANCA, M. (1995). Immunohistochemical Detection of CD31 Antigen in Normal and Neoplastic Canine Endothelial Cells. J. Comp. Pathol., 112:319-326. 14. FORESMAN, W.H., MESSING. Bladder Cancer: Natural History, Tumor Markers, and Early Detection Strategies. Semin. Surg. Oncol., 13(5):299-306, (1997). 15. GEORGIEV, T. (1955). Clinical and Chemical Laboratory Investigations of Chronic Vesical Hematuria. Veterinaria, 4:663-668. 16. GÖKSOY, K. (1968). Sığır Mesane Tümörlerinin Teşekkülünde Eğrelti Otunun (Pteris aquilina) Rolü. Doktora tezi. 1966. Ongun Kardeşler Matbaası. Ankara. 17. HARNDEN, P., ALLAM, A., JOYCE, A.D., PATEL, A., SELBY, P. and SOUTHGATE, J. (1995). Cytokeratin 20 Expression by Non-Invasive Transitional Cell Carcinomas: Potential for Distinguishing Recurrent from NonRecurrent Disease. Histopathology, 27(2):169-74. 18. INAGAKI, T., EBISUNO, S., UEKADO, Y., HIRANO, A., HIROI, A., SHINKA, T., OKHAWA, T. (1997).PCNA and p53 in Urinary Bladder Cancer: Correlation with Histological Findings and Prognosis. Int. J. Urol., 4(2):172-177. 19. INAGAKI, T., EBISUNO, S., UEKADO, Y., HIRANO, A., HIROI, A., SHINKA, T., OKHAWA, T. (1997).PCNA and p53 in Urinary Bladder Cancer: Correlation with Histological Findings and Prognosis. Int. J. Urol., 4(2):172-177. 20. KOTLIAR, S.N., WOOD, C.G., SCHAEFFER, A.J., OYASU, R. (1995). Transitional Cell Carcinoma Exhibiting Clear Cell Features. A Differential Diagnosis for Clear Cell Adenocarcinoma of the Urinary Tract. Arch. Pathol. Lab. Med., 119:79-81. 21. Luna, L.N. (1968). Manuel of Histologic Staining Methods of the Armed Forces rd Institute of Pathology. 3 Ed., McGraw-Hill, New York. 22. MAXIE, M.G. (1985). Enzootic Hematuria. The Urinary System. In: Jubb, K.V.F., Kennedy, P.C., Palmer, P. Pathology of Domestic Animals. 3rd Ed., Vol II, Academic Press, Florida. Pp: 398. 23. MEUTEN, D.J. (2002). Tumours of the Urinary System. In: Tumours in Domestic Animals. Ed: MEUTEN, D.J. Iowa State Press, Ames. pp:509-546. 24. NAFTALIN, J.M. and CUSHNIE, G.H. (1954a). Pathology of bracken poisoning in cattle. J Comp Pathol., 64(1):54-74. 19 25. NAFTALIN, J.M. and CUSHNIE, G.H. (1954b). Experimental bracken poisoning in calves. J Comp Pathol., 64(1):75-86. 26. OLSON, C., LUEDKE, A.J. and BROBST, D.F. (1962). Induced Immunity of Skin, Vagina and Urinary Bladder to Bovine Papillomatosis. Cancer Res., 22:463-468. 27. OLSON, C., PAMUKÇU, A.M. and BROBST, D.F. (1965). Papilloma-like Virus from Bovine Urinary Bladder Tumours. Cancer Res., 25:840-849. 28. ÖZKUL, I. A., AYDIN, Y. (1996). Tumours of the Urinary Bladder in Cattle and Water Buffalo in the Black Sea Region of Turkey. Br. Vet. J., 152: 473-475. 29. PAMUKÇU, A. M. (1974). Tumors of the Urinary Bladder. Bull. Wld. Hlth. Org., 50:43-52. 30. PAMUKÇU, A.M. (1955). Investigations on the Pathology of Enzootic Bovine Hematuria in Turkey. Zentrabl Vet. Med., 2(5):409-429. 31. PAMUKÇU, A.M. (1957). Tumors of the Urinary Bladder in Cattle and Water Buffalo Affected with enzootic bovine hematuria. Zentrabl Vet. Med., 4:185-197. 32. PAMUKÇU, A.M. (1963). Epidemiologic Studies on Urinary Bladder Tumors in Turkish Cattle. Ann. New York Acad. Sci., 108: 938-947. 33. PAMUKÇU, A.M., BRYAN, G.T. (1976). Pathology of the Bovine Urinary Bladder Tumors. Fırat Üniv. Vet. Fak. Derg., 3(3):27-44. 34. PAMUKÇU, A.M., ERTÜRK, E., BRYAN, G.T. (1977). Induction of Urinary Bladder and Intestinal Tumors in Mice by Feeding Bracken Fern. Ankara Univ. Vet. Fak. Derg., 24:28. 35. PAMUKÇU, A.M., ERTÜRK, E., YALÇINER, Ş., BRYAN, G.T. (1976). Histogenesis of Urinary Bladder Cancer Induced in Rats by Bracken Fern. Invest. Urol., 14:213. 36. PAMUKÇU, A.M., GÖKSOY, S.K., PRICE, J.M. (1967). Urinary Bladder Neoplasms Induced by Feeding Bracken Fern (Pteris aquilina) to Cows. Cancer Res., 27(1); 917924. 37. PAMUKÇU, A.M., OLSON, C., PRICE, J.M. (1966). Assay of Fractions of Bovine Urine for Carcinogenic Activity after Feeding Bracken Fern (Pteris aquilina). Cancer Res., 26(1); 1745-1753. 38. PAMUKÇU, A.M., OLSON, C., PRICE, J.M. (1966). Assay of Fractions of Bovine Urine for Carcinogenic Activity after Feeding Bracken Fern (Pteris aquilina). Cancer Res., 26(1); 1745-1753. 20 39. PEIXOTO, P.V., FRANÇA, T.N., BARROS, S.L.C. and TOKARNIA, C.H. (2003). Histopathological aspects of Bovine Enzootic Hematuria in Brazil. Pesq. Vet. Bras., 23(2):65-81. 40. PINTO, C. A., JANUARIO, T., GERALDES, M., LAUREN, D. R., SMITH, B. L. and Robinson, R. C. (2004). Bovine enzootic haematuria on Sao Miguel Island, Azores……… 41. SHAHIN, M., SMITH, B.L. and PRAKASH, A.S. (1999). Bracken Carcinogens in the Human Diet. Mutat Res., 443(1-2):69-79. 42. SMITH, B.L. (1997). The Toxicity of Bracken Fern (Genus Pteridium) to Animals and its Relevance to Man. In: Handbook of Plant and Fungal Toxicants. Ed: D’MELLO, F.J.P. Boca Raton, F.L:CRC Press. 43. SOSLOW, R.A., ROUSE, R.V., HENDRICKSON, M.R., SILVA, E.G., LONGACRE, T.A. (1996). Transitional Cell Neoplasm of the Ovary and Urinary Bladder: a Comparative Immunohistochemical Analysis. Int. J. Gynecol. Pathol., 15(3):257-265. 44. SOSLOW, R.A., ROUSE, R.V., HENDRICKSON, M.R., SILVA, E.G., LONGACRE, T.A. (1996). Transitional Cell Neoplasm of the Ovary and Urinary Bladder: a Comparative Immunohistochemical Analysis. Int. J. Gynecol. Pathol., 15(3):257-265. 45. THOMAS, A.J. (1963). Bracken Poisoning of Animals. Biochem. J., 65:5. 46. TOKARNİA, C.H., DÖBEREINER, J. and PEIXOTO, P.V. (2000). Plantas Tóxicas do Brasil. Editora Helianthus, Rio de Janeiro. 320p. 47. TSUJI, M., KOJIMA, K., KANAYAMA, H., KAWAGA, S. (1997). Prognostic Value of Ki-67 Antigen and p53 Protei in Urinary Bladder Cancer: Immunohistochemical Analysis of Radical Icystectomy Specimens. Br. J. Urol., 79(3):367-372. 48. TSUJI, M., KOJIMA, K., KANAYAMA, H., KAWAGA, S. (1997). Prognostic Value of Ki-67 Antigen and p53 Protei in Urinary Bladder Cancer: Immunohistochemical Analysis of Radical Icystectomy Specimens. Br. J. Urol., 79(3):367-372. 49. von BEUST, B.R., SUTER, M.M., SUMMERS, B.A. (1988). Factor VIII-Related Antigen in Canine Endothelial Neoplasms: an Immunohistochemical Study. Vet Pathol., 25(4):251-255. 50. YALÇINER, Ş. (1970). Eğrelti otunun (Pteris aquilina) kanserojenik etkisinin sıçanlar üzerinde araştırılması. Doktora tezi, Ankara Üniversitesi. 21 51. Pinto, C. A., Januario, T., Geraldes, M., Lauren, D. R., Smith, B. L. and Robinson, R. C. (2004). Bovine enzootic haematuria on Sao Miguel Island, Azores. In: Poisonous Plants and RelatedToxins, T. Acamovic, C. S. Stewart and T. W. Pennycott, Eds, CAB International, Oxon, UK, pp. 564^574. 52. deLeo, A. B., Jay, G., Appella, E. ve ark., Detection of a TransformationReleated Antigen in Chemically Induced Sarcomas and Other Transformed Cells of the Mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,76, 2420. In: İmmunomicroscopy: A diagnostic Tool for the Surgical Pathologist. Tumors of the Breast. Taylor, C. R., Cote, R. J. (1994). WB Saunders Company, Pennsylvania, 219-221, (1979). 53. Mayr, B., Reifinger, M., Alton, K., Novel Canine Tumor Suppressor Gene p53 Mutations in Cases of Skin and Mammary Neoplasm. Vet. Res. Com., 23, 285291, (1999). 54. Poller, D.N., Roberts, E.C., Bell, J.A., Elston, J.W., Blamey, R.W., Ellis, I.O., p53 Protein Expression in Mammary Ductal Carcinoma In-Situ: Relationship to Immunohistochemical Expression of Estrogen Receptor and c-erbB-2 Protein. Human Pathol., 24, 463-468, (1993). VII. EKLER Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından 13.07.2004 tarihinde kabul edilen proje “15,624 YTL (15,624.000 TL) ile desteklenmiştir. Destek miktarı; tüketime yönelik mal ve malzeme alımları (10,692 YTL) ile yolluk-yevmiyelerin (3457,50 YTL) karşılanmasında kullanılmış; tüketime yönelik mal ve malzeme alımları kalemindeki 872 YTL, yolluk yevmiye kalemindeki 102,50 YTL ile Geçici Personel kalemindeki 500 YTL kullanılmamıştır. 22
