drosophila genetiği - Biyoloji Ders Notları

T.C.
MUSTAFA KEMAL ÜNİVERSİTESİ
FEN-EDEBİYAT FAKÜLTESİ
BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
B. 353 GENETİK I LABORATUVAR KILAVUZU
DROSOPHİLA GENETİĞİ
HAZIRLAYANLAR
Prof. Dr. Mahmut ÇALIŞKAN
Yrd. Doç. Dr. Ayşe YAVUZ KOCAMAN
HATAY-2002
DROSOPHİLA GENETİĞİ
Drosophila melanogaster, genetiğin temel olaylarını uygulamalı olarak göstermek
için oldukça uygun bir organizmadır. Genellikle meyve sineği ya da sirke sineği olarak
bilinen D. melanogaster Thomas Hunt Morgan'ın çalışmalarıyla 1909 yılından beri genetik
çalışmalarında kullanılmaktadır. Günümüzde kalıtımla ilgili bilnenlerin çoğu bu canlılar
üzerinde yapılan çalışmalarla kazanılmıştır. Morgan ve öğrencileri Mendel kalıtımının
mekanizmasını anlamak ve ilk linkaj (bağlantı) haritasını yapmak için Drosophila'yı
kullanmışlardır.
Sitogenetikçiler kromozom morofolojisi ve karyotip çalışmak için; populasyon
genetikçileri emrimsel çalışmalar ve seleksiyon deneyleri için Drosophila'nın kullanışlı bir
organizma olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca D. melanogaster Genetik Mühendisliğinde ve
gelişimin moleküler temelinin anlaşılmasında kullanılan ilk ökaryotik organizmalardan
biridir. Bu canlının genetik çalışmalarda sıklıkla kullanılmasının nedenlerini şöyle
sıralayabiliriz:
1. Laboratuvarda yaşatılmaları kolay ve ekonomiktir.
2. Uygun büyüklükte olduklarından fazla yer işgal etmezler.
3. Generasyon süreleri kısa olup (25°C'de 10 gün) çok sayıda yavru meydana getirirler.
4. Kolayca incelenebilen ve ayırt edilebilen dört çift kromozoma sahiptirler (2n=8).
5. Larvalarının tükrük bezi hücrelerinde gözlenebilen dev kromozomların bulunuşu
sitogenetik çalışmalar için ideal yapılardır.
6. Kontrollü eşleştirmeler yapılabilir.
7. Çok sayıda genetik varyanta sahip olmaları kalıtımla ilgili problemlerin çözümü için
elverişlidir.
Laboratuvar Çalışması için Gerekli Ekipman
Stereo Mikroskop: Drosophila'nın morfolojik özelliklerinin belirlenmesinde, eşey
ayırımının yapılmasında vs. gereklidir.
Binoküler mikroskop: Tükrük bezi preparasyonlarında dev kromozomların gözlenmesi
çalışmalarında gereklidir.
Anestetizer: Temel olarak küçük bir şişe ve bayıltma işlemi için eter gereklidir.
Morg: Ölü sineklerin içine konulduğu, %70'lik alkol ya da deterjan ile hazırlanan şişelerdir.
Beyaz Fayans: Eterizasyon işlemi uygulanılan sinekler, tasnif işlemleri için beyaz bir zemin
üzerine alınarak incelenirler. Bunun için genellikle beyaz fayans kullanılır. Fakat cam
levhanın altına beyaz kağıt konularak da aynı işlem yapılabilir.
Fırça: Çalışmalar sırasında sineklerin zarar görmesini engellemek için yumuşak kıllı
suluboya fırçaları kullanılır.
İnkübatör (etüv): Sineklerin yetiştirilmesi için 24 °C sabit sıcaklığa ayarlı inkübatör
gereklidir.
Genetik Terminoloji
Alel: Bir genin alternatif formlarından biridir.
Diploit: Hücre çekirdeğinde herbir kromozom tipinin iki kopyasının bulunmasıdır. Böyle
kromozom takımına diploit ya da 2N denir. Sirke sinekleri diploittir ve 4 çift kromozom
taşırlar.
Dominant/resesif: Diploid organizmalarda bir alel fenotipik olarak hem homozigot hem de
heterozigot durumlarda ifade edilebiliyorsa dominanttır (baskın). Alel sadece homozigot
durumlarda fenotipik özelliğini ortaya koyabiliyorsa resesif (çekinik) denilir.
Fenotip: Organizmanın gözlenebilir özellikleridir. Genotip ile çevrenin etkileşimiyle
meydana gelir.
F1: Birinci oğul döl (First filial generation); bir deneysel çaprazlamadan elde edilen yavru
döllerdir. F1'in atasoyu (ebeveyn=parent) P olarak gösterilir.
F2: F1 bireylerinin kendi aralarında çaprazlanması sonucu elde edilen yavru döller.
Gen: Gen, klasik anlamda bir kalıtım birimidir ve genellikle genomdaki spesifik bir
kromozom üzerinde spesifik bir pozisyonda (lokus) bulunur; pratik olarak organizmanın
fenotipi üzerine bir ya da daha fazla spesifik bir etkiye sahip olan bir birimdir; moleküler
seviyede bir DNA molekülündeki nükleotidlerin spesifik bir dizilimidir.
Genom mutasyonu: Türü için normalden farklı sayıda kromozomlu bireyler ya da
heteroploid hücreler meydana getiren kromozom sayısındaki değişimdir. Böyle bir değişim
tüm kromozom takımlarını içerebilir (öploidi) ya da bir ya da daha fazla kromozomda
olabilir (anöploidi).
Genotip: Bir hücrenin ya da organizmanın genetik bileşimidir.
Gonozom: Eşey kromozomlarıdır. Drosophila'da X ve Y kromozomları cinsiyeti belirler.
Haploid: N olarak sembolize edilen gametik kromozom sayısı.
Hemizigot: Genin tek bir alel taşıması durumudur. Haploid organizmadaki gen, ya da
heterogametik cinsiyetteki cinsiyete bağlı gen olabilir. Örneğin erkek bireylerdeki X'e bağlı
genlerin durumuna hemizigot denir. Çünkü bunlar Y kromozomu üzerinde hiçbir karşılık
alele sahip değildir.
Heterogametik eşey: Eşey kromozomları bakımından benzer olmayan gametler meydana
getiren cinsiyettir (Drosophila ve memelilerin erkek bireyleri X ve Y meydana getirirler).
Heterozigot: Homolog kromozomun karşılıklı lokuslarında farklı alellere sahip olma
durumu.
Homogametik eşey: Sadece bir çeşit gamet meydana getiren cinsiyettir (Drosophila ve
memelilerin dişileri sadece X kromozomu taşıyan yumurta meydana getirirler).
Homolog kromozom: Şekil, yapı ve fonksiyon bakımından birbirine benzeyen ve biri
anadan diğeri babadan gelen kromozomdur. Homolog kromozomlar genin aynı lineer
dizilimini taşırlar ve her bir gen diploid bir organizmada bir çift oluşturur.
Homozigot: Homolog kromozomların karşılıklı lokuslarında benzer alellerin bulunmasıdır.
Kontrol çaprazlama: Bir genotipin homozigot mu yoksa heterozigot mu olduğunu anlamak
için resesif homozigot bir genotiple çaprazlanması olayına denir.
Kromozomal mutasyon: Genetik bilgiyi taşıyan kromozomun duplikasyonu, delesyonu gibi
birden fazla gen bölgesinin değişime uğraması.
Letal mutasyon: Organizmanın ölümüne neden olan mutasyondur. Dominant letal
dominantları öldürürken homozigot letal sadece homozigotları öldürür.
Lokus: (çoğulu: loci) Bir genin kromozom üzerinde yer aldığı alan.
Mendel genetiği: Gregor Johann Mendel'in 1854'te başlayan bezelyelerle yaptığı çaprazlama
çalışmalarıyla elde ettiği sonuçlar günümüzde genetiğin temelini oluşturmakta ve Mendel
Genetiği olarak bilinmektedir. Mendel genetiğini oluşturan bu kanunları şunlardır:
1. Dominantlık (İzotipi) kanunu: Aynı karakter bakımından fark gösteren iki homozigot
bireyin eşleşmesi sonucu meydana gelen melez bireylerin genotipleri birbirinin aynıdır, yani
bunlar izotoptur. Bu kanuna izotipi kanunu denir.
2. Segregasyon (=Ayrılım) kanunu: Gamet oluşumu sırasında bir genin alelleri rastgele
ayrılarak oluşan her gametin bunlardan birini alması sağlanır.
3. Bağımsız açılım (=Independent assortment) kanunu: Farklı genlere ait alellerin eşey
hücrelerinde (gametlerde) bir araya gelmeleri birbirinden bağımsızdır ve rastlantıya bağlıdır.
Bu kural eğer genler birbirine bağlı genler değilse geçerlidir.
Mutasyon: Kalıtsal molekülde dölden döle aktarılabilen değişiklikler meydana getiren ani
ve tesadüfi değişmelerdir.
Nokta (gen) mutasyon: Sadece bir geni etkileyen mutasyondur.
Otozom: Eşeylikle ilgisi olmayan, vücut kromozomlarıdır (insanda 44, Drosophila'da 6
tanedir).
Poliploidi: Bir bireyin ya da hücrenin ikiden fazla kromozom setine sahip olmasıdır.
Resiprokal çaprazlama: Herhangi bir karakter bakımından farklılık gösteren iki birey
arasında yapılan karşılıklı çaprazlamadır. A ♀ x B ♂ ve B ♀ x A ♂ şeklindeki
çaprazlamadır.
Genetik Semboller
Genetik deneylerde kullanılan semboller genin normal ya da mutant olmasına göre
değişmektedir. Yabanıl tip alel, doğal populasyonlarda en yaygın olarak bulunan, mutasyon
meydana gelmeden önceki orijinal aleldir. D. melanogaster'in normal tipini ifade eden
yabanıl tip + ile sembolize edilir. + sembolü tüm yabanıl tip genler için geçerlidir.
Mutasyonlar için ise mutasyonu tanımlayan adın yazılışından uygun harfler türetilerek
sembolize edilir. Örneğin, Drosophila 'da körelmiş kanadı meydana getiren mutasyon için
vg (vestigial), kahverengi gözlü mutasyon için se (sepia), tüysüz mutasyon için ise H
(hairless) kullanılır.
Resesif mutantlar küçük harfler ile vg yazılırken, dominant mutantlar kullanılan
sembolün ilk harfinin büyük olanı ile H yazılır. Diploid organizmalarda homozigotlar
sembolü iki kere yazarak vg/vg ya da bazen sembolü tek başına yazarak vg ile gösterilir.
Yabanıl tip homozigotlar da +/+ veya sadece + ile belirtilebilir.
Vestigal ve yabanıl tip gibi tek bir gen farklılığına dayanan heterozigotlar +/vg ile
gösterilir. Eğer farklı kromozomlarda bulunan iki veya daha fazla gen çifti kaybedilecekse
(vg ve H gibi) her iki mutant için homozigot olan sinek vg/vg, H/H veya vg/H olarak
gösterilir. İki gen farklılığı için yabanıl tip / mutant heterozigot vg/+, H/+ olarak sembolize
edilir.
Yabanıl tip gen ayrıca mutant faktörün sembolü üstüne + yazılarak da belirtilebilir.
Örneğin vg+/vg+ ya da +/+ kanat özelliği bakımından homozigot bireyi ifade eder. Benzer
şekilde, w/+ ile w/w+ aynı genotipi (heterozigot kırmızı göz) ifade ederler.
Görüldüğü gibi; Drosophila 'da kullanılan genetik sembol sistemi diğer birçok
organizmada kullanılandan farklıdır. Bir karakteri belirtmek için aynı harfin büyük ve küçük
yazımı kullanılmaz. Örneğin, B ve b farklı genleri gösterir, bir genin alternatif alelleri
değildirler. B dominant bir mutasyon (Bar göz) ve onun yabani tip aleli B +'dır. Oysa b
resesif mutasyondur (siyah vücut rengi), normal vücut rengi b+ ya da sadece + ile gösterilir.
Bir kural olarak dişi ebeveynin genotipi önce (sola) yazılır sonra çaprazlamayı
temsilen X işareti ve sonra da (sağa) erkeğin genotipi yazılır. Eğer çaprazlamadaki genler
otozomal ise genetik formül eşey kromozomlarının özel sembolleri olmadan yazılır.
Bir kromozom üzerindeki birkaç gen birlikte kalıtılıyorsa yani bağlantı durumu söz
konusu ile, genlerin sembolleri bir homolog kromozom üzerinde birlikte yazılır ve iki yatay
çizgi ile diğer homolog üzerindeki genlerden ayrılır:
wm
wm
wm
/
genotipi w (white) ve m (miniature) genlerinin aynı kromozom üzerinde olduğunu ifade
eder.
DROSOPHILA BİYOLOJİSİ
Drosophila melanogaster gelişimleri tam metamorfozlu olan holometabol böcekler grubuna
girer. Drosophila sineklerinin döllenme ve zigot oluşumunun ardından embriyonik gelişim
ve diğer hayat devreleri süre bakımından ortam sıcaklığına bağımlılık gösterir. Optimum
büyüme sıcaklığında (25°C) ortalama 10-15 günde ergin duruma geçerler.
Embriyonik gelişim
Birinci larval instar (L1)
İkinci larval instar (L2)
Üçüncü larval instar (L3)
1 gün
1 gün
1 gün
2 gün
Prepupa
Pupa
Ergin
4 saat
4.5 gün
40-50 gün
Erkekler pupal evreden çıktıktan kısa bir süre sonra eşeysel olarak fertil ve olgun
duruma geçerler. Dişilerin olgunluğa erişmesi soylara bağlı olarak 6-12 saat arasında değişir.
Dişi bir defa eşeysel olgunluğa eriştiği zaman birçok erkek sinekle tekrar tekrar eşleşebilir.
Sperm, dişi tarafından karın kısmında depo edilir ve kısa bir zaman sonra yumurtaları
döllemek için kullanılır.
Her ne kadar ergin sineklerin ömrü 25°C'de 40-50 gün arası ise de bireyler 80 güne
kadar yaşayabilirler. 10 günlükten daha büyük olmayan genç sinekler çaprazlama
çalışmalarında kullanılır. Çünkü sineklerin yaş ile beraber fertiliteleri azalır.
Standart koşullar altında (25°C, % 60 kısmi nem) yumurtadan tam ergin bireyin
gelişimi yaklaşık 10 günü alır. Düşük sıcaklıklarda yaşam döngüsü uzar; 23.5 °C'de 14 gün,
18 °C'de 21 gündür. Kültürlerin 18 °C'den daha küçük sıcaklıklarda bulunması
metabolizmayı yavaşlatır ve bu da kültürün devamlı olarak yeni besiyerlerine transfer
oranını azaltır. Sıcaklığın artmasıyla gelişim hızlanabilir. Fakat 29-30 °C arasında çarpıcı
olarak pupal ölüm artışı gözlenir ve birçok soyda 30°C'nin üzerindeki sıcaklıklarda dişiler
steril hale gelirler yani yumurta üretemezler. Ayrıca sıcaklık artışı çeşitli bakteri, mantar gibi
organizmaların gelişmesine neden olacağından sinek kültürlerinin kullanılamaz hale
gelmesine neden olur.
Yumurta ve Embriyolar
Yumurtalar oval şekilli, yaklaşık 0.5 mm uzunluğunda ve 0.2 mm çapındadır. Dorsal
tarafları ventral taraflarına göre daha yassıdır. Dorsal tarafın anterior ucunda iki filament
bulunur. Bunlar yumurtanın yumuşak besi ortamına batmasını engeller ve oksijen alımını
sağlar. Yumurta koruyucu görevi olan koryon zarı ile kaplanmıştır.
Yumurtaları karnında depo eden dişiler şişkin görünürler. Bu durumdaki dişiler erkek
içermeyen besi yerine aktarılırlarsa döllenmemiş yumurtaları taşıyan virjin dişiler elde
edilir.
Erkeklerin testislerinde, diploid spermatogonialardan haploid spermler üretilir.
Spermin boyu 1.7-1.8 µm kadardır.
Kopulasyon sırasında, spermler dişinin uterusuna aktarılır. Sperm burada günlerce
canlı kalabilir. Yumurtalar dişinin uterusunda döllenir. Döllenme sırasında tek bir sperm
mikropil tarafından yumurtaya girer (monospermi). Dişi, yumurtalarını ya hemen
döllenmenin ardından bırakır ya da embriyonik gelişmenin ilk dönemleri uterusta geçer.
Larva
Embriyonik gelişimden yaklaşık 1 gün sonra yumurtadan çıkan larvalar, besiyerinin
yüzeyinde bulunurlar. Larval gelişim sırasında bira mayası hücreleri temel besin
maddeleridir. 1 gün sonra ilk deri değişimi gerçekleşir. Bu larvanın birinci instar (L1)
döneminden ikinci instar (L2) dönemine geçişidir. Larva, 1 gün daha sonra, ikinci deri
değişimi ile üçüncü instar döneme (L3) geçer. L3 larva dönemi boyunca 2 gün süresince
beslenir ve hızla büyürler. Yaşlı larvalar besi yerini delik deşik ederler ve besi yeri içinde
tünel açan işçiler gibidirler. Larvalar kültür şişesinin etrafında ve besi yeri içinde çıplak
gözle bile görülebilirler. Besin almalarını sağlayan çengel şeklindeki ağız parçaları önemli
özelliklerindendir.
Pupa
Üçüncü larval dönemin sonunda, larvalar besi yerinden ayrılırlar ve diğer gelişimlerini
tamamlamak için şişenin etrafındaki uygun bir yere tırmanarak pupalaşırlar. Pupalar
başlangıçta beyazdır, sonra iki saat içinde koyumsu sarı renk, en sonunda da
kahverengileşirler. Pupa evresi hareketsizdir ve beslenme görülmez. Pupal periyodda bir
erginin organları ve vücut formuna sahip bir bireyin gelişmesi için gerekli dönüşümler
(metamorfoz) gerçekleşir. Bu gelişme 20°C'de 6 gün, 25°C'de 4 günde tamamlanır.
Ergin Sinekler
Pupa formasyonu içinde gelişimin tamamlanması ile ergin sinekler pupa kılıfının anterior
ucunu (operkulum) delerek dışarı çıkarlar. Yeni çıkan ergin bireyler önceleri açık renkli ve
uzun vücutludur. Fakat daha sonra birkaç saat içinde renkleri koyulaşır. Kanatlar ve
vücudun diğer kısımları başlangıçta yumuşaktır. Havadaki oksijene maruz kaldıklarında
birkaç saat içinde sertleşir. Böylece başlangıçta kırışık olan kanatlar açılır ve normal ergin
birey görünümüne ulaşırlar.
ERGİN SİNEKLERDE EŞEY FARKLILIKLARI
Genetik çaprazlamalar için ergin dişi ve erkek sineklerin birbirlerine karıştırılmadan
ayrılması zorunludur. Her ne kadar ergin dişi ve erkekler arasında birçok morfolojik
farklılıklar var ise de bunlardan yalnız birkaçı eşey farklılıklarını belirlemek için
güvenilirdir.
1. Eşey Tarağı: Ergin sinekler stereo mikroskop altında incelendikleri zaman; erkek
bireylerin birinci çift yürüme bacaklarının Tarsus segmentinin bazal tarafında siyah ve kalın
bir seri kıldan meydana gelmiş "eşey tarağı" (sex comb) denilen yapılara sahip olduğu
gözlenir. Dişilerde bu yapı bulunmaz. Deneysel çaprazlamalar için erkek ve dişi bireyleri
seçerken bu özelliğin kullanılması (özellikle pupadan yeni çıkmış sineklerde) güvenilir
olmaktadır.
2. Genital Organ ve Abdominal Renklenme: Genital organın dış yapısı her iki cinsiyette
birbirinden farklıdır. Fakat bu farklılıklar sadece mikroskopta 25-ya da daha fazla kez
büyültme sonucu gözlenebilir. Genel olarak erkeğin genital organı daha koyu yapıya
sahiptir.
Dişiler karın bölgesinde 7 abdomen segmentine sahiptir. Erkeklerde ise sadece 5
abdomen segmenti vardır. Erkek sineklerde abdomenin son kısmı siyahtır, çünkü son
segmentlerde güçlü bir şekilde pigment birikimi olur ve böylece siyah bir bölge oluşur. Dişi
sineklerde ise abdomen segmentleri açık ve koyu bantlar halinde uç kısma kadar uzanır
(Bkz. Şekil 1). Bu özellikler, özellikle pupadan yeni çıkmış bireylerin eşey ayırımı için
uygun değildir. Çünkü bireylerde pigmentasyon henüz tam olarak gelişmemiştir. Ayrıca
bayıltılmış erkek sineklerin abdomenleri uzar ve bu da abdomenin dişilerinkine benzer
olarak çizgili görünmesine neden olabilir.
3. Abdomenin Şekli: Erkek sineklerin abdomen ucu küttür oysa dişilerinki uzundur. Ayrıca
dişilerin yaşlanması ve devamlı yumurta gelişimi dolayısıyla abdomen geniştir.
4. Vücut Büyüklüğü: Genel olarak dişiler erkeklere göre daha büyüktür. Fakat ergin
sineklerin vücut büyüklüğü larval dönem boyunca beslenme durumlarına bağlı olduğundan,
güvenilir bir kriter değildir.
5. Kanat Uzunluğu: Dişilerin kanatları erkeklerinkine oranla daha uzundur. Fakat bu
özellik de eşey ayırımı için uygun değildir.
GENETİK ÖZELLİKLERİ
Drosophila 'ların somatik doku hücrelerinde diploid sete sahip 4 çift kromozom
(2N=2X=8) bulunur. Bu seti oluşturan kromozomlardan 3 çifti otozomal (somatik
kromozomlar) 1 çifti de gonozomal (cinsiyet kromozomları) dır. Bunlar X, Y, 2, 3 ve 4
şeklinde numaralandırılmıştır. Dişilerde 2 tane çubuk şeklinde X kromozomu, erkek
sineklerde ise 1 X kromozomu ve 1 de ters J şeklinde Y kromozomu bulunur.
Homogametik dişiler (XX) ile heterogametik erkekler (XY) arasındaki eşey
kromozomu farklılıklarının özel bir önemi vardır. Erkeklerde X kromozomu sadece 1 tane
bulunur ve bu yüzden X üzerindeki genler hemizigot durumda bulunurlar. Bunun sonucu
olarak X kromozomu üzerinde meydana gelen mutasyonlar (cinsiyete bağlı genler)
dominant olmasına bakılmaksızın erkeklerde fenotipik olarak gözlenir. Yani resesif
mutasyonlar erkek bireylerde dominant mutasyonlar kadar fenotipe yansır.
Dev Kromozomlar
Dipter larvalarının tükrük bezleri, barsak, trake, yağ dokusu ve malpighi tübülleri gibi çeşitli
somatik doku hücrelerinde bulunan ve aynı organizmanın diğer vücut hücrelerindekine
kıyasla yaklaşık 1000 kat daha büyük olan kromozomlara politen kromozomlar
denilmektedir. (Bkz. Deney I ve Şekil 5).
Mayozun Genetik Kontrolü
D. melanogaster 'de mayozun çok özel genetik kontrolü dikkat çeker. Dişilerde oogenez
sırasında mayozda krosing over düzenli olarak meydana gelir. Bunun aksine erkeklerdeki
spermatogenezde mayotik krosing over görülmez ya da çok nadir meydana gelir. Erkek
sineklerde krosing over görülmemesinin sebebi kromozom üzerindeki genlerin birbirine çok
yakın bulunmasından kaynaklanmaktadır. Bu durum spermatogenez sırasında kiyazma
bölgesinin oluşmasını engellemektedir.
SİNEKLERİN LABORATUVARDA YETİŞTİRİLMELERİ
Drosophila kültürleri, laboratuvar koşullarında 24°C sabit sıcaklığa ayarlı
havalandırmalı etüvde yetiştirilirler.
Kültür kaplarının büyüklüğü laboratuvar şartlarına ve deneyin amacına göre
değişebilir. Fakat, sınıf deneylerinde genellikle 200 ml'lik cam şişeler uygun olmaktadır. Bu
amaçla süt ya da ayran şişeleri kullanılabilmektedir. Kültür kabunun renksiz camdan olması,
sineklerin gelişimlerinin kolay izlenebilmesi sebebiyle tercih edilmektedir. 200 ml'lik şişeye
yaklaşık 40 ml besi yeri konularak ağzı tıpayla kapatılır. Tıpa şişeye yeterli havanın geçişini
engellemeyecek bir özellikte olmalıdır. Bu nedenle ya sünger tıpa ya da gazlı bez ile
sarılmış pamuk yumağı kullanılır. Şişeler ve tıpalar kullanılmadan önce steril edilirler (kuru
hava ile sterilizasyon).
Meyve sinekleri doğada, fermente olan çeşitli bitki materyallerinin üzerinde
bulunurlar, fakat doğrudan meyve üzerinden beslenmezler. Mayalar bu sineklerin temel
besin maddesini oluştururlar. Bu nedenle maya çoğalmasını sağlayan her türlü ortam onlar
için iyi bir besin ortamıdır. İyi bir kültür ortamı, larvanın beslenmesine ve mayanın
gelişmesine yeterli olacak miktarda şeker içermeli ve uygun yumuşaklıkta olmalıdır.
Değişik laboratuvarlarda çok çeşitli kültür ortamları hazırlanabilmekte, ya da hazır
olarak satın alınabilmektedir. Bizim laboratuvara kullanılan besiyerinin içeriği ve hazırlanışı
aşağıda verilmiş olup, hazırlanması kolay ve ucuz olma özelliğine sahiptir.
a) Besiyerinin içeriği:
104 g mısır unu
94 g şeker
9 g bira mayası
6 g agar
1020 ml distile su
6 ml asit karışımı (7.83 ml Ortofosforik asit + 8.36 ml Propiyonik asit + 1081 ml
distile su)
b) Hazırlanışı:
Mısır unu, toz şeker ve bira mayası tartılarak üzerine 500 ml distile su konur ve iyice
karıştırılır. Geri kalan 520 ml distile su içine ise agar tartılarak konur ve tamamen eriyinceye
kadar kaynatılır. Bu arada mısır unu, şeker, bira mayası ve sudan oluşan karışımın da
pişirilmeye başlanmış olması gerekir. Kaynama durumundaki bu karışımın üzerine, eritilmiş
agar üç aşamada dökülür ve devamlı olarak karıştırılır. İyice homojen hale gelince üzerine
mantar-bakteri gelişmesini önleyici özelliği olan asit karışımı ilave edilir ve dağılması için
kaşık ile karıştırılır. Fakat asit karışımının fazlası gerek maya gerekse sineklerin gelişimini
engelleyeceğinden sadece yeterli miktarda konulmalıdır.
Böyle bir ortamda mayalar çok hızlı bir şekilde çoğalırlar ve sinekler için iyi bir
besin kaynağı olurlar. Fakat aşırı miktarda maya katılmamasına dikkat edilmelidir. Çünkü
maya hücreleri sinekler için gerekli olan O2'yi kullanarak ortamdaki oksijenin azalmasına
neden olurlar.
Hazırlanan besi ortamı sıcak iken steril kültür şişelerine yaklaşık 2 cm yükseklikte
olacak kadar dökülür ve ağzı tıpa ile kapatılır. Soğurken agar nedeniyle katılaşır.
Kullanılana kadar serin ve temiz bir yerde saklanır.
SİNEKLERİ BAYILTMA İŞLEMİ (ETERİZASYON)
Kontrollü çaprazlama deneylerinde kullanılacak olan sineklerin çeşitli fenotipik
özelliklerini önceden belirlemek gerekir. Bu nedenle canlı sinekler bayıltma işlemine tabi
tutulur. Bu amaçla iki farklı gaz; eter ve CO2 uygundur. Fakat gerekli ekipmanı daha basit
olduğu için sınıf deneylerinde eter kullanmak daha avantajlıdır.
Eter kullanımındaki temel prensip sinekleri kısa bir süre için eter buharına maruz
bırakmaktır. Etere maruz bırakma süresi oldukça kısa olmalıdır. Çünkü sinekleri anestezi
etmek, kısırlaştırmak ya da ölümlerine neden olmak arasında çok kısa bir süre vardır.
Kısırlaşan sinekler döl vermemeleri ile tanınabildikleri halde ölen sinekler kolayca
tanınırlar. Çünkü fazla eter buharının etkisi ile ölen sineklerin kanatları thoraxtan ayrılarak
45°'lik bir hal alır. Bacaklar aşırı kasılmadan dolayı gergin uzanırlar ve vücut kıvrılarak
hareketsiz kalır.
Eterizasyon işlemi için bayıltma şişesine, etere ve pamuğa ihtiyaç vardır. Kültür
şişelerinden bayıltma şişelerine sineklerin aktarılmasında hızlı ve dikkatli olmak gerekir.
(1) Yumak haline getirilmiş pamuk üzerine birkaç damla eter damlatılarak bayıltma
şişesinin ağzına kapatılır.
(2) Kültür şişesinde bulunan sineklerin şişenin tabanında toplanması için bir kağıt
destesi üzerine vurulur.
(3) Kültür şişesinden pamuk tıpa çıkarılarak ağzı, bayıltma şişesinin ağzı üzerine
getirilir. Burada şişelerin durumunu korumasına dikkat edilmelidir. Çünkü meydana gelecek
küçük bir açıklıktan sinekler kaçabilirler.
(4) Sineklerin dikey durumda olan şişelerden alttaki şişeye düşmesi için alttaki şişe
bir kağıt destesi üzerine hafifçe vurulur. Böylece sinekler bayıltma şişesinin içine düşerler.
(5) Her iki şişe birbirinden ayrılır ve hemen kültür şişesine tıpası tekrar kapatılırken
bayıltma şişesine de üzerine eter damlatılmış pamuk tıpa kapatılır.
Yaklaşık 1-2 dakika sonra sinekler eter buharının etkisiyle bayılırlar. Bu anestezik
uygulamadan sonra sinekler normal havaya alınır ve stereo mikroskop altında tabanına
beyaz kağıt yapıştırılmış bir petri kabı içinde ya da beyaz fayans üzerinde yumuşak bir sulu
boya fırçası kullanılarak incelenirler. Sinekler bu şekilde 10-15 dakika kadar kalabilirler.
Anestezi etkisinin geçmesiyle hareket etmeye başlayan sinekler eğer gerekirse içine
konuldukları petri kabunda tekrar bayıltılabilirler. Ölüm durumunda bazı fenotipik
karakterler değişebileceğinden inceleme ve sayım işlemlerine alınmamalıdır. Ölen, işe
yaramayan ya da kullanılmayan sinekler morga atılır.
UYARI: Eter ve hava karışımı patlayabilir. Eterin kaynama noktası yaklaşık 35 °C'dir. Eter
güçlü bir narkotiktir. Çalışma ortamında yeterince temiz havanın bulunması önemlidir. Eter,
zehirli peroksidazın meydana gelmesini engellemek için kahverengi şişelerde saklanmalıdır.
Solumamalı ve etrafında ateş yakılmamalıdır.
UYARI: Bayıltma işlemi sırasında sinekler doğrudan etere maruz bırakılmamalıdır.
YENİ KÜLTÜRE BAŞLAMA VE TRANSFER İŞLEMLERİ
Yeni bir kültüre başlandığı zaman ne şişe duvarının ne de besiyeri yüzeyinin ıslak
olmaması gerekir. Her ne kadar Drosophila 'nın kelime anlamı "nemi seven" olsa da sinekler
ıslak kısımlara yapışabilir ve ölebilirler.
Laboratuvarda yetiştirilen Drosophila kültürlerinin en az ayda 1 kez taze besiyeri
içeren şişelere aktarılması gerekir. Bunun için öncelikle yeni hazırlanan şişenin üzerine
tarih, Drosophila soyu gibi bilgiler yazılarak etiketlendirilir. Aktarma işleminde en basit yol
bir şişeden taze besiyeri içeren şişeye sineklerin doğrudan aktarılmasıdır. İlk olarak sinek
içeren şişe bir kağıt destesi üzerine vurularak sineklerin şişenin tabanında birikmesi sağlanır.
Sonra her iki şişenin tıpası çıkarılır. Sinek içeren şişenin ağız kısmı boş olan şişenin ağzına
getirilir (ya da tersi uygulanarak, şişeler ters yüz edilir). Tekrar kağıt destesi üzerine
vurularak üstteki sineklerin boş şişeye geçmesi sağlanır. Sonra hızla her iki şişenin ağızları
tıpaları ile kapatılır.
Çaprazlama deneyleri sırasında ise stereo mikroskop altında eşey tayini yapılan
sinekler bayılmış durumdadırlar. Bu haldeki sineklerin yeni besi yerine aktarılması oldukça
dikkatli olmayı gerektiren bir işlemdir. Aktarma sırasında anestezi halindeki sineklerin
besiyerine ya da diğer yüzeylere yapışmaması gerekir. Bunun için en kolay yol şişeyi eğik
tutarak petri kabu içindeki ya da beyaz bir fayans üzerindeki sineklerin şişenin kuru tarafına
yumuşak bir fırça yardımıyla aktarılmasıdır. Sinekler hareket edene kadar şişenin yatay
konumda kalması gerekir. Anestezinin etkisi geçtikten sonra şişe dik konuma getirilmelidir.
Aynı amaç için kullanılan diğer bir yol da Anestezi uygulanmış sineklerin önce boş, kuru ve
temiz olan bir şişeye alınıp ayılmalarının beklenmesi ve daha sonra hareketli sineklerin taze
besi yeri içeren şişeye aktarılmasıdır.
DENEYSEL ÇAPRAZLAMALAR
Çaprazlamalara başlamadan önce ergin sineklerin eşeysel dimofizme dayanan
özellikleri ile mutantların belirgin fenotipik özelliklerinin çok iyi bir şekilde öğrenilmesi
gerekmektedir.
1. Virjin Dişilerin Seçilmesi
Çaprazlama deneyleri için henüz hiç döllenmemiş virjin dişilere ihtiyaç duyulur. Virjin
dişileri toplamak için tercihen 9-10 günlük, koyu kahverengi pupaları olan kültür seçilir ve
bu şişeden tüm erginler uzaklaştırılır. Kültürde tek bir dişi ya da erkek sinek kalmamalıdır.
Stok kültüre bağlı olarak 6-8 saat sonra dişiler toplanır. Dişi sinekler pupadan çıktıktan
sonra yaklaşık 12 saat çiftleşmezler. Bu süre sonunda sinekler eter ile bayıltılır. Stereo
mikroskop altında dişiler ve erkekler iyi bir fırça kullanarak dikkatli bir şekilde ayırt edilir.
Erkekler genellikle atılır ya da diğer çaprazlamalarda kullanılmak için uzaklaştırılır. Dişiler
hiç erkek içermeyen taze bir besiyerine alınırlar. Burada 2-3 gün içinde eşeysel olgunluğa
erişirler.
Virjin dişilerin toplanması Drosophila deneylerinin en kritik kısmını oluşturur. Bu
nedenle virjin dişilerin toplanması aşağıda tekrar aşamalar halinde yazılmıştır.
(1) Virjinleri toplamaya başlamadan önce, kültürde tek bir sinek bile kalmamalıdır.
(2) Pupadan çıkan ergin sinekler en kısa zamanda şişeden alınarak cinsiyet tayini
yapılmalıdır.
(3) Her iki cinsiyet birbirinden çok dikkatli bir şekilde ayırt edilmelidir. Erkeklerdeki
eşey tarağı ve genital bölgenin dış yapısı pupadan yeni çıkmış sineklerin eşey ayırımı için
en kullanışlı özelliklerdir.
(4) Yeni kültür şişesine dişileri aktarmadan önce hiç erkek bulunmadığına emin
olunmalıdır.
2. Erkeklerin Toplanması
Erkek sinekler herhangi bir zamanda toplanabilirler. Erkeklerin çok genç olması gerekmez.
Genellikle 1-2 günlük erkek sinekler toplanır ve besiyerine alınırlar.
3. Bazı Mutantlar
Değişik soylardan alınan 2-6 günlük sinekler eter ile bayıltılarak stereo mikroskop altında
incelendiğinde, vücut rengi, göz şekli ve rengi, kanat büyüklüğü ve şekli, kanat damarlanma
tipi, kılları gibi özellikler bakımından, yabani tip (wild type) Drosophila 'dan farklı
morfolojik özelliklere sahip oldukları gözlenir. Bunlar yabani tip Drosophila 'nın mutant
tiplerini oluştururlar.
Yabanıl tip terimi, organizma için genotip ve fenotip bakımından standart olarak
belirlenen bir soy, gen ya da organizmayı gösterir. Örneğin yabanıl tip Drosophila soyu, gri
vücut rengine ve uzun kanatlara sahiptir; göz şekli yuvarlak ve göz rengi ise parlak
kırmızıdır. Yabanıl tip genlerin mutasyonal değişimleriyle mutant aleller ve dolayısı ile
mutant soylar ortaya çıkar.
Bazı mutant soylar aşağıda listelenmiştir.
Sembol
Tanımlama
b
black; siyah vücut rengi
B
Bar; homozigot B/B ♀ ve hemizigot B/Y ♂: gözler küçülmüş çubuk göze
yaklaşmıştır; B/+ ♀: böbrek şekilli gözler
bw
brown; kahverengimsi kırmızı göz rengi
Cy
Curly; kanatlar yukarıya doğru kıvrılmıştır.; homozigot hali öldürücüdür.
dm
diminutive; kıllar kısa ve incelmiş; dm/dm dişileri kısırdır.
dp
dumpy; kanadın posterior ucu kesik
e
ebony; siyah vücut rengi; e geninin kromozom üzerinde bulunuş yeri b'den
farklı
ey
eyeless; göz, normal gözün yaklaşık olarak 1/4 'ü kadar
f
forked; kıllar çatallanmış
H
Hairless; postvertikal ve abdominal kısımlarda kılları yoktur; homozigot hali
öldürücüdür.
m
miniature; kanatlar kısa; yaklaşık abdomen boyu kadar
Pm
Plum; kahverengimsi göz rengi; homozigot hali öldürücü
ry
rosy; koyu kırmızı göz rengi
se
sepia: kahverengi göz rengi; yaşlandıkça koyulaşır.
sn
singed; kıllar kısa ve karışık
vg
vestigal; kanatlar körelmiş, küçülmüş
w
white; beyaz göz rengi
y
yellow; ergin sineklerin vücut rengi sarı
4. Çaprazlama
Farklı mutant formlar arasında çaprazlama yapmak için bir mutant grubundan alınan
yaklaşık 3-5 virjin dişi, diğer mutant gruptan alınan aynı sayıdaki erkek sinekle yeni bir
kültür ortamında eşleştirilir. Çapraz kurulur kurulmaz kültür şişesinin üzerine çaprazlama
çeşidi, kullanılan sineklerin cinsiyeti, sayısı ve tarih gibi bilgiler yazılır (etiketleme). Bu
kültür şişeleri 24 °C sabit sıcaklıktaki etüve alınır. Dişiler çiftleşmeden 2 gün sonra yumurta
bırakmaya başlarlar. Çaprazlama yapılan kültür şişesinde ortalama 5 gün sonra larvalar
ortaya çıkar ve bunlar besin içinde tünel kazan işçiler gibi görünürler. Larvaları koyu renkli
ağız parçalarından dolayı ayırt etmek kolaydır. Yaklaşık 7-8 gün sonra pupalar görülmeye
başlandığında, kültür şişesinden ebeveynler uzaklaştırılır. Çünkü sayım yapıldığında yeni
döl sineklerin ebeveynlerle karışmaması gerekir. Başarılı kültürlerde ilk ergin sinek ortaya
çıktıktan sonraki bir hafta içinde yaklaşık 200-300 kadar yavru döl elde edilir.
Resiprokal çaprazlamalar için her iki mutant formdan hem virjin dişiler hem de
erkekler seçilir ve bunların zıt kombinasyonlarda iki ayrı kültürü yapılır. Örneğin yabani
dişiler ile vestigial erkeklerin çaprazlanmasına karşılık, bunun resiprokali olarak vestigial
dişiler yabani erkekler ile çiftleştirilir.
5. Kayıt ve Sayma İşlemleri
Çaprazlama kurulduğu zaman kültür şişesinin üzerindeki etikete yazılan tüm bilgiler deney
kayıt formuna da yazılır. Sınıf deneyleri genellikle gruplar halinde yapıldığı için grup
numarası da kaydedilmelidir. Çaprazlama için kullanılan mutantların stok kültürlerinden
alınan sinekler ebeveyn olarak raporun P 1 X P1 kısmında gösterilir. P1 X P1
çaprazlamasından elde edilen ilk döller F 1 olarak, sonraki generasyonlar ise F 2 ve F3 vs.
şeklinde adlandırılır.
Çaprazlamanın olduğu kültür şişesinde sinekler pupadan çıktıktan sonra sayım
işlemleri için önce eterle bayıltılmaları gerekir. Daha sonra beyaz zeminde belli bir düzende
sayımları yapılır. Hem cinsiyet hem de mutant fenotipleri dikkate alınarak sinekler teker
teker ayrılır ve sayımları yapılır.
Sayım işlemleri 8 gün boyunca her gün veya iki günde bir yapılmalıdır. 8 günden
daha az sayım ağır gelişme hızına sahip mutant ve eşeydeki sineklerin sayımını
engelleyebilirken daha fazla sayım da sonraki generasyonun sineklerini içerebilir. Ayırım ve
sayım işlemi yapılan sinekler ile ilgili olarak elde edilen bilgiler hemen kayıt formuna
geçirilir ve daha sonra morga atılırlar.
RAPOR YAZMA VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ
Rapor azırlanırken uyulması gereken aşamalar aşağıda verilmiştir:
1. Giriş: Deneyin amacı ve ileri sürülen hipotez açıklanır.
2. Materyal ve Yöntem: Deneyde kullanılan malzeme ve deneyin yapılış şekli anlatılır.
3. Bulgular: Deney sonucunda elde edilen veriler kayıt formuna kaydedilir.
4. Sonuçların değerlendirilmesi: İlk olarak kalıtım mekanizması diagram çizilerek
açıklanır. Çaprazlama sonucunda gözlenen ve beklenen değerler arasında farklılıklar
meydana gelebilir. χ2 (ki kare) testi kullanılarak beklenen ve gözlenen değerler karşılaştırılır.
Böylece öne sürülen hipotezin kabul edilip edilmeyeceğine karar verilir.
χ2 (ki kare) değerini hesaplamak için; elde edilen değerle (gözlenen) beklenen değer
arasındaki farklar bulunur. Farkların kareleri beklenen değerlere bölünür. Elde edilen
değerlerin toplamı χ2 (ki kare) değerini verir.
Bu testte, hangi sapma derecesinin rastlantıya bağlı hangisinin ise önemli olduğuna
karar vermek için bir ölçüt saptanmıştır. Bu ölçüt olasılık (P) derecesiyle ifade edilir. Elde
edilen orana ait P değeri 0.05'e eşit veya daha küçük ise gözlenen ve beklenen değerler
arasındaki sapmanın önemli olduğu kabul edilir ve öne sürülen hipotez reddedilir. Eğer, P =
0.01 ise sapma çok önemlidir. Bu durumda, gözlenen ve beklenen arasındaki sapma
kesinlikle rastlantıya bağlı değildir ve sonucu etkileyen etkenler vardır. P değeri, 0.05'den
büyük ise sapma istatistiki bakımdan önemli değildir ve öne sürülen hipotez kabul edilir.
Meydana gelen sapma sadece rastlantıya bağlıdır.
Elde edilen χ2 (ki kare) değerini kullanarak P değerini bulmak için χ2 tabloları
düzenlenmiştir. Fakat P değerini belirleyebilmek için önce serbestlik derecesinin (df)
hesaplanması gerekir. Serbestlik derecesi N sayıda grubu (farklı fenotipi) kapsayan bir
analizde N-1'e eşittir. χ2 (ki kare) tablosu üzerinde, analizdeki serbestlik derecesinin
bulunduğu yatay sütunda hesaplanan χ2 değerinin uygun düştüğü dikey sütun belirlenir ve
bu bölgenin hangi P değerinin karşılığı olduğu bulunur.
Böyle çalışmalarda öncelikle kritik ki kare değeri belirlenerek hipotezin kabul edilip
edilmeyeceğine karar verilebilir. Daha sonra eğer sapma varsa önem seviyesi belirlenir.
Kritik χ2 (ki kare) değeri, ki kare tablolarında düşey sütundaki serbestlik derecesinin 0.05
düzeyindeki χ2 değeridir. Eğer elde edilen χ 2 (ki kare) değeri, kritik χ2 değerinden büyükse
sapma vardır ve hipotez reddedilir. χ2 (ki kare) değeri kritik χ2 değerine eşit veya küçükse
hipotez kabul edilir.
Aşağıdaki örneği inceleyiniz.
P:
G:
AaBb ♀ x aabb ♂ (A, B; a ve b'ye dominanttır)
AB, Ab, aB, ab
ab
F1: ¼ AaBb, ¼ Aabb, ¼ aaBb, ¼ aabb
F1 neslinde dört fenotipik sınıfın 1:1:1:1 oranında ortaya çıkmasını bekleriz. Eğer çalışılan
toplam birey sayısı 200 ise fenotipik sınıflara göre dağılımının aşağıdaki gibi olması gerekir.
Beklenen birey sayısı:
AaBb=50
Aabb=50
aaBb=50
aabb=50
Gözlenen birey sayısı ise çalışma sonunda her bir fenotipten sayılan birey sayısıdır.
Örneğin:
AaBb=44
Aabb=66
aaBb=32
aabb=58
olsun. Gözlenen ve beklenen değerler
aşağıdaki tabloya yazılır.
Fenotipler
Toplam
Gözlenen (o)
44
66
32
58
200
Beklenen (e)
50
50
50
50
200
Sapma (o-e)
-6
16
-18
8
Sapma2 (d2)
36
256
324
64
Sapma2/beklenen
(d2/e)
0.72
5.12
6.48
1.28
χ2=13.6
Bu deneyde farklı fenotipik sınıf sayısı (N) 4 olduğundan dolayı serbestlik derecesi (N-1)
3'tür. χ2 tablosu üzerinde, serbestlik derecesinin 3 olduğu yatay sütunda hesaplanan χ 2
değerinin uygun düştüğü dikey sütun belirlendiğinde P değerinin 0.01 ile 0.001 arasında
olduğu görülür (P<0.01).
df=3 olduğunda 0.05 düzeyindeki kritik χ2 değeri=7.82'dir. Elde edilen χ2 =13.6
kritik ki kare değerinden büyük olduğundan hipotez reddedilir. Buna göre, beklenen ile
gözlenen değerler arasında sapma vardır. Sapmanın önem seviyesi belirlendiğinde ise
Px0.01 düzeyinde anlamlı olduğu görülür. Yani meydana gelen sapma rastlantıya bağlı
değildir ve sonucu etkileyen önemli sebepler vardır (örneğin genler bağımsız olarak
birbirlerinden ayrılmamış olabilirler).
5. Tartışma: Elde edilen sonuçlar benzer çalışmaların sonuçları ile karşılaştırılır.
Çaprazlama sonucunda elde edilen verilere göre, beklenen ve gözlenen oranlar arasında
Hardy-Weinberg dengesinden sapma varsa sebepleri açıklanır.
KAYIT FORMU
Adı Soyadı :
No/Grubu :
Çaprazlama Tarihi:
Deneyin Adı :
Deneyin Amacı:
P1 x P1
♀ x
F1
♂
Genotip
___________________ Fenotip
F1 x F1
♀ x
♂
F2 Fenotipleri:
Sayım
Tarihi
F2 Fenotipleri ve elde edilen sinek sayısı
♀
1
2
3
4
5
Toplam
Beklenen
χ2
P
♂
♀
♂
♀
♂
♀
♂
KHİ KARE (χ2) TABLOSU
Olasılık (P)
df
0.90
0.50
0.20
0.05
0.01
0.001
1
0.02
0.46
1.64
3.84
6.64
10.83
2
0.21
1.39
3.22
5.99
9.21
13.82
3
0.58
2.37
4.64
7.82
11.35
16.27
4
1.06
3.36
5.99
9.49
13.28
18.47
5
1.61
4.35
7.29
11.07
15.09
20.52
6
2.20
5.35
8.56
12.59
16.81
22.46
7
2.83
6.35
9.80
14.07
18.48
24.32
8
3.49
7.34
11.03
15.51
20.09
26.13
9
4.17
8.34
12.24
16.92
21.67
27.88
10
4.87
9.34
13.44
18.31
23.21
29.59
15
8.55
14.34
19.31
25.00
30.58
37.30
25
16.47
24.34
30.68
37.65
44.31
52.62
50
37.69
49.34
58.16
67.51
76.15
86.60
χ2 Değerler
DENEY I
Deneyin Adı: Monohibrit Çaprazlama
Bir gen çifti bakımından farklılık gösteren bireyler arasındaki çaprazlamaya monohibrit
çaprazlama denir. Bu deneyde iki otozomal genin monohibrit çaprazı için yabani tip (normal
kanatlı, +) Drosophila ile vestigial (körelmiş kanatlı, vg) Drosophila kullanılacaktır.
Vestigial geni 2'nci kromozom üzerinde bulunur ve otozomal mutanttır.
Yöntem:
1) Çaprazlamaya başlamadan önce her iki soya ait ayırt edici fenotipik özellikleri yeniden
gözden geçiriniz.
2) Virgin dişiler kullanarak resiprokal çaprazlamalar yapınız.
a) ++ ♀ x vgvg ♂
b) vgvg ♀ x ++ ♂
Çaprazlama 5 dişi ve 5 erkek sinekle başlatılır. Her kültür şişesinin üzerine
çaprazlama tipi ve tarih yazılır. Bir kültür şişesine yabani tip dişi ve mutant erkek (a), diğer
kültür şişesine mutant dişi ve yabani erkek (b) sinekler konulur. Resiprokal çaprazlama
denilen bu iki yönlü çaprazlama, çalışılan karakterde cinsiyete bağlı bir durum olup
olmadığını ortaya koyar.
3) 7 gün sonra ebeveyn sinekler (P1) kültürden uzaklaştırılır. Bu işlem yapıldığında, kültür
şişesinde çok sayıda larva ve pupa olması gerekir.
4) F1 generasyonunun (birinci yavrudöl kuşağı) sinekleri ortaya çıktığı zaman fenotipleri
kontrol edilir.
5) Yeni bir kültür şişesinde F1 generasyonundan elde edilen 5 dişi ve 5 erkek sinek
çaprazlanır. Etiketlendirilir.
6) F1 çaprazlaması kurulduktan 6-7 gün sonra, kültür şişesinde larvalar gözlenmeye
başlandığı zaman birinci yavru döller atılır ve 8 gün boyunca sayım yapılır. Elde edilen
sonuçlar kayıt formuna kaydedilir.
7) Sayım yaptığınız toplam birey sayısına göre, farklı fenotiplere sahip olan sineklerin
oranları hesaplanır. Teorik olarak beklenen oranlarla karşılaştırılır. Çaprazlamadaki kalıtım
mekanizması Mendel kanunları göz önüne alınarak diagram halinde gösterilir (yani
gametleri meydana getirmek için genlerin ayrılımı ve zigotta tekrar birleşmeleri gibi). Ki
kare testi kullanılarak sonuçların doğruluğu kontrol edilir. Beklenen oranlarla gözlenen
oranlar arasında sapma olup olmadığı, varsa % 5 kriterine göre önem seviyesi belirlenir.
DENEY 2
Deneyin Adı: Test Çaprazlama (Geri Çaprazlama)
Test çaprazlaması, dominant fenotipli fakat genotipi bilinmeyen organizmanın
homozigot resesif bireyle çaprazlanarak genotipinin belirlenmesi amacıyla yapılır.
Monohibrit çapraz sonucu elde edilen ve fenotipik olarak benzer olan heterozigot F 1
döllerinin genotipik yapısı gösterilir.
Yöntem:
1) Birinci deneyde elde edilen F1 sineklerinden aynı cinsiyettekiler alınır ve vestigial kanatlı
karşıt cinsiyettekilerle çaprazlanır. Bu çaprazlamanın resiprokali de yapılabilir.
2) Monohibrit çaprazlamada izlenilen aşamalar uygulanır.
3) Deney sonunda çaprazlamanın mekanizması ve elde edilen değerler açıklanır.
DENEY 3
Deneyin Adı: Eşeye Bağlı Kalıtım
Mendel'in dominantlık kuralına göre, resesif ve dominant homozigot bireylerin
resiprokal çaprazlamalarından elde edilen hibritlerin (melez) aynı genotipi göstereceği
önceden bellidir. Fakat erkeklerde eşeye bağlı genlerin hemizigot olması sebebiyle, bu
genler resiprokal çaprazlamalarda daha farklı bir durum gösterirler. Bu deneyde Drosophila
melanogaster 'de eşeye bağlı kalıtım gözlenmeye çalışılacaktır. Deneyde beyaz gözlü (w)
Drosophila soyu kullanılacaktır. Beyaz göz geni, birinci kromozom (X) üzerinde taşınan
eşeye bağlı resesif bir gendir.
Yöntem:
1) Normal kırmızı gözlü Drosophila ile beyaz gözlü mutant Drosophila 'lar arasında
resiprokal çaprazlamalar yapılır.
I. Çapraz
+
w
w
x
+
/
w
II. Çapraz
+
x
/
X kromozomunu;
/ Y kromozomunu ifade eder.
2. F1 dölleri çıkınca kendi aralarında çaprazlanır ve elde edilen F 2 dölleri fenotiplerine ve
cinsiyetlerine göre dikkatli bir şekilde sayılır.
3. Eşey kromozomlarının dağılımını göstermek için diagram çizilir, bu iki çaprazın
sonuçları değerlendirilir.
4. Bu çaprazlamaların sonuçları ile monohibrit çaprazlama sonuçlarını karşılaştırınız.
Benzerlik ya da farklılıklar var mıdır? Neden?
DENEY 4
Deneyin Adı: Dihibrit Çaprazlama
İki gen çifti bakımından farklılık gösteren bireyler arasındaki çaprazlamaya dihibrit
çaprazlama denir.
Mendel'in bağımsız dağılım prensibine göre; gamet oluşumu sırasında farklı genlere
ait alellerin bir araya gelmeleri birbirinden bağımsızdır ve rastlantıya bağlıdır. Bu kural eğer
genler birbirine bağlı genler değilse geçerlidir. Buna göre, dihibrit çaprazlama, ayrı
kromozomlarda yer alan iki gen çiftinin döllere aktarılmasında birbirleri ile nasıl bir ilişki
içinde olduklarını açıklayan bağımsız dağılım prensibine dayanır.
Herhangi bir genetik çaprazlamanın sonuçlarını önceden tahmin etmek için ilk aşama
her bir ebeveynin meydana getirebileceği gametleri belirlemektir. Her gamet, farklı her gene
ait sadece bir alel içermelidir. Meydana gelen tüm kombinasyonları gösteren en basit yol
dallanma yöntemidir. Homozigot olan lokus sadece bir tip alel meydana getirirken
heterozigot olan lokus iki çeşit alel meydana getirir. Örneğin genotipi a +a; bb; c+c; dd olduğu
varsayılan bir bireyin meydana getireceği gametleri bir diyagram çizerek gösterelim:
+
___________ a+
a
Gamet çeşitleri
a+ b c+ d
c
d
c
d
a+ b c d
c+
d
a b c+ d
c
d
a b c d
b
b
Mümkün olan tüm kombinasyonlar formül uygulayarak kontrol edilebilir. Gamet çeşidi
sayısı = 2n formülüyle hesaplanabilir. Burada n=heterozigot lokusların (dolayısıyla genlerin)
sayısıdır. Yukarıdaki örneğe göre, dört lokus vardır, bunlardan sadece ikisi heterozigottur.
Bu nedenle n=2 ve meydana gelecek olan gamet çeşidi sayısı 4'tür.
Yöntem:
1) Virjin dişiler kullanarak aşağıda belirtilen sinekler arasında resiprokal çaprazlamalar
kurulur.
Beyaz gözlü (w, 1. X kromozomu eşeye bağlı) ve körelmiş kanatlı (vg, 2. kromozom)
Drosophila soyları kullanılır. Beyaz gözlü Drosophila kanat özelliği bakımından yabani
forma sahip (wvg+) iken körelmiş kanatlı Drosophila göz rengi bakımından yabani forma
(w+vg) sahiptir.
2) 7 gün sonra ebeveynler (P1) uzaklaştırılır.
3) F1 sineklerinin fenotipleri belirlenir.
4) F2 neslini gözlemek için F1 dölleri kendi aralarında çaprazlanır. Bu çaprazlamada F 1
dişilerinin virjin olması gerekir.
5) 7 gün sonra bu çaprazlamanın ebeveynleri (P2) uzaklaştırılır.
6) F2 yavruları görülmeye başlandığı zaman inceleme, sayım ve kayıt işlemleri başlatılır. F 2
sinekleri fenotipik sınıflara ayrılarak sayılır ve istatistik analizi yapılır.
DENEY 5
Deneyin Adı: Bağlantılı Gen Dağılımı
Herhangi bir organizmadaki kromozom sayısı bireyin sahip olduğu gen sayısına göre
oldukça azdır. Bu durum Drosophila gibi sadece birkaç çift kromozomu olan fakat kalıtsal
özellikleri çok fazla olan organizmalarda daha fazla göze çarpar.
Bilindiği gibi kromozomlar bir bütün halinde kalıtılma eğilimindedirler. Genler
kromozomlar üzerinde yer aldıklarına göre hücre bölünmesinde kromozomların
davranışlarını izlerler. Mayoz sırasında homolog kromozomlar birbirlerinden ayrılırlar,
dolayısıyla üzerinde bulunan genler de birbirine bağlı olarak kalıtılırlar. Fakat bu arada
homolog kromozomlar arasında gerçekleşen krosing over'dan dolayı genetik yapının
değişmesi ve rekombinasyonun meydana gelmesi söz konusudur. Fakat, mayozdaki ayrılım
sırasında, belirli bazı aleller, aynı kromozom üzerinde birbirine yakın bulunduğundan, bir
bağlantı grubu (linkaj) oluştururlar ve birlikte kalıtılma eğilimi gösterirler. Bir çift
homologun ayrılımı diğer çift homologun ayrılımından etkilenmez. Bu nedenle, belli bir
kromozom üzerinde bulunan alel çiftleri farklı bir linkaj grubunu taşıyan alel çiftlerinden
bağımsız olarak ayrılacaktır.
Drosophila 'da her biri bir grup gen taşıyan 4 çift kromozom olduğuna göre bu
genlerin bağlantı durumları da söz konusudur.
Yöntem:
Bu deneyde X kromozomu üzerinde yer alan üç resesif mutant alel arasında bağlantı testi
yapılacaktır. Bu amaçla yabani Drosophila soyu ile, beyaz gözlü, kanat ve vücut boyu
küçülmüş ve çatallı kılları olan (wmf) mutant Drosophila soyu kullanılacaktır.
1) Virjin wmf dişileri, yabani soydan erkek sineklerle çaprazlanır.
2) 7 gün sonra ebeveynler uzaklaştırılır.
3) F1 dölleri ortaya çıktığı zaman 2 kültür şişesinde F2 çaprazı başlatılır.
4) 7 gün sonra F1 sinekleri uzaklaştırılır.
5) F2'de ortaya çıkan farklı fenotipler sayılır ve kaydedilir.
6) Sonuçlar istatistiki olarak değerlendirilir.
DENEY 6
Deneyin Adı: Drosophila melanogaster 'de Politen Kromozomlar
Politen (Dev) kromozomlar, kromatid yığınlarını içeren özel bir kromozom tipi olup
Diptera grubu sineklerin belirli dokularında karakteristiktir. Dev kromozomlar Drosophila
larvalarının tükrük bezleri, orta barsak, malpighi tübülleri gibi metabolik aktivitenin yoğun
olduğu organlarda gözlenir. Bu dokular, hücre sayısının artışıyla değil hücrenin genişlemesi
yoluyla büyürler. Dev hücreler normal hücrelere göre daha fazla genetik materyale ihtiyaç
duyarlar ve bu da dev kromozomun oluşumu ve dolayısı ile gen sayısının arttırımı ile büyük
miktarlarda ve hızlı mRNA sentezi ile karşılanır. Dev kromozomlar "Endomitoz" denilen
özel bir işlem sonucu meydana gelirler. Endomitozda kromozomlar çekirdek zarı
parçalanmaksızın çoğalırlar. Böylece kromozom sayısı 2n'in katları şeklinde artarak
poliploidi durumu oluştururlar. Kromozomlar ayrılma olmadan tekrar tekrar replike edilerek
genişlerler ve ayrıca uzunlukları da artar. Yeni oluşan kromozomlar bir arada kalarak bir
ünite (birim) oluştururlar. Bunun nedeni mitotik iğe bağlanma bölgesinin tam fonksiyonunu
gerçekleştirememesi ve birçok DNA replikasyonu ile ortaya çıkan kromatidlerin
ayrılamamasıdır. Bu politenin ya da çok iplikçikli yapının oluşumunu başlatır.
Dev kromozomlar, hücre bölünmesindeki normal hücrelerin kromozomlarına göre
yaklaşık 100 kat daha kalın ve 100 kat daha uzundur. Dev kromozomların sentromerleri
kromosenter denilen bölgede bir araya gelirler. Bu durum karşılıklı çekim yoluyla olur.
Dev kromozomlar düzenli ve çok belirgin bantlama modelleri gösterirler. Çeşitli
kalınlıkta olan bantlar yüksek oranlarda DNA ve histon içerirler. Bantlar arasındaki alanlar
interbant olarak adlandırılırlar ve DNA ile histonu çok az oranlarda içerirler. Bu bantların
düzenleniş şekillerinin türe özel ve fenotipik karakterlerle bağlantılı olması bunların
kromozom haritalarının hazırlanmasında kullanılmasına nedendir. Enine bantların sayısı D.
melanogaster 'de 5000'e kadar ulaşır.
Dev kromozomların belirli bölgeleri özellikle aktif olduklarında tüm benzer DNA
molekülleri bu bölgede fırça benzeri loplar oluştururlar. Lopların yan yana takımlar
oluşturması "kromozomal puf" olarak adlandırılır. Farklı dokularda ya da aynı dokunun
farklı gelişim aşamalarında pufların kromozomlar üzerinde yerleşim alanları farklıdır. Puflar
hızlı RNA sentezinin olduğu, aktif genlerin yerleşimini gösteren yerlerdir. Puflar RNA
sentezi için yüzeyi maksimum tutmak amacıyla dışa doğru loplar oluşturmuş DNA'nın
yüzlerce kopyasını içerir.
Yöntem:
Dev kromozom yapısının mikroskopta iyi incelenmesi için larvaların iyi yetiştirilmiş olması
gereklidir. Bu nedenle kültür şişesinde yumurtalar görüldükten sonra en geç 2 gün içinde
ebeveynler uzaklaştırılır. Ayrıca, özellikle büyük tükrük bezi kromozomlarının preparasyonu
için düşük sıcaklıklarda (16-18 °C) yetiştirilmiş larvalar kullanılır.
1) Kültür şişesinde, besiyerinden ayrılarak şişenin duvarlarında yukarıya doğru tırmanmaya
başlayan üçüncü instar dönemindeki larvalar; bir fırça yardımıyla üzerine bir damla %
0.7'lik tuz (NaCl) konulmuş bir lam üzerine alınır.
2) Disseksiyon iğneleri ya da iki tane ince uçlu pens kullanılarak larvanın ağız parçalarının
bulunduğu ön ucu hızlı bir hareketle ayrılır. Geri kalan 2/3'lük kısmı atılır (Bkz. Şekil 5).
3) Tükrük bezi kurumadan üzerine aseto karmin (veya aseto orsein) boyası damlatılır.
4) Üç dakika kadar beklenerek kromozomların fikse edilmesi ve boyanmaları sağlanır.
Sürenin daha uzun tutulması kromozomları daha kolay kırılır hale getirirken kısa oluşu da
kromozom bant yapılarının boyanmamasına neden olur.
5) Lam üzeri lamelle kapatılır, preparat bir parça filtre kağıdı ile sarılarak üzerine hafif
birkaç darbe ile fiziksel basınç uygulanır. Böylece hücreler parçalanır ve kromozomlar
kırılmadan açığa çıkabilir.
6) Hazırlanan preparat binoküler mikroskopta incelenerek, dev kromozomlar belirlenir ve
çizilir.
Aseto-Karmin Boyasının Hazırlanışı:
(1) 90 ml asetik asit 110 ml saf su ile seyreltilir.
(2) Üzerine 1 g karmin boyası konularak orta derecedeki bir alevde 2 saat kaynatılır.
(3) Kaynama sırasında buharlaşma önlenir. Daha sonra soğutularak boya filtre edilir.
(4) Hazırlanan boya kahverengi şişede ağzı sıkıca kapatılarak saklanır.