Mantar Preparat ve Kültür Hazırlama Yöntemleri
advertisement
İsim Okul Numarası Gül Sümeyra Taş 11112111004 Tuğba Eraslan 1111211006 Yakup Kösem 1111211014 Vetha Turan 1111211018 MANTARLAR ALEMİ (FUNGİ) 1 İçindekiler Genel Bilgiler ............................................................................................................................................3 Mantarların Morfolojik Özellikleri ........................................................................................................ 3 Mantarlarda Büyüme ........................................................................................................................... 17 Mantarlarda Üreme .............................................................................................................................. 19 Mantarların Beslenmesi ....................................................................................................................... 30 Mantarların Fizyolojisi .......................................................................................................................... 32 Mantarların Metabolizması .................................................................................................................. 34 Mantar Plasmidleri ............................................................................................................................... 36 Mantar Virüsleri ................................................................................................................................... 36 Mantar Parazitizm Ve Parazit Mantarlar ............................................................................................. 37 Mantar Hastalıklarının Epidemiyolojisi ................................................................................................ 38 Patojenik Mantarların İncelenmesi ..................................................................................................... 43 Mantar Kültürlerinin Muayenesi .......................................................................................................... 54 Patojenik Mantarların Immunolojisi .................................................................................................... 65 Mantar Preparat Ve Kültür Hazırlama Yöntemleri .............................................................................. 71 Araştırmalarda Tespit Edilen Yenilebilen Mantarlar ......................................................................... 108 Araştırmalarda Tespit Edilen Zehirli Mantarlar ................................................................................. 111 Kaynakça ............................................................................................................................................. 113 2 Genel Bilgiler Fungi (mantarlar) deyimi mikrobiyolojinin farklı disiplinlerinde farklı tanımlarla anılmaktadır. Grubun orijinal adı fungi (=Mycota) doğrudan şapkalı mantarları tanımladığı için bir grup mikrobiyolog 3 farklı gruptaki mikroorganizmaları "mantarlar" olarak kabul ederken, özellikle gıda mikrobiyolojisinde mantar denildiğinde sadece şapkalı mantar anlaşılmaktadır. Tüm dünya genelinde süren bu kavram kargaşalığı nedeni grubun aşağıdaki gibi adlandırılması giderek benimsenmektedir; Flamentli mikrofunguslar (= küfler) Flamentsiz mikrofunguslar (= maya) Makrofunguslar (= şapkalı mantarlar) Özellikle insan ve hayvanlarda hastalık yapan flamentli mikrofunguslar ile gıdalarda bozulmaya neden olanlar aynı grupta iken, genel eğilim hastalık yapanlara mantar, gıdaları ilgilendirenlere küf (mold) denilmesi şeklindedir. Mantarların Morfolojik Özellikleri 01. Giriş Mantarlar, çok çeşitli olmaları nedeniyle, makroskopik ve mikroskopik morfolojik karakterleri yönünden oldukça geniş bir varyasyon gösterirler. Bu durumları, her ne kadar, genetik özelliklerine bağlı ise de yaşlanma (kültürlerin eskiliği), beslenme ve çevresel koşulların etkisi ile de yakından ilişkilidir. Hatta aynı koloni içinde, yaşlanmaya bağlı olarak koloninin ortası ile çevresi arasında makrokonidiumların, şekli, büyüklüğü ile hifaların morfolojileri yönünden fark bulunmaktadır. Bu nedenle, özellikle patojenik mantarların birbirlerinden ayrılmalarında, sadece bir iki karakter yanı sıra diğer özelliklerini de dikkate almakta büyük yararlar bulunmaktadır. Mantarların büyük çoğunluğu (Ascomycetes, Zygomycetes, Deuteromycetes, vs ) flamentöz bir koloni morfolojisine (küfler) sahip olmalarına karşın, bazıları da mukoid bir üreme gösterir (mayalar). Böyle karakterde olanlar arasında Candida, Saccharomyces, vs. cinslerine ait olan türler örnek olarak verilebilir. 3 Flamentöz mantarların (küflerin) morfolojileri başlıca iki yönden incelenmektedir.Bunlar da: 1) Mikroskopik morfolojik özellikleri 2) Makroskopik morfolojik özellikleri 4 Mantarların Bazı Özellikleri 02. Flamentöz Mantarların Mikroskopik Morfolojileri Mantarların karakterize edilmesinde, bunların mikroskopik özelliklerinin büyük bir önemi vardır. Bu nedenle, bir mantarı oluşturan elementlerin mikroskopik olarak teker teker incelenmeleri gereklidir. Hifa (hypha) : Mantar kolonileri, hifa adı verilen, genellikle, ince, uzun ve saydam mikroskopik flamentlerden oluşmuşlardır. Uzunlukları türlere göre değişmek üzere 1-3 cm (veya daha uzun) ve çapları da 5-10 mikrometre arasında bulunmaktadır. Bazıları branşsız ve ince bir borucuk tarzında bir görünüme sahip olmasına karşın, bir kısım hifalar da, genetik karakterleri gereği, branşlaşma gösterirler. Hifalardan meydana gelen ağ benzeri oluşumlara miselyum (mycelium) adı verilir. Miselyumlar mantarın vejetatif gövdesini teşkil ederler. Aynı koloni içinde bulunan hifalardan bazıları beslenmeyi sağlamak için, üzerinde yaşadığı substratların içine doğru uzanırlar. Genelde, beslenmeyi sağladıkları için bunlara vejetatif hifa adı da verilmektedir. Diğer bir bölümü de dışarıda kalır (aerial hifa). Bu son türdeki hifalar arasında bazıları çoğalmada görev alır ve buna uygun olarak da kendilerinde özel organizasyonlar oluşur (reprodüktif hifa, fertil hifa). Flament özellik taşıyan mantarlardan (Mastigomycotina, Zygomycotina, vs.) alt divizyonlarına ait türlerde hifalar septumsuz olup kesintisiz düz bir borucuk halindedir ve özel septumlarla bölünmediği için kompartımanlara (hücrelere) ayrılmamıştır (septumsuz hifa, sönositik hifa). Buna karşın, Ascomycotina, Deuteromycotina, vs. alt divizyonu içindeki sınıflara ait mantar türlerinde hifalar belli aralıklarla özel septumlar aracılığı ile bölünmüşlerdir (septumlu hifa). Ancak, bu bölünme tam olmayıp, bölmeleri ayıran septumların ortalarında veya ortalarına 5 yakın yerlerinde bulunan özel deliklerle, hücreler, birbirleriyle ilişki içindedirler. Bu nedenle bazı araştırıcılar hücre terimi yerine kompartıman kelimesini kullanmanın daha uygun olacağını belirtmektedirler . Küf mantar mikroskobik görünümü Hifa türleri yandaki şekilde gösterilmektedir. 6 Kültür koşulları altında, özellikle, patojenik mantar kolonilerinde, hifaların mikroskopik ve makroskopik morfolojilerinde bazı farklılaşmalar göze çarpmaktadır. Böyle modifikasyonlar daha ziyade aerial ve fertil hifalarda gözlemlenmektedir. Bir kısım hifalarda da spiral, raket, noduler, şamdan, tarak, gibi özel formlara rastlanabilmektedir. Hifalarda tesadüf edilen formasyon değişiklikleri, hiç bir zaman teşhis için kriter olarak düşünülmemelidir. Bunlar her ne kadar genetik karakterlerle ilgili iseler de besi yerinin kimyasal yapısı, çevresel koşullar, kültürün yaşı, vs. ile de yakından bağlantılıdırlar. Hifalarda septumların bulunuşu veya bulunmayışı sınıfların ayrımında bir ip ucu verirse de her zaman güvenilir bir kriter değildirler. Şöyle ki, Ascomycetes sınıfındaki mantarlar genelde septumlu iseler de bazen genç koloni hifalarında, septum oluşumu geç meydana geldiğinden, septumsuz gibi görülebilirler. Ayrıca, septumsuz olan Zygomycetes ve Oomycetes sınıfı mantarları içinde bazı türlerde pseudohifalara da rastlanabilir. Böyle karakterize edilen görünüme mayalarda da tesadüf edilmektedir. Bazı hallerde de, iki hifanın birbirine değdiği yerde anastomoz meydana gelmekte burada hücre duvarları eriyerek iki hücre birleşebilmektedir. Hücre duvarı : Hücre duvarı ancak septumlu hifalarda söz konusudur. Sönositik hifalar tek hücre veya tek bir borucuk şeklinde bir yapıya sahip olduklarından, bunlar için, hifanın cidar yapısı hücre duvarı olarak ele alınacaktır. Mantar Hücresi Yandaki şekilde tipik bir mantar hücresi gösterilmektedir. 7 Hücre duvarı, mantar hücrelerinin (kompartımanlarının) büyüklüğünü ve şeklini tayin edebilecek derecede kuvvetli bir yapıya sahiptir. Hücre duvarının giderildiği hallerde protoplastlar meydana gelir. Hücre duvarı, hücreleri çevresel koşulların olumsuz etkisinden koruduğu gibi, antijenik bir özelliğe ve bazı enzimleri içermeleri nedeniyle de fizyolojik bir aktiviteye sahiptir. Mantar hücrelerinde, hücre duvarı, genellikle, çok katlı (multilaminer) ve fibriler bir özellik gösterir. Bu durum hücre duvarının sağlamlığını arttırmaktadır. Yapısında, polisakkaridler (yaklaşık % 80) daha fazla olmak üzere protein (% 5-15) ve lipid’ler (% 3-10) bulunmaktadır. Bunların miktarları, mantar türlerine, besi yerinin birleşimine ve çevresel koşulların durumuna göre az çok değişmektedir. Polisakkaridler arasında, glukan, galaktoz, kitin, kitozan, mannan ve selüloz en fazla bulunanlarıdır. Bu komponentler bazen birlikte de olabilmektedirler. Örn, Basidiomycetes ve Chytridiomycetesler de kitin + glukan; Zygomyceteslerde kitin + kitozan; Ascomyceteslerde kitin + glukan; Mayalarda mannan + glukan, gibi. Hücre duvarının fibriler özelliğini kitin veya selüloz verir. Bunlar, N-asetilglikozamin ve glikoz polimerlerinin 1-4 beta tarzında birleşmesinden meydana gelmiş düz zincirlerdir. Glukanların (glikoz polimerleri) branşlı olmaları ve hücre duvarının diğer komponentleri ile çapraz bağlar kurabilme yetenekleri hücre duvarının kuvvetini ve sağlamlığını arttırmaktadır. Mayalardaki mannanlar (mannoz polimerleri) hücre duvarının esas komponentini oluşturmaktadır. Hücre duvarının kimyasal yapısında, yukarıda bildirilen 3 temel substansın yanı sıra, melanin derivatları, inorganik elementler, fosfatlar, aminopolisakkaridler de vardır. Mantarlarda hücre duvarının katman sayıları türler arasında farklar göstermektedir. Örn. N. crassa ’da dıştan içe doğru 4 tabaka bulunmaktadır (amorf glukan dış tabaka, glikoprotein, protein ve protein içine yerleşmiş kitin mikrofibril ağ tabakaları). Bu nedenlerle hücre duvarı veya hifaların cidarları oldukça kalındır. Bu durum 150-200 nm arasında bir varyasyon göstermektedir. Hifa, çok büyük bir üreme kapasitesine sahip olan apekse doğru giderek incelir ve çapı azalır (50-70nm), yapısı da basitleşerek bazı mantar türlerinde sadece iç ve dış tabakalar kalır. 8 Septum: Septum formasyonuna, Oomycetes ve Zygomycetes sınıfı mantarları hariç olmak üzere, diğer flamentöz mantarlarda rastlanmaktadır. Yapılan elektron mikroskopik incelemelerde birkaç tür septumun varlığı belirlenmiştir. Bunlar arasında başlıca 2 tipe fazlaca tesadüf edilmektedir. 1-Basit septum: Bu tür septum, daha ziyade Ascomycetes ve Deuteromycetes sınıfına ait mantar türlerinde bulunmaktadır. Böyle septumun ortasında veya ortasına yakın yerde bir tek delik (por) (0.005-0.5 mikrometre çapında) yer almaktadır. Bu deliği gerektiğinde kapatan ve bir hücrede bir veya birden fazla sayıda Woronin cisimciği bulunmaktadır. 2- Dolipor septum: Bu tür septuma Basidiomycetes sınıfına ait mantarlarda ve gelişmenin bazı aşamalarında rastlanılmaktadır. Bunda, septumun ortasında çok dar bir delik (100-200nm) vardır ve etrafı amorf ve kabarık bir kenarla (yaka) ile çevrilidir. Bunu da dışardan çok ince ve delikli bir membran sarar (parentosom ). Dolipor septum, sitoplasmayı, bir kompartımandan diğerine geçirmesine karşın, çekirdeği geçirmez. Yandaki şekilde gösterilmektedir. septum yapısı Septum formasyonu genetik bir karakter olup hücre duvarının iç kısımından orijin alır ve içeri doğru uzanarak karşı cidara kadar devam eder. Yapısı, hücre duvarının yapısı ile aynı kimyasal özelliği gösterir. Septumun var veya yok oluşu, mantar türlerini ayırmada tek başına bir kriter oluşturamaz. Sitoplasmik Membran (Plasmalemma) : Elektron mikroskopla yapılan ince kesitlerin muayenelerinde, hücre duvarının altında 3 tabakadan yapılmış ve ünit membran özelliği gösteren bir sitoplasmik membran bulunur. Permeabilite özelliği gösterdiğinden absorbsiyon ve sekresyonda büyük kolaylıklar sağlamaktadır. Yapısında, fosfolipid, protein ve steroller 9 (ergosterol) bulunur. Proteinlerin çoğunu, substansların geçişlerinde önemli fonksiyonlara sahip olan permease enzimleri oluşturmaktadır. Steroller, amfipatik bir karaktere sahip olup hem polar (suda eriyebilir) ve hem de nonpolar (yağda eriyebilir) bölgelere sahiptirler. Bunlar, fosfolipid çift katmanı içine girmiş bir durumdadırlar. Lomasom : Bazı mantar türlerinde, hücre duvarı ile sitoplasmik membran arasında yerleşmiş ve lomasom olarak adlandırılan bazı organizasyonlara tesadüf edilmektedir. Bunların bulundukları yerlerde, sitoplasmik membran içe doğru çöküntüler meydana getirmektedir. Fonksiyonları tam olarak aydınlatılmamışsa da, bu oluşumların salgısal aktivitede ve sitoplasmanın sentezinde bazı önemli görevler üstlendikleri açıklanmaktadır. Özellikle, aktif gelişmekte ve büyümekte olan hifaların apeks hücrelerinde, vesiküllerin lomasomlarla birleştiğini gösteren çalışmalar bulunmaktadır. Endoplasmik Retikulum : Mantar hücrelerinde, etrafı iki katlı ünit membranla çevrili ve üzerlerinde ribosomların yerleştiği strüktürler bulunmaktadır. Protein sentezinde ve metabolizma için gerekli substansların taşınmasında büyük etkinliği olan endoplasmik retikulumların (ER) yapıları daha ziyade lipoprotein bir karakter arz etmektedir. Bu retikulumların bir ucunun da çekirdekte olması, bu aktiviteleri ile uygunluk göstermektedir. Yaklaşık 8 nm kalınlıkta olan endoplasmik retikulumların bazılarının lâmeller veya vesiküler bir yapısal özellik taşıdıkları da belirtilmiştir. Vakuol : Olgun mantar hücrelerinde daha fazla olmak üzere çok sayıda vakuollere rastlanılmaktadır. Etrafları ünit membranla çevrili olan vakuollerin içlerinde pigment, kristal ve amorf karakterlerde bazı maddelerin bulunduğu ve hücre duvarına yakın olarak yerleştikleri bildirilmiştir. Hücrelerin dejenerasyonları sırasında sayılarında artmalar da meydana gelmektedir. Vesikül : Büyümekte olan hifalarda, özellikle, apeksteki hücreler vesikül bakımından oldukça zengindirler. Bunların Golgi aparatından orijin aldıkları bildirilmektedir. Vesiküllerin içinde, hücre duvarının sentezinde ve aynı zamanda, lizisinde etkinlikleri olan enzimler, inorganik elementler, polisakkaridler, lipidler ve diğer gerekli substanslar bulunur ve bunları büyümekte olan hücre duvarı bölgesine taşırlar. Vesiküllerin etrafı bir ünit membranla çevrilidir. Bazıları küçük elektron dens, diğer bir kısmı da büyük ve elektron transperent bir özelliğe sahiptir. Çekirdek ve çekirdekçik : Mantar hücrelerinde, nukleuslar genellikle, küçüktürler (2-3 mikrometre). Bu nedenle de normal ışık mikroskopları ile güçlükle fark edilirler. Çekirdeğin etrafında çift katlı ve delikli bir membran (nükleer membran) bulunur. Giemsa ile boyanan preparatlarda çekirdek kolayca görülebilir. Her hücrede bir tane çekirdek olmasına karşın, çok genç ve çok çabuk ürüyen hifalarda bazen birden fazla nukleusa rastlanabilir. Septumsuz hifalarda, her hücrede birden fazla çekirdeğin varlığı kabul edilmektedir. Çekirdek içinde bulunan kromozom, deoksiribonukleik asit (DNA) yapısında olup birden fazla sayıdadır. Örn. N. crassa ’da kromozom sayısı 7, A. nidulans’da 8 ve S. cerevisiae’de ise 17 tanedir. 10 Kromozomun yapısı ökaryotik ve prokaryotik hücre kromozomlarına benzerlik gösterir. DNA daki G + C oranı % 35-65 arası olup türler arasında bu sınırlar içinde farklar görülmektedir. DNA’nın molekül ağırlığı kromozom sayısına bağlı olarak artmaktadır. Nükleer membranda bulunan delikler, çekirdek içinde sentezlenen mRNA’nın (mesenjer ribonukleikasit) sitoplasmaya geçmesine ve endoplasmik retikulumlar üzerinde translasyonuna yardımcı olur. Transkripsiyon ve translasyon olguları aynen ökaryotiklerde olduğu gibidir. DNA’nın yapısı ve sentezi de Watson-Crick modeline uymaktadır. Somatik bölünme mitosis ve seksüel üreme meiosis tarzındadır. Çekirdekçik bir veya birkaç tane olabilmektedir. Yapısında % 80 RNA ve ayrıca protein de bulunmaktadır. Mitokondrium : Yapısında protein ve DNA bulunan mitokondriumların bölünerek ve/veya tomurcuklanma ile çoğaldıkları bildirilmektedir. Hücrelerin birer enerji merkezleri (veya santralleri) fonksiyonlarını üstlenen bu oluşumlardan bir hücrede çok sayıda (yaklaşık 100 kadar) bulunabilmekte ve özellikle, üremekte olan hifalarda daha aktif ve fazla sayıda olabildiği belirtilmektedir. Boyutları (0.4 - 0.8x 1-2 mikrometre) mantar türleri arasında da değişmeler göstermektedir. Mitokondriumların Krebs siklusunda ve oksidatif fosforilizasyonda da önemli aktiviteleri olduğu gibi, respirasyonda fonksiyonu olan enzimlerce de zengindirler. Zoosporlarda, genellikle, bir tane mitokondrium bulunmaktadır. Ribosom : Elektron mikroskopla ancak görülebilen ribosomlar (25-80 nm), bir hücrede binlerce sayıda bulunabilmekte ve protein sentez merkezleri olarak önemli fonksiyonlar üstlenmektedirler. Yapısında RNA (% 50-70) ve protein (%35-50) bulunan ribosomlara, hücre sitoplasmasında serbest olarak veya birkaç tanesi bir arada (poliribosom) rastlanabildiği gibi, endoplasmik retikulumlarda ve mitokondriumlarda da bulunurlar. Ökaryotik bir özellik gösteren mantar ribosomlarının sedimentasyon konstantları 80 S (Svedberg ünitesi) dir (40 S + 60 S). Golgi Aparatı : Bir hücrede, genellikle, bir tane olarak bulunan ve çekirdeğe yakın olarak yerleşen Golgi aparatı, mantar türlerine göre yapı ve şekillerinde farklar görülmektedir. 11 Vesikül, granül veya kesecikli bir strüktüre sahip olan Golgi aparatı, sentez olaylarında fonksiyonlara sahiptir. Sitoplasmik Granüller : Mantar hücrelerinde yukarıda açıklanan yapısal oluşumların yanı sıra lipid granülleri, kristaller, pigmentler, mikrotubuluslar, glikojen granülleri de bulunur. Lisosom ve Kitosom : Mantar hücreleri de endomembran sistem arasında yer alan lisosomların içlerinde hidrolitik enzimler vardır. Bunların yanı sıra, son yıllarda saptanan kitosom ise kitin, mikrofibrillerinin sentezinde etkinlikleri olan chitin synthase enzimine sahiptirler. 03. Mayaların Mikroskopik Morfolojileri Maya hücreleri, yuvarlak, oval ve silindir biçiminde bir görünümde olup tek hücrelidirler. Boyutları, türlere ve kültür koşullarına göre değişmek üzere, 2-10 x 3-16 mikrometre arasında değişmektedir. Bazı koşullarda, çok sayıda hücre yan yana gelerek uzun zincirler (pseudohifa) oluşturabilirler. Boyutları, genellikle bakterilerden daha büyüktürler. Hücre duvarı, maya hücrelerine şekil verir ve oldukça sert bir kimyasal yapıdadır. Bileşiminde glikoz ve mannoz polimerleri (mannan) ile birlikte az oranda lipid, protein ve kitin bulunmaktadır. Hücre duvarında, kalınlıkları değişik olan 3 tabakanın varlığı belirtilmektedir. Sitoplasmik membran, ünit membran karakteri taşır ve permeabilitesi oldukça fazladır. Ayrıca, sitoplasmik membran enzimlerce de oldukça zengindir. 12 Maya hücrelerinde, etrafında delikli bir membrana (nükleer membran) sahip ve çapı 1 mikrometre civarında bulunan bir çekirdek bulunur. Hücre içinde, üremenin aktif olduğu dönemde sayıları az olan ve üremenin sonuna doğru artan sayıda granül ve globullere rastlanılmaktadır. İçlerinde transperent bir sıvı bulunan büyükçe vakuoller, boyutları 0.25 x0.5 mikrometre kadar olan mitokondriumlar ve çok sayıda ribosomlar da yer almaktadır. Bir mayanın yapısı yandaki şekilde gösterilmektedir. 04. Mantarların Makroskopik Morfolojileri 04.01. Koloni Morfolojileri Patojenik mantarlar katı ortamlarda üretildikleri zaman başlıca 5 türde koloni oluşturmaktadırlar. Bu varyasyonlar, mantarların genetik karakterleri ile yakından ilgili iseler de besi yerinin kimyasal yapısına, kültürlerin eskiliğine, çevresel koşulların durumuna da bağımlı bulunmaktadır. Örn. difazik mantarların koloni morfolojileri ortamın ısısı ile yakından ilişkilidir. Şöyle ki, C. immitis, vücut ısısında (37°C) üretildiği zaman maya benzeri koloniler oluşturmasına karşın, oda ısısında (22-25°C) genellikle miselyal bir koloni meydana getirirler. B.dermatitidis, H. capsulatum, vs. de aynı karakterlere sahiptirler. 13 Başlıca koloni tipleri ve kısa özellikleri aşağıda belirtilmiştir. 1) Miselyal Koloniler : Kutan mikozislere neden olan dermatofitler (Epidermophyton, Microsporum, Trichopyton cinslerine ait türler)ve sistemik infeksiyona neden olan bazı mantarların (B. dermatitidis, C. immitis, H. capsulatum, vs.) oda ısısında üretilmiş koloni formları ile saprofitik özellikte olan birçok mantarın kolonileri miselyal bir görünüme sahiptirler. Bu miselyumlar, genellikle, aerial ve reprodüktif hifalardan meydana gelmektedir. Miselyal koloniler, genellikle, oval, yuvarlak bazen de düzensiz bir şekil gösterebilirler ( çentikli, loblu, asteroid, poligonal, vs.) . Bu tür koloniler çeşitli renklere de sahip olabilirler. Bazı kolonilerin üzerinde birden fazla sayıda katlanmalar ve kıvrımlar gözlenebildiği gibi, yayvan, kabarık ve pamuk gibi tüylü olanlarına da fazlaca rastlanabilir. 2) Maya Benzeri Koloniler : Saccharomyces sınıfına ait türler (S. cerevisiae, S. fragilis, S. carlsbergensis, vs.) kolonileri ile sistemik infeksiyon oluşturan dimorfik mantarların 37°C deki kolonileri genellikle maya benzeri bir özellik gösterirler. Koloniler yumuşak, mukoid kıvamda kabarık ve nemli bir görünüşte olup oval veya yuvarlak kenarlara sahiptirler. 14 C. albicans kolonileri de, genellikle, maya benzeri bir görünümdedirler. 3) Membranöz Koloniler : Dermatofit mantarların bazıları (T. schoenleini, T. verrucosum, T. violaceum, vs.) üremelerinin bazı aşamalarında kolonileri ince deri veya membranöz bir özelliğe sahiptirler. Böyle olsalar da yine bazılarında az miktarda aerial hifalara rastlanmaktadır. 4) Granüler Koloniler : Eğer kolonilerde fazla miktarda sporulasyon meydana gelmişse, aerial hifalarda azalmalara buna karşın çok fazla mikt arlarda sporlara rastlanabilir. Koloni, sporun özelliğine göre, ince veya kaba bir granülasyon gösterir. Ancak, bu tür kolonilerin de başlangıçta genellikle, flamentöz olduklarını unutmamak gerekir. Dermatofitlerden, E. floccosum, M. gypseum, M. van breuseghenii, T. megninii, vs. böyle bir koloni formasyonu gösterirler. 15 5) Pleomorfik Koloniler : Mantarların laboratuvarlarda, besi yerlerinde uzun süre pasajları yapıldığında, bazen, kolonilerin orta veya kenarlarında beyaz, steril ve kadife görünümünde hifaların oluştuğu gözlenir. Bu durum renkli kolonilerde daha belirgin olarak fark edilebilir. Pleomorfizm, aerial hifalar arsında reprodüktif hifaların teşekkül etmemesi ile karakterizedir. Bu tarz dejenerasyonlar, mantarlarda, genellikle, mutasyonlar sonucu oluşurlar. Böyle kolonilerden yapılan pasajlar, genellikle, steril kalır ve herhangi bir üremeye rastlanamaz. Renkli bir kolonide, böyle, pleomorfik dejerenasyona maruz kalmış bölgeleri tanımak, renklerinin beyaz olması nedeniyle, oldukça kolaydır. Dermatofitlerde, bu tür dejenerasyonlara sıkça tesadüf edildiğinden, pasajlarda buna dikkat edilmelidir. 16 Pleomorfik dejenerasyonların ekserisi genetik düzeyde olmasına karşın, çevresel koşulların, besi yerinin kimyasal yapısının ve diğer nedenlerin etkisi altında da bazı varyasyonlar meydana gelebilmektedir. Besi yeri bileşiminin yanı sıra, pH, redoks potansiyel, düşük ozmotik basınca bağlı olarak, aslında flamentöz olan M. ramannianus nitrojensiz ortamlarda maya benzeri koloniler oluşturmaktadır. Mantarların üremeleri sırasında besi yerinde oluşan bazı değişmelerle ilgili olarak mantarların morfolojilerinde de varyasyonlar meydana gelmektedir. Septum formasyonunda gecikmeler, durmalar veya hücrelerin sporangiuma dönüşmeleri, renk değişiklikleri, hücre büyüklüğü, hücre duvar kalınlığı, aerial hifa sayısında azalmalar, vs. değişmelere rastlanabilir. Kültür koşullarında fiziksel ve kimyasal değişmeler ne kadar yavaş olursa, mantarlarda meydana gelen gelişmeler de o kadar yavaş olur. Daha fazla olan köklü değişmelerde primer metabolizmadan sekonder metabolizmaya bir kayış gözlenebilir. Bu son durumda sekonder metabolit sentezi artar. Bu olgu da vejatatif fazın durmasına buna karşı reprodüksiyon faza geçmek için bir sinyalin verilmesine neden olur. Bazı mantarlarda dairesel zonların meydana gelişi de üreme aşamalarını gösterebilir. MANTARLARDA BÜYÜME Giriş Flamentöz, mantarlarda hücre üremesi ile büyüme birbirleri ile yakından ilişkili iki kavramdır. Ancak, bunları birbirinden ayırarak incelemede yarar bulunmaktadır. Mantarlar, hifaların, genellikle, uç(bazen yan) kısımlarından büyüme ve dolayısıyla da hücre üremesi (apikal büyüme ve apikal üreme) gösterirler. Bu durumu, çabuk büyüme yeteneğine sahip olan mantarlardan N. crassa ’da ışık mikroskobu altında izlemek bile mümkün olabilmektedir. Bu mantar 25°C' de dakikada 3-4 mikrometre kadar bir uzama hızına sahiptir. Sinefotografla yapılan incelemelerde apikal hücrelerdeki sitoplasmanın öne doğru akışı kolaylıkla gözlenebilmektedir. Bu akış, ortamda suyun azalması ile daha hızlanmaktadır. Öne doğru akış,septumsuz olan mantarlarda, daha belirgin ve daha hızlı olup büyümekte olan bölgeye gerekli olan kimyasal maddelerin iletilmesinde büyük kolaylıklar sağlanmaktadır . Büyümekte olan bir mantar hifasının apeksi yandaki şekilde gösterilmektedir. 17 Apeks hücresini saran hücre duvarı, gerisindeki diğer olgun hücre duvarlarına oranla daha az kalınlıkta ve tabakada olduğu gibi, çapı da öne doğru gidildikçe azalmaktadır. Apekste büyüme sırasında, meydana gelen lizis ve sentez işlemleri, birbiri ardı sıra ve uyum içinde yürütülür. Bu nedenle apeksteki hücrelerde hücre duvarının ne çok sert ve kalın ve ne de fazla zayıf olmaması gereklidir. Büyümekte olan hifalarda apeks hücreleri içinde, diğer hücrelere oranla daha fazla vesikül de bulunmaktadır. Yaşlı veya büyümesi durmuş olan hücrelerde vesikül daha az sayıdadır. Vesiküllerin, hücrelerdeki, Golgi aparatından orijin aldıkları bildirilmektedir. Ayrıca, vesiküllerde apekse doğru gitme eğilimi de vardır ve sitoplasmik membranla birleşerek içindeki enzim, organik ve inorganik materyalleri buraya bırakırlar. Vesiküllerin içinde, hücre duvarının lizis ve sentez işlemlerinde fonksiyonları bulunan enzimler ve prekürsörler yanı sıra, sellülase, alkalin fosfotase, glukonase, mannan synthase, karbonhidratlar, inorganik materyaller, vs. bulunmaktadır. Bu nedenle de vesiküller gelişmekte ve üremekte olan uç kısımlara gerekli materyalleri taşıyan konteynırlar gibi fonksiyonlara sahiptirler. Ayrıca, apekste kitin sentase (chitin synthase) enzimini muhafaza eden kitosomlar da (Chitosoma) bulunmaktadır. Vesiküllerin apekse doğru yol alışları hakkında kesin bir bilgi yoksa da, bunların, apekste membran potansiyelinin farklılığı nedeniyle proton pompalama yeteneklerinin fazla olmasından kaynaklandığı ve ayrıca hücre içinde bulunan mikrotubulusların veya mikroflamentlerin vesiküllerin apekse doğru gidişlerinde bir ray ödevi gördükleri iddia edilmektedir. Açıklığa kavuşturulması gereken diğer bir husus da apeksin nerede ve nasıl meydana geldiği sorusudur. Sporlar üzerinde yapılan bazı çalışmalardan elde edilen sonuçların apeks içinde kullanılabilmesi veya adapte edilmesi düşünülmektedir. Sporların su çekerek şişmesi ve jerm tüplerinin oluşması örneği apeksin meydana gelişini açıklamak için değerlendirilmektedir. Ancak, bu bilgiler de henüz olayı tam olarak aydınlatmada yeterli bulunmamaktadır. Mantar hifalarında branşlaşmada ve her branşın meydana geleceği yerde bir apeksin oluşması fenomeni genetik kontrol altında bulunmaktadır. Branşlaşmada da vesiküller ve diğer yapısal organeller aynı fonksiyonu yaparlar. 18 Mantarlarda Üreme Mantarlar sporlanma (sporulasyon) ile eşeysiz (aseksüel) ve eşeyli (seksüel) olarak üreme yeteneğine sahiptirler. Miselyumlar olgunlaşır ve yeterince gıda depo ederse veya çevresel koşullar sporulasyona uygun ise, hifalarda, genellikle, aerial olanlarında, çeşitli şekillerde sporlar gelişirler. Sporlar olgunlaştıktan sonra hifadan ayrılarak serbest hale gelir ve uygun ortam ve koşullarda çimlenerek kendi türüne özgü mantarı oluşturulurlar. Mantar sporları çok değişik biçim ve görünüme sahiptirler. Aynı zamanda, birçok tarzda da oluşturulurlar. Bu özellik, mantarların klasifikasyonunda fazlaca yardımcı olur. Mantar sporları değişen çevre koşullarına çok dayanıklıdırlar. Bu nedenle, doğada uzun yıllar canlı ve infektif olarak kalabilirler. Sporların içinde, seksüel veya aseksüel reprodüksiyon sonu oluşan bir veya birden fazla çekirdek bulunur. Karada yaşayan mantarların sporları etrafında kalın bir spor muhafazası (epispor) vardır. Bu tabakanın altında protoplasmayı çevreleyen endospor yer alır. Bazı mantar sporlarında da, sporu en dıştan saran, ayrıca bir tabaka (perispor) daha bulunabilmektedir. Sporların sitoplasmalarında nukleus, vakuoller, lipid granülleri ve bir mantarın oluşumuna yetecek miktarda diğer inorganik ve organik moleküller vardır. Spordan tallusun ortaya çıkması (germinasyon, çimlenme, filizlenme ) sırasında, sporlar su alarak şişerler, dışardan yeterince su ve gerekli diğer maddeleri alırlar ve sonra buradan dışarı doğru bir jerm tüpü uzanır. Bu tüp uygun ortamlarda hızla gelişerek ve büyüyerek diferensiye olur ve kendi türüne özgü hifaları ve bunlardan da diğer reprodüktif hifaları meydana getirir. 19 Spordan, jerm oluşumu yandaki gösterilmektedir. tüpü şekilde Sularda yaşayan mantarların sporlarında bulunan flagellumlar, bunları uygun ortamlara taşımakta ve hareketlerini sağlamaktadır. Böyle sporlara zoospor adı verilir. Bu kısım belgenin alt başlıklarının olduğu linkleri göstermektedir. 1.ASEKSÜEL SPORLAR 2. SEKSÜEL SPORLAR 20 Aseksüel Sporlar Mantarlarda başlıca 5 tür aseksüel spor oluşumuna rastlanmaktadır. Bunlar da : 1-Artrosporlar (Arthrospore) : Artrospor oluşumunda, hifalarda çok büyük bir şekil değişikliği görülmez. Sadece, reprodüktif hifalar, enlemesine septumlarla bölünerek ayrılırlar (fragmentasyon). Bazı artrosporların kenarları hafifçe kalınlaşmıştır. Biçimleri, genellikle, oval veya silindiriktir. Türlere özgü bir büyüklük gösteren artrosporlar, hifalardan ayrıldıktan sonra serbest kalır ve uygun ortamlarda çimlenerek her biri tekrar aynı tür mantarı oluştururlar. Dermatofitlerde artrosporlara, genellikle, deri ve kıllar üzerinde rastlanır. Kültürlerde pek az oluşurlar. Ayrıca, birçok mantar türlerinde de (Dermatofitler, Trichosporon, Geotrichum, C. immitis, vs.) artrospor oluşumu vardır. Arthrospor oluşumu yandaki şekilde gösterilmektedir. 2-Blastosporlar : Flamentöz Ascomycetes mantarlarında, mayalarda ve maya benzeri koloni oluşturan mantarlarda, hifaların çeşitli yerlerinde, genellikle, birden fazla küçük tomurcuklar (blastosporlar) meydana gelir ve çoğalma, bu tür sporlar aracılığıyla devam ettirirler. Blastosporlar olgunlaştıktan sonra serbest hale geçerler. Blastosporlar hifalara veya ana hücreye yapışık olarak da kalabilirler. Örn.Saccharomyces cerevisiae gibi. 3- Klamidosporlar (Chlamydospore) : Hifalarda bulunan hücrelerin bazıları daha büyür, gelişir, kenarları (hücre duvarları) kalınlaşır ve protoplazması konsantre hale gelerek klamidosporları oluştururlar. Bu tarzda meydana gelen ve etrafı kalın bir hücre duvarı ile çevrili olan sporlar, çevresel koşullara (mekanik, fiziksel ve kimyasal faktörler) çok dayanıklılık gösterirler. Klamidosporlar, hifaların, orta, yan ve uçlarında meydana gelebilirler. Mucoraceae familyasına ait türlerde bu tarz sporulasyona fazlaca rastlanır. Çeşitli aseksüel sporlar yandaki şekilde gösterilmektedir. A. Konidiospor B. Blastospor C. Klamidiospor 21 Yukarıda bildirilen 3 tarzda oluşturulan sporlar Tallosporlar adı altında da toplanmaktadırlar. 4- Konidiosporlar (Conidiospore) : Bu tür sporlara, flamentöz Ascomycetes ve bir çok Deuteromycetes (Fungi imperfecti) mantarlarında rastlanmaktadır. Sporlar (conidiae ), özel reprodüktif hifaların (konidiofor, conidiophore) yanlarında veya uçlarında meydana gelirler. Bu hifalar, aerial hifaların modifikasyonu ve diferensiye olması sonu teşekkül ederler. Bazı sporlar da doğrudan doğruya fertil hifa üzerinde oluşmaktadırlar. Bir kısmı da kısa bir sterigmata üzerinde gelişmektedirler (Sporotrichum da olduğu gibi). Konidiumlar, genellikle, oval, yuvarlak, şişe benzeri, armut, mekik, puro biçiminde, büyük veya küçük boyutlarda olabilirler. Konidiosporların büyüklüğü, şekli, yapısı, dizilişi ve diğer özellikleri ile konidioforların morfolojik karakterleri mantar türlerinin ayırımında işe yarayan önemli kriterler arasındadır. Bu tarz sporulasyona Aspergillus, Penicillium ve Hormodendrum cinslerinde fazlaca rastlanmaktadır. Deuteromyceteslere ait mantarlardan özellikle Dermatofitlerde (Microsporum, Trichopyton cinsleri) aynı hifa üzerindeki iki türde konidium oluşmaktadır. Bunlardan tek hücreli olanlar hifa üzerinde çeşitli yerlerde lokalize olmuşlardır ve küçük, oval, yuvarlak veya genellikle armut biçimindedirler. Mikrokonidium (microconidium, microaleuriospor) olarak adlandırılan bu sporlar, bazı mantar türlerinde çok sayıda olmasına karşın, diğerlerinde az veya çok nadir bulunabilir. Çok hücreli, mekik, puro veya limon biçiminde olan büyük sporlar, makrokonidiumlar ( macroconidium, macroaleuriospor ) enine septumlarla birden fazla hücreye bölünmüştür. Örn. M. nanum ’da 2-3 ve M. canis ’de ise 7-10 hücre bulunur. Çeşitli konidiosporlar gösterilmektedir. yandaki şekilde A. Mikrokonidium B. Makrokonidium Bazen, konidiosporlar (makrokonidium veya mikrokonidiumlar) hifa üzerinden doğrudan doğruya çıkarlar ve kendilerini taşıyan herhangi bir vejetatif hifa veya konidiofor bulunmayabilir (sapsız konidia, sesil konidia). Bazen de konidium özel bir hifa veya konidioforla esas hifaya bağlanır (saplı konidia, pedikulat konidia). 22 5- Sporangiosporlar : Bu tarz sporulasyona, Phycomcetes mantarlarında rastlanır. Sporlar (sporangiospor) , bunları taşıyan özel hifaların (sporangiofor) uçlarında oluşan büyük ve yuvarlak keseler (sporangium) içinde bulunurlar. Sporlar, genellikle, küçük dehidre ve kenarları kalıncadır. Sporangiumların alt kısımlarında, buna destek olan kolumella (columella) vardır. Sporangiumların patlaması ile sporlar dışarı saçılır, uygun ortam ve çevresel koşullar altında filizlenerek kendi türlerine özgü mantarları meydana getirirler. Örn. Rhizopus nigricans ’da olduğu gibi. Rhizopus nigricans’da sporangiofor ve sporangiumlar yandaki şekilde gösterilmektedir. Suda yaşayan Pyhcomycetes mantarlarının bazılarında sporların flagellumları vardır ve bunlar aracılığı ile hareket ederek uygun ortamlara ulaşırlar (zoospor). Örn. Saprolegnia mantarlarında olduğu gibi. Seksüel Sporlar Eşeyli üremede, seksüel sporlar, ayrı cins veya karakterde olan iki gametin çekirdeklerinin redüksiyona uğrayarak haploid hale gelmesi ve bu haploid kromozomların birleşmesi sonu meydana gelirler. Mantarların klasifikasyonunda dikkate alınan bu özellikler, mantar türleri arasında oldukça farklılıklar gösterebilmektedirler. 23 Seksüel üremede başlıca dört aşamanın varlığı bildirilmektedir. Bunlar da 1) Gamet veya seks cinsel organlarının hücrelerin oluşumu, 2)Bu organların birleşmeleri (plasmogami), hemen veya sonra nükleer bir birleşme (karyogami), 3) Haploid mantarlarda meiosis, ve 4) Sporların meydana gelmesi ve gelişimi. Son yıllarda yapılan bazı araştırmalarda seksüel üremede özel hormonların görev aldığı belirtilmektedir. Örn, Allomyces mantarlarında dişi gamet tarafından oluşturulan sireninin, kemotaksis ile erkek gameti kendine doğru çektiği açıklanmaktadır. Achlya türü mantarlarda dişi gametin meydana getirdiği antheridiolun, erkek gametin meydana gelmesi ve gelişmesine yardımcı olduğu bildirilmektedir. Antheridiolun absorbsiyonu sonu gelişen erkek gamet de oogoniol adı verilen bir madde salgılayarak bunun dişi gamete ulaşması oogoniumun gelişmesine büyük katkıda bulunduğu açıklanmıştır. Zygomycotina mantarlarında erkek ve dişi gametler ayrı hifalarda bulunurlar (heterotallik). Böyle özelliğe sahip olan türlerde, (+) ve (-) gametler ayrı hormon prekürsörleri oluştururlar. Bunlar birbirlerine karşı yönelerek birleşirler ve aktif bir hormon karakteri gösteren trisporik asit meydana gelir. Bu aktif hormon, aerial hifaların birbirlerine uzanmalarına ve değmelerine yardımcı olur.Bu uzantılara zigofor adı verilmektedir. Sonra bu (+) ve (-) gametler birleşerek zigot meydana getirirler. Çok katlı ve kalın bir spor duvarına sahip olan seksüel sporlar içinde sitoplasmik organeller (endoplasmik retikulum, mitokondrium, vs.) çok zayıf gelişmiş olup ancak depo materyalleri (lipid, glikojen, trehaloz) fazladır. Sporlar içinde su oranı düşük olduğu gibi iç metabolizma da minimal düzeydedir. Buna karşın zoosporlar ise çok daha fazla aktif bir metobolizmaya 24 sahiptirler. Bunlarda hücre duvarları yoktur ve sitoplasmik organeller oldukça fazladır. Depo madde oranları da diğer sporlara oranla daha düşüktür. Sporların başlıca iki tür dormant durumları bulunmaktadır. Endojenik dormant sporlarda, dış koşullar uygun olsalar bile germinasyon meydana gelmez. Böyle sporların belli bir olgunlaşma dönemi geçirmeleri gereklidir. Ancak, bazı özel koşullar (ısı veya soğuk şokları, spor dış muhafazasının giderilmesi, organik solventlerle muamele, vs.) sporu aktive edebilir. Aseksüel sporlarda genellikle, ekzojenik dormantspor karakteri bulunmaktadır. Aktivasyon için çevre koşulları (ısı, ışık, pH, oksijen, gıda, karbon ve nitrojen kaynakları, vs.) gereklidir. Mantarlarda seksüel sporlar başlıca 4 tarzda oluşturulurlar. 1- Askosporlar (ascospore) : Ascomycetes mantarlarında seksüel sporlar askus (ascus) denen genişlemiş ve uzamış hücre keseleri içinde oluşurlar. Aynı veya ayrı hifalarda, birbirine komşu iki hücrenin (askogonium ve anteridium) uzaması ve bunların birbirleriyle birleşmesi sonu askosporlar meydana gelirler. Önce, iki hücre arasındaki membran eriyerek kaybolur. Sonra, anteridial çekirdek, askogoniumun içine girer ve yeni hücre, iki nukleuslu hale gelir. Nukleuslar birleştikten sonra, meiosis tarzında bölünmeye başlar. İki veya daha fazla bölünmeden sonra, çekirdeklerin etrafı kalın bir muhafaza ile çevrilir. Böylece, 4 veya 8 haploid askospor meydana gelmiş olur. Sporlar olgunlaşınca, etrafında bulunan kese yarılarak sporlar dışarı çıkarlar. Örn. Aspergilluslarda olduğu gibi. Askospor formasyon aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir. Perithecium of Gelasinospora ascospore 25 Birbirine yakın veya yan yana bulunan birden fazla asklar (asci), askokarp (ascocarp) diye adlandırılan açık veya kapalı özel kese veya muhafaza içinde bulunurlar. Çeşitli yapısal ve biçimsel farklar gösteren askokarplardan tabak gibi açık olanına apotesium (apothecium), kapalı ise klaistotesium (cleistothecium) ve yuvarlak ise peritesium (parithecium) gibi adlar verilmektedir. 2- Basidiosporlar: Bu tarz seksüel sporlara Basidiomycetes mantarlarında rastlanır. Bunlarda, basidiumların gelişmesi ve basidiosporların oluşması ile askosporlara bazı yönlerden benzerlik gösterirler. Önce, birbirine komşu olan iki hücre uzayarak birleşir ve aralarındaki membran kaybolur. Sonra, bir hücrenin çekirdeği diğerine girerek birleşir ve tek nukleuslu hale gelirler. Tek çekirdek, meiosis tarzında bölünmeye devam ederek 4 haploid nukleusa ayrılır. Basidiumların uç kısmında, her çekirdek içinde bir tane olmak üzere sterigmata (basidium) meydana gelir ve nukleusların her biri kendine ait olan sterigmata içine girer ve böylece basidiosporlar oluşurlar. Sporlar, sonradan, bulundukları yerlerinden ayrılarak çeşitli yerlere giderler. Bunlar kendileri için elverişli ortam bulduklarında filizlenerek yeni bir mantarı meydana getirirler. Basidiosporlar, askosporların aksine, eksternal olarak gelişirler . 26 Basidiospor formasyon aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir. 3- Oosporlar : Phycomcetes mantarlarında Oomycetes sınıfına ait türlerde seksüel çoğalma oosporlar aracılığı ile devam ettirilir. Bu mantarlarda erkek gamet anteridium(antheridium), dişi gametten (oogonium) daha küçüktür, ayrı karaktere ve görünüme sahiptir. Oosporlar, bu gametlerin birleşmesi sonucu meydana gelirler. Oosporlar kalın duvarlı, yuvarlak, dış etkilere dayanıklı ve içleri gıda ile doludur.Saprolagnia mantarlarında oogonium ve 27 oospor oluşumu yandaki şekilde gösterilmektedir. Saprolegnia mantarlarında, aynı mantar üzerinde bulunan gametlerden erkek gamet flamentöz yapıya sahiptir ve başka bir hifadan orijin alır. Yuvarlak veya oval biçimde olan oogoniuma uzanır ve fertilizasyon tüpü yardımı ile onunla birleşir ve böylece oosporlar meydana gelirler. Saprolegnia mantar türlerinde gametler aynı mantar üzerindeki hifalardan kaynaklanmasına (homotallik) karşın, bazı mantarlarda ise, gametler ayrı mantarlara ait hifalar üzerinde bulunurlar (heterotallik). 4- Zigosporlar (Zygospore) : Phycomycetes mantarlarından Zygomycetes sınıfına ait türlerde, gametangiumlar (+ ve - hücreler) somatik hifaların branşlarından orijinlerini alırlar ve aynı mantar üzerinde bulunurlar (homotallik). Bunlarda, belli bir görünüme ve biçime sahip erkek veya dişi karakteri gösteren hücreler oluşmazlar. Birbirine benzeyen iki cins gametin birbirine doğru uzaması ve birleşmesi sonu seksüel spor (zigospor) teşekkül eder. Birleşme sırasında, hücreler arası bölmeler kaybolur ve nukleusları kaynaşır. Sonra, sporun etrafı kalın bir muhafaza ile çevrilir. Zigospor uygun koşullar altında filizlenerek yeni hifa ve mantarı teşkil eder. Rhizopus Homothallicus, Zygospore Örneği 28 Zygospores of Rhizopus sexualis 29 Rhizopus sexualis ‘te zygospor oluşumu aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir. Mayalarda Üreme Ve Üremenin Kinetiği Mayalar üreme yönünden başlıca iki gruba ayrılırlar (aseksüel ve seksüel üreme). Aseksüel Üreme : Bu üreme tarzı başlıca iki karakter gösterir. Bazı mayalar tomurcuklanma ve diğerleri de ortadan bölünerek çoğalırlar. Tomurcuklanma ile çoğalmada önce hücrenin bir ucunda kabarcık meydana gelir ve bu zamanla gelişerek esas hücre boyutlarına ulaşır. Bu durumda, yeni oluşan hücre ya ayrılarak serbest kalır veya bitişik olarak yaşamına devam eder. Bu tarzdaki üremeye Saccharomyces sınıfına ait türler (S. cerevisiae, vs.) örnek verilebilir. Bitişik olan iki hücre de sonradan tomurcuklar oluşturarak üremeye devam ederler. Ortadan bölünerek çoğalma, aynen bakterilerde olduğu gibi, maya hücresi, ortasına doğru uzanan bir septumla ikiye ayrılır. Seksüel Üreme: Bu üreme tarzı yine Saccharomyces sınıfına ait türlerde (S. cerevisiae veSchizosaccharomyces octoporus) görülmektedir. Bu türlerde zigot oluşumu değişik tarzda gelişir ve gerçekleştirilir. Seksüel üreme, ya askosporların oluşmasına yol açan sporulasyonla veya gametlerin birleşmesi (gamet formasyonu) tarzında görülmektedir. Mantarların Beslenmesi Mantarların kendilerine özgü bir beslenme tarzları bulunmaktadır. Enerji kaynağı için organik bileşiklere ve biyosentez için de karbonlu kaynaklara gereksinim duyarlar. Mantarlar, genel olarak, heterotrofik organizmalar olarak kabul edilirler. Basit organik moleküller (monosakkaridler, amino asitler, organik asitler, vs.) hücre membranlarından kolayca içeri girebilirler. Buna karşın, makromoleküller ise (disakkaridler, polisakkaridler, polipeptid ve proteinler, vs.) dışarıda enzimatik olarak ayrıştırıldıktan ve membrandan geçebilecek bir düzeye indikten sonra içeri girebilirler. Bazı mantarlar da (Myxomycestes) gıdalarını fagositozis veya endositozis ile alabilirler. 30 Mantarlar gıdalarının bir kısmını kendileri sentez edebilirler. Ancak, büyük bir bölümünü de dışardan sağlarlar. Dışarıda bulunan makromoleküllerin veya polimerlerin membrandan girebilmesi ekstrasellüler enzimlerin aktiviteleri ile mümkündür. Bu hidrolitik enzimler, hücre içinde sentezlendikten sonra, bir kısmı (yeteri kadarı) hücre içinde kalır ve diğer bir kısmı da dışarıya bırakılırlar. Bu enzimler polimerleri monomer haline getirirler. Bu monomerler de aktif ve/veya pasif transportla hücre içine girerler. Hücre içine ulaşan bu maddeler burada daha küçük birimlerine ve yapı taşlarına kadar ayrıştırıldıkları gibi bir kısmı da olduğu gibi sentez olaylarında kullanılırlar. Ekstrasellüler enzimlerin dışarı çıkmasında ve hücre duvarına kadar taşınmalarında vesiküllerin büyük rolleri olduğu bildirilmektedir. Vesiküller, sitoplasmik membrana kadar gelerek içindeki enzimleri buraya bırakır ve buradan da enzimler dışarı çıkarlar. Enzimlerin ve hücre içindeki metabolitlerin dışa çıkmasında ve dışardan içeri monomerlerin girişinde suyun rolü büyüktür. Enzimlerin bir kısmı, aynen bakterilerde olduğu gibi, yapısal ve bir bölümü de indüklenebilen bir karaktere sahiptir. Mantarlar karbon ve enerji kaynaklarını bir çok substratlardan temin edebilirler. Doğada serbest olarak yaşayan mantarların bir çoğu enerji için bitkisel orijinli kaynaklardan yararlanırlar. Mantarların büyük bir ekseriyeti de glikoz, sakkaroz, nişasta, maltozu ayrıştırabilir ve bunlardan yararlanabilir. Bazıları da yağ asitlerini, organik asitleri ve gliserolu da enerji kaynağı olarak ve ayrıca, hekzos ve pentoz şekerlerinin derivatlarını da (uronik asit ve şeker alkollerini) kullanabilirler. Bunların hücre membranlarından geçişinde permease enzimlerinin rolü fazladır. Bir polisakkarid (birbirine beta 1 - 4 bağlarıyla birleşmiş glikoz monomerlerinden oluşmuş düz zincirli homopolimer) olan nişasta hücre duvarı yapısında bulunması bakımından önemlidir. Sellüloz da mantar hücrelerin sentezledikleri sellülase enzimleri tarafından ayrıştırılır. İki enzim (endo - beta - glukonase ve beta - glukosidase) tarafından ayrıştırılan selüloz küçük moleküllere kadar indirilir. endo-beta beta-glukosidase Sellüloz ¾———® Sellobiose ¾¾¾—¾——®glikoz glukonase Bu enzimlere topluca sellülase kompleksi adı verilmektedir. Bunlar indüklenebilen enzimlerdendir. Ancak, sellülazın sentezi, ortamda glikoz veya çabuk ayrışabilen diğer şekerler varsa suprese olabilir (katabolik baskılama). Enzimlerden endo glukonazın M.A. 11000 - 65000 ve beta glukosidase de 50000 ile 65000 molekül ağırlığı civarındadır. Bazı mantarlar üremeleri için basit inorganik bileşiklerden de yararlanabilir, eğer bunlar karbon kaynakları bulabilirse. Bir kısmı da tiamin, biotin, vs. gibi vitaminlere gereksinim duyarlar. 31 Mantarların Fizyolojisi Mantarların hücre duvarlarında kitin ve selüloz karakterinde substansların bulunması, bunların devamlı değişen ve çok değişik olan çevre koşullarına uymalarında büyük yardımcı olurlar. Örn. mantarlar, bakterilerin dayanamayacakları kadar yüksek konsantrasyondaki şeker(%50) solüsyonuna direnç gösterirler. Çünkü, yüksek ozmotik basınca karşı, bakteriler kadar duyarlı değillerdir ve bunu hücre duvarının yapısındaki maddeler sağlarlar. Bu nedenle, reçel ve jöleler mantarlar tarafından kolayca kontamine edilebilirler. Ancak, bazı mantar türlerinin de %15 şeker yoğunluğunda üremelerinde sınırlanma oluşmaktadır. Mantarlar genellikle düşük pH derecelerinde bile kolayca üreyebilir ve böyle ortamlara adapte olabilirler. Bu sebeple, mantarların minimal ve maksimal pH-limitleri 2-11 arasında değişebilir. Asit karakterdeki meyveler veya suları (özellikle, domates, portakal, limon, greyfurt, mandalina, vs.) buz dolabı ısısında olsalar bile mantarların üremeleri için iyi bir ortam oluştururlar. Hatta, bazı türler, 1 N asetik asit ve 2 N sülfürik asite dirençlidirler. Bunlara karşın, mantarların türlerine göre değişmek üzere, optimal pH'ları, üreme ve çeşitli metabolit sentezi ile paralellik göstermeyebilir. Buna, diğer çevresel koşulların ve üreme ortamının yapısının da büyük etkisi bulunmaktadır. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan mantarlar (patojenik mantarlar), üredikleri bölgelere ait pH limitleri, genellikle, kendileri için optimal bulunmaktadır. Rutubet, mantarların üremelerinde çok önemli faktörlerden birini oluşturmaktadır. Yüksek orandaki rutubet, genellikle, üreme üzerine olumlu etkide bulunur. Rutubet azaldıkça, mantarların çoğalmaları da sınırlanmaya başlar. Mantarların rutubete olan gereksinmeleri, türler arasında değişiklik gösterir. Bazı mantar türleri relatif rutubeti %10-15 arasında bulunan ortamlarda veya suyu çok azalmış olan kuru danelerde üreme yeteneğine sahiptirler. Patojenik mantarların, özellikle, dermatofitlerin insan veya hayvan vücutlarında yerleşebilmesi ve hatta hastalık oluşturabilmesi için rutubet yine önemli bir faktördür.Eğer deri, su ile ıslanmış ise, mantarların yerleşmesi ve üremesi daha kolay olmaktadır. Mantarların üreme ısısı limitleri oldukça geniştir ve türler arasında farklar gösterir. Bu sınırlar, 0° ile 60°C arasında değişebilmektedir. Hifalar maksimal ısı limitinin dışında kolayca ölmelerine karşılık, sporları yüksek ısıya ve değişik çevre koşullarına çok fazla dayanıklılık gösterirler. Buz dolabı ısısında üreyebilen ve gıdaların bozulmasına neden olan mantarlara her zaman rastlamak mümkündür. Termofilik olanlar ise 60°C nin üstünde gelişebilirler. Ancak optimal ısı, üreme için en uygun olanıdır. Patojenik mantarlar için optimal ısı, üzerinde veya içinde üredikleri canlının ısı derecesi olarak kabul edilmektedir. Ancak, deride lokalize olan mantarlar dış ortamla da temasta bulunduklarından optimal ısı, çevrenin ısısı ile bir yakınlık göstermektedir. Bu nedenle, dermatofitler için optimal üreme ısısı 20-25° C'ler arasındadır. Mantarlar, aynı bakterilerde olduğu gibi, üreme ısısı derecelerine göre başlıca 3 kısma ayrılırlar. Soğuk sevenler (psikrofilikler), genellikle 0° ile 15°C'ler; Ilık sevenler (mesofilikler), 15° ile 40°C'ler arasında ve sıcak sevenler (termofilikler) ise 40°C'den yukarıda 32 üreyebilme kabiliyetine sahiptirler. Çok fazla soğuk, mantarların muhafazasında kullanılmaktadır. Sıfırın altında 195°C'de mantarlar uzun süre canlı kalabilirler. Mantarlar, genellikle, aerobik karakter taşırlar ve oksijenin bulunduğu ortamlarda gelişirler ve ürerler. Bu nedenle, havada bulunduğu miktar (veya oran) kadar oksijen, üreme için gereklidir. Patojenik mantarlardan, Actinomyces bazı türleri hariç olmak üzere, diğerleri aerobik koşullarda ürerler. Oksijenin azlığı veya mikroaerofilik koşullar üremeyi ve gelişmeyi sınırlar. Mantarların üremeleri için ışık, gereksinme duyulan önemli bir faktör değildir. Işık olmadan da kolayca gelişebilirler. Patojenik mantarlar da direkt ışık olmadan üreyebilme yeteneğine sahiptirler. Direkt güneş ışınları, üremeyi ve gelişmeyi sınırlar. Ultraviolet ışınları fungistatik bir etkiye sahip olmasına karşın iyonizan ışınlar öldürebilirler (fungisid). Mantarların klorofilleri olmadığı için fotosentez yapamazlar. Bu nedenle gıda gereksinimlerini (beslenme) dışardan karşılamak zorundadırlar. Bazı mantarlar basit yapıdaki ortamlarda (minimal ortam) gelişebildikleri halde, diğerlerinin ise üremeleri ve gelişmeleri için inorganik (C ,H, O, K, P, N, S, Fe, Mn, Mo, Cu, Zn, Ca, vs.) maddelere ve özel üretme faktörlerine (tiamin, biotin, Vit. B6, pantotenik asit, inositol, riboflavin, vs.) ihtiyaçları vardır. Mantarların karbon kaynaklarını, daha ziyade karbonhidratlar, alkol, organik asitler ve proteinler oluşturmaktadır. Nitrogen kaynağı için amonyum tuzları, sitratlar, proteinler, pepton, peptid, amino asit, üre, vs. den yararlanırlar. Bazı türler de amonyak ve nitratı bu amaç için kullanırlar. Mantarların bazıları kendilerine lüzumlu olan vitamin veya diğer gerekli maddeleri sentez edebilme kabiliyetine sahiptirler. Patojenik mantarlardan bir kısmı için tiamin, inositol veya biotin üremeyi artırıcı veya üretme faktörü olarak önemlidir. Örn. T. equinumüremesi için nikotinik asit, T. megnii için de L-histidine gereksinim duyulur. Tiamin, T. tonsurans 'ın üremesini artırır. Patojenik mantarları üretmek ve izole etmek için, laboratuvarlarda, bileşiminde çeşitli inorganik ve organik maddeler bulunan besi yerleri kullanılmaktadır. Bunlar arasında en fazla Sabouraud dekstroz agar, Brain-heart infusion kanlı agar, Czapek agar, Patates dekstroz agar, vs. sayılabilir. Mantarların bazıları kuvvetli enzimler sentezleyerek bunların aracılığı ile çevredeki gıda maddelerini ayrıştırır ve bunlardan yararlanırlar. Bu enzimler, daha ziyade protease, karbonhidrase, nuklease ve lipase karakterindedirler. Bazı mantarlar da birden fazla enzim sentez edebilmektedirler. Örn.Aspergillus niger (amilase, sellobiase, katalase, lipase, protease, maltase, vs.) ve A.oryzae (amidase, amilase, katalase, lipase, protease, maltase, vs.) ve P. camamberti (amidase, laktase, lipase, maltase, protese, nuklease, vs.) gibi. Mantarlar toprak fertilitesinin sağlanmasında, peynirlerin olgunlaşmasında ve bazı önemli endüstri ürünleri elde edilmesinde çok büyük yararlar sağlarlar. Organik asitler (asetik, formik,fumarik, gallik, glukonik, laktik, malonik, sitrik, oksaIik asitIer ve diğerleri), alkoller (alkol, gliserol, eritritol, mannitol, vs.), enzimler (amidase, amilase, invertase, lipase, protease, maltase, vs.), pigmentler (aleoamodin, auratin, beta karoten, aspergillin, vs.), 33 polisakkaridler (glikojen, reguloz, nişasta, vs.), steroller (kolesterol, ergosterol, fungisterol, fitosterol, vs.), antifungal maddeler (griseofulvin, mikostatin, nistatin, vs.), antibiyotikler ( penisilin, eritromisin, sikloserin, sefalosporin, kanamisin, streptomisin, vs.) ve diğer bir çok önemli maddeler ( vitaminler, proteinler, ergot alkaloidleri, lipidler, toksin ve diğer toksik substanslar) bu ürünlerin arasında yer alırlar. Mantarlar insan ve hayvanlarda, gerek kutan ve subkutan ve gerekse sistemik infeksiyonlar oluşturması bakımından da medikal önemleri fazladır. Bu hastalıkların bazıları da zoonotik bir karaktere sahiptir. Mantarlar insan gıdası olarak da kullanıldıklarından, beslenmede özel bir yerleri vardır. Bu amaçla, zehirsiz türde mantarlar üretilmekte ve yemek olarak kullanılmaktadırlar. Mayalardan ekmek yapımına ve içkilerin fermentasyonunda (bira, şarap, viski, vs.) da büyük yararlar elde edildiği gibi bazı peynirlerin (Roquefort, Camemberti, Gorgonzola, Stilton, vs.) olgunlaşmasında da önemli görevler yaparlar. Ayrıca, maya hücrelerinin sentezlediği vitaminler (tiamin, riboflavin nikotinik asit, pentotenik asit, biotin, pridoksin, vs) de insan ve hayvanlarda kullanılan medikal önemleri olan maddeler arasındadır. Mantarların sentezledikleri ve sekonder metabolitlerden olan toksinler (mikotoksinler) insan ve hayvan sağlığı için büyük tehlike göstermektedirler. Bunlar arasında A. flavus 'un ve diğer mantarların sentezledikleri Aflatoksin karaciğerde kanser oluşturacak nitelikte etkiye sahiptir. Ayrıca, Rubratoksin, Okratoksin, Fusariotoksin ve diğer toksik substanslar da çeşitli mantarlar tarafından oluşturulurlar. Mantarlar, meyve, sebze, ağaç gövdeleri, depolardaki çeşitli dane ve diğer gıdalarda da üzerinde veya içinde üreyerek bozulmalarına, değerinin ve kalitesinin düşmesine neden olurlar. Mantarların Metabolizması Mantarların metabolik aktiviteleri alg ve yüksek bitkilerden biraz farklılık gösterir. Fotosentez yetenekleri olmadığından, enerjice zengin karbon kaynaklarına ihtiyaçları vardır. Heterotrofik bir beslenme özelliği gösteren mantarların metabolizmaları oldukça fazladır. Bunu gerçekleştirmek için fazla enerjiye ve dolayısıyla da enerji üretimine gereksinimleri vardır. Mantarlarda da, diğer ökaryotik ve prokaryotiklerde olduğu gibi, adenozin trifosfat ( ATP) merkezi bir role sahiptir. Enerji üretiminde şekerler ve şeker derivatlarının ayrıştırılması (glikolizis) önemli olup başlıca 3 yolla sağlanmaktadır. 1) Embden - Meyerhof - Parnas (EMP), 2) Hekzos monofosfat yolu (HMP) ve 3) Entner - Deudoroff (ED) biyokimyasal yollarıdır. Mantar türlerine göre değişmek üzere, bunlardan birinci veya ikinciler en fazla tercih edilen metabolik yollardandır ve bu sayede enerji üretimi gerçekleştirilir. Her üç metabolik yolla da pürivik asit merkezi role ve basamağa sahiptir. Şekerlerin veya derivatlarının oksidatif ayrışmasında (aerobik) daha fazla enerji açığa çıkar. Çünkü, son ürün olarak karbondioksit ve su meydana gelir. Halbuki, fermentatif ayrışmada (anaerobik) organik asitler daha fazla 34 teşekkül eder ve oluşan enerjinin büyük bir kısmı bu asitlerin atomları arasında saklı kaldığından daha az oranda enerji üretilir (daha az ATP meydana gelir). EMP metabolik yolundan bir molekül glikozdan 2 molekül ATP oluşmasına karşın, HMP yolundan ise 1 M glikozdan ancak 1 molekül ATP üretilir. Fermantasyonda, elektron alıcısı olarak organik moleküller ve respirasyonda ise inorganik moleküller görev yaparlar. Metabolik aktivite sonunda mantar hücreleri içinde birçok depo maddeleri birikebilir. Bunlar arasında lipidler ve karbonhidratlar vardır. Mantar hücre duvarında kitin (N-acetyl glucose amine monomerlerinin birbirlerine beta 1-4 bağları ile birleşmesinden oluşan düz bir zincir halinde polimerdir) de bulunmaktadır. Kitinin sentezinde görev alan chitin synthase enzimi birçok mantarda zymogen (inaktif formda) halinde sentezlenir. Sonradan, proteolitik enzimlerin (kısmi proteolitik) etkileri ile aktif enzim haline dönüştürülür. Son yıllarda, elektron mikroskopla yapılan çalışmalarda chitin synthase enziminin hücre içinde partiküller halinde (chitosome) bulunduğu gösterilmiştir. Bunların yuvarlak (40-70 nm çapında) ve etrafında 7 nm kalınlıkta bir membranla çevrili oldukları ortaya konulmuştur. Eğer, kitosomlar, enzim, aktivatör (proteolitik enzim ve substrat) Nacetyl glucose amine ile birlikte inkube edilirse, bir süre sonra tipik kitin mikrofibrillerinin oluştuğu gözlenebilir. Mantar hücrelerinde, birçok amino asit, organik asitlere amonyağın ilavesiyle (aminasyon) veya transaminasyon ile (amino asit ile organik asit inkorporasyonu) elde edilmektedir. Mantarlarda sekonder metabolizma olarak tanımlanan ve ancak, normal metabolizmanın sınırlandığı durumlarda aktif hale gelen diğer bir metabolizma olayı da bulunmaktadır. Şimdiye dek 1000 den fazla sekonder metabolit bildirilmiştir. Bu metabolitlerin kimyasal yapıları farklı olup türlere özgü bir karakter taşımaktadırlar. Bazı metabolitlerin ticari değerleri çok fazladır (antibiyotikler, hormonlar, vs.) bazıları da insan ve hayvan için oldukça toksiktirler (mikotoksinler gibi). Üremeleri kısıtlanan ve durma dönemine giren mantarlar tarafından sentezlenen bu sekonder metabolitler, bir mantar için hayati önemde olmayıp normal üreme döneminde sentezlenen primer metabolitlerden oldukça farklıdırlar. Primer metabolizma ürünleri arasında bazı hidrolitik enzimler (protease, karbohidrase, lipase, organik asitler, pigmentler, polisakkaridler, steroller, vs. metabolitler) bulunmaktadır. Bunların da ticari önemleri oldukça fazladır. Mantarların hücre yapısında makromoleküller ve mikromoleküller bulunmaktadır. Makromoleküllerden, nukleik asitler, DNA ve RNA ( tRNA, mRNA, rRNA) lar bulunur. Ribosomal RNA 80 S (60 S + 40 S) karakterinde olup, prokaryotiklerden (70 S) farklıdır. Mantar türlerine göre % G + C oranı da değişiklik gösterir. Proteinlerin büyük bir çoğunluğunu enzimler teşkil ederler. Polisakkaridler ise hücre duvarında ve hücre içi depo maddelerinde bulunurlar. Mikromoleküller arasında çeşitli inorganik elementler (minareller, vs.) vardır. Mantar hücrelerinde ayrıca, lipidler, pigment maddeleri, tuzlar, vs. vardır. 35 Mantar Plasmidleri Yapılan çalışmalarda mayalarda (S.cerevisiae) DNA karakterinde (3.9 x 106 dalton) ve 2 mikrometre uzunluğunda sirküler ve çift iplikçikli plasmidlere rastlanılmıştır. Yaklaşık 6 polipeptid zincirini kodlayabilecek bir kapasitede (6318 bp) olan plasmidin bir hücrede 25100 kopyasının bulunabildiği ve maya hücresi kromozomunun %3'ü kadar olduğu belirtilmiştir. Ayrıca bu plasmidin oligomycine karşı dirençlilik geni taşıdığı da açıklanmıştır. Maya plasmidinin, diğer ökaryotik ve prokaryotik hücrelere ait olan plasmidlere bazı benzerlikleri de bulunmaktadır. Maya hücresi DNA'sı her replike olduğunda plasmid DNA'sı da replike olmaktadır. S. italicus, D. diastaticus, T. dattila ve diğer bira mayası hücrelerinde (K. lactis) de 2 tane lineer çift iplikçikli ve öldürücü nitelikte DNA plasmidlerin varlığı açıklanmıştır (PGKL 1 ve PGKL 2). Bu karakterde plasmide sahip olan K. lactis, toksik maddeler salgılayarak diğer tür mayaları (toksik madde sentezlemeyenler) öldürülebilmektedir. Son yıllarda plasmidlerin, rekombinant DNA teknolojisinde gen aktarımlarında, vektör olarak kullanılması, maya plasmidlerinden de yararlanma olasılığını ortaya koymuştur. Örn. Hepatitis B virusunun yüzey proteinini kodlayan gen (S-geni), S. cerevesiae içinde klonlanarak aşı hazırlanmıştır. Şöyle ki, S-geni restriksiyon enzimleri ile kesilerek çıkarıldıktan, E. coli 'ye ait pBR322 plasmidi ile bağlandıktan sonra E.coli 'ye aktarılarak fazlaca üretilmesi sağlanır. Sonra, E.coli 'den çıkarılan plasmidlerden S-geni ayrılarak S. cerevisiae'nin pRIT 12363 plasmidi ile birleştirilerek, maya hücresi protoplastına aktarılır. Böylece, genin maya hücresi içinde üretilmesi ve ekspresyonu sağlanır). Maya protoplastlarından ökaryotik alıcı hücre olarak fazlaca yararlanılmaktadır. Mantar Virusları (Mikoviruslar) Elektron mikroskopla yapılan incelemelerde, Penicillium cinsine ait bazı türler içinde çapları 25-50 nm kadar olan izometrik çift iplikçikli RNA viruslarına rastlanıldığı açıklanmıştır. Mikoviruslar, nadiren mantar hücrelerinde erimeler meydana getirirler. Mikovirusların mantarlarda toksin sentezini önlediği ve mantarları apatojenik hale getirdiği bildirilmiştir. Viruslar mantarlardan çıkarılınca, mantarların tekrar toksin sentezlediği açıklanmıştır. Virusların vektörler aracılığı ve anastomozlarla bir hifadan diğerine aktarılabildiği belirtilmiştir. Sporlarla da yayılmanın olabileceğine deyinen araştırıcılar bulunmaktadır. 36 Bir kısım virusların da konakçısını (Agaricus bispores) lize ettiği bildirilmiştir. Parazitizm ve Parazitik Mantarlar Mantarlar gıdalarını temin etmede çok geniş bir konakçı spektrumuna sahiptirler. Canlı (insan, hayvan, bitki, protozoa, vs.) ve cansız (daneler, yemler, besinler, vs.) ortamlar, uygun çevresel koşullar (ısı, rutubet, vs.) altında, mantarların üremeleri ve gelişmeleri için oldukça elverişlidir. Mantarlar üzerinde üredikleri substratlardan gıdalarını temin ederken bazı bozukluklara neden oldukları gibi salgıladıkları toksinlerle (mikotoksinler) ve toksik maddelerle de oldukça etkili olmaktadırlar. 1) Mantar Patojenleri Ve Mikoparazitizm : Mantar türleri arasında birbirlerini parazitine eden mantarlara rastlanılmıştır. Bu tür mantarlardan doğada fazla bulunmakta ve regülatör bir fonksiyon yaptıkları da açıklanmaktadır. Çünkü, aşırı mantar üremelerinin bu tarzda biyolojik bir kontrolle önlenebildiği kabul edilmektedir. En fazla tanınan parazitik mantar türleri arasında, Trichoderma viridae ve diğer bazı türler (Pythium oligandrum, vs.) sayılabilir. Gliocladium roseum ve P. vermiculatum nekrotoksik mikoparazitler arasında yer almaktadır. Zygomycotina sınıfına aitPiptocephalis dispira ve Dimargaris spp., gibi mantarlar, aynı sınıfa ait diğer mantarlar için parazitiktirler. Deuteromycetes sınıfına ait Gonatobotrys simplex, Gonatobotrium fuscum, gibi mantarlar da, aynı sınıfa ait bazı mantarlar için parazitik oldukları açıklanmıştır. 2) İnsekt Patojenleri Ve İnsektparazitizm : İnsektler için patojenik olan mantarlar, ya insektlerin üzerinde veya larvalarının üzerlerinde yaşayarak hastalanmalarına ve ölmelerine neden olurlar. Chytridiomycetes sınıfına ait olan Coelonomycetes türleri moskito larvalarında ve Zoomycotina grubundan Entomophters türleri aphidler, ev sinekleri ve diğer insektler üzerinde parazitik bir yaşama sahiptirler. Deuteromycetes sınıfına ait bazı türler de (Matarhizium anisopliae, Beauveria bassiana veVerticillium lecanii ) gibi mantarlar da tahıl böcekleri üzerinde yaşarlar ve bunların ölmelerine neden olurlar. Coelonomycetesler (yaklaşık 40'dan fazla türü bildirilmiştir,) özellikle Anapheles ve Aedes insektleri için obligat parazittirler. Bu mantarların sporları larvalardan çıktıktan sonra copepodalara (Cyplops vernalis) girerek bunlarda gametangiumlar oluştururlar. Haploid olan bu gametangiumlar içerde ve dışarıda birbirleri ile birleşerek zigot meydana getirirler ve bunlar da moskito larvalarını infekte ederler. Entomophteralar (yaklaşık 100 kadar tür 37 bildirilmiştir.), E. aphidis ve ev sinek larvalarına (E. muscae) girerek burada yaşarlar ve larvaların dejenerasyonlarına yol açarlar. 3) Bitki patojenleri ve fitoparazitizm : Mantarlar, genellikle, bitkiler üzerinde daha uygun bir gelişme ve üreme olanağı bulurlar. Bu nedenle de bitkilere fazla zarar verirler. Çeşitli bitki, ağaç ve tahıllara zarar veren oldukça geniş bir mantar türü bulunmaktadır, Phytophtera parasitica, Fusarium spp., Rhizoctonia solani vs. mantarlar peptik enzimler (pectinesterase, polygalactouronase, polymethylgalactouronase, vs.) sentezleyerek danelerin bozulmasına (hasattan önce, hasattan sonra ve depolarda) neden olurlar. C. purpura 'nın sclerotoniumu da, özellikle, tahıllar tarlada iken büyük zararlara yol açmaktadırlar. 4) Hayvan Ve İnsan Patojenleri Ve Zoo-Ve Antropoparazitizm: Özellikle, Deuteromycetes sınıfına ait olmak üzere diğer bazı mantarlar da, insan ve hayvanlarda yüzeysel, kutan, subkutan ve sistemik infeksiyonlara neden olurlar. Ayrıca birçok mantarların da (A. flavus, A. ochraceus, P. rubrum, F. tricinctum, vs.) sentezledikleri toksinler (mikotoksinler: Aflatoksin,Okratoksin, Rubratoksin, Fusariotoksin) insan ve hayvan için oldukça tehlikeli hastalıklara ve bazen ölümlere yol açarlar. Basidiomycetes sınıfına ait bazı türler de yenildiklerinde mantar zehirlenmelere yol açmaktadırlar. MANTAR HASTALIKLARININ EPİDEMİYOLOJİSİ Mantar infeksiyonlarının çıkış, yayılış ve bunları etkileyen faktörlerinin saptanması, özellikle, bulaşma ve yayılma yönünden, kısa bir süre içinde önlemlerin alınması bakımlarından değer taşımaktadır. Hastalığın kaynağını bulmak, etkeni izole ve identifiye etmek sağaltıma erken başlamak ve infeksiyonu, etrafa yayılmadan söndürmek yönünden çok büyük yararlar da sağlar. Mantar hastalıkları, insanlar ve hayvanlar arasında, yeryüzünde çok yaygın olarak bulunurlar. Ancak, mantar infeksiyonlarının sporadik karakterde ve belli yörelerde lokalize olmaları ve yavaş gelişmeleri gibi nedenler, bunların epidemik hale gelmesini engellemektedir. Buna, mantarların bulaşma tarzlarının da katkısı fazladır. Ayrıca, sistemik infeksiyonlara neden olan mantarlardan bazıları bir şahıstan diğerine bulaşma yeteneğine sahip değildir. Bu durum da, yayılma ve bulaşmada yer alan önemli faktörü ortadan kaldırmakta, ve bulaşma zincirini kırmaktadır. Mantarların bazıları, hastalık oluşturmayan bir karaktere sahiptirler. Bunlar doğada toprakta insan ve hayvanların solunum ve sindirim sistemlerinde, deri ve mukozalarında, gübreler de (memeliler kanatlı ve yarasa), barınaklarında çürümüş yapraklar, odunlar, ot, saman, yem, gıdalarda ayrıca mantar sporları havada oldukça fazla bulunurlar. Bu nedenle toprak, mantarlar için çok iyi bir rezervuar alıştırmakta ve kuşağındaki insan ve hayvanlara, özellikle, solunum sisteminden bulaşmaktadırlar. 38 Mantar sporları, laboratuvarlara, toprak, toz ve gönderilen muayene materyalleri ile taşınır. Mantarların çoğu, uygun koşullar oluştuğunda insan ve hayvanlara bulaştığından ve hastalık yaptığından bir kontaminant özelliği taşımaktadır. Mantarlar, insan ve hayvanlarda başlıca iki kategoriye ayrılmaktadır. Bunlardan birincisi, mantarların bizzat kendilerinin vücutta üreyerek infeksiyon (mikozes) oluşturmaları ve diğeri de, üzerinde üredikleri maddelerde (substratlarda) sentezledikleri toksinlerin (mikotoksinler) sindirim sisteminden alınması sonu gelişen mitotoksikozislerdir. Mikotik infeksiyonlar yerleştikleri yere göre 3 gruba ayrılırlar. Bunlarda, Kutan mikozesler, subkutan mikozesler ve sistemik mikozesler olarak adlandırılırlar. Kutan Mikozeslerin Epidemiyolojisi Kutan mikozeslere (Dormatomikozis, dermatofitozis) yol açan mantarlar 3 cins içinde bulunmaktadır. Bunlarda, 1) Trikofiton cinsi, 2) Mikrosporum cinsi ve 3) Epidermofiton cisimleridir. Bu mantar ve sporları deri, saç, tüy, kıl, deri ve tırnaklarda lokalize olurlar. Bir kısma mantar hastalıkları hayvandan hayvana ve insana veya insandan insana bulaşabilirler. Bu grup içindeki mantarlar, kutanöz bir yerleşim gösterdiğinden solunum sisteminden bulaşmazlar. Hastalığın oluşmasında çevreye ve konakçıya ait bazı predispoze edici faktörlerini de önemli rolleri bulunmaktadır. İnsan ve hayvanlarda dermatomikozeslere neden olan mantarlar (dermatofitler) origin ve ekolojilerine göre 3 grupta incelenmektedirler. 1- Geofilik Dermatofitler: Bazı dermatofitler, toprağa adapte olmuşlardır, burada yaşar, gelişir ve çoğalırlar. Bunlar, genellikle, saprofitik bir yaşantıya sahiptirler. Böyle mantarların rezervuarı topraktır. Çok nadiren, insan ve hayvanlardaki mantar lezyonlarından izole edilmişlerdir. Geofilik dermatofitler arasında, Trichophyton terrestre tam bir geofilik olmasına karşın, Keratinomyces ajelloi, Microsporum cookei, M. gypseum, M. nanum gibi bazı dermatofitler de insan veya hayvanlardan izole edilmişlerdir. Geofilik dermatofitlerin yaşam çemberi yandaki şekilde gösterilmektedir. 39 2- Zoofilik Dermatofitler : Bu gruba ait dermotofitler genellikle hayvanlarda hastalık oluşturur ve araşıra da insanlara bulaşabilirler. Böyle dermatofitler arasında, Microsporum canis, M. distortum,Trichcophyton gallinae, T. simii, M. erinacei, vs. vardır. Bazı zoofilik mantarların yaşam çemberleri aşağıda gösterilmiştir. M. canis ve T. verrucosum ’un yaşam çemberi yandaki şekilde gösterilmektedir. T. equinum ve T. gallinae’nin yandaki şekilde gösterilmektedir. yaşam çemberi 3- Antropofilik Dermatofitler : Bu tür dermatofitler genellikle insanlarda hastalık oluştururlar ve kaynakları da insanlardır. Ancak, ara sıra hayvanlarda da infeksiyonlar meydana getirebilirler. Antropofilik dermatofitler arasında T. audouinii, T. concentricum, T. ferrugineum, T. gourvilii, E. floccosum, T. megninii, T. rubrum, T. schoenleinii, T. tonsurans, T. violaceum, T. yaoundeibulunmaktadır. Antropofilik dermatofitlerin yandaki şekilde gösterilmektedir. yaşam çemberi Dermatofitler, insan veya hayvan vücutlarında bulundukları zaman (parazitlik dönem) artrospor oluşturmalarına karşın, saprofitik yaşantıda (toprakta, kültürlerde) ise artrospor, klamido spor, makrokonidia, mikrokonidia ve askopor meydana getirmektedirler. Parazitik 40 dönemde teşekkül eden artrosporlar bir konakçıdan diğerini ve bazen de toprağı kontamine edebilirler. Toprakta saprofitik perfekt ve/veya imperfekt döneme geçerler. Doğal koşullar dermatofitlerin dönemleri yandaki gösterilmektedir. altında yaşam şekilde Toprak, genellikle, birçok mantarın ve sporların bulunduğu yer rezervuar olması bakımından önemlidir. Bazı önemli dermatofitlerin ekolojilerine göre sıralanması aşağıda gösterilmiştir. I- Antropofilik Dermatofitler Epidermophyton Microsporum Microsporum Microsporum Trichophyton Trichophyton Trichophyton Trichophyton Trichophyton Trichophyton Trichophyton Trichophyton II- floccosum audouinii distortum ferrugineum concentricum gourvilli megninii mentagrophytes (Zooantropofilik) rubrum schoenleinii soudanese tonsurans Zoofilik dermatofitler Microsporum Microsporum Microsporum Microsporum Trichophyton ücanis nanum vanbreuseghemii simii equinum 41 Trichophyton Trichophyton gallinae mentagrophytes III- Zooantropofilik dermatofitler M. T. T. canis mentagrophytes verrucosum IV- Geofilik dermatofitler Keratinomyces Microsporum Microsporum Trichophyton ajelloi cookei gypseum terrestre Subkutan Mikozeslerin Epidemiyolojisi Subkutan infeksiyonlara yol açan Rhinosporidium seeberi 'in kültürü yapılamadığı için deneysel infeksiyonlar da oluşturulamadığından insan ve hayvanlara bulaşma tarzları tam açıklığa kavuşturulamamıştır. Ancak, lezyonların burunda yerleşmesi, infeksiyonun solunum yolu ile bulaşabileceği şüphesini uyandırmaktadır. Sporotrikozise neden olan Sporotrichum schenckii, doğada toprak, su, gübre, çürümüş bitkilerde, odunlarda sağlıklı ratların ağzında ve gastrointestinal sistemleri de bulunur. Vücuda derideki porantrelerden olmaktadır. Bir hayvandan diğerine bulaşmaz. Sistemik Mikozeslerin Epidemiyolojisi Bu mantarlarda da Toprak, çürümüş yapraklar, odunlar, gübreler, barınaklar, yarasa gübreleri, yiyecekler dane yemler, vs. esas rezervuarı oluşturur. Buralarda üreyen mantarların sporları soluk havanı ile kolayca ulaşabilir. Sistemik infeksiyonlar arasında, Aspergillozis, Blastomikozis, Histoplasmozis, Kandidiazis (moniliazis), Koksidioidomikozis, Kriptokokkozis, Nokardiozis bulunmaktadır. Bunlar içinde tehlikeli bulunmaktadır. olan infeksiyonlar (Koksidioidomikozis, kriptokokkozis, vs) 42 PATOJENİK MANTARLARIN İNCELENMESİ Mantar hastalıklarının (Mycoses) teşhisi, hastalık etkeninin patolojik materyallerde tespit edilmesi, kültürler yardımı ile üretilmesi, izolasyonu ve identifikasyonu, serolojik ve alerjik testlerle ile gerçekleştirilir. Buna, klinik semptomlar ve otopsi bulguları da (eğer çok nadiren ölüm olursa) büyük ölçüde yardımcı olur. Ancak, özellikle, laboratuvarlarda, buraya getirilen her türlü muayene materyallerini en iyi ve en uygun şekilde işleyecek ve değerlendirecek tecrübeli laboratuar elemanlarına gereksinim vardır. Patolojik materyallerden izolasyon şansının artırılmasında, hastalardan alınan materyallerin önemi çok fazla olmaktadır. Materyallerin seçimi, infeksiyonunun türü ve yerleştiği yere göre değişebilir. Sistemik infeksiyonlardan şüpheli olgularda laboratuar elemanlarının çok daha dikkatli bulunması gereklidir. Özellikle, H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis vb. bazı mantar hastalık etkenleri bulaşabilir ve sağaltımı çok zor infeksiyonlara yol açabilir. Bu mantarların sporlarının inhalasyonu ölümcül mikozeslere neden olabilir. Böyle durumlarda, laboratuvarlarda özel inokulasyon kabinetinin veya benzer kabinetin kullanılması şarttır. Bu infeksiyonlardan şüpheli olgulardan alınan marazi maddeler de, mutlaka, tüplere ekimleri yapılmalıdır ve ekim için petri kutusu sakıncalı olabilir. Tüplerde üremiş mantarlardan da, mümkün olduğu kadar, lâm kültürleri yapılmamalıdır. Bu tür mantarlarla çalışmalar veya laboratuarlarda izolasyonlar yapılacaksa, elemanların maske kullanması ve kültürlerin özel inokulasyon kabineti altında açılması ve sterilizasyon veya dezenfeksiyon kurallarına çok dikkat edilmesi gereklidir. Dermatofitlerden ileri gelen hastalıklarda da, bunların bazı türlerinin, zoofilik-antropofilik karakterde olmaları nedeniyle, yine dikkatli bulunmak şarttır. Böyle materyallerle (deri ve tırnak kazıntısı, tüy, kıl, yün, deri parçası, vs.) direkt temas bulaşma ile son bulabilir. Bu nedenle, mantar hastalıkları teşhis ve araştırma laboratuarlarında, aynen bakteriyoloji veya viroloji laboratuvarlarında olduğu gibi, bazı kurallara uyulması lazımdır ve herhangi bir önlem almada kusur yapılmamalıdır. 02. Materyallerin Toplanması Mantar hastalıklarının teşhisinde, muayene materyallerin alınması ve gönderilmesi en önemli ve dikkat edilmesi gereken noktalardan birini oluşturmaktadır. Patolojik maddeler, genellikle, herhangi bir sağaltım yapılmamış olanlardan ve yeteri miktarda alınır. Materyaller, ağzı vidalı kapalı şişelere veya petri kutularında toplanır. Alma işleminde kullanılan makas, pens, bistüri, küret, vb. malzeme ile şişe veya petri kutularının çok iyi sterilize edilmiş olmaları gereklidir. Nemli malzeme, saprofitik mantar sporlarının germinasyonunu kolaylaştırır. Alınan materyal en seri vasıta ile mikoloji laboratuarına gönderilir. Eğer, göndermede gecikme olacaksa, bu zaman materyal buzdolabında muhafaza edilebilir. Materyalle birlikte, gerekli bilgi içeren bir yazı da gönderilir. 43 Kutan Mikozesler Kutan (süperfisial) mikozeslere genellikle dermatofitler (Microsporum, Trichophyton ve Epidermophyton cinslerine ait türler) neden olurlar. Bu infeksiyonları teşhis için aşağıda bildirilen materyaller alınır : Deri kazıntısı : Derideki lezyonların yeri, büyüklüğü, şekli, yayılma durumu ve oluşturduğu bozukluğun derecesi, vb. önemli noktalar iyice incelendikten sonra, lezyonlarda bulunan yabancı maddeleri, kontaminant mantar sporlarını ve diğer ajanları gidermek için, lezyonlar, %70 alkole batırılmış pamukla iyice silinirler. Alkol kuruduktan sonra, steril makas, pens, küret, bistüri, vs., ile lezyonların kenarlarındaki aktif bölgelerden deri kazıntısı alınarak steril kuru petri kutularına veya şişelere, yeteri miktarda toplanır ve ağzı iyice kapatılır. Eğer lezyonlar birden fazla ise, her lezyon için ayrı örnek alınır ve hemen laboratuvara gönderilir. İnfiltrasyon olan bölgelerden veya ekzudatif karakterdeki lezyonlardan deri kazıntısı alırken kanatmamaya dikkat edilmelidir. Deri kazıntıları, genellikle, mantar izolasyonu için, kıllar kadar avantaja sahip değillerdir. Lezyonlar, herhangi bir kimyasal madde ile muamele edilmişse, bu taktirde, alkolle temizleme işlemini daha dikkatlice yapmalı ve alınan materyal steril su içinde 1-2 gün kadar bekletilmeli ve yıkanmalıdır. En iyisi, ilaç kullanmamış hastalardan veya lezyonlardan materyal alınmasının sağlanmasıdır. Kıllar: Lezyonlu bölgenin kenarlarındaki tüyler, kıllar steril pensle tutularak özellikle kıl kökleri kıl follikülleri ile birlikte çıkarılarak, yeterli miktarda alınır. Lezyonların ortasında, genellikle, az sayıda mantar elementi bulunur ve bu bölgenin rengi de çeşitli nedenlerle değişebilir (dejenerasyon, parçalanma, mikrobial kontaminasyon, vs.). Kıl folliküllerinde fazla mantar elementi toplandığından materyali buralardan almak, izolasyon şansını artırır. Eğer deride gözle iyice görülebilecek derecede lezyonlar yoksa veya latent infeksiyon varsa, böyle durumlarda steril diş veya saç fırçalarından yararlanılır. Deri bu malzeme ile bir petri kutusuna iyice kazınarak hem kıl hem deri kazıntısı örnekleri alınır. Ancak, materyalin büyük bir kısmı fırçanın tüyleri arasında kalacağından, kültür için, fırça olduğu gibi hafifçe besi yerine de daldırılır. Tırnaklar: Tırnakları iyice temizlendikten ve alkolle silindikten sonra veya küretle kazınarak veya makasla kesilerek yeterince materyal alınır. Bazı durumlarda, tırnağın derin kısımlarından da madde toplanmalıdır. Subkutan ve Sistemik Mikozesler Subkutan mikozeslerden Rhinosporidiosisde, burundan gelen akıntılar ve burunda meydana gelen polip benzeri oluşumlardan; Sporotrichosisde de deride teşekkül eden ülserlerden akan irinler, lenf yumrusu içeriği ve diğer lezyonlardan alınan patolojik materyaller gönderilir. Bu marazi maddeler, mümkün olduğu kadar aseptik koşullarda ve usulüne göre alınırlar. 44 Deride vesikül varsa, üzeri alkolle silindikten sonra, steril bir makasla üst kısımdan kesilerek açılır. İçindeki materyal kapiller veya normal bir pipetle çekilerek küçük bir tüpte toplanır. Materyalin çok az olduğu durumlarda, iki steril lâm arasına alınır ve bir kağıda sarılarak gönderilir. Mantarlardan ileri gelen sistemik mikozeslere çok az sayıda rastlanır. Bu hastalıklarda alınacak materyal, infeksiyonun türüne ve yerleştiği yere göre değişebilir. Aspergillosisde: Bu hastalık daha ziyade akciğerlerde lokalize olduğundan, bronşial sekretler ve biopsi materyalleri alınır. Blastomycosisde: Bu infeksiyonda lezyonlu deri, lenf yumrusu içeriği, lezyonlardan akan irinler, bronşial sekretler ve biopsi materyalleri, Candidiasisde: Lezyonlu doku ve organ parçaları, çeşitli patolojik sıvılar ve biopsi materyalleri, Coccidioidomycosisde : Lenf yumrusu içeriği, pleural ve peritoneal eksudatlar ve diğer biopsi materyalleri, Cryptococcosisde : Deri ve deri altında oluşan lezyonlu kısımlar, lenf yumrusu içeriği, idrar, spinal sıvı, kraşe, irin, vs. Histoplasmosisde: Periferik kan, periton sıvısı, lenf organlardan alınan biopsi materyallerin ve çeşitli eksudatlar. yumruları içeriği, lezyonlu Nocardiosisde: Lezyonlardan, lenf düğümü içeriklerinden, sekret ve ekskretlerden yeteri oranda materyal alınarak ve laboratuara gönderilir. Yukarıda bildirilen ve teşhis amacıyla gönderilen materyaller, tekniğe uyularak ve aseptik koşullar altında alınırlar. İdrar muayeneleri için, özellikle, kataterle alınanı muayenelerde ve ekimlerde kullanılmalıdır. İdrar, pleural ve peritoneal sıvılar laboratuarlarda kuvvetli santrifüje edildikten sonra, tortudan preparatlar ve ekimler uygulanır. Gerekli hallerde, kan, kemik iliği ve diğer lezyonlu doku veya organlardan da yararlanılır. Alınan materyallerin konulduğu kapların üzerine hastanın cinsiyeti, yaşı, hasta veya lezyonlu bölgenin adı, lezyonların karakteri, yerleri ve diğer önemli ve gerekli bilgiler yazılır ve böylece laboratuara gönderilir. 45 Materyallerin Muayenesi Laboratuvarlara gönderilen patolojik materyallerin, türüne ve infeksiyonunun karakterine göre gruplandırılarak özel muayeneye tabi tutulurlar. Kutan Mikozeslerde Dermatofitoseslerin teşhisi için laboratuara, genellikle kıl, deri kazıntısı saç ve tırnaktan alınmış materyaller gönderilir. Bunların muayenesinde aşağıdaki sıra izlenir : 1- Ultraviolet Işığında (Wood Işığı) Muayene: Bu muayene genellikle, infekte kılların saptanmasında yararlı olmaktadır. Bazı dermatofit mantarlarıyla infekte kıllar, ultraviolet ışığı altında sarı-yeşil veya yeşil-mavi bir parıltı gösterirler. Böyle kıllar pensle tutularak alınır, mikroskopik muayenesi ve ekimleri yapılır. Ancak, Wood ışığı altında fluoresensın görülmemesi, infeksiyonunun yokluğunu ifade etmez. Bu nedenle, kıllar, flüoresans versin veya vermesin, mikroskop altında muayene edilmeli ve ekimleri yapılmalıdır. Ultraviolet ışığı altında mantar türlerinin gösterebilecekleri flüoresans türü aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir. Ultraviolet ışığı altında görülen fluoresens, mantarların metabolizma artıklarından ileri gelmektedir. Ancak, kıl veya deri kazıntılarına yapışmış olan bazı organik veya inorganik maddelerin fluoresens vermesi, bu yöntemin spesifitesini azaltmaktadır. Ayrıca, tırnak, keratin, petrol, salisilikasit, porfrinler, vb. maddeler de fluoresan verilebilirler. Bu muayene karanlık bir yerde yapılır. Petri kutusunda bulunan örnekler bu ışığa tutularak fluoresens yönünden kontrol edilirler. Bu amaçla kullanılan wood ışığı için özel kutular yapılmıştır. 2- Direkt Mikroskopik Muayene : Laboratuvara götürülen materyalin cinsine göre, aşağıdaki tarzda özel muayeneler yapılır. Kıllar ve Tüyler : Temiz bir lam üzerine, Lakto fenol pamuk mavisi veya Amman kloral lakto fenol solüsyonundan bir damla konulduktan sonra, üzerine, wood ışığı altında seçilmiş veya seçilmemiş kıllardan bazıları (5-6 tane kadar) pensle tutularak bırakılır. Üzeri bir lamelle kapatıldıktan sonra, mikroskop altında (200 x) muayene edilirler. Bu muayenede, kılların etrafında ve özellikle, kıl folliküllerinde miseller ve mantar sporları aranır. Kılların muayenesinde, yukarıda bildirilen muayeneden başka % 10 - 20 KOH solüsyonu da çok kullanılır. Potasyum hidroksit, kıllar üzerinde bulunan bazı materyallerin erimesini sağladığından mantarları incelemek daha kolay olmaktadır. Ancak KOH uzun süre etkide bulunursa ve daha yüksek yoğunlukta kullanılırsa, dermatofit elementlerinin yumuşamasına ve dağılmasına neden olabilmektedir. Ayrıca, Candida türlerinin muayenesinde de, hücrelerde bozukluklar oluşturması nedeniyle, az kullanılmaktadır. KOH'ın etkilemesi için 3060 dakika beklemek gerekmektedir. Bu süre içinde preparat çok hafifçe ısıtılabilir veya etüv ısısın da bulundurulur. 46 Deri kazıntıları : Deri kazıntıları, lâm üzerinde bulunan bir-iki damla %10-20 KOH solusyonuna batırılır ve üzeri lâmelle kapatılır. Hidrolizasyonu hızlandırmak için, alttan çok hafifçe ısıtılır (50-60 °C'de). Aynı amaçla, %10-20 NaOH, dimethyl sulphoxyde (%10-40) veya her ikisinin karışımı, veya KOH ile Parker boyası karışımı veya ince deri kazıntıları için sadece Metilen mavisi solüsyonu kullanılabilir. Hidrolizasyon (dermis veya derinin diğer kısımlarında bulunan keratinöz karakterdeki materyalin erimesi suretiyle berraklaşması) için ayrılan 30-60 dakikalık süre tamamlandıktan sonra preparat mikroskop altında önce küçük büyütme (100x200x) ve sonra da büyük büyütme (450x - 500x) ile muayene edilir. Bu amaçla, kuru sistem objektif kullanılır ve iyi bir kontrast sağlanır. Potasyum hidroksit (%5), 15-20 saatte ve %20 yoğunluğu ise 30-60 dakikada hidrolizasyon sağlayabilmektedir. Çok sayıda preparatı muayene için %5 lik KOH solüsyonu kullanılır ve preparatlar 24 saat sonra (ertesi günü) muayene edilebilirler. Mikroskop altında dermatofit mantarlarının elementlerini (hifa ve sporlar) göstermede, %20 KOH ile %10 Parker boyası (Parker super chrom bleu-black Ink) karışımı, çok iyi sonuçlar vermektedir. Bu solüsyon bir ay kadar kullanılabilir. Büyük deri parçaları ve keratinöz kütleler, steril bir havan içinde ezilir ve sonra, aynı yukarıdaki gibi muayeneye tabi tutulurlar. Isıtmanın, her ne kadar hidrolizasyonu çabuklaştırması ve kısa bir süre içinde mikroskoba hazır etmesi gibi yararları yanı sıra, bazı araştırıcılar, kristal oluşumuna neden olması ve hücre elementlerini tahrip etmesi olasılığını ileri sürmektedirler. Direkt mikroskopik muayenelerde, genellikle, mantara ait hifa ve artrosporlar aranır. Hifalar daha ziyade, branşlı ve septumludurlar. Lezyonlarda veya kıllarda rastlanılan artrosporlar, hifaların fragmentasyonu sonu meydana geldiklerinden, genellikle tesbih gibi diziler halinde bulunurlar. Sporlar, yuvarlak, oval veya silindirik bir biçimde olup 2 - 10 mikrometre boyutlarındadırlar. Mikroskop altında mantarların kılları infekte ediş tarzına çok fazla dikkat edilir ve bu durum mantar türlerini teşhiste yardımcı olur. Bazı mantar türlerinde (M. canis, M. audouinii, M. distortum, M. ferrugineum) sporlar kılların dışında lokalize olmuştur (ektotriks - ectothrix). Bu sporların çapları küçük olabilir (2-3 mikrometre) ve bu nedenle de ancak yüksek büyütmelerle görülebilirler. Bunlar ultraviolet ışığı altında parlak fluoresens verebilir. Bazı mantarların sporları daha büyüktür (5-8 mikrometre) ve kılların dışında dağınık ve seyrek olarak bulunurlar. Bunlar genellikle, fluoresens vermezler. Bu tür sporlara, M. gypseum, M. fulvum, M. nanum, M. vanbreuseghemii, T. gallinae 'de rastlanabilir. Böyle sporlar küçük büyültmeli mikroskop altında kolayca görülebilirler. Düzgün diziler halinde bulunan büyük sporlara, T. verrucosum, T. mentagrophytes, T. rubrum, T. megninii 'de tesadüf edilebilir. Mantarlara ait sporlar eğer kılların içinde lokalize olmuşsa, bu duruma endotriks ( endothrix ) adı verilmektedir. Böyle, kıllarda kırılma ve bükülmelere fazlaca rastlanır. T. tonsurans, T. violaceum, T. soudanese, T. yaoundei,T. gourvilii mantarlarında bu tarzda kıl invazyonuna rastlanabilir. 47 Mantarlar tarafından kılların invazyon türleri yandaki şekilde gösterilmektedir. Bir kısım hifalarda kılların dip kısımlarında skutulum formasyonu görülür. Bazı hifaların içinde hava boşlukları olabilir(T. schoenleinii). T. concentricum ve M. persicolor da kıllarda hiç bir parazitizme rastlanmayabilir. Tırnaklar : Tırnaklar aynı deri kazıntıları gibi muamele ve muayeneye tabi tutulurlar. A) Ektotriks (ectothrix) Mantar sporlarının kıllarda parazitlik durumları yandaki şekilde gösterilmektedir. 1-Kılların dışında küçük artrosporlar (2-4 mikrometre) ve Wood ışığı altında parlak fluoresens verirler. M. canis M. distortum M. audouinii M. ferrugineum 2-Kılların etrafında az sayıda büyük artrosporlar (5-8 mikrometre) ve Wood ışığı altında fluoresens yok (39.2b). M. gypseum M. fulvum M. nanum M. vanbreuseghemii T. gallinae 3-Kılların etrafında çok sayıda büyük artrosporlar, genellikle tesbih gibi dizili, fluoresans yok. T. verrucosum T. mentagrophytes T. rubrum T. megninii 48 B) Endotriks (endothrix) Artrosporlar kılların içinde lokalize olmuştur ve kıllar kolayca kırılabilir hale gelmiştir. T. tonsurans T. violaceum T. soudanese T. yaoundei T. gourvilii T.schoenleinii C) Endo-ektotriks (endo-ectothrix ) Kılların hem içinde hem de dışında artrosporlara rastlanır. T. simii D) Kıllarda herhangi bir invazyon yok. T. concentricum E. floccosum T. persicolor E) Kıl içinde hifalar T. schoenleinii Subkutan ve Sistemik Mikozeslerde Teşhis için gönderilen patolojik materyalin türüne göre muayene yapılır. İrin, idrar ve eksudatlar : Aseptik koşullarda alınan bu materyaller %10-20 KOH ile muamele edildikten sonra mikroskop altında muayene edilirler. Preparatların bir kısmı da Gridley, PAS, Giemsa, Gram, ve Ziehl-Neelsen gibi boyama yöntemlerinin biri ile boyanarak incelenirler. Boyama yönteminin seçilmesi şüphelenilen infeksiyonun türüne ve laboratuar elemanlarının kendi tecrübesine göre değişebilir. B. dermatitidis, C. immitis, Aspergillosis türleri ve diğer mantarlar, boyanmadan yapılan preparatlarda (natif preparatlar) kolaylıkla görülebilirler. İdrar ve eksudatlar, durumlarına göre, hem santrifüje edilmeden ve hem de kuvvetli santrifüje edilerek tortudan preparatlar hazırlanır ve yukarıda bildirilen muayeneler aynen uygulanabilir. Spinal sıvı : Aseptik koşullarda alınan spinal sıvı kuvvetlice santrifüje edildikten sonra (4000 dev.\ dak., 15-20 dak.) dipteki tortudan temiz bir lâm üzerinde preparat hazırlanır, hem boyanmadan ve hem de çeşitli boyama yöntemlerinden biri ile boyanarak mikroskopta muayene edilir. C. neoformans için negatif boyama yöntemi uygulanabilir (Çin boyası ile). Kan ve kemik iliği : Bu dokulardan da hazırlanan preparatlar PAS, Gridley, Gomori, Giemsa, Gram, Ziehl-Neelsen (veya Kinyoun) vs. boyama yöntemlerinden biri ile boyanarak mikroskop altında incelenirler. Biopsi ve otopsi materyalleri : Alınan materyalin bir kısmı, %10 formalin (veya diğer fiksatiflerle) ile tespit edilerek histolojik muayeneler için kullanılır. Hazırlanan kesitler Gridley, Gomori, PAS, vs. boyama tekniklerinden biri ile boyanarak muayene edilirler. Materyalin 49 diğer kısmından alınanlardan formolsuz ise yukarıda bildiren yöntemlerden birine göre preparatlar hazırlanır ve aynı zamanda ekimler için kullanılır. Kraşe ve bronşial eksudat :Bu materyaller önce steril fizyolojik tuzlu su içinde 3-4 kez iyice yıkanarak oral flora ve yabancı materyallerin uzaklaştırılmasına çalışılır. Sonra yıkanmış materyallerden, çok temiz lâm üzerinde preparatlar hazırlanarak, hem boyanmadan ve hem de boyanarak mikroskop altında incelenirler. Pleura ve periton eksudatları : Bu materyaller de, duruma göre, santrifüje edilmeden ve edildikten sonra dipteki tortudan, yukarıda bildirilen yöntemlere göre muayene edilirler. Subkutan ve sistemik mikozeslerde direkt mikroskobik muayenelerde görülebilecek mantar elementleri, mantar türlerine göre değişiklikler gösterirler. Bunlar infeksiyonlara göre kısaca aşağıdaki gibidir. Rhinosporidiosisde : Mikroskop altında, R.seeberi 'ye ait sporangium (sferula) 300-400 m.m çapında ve sporlar (7-9 m m) görülür. Sporangiumlar kalın duvarlıdırlar. Sporotrichosisde : İnfekte materyallerde, S. schenckii 'ye ait uzunca oval, puro biçiminde, maya benzeri ve bazıları tomurcuklu hücrelere (2-3.6 m m) rastlanır. Aspergillosisde : Dokularda veya eksudatlarda, bu mantara ait branşlı miselyumlar, konidiofor ve sporlara rastlanabilir. Blastomycosisde : Mikroskop altında, büyük, yuvarlak veya oval, çift cidarlı ve bazıları tomurcuklu hücreler (8-20 mm çapında) görülebilir. Candidiasisde : Patolojik materyaller içinde oval veya yuvarlak, bazıları tomurcuklu hücreler (2-5 mm) ve septumlu miseller bulunur. Coccidioidomycosisde : Vücuttan elde edilen marazi maddeler içinde, oval veya yuvarlak (1590 mm çapında), çift cidarlı ve içleri granüllü hücreler (sferulalar) ve bunların bazılarından çıkmış endosporlar görülebilir. Cryptococcosisde : Dokulardan yapılan preparatlarda, kalın duvarlı ve kapsüllü, oval veya yuvarlak hücreler (5-20 mm) bulunur. Histoplasmosisde : Patolojik materyaller içinde, mikroskop altında, oval veya yuvarlak, küçük (2-4 m m) hücreler ve bunların etraflarında bir veya birden fazla tomurcuk gözlenebilir. Nocardiosisde : Lezyonlar, sekretler veya eksudatlar içinde branşlı ve asidorezistans küçük çomakçıklar tarzında N. asteroites 'e rastlanabilir. 50 Materyallerin Ekilmesi Laboratuvara gönderilen materyallerden, şüphelenilen infeksiyonun türüne göre uygun besi yerlerine ekimler yapılır. Eğer, marazi madde yeterli ise, bunları 4 gruba ayırmak iyi bir tedbir olur. Materyal, 1-Mikroskobik muayeneler için, 2-Ekimler için, 3-Histopatolojik yoklamalar için, 4-Muhtemelen, tekrar gerekli olabilecek muayeneler için olmak üzere gruplandırılır. Laboratuara gönderilen patolojik materyal, hemen ekilemeyecek veya muayene edilemeyecekse, bu takdirde buzdolabı ısısında muhafaza edilirler. Ancak, 0°C ile 4° C arası ısısı, bazı flamentöz mantarlar için uygun olmayabilirler. Mantar örnekleri rutubetli bir ortamda, veya rutubetli bir tüpte, petri kutusunda, şişede, vs. kaplar içinde bulundurulmamalı veya muhafaza edilmemelidir. Çünkü, bazı saprofitik mantarlara ait sporlar, rutubetli ortam içinde filizlenebilir ve bu durum, etkilen besi yerlerinin kısa bir süre içinde kontaminasyonlarına neden olabilir. Böylece patojenik mantarların üremesini ve izolasyonunu güçleştirir veya imkansız hale gelir. Kutan mikozes olgularından alınan materyallerin ekimlerinin bir kaç gün sonra yapılmasının bakteri kontaminasyonlarını azaltacağını bildiren araştırmacılar bulunmaktadır. Ancak, üretme ortamlarına antibiyotikler katıldığından, bakteri kontaminasyonlarının önemli bir engel oluşturamayacakları açıktır. Bu nedenle, laboratuvarlara materyaller ulaşır ulaşmaz ekilmeleri gereklidir. Muayene materyallerin ekimlerinde, aynen bakteriyoloji laboratuarlarında uygulanan steril çalışma kuralları, burada da, izlenir. Ekim malzemesi ve besi yerleri steril olmalıdırlar. Materyallerin laboratuvarlarda açılması ve ekimleri, mutlaka, özel kabinet (inokulasyon kabineti) içinde yapılmalıdır. Kutan Mikozesler Kutan mikozes olgularında, genellikle, kıl, tüy, deri ve tırnak kazıntıları gönderilir. Bu materyallerden petri kutusundaki besi yerlerinin 4-5 yerine, steril pensle ekimler yapılır. Kıl veya deri kazıntılarının, besi yerlerinin içine biraz batırılmasının, üreme şansını artırması bakımından önemi fazladır. Özellikle, kıl follikülleri pensle agarın içine biraz daldırılmalıdırlar. İzolasyonlar için, tüp veya şişeler yerine, daha geniş bir alan oluşturan, iyi bir mikroskobik görünüm sağlayan ve daha fazla ekimlerin yapılmasına olanak veren, petri kutularının kullanılması yerinde olur. Ayrıca, kontaminantları veya saprofitik olanları zamanında ve agarın yüzeyini kaplamadan görerek bunları uzaklaştırmak olanağını da sağlar. İlk izolasyonlarda, sıvı besi yerlerinden pek yararlanılamaz. 51 Subkutan ve Sistemik Mikozesler Bu infeksiyonlarda çeşitli patolojik materyallerden ekimler uygulanır. Vesikül sıvıları, irin ve bunun gibi materyaller, petri kutusundaki katı besi yerinin yüzeyine iyice yayılarak ekilirler. Serobrospinal sıvı, pleural ve peritoneal eksudatlar, hem sanrfüje edildikten sonra tortudan ve hem de sanrfüje edilmeden ekimleri yapılır. Doku parçaları iyice ezildikten veya çok küçük parçalara ayrıldıktan sonra ekilirler. Sistemik infeksiyon oluşturan mantarlardan, H. capsulatum, C. immitis, B. dermatitidis, vb., ekimler petri kutusu yerine tüpteki katı ortamlara yapılması daha uygun olur. İnokulasyonlar için kullanılacak besi yerleri, hastalık etkenini en iyi şekilde üretebilme yeteneğine sahip ve aynı zamanda selektif olmalıdırlar. Ayrıca, her türlü optimal koşullar sağlanmalıdır. Mantarlar genellikle aerobik bir karaktere sahiptirler. Kültürler, inkubasyonda 15-20 günden aşağı olmamak üzere tutulurlar. Ancak, bu süre mantarların türüne göre değişebilir. Bazı hallerde kültürün yüzeyi saprofitik mantarlarla kaplanabilir. Bu zaman, kısa bir süre içinde ve besi yerinin yüzeyini kaplamadan ya başka ortama ekim yapılmalı veya saprofitik mantar spor oluşturmadan, besi yerinden uzaklaştırılmalıdır. Mantar hastalıklarına neden olan etkenleri izole etmek için kullanılacak besi yerlerinin türü, şüphelenilen hastalığa göre değişebilir. Ancak, son yıllarda çeşitli ticari firmalar tarafından pratiğe sunulan, özel ve selektif izolasyon ve identifikasyon besi yerleri bulunmaktadır. Bunlardan da aynı tarzda yararlanılabilir. Dermatofitozeslere neden alan etkenlerin ilk izolasyonu için, direk marazi maddelerin muayene sonuçları ne olursa olsun, uygun besi yerlerine ekilmelidirler. Besi yerinin seçimi aranan etkene göre değişir. Her ne kadar besi yerlerine anti bakteriyel (kloramfenikol veya streptomisin + penisilin karışımı) ve antifungal (cyclohexamide =actidione) maddeler katılsa bile, hastalardan alınan örneklerde bakteriler ve özellikle saprofitik mantar kontaminasyonlarını önlemek önemli bir sorun olarak bulunmaktadır. En fazla kontaminant mantarlar Phycomyceteslere ait türler arasındadır. Bunlar üremelerinin başlangıcında, ayni dermatofitlere benzer koloni formu oluşturmakta ve bazen yanlış teşhise yol açmaktadırlar. Bu yönden dikkatli bulunmak gerekmektedir. Laboratuarlarda, dermatofit ve diğer patojenik mantarların ilk izolasyonu için, bileşiminde kloramfenikol ve siklohekzamid (cyclohexamide) bulunan, Sabouraud dekstroz agar (SDA ) kullanılır. Bu ortamın pH'sı düşük olduğundan ve içerdiği antibakteriyel ve antifungal substanslardan dolayı, birçok bakterilerin ve saprofitik mantarların üremesini inhibe eder. Ancak, bu maddelere rağmen özellikle, saprofit bazı mantar üremesine rastlanabilir. Ortama, aktidion (actidione, 0.5 g/ lt), kloramfenikol (0.05 g / litre) veya bunun yerine streptomisin 52 (40 mcg. / ml) ve penisilin (20 ui / ml.) karışımı konabilir. Bazı araştırıcılar, antifungal olarak, fungicidini önermektedirler (100 mcg. / litre). Bu madde, % 1 oranında dimethylformamide içinde eritildikten sonra kullanılır. Dermatomikozese neden olan etkenleri izolasyonda, bazı laboratuarlar, Sabouraud dekstroz agarın yanı sıra veya ayrı olarak Littman-Oxgall agarından da yararlanılmaktadır. Ancak, bu ortamda koloniler, birinci besi yeri kadar tipik bir görünüme sahip değildirler. Bu nedenle, özellikle, identifikasyon için SDA besi yeri yeğ tutulmaktadır. T. violaceum, T. verrucosum, T. concentricum, T. ferrugineum ve T. tonsurans gibi dermatofitleri üretmede besi yerine tiamin ( 0.05 g / litre ) katılması üreme şansını artırır. Ayrıca, T. equinum için nikotinik asit ve T. gallinae için histidin üretme faktörü olarak kullanılmalıdır. Subkutan ve sistemik mantar infeksiyonlarında da genellikle, Sabouraud dekstroz agar kullanılırsa da, bundan ayrı olarak, Beyin-kalp infusyon agarı veya aynı ortamın kanlı agarı, Sabhi agardan da büyük ölçüde yararlanılır. Bu ortamların bileşiminde, siklohekzamid (0.5 g. / litre) ve kloramfenikol (0.05 g. / litre) bulunabilir. Ancak, antifungal madde, Cryptococcus ve Candida türlerinin izolasyon ve identifikasyon besi yerlerinde bulunmamalıdır. Üremeyi inhibe edebilir. İnokule edilen besi yerleri, dermatofit izolasyonu için 25o - 26o C. aralarında inkubasyona konurlar. Ekimlerin çift olarak yapılması ve birinin 37oC tutulması gereklidir. Ancak, bu ısı (37oC) dermatofitlerin çoğunu inhibe eder. Sistemik infeksiyonlara neden olan mantarların izolasyonu için de çift ekimler yapılır ve biri 37oC. tutulur. Bu ısıda dermatofit mantarların parazitik formu (maya benzeri form) elde edilir. Kontamine olmuş kültürleri temizlemek için sulandırma (bir özeye 10-15 spor düşecek tarzda) yöntemi kullanılır. Bu miktar inokulum, 45oC'ye kadar ılıklaştırılmış agarla iyice karıştırıldıktan sonra petri kutusuna dökülür. Bir kaç gün sonra (veya koloniler görülmeye başladıktan sonra) seçilen koloni veya koloniler başka bir besi yerinin ortasına inokule edilir. Uygun bir süre inkubasyonda tutulduktan sonra (koloni iyice görüldükten sonra ) kenarlarından alınan inokulum taze bir ortama aktarılır. Bazı durumlarda, işlemi birkaç kez yinelemek gerekebilir. Primer kültürlerde, dermatofit mantarlar, genellikle, 4-15 gün içinde koloni oluştururlar. Kültürler 4 günden sonra her gün veya gün aşırı, sabah ve akşam, düzenli olarak kontrol edilir ve 3 hafta kadar inkubasyonda bırakılır. Bu arada patojenik mantarlar bakımından şüpheli görülen koloniler, zaman geçirmeden ve kontaminantların bulaşmasına meydan vermeden, başka ortama aktarılırlar. Üç hafta sonra, her hangi bir üreme görülmeyen besi yerleri negatif kabul edilirler. Ancak, marazi maddelere bir şans daha tanımak istenirse, bu sefer 15 - 20 gün sonra, tekrar ekilmelidirler. Bu zaman, iki ayrı izolasyon besi yeri kullanılmasının yararı bulunabilir. Kültürlerde kontaminasyonun varlığı anlaşılırsa, hemen subkültür yapılmalıdır. 53 Eğer birden fazla koloni varsa, bunlar ayrı ortamlara nakledilmelidirler. Kültürleri muayene ederken çok yavaş hareket etmeli ve petri kutuları, mümkünse, pek fazla kıpırdatılmamalıdır. Aksi hallerde saprofitik mantar (Aspergillus, Penicillium, Mucor, v.s.) sporları, patojenik mantar kolonilerini kontamine edebilirler. Besi yerlerini petri kutularında kullanmak, geniş bir yüzey sağlaması ve görmeyi kolaylaştırması bakımından çok faydalıdır. Ancak, insanlara bulaşan sistemik mikozeslerde ağzı kapaklı tüp kullanmak iyi bir tedbir olur. Çeşitli mantar hastalıklarında alınacak materyalin ve izolasyon için kullanılacak besi yerlerinin türü aşağıdaki çizelgede gösterilmiştir. Mantarların antifungal ve antibiyotikli ortamlarda izolasyonu sağlandıktan sonra, subkültürlerinin yapılması için ayrı besi yerleri kullanılmalıdır. Bu besi yerinde antifungal madde konmayabilir. Pasajlar aynı bakterilerde uygulanan yöntemlerle devam ettirilir. Eğer identifikasyon yapılacaksa, alınan inokulumlar, diğer besi yerinin tam ortasına ekilmelidirler. Üreme meydana geldikten sonra kültürler muayene edilir. İdentifikasyon için özel selektif besi yerlerinden yararlanılabilir. MANTAR KÜLTÜRLERİNİN MUAYANELERİ 01.Kutan Mikozesler 01.01. Koloni Makromorfolojisi 01.02. Koloni Mikromorfolojisi 02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler 02.01. Koloni Makromorfolojisi 02.02. Koloni Mikromorfolojisi 01. Kutan Mikozesler Uygun bir süre ve ısıda tutulan saf kültürlerin incelenmesinde, genellikle, aşağıdaki sıra izlenir: 01.01. Kolonilerin Makromorfolojisi Dermatofitlerin identifikasyonunda kolonilerin makromorfolojilerinin incelenmesi önemli yer tutar. Bu muayenede, üreyen saf mantar kolonileri, morfolojik olarak çeşitli yönlerden tetkike tabi tutulur. Bunlar da; 54 1- Üreme durumu: Kolonilerin gelişme durumu çaplarının ölçülmesi ile saptanır. Üreme durumu inkubasyon ısısı, süresi, besi yerinin bileşimi ve miktarı ile ilişkili olması yanı sıra, türlerinin kendine özgü bir gelişme kapasitesine de bağlıdır.Ayrıca, ilk izolasyonlarda yavaş bir üreme gösteren ve küçük koloni çapına sahip olan bazı mantarlar, pasajları yapıldıktan sonra daha çabuk üreme yeteneği kazanabilirler. Bazı mantarlar (M. canis, M. gypseum) genellikle çabuk ürer ve 10-13 gün içinde koloni çapı 3-4. cm. büyüklüğe ulaşır. Buna karşılık T. verrucosum ve T. violaceum daha yavaş ürer ve aynı süre içinde 1.0-1.5cm. kadar olur. T. schonleinii, T. soudanse, T. yaoundei, ilk pasajda bile çok yavaş ürer ve 20 gün sonra olgunlaşır. T. gallinae, E. floccosum, M. ferrugineum ise ancak, 15 günden sonra olgunlaşır. Bu olgunlaşma dönemi mantarların teşhisine yarayacak en iyi periyoddur. Bazı mantarlar da laboratuarlarda, devamlı pasajlar sonu, mutasyona (kromozomal değişmelere) uğrayarak koloni görünümünde bazı değişmeler meydana gelir. Böyle kolonileri teşhis etmek oldukça güçtür. T. audouinii ve T. megninii kültürleri, diğerlerine oranla daha sabit bir karaktere sahiptirler. 2- Koloni şekli: Dermatofit kolonilerinin şekli, genellikle, yuvarlak veya ovaldir. Bazılarının kenarları loblu, çentikli, asteroid, vs. olmasına karşın, bir kısmının da düzdür. Ancak, bu görünümler varyasyonlar sonucu değiştiğinden, türlere özgü bir sabit karakter göstermezler ve bu nedenle de kolonilerin identifikasyonunda, koloni şekli yanı sıra, diğer özelliklere daha fazla önem verilir. Aşağıdaki çizelgede, dermatofitlerin koloni morfolojileri gösterilmiştir. 3- Koloni topografisi: Dermatofit mantarlarının koloni topografisi çok değişiklik gösterir. Koloniler, genellikle, yassı ve hafifçe kabarık bazılarının ortası belirgin şekilde çıkıntılı, bazı dermatofitler de, merkezden yanlara doğru sathi veya derince çizgili, katlı, bazılarının üzeri düzensiz kıvrımlı ve kırışıktır. 55 4- Koloni yapısı: Dermatofitler başlıca, 4 koloni yapı karakteri gösterirler: a) Maya-benzeri yapı: Bu özellikteki koloni yapısına, Candida türlerinde ve dimorfik mantarların (Blastomyces, Coccidioidomyces, Histoplasma, vs.) 37 oC'de üreyen kolonilerinde rastlanır. Bu tarz koloniler kabarık, kenarları yuvarlak, oval veya düzensiz, mukoid karakterdedirler ve hifalara rastlanmaz. 56 b) Flamentöz yapı: Böyle koloniler, pamuk veya kadife gibi tüylü bir görünüme sahiptirler. Aerial hifalardan oluşan bu yapıda, sporulasyona veya konidioforlara fazlaca rastlanmaz. c) Granüler yapı: Aerial hifaların az bulunduğu veya görülmediği bu dönemde sporulasyona fazlaca rastlanır. Bu yapı özelliği koloniler olgunlaştıktan sonra meydana gelir. Kolonilerin üzeri ince granüler bir görünümdedir. Bazen aynı kolonilerin bir bölgesi (daha ziyade orta kısmı) granüler bir yapı gösterirken, kenarları flamentöz bir özelliğe sahip olabilmektedir. d) Tüysüz membranöz yapı: Bu koloni yapısında, tüysüz deri gibi bir görünüm vardır. Ancak, koloni kenarlarında hifalara rastlanabilir. 5- Koloni rengi (üstten) : Koloniler olgunlaştıktan sonra yüzeyde görülen renk bazen tek ve bazen de birçok renklerin kombinasyonu halinde bulunabilir. Bazı dermatofitler de, ortama yayılabilen pigmentler meydana getirebilirler. Mantarların renk oluşturması bir genetik karakter olmakla beraber, ortamın yapısı ve pH’sı ile de ilişkilidir. T. mentagrophytes, T. rubrum ve T. violaceum ’un pigmentleri antrakinon yapısındadır. Dermatofitler açıktan koyu renge kadar değişebilen kanarya sarısı, limon sarısı, portakal rengi, açık kırmızı, koyu kırmızı, kahverenginin çeşitli tonları, siyah, menekşe rengi, vs.), bir renk skalasına sahiptirler. Koloni rengi (alttan): Bazı dermatofitlerin (T. gallinae, T. megninii, vs) koloni arka yüzünün pigmentasyonu ile karakterize olmaktadırlar. Bazen de koloninin üstten görünümü ile alttan görünümü ayrı renk tonundadır (E. floccosum, T. violaceum, vs.). Dermatofitlerin arka yüzü görünümü de çok çeşitli renkler (sarı, oranj, kırmızı, kahverengi, yeşilimsi ve renklerin açık ve 57 koyu formları) gösterirler. Arka yüz rengi koloni identifikasyonunda daha fazla işe yaramaktadır. 6- Pleomorfizm: Granüler veya membranöz karakterdeki kolonilerin, genellikle, orta kısımlarında bazen de kenarlara yakın yerlerinde, beyaz pamuk veya tüy gibi oluşumlara rastlanır. Bunlar steril hifaların oluşturduğu topluluklardır (pleomorfizm veya pleomorfik dejenerasyon). Bazı hallerde, pleomorfizm, bütün koloniyi kaplayabilir. Böyle durumlarda, mantar, orijinal makro-ve mikrokoloni morfolojisini ve pigmentasyon yeteneğini kaybeder. Dejenerasyonun ilk başlangıçında makrokonidiumlar, sonra da mikrokonidiumlar ve bununla beraber diğer strüktürler gelişemezler veya oluşamazlar. Koloni sadece miselyum halinde kalır. Bu değişmelere, fizyolojik ve biyokimyasal varyasyonlar da katılır. Pleomorfik dermatofit şuşları, orijinallerinden daha fazla nitrojenli madde kullanırlar. Pleomorfizm, daha ziyade, kültürlerde spontan mutasyonlar sonucu meydana gelir ve pasajlar bu durumu kolaylaştırırlar. Bazı hallerde, lezyonlardan ilk izole edilen mantar kolonilerinde de pleomorfik dejenerasyonlar görülebilir. Böyle mantarları pasaj etmek ve identifikasyonunu sağlamak olanak dışıdır. Eğer koloni tam pleomorfik değilse, ancak, bir kaç pasajdan sonra sporulasyon görülebilir. Böyle durumlarda, özel sporulasyon ortamları (patates dekstroz agar, vs. gibi) kullanmak iyi bir tedbir olur. Tam pleomorfizm oluşmuşsa, bunu geriye, sporlu formuna döndürmek çok zordur veya imkansızdır. Pleormorfik dejenerasyon pasajlarla arttığından, bunu laboratuarlarda önlemek için, her 1015 gün içinde (veya mantarın olgunlaştığı dönemde) subkültür yapılır. Bu amaçla, inokulumlar, normal görülen koloni bölgelerinden seçilmelidir. Ayrıca pleomorfizme mani olmak için, mantarlar, -20oveya -60oC'de muhafaza edilebilirler. 7- Faviform dejenerasyon: Bazı mantarların orijinal tüylü veya kadife gibi olan kolonilerinin kenarları, tüysüz membranöz bir durum gösterir. Bu tarz değişikliğe ƒaviform dejenerasyon adı verilmektedir. T. rubrum kolonilerinde bazen, ve T. violaceum'da da, genellikle, kolonilerin ilk başlangıçında bu tarzda oluşumlarına rastlanabilir. 01.02. Kolonilerin Mikromorfolojisi Dermatofitlerin makromorfolojik karakterleri, kolonilerin birbirlerine bir çok yönden benzemeleri sonu, identifikasyonda önemli ip uçları verememektedir. Bu nedenle mikroskop altında muayene edilmeleri ve türlere ait bazı özelliklerin saptanması gereklidir. Kolonilerin mikromorfolojisi başlıca iki tarzda saptanabilir. 1- Tüm koloninin, stereoskopik mikroskop altında ve küçük büyütme ile muayene edilmesi, genellikle, mantarların identifikasyonuna pek yararlı bilgi vermemekle beraber, koloni hakkında kabaca bir fikir edinilmesi bakımından önem taşır. Bu muayenede, koloninin şekli, topografisi, yapısı ve dejenerasyonlarına ait bazı bilgiler elde edilebilir. 58 2- Üremiş kolonilerin çeşitli yerlerinden alınan materyallerden, tekniğine uyularak, boyalı veya boyasız preparatlar hazırlanarak 200 X veya 500 X büyütme ile (veya gerekiyorsa daha fazla büyüterek) mikroskop altında muayene edilir ve koloninin mikroskopik yapısı incelenir. Bu muayenede, hifalar, makrokonidium, mikrokonidium ve mikroskop altında görülebilen ve mantara ait diğer yapılar (klamidospor, artrospor, blastospor, v.s.) iyice incelenirler. a) Hifalar: Mantarların hifa durumuna ve yapısına bakarak teşhis konulamaz. Çünkü, bu oluşumlar çok değişkendir ve çok değişiklikler gösterirler. Dermatofitlerin hifaları septumlarla bölünmüş olup branşlıdırlar. Bazı mantarlardan (M. ferrugineum, T. tonsurans) hifaların yanlarından küçük veya kısa dallanmalar görülebilir (pektinate hifa). Favik şamdanı adı verilen hifa tarzına, M. distortum, M. ferrugineum,T. concentricum, T. schoenleinii, T. verrucosum ve T. violaceum kolonilerinde rastlanabilir. T. mentagrophytes’de, özellikle, spiral hifa oluşumuna tesadüf edilir. Bazı dermatofitlerde de noduler yapı bulunabilir. Bunların yanı sıra raket hifa, formlarına da bazı dermatofit mantarlarında rastlanabilir. Yandaki şekilde gösterilmektedir. hifa türleri b) Mikrokonidiumlar (microconidiae) : Dermatofitlerin önemli ve tek hücreden oluşan reprodüktif elementlerinden birisi de mikrokonidiumlarıdır (microaleuriospor). Bunlar, çok sayıda, az veya hiç bulunmayabilirler. E. floccosum, T. concentricum, M. ferrugineum ve T. schoenleinii, genellikle, mikrokonidium oluşturmazlar. Mikrokonidiumların hifa üzerinde veya serbest olarak, morfolojik yapılarının ve dizilişlerinin, mantarların identifikasyonunda rolleri pek azdır. Ancak, M. persicolor, T. mentagrophytes, T. tonsurans, T. rubrum, T. terrestre, T. georgiae, gibi dermatofitlerde, mikroaleuriosporların şeklinden yararlar sağlanabilir. Biçim bakımından, genellikle oval, yuvarlak ve armut görünümündedirler. Hifalardan tek tek çıktıkları gibi bazen toplu olarak da bulunabilirler. Uygun koşullar altında, mikrokonidiumlardan, bir veya birkaç tane jerm tüpü oluşur, bunlardan hifalar ve sonra da miselyumlar meydana gelir. c) Makrokonidiumlar (macroconidiae) : Dermatofitlerin mikroskopik morfolojilerinin incelenmesinde, üzerinde durulması ve iyice gözlenmesi gereken reprodüktif elementlerin 59 başında makrokanidiumlar (macroaleuriospor) gelmektedir. Bu oluşum, bazen çok fazla, bazen de az veya hiç bulunmayabilir. M. ferrugineum, T. concentricum, T. soudanese, T. ycoundei, genellikle, makrokonidium oluşturmazlar. Diğer dermatofitler de az veya çok sayıda (M. canis,M. cookei, M. gypseum, M. nanum v.s.) makrokonidium meydana getirirler. Bunların mikroskop altında, şekli, büyüklüğü, içindeki hücre sayısı, kenarlarının durumu ve diğer özellikleri çok iyi incelenmelidir. Şekilleri, daha ziyade, mekik, puro, kayık, lobut, yumurta görünümünde ve uçları sivri veya hafifçe yuvarlakçadır. Bazıları orta eksene göre bükülmüş (M. distortum) olmasına karşın diğer mantarların ki, genellikle, düzdür. Boyutları, mantar türlerine göre değişmek üzere, 6-20 x 30-150 mikrometre arasındadır. T. gallinae, M. persicolor, M. audouinii ve M. vanbreuseghemi 'nin makrokondium hücre duvarları ince olmasına karşın, M. canis ’in kalındır. Bazılarının kenarlarında da özel dikensi çıkıntılar bulunur. Makrokonidiumlar birden fazla hücreye sahiptirler. Hücreler, birer septumla birbirlerinden ayrılmışlardır. Bunların sayıları, M. nanum ve E. floccosum ’da genellikle 2-3 tane olmasına karşın, diğerlerinde 4-12 arasında değişebilir. Hücre sayıları türler için önemli bir ayırıcı karakter taşımazlar. Ancak, M. nanum’da oval veya yumurta biçiminde olan makrokonidiumlarda 2-3 taneden fazla hücre bulunmaz. E. floccosum ’da benzer yapı özelliği gösterir. Mikroskopik preparatlarda kullanılan solüsyonların, makrokonidiumların morfolojik karakteri üzerine etkisi vardır. Bu nedenle, bazı araştırıcılar fazla değişiklik yapmaması ve çabuk öldürmesi bakımından Lugol solusyonunu (veya iyot sol.) uygun bulmaktadırlar. Ancak, muayenelerin 10-30 dakika içinde bitirilmesi gereklidir. Bu süre, lugol solusyonunun etkilemesi için yeterli bulunmaktadır. Fizyolojik suyun kullanıldığı hallerde, makrokonidiumların yapısını iyice görmek olanaksızdır. Lugol solusyonu, sporun hücre duvarını, genellikle,10-15 dakika içinde kalınlaştırır. Bu kalınlaşma, standart ve her tarafta aynı olduğu için, herhangi bir sakınca yaratmaz. Aynı mantara ait aynı koloni içinde oluşan makrokonidiumlar morfolojik olarak bir örneklik göstermeyebilirler. Bu nedenle de sadece makrokonidiuma dayalı teşhis sakıncalıdır. Bu konuda M. cookei üzerinde yapılan araştırmalar, özetle, aşağıdaki gibidir. - Aynı koloninin çeşitli yerlerinden yapılan preparatlarda, birbirinden önemli derecede ayrı mikroskopik görünümde, makrokonidiumlara rastlanmaktadır. - Aynı koloninin ortasından aynı uzaklıktaki çeşitli yerlerden 12-41 gün sonra yapılan preparatlarda, makrokonidiumların uzunluk ve genişliği önemli derecede farklar göstermektedir. - Makrokonidiumların ortalama uzunluğu, 41 günlük kolonide, merkezden (koloninin ortasından) uzaklaştıkça azalmaktadır. 60 - Preparatta rastlanılan makrokonidium sayısı, koloninin yaşı, preparat için örneğin alındığı yer ve besi yerinin, makrokonidiumun genişliği ve hücre duvarı kalınlığı üzerine, diğer değişiklikler kadar, büyük oranda etkilememektedir. - Makrokonidiumlardaki hücre sayısı, koloni yaşlandıkça artmakta ve aynı zamanda, preparat yapmak için alınan örneğin yerine göre değişmektedir. Yukarıda bildirilen durumlar, makrokonidiumların morfolojileri, sayıları, kalınlığı ve içlerindeki hücre sayısını etkilediğinden, teşhiste çok dikkatli bulunmak gereklidir. Uygun koşullar altında, makrokonidiumlardan bir veya birden fazla jerm tüpü meydana gelebilir. Bu gelişerek hifayı oluşturur. Bazı dermatofitlerin makrokonidium sayısı, boyutları ve şekilleri bahsin sonunda çizelgelerde gösterilmiştir. d) Klamidosporlar (chlamydospor) : Bazı dermatofit mantarlarında, preparatlarda, klamidosporlara rastlamak mümkündür. Bu sporlar, hifalarda bulunan hücrelerin genişlemesi, büyümesi ve kenarlarının kalınlaşması sonu meydana gelirler. Hifaların ucunda (terminal) veya yanlarında (lateral) bulunurlar. Bazen, hifada bulunan hücrelerin arka arkaya klamidospor haline dönüşmesi, tesbih gibi bir görünüm meydana getirir. Bu tarz oluşuma, T. verrucosum’da tür özelliği olarak rastlanır ve identifikasyonda çok yararlı olur. e) Artrosporlar (arthrospor) : Bu tür sporlara in vitro pek rastlanamaz. Bu sporları daha ziyade lezyonlardan yapılan preparatlarda görmek mümkündür. f) Blastosporlar: Bazı mantar hifalarında çeşitli yerlerde gruplar halinde yuvarlak veya oval şekilde blastosporlara rastlanabilir. 02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler Subkutan ve sistemik infeksiyonlara neden olan mantar kolonilerinin makroskopik ve mikroskopik muayenelerinde de, aynen kutan infeksiyonlarda bildirildiği gibi, hareket edilir. 02.01. Koloni Makromorfolojisi Hastalık olgularından izole edilen ve saf olarak üretilen mantar kolonilerinin makroskopik olarak muayeneleri, infeksiyon etkenlerine göre az-çok değişmek üzere, genellikle, aşağıdaki tarzda yapılır: 1- Üreme durumu: Kolonilerin uygun ortamlarda gelişme, olgunlaşma durumu ve süresi saptanır ve koloninin çapı ölçülmek suretiyle üreme durumu tespit edilir. Kolonilerin üreme durumu, besi yerinin bileşimi, miktarı, inkubasyon ısısı ve süresi ile mantar türlerine göre önemli değişiklik gösterir. Ancak, dimorfik mantarların (S. schenckii, B. dermatitidis, C. immitis, H. capsulatum) 37°C'deki kolonilerinin üreme durumu ile aynı mantarların oda 61 ısısında (25°C.) elde edilen kolonilerinin, yapı bakımından aralarında önemli farklar gösterdiğinden, üreme durumları da çok değişik olmaktadır. 2- Koloni şekli: Subkutan ve sistemik mantarların oluşturdukları koloniler genellikle oval veya yuvarlak bir görünüme sahiptirler. Kenarları, düz, çentikli, loblu, rizoid, vs. ve üzerleri de kabarık, buruşuk, ortadan kenarlara doğru kırışık veya katlı olabilmektedir. 3- Koloni topografisi :Koloniler bazı türlerde yassı veya kabarık, bir kısmında buruşuk, katlı, çizgili, vs. görünümlere sahiptirler. 4- Koloni yapısı: Subkutan ve sistemik mikozeslere neden olan mantarlardan difazik olanların (S. schenckii, B. dermatitidis, C. immitis, H. capsulatum) 37 oC'de üremiş kolonileri mayabenzeri forma sahiptirler. Bu parazitik faza ait koloniler, mukoid, nemli, yapışkan ve kabarıktırlar. Bunlarda miselyal görünüme rastlanmaz. Buna karşın, oda ısısında (20oC'de) üremiş kolonilerinde ise flamentöz yapıya tesadüf edilir ve miselyum bulunur. Bazı kolonilerde de granüler yapı formuna rastlanabilir. 5- Koloni rengi: Bu mantarlara ait kolonilerde, krema renginden siyah renge kadar değişen renk farkları görülebilir. 02.02. Koloni Mikromorfolojisi İzole edilmiş ve uygun bir ısı ve süre ile saf olarak üretilmiş kolonilerin belli yerlerinden ve çok dikkatli bulunmak ve özel kabinet (veya inokulasyon kabineti) içinde olmak kaydı ile preparatlar hazırlanır. Bunlardan, bir kısmı, doğrudan doğruya, boyanmadan (natif muayene) ve diğer kısmı da uygun boya yöntemlerinden biri ile (Gram, Giemsa, PAS, Ziehl Neelsen, Griedley, v s.) boyandıktan sonra mikroskop altında 500 x ile ve gerektiğinde immersiyonla (1000 x) muayene edilerek, kolonilerin ince yapıları ve mantar elementleri tetkik edilir. Bu muayenede, dimorfik mantarlarda, hem parazitik forma (maya-benzeri form) ve hem de miselyal formdaki kolonilere ait mantar elementleri ve monomorfik (monofazik) mantarlara ait mantarı oluşturan yapılar incelenir. Mantar türlerine ve inkubasyon süresine göre kolonilerin mikromorfolojileri aşağıdaki gibidir: Rhinosporidiosisde: Bu hastalığın etkeni olan, R. seeberi ’in kültürü yapılamamıştır. Sporotrichiosisde: Oda ısısında (25°C'de) üreyen miselyal formdan yapılan preparatlarda septumlu hifalar ve bunların yanlarından çıkan tek tek veya çiçek yaprağı gibi dizilmiş konidiumlara rastlanır. Maya benzeri kolonilerden (37°C’de üretilmiş) mikroskop altında oval veya yuvarlak, puro veya maya benzeri tomurcuklu veya tomurcuksuz hücreler görülebilir. Aspergillosisde: Oda ısısında veya 37°C’de üremiş kolonilerde septumlu miselyum, konidiofor ve çok sayıda oval veya yuvarlak konidiumlar gözlenebilir. 62 Blastomycosisde: Oda ısısında üreyen kolonilerin mikromorfolojilerinde septumlu hifa, klamidospor ve hifalara kısa sapla bağlı konidiumlara rastlanır. B. dermatitidis ’in 37oC’de ki maya benzeri kolonilerinde oval veya yuvarlak, çift cidarlı ve bazıları tomurcuklu hücrelere tesadüf edilir. Candidiasisde: Oda ısısında ve 37°C'de üreyen maya benzeri kolonilerden yapılan preparatlarda pseudomiseller, oval veya yuvarlak blastosporlar, kalın duvarlı ve iri klamidosporlar görülebilir. Coccidioidomycosisde: Oda ısısında üreyen miselyal formdaki kolonilerde septumlu ve branşlı miselyumlar ve varil biçiminde artrosporlar bulunur. Mantarın (C. immitis) 37oC'de üremiş maya benzeri kolonilerinde ise, oval veya yuvarlak, çift cidarlı sporangium (sferula) ve endosporlara rastlanabilir. Cryptococcosisde: C. neoformans oda ısısında ve 37°C'de maya benzeri koloniler oluşturur. Yapılan preparatlarda, oval veya yuvarlak, çift cidarlı ve etrafı kapsüllü, bazıları tomurcuklu hücreler görülür. Histoplasmosisde: H. capsulatum oda ısısında üreyen kolonilerde septumlu hifalar, hifalardan lateral çıkan ve üzeri dikensi büyük klamidosporlar görülür. Maya fazından yapılan preparatlarda ise küçük oval veya yuvarlak hücrelere rastlanır. Nocardiosisde: N. asteroites ’in 37°C'de üremiş kültürlerinde branşlı flamentler ve difteroid formda mikroorganizmalar görülür. 63 64 PATOJENİK MANTARLARIN IMMUNOLOJİSİ 01. Giriş 02. Serolojik ve Alerjik Testler 02.01. Kutan Mikozesler 02.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler 03. Kültürlerin Muhafazası 04. Mikofajik Böceklerin Kontrolü 01. Giriş Mantarlardan ileri gelen infeksiyonlarda vücut, mantar elementlerine karşı immunolojik bir yanıt verir. Bu cevap, bakteriyel antijenlere oranla zayıf olmakla beraber, kendini humoral ve sellüler tarzda belli eder. Mantar elementlerinin vücuda girmesi ile lenfoid sisteme ait retikuloendotelyal sistem (RES) aktivite kazanır veya uyarılır. Hücresel veya sıvısal yanıtın derecesi ve bunlardan birine ait öncelik sırası, infeksiyonun türüne göre değişir. Bazı hastalıklarda ilk önce deri duyarlılığı oluşur ve bunu deri testleri ile ortaya koymak mümkün olabilir. Diğer bazı hastalıklarda da humoral yanıt önce belirir. Mantar hastalıklarında oluşan antikorları saptamak için,mikrobiyolojide kullanılan yöntemler, aynen burada da uygulanır. Bu reaksiyonlar, genellikle, sistemik mantar infeksiyonlarında daha fazla kullanma alanına sahiptir. Aglütinasyon reaksiyonu mantar infeksiyonlarında çok 65 az kullanılır. Komplement fikzasyon testi ise, yararlanılan ve güvenilen bir serolojik yöntemdir. Bu reaksiyondan, özellikle, sistemik infeksiyonların teşhisinde faydalanılır. Komplementi fikze eden antikorlar presipitinlerden sonra ortaya çıkarlar ve IgG karakterinde olup kanda uzun süre kalabilirler. İnfeksiyonun şiddeti artıkça, bu teste ait titre de yüksek bir düzeye ulaşır ve hastalık süresince teşhise yardımcı olur. Titrenin yüksek olması prognozun iyi olmadığına bir kanıt sayılabilir (Örn. İnsanlarda, Coccidioidomycosisde). Presipitasyon reaksiyonu, bu yöntem genellikle, IgM karakterinde olan antikorları (presipitinleri) saptamada işe yarar. Bir çok mantar hastalıklarında, presipitinler erken oluşurlar ve 3 hafta kadar yüksek titrede kalırlar. İmmunfluoresans testi, özellikle, H. capsulatum, Candida türleri, C. neoformans, S. schenckii, B. dermatitidis gibi sistemik infeksiyonlara neden olan mantarların saptanmasında kullanılan önemli ve yararlı bir yöntemdir. İmmundiffusyon tekniği de mantarlar arasındaki ortak antijenik komponentlerin saptanmasında kullanılmaktadır. Ancak, bu durum testin spesifitesini azaltıcı role sahiptir. C. neoformans ve B. dermatitidis 'e ait komponentler genellikle zayıf olduğundan, vücuttaki immunojenik uyarımı da düşük olmakta ve oluşan antikorları saptamada güçlükler çekilmektedir. Ayrıca, teşhisin çok önemli olduğu infeksiyonun başlangıcını tespit etmekte, oluşan antikorların yetersizliği nedeniyle, olanaksızdır. Bakteriyel ve viral infeksiyonların teşhisinde çok kullanılan ELİSA mantar hastalıklarının tanımında çok sınırlı kullanılmaktadır. Mantarlardan etkin bir antijen hazırlamak ve bunları standardize etmek de oldukça zordur. Özellikle, patojenik dimorfik mantarların, vücuttaki parazitik formları ile in vitro formları arasında oldukça farklı morfolojik ve antijenik ayrılıklar vardır. H. capsulatum 'un h-antijeni, aktif infeksiyon hallerinde antikor oluşturmasına karşın, m-antijeni ise daha ziyade latent infeksiyonlarda antikor meydana getirmektedir. Diğer bir antijenik faktör olan, c-antijeni ise spesifik olmayan bir karakter gösterir ve bir çok mantarlarda da ortaktır. Bu mantara ait olan diğer antijenik komponentler de n.y ve x olarak identifiye edilmiştir. Histoplasma üzerinde yapılan antijenik analiz çalışmalarında 7 antijenik fraksiyonun da, özellikle, h- ve mantijenlerinde toplandığı ortaya konulmuştur. Son yıllarda, Cryptococcosisli hastaların kanında ve serebrospinal sıvılarında antikor aramaktan ziyade, bu mantara ait antijenlerin varlığını ortaya konan yöntemlerin geliştirilmesi üzerinde durulmaktadır. H. capsulatum ve C. immitis' den ileri gelen infeksiyonlarda dokularda bulunan mantar elementlerinin antijenik komponentleri özellikle, mantar hücre duvarlarında lokalize olmuşlardır. Bileşiminde lipid, polisakkarid, protein ve kitin gibi substanslar vardır. Blastomycosis olgularında presipitasyonla saptanan antikorlar ancak %50 oranında aktif infeksiyonu gösterdiği bildirilmektedir. Coccidioidomycosisde komplement fikzasyonla veya immundiffusyonla ortaya konan antikorlar ise, infeksiyonun şiddetini ifade eder. Yaygın infeksiyon olgularında kanda yüksek titrede antikor bulunmasına karşın, tek veya ekstrapulmoner lezyon olguların antikor titresi daha düşüktür. Candida türlerinde immunelektroforez yöntemi ile 5 antijenik grup ayrılmış olup, bunların esasını protein ve polisakkaridler oluşturmaktadır. S. schenckii’nin tüm hücresi kullanılarak 66 hazırlanan antijenle yapılan aglütinasyon ve komplement fikzasyon yöntemleri, sonuçları bakımından birbirlerine paralellik gösterdiği açıklanmıştır. Mucor, Aspergillus ve Nocardia türleri vücutta çok az bir immunolojik uyarım meydana getirirler. Dermatofitlerin indirekt teşhislerinde de serolojik yöntemler, genellikle, sınırlı kalmaktadırlar. Çünkü, bu mantarlara ait elementlerin vücuttaki humoral yanıtları, aynı antijenik komponentlerin, sellüler reaksiyonlarından daha az olmaktadır. Mantar hastalıklarında hücresel bağışıklık (sellüler immunite) teşhis de büyük kolaylıklar sağlar. Bu türlü yanıtta, T-hücreleri önemli görev yaparlar. T-lenfositlerinin başlıca 5 görevi bulunmaktadır :1-Geciken türde kutan aşırı duyarlılık (tüberkülin, histoplasmin, coccidiodin, vs.), 2-Patojenik mantarlara (ve viruslara) karşı savunma, 3-Allograft reddi ve bununla ilişkili reaksiyonlar, 4-Tümörlerin kontrol altına alınmaları ve 5- Hücresel savunmada etkin role sahiptirler (lenfokin sentezi). T-hücreleri tarafından meydana getirilen substanslara, mediatör veya lenfokin adı verilmektedir. Eğer, T-hücrelerinin fonksiyonlarına mani olunursa mantar infeksiyonları, özellikle, Candidiasis, Aspergillosis, Cryptcoccosis, Phycomycosis, olguları fazlaca görülmektedir. Dermatomycosis ve sistemik infeksiyonlarda, hastaların derisinde duyarlılık meydana gelir. Bu durum deri testi ile ortaya konabilmektedir. Bu amaçla, mantarlardan hazırlanan çeşitli allergenler veya antijenler (trichofitin, coccidiodin, blastomycin, histoplasmin, sporothricin, oidiomycin, vs) kullanılmaktadır. Bazı mantar infeksiyonlarında deri testlerinde kros reaksiyonlara rastlanmaktadır. Ayrıca, bazılarında da (özellikle bazı dermatofitlerde, E. floccosum, M. audouinii, T. schoenleinii, T. rubrum vs. gibi) sensitizan karakter, daha zayıf olmaktadır. Deri testini yapabilmek için, mantarlardan özel yöntemlerle hazırlanan, saflaştırılan ve standardize edilmiş allergenler, deri içine 0.1 ml. miktarında şırınga edilir. Pozitif reaksiyonlar da şırınga yerinde 1 cm. çapına kadar değişebilen büyüklükte ve halka biçiminde kızarıklık meydana gelir. Reaksiyon bazen çok çabuk (bir kaç dakika içinde) bazen de geç 24-48 saat içinde (nadiren bir haftaya kadar) oluşur. İnsanlarda klinik olarak bir infeksiyonun saptanamadığı olgularda, deri testleri pozitif çıkabilmektedirler. Bu durum, vücudun, daha önceden mantarla temasa geldiğini ve deride duyarlılığın kaldığını göstermektedir. Mantar infeksiyonlarından bağışıklıkla korunmada bazı aşılar hazırlanmış ve denenmiştir. Ancak aşıları hazırlama tekniklerinin farklılığı yanı sıra bunların standardize edilmeleri de önemli güçlükler yaratmaktadır. Aşılar genellikle, öldürülmüş (60 oC. de 2 saat tutularak) misellerin fizyolojik su içinde ezilmesi ile hazırlanan ve homojenize edilen süspansiyonlarıdır. Maya benzeri koloni oluşturan mantarlardan veya dimorfik mantarların maya benzeri kolonilerinden de aşılar hazırlanır ve kullanılabilir. Bu aşıların sterilite kontrolleri yapıldıktan sonra, içine konservatif olarak %0.5 fenol,%0.3 trikresol veya mertiolet 1/10.000 oranında katılır. Ancak, şimdiye dek, infeksiyondan koruyabilecek bir aşı geliştirilememiş veya pratiğe konamamıştır. 67 02. Serolojik ve Alerjik Testler Mantar hastalıklarının teşhisinde serolojik testler, bakteriyel ve viral infeksiyonlardaki kullanma alanı kadar pek yaygın olmayıp çok sınırlıdır. Hatta çoğu zaman kullanılmamaktadır. 02.01. Kutan Mikozesler Dermatofitlerin teşhisinde, serolojik (aglütinasyon, komplement fikzasyon, presipitasyon, ve diğerleri) ve alerjik testler genellikle kullanılmaktadır. Dermatofitler zayıf immunojenik veya immunostimulan etkiye sahiptirler. Ancak, alerjik özelliği olduklarından deri testlerinde yararlar sağlamaktadırlar. 02.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler Rhinosporidiosis : İnsan ve hayvanlardaki Rhinosporidiosis infeksiyonlarında serolojik ve alerjik testlerden yararlanılamamaktadır. Sporotrichosis: Laboratuar hayvanlarında yapılan deneysel infeksiyonlarda çok zayıf bir antikor düzeyine rastlanır. Bu antikorlar, komplement fikzasyon, aglütinasyon ve presipitasyon teknikleriyle ortaya konabilmektedir. Evcil hayvanlardaki doğal infeksiyonlardaki antikor durumu hakkında yeterli bilgiler yoktur. Presipitasyon testinin, bu infeksiyonda daha duyarlı olduğu bildirilmiştir. Ancak, diğer bazı mantarlarda kros reaksiyon vermesi testin duyarlılığını azaltır. İnsanlarda doğal infeksiyonlarda, yukarıda anılan antikorlar oluşur. Ancak, deride lokalize olan olgularda bu antikorlar diagnostik düzeyin altındadır veya hiç meydana gelmezler. Serolojik testler içinde fluoresens antikor, latex aglütinasyon ve agar-jel diffusyon tekniklerinden yararlanılmaktadır. S. schenckii’nin maya formundan ısıtılarak elde edilen deri testi antijeni (sporotricin) insanlarda teşhis için kullanılmaktadır. Aspergillosis: Bu infeksiyonun teşhisinde immunodiffusyon ve komplement fikzasyon testleri uygulanabilir. Blastomycosis: İnsanlarda serolojik testler, Histoplasmosis ve Coccidioidomycosis de olduğu kadar pek güvenilir değildir. Komplement fikzasyon testi infeksiyonun başlangıcında negatif olmasına karşın zamanla titre yükselmesi ile test de pozitif çalışır. İyileşme olduktan sonra antikorlar kaybolur. Yüksek komplement fikzasyon titresi ve negatif deri testi prognozun iyi olmadığını gösterir. Immunodifusyon testi çok duyarlıdır. Bu test, Histoplasmosis ile de kros reaksiyon verir. Kültür filtratlarından elde edilen allergen (Blastomycin) insanlarda deri testinde kullanılır. 68 Köpeklerde, Blastomycosis infeksiyonlarında, komplement fikzasyon testinden yararlanılmaktadır. Ancak, test çok spesifik olmasına karşın, bu testle pozitif reaksiyon veren serumlar Histoplasmosis ve Coccidioidomycosis ile de daha düşük titrede olsa bile, kros reaksiyon vermektedirler. Diğer serolojik testler (aglütinasyon, presipitasyon, agar gel diffusyon, vs.) daha az kullanılır. B. dermatitidis ’in sentetik ortamlarda üretilmesi sonu elde edilen filtrat (Blastomycin) deri testi için kullanılır. Bu allergen, Histoplasmin ve Coccidiodin kadar spesifik değildir. Candidiasis: Bu hastalıkta, insanlarda, immunodifusyon, aglütinasyon, latex aglütinasyon, fluoresens antikor ve presipitasyon testleri ile etkenden elde edilen allergen (Oidiomycin) deri testlerinde kullanılabilir. Latex aglütinasyon testi, Cryptococcosis ve Tuberculosisli hasta serumlarıyla kros reaksiyon verebilir. Coccidioidomycosis: İnsanlarda Coccidioidomycosisin teşhisinde, komplement fikzasyon, latex aglütinasyon ve presipitasyon testlerinden yararlanıldığı gibi deri testinde de coccidiodin de kullanılabilir. Cryptococcosis : İnsanlarda infeksiyonun teşhisinde, daha ziyade indirekt fluoresens antikor yöntemi ve daha az olarak komplement fikzasyon ve aglütinasyon tekniği kullanılır. Ayrıca, deri testi için, Coccidioidinden yararlar sağlanabilir. Ancak bu son test, Histoplasmosis ve Blastomycosisli hastalarda da pozitif çalışır. Histoplasmosis : Komplement fikzasyon reaksiyonu antijeni (maya ve miselyal form dan hazırlanan) ve latex aglütinasyon testi, insanlarda Histoplasmosis de kullanılabilir. Nocardiosis : İnsanlarda da, serolojik testlerden ziyade, mikroorganizmadan elde edilen allergen (Nocardin) deri testlerinde yararlanılmaktadır. 03. Kültürlerin Muhafazası Kültürlerin muhafazası, mantarların makro-ve mikro morfolojik özelliklerinin korunmasında büyük yararlar sağlar. Bunun için başlıca yöntemler kısaca şöyledir: 1- Kültürlerin oda ısısında muhafazası: Bu yöntem zaman alıcı ve biraz da masraflı olmaktadır. Kültürlerin 2-3 ayda bir pasajı yapılarak devam ettirilir. Subkültürler tüplerde yapılır ve pasaj için, koloninin tipik yerlerinden seçilir. Ancak, uzun süre subkültürler pleomorfizme neden olabilir. Tüplerin ağzı parafin ile kapatılarak kurumaları önlenir. İyi bir üreme elde edildikten sonra, tüpler bir kutu veya tel sepete konarak oda ısısında ve belli özel yerlerde muhafaza edilirler. Bazı araştırıcılar, besi yerinin her pasajda değişimini uygun görmekte ve örneğin, önce A ortamı kullanılmışsa sonra B vasatı, sonra tekrar A besi yeri ve B ortamı kullanmanın mantarları daha iyi durumda tuttuğunu bildirmektedirler. 69 2- Soğukta muhafaza: Üremiş kültürler 5-10° C. arasındaki özel yerlerde muhafaza edilebilirler. Bu ısıda kuruma azdır ve kültürlerin 3-4 ay aralıkla pasajı yapılabilir. Dermatofitler bu ısıya uzun süre dayanmasına karşın bazı türler (E. flocosum, M. aoudouinii, T. schoenlenii, T. violaceum) için uygun olmayabilir. 3- Dondurarak muhafaza: Dondurma, dermatofitlerin en iyi muhafaza yöntemidir. Tüplerde üretilen 10-14 günlük kültürler üzerine yağsız süt veya % 5-7 DMSO katarak -20°C. veya daha düşük ısıda muhafaza edilirler. 4- Suda muhafaza: İçinde 5-10 ml. steril fizyolojik su veya distile su bulunan tüplere kültür parçası (sporlu) konarak ağzı pamuk veya mantarla kapatılarak oda ısısında veya buzdolabında muhafaza edilebilir. Pasajlar yapılmadan önce, canlılık kontrolleri yapılır ve canlı olanlar subkültür için kullanılır. Bu yöntemin pleomorfizmi önlediği bildirilmektedir. 5- Kültürlerin mineral yağ tabakası altında muhafazası: Tüplerde üremiş kültürlerin üzerine, kaplayacak derecede, sterilize edilmiş (otoklavda 120oC'de 45 dakika) mineral yağ ilave edilir. Böyle hazırlanan kültürler oda ısısında bir kaç yıl saklanabilirler. Bazen yağ tabakası altında üremeye de rastlanabilir. Sıvı parafin de bu amaç için kullanılabilir. 6- Liyofilizasyon: Bu yöntem de çok fazla kullanılmaktadır. Bu amaçla yağsız sütten (%10) yararlanılır. İçinde mantar üremiş tüplere 5 ml. miktarında konarak, steril bir öze ile mantar süt içinde süspansiyon yapılır. Bu süspansiyondan ampullere 1 veya 2 ml. kadar taksim edilir. Ampuller hemen -25°C' deki alkol içine daldırılarak dondurulurlar. Sonra, hemen, vakumla havaları alınır ve liyofilize edilir. Ampullerin iyi kapatılıp kapatılmadığı veya içinde hava olup olmadığı özel aletle kontrol edilir. Her türden 9-10 ampul hazırlanır. Liyofilizasyonun sonunda bir tanesi açılarak kontrol edilir. Kontrolde üreme varsa, diğerleri oda ısısında muhafaza edilebilirler. 7- Steril toprakta muhafaza: İçinde steril toprak bulunan tüp veya şişelere mantar süspansiyonları katılarak buz dolabında muhafaza edilebilirler. Bu teknik yaygın kullanılmamaktadır. 8- Sıvı nitrojende muhafaza: Gliserin (%10) için de suspansiyonları yapılan mantarlar 190oC' de muhafaza edilebilirler. 04. Mikofajik Böceklerin Kontrolü Bu böcekler laboratuarlara toprak veya infekte marazi maddelerle getirilirler. Bu böcekler, genellikle, mantar yiyen cinse, Tarsonemusa aittirler. Boyları 1 mm. kadardır. Tüplerin pamuğunu delerek içeri girer ve kültürleri yerler. Bunların yumurtaları da pasajlarla nakledildiği için, subkültürler devamlı kontamine çıkarlar. Önerilen bazı akarisidler 70 (paradiklor benzen, dikloro etan, vs.) hem insan ve hem de mantar için zararlıdırlar. Bu amaçla aşağıdaki önlemler alınır : 1- Sabouraud dekstroz agara ,%0.01 oranında Lindan tozu karıştırılarak besi yeri hazırlanır. Sonra, mantarlar ekilir. Lindan böcekleri öldürür. Veya, 2- Böcekli kültürler timol buharına tutulur. Bunun için, dip tarafından timol kristalleri bulunan bir kaba kontamine kültürler konur ve kabın ağzı iyice kapatılır. Timol buharı hem ergin böcekleri ve hem de yumurtalarını öldürür. Timol buharları insan için (temas veya buhar) toksik değildir. 3- Tüplerin ağzına konan pamuk tıkacın dışta kalan kısmına alkol (%96) 500 ml.+ Su 450 ml. + HgCL2 10 g+ gliserin 50 ml. den ibaret karışımdan bir kaç damla konur. Bu solüsyon böcekleri öldürür. Bu yöntem de çok kullanılmaktadır. Mantar Preparat ve Kültür Hazırlama Yöntemleri 01. Giriş 02. Kutan Mikozeslerde 02.01. Potasyum Hidroksit (%10) 02.02. Lacto Phenol Pamuk Mavisi 02.03. Lâm Kültürü Hazırlama 02.04. Rivalier Seydel Yöntemi 02.05. Agar Blok Yöntemi 03. Subkutan ve Sistemik Mikozeslerde 03.01. Muayene Materyallerinden 03.02. Doku Kesitleri Hazırlamak 03.03. Kültürlerden Preparat Hazırlamak 04. Deneme Hayvan İnokulasyonları 04.01. Kutan Mikozesler 04.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler 71 05. Bazı Besi Yerleri 05.01. Sabouraud Dekstroz Agar 05.02. Sabouraud Glukoz Buyyon 05.03. Littman Oxgall Agar 05.04. Beyin Kalp İnfusyon Agarı 05.05. Mısır Unlu Agar 05.06. Malt Ekstrakt Agar 05.07. Yulaf Unlu Agar 05.08. Patates Dekstroz Agar 05.09. Pirinçli Besi Yeri 05.10. Czapek Agar 05.11. Dermatofit Test Medium ( DTM ) 05.12. Cysteinli Kanlı Agar 05.13. Salvin YP Ortam 05.14. Sabhi Agar Besi Yeri 05.15. Casitone Nişasta Agar 05.16. Thioglucolate Besi Yeri 05.17. Nitrat Redüksiyon Ortamı 05.18. Kanlı Agar 06. Diğer Test Ortamları ve Yöntemler 06.01. Kazein Agar 06.02. Peptonlu Su 06.03. Amonyum Nitrat Agarı 72 06.04. Üre Agar 06.05. Jelatinli Ortam 06.06. Tiamin, İnositol, Nikotinik Asit ve Histidine Gereksinim Testi 06.07. Tyrosine Testi 06.08. Kıl İnvazyon (Perforasyon) Testi (Keratinolizis) 06.09. Germ Tüp Testi 06.10. Dimorfik Mantarların Maya Formuna Dönüştürülmesi 07. Solüsyonlar 07.01. Potasyum Hidroksit ( %10 ) 07.02. Parker Boyası + KOH 07.03. Gliserinli Potasyum Hidroksit 07.04. Lakto Phenol Pamuk Mavisi (Aman's Solusyonu) 07.05. Polivinil Alkol Solusyonu 08. Boyalar 08.01. Gram Boyama Yöntemi (Hucker Modifikasyonu) 08.02. Kinyoun'un Boyama Yöntemi 08.03. Ziehl Neelsen Boyama Yöntemi 08.04. Giemsa Boyama Yöntemi 08.05. Periodik Asit Schiff ( PAS ) ile Boyama 08.06. Gridley Boyama Yöntemi 08.07. Akridin Oranj Boyası 09. Antifungal İlaçlar (Antifungal Kemoterapötikler) 73 01. Giriş Mantar kolonilerinin makro-ve mikro morfolojilerini kolay ve ayrıntılı inceleyebilmek için önce bunlardan preparatlar hazırlamak ve sonra bu preparatları, ya natif olarak veya uygun boyama yöntemleri ile boyayarak muayene etmek gereklidir. Preparatların hazırlanmasında aşağıdaki tarzda hareket edilir: 02. Kutan Mikozeslerde Dermatofitozise neden olan mantarların identifikasyonunu sağlamak için preparat, hem laboratuara gönderilen marazi maddelerden ve hem de üremiş olan kolonilerden hazırlanır. Mikroskopik muayenelerde kullanılacak lâm ve lâmellerin çok iyi temizlenmiş olması, çizgili ve yağlı olmaması gereklidir. Bu amacı gerçekleştirmek için lâmlar devamlı olarak, ağzı iyice kapatılmış ve içinde alkol (% 96) bulunan kaplarda muhafaza edilirler. Kullanılacağı zaman, lâmlar bir pensle tutularak çıkarılır ve alkol kuruduktan sonra yağsız ve tüysüz bir bezle iyice silinir ve alevde hafifçe ısıtılır. Kolonilerden materyal alırken çok yavaş hareket etmeli ve orijinal morfolojilerini bozmamaya çalışılmalıdır. Materyal, koloniler oluştuktan sonra ve en iyisi olgunlaşma döneminde iken ve koloninin çeşitli yerlerinden alınmalıdır. Mikroskopta iyi bir görünüm elde edebilmek için, uygun bir kontrast sağlanır. Preparat önce küçük büyütme(100-200 x) ve sonra daha yüksek büyütme (450-500 x) ile muayene edilir. Gerekli hallerde immersiyon objektifi de kullanılabilir. 02.01. Potasyum Hidroksit (%10) Potasyum hidroksit veya Sodyum hidroksit, kıl, tüy, deri ve tırnak kazıntılarını muayenede, materyaldeki debrisleri hidrolize etmek ve materyali berraklaştırmak amacı ile kullanılır. Fungal elementleri iyice görebilmek için, lamdaki preparat hafifçe ısıtılır ve oda ısısında 30-60 dakika bekletilir. Eğer, çok fazla preparat hazırlanacaksa, bu takdirde % 5 KOH veya NaOH solusyonu kullanılır ve preparatlar bir gece bekletildikten sonra mikroskopta muayene edilirler. Preparatlar aşağıdaki tarzda hazırlanır. 1- Temiz ve kuru bir (veya birkaç) lâmın ortasına bir veya iki damla %10 KOH (veya %10 NaOH) solusyonundan damlatılır. 2- Bu solusyonun üzerine, steril bir pensle tutularak alınan yeterince materyalden konur. 3- Lâmelle kapatılır. 4- Alevde çok hafifçe ısıtılır (50oC - 60oC 'de, hiç bir zaman kabarcık çıkmamalı veya kaynatılmamalıdır.) 74 5- Preparat oda ısısında 30-60 dakika bekletilir. Eğer, alevde ısıtılmış ise, bu süre daha kısa olur. 6- Preparat, önce 100 veya 200 büyütme ile ve sonra da 450-500 büyütme ile muayene edilir. 02.02. Lacto Phenol Pamuk Mavisi Bu yöntemle muayene, genellikle, kültürlerden yapılır. Solusyonun içindeki laktik asit özellikle mantar elementlerinin muhafazasında, fenol mantarların öldürülmesinde ve pamuk mavisi (anilin mavisi) de boyamada görev alarak iyi bir görünüm sağlarlar.Preparat aşağıdaki tarzda hazırlanır. 1- Temiz ve kuru bir lâmın ortasına bir veya iki damla lacto phenol pamuk mavisi solusyonu damlatılır. 2- Steril iğne ile, koloninin bir kaç yerinden materyal alarak, bu solüsyon üzerine konur. 3- Üzeri temiz bir lâmelle kapatılır. 4- Preparat önce, 100-200 ve sonra da 450-500 büyütme ile mikroskop altında muayene edilir. Eğer lâmelin etrafı oje ile veya buna benzer madde ile kapatılırsa, uzun, süre muayene olanağı sağlanır. Mikroskopik muayenelerde iyi bir sonuç alınamazsa, o zaman başka bir koloniden materyal alınır. Eski kolonilerde kenarlardan ve genç kolonilerden de orta ve ortaya yakın yerlerden örnek alınarak muayene edilmelidir. İyi bir sonuç alınmadığı hallerde lugol solusyonu veya %10 KOH ile Parker boyası karışımı kullanılabilir. 02.03. Lâm Kültürü Hazırlama Bu teknik, dermatofitlerin iyi tanınması ve teşhisi yönünden uygulanır. Aynı zamanda, saprofitlerle patojenik mantarların ayrımında da büyük yararlar sağlar. Lâm kültürü aşağıdaki tarzda hazırlanır: 1- Bir tüpte eritilmiş ve 45-50oC 'ler arasına kadar ılıklaştırılmış olan SDA (veya patates dekstroz agar, v.s.) steril temiz bir lâm üzerine ince tabaka şekilde dökülür. 2- Agar içeren lâm, steril boş bir petri kutusunda bulunan (U) veya (V) şeklindeki bir cam borunun üzerine yerleştirilir. 3- Lâm üzerindeki besi yerine, mantar elementlerinden (sporlar, koloni parçaları, miselyum, v.s.) ekilir. 75 4- Petri kutusunun yanlarına steril distile suya batırılmış pamuk yerleştirilir (veya gliserinli su). 5- Petri kutusunun kapağı kapatılarak uygun ısıda (25°-27°C) ve 4-8 gün inkubasyonda tutulur (koloniler iyice belli oluncaya kadar). 6- Bu sürenin sonunda, kültür kuru bir etüvde 37°C'de 24 saat bırakılır. 7- Lâm, petri kutusundan çıkarılarak, mikroskop altında muayene edilir. Ancak tehlikeli bir mantar üremesinden şüphe edilirse, bu zaman, kültür % 40 formol buharı ile 2 gün muamele edilerek öldürülür ve sonra muayene edilir. Yukarıda bildirilen lâm kültürü lakto fenol pamuk mavisi ile de boyanarak muayene edilebilir. Bunun için yukarıdaki işlemler aynen uygulandıktan sonra aşağıdaki tarzda hareket edilir. 02.04. Rivalier Seydel Yöntemi 1- Lâm üzerinde koloniler üredikten sonra, agar üzerine, kollodyum 1 ml.+ absolut alkol 2 ml.+ sülfürik eter 2 ml. den oluşan karışımdan kaplayacak miktarda dökülür. 2- Lâm dik tutularak fazla gelen solüsyon aktarılır ve böylece 24 saat bekletilir. 3- Lâm sonra, lakto fenol pamuk mavisi ile 10-15 dakika boyanır. 4- Preparat, %70 alkole daldırılarak fazla boya giderilir. 5- Alkol (% 95’lik) içinde 3-5 saniye dehidre edilir. 6- Aseton (susuz) içine 3-5 saniye daldırılır. 7- Aseton + alkol (1 / 1) veya aseton + toluol (1 / 1) içinde 15 saniye tutulur. 8- Ksilol veya toluol içinde 10 dakika tutulur. 9- Kanada balsamına yatırılır ve mikroskop altında incelenir. 02.05. Agar Blok Yöntemi Mantarların morfolojilerinin incelenmesinde ve birbirlerinden ayrılmasında çok kullanılan bir yöntemdir. 1- Eritilmiş SDA (veya diğer katı besi yerleri) steril bir petri kutusuna ince bir tabaka (2-3 mm. kalınlıkta) halinde dökülür ve katılaşması beklenir. 76 Yanda gösterilen tarzda hazırlanır. 2- Üzerinde, steril ve keskin bir bistüri ile 10 X 10 mm. boyutlarında bloklar çizilir. 3- Bunlardan bir tane, steril bir pensle tutularak, steril bir lâmın üzerine ( ortasına ) yerleştirilir. 4- Bu agar içeren lâm, steril petri kutusunda bulunan (U) veya (V) şeklindeki cam borunun (veya cam çubuğun) üzerine yerleştirilir. 5- Agar bloğun kenarlarının orta yerine ekimler yapılır. 6- Agar bloğun üzerine lâmel kapatılır. 7- Petri kutusunun içine, distile suya batırılmış pamuk konur (veya %20 su + %80 gliserin karışımı). 8- Kapak kapatıldıktan sonra, 25-27 °C' de 4-8 gün inkubasyonda tutulur (koloniler iyice görülünceye kadar). Petri kutusu mikroskop altına konarak üreyen mantar kolonileri incelenirler. 9- Bu sürenin sonunda, agar bloğun üzerindeki lâmel bir pensle tutularak kaldırılır. 10-Lâmelin mantarlı yüzü üzerine bir damla % 96'lık alkol konur ve bunun mantar kolonileri üzerine yayılması sağlanır. Tam bir kuruma elde edildikten sonra, lâmel, temiz bir lâm üzerinde bulunan lakto fenol pamuk mavisi solusyonuna, mantarlı yüz alt tarafa gelecek tarzda, yatırılır. 11-Preparat mikroskop altında incelenir (fazla boya solusyonu akıtıldıktan sonra etrafı oje ile kapatılabilir). Geride kalan agar bloğu, üzerinde lakto fenol pamuk mavisi olan lâm üzerine tersine döndürülerek yatırılır ve üzerine lâmel kapatılır. Preparat mikroskop altında incelenir. 03. Subkutan ve Sistemik Mikozeslerde Bu mantar infeksiyonlarının teşhisinde, laboratuara gönderilen çeşitli materyallerden ve kültürlerden olmak üzere preparatlar hazırlanır. Bunlarda ya boyamadan veya çeşitli boyama yöntemler ile boyanarak muayene edilirler. 03.01. Muayene Materyallerinden 77 Laboratuara gönderilen materyallerden (çeşitli eksudatlar, irinler, vücut sıvıları, lezyonlu doku ve organ parçaları, vs.) biri aynen Dermatofitozislerde olduğu gibi, %10 KOH (veya %10 NaOH) ile, diğeri ise, negatif boyama yöntemleri ile (İndia boyası) muayene yapılmak üzere preparatlar hazırlanır ve mikroskop altında incelenir. Bunun yanı sıra, bakteriyolojide kullanılan tekniklere uyularak, preparatlar hazırlanır ve bunlar çeşitli boyama yöntemleri ile (Gram, Giemsa, PAS, Ziehl- Neelsen veya Kinyoun asit -fast boyama tekniği, Methanamine AgNO3, AO “acridin oranje”, vs. boya yöntemleri) boyanarak mikroskop altında immersiyonla muayene edilirler. 03.02. Doku Kesitleri Hazırlamak Lezyonlu doku parçaları veya biyopsi materyallerinden de, usulüne uygun olarak doku kesitleri yapılır ve bunlar da yukarıda bildirilen boyama yöntemlerinden biri veya ikisi ile ayrı ayrı boyanarak incelenirler. Doku seksiyonlarını boyamada, yukarıdakilerin yanı sıra, Gridley, Musicarmine ve HE boyaları da kullanılabilir. 03.03. Kültürlerden Preparat Hazırlamak Laboratuara gönderilen patolojik materyaller, şüphelenilen hastalığın karakterine göre bir veya izolasyon şansını artırmak için iki veya daha fazla besi yerlerine, usulüne uygun olarak ekilir. Uygun bir ısı ve inkubasyon süresinden sonra, üreyen mantar kolonilerinden çok dikkatli davranmak kaydıyla, preparatlar hazırlanır ve mikroskop altında incelenir. Kolonilerden hazırlanan preparatlar, duruma göre lakto fenol pamuk mavisi, Giemsa, ZiehlNeelsen, vs. boyama yöntemleri ile boyanarak mikroskop altında muayene edilirler. 04. Deneme Hayvan İnokulasyonları Deneme hayvanları, infeksiyon etkeninin özelliğine göre seçilir ve kullanılır. Bu hayvanlara, daha ziyade, teşhis amacı ile inokulasyonlar yapılabilir. Deneme hayvanlarına, ya infekte materyallerden veya üremiş şüpheli kolonilerden, çeşitli yollarla şırıngalar uygulanır. Deneme hayvanı olarak kobay, tavşan, rat, fare veya bazen de büyük hayvanlar da işe yararlar. Denemelerde eğer mümkünse 2-3 hayvan kullanılmalıdır. Çünkü, mantar infeksiyonlarına karşı hayvanların duyarlılıkları, genellikle, değişiktir. Denemelerde beyaz veya özellikle, albinöz hayvanların kullanılmaları, sonuçları değerlendirme bakımından yararlar sağlayabilir. Deneme hayvanları her bakımdan sağlam ve derilerinde her hangi bir lezyon bulunmamalıdır. 04.01. Kutan Mikozesler 1-Klinik materyal inokulasyonu : Laboratuara teşhis amacı için gönderilen infekte (veya şüpheli) kıl, tüy, deri kazıntısı, vs. materyal çok az miktar SDA ile karıştırılır. Uygun deneme 78 hayvanının karın veya yan tarafındaki bu amaç için hazırlanmış (5x5cm. alanındaki yerin kılları kesilir, derisi traş edilir ve ılık su ile iyice temizlenir, silinir ve kurutulur. Bu işlemler sırasında deriye zarar verilmemeye çalışılır ve deri kanatılmaz veya yaralanmaz. Eğer hayvan büyükse, daha geniş saha inokulasyon için hazırlanabilir) deriye cam çubukla bastırmak suretiyle sürülür. Birçok hastalık etkenleri bu yolla deneme hayvanlarını infekte edebilir ve lezyonlar oluşturabilir. 2- Kültür inokulasyonu: Uygun olarak seçilen deneme hayvanının karın ve yan tarafından derisine, yukarıda bildirilen tarzda hazırladıktan sonra, kanatılmamak kaydıyla, zımpara kağıdı ile skarifikasyon yapılır. Fizyolojik su ile yoğun suspansiyonu yapılmış kültür veya bala karıştırılmış kültürler, cam bir çubukla bastırarak deriye sürülür. Hayvanların ekserisinin derisinde, inokulasyondan 3-5 gün sonra kızarıklıklar ve lezyonlar görülmeye başlar. Bir hafta sonra, infeksiyon etkeninin karakterine göre, bölgede ödem oluşur ve eksudat sızıntısına rastlanır. Bu eksudat, zamanla, sarı-beyaz bir kabuk oluşturarak kurur. Bazen, deride meydana gelen bu reaksiyon, daha şiddetli olabilir ve nekrozlar oluşturabilir. Gelişmiş lezyonlardan alınan materyallerden, mikroskopik muayeneler, ekimler ve gerektiğinde histopatolojik yoklamalar yapılabilir. Deneme için genç kültürler tercih edilmeli (3-4 haftalık) ve eski kültürler de tazelendikten sonra kullanılmalıdırlar. Genellikle, aerial hifaları olmayan kolonilerden alınan inokulumlar başarısız sonuç vermektedirler. Lezyonların oluşumu (erken veya geç) ve lezyonların karakteri inokule edilen mantarın türüne bağlıdır. Yeni izole edilmiş ve fazla spor oluşturan suşlar, kısa süre içinde lezyon meydana getirebilirler. Lezyonların oluşumu yönünden hayvanlar arasında bazı farklar olabilir. Bu nedenle böyle durumları hesaba katarak en azından 2 deneme hayvanı kullanmak yerinde olur. Aşağıdaki çizelgede bazı dermatofitlerin, kobaylarda patojenite durumları gösterilmiştir. 79 04.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler Bu mantarların teşhisi için kullanılan deneme hayvanlarının seçimi (hayvanın türü, cinsi, yaşı) ve inokulasyon yolları bazı değişikliklerle birlikte Dermatofitlere ait kısımda bildirildiği gibidir. Mantarların türüne göre kullanılacak deneme hayvanı aşağıda gösterilmiştir. Sporotrichum schenkii : Bu etkenin maya veya miselyal formundan hazırlanan suspansiyondan 0.3ml. farelerin testisleri içine şırınga edilir. Testislerde oluşan lezyonlardan hazırlanan preparatlar Gramla boyanarak mikroskop altında incelenir. Mikroskopta tomurcuklu veya tomurcuksuz hücreler aranır. Blastomyces dermatitidis : Bu mantarın sporlarından veya maya benzeri kolonilerinden hazırlanan suspansiyondan %5 gastrik mucin ile aynı miktar karıştırıldıktan sonra, farelere i.p., 1 ml. verilmesi halinde infeksiyon meydana gelmektedir. Eğer ölüm olmazsa, hayvanlar iki hafta sonra öldürülür, oluşan veya görülen lezyonlardan preparatlar hazırlanarak lakto fenol pamuk mavisi ile boyanırlar ve mikroskop altında muayene edilirler. Candida albicans : Bu mantarın 24-48 saatlik kültüründen hazırlanan %1 lik suspansiyondan (fiz su ile) tavşanların kulak venası içine 1 ml. şırınga edilir. Hayvanlar genellikle, 3-5 gün 80 içinde ölürler. Böbreklerde oluşan küçük apse odaklarından elde edilen materyallerden preparatlar hazırlanır ve bunlar Gram yöntemi ile boyanırlar. Gastrik mucin ile eşit miktarda karıştırılmış C. albicans, farelere karın içi olarak 1 ml. miktarında şırınga edilebilir. Coccidioides immitis: Bu mantara ait kolonilerden suspansiyon hazırlanırken çok dikkat edilir. Fizyolojik su ile kobayların testis içi 0.5 ml. şırınga edilir. İnokulasyondan 7-10 gün sonra kobaylarda orşitis meydana gelir. Bu anda, hayvan öldürülür ve testislerde oluşan apse odaklarından preparatlar yapılır ve sporangiumlar yönünden incelenir. Mantarın artrosporlarından veya miselyumlarından hazırlanan suspansiyondan eşit oranda % 5 gastrik mucin ile karıştırıldıktan sonra 1 ml. miktarının karın içi kobaylara şırıngası lezyonların oluşmasına neden olabilir. Cryptococcus neoformans : Bu mantarın 4-5 günlük kültüründen hazırlanan suspansiyon farelere beyin içine 0.03 ml. miktarında şırınga edilir. İnokulasyondan 10-12 gün sonra, hayvanın başı şişer ve fare ölür. Eğer ölümler meydana gelmezse hayvanlar ikinci hafta içinde öldürülür. Beyinde oluşan jelatinöz materyalden, India boyası ile preparat hazırlanır ve mikroskopta muayene edilir. Mikroskop altında kapsüllü yuvarlak hücreler aranır. Koloniden hazırlanan suspansiyonlardan 1 ml. karın içi olarak da verilebilir. Histoplasma capsulatum : Bu etkenin BHI agar da üretilmiş maya benzeri formundan hazırlanan suspansiyon 8-10oC'de 2-3 saat tutulduktan sonra, farelerin kuyruk venasına 0.2 ml. miktarında şırınga edilir. Eğer hayvanlar bir hafta içinde ölmezlerse, farelerden biri veya ikisi öldürülür. Farelerin kanından, karaciğer ve dalağın kesit yüzlerinden preparatlar hazırlanarak Giemsa veya Wright boyama yöntemi ile boyanırlar. Miselyal formunu, maya formuna döndürmek için, miselyal fragmentlerden veya sporlardan yoğun bir suspansiyon hazırlanarak farelere karın içi 1 ml. şırınga edilir. Ölen veya iki hafta sonra öldürülen farelerin dalak ve karaciğerinden preparatlar hazırlanır ve Giemsa ile boyanarak mikroskop altında incelenir. Mikroskopta küçük, oval ve tomurcuklu hücreler aranır. Organlardan, tüpteki BHI agara ekimler yapıldıktan sonra 37°C'de inkube edilirse maya benzeri formlar elde edilir. Nocardia asteroides : Mantar suspansiyonu eşit miktarda gastrik mucin ile karıştırıldıktan sonra kobaylara karın içi 1 ml. şırınga edilir. İki hafta içinde ölen hayvanların dalak ve karaciğerlerindeki lezyonlardan preparatlar hazırlanır ve Kinyoun boyama yöntemi ile boyanarak mikroskop altında incelenirler. 05. Bazı Besi Yerleri Mantarları üretmede kullanılan besi yerleri genellikle az sayıdadır. Bunlar da izolasyon ve özel besi yerleri olmak üzere 2 kısma ayrılabilirler. Ancak, bu ortamlar birbirinin yerlerine kullanılabilirler. Mantarları izole ve identifiye etmede yararlanılan başlıca besi yerleri 81 şunlardır: Aşağıda belirtilen izolasyon ve identifikasyon besi yerleri, ticari firmalardan da, aynı amaçlar için temin edilebilir ve kullanılabilirler. 05.01. Sabouraud Dekstroz Agar Patojenik mantarların ve dermatofitlerin izolasyonunda ve üretilmesinde en çok kullanılan bir ortamdır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Pepton 10.0 g. Et ekstraktı 3.0 g. NaCl 5.0 g. Agar 17.0 g. Distile su 1000.0 ml. Yukarıdaki maddeler distile suya konur, alttan ısıtılarak ve karıştırılarak eritilir. Otoklavda 120°C de 20 dakika sterilize edildikten sonra içine, katılır Dekstroz 40.0 g. (filtrasyonla sterilize edilir) Maya özeti 3.0 g Tiamin 0.05 g. Kloramfenikol 0.04 g. Aktidion (cyclohexamide) 0.5 g. ve iyice karıştırılır. Ancak, kloramfenikol ve aktidionun özel olarak hazırlanması gereklidir. Bu amaçla, kloramfenikol 10 ml. % 70'lik alkolde ve aktidione de 10 ml. asetonda eritildikten sonra ilave edilir ve iyice karıştırılır. Eğer kloramfenikol bulunmazsa bunun yerine penisilin 20 U.I /ml. ve streptomisin 40 mcg. /ml. kullanılabilir. Besi yeri petri kutusunda veya tüp içine hazırlanır. Bileşiminde bulunan aktidion (cyclohexamide) C. neoformans, Allescheria boydii, A. fumigatus,Candida krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis, N. asteroides gibi mantarların üremelerini inhibe edebilir. Bu nedenle, bu etkenlerin izolasyonunda besi yerlerine antifungal madde katılmamalıdır. Dermatofitlere etkisi olmadığından, bunları izole etmede bu besi yerlerinden yararlanılır. Aynı besi yeri aktidionsuz ve antibiyotiksiz olarak da saf kültürlerin devam ettirilmesinde kullanılır. 82 05.02. Sabouraud Glukoz Buyyon Candida türlerinin ayrımında kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır. Glukoz 20.0 g. Pepton 10.0 g. Distile su pH I000.0 ml. 5 .7 Maddeler distile suda ısıtılarak eritilir ve tüplere 10 ml. miktarında taksim edildikten sonra otoklavda sterilize edilir. 05.03. Littman Oxgall Agar Bu besi yeri de patojenik bazı mantarların ve dermatofitlerin izolasyonunda kullanılır. Ancak, H. capsulatum, Nocardia ve Actinomycetesler için uygun değildir. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Pepton 10.0 g. Glukoz 10.0. g (filtrasyonla sterilize edilir) Oxgall (Bacto) Agar Crystal violet Distile su 15.0 g. 20.0 g. 0.01 g. 1000.0 ml. Yukarıdaki maddeler 1 litre suya konur, karıştırılır ve ısıtılarak eritilir. Otoklavda 120 ° C'de 20 dakika sterilize edildikten ve 45-50 °C'de ılıklaştırıldıktan sonra streptomisin 30 mcg. /ml. ve sterilize edilmiş glukoz katılır ve iyice karıştırılır. Petri kutusu veya tüplere taksim edilir. 05.04. Beyin Kalp İnfusyon Agarı Bu ortam, A. israelii ve A. bovis ’in izolasyon, üretimi ve aynı zamanda H. capsulatum ile B. dermatitidis’in oda ısısında izolasyonu için de kullanılır. 83 Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Beyin-kalp infüsyonu 37.0 g. Kloramfenikol 0.05 g. Cyclohexamide 0.05 g. Agar 20.0 g. Distile su 1000.0 ml. Besi yerinin bileşimine giren aktidion ve kloramfenikol, Sabouraud dekstroz agarda bildirilen tarzda hazırlandıktan sonra, katılır. Besi yeri petri kutularına veya tüplere taksim edilerek kullanılır. Bu besi yerine % 10 kan katılarak üretme özelliği artırılabilir. 05.05. Mısır Unlu Agar Bu ortam C. albicans ’ta klamidospor oluşturmak, Streptomycetesleri, perithecia veya pycnidia oluşturan mantarları üretmede kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Mısır unu 40 .0 g. Agar 15.0 g Distile su 1000.0 ml Mısır unu 500 ml. distile suya konarak karıştırılır, kaynatılır, eritilir ve süzülür. Sonra içine 500 ml. suda ayrıca eritilmiş olan agar katılarak iyice karıştırılır. Tekrar süzülür. Otoklavda 120oC'de 20 dakika sterilize edilir, tüplere taksim edilir. Besi yerine %2 glukoz ve % 2 pepton katılabilir. Bu ortama, % 1 Tween-80'in katılması klamidospor oluşumunu ve % 1 glukoz ilavesi de T.mentogrophytes ile T.rubrum 'un ayırımında işe yarar. 05.06. Malt Ekstrakt Agar Bir çok mantarları izole etmede ve üretmede kullanılan bir ortamdır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır : Malt ekstrakt 20.0 g. Pepton 1.0 g. Glukoz 20.0 g. (filtrasyonla sterilize edilir) Agar 20.0 g. 84 Distile su 1000.0 ml. Maddeler distile suya konur, karıştırılır ve ısıtılarak eritilir. Otoklavda 1200C'de 20 dakika sterilize edilir, sonra glukoz solusyonu katılır ve iyice karıştırılır. Tüplere taksim edilir. 05.07. Yulaf Unlu Agar Streptomycetesleri, üretmede iyi bir ortamdır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Yulaf unu 30 .0 g. Agar 15 .0 g. Distile su 1000 .0 ml Yulaf unu 500 ml. distile suya konur kaynatılarak eritilir ve süzülür. Su ilâvesiyle 1 litreye tamamlanır. Otoklavda 120° C'de bir saat sterilize edilir. Sonra agar ilave edilir ve 120° C'de tekrar otoklavda 20 dakika sterilize edilir. Tüplere taksim edilir. 05.08. Patates Dekstroz Agar Bu ortam M. audouinii ile M. canis 'i ve T. rubrum ile T. mentagrophytes 'i ayırmada kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır : Patates 200 gr. (haşlanmış soyulmuş küçük parçalar halinde) Dekstroz 20 .0 g. (filtrasyonla sterilize edilir) Agar 15 .0 g. Distile su 1000.0 ml. pH 6.6 Maddeler distile su da kaynatılarak eritilir, tüplere taksim edilir ve otoklavda 10 dakika sterilize edilir. (Patates ekstresi: yıkanmış, haşlanmış ve soyulmuş patates, iyice ezilir. Bundan 100 g. alınır ve 300 ml. suya karıştırılır. Buz dolabında bir gece bırakılır, süzülür ve otoklavda sterilize edilir). 05.09. Pirinçli Besi Yeri Dermatofıtler için kullanılan bir ortamdır. M. audouinii ile M. canis 'i ayırmada kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır : Pirinç 16.0 g. Distile su 50.0 ml. 85 Bir erlen mayere konan pirinç ve su, açık otoklavda kaynatılır ve tüplere taksim edilir. Otoklavda 12O° C'de 20 dakika sterilize edilir. 05.10. Czapek Agar Penicillium, Aspergillus, Nocardia, v.s. mantarlar üzerinde araştırma yapmak için kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır : Sakkaroz 30.0 g.(filtrasyonla sterilize edilir) K2HPO4 MgS04. 7.H2O 1 .0 g. 0.5 g. Fe S04 0.1 g. NaNO3 2.0 g. Agar 15.0 g. Distile su 1000.0 ml. Maddeler (sakkaroz hariç) distile suya konur, eritilir ve otoklavda sterilize edilir. Sonra içine steril sakkaroz solusyonu ilave edilir. Petri kutusu veya tüplere taksim edilir. 05.11. Dermatofit Test Medium ( DTM ) Dermatofitlerin ayırımı için kullanılan indikatörlü bir ortamdır. Ekseri dermatofitler bu besi yerinde kırmızı renk oluştururlar. Saprofitler; bakteri ve mayalar renk meydana getirmezler. Aşağıdaki tarzda hazırlanır : Phytone 10 .0 g. (Baltimore) Glukoz 10 .0 g. Agar 20 .0 g. Fenol red sol. HCL, 0.8 M 40.0 ml. 6.0 ml. Cyclohexamide 0.5 g. (Upjoehn Co.) Gentamycin sulfat 100 mcg./ml. (Schering Corp) Chlortetracycline HCI 100 mcg./m lederle lab) Çok duyarlı olan besi yeri formülüne giren maddeler, belirlenen yerlerden sağlanması gereklidir. Aksi halde duyarlılığı azalır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır. 86 1- Phyton, glukoz ve agar 1000 ml. distile suya katılır, ısıtılır ve karıştırılarak eritilir. 2- Karıştırılırken, 40 ml. fenol red solusyonu konur (fenol red 0.5 g. + 15 ml. 0,1 N NaOH içinde eritilir ve distile su ile 100 ml.ye tamamlanır.) 3- Besi yerinin pH'sı, 6 ml. 0,8 M HCI ile ayarlanır. 4- Cyclohexamide 0.5 g. + 2 ml. aseton içinde eritilerek ortama karıştırılır. 5- Gentamycin sulfat, 1 ml. sinde 100 mcg./ ml. olacak şekilde 2 ml. cam distile su içinde eritilir ve karıştırılır. 6- İyice karıştırıldıktan sonra 12 Ibr basınçta 10 dakika otoklave edilir ve 47° C'ye kadar ılıklaştırılır. 7- Klortetrasiklin 25 ml. steril camdan çekilmiş distile suda eritilir, katılır ve iyice karıştırılır. 8- Ağzı vidalı kapaklı şişelere konur ve yatık tarzda katılaştırılır. Vasatın pH'sı 5,5 + 0,1 kadardır. Buzdolabında saklanır. Kontaminasyonlar yanlış sonuç verdirebilirler. İnokule edildikten sonra, kapağı gevşetilir ve 28-30° C. inkubasyona konur. Sonuç 14 güne kadar değerlendirilmelidir. İki haftadan sonraki değerlendirilmelerde yanlış pozitif reaksiyon görülebilir. Pozitif olgularda ortamın sarı rengi kırmızıya dönüşür. 05.12. Cysteinli Kanlı Agar Mantarların maya formunu devam ettirmede kullanılan bir ortamdır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Nütrient agar 100 ml. Glukoz Cysteine 1 g (filtrasyonla sterilize edilir) 0.1 g. Nütrient agar eritildikten sonra içine steril 1 gr. dekstroz ile 0.1 gr. cysteine katılır, iyice karıştırılır ve homojen hale getirilir. Ortam 42-45° C'ye kadar ılıtıldıktan sonra içine 10 ml. steril defibrine koyun kanı ilave edilerek tekrar iyice karıştırılır ve petri kutularına (veya tüplere yatık olarak) dökülür. 05.13. Salvin YP Ortam Bu besi yeri Histoplasma capsulatum için kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: 87 Proteose-pepton 10.00 g. Noepeptone 3.25 g. Tryptone 3.25 g. Glukoz 2.0 g.(filtrasyonla sterilize edilir) NaCl 5.00 g. Na2HPO4 2.50 g. Agar 1.75 g. Distile su pH 1000 ml. 6.5-7.5 Yukarıdaki maddeler distile suya konarak ısıtılır,iyice eritilir ve pH'sı ayarlanır. Otoklavda 121 oC’de 15 dakika sterilize edilir. Sonra içine steril glukoz solüsyon katılır ve iyice karıştırılır. Tüplere 10 ml. miktarında dağıtılır. Buzdolabında muhafaza edilir. 05.14. Sabhi Agar Besi Yeri Bu ortam doku sıvılardan, Blastomyces dermatitidis ve H. capsulatum 'u izole etmede kullanılır. Besi yerine: %10 steril koyun kanının (veya insan kanı) ilavesi izolasyon şansını artırır. Hazır besi yeri, oda ısısında (25°C) 2 ay kadar muhafaza edilebilir. Bu besi yeri aynı zamanda miselyal formları maya formuna döndürmede de (37°C'de.) kullanılır. İçine, genellikle, kloromisetin katılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır. Dana beyni infusyonu 100 g. Sığır kalbi infusyonu 125 g. Proteose pepton Neopeptone Glukoz NaCl Na2HPO4 5 g. 5 g. 21 g. 2.5 g. 15 g. 88 Hazır ortamdan 59 g. alınarak bir litre distile suya konur ve ısıtılarak eritilir. Otoklavda sterilize edildikten sonra 50°C'ye kadar ılıklaştırılır ve içine 1 ml. steril 100 mg./ml. kloromisetin solusyonu konur ve karıştırılır. Tüplere veya petri kutularına dökülür. 05.15. Casitone Nişasta Agar Actinomyces türlerinde nişasta hidrolizasyonu testi için kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Kalp infusyon buyyonu 25.0 g. Casitone 4.0 g. Maya ekstraktı 5.0 g. Nişasta (eriyebilir) 5.0 g. Agar 15.0 g. Distile su 1000.0 ml. pH 7.0 Maddeler distile suda ısıtılarak eritildikten sonra pH 7.0'ye ayarlanır ve tüplere 8 ml. miktarında taksim edilir 05.16.Thioglucolate Besi Yeri Actinomyces türlerinin izolasyonunda kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Tripticase NaCl K2P04 Sodyum Thioglucolate Metilen mavisi Distile su 20.0 g. 5.0 g. 2.0 g. 1.0 g. 0.5. ml 1000.0 ml Maddeler, distile suda eritilir ve tüplere 8 ml. taksim edildikten sonra otoklavda sterilize edilir. 89 05.17. Nitrat Redüksiyon Ortamı Actinomyceteslerin nitrat redüksiyon durumunu ölçmede kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Kalp infusyon buyyonu 25.0 g. Maya ekstraktı 5.0 g. Casitone 4.0 g. KNO3 1.0 g. Distile su pH 1000.0 ml 7.6 Maddeler distile suda ısıtılarak iyice eritildikten sonra tüplere 5 ml. miktarında taksim edilir ve otoklavda sterilize edilir. Testin uygulanışı aynen bakterilerdeki gibidir. 05.18. Kanlı Agar Laboratuarlarda genel amaçla hazırlanan kanlı agara tiamin 10 mg. / litre ilavesiyle dermatofitlerin (T. mentagrophytes, T. rubrum, T. schoenleinii, T. verrucosum ve T. violaceum) makrokonidia formasyonunu artırır. 06. Diğer Test Ortamları ve Yöntemler Mantarların kesin teşhisi oldukça güçtür ve bu konuda tecrübeli elamanlara gereksinim vardır. Laboratuara gelen materyalin muayenesi, ekimler sonu elde edilen mantar kolonilerinin makro-ve mikro morfolojileri, hayvan inokulasyonları ve serolojik-alerjik testler çoğu zaman güvenilir bir teşhise götürmeyebilir. Ayrıca, dermatofit mantarların koloni morfolojileri genellikle birbirlerine de çok benzerler. Bu nedenle yukarıda bildirilen muayenelerin dışında ve yanı sıra, bazı ayırıcı testlerin yapılması ve bunun sonuçlarının, diğer muayenelerinkilerle birleştirilerek teşhis konması daha isabetli olur. Bu amaçla aşağıdaki önemli bazı ortamlardan yararlanılır. 06.01. Kazein Agar Ortam genellikle Nocardia ile Streptomycesleri ayırmada kullanılır. Streptomycesler kazeini hidrolize ederler. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Casein (%10 asit hidrolize) 25.0 ml.(vitaminsiz) Glukoz 40.0 (filtrasyonla sterilize edilir.) 90 MgSO4 0.1 g. KH2PO4 1.8 g. Agar 20.0 g. Distile su 1000.0 ml Maddeler distile suya konur, alttan ısıtılır ve karıştırılarak eritilir. Erlen mayerlere (100 ml. lik) taksim edilir ve 120°C'de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Bu ortam, aynı zamanda sütle de hazırlanabilir. Bu taktidir de açık otoklavda 1000°C de 3 gün arka arkaya 45 - 50 dakika sterilize edilmiş yağsız sütten %10'luk bir suspansiyon hazırlanır. Sonra, % 2 erimiş agarla karıştırılarak petri kutularına dökülür. Bu besi yerinde Streptomyces türleri çok geniş bir hidrolizasyon alanı meydana getirirler. 06.02. Peptonlu Su Bazı dermatofitlerin (T. mentagrophytesve T. rubrum) identifikasyonunda %10 peptonlu su kullanılır. T. mentagrophytes yüzeyde ürer ve kolonileri hafif kahve renklidir. T. rubrum ise, beyaz, pamuk gibi ve hemisfer koloniler oluşturur. 06.03. Amonyum Nitrat Agarı Bu ortam, Trikofıtonların üreme karakterlerini saptamada işe yarar. Yukarıda bildirilen kazein agar besi yerindeki casein yerine,1.5 gram NH4N03 koymakla elde edilen bu ortam aynı tarzda hazırlanır. NH4NO3 1.5 g. Glukoz 40.0 g. (filtrasyonla sterilize edilir) Mg504 0.1 g. KH2PO4 1.8 g. Agar 20.0 g. Distile su 1000.0 ml T. megninii ile M. gallinae 'yi ayırmada amonyum nitrat agar içine histidin (30 mcg./ml.) katılır. T. megninii histidinli ortamda ürer, M. gallinae ise her iki ortamda (histidinli ve histidinsiz) üreyebilir. 06.04. Üre Agar 91 Bu ortamdan ürease testi için yararlanılır. T. mentagrophytes üreyi çabuk hidrolize ederek koyu kırmızı renk meydana getirir. T. rubrum ise daha yavaş reaksiyon oluşturur. Aşağıdaki tarzda hazırlanır : Pepton 1.0 g. NaCl 5.0 g. KH2PO4 2.0 g. Glukoz 5.0 g. Agar 20.0 g. Distile su 1000.0 g. Maddeler distile suda ısıtılarak eritilir, içine 2 ml. fenol red solusyonu (% 50 alkolde % 0.2) katılır ve 115°C'de 15 dakika otoklave edilir, ılıklaştırılır (45 - 50oC) ve içine 100 ml. üre solusyonu (%20 ve filtrasyonla sterilize edilmiş) katılır ve iyice karıştırılır. Tüplere konur ve yatık tarzda katılaştırılır. Sonuçlar bir hafta sonra değerlendirilir. Koyu kırmızı renk pozitiftir. 06.05. Jelatinli Ortam Bu ortam daha ziyade, N. asteroides ile N. brasiliensis 'i birbirinden ayırmada kullanılır. N. asteroidesjelatinli ortamda üremez. Buna karşın N. brasiliensis iyi gelişir. Aşağıdaki tarzda hazırlanır. Jelatin Distile su 4.0 g. 1000.0 ml. Otoklavda sterilize (110°C'de 15 dakika) edildikten tüplere taksim edilir. Jelatin erime testi yapmak için bir litre buyyona 120 gram jelatin koymak ve eritmek gereklidir. Test aynen bakterilerde olduğu gibi değerlendirilir. Ayrıca aşağıdaki besi yerinden de aynı test için yararlanılır. Jelatin Kalp infusyon buyyon 100.0 g. 25.0 g. Casitone 4.0 g. Glukoz 5.0 g. Maya ekstraktı Distile su 5.0 g. 1000.0 ml. 92 pH 7.0 Maddeler distile suda eritilir ve tüplere taksim edilir. Otoklavda sterilize edilir. 06.06. Tiamin, İnositol, Nikotinik Asit ve Histidine Gereksinim Testi Mantarların adı geçen maddelere olan ihtiyaçları değişiktir. Bu amaç için vitaminsiz kazein hidrolizat besi yeri kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanırlar : A- Esas ortam kazeinli agar. B- Tiamin solusyonu Tiamin HCI Distile su 1.0 mg. 100.0 ml. C- İnositol solusyonu İ-İnositol 250 .0 mg. Distile su 100.0 ml. D- Histidin solusyonu L- Histidin 150.0 mg. Distile su 100.0 ml. E- Nikotinik asit Nikotinik asit Distile su 10.0 mg. 100.0 ml Bu vitamin solüsyonları otoklavda 120°C'de 10 dakika sterilize edilir ve buzdolabında (15°C) saklanır. Kullanılacağı zaman kazeinli 100 ml. besi yerine 2 ml. stok vitamin solüsyonundan katılır. T. equinium, nikotinik asitli ortamda ürer. T. verrucosum, vitaminsiz ortamda üremez. İnositol ve tiaminli ortamda ürer. 06.07. Tyrosine Testi 93 N. asterodies ile N. brasiliensis 'in üreme durumlarını kontrol etmek için tirosinli ortam kullanılır. N. asteroides bu ortamda iyi, N. brasiliensis ise çok zayıf bir üreme gösterir. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Pepton 5.0 g. Et ekstraktı 3.0 g. Agar Tyrosine Distile su 15.0 g. 5.0 g. 1000.0 ml Ortamın pH'sı 7.0 'ye ayarlanır. Hazırlanan besi yeri petri veya tüplere taksim edilerek kullanılır. 06.08. Kıl İnvazyon (Perforasyon) Testi (Keratinolizis) Bu test dermatofitlerin kıl üzerinde yaptığı erimeleri ortaya koymak için uygulanır. Mantarların keratinolitik aktivitesini ölçmede çeşitli steril hayvan ve insan kılları kullanılabilir. Kıllar iyice yıkanıp, kurutulduktan sonra 0.5-1 cm. uzunluğunda kesilerek petri kutusuna konur ve otoklavda sterilize edilir. Bir tüp veya petrideki besi yeri (Czapak) üzerinde 8-10 tane kıl konur ve denenmek istenen mantar inokule edilir. On gün sonra kıllardan bazıları çıkarılır, lâm üzerine konur, lakto fenol damlatılır ve lamel kapatılarak mikroskopta incelenir. Kıllarda dıştan içe doğru olan erimeler pozitif olarak değerlendirilir. Dermatofitler tarafından kılın invazyonu yandaki şekilde gösterilmektedir. 94 Aşağıdaki çizelgede mantarların, hayvan türlerindeki invazyon testi gösterilmektedir. 06.09. Germ Tüp Testi Bu testte hücrelerden germ tüpü oluşumu aranır. Aşağıdaki tarzda yapılır: 1- Maya benzeri mikroorganizmalardan 0.5-1.0 ml steril serum ( sığır ve koyun ) içinde hafif bir suspansiyon yapılır. 2- Süspansiyon 37°C'de 3 saat inkube edilir. 3- Karışımdan bir damla lâma konur ve üzeri lâmelle kapatılır. 4- Mikroskop altında hücrelerden germ tüpünün meydana gelip gelmediği araştırılır. 95 06.10. Dimorfik Mantarların Maya Formuna Dönüştürülmesi Miselyal formda üremiş (25°C'de) mantarlar, uygun ortama (BH agar) inokule edildikten sonra 37°C'de üretilirse, maya benzeri forma dönüşür. Ancak bazen birkaç pasaj yapmak gerekir. 07. Solüsyonlar 07.01. Potasyum Hidroksit ( %10 ) Klinik materyalleri direkt muayenede kullanılan bir solüsyondur. KOH'lı lâmın hafifçe ısıtılması materyalin çabuk berraklaşmasını ve dolayısıyla da kolay görülmesini sağlar. Potasyum hidroksit % 20 yoğunlukta, materyali 30-60 dakika berraklaştırır. Bazı mantarlarda (Candida gibi) yalancı formasyonlara neden olması sebebiyle kullanılmamalıdır. Solüsyon taze hazırlanmalıdır. 07.02. Parker Boyası + KOH Dermatofitleri daha iyi görmede eşit miktarda hidroksit solüsyonuna (% 10), Parker mavisi (%10) katılabilir. Bir ay kadar muhafaza edilebilir. 07.03. Gliserinli Potasyum Hidroksit Epidermal kazıntı ve kabukları berraklaştırmada kullanılan bir solüsyondur. 96 Aşağıdaki tarzda hazırlanır: KOH 5.0 g. Gliserin 25.0 g. Distile su 100.0 ml. Hazırlandıktan 60 dakika sonra kullanılabilir. 07.04. Lakto fenol Pamuk Mavisi (Aman's Solusyonu) Klinik materyallerin ve kültürlerin mikroskopik muayenelerinde kullanılan bir solüsyondur. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Fenol (kristal) 20.0 g. Laktik asit 20.0 g. Gliserin 40.0 g. Pamuk mavisi (anilin mavisi) 0.05 g. Distile su 20.0 ml. Fenol distile suya katılır ve eritilir. Sonra diğer maddeler ilave edilerek iyice karıştırılır. Uzun süre saklanabilir. 07.05. Polivinil Alkol Solusyonu Materyalleri ve özellikle, kültürleri muayenede kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır: Polivinil alkol 10.0 g. Kloralhidrat 20.0 g. Laktik asit 35.0 ml. Karbolik asit (% 15) 25.0 ml. Gliserin 10 .0 ml. Distile su 50.0 ml. Yukarıdaki maddeler distile su içinde birbirlerine karıştırılır. Karanlık şişede ve ağzı sıkıca kapalı olarak muhafaza edilir. 08. Boyalar 97 Dokularda bulunan mantar elementlerini ortaya koymada bir çok yöntemler vardır. Ancak, doku kesitlerinin hazırlanması ve boyanarak muayene edilmeleri genellikle zaman alıcı bir durum gösterir. Buna rağmen, yine de, mikozeslerin kesin teşhisi için boyama yöntemlerinden fazlaca yararlanılır. Biyopsi ve klinik materyallerinin histopatolojik muayeneleri için alınan örnekler hemen bufferli % 10 formalin solusyonuna (4g. NaH2 PO4 +1000 ml. %10 formalin +%6.5 g. Na2 PO4) veya Zenker + formol solusyonuna konarak fikse edilirler. Fikse edici solüsyonun miktarı, genellikle alınan materyalin 20 katı kadar olmalıdır. Materyal 0.5 cm.den fazla büyüklükte ise, fiksatifin etkimesi için daha küçük parçalara ayrılabilirler. Materyaller fiksatif içinde 24-48 saat bırakıldıktan sonra çıkarılır, çeşme suyunda yıkanır ve tekrar %10'luk formalin solusyonuna konur. Kavanozun ağzı çok iyi kapatıldıktan sonra laboratuara gönderilir. Laboratuarlarda mantarları boyamada en çok kullanılan boyama yöntemleri aşağıdaki gibidir. 08.01. Gram Boyama Yöntemi (Hucker Modifikasyonu) Klinik materyallerde, kraşede diğer sıvılarda ve dokularda mantar elementlerini ortaya koymada kullanılan bir tekniktir. Ancak bir çok modifikasyonları bulunmaktadır (Hucker, Mac Callum, Brown-Hopps, v.s.). Bunlardan birinin seçimi araştırıcının tercihine ve tecrübesine kalmıştır. Mantar elementleri Gram pozitiftir. Solüsyonlar 1-Kristal violet sol A- Kristal violet 4.0 g. (%85 boya içerikli) Etil alkol (% 95) 20.0 ml. B-Amonyum oksalat Distile su 0.8 g. 80.0 ml. Kristal violet alkolde iyice eritildikten sonra distile su ile 1/10 sulandırılır. Bir kısım kristal violet sol. (1/10) ve 4. kısım sol. B ile (amonyum oksalat sol.) ile karıştırılır. 2- Lugol solusyonu İyot KI 1.0 g. 2 .0 g. Distile su 300 .0 ml. Bir havan içine konan materyaller, azar azar ilave edilen distile su içinde eritilirler. Tam erimesi için bir gece bekletilir. 98 3-Safranin solusyonu Safranın(%2.5 sol. %95 alkolde) 10 ml. Distile su 100 ml. Boya solusyonu distile suya iyice karıştırılır. Boyama yöntemi 1- Preparat lâm üzerine hazırlanır, kurutulur ve alevde tespit edilir. 2- Kristal violet ile bir dakika boyanır. 3- Hafif akan su ile yıkanır. 4- Lugol solusyonu ile bir dakika muamele edilir. 5- Hafif akan su ile yıkanır. 6- Alkol ( %95 ) veya alkol + aseton karışımı (eşit miktarda) ile dekolore edilir. 7- Hafif akan su ile yıkanır. 8- Safranın solusyonu ile 10 saniye boyanır. 9- Hafif akan su ile yıkanır. 10- Kurutulur (havada). 11- Mikroskopla muayene edilir (önce küçük büyütme, sonra immersiyonla). 08.02. Kinyoun’un Boyama Yöntemi Bu yöntem daha ziyade Nocardiaları ayırmada kullanılır. N. brasiliensis hifaları kısmen asido-rezistans özellik gösterirler. Solüsyonlar 1- Bazik fuksin 4.0 g. Fenol 8.0 g Alkol (% 95) 20.0 ml. Distile su 100.0 ml. 2- HCL (konsantre) 3 g ml. Etil alkol 97 ml. 3- Metilen mavisi 2.5 g 99 asteroides ve N. Alkol (% 95) 100.0 ml. Solüsyonlar ayrı ayrı hazırlanırlar. Boyama yöntemi 1- Preparat hazırlanır, kurutulur ve alevde tespit edilir. 2- Lâm üzerini kaplayacak tarzda karbol fuksin solusyonu konur ve oda ısısında 3 dakika boyanır. 3- Hafif akan su ile yıkanır. 4- Asit + alkol içinde 5-10 saniye dekolore edilir. 5- Hafif akan su ile yıkanır. 6- Metilen mavisi ile 30 saniye boyanır. 7- Hafif akan su ile yıkanır. 8- Kurutulur (havada). 9- Mikroskopta muayene (immersiyonla) edilir. 08.03. Ziehl Neelsen Boyama Yöntemi Aynı Mycobacterileri boyamada olduğu gibi hazırlanır, kullanılır ve değerlendirilir. 08.04. Giemsa Boyama Yöntemi Bu yöntemle H. capsulatum iyi bir şekilde görülür. Solüsyonlar 1- Stok solusyonu Giemsa tozu 600 .0 mg. Metil alkol (asetonsuz) 50.0 ml. Gliserin (nötral) 50.0 ml. Giemsa tozu bir havana konur ve az bir gliserin içinde ezilerek eritilir. Bir silindire alınır ve üst 1/3 kısmı temiz bir şişeye konur. Geride kalan kısma gliserin konarak ezilir ve aynı şişeye aktarılır. Şişenin ağzı kapatılır ve 55oC'de 2 saat tutulur. Her yarım saatte bir hafifçe çalkalanır. Bu sürenin sonunda karışım soğutulur. Havanda kalan boya alkolle toplandıktan sonra tekrar aynı şişeye aktarılır. Kullanılmadan önce iki hafta bekletilir. Damlalıklı şişe içinde kullanılır. 100 2- Buffer solusyonu (pH 7.2) Na2HPO4 (susuz) 6.77 g. KH2PO4 2.59 g Distile su 1000 .0 ml. 3- Boyama solusyonu Stok boya solusyonu 2.0 ml. Buffer sol. 6.0 ml. Bunlar birbirine katılarak iyice karıştırılırlar. Boyama yöntemi 1- Preparat hazırlanır, kurutulur ve metil alkolde (% 100) 3-5 dakika fikze edilir. 2- Boya solüsyonunda 15 dakika boyanır. 3- Hafif akan suda yıkanır. 4- Kurutulur (havada). 5- lmmersiyonla muayene edilir. 08.05. Periodik Asit Schiff ( PAS ) ile Boyama Patojenik mantarları özellikle, C. neoformans, H. capsulatum, B. dermatitidis, C. albicans v.s.gibi mantarlar ile deri ve tırnak kazıntılarını muayenede kullanılır. Doku seksiyonları da aynı yöntemle boyanarak muayene edilirler. A- Deri kazıntıları için: Temiz bir lâmın üzeri Mayer albumini ile kaplandıktan sonra deri kazıntıları konur ve iyice bastırılır, alttan hafifçe ısıtılır ve kazıntıların lâma yapıştığına dikkat edilir. 1-Alkol (% 95) içine bir dakika daldırılır. 2- Periodik asit (%5) içine de beş dakika bırakılır. 3- Aşağıdaki solüsyona 2 dakika bırakılır. Bazik fuksin 0.1 g. 101 Alkol (% 95) Distile su 5.0 ml. 95.0 ml. 4- Preparat hafif akan suda yıkanır. 5- Aşağıdaki solüsyona 10 dakika süre ile daldırılır. Zink(veya sodium)hidrosulfit. Tartarik asit 1.0 g. 0.5 g. Distile su 1000.0 ml. 6- Preparat hafif akan suda yıkanır. 7- Aşağıdaki boyalardan biri ile boyanır. Ya satire pikrik asit ile 2 dakika veya light green ile 5 saniye boyanır. Light green 1.0 g. Glacial acetic asit 0.25 ml. Alkol (% 80) 100.0 ml. 8- Suda hafifçe yıkanır. 9- Alkol de ( %95 ) 10 saniye ve % 100 alkolde 1 dakika tutulur. Sonra ksilol içinde 2 defa (her biri birer dakikalık) yıkanır. Kurutulduktan sonra üzerine polivinil alkol-kloral hidratlı solüsyon konur ve lâmelle kapatılarak mikroskopta muayene edilir. Mantar parlak kırmızı veya mavi-kırmızı renkte görülür. B- Doku seksiyonları için: Dokular fikse edildikten, kurutulduktan ve parafin içine yatırıldıktan ve kesildikten sonra rutin yöntemle boyanır. 1- Kesit, ksilol içine konarak deparafinize edilir. 2- Alkolde ( % 100 ) yıkanır. 3- Distile suda yıkanır. 4- Periodik asit (% 1 ) içinde 10 dakika tutulur. 5- Su içinde 5-10 dakika tutulur. 6- Aşağıdaki solüsyonda 2 dakika tutulur. Bazik fuksin 0.1 g. 102 Alkol ( %95 ) Distile su 5.0 ml. 95.0 ml. 7- Suda 10 saniye yıkanır. 8- Zink hidrosulfit solüsyonunda 2-3 saat tutulur. 9- Suda 3-5 dakika yıkanır. 10- Light green solüsyonunda 2 dakika boyanır. 11- Suda kısa bir süre yıkanır. 12- Alkolde ( %95 ) 10 saniye ve %100 alkolde bir dakika tutulur. Sonra ksilol içinde 2 defa (her biri birer dakikalık) yıkanır. Kuruduktan sonra üzerine polivinil alkol kloralhidrat solusyonu konarak lâmelle kapatılır. Mikroskop altında muayene edilir. 08.06. Gridley Boyama Yöntemi Doku kesitlerinde mantar elementlerini (spor, hifa, v.s.) görmede ve incelemede kullanılır. Bu muayenede uygun bir fiksatifle iyice tespit edilmiş 6 mikrometre kalınlığında parafin seksiyonları kullanılır. Aşağıdaki tarzda hareket edilir. 1- Kesitler ksilol, absolut alkol ve % 95 alkolle deparafinize edilir. 2- Kromik asit (%4) içinde 1 saat bekletilir. (Okside). 3- Akan suda 5 dakika yıkanır. 4- Colemen feulgen reagentinde 15 dakika bekletilir. 5- Sulfuroz asitte 3 dakika yıkanır (her biri 2 dakika) 6- Akan suda 15 dakika yıkanır. 7- Preparat aldehit-fuksin solusyonuna 15-30 dakika süre ile konur. 8- Alkolle (%95) yıkanır. Fazla boya atılır. 103 9- Suda yıkanır. 10- Metanil yellow boyası ile 2-5 dakika boyanır. 11- Suda yıkanır. 12- Alkol ( %95 ) ve absolut alkolde dehidre edilir. 13- Ksilolde berraklaştırılır. 14- Permounta yatırılır. Sonuç: Miselyum, koyu mavi konidiumlar koyu kırmızı ve purpul, zemin sarı, elastik doku ve musin ise mavi boyanır. Bu boyama yönteminde kullanılan bazı solüsyonlar: Kromik asit solusyonu (taze) Kromik asit 4.0 gr. Distile su 100.0 ml. Coleman Feulgen reagenti Bazik fuksin 1.0 gr. Distile su 100.0 ml. Bazik fuksin sıcak distile suda eritilir, soğutulur ve filtre edilir. Filtrata 2 g. sodyum metabisulfit ve 10 ml. normal HCI ilave edilir. Karışım 2. saat bekletildikten sonra 0.5 g. aktif karbon katılır ve bir dakika çalkalanır, sonra, kaba kağıttan süzülür. Filtrat renksiz olmalıdır. Buz dolabında saklanır. Normal HCI solusyonu HCI (1.19) 83.5 ml. Distile su 916.5 ml. Sodyum metabisulfit solusyonu Sodyum metabisulfit Distile su 10.0 g. 100.0 ml. Sulfuroz solusyonu 104 Sodyum metabisulfit (% 10) 6.0 ml. Normal HCI 5.0 ml. Distile su 100.0 ml. Aldehit-fuchsin solusyonu Bazik fuchsin 1.0 g. Alkol (%10) 200.0 ml. Paraaldehid 2.0 ml. HCI (yoğun) 2.0 ml. Bu solüsyon oda ısısında saklanır. Kullanmadan önce filtre edilir. Metanil yellow solusyonu Metanil yellow Distile su 0.25 g. 100.0 ml. Glacial asetik asit 0.25 ml. Mucicarmin boyası Carmine 1.0 g. Alüminyum klorid (susuz) 0.5 g. Distile su 2.0 ml. Materyal küçük bir tüpte karıştırılır. Alevde 2 dakika ısıtılır. Sıvı, siyah ve şurup gibi bir görünüm alır. Alkol (% 50) 100 ml. katılarak dilue edilir ve 24 saat bekletilir. Filtre edilir ve 1/4 oranında su ile sulandırılarak kullanılır. 08.07. Akridin Oranj Boyası Bu boya, preparatlarda, doku kesitlerinde ve taze materyallerdeki mantar elementlerini ortaya koymada yararlı olur. Bu boya ile aşağıdaki tarzda boyama yapılır. Kıl ve deri kazıntılarını muayene 1- %20 KOH solüsyonundan hazırlanır. 105 2- %0.1 akridin oranj solüsyonundan 1 ml. alınarak 9 ml. KOH ( %20 ) katılır. 3-Temiz bir lâm üzerine 2 damla acridin oranj solusyonu ve bunun üzerine de kıl,deri ve tırnak kazıntıları konulur. İyice karıştırılır. 4- Üzeri lâmelle kapatılır. 5- Preparat çok hafifçe ısıtılır. 6- Özel mikroskopta muayene edilir. Doku kesitlerini muayene 1- Parafinli ince kesitler ksilol ve alkol solüsyonlarından geçirildikten sonra distile su ile yıkanır. 2- Weigert demir hematoxylen ile 5 dakika boyanır. 3- Akan suda 3-5 dakika yıkanır. 4.- Acridin oranj (% 0.1) ile 2 dakika boyanır. 5- Akan suda 30 saniye yıkanır. 6- Alkol (% 95) içinde bir dakika dehidre edilir. 7- Absolut alkolde 2-3 kez dehidre edilir. 8- Ksilolde berraklaştırılır. 9- Üzerine fluoresans vermeyen bir medium konarak lâmel kapatılır. 10- Özel mikroskopla muayene edilir. 09. Antifungal İlaçlar (Antifungal Kemoterapötikler) Mantar infeksiyonlarında proflaksi ve sağaltım, bakteri hastalıklarından daha az başarılı olduğu gibi daha fazla da zaman alır. Bakterileri etkileyen ilaçların çoğu mantar infeksiyonlarında kullanılamazlar. Çünkü, bakteriler prokaryotik olup, yapıları ökaryotik olan mantarlardan farklıdır. Bakterilerin etrafında peptidoglikan, lipopolisakkarid, protein kompleksleri bulunmasına karşın, mantar hücre duvarlarında kitin, selüloz ve diğer polisakkarid bileşikleri vardır. Mantarlar, insan ve hayvanlarda, iki karakterde hastalık oluştururlar. Bunlardan biri mantar toksinlerinin (mikotoksin) oluşturduğu mikotoksikozisler ve diğeri de mantarların bizzat kendilerinin meydana getirdiği infeksiyonlardır (mikozes). Antifungal ilaçlar, 106 mikotoksikozislerde kullanılamazlar. Ancak, mikozes olgularında, mantar hücreleri üzerine olumsuz etkide bulunurlar. Mantarlar aynı zamanda ilaçları modifiye ve inaktive edecek mekanizmalara da sahiptirler. Antifungal substansların bazıları, çeşitli mantarlardan fermentasyon suretiyle elde edilirler. Pratikte bulunan antimikotik ilaçların hemen hepsi de yüzeysel ve sistemik mantar infeksiyonlarında kullanılırlar. Mikotoksikozislerde ise yararlanılamazlar. Yüzeysel mantar infeksiyonlarının teşhisi kolay, buna karşın tedavisi zor ve zaman alıcıdır. Bazen de tam bir sağaltım gerçekleştirilemez. Sistemik infeksiyonları teşhis ve tedavi oldukça güçtür. Bazen de imkansızdır. Antimikotik ilaçların çoğu daha ziyade, Chitin senthase ve sterol sentezine etkilerler. Hücre duvarı yapısının kimyasal bileşimini bozarlar. Membranda delikler açar, permeabiliteyi bozar ve sterol sentezini inhibe ederler. Mikozislerde kullanılan antifungal ilaçlardan başlıcaları aşağıda bildirilmiştir. Amphotericin B: Bu ilaç Streptomyces nodosus 'tan elde edilir. Mantar hücre duvarındaki sterole bağlanarak hücre permeabilitesini bozar. Sistemik mikozeslerde kullanılır. Yan etkileri vardır. 5- Flucytosine : 5- Fluorocytosine, sentetik antimikotik bir preparat olup, sistemik mantar infeksiyonlarında kullanılır. İlaç, mantar hücre RNA'sı ile birleşerek fonksiyonlarını bozar. İlaca karşı dirençlilik oluşabilir. Yan etkileri vardır. Fluconazole, Clotrimazole ve Tereonazole : Aynı amaçlarla kullanılan antimikotik preparatlardır. Griseofulvin : Penicillium griseofulvinden elde edilen antifungal bir substanstır. Dermatofitlerden ileri gelen süperfisial mikozislerde kullanılır. İlaç nukleik asite etkileyerek hücre bölünmesine mani olur. Dermatofitlerin ve sistemik mikozeslerin sağaltımında geniş spekturuma sahip olan imidozollu antifungal ilaçlar tercihen kullanılmaktadır. Bunlar sitoplasmik membrandaki sterollerin sentezini bozarak permeabiliteye olumsuz yönde etkilerler. Ketoconazole : Kronik Candidiasis, dermatofitosiz ve sistemik mikozeslerde kullanılan bir ilaçtır. Yan etkileri vardır. Miconazole : Bu ilaç Candidiasis ve sistemik mantar infeksiyonlarında kullanılır. Deride krem veya losyon tarzındaki preparatlardan yararlanır. Sistemik infeksiyonlarda parenteral kullanıldığında yan etkileri olabilir. 107 Nystatin (C46 H75 NO18 ) : Streptomyceslerden elde edilen polyene bir antibiyotiktir. İlaç, özellikle, Candidaların hücre duvarındaki sterollere bağlanarak permeabiliteyi bozar. Nystatin, Candida infeksiyonlarının kontrolünde yararlanılır. Tolnaftate : Kutan mantar infeksiyonlarında yararlanılan bir ilaçtır. Bazı antifungal kemoterapötiklerin kullanıldığı infeksiyonlar ve yan etkileri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. 108 109 110 111 112 Kaynakça BİLGEHAN, H. Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, 1989. ÇETİN, E.T. , Ö. Anğ., Töreci, K. Tıbbi Parazitoloji, İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayın No: 15, Fatih Gençlik Vakfı Matbaası, İstanbul, 1985. HOWARD, B.J., Klaas II J., Rubin, S.J., Weissfeld A.S., Tilton, R.C., Clinical and Pathogenic Microbiology, The C.V. Mosby Company, St., Louis, Washington, D.C., Toronto, 1987. JAWETZ, E., (Ed). Medical Microbiology, Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut / Los Altos, California, 1989. MURRAY, P.R., Drew, W.L., Kobayashi G.S., Thompson, W.H., Medical Microbiology, Wolfe Medical Publ. Print. USA, 1990. UNAT, E.K., Temel Mikrobiyoloji, Beta Basım Yayım A.Ş., İstanbul, 1985. 113
