Alglerde recombinant protein üretimi

Alglerde rekombinant protein
üretimi
Algler her yıl total organik karbonun yaklaşık %50’ni üretmektedir.Yaklaşık 40 bin
tür içeren ,geniş spektrumlu fenotiplere sahib heterojen bir gruptur.
Bir besin kaynağı olarak kullanılan algler, yıllar önce insanlar tarafından
kullanılmaya başlamıştır.
Asya,Afrika ve Meksikada yüzyıllar boyunca Nostoc, Spirulina, ve Aphanizomenon
gibi mavi – yeşil algler besin olarak kullanılmıştır.
2000 bin yıl öncesine uzanan bulgulara göre ,kıtlık sırasında Çinde insanlar Nostok
kullanılarak açlıktan korunmuştur.Gıda olarak Japonyada dördüncü yüzyılından beri
algler kullanılmaktadır.
Biyoteknolojinin gelişmesi alg transformasyonlarına yol açmıştır
Transgenezis alglerde hızla büyüyen,karmaşık bir teknolojidir.
Selektiv marker genleri,prtomoterler,reporter
genleri,transformasyon teknik ve metodların
sayesinde,günümüzde yaklaşık 25 tür alg transformasyonuna yol
açmıştır.
Projelerin içerisinde ileri düzeyle ulaşan, yeşil alglerden
Chlamydomonas reinhardtii, Vol vox carteri ve Ostreococcus
tauri,kırmızı alglerden Cyanidioschyzon merolae,diatomlardan
Thalassiosira pseudonana türlerinde çalışmalardır.
Moleküler tarım,tıp,proteinler veya fafklı metabolitlerin
üretiminde transgenik alg sistemlerin kullanılması mümkün
olmuştur.
Transgenik alglerde rekombinant antikor,aşı,insektisid
proteinleri veya bio-hidrojen üretim olanakları gösterilmiştir.
Alglerin fiziyolojik özelliklerini arttıran genetik modifikasyonların
geliştirilmesi, alg üretim sistemlerinin optimizasyonu, üretim
potansiyelinin arttırılması, geleceğin “uğurlu teknolojisinin” ileri
gelen amaçlarındandır.
Alglerede protein üretimin avantajları
1.Biyoreaktörlerde yetişitrilmeleri ,havadaki kirletici maddelerden contamine riskini
azaltır,aynı zamanda transgenlerin çevredeki ekosistemlere geçişini önler.
2.Kontrollü yetiştirme herhangi bir patojenik saldırısına karşı ürün kaybı olasılığını
azaltmakdadır.
3.Yüksek yapılı bitkilerde (mısır,tütün) aylar ve yıllar beklenmesi gerekirken ,alglerde
transformasyon sonrası birkaç hafta içinde büyük ölçüde protein üretimi elde
edilebilir.
4.Mikroalgler tek tip hücre olduğu için üretilen rekombinant proteinlerde varyasyon
değişiklikleri az olması beklenir
5.Fotoototrofik beslenmeleri C kaynağına ihtiyaç olmadan gerçekleşebilir,böylece
alg kültürünün kontamine olasılıkları minimuma düşürülmüştür
Kloroplastlarda rekombinant protein üretimi nuklear transformasyolarına
göre birçök benzersiz özelliklere sahiptir:
Kloroplastlarda transgenik protein anlatımı ,nuklear genom anlatımından
çok daha yüksektir
Birden fazla genin eklenebilmesi ve tek bir promotor tarafından kontrol
edilebilmesi
Kloroplsttaki proteinler glikolize değildir,buda birçok antikor üretiminde
yararlı olabilir
Kontrollü rekombinasyon protein üretimi gerçekleşebilir
Kodon optimizasyonu
Diğer sistemşerde olduğu gibi,kodon optimizasyonu hem
kloroplast hem nuklear rekombinant protein anlatımları için
önemlidir (Heitzer ve ark. 2007).
Wobble pozisiyonda nuklear genomda G veya C tercih
edilirken,kloroplast genomunda A veya T tercih edilmektedir.
Çalışmalarda GFP (green fluorescent protein ) kullanılarak,kodon
optimizasyonu transgen protein birikimini nukleusta 5 kata kadar
arttırılırken (Fuhrmann ve ark. 1999),kloroplastlarda 80- katı
kadar arttırılabilmektedir (Franklin et al. 2002).
Bugün rekombinant proten üretimi için otimize edilmiş üniversal
kodonlar kullanılmaktadır.
Mikroalglere kullanılan marker ve reporter genler
Mikroalglere kullanılan promoterler
Kloroplast ekspresiyonunda kullanılan promotrer ve UTR kombinasyonları
Kloroplastlarda gen regulasyonu
Promoter ve UTR düzenleyici(UTR untranslated region ) seçimleri transgen
ekspresyon düzeylerinde iki önemli anahtar faktördür
Alg kloroplastlarında günümüzde en başararılı sonuçlar psbA promoter UTRs
kobinasyonu ile elde edilmiştir (Manuell et al. 2007; Surzycki et al. 2009).PsbA
regulatör elemanların kullanımında dikkat edilecek iki nokta vardır:
Eğer psbA gen ürünü varsa(D1protein) 5’UTR kontrolünde rekombinant
sekansının ekspersyonu azalıcaktır
D1, fotosistem II için gerkli olduğundan,psbA knockouts’lar
nonfotosentetiktir
Expression of recombinant protein in C. reinhardtii chloroplasts
Chlamydomonas reinhardtii
Tek büyük bir kloroplst içinde bulunan
ougun indirgeici ortam, proteinin disulfid
bağlarının oluşturmasını sağlayarak, doğru
katlanmasını da sağlanır.
Transformasyonda kullanılan yöntemler:
Biyolistig
PEG metodu (Polietilenglikol)
•Çalışmada,Chlamydomonas kloroplastranıda rekombinant proteinlerin birikmesini
etkileyen faktörler araştırılarak,heterolog protein ekspresiyonu için bazı
stratejilerin tasarlanması
Aynı atpA promoter/UTR tarafından kontrol edilen,üç transplastopik proteinelerin
anlatımı izlenmiştir.Üç plazmid tasarlanmıştır:
pAGR-gfp protein için
pAHR-hsv8-lsc protein için (antikor)
pALR-lux proteini için (bakterial lusiferaz)
Plazmidler kloroplastlara partikül bonbardımanı ile eklenmiş.
PCR ile amplifikasyon sonrası ,Southern Blot analizi yaparak üç farklı
transgenik DNAs ve wild-tipe genler incelenmiştir.Aralarında anlamlı
fark bulunmamıştır.
Rekombinant protein birikimi üzerine hücre yoğunluğunun ve ışığın etkisi:
ED –12h.karanl.sonra
1h-ışıklı
EL – 12h. Işık.sonra
L- sadece ışıklı ortamda
Wild -type
İki farklı hücre yöğunluğunda yetiştirilerek 12 saat ara ile ışıklı ve karnlık
ışıklı ortamda yetiştirilmişler.
ortamda,yada sadece
 GFP ve LUX proteinlerin karanlık-ışıklı siklüslarında sabit oldukları tespit edilmiştir
GFP ve LUX yüksek hücre yoğunluklarında (107 cell/ml) miktarları 2 kat daha fazladır
HSV8-lsc yüksek konsantarasyonları düşük hücre yoğunluğunda (106 cell/ml)sadece
ışıklı ortamda ve 5 kat daha fazla yüksek hücre yoğnluğnda 1 saat ışıklı ortamda
kaldıktan sonra
Recombinant proteinlerin in vivo turnoveri
Transgenik suşlar 1 x 106 cell/ml ,4500
lux yetiştirilmiştir.Kolroplastlarda protein
sentezini inhibe eden geniş spektrumlu
kloramfenikol antibiyotiği kullanılmıştır.
Belirli zaman aralıklarla eşit miktarlarda
CAM ortamdan alınmaktadır.
Wild -type
GFP ve LUX, 4 saatin sonunda hafif bir
düşüş gözlenirken endojen proteinlerde
(atpA ve rbcL) aynı süre için miktarlarında bir azalma gözlenmemiştir.
HAV8-lsc 4 saatin sonunda belirgin bir
azalma gözlenmiştir-yaklaşık 3 kat
Rekombinant protein sentezi, endojen proteinlerin
sentezinden daha düşük miktarda olması:
Her üç recombinant proteinin translasyonu ,endojen proteinin
translasiyonundan çok daha düşük seviyelerde gerçekleşir.
Düşük translasyon seviyeleri ve protein degradasyonları rekombinant
proteinlerin birikmine yansıyacaktır.
Transgenlerin gen kopya sayısı endogen genlerden iki kat daha fazla
olmasına rağmen, rekombinant ve endojen protein birikimleri arasındaki
fark, gen kopya sayısı,protein miktar birikmesi üzerine etkisi olmadığını
tespit edilmiştir.
•Bir başka çalışmada Chlamydomonas reinharditii kloroplastlarında
rekombinant proteinlerin anlatım düzeylerini arttırmak için farklı bir yöntem
kullanılmıştır.
•Rekombinant protein akumulasyonunu arttırmak için endojen proteinin
ribuloz bifosfat karboksilaz (Rubisco LSU) C-terminaline rekombinant reporter
proteini lusiferaz eklenmiştir.
•İn vivo ortamında endojen ve rekombinant proteinlerin ayrılması için iki gen
arasına (Rubisco LSU ve luciferase) preferredoxin (preFd) yerleştirilmiştir.
A. Standart olarak kullanılmıştır
B. Himer geni - Ndel-inisiasyon kodon;rbcL- Rubisko LSU; GS bağlayıcı linker;preFdproteaz saytı ;
luxCt-lusiferazı kodlayan;Xbal- stop kodon
C.Endojen rbcL’nin aphA6-kanamycin-resistance geni ile transgenik replasmanı
(knocking-out)
Model of the Rubisco LSU-luciferase fusion protein
A. Monomer-Rubisco LSULUXCt monomer GS linker
(green) preferredoxin
protease site (preFd;
purple) bridge the Rubisco
LSU (blue) and a LUXCt
(yellow).
B.Tetramer structure of the
Rubisco LSU-LUX fusion.
rbcL-luxCt ve rbcLaphA6 genlerin C. reinhardtii kloroplastına transformasyonu
•P322-rbcL-lıxCt plazmidin entegrasyonu bam-Xho ve luxCt probları kullanıLarak test edilimiştir
•Endogen rbcL genın replasmanı aph6
ve rbcL probları kullanılarak kontrol
edilmiştir
Bu sonuçlar iki transgen rbcL-luxCt
ve aphA6 de homoplazmik
olduğunu ve rbcL-luxCt/rbcL de
endojen rbcL geni
bulunmamaktadır.
Southern blot analysis
Transgenik LuxCt ‘nin mRNA’rı
1.Nothern blot analiz ile total mRNA’nın kloroplasttakı ekspresyonu gösterilmiştir
2.Lux Ct ve rbcL mRNA’ların transegik kloroplastlardaki transformasyonu(orta ve
sağ paneller).
Bu sonuçlar transgenler beklenen rbcL ve rbcL-luxCt mRNA’ları transkripsiyonu
sağlamıştır
Bu çalışmada bir endojen kloroplast proteini genetik manıpulasyonda
kullanarak, alglerde rekombinant birikiminin arttırığıldı gözlenmiştir.
RbcL-lux Ct fusyon geni ile lısiferaz proteinin aktivitesi yaklaşık 140 kez arttırılmıştır
ve gen anlatımı yaklaşık 33 kez artmıştır.
Rekombinant protein endojen proteinde in vivo ayrılması içim preFd geni
kullanıldı
Biyolojik aktivitesine sahib matur protein elde edilmiştir
Diğer alglerde transformasyon
Genetik manipulasyonlar Chlamydomonas reinhardtii ile sınırlı değildir.
Ekzojen genler tek hücreli charophyte alglerde , Closterium peracerosum–
strigosum–littorale complex (Abe et al. 2008)kullanılmıştır.
Closterium sp.
Green algae - Conjugate algae - Closterium
Bazı transformasyonlar Lotharella amoebiformis alglerinde (Hirakawa et al.
2008), Ulva pertusa (Kakinuma et al. 2009), ve kırmızı alglerde
Cyanidioschyzon merolae (Ohnuma et al. 2008) gerçekleştirilmiştir
Symbiodinium
Amphidinium
Dinoflagelates – tek hücreli ökariyotik deniz fitoplanktonuların önemli
grubudur.Bu grubun bazı türleri işıklı bileşikler üretir,bazıları insalara ve diğer
omurgalılar için toksik bileşikler üretmektedir.
Bu grubun türleri tipik ökariyotik canlılar olasda çekirdeklerinde özgün özelliğe
sahiptir.Histonları yoktur ve intronların varlığı ve kondase kromozomları ile tipik
prokariyotik özellik gösterir.
Bu grupta Amphidinium ve Symbiodinium’ başarılı transformasyonlar
gerçekliştirilmiştir.
Algler terapötik protein üretiminde
Yabancı gen ekspersiyonu ile ilişkili genel sorunlar
•Kromozoma entegre olamama
•Regulatör sekansın bulunmaması
•Yanlış poliadenilasyon
•Uygunsuz nuklear taşıma
•mRNA’nın instabilitesi
•Pozisyonel etkiler
•Metilasyon ile gen sessizleşmesi
•Epigenetik mekanizmalar ile gen sessizleşmesi