kanser kök hücre - Lenfoma Myeloma Derneği

advertisement
Prof. Dr. Mustafa ÇETİN
Erciyes Üniversitesi
GENKÖK Araştırma Merkezi
• Kanser Kök Hücre: Kendini yenileme ve tümor hücrelerini
oluşturabilme yeteneğine sahip hücrelerdir.
• Kendini yenileme kabiliyeti (self renewal) : kök hücrenin kuluçka
ortamı (niş) içindeki bir takım medyatörlerin uyarısı ile hücre içinde
meydana gelen genetik ekspresyonlar tarafından yönetilir.
• Kuluçka ortamı (niş): kök hücrelerin desteklenmesi, gerekliliklerin
idamesi ve fonksiyonlarının düzenlenmesine uygun ortamlardır.
Kök Hücreler
 Kök hücreler kendini yenileyebilme ve farklı hücrelere
değişebilme kapasitesine sahiptir.
Tümör hücresinin özelliklleri
Kanser Kök Hücre
•
Normal Hücrelerde oldukça sıkı kontrol edilen mekanizmalar bozulmuştur.
– Büyüme↑, Apopitozis ↓, Proliferasyon ↑ , Farklılaşma ↓
•
Genetik mutasyonlar ve epigenetik değişiklikler
•
Normal hücre büyümesi ve fonksiyonları kanser hücreleri tarafından
bozulmuş
Tümör & Heterojenite
• Tümörler morfoloji, yüzey
işaretleyicileri,genetik bozukluklar ve
tedaviye cevap açısından farklılıklar
gösterir.
• Tümör kitlesindeki tüm kanser hücreleri
homojen ve eşit değildir. Kendi içinde dahi
çok farklı genetik ve epigenetik bozukluklar,
değişik büyüme ve farklılaşma kapasitesi
gösterirler.
• Bu farklılaşma tümör ilerledikçe veya tedavi
sonrası nükslerde çok daha kompleks bir o
kadar karmaşık bir yapı arzeder
Kanser Kök Hücrelerin Özellikleri
•
Kanser Kök hücreler: Kendini yeniyebilme
ve kanser kitlesini oluşturan hücrelere
dönüşebilme kapasitesine sahip bir grup
tümör hücresidir.
•
Tümorojenezin devamlılığı ve sürekliliğini
sağlayan özellik self-renew kapasitesidir.
•
KKH’lerde unilineage differasyon kapasitesi
hakimdir, multilineage kapasite zorunlu
değildir.
Tümör gelişim modelleri
Klonal gelişim modeli
Kanser kök hücre modeli
Klonal gelişim modeli
Tümörler mutasyona uğramış normal hücre hatlarından oluşurlar..
Kanser Kök Hücre Modeli
Kanser kök hücrelerin bir tanesi hiyerarşik olarak kanseri başlatmasürdürme-çoğaltma kapasitesine sahiptir.
Non-stem kanser modeli (Skolastik Model):
Tümör içindeki her hücre yeni bir kanseri başlatır
Kök hücre modeli (Hiyerarşik Model):
Lösemi hücreleri hücresel olarak heterojen yapıya
sahip olmasına rağmen, tümör oluşumu tek bir
hücreden kaynaklanmakta ve klonal özellik
göstermektedir.
Kanser dokusu içindeki nadir hücreler kanseri
başlatabilir
Kanser Kök Hücre Yüzey İşaretçileri
Tümör Tipi
CSC ayırmada kullanılan işaret
AML
B-preALL
Myeloma SC
CML SC
MEME
PROSTAT
BAŞ BOYUN (Skuamoz h.ca.)
KOLON
PANKREAS
Mezenkimal
Akciğer
KARACİĞER
MELANOM
OVER
GLİOBLASTOM
CD34+ CD38- CD123+
CD34+ CD38CD19+
CD138- CD19+ CD20+ CD27+
CD34+ CD38(Ph+)
CD44+ CD24ESA+
ALDH1 veya CD133+
hi
CD44+ a2b1
CD133+
CD44+ linESAhi
CD44+ CD133+ ALDH1+ CD166+/ESA+
CD44+ CD24+
ve/veya
CD133+
SP
CD133+ ALDH1+
SP-C+
CD90+ CD133+
EpCAM
ABCG2+ CD133+
CD20+MCAM+
CD44+ CD117+
CD133+
CD133+ NESTİN+
SP: Side Population, ESA/EpCAM: Epidermal Surface Ag ALDH: Aldehid Dehidrogenaz
ABC: ATP Binding Casette SP-C: Surfactant protein -C
İnsan AML Hücrelerinden Lösemi Gelişmesi
CD34+/ CD38Lösemi
Gelişmekte
AML hastasından alınmış blastlar
NOD/ SCID
fare
CD34+/ CD38+
Lösemi yok
John Dick and Dominique Bonnett
LKH’nin kendisini yenileme modeli:
FACS
AML hücreleri
5 x 103
CD34+/CD38-
Sublethal doz
NOD/SCID Model
Lapidot T et al. Nature 1994;367: 645-8.
Kanser hücrelerinde ortaya çıkan
kromozomal değişiklikler
Deletion
Terminal
Deletion
Reciprocal
translocation
Duplication
Insertion
Inversion
Ring
Chromosome
Robertsonian
Translocation
Isochromosomes
Kanser hücreleri genomunda
nükleotid değişiklikleri
Nucleotide
Deletions
Nucleotide
Insertions
Nucleotide
Substitutions
Self-renewal sinyal sistemleri
Pluripotensinin Moleküler yolakları
Kanser & Trofoblast Hipotezi
Plesantal implantların annne dokusuna invazyon ve implantasyonu kanser
dokusuna benzemektedir.
Gametogenesis & Tumorigenesis
Germ (eşey) hücre & Kanser Kök Hücre
Cancer cells
Germ cells
Stem cells
Cancer cells
Germ cells
Stem cells
Somatic/Germ Cells
Sperm
Somatic Cells
Farklılaşma
Çoğalma
Çoğalma ve Farklılaşma aktivitesi
Kanser Biyomarkerleri olarak germline kök hücre proteinleri
Hipotetik Model
Somatic stem cells
Germ cells
Somatic cells
Germline stem cells
Cancer stem cells
Tumor
Tumor niche
Germline stem cells
Germ cell niche
Somatic cell niche
Germline stem cells
Epithelial Mesenchymal Transition (EMT)
Hipotetik Model: Kanserin hücresel orjini
Germ Cell Origin
Germ Cell Transition
Germline stem cells
Somatic stem cells
ICM (ES)
Trophoblast
Cancer stem cells
Somatic niche
Tumor
Tumor niche
Cancer stem cells
Germline stem cells
Tumor
ICM (ES)
Trophoblast
MikroRNA
 Küçük, protein kodlamayan
RNA parçaları olup, gen
ifadesinin posttranskripsiyonel
regülatörüdürler.
 Hücre proliferasyonu,
farklılaşma, apoptozis gibi
fonksiyonlardan sorumludur.
 LKH’lerinin kendi-kendilerini
yenileme ve farklılaşma
fonksiyonlarından sorumlu
bulunmuşlardır.
Xia HP. J Cancer Mol 2008; 4:79-89
PIWIL 2; KANSER KÖK HÜCRE/ EŞEY HÜCRE PROTEİNİ
• PIWIL 2, Argonaute Proteinlerini kodlayan geniş bir gen
ailesinin germline kök hücrelerinin gelişimi ve onarımından
sorumlu bir üyesidir.
• 8p 21.3 bölgesinde lokalizedir.
• 973 amino asit; 109.849 Da ağırlığındadır.
• Eşey hücrelerin bütünlüğü için gerekli olan transpozonları
baskılayıp mobilizasyonlarını engelleyerek spermatogenez
sırasında önemli bir rol oynar.
• Spermatozoaların mayotik farklılaşmasında ve
spermatogonial hücrelerin kendilerini yenilemelerinde büyük
rolü vardır.
• Piwi gen ailesinin üyesi olan PIWIL2’nin, ilk olarak testis
dokusunda eksprese olduğu tespit edilmiştir.
• Piwi, germline kök hücre bölünmesinde otonomik organizatör
olarak çalışmaktadır.
PIWIL 2; KANSER KÖK HÜCRE/ EŞEY HÜCRE PROTEİNİ
• Piwi genleri, Arapidopsis bitkisinden insana kadar değişen aralıkta farklı
organizmalarda kök hücrelerin kendilerini yenilemesinde, gametogenezde
ve RNA interferansında rol oynadığı bilinmektedir.
• Piwil2 kanser kök hücrelerinde sinyal ileti yolaklarında proliferasyon ve
apopitozisi düzenleyen anahtar görevindedir.
• Onkogenezde etkili olan Piwil2’nin birçok genle etkileşimde olduğu ve
birlikte eksprese olduğu bilinmektedir. Bunların arasında onkogenik
mekanizmalarda etkili olduğu en çok düşünülen genler Piwil1 ve DDX4 ‘tür.
Piwil2’nin somatik hücrelerde sessiz durumda iken,
kanser kök hücrelerinde neden ve nasıl aktiflendiği
konusu tam olarak açıklık kazanmamıştır.
Piwil1 ve Piwil2’nin spesifik olarak premeiotik eşey
hücreleri tarafından eksprese edildiği çeşitli araştırma
grupları tarafından daha önce gösterilmiştir.
Fakat bunların atipik olarak farklı tümör türlerinde de
eksprese edildiği belirlenmiştir.
???
Piwil2
Proliferation
Apoptosis
PIWIL 2; KANSER KÖK HÜCRE/ EŞEY HÜCRE PROTEİNİ
• Olası mekanizmalardan biri Piwil2 ilişkili gen
regülasyonunun küçük RNA ve metilasyon vasıtasıyla
olabileceğidir
• Bu olasılık doğrultusunda piwi-etkileşimli RNA’lar (piRNAs)
olarak adlandırılan küçük RNA türlerinin bir alt grubu,
memeli testislerinde tanımlandırılmıştır.
• Bu küçük RNA’lar eşey hücrelerin genomundaki transpozon
fonksiyonunu baskılamak için PIWI proteinleri ile (Piwil1
ve Piwil2) etkileşime girmektedirler.
• Bu da piRNA’ların, kanser hücrelerinde gen regülasyonunun
anahtar bileşeni olarak bilinen DNA metilasyonunun spesifik
belirleyicileri olduğunu göstermektedir.
Piwi gen ailesi
Piwi protein & piRNA
Piwi Proteinlerinin Fonksiyonlar
Gen Baskılama; Translasyonel Kontrol; Epigenetik Regulasyon
Piwil 2 Fonksiyonel Bölgeleri
1-Piwi
Piwi gen ailesi; korunmuş PAZ ve Piwil bölgesi olarak
tanımlanır ve
- kök hücrede kendini yenileme
-RNA baskılama
-çeşitli organizmalarda translasyonel regülasyonda rol oynar.
2- PAZ
- Paz bölgesi siRNA dubleksine bağlanır ve efektör kompleks içindeki öncü RNA’ya
takılmayı kolaylaştırır.
3- Piwil2
Piwil2 (Fare):4913 bp mRNA, 2915 bp ORF, 971 a.a, piwi ailesinin 2 üyesi
Piwil2 (İnsan): 3545 bp mRNA, 2921 bp ORF, 973 a.a, piwi ailesinin 8 üyesi
Fare
piwil2
gapdh
colon
bone marrow
brain cerebellum
small intestine
fetal brain
fetal liver
heart
kidney
spinal cord
lung
placenta
prostate
salivary gland
skeletal muscle
spleen
testis
stomach
thyloid
trachea
uterous
testis
liver
ovary
muscle
kidney
brain
heart
lung
Fare ve insan testisinde piwil2 ekspresyonu
İnsan
piwil2
gapdh
İnsan Farklı Hücre Hatları Ve Dokularında Pıwıl 2 Ekspresyonu
Fare
İnsan
KÖK HÜCRE PROLİFERASYONU VE DİFERANSİYASYONU SIRASINDA VE EŞEY
HÜCRELERDEN EKSPRESE EDİLEN PIWIL2 İLİŞKİLİ GENLER
Gene
Function
Referance
Tbca
Early meiotic gene in differentiating spermatogonia known to be
upregulated by the kit ligand.
Rossi et al., 2008
IGF2AS
Insulin-like growth factor 2 expressed in testicular seminomas
Stier et al., 2006
MAP3K10
(MLK2)
Expression of mixed lineage kinase 2 in germ cells of the rat testis.
Phelan et al., 1999
TEC
High expression of the tec gene product in murine testicular germ
cells.
Kazama et al.,
1996
TBx6
Mouse T-Box gene implicated in paraxial mesoderm formation at
gastrulation.
Chapman et al.,
1996
CDH10
(cadherin10)
Plays a role in the regionalization of the chicken embryonic
central nervous system and in the embryonic zebrafish.
Fushimi et al.,
1997; Liu et al.,
2006
MEG3
Imprinted gene that is expressed in day-9.5 mouse fetuses.
Miki et al., 2004
CSF3
Involved in human mesenchymal stem cell differentiation.
Chou et al., 2008
EPHA5
Role in mouse neocortex development.
Yun et al., 2003
EPC1
Enhancer of polycomb1, a homeodomain only protein-binding
partner, induces skeletal muscle differentiation.
Kee et al., 2007
FGF3
Role in embryonic development, for instance of the inner ear.
Zelarayan et al.,
2007
GH1
Role in breast development.
Wagner et al.,
2007
HoxA6
Involved in hematopoietic stem cell proliferation and self-renewal
Dickson et al.,
2009
İnsan Kanser dokularında Piwil2 ekspresyonu
A. MDA-MB-231
B. C. D. Ductal invasive breast carcinoma
E. Ductal carcinoma in situ
F. Normal breast tissue
G. teratoma,testis.
H. negative control, (only 2nd Ab).
I. germ cell tumor.
J. teratoma,seißbein
K. dysgerminous, ovary.
L. teratoma, ovary.
M. adenocarcinoma, colon.
N. O. T. Gastrointestinal, stromal tumor
P. kidney cell carcinoma.
Q. MMMT, endometrium.
R. stromacarcinoma, endometrium.
S. adenocarcinoma, endometrium.
Table 1. Expression of Piwil2 protein in breast cancer
Score
Total
0
+1
+2
+3
Benign
25% (2)
25% (2)
50% (4)
0
8
In situ
19% (3)
56% (9)
19% (3)
6% (1)
16
Invasive
10% (13)
40% (50)
37% (46)
13% (17)
125
B
Colon
Peripheral blood
leukocyte
Small intestine
Ovary
Testis
Prostate
Thymus
Spleen
A
Testis
MDA-MB-231
MCF12A
9.5 kb
7.5 kb
4.4 kb
Piwil2
2.4 kb
1.4 kb
Fibroadenoma
Ductal carcinoma Lobular carcinoma
β-actin
C
1
2
3
4
5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16
17 18 19
20
21 22
Piwil2
Gapdh
D
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
15
Piwil2
Gapdh
A
B
C
SC
MCF7
C
MDA-MB-231 Liver Testis
SC
C
Piwil2
Gapdh
SC
C
E
% Piwil2 + Cells
D
100
86
50
12
0
SC
C
Piwil2+
Piwil2 : Stat3/Bcl-X yolağındaki moleküllleri aktive eder
Piwil2 : eksprese eden hücreler farede tümör oluşumuna yol açar.
EÜ. GENOM VE KÖK HÜCRE MERKEZİNDE
KÖK HÜCRE VE PIWIL2 İLE İLGİLİ YÜRÜTÜLEN ÇALIŞMALAR
İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK
HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI”
Amaç: Kök hücre proteini Piwil 2’nin meme kanseri kök hücreleri
üzerindeki rolünün araştırılarak erken teşhis için Piwil2 ilişkili ve
kök hücre temelli yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi.
Materyal &Metod: Meme epitel hücrelerinin kanser kök
hücrelerine transformasyonunda kanseröz ve non-kanseröz
meme epitel hücre kültürü kullanıldı.
Bu amaçla;
ve
(kanseröz meme epitelyal hücre hatları)
ve
(normal meme epitelyal hücre hatları)
İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK
HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI”
Metod:
1- Stabil hücre kültürleri oluşturma
MCF7 ve MDA-MB-231
MCF12A ve MCF10
2-Transfeksiyon
Piwil2 kodlayan geni taşıyan plazmidle
vasıtasıyla hücrelerin transfekte edilmesi
İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK
HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI”
3- RNA İzolasyonu ve RT-PCR Analizi
Kontrol hücrelerden ve transfekte edilen hücrelerden RNA izolasyonu ve
gibi kök hücre spesifik markerlara RT-PCR ile bakılması
4- İmmunositokimya
Transfekte edilen hücrelerde Piwil2, Oct4 ve Nanog için immunboyama
(monoclonal anti-Piwil2 antibody, polyclonal anti-Oct4 and anti-Nanog
antibodies).
5- Tümorojenik analiz
Proliferasyon analizi ve apoptozis analizi-in vitro
in vivo tümor oluşumu (SCID Mouse)
İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK
HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI”
RT-PCR
MCF7 hücre kültürü
Kültür ve Transfeksiyon
Bulgular
HÜCRE ADI
PWİLL/GAPDH
BCL-XL/GAPDH
CyclinD1/GAPDH
STAT3/GAPDH
MCF12A-wt
0,95
0,92
1,03
0,85
MCF12A-TR-L300
10,95 ↑
1,2
3,45 ↑
1,66 ↑
Transfekte ve wild type hücrelerde Piwil2 ekspresyon düzeyleri
(over expression)
MCF12A-TR-L200
6,85 ↑
(over expression)
0,35
(over expression)
2,66 ↑
1,78 ↑
(over expression)
Transfekte ve wild type hücrelerde Nanog ekspresyon düzeyleri
HÜCRE ADI
PWİLL/B.ACT
BCL-XL/B.ACT
CyclinD1/B.ACT
STAT3/B.ACT
MCF12A-wt
0,86
0,83
0,93
0,85
4,82 ↑
2,33 ↑
MCF12A-TR-L300
15,31 ↑
1,406
(over expression)
MCF12A-TR-L200
5,65 ↑
(over expression)
Transfekte ve wild type hücrelerde Oct4 ekspresyon düzeyleri
(over expression)
0,23
2,19 ↑
(over expression)
1,41 ↑
MCF7 tr. piwil
MCF12A tr. piwil
MDA-MB-231
İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK
HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI”
İmmunositokimya

Sonuç
Piwil2 ekspresyonu transfekte
hücrelerde diğerlerine göre çok
daha
yüksek
bulundu.
Bu
hücrelerde kök hücre markerları
immunboyama
ve
PCR
ile
saptandı.
Piwil2’nin
normal
epitel
hücrelerinin
kanser
kök
hücrelerine transformasyonunda
rolü olduğu kanısına varıldı.
İNSAN MEME EPİTEL HÜCRELERİNİN, MEME KANSERİ KÖK
HÜCRELERİNE TRANSİSYONUNDA PİWİL2 ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI”
NOD/SCID Model’in gelişmesi
 Nude (atimik): T hücrelerinden yoksun
 SCID : B ve T hücrelerinden yoksun
 NOD : NK hücreleri, makrofaj ve kompleman
aktivasyonundan yoksun
İNSAN MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİNİN KANSER KÖK
HÜCRELERİNE DÖNÜŞÜMÜNDE PİWİL2'NİN ROLÜ
Amaç: Bu çalışma ile MKH’leri bir kök hücre proteini olan Piwil2 vasıtasıyla
yeniden programlanmış mezenkimal kanser kök hücrelerine
dönüşmesinde rol oynayan moleküler ve hücresel yolların aydınlatılması
amaçlanmıştır.
Materyal& Metod:
PROSTAT KANSERİ KÖK HÜCRELERİNDE PİWİL2’NİN ROLÜ”
• Amaç: Prostat kanserinde
Piwil2 rolünün
araştırılarak, prostat
kanserinde ilgili proteinin
erken tanıda kullanılması
ve kök hücre temelli
tedavi yaklaşımlarının
oluşturulması
• Materyal&Metod:
- LnCap hücre hattı
University of Newcastle
Jae Ho Lee
Rachael Brooker
Elda Latif
Vaseleios Floros
Mosin Wahid
Sari Al-Hasan
Mehdi Amirrassouli
Emma Fairhall
Hussain Behbahani
Shabnam Thahina
He Dawei
Ximbo Xu
Shuo Huang
Christian Mueller
Ian Dimmick
NIGEB
Reza Soleimanpour
Maryam Kabir Salmani
Maryam Shahali
Tehran University
of Medical Sciences
Said Amanpour
Mohamad Vasaei
Erciyes University
Mustafa Cetin
Yusuf Ozkul
Servet Ozcan
Gokcen Dinc
Fahretin Kelestimur
IFADO
University of Dortmund
Jan Hengstler
Center of Gynaecology
University of Goettingen
Thomas Harwighorst
NHS Newcastle
Robert Pickard
Kevin McLeny
Department of Pathology
University of Goettingen
Stephan Schweyer
University of Göttingen
Institute of Human Genetics:
Cornelia Jung
Dorothea Schuette
Wolfgang Engel
Northern Institute of Cancer Research
Newcastle
Craig Robson
Tom Leannard
Rakesh Heer
Department of Experimental Oncology
University of Alberta
Fereidoon Bushehri
This study was supported by:
• University of Erciyes& GENKOK
• University of Newcastle
• ONE North East
• BBSRC
• DFG
• University of Goettingen
Merkez bünyesinde GMP şartlarında Kök Hücre, GMP şartlarında Gen Tedavi, GMP
şartlarında Kordon Kanı Bankacılığı, Genom, Proteomiks, Moleküler Mikrobiyoloji,
Transgenik-Scid ve Nude Mause Üniteleri, Bitki Biyoteknolojisi, Bitki Doku Kültür
Laboratuarları, Görünteleme Merkezi, Biyosensör, Biomateryal ile Bioinformatik
ünitelerini içeren toplam 13 alt üniteden oluşmaktadır
MOU ANLAŞMASI YAPILAN MERKEZLER
University of Palmero, Italy
University in Naples, Italy
University of Nice, France
University of Cologne , Germany
Szechenyi Istvan University, Hungary
Fontys University of Applied Sciences, The Netherlands
State University of Nakhchivan, Azerbaijan
University of Tehran, Iran
BGI ( Beijing Genome Instuty ), ÇİN
University of Goettingen
Northern Institute of Cancer ResearchNewcastle
Beni dinlediğiniz için teşekkür ederim…..
Download