vektörler - AVES - İstanbul Üniversitesi
advertisement
VEKTÖRLER Halime Nebioğlu İstanbul Üniversitesi Gen klonlamasında kullanılan aracı moleküllere vektör denir. Vektörler konakçı organizmada, konakçı organizmadan bağımsız olarak replikasyon (çoğalma) gösterirler. BAŞLICA VEKTÖRLER Plazmidler Bakteriyofajlar Cosmidler Bakteri yapay kromozomları (BAC) P1 kökenli yapay kromozomlar (PAC) Maya yapay kromozomları (YAC) Memeli yapay kromozomları (MAC) İnsan yapay kromozomları (HAC) Plazmidler Bakteri DNA’sı harici kendi kendien replike olabilen minikromozomlardır. Doğal olarak bulunan plazmitler büyük ve kullanışsız olduklarından, bunların yerine in vitro ortamda amacına yönlik olarak hazırlanan yapay plazmid vektörler kullanılmaktadır. Üzerlerinde ampiciline, tetrasiklin, kanamisin gibi antibiyotiklere karşı direnç genleri taşırlar. Bunlar seleksiyonda önemli fonksiyonu olan marker genlerdir. Plazmid vektör 10 kb yabancı DNA alabilir. Kullanılan ilk plazmid vektör pBR322 olarak adlandırılmıştır. Bu vektör 4361 bp içerir. Shuttle (mekik) plazmit vektörler: Prokaryotik promotor taşıyan ekspresyon vektörlerine, ökaryotiklere ait bir promotor da ilave edilirse, bu tarzda hazırlanan vektör hem prokaryotik ve hem de ökaryotik mikroorganizmalarda replike olabilir (bifonksiyonel plazmitler). Bakteriyofajlar Faj’lar bakteriyi enfekte eden virüslerdir. Fajların bazıları, kendi konakçılarında lizis meydana getirmelerine karşın, bir kısmı da bakteri içinde bulunduğu halde herhangi bir zararlı etkide bulunmazlar (Örn: E.coli ’ye ait lambda fajı). Bu tür fajlar bakterinin genomu ile birleşir, onun bir devamı haline gelir, onunla birlikte eş zamanlı olarak replike olur ve her hücre bölünmesi sırasında da, bakteri DNA’sı ile birlikte kardeş hücreye aktarılır. Faj DNA’sı E. coli ’ye girdikten sonra başlıca 2 replikasyon formu gösterir. Bunlar litik ve lijojenik formlardır. Lambda fajının orta bölgesi, bakteri içinde litik bir üreme için gerekli değildir. Bu bölge, başka bir gen ile yer değiştirebilir. Yani, fajın ortası çıkarılarak buraya yabancı gen aktarılabilir. Böyle bir değişme de fajda zararlı bir etki yaratmaz. Fajın orta bölgesi restriksiyon endonükleaz enzimi ile iki yerinden kesilerek orta segment çıkarılır, buraya yaklaşık aynı boyda, yabancı gen taşıyan segment (aynı RE ile kesilmiş) fajın orta kısmına yerleştirilir. Sonra, paketleme enzimi yardımı ile faj başlığı içine paketlenir ve buradan da başka bir E. coli ’ye transfer edilir. Böylece, yabancı bir gen, faj vektör yardımı ile bakteriye aktarılmış olur. Bakteriofajlar plasmidler gibi antibiyotiğe karşı direnç geni taşımazlar. Lambda bakteriyofajı 50 kb uzunluğundadır ve 20 kb yabancı DNA bu vektörlere sokulabilmektedir. Cosmidler Kosmid vektörler, bir bakteriye ait ve replikasyon orijin bölgesine sahip plasmidle, buna birleştirilmiş lambda fajı yapışkan ucundan (cos, cohesive ends) oluşturulmuşlardır (hibrit vektörler). Tek cos bölgeli kosmid vektörler: Bu vektörler için lambda fajının lineer faj DNA’sındaki cos bölgeleri RE’lerle kesilerek çıkarılır. Bunlar, pBR322 plasmidinin tetrasiklin geni içine integre edilir ve böylece tek bir cos bölgesine sahip kosmid vektör elde edilir. Böyle bir kosmid yaklaşık 6 kb uzunlukta olup, yapısında plasmide ait replikasyon orijini (RO) ,ampr geni ve lambda fajının cos bölgesi bulunur. Bu tarzda hazırlanan kosmid yaklaşık 35-40 kb uzunlukta yabancı bir geni kabul edebilir ve aktarabilir. Çift cos bölgeli kosmid vektörler: İki cos bölgesine ve iki markere (ampr, kanr) sahip vektörlerdir. Kosmidler iki RE ile aynı anda kesildiğinde iki lineer parça elde edilir ve her birinde bir cos bölgesi ve bir marker bulunur. Yabancı gen DNA’sı, iki cos bölgesi arasına integre edilir. diğer işlemler aynen tek cos bölgeli kosmidde olduğu gibi yürütülür(Örn:pLFR-5 kosmidi, iki COS bölgesi içerir). Mekik (shuttle) kosmid vektörler: Bu tarzda dizaynı yapılan vektörlerde cos bölgeleri ve markerleri yanı sıra prokaryotik ve ökaryotik hücrelere ait genetik DNA sekansları da bulunur. Bunlar da 35-40 kb’lık yabancı DNA’yı kabul edebilir ve transferini sağlayabilir. Bakteri yapay kromozomu (BAC) Farklı türlerden alınan 100,000 ila 200,000 baz büyüklüğünde DNA parçalarının bakteride klonlanması ile olur. Klonlandığı zaman hücre içinde birçok kopyası olur. BAC vektörleri doğal olarak var olan büyük bakteri plazmidi F-faktör üzerine kurulurlar. BAC vektörleri büyük DNA fragmentlerini klonlamada ve özellikle büyük genomların sıradizilerinin eldesinde kullanılırlar. BAC vektörü 300kb’a kadar yabancı DNA’yı içine alabilir. P1 kökenli yapay kromozom(PAC) Maya yapay kromozomu (YAC) • Çok büyük DNA (200-500 kb veya 1–2 Mb ) fragmentlerini kabul edebilir. • Bir kromozomun önemli öğeleri olan telomerleri, sentromeri ve replikasyon başlangıç noktasını içerirler. Oldukça kararlıdır ve insan genomunun haritalanmasında, genomik kütüphanelerin yapılmasında etkili bir şekilde kullanılır. Memeli yapay kromozomu (MAC) Memeli yapay kromozomları, kromozomların fonksiyonel bölgelerini (sentromer,telomer,replikasyon orijini) taşıyan ve hücreden bağımsız olarak çoğalabilen moleküllerdir.MAC yüzlerce kb büyüklüğünde genomik DNA taşıyabilir. MAC oluşumu en yakın örnek olan YAC’a göre çok daha zordur.Çünkü memeli telomeri maya telomerinden 10-100 kat; memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000 kat daha büyüktür.Memeli sentromer ve telomer dizilerinin çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu oluşturulmasını zorlaştırır. Bunlar hem E. Coli, hem de ökaryot alıcıda çoğalan shuttle vektörlerdir. Virüsten gelen ökaryotik replikasyon orjini taşırlar (SV40). Klonlanan genin promoter dizisi ve transkripsiyon terminasyon sinyali ökaryotik olmalıdır. İnsan yapay kromozomu (HAC) HAC'lar, insan DNA dizileri, sentromer dizisi, telomer dizisi ve DNA replikasyon noktasının olması ile gen tedavisi için avantajları olan bir vektördür. Daha büyük insan DNA'sini taşıması; stabiliteyi sağlayacak sentromer dizisinin olmasi; kromozom yapısının stabilitesini ve degradasyonunu önleyen telomer dizilerinin olmasi; DNA replikasyon noktası ile bir hücre siklusundan diğerine normal S fazında replikasyonu düzenleyebilmesi avantajlarıdır. 6-10 megabaz uzunluğundadır. Transferi, liposomlar veya reseptörler aracılığı ile veya in vivo olarak da oluşturulabilir. Bitkilere Gen Transferinde Kullanılan Vektörler Ti plasmidler Bitki Ti plasmidler gibi diğer bazı klonlama vektörleri bulunmaktadır. “Co-integrative” Vektörler Bu vektör sisteminde sınır bölgeleri kalacak Ti plazmidinin T-DNA bölgesinin büyük bölümü çıkartılarak yerine, küçük bir E.coli klonlama plazmidine (alıcı) homolog yapıda bir DNA parçası yerleştirilmektedir. Bitkilere aktarılacak olan gen, işaret geni ile birlikte önce bu aracı plazmidlere E.coli içerisine klonlanırlar. Aracı plazmidler alıcı vektörün bulunduğu A. tumefaciens’e aktarıldıklarında, tek homolog rekombinasyon ile Ti plazmidinin T-DNA bölgesine entegre olurlar. “Co-integrative” vektörlerin özellikleri Bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolayca klonlanabileceği klonlama bölgesi E.coli ve Agrobacterium’da aktif olan seçici bakteriyel işaret geni Bitkide işlev yapabilen seçici işaret geni E. coli içerisinde fonksiyonel olan, ancak Agrobacterium’da etkili olmayan bir replikasyon orijini “Binary” Vektörler Vir bölgesinin trans-hareket özelliğinden yararlanarak bu vektör sistemleri geliştirilmiştir. Agrobacterium içerisinde birbirinden bağımsız olarak replike olan iki plazmidten oluşmaktadır. T-DNA bölgesinin tamamının çıkartıldığı ve yalnızca vir bölgesini taşıyan Ti plazmidi T-DNA sınır bölgeleri içinde bitkilere aktarılmak istenen genleri taşıyan, manipulasyonu kolay olan küçük ve hareketli bir plazmidtir. “Binary” Vektörlerin Özellikleri: T-DNA içerisinde bulunan ve bitkilere aktarılmak istenen genlerin kolaylıkla klonlanabileceği bir klonlama bölgesi Hem E.coli hem de Agrobacterium’da fonksiyonel olan replikasyon orijini E.coli ve Agrobacterium’da seçici bakteriyel işaret geni Bitkide işlev yapan seçici işaret geni Bitki Viral Vektörleri Geminivirüs TMV (Tütün Mozaik Virüsü) CaMV (Karnabahar Mozaik Virüsü) Viral vektörlerin ekspresyonu bitkilerdeki yabancı gen sekanslarını ve protein ürünlerini ortaya çıkarır. Bu sayede bitkilerdeki rekombinant proteiner bitki ve hayvan hastalıklarının kontrolünde yararlı olabilir. Geminivirüs Geminivirüsler dairesel tek iplikli DNA genomu ile çok küçük bitki virüsleridir. Geminivirüsler bitkilerdeki yabancı gen amplifikasyonları için tek elverişli replikasyon vektörü gibi kullanılırlar. Doku kültürü teknikleri kullanılarak, monokotil ve dikotil türlerini içine alan geniş bir dizi konakçı içinde gen ekspresyonu düzeninin analizi için uydurulmuşlardır. CaMV (Karnabahar Mozaik Virüsü) CaMV küçük izometrik bitki virüsleri grubundan dairesel çift iplikli genomlu bir virüstür. Bitkiler için potansiyel genetik vektör olarak kullanımlarından dolayı önemli bir yere sahiptirler. CaMV taneciklerinden gelen DNA,hassas yaprakların yüzeyine sürtündüğü zaman bitkileri enfekte edebilir ve virüs üretimine neden olabilir. Ayrıca, birçok CaMV soyunun bütün kromozomu bakteri konakçılarına plasmid ve phage lamda vektörleri ile yayılabilir. Bunlar bitkileri enfekte etmede başarıyla kullanılmışlardır. CaMV kullanılarak bitkide yabancı DNA’nın üremesi sağlanır. TMV (Tütün Mozaik Virüsü)
