Akdeniz yöresinde yaşayan, kistik fibrosiz tanısı almış pediatrik

Yrd.Doç.Dr. Ö. Alper
Proje Adı: Akdeniz yöresinde yaşayan, kistik fibrosiz tanısı almış
pediatrik olgular ile infertil erkek ve dişi bireylerde CFTR
geninin moleküler düzeyde araştırılması
Projenin Türkçe Özeti
Kistik fibrosiz hastalığı ekzokrin bezlerin multisistemik hastalığı olup, 1/25 taşıyıcı
sıklığı ve 1/2000-3500 canlı doğum insidansı ile, beyaz ırkta otozomal resesif geçiş
gösteren en yaygın ölümcül seyreden genetik hastalıklardan birisidir. Kistik fibrosiz
hastalığına neden olan gen, kistik fibrosiz transmembran regülatör proteinin (CFTR)
sentezinden sorumludur. Bu gen 7 nolu kromozomun uzun kolunda (7q31) bulunmakta
ve 27 ekzon içermektedir. Bu gendeki mutasyonlar birçok organ tutulumlu klinik
bulgular veren hastalığın ortaya çıkmasına neden olmaktadır.
Akraba evliliğinin çok sık olduğu (%35.7) yöremizde kistik fibrosiz tanısı konmuş
çok az hasta bulunmaktadır. Ayrıca, yetişkin erkeklerde spermi taşıyan vas deferens
kanallarının oluşumunu ve dişilerde uterus ve vajinanın gelişimini etkileyen bu genin
yokluğu veya mutasyonu bu bireylerde infertiliteye neden olmaktadır.
Bu üç farklı grubdaki hastaların kan örneklerinden elde edilecek genomik DNA'
larda
en sık gözlenen 36 mutasyon taranacak, mutasyonları olmayan bireylerin
örneklerinde TTGE yöntemi uygulanarak tüm ekzonlar taranacaktır. TTGE analizinde
farklı bant paterni gösteren bireylerin örnekleri dizi analizine alınarak mutasyonları yada
polimorfizmleri teyit edilecektir. TTGE analizinde farklı bant paterni göstermeyen
örnekler ise en sıklıkla mutasyona rastlanılan ekzonlar için dizi analizine alınacaktır.
Böylece, yöremizde CF hastalığının görülme sıklığı ve prenatal tanısı gerçekleştirilirken,
infertil erkek ve dişi bireylerde CFTR gen mutasyonları ile ilişkisi belirlenebilecek ve
ailelere genetik danışma verilecektir. Ayrıca, çalışma kapsamına alınan hastaların
genomik materyallerinin saklanımı ile ileri düzeyde genomik ve fonksiyonel genomik
çalışmalara altyapının oluşturulması hedeflenmiştir.
Yrd.Doç.Dr. Ö. Alper
Projenin İngilizce Özeti
Cystic fibrosis (CF) is a multisystemic disorder of exocrine glands, which is represented
as the most common autosomal recessive lethal disorder of white race with an incidence of
1/2000-3500 in live births and a heterozygosity prevalence of 1/25 among whites. Cystic
fibrosis transmembrane regulator gene (CFTR) is responsible for cystic fibrosis disease.
CFTR gene is located on the long arm of chromosome 7 (7q31) and has 27 exons. The
mutations in the CFTR gene are causing a heterogeneous clinical phenotype.
As the consanguinity rate is so high in our Mediterranean region (35.7%); there isnot
much detected CF patients. Also, the absence of CFTR protein or the presence of CFTR
mutations are playing an important role in the infertility status of males with the congenital
bilateral absence of vas deferens (CBAVD) and females with the congenital absence of uterus
and vagina (CAUV).
As a first step, genomic DNA samples of all the three group of patients will be screened
with the use of CFTR mutation panel set for 36 mutations, then the negative ones will be
taken to temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) analysis for the whole
CFTR gene screening. Sequencing analysis will be done both for to confirm the mutations or
polymorphisms after getting the differential band patterns and hot exons for TTGE negative
samples. As a result, the prevalence of cystic fibrosis disease in our Mediterranean region
will be detected and be helpful for the prenatal diagnosis. Also, CFTR gene mutation
spectrum and the correlations will be known by screening both infertile males and females,
which will be important for genetic counseling. Our research project will give us a chance to
build up a structure for to work on both advanced genomic and functional genomic studies in
the cystic fibrosis disease.
Yrd.Doç.Dr. Ö. Alper
Malzeme Listesi
Malzemeler
Miktar (adet)
K3EDTA'lı tüp
15 ml falkon tüp
Saklama kapları (96 tüplük)
PCR Purifikasyon kolonları
DNA dizi analiz kiti
Big Dye sekans kiti ::::
Sekans enjektörü
Mikropipet seti: 1-10 ul multipipet
P 1000 Mikrotip
P 100 Mikrotip
P 10 Mikrotip
PCR tüp 8li strip düz kapaklı (200ul)
Taq DNA polimeraz (500 ünite),
dNTP karışımı (her biri 100mMlık 200er ul),
Ependorf tüpler (1.5ml),
Ter testi ölçüm kiti
100
1000
10
250
1
1
1
1
1
2
2
1000
1
5
2000
100
**** 30 çift primer (her çift ortalama 25-30mer),
***** CFTR 36 mutasyon tarama paneli; INNO-LİPA- Innogenetics
TTGE analiz malzemeleri:
Akrilamid/bisakrilamid solüsyonu %30;37.5:1,500 ml: BioRad-161-0158)
Formamid,
Üre
Trizma baz
TEMED (BioRad; 161-0800)
Amonuyum persülfat (BioRad; 161-0700)
Sukroz (Merck 107653) GELDİİİİ
Dikey elektroforez aleti (DCode system, BioRad- 170-9090)