protein elektroforez
advertisement
PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ Proteinler hücrelerde en fazla bulunan makromoleküller olup; kuru ağırlığın yaklaşık %50’sini teşkil etmektedirler. Proteinlerin primer yapısı DNA molekülü tarafından denetlenmektedir. Hücre nükleusunda binlerce gen bulunmakta ve bu genlerin ürünü olarak binlerce çeşit protein meydana getirilmekte ve her bir protein ise spesifik bir fonksiyon görmektedir. PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ Fonksiyonu ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun bütün proteinler 20 standart amino asitten meydana gelmiştir. Amino asitlerin gerçek bir biyolojik aktivitesi olmamasına rağmen polipeptid zincirlerine yapıtaşları olarak girdikten sonra oluşturdukları proteinlerin bir kısmı enzim aktivitesine, bir kısmı hormon aktivitesine, bir kısmı antikor aktivitesine, diğer bir kısmı ise yapısal fonksiyon görmek üzere özelleşmiştir. PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ Proteinlerin saflaştırılmasında çok çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bunlar: Diyaliz, ultrafiltrasyon, jel filtrasyonu, elektroforez, iyon-değişim kromatografisi, affinite kromatografisi ve densite gradient santrifügasyon olarak sıralanabilir. Elektroforez Poliakrilamid ve diğer katkı maddeleri, cam tüpler içerisine veya iki cam levha arasına konulur ve polimerize edilir. Cam tüplerin ve tabaka halindeki camın altı ve üstü bir tampon çözelti ile temas ettirilir. Alt ve üstteki tampon çözeltiler içinde ise pozitif ve negatif elektrotlar bulunur. Tüplerin üstünden ve iki cam levha arasındaki poliakrilamid tabakanın üstünden protein çözeltisi ilave edilir. Elektroforez Pozitif ve negatif elektrotlar bir güç kaynağına bağlanır. Devreden belirli sürede belirli amperdeki akım geçirilir. Proteinler molekül ağırlıklarına ve taşıdıkları elektrik yüklerine göre bu elektriki alanda hareket etmektedirler. Sonunda protein molekülleri birbirinden ayrılmaktadır. Protein boyaması yapıldıktan sonra protein bantları görünür hale gelir. Bu bantları keserek, jeli ezerek her banttaki proteini oldukça saf halde elde etmek mümkündür. Protein Miktar Tayini Protein Belirlenmesi Örneklerin protein konsantrasyonları belirlenir. Bu amaçla farklı metotlardan yararlanılır. Örneğin, Bradford metodu, Lowry metodu, Kjeldahl metodu gibi. Protein miktarı örnekte belirlendikten sonra bu belirlenen oranlara göre örnek hazırlanır. Hangi örnek analiz edilecekse o örnekten belli bir miktar alınır. Daha sonra örnek tamponu içerisine ilave edilir. Örnek tamponu: -Tris base 6g -SDS 2g -Brom fenol mavisi 0.1 g -Gliserol 10 ml -----------------------------------1M HCl ile p H 6.8 ‘e ayarlanır. 5 ml beta merkapta etanol ilave edilir.Seviye 100 ml’ e tamamlanır. SDS-poliakrilamid jel elektroforez çözeltileri ve hazırlanması 1) Akrilamid/Bis Stok Çözeltisi (% 30 T, % 2.67 C) Akrilamid 29.2 g N,N’-metilen-bis-akrilamid 0.8 g Distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Filtre edilir ve renkli şişede +4C’de saklanır. Bu koşullarda 30 gün içinde kullanılmalıdır. 2) Ayrıştırma (Alt) Jel Stok Tamponu (1.5M Tris-HCl, pH:8.8) Trizma base 18.165 g Distile su 75.00 ml HCl ile pH:8.8 ayarlanır.Distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Renkli şişede +4C’de saklanır. 3) Üst Jel Stok Tamponu (1 M Tris-HCl, pH:6.8) Trizma base 12.11 g Distile su 75.00 ml HCl ile pH:6.8 ayarlanır.Distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Renkli şişede +4C’de saklanır. 4) SDS Stok Çözeltisi (% 10) : 10 g SDS 60 mL distile suda çözülüp, 100 mL’ye tamamlanır. 5) % 10 Amonyum Persülfat (APS) : 100 mg APS 1 mL distile suda çözülür. 6) 5x Elektrot (Yürütme) Tamponu (25 mM Tris, 192 mM Glisin) Trizma base 15,1 g Glisin 94,0 g %10 SDS 50 ml Distile su ile 1 litreye tamamlanır. +4C’de saklanır. Seyreltik çözelti elektroforetik yürütme için kullanılır. Kullanılırken 5 katı seyreltilerek kullanılır. • 7) Ayrıştırma Jeli (% 12) Hazırlanması ( pH:8.8) (10 ml lik) • • • • • • • • • Akrilamid/bis stok çözeltisi (% 30 T, % 2.67 C) 4 mL Distile su 3.3 mL Ayrıştırma jel stok tamponu (1.5M Tris-HCl, pH:8.8) 2.50 mL SDS Stok Çözeltisi (% 10) 0.1 mL % 10 APS* 0.1 ml TEMED 0.004 mL *APS çözeltisi her zaman taze olarak hazırlanmalıdır. Hazırlanan çözelti hemen çalkalanmalı ve elektroforez camları arasına dökülmelidir. 45 dakika beklenerek jelin polimerleşmesi beklenmeli daha sonra üst jel hazırlanarak dökülmelidir. 8) Üst Jel % 5’lik Hazırlanması (pH 6.8) (5 ml’lik) Akrilamid/bis stok çözeltisi (% 30 T, % 2.67 C) 0.83 mL Distile su 3.4 mL Ayrıştırma jel stok tamponu (1M Tris-HCl, pH:6.8) 0.63 mL SDS Stok Çözeltisi (% 10) 0.05 mL % 10 APS* 0.05 ml TEMED 0.005 mL • • • • • • • SDS-PAJE ile farklı moleküler ağırlıklardaki proteinleri çözmek için kullanılan akrilamidin yüzdesi Farklı Molekül Ağırlık (Da) Aralıkları Kullanılan Akrilamid Yüzdesi (%) 200 000 – 60 000 5.0 120 000 – 30 000 7.5 75 000 – 18 000 10.0 60 000 –15 000 12.5 45 000 – 12 000 15.0 SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAJE) Hazırlanan jel solüsyonu, 0.5 mm kalınlıkta boşluk içeren 10x10 cm boyutundaki iki cam plak arasına dökülür. Üzerine 10 dişli tarak daldırılır. Tarakla açılan kuyucuklara standart moleküler ağırlık çözeltisinden 15 L yüklenir. Yürütme tamponu olarak tankın alt ve üst kısmına SDS’li Tris-Glisin çözeltisi konulur. SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAJE) Ayrıştırma ilk 30 dakika jel başına 10 mA, sonra bromfenol mavisinin jelin tabanına yaklaşık 1 cm kalıncaya kadar jel başına 25 mA sabit akımda gerçekleştirilir. Yürütme işleminin bitiminde iki cam plak arasındaki jel boyama çözeltisine alınır. Boya çözeltisi: 0.25 g Coomassie Brillant Blue R250 90 ml Methanol:H2O (1:1) 10 ml Glacial asetik asit Jellerin Kurutulması ve Değerlendirilmesi Jeller, boyamadan sonra Destaining solüsyonuna konulurlar. Destaining Solüsyonu: -400 ml methanol -100 ml asetik asit -500 ml destile su Fazla boyalarından arındırılan jeller saklanmak üzere kurutulur. Kurutmada, selofan kağıdı kullanılır. Jel, fleksiglas çerçeve üzerine yerleştirilen saf su ile ıslatılmış iki selafon arasına hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilir ve kenarlarına metal kıskaçlar tutturulur. Dolayısıyla jelin kuruması sırasında çatlaması ve parçalanması engellenir. Jeller laboratuvar koşullarında kurutulur. Daha sonra densitometreler yardımıyla görüntülenir veya fotoğrafları çekilir.
