YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü Çevre Mikrobiyolojisi 1

YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
UYGULAMA 7 – MİKROBİYOLOJİDE BOYAMA TEKNİKLERİ: GRAM BOYAMA
1. GİRİŞ
Komplex boyama; iki farklı renkteki boyanın aynı preparat üzerinde belli tekniklerle ve
art arda uygulanması ile gerçekleştirilen bir boyama şeklidir. Komplex boyama
tekniklerinde, hücreler birinci boyayla belli bir renge boyanır. Kullanılan bu ilk boyaya
primer boya adı verilir. Bu işlemin fonksiyonu, rengi tüm hücreye dağıtmaktır. Birinci
boyamayı takiben preparata genellikle bir renk giderme (dekolorizasyon) işlemi
uygulanmaktadır. Dekolorizasyon işlemini takiben uygulanan boyalara genel olarak
karşıt boya adı verilmektedir. Dekolorize olmuş hücreler karşıt boya ile ilk boyanın
renginden farklı bir renge boyanır.
Boyanmış hücreden boyayı uzaklaştıran etil alkol gibi maddelere renk giderici ajan
(dekolorize edici madde ) denilmektedir. Bazı hücreler diğerlerine göre daha kolay
dekolorize olur. Gram boyama ve diğer komplex boyamalarda bakterilerin birbirinden
ayırt edilmesinde dekolorizasyon özelliğinden yararlanılmaktadır.
Komplex boyamaya; gram boyama yöntemi, spor boyama yöntemleri, flegella boyama
yöntemleri, negatif diferansiyel boyama yöntemi (kapsül boyama), yağ boyama
yöntemi gibi yöntemler örnek gösterilebilir. Bu laboratuar dersinde, gram boyama
yöntemi uygulanacaktır.
2. GRAM BOYAMA
Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki
büyük gruba (Gram-pozitif, Gram-negatif) ayırmak için kullanılan empirik bir yöntemdir.
Bu metodu bulan kişi, Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dır. Bu metodu,
1884 yılında, pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae
bakterilerini ayırt edebilmek için geliştirmiştir.
2.1. Gram Boyamasında Etkili Olan Mekanizmalar
Mikroorganizmaların gram boyamasında, bakteri kültürünün yaşı ve bakteri hücre
yapısı ile igili mekanizmalar etkilidir.
Uygulama 7 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Gram Boyama
1
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
I.
Bakteri hücre yapısı
 Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde Gram negatiflere kıyasla oldukça kalın
peptidoglikan
tabaka
mevcuttur.
Bu
nedenle,
aldıkları
boyayı
alkolle
dekolarizasyonda gram negatiflere nazaran daha geç bırakırlar.
 Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde karbonhidratlar, gram negatiflerde
lipidler
fazladır.
Karbonhidratlar
alkolle
dekolarizasyon
esnasında
dehidratasyona (su molekülü açığa çıkar) uğrar. Porlar iyice büzüşür , daralır ve
boya dışarı çıkamaz. Lipitler için ise alkol çözücüdür ve hücre çeperinde olan
porlar daha çok açılacaktır.
 Gram pozitif hücre çeperinde bulunan teikoik asit, bazik boyalarla daha
kuvvetli birleşik oluşmasını sağlar.
 Gram pozitif hücre çeperinde bulunan magnezyum ribonucleatın gram
boyanmada önemli fonksiyonları vardır.
 Bakteri protoplazmasının pH‘sıda önemlidir. Gram pozitiflerdeki protoplazmanın
pH‘sı daha asidiktir.
II.
Bakteri kültürünün yaşı
 Genel olarak yaşlanmış kültürden elde edilen preparat gramla negatif boyanma
eğilimindedir.
Gram boyamada kullanılan değişik boya çözeltileri vardır. Bu boyaların hazırlandığı
çözeltiye göre boyama süresi değişir. (Toz boya distile su içinde hazırlanırsa Kristal
Viole ile boyama 1 dakika iken, amonyum oxalat kullanıldığında kristal viole ile
boyamada 30 saniye yeterli olmaktadır.)
2.2. Gram Boyama Yönteminin Yararları
 Mikroorganizmaları gram pozitif ve gram negatif diye iki ana gruba ayırır.
 Mikroorganizmaların morfolojisi ve dizilimi esas alınarak ön tanı konur. Buna
dayanarak izolasyon için uygun besiyeri seçimi yapılır.
 Örneğin usulüne uygun olup olmadığı hakkında bilgi verir.
Uygulama 7 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Gram Boyama
2
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
 Anaerop mikroorganizma olup olmadığı hakkında bilgi verir. Aeroplarda üreme
yok; fakat mikroskopta polimikrobiyal özellik gözleniyorsa anaerop olduğu
anlaşılır.
3. GRAM POZİTİF VE GRAM NEGATİF BAKTERİLER
Hem gram-pozitif bakterilerin hem de gram-neagit bakterilerin S-tabakası denen ayrı
bir zarları daha vardır. Gram-negatiflerde s-katmanı, dış zara yapışıktır. Grampozitiflerde ise s-katmanı, peptidoglikan tabakasına yapışıktır. Gram-pozitiflerin
kendilerine has bir özellikleri hücre duvarlarında teyikoik asit bulundurmalarıdır.
Lipoteyikoik asit denen, özel teyikoik asit türünün lipid kısmı, peptidoglikan tabakasının
hücreye ¨demirlenmesine¨ yardımcı olur.
Şekil 1- Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteri hücre yapısının karşılaştırılması.
Gram Pozitifler
Gram-pozitif gram boyama prosedüründen geçtikten sonra, mikroskop altında mavisiyah, mor renk alan bakterilerdir. Bu rengin sebebi gram-pozitif bakterilerin hücre
duvarlarının kristal viyole/iyot karışımını tutmasıdır.
 80 nm hücre duvarı
Uygulama 7 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Gram Boyama
3
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
 M protein lipoteikoik asit
 Yoğun çapraz bağlar
 Çapraz bağlar dekolorizasyona dirençli
Gram-Pozitif
bakterilere
Actinobakteria
Bacillus,
Listeria,
Staphylococcus,
Streptococcus, Enterococcus, ve Clostridium familyaları örnek verilebilir.
Gram Negatifler
Gram-negatif bakteriler, Gram boyama prosedürü sırasında kristal viyole boyasını
tutmayan bakterilerdir. Gram-negatif bakteriler dekolorizasyon işleminden sonra mavi
rengi kaybederler ve ikinci boyanın rengini alarak kırmızı-pembe renge boyanırlar.
Gram-negatif bakterilerin pek çoğu patojendir. Yani, insanlarda hastalık yapma
yetisine sahiplerdir. Bu hastalık yapma yetisi, Gram-negatif hücre duvarının bazı
özelliklerinden,
isim
vermek
gerekirse
LPS
(lipopolisakkarit)
içeriğinden
kaynaklanmaktadır. LPS'ler endotoksinlerdir.
 Hücre duvarı ince
 Tek katlı peptidoglikan
 Dış membran LPS’leri peptidoglikana bağlanır
 Lipid
Gram-Negatif bakteri türleri; Escherichia coli, Salmonella, v.b. Enterobacteriaceae,
Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, acetic acid
bacteria, Legionella.
Şekil 2 Gram-pozitif (Bacillus Anthracis)
Şekil 3Gram-negatif (Kokobasil Brucella)
Uygulama 7 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Gram Boyama
4
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı
UYGULAMA
Materyal:

Lam

Lamel

Öze

İğne

Pasteur Pipeti

İmmersiyon Yağı

Etil Alkol

Gram Boyama Seti

Işık mikroskobu
Metot:
Şekil 4- Gram boyama prosedürünün şematik gösterimi.

Preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.

Kristal violet (veya metil violet) solusyonu preparat boyanır ve beklenir.

Alkolle dekolorizasyon işlemi yapılır (alkol renksiz akıncaya dek).

Saf su ile yıkanır.

Safranin (veya eosin, sulu fuchsin) ile boyanır ve beklenir.

Saf su ile yıkanarak boya giderilir.

Kurutma kâğıdında (veya havada) kurutulur.
Uygulama 7 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Gram Boyama
5
YTÜ Çevre Mühendisliği Bölümü
Çevre Mikrobiyolojisi 1 Laboratuarı

İmmersiyon yağı (Sedir yağı) konarak immersiyon objektifi ile mikroskopta
incelenir.

Bu yöntemle mor görülen mikroorganizmalar Gram pozitif ve pembe-kırmızı
görülenler de Gram negatif olarak değerlendirilirler.

Sonuçlar rapora kaydedilir.
Şekil 5- Gram (+) ve Gram (-) bakteri hücresinin boyanmasının şematik gösterimi.
Uygulama 7 - Mikrobiyolojide Boyama Teknikleri: Gram Boyama
6