Virüslerin oluşturduğu sitopatik etki tipleri

3. Bölüme devam
VİRUSLERİN ÜRETİLMELERİ
Viruslar eskiden deney hayvanları ve
embriyolarda üretilirken, artık hücre kültürleri
kullanılabilmektedir.
Hayvan viruslarının üremesi için 3 yöntem:
 Deney hayvanları
 Embriyonlu yumurta
 Hücre kültürleri
Deney Hayvanları
• Bazı viruslar laboratuvar hayvanlarını enfekte eder ve
virusun cinsine ve ya hayvana verilişine göre çeşitli
dokularda hastalık yapar.
• Maymunlarda da insana benzer hastalıklar görülmekte
ancak maymunlar model organizma olarak kullanılamaz.
• Maymunlar daha çok patogenezi incelemek için model
organizma olarak kullanılırlar.
• Virusların üretilmesinde en sık fareler kullanılır.
Çünkü,üremeleri hızlı, kolay ve düşük maliyetlidir. Ancak
farelerin duyarlı olduğu virus spektomu sınırlıdır.
• Virusler için konağın sınırlı olması, virusun kapsid veya zarf
proteinlerine, reseptör varlığına bağlıdır. Ayrıca virusun
üremesi, hücre içinde replike olabilmesi için gerekli
faktörlerin hücre içinde bulunup bulunmaması da
önemlidir.
• Deney hayvanları daha çok ilaç ve aşı denemelerinde test
için kullanılır.
Embriyonlu Yumurta
• Bazı viruslerin incelenmesi, serolojik testler ve
aşı üretiminde kullanılır.
• Daha çok tavuk embriyosu kullanılır, bunun
yanı sıra kaz ve ördek embriyosuda kullanılır.
• Bir tavuk yumurtası 40 C de nemli bir ortamda
embriyonik dönemi 21 günde tamamlar.
• Embriyonun gelişmesi sırasında oluşan
membran ve keselerde virusler çoğaltır.
Embriyonun gelişimi sırasında 4 yolla virus
inokülasyonu yapılabilir:
• Sarı kese ekimi(6-7. günde) : Özellikle kuduz
virusu, riketsiya ve klamidyalar üretilebilir.
• Amniyotik kese ekimi(8-9. gün) : Bazı viruslerin ilk
izolasyonu için kullanılır. Amniyotik kesenin epitel
hücreleri paramiksoviruslerin üremesi için
uygundur.
• Koryoallontaik kese ekimi(9-11. gün)
• Koryoallantoik memran ekimi(11-13. gün) : Bu
keseyi çevreleyen epitel hücrelerinden oluşan
membranda virusler ürerler. Membran yüzeyi ve
kesedeki sıvı miktarının fazla olması önemli bir
avantajdır.
HÜCRE KÜLTÜRLERİ
• Klinik örneklerden virüs izolasyonu, virüslerin üretilmeleri ve
tanımlanmaları, aşı hazırlanması için kullanılır.
• Hücre kültürleri için daha çok hızlı ve kolay üreme yeteneğinde olan
embriyonik, kanser vs. dokuları tercih edilir.
• Hücre kültürü hazırlanması
• Doku parçalara ayrılır
• Proteolik bir enzimle(tripsin,kollajenaz) muamele edilir. Hücreler
ayrılmış olur.
• Zengin sıvı bir vasat içinde cam veya polistren tüplere düz tabanlı
şişelere ya da ‘shell vial’ adı verilen özel tüplere konularak katı
yüzeyde üremeleri sağlanır.
• EMEM adında bir medyum kullanılır. Hücre üremesini artırmak için
%20 oranında fetal dana serumu eklenir.
• Tampon olarak bikarbonat, antibiyotikler, antimikotikler eklenebilir.
• EMEM içinde tüp ve şişelere inoküle edilir .katı yüzeye tutunarak
üremeye başlar. Tek tabakalı monolayer kültür oluşur.
• Primer hücre kültürü oluşmuş olur. Bu kültürden tekrar tripsinojenle
muamele edilip fenotipik ve genotipik özellikleri değişmeden
pasajlama yapılabilir.(diploid hücre kültürü)
Devamlı hücre kültürleri de yapılabilir(cell line) .
Primer ve diploid hücre kültürleri orijinal
konağın fenotipik ve genotipik özelliğini aynen
taşırlar(öploid2n)
devamlı
kültür
taşımaz.(anöploid n )
Hücre kültürleri morfolojik özelliklerine göre;
• Fibroblast benzeri
• Epitel benzeri
• Epiteloid ya da epitelyal olarak ayrılır.
Virüslerin oluşturduğu sitopatik etki tipleri
Litik enfeksiyon oluşturan virüsler hücrede fizyolojik,biyokimyasal,
morfolojik değişikliklere yol açar bu etkilere sitopatik etki(CPE) denir.
1. Piknozis;virüs çoğalması sonunda hücre yuvarlaklaşır, çekirdek
elektron-yoğun hale gelir, hücre parçalanır.
2. Agregasyon;hücreler yuvarlaklaşır, üzüm salkımı haline gelir.
3. Sinsitya-füzyon ve dev hücre oluşumu;virüsler füzyon proteinleri
yardımıyla hücreler arasında köprü oluşturur.(sinsitya) birçok
hücre biraraya gelir çok çekirdekli dev hücreler oluşur. Bunu
zarflı virüsler yapar.
4. Minimal etki; virüsün yaptığı etki mikroskopta görünmez, indirek
yöntemlerle varlığı saptanır. Hemadsorbsiyon(hücre yüzeyinde
virüse özgül hemaglütinin antijenlerinin belirlenmesi ve
eritrositlerin hücre yüzeyine adsorbe olması) ve viral
interferenstir (CPE yapan başka bir virüs verilir hücreye girişinin
önlenmesi CPE etkisini oluşturmaması esasına dayanır.)en çok
kullanılan iki yöntemdir.
5. İnklüzyon cisimciği oluşumu; inklüzyon cisimcikleri, viral
replikasyon ürünlerinin biraraya toplandığı bölgelerdir. Histolojik
boyalarla ışık mikroskobunda görülebilir.
Virüslerin tek basamaklı üreme eğrisi
Bir döngü virüs üremesi deneyi yapılır. Tek tabaka
halinde üremiş bilinen sayıdaki hücreleri enfekte
edecek miktarda virüs ekimi yapılır. Her hücre başına
10 enfektif virüs partikülü verilmektedir.
Hücrelerin virüs ile enfekte edilmesinden sonra, belirli
zamanlarda hem hücre içi hem de hücre dışı
enfeksiyoz virüs ölçümü yapılarak alınan değerlerle
üreme eğrisi oluşturur.
Eklips dönemi; adsorbe ve penetre olan virüsler
kapsidi ve zarfı soyulmuş olduğundan, enfeksiyoz
olamayn özelliktedir bu yüzden çok az miktarda virüs
saptanır.
Latent dönem; enfeksiyon başlangıcından ilk hücre
dışı virüsün saptanmasına kadar geçen süre
VİRÜSLERİN TİTRASYON YÖNTEMLERİ
Elektron mikroskobunda enfektif virüsle (fiziksel virüs) enfektif olmayan eksik virüs
ayırt edilemez. Bunun için aşağıdaki yöntemler kullanılır;
Toplam virüs miktarının saptanması
• Elektron mikroskobisi(EM);saflaştırılmış yüksek derecede konsantre virüs
partiküllerinin ml deki sayısı EM ile saptanabilmektedir.yapay virüs partikülleryle
virüs süspansiyonu karıştırılır. Virüs sayısı yapay virüs sayısıyla oranlanarak gerçek
sayı bulunur.
• Hemaglütinasyon(HA) testi;hem enfeksiyoz olan hem olmayan virüsler
hemaglutinasyon yapabilirler. Seri sulandırma yapılan virüslere eritrositler eklenir
ve HA oluşumu izlenir. HA oluşturan son virüs sulandırımındaki virüs miktarına, 1
HA ünitesi denir.
Enfektif virüs miktarının saptanması
• Plak yöntemi; enfektif virüsün tek bir hücreye girmesi , çevredeki hücreleri enfekte
etmesi, bu bölgedeki hücrelerin ölmesiyle zon oluşması yöntemidir. Tek bir virüsün
bir plak oluşturduğu varsayılır. Enfektif virüs partikülü sayısı plak oluşturan ünite
olarak ifade edilir. Enfekte olan hücreler ölü etraftaki hücreler canlıdır vital boyalar
kullanılarak plak zonlar tespit edilir.( noble agar kullanılarak etraftaki hücrelerin
enfekte edilmesi engellenir.)
• Doku kültürü enfektif doz-50 tayini ; ekim yapılan hücre kültürlerinin %50 sinde
sitopatik etki oluşturan en yüksek virüs sulandırımı TCID 50 olarak kabul edilir. Bu
yöntemin esası, doku kültürlerinde enfeksiyon oluşturabilen virüslerin en yüksek
dilisyonu saptamaktır.
• Pok (pock) yöntemi,bazı virüsler embriyonlu
yumurtanın koryoallantoik membranında pok adı
verilen lokalize lezyonların oluşumuna neden olur.
Membranda oluşan her bir pok, bir enfeksiyoz
virüs partikülünü ifade eder. Dolayısıyla membran
üzerindeki pok sayısı belirlenerek orjinal virüs
süspansiyonundaki enfektif virüs miktarı pok
oluşturan ünite olarak hesaplanır.
• Fokus (focus) yöntemi, bazı onkojenik RNA
virüsleri hücrelerde hem ürerler hem de
proliferasyona neden olurlar. Fokus adı verilen
prolife hücrelerden odaklar oluşur. Bu fokuslar
sayılarak enfektif virüs miktarı saptanır.