rflp yöntemi - Dr. Onur YILMAZ

SELEKSİYONA YARDIMCI MARKERLAR
(Marker Assisted Selection)
 Geleneksel olarak bireylerin kendisini, atalarını ve
varsa döllerinin bilgilerini içeren kriterlere göre
seleksiyon yapılmaktadır. Elde edilen tüm bu bilgiler
geliştirilmiş istatistik metotlar ile değerlendirilerek
bireyin damızlık değeri elde edilir.
MAS
 Son yıllarda moleküler genetik biliminde meydana gelen
gelişmeler sayesinde belirli bir özellik için seleksiyon DNA
işaretleyicilerinin sağladığı bilgiye göre yapılabilmektedir.
MAS
Seleksiyona yardımcı işaretleyiciler seleksiyonda
sağlanan ilerlemeyi iki şekilde artırmaktadır bunlar;
1.
İstenen özellik için hangi hayvanın en iyi nitelikte
olduğu daha isabetli tahmin edilir. Böylece
gerçekten nitelikli hayvanların seçimindeki isabet
artar.
2. Generasyon aralığı kısalır
Seleksiyona yardımcı markerlar gelecekte geleneksel
seleksiyon yönteminin yerini almasa da seleksiyona
ek bilgi sağlaması bakımından önemlidir (DeNise,
1994).
 Bazı durumlarda DNA’nın bir bölgesi bireyin tam
olarak fenotipini belirlemektedir. Bu tip DNA
bölgeleri büyük etkili kantitatif karakter lokusları
olarak adlandırılır.
 Avusturalya merinosu koyunlarında bulunan
Booroola geni, Belçika mavi sığırında bulunan
Çift kaslılık geni bu genlere örnek olarak verilebilir.
GEN AKTARIMI
 Genomda istenilen bir dizinin
izole edilip başka bir genoma
aktarılması ile
gerçekleştirilmektedir.
 Bu teknolojide gen veya genler
döllenmiş yumurtaya aktarılır.
Gen Aktarımının Çiftlik Hayvanları
Yetiştiriciliğini Etkileyeceği Alanlar
 Genom haritalarının çıkarılması ile genler
arasındaki ilişkiler, işleyiş mekanizmaları ve
Kantitatif Karakter Lokusları belirlenebilmektedir.
 Hastalıklara ve parazitlere karşı direnç sağlayan
genlerin hayvanlara aktarılması
 insan genlerinin hayvanlara aktarımı sağlanarak
insan için yararlı tıpta kullanılacak biyomedikal
maddeler, hücreler, dokular ve organlar elde
edilebilir.
 Cinsiyetin belirlenmesinde rol alan genlerin
aktarılması ile cinsiyetin kontrolü mümkün
olabilecektir.
GEN AKTARIMI
 1990 yılında Tracy adında bir koyuna, insanlarda bazı
akciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılan alpha-1antitrypsin (AAT) enziminin genetik kodu aktarılmıştır. Ve
Tracy büyüdükten sonra sütünün her litresinde yaklaşık
40 gram AAT salgılamaya başlamıştır.
(http://www.yildizindunyasi.net/bilim%20dunyasi/klonlama-2.htm )
GEN AKTARIMI
Büyüme Hormonu Aktarılmış Atlantik Salmon Balığı
GENETİK KOPYALAMA
 Bir canlının bütün özellikleri o canlının her hücresinin
çekirdeğindeki genlerinde bulunur.
 Her canlının DNA yapısı farklı dolayısıyla özellikleri de
farklıdır. Genetik kopyalama bir canlı ile aynı genetik
bilgiye yani aynı DNA yapısına dolayısı ile aynı
özelliklere sahip başka bir canlı üretmektir.
KOPYALAMA
1997 yılında İskoçya'nın Edinburg şehrindeki Roslin
Enstitüsünden Dr. Ian Wilmut ve ekibi bir koyunun meme
bezinden aldıkları hücrenin çekirdeğini metafaz
safhasındaki yumurta hücresine aktararak genetik
kopyalamayı gerçekleştirmişler ve bunun sonucunda
Dolly adlı kuzu dünyaya gelmiştir.
Hayvancılıkta Genetik Kopyalama
Meme hücresinin
alınması
Hücre Çekirdeği
Verici Hayvan
İki Hücre Elektik Şoku
ile Birleştirilmesi
Birleştirilmiş Hücre
Yumurta Hücresi
Ergin Koyundan
Yumurta Hücresinin
Alınması
Yumurta Hücresinin
Çekirdeğinin
Çıkarılması
Embriyo
Taşıyıcı Hayvan
Embriyonun Taşıyıcı
Hayvana verilmesi
Klonlanmış Kuzu
Birleştirilmiş
Hücrenin
Normal
Olarak
Bölünmeye
başlaması
Moleküler biyoloji ve
istatistik bilimindeki son
gelişmeler
Büyük etkili kantitatif
karakter lokuslarının (QTL)
tanımlanması ve
kullanılması
Genomik varyasyonun
tanımlanmasını ve
kullanılması
 Hayvansal üretimde hayvanların bireysel olarak tanımlanması
hayvan ıslahı programları için oldukça önemlidir.
 Hayvanların tanımlaması için başlangıçta kullanılan kan
gruplarının tiplendirilmesi ve biyokimyasal polimorfizmlerin
izlenmesi, DNA işaretleyicileri (marker) kadar etkili olmamıştır.
 Bu DNA baz dizisinde meydana gelen varyasyonunu
tanımlamak için DNA temeline dayalı çeşitli teknolojiler
geliştirilmiştir. Bu teknolojiler moleküler genetik işaretleyiciler
(Marker) olarak bilinmektedir.
Genetik
Varyasyon
tanımlanması
Evrim tarihi
Hayvasal
ürünlerin
orjinlerinin
belirlenmesi
DNA baz
sıralarının
belirlenmesi
Babalık
testleri
Moleküler
Markerların
kullanımı
Gen
haritaları
çıkarılması
Genlerin
tespiti
QTL Tespiti
Rekombinant
DNA
teknolojisi
RAPD
Rastgele
Çoğaltılmış
Polimorfik
DNA
RFLP
AFLP
Kesilmiş Parça
Uzunluk
Polimorfizmi
Çoğaltılmış
Parça Uzunluk
Polimorfizmi
STR
Mikrosatellit
SNP
Tek Nükleotit
Polimorfizmi
RAPD Yöntemi
(Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA)
 İlk olarak Williams ve arkadaşları tarafından 1990 yılında
insan DNA’sında kullanılan RAPD yöntemi nükleotit dizileri
hakkında herhangi bir bilgiye gereksinim duyulmadan
şansa bağlı primerler kullanılarak her canlı türünde
uygulanabilmektedir.
 Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunluğundaki primer
(başlatıcı) kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin DNA
amplifikasyonu gerçekleştirilir.
 Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rastgele çoğaltıma izin
verir.
 Üretimi yapılan DNA parçaları (amplikon) agaroz jel üzerinde
elektroforeze tabi tutulduğunda bazı parçaların bazı
genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir
RAPD YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI
 DNA üzerinde tesadüfi bölge çoğaltılmasını sağlar
 Düşük miktarda DNA yeterlidir (5–50ng)
 Çabuk sonuç veren bir analiz yöntemidir
 Diğer tekniklere göre düşük maliyetlidir
 Yüksek polimorfizm gösterir
 Çok yönlü bantlar üretir
 Diğer yöntemlerin aksine radyoaktif madde kullanılmaz
RAPD YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI
 Saf, yüksek molekül ağırlıklı DNA gerektirir
 DNA parçalarının çoğaltılabilmesi için tesadüfi primerler
kullanılır
 Reaksiyon hassas olduğundan deneme için kullanılan
yöntemin son derece standartize olması gerekir
 Polimorfizm oranı diğer işaretleyicilerden düşüktür
 Tekrarlanabilirliği zayıftır.
RAPD YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA
KULLANIMI
Genetik Çeşitlilik Çalışmaları
Akrabalık Düzeyinin Belirlenmesi
Genom Haritalarının Çıkarılması
Genetik Markerların Tespiti
Hayvansal Ürünlerin Orjinlerinin
Belirlenmesi
Binbaş ve Cemal, 2006;
Elmacı ve ark., 2007; Ali,
2003; Kumar ve ark., 2008
Bhattacharya, 2003
Botstein ve ark., 1980.
Rao, ve ark., 1996
Ahmed, 2005
RFLP YÖNTEMİ
(Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi)
 RFLP yöntemi 1960’lı yıllarda restriksiyon endonükleazların
keşfini takiben geliştirilmiştir.
 İlk başarılı genetik haritalama çalışmalarında RFLP
işaretleyicileri kullanılmıştır.
 DNA’da oluşan mutasyonları veya polimorfizmi ortaya koyan
ve restriksiyon enzimi ile kesim sonucu oluşan değişik boydaki
DNA segmentlerini belirlemeye yönelik bir yöntemdir.
 Restriksiyon enzimleri, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli
DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden
kesmektedir.
RFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI
 RAPD yöntemine göre iki kat fazla bilgi sağlar
 Prob olarak cDNA klonları kullanılabilir.
 Laboratuarlar arasındaki uyum oldukça iyidir
RFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI
 Diğer marker metotlarına göre pahalı ve zaman alıcıdır.
 Her prob ile sadece bir polimorfizm ortaya konmaktadır.
 Bazı durumlarda mutasyonlar restriksiyon endonükleaz
tanımlama bölgesinde herhangi bir değişime neden olmaz
bu nedenle bazı mutasyonlar bu yöntemle
tanımlanamazlar
RFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA
KULLANIMI
Genetik Polimorfizmlerin
Tanımlanması
Yılmaz ve ark., 2014a;
Yılmaz ve ark., 2014b;
Yılmaz ve ark., 2013;
Sevim ve ark., 2012,
Cemal ve ark., 2009;
Ahmed, 2005
Rekombinant DNA teknolojisi
Genom Haritalarının Çıkarılması
Solak ve ark., 2000
Botstein ve ark., 1980.
AFLP YÖNTEMİ
(Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi)
 Bu yöntem SRAF (Selective Restriction Fragment
Amplification) olarak da bilinmektedir.
 Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan
DNA parçalarının bir grubunun selektif çoğaltılması esasına
dayanan bir genotipleme metodudur
 Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve Değişken sayılı
bitişik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayalı aleller
ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır.
 Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Analiz jelde
yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin üst kısmında
sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir.
AFLP YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI
 Daha önceden baz dizilerinin bilinmesine gereksinim
yoktur.
 Her reaksiyonda çok fazla miktarda polimorfizm
tanımlanabilir.
 Güvenilir bir yöntemdir.
 Standardizasyonu sağlanabilir.
 Elde edilen ürün sürekli olarak çoğaltılabilir.
AFLP
AFLP YÖNTEMİNİN DEZAVANTAJLARI
 Sadece seçilen alleller tanımlanır.
 Genomların büyüklüğüne göre adapte edilebilen farklı
kitlere gereksinim duyarlar.
AFLP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA
KULLANIMI
Genetik Polimorfizmlerin
Tanımlanması
Parmak izi teknolojisi
Mikrosatelitlerin bulunması
Genetik haritalama ve QTL
tarama
Foulley ve ark., 2006; Sheng
ve ark., 2004
Marsan ve ark., 1997; Negrini
ve ark., 2007; Utsunomiya ve
ark., 2014
Nijiman ve ark., 1999, Santana
ve ark., 2009
Otsen ve ark., 1996; Barendse
ve ark., 1994
MİKROSATELİTLER (STR)
 Birçok ökaryotik genomunda nispeten homojen aralıklarla
bulunan, 2-5 bazlık ardışık basit tekrarlardan oluşan kısa DNA
zincirleri mikrosatellit olarak adlandırılmaktadır.
 Yapılan çalışmalarda mikrosatelitlerin genellikle dinükleotit
tekrarları şeklinde olduğu bildirilmiştir
 Mikrosatellitler standart PCR yöntemleri ile çoğaltılabilirler
 Yüksek düzeyde polimorfizm gösteren mikrosatellitler
mutasyonların detaylı olarak analizine olanak tanır.
 Mikrosatellitlerle yapılan analizlerde, alleller arasındaki
küçük farklılıklar oldukça önemlidir bu nedenle allel
uzunluklarının belirlenmesinde genetik analizörler gibi
otomasyon sistemlerinin kullanılması çalışmanın
hassasiyetini artırmaktadır.
 Mikrosatellitler; DNA’nın kodlanmayan bölgelerinde tüm
genoma yayılmış durumda bulunurlar ve çok sayıda
kodominant allele sahiptirler.
MİKROSATELLİT YÖNTEMİNİN
HAYVANCILIKTA KULLANIMI
Irk içi ve ırklar arası genetik
çeşitliliğin saptanmasında
Yilmaz ve ark., 2014; Yilmaz
ve ark., 2015; Cemal ve ark.,
2013; Öner ve ark., 2014;
Hoda ve Marsan, 2012;
Özşensoy ve Kurar, 2014
Babalık Testleri
Yılmaz ve Karaca, 2012;
Araujo ve ark., 2010; Tian ve
ark., 2008; Sherman ve ark.,
2004
Tehlike altındaki populasyonların
durumlarının belirlenmesinde
Whitehouse ve Harley, 2001;
Mahmoudi ve ark., 2012;
Mahmoudi ve ark., 2013
Groenen ve ark., 2000; Rohrer
ve ark 1994;
Genom Haritalama
SNP (Tek Nükleotit Polimorfizmi)
 DNA’daki tek nükleotit değişiklikleri olarak adlandırılır.
 Genetik koddaki tek bir nükleotit değişimine bağlı olması
nedeniyle SNP’deki DNA varyasyonunun formu
mikrosatellitlere göre daha basittir.
 Genetik varyasyonun %90’ını oluşturan SNP’ler
otomasyona yüksek düzeyde uyum sağlamaları ve diğer
işaretleyicilere göre daha duyarlı analizlerin yapılmasına
olanak tanımaları nedeniyle hayvancılıkta son yıllarda
oldukça geniş bir kullanım alanı bulmuşlardır.
 Gen kodlayan bölgelerde görülen SNP varyantları, bir
proteinin amino asit sekansını değiştirmekte ve protein
fonksiyonunu doğrudan etkilemektedir
 Gen kodlayan bölgelerdeki SNPs’in sayısının 10000-50000
dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir.
 Günümüzde aynı anda çok fazla sayıda SNP’in analizine
olanak tanıyan otomasyon sistemleri geliştirilmiştir.
 Meydana gelen bu gelişmeler sayesinde yüksek
çözünürlüğe sahip SNP çipleri sayesinde genom boyu
ilişki analizleri gerçekleştirilebilmektedir.
 Elde edilen bilgiler ışığında genomik seleksiyon olanaklı
bir hale gelmiştir.
SNP YÖNTEMİNİN HAYVANCILIKTA
KULLANIMI
Genetik Çeşitlilik
Babalık Testleri
Genomik Seleksiyon Çalışmaları
Genom Haritalama
Pariset ve ark., 2006; Pryce ve
ark., 2012
Hill ve ark., 2008; Harlizius ve
ark., 2011; Heaton ve ark.,
2014
Daetwyler ve ark., 2012;
Eggen, 2012; Goddard ve
Hayes, 2007; Slack-Smith ve
ark., 2010
Kijas ve ark., 2009
MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERİN
KARŞILAŞTIRILMASI
RAPD
RFLP
AFLP
STR
SNP
Tarama
Yöntemi
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
Primer Tipi
Rastgele
Primer
Diziye Özel
Primer
Diziye
Özel
Primer
Diziye Özel
Primer
Diziye Özel
Primer
Polimorfizm Tipi
OrtaYüksek
Düşük
OrtaYüksek
Yüksek
Yüksek
Otomasyona
uyum
Evet
Evet
Evet
Evet
Evet
Güvenilirlik
Düşük
Yüksek
Orta
Yüksek
Yüksek
Fenotipik
ifadesi
Dominant
Kodomina
nt
Dominant
Kodomina
nt
Kodomina
nt
DNA DİZİ ANALİZİ ?
 Gen yapısı ve genetik kontrol
mekanizmaları hakkında bir
çok bilgi edinmemizi
sağlamıştır
 Herhangi bir canlıya ait DNA
örneğindeki baz diziliminin
ortaya çıkartılması işlemidir.
 Bir bölgenin dizilimi
çıkartılabileceği gibi canlıya
ait tüm genom dizilişi de
çıkartılabilmektedir
DNA Dizi Analizi İle İlgili Çalışmalar
1964- Robert HOLLEY 74 nükleotidlik bir tRNA molekülünün dizi analizi
1977- Allan MAXAM - Walter GILBERT
1977- Frederick SANGER
1982- Akiyoshi WADA (Otomatik Analiz Önerisi)
1986- Leroy HOOD ve Llyod SMITH -Tam otomatik analiz makinasının
bulunması
1990 -Edward UBERBACHER tarafından bir gen bulma programı olan
GRAİL kullanılmaya başlanmıştır
1992- 21. kromozomun DNA Dizi Analizi tamamlanmıştır
2000- İnsan Genom Projesi katılımcıları ve Celera’ nın insan gen
haritası taslağını tamamladığı açıklanmıştır.
2003- yılında Whitehead Enstitüsünde görevli David PAGE ve
arkadaşları Y kromozomunun dizi analizini tamamlamışlardır
DNA DİZİ ANALİZİ
Geleneksel Yöntem Maxam ‐ Gilbert
Yeni Nesil Yöntemler
Sanger ‐ Coulson
 Her iki geleneksel yöntem üç temel basamaktan
oluşmaktadır.
• DNA’nın hazırlanması
• Reaksiyonlar
• Yüksek voltajlı jel elektroforezi
Günümüzde Sanger – Coulson yöntemi daha yaygın
kullanılmaktadır.
GELENEKSEL YÖNTEMLER
MAXAM‐GİLBERT YÖNTEMİ
(Kimyasal Kırılma Yöntemi)
Walter GILBERT
 Allan MAXAM ve Walter GILBERT tarafından geliştirilmiş
bir yöntemdir.
 DNA’nın kimyasal yöntemlerle istenen bazlardan
kırılması ve hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları
elde edilmesine dayalı bir yöntemdir.
 Purin bazlarının (G-A) kırılmasında dimetil
sülfat
 Pirimidin bazlarının (C-U-T) kırılması ise hidrazin
enzimi ile yapılır.
a. Baz sıraları saptanması istenen DNA, spesifik
restriksiyon endonukleaz (Örn., EcoRI) ile kesilerek
değişik boylarda çift iplikçikli DNA fragmentleri elde
edilir.
b. Nükleotid dizisi saptanacak olan DNA fragmenti 5’ucundan 32P ile ya da floresan bir boya ile
işaretlenir.
c. Radyoktif fosforla işaretli olan bu çift iplikçikler çeşitli
yöntemlerle (ısı, NaOH, vs.) denatüre edilerek tek iplikçikli
hale getirilirler.
• Bu denatüre süspansiyon, 4 eşit kısma ayrılarak tüplere
taksim edilirler.
• Tüplerin her birine, çok kontrollü miktar ve süre de spesifik
bazları parçalayan bazı kimyasal maddeler (dimetil sulfat,
hidrazin, formik asit, piperidin, vs.) katılarak etkilemeleri
sağlanır. Bu maddeler, bir DNA segmentinde sadece bir
tür baza etkileyecek tarzda ayarlanmışlardır.
 Birinci tüpteki işaretli ve tek iplikçik DNA fragment süspansiyonuna
guaninine (G) etkileyen dimetil sülfat (DMS) eklersek bu madde
bir segmentte bulunan guaninlerden birine etkileyecek diğerleri
ise sağlam kalacaktır.
 İkinci tüpe hem guanin (G) ve hem de adenini (A) etkileyen
kimyasal maddeler katılır ve reaksiyonunun sağlanması beklenir.
Reaksiyonunun sonunda DNA segmentlerindeki hem guanin ve
hem de adenin bazları parçalanır.
 Üçüncü tüpe sadece timini (T) etkileyen madde katılır. Bu baz
parçalanır.
 Dördüncü tüpe ise hem timin (T) ve hem de sitozini(C) etkileyen
maddeler katılarak reaksiyona bırakılır. Bu tüpte timin ile sitozin
bazları parçalanır.
G
G+A
T
T+C
Bu 4 tüpte reaksiyonların sonunda çok değişik
boylarda DNA segmentleri meydana gelecektir.
Ancak, bunların içinde uçları 32P ile işaretlenmiş
olanlar önemlidir.
 Birinci tüpte değişik boyda ve sadece Gbazlarından kesilmiş segmentler bulunacaktır,
 İkinci tüpte, hem G ve hem de A bazlarından
kesilmiş fragmentler vardır.
 Üçüncü tüpte,sadece T-bazlarından kesilmiş
fragmentler bulunur.
 Dördüncü tüpte de, hem T- ve hem C bazlarından
kesilmiş DNA segmentleri vardır.
 Bu tüpler ayrı ayrı agarose
gel elektroforezise (veya
poliakrilamid gel
elektroforezis, PAGE) tabi
tutularak, elektriksel
ortamda, boylarına göre
(molekül ağırlıklarına göre)
büyükten küçüğe doğru bir
seperasyona tabi tutulurlar.
Jel üzerinde, büyük
segmentler baş tarafta ve
küçük segmentler de karşı uç
da yer alacaklardır.
 Dört tüp için elde edilen bantlar birbirleriyle karşılaştırılır ve
değerlendirilmesi yapılır.
 1.tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı,
2. tüpe ait sütunda, 3 tane G bandı ve 3 tane de A bandı
(toplam 6 bant),
3. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı,
4. tüpe ait sütunda, 2 tane T bantı ve 2 tane de C bandı
bulunacaktır (toplam 4 bant).
G
C
A
G
T
A
C
G
A
T
G
C
A
G
T
A
C
G
A
T
SANGER‐COULSON YÖNTEMİ
(Zincir Sonlandırma Yöntemi)
Fred SANGER
 DNA dizi analizinde kullanılan diğer bir yöntem de Fred SANGER
ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma
yöntemidir (Sanger et al., 1977).
 Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en
yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir.
 Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni
sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.
 Bu yöntem için;
dNTP’lere
ddNTP’lere
Tek iplikli kalıp DNA’ya
Klenov, Taq DNA polimeraz , ters transkriptaz
veya sekuenaz enzimine
Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç duyulur
Sanger metodu PCR’ın işleyişine benzemektedir.


DNA tek zincir haline getirilir. Reaksiyona girecek olan
karışımda 4 çeşit normal nükleotid bol miktarda bulunur.
Bunlar: dATP - dGTP – dCTP - dTTP
Karışımda aynı zamanda dizilimi rastgele sonlandırmak
için farklı renklerde floresan ile işaretlenmiş
dideoxynucleotidler bulunmaktadır. Bunlar ddATP –
ddGTP – ddCTP - ddTTP
 Sekanslama reaksiyon karışımı
 İşaretli primer
 Kalıp DNA’yı içerir. Hem çift, hem de tek zincirli
DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında
polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniği ile elde
edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA
olarak adlandırılır
Primer
-3′ OH
5′OP-
TCGACGGGC…
Kalıp DNA
Sekanslanacak kalıp bölgesi
 Dideoksinükleotidler dört tüpün her birine ayrı ayrı
ilave edilmiştir
A
ddATP +
ddA
dAdGdCdTdGdCdCdCdG
ddCTP +
dAdGddC
dAdGdCdTdGddC
dAdGdCdTdGdCddC
dAdGdCdTdGdCdCddC
DÖRT (4) dNTPs
C
DÖRT (4) dNTPs
G
ddGTP +
T
DÖRT (4) dNTPs
ddTTP +
DÖRT (4) dNTPs
dAddG
dAdGdCdTddG
dAdGdCdTdGdCdCdCddG
dAdGdCddT
dAdGdCdTdGdCdCdCdG
Sanger Yöntemi
Primer
Kalıp DNA
-3′ OH
5′OP-
DNA Polimeraz
ddGTP
dNTPs
ddATP
1.Tüp
ddCTP
2. Tüp
ddTTP
3. Tüp
4. Tüp
 Enzim eklenir (DNA polymerase), primer ddNTP’ler
karşılaşıncaya kadar uzatılır.
 Zincir ddNTP’lerin birleşmesi ile son bulur.
 Sonlanan zincirlerin sonunda reaksiyona eklenen
ddNTP’ler bulunmaktadır.
 Toplanan fragmentler sekanslama merdivenini
(sequencing ladder) oluşturur.
 Sonlanan zincirler elektroforez yöntemi ile gözlenebilir
Uzun fragmentler
ddG
Kısa fragmentler
ddG
G
A
T
C
3′
G
G
T
A
A
A
T
C
A
T
G
5′
YENİ NESİL YÖNTEMLER
 Otomatik DNA cihazlarının gelişmesi ile poliakrilamid jellerin
yerini polikarbon bileşikleri olan polimerler almıştır. Bu
polimerler yoğunluklarına göre farklı ayrım gücüne sahiptirler.
 Kullanılan polimer otomatik cihazlarda çapları milimetreden
küçük olan cam kapilerler içine yüklenirler. Cihazlarda kapiller
elektroforez gerçekleştirilir.
 Kapiller elektroforez degrade DNA’larla yapılan
çalışmalarda, düşük miktarda PCR ürünü bulunduğu
durumlarda geleneksel jel elektroforezine göre daha
etkin sonuç vermektedir.
 Bu yöntemin standart sapması 0,075-0,1175 baz çifti
arasında değişmektedir.
 Bu nedenle kapiller elektroforez standart sapması 0,2
baz çifti olan geleneksel jel elektroforezinden daha
etkin ayrım yapılabilmektedir.
 ABI 310 Genetik Analiz Cihazı (5 farklı flüoresan) veya Beckman
Coulter cihazı (4 farklı flüoresan) rengi aynı anda algılayabilir. Bu
özelliği nedeniyle dizi analiz reaksiyonu tek bir reaksiyon tüpünde
gerçekleştirilir.
 Genotip belirlemede çoklu renk algılama sistemi değişik renklerle
işaretlenmiş çeşitli büyüklüklerdeki birden fazla PCR ürününü aynı
anda inceleme imkanı sağlar.
 Yeni nesil sekanlama yöntemlerinde Sanger’in DNA dizilimi
çözme yöntemi geliştirilerek her bir tepkimede kullanılan
ddNTP’ler değişik renkli floresanlarla etiketlenir.
 Bu teknoloji ile binlerce nükleotidlik bir DNA’nın dizilimi birkaç
saatte çözümlenmektedir.
 Bu sayede daha büyük DNA dizilimleri bulunmaya başlanmıştır
Yeni Nesil Analiz Sistemlerinden Bazıları
 ABI 310
 Beckman Coulter SEQ 8000-8800-GXP
 ABI Solid
 Illumina Solexa
 Roche 454
 HeliScope
 Ion Torrent
Ion Torrent İle Gen Analizi
 Full insan genom sekanslaması için çıkarılmıştır.
 Çalışma prensibi olarak pH metre ile aynı prensibi
kullanmaktadır.
 Çipin içine sekanslayacağımız örneği yükleriz.
 Yüklediğimiz örnek, çipin altındaki çok sayıdaki
kuyucuklara şansa bağlı bir şekilde dağılır.
 Cihaz bu kuyucukların içine her bir seferde dNTP’lerden
(A,T,C,G) birini gönderir.
 İçerideki tek iplik halinde bulunan DNA’nın komplomentlerini
oluştururken bağlanan baz ile birlikte H+ iyonu açığa çıkar.
 Bu açığa çıkan H+ iyonu sayesindeki meydana gelen pH
değişimi ile cihaz kuyuya gönderilen NTP (A,T,C,G) bazlarından
hangisinin bağlandığını tespit eder.
 Aynı bazın birden fazla bulunduğu durumlarda çıkan H+
iyonuna göre oluşan pik yüksekliği kaç bazın ard arda
bulunduğunu gösterir.
Çiftlik Hayvanlarında DNA Dizi Analizi
 Hayvan genomunda varyasyonların varlığının
saptanmasından sonra moleküler genetikte verimlerden
sorumlu genlerin yerlerinin tespitinde kullanılan başlıca
yöntemler bağlantı ve asosiasyon analizlerini içeren LD
(Linkage Disequilibrium) haritalaması yöntemleridir.
 Bu yöntemlerin hedefi gen işlevi hakkında bir önbilgi
olmadan verim veya hastalık ile ilişkili olan genlerin
genomdaki adreslerinin belirlenmesidir.
 DNA dizi analizi ile bütün genomun veya bazı DNA bölgelerinin
dizilişi çıkartılarak verimle ilişkilendirilmeye çalışılmaktadır.
 DNA dizi analizi temelli yeni yöntemler gen-verim veya genhastalık bağlantılarının kurulmasında LD-haritalama
yöntemlerinin yerini almaya başlamıştır.
 Genom diziliminin çıkartılması bireyler arası tek nükleotid
farklılıklarının (SNP: Single Nucleotide Polymorphisms)
belirlenmesine ve bu farklılıklarla verim ilişkilerinin belirlenmesine
olanak tanımıştır.
 Son zamanlarda geliştirilen SNP çipleri ile aynı anda bir DNA
örneğinde yüz binlerce hatta birkaç milyon nükleotid farklılığının
belirlenmesi, bu bilgilerin ıslah programlarında kullanılmasının
yolunu açmıştır.
 Tüm bu gelişmeler doğrultusunda DNA dizi analizinin
çiftlik hayvanlarında uygulanması ile;
 Babalık testleri yapılabilmekte
 Irklar arası farklılık daha ayrıntılı tanımlanmakta
 Irklarda bireyler arası farklılıklar belirlenmekte
 SNP çipleri ile genotipleme yapılabilmekte
 Verimlerle ilgili genom bölgeleri belirlenebilmekte
 Akrabalık ilişkileri tanımlanabilmekte
 Fenotipe dayalı bilgilerin yanında genom bilgileri de
kullanılarak daha isabetli damızlık değer tahmini
yapılabilmektedir.
Gen İfadesi (Ekspresyon)
 Gen ifadesi veya gen ekspresyonu, genetik
materyalde (DNA) şifrelenen bilginin ürüne
dönüştürülmesini yani ilgili genin fonksiyonunu
sergilemesidir. Transkripsiyon ve translasyon olaylarının
toplamı olarak da tanımlanabilir.
 Transkripsiyon: DNA’da saklanan genetik bilgilerin
RNA molekülü (mRNA, tRNA, rRNA) sentezi ile
kopyalanması veya yazılmasını ifade eder.
 Translasyon: Transkripsiyon ile RNA’ya kopyalanan
genetik bilginin bir polipeptit zincir (protein) haline
dönüştürülmesini ifade eder.
Gen İfadesi
DNA
Transkripsiyon (Okuma)
mRNA
rRNA
tRNA
Ribozom
Translasyon (Çeviri)
PROTEİN
RNA
(RiboNükleikAsit)
Figure 6-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
RNA Polimeraz
RNA
DNA kalıbının ilgili bölgesinin kopya dizilimi yani mesajcı RNA (mRNA) RNA
Polimeraz enzimi aracılığıyla çıkartılır
Hücrede Protein Sentezi
 Protein = Polipeptit zincir
 Polipeptid büyüklüğü  Ortalama
500-550 aa
 En büyük polipeptid  Titin 38138
kodon
 En küçük polipeptidler  onlarca aa
(aa: amino asit)
(küçük hormonlar)
DNA’dan Protein Sentezi Süreci
Figure 6-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
mRNA sentezi
• mRNA sentezi sırasında ilk elde edilen RNA molekülü
“splicing” işlemi ile işlenerek olgun RNA molekülü elde edilir.
Splicing işlemi sırasında “intron” bölgelerine ait bilgiler
ayıklanır ve sadece “exon” bölgelerini içeren bilgiler kalır.
RNA Tipleri ve Görevleri
mRNA
Haberci RNA, proteinleri kodlar
rRNA
ribozomal RNA, ribozomların yapısında yer alır ve protein sentezini katalize
eder
tRNA
transfer RNA, aminoasitleri bağlayarak protein sentezinde rol oynar
snRNA
küçük nüklear RNA, pre-mRNA kesilmesi ve diğer bazı nükleus içi süreçlerde
rol oynar
snoRNA
küçük nükleolar RNA, rRNA modifikasyonunda rol oynar
scaRNA
küçük kajel RNA, snoRNA ve snRNA modifikasyonu
miRNA
mikro RNA, gen ekspresyonu regülasyonu
siRNA
küçük interferans RNA, gen ekspresyonu regülasyonu
Diğer kodlama yapmayan RNA’lar telomer sentezi, X-kromozom
inaktivasyonu, proteinlerin ER’ a transferi gibi süreçlerde rol oynarlar
DNA kalıbı kullanılarak tamamlayıcı yani
komplementer RNA molekülünün
oluşturulmasına “transkripsiyon”, oluşan RNA
molekülüne ise “transkript” denir.
Protein sentezinde görev alan 3
unsur:
•mRNA
•tRNA ve
•ribozomlar
Genetik kod
Gen Ekspresyonu analizleri
• Gen ekspresyonu analizleri ile hangi dokularda hangi genlerin
aktif olduğu belirlenebilmektedir.
• Analizler için önce ilgili dokulardan RNA ekstraksiyonu
yapılmaktadır.
• RNA ekstraksiyonu sonrasında mRNA’dan revers transkriptaz
enzimi kullanılarak tamamlayıcı yani komplementer
(complementer) DNA (cDNA) sentezi yapılmaktadır.
• Ardından istenirse cDNA dizilimi (sekansı) çıkartılabilmekte veya
bilinen DNA bölgelerinin var olup olmadığı problar aracılığıyla
belirlenebilmektedir.
• Microarray çipler aracılığıyla aynı anda binlerce genin
ekspresyon gösterip göstermediği belirlenebilmektedir.
Mikroarray çip ile gen ekspresyonu analizi
Mikroarray çiplerin yapıları
 Çiftlik hayvanları bağlamında kantitatif teorileri temel alan
fenotipik performans verilerine dayalı genotip tahminleri esas
alınarak yürütülen klasik ıslah yöntemleri günümüzde de
başvurulan en temel yöntemlerdendir.
 Kantitatif genetik teoride hayvanların damızlık değerleri fenotipik
veriler kullanılarak tahmin edilmektedir
 Özellikle fertilite, ömür uzunluğu, yemden yararlanma yeteneği
gibi karmaşık ve ölçülmesi zor özellikler söz konusu olduğunda
klasik ıslah yöntemlerinin etkinliği azalmaktadır.
 Türlerin genetiğine yönelik bilgilerin artması ve DNA düzeyinde
tanımlamalara ulaşılması, fenotipe göre işletilen seleksiyon
programlarına, genotipe yönelik bilgilerin de eklenmesi ile
genetik ilerleme daha üst seviyelere çıkartılabilmektedir
29
 Bu teknikler ile ırklar içi ve arası genetik varyasyon
tanımlanabilmekte, gen haritaları çıkarılabilmekte, pedigri
kayıtlarının doğrulukları kontrol edilebilmekte ve genomik
seleksiyon çalışmaları gerçekleştirilebilmektedir.
 Bu tekniklerin klasik ıslah yöntemleri ile birlikte kullanımı önemli bir
bilgi birikimini birlikte getirecektir.
 Genetik işaretleyicilerin devreye girmesi daha erken yaşlarda
bazı özellikler bakımından genetik yapının tam doğrulukla
belirlenmesine ve erken yaşta damızlık seçimine olanak
tanıyabilmektedir.
30
 Ülkemizde mevcut yerli ırkların moleküler genetik düzeyde
tanımlanması, ve elde edilen bilgilerin yürütülen /
yürütülecek ıslah çalışmalarında kullanılması önemli
kazanımlar sağlayacaktır.
 Yerli hayvanlarımıza ait DNA örneklerinin bir DNA
bankasında depolanması sağlanmalıdır.
 Hayvancılık için çok önemli olan ve halen etkin olarak
devrede olan klasik ıslah yöntemlerinin DNA belirteçleri ile
beraber kullanımı seleksiyon programlarını daha da etkin
kılacaktır.