Spor, Kapsül ve Flagella Boyama

Spor, Kapsül ve Flagella Boyama
Özet:
Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile
görülmeleri zordur. Mikroorganizmaların ve onlara ait spor, flagella, kapsül gibi
morfolojik özelliklerinin mikroskopta görünür hale getirilmesi için preparat
hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyama yapılır. Bu işlemin sonucunda
mikroskop incelemesi için daha görülebilir hale gelen mikroorganizmalar daha rahat
tanımlanabilir ve gruplandırılabilirler. Böylece bir gıda maddesi üzerinde üreyebilecek
canlılar belirlenmiş olur.
Giriş:
Boya bir benzen halkasına bağlı kromofor ve okzokrom gruplarını taşıyan organik bir
bileşiktir. Kromofor grup moleküle renk özelliği verir, ancak bu bileşik renkli olmasına
rağmen henüz boya karakterinde değildir. Bu maddenin herhangi bir ortama tutunma
özelliği yoktur. Bu özellik okzokrom grubu ile sağlanır. Okzokrom grubu moleküle
elektrolitik çözünme özelliği vererek tuz meydana getirilmesini sağlar. Okzokrom
grubu boyanın renk tonunu değiştirebilir. Ancak rengin ortaya çıkmasını sağlayamaz.
Bir çözücüde pozitif yüklü iyonlar veren boyalara bazik boyalar denir. Örnek olarak
bazik fuksin, kristal violet, metilen mavisi ve safranin verilebilir. Çözücüde negatif
yüklü iyonlar veren boyalara ise asit boyalar denir: Nigrosin, eosin, asit fuksin. Bazik
ve asit boyaların uygun oranda karışımları ile nötr boyalar elde edilir: Giemsa,
leishman.
Bazı kimyasal maddeler; boyanacak madde ile boyanın birleşmesini kolaylaştırır veya
kuvvetlendirir. Bunlara mordant adı verilir: Tannik asit, fenol, çinko, amonyum
oksalat, iyot.
Boyama yöntemleri ile mikroorganizmaların sınıflandırılması ve tanımlanması, genel
olarak şeklinin gözlenmesi mümkündür. Boyama ile bir gıda ürününün ekim
işleminden sonra açığa çıkan kültürlerden şüphe duyulanların hangi
mikroorganizmalar olduğu belirlenir. Böylece insan sağlığı açısından güvenilir bilgiler
elde edilebilir. Ayrıca boya maddeleri mikroorganizmaların boyanmasının dışında
başka amaçlar için de kullanılmaktadır. Örneğin trifenil içeren bazı boyalar(malachit
yeşili, kristal violet) bazı mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkiye sahip
olduklarından, mikroorganizmaların izolasyonunda besi yerine inhibitör ajan olarak
ilave edilmektedir. Böylece istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önleyerek
besi yerine seçici özellik kazandırır.
Boyama yöntemleri temel olarak üç grupta toplanır: Basit boyama, diferansiyel
boyama ve hücrenin spor, flagella, kapsül gibi kısımlarının boyandığı özel boyama
yöntemleri.
Boyama Yöntemleri:
·
Basit Boyama
·
Gram Boyama
·
Endospor Boyama
·
Flagella Boyama
·
Kapsül Boyama
·
Küf Boyama
Spor Boyama:
Bazı bakteriler yüksek sıcaklık, düşük su aktivitesi gibi dış ortam koşullarına dayanıklı
spor oluştururlar. Bakteri hücresinin içinde oluşan bu spora endospor denir. Her
bakteri kendine özgü pozisyon, biçim ve büyüklükte spor oluşturur. Sporların bakteri
hücresinde bulunma
şekilleri farklılık gösterir.
Gram boyamada kullanılan boyalar spor çeperine nüfuz edemediklerinden gram
boyama yöntemi ile boyanmazlar. Sporların görünmesi amacıyla en yaygın olarak
kullanılan yöntem Schaffer-Fulton yöntemidir. Bu yöntem ile boyanan sporlar
mikroskopta yeşil, hücreler ise pembe-kırmızı renkte görülürler.
Materyal:
·
Lam
·
Öze
·
Besiyerinde bakteri kültürü
·
Boya çözeltileri: malachit yeşili, safranin
·
%95’lik etil alkol
·
Kurutma kağıdı
·
İmmersiyon yağı
·
Mikroskop (100X obj.)
Metot:
Ø
Temiz bir lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.
Ø
Öze bunzen alevinde sterilize edilir,soğuması için kısa süre beklenir.
Ø
Steril öze ile katı besiyerinden bir miktar kültür alınır.
Ø
Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.
Ø
Öze bunzen alevinde sterilize edilip,yerine konur.
Ø
Preparatın kuruması için bir süre beklenir.
Ø
İyi bir tespit için pens yardımıyla ucundan tutulan lam bunzen aleviden 20
kere geçirilir.
Ø
Preparatın üzeri kurutma kağıdı ile kaplanır, üzerine malachit yeşili çözeltisi
dökülür.
Ø
Preparat hafif alev üzerinde veya su banyosunda 5 dakika ısıtılır. Ancak
preparatın kurutulmamasına dikkat edilmelidir. Gerektiğinde üzerine boya ilave
edilir.
Ø
Preparat yavaş bir şekilde musluk suyu ile 10 saniye yıkanır.
Ø
Karşıt boyama için safranin ile 15 saniye boyanır.
Ø
Su ile yıkanır, kurutma kağıdı ile kurutulur.
Ø
Yağ damlatılarak 100X objektif ile incelenir.
Flagella Boyama:
Pseudomonas gibi bazı bakterilerin hareketli organeli olan flagella ince ve narin bir
yapıdır. Bu boyamada amaç flagellanın boyanması olup, boyamada en çok
carbolfuchsin kullanılır, ayrıca boyayı kuvvetlendirici mordant ilave edilmelidir.
Boyama sonucunda flagella ve bakteriler pembe ve kırmızı renkte boyanırlar.
Materyal:
·
Lam
·
Öze
·
Besiyerinde taze bakteri kültürü
·
Boya: carbolfuchsin mordant
·
%95’lik etil alkol
·
Kurutma kağıdı
·
İmmersiyon yağı
·
Mikroskop (100X obj.)
Metot:
Katı besiyerindeki kültürün üzerine birkaç damla steril su damlatılır.
Ø
Ø
Ø
Ø
Bakteriler fazla karıştırılmadan öze yardımıyla lamın üzerine alınır.
Lam eğilerek bakteri süspansiyonunun aşağı doğru akması temin edilir ve bu
şekilde kurutulur.
Üzerine mordant carbolfuchsin çözeltisi damlatılır, 10 dakika beklenir.
Ø
En uygun boyama tecrübe ile sağlanır. Preparat koyu bir zemin üzerine
konur ve aglütinasyon olduğunda boyamaya son verilir.
Ø
Lam eğilerek boya su ile uzaklaştırılır ve dik durumda kurutulur(kurutma için
filtre kağıdı kullanılmaz).
Ø
İmmersiyon yağı damlatılarak 100X objektifte incelenir.
Kapsül Boyama:
Bazı bakteriler kendisine hastalık yapma yeteneği kazandıran jelatinimsi yapıda
kapsül içerirler. Kapsül suda eridiğinden ve boyanması mümkün olmadığından ortam
nigrosin gibi koyu renk bir boyayla, hücre safranin ile boyanır. Kapsülün varlığı hücre
etrafındaki boyanmamış bölge ile anlaşılır. Bakteri pembe, ortam gri, kapsül renksiz
görünür.
Materyal:
·
Lam
·
Öze
·
Besiyerinde taze bakteri kültürü
·
Boya çözeltileri: nigrosin veya çini mürekkebi, safranin
·
%95’lik etil alkol
·
Kurutma kağıdı
·
İmmersiyon yağı
·
Mikroskop (100X obj.)
Metot:
Ø
Basit boyamada olduğu gibi preparat hazırlanır.
Ø
Hafifçe alevden geçirilir.
Ø
Nigrosin veya çini mürekkebi damlatılır.
Ø
Süspansiyon lam 45o eğilerek lamel ile yayılır ve kuruması beklenir.
Ø
Preparat karşıt bir boya olan safranin ile kaplanır ve 30 saniye beklenir.
Ø
Ø
Boya dökülür ve filtre kağıdı arasında hafifçe fazla suyu alınır, havada
kurutulur.
İmmersiyon yağı damlatılarak 100X objektifte incelenir.
Kullanılan Boya Çözeltileri:
Carbolfuchsin
Ziehl-Nielsens corbolfuchsin
Saf su
10 ml
150 ml
Malachit Yeşili
Malachit green
5g
Saf su
100 ml
Safranin
Safranin
0.5 g
Saf su
100 ml
Nigrosin
Çini Mürekkebi
Sonuç:
Besiyerlerinden alınan kültürler metotlarda anlatıldığı gibi boyandı ancak spor,
flagella veya kapsül mikroskop incelemesi sonunda gözlemlenemedi.
Yorum:
Deneyde uygulanan yöntemlerden sonra başarılı sonuç elde edilememesinin başlıca
sebebi deney sırasında yapılan hatalardır. Bu hatalar “Hata Kaynakları” başlığı
altında incelenebilir.
Hata Kaynakları:
·
İstenilen özellikteki mikroorganizmalarla çalışılmaması.
·
Besi yerinden kültür alımına dikkat edilmemesi.
·
Preparat alınırken kültürün lam üzerindeki su ile iyice karıştırılmaması.
·
Mikroorganizmaların lam üzerine iyice fiksasyon edilmemesi.
·
Damlatılan boyaların gereğinden fazla veya az damlatılması.
·
Bekleme sürelerinin yeterli olmaması.
·
Su ile yıkamada mikroorganizmaların kayıp olması.
·
Kurutma kağıdının fazla bastırılması.
·
Yanlış boya çözeltileri kullanılması.
Referanslar:
Ø
HEPERKAN, D.1998, Basılmamış Veri,Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, İTÜ
Gıda Mühendisliği Bölümü, İstanbul