Kişisel PDF Dosyası
advertisement
LAKTİK ASİT BAKTERİLERİ Laktik asit bakterileri fermentasyon sonucu temel ürün olarak laktik asit oluşturan mikroorganizmalardır. Bu bakteriler, genellikle spor oluşturmayan ve gıda fermentasyonlarında güvenli bir şekilde kullanılan mikroorganizmaları kapsamakla birlikte, patojen olanlarına ya da spor oluşturanlarına da rastlanmaktadır. Diğer taraftan, metabolizması bakımından farklılık gösteren bifidobakteriler gibi mikroorganizmalar da bu bakteriler içerisinde yer almaktadır. Bu nedenle, laktik asit bakterilerinin tanımlanmasında evrensel olarak kabul gören bir terim mevcut değildir. Klasifikasyonları Mikroorganizmaların isimlendirilmesi ve klasifikasyonu, Uluslararası Mikrobiyoloji Toplulukları Birliği (International Union of Microbiological Societies)’nin gözetiminde faaliyet gösteren taksonomi komitelerinin önerileri doğrultusunda yürütülmektedir. Bakteriler arasındaki genetik akrabalıkları doğru bir şekilde yansıtan yeni ve güçlü kanıtlar elde edildikçe bakterinin dahil edildiği tür ve resmi tanımlamalar değişikliğe uğramaktadır. Bakterilerin teşhisi ve sınıflandırılması, uzunca bir süre fenotip olarak ifade edilen gözlemlenebilir özelliklerine (morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özellikler) göre yapılabilmiştir. Buna göre, birbirine çok benzer özellikler gösteren bakterilerin aynı türden olduğu kabul edilmekte, benzer özellikler gösteren türler de aynı cins içerisinde toplanmaktadır. Bazı durumlarda, türler alt türlere (kısaca subsp. veya ssp.) bölünmektedir. Türlerin resmi olarak isimlendirilmesi, esasen bitkiler ve hayvanların isimlendirilmesi için geliştirilen Latin binomiyal sistemine göre yapılmaktadır. Örneğin, Lactococcus lactis, Lactococcus cinsine ait bir tür, Lactococcus lactis subsp cremoris ise Lactococcus lactis’in alt türüdür. Fenotipik çalışmaların moleküler düzeye (hücre duvarının kompozisyonu, serolojik teknikler, elektroforetik teknikler) yayılması ve DNA analiz tekniklerinin geliştirilmesi (DNA hibridizasyonu ve DNA sekansının karşılaştırılması), mikroorganizmalar arasındaki benzerlik ve farklılıkların daha güvenilir biçimde ortaya konulmasını mümkün kılmıştır. Günümüzde, DNA hibridizasyon çalışmaları iki bakterinin aynı türe ait olup olmadığına dair en fazla kabul gören bir ölçüt sayılmaktadır. Fenotipik özellikler konusu önemini korumakla birlikte, bu özelliklere göre genetik akrabalıklar her zaman doğru bir şekilde ortaya konulamamaktadır. 1 Günümüzde canlı organizmalar 3 üst alem içerisinde toplanmıştır: - Ökarya (Eucarya) - Arkaya (Archaea) - Öbakteri veya bakteri (Eubacteria) Hücre nükleusu içerisinde kromozom taşıyan, bitkiler, hayvanlar ve fungusları içine alan canlılar (ökaryotlar) ökarya olarak sınıflandırılmıştır. Topluca bakteri olarak ifade edilen prokaryot organizmalar da arkaya ve öbakteri olmak üzere iki bölüme ayrılmıştır. Filogenetik (Bir türün veya yüksek taksonomik grupların soy gelişimi ve evrim geçmişi) ifadeyle, laktik asit bakterileri olarak adlandırılabilecek belirli bir bakteri grubu mevcut değildir. Laktik asit bakterileri, gram-pozitif öbakterilerin (Firmicute) G + C (Guanin + Sitozin) yüzdesi düşük olan alt bölümünde yer alırlar. Bunların DNA moleküllerinde, Guanin ve Sitozin bazlarının toplamı yaklaşık %53’ün altındadır. Bu alt bölüm, bazen, klostridiyal alt bölüm olarak da ifade edilmekte olup, burada yer alan bakterilerin hepsi laktik asit bakterileri değildir. Bacillus, Listeria, Staphylococcus cinsi bakteriler de bu alt bölümde yer alırlar. Bifidobacterium, Brevibacterium, Micrococcus ve Propionibacterium cinsi mikroorganizmalar da süt fermentasyonlarında yer alan diğer gram-pozitif bakterilerdir. Ancak, biyokimyasal özellikleri yönünden laktik asit bakterileri arasında sayılmazlar, ayrıca filogenetik olarak da laktik asit bakterileri ile yakınlıkları yoktur. Bu bakteriler aktinobakteri (actinomycete) alt bölümü içerisinde yüksek G + C oranına sahip bakterilerdir. Laktik asit bakterileri, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus ve Pediococcus cinslerini içine almaktadır. 2.1.1. Lactobacillus cinsi süt asidi bakterileri Laktobasiller gram-pozitif, katalaz-negatif, spor oluşturmayan çubuk biçimli bakterilerdir. Çubuklar çok uzun ve çok narin incelikte olabileceği gibi, çok kısa, kokobasil şeklinde de olabilir. Zincir formlarına genellikle logaritmik gelişme döneminin geç evresinde rastlanır. Süt asidi bakterilerinin büyük bir kısmı Lactobacillus cinsine dahildir. Günümüze kadar, 80’den fazla tür ve alt türün tanımlaması yapılmış olup, yeni bilgiler doğrultusunda taksonomileri gözden geçirilmektedir. Laktobasiller, toprak, bitki ve hayvanların dahil olduğu geniş bir çevrede bulunan bakterilerdir. Fermente olabilen şekerler, vitaminler, hidrolize protein ürünleri, kofaktörler ve oksijen içeriği düşük ortamlar bu cinse dahil mikroorganizmaların doğal yaşam alanlarıdır. İnsanlar ve hayvanlarda, ağız 2 boşluğu, bağırsak ve vajinada; gübrede; toprakta ve bitkilerde bu mikroorganizmalara rastlanır. Fermentasyon teknolojisinde (örn., silaj yemi, et, yoğurt, peynir, turşu, unlu mamüller) istenen, ancak gıdalarda bozulmaya neden olan mikroorganizmalardır. Süt endüstrisinde yalnızca birkaç türü starter kültür olarak kullanılmaktadır. Beslenme istekleri karmaşıktır. Amino asitlerine, peptitlere, vitaminlere, fermente olabilir karbonhidratlara, yağ asitlerine ve esterlerine, çeşitli tuzlara, nükleik asitlere ve türevlerine gereksinim duyarlar. Lactobacillus cinsi laktik asit bakterileri, çok heterojen bir cins olma özelliği taşımaktadır. DNA baz kompozisyonunda G+C % mol oranı % 32-55 gibi geniş bir aralıkta değişim göstermektedir. Teşhislerinde yararlanılan fenotipik özelliklerine göre iki, üç ya da dört grup altında toplanmışlardır. Fermentasyon özelliklerine göre, aşağıdaki üç alt gruba bölünmüşlerdir: Homofermentatif laktobasiller: Bu grupta yer alan türler, hegsoz şekerlerini Embden-Meyerhof glikolitik yoluna göre parçalar ve yalnızca ya da baskın olarak laktik asit oluştururlar. Pentozları ve glukonatı fermente etmezler. Türlerden bazıları peynir, yoğurt ve probiyotik içeceklerde starter külütü olarak kullanılan önemli bakterilerdir. Fakültatif heterofermentatif laktobasiller: Hegsozları Embden-Meyerhof yoluna göre, pentozlar ve diğer bazı substratları ise fosfoketolaz enzim aktivitesine dayalı metabolik yola göre parçalarlar. Sonuçta, laktik asitin yanı sıra tipik olarak asetik asit ve etanol oluştururlar. Birkaç türü, geleneksel fermente ürünlerin ve silaj yemlerinin üretiminde kullanılır. Obligat heterofermentatif laktobasiller: Bunlar, şekerleri yalnızca fosfoketolaza dayalı metabolik yola göre parçalar, laktik asit ve önemli miktarda asetik asit ve/veya etanol ve CO2 oluştururlar. Bozukluk etmeni bakteriler olarak kabul edilirler. Gastrointestinal sistemde bulunurlar. Ayrıca, olgun peynirin de dahil olduğu değişik gıdalarda bu mikroorganizmalara rastlanabilir. Aşağıdaki çizelgede fermentasyon yollarına göre süt ürünlerinde rastlanan laktobasiller gösterilmiştir. 3 Çizelge. Fermentasyon yollarına göre laktobasil sınıfları Homofermentatif Heterofermentatif Lb. acidophilus Lb. helveticus Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Lb. delbrueckii subsp. lactis Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii Fakültatif Lb. casei Lb. paracasei Lb. plantarum Lb. rhamnosus Lb. coryneformis Lb. curvatum Obligat Lb. brevis Lb. reuteri Lb. fermentum Lb. bifermentans Lb. kefiri Lb. buchneri Kaynak: Curry and Crow, 2010. Filogenetik olarak, Lactobacillus cinsi bakterilerin, aşağıda gösterilen genellikle 3 büyük grubu olduğu kabul edilmektedir: a) Lactobacillus casei – Pediococcus grubu. Homofermentatif, fakültatif heterofermentatif ve obligat heterofermentatif türleri içine almaktadır. Homofermentatif Lb.salivarius Pc.damnosus Fakültatif heterofermentatif Lb.casei Lb.paracasei Lb.plantarum Lb.rhamnosus Lb.sake Pc.acidilactici Obligat heterofermentatif Lb.fermentum Lb.kefiri Lb.sanfranciscens Lb.hilgardii b) Lactobacillus delbrueckii grubu. Bu gruptaki tüm türler homofermentatiftir. Önceden Lb.acidophilus’un alt türleri olan Lb.johnsonii, Lb.amylovorus, Lb.crispatus, Lb.gallinarum ve Lb.gasseri günümüzde ayrı tür statüsü kazanmıştır. Grubun tipik üyeleri aşağıda verilmiştir. Lb.delbrueckii Lb.delbrueckii subsp delbrueckii Lb.delbrueckii subsp bulgaricus Lb.helveticus Lb.acidophilus c) Leuconostoc grubu. Lactobacillus cinsi içerisinde bir iki türün filogenetik olarak, laktobasillerden ziyade Leuconostoc cinsine daha fazla benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. Bu grupta yer alan laktobasiller obligat heterofermentatif (örn.; Lb. fructosus) özellikte olup, karışık hücre morfolojisi sergileyen filogenetik gruba diğer bir örnektir. - Laktobasillerin starter kültür olarak kullanımı Laktobasiller, laktozun hızlı bir şekilde laktik asite dönüşmesi için süte yüksek oranda aşılanırlar. Bunun sonucu, ortamın pH değerini düşürerek 4 istenmeyen bakterilerin gelişimini baskılar ya da onları öldürürler. Ayrıca, fermente ürünlerde jel oluşumu sağlarlar. Süt ürünlerinde starter kültür olarak kullanılacak Lactobacillus cinsi bakterilerin seçiminde dikkate alınan faktörler şunlardır: - Bakterinin türü ve suşu - İnokülüm miktarı - Diğer bakterilerin varlığı ve sayısı - Süt türü - Sütün bileşimi - Sütün ısıl işleme tabi tutulması - Katkı maddelerinin varlığı - Fermentasyon koşulları Bazı durumlarda, laktobasillerin gelişimi ve son üründe asit oluşumu engellenebilir. Starter kültür aktivitesini olumsuz yönde etkileyen bu faktörler aşağıdaki gibidir: Bakteriyofajlar. Laktobasillere özgü bakteriyofajlar sütün fermentasyonu sırasında pıhtılaşmayı yavaşlatırlar. Sütün doğal inhibitörleri (örneğin laktoperoksidaz sistemi). Yüksek somatik hücre sayısı. Antibiyotik ve temizlik maddesi kalıntıları. Mikroorganizmalar tarafından üretilen ya da süte dışarıdan ilave edilen hidrojen peroksit. Isıl işlem uygulamasının tetiklediği inhibitörler. Starter kültür kombinasyonları oluşturulurken, laktobasillerle diğer bakteriler arasındaki rekabetin göz önüne alınması önemli bir husustur, çünkü farklı bakteri türlerine ait birkaç suş diğer starter bakterilerinin faaliyetini engelleyen bakteriyosinler üretebilir. Fermente ürünlerde, esasen Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus starter kültür olarak Streptococcus thermophilus ile birlikte kullanılır. İnokülüm miktarı üretilecek ürüne göre değişebilir. Bulk starter kültürün %3 oranında aşılanması ile 40-45°C’de 3 saat içerisinde pH değeri 4-4.5’e düşebilir. Her iki mikroorganizma ürettikleri bileşikler yardımıyla birbirlerinin gelişimine katkıda bulunurlar. 5 Fermente ürünlerde starter kültür olarak yararlanılan diğer laktobasiller şunlardır: Lb. paracasei subsp. paracasei Lb.acidophilus Lb.rhamnosus Lb. plantarum Lb.reuteri Lb. paracasei biovar shirota Bu bakterilerin fermente ürünlerdeki işlevleri şunlardır: Yavaş hızda asitlik gelişimi sağlamak, Asetaldehit, diasetil gibi aroma maddelerini üretmek, Sağlık açısından yarayışlı özellikler sergilemek, Ekzopolisakkarit üretim yeteneğine bağlı olarak tekstür geliştirici madde işlevi görmek, Bakteriyosin üretim yeteneğine bağlı olarak koruyucu katkı maddesi gibi davranmak. Peynirde starter kültür olarak kullanılan başlıca laktobasil türleri Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis ve Lb.helveticus’dur. Bu bakteriler Mozzarella, Parmigiano ve İsviçre peynirleri gibi pıhtısı haşlanan (45-60°C’de) peynirlerde asitlik gelişimi sağlamak amacıyla, genellikle Sc.thermophilus ile bir arada kullanılmaktadır. Termofilik özellikteki bu laktobasiller haşlama sıcaklıklarında canlılıklarını korur ve soğumakta olan pıhtıda asit üretmeye devam ederler. Termofilik laktobasilin türü ve suşu, inokülasyon oranı ve starter kültür içerisindeki oranı, sütün peynir mayası ile pıhtılaşma döneminde pH değerinin kontrolü açısından önemli noktalardır. Starter kültür içerisinde yer alan Sc.thermophilus tarafından üretilen galaktoz, bu mikroorganizma tarafından fermente edilemediği için, peynir kitlesinde birikerek esmerleşmeye yol açabilir. Bu tip peynirlerde Lb.helveticus suşları ile Lb.delbrueckii subsp. lactis’in bazı suşları, galaktozu kullanmak suretiyle bu kusurun önlenmesini sağlarlar. Laktobasillerin birçoğu peynirde, özellikle olgunlaşma döneminde aroma oluşumuna katkıda bulunurlar. Termofilik laktobasillerin belirli suşları pıhtının asidifikasyonu sırasında ekzopolisakkarit üretir ve pıhtıda tutulan nem oranını artırarak peynir tekstürünü etkilerler. Laktobasiller, peynir üretiminde yardımcı kültür (adjunct culture) olarak da ortama ilave edilirler. Bu durumda, asit üretimi ortama aşılanan diğer bakteri kültürleri tarafından gerçekleştirilir. Laktobasillerin yardımcı kültür olarak kullanımının nedeni, peynirde olgunlaşmaya katkıda bulunmaktır. 6 - Laktobasillerin asitlik ve tat gelişimine ilişkin rolleri Sütteki laktoz, laktobasillerin hızlı bir gelişme göstermesi ve asit üretmesi açısından yararlanabilecekleri tek karbonhidrat kaynağıdır. Laktozun laktobasiller tarafından fermentasyonu sonucu oluşan laktik asit, asetik asit, etanol gibi temel ürünler, asetaldehit, diasetil gibi minör bileşiklerle birlikte süt ürünlerinin tadına katkıda bulunurlar. Laktobasiller tarafından laktozun hangi yola göre kullanılacağı konusunda belirleyici faktörler şunlardır: - Bakterinin türü ya da suşu - Bakterinin transport sistemi - Bakterinin β-galaktozidaz ve β-fosfogalaktozidaz enzim aktivitesi - Sütün galaktoz içeriği Laktozun fermentasyonunda esas olarak 3 muhtemel yol mevcuttur: 1. Laktozun hücre içine taşınması laktobasillerin birçoğunda permeaz enzimi yardımıyla gerçekleşir, daha sonra laktoz β-galaktozidaz enzimiyle glikoz ve galaktoza parçalar. Parçalanma ürünleri olan glikoz ve galaktoz, ya Embden-Meyerhof yoluna (glikolitik yol) göre kullanılıp başlıca fermentasyon ürünü olarak laktik asit üretilir, ya da 6fosfoglukonat yoluna göre laktik asit, karbondioksit, asetat ve/veya etanol oluşturulur. 2. Bazı laktobasiller (örneğin, Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus suşları) Sc.thermophilus’unkine benzer transport sistemine sahiptir. Bu bakterilerde, laktoz hücre içerisine antiport sistemi yoluyla taşınır ve β-galaktozidaz enzimi tarafından parçalanır, fakat oluşan parçalanma ürünlerinden sadece glikoz metabolizmada kullanılır, galaktoz ise hücre dışına atılır. 3. Lb.paracasei suşlarından bazılarında laktoz hücre içerisine laktoz-6fosfat halinde taşınır. Laktoz-6-fosfat, β-galaktozidaz enzimi tarafından glikoz ve galaktoz-6-fosfata parçalanır. Galaktoz-6-fosfat, tagatoz-6fosfat yoluna göre metabolizmada kullanılır ve Embden-Meyerhof yolunun ortasındaki bir basamakta glikozla birleşerek laktik asit üretilir. Laktobasiller süt yağı, kazein, amino asitler, serbest yağ asitleri ve sitrat gibi süt bileşenlerini kullanmak suretiyle de tat oluşturabilirler. Süt ürünlerinde laktobasillerin faaliyeti sonucu tat oluşumu sağlayan reaksiyonlar aşağıdaki gibidir: Kazeinin modifikasyonu: Laktobasiller, tür ve suşlara göre değişmek üzere, proteinaz ve peptidaz enzim enzim aktivitesine sahip bulunmaktadır. Proteinaz ve peptidaz enzimlerinin ortak etkisiyle oluşan bileşikler peynirde ve fermente ürünlerde tat oluşumuna katkıda bulunmaktadır. 7 Amino asit fermentasyonları: Laktobasiller amino asitleri kullanarak süt ürünlerinde tat değişimlerine katkıda bulunabilmektedir. Örneğin, treonin amino asidi Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus tarafından kullanılarak yoğurtta asetaldehit oluşmaktadır. Arjinin, aspartik asit, glutamik asit, serin, kükürtlü ve uzun zincirli amino asitler ve aromatik amino asitler laktobasiller tarafından metabolik faaliyetlerde kullanılan diğer amino asitlerdir. Aromatik amino asitlerin laktobasiller tarafından katabolize edilmesiyle parakresol, indol ve skatol gibi istenmeyen tat bileşikleri ile triptamin ve tiramin gibi zararlı biyojenik aminler oluşmaktadır. Yağın modifikasyonu: Laktobasiller, sütteki digliseridleri ve monogliseridleri parçalayabilen esteraz enzimlerine sahiptir. Laktobasillerin lipolitik aktivitesine bağlı olarak serbest yağ asitleri düzeyindeki artış, bazı süt ürünlerinde tat gelişimine katkıda bulunmaktadır. Laktobasiller yağ asitleri ve alkolden esterler oluşturabilmektedir. 2.1.1.1. Lactobacillus helveticus Lb.helveticus gram-pozitif, katalaz-negatif, spor oluşturmayan termofilik laktobasil türüdür. Çubuk biçiminde olup, çapı 0.5-1.1 µm arasında değişir. Önceleri Thermobacterium helveticus olarak bilinen bu bakteri ekşi süt, peynir gibi kaynaklardan izole edilir. Lb.helveticus suşları filogenetik olarak, diğer termofilik laktobasillerle (Lb.delbrueckii grubu) akraba değildir, fakat Lb.acidophilus ile aralarında %13-44 arasında değişen oranda DNA homologluğu bulunmaktadır. Lb.helveticus ve Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus’un bazı suşları pratikte, starter kültür olarak benzerlik göstermekle birlikte, genetik özellikleri bakımından birbirlerinden kesinlikle ayırtedilebilirler. Genel olarak, Lb. helveticus galaktoz-pozitif (galaktozu enerji kaynağı olarak kullanabilen) termofilik laktobasildir, D(-) ve L(+) laktik asit üretir ve yapısında metakromatik (bazı bazik boyalarla boyanabilen) granüller mevcut değildir. Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus ise, galaktoz-negatif (galaktozu fermente edemeyen) laktobasildir, yalnızca D(-) laktik asit oluşturur ve metakromatik granüllere sahiptir. Lb.helveticus 15ºC’de gelişmez, fakat 45ºC’de iyi gelişir. Suşlarının çoğu 50-52ºC’de maksimum düzeyde gelişme gösterir. Niyasin, riboflavin, kalsiyum pantotenat ve piridoksin veya piridoksal gelişmeleri için zorunlu faktörlerdir. Lb.helveticus suşları arjininden amonyak oluşturmazlar. Lb.helveticus süt proteinleri ve peptitler üzerinde diğer laktobasillere göre daha genel bir aktivite sergileyen proteolitik enzimlere sahiptir. Proteinaz ve 8 peptidaz aktivitesi suşlara göre farklılık gösterir. Lb.helveticus, İsviçre ve İtalyan tipi peynirlerde (pıhtısı 45-60ºC’de haşlanan) tercih edilen bir laktobasil türüdür. Peynirde tat gelişimine katkıda bulunur. Genellikle Streptococcus thermophilus ile birlikte kullanılır. Bakteri türleri tek tek ya da karışık kültür halinde süte aşılanabilir. Starter kültürdeki bakteri suşları ve bakterilerin birbirlerine oranı belirlenirken, ortak gelişim ve ortamda inhibitörlerin mevcudiyeti dikkate alınmalıdır. Böylece, pıhtıda bulunması istenen uygun bir oran sağlanmış olur. Üretilecek peynir tipine ve yapım gereksinimlerine göre, starter kültürde mevcut bakterilerin farklı oranlarından yararlanılabilir. Termofilik laktobasillerin geleneksel olarak yer almadığı peynirlerde, bu bakteri, yardımcı (adjunct) kültür olarak yaygın biçimde kullanılmaya başlanmıştır. Yoğurt ve yoğurt benzeri ürünlerde, Lb.delbrueckii grubuna dahil bakteriler kadar sıklıkla kullanılmaz. 2.1.1.2. Lactobacillus casei grubu Lb.casei, 1916 yılında Orla-Jensen tarafından Streptobacterium casei olarak adlandırılan bir bakteridir. İlk olarak peynirden izole edilmekle birlikte, doğada geniş bir dağılım göstermektedir. Çürümekte olan bitkisel materyaller, silaj yemleri, insanların bağırsağı, ağız boşluğu ve vajinası, lağım suları, ve çeşitli süt ürünleri bu bakterilerin bulunabileceği ortamlardır. Asidurik özelliğe sahip olmaları nedeniyle bitkisel ve hayvansal kökenli fermente ürünlerin birçoğunda bu grup üyelerine rastlanabilir. Bu grubun sütte bulunan iki öenmli türü Lb.casei subsp paracasei (önceden Lb.casei) ve Lb.rhamnosus (önceden Lb.casei subsp. rhamnosus)’dur. - Lb.casei grubunun genel özellikleri Lb.casei grubunda yer alan bakteriler, spor oluşturmayan, hareketsiz, grampozitif, katalaz-negatif çubuk biçiminde mikroorganizmalardır. Gelişme ortamlarında tek, çift veya zincir oluşturmuş halde bulunurlar. 9 Zengin olmayan besi yerlerinde geliştirdikleri koloniler derin ve pürüzsüzdür. Mercimek veya baklava şeklindeki kolonilerin rengi beyazdan çok açık sarıya kadar değişim gösterir. DNA zincirinde G + C % mol oranı % 45-47 arasında değişim gösterir. Bütün türler fakültatif heterofermentatiftir, son ürün olarak laktik asit oluştururlar. Glikozdan gaz oluşturmazlar. Glikozun kısıtlı miktarda bulunduğu koşullarda, laktik asite ilaveten asetik asit, formik asit ve etanol oluştururlar. Pentozları laktik asit ve asetik asite dönüştürürler. Laktik asitin genellikle L(+) izomerini üretirler, ancak bazı Lb.paracasei suşları rasemik formda [(L(+) ve D(-) izomerlerini eşit miktarda içeren] laktik asit oluşturabilirler. Bütün türler 15ºC’de, hatta 6ºC gibi düşük sıcaklıklarda gelişebilir. Gelişmeleri için, riboflavin, folik asit, kalsiyum pantotenat ve niyasine mutlak gereksinim duyarlar, bazı suşları piridoksal fosfat ve piridoksamine ihtiyaç gösterebilirler. Arjininden amonyak oluşturmazlar. Bu gruptaki bakteriler, aminopeptidaz, dipeptidaz ve tripeptidaz ve endopeptidaz enzim aktivitesine sahiptir. Esterolitik aktiviteleri, genellikle düşük düzeydedir. - Lb.casei grubundaki üyelerin ayırtedici özellikleri Lb.casei Burada yer alan birkaç suş, laktoz ve sakarozu fermente edemez ve bu özellikleri nedeniyle diğer grup üyelerinden ayrılırlar. 10°C’de gelişebilir, 45°C’de gelişemezler. Lb.paracasei ile bu özellikleri bakımından benzerlik gösterirler. Lb.rhamnosus’dan 45°C’de gelişememeleri ile ayırtedilirler. 10 Lb.paracasei subsp. paracasei Önceden Lb.casei olarak bilinen bakterilerin çoğunluğu Lb.paracasei subsp. paracasei olarak yeniden sınıflamaya tabi tutulmuştur. 10°C’de gelişebilir, 45°C’de gelişemezler. Bu bakımdan Lb.casei ve Lb.paracasei subsp. tolerans ile benzerlik gösterirler. Ramnozu fermente edemezler. Birkaç suşu L(+) ve D(-) laktat dehidrogenaz enzim aktivitesine sahiptir, bu nedenle rasemik laktik asit üretirler. Lb.rhamnosus Ramnozu fermente ederek asit üretebilir ve 45°C’de gelişebilir. Bu özellikleri ile Lb.paracasei subsp. paracasei’den ayrılır. Tüm suşları 15°C’de, çoğu suş da 10°C’de gelişir. Lb.paracasei subsp. tolerans Ayırtedici özelliği 72°C’de 40 saniye süreyle uygulanan ısıl işlemde canlılığını korumasıdır. 10°C’de gelişebilir, 45°C’de gelişemez. Gruptaki diğer bakterilerden daha az sayıda karbonhidratı fermente eder. - Lb. casei grubunun fermente ürünlerde kullanımı Lb.rhamnosus ve Lb.paracasei, ekzopolisakkarit, bakteriyosin ya da aroma maddeleri oluşturmaları nedeniyle fermente ürünlerin üretiminde kullanılan starter kültür kombinasyonlarında yer alırlar. Genel olarak, sütte yavaş bir asitlik gelişimini sağladıkları için, probiyotik fermente ürünlerde kullanılabilirler. - Peynirde Lb. casei grubu Lb.paracasei ve Lb.rhamnosus ya non-starter (kontaminant) laktik asit bakterileri olarak ya da yardımcı kültür halinde peynirde bulunabilirler. Non-starter laktik asit bakterileri olarak Lb.casei grubu Lb.casei grubunda yer alan bakteriler, non-starter laktik asit bakterileri olarak, peynir tadının oluşmasına katkıda bulunabilir, kusurlara yol açabilir, ya da hiçbir etki yaratmayabilirler. Bu etkiler, bakteri suşuna, hücre yoğunluğuna ve peynire ilişkin faktörlere bağlı olarak değişim gösterir. Laktobasiller çiğ sütün genel kontaminantları olmakla birlikte, floranın çok az bir kısmını oluştururlar. Bulk halindeki sütte sayıları birkaç adetle birkaç bin arasında değişim gösterir. Çiğ sütten üretilen peynirlerde laktobasillerin 11 bulunması doğaldır. Pastörize sütten üretilen peynirlerde ise, laktobasillerin peynir sütündeki varlıkları, mevcut suşların ısıl işleme karşı duyarlığına ve pastörizasyondan sonraki olası kontaminasyona bağlı olarak değişir. Örneğin, Lb.paracasei subsp. tolerans, pastörizasyonda canlılığını korur. Lb.paracasei ve Lb.rhamnosus’un ısıya karşı direnci ise suşlara göre değişim gösterir. Peynir sütünün, pastörizasyon sonrası bu bakterilerle kontaminasyonuna neden olabilen kaynaklar şunlardır: - Peyniraltı suyu (Peynir sütüne ya da telemeye karışması) - Starter kültür (Kontaminasyona uğramış olması) - Pıhtının işlenme şekli (mekanizasyon yerine elle işleme) - Peynir üretiminde kullanılan alet-ekipmanlar (peynir teknesi, peyniraltı suyunun süzülmesinde yararlanılan kaplar, peynir kalıpları, baskı aletleri, taşıyıcı bantlar) - Hava - Yıkama suyu - Salamura - Lb.casei grubunun yardımcı kültür olarak kullanımı Yardımcı kültürler peynirde asit üretimine önemli bir katkısı bulunmayan, fakat olgunlaşmayı hızlandırılan kültürlerdir. Bu kültürler, ısı şoku, dondurulma, püskürterek kurutma ya da dondurarak kurutma teknikleri yardımıyla inaktif hale getirilebilir. Böylece, peynirde gelişme gösteremez, enzim kaynağı olarak görev yaparlar. Lb.paracasei ve Lb.rhamnosus’un seçilmiş suşları düşük yoğunlukta (genellikle 104-106 kob/ml) peynir sütüne ilave edilerek yardımcı kültür halinde kullanılabilir. Peynirin olgunlaşma döneminde, sayıca artış gösterir (107-108 kob/g) ve bu sayıyı belirli bir süre korurlar. Non-starter laktik asit bakteri sayısı düşük olan süt kullanıldığı, peynir çeşidine uygun yardımcı kültür seçildiği ve hijyenik koşullara uyulduğu takdirde, yardımcı kültürler, peynirde tesadüfi olarak bulunan non-starter laktik asit bakteri populasyonunun baskın hale gelmesini sağlarlar. Böylece, peynirin olgunlaşması hızlı ve kontrollü koşullarda gerçekleşerek peynirin kendine özgü tadı oluşur. Bazı yardımcı kültürler, bakteriyosin üretmeleri nedeniyle, istenmeyen mikroorganizmaların, örn.; Clostridium sp., mayalar, diğer laktobasiller veya patojenlerin peynirde gelişmesini engellemek amacıyla kullanılırlar. Probiyotik özelliğe sahip bazı suşlar, peynirde tat ve yapı kusurlarına yol açmadan gelişir ve sayılarını yüksek düzeyde korurlar. Böylece, peynirin değişik özelliklere sahip olmasını mümkün kılarlar. 12 Lb.casei grubunun peynirde gelişimini etkileyen faktörler Peynirin pH değeri, tuz içeriği ve redoks potansiyeli bu grupta yer alan suşların çoğunun gelişimine uygundur. Bu nedenle, sayıları <10 kob/g 7 8 düzeyinden 10 -10 kob/g’a kadar ulaşabilir. Bu sayı, daha sonra, suşlara ve olgunlaşma sıcaklığına göre değişmek üzere azalır. Lb.casei grubunun peynirde gelişme hızını etkileyen en önemli parametre olgunlaşma sıcaklığıdır. Lb.paracasei’nin birçok suşu 4°C’de peynirde gelişir, Fakat Lb.rhamnosus genellikle 10°C’nin altındaki sıcaklıklarda gelişmez. Peynir yüksek sıcaklıklarda olgunlaştırıldığında, bakteri sayısının maksimuma erişmesi için gerekli olan süre kısalır, fakat ölüm oranı da artış gösterir. Peynirin tuz oranı, Lb.casei gelişimi üzerinde suşlara bağlı olarak etki gösterir. Bu gruptaki birçok suş %4-6 nemde-tuz oranından etkilenmez, ancak bu oran diğer non-starter laktik asit bakteri türlerinin gelişimini önemli ölçüde yavaşlatır. Lb.casei’nin bazı suşları, %10’dan daha yüksek nemdetuz oranında gelişebilirler. Lb.helveticus ve Lb.rhamnosus’un çoğu suşu, en az bir tane serin tipi proteinaz enzimine sahiptir. Peynirin tuz oranı ve pH değeri proteinazlar üzerinde önemli bir engelleyici etkiye sahip değildir. Lb.casei grubunda yer alan bazı bakteri suşları, proteolitik enzim sistemlerinin dengeli olmaması nedeniyle, peynirde acı tat kusuruna yol açarlar. Lb.casei grubu, peynirde sitrat, laktat ve aminoasitler gibi diğer substratlardan yararlanarak olgunlaşmayı etkileyen ürünler oluştururlar. - Lactobacillus acidophilus Çubuk şeklinde olup, uçları yuvarlaktır. Eni 0.6-0.9 µm, boyu 1.6-6.0 µm arasında değişir. Kısa zincirler oluşturabilir. 13 Gram pozitif, hareketsizdir, kamçısı bulunmayan bir bakteridir. Genç kültürleri boyandığında tekdüze görünüştedir, ancak yaşlı kültürlerinde hücre içinde çoğunlukla tesbih taneleri veya bipolar görünümlü granüller bulunur. Tipik pigment oluşturmayan koloniler pürüzlü olup, koloni kenarları saçaklıdır, filamentlerin sarmaşık gibi karışık ve kıvrımlı koloni kenarları oluşturduğu dikkati çeker. Homofermentatif olan L.acidophilus DL-laktik asit üretir. Arjininden amonyak oluşturamaz. Sütte %0.3-1.9 arasında değişen düzeyde laktik asit üretir, oluşan laktik asit miktarına bağlı olarak sütün koagülasyon süresi de farklılık gösterir. Hücre duvarının peptidoglikan yapısı L-lisin, D-aspartat tipindedir. Hücre duvarında genellikle taykoik asit bulunmaz, ancak çok az miktarda gliserotaykoik aside rastlanır. L.acidophilus suşlarının antijenleri farklı olduğundan ve bu bakterilerin spesifik bir grup antijeni bulunmadığından serolojik grubu belirlenememiştir. Gelişimi için asetik asit, riboflavin, kalsiyum pantotenat, niyasin ve folik asite gereksinim duyar, mutant tipleri deoksirobozitlere de ihtiyaç gösterir. 14 Optimum gelişme sıcaklığı 35-38ºC arasında değişir, genellikle 45ºC’de hatta 48ºC’de üreyebilir, 15ºC’de gelişemez, 22ºC’de de gelişme göstermez. pH 5.5-6.0’da en iyi şekilde ürer. Çocukların, yetişkinlerin ve süt, süt şekeri, dekstrin içeren besinlerle beslenenlerin bağırsaklarında görülen bir bakteridir. Özellikle iyileştirici etkisi olan asidofiluslu sütün hazırlanmasında kullanılır. - Lactobacillus plantarum Düzgün çubuk şeklindeki bu bakterilerin eni 0.9-1.2 µm, boyu 3.8 µm’dir. Tek, çift veya kısa zincirler halinde bulunabilir. Genellikle kamçısızdır, ancak hareketli bir bakteridir. Diğer taraftan peritrik kamçılı olanları da saptanmıştır. L.plantarum’un anaerob koşullarda üreyen kolonileri 3 mm çapında, kalkık, yuvarlak, düzgün ve yoğun görünümlüdür. Kolonilerin rengi beyaz, açık sarı, bazen de koyu sarı olabilir. Bazı suşları arabinozu, bazıları da arabinoz ve ksilozu fermente edebildikleri için ayrı bir türmüş gibi değerlendirilir ve Lactobacillus arabinosus ve Lactobacillus pentosus isimlerini alırlar. 15 Glukonat içeren besiyerinde fazla miktarda karbondioksit çıkararak ürer. Riboz ve diğer pentozları 1 mol laktik asit ve 1 mol asetik asit oluşturacak şekilde katabolize eder. DL-laktik asit üretir. Bu bakteri FDF yolunu kullanabildiği gibi HMF yolu aktivitesine de sahiptir. Nitratları genellikle indirgeyemez, arjininden amonyak oluşturamaz. Sütte %0.3-1.2 arasında değişen miktarda laktik asit oluşturur ve sütü pıhtılaştırır. Hücre duvarı peptidoglikan yapısı m-diamino pimelik asit tipindedir. Serolojik D grubuna girer, bu özelliği ile L.casei’den kolaylıkla ayrılabilir. Optimum gelişme sıcaklığı 30-35ºC’dir, 15ºC’de gelişebilir, fakat çoğunlukla 45ºC’de gelişemez. Mutlak gereksinim duyduğu vitaminler kalsiyum pantotenat ve niyasindir. Sütten, peynirden izole edilebildiği gibi silo yemlerinden, fermente olmuş bitkilerden, turşudan, salamura sularından, bozulmuş domates ürünlerinden, ekşi hamur, inek gübresi, insan ağzı ve sindirim sisteminden ve ayrıca insan fekalinden izole edilebilir. 2.1.2. Streptococcus cinsi süt asidi bakterileri Streptokoklar, gelişme ortamlarında yuvarlak ya da oval hücreler şeklinde, ikili ya da zincir oluşturmuş halde bulunurlar. Bu cinse dahil bakteriler piyogenik (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pneumonia) ve oral streptokoklar (Sc.salivarius, Sc.mutans) olmak üzere iki grup altında toplanmıştır. Birçoğu omurgalı canlının ağız boşluğunda ve solunum yollarında bulunurlar. Bazıları diş çürüklerine neden olan bakterilerdir. Bazıları da solunum yolları enfeksiyonları, endokardit gibi hastalıklara yol açan patojenlerdir. Bu cins içerisinde yalnızca Streptococcus thermophilus, starter kültür olarak kullanılan türdür. - Streptococcus thermophilus Gram-pozitif, hareketsiz, yuvarlak veya oval biçimli bir bakteridir. İkili ve zincir oluşturmuş halde bulunur. Zincirler bazen çok uzun olabilir. 16 Filogenetik olarak, Sc.thermophilus oral streptokok grubunda yer alır. Herhangi bir sistematik gruplandırmaya uymayan bir bakteridir. DNA-DNA hibridizasyon tekniği ile elde edilen bulgulara göre, Streptococcus salivarius ile yakın akraba olduğu belirlendikten sonra bu bakterinin alt türü olarak sınıflandırılmıştır. Ancak, daha detaylı DNA hibridizasyon çalışmaları sonucu yeniden ayrı bir tür olduğu kabul edilmiştir. Sc.thermophilus, homofermentatif süt asidi bakterisidir, laktozu EM yoluna göre fermente ederek L(+) laktik asit oluşturur. Laktoz, antiport sistemi ile hücre içine taşınır, β-galaktozidaz enzimi tarafından parçalanır ve açığa çıkan monosakkaritlerden yalnızca glikoz kullanılarak L(+) laktik asit üretilir. Böylece, 1 mol laktozun fermentasyonu sonucu 2 mol laktik asit ve 1 mol galaktoz meydana gelir. Sc.thermophilus suşları galaktoz-negatif (Gal-) oldukları için, laktozun fermentasyonu sırasında galaktozdan yararlanmazlar ya da çok azını kullanırlar. Gelişimi, 40-45°C’de optimum düzeydedir, en düşük gelişme sıcaklığı 20-25°C’dir, 47-50°C’nin üzerinde gelişme gösteremez. Sc.thermophilus suşları gelişmeleri için serbest amino asitlere (glutamik asit, histidin, metiyonin, sistein, valin, lösin, izolösin, triptofan, arjinin ve tirozin) gereksinim duyarlar. Hidrolize protein içeren besi ortamlarında iyi bir gelişme gösterirler. Çiğ sütteki azot miktarı, iyi bir gelişme gösterebilmeleri açısından, genellikle yeterli değildir. Yoğurt üretiminde, serum proteinlerinin yeterli düzeyde denatürasyonunu sağlayacak ısıl işlem uygulanması ya da bakterinin uygun Lactobacillus kültürü ile birlikte kullanılması daha iyi gelişmesini sağlar. Yağsız süttozundan hazırlanan sterilize rekonstitüe sütte hızlı bir şekilde gelişerek sıkı bir pıhtı oluşturur. 17 Aminopeptidaz, dipeptidaz, tripeptidaz ve endopeptidaz enzimleri Sc.thermophilus’un sahip olduğu proteolitik enzimlerdir. Diğer laktik starter kültürlere kıyasla Sc.thermophilus daha kısıtlı bir proteolitik sisteme sahiptir. Bu nedenle, daha yüksek proteolitik aktiviteye sahip olan Lactobacillus türleri ile birlikte kullanımı genel bir uygulamadır. Sc.thermophilus herhangi bir probiyotik aktiviteye sahip değildir. Bu durum, Streptococcus türlerinin safra tuzlarına karşı tolerans gösterememesi ve bunun sonucunda bağırsakta varlıklarını koruyamaması ya da gelişememesinden ileri gelmektedir. Sc.thermophilus süt üretim alanlarına çok iyi adapte olmuş bir bakteridir. Yabani türleri yalnızca sütten izole edilebilir. Çiğ sütte düşük sayıda bulunur. Plakalı pastörizatörün rejeneratif bölmesinde biyofilm halinde gelişme göstererek, istenmeyen bir şekilde, pastörize sütte çiğ süttekinden daha yüksek sayıda bakteri bulunmasına yol açabilir. - Süt ürünlerindeki önemi Starter kültür olarak kullanımı Streptococcus thermophilus ile laktobasiller arasındaki simbiyotik ilişki uzun yıllar boyunca fermente ürünlerin ve Emmental ve Mozzarella gibi İsviçre ve İtalyan peynirlerinin yapımına olanak tanımıştır. Termofilik bir bakteri olan Sc.thermophilus bir veya birkaç termofil laktobasil türü ile bir arada kullanıldığında, türlerin tek başlarına kullanımına göre, daha hızlı gelişme sağlandığı ve daha fazla asit ve aroma oluştuğu gözlenmiştir. Çünkü, Lactobacillus proteinazlarının kazeini parçalaması sonucu açığa çıkan ürünler streptokokların gelişimini teşvik ederken, streptokokların oluşturduğu formik asit ve karbondioksit de Lactobacillus gelişimini teşvik etmektedir. Yoğurt üretiminde Sc.thermophilus geleneksel olarak Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ile birlikte kullanılır. Laktik asitle birlikte, lipidler, laktoz ve proteinlerin termal parçalanma ürünleri olan karbonil bileşikleri ve diğer bileşikler yoğurdun tipik aromasını oluştururlar. Peynir üretiminde, asitlik gelişiminden başlangıçta büyük ölçüde Sc.thermophilus sorumludur. Laktozun parçalanması ile açığa çıkan galaktoz Sc.thermophilus tarafından kullanılamadığı için, hücre dışına taşınır ve pıhtıda toplanır. Termofilik laktobasiller (Lb.helveticus ve Lb.delbrueckii subsp. lactis) galaktozu kullanmak suretiyle sayılarını artırır ve optimum koşullarda peynir üretimine olanak tanırlar. Peynirdeki Lactobacillus suşları galaktozdan yararlanamazlarsa, istenen nitelikte peynir elde edilemeyebilir. 18 Sc.thermophilus hızlı yöntemle Cheddar peyniri üretiminde laktokoklarla birlikte kullanılır. Starter kültürün gelişimi, yüksek haşlama sıcaklığı uygulanmak suretiyle hızlandırılır. Pıhtıdaki galaktozun uzaklaştırılmasında, non-starter floradan ya da Lactobacillus yardımcı kültüründen yararlanılır. Galaktozun mevcudiyeti, pizza ya da eritme peyniri gibi ürünlerde kullanılmak üzere ısıtılan peynirin renginin önemli düzeyde kahverengileşmesine yol açar. Ekzoselülar polisakkarit üretimi Genel olarak, Sc.thermophilus’un bazı suşları, diğer süt asidi bakterilerinde olduğu gibi, ekzoselülar polisakkaritler üretirler. “Ropy” olarak adlandırılan bu suşlar, stabilizer kullanımına izin verilmeyen ülkelerde yoğurdun viskozitesinin artırılması ve yapısının iyileştirilmesi açısından yararlı görülmektedir. Ancak, polisakkarit üretimi büyük ölçüde inkübasyon sıcaklığına bağlı olarak değişmekte, Sc.thermophilus kültürleri polisakkarit üretimi bakımından stabil bir durum göstermemekte ve üretilen polisakkaritler arasında bileşim yönünden farklılıklar bulunmaktadır. Bakterinin polisakkarit üretim yeteneğinin stabil olmaması, kısmen, ekzopolisakkariti parçalayabilen glikohidrolazların bulunmasından ileri gelebilmektedir. Polisakkaritlerin bileşimi konusunda yürütülen bir çalışmada, Sc.thermophilus’un bir suşunun ürettiği polimerin 2:1:1 oranında galaktoz, glikoz ve N-asetil galaktozaminlerden ibaret olduğu ortaya konulmuştur. Diğer taraftan, üretilen polimer düzeyi ile ürünün viskozitesi arasında her zaman doğrusal bir ilişki bulunmadığı belirtilmektedir. Bu durum, yapısal değişimlerden ve/veya düşük pH değerlerinde polisakkaritlerin presipite kazeinlerle interaksiyona girmesinden kaynaklanabilmektedir. Antibiyotik testlerinde kullanımı Mastitis tedavisinde antibiyotiklerin kullanımı, sütün antibiyotik kalıntıları ile kontaminasyonuna yol açabilir. Hem toplum sağlığını hem de starter kültür gelişimini olumsuz yönde etkilemesi açısından bu kalıntıların sütte bulunması istenmeyen bir durumdur. Sc.thermophilus’un antibiyotiklerle inhibisyon özelliği, uzun yıllar boyunca sütte penisilin kalıntılarının varlığının ortaya konulmasında belirteç görevi görmüştür. Günümüzde, çok düşük düzeydeki antibiyotik kalıntılarını belirlemek amacıyla indikatör bakteriler olarak daha düşük Bacillus stearothermophilus ya da Geobacillus’dan yararlanılmaktadır. Biyofilm oluşturma özelliği Biyofilmler, ekstraselülar polimerik salgıları yardımıyla süt işleme ekipmanlarının yüzeylerine tutunarak burada gelişen mikrobiyel hücre kümeleridir. Biyofilm içerisindeki bakterilerin elemine edilmesi, serbest halde 19 yaşayan hücrelerden daha güçtür. Ekipmanın yüzeyine biyofilm halinde yerleşen bakteri hücreleri daha sonra ekipmanın tamamına dağılabilir ve süt ürünleri için önemli bir kontaminasyon kaynağı haline gelir. Süt işletmelerinde biyofilm sorununun sıklıkla pastörizatörlerde Sc.thermophilus gelişiminden kaynaklandığı belirtilmektedir. Pastörizatörün soğutma bölmesindeki (30-50°C arasındaki sıcaklık) paslanmaz çelik 7 2 yüzeyde 10 kob/cm düzeyinde bakteri bulunması 7-8 saatlik bir üretim 6 faaliyetinden sonra pastörizatörü terk eden sütte 10 kob/ml düzeyinde Sc.thermophilus bulunmasına yol açabilir. Sütün yüksek sayıda Sc.thermophilus ile kontaminasyona uğraması, Cheddar ve Gouda gibi peynirlerde kullanılması durumunda son ürün kalitesini olumsuz yönde etkileyebilir. 2.1.3. Lactococcus cinsi süt asidi bakterileri Lactococcus cinsi mikroorganizmalar, yuvarlak ya da oval biçimli bakterilerdir. Tek, çift ya da zincir oluşturmuş halde bulunurlar. Gram-pozitif, hareketsiz, spor oluşturmayan, fakültatif anaerop mikroorganizmalardır. 10°C’de gelişebilir, 45°C’de gelişemezler. Glikozun fermentasyonu sonucu predominant olarak L(+) laktik asit oluştururlar. Süt üretim ve işleme alanları bu bakterilerin doğada en fazla bulundukları alanlardır. Hayvansal kaynaklardan ve süt üretim alanlarından izole edilirler. Laktokoklar, mezofilik karakterde bakterilerdir. Fermente süt ürünlerinin üretiminde asit oluşumu sağlamak üzere starter kültür olarak kullanılırlar. Ekşi krema, laktik kültürle olgunlaştırılan kremadan üretilen tereyağı, Cottage ve Quark gibi taze peynirler, Camembert, Brie, Roquefort gibi yumuşak ya da Gouda, Edam, Cheddar gibi sert peynirler, laktik asit kazeini, ve diğer spesifik fermente ürünler bu bakterilerin kullanımıyla üretilen süt ürünlerine örnek olarak gösterilebilir. Lactococcus cinsi süt asidi bakterileri, laktik asit üretimleri ile sütün fermentasyonunu sağlamanın yanı sıra, bu yolla elde edilen ürünlerin tat ve yapı özelliklerinin oluşumuna katkıda bulunmak ve istenmeyen mikroorganizmaların gelişimini engellemek gibi görevleri de yerine getirirler. Klasifikasyonları Sütün ekşimesine sebep olan bakteri, ilk kez 1873 yılında Joseph Lister tarafından izole edilmiş ve önce Bacterium lactis, daha sonra Streptococcus lactis olarak adlandırılmıştır. Orla-Jensen, 1919 yılında, mezofilik karakterdeki bu bakterileri Streptococcus lactis ve Streptococcus cremoris olmak üzere iki türe ayırmıştır. Bu türler, 1933 yılında Lancefield tarafından 20 önerilen serolojik tiplendirmeye göre, N grubu bakterilere dahil edilmiştir. Bu tiplendirme ile, iki bakterinin, A, B, ve C grubundaki patojen streptokoklarla, D grubundaki enterokoklardan ayrımı sağlanmıştır. 1985 yılında Schleifer, 3 grubu resmi olarak farklı cinslere ayırmış ve laktik streptokoklara Lactococcus adı verilmiştir. Bu cins içerisinde yer alan 5 tür arasında süt fermentasyonları açısından önem taşıyan tür Lc.lactis’dir. Ek bilgi: Seroloji, antijenlerle antikorlar arasındaki reaksiyonlarla ilgilenen, vücut sıvılarındaki özellikle de kan serumundaki antikorların ve diğer immünolojik unsurların ölçümü ve tanımlanması ile uğraşan bir bilim dalıdır. Antikorlar, mikrobiyel enfeksiyonlara, yabancı proteinlere (örn., uygun olmayan kan nakli durumunda) ya da bir bireyin kendi proteinlerine (otoimmün hastalıklarda) karşı bir tepkinin ortaya konulmasını gerektiren durumlarda oluşurlar. Bir enfeksiyonun, romatizmal rahatsızlığın ve kan grubunun teşhisi gibi durumlarda serolojik testlerden yararlanılır. Antikorların tayinine dayalı olan serolojik testler şunlardır: ELISA, agglutinasyon, presipitasyon, komplement fiksasyon ve floresen antikorları. Serolojik testlerde, antijen adı verilen, hücreden arındırılmış haldeki spesifik polisakkaritler kullanılmaktadır. Antikorlarla antijenler arasındaki reaksiyon spesifik bir reaksiyon olup, mikroorganizmaların identifikasyonlarında yararlanılan testler arasındadır. Antikorlarla antijenler arasındaki reaksiyon spesifik bir reaksiyon olup, mikroorganizmaların identifikasyonlarında yararlanılan testler arasındadır. Lactococcus lactis’in, Lc.lactis subsp. lactis ve Lc.lactis subsp. cremoris olmak üzere 2 genotipi (genotip: kişiye kalıtımla aktarılan, ancak fiziksel olarak gözlenmesi şart olmayan, organizmanın toplam genetik özellikleridir); organizmanın genetik özelliklerinin toplamıdır) bulunmaktadır. Lactis ve cremoris alt türleri gelişme sıcaklıklarına ve tuza karşı dayanımlarına göre birbirlerinden ayırtedilebilmektedir. Lc.lactis subsp lactis suşları genel olarak daha yüksek sıcaklıklarda gelişebilmekte, %4’lük tuz oranını tolere edebilmekte ve arjininden amonyak oluşturabilmektedir. Lc.lactis subsp cremoris suşları ise %2’lik tuz oranına dayanım gösterebilmekte, arjinini kullanamamakta, ve lactis’e kıyasla daha az biyokimyasal aktiviteye sahip bulunmaktadır. Ayrıca, starter kültür olarak peynirde daha az acılaşmaya ve diğer tat kusurlarına yol açmaktadır. Laktokokların sitratı fermente edebilen suşları, önceleri Lc.lactis subsp. lactis biovar diacetilactis adıyla taksonomik sınıflandırmaya tabi tutulurken, daha sonra lactis’in alt türü olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, bu suşlar, günümüzde halen, önceki isimleri ile anılmakta ya da sitratı-kullanabilen Lc.lactis olarak belirtilmektedir. 21 Metabolik özellikleri Laktokoklar, homofermentatif süt asidi bakterileridir, laktozun fermentasyonu sonucu temel ürün olarak L(+) laktik asit oluştururlar. Laktik asit oluşumunun başlıca etkisi sütün pH değerinin hızla düşmesidir. Laktik asit, ayrıca, fermente ürünlerin temel aroma unsuru olması açısından önem taşımaktadır. Bu cinse dahil bakteriler, tipik olarak %0.8 dolayında laktik asit oluşturur ve 22°C’de bir gece süreyle inkübasyon sonunda pH değerini 4.6’ya kadar düşürürler. Canlı hücre sayısı bu koşullarda 109 kob/ml düzeyine kadar çıkabilir, ancak, düşük pH değerlerinde inkübasyon süresinin uzamasıyla birlikte canlılık oranı hızla azalma gösterir. Fermentasyon sırasında, laktoz, fosfotransferaz sistemi yardımıyla laktoz-6fosfat halinde hücre içine taşınır. Hücre içinde, laktoz-6-fosfat, fosfo-βgalaktozidaz enzimi tarafından glikoz ve galatoz-6-fosfata parçalanır. Glikoz EM yoluna göre, kullanılarak L(+) laktik asit üretilir. Galatoz-6-fosfat ise, belirli bir noktaya kadar tagatoz-6-fosfat yolunun 3 enzimi tarafından metabolize edilir, daha sonra EM yoluna dahil olur ve son ürün olarak L(+) laktik asit üretilir. Sütte az miktarda, yaklaşık %0.2 oranında sitrat mevcuttur. Lc.lactis’in belirli suşları, sitratı kullanarak diasetil üretirler. Diasetil, ekşi kremanın ve kültür kullanılarak üretilen tereyağının tat ve aromasına önemli katkıda bulunan bir bileşiktir. Sitrat fermentasyonu sonucu oluşan diasetil miktarı en fazla 5 ppm kadardır. Bunun nedeni, diasetilin α-asetolaktat dekarboksilaz enzim aktivitesine bağlı olarak kısa sürede asetoine dönüşmesidir. Sitratın fermentasyonu sırasında karbondioksit de oluşur. Karbondioksit, Hollandatipi peynirlerde istenen göz oluşumunu sağlar. Diasetil oluşumunda aşağıdaki biyokimyasal yol izlenir: - Sitrat permeaz enzimi yardımıyla sitratın hücre içine taşınması Sitrat liyaz enzimi tarafından sitratın asetat ve okzaloasetata parçalanması Okzaloasetatın dekarboksilasyonu ile prüvat oluşması Prüvatın fazlasının α-asetolaktata dönüşmesi α-asetolaktattan diasetil ve asetoin oluşması Laktococcus cinsi süt asidi bakterileri, gelişmeleri için, suşlara göre değişmek üzere, 14 farklı amino asidine ihtiyaç duyarlar. Süt serbest amino asitler bakımından nisbeten zayıf bir kaynak olmakla birlikte, kazeinlerin yapısında laktokokların gelişimi için gerekli amino asitler yüksek miktarda bulunur. Bu nedenle, laktokokların sütte gelişmeleri, proteinleri parçalayan proteolitik enzim sistemlerine bağlı bulunur. Laktokokların proteolitik enzimleri 3 grupta toplanır: 22 a) Kazeinleri (αs1-, β-, κ-) peptitlere parçalayan proteinaz b) Parçalanma ürünlerini hücre membranından geçiren taşıyıcı enzimler c) Peptitleri daha küçük peptitler ve serbest amino asitlere parçalayan endopeptidaz ve amino peptidazlar Laktokokların lipolitik aktiviteleri düşük düzeyde olmakla birlikte, kısa zincirli yağ asitlerinden serbest yağ asitleri oluşumunda yer alarak peynirde aroma gelişimine katkıda bulunurlar. Lc.lactis’in birçok suşu antimikrobiyel bileşikler üretir. Bakteriyosin olarak tanımlanan bu bileşiklerin çoğu yalnızca yakın akraba oldukları laktokok suşları üzerinde bakterisit aktivite gösterir. Ancak, nisin ve laktisin 3147 gibi bakteriyosinler, gram-pozitif bakterileri de kapsayan geniş bir antibakteriyel etki spektrumuna sahiptir. Bunlar, gıdaların korunmasında doğal koruyucu inhibitörler olarak kullanılmaktadır. Karışık veya çok suşlu starter sistemlerinde bakteriyosin üretim yeteneği istenen bir nitelik değildir, çünkü fermentasyon sırasında starter kültürdeki bakteri dengesi bozulabilmektedir. Lc.lactis’in bazı suşları ekzopolisakkarit üretmektedir. Ekzopolisakkarit üretimi fermente süt ürünlerinin yapı ve tat özelliklerinin iyileştirilmesi bakımından önemli bir noktadır. 2.1.4. Enterococcus cinsi süt asidi bakterileri Enterokoklar gram-pozitif, tipik olarak yuvarlak veya oval biçimli bakterilerdir. Genellikle hareketsiz bakterilerdir, ancak hareketli olan türlerine de sıklıkla rastlanır. Serolojik olarak D grubunda yer alırlar. Tür isimleri bu bakterilerin bağırsak kökenli olduğunu ifade etmektedir. İlk kez insan bağırsağından izole edilmişlerdir. İnsanların ve monogastrik hayvanların bağırsakları, yeşil bitkiler, süt ve toprak dahil değişik ortamlarda yaşarlar. Bu grubun başlıca üyeleri şunlardır: Enterococcus faecalis (eski adı Streptococcus faecalis) Enterococcus faecium ( “ “ Streptococcus faecium) Enterococcus durans 23 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Ec. faecalis ve Ec.faecium’un diğer gram pozitif-bakterilerden farklılığı katalaz-negatif olmaları, 10°C ve 45°C’de gelişebilmeleri, 9.6 pH değerinde %6.5 tuz içeren ortamda gelişebilmeleri ve 60°C’deki ısıl işlem uygulamalarında canlılıklarını koruyabilmeleridir. Spor oluşturmayan bakteriler arasında ısıya karşı en fazla tolerans gösteren mikroorganizmalardır. Ek bilgi: Katalaz enzimi, oksijeni kullanarak solunum (respirasyon) yapan bakteriler tarafından salgılanır ve onları oksijen metabolizmasının toksik yan ürünlerine karşı korur. Katalaz pozitif bakteriler, son elektron akseptörü olarak oksijeni kullanıp solunum yapabilme yeteneğine sahip olmakla birlikte, zorunlu aerop ve fakültatif anaerop bakterilerden oluşurlar. Katalaz negatif bakteriler, anaerop olabilirler ya da yalnızca fermentasyona yol açan, oksijeni kullanarak solunum yapamayan fakültatif anaerop bakterilerden oluşurlar (örn. Streptokoklar). Solunum, oksijen varlığında glikozun CO 2 ve suya dönüşmesi sonucu fazla miktarda ATP’nin açığa çıktığı bir süreçtir. Bu süreç, krebs siklüsü, elektron transport zinciri ve oksidatif fosforilasyondan ibarettir. - Enterokokların süt teknolojisindeki önemi Enterokoklar, süt teknolojisinde hem yararlı hem de bozukluk etmeni olabilen mikroorganizmalardır. Süt ürünlerinde istenen tat artışı sağlamaları, bakteriyosin üretmeleri ve probiyotik olarak faaliyet göstermeleri bakımından yararlı, ürünlerde bozulmaya yol açmaları nedeniyle de istenmeyen bakteriler olarak görülürler. Doğal olarak bulundukları birçok ortamdan birisi çiğ süttür. Enterokokların bir kısmı pastörizasyon uygulamasıyla inaktif hale getirilmekle birlikte, bazıları 24 canlılıklarını koruyabilirler. Dolayısıyla, çiğ süte enterokokların bulaşması ve sütün işlenmesi sırasında canlılığın korunması süt ürünlerinde bu bakterilerin bulunmasına yol açar. Bu nedenle, enterokoklar esas olarak üretim hijyenini ya da kalitesini ortaya koyan indikatör mikroorganizmalardır. Peynir gibi tuz içeren ürünlerde canlı kalabildikleri için, enterokok grubu mikroorganizma sayısının hijyenik kalite göstergesi olarak koliform grubu mikroorganizma sayısından daha güvenilir olduğu kabul edilmektedir. Peynirde enterokok sayısı peynir çeşidine ve üretim mevsimine bağlı olarak değişim göstermektedir. Çoğu peynirde enterokok mevcut değildir, ancak tamamen olgunlaşmış bazı peynirlerde predominant bir durum gösterebilirler. Bu durum, peynirin üretimi ve olgunlaştırması sırasında uygulanan koşullarda enterokokların canlılıklarını koruyabilme ve gelişebilme yeteneklerine bağlı olarak değişmektedir. Enterokoklar geniş bir sıcaklık aralığında gelişebilir, tuza karşı yüksek bir tolerans gösterir, asit üretebilir ve kazeinin parçalanmasında yer alan proteolitik enzimleri salgılalarlar. Bu özellikleri de peynirde varlıklarını korumalarını sağlamaktadır. Farklı peynir pıhtıları ile yapılan çalışmalar, enterokok sayısının 104-106 kob/g arasında, olgunlaşmasını tamamlamış peynirlerde de 105-107 kob/g arasında değiştiğini ortaya koymuştur. - Tat üzerine etkileri Enterokokların belirli suşları, bazı peynirlerin olgunlaşması ve aromasının gelişiminde önemli rol oynamaktadır. Bu özellikleri nedeniyle, belirli starter kültürlerinde belirli enterokok suşlarına (örn.; Enterococcus faecium K77D suşu) yer verilmekte, özellikle Avrupa’nın güneyindeki bazı bölgelerde çiğ ya da pastörize sütten üretilen çeşitli peynirlerde (örn., Fontina peyniri) enterokokların bulunması ve gelişimi fazlaca arzu edilmektedir. Enterokoklar diğer laktik asit bakterilerinden daha yüksek proteolitik aktiviteye sahip bulunmakta, bu da peynir olgunlaşması açısından önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir. Diğer taraftan, enterokoklar salgıladıkları esteraz enzimleri yardımıyla süt yağını parçalamakta ve bu yolla da olgunlaşmaya katkıda bulunmaktadır. Bunlara ek olarak, enterokoklar asetaldehit, diasetil, asetoin gibi tipik aroma maddeleri oluşturmakta ve peynir aromasının gelişimine katkı sağlamaktadır. - Bakteriyosin üretimleri Bakteriyosinler, Listeria ve Clostridium türleri dahil, bakterilere karşı aktivite gösteren, ısıya dayanıklı, küçük non-lantibiyoktiklerdir. Enterokokların, diğer laktik asit bakterilerinin çoğunun ürettiği antimikrobiyel peptitlerden daha çeşitli antimikrobiyel peptitler ürettikleri ortaya konulmuştur. Süt işletmelerinde Listeria gibi patojenlerin kontrolünde öncelikle hijyenik önlemlerin alınması gerekmektedir. Enterokokların, Listeria türlerine karşı 25 sekonder koruyucu madde olarak kullanılabileceği açıklanmaktadır. Özellikle, yumuşak tipteki bazı peynirlerde, pH değerinin kabuk kısmında belirli bir düzeye kadar artışı ile Li.monocytogenes’in gelişiminin belirli ölçüde kontrol altına alınabildiği bu konuda yürütülen çalışmalarda ortaya konulmuştur. Enterokoklar, Cl tyrobutyricum’a karşı aktivite göstermeleri nedeniyle, ambalajlı peynirlerde söz konusu bakteriden kaynaklanan şişme kusurunun önlenmesinde potansiyel bir kullanım alanına sahip bulunmaktadır. Silaj üretiminde, fermentasyon işleminin başlangıcında enterokoklar ortamda aktif durumda bulunmakta ve gram-negatif bakterilerin gelişimini engelleyici bir etki göstermektedir. Böylece, fermentasyonun devamını sağlayan laktobasiller için uygun bir ortam yaratılmış olmaktadır. - Probiyotik etkileri Hem Ec.faecium hem de Ec.faecalis probiyotik olarak kullanılmaktadır. Örneğin; Ec.faecium SF68 suşunun diyare tedavisinde kullanılabileceği belirtilmektedir. Bu etkinin, bağırsakta komensal olarak faaliyet göstermesinden ve latent (lag) fazı ile logaritmik çoğalma fazının kısa (20 dk.) olmasından ileri gelebileceği belirtilmektedir. Söz konusu suşun, düşük pH değerlerinde canlılığını koruması, safra tuzlarına karşı duyarsız olması ve bireylerde herhangi bir yan etkiye yol açmadan yüksek düzeyde tolere edilebilmesi avantajlı yönlerini oluşturmaktadır. Ayrıca, antibiyotiklere karşı kısmen direnç göstermekte ve E.coli, Salmonella, Shigella ve Enterobacter türlerinin gelişimini in vitro koşullarda önlemektedir. Klinik çalışmalarda, iyileşme periyodunu önemli düzeyde kısalttığı belirlendiği için, diyare tedavisinde antibiyotiklerin yerine kullanılabileceği bildirilmektedir. - Bozukluk etmeni olarak rolleri Bazı peynirlerde, yüksek düzeyde enterokok kontaminasyonu, duyusal özelliklerin bozulmasına yol açabilmektedir. Örneğin, geleneksel yolla üretilen İspanyol mavi peynirinde yapı, tat, koku ve görünüş kusurlarının 1 x 105 kob/g düzeyindeki enterokok sayısı ile bağlantılı olduğu ortaya konulmuştur. - Patojeniteleri ve antibiyotik dirençleri Ec. faecalis ve Ec. faecium’un, doğrulanmamakla birlikte, gıda kökenli rahatsızlıklara sebep olan mikroorganizmalar olmalarından şüphelenilmektedir. Hastane enfeksiyonları; endokarditis ve bakteriyemi (bakterilerin veya bakteri toksinlerinin dolaşım sistemine geçmesiyle oluşan ateş ve titremenin eşlik ettiği klinik tablo) gibi süperenfeksiyonlar; yeni 26 doğanlarda meydana gelen enfeksiyonlar; idrar yolları, merkezi sinir sistemi, intra-abdomen ve leğen kemiği enfeksiyonlarında bu bakteriler teşhis edilmiş, ancak, patojeniteleri kanıtlanmamıştır. Enterokokal enfeksiyonların büyük bir kısmının bağırsak kaynaklı olduğu düşünülmektedir. Antibiyotiklere özellikle de vankomisine karşı dirençli olmaları, enterokoklardan ileri gelen enfeksiyonların tedavisini güçleştirmektedir. Bu durum, büyük ölçüde, enterokokların diğer bakterilerden direnç genlerini elde etmelerinden ileri gelmektedir. Enterokoklar, spesifik ekstraselülar matriks proteinlerine kolaylıkla bağlanabilmeleri ve ayrıca hidrofobik interaksiyonlara girmeleri sayesinde konakçı dokulara etkili bir şekilde yerleşmektedir. Gerek Ec. faecalis, gerekse Ec. faecium’un patojenik potansiyele sahip olabileceği belirtilmektedir. Bu nedenle, her iki bakteriye de gıdalarda bulunması istenmeyen mikroorganizmalar gözüyle bakılmakta ve patojenik suşlarının gıdalar yoluyla taşınabileceği ve hastalığa yol açabileceği konusunda şüpheler bulunmaktadır. Gıda zincirinden kaynaklanan enterokokal enfeksiyonların ortaya çıktığı durumlarda, özellikle antibiyotik kullanılan hayvanlardan elde edilen ürünlerde vankomisine dirençli suşlara rastlanabileceği açıklanmaktadır. Ec.faecalis’in Ec.faecium’dan daha fazla patojenik potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir. Bunun nedeni, enterokokal enfeksiyonların %80’den fazlasının Ec.faecalis’le bağlantılı bir durum göstermesidir. Bununla birlikte, insanlarda meydana gelen hastalıklarda enterokokların bulunma sıklığı ile gıdalarda enterokokların bulunma sıklığı arasında doğrusal bir ilişki olmadığı belirtilmektedir. 2.1.5. Leuconostoc cinsi süt asidi bakterileri Leuconostoc cinsi içerisinde tanımlanmış 11 tür yer almaktadır. Aşağıdaki çizelgede izole edildikleri kaynaklara göre Leuconostoc türlerine yer verilmiştir. Taksonomik revizyonlarda, Ln.cremoris, Ln.dextranicum ve Ln.mesenteroides, Ln.mesenteroides’in alt türleri olarak sınıflandırılmıştır. Önceleri Ln.oenos ve Ln.paramesenteroides olarak bilinen türler de günümüzde sırasıyla, Oenococcus oeni ve Weissella paramesenteroides adlarıyla yeni bir sınıflandırmaya tabi tutulmuştur. 27 Çizelge. Leuconostoc cinsi mikroorganizma türleri ve alt türleri Tür Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides subsp. dextranicum subsp. cremoris Leuconostoc lactis Leuconostoc argentinum Leuconostoc carnosum Leuconostoc gelidum Leuconostoc fallax Leuconostoc citreum Leuconostoc pseudomesenteroides Birincil kaynağı Bitkiler/çiğ süt peynirleri/etler Bitkiler/çiğ süt peynirleri Süt ürünleri Süt ürünleri Çiğ süt Dondurulmuş etler Dondurulmuş etler Mayonez , ekşi krema İnsan klinik kaynakları İnsan klinik kaynakları Bu bakteriler doğada yeşil bitkilerin yaprakları, tohumları, meyveleri ve çiçeklerinde yerleşik bir durum gösterirler. Tereyağı, ekşi krema, Gouda ve Edam peyniri gibi süt ürünlerinin, et ürünlerinin ve turşuların üretiminde önem taşıyan bakterilerdir. Süt ürünlerinde genellikle iki tür mevcuttur: a. Ln.lactis b. Ln.mesenteroides (subsp.mesenteroides, subsp. dextranicum) subsp. cremoris ve Ln.mesenteroides karışık suşlu mezofilik starter kültürlerden ve fermente ürünlerden en sık izole edilen türdür. - Genel özellikleri Leuconostoc cinsi bakteriler gram-pozitif, katalaz-negatif, fakültatif anaerop, hareketsiz bakterilerdir. Hücreleri tek boyutlu bölünme gösterir. Genellikle çift veya zinci oluşturmuş halde bulunurlar. Oluşturdukları koloniler genellikle 1 mm çapında veya daha küçük, yuvarlak şekilli ve grimsi beyaz renktedir. Optimum gelişme sıcaklıkları 20-30ºC arasındadır. Patojen özellik göstermezler. Kemoorganotrofturlar. Karmaşık büyüme faktörlerine ve çeşitli amino asitlere gereksinim duyarlar. Bütün türleri ve alt türleri üreme için nikotinik asit, tiyamin, pantotenik asit ve biyotine ihtiyaç duyarlar. Kobalamin ve paraaminobenzoik asit üremeleri için mutlak gerekli değildir. 28 Sitokromları (oksijenin var olduğu ortamlarda yaşayan canlılarda bulunan ve hücre solunumunda kullanılan bir pigment) yoktur. Arjinini hidrolize edemez ve sütü ender olarak pıhtılaştırırlar. Bu özellikler Leuconostoc cinsinin saptanması açısından önem taşımaktadır. İndol oluşturmaz, nitratı indirgeyemez ve hemoliz yapmazlar. DNA molekülünde % G + C oranı Leuconostoc lactis’de 43-44, diğer türlerde 38-42 arasında değişir. 29 Çizelge. Leuconostoc cinsi mikroorganizmaların özellikleri Özellikleri Ln.lactis Ln.mesenteroides subsp. cremoris Hücre şekli Arjininden amonyak üretimi Sitrat metabolizması Şeker fermentasyonu Laktat izomeri Şekerlerin kullanımı: Glikoz Galaktoz Laktoz Mannoz Rafinoz Mannitol Arabinoz Gelişme 10ºC’de 45 ºC’de %6.5 NaCl’de pH 4.8’de Sütte laktat üretimi Sütte litmusun indirgenmesi Katalaz Vankomisin direnci Sakarozdan dekstran üretimi Bakteriyosin üretimi Ln.mesenteroides subsp. mesenteroides Ln.mesenteroides subsp. dextranicum Kok + Heterolaktik D(-) Kok + Heterolaktik D(-) Kok + Heterolaktik D(-) Kok + Heterolaktik D(-) + + + ± ± - + + + - + + + Tanımlanmamış + + + + Tanımlanmamış + <%0.5 + Tanımlanmamış + %0.2 + Tanımlanmamış + + Tanımlanmamış + + + Kaynak: Liu and Holland, 2009 + pozitif reaksiyon; - negatif reaksiyon; ± değişken reaksiyon; heterolaktik fermentasyon: düşük miktarda laktik asit üretimi 30 + Tanımlanmamış + + Tanımlanmamış - Biyokimyasal özellikleri Sitratın fermentasyonu Sitrat, birkaç Leuconostoc türü tarafından metabolik faaliyetlerde kullanılabilir. Ancak, sitrat tek başına enerji kaynağı olarak kullanılmaz, ayrıca fermente olabilir bir şekere de ihtiyaç duyulur. Sitratın kullanımında Lc.lactis subsp lactis biovar diacetilactis tarafından kullanılan biyokimyasal yolun aynısı izlenir. Sitrat fermentasyonu sonucu oluşan diasetil bazı süt ürünlerinde önemli uçucu aroma maddesidir. Ayrıca, fermentasyon ürünlerinden olan karbondioksit bazı peynirlerde göz oluşumundan, fermente ürünlerde de gaz kabarcıklarının çıkmasıyla kendini belli eden köpürmeden sorumludur. Birincil fermentasyonları Bu mikroorganizmalar heterofermentatiftir, yani glikoz ve galaktoz gibi hegzos şekerlerini fosfoketolaz yoluna göre katabolize eder ve son ürün olarak D-laktik asit, etanol ve karbondioksit oluştururlar. Glikoz (galaktoz) D-laktik asit + etanol + CO2 + 1 ATP Ortamda asetaldehit ve pürüvat gibi dış elektron akseptörlerinin bulunması halinde, etanol yerine asetik asit oluşur ve 1 ATP daha üretilir. Leuconostoc’lar laktozu esas olarak β-galaktozidaz enzimi yardımıyla parçalarlar. Laktozun hücre içine iletiminde permeaz enzimi yardımcı olur. Hücre içerisinde laktoz β-galaktozidaz tarafından glikoz ve galaktoza parçalanır. Glikoz fosforilize edilir ve fosfoketolaz yoluna göre metabolizmada kullanılır. Galaktoz ise, fosforilizasyona uğrar ve galaktoz-1-fosfat meydana gelir, bu bileşik daha sonra glikoz-1-fosfata dönüşür ve glikozda olduğu şekilde metabolize edilir. Leuconostoc’lar pentoz şekerlerini (riboz, arabinoz, ksiloz) hegsoz monofosfat (pentoz fosfat) (HMF) yoluna göre metabolize ederler. Bunun sonucunda 1 mol laktat, 1 mol asetat ve 2 mol ATP oluşur, etanol ve karbondioksit meydana gelmez. Bu metabolik faaliyetlere ilaveten, Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides ve subsp dextranicum suşlarının sakarozdan dekstran üretebildikleri bilinmektedir. Fakat, süt ürünlerinde bu özelliğe rastlanmamıştır. 31 Leuconostoc’ların genellikle proteolitik ve lipolitik aktiviteye sahip olmadıkları kabul edilmektedir. Bununla birlikte, intraselülar (yalnızca üretildiği hücre içerisinde aktiviteye sahip) ve hücre duvarıyla bağlantılı proteolitik, peptidolitik, esterolitik ve lipolitik aktiviteler gösterirler. İntraselülar esteraz ve lipaz aktiviteleri laktokoklarınkine benzer ve daha ziyade kısa zincirli yağ asitlerinin esterlerini parçalamaya yöneliktir. İntraselülar proteinaz ve peptidaz aktiviteleri laktokoklarınkinden çok düşük düzeydedir. Bu özellikleri nedeniyle, Leuconostoc’lar süt proteinlerini ve süt yağını sınırlı düzeyde parçalayabilirler. İkincil fermentasyonları Sitratın parçalanması sırasında Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides tarafından amino asitler de sentezlenmektedir. Sitratın parçalanma ürünlerinden olan okzaloasetat transaminasyon yoluyla aspartata dönüşebilmektedir. Ayrıca, bu transaminasyon reaksiyonu sırasında α-ketoasitlerden glutamat ve lösin gibi diğer amino asitler de sentezlenebilmektedir. Asetaldehit, taze peynir, fermente krema ve fermente süt ürünlerinde laktokok ve laktobasil gibi starter kültürleri tarafından üretilen başlıca aroma maddesidir. Fakat, asetaldehitin aşırı miktarda oluşumu bu ürünlerde “yeşil elma benzeri” olarak adlandırılan bir tat kusuruna yol açmaktadır. Leuconostoc’lar asetaldehiti kullanarak onu etanole indirgemekte ya da asetik asite oksitleyebilmektedir. Bu bakteriler şekerlerin fermentasyonu sırasında oksijeni elektron akseptörü olarak kullanabilmektedir, bunun sonucunda fazla miktarda asetik asit ve ATP, az miktarda da etanol oluşmaktadır. Starter kültür olarak kullanımları Leuconostoc cinsi mikroorganizmalardan süt teknolojisinde genellikle aroma üreticisi mikroorganizmalar olarak yararlanılır. Bunlar, asitlik gelişimi sağlayan mezofilik Lactococcus lactis subsp. lactis ve/veya Lc lactis subsp. cremoris bakterilerinin tek veya karışık suşları ile kombine hale getirilerek kullanılırlar. Mezofilik starter kültür olarak aşağıdaki süt ürünlerinde kullanılırlar: 32 Peynir (Cottage ve krem peynirleri, mavi damarlı peynirler, Feta, Gouda, Edam ve Havarti peynirleri, Quark). Gouda, Edam ve mavi damarlı peynirlerde göz oluşumunu sağlamak amacıyla kullanılırlar. Olgun krema Fermente ürünler (fermente yayıkaltı, fermente krema ve İskandinav tipi fermente ürünler) Kefir Karışık suşlu mezofilik kültürler geleneksel olarak 4 gruba ayrılır: 1. D kültürleri. Aroma üreticisi olarak kullanılan, yalnızca, sitratı kullanan Lc lactis subsp lactis biovar diacetilactis’in bulunduğu kültürlerdir. 2. L kültürleri. Önceden B kültürleri olarak adlandırılan kültürlerdir. Aroma üreticisi olarak yalnızca sitratı kullanan Leuconostoc’ların bulunduğu kültürlerdir. 3. DL kültürleri. Önceden BL olarak bilinen kültürlerdir, Hem D hem de L kültürlerini bulundururlar. 4. O kültürleri. Önceden N kültürleri olarak bilinen kültürler olup, aroma üreticisi mikroorganizma bulundurmazlar. Mezofilik kültürlerde, Leuconostoc cinsi bakteriler toplam floranın %1-10’nu oluştururlar. - Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Kökeni süt ve mamülleridir. Hücreleri yuvarlaktır, hücrenin iki tarafı dış bükey biçimlidir. Hücre boyutları 0.5-0.7 veya 0.7-1.2 µm arasındadır. Çift ve kısa zincir oluşturur. Tipik özelliklerinden birisi sakarozdan mukoz madde olarak dekstran üretmesidir. Ancak üretilen dekstran miktarı çok azdır. 33 (A) (B) (A) Leu.mesenteroides ssp mesenteroides’in mikroskobik görünümü (B) Katı besiyerinde Leu.mesenteroides ssp mesenteroides kolonileri Glikozu hegzos-mono-fosfat (HMF) yoluna göre katabolize ederek D-laktik asit, etanol ve karbondioksit oluşturur. Bu bakteride 1-6 früktozdifosfat enzimi yoktur, fosfoketolaz enzimi önem taşır. Bazı suşları aerop koşullarda oksijeni kullanarak glikozdan laktik asit, asetik asit ve karbondioksit oluşturur. Gelişimi için az sayıda amino asidine gereksinim duyar, fakat bütün suşları valin ve glutamik asite mutlak gereksinim gösterir. Optimum gelişme sıcaklığı 20-30ºC arasındadır, 10-37ºC arasında gelişebilir. Isıya karşı direnci mukoz madde oluşturma yeteneğine bağlı bir durum gösterir. Mukoz oluşturan suşları 80-85ºC’deki sıcaklığa dayanıklıdır, mukoz oluşturmayanlar 55ºC’de 30 dakikalık ısıtma işlemine dayanamazlar. 2.1.5. Pediococcus cinsi Filogenetik olarak, laktobasillerle birlikte gruplandırılmışlardır. Doğada, daha ziyade bitkilerde yaşarlar. Asma gibi bitkilerin yaprağında, ekşi kremalarda, silajda, zeytinde ve birada bu bakterilere rastlanabilir. Bu geniş yaşam alanı 34 nedeniyle, Pediococcus cinsi bakteriler farklı ortamlara ve ekstrem yaşam koşullarına kendilerini kolayca adapte edebilirler. Gram-pozitif, katalaz-negatif, hareketsiz bakterilerdir. İki boyutlu olarak bölündükleri için çift halde veya tetrat formunda bulunurlar. Pediococcus cinsi bakterilerde zincir formlarına rastlanmaz. Bu morfolojik yapı pediyokokların zincir oluşturan koklardan ayrımını sağlayan bir özelliktir. Homofermentatif yolla DL-laktik asit üretirler. Glikozu katabolize ederek asit üretir, fakat gaz oluşturmazlar. Bu yönleri ile Leuconostoc cinsi mikroorganizmalardan ayrılırlar. Bu cinse giren mikroorganizmalar şunlardır: Pediococcus cerevisiae Pediococcus acidilactic Pediococcus pentosaceus Pediococcus halophilus Pediococcus urinae-equii Pediyokokların bazı suşları antimikrobiyel özelliklere sahip olduğu için, fermente ürünlerde bu bakterilere yer verilmektedir. Bakteriyosin üretme yeteneğine sahip bakterilerdir. Pediyosin olarak adlandırılan bu madde ticari olarak piyasada bulunmakta ve gıdaların güvenli hale getirilmesinde, özellikle Listeria sp. gelişiminin kontrol altına alınmasında kullanılabilmektedir. 35 2.1.6. Süt asidi bakterileri dışında laktozu fermente eden diğer bakteriler - Bifidobacterium cinsi bakteriler Bu cinse dahil türler, önceleri laktobasiller içerisinde sınıflandırılmış, günümüzde Actinomycetaceae familyasına dahil edilmiştir. Başlıca yaşam alanları insanlar ve hayvanların bağırsağıdır. En az 32 tür ve alt türün tanımlaması yapılmıştır. Süt teknolojisi açısından önem taşıyan tür Bifidobacterium bifidum’dur. Anaerop karakterde bakterilerdir. Gram-pozitif reaksiyon vermekle birlikte, kültürün yaşına bağlı olarak gram reaksiyonu değişiklik gösterir. Çubuk şeklindeki bakterilerin görünüşü de değişken olabilir. Anaerop koşullarda gelişen yüzey kolonileri yuvarlak, konveks biçimli olup beyaz, opak, pürüzsüz, düz ve mukoid yapıda olabilir. Optimum gelişme sıcaklıkları 36-38ºC’dir, 20ºC ve 45ºC’de gelişemezler. pH değeri 6-7 arasında olan ortamlarda gelişirler, ortamın pH değeri 5.5’in altına düştüğü zaman gelişme frenlenir. Bifidobacterium cinsi bakteriler karbonhidratları fermente etmek suretiyle laktik ve asetik asit üretirler. Suşlarının birçoğu, ticari ürünlerde probiyotik kültür olarak kullanılır. 36
