PCR (POL*MERAZ Z*NC*R REAKS*YONU)
advertisement
PCR (POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU) GÜLBEYAZ ÇEVİK İLK KEZ 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem araştırmada hem de klinik laboratuarlarda tanıda yeni bir çığır açmıştır. ABD'de Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir. PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), in vitro koşullarında DNA dizilerinin çoğaltılması esasına dayanmaktadır. PCR; basit spesifik hassas bir tekniktir. PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ PCR tekniği, temelde üç aşamadan oluşmaktadır. 1)DNA Zincirinin Açılması (Denaturation) Kalıp DNA (template DNA), 92-95 oC’de 1-2 dakika tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçikleri birbirlerinden ayrılmaktadır. DNA zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak gerekebilir. PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ 2)Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması (Annealing) Reaksiyon sıcaklığının, 37-65 oC’ye düşürülerek oligonükleotid primerlerinin açılan DNA zincirlerinin kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması işlemidir. Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak 3060 saniyede gerçekleşmektedir. PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ 3) Primer Uzaması (Primer Extesion) DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA polimeraz enzimi (Taq DNA polymerase) vasıtasıyla uzatılmasıdır. Taq DNA polymerase 72 oC sıcaklıkta daha iyi çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu sıcaklıkta yapılmaktadır. POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU • In vitro DNA (gene) amplifikasyon tekniği 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ DNA 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ >90° POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU 5’ 3’ 37–65° 3’ 5’ POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU 5’ 3’ 72° 3’ 5’ POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ >90° 37–65° 72° 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU 5’ 3’ >90° 37–65° 72° 3’ 5’ POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU >90° 40–60° 72° POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU 2n x PCR: 3 steps Üç basamaktan (denaturation, annealing, primer extension) oluşan işlem, bir PCR devrini temsil eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA parçacığı çoğaltılır. PCR sonucunda elde edilen DNA parçacıkları agaroz veya poliakrilamit jellerde yürütüldükten sonra, ethidium bromide (EtBr) veya gümüş nitrat (GN) ile boyanarak gözlemlenir. PCR OPTİMİZASYONU PCR şartları yeni PCR uygulaması için uygun bir şekilde yeniden ayarlanmazsa bazı problemlerle karşılaşılabilmektedir. Bu problemler; PCR’dan beklenen ürün ya az alınır yada hiç alınmaz. Primerlerin yanlış bağlanmasından dolayı spesifik olmayan bantlar oluşabilir. Primerler yanlış şekilde uzayabilir. Primer-dimer oluşumu ortaya çıkabilir ve bu oluşumlar çoğaltma işlemini yavaşlatır. Yeni sentezlenen DNA dizilerinde mutasyon veya istenilenden farklı diziler ortaya çıkabilir. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 1)Enzim Konsantrasyonu Diğer PCR şartları optimum seviyede olduğu zaman 100 μl reaksiyon için önerilen Taq DNA polimeraz enzim konsantrasyonu 1-2.5 ünitedir. Fakat enzim gereksinimi kullanılan kalıp DNA veya primere göre değişebilir. Enzim konsantrasyonu düşük olursa elde edilecek ürün (DNA) az olur. Enzim konsantrasyonu yüksek olursa spesifik olmayan bantlar ortaya çıkabilir PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 2)Magnezyum Konsantrasyonu Mg konsantrasyonu primerlerin açılan DNA zincirlerine yapışmasını, kalıp DNA’nın açılma sıcaklığını, PCR sonucunda elde edilen DNA kalitesini, primer-dimer bağ oluşumlarını, enzim aktivitesi ve güvenilirliğini etkilemektedir. Taq DNA polimeraz enziminin iyi bir şekilde çalışabilmesi için; kalıp DNA, primerler ve nükleotid bazları üzerinde serbest Mg iyonlarının bulunması gerekir. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 3)Deoksinükleotid Trifosfatlar (Deoxynucleotide Triphosphates=dNTPs) dNTP konsantrasyonunun yüksek olması yeni sentezlenen DNA dizilerinde istenilenden farklı dizilerin (misincorporation) hatalı olarak ortaya çıkmasına sebep olabilir. Bu yüzden mümkün olduğu kadar düşük konsantrasyonda dNTP’leri kullanmak PCR spesifikliğini ve güvenilirliğini artırmaktadır. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 4) DNA Zincirinin Açılması İçin Gerekli Zaman ve Sıcaklık PCR uygulamalarında sistemin çalışmamasının en önemli sebeplerinden birisi kalıp DNA zincirinin veya üretilen DNA parçacığının yeterince açılmamasıdır. Genel olarak DNA moleküllerinin 95 oC de 2 dakika tutulması zincirin açılması için yeterli olmaktadır. Fakat GC bazlarınca zengin kalıp DNA zincirlerinde bu süre ve sıcaklığın fazla olması istenmektedir. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 5)Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması Primerlerin açılan DNA zincirlerine yapışması için gerekli sıcaklık derecesi ve zaman aralığı primerlerin konsantrasyonu, elde edilecek DNA’nın uzunluğu ve kullanılan bazların kompozisyonuna göre değişir. Primerlerin kalıp DNA’ya bağlanması 37- 65 oC sıcaklıklarda gerçekleşir. Primerler açılan DNA’ya bağlanması sırasında sıcaklığın artırılması DNA seçiciliğini artırmaktadır. Dolayısıyla primerlerin yanlış yerlere bağlanması ve hatalı DNA dizilerinin elde edilmesi önlenmiş olmaktadır. Özellikle PCR işleminin ilk birkaç devrinde sıcaklığın artırılması PCR uygulamasının hassasiyetini çok yükseltmekte ve spesifik olarak beklenen DNA parçacıkları sentezlenmektedir. Sıcaklığın düşürülmesi primerlerin hatalı şekilde uzamasına ve yeni sentezlenen DNA dizilerinde hatalı baz bağlanmalarına sebep olmaktadır. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 6)Primer Uzunluğu, Konsantrasyonu ve Yapısı Yüksek primer konsantrasyonu primerlerin yanlış bağlanmasına ve spesifik olmayan DNA bantlarının üretilmesine sebep olur. Ayrıca primer-dimer oluşumunu teşvik ederek elde edilecek ürünün (DNA) az olmasına sebep olmaktadır. Primerlerin yapışma sıcaklığını hesaplamak için bir formül geliştirilmiştir. Bu formül Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T) şeklinde ifade edilmiştir. Burada Tm yapışma sıcaklığını, G,C,A ve T ise nükleotid bazlarını ifade etmektedir. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 7)Primer uzaması Primerlerin DNA polimeraz tarafından uzatılması için gerekli zaman, çoğaltılması hedeflenen kalıp DNA parçasının uzunluğu, kalıp DNA’nın konsantrasyonu ve ortam sıcaklığına bağlı olarak değişmektedir. Genel olarak primer uzatılma işlemi 72 oC de yapılmaktadır. Çünkü bu sıcaklık Taq DNA polimeraz enziminin iyi çalışması için uygun bir ortam oluşturmaktadır. PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 8)Devir sayısı PCR’ın çalışma şartları iyi ayarlandığı taktirde 25-40 devir sayısı yeterli olmaktadır. Devir sayısının fazla olması spesifik olmayan bantların ortaya çıkmasına, devir sayısının az olması üretilen DNA miktarının az olmasına sebep olmaktadır. PCR KULLANIM ALANLARI Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında adli tıpta onkogenesisin araştırılmasında klonlamada / gen ekspresyon araştırmalarında DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında bilinmeyen dizilerin belirlenmesinde geçmiş DNA'nin incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm (RFLP) Analizinde gen aktarılmış bitkilerin ve DNA baz dizilerinin belirlenmesi REAL TIME PCR Son yılllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, realtime PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır. REAL-TIME PCR Real-time PCR Reaksiyon esnasında her bir PCR siklüsünde yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama sonuna kadar oluşan ürünü kontrol eden bir sistemdir. REAL-TIME PCR Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken izleme ve miktar belirleme yöntemidir. GERÇEK ZAMANLI PCR Kantitasyon Erime eğrisi (Tm) analizi Multipleks uygulaması KLASİK PCR PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanır; analiz edilir. “REAL TIME PCR” (GERÇEK ZAMANLI PCR) PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler saptanmaya başladığı anda değerlendirmeye alınır. KLASIK PCR’DA PROBLEMLER Primer seçimi ve dizaynı Termalcycler programları Reaksiyon şartları Zaman alan analiz işlemleri Bir testin optimizasyonu Agaroz jel elektroforezi, Blotlama Kontaminasyon riski REAL-TIME PCR’IN AVANTAJLARI Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor Reaksiyon boyunca veri toplanarak aynı anda analiz imkanı PCR sonrası ürünlerin ikincil bir işlemi gerekmiyor (yüksek verimlilik,düşük kontaminasyon riski) ultra-rapid siklus (30 dak. to 2 saat) 10¹º katı bulan geniş dinamik aralık İki kat değişikliği hızla tanımlayabilmekte Spesifik erime eğrisi analizleri ile spesifik amplifikasyonların tanımlanması Duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği yüksek Konvensiyonel PCR’dan daha pahalı değil REAL-TIME PCR’IN DEZAVANTAJLARI teknik donanım, alt yapı, beceri ve tecrübe gerektiriyor Yüksek ekipman ihtiyacı Aynı ve farklı laboratuvar’lar arasında sonuçlar arası faklılıklar Standardizasyon problemi REAL TIME PCR’IN KULLANIM ALANLARI Real-time PCR tekniğine dayalı pek çok çalışma yapılmış ve bu çalısmalarda amplifikasyon ürünlerinin tespitinde kullanılan tekniklerde şu şekilde belirlenmiştir. 1)Nükleik Asit Boyaları: Bu teknikte, çift zincirli nükleik asitlere baglanan bir boyanın olusturdugu sinyal, termal cycle üzerindeki optik okuyucu ile tespit edilir. En yaygın kullanılan boya,SYBR Green I’dir. 2)Moleküler Beacon: Bu molekül uçları birbirine yapışık yaklaşık 25-35 baza sahip saç tokası şeklinde işaretli bir oligonükleotiddir. PCR sırasında molekül açılarak komplimenter olduğu amplikona bağlanır ve bu sırada 5’ ucunda bulunan boya serbest hale geçerek floresans bir ışın yayar. 3)Taqman Probları: SYBR Green I’deki güçlükler ve moleküler beacon’daki esneklik probleminin giderilmesi amacıyla gelistirilmistir. Bu teknikte amplifikasyon ürününe spesifik olarak hibridize olan isaretli bir oligonükleotid (TaqMan probları) polimeraz enzimi ile yıkılınca, 5’ ucunda bulunan boya serbest hale geçer ve yaydıgı ısın, real-time cihazında kaydedilir.
