Transgenik Rodent Üretimi - Journal of Clinical and Analytical

advertisement
ne
ci
of Clinic
M
ical edi
al
and Anal
yt
al
Transgenik Rodent Üretimi
· Jour
n
Haydar Bağış
Özet
Transgenik hayvanlar kendi genomunda baska bir
organizmaya ait rekombinant bir geni tasıyan hayvanlardır.
Mikroenjeksiyon teknigi ile üretilen ve daha çok hastalık
modellemesi amacıyla gelistirilen transgenik farelerin ilki
1980 yılında yayınlanmıstır. Fakat, özellikle transfer edilen
genin ürününün elde edilmesi, yani, transgenik hayvanların
bir çesit “protein üreten fabrika” olarak kullanılması
hedeflendiginde bu alandaki çalısmalar da farklı bir boyut
kazanmıstır. Temel amaç, elde edilecek ürünün –ki bu
ürün terapötik degere sahiptir ve tıbbi açıdan son derece
degerlidir- bol miktarda ve mümkün oldugunca saf olarak
kazanılmasıdır. Aktarılan rekombinant genin (transgenin)
ekspresyonunun, promotor gibi gen ekspresyonunu kontrol
edici dizilerin yardımıyla transgenik hayvanın belirli
dokularına yönlendirilmesi ve böylece hedef proteinin süt
ve idrar gibi vücut sıvılarından salgılanmasının saglanması
çalısmaları, çok az süt verdiklerinden dolayı farelerin bu
amaç için uygun olmadıgını açıkça ortaya koymustur. Varılan
nokta, rekombinant proteinlerin üretilmesinde kullanılacak
transgenik hayvanların, bol süt veren çiſtlik hayvanlarından
seçilmesi gerekliligi olmustur. Teknigin ilk adımında, mezbaha
materyalinden veya ovaryumlardan oosit pick-up (OPU) ile
elde edilen olgunlasmamıs oositlerin in vitro maturasyonu
ve in vitro fertilizasyonu
gerçeklestirilmektedir. Daha sonra, pronükleer dönemde
bulunan zigotlara mikroenjeksiyon yöntemi ile 2-4 ng/
µl konsantrasyonda gen konstraktından (transgen) 2 piko
litre verilmektedir. Süt alınması temel sart oldugundan, in
vitro kültür ortamında morula ya da blastosist asamasına
gelen embriyolara sex tayini yapılarak disi olanlar belirlenir.
Sonraki adım, disi embriyoların tasıyıcı annelere transfer
edilmeleridir. Dogan yavrular arasından transgenik olanlar
çesitli moleküler biyolojik yöntemlerle (PCR, Southern Blot)
saptanır. Transgenik çiſtlik hayvanlarının üretimi ile yılda 1
tona yakın rekombinant protein, ölü insan dokularındakinden
çok daha saf, sağlığa uygun ve bol miktarda elde
edilebilmektedir.
Giriş
İlk transgenik rodent 1980 yıllında pronükler DNA
mikroenjeksiyon yöntemi ile Gordon ve ark. Tarafından elde
edilmiştir [1]. Daha sonra 1985 yılında ilk transgenik tavşan,
koyun, domuz ve inekler elde edilmiştir. Yapılan ilk deneysel
transgenik çalışma, 1980’li yıllarda rodent metallotiyonin
promotorü altında sıçan büyüme hormonu geni kullanılarak
gerçekleştirilmiştir [2]. Daha sonraki yıllarda deneysel
çalışmalardan elde edilen olumlu sonuçlarla çok sayıda
büyüme hormonu geni ekonomik önemi olan çiſtlik hayvanlarda
tekrarlanmıştır. Ülkemizde ise ilk doktora tezi düzeyinde
çalışma Bağış [3] tarafından rodentlerde gerçekleştirilerek
transgenik rodentler elde edilmiştir. Elde edilen transgenik
rodentler insan büyüme hormonu geni taşımaktadırlar. Daha
sonraki yıllarda insan hepatit B virus genomunu [4], balık
antifriz protein (AFP) ve insan gamma interferon genlerini
taşıyan ve bu genleri değişik dokularında ifade eden
transgenik rodentler elde edilmiştir. [5-7]. Transgenik hayvan
kendi genomunda “transgen” olarak adlandırılan yabancı
DNA parçası taşıyan hayvan olarak isimlendirilir. Transgenik
hayvanların üretim tekniklerinin gelişimi biyoloji, tıp ve
veteriner hekimlik alanındaki araştırmalar için çok sayıda
yeni fırsatlar sağlamaktadır. Bu teknoloji aynı zamanda
tarım, hayvan ve insan sağlığını içeren diğer alanlarda da
yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu hayvanlar, geleneksel
üretim metotlarının yerine laboratuvarda rekombinant DNA
teknolojisinin kullanılmasıyla üretilir. Bunun için bir transgen
(aktarılan gen), bir genin kontrol elementlerini (enhancer
element ve promotor) ve buna ilaveten diğer bir genin protein
kodlayan DNA baz dizisini (cDNA veya genomik DNA) içerebilir.
Transgenin kontrol elementi transgenin ekspresyonunu
kontrol eder. Bazı kontrol elementleri transgenin dışarıdan
uyarılabilir ekspresyonunu sağlar; örneğin, metallothionin
promotorlu bir transgenin ekspresyonu içme suyuna Çinko
ve Kadmiyum’un ilave edilmesiyle uyarılabilir. Transgenik
hayvanların üretiminde en yaygın olarak kullanılan yöntem
pronükler DNA mikroenjeksiyondur [8]. Gen transferi, bir
hücreli dönemdeki döllenmiş yumurtaların (zigotların)
pronukleuslarına DNA mikroenjeksiyonu tekniği ile yapılır
ve transfer edilen gen (transgen) embriyonun genomu
içerisinde rastgele bir yere yerleşir. Bu rastgele gerçekleşen
integrasyonun moleküler mekanizması henüz tam olarak
bilinmemektedir [2]. Bu teknoloji sayesinde, doğal yetiştirme
yöntemlerinden farklı olarak, pronükler DNA mikroenjeksiyon
yöntemi ile türler arasında (türden türe) da gen transferi
olayı gerçekleştirilebilmektedir. Örneğin; insan genleri,
ekspresyon davranışlarının çalışılabilmesi amacıyla hayvan
modellerinin üretilebilmesi için rodent genomu içerisine
entegre edilebilmektedir [8]. Transgenik çalışmaların
çoğu rodentler ile yapılmaktadır. rodentlerin transgenik
çalışmalarda yaygın bir şekilde kullanılmalarının sebebi
diğer türlerle karşılaştırıldığında maliyetlerinin az olması,
biyolojilerinin yoğun biçimde bilinmesi, yavru sayısının çok
olması (10-15 ad.), doğum (19-21 gün) ve östrus siklusunun
(4 gün) kısa olmasıdır. Ek olarak, transgenik rodentler,
genlerin fonksiyonlarının ve gen regülâsyonlarının canlı
hayvanda çalışılmasına olanak sağlamaları bakımından
diğer sistemlere göre daha üstün avantajlar sunmaktadırlar.
Mikroenjeksiyon tekniği ile üretilen ilk transgenik rodent
1980 yılında elde edilmiştir [1]. O zamandan günümüze
kadar yüzlerce transgenik rodent hattı geliştirilmiştir.
Transgenik rodentler hastalık modeli olarak kanser,
AIDS, kistik fibrozis, kronik hipertansiyon, Alzheimer,
Sorumlu Yazar: Haydar Bağış, Tıbbi Genetik AD, Adıyaman Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Adıyaman, Türkiye. GSM: +905327337379 E-Mail: hbagis@adiyaman.edu.tr
80
of Clinical
andand
Analytical
Medicine
| Journal
of Clinical
Analytical
Medicine
1Journal
Transgenik Rodent Üretimi
Transgenik Rodent Üretimi
Hepatit B, Werner sendromu vs gibi alanlarda, yeni tedavi
stratejilerinin geliştirilmesinde, fonksiyonu bilinmeyen genlerin
araştırılmasında kullanılmaktadırlar. Bunlardan başka, transgenik
hayvanlar organ naklinde (xenotransplantasyon),gen tedavisinde
kullanılması düşünülen bazı vektörlerin araştırılmasında ve tıbbi
öneme sahip bazı rekombinant proteinlerin süt, idrar ve kan
gibi çeşitli dokularda üretilmesinde de kullanılmaktadır. Çeşitli
rekombinant proteinlerin sözü edilen dokularda sentezlenmesi
amacıyla üretilen transgenik hayvanlara “biyoreaktörler
(Bacasız İlaç fabrikaları)” adı verilmektedir. Bu güne kadar
50-55 rekombinant proteinin transgenik rodent, tavşan, keçi,
koyun, domuz ve ineklerin sütünde ekspresyonları sağlanmıştır
[9]. Transgenik hayvan teknolojisi ile koyunların yapağı kalitesini
artırmaya yönelik birçok çalışma yapılmıştır [10]. Mikroinjeksiyon
tekniği ile elde edilen transgenik koyunlarda, yapağı veriminde
önemli oranda artış sağlandığı bildirilmiştir. Koyunlarda yapağı
kalitesinin artırılması için sistein biyosentezi değiştirilmiş ve
sistein üretiminin artırılması sonucu yapağı üretim hızının
artırıldığı bildirilmiştir.
e)Nükleer Transfer Teknolojisi İle Transgenik Hayvan
Eldesi
Son yıllarda transgenik çiftlik hayvanlarının üretiminde
klonlama teknolojisinden oldukça yararlanılmaktadır. Bunun için
aktarılacak gen somatik hücrelere elektroporasyon ile aktarılır
(konstrakt Neo resistantlık ve markır genlerini beraber taşımalı)
gen transferi yapılan somatik hücreler seçildikten (yeşil görünen
veya neomisine dirençli olanlar) sonra Metafaz-II aşamasındaki
inek veya keçi yumurtalarının genetik materyali (iğ iplikleri)
ve birinci kutup cismi enüklasyon pipeti ile dışarı alınır. Gen
transferi yapılmış vücut hücresi (fibroblast, granuloza vs) enükle
edilmiş yumurtaların perivitellin boşluğuna enjeksiyon pipeti
ile transfer edilir. Hücre transfer sonrası hücrenin yumurtanın
sitoplazması içine girmesi için elektrofüzyon yapılır. Füzyon
sonrası bu yumurtalar aktive edilerek blastosist dönemine kadar
kültüre alınır. Bu dönemde ya uygun bir alıcı ineğin uterusu
içersine transfer edilir veya uygun bir dondurma tekniği ile bu
embriyolar dondurularak saklanırlar. Bu teknoloji ile elde edilen
yavrular hem klon hem de transgenik olacaklardır.
Gen Transferinde Kullanılan Teknikler
a)Viral Vektörlerle Gen Transferi Tekniği
İnsan ve hayvanlara ait çok önemli genlerden bazılarının, ökaryotik
viral vektörler aracılığı ile embriyolara nakli ve nakil işleminden
sonra bu genlerin entegrasyon ve ekspresyonlarının sağlandığı
bildirilmektedir. Bu vektörler, birçok DNA ve RNA karakterinde
genetik materyal taşıyan, özellikle RNA karakterindeki genoma
sahip olan virüslerden, retrovirüslerin dışardan verilen yabancı
DNA ile kombinasyonundan elde edilen rekombinant vektörlerinin
kullanılmasıyla transgenik canlılar elde edilmiştir.
f)Pronükleer-Dna Mikroenjeksiyon Tekniği
Transgenik hayvan üretiminde yukarda açıklanan çeşitli teknikler
geliştirilmiş olmasına rağmen pratikte en yaygın kullanılanı
tek hücreli embriyonun (zigot) bir pronukleusuna rekombinant
DNA’nın doğrudan mikroenjeksiyon ile verilmesi en etkili yol
olarak bilinmektedir.
b)Embriyonik Kök Hücrelerine Gen Transferi Tekniği
Bu teknikle, blastosistin “inner cell mass“ (ICM) hücrelerinden
elde edilen embriyonik kök hücrelerine (stem cell) rekombinant
DNA (transgen) elektroporasyon tekniği ile transfer edilir. Geni
taşıyan 10-15 adet kök hücre seçilerek alıcı blastosistin blastosöl
boşluğuna mikroenjeksiyon ile transfer edilir. Kök hücre transferi
yapılan 4-10 adet blastosist taşıyıcı farenin kornu uterusuna
cerrahi yöntem ile transfer edilirler. Transfer edilen kök hücreler
blastosistin “inner cell mass“’leri birbirleri ile kaynaşarak kimerik
fareler elde edilir. Kimerik fareler renk ayrımına göre yapılırlar.
Renk ayrımında esas gen transferi yapılan kök hücreler siyah ve
alıcı blastosistler ise beyaz farelerden elde edildikleri için doğan
hayvanların bir kısmı siyah-beyaz (benekli) olacaktır. Seçim
buna göre olacaktır.
c)Spermatozooitlere Gen Transferi Tekniği
Transferi düşülen gen (plazmid-DNA) spermalar ile beraber
birlikte birkaç saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda gen
transferi yapılan spermalar ile in vitro fertilizasyon yapılarak
transgenin yumurtanın içerisine girmesi sağlanır. Ayrıca,
kurutulan spermatozoitlere gen transferi yapıldıktan sonra
spermatozoitin yumurtaya intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu
(ICSI) tekniği ile aktarılması sağlanarak transgenik fare elde
edilmiştir.
d)Testislere Gen Transferi Tekniği
Plazmid-DNA (sirküler formda) yalnız veya lipozomlar ile birlikte
testislerin kapsulalarının altına bir ml’lik şırıngaya bağlı 30gauge’lik bir iğne yardımıyla verilir. Gen transferinden 2-4 gün
sonra kaput ve korpus epididimislerde yapılan incelemelerde
aktarılan genlerin varlığı tespit edilmiştir.
2 | Journal of Clinical and Analytical Medicine
Pronükler DNA Mikroenjeksiyon Tekniği ile Transgenik
Rodent Üretimi Aşamaları
Transgenik hayvan üretiminde çeşitli teknikler geliştirilmiş
olmasına rağmen pratikte en yaygın kullanılanı pronükleer
safhadaki embriyonun (zigot) bir pronukleusuna rekombinant
DNA’nın doğrudan mikroenjeksiyon ile verilmesi en etkili yol
olarak bilinmektedir [8,11]. Transgenik hayvan üretiminde
kullanılan prosedür aşağıda yazıldığı gibidir.
a)Gen Konstraktlarının Dizaynı ve Hazırlanması
Amaca uygun bir promotor-enhancer (beta-actin, CMV, betalaktoglobin vs) ve ekspresyon vektörü seçilir. Vektöre önce
promotor ve daha sonra transgen (sub-cloning) klonlanır.
Rekombinant vektörde bulunan promotor-transgen ve
sonlandırıcı dizi (SV40 Poly A) restriksiyon endonüklaz enzimleri
ile kesilerek çıkarılır ve agaroz jelden prüfiye edilir (kit ile).
Elde edilen gen konstraktı Tris-EDTA tamponu ile konsantre
edilir Elde edilen konstrakt hazırlanırken şu hususlara dikkat
edilir. Plazmidin kesim şekline, genin kopya sayısına, DNA’nın
büyüklüğüne (2-8 kb), temizliğine ve vektör sekanslarının
olmamasına dikkat edilir [8]. Gen konstraktının yani dairesel
plazmitin bir kısmının enzimler ile kesilerek çıkarılmış bölümü
(linner kısım) embriyolara mikroenjeksiyon ile aktarılmaktadır.
b)Embriyo Eldesi
Rodentlerde ovulasyon ve çiftleşme günlük ışık periyodu ile ilişkili
olduğundan, elde edilecek embriyoların ne zaman pronükleer
dönemde olacakları yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.
Pronükleer safhadaki zigotların eldesinde, 10-12 haftalık ve
ortalama 150-200 gram ağırlığındaki çeşitli soydaki (Spraque
Dawley) sıçanlar kullanılmaktadır. Sıçan barınma odasında
lambalar sabah 04.00 de yanıp akşam saat 16.00’da söner. Östrus
senkronizasyon için PMSG ve hCG hormonları kullanılır. Bunun
için saat 13.00-15.00 arasında 15 IU PMSG ve 48 sat sonra
10-15 IU dozu hCG periton içine enjekte edilir. hCG hormonunun
Journal of Clinical and Analytical Medicine
81
Transgenik Rodent Üretimi
Transgenik Rodent Üretimi
enjeksiyonundan hemen sonra sıçanlar kafeslerde tekli olarak
bekletilen fertil erkeklerle bire bir oranında çiftleştirmeye alınır.
hCG enjeksiyonundan yaklaşık bir saat sonra vaginal plak
kontrolü yapılır. Vajinal plakları görülen sıçanlar ayrı bir kafese
toplanarak deneye alınırlar. Plak göstermeyen dişiler ayrılır ve
gebelik şüphelerinden dolayı farklı bir kafeste bekletilirler. Plak
gösteren tüm sıçanlar CO2 gazı ile itlaf edildikten sonra batın
bölgeleri açılarak oviduktları M2 medyum içerisine alınır ve bu
oviduktlardan zigotlar elde edilir. Elde edilen zigotlar R1ECM
embriyo kültür medyumlarında kültüre alınır. Kültür ortamı
olarak %5 CO2, %95 hava, 370C sıcaklık ve %90’nın üzerinde
nem içeren inkübatörler kullanılır [12-13].
c)Mikroenjeksiyon İle Gen Konstraktının Aktarımı
Pronukleer safhadaki embriyolar, çukur bir lamın ortasında
bulunan ve üzeri mineral yağla kapatılmış olan 20-30 μl’lik
M2 vasatının içine konur ve ters mikroskopun tablasına
yerleştirilmekte ve mikroenjeksiyon setinde gerekli ayarlama
işlemleri tamamlandıktan sonra önceden hazırlanan gen
konstraktının 1-2 piko litresi mikroenjeksiyon ile erkek
pronükleusun içine verilir [11]. Tüm embriyolarda gen aktarım
işlemi tamamlandıktan sonra mikroenjeksiyon sonunda sağlam
kalmış embriyolar gece boyu KSOM veya CZB vasatlarında % 5
CO2 ‘li ortamda kültüre edilirler.
d)Embriyo Transferi ve Doğum
Embriyo transferi için yaklaşık 30 ad. Olgun Sprague-Dawley
soyu 13 haftalık alıcı dişi sıçanlar kulanılır. Alıcı sıçanların
senkronizasyoun için vazektomize edilmiş erkek sıçanlar
kullanılmaktadır. Senkronize edilen hayvanları anlamak için
vaginal plaklarına veya vaginal semar alınarak içinde lökositlere
varlığına bakılır. Vajinal plak gösteren sıçanlar, hCG enjeksiyonunu
takiben 21. saatte erkeklerin yanından alınarak ameliyathaneye
getirilir. Vaginal plaklı alıcı sıçanlar ketamin ve rompun ile genel
anesteziye alınır ve anestezi altındaki sıçanlar sırt bölgesinden
açılarak mikroenjeksiyon yapılmış embriyolar infundubulim
bölgesinden transfer edilir. Her alıcı anneye 15-20 ad. Embriyo
transfer edilebilir. Embriyo transferinden yaklaşık 19-21 gün
sonra gebe kalan alıcı annelerin % 70-80’i doğurabilir [8].
e)Genomik DNA Eldesi ve Transgenin Tespit Edilmesi
Embriyo transferi sonrası doğan yavrular 21 günlük yaşa
eriştikleri zaman kuyruk dokularından 1’er cm kesilerek alınır
ve bunlardan genomik DNA izolasyonları yapılır. Bu DNA’larda
aktarılan transgenin varlığı için Shouthern blot, Slot blot veya
PZR gibi moleküler teknikler kullanılır. Çalışmanın amacına
göre, hemizigot veya homozigot rodentler kullanılır. Gen
ekpresyonlarına bakmak için Northern blot (RNA ile yapılır),
dokularda transkripte bakmak içinde RT-PZR ve protein
ekspresyonlarına bakmak için Westhern blot yapılır. Transgenin
varlığı tespit edilen yavrulara founder (anaç) ismi verilir ve F0
olarak değerlendirilir. Ancak doğan her anaç rodentden ayrı
ayrı üretim hatları oluşturulur. Çünkü her anacın (F0) taşıdığı
transgen kromozomların farklı yerlerinde olabilir. Her F0 anaç
rodent normal rodentler ile çiftleştirilir ve bunlardan elde edilen
F1 rodentler kendi aralarında çiftleştirilir. Bunlardan (%25
homozigot, %75 hemizigot ve %25 boş) elde edilecek erkek ve
dişi homozigot rodentler kendi aralarında çiftleştirilerek hattın
devamlılığı sağlanır. Elde edilen her homozigot rodent mutlaka
normal rodentler ile geri çaprazlamaya alınır ve doğan bütün
yavruların hepsinin hemizigot olması gereklidir. Şayet doğan
rodentlerin hepsi transgenik değil ise transgenik lokus sıtabil
82 Journal of Clinical and Analytical Medicine
3 | Journal of Clinical and Analytical Medicine
olmayabilir veya üreme hücrelerinde kaybolmuş olabilir. Ayrıca,
bazı durumlarda transgen üreme hücrelerine girmemiş olabilir
ve bu tür hayvanlar mozaik olarak değerlendirilir (yavrularına
aktarılan geni transfer edemiyeceğinden dolayı). Bu gibi F0
hayvanları üretimde kullanmamak gerekir [11].
f) Embriyoların dondurulması
Mikroenjeksiyon sonrası uygun alıcı rodentler bulunmadığı
durumlarda embriyolar dondurularak saklanabilirler. İlk başarılı
embriyo dondurma işlemi 1972 yılında fare embriyolarında
gerçekleştirilmiştir [14]. Daha sonra Wilmut ve Rowson dondurup
çözündürdükleri fare ve sığır embriyolarından gebelik elde
ettiklerini bildirmişlerdir [15]. Yapılan bu ilk çalışmalarda DMSO
(Dimetilsülfoksit) kriyoprotektan olarak kullanılmış ve dakikada
0,2C’lik bir soğutma hızı uygulanmıştır. Sonraki yıllarda farklı
hayvan ve insan embriyoları başarılı şekilde dondurulmuştur
[16-17].
Embriyo dondurma ve çözme işlemi, embriyolar kimyasal
maddelerle (kriyoprotektan) dengelendikten sonra soğutulması
ve -196 santigrat derecede sıvı nitrojen içinde depolanması,
çözüldükten sonra da krioprotektan ortamından uzaklaştırılarak
ileri gelişimi sağlamak için özel kültür ortamlarının içine
alınması işlemlerini kapsamaktadır. Her iki işlem de çok dikkatli
yapılmalıdır. Hücre yapısının korunabilmesi için hücrelerin düşük
hızda su kaybetmeleri buna bağlı olarak da yavaş soğutma
yöntemi ile dondurulmaları sağlanmalıdır. Soğutma sırasında
içindeki saf su katılaşır ve sonuçta hücreye göre daha yoğun
bir hal alır. Ancak yavaş soğutma yöntemi ile ufak hacimler
soğutulduğunda bu kez aşırı soğuma oluşur ve solüsyon donma
sıcaklığının altına kadar soğutulduğu halde buz kristalleri oluşur.
Bu işlem çok ani olur ise embriyolar zarar görür. Bu zararı
engellemek için seeding adı verilen bir teknik ile buz kristalleri
çok yavaş oluşturulur.
Embriyolar dondurma-çözündürme sonrası canlılık oranları
türler arasında bazı farklılıklar göstermektedir. Buna neden olan
unsurlar olarak; dondurma ve çözündürme işlemlerinde uygulanan
donma ve çözünme hızları, embriyoların büyüklükleri ve gelişim
dönemleri, hücrelerin geçirgenlik özellikleri ve kriyoprotektanların
ozmotik özellikleri ile toksisiteleri sıralanabilir. Kriyoprezervasyon
işleminde kullanılan yöntemleri geleneksel yavaş dondurma (slow
freezing), hızlı dondurma (rapid freezing) ve vitrifikasyon olarak
üç grupta incelemek mümkündür. Başlangıçta embriyoların
dondurulmasında yavaş ya da kademeli soğutmayı gerektiren
yavaş dondurma yöntemi kullanılmıştır.
Geleneksel bir yöntem olan yavaş dondurmada, embriyoların
dondurulması için çok pahalı ve komplike cihazlara
gereksinim vardır. Hızlı dondurma işleminde ise, en az iki
farklı kriyoprotektan madde ve yüksek donma hızları kullanılır.
Yapılan çalışmalar sonucunda, 1985 yılında vitrifikasyon denilen
embriyoyu dondurma sistemi geliştirilmiştir [18]. Bahsedilen bu
iki yöntem sayesinde yavaş dondurma yönteminde gerekli olan
pahalı ve komplike cihazlara olan gereksinim ortadan kalkmıştır.
Vitrifikasyonda, buz kristallerinin hiç şekillenmediği vitröz ya da
camsı bir durum yaratılarak, hücrelerin, dokuların ve organların
direkt olarak sıvı azot içerisine daldırılmasıyla dondurulmaları
sağlanmaktadır. Çeşitli kimyasalların sulu çözeltilerinin camsı
yapı şekillendirme özelliklerinin önemli derecede değişkenlik
gösterdiği belirlenmiştir.
Donma ve çözünme işlemlerinde hücrelerin zarar görmesini
önlemek amacıyla, dondurma ve çözündürme solüsyonları
içerisine kriyoprotektan diye adlandırılan çeşitli kimyasal
maddeler katılmaktadır. Günümüzde uygulanan dondurma
Transgenik Rodent Üretimi
yöntemlerinde çeşitli kriyoprotektanlar ile yavaş veya
hızlı soğutma ve çözündürme yöntemleri kullanılmaktadır
[16,19,20,21].
Uygulanmakta olan tüm dondurma yöntemlerindeki temel
prensip, donma ve çözünme sırasında oluşabilecek hücre
içi buz kristallerinin oluşumunu engelleyerek, hücrelerin buz
kristallerinden görecekleri zararı önlemektir. Bunu sağlamak
amacıyla hücre içi sıvısının, hücre membranından geçebilen
başka bir deyişle nüfuz edebilen ve hücrelere olabildiğince
zararsız olan kriyoprotektan maddelerle yer değiştirmesi
hedeflenmektedir.
Başarılı gamet ve embriyo dondurulması çalışmalarında
embriyonun yaşamını doğrudan etkileyen nedenler olarak;
dondurmada kullanılan kriyoprotektif ajanlar, embriyo soğutma
oranları, embriyo saklama son sıcaklığı ve embriyo çözündürme
oranları gibi kriyobiyolojik faktörler sıralanmıştır. Dondurma
ile ilgili olarak kullanılan tüm yöntemlerin temel amacı,
dondurma süresi boyunca hücre içinde şekillenen hücre içi buz
kristallerinin oluşumunun ve çözündürme süresince şekillenecek
yeniden kristalleşmenin önlenmesidir.Hücre içi buz kristallerinin
şekillenmesinin önlenmesi için, hücre içi sıvının kriyoprotektan
maddelerle yer değiştirmesi sağlanarak, embriyoların
dehidre olması sağlanır.Dondurma-çözündürme sonu canlılık
oranları türler arasında bazı farklılıklar gösterebilmektedir.
Örneğin, domuz embriyoları dondurma işlemine karşı daha
duyarlıdırlar. Embriyoların dondurulmasında başlangıçta yavaş
ya da kademeli bir soğutmayı gerektiren yavaş dondurma (slow
freezing) yöntemi kullanılmıştır. Geleneksel bir yöntem olan
yavaş dondurmada, embriyoların dondurulması için çok pahalı
ve komplike cihazlar gerekmektedir. Son 10-20 yıllık süreç
içerisinde ise, dondurma ile ilgili yapılan çalışmalar daha çok
sistemi kolaylaştırmaya yönelik olmuştur. Örneğin, tek aşamalı
biçimde kriyoprotektan solüsyonun uzaklaştırıldığı veya hiçbir
işlem uygulanmadan direkt transfere olanak sağlayan yöntemler
geliştirilmiştir. İşlemlerin bu şekilde kolaylaştırılmasıyla, donmuş
embriyolardan saha şartlarında yararlanma olanaklarının
artırılması amaçlanmaktadır. İşlemlerin kolaylaştırılması için
yapılmış çalışmaların sonucunda, 1985 yılında, vitrifikasyon
denilen embriyo dondurma sistemi geliştirilmiştir. Böylece,
yavaş dondurma yönteminde gerekli olan pahalı ve komplike
cihazlara olan gereksinim ortadan kalkmıştır. Günümüzde,
embriyoların ve oositlerin dondurulmasında vitrifikasyon
yöntemi yaygın biçimde kullanılmaktadır. Vitrifikasyonda, buz
kristallerinin hiç şekillenmediği vitröz ya da camsı bir durum
yaratılarak, hücrelerin, dokuların ve organların direkt olarak sıvı
azot içerisine daldırılmasıyla dondurulmaları sağlanmaktadır.
Vitrifikasyon işleminde kriyoprotektan maddelerin soğutma
işlemi boyunca buz oluşumunu önleyebilme yeteneği kritik bir
unsurdur. Isı derecesi düşürüldükçe solüsyon bütün olarak
oldukça viskoz bir hal alır ve sonunda tümüyle viskoz, camsı bir
faza geçer.
Transgenik Hayvan Modelleri ve Tıbbi Araştırmalarda
Kullanımı
Transgeniklerle yapılan çalışmalarda yöntemin süresi 6-7
ay sürmekte ve böylece standart 2 yıl süren biyolojik rodent
uygulamasından daha kısa bir sürede sonuç alınmaktadır.
Bundan başka uygun model seçildiğinde düzenleyici kurallar ve
risk değerlendirmelerinde geçerlilik ve kolaylık sağladığından
yanıtların daha doğru tahminini de sağlarlar. Böylece; spesifik
genetik değişimlerden dolayı transgenik modeller tümörlerin
başlaması ve gelişmesindeki mekanizmaların anlaşılmasında
4 | Journal of Clinical and Analytical Medicine
Transgenik Rodent Üretimi
büyük kazanç oluşturur.
Transgenik rodentlerde farklı hastalık modelleri oluşturulmuştur.
Bunların başında Alzheimer gelmektedir. Alzheimer hastalığı
%50’den daha yüksek bir oranla en sık görülen demans tipidir.
İlk olarak 1907 yılında Alman hekim Alois Alzheimer tarafından
tanımlanmıştır. Alzheimer hastalığına benzer belirgin bir
nöropatoloji sergileyen transgenik model ilk olarak rodentlerde
yaratılmıştır. Bu modelde kalıtsal Alzheimer hastalığı ile ilişkili
Kromozom 21’deki amiloid prekürsör protein (APP) V717F
mutasyonu şifreleyen bir insan APP mini geni taşıyan rodentler
(PDAPP rodentler) oluşturulmuştur [22]. PDAPP rodentlerin
beyinlerinde Alzheimer hastalığında da gözlenen ekstrasellüler
nitelikli tiyoflavin S-pozitif Aβ tortuları, nörotik plaklar, sinaptik
kayıplar, astrositlerde ve mikroglialardaki dejenerasyonlar ortaya
çıkmaktadır. Bu rodentlerdeki Aβ tortuları nöronal kayıplardan
çok nötrofil değişiklikleri ile ilişkilidir [23]. Aβ tabakalarının
oluşumunda ApoE geninin rolünü incelemek için ApoE geni
ortadan kaldırılmış (ApoE knockout) rodentler oluşturulmuştur.
ApoE geni yokluğunda Aβ tabakaları anlamlı ölçüde azalırken,
APP ekspresyonu veya Aβ oluşumu değişmemiştir. Bu durum
amiloid tortularının veya tabakalarının oluşumunda ApoE
geninin katkısına işaret etmektedir [24]. Kistik fibroz hastalarının
DNA’larının analiz edilmesi ve DNA dizilimlerinin hasta olmayan
kardeşlerinin, anne ve babalarının ve sağlıklı kişilerin DNA
dizilimleri ile karşılaştırılması sonucu, hastalığın CFTR (Cystic
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) genindeki
mutasyon sonucu ortaya çıktığı 1989 yılında belirlenmiştir.
Knock-out, Knock-in ve Knock-down Rodent Üretimi
Standard transgenik problemlerinden kaçınmak ve bir proteinin
ekzojen ekspresyonunu çalışmak üzere knock-in rodentler
oluşturulmaktadır. Homolog rekombinasyonla transgenin
çok özel bir bölgesine hedeflenmesine olanak tanır. Yüksek
düzeyde ekspresyon kasetini çevreleyen genetik çevrenin tüm
kontrolünü elinde bulundurur ve transgen kendisini birden
fazla bölgeye yerleştirmemiş olur. Bölgeye özgü “knock-in”
ler transgenin nesilden nesile daha tutarlı ekpresyonuyla
sonuçlanır çünkü ekspresyon kasetinin tek kopya olarak
bulunduğu bilinmektedir. Hedeflenmiş transgen kritik lokus
ile çakışmadığından araştırmacı oluşacak fenotipin proteinin
ekzojen ekspresyonundan kaynaklandığından daha emin olur.
Bu yaklaşım vektörü oluşturmak ve homolog rekombinasyona
uğrayan hücreleri seçmek için klasik transgenik rodent eldesine
göre daha fazla zaman gerektirir olur.
Genin veya proteinin fonksiyonel domainin ortadan kaldırılması
söz konusudur. Kimyasal mutagenez, rasgele mutasyon, gene
trap yaklaşımı veya gen hedeflemesiyle knock-out rodent
oluşturulabilir. Homolog rekombinasyon genden bir veya
birden fazla ekzonun çıkarılmasına ve mutant veya kırpılmış
protein üretimine veya sıklıkla protein oluşmamasına yol açar.
Knock-out rodentlerin fenotipleri çok karmaşık olabilir çünkü
rodentlerin tüm dokuları etkilenir, fakat knock-out rodentlerin
embriyonik ölüm göstermeleri veya hiç fenotip göstermemeleri
de olağandışı değildir.
Bir gen knock-down, kromozomunda aktivitesi ya da
ekspresyonu azaltılmış bir yahut birden fazla gen taşıyan bir
genetiği değiştirilmiş organizmadır veya aktif bir gene ya da
onun mRNA transkriptine komplementer dizisi olan kısa bir DNA
ya da RNA (oligonükleotid) gibi bir reaktifin kullanılmasıdır. Bu
oligonükleotit, özel bir genin ekspresyonunu azaltmak için buna
benzer genetik değişikliklerin etkilerini kopyalayarak bu aktif
gene (ya da onun transkriptlerine) bağlanır. Şimdiye kadar bu tür
Journal of Clinical and Analytical Medicine
83
Transgenik Rodent Üretimi
Transgenik Rodent Üretimi
organizmalar, araştırma amaçları için çok fazla düzenlenenmiştir.
Ayrıca knock-down organizma ya da basitçe knock-downlar
olarak da bilinen bu organizmalar, bilinmeyen veya fonksiyonu
tam olarak bilinmeyen, dizisi çıkarılmış bir gen hakkında daha
fazla bilgi edinmek için ters genetik olarak bilinen deneysel bir
yaklaşımla direkt olarak kullanılır. Araştırmacılar, ilgilenen genin
etkisiz hale getirilmediği bireyler ile knockdown’ın nasıl farklı
olduğu sonucunu araştırdılar. Knockdown, yukarıda açıklanan bir
organizmayı düzenleme veya “bir geni knock down”da olduğugibi
bir reaktif kullanarak gen ekspresyonunu baskılama süreçlerini
içerir. Bir genin ekspresyonunu knock down etmek için kullanılan
popüler reaktif-tabanlı metotlar, small interfering RNA (siRNA) ya
da Morpholino oligoları kullanarak translasyonun baskılanmasını
içermektedir [25].
Transgenik Hayvanların Sütünde Rekombinant Proteinlerin
Üretimi
Transgenik çiftlik hayvanı elde etmeden önce, bu gen konstraktları
transgenik farelerde denenmelidir. Bu şekilde bu konstraktlar
farelerde test edilerek konstraktın hakkında bilgi sahibi olunur.
Şayet gen konstraktı ile ilgili integrasyon ve ekpresyon yönünden
herhangi bir problem olmaz ise bu konstraktlar çiftlik hayvan
embriyolarında kullanılabilir diye karar verilir. Bu konstraklar
kullanılarak transgenik biyoreaktörler elde edilir ve elde edilen
transgenik hayvanların süt, idrar ve kan gibi vücut salgılarında
rekombinant proteinlerin üretilir [26-28]. Bu proteinlerin
üretimi için, dokuya özgü güçlü promotorlara ihtiyaç vardır.
Bunlardan bazıları, koyun -lactoglobulin, fare, rat, tavşan ve
keçi whey asid protein (WAP), inek -s1 kazein, rat, tavşan ve
keçi -kazein, guniea pig, koyun, keçi ve inek -lactalbumin gibi
promotorlardır. Bu güçlü promotorlar, rekombinant proteinlerin
sadece hedef dokularda (süt, kan ve idrar) salınmasını sağlarlar.
Doğal haldeki süt protein geninin ya da bu genin düzenleyici
dizisiyle birleştirilmiş füzyon genin ekspresyonunu, türler
arasında bile meme bezine yönlendiren ve süt protein genlerinin
5’ (dokuya özgü transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgesi)
ve 3’ ucunda yer alan translasyona katılmayan bölgelerde kısa
korunmuş diziler içerildiği bilinmektedi. Hedef dokuya özgü
bu tür düzenleyici DNA dizilerinin kullanılmasıyla herhangi
bir genin ekspresyonu istenilen dokuda gerçekleştirilebilir.
Süt bileşenlerinin genetik modifikasyonu, meme bezine
spesifik düzenleyici diziler aracılığıyla ilgili yapısal genlerin
yönlendirilebildiği füzyon genlerin oluşturulması stratejisine
dayanmaktadır. Transgenik domuzların meme bezinde kemirgen
whey asidik protein geninin ve transgenik farelerde koyun
-laktoglobulinin yeterli düzeyde ekspresyonunun sağlandığı
örneklerde olduğu gibi, hayvanların normalde sahip olmadıkları
genlerin ürünü olan süt proteinleri, farklı türlerin meme bezlerinde
eksprese edilebilmektedir. Örneğin, insan doku plazminojen
aktivatörü, insan ürokinazı, insan büyüme hormonu ve insan 
1-antitripsin gibi birçok farmasötik protein biyoreaktör farelerin
meme bezinde üretilmiştir. Laktasyondaki farelerin sadece
birkaç ml süt üretmelerinden dolayı farelerin biyoreaktör olarak
kullanımları oldukça güçtür. Fakat iki yüz adet süt üreten fareden
ham rekombinant protein (insan büyüme hormonu gibi) üretimi,
meme bezinin disseksiyonuyla ve bunların soğukta birkaç saat
süreyle inkübe edilmesiyle 1 grama kadar varan miktarlara
yükseltilebilir. Tavşanlar ise süt verimleri endüstriyel uygulama
sınırları içerisinde olduğundan biyoreaktör olarak kullanılabilirler
ve günlük süt üretimleri dişi başına yaklaşık 100 gramdır.
Ayrıca, kısa gebelik süresi (30 gün), çok sayıda yavru (onbeşe
kadar) ve sütün yüksek protein içeriği (sığırınkinin üç katı)
84 Journal of Clinical and Analytical Medicine
5 | Journal of Clinical and Analytical Medicine
transgenik tavşanların biyoreaktör olarak kullanımını sağlayan
diğer avantajlardır. Transfer edilen genin ekspresyon düzeyinin
(tavşan -kazein promotörünün kontrolü altında) düşük olmasına
rağmen, araştırmacılar süt veren tavşanların biyoreaktör
olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Bu bağlamda, insan
interlökin-2 proteini ve insan doku plazminojen aktivatörü
transgenik tavşanların sütlerinde eksprese edilmiştir. Transgenik
biyoreaktörlerde salgılanan rekombinant proteinler genellikle
proteolitik yıkımlanmaya karşı dayanıklıdırlar ve çok miktarda
elde edilebilirler. Bu bize şimdiye kadar insan materyalinden
ya da yetersiz hücre kültürlerinden üretilen proteinleri
sınırsız miktarda üretme imkânını sağlamaktadır. Transgenik
hayvanların vücut sıvılarından elde edilen rekombinant
proteinler insan plazmasından elde edilenlerden çok daha saftır
ve insan infeksiyon ajanlarını barındırmamaktadır (hepatit B
ve C, HIV ve AIDS). Saflaştırma aşamasında viral inaktivasyon
yapılması, transgenik hayvanların spesifik patojen-free şartlarda
barındırılması ve üretim standartlarına uyulmasıyla rekombinant
proteinler çok saf ve temiz olarak elde edilebilmekte ve böylece
ürün kaliteleri yükseltilebilmektedir. İnsan plazmasında sadece
eser miktarda bulunan proteinler, transgenik biyoreaktörlerde
endojen düzeylerinin 100-500 katı oranında üretilebilmektedir.
Alınan sonuçlar insan Factor VIII (kanın pıhtılaşmasını sağlayan
mekanizmada rol oynayan proteinlerden biri) gibi üretilmesi
çok zor olan proteinlerin bile transgenik biyoreaktörlerin meme
bezinde sentezlenebileceğini göstermiştir [29].
Sonuç
Transgenik hastalık modeli rodentler gün geçtikçe yaygın
bir şekilde kullanılmaya devam etmektedir. Transgenik
biyoreaktörlerde salgılanan farmasötik proteinler genellikle
proteolitik yıkımlanmaya karşı dayanıklıdırlar ve çok miktarda
elde edilebilirler. Bu bize şimdiye kadar insan materyalinden
ya da yetersiz hücre kültürlerinden üretilen proteinleri
sınırsız miktarda üretme imkânını sağlamaktadır. Transgenik
hayvanların vücut sıvılarından elde edilen rekombinant proteinler
insan plazmasından elde edilenlerden çok daha saftır ve insan
infeksiyon ajanlarını barındırmamaktadır (hepatit B ve C, HIV
ve AIDS). Rekombinant proteinlerin serum, süt veya idrardan
saflaştırma aşamasında viral inaktivasyon yapılması, transgenik
hayvanların spesifik patojen-free şartlarda barındırılması,
üretim standartlarına uyulmasıyla rekombinant proteinler çok
saf ve temiz olarak elde edilebilmekte ve böylece ürün kaliteleri
yükseltilebilmektedir. Transgenik çiftlik hayvanlarının üretimi
sonucunda yılda 500 kg ile 1 tona yakın rekombinant protein
(alpha-antitripsin-III, faktör VIII ve IX vs) bu biyoreaktörlerin
sütünden izole edilebilir. Tıbbi öneme sahip terapötik poteinlerin
kullanımının sağlanması ile milyonlarca insan bunlardan çok daha
kolay faydalanacak ve herhangi bir kontaminasyon riski ile karşı
karşıya kalmayacaktır. Özellikle çiftlik hayvanlarında klonlama ve
transgenik teknolojisinin gelişimine engel teşkil eden bazı teknik
güçlükler ortadan kalktıkça bu üretim teknolojisi tüm dünyada
pratik uygulama alanları bulabilecektir. Çok yakın zamanda
transgen ve kopyalama teknolojileri yaşamın içinde kendine bir
yer bularak uygulamaya dönüşebilirler. Bu teknolojiler sonunda
transgen-klon domuzlar üretilip bunların bazı organları insanlara
transfer edilebilir (xenotransplantasyon) (karaciğer gibi). Ayrıca,
insanlarda kullanılan bazı tedavi edici proteinler (biofarming)
transgenik hayvanların sütünden izole edilebilecektir. Ayrıca,
terapötik kopyalama teknolojisinin ilerlemesi ile kişilere özgü
blastositler ex-vivo ortamlarda üretilebilecektir. Üretilen bu
blastositlerden elde edilecek ICM hücreleri (pluripotent hücreler)
Transgenik Rodent Üretimi
Transgenik Rodent Üretimi
çeşitli ortamlarda her dokuya dönüşebilme özelliğine sahip
olabilecektir. Özellikle de son yıllarda biyomühendislik bilim
dalının gelişmesi ile de bu teknolojiler hız kazanacaktır. Böylelikle
kişilere çok özel olarak organlar üretilebilecektir. Böylece
bu teknolojiler sayesinde her yıl organ yetersizliği nedeniyle
yaşamını kaybeden milyonlarca insan hayata döndürülebilecektir
[30].
Kaynaklar
1. Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH. 1980. Genetic transformation of mouse embryos by
microinjection of purified DNA. Proc Nat Acad Sci. USA 77, 7380-7384
2. Brinster RL, Chen HY, Trumbauer ME, Yagle MK, Palmiter RD. 1985. Factors affecting the efficiency of introducing
foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci 82: 4438-4442
3. Bağış H, Papuççuoğlu S . 1997. Studies on The production of Transgenic Mice. T Jr of Vet Anim Sci 21 (4):
287-292.
4. Bagis H, Aktoprakligil D, Mercan HO, Yurdusev N, Turgut G, Sekmen S, Arat S, Cetin S. 2006a. Stable transmission
and transcription of Newfoundland ocean pout type III fish antifreeze protein (AFP) gene in transgenic mice and
hypothermic storage of mouse gamets with AFP. Mol.Rep.Dev. 73: 1404-1411.
5. Bagis H, Arat S, Mercan HO, Aktoprakligil D, Caner M, Turanlı ET, Baysal K, Turgut G, Sekmen S, Cirakoglu B.
2006b. Stable transmission and expression of the hepatitis B virus genome in hybrid transgenic mouse until F10
generation. J Exp Zoo 305A.
6. Bagis H, Tas A, Kankavi O. 2008a. Determination of the Expression of Fish Antifreeze Protein (AFP) in several
Tissues and Serum of Transgenic Mice in F7 generation at the Room Temperatura. J Exp Zool Part A Ecol Genet
Physiol. 309: 255-61.
7. Bagis H, Akkoc T, Tas A, Aktopraklıgil D. 2008b. Cryogenic Effect of Antifreeze Protein on Transgenic Mouse
Ovaries and Production of Live Offspring by Orthotopic Transplantation of Cryopreserved Mouse Ovaries. Mol.
Rep.Dev. 75: 608-613.
8. Hogan B, Beddigton R, Costantini F, Lacy, E .1994. Manipulating the mouse embryo:A laboratory manual. Second
Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 494p. expressing small interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A
2003 100:1844-1848
9. Stinnakre M.-G., Devinoy E., Thepot D., Chene N., Bayat-Samardi M., Grabowski H. and Houdebin L.-M. (1992)
Quantitative collection of milk and active recombinant proteins from the mammary glands of transgenic mice.
Anim. Biotechnol. 3, 245-255.
10. Roger, G.E. 1990. Improvement of Wool Production Through Genetic Engineering. TRENDS in Biotechnol., 8:
6-11
11. Bağış H, Keskintepe L.2001. Application of Green Flourescent Protein as a Marker for Selection of Transgenic
Mouse Embryos before Implantation. Turk J of Biology 25 (2):123-131.
12. Pinkert, CA. 1994. Transgenic Animal Technology. A Laboratory Handbook Academic Press.
13. Akkoc T. 2007. Sıçan embriyo eldesi ve değişik gelişim dönemlerinde bulunan sıçan embriyolarının vitrifikasyon
yöntemiyle dondurulması. Trakya Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü.
14. Whittingham Dg, Leibo Sp, Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to –196 and -269C. Science 1972;
178: 411-414.
15. Wilmut I, Rowson Lea. The successful low temperature preservation of mouse and cow embryos. J. Reprod.
Fertil. 1973; 33: 352-353.
16. Bağış H, Odaman H, Sağırkaya H, Dinyéss A. 2002. Production of Transgenic Mice from Vitrified PronuclearStage Embryos. Mol Reprod Dev 61:3.
17. Lane M, Bavister BD, lyons EA, Forest KT (1999): Containerless vitrification of mammalian oocytes and
embryos. Nat Biotecnol. 17: 1234-6
18. Rall Wf, Fahy Gm. Ice-free cryopreservation of mouse embryos. Nature 1985; 313: 573-574.
19.Bagis H., Mercan Odaman H. (2004a): Effect of Culture Medium Supplemented With Beta
Mercaptoethanol and Amino Acids on Implantation and Development of Different Stage In Vivo- or In Vitro-Derived
Mouse Embryos. Mol Reprod Dev. 69: 52-59.
20. Bagis H., Sağırkaya H., Odaman H., Dinyéss A. (2004b): Pronuclear-stage mouse embryos vitrification on solid
surface (SSV) vs. in cryotube: Comparison of the effect of equilibration time and different sugars in the vitrification
solution. Mol.Reprod.Dev. 67:186-192.
21. Bagis H. Mercan Odaman H.,Cetin S, Sekmen S (2005): The Effect of Equilibration Time on Survival and
Development Rates of Mouse Pronucler-Stage Embryos Vitrified in Solid Surface (SSV) and Convential Straws: In
Vitro and In Vivo Evaluations. . Mol Reprod Dev. 72: 494-501.22.
22. Games D, Adams D, Alessandrini R ve ark. (1995) Alzheimertype neuropathology in transgenic mice
overexpressing V717F β-amyloid precursor protein. Nature, 373:523-527.
23. Irizarry MC, McNamara M, Fedorchank K ve ark. (1997). Appsw transgenic mice develop age-related Aβ deposits
and neutrophil abnormalities, but no neuronal loss in CA1. J Neuropathol Exp Neurol, 56:965-973.
25. Tiscornia G, Singer O, Ikawa M, Verma IM. A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral
vectors
27. Clark AJ, Bessos H, Bishop JO, Brown P, Harris S, Lathe R, McClenaghan M, Prowse C, Simons J, Whitelaw CBA,
Wilmut I. 1989. Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep. Biotechnology 7,
487-492.
28. Houdebine LM. 2000. Transgenic animal bioreactors. Transgenic Research 9: 305-320.
29. Wall RJ, Pursel VG, Shamay A, McKnight RA, Pittius CW, Hennighausen L. 1991. High-level synthesis of a
heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine. Proc Nat Acad Sci. USA 88: 1696-1700.
30. White D, Dunning J. 1994. Wal1work J. Transgenic pigs as potential donors for xenografts. Nefrología 14:
7073.
6 | Journal of Clinical and Analytical Medicine
Journal of Clinical and Analytical Medicine
85
Download