Fungal Ksilanaz Enziminin E. coli`de Rekombinant Olarak Üretilmesi

advertisement
Fungal Ksilanaz Enziminin E. coli’de
Rekombinant Olarak Üretilmesi
Hümeyra SALTIK
Yüksek Lisans Tezi
Biyoloji Anabilim Dalı
Prof. Dr. Necmettin Yılmaz
2014
Her hakkı saklıdır
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FUNGAL KSİLANAZ ENZİMİNİN E.coli’de
REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ
Hümeyra SALTIK
TOKAT
2014
Her hakkı saklıdır
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
FUNGAL KSİLANAZ ENZİMİNİN E.coli’de
REKOMBİNANT OLARAK ÜRETİLMESİ
Hümeyra SALTIK
Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Necmettin YILMAZ
Ksilan, polisakkarit yapıya sahip olup bitkilerde selülozdan sonra en fazla bulunan
hemiselülozdur. Ksilan, ksilozların glikozid bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur.
Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi adı verilir. Bu
gurupta β-1,4-Endoksilanaz, β-Ksilozidaz, β-Laraninofuranozidaz, β-Glukuronidaz,
Asetil ksilan esteraz ve Fenolik asit (Ferulik ve p- Kumarik asit) esteraz yer almaktadır.
Ksilanaz enzimi, ksilanın β-1,4 glikozid bağlarını hidrolize ederek hemiselülozik
maddelerin biyo yararlılığını artırır. Ksilanaz kağıt ve kağıt hamuru başta olmak üzere
gıda ve hayvan yemi endüstrisi gibi alanlarda temel endüstriyel enzim olarak çok büyük
öneme sahiptir. Bu enzimin hayvanların et ağırlığı üzerine verim ve performansını
olumlu yönde değiştirdiği belirtilmektedir. Ksilanaz enzimi bakteri, maya ve fungus
grubunda yer alan çeşitli mikroorganizmalar tarafından doğal olarak dışarıdan karbon
kaynağını karşılamak için üretilebilmektedir. Bu çalışmada Aspergillus niger
mikroorganizmasının (Fungus) ürettiği ksilanaz (endo-1,4-β-ksilanaz)
enzimini
kodlayan xynB geni pET28b vektör sistemine klonlanmış ve ekspresyon amacıyla E.coli
BL21(DE3) pLysE hücrelerine transfer edilmiştir. Böylece ksilanaz enzimi rekombinant
olarak üretilmiştir. Üretilen enzimin DNS yöntemiyle: pH’nın etkisi, sıcaklığın etkisi,
sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi, substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine
etkisi testleri yapılmış ve optimum sıcaklığı 50°C, optimum pH’sı ise 5,0 olarak
bulunmuştur. Elde edilen bu sonuçlara göre enzimin aktivite gösterdiği anlaşılmıştır.
Yapılan literatür taraması ve sonuçlar değerlendirildiğinde üretilen enzimin yem
endüstrisinde kullanılabilir nitelikte olduğu belirlenmiştir.
2014, 54 sayfa
Anahtar kelimeler: Ksilan, Ksilanaz, Aspergillus niger, E.coli, Endüstriyel enzim
i
ABSTRACT
M.Sc. THESIS
Expression of recombinant Fungal Xylanase enzyme in E. Coli.
Hümeyra SALTIK
Gaziosmanpasa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Necmettin YILMAZ
Xylan is a hemicellulose that consist of polysaccharide structure and is second of the
most abundant components in the plant. Xylan is formed by binding xyloses with
glycoside bonds. All of the enzymes which hydrolyse xylan is called xylanolytic
enzyme system. In this group there are endo-1,4- β -xylanase, β- xylosidase, β- L arabinofuranosidase, β- glucuronidase, acetylxylan esterase and Fenolic acid esterase.
Xylanase hydrolyse β-1,4- glycoside bonds of xylan and increase biobenefit of
hemicellulosic components. Xylanase plays an important role as a essential enzyme in
animal feed and food industry and also in pulp and paper industry. It is suggested that
this enzyme improve yield and performance of weight gaining of animals. Xylanase
naturally is produced by various microorganisms such as bacteria, yeast and fungus to
use xylan as carbon source from outside.
In this study, xynB gene encoding Xylanase (endo-1,4- β –xylanase) from Aspergillus
niger is clonned to pET28b vector system and transfered to E.coli BL21(DE3) pLysE
cells for expression. Tests of effect of pH, effect of temperature, determine of
temperature stabilization, effect of substrat concentration on enzyme activation was
performed with DNS method. Optimum temperature was found as 50 ˚C and optimum
pH was found as 5. Acording to this results, it is determined that enzym work. When
literature search and results are evaluated it is determined that produced enzyme can be
use in feed industry.
2014, 54 pages
Keywords: Xylan, Xylanase, Aspergillus niger, E. coli, Industrial enzyme.
ii
ÖNSÖZ
Bu çalışmada bana araştırma ve kendimi geliştirme olanağı sağlayan, tez konumun
belirlenmesinde, çalışmam süresince yakın ilgi ve önerileriyle bana yol gösterip beni
yönlendiren danışmanım Sayın Prof. Dr. Necmettin YILMAZ’a, çalışmanın yürütülmesi
çalışma sürem boyunca laboratuarlarının tüm imkanlarını kullanmama izin veren ve tez
yazım aşamasında beni yönlendiren değerli hocam Sayın Prof. Dr. İsa GÖKÇE’ye,
çalışmalarım sırasında bilgi ve deneyimleriyle bana yardımcı olan Arş. Görv. Hülya
KUDUĞ’a, tezimin enzim aktivitesinin belirlenmesi konusunda bana bilgi ve
deneyimleriyle yol gösteren ve yardımlarını esirgemeyen Arş. Görv. Sema BİLGİN
ŞENTÜRK’e çok teşekkür ederim.
Her zaman yanımda olan ve benden maddi manevi desteklerini esirgemeyen aileme
sonsuz teşekkürler.
iii
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET..................................................................................................................................i
ABSTRACT......................................................................................................................ii
ÖNSÖZ.............................................................................................................................iii
İÇİNDEKİLER.................................................................................................................iv
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ.............................................................................vii
SEKİLLER DİZİNİ........................................................................................................viii
ÇİZELGELER DİZİNİ.....................................................................................................ix
1. GİRİŞ ...........................................................................................................................1
2. KAYNAK ÖZETLERİ (KURAMSAL TEMELLER / GENEL BİLGİLER .......2
.1. Enzim Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi………………………………….2
2.2. Enzim Üretiminde Mikroorganizmalar’ın Kullanılması……………………………4
2.3. Endüstriyel Enzimler………………………………………………………………..5
2.4. Ksiloz ve Ksilan……………………………………………………………………..8
2.5. Ksilanazlar…………………………………………………………………………10
2.6. Ksilanolitik Enzimler ve Ksilanın Enzimatik Hidrolizi…………………………...11
2.7. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları…………………………………………….13
2.8. Ksilanaz Gen Kaynakları………………………………………………………......15
2.9. Ksilanazla İlgili Yapılan Daha Önceki Çalışmalar………………………………...15
3. MATERYAL VE YÖNTEM………………………………………………………17
3.1. Materyal……………………………………………………………………………17
3.1.1. Kullanılan Cihazlar………………………………………………………………17
3.1.2. Kullanılan Kimyasallar………………………………………………………......18
3.1.3. Kullanılan Enzimler……………………………………………………………...20
3.1.4. Primerler…………………………………………………………………………20
3.1.5. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar……........21
3.1.6. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler…………………...21
3.1.7. Kullanılan Çözeltiler……………………………………………………………..23
3.1.7.1. Tampon Çözeltiler ve Hazırlanışları…………………………………………...23
3.1.7.2. Sıvı ve Katı Besiyerleri………………………………………………………...23
iv
3.1.7.3. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Poliakrilamid Jel Elektroforezinde Kullanılan
Çözeltiler……………………………………………………………………………….24
3.1.7.4. Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler……………………………24
3.1.7.5. Enzim Saflaştırmada Kullanılan Çözeltiler…………………………………....25
3.1.7.6. Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Çözeltiler………………………………25
3.1.7.7. Diğer Çözeltiler………………………………………………………………..25
3.2. Yöntem…………………………………………………………………………….26
3.2.1. Ksilanaz Gen Kaynağı…………………………………………………………...26
3.2.2. PCR İşlemi için Primerlerin Tasarımı…………………………………………...26
3.2.3. PCR İle Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu…………………………………..26
3.2.4. PCR Ürünlerinin Saflaştırılması…………………………………………………28
3.2.5. Restriksiyon Enzimleri ile Kesim………………………………………………..28
3.2.6. DNA Ligasyonu………………………………………………………………….29
3.2.7. Kompotent Hücre Hazırlanması…………………………………………………30
3.2.7.1. PİPES’li Kompotent Hücre Hazırlanması……………………………………..30
3.2.7.2. FSB’li Kompotent Hücre Hazırlanması……………………………………….30
3.2.8. Transformasyon………………………………………………………………….31
3.2.9. Plazmit DNA Saflaştırılması…………………………………………………….31
3.2.10. Doğrulama Restriksiyon Kesimi……………………………………………….32
3.2.11. DNA Dizileme………………………………………………………………….33
3.2.12. E. coli BL21(DE3) pLysE Hücresinin pET28b(+)-xynB Plazmidi ile.
Transformasyonu ve Ksilanaz’ın Ekspresyonu………………………………………...33
3.2.13. SDS-PAGE ile E. coli Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi...34
3.2.14. E. coli BL21 pLysE Hücrelerinin Parçalanması………………………………..35
3.2.15.E.coli BL21(DE3) pLysE’de Ekspres Edilen Ksilanaz Enziminin Afinite
Kromatografisi ile Saflaştırılması……………………………………………………....35
3.2.16. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrillamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) İle
Ksilanaz Proteininin Analizi……………………………………………………………35
3.2.17.Saflaştırılan Proteinin Kantitatif Analizi…………………………………….….36
3.2.18. DNS Yöntemi İle Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi…………………………..37
3.2.19. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi………………………..37
3.2.19.1. pH’nın Etkisi………………………………………………………………….37
v
3.2.19.2. Sıcaklığın Etkisi…………………………………………………………..…..38
3.2.19.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi…………………………………………..38
3.2.19.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi………………38
4.BULGULAR VE TARTIŞMA……………………………………………………..39
4.1. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu…………………………………….39
4.2. Klonlama Sonrası Plazmid DNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Analizi……….39
4.3. DNA Dizileme……………………………………………………………………..40
4.4. SDS-PAGE İle Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi……...........42
4.5. Saflaştırılan pET-xynB Proteininin Kantitatif Analizi…………………………….44
4.6. Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi…………………………………………………45
4.6.1. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi ………………………...45
4.6.1.1. pH’nın Etkisi…………………………………………………………………...45
4.6.1.2. Sıcaklığın Etkisi………………………………………………………………..45
4.6.1.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi……………………………………………46
4.6.1.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktiviesi Üzerine Etkisi………………...47
5. SONUÇ……………………………………………………………………………...48
KAYNAKLAR………………………………………………………………………...50
ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………………...54
vi
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ
Simgeler
Açıklama
bç
baz çifti
μl
mikro litre
µM
mikro molar
M
Molar
mM
mili molar
nm
nano metre
P
Fosfat
rpm
Dakikadaki devir sayısı (rotatory per minute)
Kısaltmalar
Açıklama
Amp
Ampisilin
APS
Amonyumpersülfat
BSA
Sığır (Bovine) Serum Albümini
dH2O
distile su
DMSO
Dimetil sülfoksit
DNA
Deoksiribonükleikasit
dNTP
Deoksiribonükleosit trifosfat
E. coli
Escherichia coli
FSB
“Frozen Storage Buffer”
IPTG
İzopropil β-D-1 tiyogalaktopiranozid
LB
Luria-Bertani
OD
Optik dansite
PCR
Polimeraz zincir (chain) reaksiyonu
PMSF
Fenil metil sülfonil florit
SDS
Sodyum dodesil sülfat
SDS-PAGE
SDS poliakrilamid jel elektroforezi
TAE
Tris-asetat-EDTA
TEMED
N,N,N’,N’-Tetrametilenetilendiamin
Tris
2-Amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 2.1. Ksilan’ın Diyagramatik Yapısı………………………………………………..8
Şekil 2.2. Ksilanaz Enziminin Etki Spesifitesi…………………………………………..9
Şekil 2.3. Ksilanolitik Enzim Sistemi…………………………………………………..11
Şekil 2.4. Ksilan’ın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler Ve Etki Bölgeleri…………...12
Şekil 3.1. pET-28a (+) Vektörünün Dairesel Haritası Ve Poli-linker Bölgesinin Detaylı
Restriksiyon Enzimleri İle Birlikte Verilen DNA Dizisi……………………………….22
Şekil 3.2. Ksilanaz Genini Çoğaltmak Amacıyla Kullanılan İleri Ve Geri Primerlerin
Nükleotit Sıraları……………………………………………………………………….26
Şekil 4.1. pET-28b Vektör Sistemi İçin Koloni PCR sonucunun %1’lik Agaroz Jeldeki
Görüntüsü………………………………………………………………………………39
Şekil 4.2. pET-28b Vektör Sistemi İçin Doğrulama Kesim Sonucunun %1’lik Agaroz
Jeldeki Görüntüsü……………………………………………………………………....40
Şekil 4.3. NEBcutter V2.0 Programı Kullanılarak Elde Edilen pET-28b Klonlama
Bölgesinin xyn Genine Ait Restriksiyon Enzim Haritası………………………………40
Şekil 4.4 Dizi Analizi Sonucu Elde Edilen Kromotogram……………………………..41
Şekil 4.5. SDS-PAGE Analiz Görüntüsü………………………………………………43
Şekil 4.6. Saflaştırma Sonrası SDS-PAGE Analiz Görüntüsü…………………………43
Şekil 4.7. Ksilanaz Enziminin pH Bağımlılık Eğrisi……………………………….......45
Şekil 4.8. Ksilanaz Enziminin Sıcaklık Bağımlılık Eğrisi………………………….......46
Şekil 4.9. Ksilanaz Enziminin Isıl Kararlılık Eğrisi……………………………………46
Şekil 4.10. Ksilanaz Enziminin Linewear-Burk Eğrisi………………………………...47
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 2.1. Ksilanazların Potansiyel Uygulama Alanları ……………………………...7
Çizelge 3.1. Kullanılan Cihazlar………………………………………………………..17
Çizelge 3.2. Kullanılan Kitler Ve Kimyasal Malzemeler ……………………………...18
Çizelge 3.3. Kullanılan Enzimler……...……………………………………………….20
Çizelge 3.4. Ksilanaz Genini Çoğaltmak Amacıyla PCR’da Kullanılan Primerler……20
Çizelge 3.5. Klonlama Ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar….21
Çizelge 3.6. Klonlama Ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler……………21
Çizelge 3.7. Kesim İşlemi İçin Gereken Madde Miktarları……………………………28
Çizelge 3.8. pET-28b Vektör Sistemi Ligasyon İçin Gereken Madde Miktarları……...29
Çizelge 3.9. pET-28b Doğrulama Kesimi İçin Gereken Madde Miktarları……………33
Çizelge 3.10. SDS-PAGE Elektroforezinde Kullanılan Bileşenler Ve Oranları……….36
Çizelge 4.1. pET-xynB Proteinine Ait Amino Asit Dizisi……………………………..44
ix
1.GİRİŞ
Enzimlerin hücrelerde oldukça önemli metabolik görevleri vardır, biyokimyasal
reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir ve çeşitli amaçlarla
kullanılmak üzere gündelik ve ekonomik hayata girmişlerdir. Endüstride kullanılan
enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Çünkü mikroorganizma
kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik
aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve
ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır. Ürünlerin
kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerlerinin çok yüksek olması gibi
nedenlerle enzim teknolojisi giderek gelişmektedir ve biyoteknolojinin endüstriyel
enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır
(Wiseman,
1987). Özellikle son
yıllarda
rekombinant
DNA teknolojisinden
yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek
yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998).
Türkiye büyük bir biyoteknoloji ürünleri tüketicisidir. Tüketicisi olduğumuz bu pazarın
en önemli alanlarından birisini “endüstriyel enzimler” oluşturmaktadır. Türkiye’nin
yerli enzim üretimi hemen hemen yok gibidir. Enzimler farklı kategorilerde farklı
isimler, sektörler ve kalemler altında yerli pazara girdikleri ve tüketildikleri için pazar
hacminin bütününün tek bir rakam halinde tespiti de mümkün değildir fakat bilinen
kadarıyla bile tüketimimiz milyar dolarlar seviyesindedir. Enzimlerin endüstriyel
kullanım alanları incelendiğinde ne kadar yaygın, yüksek hacimli ve ticari fırsatlarla
dolu bir pazar oluşturduğu görülmektedir (Özer, 1999). Enzimler genellikle endüstride;
ilaç, gıda, tekstil, deri, kâğıt, yem ve deterjan sanayilerinde ve moleküler biyolojide
kullanılmaktadır (Anonim, 2013a).
Bu çalışmayla literatürde var olan rekombinant enzim üretim sistemlerini kullanmak ya
da bu sistemler üzerinde ihtiyaca yönelik değişiklikleri yapmak suretiyle enzim
üretimine katkıda bulunulması hedeflenmiştir. Bu hedefe ulaşabilmek için gıda, yem,
kağıt sanayisinde kullanılan ksilanaz enzimi (Fungal; A. niger) pET28b vektörü ile
rekombinant olarak Escherichia coli’de üretimi yapılmış, üretilen enzim saflaştırılmış,
enzimin optimum çalışma sıcaklık ve pH’sı belirlenmiştir.
1
2. KAYNAK ÖZETLERİ (KURAMSAL TEMELLER / GENEL BİLGİLER)
2.1. Enzim Üretiminde Rekombinant DNA Teknolojisi
Biyoteknoloji, çok çeşitli alanlarda gelişme gösteren ve günümüzde moleküler biyolojik
yöntemlerinde yaygın şekilde kullanımıyla birlikte, giderek moleküler biyoteknoloji
şeklinde transformasyona uğrayan ve çağımıza damgasını vuran bir alandır.
Rekombinant DNA teknolojisi; Hamilton Smith tarafından 1970’de Heamophilius
influenzae’den elde edilen restriksiyon endonükleaz enzimlerin keşfi ile başlamıştır. Bu
enzimler özgün DNA bölgelerini tanıyıp DNA’yı bu özgün bölgelerden kesen
enzimlerdir (Sultuybek ve ark., 1995).
Rekombinant DNA teknolojisinin ve destekleyen gelişmelerin tarihçesi;
1871: Spermde DNA’nın keşfi.
1944: Avery, Macleod ve Mc Carty genetik materyalin DNA olduğunu gösterdi.
1953: Watson ve Crick DNA’nın yapısını belirledi.
1958: DNA replikasyonunun çift sarmalın komplementer ipliklerinin ayrılmasını
kapsadığı kanıtlandı.
1960: Haberci RNA’nın keşfi.
1965: Bakteride antibiyotiğe dirençli genleri içeren ve hücre duvarı içinde otonom
olarak replike edilen ekstrakromozomal yapılara plazmid denildi.
1966: Tüm genetik kodun çıkarılması.
1970: İn vitro koşullarda genlerin sentezlenmesi ve ilk restriksiyon endonükleaz
enziminin Hamilton Smith tarafından izole edilmesi.
1972: İlk rekombinant DNA molekülünün hazırlanması.
1972: Khurana ve arkadaşları bütün bir tRNA genini sentezlediler.
1973: Gen klonlanması için plazmid vektörlerinin kullanımı.
1973: Boyer ve Cohen rekombinant DNA teknolojisini yarattılar.
1974: İlk rekombinant DNA Dünya kongresi yapıldı.
1977: Gilbert ve Sangers tarafından DNA dizileri için yeni metotların kullanımı.
1977: İlk genetik mühendislik şirketi olan “Genentech” kuruldu.
1978: E.coli bakterisi kullanılarak insan insülini üretildi.
1979: Viral antijen hepatit B’nin klonlanması.
2
1981: Orak hücreli anemi DNA’sı restriksiyon enzimi analiziyle teşhis edilen ilk
hastalık oldu.
1982: İnsan tümör genlerinin karakterizasyonu.
1983: Bakteriyofaj λ’nın DNA dizisi 48 502 baz çifti olarak saptandı.
1983: Genetik olarak değiştirilmiş plazmidler, bitkilerin transformasyonu için
kullanıldı.
1986: Kary B. Mullis tarafından polimeraz zincir reaksiyonu tekniği geliştirildi.
1989: AIDS virüsü dizilendi.
1990: İnsan genom projesi resmen başlatıldı.
1997: Koyun (Dolly) klonlandı.
2001: İnsan gen haritası tamamlandı.
2002: Fare genomu aydınlatıldı.
2004: Rat genomu aydınlatıldı, (Sultuybek ve ark, 1995; Tarım, 2004).
Rekombinant DNA teknolojisi, genetik rekombinasyon olaylarının yapay olarak
gerçekleştirilmesi esasına dayanan ve bugün dev adımlarla ilerlemekte olan bir gen
mühendisliği konusudur. Bu teknoloji ile çeşitli amaçlar için adeta ısmarlama genler ve
proteinlerin üretimi mümkün olmaktadır. Bu iş için istenen gen orijinal kromozomdan
restriksiyon endonüklez enzimleri ile kesilip alınmata ve sonra bir vektöre takılıp konak
hücre içine sokularak çoğaltılmaktadır. Yerine göre ya doğrudan çoğaltılmış olan bu
genler kullanılmakta ya da bunların ekspresyonu ile elde edilen proteinler
kullanılmaktadır. (Watson JD, Tooze, Kurtz DT, 1983).
Rekombinant DNA teknolojisi, günümüzde genetik hastalıklarda tanı, rekombinant aşı
yapımı, başka canlılardan gen transferi yoluyla transgenik bitki ve hayvan soyları elde
edilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır (Alper, 2003; Alper, 2004).
Rekombinant DNA teknolojisinin temelini gen klonlama süreci oluşturur. Bu sürecin
temel basamaklarını Klug ve Cummings asağıdaki gibi açıklamıştır:
1. Doku ya da hücrelerden DNA izole edilir.
2. DNA moleküllerini özgül dizilerden tanıyıp kesen restriksiyon endonükleazlar ya da
restriksiyon enzimleri denilen enzimlerle DNA parçaları oluşturulur.
3. Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçaları, vektör ya da taşıyıcı molekül
adı verilen diğer DNA molekülleri ile birleştirilir. İçine bir DNA parçası sokulmuş olan
vektör, bir rekombinant DNA molekülüdür.
3
4. Kendi DNA’sı ile birlikte, üzerinde yabancı DNA molekülünü taşıyan vektörün
oluşturduğu rekombinant molekül konakçı içerisinde kendini esler ve klon olarak
bilinen birbirine özdeş düzinelerce kopyasını oluşturur.
5. Konakçı hücre kendini eşlerken, rekombinant DNA molekülleri de yavru hücrelere
geçer ve her biri klonlanmış DNA dizisinin kopyalarını taşıyan konakçı hücre topluluğu
oluşur.
6. Klonlanmış DNA konakçı hücrelerden izole edilebilir ve incelenebilir.
7. Potansiyel olarak klonlanmış DNA transkripsiyona uğrayabilir, mRNA’sı
translasyona yönlendirilebilir, gen ürünü izole edilebilir ve araştırma için ya da ticari
amaçlarla satılmak için kullanılabilir.
Bu çalışmada rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak endüstriyel bir enzim olan
ksilanaz üretilmiş ve üretilen ksilanaz çeşitli karakterizasyon çalışmalarında
kullanılmıştır.
2.2. Enzim Üretiminde Mikroorganizmalar’ın Kullanılması
Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde edildiği
görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı
karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark, 2003). Bugüne kadar
yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10’u ticari alanda kullanım
için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu %10 içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile deterjan
katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün enzimlerin %80
ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal enzimlerin endüstriyel
ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir şekilde mikrobiyal
enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar, biyokimyasal çeşitlilikleri ve
genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden dolayı mükemmel bir enzim
kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark.,1998). Günümüzde endüstride
kullanılan enzimlerin
yaklaşık
%90’ı mikroorganizmaların fermentasyonu ile
üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin
yaklaşık %90’ı mikroorganizmalardan üretilmektedir (Wolfgang, 2004).
4
Mikroorganizma kökenli enzimlerin biyoteknolojik işlemlerle daha ekonomik biçimde
üretimi ve suda çözünmeyen matrikslerle immobilize edilerek daha uzun süre
kullanılabilmesi, mikrobiyal enzimlerin endüstriyel alanlarda kullanılmasındaki artış
nedenleridir (Gümüşel, 2002).
Enzim kaynağı olarak mikroorganizmaların tercih edilmesinin nedenleri;

yan ürün oluşturmalarının az olması

aktivitelerinin yüksek olması

daha ekonomik olması

stabiliteye sahip olması

yüksek oranlarda ve saflıkta üretilebilmeleridir
(Wiseman, 1987; Horikoshi, 1999).
Mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin tüm dünya genelinde yıllık kullanım
oranlarına bakıldığında %25 alkalin proteaz, %21 diğer proteazlar, %18 amilaz, %10
renin, %3 tripsin, %3 lipaz ve %10 diğer karbonhidrat parçalayan enzimler (selülaz ve
ksilanaz gibi), %10 kadar ise analitik ve farmasötik enzimlerin olduğu şeklinde bir
dağılım belirlenmiştir (Rao ve ark., 1998).
2.3. Endüstriyel Enzimler
Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve
ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler
ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır. Özellikle son
yıllarda stratejik alan şeklinde değerlendirilen rekombinant DNA teknolojisinden
yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek
yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998).
Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının yaklaşık 1,6
milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir (Schallmey ve ark., 2004).
Bu enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında;

%29’unun gıda endüstrisinde

%15’inin hayvan yemi sektöründe

%56’sının ise genel amaçlı
teknik alanlarda yer aldığı görülmektedir (Outtrup ve Jorgensen, 2002).
5
Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75’ini hidrolitik enzimler oluşturmaktadır.
Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken, karbohidratları parçalayan
enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992; Bhat, 2000). Karbonhidrat
parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında yaklaşık %25’lik bir paya sahiptir
(Sidhu ve ark., 1997; Rao ve ark., 1998). Son zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt
hamurunun beyazlatılması için ksilanazların endüstride kullanılması Viikari ve
arkadaşlarının (1986) buluşu ile artışa geçmiştir. Endüstride faydalı olan ve ticari olarak
kullanılan enzimlerin, bir ürünün üretilmesinde bazı avantajlara sahip olması
gerekmektedir.
Buna göre, bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet
bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en
önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına
bağlıdır (Wisema, 1987; Sarıkaya, 1995).
Bu çalışmada üretilen ksilanaz enziminin endüstrideki kullanım alanları Çizelge 2.1’ de
verilmiştir:
6
Çizelge 2.1. Ksilanazların Potansiyel Uygulama Alanları (Collins ve ark., 2005)
ENDÜSTRİSİ
UYGULAMA ALANI
FONKSİYONU
Çöp arıtımı, fermente edilebilen
Biyodönüşüm
Tekstil
Endüstriyel,evsel ve tarımsal
ürünlerin üretimi, yenilenebilir
atıkların çevreye karşı zararlarının
bioetanol ve zararsız kimyasalların
önlenmesi.
üretimi
Keten, kendir, jüt ve rami işlenmesi
Enzimatik yüzey düzleştirimi
Nişasta ihtiva etmeyen polisakkaritlerin
Hayvan beslemesi
Monogastrik (domuz ve kümes
içeriğini azaltır, intestinal vizkoziteyi
hayvanları) ve geviş getirenlerin
azaltarak hayvanın protein ve nişastadan
yemleri
maksimum ölçüde faydalanmasını
sağlar.
Kağıt imalatı esnasında klorin ve toksik
Kağıt hamurunun ağartılması
disakkaritlerin kullanımlarının
azaltılması
Kağıt ve kağıt hamuru üretimi
Alkali kullanımının azaltılması ve
biyoleke çıkarılması süreçlerinin
Biyoleke yok edilmesi
kolaylaştırılması
Pasta hamuru viskozitesinin azaltılması
Nişasta
Nişasta gluten ayırımı
Fırıncılık
Hamur ve pastacılık ürünleri
Meyve ve sebze işleme
Meyve ve sebze suyu, nektar ve
yanında yumuşatma özelliği ile kaliteyi
püre eldesi ile bitkisel yağ, şarap
artırır.
ve gluten topaklanmasının artırılması.
Hamur elastikiyetini ve dayanıklılığını
artırır.
Meyve suları viskozitesini azaltıcı etkisi
süreçleri, demleme, şarap
imalatı
imalatı
7
2.4. Ksiloz ve Ksilan
Ksiloz, yenilebilir birçok bitkinin tohumunda bulunan bir şeker olup, odun veya saman
gibi bitkisel yapılarda bulunan bir maddedir. Hayvansal tıpta ksiloz, bağırsaktaki
emilim sorununun teşhisi için suyla karışık olarak aç karnına verilmektedir. Eğer kanda
bir süre sonra ksilozla karşılaşılırsa bu bağırsakta bir sorun olmadığını gösterir.
Katalitik hidrojenasyon ile ksiloz, bir tür tatlandırıcı olan ksilitole dönüşür. Ksiloz ve
ksilitolün
her
ikisi
de
indirgeyici
şeker
olup
sanayide
tatlandırıcı
olarak
kullanılmaktadır.
Ksiloz ayrıca serin veya treonin, proteoglikan tip O-glikozilasyonda eklenen ilk
polisakkarittir. Bu nedenle heparan sülfat ve kondroitin sülfat gibi çoğu anyonik
polisakkaritlerin biyosentetik yolundaki ilk polisakkarittir. Ksilan, ksilozların glikozid
bağlarıyla bağlanması sonucu oluşur. Bitkilerin hücre duvarında, selülozdan sonra en
fazla bulunan hemiselülozik bir polisakkarittir.
Şekil 2.1. Ksilanın diyagramatik yapısı (Anonim, 2008d)
Ksilanlar, doğada yaygın olarak bulunan ve hemiselülozların yapısını oluşturan temel
polisakkaritlerdendir. Karasal bitkilerin hücre duvarlarındaki, lignin ve selüloz ara
yüzeyinde bir başka deyişle, bitki hücrelerinin ikincil hücre duvarında yer almaktadırlar
(Wong ve ark,1988, Seyis,1997). Ksilan bazı bitkilerde toplam kuru maddenin %
35’kadarını meydana getirmektedir. (Coughlan, 1985).
Ksilan tahıl danelerinin lif içeriklerinin önemli bir kısmını oluşturur. (Cowan, 1996).
Ksilan, selüloz ve lignin birbirlerine kovalent ya da non-kovalent bağlarla bağlanmış
olup birlikte bitki hücre duvarının ana yapısını oluştururlar (Beg ve ark., 2001).
Ksilanlar, ksilanazlar (β-1,4-D-endoksilanaz (EC 3.2.1.8)) tarafından β-1,4 bağlarının
hidrolizi ile D-ksiloz ünitelerine parçalanır ( Biely, 1985) (Şekil 2.1).
8
Şekil 2.2. Ksilanaz Enziminin Etki Spesifitesi
Arabinoksilanlar, pangola çayırları, bambu filizleri ve çavdar çayırları gibi bazı diğer
bitkilerde tanımlanmasının yanında arpada, buğdayda, çavdarda, pirinçte, yulafta da
tanımlanmıştır (Izydorczyk ve Biliaderis, 1995). Bu polisakkaritler tüm tahılların minör
bileşenleri olsa da onlar bitki hücre duvarlarının önemli bir parçasını oluşturur.
Glukuronoksilanlar ve glukuronoarabinoksilanlar hücre duvarının bütünlüğü için temel
olan lignin selüloz ve diğer polimerlerle kovalent ve non-kovalent bağlar oluşturarak
yapıştırıcı olarak işlev görür. Ksilanlar hemiselülozların en önemli sınıfıdır.
Angiospermlerde toplam kuru ağırlığın %15-30 unu oluştururlar fakat gymnspermlerde
daha az bulunurlar (%7-12 ksilan) (Haltrich ve ark., 1996). Glukuronoksilanlar, ksiloz
ile bağlı β-D-ksilopiranosil ünitelerinin lineer polimerleridir.
Bu polisakkarit iskeleti 4-O-metil-α-D-glukuranopiranosil ünitelerine, 4 pozisyonunda
metilenmiş D-glukuronosil ünitelerinden ve 2 veya 3 pozisyonuna dahil olmuş ve β-Dksilopiranosil’e
sahiptir
(Coughlan
ve
Hazlewood,
1993).
Angiosperm
glukuronoksilanlar, β-ksilopiranosil’in 2 veya 3 pozisyonunda asetil gruplarıyla yüksek
değişim oranına sahiptir bu durum ksilana sudaki kısmi çözünürlüğünü verir. Tipik
olarak yumuşak ağaçlarda bulunan Glukuronoarabino ksilanlar aynı ksilan iskelete
sahiptir fakat her birinde 10 tane β-D-ksilopiranosil ünitesi α-L-arabinofuranosil ile
yerine konulmaktadır. Yumuşak odunlar sert odunlardan daha yüksek 4-O-metil-α-Dglucuronopiranosil üniteleri içeriğine sahiptir. Bu ksilanlar asetillenmemiştir ve onların
furanosit yapısından dolayı arabinoz yan grupları asit tarafından hidrolizlenmektedir
(Ferreira-Filho 1994; Sunna ve Antranikian, 1997).
9
2.5. Ksilanazlar
Ksilanazlar ksilanların hidrolizini katalizler. Bu enzimler temelde mikroorganizmalar
tarafından üretilmektedir ve polisakkaritleri hidrolizleyen diğer enzimlerle birlikte bitki
hücre duvarının yıkımında rol alır ayrıca ksilanazlar bazı tohumların çimlenmesi
sürecinde ksilanı da sindirir (örneğin arpa tanelerinin malt haline dönüştürülmesinde).
Ksilanazlar ayrıca marina alglerinde, protozoalarda, kabuklu hayvanlarda, böceklerde,
salyangozlarda ve toprak bitkilerinin tohumlarında da bulunabilir
(Sunna ve Antranikian,1997).
Mikrobiyal kaynaklar arasında özellikle de flamentli mantarlar bu enzimleri ortama
salgıladığı için ve onların ksilanaz seviyeleri mayalarda ve bakterilerde olandan çok çok
daha yüksek olduğu için ilginçtir. Bakterilerde ksilanazlar mantarlarda olduğundan daha
düşük aktivite seviyelerinde üretilmemekte intrasellüler veya periplazmik miktarlarla
sınırlı kalmaktadır. Dahası bakteride eksprese edilen enzimler glikozilasyon gibi posttranslasyonel modifikasyonlara maruz kalmamaktadır.
Ksilanazlar, katalitik domainlerinde ki aminoasit dizi benzerliklerine bakılarak iki
glikanaz ailesine ayrılmıştır. İki ksilanaz ailesi, enzim hareket metodu, moleküler
ağırlık, net elektrik yükü vb özellikler bakımından birbirinden ayrılır (Gregory, A. C. E,
O’Connell, A. P, Paul, B. G, 1998) Günümüze kadar pek çok çeşit ksilanaz klonlandı.
Farklı özellikteki ksilanazlar farklı uygulamalarda kullanılmaya uygundur. Örneğin
alkali ksilanazlar kağıt endüstrisinde asidik ksilanazlar ise yem endüstrisinde kullanılır.
Bunlara ek olarak, spesifik aktivite, termal stabilite, katyon ve kimyasallara direnç gibi
ksilanazların bazı temel özellikleri de uygulamalar için önemli faktörlerdir
( Prade, R. A, 1995).
Günümüzde giderek popülarite kazanan ksilanazların, bitki hücre duvarının hemiselüloz
kısmını parçaladığı; ot yiyen hayvanların ve bazı bitki patojenlerinin bitkileri
parçalamak için ksilanaz içerdikleri saptanmıştır. Pek çok bakteri ve küf mantarının,
hemiselüloz-ksilan içeren ortamlarda heterotrofik olarak gelişmesini sağlayan ve
ortamda son ürün olarak serbest ksiloz oluşturan hücre dışı ksilanazlar oluşturduğu
anlaşılmıştır (Kulkarni ve ark.,1999). Birçok mikroorganizmaya ek olarak, bazı otçul
böcekler,
kabuklular
ve
bazı
alglerin
üretebildiği
ksilanazı,
memeliler
üretememektedirler (http://www.nature.nps.gov/benefitssharing/xylanase.htm..2004).
10
2.6. Ksilanolitik Enzimler ve Ksilanın Enzimatik Hidrolizi
Ksilan çok karmaşık bir moleküldür. Bu nedenle ksilanın hidrolizi için farklı enzimlere
ihtiyaç duyulur. Ksilan molekülünün hidrolizini gerçekleştiren enzimlerin tamamına
ksilanolitik enzim sistemi denir (Şekil 1. 7.). β-1,4-endoksilanaz, β- ksilozidaz, α-Larabinofuranosidaz, α-glukuronidaz, asetil ksilan esteraz ve fenolik asit (Ferulik ve pKumarik asit) esteraz enzimleri bu bahsedilen enzim sistemi içinde yer almaktadır
(Subramaniyan ve Prema, 2000).
Şekil 2.3. . Ksilanolitik Enzim Sistemi (Anonim, 2009e)
Ksilanın, heterojen ve karmaşık yapısı nedeni ile tamamen hidrolizi için işbirliği
içerisinde çalışan bir grup mikrobiyal enzimi gerektirmektedir. Bu grubu oluşturan
enzimler şunlardır (Gilbert ve Hazlewood 1993, Collins ve ark., 2004);

Ksilan iskeletindeki iç glikozid bağları rast gele kıran β-1,4-endoksilanazlar

(β-1,4–D-ksilanazlar; β-1,4-D-ksilan ksilanohidrolazlar; E.C. 3.2.1.8).

Ksilobiyozu ksiloza hidrolize eden, başka bir deyişle ksilooligosakkaritleri
İndirgen olmayan uçlarından kıran β-D-ksilosidazlar (β-1,4-D-ksilozid ksilohidrolazlar;
E.C.3.2.1.37 ).

Ksilandaki arabinoz yan zincirlerini hidrolize eden α-L-arabinofuranosidazlar
(E.C. 3.2.1.55).
11

Ksiloz gruplarından glukuronik asit yan zincirlerini ayıran α-D-glukuronidazlar
(E.C. 3.2.1.139 ).

Asetat gruplarını serbestleştiren asetil-ksilan esterazlar (E.C.3.1.1.72 ).

Ferulik asit esterazlar (E.C. 3.1.1.73 ).

p-kumarik asit esterazlar (E.C. 3.1.1.- ).

Ekzo-β-1,4-ksilanazlar (α - 1,4-D-ksilan ksilohidrolazlar ).
Bunlardan en önemlisi 1.gruptaki 1,4- β - endoksilanazlar’dır. Endoksilanazlar, ksilan
omurgasındaki iç glikozid bağları, ekzoksilanazlar ise endoksilanazların etkisi sonucu
oluşan ksilooligosakkaritleri hidrolize ederler; ve bu yolla ksilanın hidroliz oranı
yükseltilmiş olur (Wong ve ark.,1988).
Şekil 2.4’de ksilanaz enzimlerinin ksilan omurgasındaki etki noktaları şematik olarak
gösterilmektedir (Beg ve ark., 2001).
Şekil 2.4. Ksilanın tam hidrolizinde gerekli enzimler ve etki bölgeleri (Beg ve ark., 2001)
12
2.7. Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları
Ksilanazlar, gıdaların fiziksel özelliklerini geliştirmede, sıvı ya da gaz yakıtların
üretimi, çözücüler ve şeker gruplarının üretimi gibi genel uygulamalarda, tek hücre
proteini üretmede, lignoselülozik materyallerin dönüşümü, tarımsal atıkların fermentatif
ürünlere parçalanarak dönüşümü, meyve sularının berraklaştırılması, biranın kıvamının
düzenlenmesi, kağıt endüstrisinde ağartmayı iyileştirici olarak kullanılırlar ve
biyoteknolojik uygulamalar için yaygın potansiyelleri vardır (Beg ve ark., 2001;
Subramaniyan ve Prema, 2002). Ayrıca ksilanaz enzimi, özellikle öncelikli alan olan
hayvan besleme işleminde; kanatlı kümes hayvanlarında (Bedford ve Classen, 1992),
domuzlarda (Thacker ve Baas, 1996) ve sığırlarda (Beachemin ve ark., 1999b) verim ve
performansı artırmada etkin bir şekilde kullanılmaktadır ve ksilanaz kullanımı
hayvanlardaki kütle artışında önemli bir rol oynamaktadır. Yemlere enzim ilavesi
yapılmasıyla hayvanların yeterince veya hiç salgılayamadıkları enzimlerin salgılanması,
istenilmeyen bazı maddelerin etkisiz hale getirilmesi, yemlerdeki sindirimi güç olan
karbonhidratlarla diğer organik ve inorganik unsurlardan daha fazla yararlanılması
amaçlanmaktadır (Güçlü ve Kara, 2009).
Collins ve arkadaşları (2004) ksilanaz enzimlerinin endüstriyel kullanım alanlarını
temel olarak 4 grupta toplamışlar ve bu alanları:

Kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi

Hayvan besleme (Yem endüstrisi)

Gıda endüstrisi

Diğerleri olarak ifade etmişlerdir.
Ksilanazların en ümit verici uygulamalarından birisi, kağıt hamuru hazırlamada
beyazlastırma ajanı olarak klor kullanımınının azaltılması ve kağıt hamurundan lignini
ayırma özelliğidir. Enzim uygulaması kağıt hamurunun fibrilasyonunu ve su tutusunu
artırır, islenmemiş kağıt hamurunda dövme sayısını düşürür, hurda kağıt hamurunda
bağları onarır, çözünen hamurdan ksilanların selektif giderimini sağlar.
Ksilanazlardan ayrıca odun hamurunda biobeyazlatma, sentetik ipek üretiminde ise
hamurdan selüloz eldesinde faydalanılır (Viikari ve ark., 1986; Beg ve ark., 2001).
13
Ksilan tarım ve gıda endüstrisi atıklarında bol miktarda bulunmaktadır. Ksilanaz
uygulamaları ile atık sulardaki ksilan ksiloza dönüştürülür (Rani ve Nand,1996).
Yemlere ksilanaz eklenmesinin sindirimi kolaylaştırarak gelişme hızını arttırdığı, bir
başka deyişle, ksilanın kısmi hidrolizi ile ruminal sindirimde selüloza erişilebilirliğin
geliştiği ve bu yolla hayvan yemlerinin besinsel değerinin arttığı, ancak yemden
ksilanın tamamen uzaklaştırılmasının istenmediği çünkü hemiselülozların besinsel
liflerin önemli bir bileşeni olduğu ve bunların uzaklaştırılması ile bağırsak
hastalıklarının artabileceği anlaşılmıştır (Wong ve ark.,1988). Hayvan beslenmesinde
kullanılan ksilanazların esas kaynağının fungal olduğu, en çok kullanılanlar arasında da
Trichoderma ve Aspergillus türlerinden elde edilen ksilanazların yer aldığı açıklanmıştır
(Aehle, 2004).
Yemlerde doğal olarak bulunan ve besinsel değeri olmayan bazı faktörleri yıkarak besi
hayvanlarında daha çok ağırlık artışı sağlamak, ya da yemden daha iyi yararlanarak
hayvanın performansını arttırmak; protein, nişasta ve minerallerin kullanılabilir
olmayan kaynaklardan, elde edilebilirliklerini arttırmak gibi amaçlarla hayvan
beslemede ticari enzim preparatlarının kullanıldığı ve ksilanazlar veya endo-1,4-βksilanazlar (E.C.3.2.1.8)’ ın bu amaçla en çok kullanılan enzimler olduğu belirtilmiştir
(Aehle, 2004).
Meyve ve sebzelerin suyunun çıkarılması ve meyve sularının berraklaştırılması
amacıyla pektinaz ve selülaz ile birlikte kullanılır. Ayrıca ruminantların beslenmesinde
sindirimi artırmak amacıyla yem bitkilerinin ön işleminde kullanılmaktadır (Gilbert ve
Hazlewood, 1993). Bazı ksilanazlar bitki hücrelerinden protoplast üretimi için hücre
duvarının yumusatılmasında da kullanılır (Wong ve ark., 1988).
Ksilanazlar gıda endüstrisinde de kullanılmaktadır, bu alanda en çok fırıncılıkta
kullanıldığı ve unda bulunan, suda çözünmeyen hemiselülozu çözünür hemiselüloza
dönüştürdüğü; çözünür hemiselülozun ise hamurda ağırlığının yaklaşık 10 katı su
bağladığı ve bu yolla hamurun sağlamlığını arttırdığı, makineye yapışmasını önlediği
bilinmektedir. Ksilanaz ilave edilmiş hamurla yapılan ekmeklerin somun hacminin
arttığı, daha iyi daha uniform kırıntı, daha yumuşak ekmek elde edilebildiği, tazeliğin de
uzun süre korunduğu saptanmıştır (Kulkarni ve ark.,1999i; Beg ve ark., 2001).
14
2.8.Ksilanaz Gen Kaynakları
Ksilanazlar,
genellikle
saf
ksilan
veya
ksilanca
zengin
ortamlarda
gelişen
mikroorganizmalarda bulunan indüktif enzimlerdir. Bakteriler, fungiler, protozoalar,
algler, karındanbacaklılar ve antropodları da içine alan bir grup organizma tarafından
üretildikleri bildirilmiştir (Beg ve ark.,2001).
Bazı genel özelliklerine göre, ksilanaz üreten mikroorganizmaları aşağıdaki gibi
gruplandırmak mümkündür (Köksal, 1998).
1. Bakteriler; Bacillus sp., Cellulumonas fimi, Micrococcus sp. AR-135, Staphylococcus
sp. SG-1, Thermotoga maritima MSB8 vb.
2. Küf mantarları; Aspergillus niger ve Aspergilius nidulans gibi Aspergilli,
Aureobasidium pullulans vb.
3.
Funguslar;
Trichoderma,
Fusarium,
Penicillium,
Thermomyces
vb.
4.
Actinomycetes; Streptomyces sp., Thermomonospora curvata vb.
5. Rekombinant mikroorganizmalar.
Ayrıca genetik mühendisliği, moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojileri ile
üretilip endüstride kullanılan çok sayıda ticari ksilanaz da bulunmaktadır. Ksilanazların
ticari üretiminde kullanılan suşlar Trichoderma reesei, Thermomyces lanuginosus,
Aureobasidium pullulans, Bacillus subtilis ve Streptomyces lividans’ dır
(Beg ve ark., 2001).
2.9. Ksilanazla İlgili Yapılan Daha Önceki Çalışmalar
Lowe ve ark. (1987a), ksilanaz üretimini en çok etkileyen ksilan olsada ksilanazların
buğday samanı, selüloz, sellobiyoz, glukoz ya da ksilozda büyümüş anaerobik funguslar
tarafından da üretileceğini bildirmişlerdir. Bunun, anaerobik funguslar tarafından
sürekli olarak üretilen ksilanazın temel seviyesi olduğunu ve üretimi ksilanın varlığını
artırdığını da eklemişlerdir.
Lowe ve ark. (1987c) ve Mountfort ve Asher (1989) yaptıkları çalışmalarında ksilanlı
ortamda, ksilanaz ve ksilobiaz enzimlerinin her ikisinin de kültür sıvısında ksilanın
parçalanarak; ksiloz, ksilobioz ve ksilo-oligosakkaritlerin oluşması süresine dek görev
aldığını belirtmişlerdir.
15
Mountfort ve Asher (1989), ksilanazın esasen ekstraselüler ya da kısmen hücre
bağlantılı olarak salgılanabildiğini ve enzimin optimum pH’sının 5.5–6.0 arası,
optimum sıcaklığının ise 50ºC olduğunu bildirmişlerdir.
Gilbert ve ark. (1992), rekombinant bir ksilanazı (xynA), Neocallimastix patriciarum’un
mRNA’sından elde edilen bir E. coli’nin barındırdığı xylA’dan saflaştırmış, bu enzimin
çavdar ksilanından ksilobioza kadar etkin olduğunu saptamışlardır. Ancak bu enzimin
katalitik etki alanının farklı olması sebebiyle selülotik substratlara ve bu yapıların
birimlerine etkili olmadığını eklemişlerdir.
Gilbert ve Hazlewood (1993) çalışmalarında selülaz celB geni gibi, Neocallimastix
patriciarum ve bazı bakteriyel ksilanaz enzimlerinin sekanslarının karşılaştırmış ve bu
enzimler arasındaki belirgin homolojiyi açığa çıkarıp, rumen prokaryotları ve düşük
ökaryotlar arasında horizontal gen transferinin olabilirliğini ve ortak bir evrimsel
orijininin olabileceğini rapor etmişlerdir.
Garcia-Campayo ve Wood (1993), Neocallimastix frontalis’ten B-D-ksilosidazı
saflaştırmışlardır. Enzimin 2 polipeptit alt ünitesinin moleküler ağırlığının 83 kDa ve 53
kDa olduğunu belirtmişlerdir. İzole edilen enzimin optimum sıcaklığı 37ºC, optimum
pH’sı 6,4 olup, enzim, ksilo-oligosakkaritler ve ksilobioz üzerinde tipik bir ekzoaktiviteye sahiptir ve D-ksiloz varlığında enzim aktivitesi ciddi miktarda azalır.
Katalitik aktivitelerin polipeptit alt ünitelerinin biri ya da her ikisine bağlı olup olmadığı
net değildir ancak enzimin Cu2+, Ag2+, Zn2+, EDTA ve SDS tarafından yavaşlatıldığını
ve Ca2+, Mg2+ varlığında uyarıldığını da eklemişlerdir.
16
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Kullanılan Cihazlar
Çalısmada kullanılan cihazlar Çizelge 3.1’de verilmiştir.
Çizelge 3.1 Kullanılan cihazlar
Cihaz Adı
Firma
Model
Mikrodalga Fırın
Arçelik
MD500
Sonikatör
Bandelin
Sonopuls HD3100
Mikrotüpler İçin Termal
Biosan
TS-100
Sallayıcı
Spin Cihazı
Thermo
Shaker
Biosan
Combi Spin FVL
2400N
Thermal cycler
BioRad
Agaroz Jel Elektroforezi
BioRad
PAGE Elektroforezi
BioRad
Güç Kaynağı
BioRad
Power PAC 300
PCR makinesi
BioRad
DNA Engine
Santrifüj
Hettich Vision 300.000 I
MIKRO 22R
Dondurucu (-80°C)
Hettich
Mikrosantrifüj
Hitachi
Otoklav
Hiclave
İnkübatör
Memmert, Biosan
Jel Görüntüleme Sistemi
Syngene and Kodak
pH Metre
Sartorius Professional meter pp
15
Dikey Soğutucu +4oC
Uğur
UV/VIS Spektrofotometresi
Varian carry 50
Vorteks
VVR, Biosan
17
Buzdolabı
Vestel
Isıtıcı-Magnetik karıştırıcı
Velp Scientifica ARE
Terazi
Vibra
Buz Makinesi
VISION
Yüksek Hızlı Santrifüj
VISION
Kar makinesi
VISION
Saf Su Cihazı
Younglın ınstrument
Orbital
GTP 455A
VS 30 000i
Çalkalayıcılı Zcheng
ZHWY-111C
inkübatör
3.1.2. Kullanılan Kimyasallar
Çalısmada kullanılan kitler ve kimyasal malzemeler Çizelge 3.2’de verilmiştir.
Çizelge 3.2 Kullanılan kitler ve kimyasal malzemeler
Kimyasal Madde/Malzeme
Firma
LB Broth Base
Invitrogen- lennox L Broth Base
Agar
BD BactoTM Agar
Dekstroz
Merck
Pepton
BD
Tripton
BD- BactoTM
D-Glukoz monohidrat
Alfa Aesar
Gliserol
Euromedex
KCH3COO
Merck
KCl
Sigma
NaCl
Carlo Erba
MgSO4.7H2O
Riedel de Haën
CaCl2.2H2O
Carlo Erba
Kanamisin
Sigma Aldrich
Kloramfenikol
Sigma
IPTG
Amresco
DMSO
Merck
18
Agaroz
Bioron
Etidyum bromür
ICN
Akrilamid
Amresco
SDS
Serva
APS
Biorad
TEMED
Biorad
PiPES
Alfa Aesar
Trisma baz
Sigma Aldrich
HCl
Merck
PMSF
Sigma Aldrich
Bezamidin
Merck
İmidazol
Merck
Etanol
Merck
Metanol
Merck
C6H5Na3O7
Sigma-Aldrich
Tampon D
Promega
Tampon K
Takara
Tampon E
Promega
T4 DNA ligaz tamponu
Promega
Triton X100
Takara
BSA
Promega/Takara
DNS
Alfa Aesar
Na-K-tartarat
Carlo Erba
19
Ksilan
TCl
Plazmid DNA saflastırma kiti
Promega
PCR ürünleri temizleme kiti
Bio Basic
3.1.3. Kullanılan Enzimler
Çalısmada kullanılan enzimler Çizelge 3.3’de verilmistir.
Çizelge 3.3 Kullanılan enzimler
Enzim
Firma
Taq DNA Polimeraz
Fermentas/Promega
T4 DNA ligaz
Promega/Takara
XhoI
Promega
NcoI
Takara
XbaI
Takara
3.1.4. Primerler
Çizelge 3.4 Ksilanaz genini çoğaltmak amacıyla PCR’de kullanılan primerler
Primer
Primer dizisi
Tm
pET28xynBNcoISense
TTTTTCCATGGGTTCTACCCCTAGTTCTACT
60.4
pET28xynBXhoIReverse
TTTTTTCTCGAGTTAGTGATGGTGGTGATGATGTT
60.7
20
3.1.5. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Mikroorganizmalar
Klonlama
ve
ekspresyon
işlemlerini
gerçekleştirmek
amacıyla
kullanılan
mikroorganizmalar Çizelge 3.5’de verilmiştir.
Çizelge 3.5. Klonlama ve ekspresyon işlemlerinde kullanılan mikroorganizmalar
Tür
Suş
Kullanım amacı
Escherichia coli
DH5α
Klonlama
Escherichia coli
BL21(DE3) pLysE
Ekspresyon
3.1.6. Klonlama ve Ekspresyon İşlemlerinde Kullanılan Plazmitler
Klonlama ve ekspresyon işlemlerini gerçekleştirmek amacıyla kullanılan plazmitler
Çizelge 3.6’da verilmiştir.
Çizelge 3.6. Klonlamada ve ekspresyonda kullanılan plazmitler
Plazmit
Firma
Kullanım amacı
pET28b(+)
Novagen
Klonlama ve ekspresyon
vektörü
Şekil 3.1’de pET-28a(+) vektörüne ait dairesel harita ve poli-linker bölgesinin detaylı
dairesel restriksiyon enzimleri ile birlikte DNA dizisi verilmiştir.
21
Şekil 3.1. pET-28a(+) vektörünün dairesel haritası ve poli-linker bölgesinin detaylı dairesel restriksiyon
enzimleri ile birlikte verilen DNA dizisi (Novagen)
22
3.1.7. Kullanılan Çözeltiler
3.1.7.1. Tampon Çözeltiler ve Hazırlanışları
FSB çözeltisi: 7,4 g KCl, 7,5 g CaCl2.2H2O, 100g gliserol, 10 ml 1M (pH=7,5)
KCH3COO alınarak pH=6,2’ye ayarlandı ve hacim 1 L’ye tamamlandı. Otoklavlandı.
PİPES’li tampon çözeltisi: 0,5 M, 50 ml PiPES çözeltisi hazırlandı. KOH ile pH 6,7’e
getirildi. Ardından 6,92 g MnCl2, 1,66 g CaCl2 ve 18,64 g KCl 980 ml suda çözüldü.
Üzerine 20 ml PiPES çözeltisi eklendi ve hacim 1 L’ye tamamlandı. 0,45 μm’lik
filtreden geçirildi ve steril şişelere bölünerek, -20˚C’de saklandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 4): 61,45 ml 0,1 M sitrik asit ve 38,55ml
0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 5): 48,50 ml 0,1 M sitrik asit ve 51,50
ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 6): 39,85 ml 0,1 M sitrik asit ve 63,15
ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Sitrik asit-Na2HPO4 (Mcllvaine) tamponu (pH 7): 17,65 ml 0,1 M sitrik asit ve 82,35
ml 0,2 M Na2HPO4 çözeltisi karıştırılarak hazırlandı.
Tris-HCl tamponu (100 mM pH 8): 1,21 g Tris yaklasık 90 ml saf suda çözüldükten
sonra pH’sı 1M HCl ile 8’e ayarlanarak toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye tamamlandı.
3.1.7.2. Sıvı ve Katı Besiyerleri
LB Agar: 20 g LB (Luria-Bertani) Broth Base (10 g pepton, 5 g maya özütü, 5 g NaCl)1
L suda çözüldü. Hazırlanan 1 L’lik çözelti 400’er ml olacak şekilde 2 tane stok şişesine
alındı ve üzerlerine 6’şar g agar ilave edilip karıştırıldı, otoklavlandı.
Artan LB çözeltisi yaklaşık 5’er ml olacak şekilde deney tüplerine konuldu ve ağız
kısımları alüminyum folyo ile kapatıldı, otoklavlandı. (LB: 10 g yeast ekstrakt, 10 g
tripton, 5 g NaCl).
SOB: (Super Optimal Broth): 20 g tripton, 5 g maya özütü, 2 ml 5 M NaCl, 2,5 ml 1 M
KCl, 10 ml 1 M MgCl2 ve 10 ml 1 M MgSO4.7H2O büyük bir behere alınarak üzeri
deiyonize su ile 1 L’ye tamamlandı, iyice karıştırıldı ve otoklavlandı.
23
3.1.7.3. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Poliakrilamid Jel Elektroforezinde
Kullanılan Çözeltiler
Ayırma jeli tamponu: 18,2 g Tris (1,5 M) ve 0,4 g SDS (%0,4 w/v) yaklasık 90 ml saf
suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M HCl ile 8,8’e ayarlanıp toplam hacmi saf suyla 100
ml’ye tamamlandı.
Yükleme jeli tamponu (4xTris-HCl/SDS): 6,05 g Tris (0,5 M) yaklasık 90 ml saf suda
çözüldükten sonra pH’sı 1 M HCl ile 6,8’ ayarlanıp toplam hacmi saf suyla 100 ml’ye
tamamlandı. 0,4 g SDS (%0,4 w/v) ilave edildi. +4°C’de muhafaza edildi.
Numune tamponu (2x): 25 ml 4x Tris-HCl/SDS (pH6,8), 20 ml gliserol (%20 w/v), 4 g
SDS (%4 w/v), 2 ml β-merkaptoetanol, 1 mg bromfenol mavisi ve 53 ml suyun
karıstırılmasıyla hazırlandı. Küçük kısımlara ayrılarak -20°C’de muhafaza edildi.
Amonyum persülfat (APS) çözeltisi (%10w/v): 0,1 g APS 1 ml saf suda çözüldü.
Running Buffer (5X): 15 g Tris, 72 g glisin ve 5 g SDS yaklasık 900 ml suda
çözüldükten sonra toplam hacmi saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı.
Stain çözeltisi: 0,5 g Coomassie brillant blue 250 ml metanol, 50 ml glasiyel asetik
asitte çözüldükten sonra toplam hacim saf suyla 500 ml’ye tamamlandı.
Destain çözeltisi: 250 ml metanol ve 50 ml glasiyel asatik asit karıstırılarak toplam
hacim saf suyla 500 ml’ye tamamlandı.
3.1.7.4. Agaroz Jel Elektroforezinde Kullanılan Çözeltiler
Etilendiamin tetra asetik asit (0,5 M pH 8 EDTA): 186,1 g Na2EDTA.2H2O 700 ml saf
suda çözüldükten sonra pH’sı 1 M NaOH ile 8,0’e ayarlanarak toplam hacim saf suyla
1000 ml’ye tamamlandı.
Tris Asetat EDTA (50xTAE) tamponu: 242 gr Tris, 57,1 ml glasiyel asetik asit, 100 ml
0,5 M EDTA (pH 8,0) bir miktar suda çözüldükten sonra pH’sı glasiyel asetik asitle
8,5’e ayarlanarak toplam hacim saf suyla 1000 ml’ye tamamlandı.
Örnek yükleme boyası (6x): 25 mg bromfenol mavisi ve 3 ml gliserol saf su ile iyice
karıştırılarak toplam hacmi 10 ml’ye tamamlandı.
24
3.1.7.5. Enzim Saflaştırmada Kullanılan Çözeltiler:
NaH2PO4-Na2HPO4 tamponu (100 mM pH 7,6): 65 ml 0,2 M NaH2PO4 ve 0,2 M 435
ml Na2HPO4 karıştırıldıktan sonra toplam hacim saf su ile 1000 ml’ye tamamlandı.
Yükleme tamponu (Loading Buffer)(100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4-Na2HPO4 pH
7,6): 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4-Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü.
Yıkama tamponu (Wash Buffer)(25 mM imidazol 100 mM NaCl-100 mM NaH2PO4Na2HPO4 pH 7,6): 0,85 g imidazol, 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4-Na2HPO4
tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü.
Elüsyon tamponu (Elution Buffer)(300 mM imidazol 100 mM NaCl-100 mM
NaH2PO4-Na2HPO4 pH 7,6): 10,21 g imidazol, 2,92 g NaCl 500 ml NaH2PO4Na2HPO4 tamponunda (100 mM pH 7,6) çözüldü.
3.1.7.6. Enzim Aktivite Tayininde Kullanılan Çözeltiler
Dinitrosalisilik asit (DNS): 1 g DNS 50 ml saf suda çözüldü, üzerine 30 g K-NaTartarat ve 20 ml 2N NaOH ilave edilerek toplam hacim saf suyla 100 ml’ye
tamamlandı. +4°C’de muhafaza edildi.
Ksilan substratı (%1’lik(w/v)): Çözelti konsantrasyonu %1’lik (w/v) olacak sekilde
beechwood xylan tartıldı ve üzerine çalışılacak tampon çözeltiden ilave edildi. Birkaç
dakika kaynatıldıktan sonra bir gece boyunca magnetik karıştırıcıda karıştırıldı.
Ksiloz standart çözelti: Konsantrasyonu 10 mg/ml olacak şekilde, hesaplanan miktarda
ksiloz saf suda çözülerek ana stok çözelti hazırlandı. Hazırlanan bu stok çözeltiden saf
suyla seyreltmeler yapılarak çalışılacak farklı konsantrasyonlarda strandart çözeltiler
hazırlandı.
3.1.7.7. Diğer Çözeltiler
IPTG: 1 g IPTG, 10 ml steril suda çözüldü ve nitro selüloz membrandan süzüldü. 1’er
ml olacak şekilde ependorflara bölündü ve dondurucuya (-20 ˚C) kaldırıldı. PMSF
çözeltisi: 200 μg PMSF %99’luk 1 ml etanol ile çözüldü. -20°C’de muhafaza edildi.
25
Benzamidine çözeltisi: 15,66 mg benzamidin hidroklorür 1 ml suda çözüldü. -20°C’de
muhafaza edildi.
İmidazol çözeltisi: (300 mM) 2,045 g imidazol, bir miktar tris tamponunda çözüldü. Son
hacim tris tamponuyla 100 ml’ye getirildi.
Kloramfenikol Çözeltisi: Kloramfeikol 34 mg/ml olacak sekilde mutlak etanolde
çözüldü ve 0,2 μm’lik filtreden geçirilerek steril edildi. -20°C’de saklandı.
Kanamisin çözeltisi: 0,25 g kanamisin 5 ml otoklavlanmıs ultra saf suda çözüldü ve 0,2
μm’lik filtreden geçirilerek steril edildi. Ardından küçük hacimler halinde steril
ependorf tüplerine dağıtılarak -20°C’de muhafaza edildi.
3.2. Yöntem
3.2.1. Ksilanaz Gen Kaynağı
Ksilanaz geninin eldesi (Plazmid DNA şeklinde Prof. Dr. Mehmet İNAN tarafından:
Akdeniz Üniversitesi Mühendislik fakültesi Gıda Mühendisliği) bölümünden temin
edildi.
3.2.2. PCR İşlemleri için Primerlerin Tasarımı
Ksilanaz enziminin üretimi için gerekli olan DNA dizisi, DNA kütüphanelerinden
belirlendi. Aspergillus niger xynB geninin DNA dizisinin çoğaltılması için PCR
işleminde gerekli olan primerler pET28b plazmit sistemi için dizayn edildi.
Primerler
pET28xynBNcoISense
pET28xynBXhoIReverse
DNA Dizisi
TTTTTCCATGGGTTCTACCCCTAGTTCTACT
TTTTTTCTCGAGTTAGTGATGGTGGTGATGATGTT
Şekil 3.2. Ksilanaz genini çoğaltmak amacıyla kullanılan ileri ve geri primerlerin nükleotit sıraları
3.2.3. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu
PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) islemleri için satın alınan primerler 5 μM olacak
sekilde, yüksek saflıktaki oligonükleotidler ise PCR islemlerinde kullanılacak
konsantrasyonda hazırlanarak asağıda içeriği ve koşulları verilen PCR gerçekleştirildi.
26
50 μl’lik PCR karısımı:
27,5 μl H2O (DNAz & RNAz free)
5 μl 10x tamponu
4 μl MgCl2
4 μl dNTP karışımı (25 mM)
4 μl primer “sense”
4 μl primer “reverse”
1 μl Kalıp DNA
0,5 μl Taq DNA polimeraz
Şeklinde toplam 50 µl olan PCR tüpleri hazırlandı. PCR işleminde; sıcaklık değerleri
her bir döngü için aşağıda gibi ayarlanmış ve toplamda 30–35 döngüyle PCR işlemi
tamamlanmıştır.
PCR koşulu:
4°C
10 dk
95°C
2 dk
94°C
1 dk
55°C
1 dk
72°C
1 dk
72°C
5 dk
4°C
∞
35 döngü
1. Denatürasyon:
94 C
2. Primer Annealing:
55C
3. Ekstensiyon:
72 C
PCR işlemleri gerçekleştirildikten sonra 10 μl PCR karışımından alınarak %1‘lik agaroz
jelinde analiz edildi ve jelin fotoğrafı alındı.
27
3.2.4. PCR ürünlerinin Saflaştırılması
PCR işlemi gerçekleştirildikten sonra, DNA PCR karışım çözeltisinden “Biobasic Gel
and PCR Clean-Up” kiti kullanılarak üreticinin tavsiye ettiği protokole uygun olarak
saflaştırıldı.
Protokol aşağıdaki gibidir:

DNA karışımı 1.5 ml Eppendorf tüpüne transfer edilir ve karışımın hacminin 3
katı kadar “Cleanup Solution” eklenir.

Karışım EZ-10 Spin kolona eklenir ve 2 dk oda sıcaklığında bekletilir. Ardından
2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj yapılır.

Alttaki sıvı atılır. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm
(8000xg)‘de santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve kolon aynı toplama tüpüne geri
koyulur.

Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj
yapılır. Alttaki sıvı atılır ve Wash Solution’ın kalan miktarını çıkarmak için 10000 rpm
de 1dk santrifüj yapılır.

Kolon 1.5 ml temiz Eppendorf tüpüne transfer edilir. Kolonun merkezine 30-50
μl “Elution Buffer” ya da su eklenir ve 50 °C’de 2 dk bekletilir.

10000 rpm (8000xg)‘de 2 dk santrifüj yapılır.
3.2.5. Restiriksiyon Enzimleri ile Kesim
Çizelge 3.7 Kesim işlemi için gereken madde miktarları:
xynB Geni İçin Kesim
pET28b Vektörü İçin Kesim
28 µl DNA
20 µl Vektör DNA
4 µl 10x Buffer K
3 µl 10x Buffer K
4 µl BSA
3 µl BSA
2 µl NcoI
2 µl NcoI
2 µl XhoI
2 µl XhoI
28

Çizelge 3.7’deki gibi olmak üzere, PCR ürünü için toplam hacmi 40 μl, vektör
için 30 μl olan tüpler hazırlandı ve vortekslendi. Ardından mikrosantrifüjle 3-5 saniye
hızlıca döndürülerek 37˚C’de inkübasyona bırakıldı.

4 saat boyunca her saat başı tüpler mikrosantrifüjde hızlıca döndürüldü ve
37˚C’de inkübasyona devam edildi.

2 saat sonra tüpler alınarak; sadece vektörün kesildiği tüplere 1’er μl XhoI ve
NcoI 0,2 μl 10x Buffer K eklendi.

Ardından tüm tüpler hızlıca döndürülerek tekrar 37˚C’de inkübasyona bırakıldı.

4. saatin sonunda tüpler hızlıca döndürülerek kesim işlemi sonlandırıldı.

Şeklinde sıralanan işlemlerle kesim 4 saatte tamamlandı ve “Biobasic Gel and
PCR Clean-Up” kiti ile saflaştırıldı.
3.2.6. DNA Ligasyonu
NcoI ve XhoI ile kesilen plazmid DNA’lar ve PCR ürünleri Promega T4 DNA Ligaz
kullanılarak birleştirildi. Ligasyon karışımı için işlemler Çizelge 3.8’de verildiği şekilde
yapıldı:
Çizelge 3.8. pET28b vektör sistemi ligasyon için gereken madde miktarları:
Ligasyon Karışımı I
Ligasyon Karışımı II
1 µl kesilmiş pET28b plazmiti
2,5 µl kesilmiş pET28b plazmiti
3 µl T4 DNA Ligaz Tamponu (10x)
3µl T4 DNA Ligaz Tamponu (10x)
20 µl kesilmiş xynB Geni
18,5 µl kesilmiş xynB Geni
1 µl T4 DNA Ligaz
1 µl T4 DNA Ligaz
Çizelge 3.8’de verilen miktarlarda yapılan pipetlemenin ardından, hazırlanan ligasyon
karışımı mikrosantrifüjde hızlıca döndürüldü ve +16 ˚C’de gece boyu inkübasyona
bırakıldı. İnkübasyonun ardından transformasyon işlemlerinde kullanılıncaya kadar
+4˚C’de muhafaza edildi.
29
3.2.7. Kompotent Hücre Hazırlanması
3.2.7.1. PİPES’li Kompotent Hücre Hazırlanması

Petriye DH5α ekildi ve 16 saat inkübe edildi.

16 saatlik inkübasyonun ardından alınan petriden 1 koloni alınarak; içinde 25 ml
SOB bulunan 250 ml‘lik erlene inoküle edilerek, 250 rpm ve 37˚C de 6 saat inkübe
edildi.

6 saatin ardından kültür için içinde 250 ml SOB bulunan 3 tane erlen hazırlandı
ve bir önceki DH5α‘dan; 10 ml, 4 ml ve 2 ml inoküle edildi. Hazırlanan erlenler 1822˚C arası 14 saat boyunca 150 rpm‘de inkübe edildi.

Kültürlerin 600 nm‘deki OD‘leri her 45 dakikada bir okundu ve değer 0,55‘e
ulaştığında kültür çalkalayıcıdan alındı.

10 dakika buzlu-su banyosunda bekletildi.

Ardından hücreler +4˚C‘de 2500 g (3900 rpm)‘de 10 dakika santrifüjlendi.

Besiyeri boşaltıldı ve santrifüj şişesinin içinde kalan besiyeri temizlendi.

Hücrelere 0˚C’deki 80 ml PiPES‘li tampon ilave edilerek, hassas olarak yeniden
süspansiyon haline getirildi.

Hücreler, +4˚C 2500 g (3900 rpm)‘de 10 dakika santrifüjlendi. Tüpün içindeki
tampon boşaltıldı ve temizlendi.

Hücrelere 0˚C‘de 20 ml PiPES‘li tampon ilave edildi ve hassasça yeniden
süspansiyon hale getirildi.

1,5 ml DMSO eklendi, hafifçe karıştırıldı. Buz banyosuna alındı ve 10 dakika
beklendi.

Hızlı bir şekilde hücreler steril ependorf tüplere bölündü ve hızlıca donması için
sıvı azota atıldı. Ardından hücreler -80˚C‘de saklandı (Inoue ve ark., 1990).
3.2.7.2. FSB’li Kompotent Hücre Hazırlanması

1 gece önce inoküle edilen kültürden 1 ml ve 0,5 ml alınarak 2 tane steril erlene
eklendi. Üzerine 50 ml LB (Luria Bertani) eklenerek; 370C ve 250 rpm’de inkübasyona
bırakıldı.
30

Optik dansite, 600 nm’de absorbans yaklaşık olarak 0,7 olduğunda erlenler
inkübatörden alındı ve +40C 5000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi.

Süpernatant atıldı. Pelet üzerine 50 ml soğuk FSB (dondurulmuş saklama
tamponu) çözeltisi eklendi çok iyi vortekslendi. Ardından 1 saat buz banyosunda inkübe
edildi.

1 saatin ardından; +40C, 4000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant
atıldı.

Pelet üzerine 8 ml soğuk FSB çözeltisi eklendi ve tüpe vurarak çözünme
sağlandı.

Peletin tamamı çözününce üzerine 560 μl DMSO eklendi ve 3 saat buza
gömüldü.

saatin ardından kompotent hücre hazır hale geldi (Hanahan, 1983).
3.2.8. Transformasyon

Buz banyosunda bulunan kompotent hücrelerden 200 μl’lik kısımlar alındı.
Gerekli sayıda ependorfa pipetleme yapıldı. Üzerine 5 μl ligasyon ürünü eklendi ve
karıştırılarak 1 saat buz banyosuna gömüldü.

1 saatin ardından 2 dakika 42oC’de ısı şokuna maruz bırakıldı.

Tekrar buza gömülerek 5 dakika inkübe edildi.

Üzerine 300 μl (veya kullanılan kompotente göre SOB) LB eklendi ve yarım
0
saat 37 C ve 250 rpm’de inkübasyona bırakıldı.

Yarım saatin ardından her bir ependorf içeriği seçici besiyerine pET28b sistemi
için kanamisinli petriye sprader ile yayıldı. 370C’de 1 gece inkübasyona bırakıldı
(Hanahan,1985).
3.2.9. Plazmid DNA Saflaştırılması
Petri tabaklarından elde edilen koloniler kanamisin ihtiva eden 4 ml’lik steril sıvı LB
içerisine tek koloni olarak inoküle edildikten sonra 37 °C de gece boyu inkübe edilerek
yetistirildiler. Santrifüjle ependorf tüplerine toplanan hücrelerden plazmit DNA
31
“Biobasic Plasmid DNA Purification” kiti kullanarak aşağıdaki protokole göre
saflaştırıldı. Protokol aşağıdaki gibidir:

Kültürden 1.5-5 ml tüpe transfer edilir, 2 dk 12000 rpm ‘de santrifüj yapılır ve sıvı
tamamen dökülür.

100 μl Solution 1 eklenir ve iyi bir şekilde karıştırılır (vorteksle) ve 1dk beklenir.

Karışıma 200 μl Solution 2 eklenir ve nazikçe 4-6 kez alt üst edildikten sonra 1dk
oda sıcaklığında bekletilir. (Genomik DNA kontaminasyonlarını engellemek için
vorteksleme yapılmamalıdır).

Karışıma 350 μl Solution 3 eklenir ve nazikçe karıştırılıp oda sıcaklığında 1 dk
bekletilir.

12000 rpm’de 5 dk santrifüj yapılır.

Süpernatant EZ-10 Spin kolona eklenir ve 2 dk 10000 rpm ‘de santrifüj yapılır.

Alttaki sıvı atılır. Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm ‘de
santrifüj yapılır. Alttaki sıvı atılır ve kolon aynı toplama tüpüne geri koyulur.
 Kolona 750 μl “Wash Solution” eklenir ve 2 dk 10000 rpm (8000xg)‘de santrifüj
yapılır.
 Alttaki sıvı atılır ve Wash Solution’ın kalan miktarını çıkarmak için ekstradan 1dk
daha santrifüj yapılır.
 Kolon 1.5 ml temiz Eppendorf tüpüne transfer edilir. Kolonun merkezine 50 μl
steril distile su eklenir ve 50 ˚C’de 2 dk bekletilir.
 10000 rpm‘de 2 dk santrifüj yapılarak plazmit DNA’lar saflaştırılır.
 Saflaştırılan plazmid DNA’lar restiriksiyon enzim analizinde kullanılmak üzere -20
˚C’de muhafaza edilir.
3.2.10. Doğrulama Restriksiyon Kesimi
Saflaştırılan plazmid DNA (pET28b-xynB), XbaI ve XhoI ile kesildikten sonra bu
plazmidin istenilen uzunlukta DNA parçalarını (insertleri) (564 bç) ihtiva edip
etmedikleri %1’lik agaroz jel üzerinde analiz edildi.
32
Çizelge 3.9. pET28b vektör sistemi doğrulama kesimi için gereken madde miktarları:
pET28b Vektör Sistemi İçin Kesim
18 µl Plazmit DNA (pET-XynB )
2,5 µl 10x Buffer D
2,5 µl BSA
1µl XbaI
1µl XhoI

Olmak üzere tüpler hazırlandı, vortekslendi. Mikrosantrifüjle 3-5 saniye hızlıca
döndürüldü ve 37˚C’ye ayarlanmış bir ısıtıcı blok üzerinde 2,5 saatlik
inkübasyona bırakıldı.

2,5 saatlik inkübasyon süresince her 45 dakikada tüpler alınarak hızlıca
döndürüldü ve inkübasyona devam edildi.

2,5 saat sonra tüpler alınarak hızlıca döndürüldü.

Alınan belirli miktardaki numunelerin üzerine DNA boyası eklenerek agaroz jele
yaklasık olarak 15 μl yükleme yapıldı. Yürütme tamamlandıktan sonra jelin
fotoğrafı alındı.,
3.2.11. DNA Dizileme
Restriksiyon enzim analizi sonucu pozitif olduğu düşünülen 1,3,9,10 nolu plazmit
DNA’lardan 30 μl alındı ve T7 promotor primeri ile dizi analizi yapılmak üzere DNA
dizilemeye gönderildi.
3.2.12. E. coli BL21(DE3) pLysE Hücresinin pET28b(+)-xynB Plazmidi ile
Transformasyonu ve Ksilanaz’ın Ekspresyonu
Protein ekspresyon çalışmaları için E. coli BL21 pLysE suşu kullanıldı. -80 0C derin
dondurucudan çıkarılan stok hücreler 4 µl kloramfenikol içeren 4 ml’lik LB besiyerine
inoküle edilerek bir gece 37 0C’de 250 rpm çalkalama hızında yetiştirildi.
33
Daha sonra FSB’li kompetant hücre hazırlama protokolüne uygun şekilde hücreler
kompetent hale getirildi (Bkz 3.2.7.2).
Kompetent hücrelere pozitif plazmitler başlık 3.2.8’de anlatılan protokole göre transfer
edildi.
Transformasyonun
ardından
hücreler
pET28b
sistemi
için
içerisinde
kloramfenikol ve kanamisin bulunan LB Agar besiyerine yayma yöntemiyle ekildi ve 1
gece 37 0C’de inkübasyona bırakıldı. Üreyen hücrelerden birer koloni alarak pET28b
sistemi için içerisinde 4 µl kloramfenikol ve 2 µl kanamisin bulunan 4 ml’lik LB
besiyerine inoküle edilerek bir gece 37 0C’de 240 rpm de inkübe edildi. Hücreler
kanamisin ve kloramfenikol içeren ve içinde 600 ml LB bulunan 2 L’lik steril erlenlere
inoküle edildi. Her saat 600 nm’deki absorbanslarına bakıldı. OD  0,7 olduğunda 500
μl 1 M IPTG ilave edilerek indüklendi. IPTG ile indüklenmeden önce 1ml örnek alındı.
IPTG’li 3 saatlik inkübasyonun ardından erlenler alınarak; 1ml örnek alındı ve 250
ml’lik santrifüj kaplarında, 6000 rpm’de 4˚C’de 10 dakika santrifüjlendi. Süpernatant
tamamen uzaklaştırılarak toplanan E. coli BL21 pLysE hücreleri parçalama işlemi
yapılıncaya kadar -20˚C’de muhafaza edildi (Guda ve ark., 1995).
Alınan 1 ml’lik örnekler 12000 rpm de 4 dk santrifüj edildi. İndüklemeden önceki
örnekler için 950 μl süpernatant atılarak pelet üzerine 50 μl Tris-HCL tampon çözeltisi
ilave edilerek vortekslendi ve 100μl SDS-Sample Buffer eklendi.95 ˚C’de 5 dk
kaynatıldı. İndüklendikten sonraki örnekler için de aynı şekilde 950 μl süpernatant
atılarak pelet üzerine 50 μl Tris-HCL tampon çözeltisi ilave edilerek vortekslendi ve
100 μl SDS-Sample Buffer eklendi. Tüpler 95 ᵒC’ de 5 dk kaynatıldı. Örnekler oda
sıcaklığında soğumaya bırakıldı ve SDS-PAGE analizi için hazır hale geldi.
3.2.13. SDS-PAGE ile E. coli Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi
Hazırlanan SDS PAGE jelinin kuyucuklarına indüklemeden önceki örneklerden 20’şer
μl, indüklendikten sonraki örneklerden 30’ar μl yüklendi. SDS-PAGE tamamlandıktan
sonra distile su ile yıkanan jel sonrasında stain çözeltisi ile boyandı. Boyanan jel destain
çözeltisi ile iyice temizlendikten sonra analiz edildi.
34
3.2.14. E. coli BL21 pLysE Hücrelerinin Parçalanması

İndüklemenin ardından -20˚C’de saklanan hücreler çıkarılarak buza gömüldü.
Üzerine 100 mM Tris tamponundan (pH = 7,5) 40 ml eklenerek süspansiyon haline
getirildi.

Süspansiyona 50 μl 100 mM benzamidin ve 50 μl 100 mM PMSF ilave edildi ve
buz üzerine alındı. Buz üzerindeki hücreler 3 mm ucu olan sonikatörle 1 saat
süresince parçalandı.

+4°C ve 6000 rpm’de 10 dakika santrifüjlendi. Peletin renginden (kahverengi)
parçalama işleminin istenen düzeyde gerçeklestiği sonucuna varıldı.

Süpernatantlar ayrı bir tüpe alındı, +4˚C’de 30000 rpm 1 saat ultrasantrifüj
cihazında santrifüjlenerek karısımdaki hidrofobik proteinler ve diğer hidrofobik
hücre materyalleri çöktürüldü.
3.2.15. E.coli BL21(DE3) pLysE’de Ekspres Edilen Ksilanaz Enziminin Afinite
Kromatografisi ile Saflaştırılması
 Önce küçük bir polikarbonat kolon içerisine 3 ml kadar rezin konulduktan sonra
kolon 100 mM 40 ml kadar Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla yıkandı.
 Santrifüj sonrasında alınan süpernatant (protein karışımı) kolona tatbik edildi ve
kolondan gelen bütün fraksiyonlar toplandı (Load).
 Protein yüklenmis kolon, öncelikle 40 ml 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla
yıkanarak kolonda tutunmuş diğer proteinlerin ayrılması sağlandı (Wash).
 Ardından 300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla
kolona tutunmuş olan protein 4 ayrı fraksiyon olarak elüe edildi.
 Protein aktivite testlerinde kullanılmak üzere +4 ˚C‘de saklandı.
3.2.16. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrillamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) İle
Ksilanaz Proteininin Analizi
SDS-PAGE Sambrook ve arkadaşlarına (1989) göre %4’lük yükleme jeli ve %12’lik
ayırma jeli kullanılarak gerçekleştirildi (Çizelge 3.10).
35
Çizelge 3.10 SDS-PAGE elektroforezinde kullanılan bileşenler ve oranları:
Bileşenler
Yükleme Jeli (ml)
Ayırma Jeli
(ml)
%40 akrilamid
0,35
2,7
Ayırma jeli tamponu
-
2,25
Yükleme jeli tamponu
1
-
Saf su
2,59
4
%10 Amonyum persülfat
0,05
0,05
TEMED
0,01
0,02
Hazırlanan jel karışımı plakalar arasına yüklendikten sonra tanka yerleştirildi ve tank
SDS-PAGE yürütme tamponu ile dolduruldu. Saflaştırma aşamasında toplanan her
fraksiyondan alınan 100 μl’lik numuneler 100 μl numune tamponuyla karıştırılıp
100°C’de 5 dakika denatüre edilerek SDS-PAGE jelinin kuyucuklarına 20’şer μl
yüklendi. Proteinler, boya ayırma jelinden uzaklaşıncaya kadar 46 mA’de yürütüldü.
Yürütme işlemi tamamlanınca tanktan çıkarılan jel üzerine jel boyama çözeltisi ilave
edildi ve yavaş bir şekilde 15 dk çalkalanarak bekletildi. Boyanan jel, boyanın fazlasını
uzaklaştırarak protein bantlarını görünür hale getirmek amacıyla boya uzaklaştırma
çözeltisi ile yıkandı. Jel görüntüsü, protein bantları görünür hale geldikten sonra jel bir
tarayıcı ile taranarak dijital ortama alındı.
3.2.17. Saflaştırılan Proteinin Kantitatif Analizi
Proteinin kantitatif analizi için önce 2 adet kuartz mikro küvete (1 ml kapasiteli)
proteinin içinde bulunduğu tampon çözeltiden (Tris/HCl pH = 7,5) konularak sıfırlandı.
Sonra küvetlerden birisine konulan protein numunesinin 280 nm de absorbansı okundu.
Bulunan absorbans değeri yüksek olduğundan protein numunesi seyreltilerek absorbans
ölçüldü (1 in altında bir değere indirlidi). Seyreltmeden dolayı belli bir katsayıyla
çarpıldıktan sonra toplam protein numunesinin absorbansı hesaplandı. pET-xynB
proteininin DNA dizisi alınarak önce Expasy Translate tool‘ u (Anonim, 2012j)
kullanılarak füzyonun amino asit dizisi belirlendi.
36
pET-xynB füzyon proteininin belirlenen amino asit dizisi daha sonra Expasy ProtParam
tool’u (Anonim, 2012ı) kulanılarak teorik moleküler ağırlığı ve 280 nm deki extinction
coefficient (ekstinksiyon katsayısı) hesaplandı. Sonrasında absorbsiyon, moleküler
ağırlığı ve ekstinksiyon katsayısı değerleri alınarak Lambert-Beer yasasına göre
proteinin konsantrasyonu mg/ml olarak hesaplandı (9,06 mg/ml).
3.2.18. DNS Yöntemi İle Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi
Enzim aktivitesini durdurmak ve indirgen şeker miktarının saptanması amacı ile
kullanılmıştır (Aiba ve ark., 1983). 1 g DNS (50 mL de-iyonize su içinde çözüldükten
sonra), 30 g K-Na-Tartarat ve 20 mL 2N NaOH ilave edilerek, son hacim distile su ile
100 mL’ye tamamlanır (Aiba ve ark.,1983).
DNS bazik şartlar altında indirgeyici şekerin serbest karbonil grubu ile reaksiyona girer.
Reaksiyon sonucu 3,5-dinitrosalisilik asit (DNS) 3-amino-5-nitrosalisilik asite dönüsür.
Aromatik bir bileşik olan 3-amino-5-nitrosalisilik asit oluşumu 540 nm dalga boyunda
absorblanan ışık miktarında değişikliğe yol açar. Spektrofotometre kullanılarak ölçülen
absorbans değeri, indirgeyici şeker miktarıyla doğru orantılıdır
(Negrulescu ve ark., 2012).
pH’sı 5 olan mcllvaine tamponunda çözünen beech-wood xylan (kayın kerestesi ksilanı)
ve saflaştırılmış enzimden oluşan reaksiyon karışımı 50°C’de 10 dk inkübe edildi.
İnkübasyonun ardından 1:1 oranında DNS ilave edilip 5 dk kaynatıldı, rengin
stabilizasyonu için soğutulup 540 nm’de absorbans ölçüldü. Ksilanaz aktivitesi, standart
olarak farklı konsantrasyonlarda hazırlanan xylose (ksiloz) çözeltisi kullanılarak çizilen
kalibrasyon grafiğinden hesaplandı.
3.2.19. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi
3.2.19.1.pH’nın Etkisi
Enzimin optimum aktivite gösterdiği pH değerinin belirlenmesi için, pH 4-7 arasında
Mcllvaine tamponu, pH 8’de Tris-HCl tamponu kullanılarak farklı pH değerlerine sahip
(pH 4-8) %1’lik ksilan içeren substrat çözeltileri hazırlandı.
37
Aktivite tayini için, enzim ve substrat karısımı 37°C’de 10 dk inkübe edildi. İnkübasyon
sonrası karışıma eşit hacimde DNS ilave edilerek 5 dk kaynatıldı, soğutma işleminden
sonra 540 nm dalga boyunda köre karsı absorbans değerleri kaydedildi. Kör, eşit
hacimde substrat ve DNS çözeltisi kullanılarak hazırlandı. En yüksek absorbans
değerinin elde edildiği pH değeri baz alınarak % bağıl enzim aktivitesi bulundu.
3.2.19.2. Sıcaklığın Etkisi
Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisini belirleyebilmek amacıyla, 30, 40, 50, 60,
70°C’lik sıcaklık değerlerinde ölçümler yapıldı. Enzim ve substrat karışımı belirlenen
optimum pH değerinde, belirtilen sıcaklık aralığında 10 dk inkübe edildi. İnkübasyon
sonrası karışıma eşit hacimde DNS ilave edilerek 5 dk kaynatıldı, soğutma işleminden
sonra 540 nm dalga boyunda köre karşı absorbans değerleri kaydedildi. Kör, eşit
hacimde
substrat
ve
DNS
çözeltisi
kullanılarak
hazırlandı.
En
yüksek
absorbansdeğerinin elde edildiği pH değeri baz alınarak % bağıl enzim aktivitesi
bulundu.
3.2.19.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi
Sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi için enzimler 4, 22, 37, 50°C’lik sıcaklıklarda 30
dakikalık aralıklarla 180 dk boyunca inkübe edildi. Ön inkübasyon uygulamasından
sonra optimum şartlarda aktivite tayini yapıldı.
3.2.19.4 Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi
Substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla
optimum şartlarda enzim aktivitesi değişen substrat miktarına (1-10 mg/ml) karşı
belirlendi.
38
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. PCR ile Ksilanaz DNA’sının Amplifikasyonu
Başlık 3.2.3. anlatılan PCR reaksiyonu sonucunda Aspergillus niger’e ait ksilanaz
geninin amplifiye edildiği %1 lik agaroz jelinde gözlemlenmiştir.
~ 560 bç
Şekil 4.1. pET28b vektör sistemi için koloni PCR sonucunun %1’lik agaroz jeldeki görüntüsü
4.2. Klonlama Sonrası Plazmid DNA’ların Restriksiyon Enzimleri ile Analizi
Plazmit E. coli DH5α’dan saflaştırıldıktan sonra genin pilazmite klonlanıp
klonlanmadığını anlamak amacıyla doğrulama restriksiyon kesimi gerçekleştirildi. Jel
görüntüsü incelendiğinde, 9 numunenin kesim sonrası beklenildiği gibi 5200 bp ve 600
bp olmak üzere iki farklı uzunlukta DNA’ya parçalandığı görüldü (Şekil 4.2).
39
~ 5200 bç
~ 600 bç
Şekil 4.2. pET28b vektör sistemi için doğrulama kesim sonucunun %1 lik agaroz jeldeki görüntüsü. 7.
DNA standardı (l / EcoR I+Hind III), 1-11. Kesim sonrası elde edilen 5200 bp ve 600 bp
uzunluklarındaki DNA parçaları
Şekil 4.3. NEBcutter V2.0 programı kullanılarak elde edilen pET28b klonlama bölgesi xyn genine ait
restriksiyon enzim haritası (Anonim, 2013)
4.3. DNA Dizileme
Dizi analizi sonucu elde edilen kromotogramlar şekil 4.4’de verilmiştir.
40
Şekil 4.4. Pet28b-xynB vektörünün DNA dizileme sonucunun kromotogram şeklindeki görüntüsü
41
Kromotogramlar FinchTV programı kullanılarak okunmuştur. Şekilde de görüldüğü
üzere elde edilen pikler oldukça temizdir. Analiz sonucu elde edilen DNA dizisi,
klonlama işleminin başarıyla gerçekleştirildiğini göstermektedir. DNA dizisi, Expasy
translate programı kullanılarak amino asit dizisine çevrilerek aşağıda verilmiştir.
1
1
61
21
121
41
181
61
241
81
301
101
361
121
421
141
481
161
541
181
GAATTCTCTACCCCTAGTTCTACTGGTGAAAACAACGGATTCTATTACTCATTCTGGACC
S
T
P
S
S
T
G
E
N
N
G
F
Y
Y
S
F
W
T
GATGGTGGTGGAGATGTTACCTACACAAACGGAGATGCTGGTTCATACACAGTTGAATGG
D
G
G
G
D
V
T
Y
T
N
G
D
A
G
S
Y
T
V
E
W
AGTAACGTTGGAAATTTTGTCGGTGGAAAGGGTTGGAACCCAGGAAGTGCCCAAGACATT
S
N
V
G
N
F
V
G
G
K
G
W
N
P
G
S
A
Q
D
I
ACTTATTCTGGTACATTCACCCCTTCCGGTAATGGATACTTGTCAGTTTATGGATGGACT
T
Y
S
G
T
F
T
P
S
G
N
G
Y
L
S
V
Y
G
W
T
ACAGATCCACTTATTGAATACTATATCGTCGAGAGTTACGGTGACTATAACCCTGGATCT
T
D
P
L
I
E
Y
Y
I
V
E
S
Y
G
D
Y
N
P
G
S
GGTGGAACTTACAAAGGTACTGTTACATCTGATGGATCCGTCTACGACATCTACACCGCC
G
G
T
Y
K
G
T
V
T
S
D
G
S
V
Y
D
I
Y
T
A
ACTAGAACAAACGCTGCCTCCATCCAAGGTACCGCAACTTTTACACAATATTGGTCAGTT
T
R
T
N
A
A
S
I
Q
G
T
A
T
F
T
Q
Y
W
S
V
AGACAGAATAAGAGAGTTGGTGGAACTGTCACCACTTCTAACCATTTCAATGCATGGGCT
R
Q
N
K
R
V
G
G
T
V
T
T
S
N
H
F
N
A
W
A
AAATTGGGTATGAACCTTGGAACCCACAATTACCAGATCGTTGCTACTGAGGGTTACCAA
K
L
G
M
N
L
G
T
H
N
Y
Q
I
V
A
T
E
G
Y
Q
AGTTCAGGTTCCAGTTCCATTACCGTTCAACATCATCACCACCATCACTAATCTAGA
S
S
G
S
S
S
I
T
V
Q
H
H
H
H
H
H
4.4. SDS-PAGE İle Ksilanaz Proteininin Üretilip Üretilmediğinin Analizi
Saflaştırma öncesinde ve sonrasında SDS-PAGE yapıldı. Elektroforez jelinin
Coomassie Brilliant Blue ile boyanıp fazla boyanın uzaklaştırılması sonucunda xynB
geninin E.coli’de üretildiği ve saflaştırıldığı görüldü.(Şekil 4.5 ve Şekil 4.6).
42
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Şekil 4.5. SDS-PAGE analiz görüntüsü: 1. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-1 plazmitini içeren hücre
örneği, 2. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-2 plazmitini içeren hücre örneği, 3. İndüklenmeden önce
pET28b-xynB-3 plazmitini içeren hücre örneği, 4. İndüklenmeden önce pET28b-xynB-4 plazmitini içeren
hücre örneği, 5. E.coli BL21 pLySE hücre örneği (kontrol), 6. Protein markörü, 7. İndüklendikten sonra
pET28b-xynB-1 plazmitini içeren hücre örneği, 8. İndüklendikten sonra pET28b-xynB-2 plazmitini
içeren hücre örneği, 9. İndüklendikten sonra pET28b-xynB-3 plazmitini içeren hücre örneği, 10.
İndüklendikten sonra pET28b-xynB-4 plazmitini içeren hücre örneği
1
2
3
4
43
5
6
Şekil 4.6. Saflaştırma sonrası SDS-PAGE analiz görüntüsü. 1. Load (Santrifüj sonrasında-alınan
süpernatantın kolona tatbik edilmesi sonrasında kolondan alınan fraksiyon), 2. Wash (Protein yüklü
kolonun 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla yıkanması sonucu kolondan alınan fraksiyon), 3.
Elüat-1 (300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona tutunmuş olan
proteinin elüe edilmesiyle elde edilen fraksiyon), 4. Protein marker, 5. Elüat-2 (300 mM imidazol içeren,
100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona tutunmuş olan proteinin elüe edilmesiyle elde edilen
fraksiyon),6. Elüat-3 (300 mM imidazol içeren, 100 mM Tris/HCl (pH = 7,5) tamponuyla kolona
tutunmuş olan proteinin elüe edilmesiyle elde edilen fraksiyon)
Afinite kromatografisi ile saflaştırma işlemi sonunda, Şekil 4.7.‘de görüldüğü gibi pETxynB füzyon proteini saflaştırılmıştır. Füzyonun amino ucuna eklenen histidinlerin (6
adet) nikele olan afinitesi ile füzyon kolona bağlanmış, diğer proteinler kolondan
ayrılmış ve böylece saflaştırma gerçekleştirilmiştir.
4.5. Saflaştırılan pET-xynB Proteininin Kantitatif Analizi
“Expasy tools” sitesinde bulunan “ProtParam tool” una girilerek alınan verilerden pETxynB proteininin amino asit dizisi ve sayısı bulundu ayrıca teorik moleküler ağırlığı
21.190,60 Dalton ve molar absorbsiyon katsayısı (extinction coefficient) ise 58330
M-1.cm-1 olarak hesaplandı. Şekil 4.6’da ki jel incelendiğinde üretilen ksilanaz
enziminin moleküler ağırlığının teorik olarak hesaplanan değere oldukça yakın olduğu
görülmektedir. Daha sonra saflaştırılan pET-xynB proteininin absorbansı 280 nm‘ de
UV
ölçülerek,
spektrofotometresinde
gerekli
hesaplamalar
yapıldıktan
saflaştırılan proteinin miktarı (mg/ml) olarak hesaplandı ve 9,06 mg/ml bulundu.
Çizelge 4.1. pET-xynB proteinine ait amino asit dizisi
10
20
30
40
50
MEFSTPSSTG ENNGFYYSFW TDGGGDVTYT NGDAGSYTVE WSNVGNFVGG
60
70
80
90
100
KGWNPGSAQD ITYSGTFTPS GNGYLSVYGW TTDPLIEYYI VESYGDYNPG
110
120
130
140
150
SGGTYKGTVT SDGSVYDIYT ATRTNAASIQ GTATFTQYWS VRQNKRVGGT
160
170
180
190
VTTSNHFNAW AKLGMNLGTH NYQIVATEGY QSSGSSSITV QHHHHHH
44
sonra
4.6. Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi
4.6.1. Bazı Parametrelerin Ksilanaz Aktivitesi Üzerine Etkisi
4.6.1.1. pH’nın Etkisi
Ksilanaz enziminin en yüksek aktiviteyi gösterdiği pH değerini belirleyebilmek
amacıyla, beech-wood ksilan substratı varlığında farklı pH değerlerindeki tamponlar
kullanılarak enzim aktivite tayinleri yapıldı.
Elde edilen aktivite değerleri kullanılarak pH-%bağıl aktivite eğrisi çizildi (Şekil 4.7).
Çizilen eğriye göre, optimum pH’nın 5,0 olduğu görülmektedir.
Şekil 4.7. Ksilanaz enziminin pH bağımlık eğrisi
4.6.1.2. Sıcaklığın Etkisi
Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisini belirleyebilmek amacıyla, 30, 40, 50, 60,
70°C’lik sıcaklık değerlerinde ölçümler yapıldı. Elde edilen aktivite değerleri
kullanılarak sıcaklık-%bağıl aktivite eğrisi çizildi (Şekil 4.8). Çizilen eğriye göre
optimum sıcaklık 50°C olarak bulundu.
45
Şekil 4.8. Ksilanaz enziminin sıcaklık bağımlık eğrisi
4.6.1.3. Sıcaklık Stabilitesinin Belirlenmesi
Sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi için enzimler 4, 22, 37, 50°C’lik sıcaklıklarda 30
dakikalık aralıklarla 180 dk boyunca inkübe edildi. Ön inkübasyon uygulamasından
sonra optimum şartlarda aktivite tayini yapıldı. Elde edilen aktivite değerleri
kullanılarak zaman-kalan aktivite (%) eğrisi çizildi (Şekil 4.9). Eğriye göre enzim
4˚C’de ki sıcaklıkta genel olarak aktivitesini koruduğu % 20’lik bir kayıp olduğu
belirlendi. Sırasıyla yaklaşık olarak 22 ˚C’de %50, 37˚C’de %60 ve 50˚C’de ise %90
oranında aktivitesini kaybettiği belirlendi.
Şekil 4.9. Ksilanaz enziminin ısıl kararlılık eğrisi
46
4.6.1.4. Substrat Konsantrasyonunun Enzim Aktiviesi Üzerine Etkisi
Substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisini belirlemek amacıyla enzim
konsantrasyonu sabit tutularak optimum sartlarda değişen substrat miktarlarında (1-10
mg/ml) enzim aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Elde edilen veriler kullanılarak
Linewear-Burk eğrisi çizildi. Km değeri 10,752 mg/ml ve Vmax değeri ise 33,22 mg/ml
olarak belirlendi (Şekil 4.10).
Şekil 4.10. Ksilanaz enzimi için Linewear-Burk eğrisi
47
5.SONUÇ
Bugüne kadar 2000’den fazla enzim tanımlanmış ve bunlardan yaklaşık 100 tanesi ticari
olarak kullanıma uygun bulunmuştur. Fakat günümüzde bunlardan sadece 18 tanesi
endüstriyel amaçla üretilmektedir (Zeman ve McCrea., 1985). Endüstride faydalı olan
ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna
göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi için, işlem maliyeti
bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal koşullara bağlı olmadan aktivitesini en
yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı
alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması, allerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması
yani güvenilir olması gerekir (Sarıkaya, 1995).
Bu çalışmada rekombinant olarak üretilen ksilanazın substratı olan ksilan,hemiselülozun
baslıca bileşenidir ve hemiselülozlar doğada toplam biyokütlenin % 30-35’ini
oluşturmaktadır (Kulkarni ve ark.,1999). Ksilanazlardan bugün gıda ve yem sanayisinde
çeşitli şekillerde yararlanırken (Biely,1985; Berovic ve ark., 1997), kağıt sanayi
(Haarhoff ve ark., 1999) ve ayrıca atık arıtım ve değerlendirme proseslerinde de (Biely,
1985; Carmona ve ark., 1997; Duarte ve ark., 1994) ksilana yönelik uygulamalar
bulunmaktadır.
Bu çalışmada fungal kaynaklı ksilanaz rekombinant olarak üretilmiştir. Bunun için
Aspergillus niger gen kaynağı olarak kullanılmıştır. Aspergillus niger büyük
miktarlarda protein üretip ortama salgılama yeteneğinden dolayı homolog ve heterolog
gen ekspresyonu için uygunp bir organizmadır. A.niger’den izole edilen ksilanaz geni
pET28b vektörüne klonlanarak E.coli BL21(DE3) pLysE hücresinde ekspresyon işlemi
başarıyla gerçekleştirilmiştir. Ürettiğimiz fungal ksilanaz enzimin verimi litrede
yaklaşık 80 mg şeklinde hesaplanmıştır ve bu E coli de ürettiğimiz enzim için over
expresyon (yüksek miktarda) şeklinde ifade edilebilir. Üretilen enzim afinite
kromatografisi ile saflaştırılmış karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Yapılan
karakterizasyon çalışmaları sonucu enzimin optimum pH’sı 5,0, optimum sıcaklığı
50°C, Km değeri, 10,752 mg/ml olarak belirlenmiştir.
48
Ayrıca sıcaklık stabilitesinin belirlenmesi için enzimler 4, 22, 37, 50°C’lik sıcaklıklarda
30 dakikalık aralıklarla 180 dk boyunca inkübe edildi. Ön inkübasyon uygulamasından
sonra optimum şartlarda aktivite tayini yapıldı. Sonuç olarak enzimin 4˚C’de ki
sıcaklıkta genel olarak aktivitesini koruduğu belirlendi.
Hayvan beslemesinde kullanılan ksilanazların esas kaynağının fungal olduğu, en çok
kullanılanlar arasında da Trichoderma ve Aspergillus türlerinden elde edilen
ksilanazların yer aldığı açıklanmıştır (Aehle 2004).Bu çalışmada da fungal kaynaklı
ksilanaz enzimi yem endüstrisi hedef alınarak üretilmiştir. Literatür incelendiğinde yem
endüstrisinde kullanılan ksilanaz enziminin pH’sının 4,8 olduğu görülmüştür.
Üretilen enzimi aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH profili açısından değerlendirdiğimizde
yem endüstrisinde kullanılabilir nitelikte olduğu görülmektedir. Ancak enzimin
endüstride kullanıma uygun hale gelmesi için daha fazla miktarda üretiminin yapılması
gerekmektedir bu nedenle optimizasyon çalışmaları yapılmalıdır.
49
KAYNAKLAR
Aehle, W., 2004. Enzymes in Industry; Production and Applications. Wiley-Vch
Verlag. GwbH & Co. Kga A. Weinhelm., 484 p, Netherlands.
Akman, M., 1983. Bakteri Genetiği. Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayını
No:8,1-12, 337-371 s, Sivas.
Alper, J., 2003 Biotechnology. Hatching the golden egg; a new way to make drugs.
Science, 300, 729-730.
Alper, J., 2004. Bioengineering. Biology and inkjets. Science, 305, 1895.
Anonim., 2008d. http://class.fst.ohio-state.edu/fst605/lectures/lect20.html.
Anonim.,2009e.http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood14.html
(15.12.2009).
Anonim., 2004. Xylanase enzyme discovered in Yellowstone Xylanase from
Acidothermus cellulolyticus. http://www1.nature.nps.gov/benefitssharing/xyla
nase.m
Anonim., 2012ı. ExPASy Proteomics Server ProtParam tool. http://expasy.org/cgibin/protparam. (15.07.2012).
Anonim, 2012j. http://web.expasy.org/translate/
Anonim 2013a. http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme
Aıba, S., Kılal, K., ve Imana, T., 1983. Cloning and expression of thermostable αamilase gene from Bacillus stearotermophilus, Bacillus subtilis. Appl. And
Environm. Microbiol. 46 (5),1059-1065.
Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, L., and Hoondal, G.S., 2001. Microbial xylanases and
their industrial applications: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56,326- 338.
Bedford, M.R., Classen, H.L., 1992. Theinfluence of dietaryxylanase on
intestinalviscosityandmolecularweightdistribution of carbohydrates in rye-fed
broilerchick, In: Visser J., Beldman G., Van Someren MAK., Voragen AGJ.,
editors. Xylansandxylanases; 361–70 p, Amsterdam: Elsevier.
Beauchemin, K.A., Yang, W.Z., and Rode, L.M., 1999b. Effects of
grainsourceandenzymeadditive on site andextent of nutrientdigestion in
dairycows. J. Dairy Sci. 82,378-390.
Berovic, M., and Ostroversnik, H., 1997, Production of Aspergillus niger pectolytic
enzymes by solid state bioprocessing of apple pomace. Journal of
Biotechnology, 53, 47-53.
Bhat, M.K., 2000. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnolgy
Advances, 18(5), 355-383.
Biely, P., 1985. Microbialxylanolyticsystems. TrendsBiotechnol, 3, 286–90.
Carmona, E.C., Pizzironi, A.A., Monterio, R.T.R., and Jorge, J.A., 1997, Xylanase
production by Aspergillus versicolor. Journal of Basic Microbiology, 38 (6),
387-394.
Collins, T., Gerday, C., and Feller, G., 2005. Xylanases, xylanase families and
extremophilic xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 29 (1), 3-23.
Coughlan, M.P., 1985. Theproperties of fungal and bacterial cellulases with comment
on their production and application. In Biotechnology and Genetic Engineering
Reviews. Intercept Ltd. NewcastleuponTyne, 3, 39-109.
Coughlan MP., Hazlewood GP., 1993. β-1,4-D-Xylan-degrading enzyme systems,
biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnol Appl Biochem 17,
259–289.
50
Cowan, W.O., 1996. AnimalFeed. Industrial Enzymology. Second edition.
McMillanPress Ltd. 69 p, London. Ed. by T.
Duarte, J.C., and Ferreira, M. C., 1994. Aspergilli and lignocellulosics: Enzymology
and biotechnological applications, FEMS Microbiology Reviews, 13, 377-386.
Ferreira-Filho, EX., 1994. The xylan-degrading enzyme system. Braz J Med Biol Res
27, 1093–1109.
Garcıa-Campayo, V., Wood, T.M., 1993. Purification and characterization of a β-D
xylozidase from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis.
Carbohydrate Res. 242, 229-245.
Gessesse, A., 1998. Purification and Properties of TwoThermostable Alkaline
XylanasesFromanAlkaliphilicBacillussp.ApplıedandEnvıromentalMicrobiology,
3533-3535.
Gılbert, H.J., and Hazlewood, G.P.,1993. Bacterial cellulases and Xylanases. J.Gen.
Microbiol.139, 187-194.
Gılbert, H.J., Hazlewood, G.P., Laurie, J.I., Orpin, C.G., Xue, G.P., 1992. Homologous
catalytic domains in a rumen fungal xylanase: evidence for gene duplicationand
prokaryotic origin. Moleculer Microbiology, 6, 2065-2072.
Gılbert, H.J., Hazlewood, G.P., 1993. Bacterial cellulases and xylanases. Journal of
General Microbiology, 139,187-194.
Godfrey, T., and West, S., 1996. Introduction to Industrial Enzymology. (T.Godfrey and
S. West editör) Industrial Enzymology, 2nd Edition, Stockton Pres, New York.
Godfrey ve S, West., Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, L., Hoondal, G.S.,
2001.Microbial xylanases and their industria applications. areview, Appl
Microbio Biotechnol, 56,326–38.
Gregory, A. C. E., O’Connell, A. P., Paul, B. G., 1998. Xylans, Biotechnology and
Genetic Engineering Reviews,15(4), 439 455.
Guda, C., Zhang, X., McPherson, D.T., Xu, J., Cherry, J.H., Urry, D.W., Daniell, H.,
1995. Hyper expression of an environmentally friendly synthetic polymer gene.
Biotechnol. Lett., 17,745–750.
Gupta, R., Gıgras, P., Mohapatra, H., Goswamı, V.K. ,Chauhan, B., 2003. Microbial aamylases: a biotechnological perspective. Process Biochem.1-18.
Gümüşel, F., 2002. Biyoteknoloji, genetik ve saglık sektörü. Kocaeli Sanayii için
teknolojik uzgörü ortak projesi.73-135.
Güçlü, B.K. Kara, K., 2009. Ruminant Beslenmede Alternatif Yem Katkı Maddelerinin
Kullanımı, Erciyes Üniv. Vet. Fak. Derg. 6 (1), 65-75.
Hanahan, D., 1985. Techniques for transformation of E. coli. In DNA cloning: A
Practical Approach (ed. D.M. Glover), 1, 109-135. IRL Press, Oxford, United
Kingdom.
Hanahan, D., 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids J. Mol
Biol., 166, 557–580.
Haarhoff, J., Moes, C.J., Cerff, C., Wyk, W.J.,Gerischer, G., and Janse, B.J.H., 1999.
Characterization and biobleaching effect of hemicellulases produced
thermophilic fungi, Biotechnology Letters, 21, 415-420.
Harwood, C.R., 1992. Bacillus subtilis and its relatives: Molecular Biological and
Industrial Workhorses. Elsevier Science Publishers Ltd (U.K.), 10, 247-256.
Haltrich, D., Nidetzky, B., Kulbe, KD., Steiner, W., Zupancic, S.,1996. Production of
fungal xylanases. Bioresour Technol 58:137–161.
51
Horıkoshı, K., 1999. Alkaliphiles: some Applications of Their Products for
Biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 735-750.
Izydorczyk, MS. Biliaderis, CG., 1995. Cereal arabinoxylans: advances in structure and
physiochemical properties. Carbohydr Polym 28, 33–48.
Inoue, H. Nojima, H. Okayama, H., 1990. High efficiency transformation of
Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.
Köksal, G., 1998. İki fazlı sistemde süspande ve tutuklanmış mikroorganizmalarla
ksilanaz üretimi. Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloj
Anabilim Dalı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara.
Klug, W. Cummings, M., 2003. Genetik Kavramlar. Palme ayıncılık, 500, Türkiye.
Kulkarni, N. Shendye, A. and Rao, M., 1999. Molecular and biotechnological aspects of
xylanases. FEMS Microbiology Reviews, 23; 411-456.
Lowe, S.E., Theodorou, M.K., Trıncı, A.P.J., 1987a. Growth and fermentation of an
anaerobic rumen fungus on various carbon sources and effect of temperature on
development. Applied and Environmental Microbiology, 53, 1210-1215.
Lowe, S.E., Theodorou, M.K., Trıncı, A.P.J., 1987c. Cellulases and xylanases of an
anaerobic rumen fungus grown on wheat straw, wheat straw holocellulose,
cellulose and xylan. Applied and Environmental Microbiology. 53, 1216-1223.
Mounford, D.O. Asher, R.A., 1989. Production of xylanase by the ruminal anaerobic
fungus Neocallimastix frontalis. Applied and Environmental Microbiology. 55,
1016-1022.
Negrulescu,a,b A., Patrulea,a,b V., Mincea,#,a,b M.M., Ionascu,a,b C., Vlad-Oros#,a,b
B.A.,and Ostafe*,a,b , V., 2012. Adapting the Reducing Sugars Method with
Dinitrosalicylic Acid to Microtiter Plates and Microwave Heating. J. Braz.
Chem. Soc., 23 (12), 2176-2182.
Outtrup, H. and Jorgensen,S.T., 2002. The Importance of Bacillus species in the
production of industrial enzymes. (R.Berkley editör) Applications and systems
of Bacillus and relatives. Blackwell Science Inc. Malden, Mass. 206-218.
Özer, E., 1999. http://www.cilginbiyologlar.com/deterjandan-kozmetige-tekstildengidaya-enzimler-yatirimcilarini-ariyor-a183.html.
Prade, R. A., Xylanases From biology to biotechnology. Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews, 1995, 13(12), 101-131.
Rao, M.B.,Tanksale, A.M., Gathe, M.S., Deshpande, W., 1998. Molecular and
Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 62(3), 597-635.
Rao, M.B., Tanksale, A.M., Gathe, M.S.,Deshpande, W., 1998. Molecular and
Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 62(3), 597-635.
Rao, M.B., Tanksale, A.M., Gathe, M.S., Deshpande, W., 1998. Molecular and
Biotechnological aspect of Microbial proteases. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 62(3), 597-635.
Ranı, S. and Nand, K., 1996. Development of cellulase-free xylanase producing
anaerobic consotria for the ıse of lignocellulosic wastes. Enzyme. Microb.
Technol.18, 23-28.
Sarıkaya, E., 1995. α-amilaz üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme parametreleri,
enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu. Ankara Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi.
52
Schallmey, M., Sıngh, A., and Ward, O.P., 2004. Developments in the Use of Bacillus
Species for Industrial Production. Canadian Journal of Microbiology, 50,1-17.
Seyis, I., 1997. Fungal kaynaklardan ksilanaz eldesi. Hacettepe Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Bilim Uzmanlığı Tezi, Ankara.
Sıdhu, G.S., Sharma, P., Chakrabartı, T., Gupta, J.K., 1997. Strain improvement for the
production of a thermostable a-amylase. Enzyme. Microb. Technol.21, 525-530.
Subramanıyan, S. and Prema, P., 2000. Cellulase-free xylanases from Bacillus and other
microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 183,1-7.
Sunna, A., Antranikian G., 1997. Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria. Crit
Rev Biotechnol 17(1), 39–67.
Sultuybek, G., Ulutin, T., Sayhan, N., 1995. Rekombinant DNA Teknolojisi ve Tıpta
Kullanımı. İstanbul.
Tarım,Ö., 2004. Moleküler Biyoteknoloji Devrimi. Güncel Pediatri. 2, 101-102
Thacker, P.A., 1996. Baas T.C. Effect of gastricpH on theactivity of
exogenouspentosanaseandtheeffect of pentosanasesupplementation of thediet on
theperformance of growing-finishingpigs, Anim FeedSciTechnol 63, 187–200.
Vııkarı, L., Ranva, M., Kantelınen, A., Sandquist, J., Lınko,M., 1986. Bleecing with
Enzymes. Third International Conference in biotechnology in pulp and paper
industry.16-19 June, Stockholm, 67-69.
Watson, JD., Tooze, J.,Kurtz DT (eds)., 1983. Recombinant DNA, A Short Course. P.
58-90, 231-247, Scientific American Books, W.H. Freeman and Company, New
York.
Woodley, J.M., 2000. Advances in Enzyme Technology-UK Contributions.
(Th.scheperi editör). Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 94 s.
Wong, K.K.Y., Tan, L.U.L., and Saddler, J.N., 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanase in
microorganisms: Functions and applications. Microbiological Reviews, 52, No:
3, 305-317.
Wolfgang, A., 2004. Enzymes in ındustry: Productıon ad applications. Wıleyvch Verlag
GmbH&Co. Kga, Weinheim.
Wiseman, A., 1987. Handbook of Enzymes Biotechnology. Second Edition. Chapter 3.
The Application of Enzymes in Industry 274-373, New York.
Zeman, N.W., and McCREA, J.M., 1985. Alpha-amylase Production Using a
Recombinant DNA Organism. Cereal Foods World. 30 (1), 777-780.
53
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Adı Soyadı: Hümeyra SALTIK
Doğum Tarihi Ve Yeri: 20.04.1988- SAKARYA
Telefon: 05362804349
e-mail: humeyrasaltik@hotmail.com
Eğitim
Derece
Eğitim Birimi
Yüksek Lisans
Gaziosmanpaşa Üniversitesi
2014
Lisans
Gaziosmanpaşa Üniversitesi
2012
Mezuniyet Tarihi
54
Download