Genomics I - Ozdag Lab

Biyoteknoloji ve Genetik II
GENOM PROJELERİ
Prof. Dr. Hilâl Özdağ
Genom Projeleri
• Dizileme
• Klon kütüphaneleri
• Stratejiler
– Genom Dizilemesi
• Tekrar eden DNA dizileri
• Biraraya getirme (Assembly)
– PHRAP, PHRED,CONSED
• Bitiş
• Boşlukların kapatılması
Genetik harita
Genetik haritaların bazı eksiklikleri vardır.
Bunlardan en önemlisi çözünülürlük veya
ayrıntıdır. İnsan genomu 3.2 milyar baz
çifti içermektedir, yaklaşık 4000 cM
uzunluğundadır,
yani
850000bç/cM.
Herbir sentimorganda bir belirteç bulunsa
dahi (hayal bile olamaz) fiziksel haritaya
göre çözünülürlüğü çok düşüktür.
Fiziksel harita
Genetik / Fiziksel
Fiziksel Harita
(Ureta-Vidal et al., Nature Review Genetics 2003)
DİZİLEME
• İlgilenilen DNA’nın altklonlanması
– Değişik “insert” boyutları
• Herbir klon
– Büyür, DNAsaflaştırılır
– Dizileme reaksiyonu yapılır
– Dizileme fragmentleri kapiller elektroforezle
ayrıştırılıp lazer eksitasyonu ile tanımlanır.
– Reaksiyon başına 500-1000 bç okuma yapılabilir
(bugünkü teknoloji ile)
DNA Dizi Analizi
Vektörler
•
•
•
•
Plazmid (2kb)
Kozmid (40kb)
BAC (>= 100kb)
YAC (1Mb)
Vektörler
insert
Çoklu klonlama
bölgesi
Kavramlar
• Fiziksel harita
– Örtüşmeyen klonlar ((non)-overlapping
clones)
• Genetik harita
– Moleküler belirteçler (marker)
Shotgun yaklaşımı
• Sanger et al., 1977
• bacteriophage  genomuna uygulandı (1980)
• 1980’lerde:- plazmid, kloroplast, virusler,
kozmidler
• 1990’larda:- mitokondri/BAC/bakteri
• Küçük prokaryotik genomlarda başarılı
Shotgun yaklaşımı
• Rasgele
fragmentlerin
dizilenmelerinin
ardından
yap
boz
misali
biraraya
getirilmeleri
• Bir genomdan örtüşen/kesişen
fragmentler toplamak gerekir.
birçok
• Bir genom 10x kez 500 bç’lik parçalar
halinde okunduğunda 106 bç’de 1 boşluk olur.
Shotgun yaklaşımı
• L boyundaki bir DNA fragmenti: Bu
fragmentin bir diğer kopyasını daha
bulabilmemiz için genomun 4L bç olması
gerekir.
• Rasgele diziler
– İki okumanın 30 bç kesişmesi
– Beklenen 430 >>>> 1.2X1018 bç.
– 3 milyarlık bir genomda bu kesişmeyi
bulmak pek de kolay değil.
Shotgun yaklaşımı
•
DNA tekrar yapıları içerir


LINE
segmental duplikasyon (Samonte and
Eichler 2002)
Hiyerarşik Yaklaşım
Klon-Klon
• Genom 1.5Mb fragment’lere ayrılır
• Fragmentler BAC ve YAC’lara klonlanır
• Insertler > 100kb ve tekrar bölgelerinden
daha büyüktür.
• Bu
şekilde
klonlar
örtüşen/kesişen
fragmentlerin tanımlanması ile bir kontig
haline getirilip dizilenir.
Hiyerarşik Yaklaşım
Klon-Klon
• Klon kontiglerin biraraya getirilmesi
– Klon parmakizi yaklaşımı
• Klonlanmış DNA fragmentinin yapısına dair
bilgi.
• Parmakizindeki örtüşmeler tanımlanabilir.
• Restriksiyon paternleri; Tekrar eden DNA
parmakizleri; Tekrar eden DNA PCR; STS
haritalama
Restriksiyon Haritası
Flow sorting: özgül kromozomlar
Klon-Klon Harita Temelli
Yaklaşım
Watson ve Crick, Mayıs 1953
• http://www.dnai.org/text/mediashowcase/i
ndex2.html?id=562