Slayt 1 - Klinik Embriyoloji Derneği

ARRAY CGH TEKNOLOJİSİ VE BLASTOKİST
TRANSFERİ. DÜNÜ, BUGÜNÜ VE YARINI
Prof. Dr. Muhterem BAHÇE
Preimplantasyon Genetik Tanı;
YÜT sonuçlarını arttırmak
Tekrarlayan gebelik kayıplarını azaltmak
Kalıtsal hastalıkları önlemek
3.Gün biyopsi ve FISH analizleri
Hipotez: Embriyoların %50 si kromozomal
olarak anormal ise normal embriyoların
transferi implantasyonu 2 kat arttırmalıdır.
(Munné et al. 1993)
Sonuç: 3.gün biyopsi ve FISH analiz sonuçları
beklentiyi karşılamıyor ve PGT nin tüm
potansiyelini gösteremiyor.
3. Gün biyopsisi ve FISH analizinde karşıt
veriler
Pozitif etki
Gianaroli et al. 1999
Munné et al 1999
Gianaroli et al 2001a
Gianaroli et al. 2001b
Munné et al. 2003
Gianaroli et al. 2004
Munné et al. 2005
Munné et al 2006
Verlinsky et al. 2005
Colls et al. 2007
Garrisi et al. 2009
Rubio et al. 2009
Rubio et al. 2013 *
Etki yok
Werlin et al. 2003 *
Staessen et al. 2004 *
Platteau et al. 2005 *
Jansen et al. 2008 *
Mersereau et al. 2008 *
Schoolcraft et al. 2009 *
Negatif etki
Mastenbroek et al. 2007 *
Hardarson et al. 2008 *
* CRT
Optimal PGD methods for FISH
Biopsy media
Biopsy time / embryo
# cells biopsied
Fixation method
# chromosomes tested
# analysts / case
Reanalysis no results
Large experience
Error rate
Number of zygotes
Optimal
Questionable
with aminoacids
1 min
one
Carnoy’s
≥8
2
yes
yes
<10%
>5
simple media
> 5 min
two
Tween 20
6
1
no
no
10-50%
5
Munné et al. (2010) Fertil. Steril. 94:408
3. Gün biyopsisi ve FISH analizinde
olumsuz sonuçların nedenleri
Biyolojik:
- Mozaisizm
- Self-correction
Teknik:
- Yeterli sayıda kromozom analiz edilmiyor
- Standart olmayan yöntemler
- Biopsi basamağı
Technical differences:
high error rates
Technical errors are lab dependent and the best measure to assess a PGD
laboratory:
Study:
Baart et al 2004
Li et al. 2005
Gleicher et al. 2009
Munné et al. 2002
Geraedts et al 2011
Colls et al., 2007
Scott et al. 2012
Magli et al. 2007
Gutierrez-Mateo et al. 2011
Technique
FISH
FISH
FISH
FISH
array CGH
FISH
qPCR
FISH
array CGH
Error rate
50.0%
40.0%
15-20%
7.2%
6.0%
4.7%
4.0%
3.7%
1.8%
Mozaisizm
592 anormal embriyonun tüm blastomerleri
kullanılarak tekrar analiz edilmiş ve:
normal
<49% anormal
50-99% anormal
100% anormal
Colls et al. Fertil Steril 2007;88(1):53–61
13
27
124
528
7%
Analiz edilen kromozom sayısı
24-kromozom testleri (CGH, aCGH, etc) FISH-12 ye
göre % 50 daha fazla anomali yakalıyor ancak sadece
% 20 daha fazla embriyo anormal tanı alıyor.
Colls et al. (2009) Reprod Biomed Online 19:532-538
3.gün embriyolarında morfoloji kromozomal
anomaliler için uygun belirteç midir?
56%
%
abnormal
embryos
Morphology:
Maternal age
Embryos analyzed: 6054. Morphologically normal embryos: 3751. Source: Munné et al. 2007.
Similar results also found by Munne et al 1995, Marquez et al. 2000, Magli et al. 2007.
5.gün embriyolarında morfoloji kromozomal
anomaliler için uygun belirteç midir?
55% of best
morphology
blastocysts were
aneuploid
Time-laps ile morfoloji anöploidi ile kısmi
korelasyon gösteriyor
•
•
•
Hızlı ve yavaş gelişen blastosistler benzer anöploidi oranlarına
sahip(2)
2.gündeki anöploid embriyoların %30’u öploid embriyolar ile aynı
gelişimi gösteriyor(3)
Blastula oluşumu anöploid embriyolarda gecikiyor(1,4), ancak hala
iyi gelişen blastosistlerin %50’sinde anöploidi mevcut(1)
Euploid
Euploid
Complex abn.
Trisomy 21,22
(1) Melzer et al (in press) (2) Stevens et al. (2012), (3) Chavez et al. (2012), (4) Campbell et
al. (2013)
Time-lapse ve anöploidi: Melzer ve ark.ları
(2013)
18
•
Only timing of
compaction was
correlated by
aneuploidy
Only gross
morphological
abnormalities (group E)
were more likely
aneuploid.
14
14
Number of embryos
•
16
16
12
11
10
10
9
8
8
7
Aneuploid
6
4
4
3
2
1
0
Category A
Category B
Euploid
Category C
Hierarchal Classification
Melzer et al. (2013) Reprod Biomed Online, in press
Category D
Category E
Figure 1
Reproductive BioMedicine Online 2013;
27:140-146
Copyright © 2013 Reproductive Healthcare Ltd
The previously established three-class aneuploidy risk
model applied to embryos with known fetal heart beat
outcome (gestational weeks 6–8). Blue crosses represent
embryos that resulted in a fetal heart beat and red lines
represent embryos that did not result in a fetal heart beat.
Area under the ROC curve is 0.75. tSB = time from
insemination to the start of blastulation; tB = time from
insemination to the formation of a ‘full blastocyst’.
… 6.gün öploid embriyolar hala
implante olabiliyor
• 5.gün morulalar 6. güne kadar kültüre edildiler ve blastosiste
ulaştıklarında biyopsi edildiler.
• 5 veya 6. günde biyopsi edilen blastosistlerden tek blastosist
transferi yapıldı.
Day-5
biopsy
Implantation: 58%
Day-6
biopsy
21%
p<0.005
Grifo et al., unpublished
3.Gün ve blastosist biyopsisinin
karşılaştırılması
Implantation rate
cleavage stage
biopsy
not
blastocyst
biopsy not
31%
52%
P<0.05
53%
54%
N.S.
…but biopsy is an operator-dependent procedure and its effect may vary
Scott et al. (2013) Fertil Steril
PGD v.2:
• Array ile 24 kromozom analizi
• Blastosist biopsisi
Blastosist biopsisi:
Avantaj ve Dezavantajları
• Daha fazla DNA: Daha az sonuç yok
• Daha az mozaisizm ve hata
• Daha az biopsi etkisi
• Daha az iş yükü ve maliyet
• Daha fazla tek embriyo transferi
• Frozen siklus: Endometriyum
optimizasyonu
Dezavantajları:
• Bütün embriyolar aynı gün
blastosiste ulaşmıyor
Sonuç yok:
3. gün vs. 5. gün
Biopsi
aşaması
Cleavage
Blastosist
Sonuç yok
embriyo
%3.2
%2.3
Merkez*
dağılımı
%1 - %5
%0 - %18
En deneyimli
Deneyimsiz
Gutierrez-Mateo et al. (2011) Fertil Steril and Reprogenetics data on 9049 embryos
* Centers with >20 cycles done for that biopsy stage
Trofoektoderm analizi ICM yansıtıyor mu?
• ICM veTE %97 (31/32) uyumlu (aCGH) (a).
• aCGH ile anormal olan blastosisler FISH ile
tekrar analiz edildiğinde %97.5 yine anormal
(39/40)(b).
(a) Capalbo et al. (2013) , (b) Colls et al. (in preparation)
Array Comparative
Genome Hybridization
Normal
DNA
Embryo
DNA
Trisomy
Monosomy
Normal
Örnek kabulu
Tüm genom amplifikasyonu (3 saat)
DNA işaretleme (3 hrs)
Hybridizasyon (min. 6 saat)
Yıkama (30 dk)
Tarama ve değerlendirme (45 dk)
Raporlama
DNA nın bir bölümü
yedekleme için veya
tekrar analiz için saklanır
46,XY
46,XX+7-10
aCGH avantajları
• 24 kromozoma ait anöploidileri ve translokasyonları
tanımlayabiliyor.
• Sonuçlar 16-24 saat:
5.gün biyopsi ve 6. gün sabah transfer
• Parental DNA analizi gerektirmez
PGS evolution
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1993-1995: Cornell Univ. ; 1996-2000: Saint Barnabas; 2001-present: Reprogenetics data
aCGH day 5
aCGH day 3
CGH
FISH 12
FISH 5-9
Day 5: Prognosis depending on
age and ovarian response
Ata, Munne et al. (2012) Reprod Biomed Online (875 cycles, 4600 embryos)
and unpublished data. Euploidy significantly decreased with age (p<0.001) but
Overall clinical
results
CGH, blastocyst biopsy and
vitrification: clinical results
Cycles Mat. Prev. embryos implant.
age failed replaced (+ sac)
cycles
CGH :
45
37.7
2.4
2.0
72%
control : 113
37.1
1.2
2.7
46%
p=0.0003
Schoolcraft et al. (2010) Fertil. Steril. 94:1700
Clinical results with fresh transfer: qPCR
Average age: 32,
average blastocysts biopsied: 8
Control
Ongoing implant. rate 47.8%
PGD
66.4%
P=0.01
Ongoing preg. rate
84.7%
P=0.01
67.5%
Scott et al., 2013 Fertil Steril.
Prospective Randomized Trial in patients
<35 with day 5 biopsy, day 6 transfer
Patients
Maternal age
Biopsy on day 5
Transfer on
Embryos euploid (N)
Embryos replaced (av.)
Pregnancy rate (sac)
Ongoing preg rate
Multiple pregnancies
Control
48
<35
no
day 6
n/a
48 (1)
45.8%
41.7%
0
Yang et al. (2012) Molec Reprod
PGD (aCGH)
55
<35
yes
day 6
53.2% (425)
55 (1)
70.9%
p<0.05
69.1%
p<0.05
0
Array CGH with Day 5 biopsy:
Results from centers with >20 cycles
cycles:
Maternal age:
# blasts biopsied:
Implantation after PGD
Pregnancies / cycle
Pregnancies / transfer
total
range
per center
2015
35.6
5.5
52%
50%
66%
20-378
35 – 38.4
5.3-8.2
37-82%
28-71%
52-91%
Reprogenetics data to 1/2013
qPCR with Day 5 biopsy:
CRT results
Good prognosis patients.
Control replaced on day 5, test biopsied on day 5 and replaced on day 6
age
PGD
32.2
Control
32.2
N
blastocysts
72
8
83
7.9
Emb replaced
implantation
Sustained implant
Delivery rate
1.9
79.8%
66.4%
84.7%
2.0
63.2%
47.9%
67.5%
Scott et al. (2013) Fertil Steril
P=0.002
P=0.03
P=0.01
Fresh or Frozen?
Day 5 biopsy and vitrification:
Other center results
ongoing pregnacy rate
1 euploid
blastocyst
2 untested
blastocyst
Fresh transfer
65%
70%
Frozen transfer
55%
52%
NS
NS
Blastocyst biopsy fresh vs. frozen:
Array CGH results
ongoing pregnancy rate /
transfer
cycles
FET
day 6
Center 1
104
55%
66%
NS
Center 2
110
46%
61%
NS
Data from: Reprogenetics, unpublished
Four-hour quantitative real-time polymerase chain reaction–based
comprehensive chromosome screening and accumulating evidence of
accuracy, safety, predictive value, and clinical efficacy
Nathan R. Treff, Ph.D.,a,b,c and Richard T. Scott Jr., M.D.a,b
a Reproductive Medicine Associates of New Jersey, Morristown; b Division of Reproductive
Endocrinology, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Science, University of
Medicine and Dentistry of New Jersey–Robert Wood Johnson Medical School, New Brunswick;
and c Department of Genetics, Rutgers–State University of New Jersey, Piscataway, New Jersey
Although there are many advantages, it is also
important to note the requirement and capital
equipment expenses associated with the need for
multiple real-time PCR instruments to handle
concurrent processing of multiple embryo biopsies and
to maintain quality control for each of the individual
components of the procedure.
ÖZET
Blastosist biopsisi:
aCGH
• Daha fazla DNA: Daha az sonuç yok• 24 kromozoma ait
anöploidileri ve
• Daha az mozaisizm ve hata
translokasyonları
tanımlayabiliyor.
• Daha az biopsi etkisi
• Sonuçlar 16-24 saat:
• Daha az iş yükü ve maliyet
5.gün biyopsi ve 6. gün
sabah transfer
• Daha fazla tek embriyo transferi
• Parental DNA analizi
• Frozen siklus: Endometriyum
gerektirmez
optimizasyonu
Dezavantajları:
• Bütün embriyolar aynı gün ve
saatte blastosiste ulaşmıyor
• Maliyet
Taze / Donmuş
İki çalışmada fark yok