meme kanserl hastalarda kem kl ğ m krometastazının flovs tometr
advertisement
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI MEME KANSERLİ HASTALARDA KEMİK İLİĞİ MİKROMETASTAZININ FLOVSİTOMETRİ YÖNTEMİYLE BELİRLENMESİ VE DİĞER PROGNOSTİK PARAMETRELERLE İLİŞKİSİ Dr. Mustafa Salih AKIN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Berksoy ŞAHİN ADANA - 2009 I T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI MEME KANSERLİ HASTALARDA KEMİK İLİĞİ MİKROMETASTAZININ FLOVSİTOMETRİ YÖNTEMİYLE BELİRLENMESİ VE DİĞER PROGNOSTİK PARAMETRELERLE İLİŞKİSİ Dr. Mustafa Salih AKIN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Berksoy ŞAHİN ADANA - 2009 II TEŞEKKÜR Tezimin hazırlanmasının her aşamasında bana yardımcı olan Hocam Prof. Dr. Berksoy Şahin’e ve tüm Onkoloji Bilim Dalı çalışanlarına, Flovsitometrik değerlendirme için önemli katkılarından dolayı Pediatri İmmünoloji Bilim Dalı Öğretim Görevlisi Prof. Dr. Mustafa Yılmaz’a ve flovsitometri laboratuarı çalışanları Hatice İrday ve Sibel Erkoç’a, Önemli yardımlarını esirgemeyen Terapötik Aferez Ünitesinden Bio. Ferda Tekinturhan’a, Hastaların metastaz açısından değerlendirilmesinde yardımcı olan Nükleer Tıp Arş. Gör. Evren Tümkaya’ya, Patoloji Ana Bilim Dalından Doç. Dr. Melek Ergin ve patoloji çalışanlarına, İstatistiksel değerlendirme konusunda yardımları için Doç. Dr. Gülşah Seydaoğlu ve ekibine, İç Hastalıkları Ana Bilim Dalındaki tüm hocalarıma ve çalışma arkadaşlarıma, Sevgili Eşim ve Tüm Aileme, sabrı, desteği ve değerli katkılarından dolayı sonsuz teşekkür ederim. Dr. Mustafa Salih AKIN Adana 2009 I İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR .................................................................................................................. I İÇİNDEKİLER ............................................................................................................ II TABLO LİSTESİ ..................................................................................................... IVV ŞEKİL LİSTESİ ........................................................................................................ VV KISALTMA LİSTESİ ................................................................................................ VI ÖZET ................................................................................................................... VIVIII ABSTRACT............................................................................................................. IXX 1. GİRİŞ VE AMAÇ .....................................................................................................1 2. GENEL BİLGİLER ...................................................................................................4 2.1. Tanım ve Epidemioloji .......................................................................................4 2.1.1. Etyoloji ve Risk Faktörleri ...........................................................................4 2.1.2. Meme Kanseri Patolojik Sınıflandırma .........................................................7 2.1.3. Meme Kanserinde Evreleme ........................................................................9 2.1.4. Meme Kanserinde Prognostik ve Prediktif Faktörler ..................................13 2.1.4.1. Aksiller Lenf Nodu Tutulumu .............................................................15 2.1.4.2. Tümör Boyutu .....................................................................................15 2.1.4.3. Tümörün Histolojik Tipi......................................................................16 2.1.4.4. Tümör Derecesi (Grade) .....................................................................17 2.1.4.5. Lenfovasküler İnvazyon ......................................................................17 2.1.4.6. Hormon Reseptörleri ...........................................................................17 2.1.4.7. Moleküler Prognostik Parametreler .....................................................18 2.1.4.7.1. Proliferatif Oran ...........................................................................18 2.1.4.7.2. Flovsitometri ................................................................................18 2.1.4.7.3. Kİ-67 ............................................................................................18 2.1.4.7.4. Timidin Bağlama İndeksi (TBI) ....................................................19 2.1.4.7.5. DNA İçeriği..................................................................................19 2.1.4.8. HER-2 (epidermal growth factor receptor-2, c-erb-B2) ........................19 2.1.4.9. Siklin E ve p27 ....................................................................................20 2.1.4.10. P53 Gen Analizi ................................................................................20 2.1.4.11. Anjiyogenez Markerleri ....................................................................21 2.1.4.12. Katepsin D ........................................................................................21 2.1.4.13. Ürokinaz Plazminojen Aktivatör Sistem ............................................21 2.1.4.14. Tümör Markerleri ..............................................................................22 2.1.4.15. Multiparametreli Gen Ekspresyon Analizi .........................................22 2.2. Meme Kanserinde Kemik İliği Mikrometastazının Prognostik Önemi ...............24 2.2.1. Kemik İliği Mikrometastazının Tanımı ve Erken Metastatik Hastalığın Biyolojisi .............................................................................................................24 2.2.2. Mikrometastazın Prognostik ve Klinik Önemi ............................................31 2.2.3. Mikrometastazın Klinik ve Tedaviye Yanıtın İzlenmesindeki Yeri .............32 2.2.4. Mikrometastatik Kanser Hücrelerinin Moleküler ve Fonksiyonel Tanımlaması ........................................................................................................35 2.2.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle İlgili Gen Ekspresyon Paternleri ve Yolaklar...............................................................................................................36 2.2.6. Kemik İliği Mikrometastazının Belirlenmesi İçin Kullanılan Yöntemler ....38 2.2.6.1. İmmünositokimyasal Yöntemler ..........................................................40 II 2.2.6.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ....................................................42 2.2.6.3. Enzim-Bağlı İmmunospot (ELİSPOT) Teknolojisi ..............................44 2.2.6.4. Flovsitometrik Yöntem ........................................................................45 2.2.7. Çalışmamızda Kullandığımız Markerler.....................................................46 2.2.7.1. Sitokeratinler .......................................................................................46 2.2.7.1.1. Sitokeratin 4 .................................................................................47 2.2.7.1.2. Sitokeratin 6a ...............................................................................48 2.2.7.1.3. Sitokeratin 8 .................................................................................49 2.2.7.1.4. Sitokeratin 10 ...............................................................................49 2.2.7.1.5. Sitokeratin 18 ...............................................................................50 2.2.7.2. Epitelyal Hücre Adezyon Molekülü (EpCAM) ....................................51 2.2.7.3. CD24 ..................................................................................................52 2.2.7.4. CD44 ..................................................................................................53 2.2.7.5. CD45 ..................................................................................................53 2.2.8. Meme Kanseri Kök Hücresi Kavramı .........................................................53 2.2.9. Dolaşımdaki Tümör Hücreleri (CTC) .........................................................55 3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................................57 3.1. Hasta Seçimi ve Klinik Evreleme......................................................................57 3.2. Kemik İliği Hazırlanması ..................................................................................57 3.3. Flovsitometrik Değerlendirme ..........................................................................58 3.4. İstatistiksel Analiz ............................................................................................59 4. BULGULAR ...........................................................................................................60 4.1. Kemik İliği Mikrometastazı İle Cinsiyet İlişkisi ................................................60 4.2. Kemik İliği Mikrometastazı İle Yaş İlişkisi .......................................................61 4.3. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Boyutu İlişkisi ......................................62 4.4. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenf Nodu Metastazı Arasındaki İlişki .............63 4.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Alt Tipi Arasındaki İlişki ......................65 4.6. Kemik İliği Mikrometastazı İle Evre Arasındaki İlişki ......................................65 4.7. Kemik İliği Mikrometastazı İle Östrojen Reseptör Durumu Arasındaki İlişki ....66 4.8. Kemik İliği Mikrometastazı İle Progesteron Reseptör Durumu Arasındaki İlişki ........................................................................................................................67 4.9. Kemik İliği Mikrometastazı İle c-erb-B2 Durumu Arasındaki İlişki ..................68 4.10. Kemik İliği Mikrometastazı İle Histolojik Grade Arasındaki İlişki .................69 4.11. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenfovasküler İnvazyon Arasındaki İlişki ......70 4.12. Kemik İliği Mikrometastazı İle Menopozal Durum Arasındaki İlişki ..............71 4.13. Kemik İliği Mikrometastazı İle DCİS Komponenti Arasındaki İlişki ...............71 4.14. Kemik İliği Mikrometastazı İle Kemik İliği Biyopsisinde İmmünohistokimyasal Yöntemle Gösterilmiş Kemik İliği Metastazı Arasındaki İlişki ................................72 4.15. Kemik İliği Mikrometastazı İle Karaciğer Metastazı Arasındaki İlişki.............73 4.16. Kemik İliği Mikrometastazı İle Serebral Metastaz Arasındaki İlişki ................73 4.17. Kemik İliği Mikrometastazı İle Akciğer Metastazı Arasındaki İlişki ...............74 4.18. Kemik İliği Mikrometastazı İle Kemik Metastazı Arasındaki İlişki .................74 5. TARTIŞMA ............................................................................................................77 6. SONUÇ VE ÖNERİLER .........................................................................................95 7. KAYNAKLAR........................................................................................................97 ÖZGEÇMİŞ .............................................................................................................. 126 III TABLO LİSTESİ Tablo No Sayfa No Tablo 1. Meme kanseri evrelerinin gruplandırılması .......................................................................... 13 Tablo 2. Meme kanserinde evreye göre 5 yıllık sağkalım oranları ..................................................... 14 Tablo 3. Tümör çapı ile aksiller lenf nodu tutulumu arasındaki ilişki ............................................... 16 Tablo 4. Tümör boyutu ile meme kanseri prognozu arasındaki ilişki ............................................... 16 Tablo 5. Erken evre meme kanserli hastalarda immünositokimyasal yöntemle belirlenmiş kemik iliği mikrometastazlarının prognozla ilişkisi ........................................................................................ 33 Tablo 6. Meme kanserli hastalarda kemik iliğinde, kanda ve lenf nodlarında minimal rezidüel hastalık ile ilgili çalışmaların özeti ........................................................................................................ 39 Tablo 7. Hastaların genel özellikleri ...................................................................................................... 61 Tablo 8. Kemik iliği mikrometastazı ile cinsiyet ilişkisi ...................................................................... 62 Tablo 9. Kemik iliği mikrometastazı ile yaş ilişkisi .............................................................................. 62 Tablo 10. Kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu ilişkisi .......................................................... 64 Tablo 11. Kemik iliği mikrometastazı ile metastatik lenf nodu sayısı arasındaki ilişki .................... 64 Tablo 12. Lenf nodu veya uzak metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki ...65 Tablo 13. Kemik iliği mikrometastazı ile evre arasındaki ilişki.......................................................... 66 Tablo 14. Kemik iliği mikrometastazı ile östrojen reseptör durumu arasındaki ilişki ..................... 67 Tablo 15. Kemik iliği mikrometastazı ile progesteron reseptör durumu arasındaki ilişki............... 68 Tablo 16. Kemik iliği mikrometastazı ile c-erb-B2 durumu arasındaki ilişki ................................... 69 Tablo 17. Kemik iliği mikrometastazı ile histolojik Grade arasındaki ilişki ...................................... 70 Tablo 18. Kemik iliği mikrometastazı ile lenfovasküler invazyon arasındaki ilişki .......................... 70 Tablo 19. Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki .................................. 71 Tablo 20. Kemik iliği mikrometastazı ile DCİS komponenti arasındaki ilişki .................................. 72 Tablo 21. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik iliği biyopsisinde immünohistokimyasal yöntemle gösterilmiş kemik iliği metastazı arasındaki ilişki ............................................................................... 72 Tablo 22. Kemik iliği mikrometastazı ile karaciğer metastazı arasındaki ilişki ............................... 73 Tablo 23. Kemik iliği mikrometastazı ile serebral metastaz arasındaki ilişki ................................... 74 Tablo 24. Kemik iliği mikrometastazı ile akciğer metastazı arasındaki ilişki ................................... 74 Tablo 25. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik metastazı arasındaki ilişki ..................................... 75 Tablo 26. Klinik değişkenlere göre kemik iliği mikrometastazı prevalansı ....................................... 75 IV ŞEKİL LİSTESİ Şekil No Sayfa No Şekil 1. A45B/B3 monoklonal antikoru ile immünositokimyasal olarak boyanmış tek ve grup halinde bulunan mikrometastatik hücreler .......................................................................................... 26 Şekil 2. Apopitotik ve nonapopitotik mikrometastatik hücreler ....................................................... 27 Şekil 3. Flovsitometride pozitif bulunmuş mikrometastatik hücreler ................................................ 60 V KISALTMA LİSTESİ AgNOR APAAP AJCC ASCO ATM BCSS bFGF βhCG BRCA BrdU CDK CEA CGH CK CMF CTC COX CXCR DCİS DDFS DFS DMSO DNA DTC EDTA EGF EGFR ELİSA ELİSPOT EMA EpCAM ER FITC FİSH GEP GF H&E HER2 HIF-1a IGF-1 İDK İHK İLK İMA İSK : Argyrophilic nucleolar organizer regions : Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase : American Joint Commitee on Cancer : American Society of Clinical Oncology : Ataxia telangiectasia mutated : Meme kanseri spesifik sağkalım : Basic fibroblast growth factor : β-human koryonik gonadotropin : Meme kanseri (Breast cancer) : Bromodeoksiüridin : Siklin bağımlı kinazlar : Karsino embriyonik antijen : Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon : Sitokeratin : Siklofosfamid-metotreksat-florourasil) : Dolaşımdaki tümör hücreleri : Siklo-oksijenaz : Chemokine receptor : İn situ duktal karsinom : Uzak metastazsız hastalıksız sağkalım : Hastalıksız sağkalım : Dimetil sülfoksit : Deoksiribonükleik asit : Dissemine tümör hücreleri : Etilen diamin tetra asetik asit : Epidermal Growth Factor : Epidermal Growth Factor Receptor : Enzyme-linked immunosorbent assay : Enzim-bağlı immunospot : Epitelyal membran antijen : Epitelyal hücre adezyon molekül : Östrojen reseptörü : Fluorescein isothiocyanate : Fluorescence in situ hybridization : Gen ekspresyon profili : Büyüme faktörü : Hematoksilen&Eozin : Human Epidermal growth factor Receptor 2 : Hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 alfa : Insulin-like growth factor 1 : İnvaziv duktal karsinom : İmmünohistokimya : İnvaziv lobüler karsinom : İmmünomanyetik ayırma : İmmünositokimya VI İTH Kİ LCIS MAM MHC-1 MORE MP-FCM MRD MUC-1 NSAİİ OTC OS PAI PBS PCNA PEM Pgp-1 Pİ PR PTEN RT-PCR TAG12 TBI TIMP TNM uPA VEGF WHO : İzole tümör hücreleri : Kemik iliği : İn situ lobüler karsinom : Mammaglobin : Major histocompatibility complex-1 : Multiple Outcomes of Raloksifen Evaluation : Çok parametreli flovsitometri : Minimal rezidüel hastalık : Müsin-1 : Nonsteroid anti-inflamatuar ilaçlar : Occult tumor cells (Gizli tümör hücreleri) : Toplam sağkalım : Plazminojen aktivatör inhibitör : Phosphate buffered saline : Proliferating Cell Nuclear Antigen : Polimorfik epitelyal müsinlerin : Fagositik glikoprotein-1 : Propidyum iyodit : Progesteron reseptörü : Phosphatase and Tensin homolog : Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu : Tümör-ilişkili glikoprotein : Timidin bağlama indeksi : Metaloproteinazların doku inhibitörleri : Tümör boyutu-Lenf nodu -Metastaz : Ürokinaz plazminojen aktivatör : Vasküler endotelyal growth faktör : Dünya Sağlık Örgütü VII ÖZET Meme Kanserli Hastalarda Kemik İliği Mikrometastazlarının Flovsitometri Yöntemiyle Belirlenmesi ve Diğer Prognostik Parametrelerle İlişkisi Amaç: Meme kanserli hastalarda gizli metastatik hücrelerin araştırılması oldukça önemlidir, çünkü tümör hücrelerinin erken yayılımı uzak organlarda relapsın ve kanserden ölümün önemli nedenlerinden biridir. Meme kanserinde kemik iliği mikrometastazlarının immünositokimyasal yöntemle bulunmasının, prognostik bir marker olduğu rapor edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, kemik iliğindeki mikroskobik depozitlerin belirlenmesi ve sayılması için, objektif bir metot olarak flovsitometrinin potansiyel avantajlarını değerlendirmek ve meme kanserli hastalarda mikrometastazların prevalansı ve niceliğini belirlemektir. Bu çalışmada meme kanserli hastalarda kemik iliğindeki mikrometastazlar ile prognostik parametreler (yaş, menopozal durum, tümör büyüklüğü ve lenf nodu tutulumu) ve immünohistokimyasal belirleyiciler ve intraduktal komponent (DCİS) arasındaki ilişki araştırıldı. Gereç ve Yöntem: Evre I-IV meme kanserli 52 ve epitelyal kanseri olmayan 16 hastadan üst iliak çıkıntıdan kemik iliği aspirasyonu yapıldı. Tüm hastalarda akciğer grafisi, karın ultrasonografisi ve tüm vücut kemik taraması ile uzak organ metastaz varlığı araştırıldı. Epitelyal hücreler, anti-sitokeratin monoklonal antikor ve hem propidyum iyodit hem de CD45 ile çift boyanarak bulundu. Hücreler (105 hücre) flovsitometri ile analiz edildi. Bulgular: Onaltı kontrol hastasının ikisinde (yüzde 12,5), 52 meme kanserli hastanın 11’inde (yüzde 21) kemik iliğinde sitokeratin-18 pozitif hücreler bulundu. Kemik iliğinde gizli metastatik hücrelerin varlığı lenf nodu metastazı varlığı veya yokluğu, tümör boyutu, evre, menopozal durum, hormon reseptör durumu, histolojik grade, c-erb-B2 ekspresyonu, tümör alt-tipi, lenfovasküler invazyon, DCİS komponenti ve cinsiyet ile ilgisizdi. Hastaların yaş ortalaması 49,1 (en az 27, en çok 82) idi. Kırkdört hastada histolojik olarak tanı konmuş invaziv duktal karsinom mevcuttu. Yirmisekiz hasta premenopozal ve 22 hasta postmenopozal idi. Yirmi-bir hastada tümör çapı 2 cm.den küçük iken, 24 hastada 2-5 cm aralığında ve 6 hastada da 5 cm.den büyüktü. Yirmi-iki hastada koltuk altında lenf nodu metastazı saptanmazken, 9 hastada 1-4 arası, 12 hastada 4-9 arası ve 11 hastada 9’un üzerinde lenf nodu metastazı saptandı. ER 40 hastada ve PR 35 hastada pozitifti. C-erb-B2 ekspresyonu 38 hastada pozitifti. Dört hastada grade 1, 22 hastada grade 2 ve geri kalan 26 hastada da grade 3 tümör saptandı. DCİS 25 hastada bulundu. Pozitif CK-4 ekspresyonu bir hastada, EpCAM ekspresyonu 3 hastada görüldü. Kemik iliği mikrometastazları ile yaş, kemik, kemik iliği, akciğer ve karaciğer metastazları arasında anlamlı ilişki vardı. Sonuç: Sonuç olarak meme kanserli hastalarda kemik iliği mikrometastazları yaş ve kemik, kemik iliği, akciğer ve karaciğer metastazları ile ilişkilidir. Anahtar kelimeler: meme kanseri, kemik iliği, mikrometastaz, flovsitometri, sitokeratin VIII ABSTRACT Detection of Bone Marrow Micrometastases in Breast Cancer Patients with Flow cytometry Method and Correlation with Other Prognostic Parameters Purpose: The search for occult metastatic cells in patients with breast cancer is of considerable importance, because early dissemination of tumor cells is one of the leading causes of relapse at distant sites and of death from cancer. Immunocytochemical detection of bone marrow micrometastases has been reported as a prognostic marker in breast cancer. The aim of this study were to evaluate the potential advantage of flow cytometry as an objective method of identifying and quantifying micrometastatic deposits within bone marrow and to determine the prevalence and quantity of micrometastases in patients with breast cancer. In this study was investigate the correlation of bone marrow micrometastases with prognostic parameters (age, menopausal status, tumor size, and lymph node involvement), immunohistochemical markers and intraductal component (DCİS). Matherial and Methods: We obtained bone marrow aspirates from upper iliac crests of 52 patients with stage I-IV breast cancer and 16 patients without epithelial cancer. All patients were evaluated for the presence of distant metastases with chest Xray, abdominal ultrasound, and whole body bone scan. Epithelial cells were detected by dual staining with monoclonal anti-cytokeratin and both propidium iodide and CD45. The cells were analyzed (105 events) using on flow cytometer. Results: Cytokeratin-18 positive cells were detected in the bone marrow specimens of 2 of the 16 control patients without epithelial cancer (12.5 percent) and 11 of the 52 patients with breast cancer (21 percent). The presence of occult metastatic cells in bone marrow was unrelated to the presence or absence of lymph-node metastasis, tumour size, stage, menopausal status, hormone receptor status, histologic grade, expression of c-erb-B2, tumor subtype, lymphovascular invasion, intraductal component (DCİS) and sex. Mean age of the study subjects was 46.6 (min 27 and max 82). Forty-four patients had invasive ductal carcinoma proven histologically. Twentyeight patients were premenopausal and 22 were postmenopausal. Tumor size was less than 2 cm in 21, 2 to 5 cm in 24, and larger than 5 cm in 6 patients. In 22 subjects axilla was free of lymphatic metastases, 1 to 4 nodal involvement was detected in 9, 4 to 9 nodal metastases was observed in 12, and more than 9 nodal metastases was detected in 11 women. ER was positive in 40, and PR was positive in 35 subjects. Expression of cerbB2 was positive in 38. Four cases had grade I tumor, 22 had grade II, and the remaining 26 had grade III tumor. DCİS was detected in 25 cases. Positive CK-4 expression was detected in one patient and EpCAM exspression in 3 patients. Bone marrow micrometastases significantly correlated with age and metastases in bone, bone marrow, lung and liver. Conclusion: It is concluded that bone marrow micrometastases correlates with the age and metastases in bone, bone marrow, lung and liver in breast carcinoma patients. Keywords: Breast cancer, bone marrow, micrometastases, flow cytometer, cytokeratin IX 1. GİRİŞ VE AMAÇ Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen kanserdir ve akciğer kanserinden sonra, kansere bağlı ölümlerin ikinci en sık sebebidir. Yaşam boyu her dokuz kadından birisi, invaziv meme kanseri gelişme riskine sahiptir.1 Dünya genelinde, her yıl yaklaşık 1 milyon yeni vaka bildirilmekte, her yıl 400.000 kadın hastalıktan kaybedilmektedir.2 Özellikle son iki dekatda meme kanserinin öncelikle tanısında ve bunu izleyerek tedavisinde yaşanan bilgi değişiklikleri ve ilerlemeler; hastaların sağkalımlarına, hastalıksız yaşama sürelerine önemli katkılarda bulunmuştur. Tedavi yöntemlerinin artması, özellikle de meme kanserinin tanısından itibaren sistemik bir hastalık olarak algılanmaya başlaması ile “neo-adjuvan” ve “adjuvan sistemik” tedaviler gündeme girmiş ve bu tedavilerin hangi hastalara uygulanacağı sorusunu da beraberlerinde getirmişlerdir. Böylece hastalar evrelendirilmeye başlanmış, sağkalımla ilgili prognostik faktörler bulunmuş, bunların klinik gözlem ve tedavilere uygulanması sağlanmıştır.2 Operabl meme kanserli hastalarda uzak metastaz riski; primer tümörün boyutu, aksiller lenf nodu tutulumu ve primer tümör markerleri gibi prognostik göstergelerle korelasyon göstermektedir. Aksiller lenf nodu negatif hastalarda; tümör boyutu, HER2 pozitifliği, hormon reseptör durumu, lenfovasküler invazyon ve yüksek histolojik grade gibi faktörler, sistemik tedavi ihtiyacını ve rekürrens riskini belirlemek için kullanılmaktadır. Buna rağmen, lokalize hastalığı olan ve aksiller lenf nodu metastazı olmayan meme kanserli hastaların yaklaşık % 25’inde sistemik relaps gelişmekte; buna karşın aksiller lenf nodu metastazı olan hastaların en az % 30’unda primer tedaviyi takip eden 5-10 yıl içinde relaps gelişmemektedir.2 Bu gözlemler, tümör yayılımının önemli bir bölümünün, lenfojen yol ile birlikte ve bazı vakalarda lenfojen yoldan bağımsız olarak hematojen yolla olabileceğini akla getirmiştir. Aksiller lenf nodu negatif meme kanseri hastalarının % 20-40’ında kemik iliğinde mikrometastatik hücreler saptanmaktadır. Günümüzde kullanılan prognostik faktörlerin, hastaların relaps riskini yeterli doğrulukla belirleyememesi nedeniyle, yeni prognostik parametrelere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, metastaz gelişiminden önce kemik iliği mikrometastazlarının değerlendirilmesi ile daha doğru risk sınıflaması yapılabilir ve bu hücrelerin ortadan kaldırılması için ek konvansiyonel veya bu hücreleri hedefleyen yeni biyolojik tedaviler kullanılabilir. 1 Solid epitelyal tümörlerde, kemik iliği mikrometastazı kavramı 30 yıl önce ortaya atılmıştır. Metastatik kaskatın ilk basamağında lokal olarak tümör hücre invazyonu meydana gelmekte, bunu takiben lokal lenf nodlarına veya kan dolaşımı yoluyla ikincil organlara yayılım gerçekleşmektedir. Tümör hücreleri ikincil organlarda ya apopitozise uğramakta ya da immün sistem tarafından ortadan kaldırılmaktadır. Hayatta kalanlar ise metastatik lezyonlar için potansiyel prekürsörlerdir. Mikrometastaz, primer tümörden uzak organlara yayılan tümör hücrelerinin, çapı 2 mm.den küçük mikroskobik metastatik depozitleri olarak tanımlanmaktadır. Tümör gelişiminin olasılıkla erken döneminde meydana gelen mikrometastatik yayılım; kan, lenf nodları veya kemik iliğine olabilmekte; kemik iliği primer tümörden köken alan mikrometastatik hücrelerin en sık yayıldığı organ olarak kabul edilmektedir. Günümüzde tümör evreleme yöntemleri genellikle manifest uzak metastazları içermektedir, fakat uzak organlarda tek tek mevcut olan tümör hücrelerini içermemektedir. Metastazın başlangıcında erken dönemde tespit edilmesi, metastatik tümör yükünün daha küçük olması ve kemoterapötik ajanlara solid metastazlardan daha duyarlı olmaları nedeniyle önemlidir. Mikrometastatik hücreler G0 fazında dormant halde olmalarına rağmen, yeniden prolifere olabilme, büyüme ve metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle kanser rekürrensi için her zaman potansiyel bir tehdit oluştururlar. Erken evre hastalarda, konvansiyonel yöntemlerle gösterilemeyen gizli metastatik hücreler, uzak metastaz gelişimi ve kanser ilişkili ölümün en önemli nedenidir. Daha önceleri meme kanserinin ilk olarak lenf nodlarına metastaz yaptığı düşünülürken, günümüzde lokalize meme kanserli hastaların yaklaşık % 50’sinde hematojen yayılımın olduğu ileri sürülmektedir. Bu nedenle, primer lokorejyonel tedaviden önce kemik iliği mikrometastazının değerlendirilmesi, rekürrens riski yüksek hastaların belirlenmesi, adjuvan-neoadjuvan tedavi kararı ve tedaviye cevabın izlenmesi açısından önemlidir. Tek merkezli, önemli sayıda hastayı kapsayan ve yeterli izlem süresi olan çalışmaların çoğunda, kemik iliği mikrometastazı ile prognoz arasındaki ilişki gösterilmiştir. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan 4703 hastayı kapsayan bir meta-analizde; evre I-II ve III operabl meme kanseri hastalarda, immünositokimyasal yöntemlerle saptanan kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 olarak bildirilmiştir. Bu hastalarda çok değişkenli analizde, kemik iliği mikrometastazları diğer prognostik faktörlerden bağımsız olarak, azalmış genel ve meme kanseri spesifik sağkalım 2 oranlarıyla ilişkili bulunmuştur.3 Bununla beraber, prognozla ilişkisi gösterilemeyen çalışmalar da vardır. Kemik iliği aspirasyon teknikleri, materyallerin hazırlanması, kullanılan antikorlar, zenginleştirme yöntemlerinin kullanılıp kullanılmaması, analiz edilen hücre sayıları, hastaların evreleri ve takip süreleri arasındaki farklılıklar nedeniyle çelişkili sonuçlar ortaya çıkmaktadır. Kemik iliği mikrometastazının prognostik önemine ek olarak, tümör hücrelerinin varlığının tedavi sonrası değerlendirilmesi, gelecekte tedavinin etkinliğinin izlenmesi için bir araç olabilir. Meme ve diğer solid tümörlerde kemik iliği mikrometastazlarını belirlemek için birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Lenf nodları, kan ve kemik iliğinde çok az sayıda ve tek tek bulunan bu hücreleri bulabilmek için sensitif immünositokimyasal, flovsitometrik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Kullanılan yöntem, kanser hücrelerini normal hematopoietik hücrelerden ve kemik iliği alınırken ciltten kontamine olan epitelyal hücrelerden ayırt edebilmelidir. Ancak kullanılan çoğu yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü düşüktür. Flovsitometrik yöntem, kan ve kemik iliğindeki göreceli olarak çok az sayıdaki kanser hücrelerini bulmak için geliştirilmiştir. Bu yöntem özellikle 106 hücre içinde tek bir hücreyi belirleyebilecek duyarlılığa sahip olduğu rapor edilmiştir, ancak bu duyarlılık tüm çalışmalarda gösterilememiştir. Flovsitometri immünositokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek duyarlılıkla tümör yükünü belirlemek için kantitatif ölçümlerin yapıldığı, rezolüsyonu iyi, hızlı, tekrar edilebilir ve istatistiksel olarak daha güvenilir bir yöntemdir. Günlük pratikte kullanılabilirliği, hızlı sonuç alınabilmesi ve ilgili çalışmaların çok az sayıda olması nedeniyle flovsitometri yöntemini kullandık. Çalışmamızda, evre I-IV meme kanserli 52 hastada kemik iliği mikrometastazı prevalansı, sitokeratin pozitif hücrelerin meme kanseri kök hücresi ile benzerliği ve bu hücrelerde çeşitli sitokeratinlerin ekspresyon paternlerinin değerlendirilmesi amaçlandı. Kemik iliğinde sitokeratin pozitif hücre varlığı ile konvansiyonel prognostik parametreler (yaş, menopozal durum, tümör büyüklüğü ve lenf nodu tutulumu) ve immünohistokimyasal belirleyiciler arasındaki ilişki araştırıldı. Kontrol grubu olarak, epitelyal malignensisi olmayan, remisyonda lösemi ve lenfoma tanısı olan 16 hastadan kemik iliği aspirasyonu alındı. Bu hastalarda yanlış pozitifliğin değerlendirilmesi amaçlandı. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Tanım ve Epidemioloji Meme kanseri, memenin duktus veya lobüllerini örten epitelyal hücrelerin malign proliferasyonudur. Kadınlarda en sık görülen kanserdir ve akciğer kanserinden sonra, kansere bağlı ölümlerin ikinci en sık sebebidir. Kadınlarda görülen kanserlerin üçte birinden sorumludur. Erken tanı yöntemlerinin gelişmesi ve artan tedavi seçenekleri nedeniyle meme kanseri mortalitesi azalmaktadır.¹ Ayrıca, ER/PR (östrojen/progesteron reseptörü) pozitif meme kanseri sıklığı, erken evre meme kanseri, invaziv lobüler meme kanseri ve intraduktal karsinom (invaziv olmayan) görülme sıklığı da artmıştır. Dünya genelinde, her yıl yaklaşık 1 milyon yeni vaka bildirilmekte, her yıl 400.000 kadın hastalıktan kaybedilmektedir. Genel olarak gelişmiş ülkelerde daha yüksek insidansa sahiptir. 2007 yılında Amerika Birleşik Devletlerinde 180.000 kadın meme kanseri tanısı almış ve yaklaşık 40.000 kadın hastalıktan kaybedilmiştir. Yaşam boyu her dokuz kadından birisi, invaziv meme kanseri gelişme riskine sahiptir.² 2.1.1. Etyoloji ve Risk Faktörleri Meme kanserinin nedenleri hala bilinmemektedir. Epidemiyolojik çalışmalarda tanımlanmış birçok risk faktörü vardır. Meme kanseri hormon bağımlı bir hastalıktır. Östrojenlerin, meme epitelindeki proliferatif etkisi, daha sonra DNA (deoksiribonükleik asit)’nın hatalı replikasyonu olasılığını artırarak mutasyonlara yol açabilmektedir. Bilinen birçok risk faktörü, endojen veya egzojen östrojen uyarısının süresi ve seviyesi ile ilişkilidir. Premenopozal kadınlarda; erken menarş, düzenli ovülasyon ve geç menopoz; postmenopozal kadınlarda ise obesite ve hormon replasman tedavileri östrojen maruziyetini artıran faktörlerdir. Menarşta her 2 yıllık gecikme, risk oranında % 10 azalmaya yol açmaktadır.4 45 yaşından önce menopoza girenlerin meme kanseri riski, 55 yaşından sonra menopoza girenlerden % 50 oranında daha azdır. Menopozda her 1 yıllık gecikme, meme kanseri riskini % 1,03 artırmaktadır. 40 yaş öncesi bilateral ooferektomi, yaşam boyu meme kanseri gelişme riskini % 50 azaltmaktadır. Premenopozal over kaynaklı olan östrojen, postmenopozal dönemde, periferik yağ dokuda androjenlerden aromataz enzimi aracılığı ile oluşturulur.4 Yaşamın her döneminde egzojen östrojenler özellikle postmenopozal dönemde riski arttırmaktadır. 4 Gebelik, meme dokusunun somatik mutasyonlara duyarlılığını azaltır; böylece ilk gebeliğin erken yaşta olması, duyarlılık periyodunu kısaltmaktadır. Gebelik, özellikle erken yaşta ve sayıca çok olanlarda, riski azaltırken, ilk gebeliğini 30 yaşından sonra yapanlarda veya hiç doğum yapmayanlarda risk artmıştır.4 İnsanlarda ve hayvanlarda endojen ve egzojen östrojen kullanımının meme kanserine yol açtığı gösterilmiştir. Anti-östrojenik tedaviler (tamoksifen, kastrasyon) meme kanseri gelişimini azaltmaktadır, ancak meme kanseri riskindeki azalma ile serum östradiol seviyeleri arasındaki korelasyon, hormon seviyelerinin değişkenlik göstermesi nedeni ile tutarlı bulunamamıştır. Premenopozal hastalarda serum östrojen düzeyleri gebelik ve adet dönemlerinde belirgin dalgalanmalar göstermektedir. Postmenopozal kadınlarda, meme kanseri riski ile hormon seviyeleri arasındaki ilişki daha tutarlıdır. Yapılan 9 prospektif çalışmada, östrojen düzeyleri ile meme kanseri riskindeki artış açıkça gösterilmiştir. MORE (Multiple Outcomes of Raloksifen Evaluation) çalışmasında serum östrojen düzeyi yüksek olanlarda (>12 pmol/L) düşük olanlara göre meme kanseri riskinde 2 kat artış olduğu belirlenmiştir.11 Ayrıca, daha yüksek östradiol seviyelerine sahip kadınlarda, düşük östradiol seviyesi olan kadınlara göre daha fazla risk azalması sağlamaktadır.5 Büyüme promoterleri (transforme edici GF, epidermal GF, trombositten derive GF, fibroblast GF) ve büyüme faktör inhibitörleri meme kanser hücreleri tarafından salgılanır ve bunlar tümör progresyonunun otokrin mekanizmalarında görev alırlar. Bu büyüme faktörlerinin oluşumu östrojene bağımlıdır ve dolaşan hormonlar, kanser hücrelerince salgılanan hormon reseptörleri ve tümör hücreleri tarafından oluşturulan otokrin büyüme faktörleri arasındaki etkileşimlerin meme kanser progresyonunda görev aldığını düşündürmektedir.5,6 Yaş en önemli risk faktörlerinden birisidir. Yaş ilerledikçe, özellikle 45-50 yaş sonrası meme kanseri insidansı artmaktadır. Meme kanseri, kadınlarda erkeklerden 100 kat daha sık görülmektedir. Daha iyi sosyoekonomik şartlara sahip Kuzey Amerika ve Kuzey Avrupa toplumlarında meme kanseri görülme sıklığı 2 kat artmıştır. Etnik olarak farklı toplulukları barındıran aynı popülasyonda da, meme kanseri görülme insidansı farklılıklar göstermektedir. Beyaz ırk, siyah ırka göre daha yüksek riske sahiptir. Ancak siyah ırkta, daha ileri evrede tanı almaları nedeniyle mortalite oranları daha yüksektir.2 5 Meme kanserlerinin yaklaşık % 5-10’u doğrudan genetik faktörlerle ilişkilidir.7 Aile hikâyesi, meme kanseri için önemli bir risk faktörüdür. Ailesinde, 1. dereceden yakınında meme kanseri hikâyesi olanlarda risk 1,8 kat artmışken, 1. dereceden 2 yakınında meme kanseri hikâyesi olanlarda risk 2,93 kat artmıştır.7 Eğer bu vakalar 30 yaş ve altında ise risk 2,9 kat, 60 yaş üzerinde ise 1,5 kat artar. Yani aile bireyleri ve yakınında görülen kanser ne kadar erken yaşta ortaya çıkarsa, diğer bireylerde görülme riski o kadar artmaktadır. Ailesel vakalarda, birkaç mutat gen gösterilmiştir. LiFraumeni sendromu, p53-tümör supresör gen mutasyonuyla karakterizedir, meme kanseri, osteosarkom ve diğer malignensilerin insidansı artmıştır. BRCA-1 ve BRCA-2 tümör supresör gen mutasyonları, herediter meme kanserlerinin % 30-40’ından sorumludur.7 BRCA-1 geninin mutat allelini taşıyan kadınlarda yaşam boyu meme kanseri gelişme riski % 60-80, over kanseri gelişme riski % 33’dür. Bu mutasyonu taşıyan erkeklerde prostat ve meme kanseri gelişme riski artmıştır. BRCA-2 mutasyonunu taşıyan kadınlarda yaşam boyu meme kanseri gelişme riski % 25-30’dur. BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları varlığında gelişen tümörler, sporadik meme kanserlerine göre daha kötü diferansiye tümörlerdir ve prognozları daha kötüdür. Meme kanserinde ayrıca, PTEN ve ATM gen mutasyonları rapor edilmiştir.7 Memedeki benign ve malign öncül lezyonların varlığı bir diğer risk faktörüdür. Atipik benign proliferatif lezyonların malignleşme potansiyeli, atipisiz ve proliferatif olmayanlara göre artmıştır. Ayrıca lobüler karsinoma insitu ve atipik lobüler hiperplazi yıllık % 1 oranında invaziv karsinom geliştirme potansiyeli taşır.8 Memedeki benign non-proliferatif lezyonlar (fibrokistik değişiklikler, soliter papillom, basit fibroadenom) meme kanseri riskinde artışla ilişkili değildir.8 Non-invaziv veya invaziv meme kanserlerinin önemli prekürsörleri, sitolojik atipi gösteren proliferatif lezyonlardır. Atipi olmayan kompleks fibroadenomlar, orta derecede hiperplazi, sklerozan adenozis ve intraduktal papillomlarda, risk 1,3-2 kat artmıştır. Atipi ile beraber proliferatif lezyonlarda (atipik lobüler hiperplazi, atipik duktal hiperplazi), risk 4-6 kat artmıştır.8 Göğüs duvarına uygulanan iyonize radyasyon meme kanseri gelişme riskini arttırmaktadır. Özellikle 10-14 yaş arasında Hodgkin Lenfoma nedeniyle radyoterapi alan çocuklarda ileri yaşlarda meme kanseri gelişme riski artmıştır.8 Diyet ve vücut kitle indeksindeki değişiklikler meme kanseri riskini etkilemektedir. Postmenopozal obesite, yağdan zengin diyet, sedanter yaşam, aşırı alkol 6 kullanımı meme kanseri riskini arttıran çevresel faktörlerdir. Vücut kitle indeksinde artış, meme kanserinde artmış mortalite ile ilişkilidir.10 NSAİİ (nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar) kullanımının benign ve malign kolon tümörü gelişimini azalttığı gösterilmiştir. Meme kanserinde de aspirin ve diğer NSAİİ’ın kullanımı meme kanseri gelişimini azaltmakla birlikte, COX-2 enzim inhibitörlerinin, birincil önleme ve tedavide kullanımına yönelik, umut verici sonuçlar bildiren çalışmalar vardır.8 15 yaştan sonra menarş, 1 yıldan uzun süre emzirme, monoansatüre yağdan zengin diyet, fiziksel aktivite, premenopozal obesite, meme kanserine karşı koruyucu role sahip olduğu belirlenen faktörlerdir.8 2.1.2. Meme Kanseri Patolojik Sınıflandırma Meme kanserlerinin % 95’i meme epitelinden kaynaklanan karsinomlardır. Skuamöz hücreli karsinom, phyllodes tümör, sarkom ve lenfoma gibi adenokarsinom dışı diğer malign tümörler ise % 5’den az bir grubu oluşturmaktadır. Meme karsinomu, mikroskobik görünüm ve biyolojik davranışlarına göre çeşitli grupları kapsamaktadır. İki ana gruba ayrılabilir. İn situ karsinomlarda, tümör hücreleri duktus veya lobüle sınırlıdır. Işık mikroskobunda stromaya invazyon yoktur. İnvaziv (infiltratif) karsinomlarda ise tümör hücreleri bazal membranı aşarak stromaya invazyon göstermektedir. Bu nedenle invaziv karsinomlar, lenfatik ve kan damarlarını invaze ederek bölgesel lenf düğümlerine ve uzak organlara metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir.2 En sık kullanılan tanısal sınıflandırma sistemi Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sınıflandırmasıdır.11 Bu sınıflamaya göre meme kanserleri: 1. İn situ karsinom - İn situ duktal karsinom (DCİS) - İn situ lobuler karsinom (LCIS) 2. İnvaziv karsinom - İnvaziv duktal karsinom (% 70-80) - İnvaziv lobuler karsinom (% 5-10) - Tubuler karsinom (% 2) - İnvaziv kribriform karsinom - Medülller karsinom (% 1-5) 7 - Müsinöz (kolloid) karsinom (% 1-2) - İnvaziv papiller karsinom (% 1) - İnvaziv mikropapiller karsinom - Apokrin karsinom - Sekretuar (juvenil) karsinom - Adenoid kistik karsinom - Metaplastik karsinom - Nöroendokrin karsinom - İnflamatuar karsinom Diğer önemli histopatolojik bulgular ise, lenf nodu metastazı, lenfo-vasküler invazyon, tümör boyutu ve histolojik gradedir. Histolojik olarak tümörün derecesi Bloom-Richardson sistemine göre 3 gruba ayrılır. Tübül formasyonu, nükleer pleomorfizm ve mitotik aktivite değerlendirilir ve bu özelliklere göre 1-3 arasında skorlanır.12-14 1. Tübüler grade; tübüler formasyonun derecesi temel alınarak belirlenir. a. Tübüler yapılar tümörün % 75’den fazlasını oluşturuyorsa iyi diferansiye-1 puan b. Tübüler yapılar tümörün % 10-75’ini oluşturuyorsa orta derecede diferansiye-2 puan c. Tübüler yapılar tümörün % 10’dan azını oluşturuyorsa kötü diferansiye-3 puan 2. Nükleer grade; nükleus büyüklüğü, boyanma yoğunluğu ve şekil farklılıkları temel alınarak belirlenir. a. Küçük ve uniform boyanan nükleus varlığı, iyi prognoz-1 puan b. Nükleus boyut ve şeklinde orta derecede farklılıklar, orta dereceli prognoz-2 puan c. Koyu boyanma ve belirgin nükleer polimorfizm, kötü prognoz-3 puan 3. Siklüs fraksiyonunun belirlenmesi (mitotik indeks ve S-faz). S-fazın belirlenmesi flovsitometrinin kullanımını gerektirirken; mitotik indeks, proliferasyonun erken ve hızlı değerlendirilmesini sağlar. Mitotik indeks skorlaması aşağıdaki gibidir: a. Düşük (0-3,3/mm2)-1 puan b. Orta (3,3-7/mm2)-2 puan c. Yüksek (>7/mm2)-3 puan 8 - Histolojik grade; tübüler, nükleer ve mitotik skorların toplamından elde edilen birleşik indekstir. İnvaziv kanser aşağıdaki gibi derecelendirilir: a. İyi diferansiye - grade 1: toplam puan 3-5 b. Orta diferansiye - grade 2: toplam puan 6-7 c. Kötü diferansiye - grade 3: toplam puan 8-9 Meme kanserinde son zamanlarda yeni sınıflamalar yapılmaktadır.15 Bu sınıflamalar üzerinde görüş birliği sağlanamamıştır. Sınıflama sırasında dikkate alınan parametreler, histopatolojik tümör tipi ve farklılaşma, tümörün yaygınlığı (boyut, lenf nodu metastazı ve uzak metastaz), biyolojik belirteçler (ER, PR, c-erb-B2) ve tümör genetiğidir. Gen ekspresyon profiline göre, meme kanserleri 5 gruba ayrılmaktadır. 1. Luminal A 2. Luminal B 3. Normal meme benzeri 4. C-erb-B2 aşırı-eksprese eden 5. Bazal benzeri Luminal tümörler genellikle ER(+) olup özellikle luminal A tipinde CK8 ve CK18 ile pozitif boyanma izlenir. Prognoz Luminal tip A’da en iyidir ve endokrin tedavi yeterli bulunmaktadır. Luminal tip B’de prognoz biraz daha kötüdür ve tamoksifene yanıt Luminal A tipine göre daha az, ancak kemoterapiye yanıt iyidir. Bazal benzeri tümörlerde ER(-), c-erb-B2(-), Vimentin(+), EGFR(+), CK8/18(+), CK5/6(+) olup konvansiyonel kemoterapiye iyi yanıt verirler.15 2.1.3. Meme Kanserinde Evreleme Meme kanseri, 2002 yılında American Joint Commitee on Cancer (AJCC) tarafından, (T) tümör boyutu, (N) lenf nodu durumu ve (M) uzak metastaz durumu temel alınarak 4 evrede gruplandırılmıştır.16 Primer tümör (T) TX - Primer tümör saptanamamaktadır T0 - Primer tümör kanıtı yok Tis - Karsinoma in situ, Tis (DCİS) intraduktal karsinoma in situ 9 Tis (LCİS) Lobüler karsinoma in situ Tis (Paget) Kitle olmadan meme başının Paget hastalığı (Not: Tümör olan Paget hastalığı, primer tümörün boyutuna göre sınıflandırılır.) T1 - Tümörün en büyük boyutu 2 cm veya daha az T1mic - En büyük boyutu 0,1 cm veya daha az mikroinvazyon T1a - En büyük boyutu 0,1 cm.den büyük, 0,5 cm.den küçük tümör T1b - En büyük boyutu 0,5 cm.den büyük, 1 cm.den küçük tümör T1c - En büyük boyutu 1 cm.den büyük, 2 cm.den küçük tümör T2 - En büyük boyutu 2 cm.den büyük, 5 cm.den küçük tümör T3 - En büyük boyutu 5 cm.den büyük tümör T4 - Herhangi bir boyutta ancak (a) göğüs duvarına veya (b) cilde direkt yayılım, fakat aşağıda belirtildiği gibi (Not: Göğüs duvarına; kostalar, interkostal kaslar ve serratus anterior kası dahildir fakat pektoral kas hariç tutulmuştur) T4a - Pektoral kasa ulaşmamış göğüs duvarı yayılımı T4b - Meme cildinde ödem (peau d’orange dahil) veya ülserasyon, veya aynı memede satellit deri nodülleri T4c - Yukarıdakilerin her ikisi (T4a ve T4b) T4d - İnflamatuar karsinoma (Not: İnflamatuar karsinoma , genellikle ele gelen bir kitle olmadan, meme cildinin erizipeloid sınırlı endürasyonu ile karakterize klinikopatolojik bir durumdur. Radyolojik olarak, bir kitle bulunabilir ve meme üzerindeki deride karakteristik kalınlaşma görülebilir. Bu klinik durum, yüzeyel kapillerlerin obstriksiyonu ve dermal lenfatiklerin tümör embolizasyonu nedeniyle ortaya çıkmaktadır.) Bölgesel lenf nodları (N) NX - Bölgesel lenf nodları saptanamamaktadır (örn. daha önceden çıkartılmış) N0 - Bölgesel lenf nodu metastazı yok N1 - İpsilateral lenf nod(lar)ında metastaz (fikse değil) N2 -Fikse veya gruplaşmış ipsilateral aksiller lenf nodlarında metastaz veya klinik olarak belirgin* aksiller lenf nodu metastazı olmadığı durumlarda klinik olarak belirgin ipsilateral internal mammarial nodlarında metastaz N2a Birbirlerine veya çevre dokulara fikse ipsilateral aksiller lenf nodlarında metastaz 10 N2b Sadece klinik olarak aksiller lenf nodu metastazı olmadığında klinik olarak belirgin* ipsilateral internal mammarial nodlarda metastaz olduğunda N3 - Aksiller lenf nodu tutulumu olsun ya da olmasın ipsilateral infraklaviküler lenf nod(ları) metastazı veya klinik olarak belirgin* ipsilateral internal mammarial lenf nod(ları) metastazı ile birlikte klinik olarak belirgin aksiller lenf nodu metastazı; veya aksiller ya da internal mammarial lenf nodu metastazı olsun ya da olmasın ipsilateral supraklaviküler lenf nod(ları) metastazı N3a İpsilateral infraklaviküler lenf nod(lar)ında metastaz N3b İpsilateral internal mammarial lenf nod(lar)ında veya aksiller lenf nod(ları)nda metastaz N3c İpsilateral supraklaviküler lenf nod(ları)nda metastaz Görüntüleme metodları (lenfo-sintigrafi hariç) veya klinik muayene ile veya patolojik olarak açıkça görülerek saptanması durumunda ‘klinik olarak belirgin’ terimi kullanılır. Patolojik sınıflama (pN)a pNX - Bölgesel lenf nodları saptanamamakta (örneğin, patolojik inceleme için daha önce çıkarılmış veya çıkarılmamış) pN0 - Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı olmayan, izole tümör hücreleri (İTH) için ek inceleme yok Not: H&E boyası ile doğrulanabilen ancak sıklıkla sadece immünohistokimyasal (İHK) veya moleküler metodlarla saptanan, 0,2 mm.den daha geniş olmayan tek tümör hücreleri veya küçük hücre kümeleri ‘İzole tümör hücreleri (İTH)’ olarak tanımlanır. İTH, proliferasyon veya stromal reaksiyon gibi malign aktivite kanıtlarını genellikle göstermezler. pN0(i-) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, negatif İHK pN0(i+) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, pozitif İHK, 0,2 mm.den geniş İHK kümesi yok pN0(mol-) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, negatif moleküler bulgular (RT-PCR)b pN0(mol+) Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı yok, pozitif moleküler bulgular (RT-PCR)b 11 a. Sınıflama sentinel lenf nodu diseksiyonu uygulanan veya uygulanmayan aksiller lenf nodu diseksiyonuna göre yapılır. Ardından aksiller lenf nodu diseksiyonu uygulanmayan sentinel lenf nodu diseksiyonuna dayalı yapılan sınıflama, sentinel nod için (sn) ile belirtilir, örn ; pN0(i+)(sn). b. RT-PCR: ters transkriptaz/ polimeraz zincir reaksiyonu pN1 - 1-3 arası aksiller lenf nodlarında, ve/veya internal mamarial nodlarda sentinel lenf nodu diseksiyonu ile saptanan mikroskobik hastalıkla birlikte metastaz, fakat klinik olarak belirgin değil** pN1mic- Mikrometastaz ( 0,2 mm.den geniş, 2,0 mm.den geniş değil) pN1a - 1-3 adet aksiller lenf nodunda metastaz pN1b - Sentinel lenf nodu diseksiyonu ile internal mammarial nodlarda mikroskobik hastalık olarak saptanan metastaz, fakat klinik olarak belirgin değil** pN1c - 1-3 adet aksiller lenf nodunda ve internal mammarial nodlarda sentinel lenf nodu diseksiyonu ile mikroskobik olarak saptanan metastaz, fakat klinik olarak belirgin değil**. (3 aksiller lenf nodundan fazla pozitif nod varsa, artmış tümör yükünü göstermek için internal mammarial lenf nodları pN3b olarak sınıflandırılır). (pN1a + pN1b) pN2 - 4-9 aksiller lenf nodunda metastaz veya aksiller lenf nodu metastazı olmadığında internal mammarial lenf nodlarında klinik olarak belirgin* metastaz pN2a 4-9 aksiller lenf nodunda metastaz (2,0 mm.den büyük en az bir tümör odağı) pN2b Aksiller lenf nodu metastazı yokken, internal mammarial lenf nodlarında klinik olarak belirgin* metastaz pN3 - 10 veya daha fazla aksiller lenf nodunda veya infraklaviküler lenf nodlarında veya 1 ya da daha fazla aksiller lenf nodu pozitif olduğunda klinik olarak belirgin* ipsilateral internal mammarial lenf nodlarında metastaz; veya internal mammarial lenf nodlarında klinik olarak negatif mikroskobik metastazla birlikte 3’ten daha fazla aksiller lenf nodunda metastaz; veya ipsilateral supraklaviküler lenf nodlarında metastaz pN3a 10 veya daha fazla aksiller lenf nodunda metastaz (2,0 mm.den büyük en az bir tümör odağı), veya infraklaviküler lenf nodlarına metastaz 12 pN3b 1 veya daha fazla pozitif aksiller lenf nodu varlığında klinik olarak belirgin ipsilateral internal mammarial lenf nodu metastazı; veya sentinel lenf nodu diseksiyonuyla saptanan fakat klinik olarak belirgin olmayan mikroskobik hastalıkla birlikte 3 veya daha fazla aksiller lenf nodunda veya internal mammarial lenf nodlarında metastaz. pN3c İpsilateral supraklaviküler lenf nodlarında metastaz Uzak Metastaz (M) MX - Uzak metastaz bulunamıyor M0 - Uzak metastaz yok M1 - Uzak metastaz var (Tümörün olduğu tarafta supraklaviküler lenf nodları ve karşı memenin bölgesel lenf nodlarına metastazlar dahil) Meme kanseri evrelerinin gruplandırılması Tablo 1’de gösterilmiştir. 2.1.4. Meme Kanserinde Prognostik ve Prediktif Faktörler Adjuvan kemoterapinin yaygın olarak kullanılması, meme kanseri mortalitesini azaltmıştır. Bununla beraber, bu tedaviyi alan çoğu hasta, tedavinin faydasından çok, gereksiz toksisitesine maruz kalmaktadır. Bu nedenle, adjuvan sistemik tedaviden fayda görecek hastaların seçimi ve gereksiz toksisite ve maliyetten kaçınmak için, güvenilir prognostik faktörlerin kullanılması büyük önem taşımaktadır.2 Tablo 1. Meme kanseri evrelerinin gruplandırılması EVRE 0 EVRE I EVRE IIA Tis, N0, M0 T1, N0, M0 T0, N1, M0 T1, N1, M0 T2, N0, M0 T2, N1, M0 T3, N0, M0 T0, N2, M0 T1, N2, M0 T2, N2, M0 T3, N1, M0 T3, N2, M0 T4, herhangi bir N, M0 Herhangi bir T, N3, M0 Herhangi bir T, herhangi bir N, M1 EVRE IIB EVRE IIIA EVRE IIIB EVRE IIIC EVRE IV Prognostik faktörler, tedaviden bağımsız olarak, tanı anında, hastalığın klinik sonuçları hakkında bilgi vermektedir. Bu gibi prognostik faktörler, büyüme, invazyon 13 ve metastatik potansiyelin göstergesidir. Prediktif faktörler ise, tümörün verilen tedaviye yanıt verip vermeme olasılığı hakkında bilgi vermektedir. Bu gibi faktörler, tedavinin hedefi veya bir modülatörü olabilir. Prognozun belirlenmesinde rutin patolojik değerlendirme esastır.2 En önemli prognostik değişken, tümörün evresidir.1 Tümörün boyutu ve aksiller lenf düğümlerinin durumu, tümör rekürrensi hakkında önemli bilgi sağlamaktadır (5 yıllık sağkalım oranları tablo 2’de gösterilmiştir). Klasik prognostik faktörler; evre, aksiller lenf nodu durumu, tümör boyutu, tümörün histolojik tipi, histolojik grade, nükleer grade, lenfovasküler invazyon, karsinoma insitu komponentinin karakteri ve oranı, deri ve meme başı invazyonudur. Modern tedavide, hormon reseptör durumu, onkogenler (HER/2-neu), tümör supresör genler (p53), tümör anjiyogenezi, proteazlar, flovsitometrik incelemeler, proliferasyon belirleyicileri (Ki-67) gibi pek çok parametre prognostik ve prediktif olarak kullanılmaktadır.12 Yaş ise bağımsız prognostik parametredir. Genç hastalar yaşlılara göre kötü prognoza sahiptirler. En kötü prognoz 30 yaş altı hastalarda gözlenmektedir. 45-50 yaşa göre risk 30 yaş altında iki kat artmıştır.17 Hastaların prognostik gruplara ayrılması için, DNA içeriği (ploidi), S faz veya flovsitometri yöntemine dayanan meme dokusunun proliferasyon markerlerinin kullanımı, verilerin yetersizliği nedeniyle rutin klinik kullanımda önerilmemektedir. Ayrıca, immünohistokimyasal yöntemlere proliferasyon markerlerinin (örneğin Ki67, siklin D, siklin E, p27, p21, timidin kinaz veya topoizomeraz II), prognostik marker olarak kullanımını destekleyen yeterli kanıt yoktur. Ayrıca p53 ve katepsin D ölçümleri, meme kanserinin yönetiminde yetersiz veri nedeniyle önerilmemektedir.20,21 Tablo 2. Meme Kanserinde Evreye Göre 5 Yıllık Sağkalım Oranları EVRE 0 I IIA IIB IIIA IIIB IV 5 Yıllık Sağkalım (%) 99 92 82 65 47 44 14 Tedavi kararı için kritik bilgi sağlayan ve her zaman kabul edilen prognostik faktörler; TNM evresi, aksiller lenf nodu durumu, tümör boyutu, tümörün derecesi ve hormon reseptör durumudur. 14 2.1.4.1. Aksiller Lenf Nodu Tutulumu Aksiller lenf nodu tutulumu ve metastatik lenf nodu sayısı, invaziv meme kanseri için halen en önemli prognostik faktör olarak kabul edilmektedir. Tümör boyutu 1 cm.den küçük ve aksiller lenf nodu tutulumu olmayan hastalarda, adjuvan kemoterapiye nadiren ihtiyaç duyulur.1,17 Lenf nodu negatif fakat küçük damar (kapiller veya lenfatik) tutulumu olan tümörler, lenf nodu pozitif olanlarla eşdeğer kabul edilebilir. Aksiller lenf nodu metastazı olmayan hastalarda, 10 yıllık hastalıksız yaşam % 70-80, aksiller lenf nodu metastazı varlığında yaklaşık % 30 saptanmıştır. Metastatik lenf nodu sayısı çok önemlidir. Birçok klinik çalışmada tutulan lenf nodu sayısına göre hastalar, nod negatif, 1-3 nod pozitif, 4-9 nod pozitif, 9 veya daha fazla nod pozitif olarak gruplandırılmıştır. Tutulan lenf nodu sayısı arttıkça sistemik metastaz riski daha fazla, prognoz daha kötüdür. Metastatik lenf nodu sayısı kadar, metastatik lezyonun çapı (mikrometastaz), lenf nodu çevresi yumuşak dokuya yayılım da prognozu olumsuz yönde etkileyen faktörlerdir. Bazı görüşler mikrometastazların (2 mm.den küçük metastazlar) prognozu olumsuz yönde etkilemediği biçimindedir. Buna karşı, Friedman ve arkadaşları lenf nodlarında seri kesitlerle ortaya konan subkapsüler ve marjinal sinüs yerleşimli tümör emboli varlığında, uzak metastaz riskinin lenfatik tutulumu olmayan olgulara göre 1,7 kez arttığını saptamışlardır.13,17,18 2.1.4.2. Tümör Boyutu Tümör çapı, meme kanserinin rekürrens riski ve özellikle nod negatif hastalarda adjuvan tedavi seçimi için önemli ve güvenilir bir prognostik faktördür.22 Tümör boyutu; lenf nodu tutulumu ve hastalığın prognozuyla yakından ilişkilidir. (Tablo 3-4) Tüm nodal tutulum kategorilerinde tümör çapı büyüdükçe yaşam süresi kısalmaktadır. Tümör çapının 2 cm ya da daha küçük olduğu olgularda prognoz belirgin olarak daha iyidir. Özellikle aksiller tutulumu olmayan hastalarda, tümörün meme içindeki lokalizasyonu da prognostik önem taşımaktadır. Lateral yerleşimli tümörler, medial tümörlere göre daha fazla 15aksiller metastaz yapabilme özelliğine sahiptir.18,23,24 15 Tablo 3. Tümör çapı ile aksiller lenf nodu tutulumu arasındaki ilişki Tümör Çapı (cm) 0,5 cm.den küçük 0,5-0,9 1-1,9 2-2,9 3-3,9 4-4,9 5 cm.den büyük Lenf tutulumu (%) 20 20 33 45 52 60 70 2.1.4.3. Tümörün Histolojik Tipi Meme karsinomları iyi ve kötü prognozlu tipler olarak iki alt gruba ayrılabilir. İyi prognozlu histolojik tipler aşağıda sıralanmıştır. Meme kanserinin özel tiplerini belirleyen morfolojinin, bir tümörün % 90’ından fazlasını hatta % 100’e yakın bölümünü oluşturması önemlidir.23,24 Tablo 4. Tümör boyutu ile meme kanseri prognozu arasındaki ilişki 5 Yıllık Sağkalım Tümör boyutu (cm) Nod (-) % Nod (+) % 1-3 (+) % 0,1-0,5 82-99 52 95 0,6-1,0 72-98 54 94 1,1-2,0 68-96 39 87 2,1-3,0 63-92 39 83 3,1-4,0 61-86 33 79 4,1-5,0 59-85 26 70 >5,0 57-82 21 73 İyi prognoza sahip meme karsinomları aşağıda sıralanmıştır: 1. Tubuler karsinom 2. Kribriform karsinom 3. Pür müsinöz (kolloid) karsinom 4. Adenoid kistik karsinom 5. Düşük dereceli adeno-skuamöz karsinom 6. Sekretuar karsinom 7. Tübülo-lobüler karsinom 8. Klasik lobüler karsinom 9. Medüller karsinom 10. İnvaziv papiller karsinom 16 4 < (+) % 59 54 67 63 57 53 46 2.1.4.4. Tümör Derecesi (Grade) Günümüzde en çok kabul gören sistem, Elston tarafından modifiye edilmiş Bloom-Richardson sistemidir. Bu sistemde tümörde tubul formasyonu, nükleer özellikler ve mitoz sayısı ayrı ayrı değerlendirilerek skorlanır ve elde edilen sonuca göre tümörün histolojik derecesi; grade I, II, III olarak değerlendirilir. Medüller karsinomlar hariç tüm invaziv meme karsinomlarında derecelendirme yapılabilir. Kötü diferansiye tümörler, iyi diferansiye tümörlere göre daha yüksek rekürrens sahiptir.18 2.1.4.5. Lenfovasküler İnvazyon Kan ve lenfatik damarların tümör hücrelerince invazyonu prognoz açısından önemlidir. Bu bulgu, lenf nodu metastazı varlığı ile kuvvetli birliktelik gösterir ve ayrıca lenf nodu metastazı olmayan olgularda kötü prognoz belirtisi olarak kabul edilir. Dermal lenfatiklerde tümör hücre embolisi varlığı, inflamatuar meme karsinomunun patolojik göstergesidir.13,14,17 Tümörün büyümesi için, neovaskülarite oluşturmalıdır ve tümörün vaskülaritesi arttıkça prognozu daha kötüdür. Bu nedenle, bevasizumab gibi kan damarlarını hedefleyen tedaviler önemlidir.1 2.1.4.6. Hormon Reseptörleri Günümüzde, meme karsinomlarında immünohistokimyasal yöntemle hormon reseptörlerinin araştırılması, tedavinin belirlenebilmesi için yapılan rutin bir uygulamadır. Endokrin tedavi için prediktif belirleyici olarak, adjuvant ve metastatik meme kanserinde önemli bir yer tutar.2 ER ve PR pozitif tümörler daha iyi prognoza sahiptirler.2 Primer meme kanserlerinin ortalama % 55-65’i; meme kanseri metastazlarının yaklaşık % 45-55’i ER pozitiftir. Primer ve metastatik meme kanserlerinin yaklaşık % 45-60’ı PR pozitiftir. ER ve PR pozitifliğine postmenopozal dönemde, premenopozal döneme göre daha fazla rastlanmaktadır. ER pozitif tümörlerde, hormonal tedaviye % 55-60, ER negatif tümörlerde ise % 8 yanıt alınmaktadır. ER, evre 1 ve 2 meme kanserlerinde, toplam sağkalım ve hastalıksız sağkalım ile ilişkili bulunmuş. PR ise sağkalım için, ER’ye oranla daha belirleyici role sahiptir. İnsitu duktal karsinomlarda da nükleer derece arttıkça ER ve PR pozitifliğinin azaldığı saptanmıştır. ER ve PR, meme kanserlerinde bağımsız prognostik faktörlerdir.13,17 17 2.1.4.7. Moleküler Prognostik Parametreler 2.1.4.7.1. Proliferatif Oran Artmış proliferatif oran, genellikle tedavi edilmeyen hastalarda, kötü prognozla korelasyon göstermektedir. Meme tümörlerinde proliferatif oran; mitotik indeks, timidin bağlama indeksi (TBI), bromodeoksiüridin (BrdU) işaretleme, flovsitometri ile S-faz fraksiyonunun belirlenmesi, immünohistokimyasal yöntemlerle antijenlere karşı monoklonal antikorlar kullanarak prolifere olan hücrelerin bulunması (Kİ-67 veya proliferating cell nuclear antigen [PCNA/siklin]) ve argyrophilic nucleolar organizer regions (AgNOR)’un değerlendirilmesi gibi çeşitli yöntemlerle belirlenebilir. En sık kullanılan yöntemler, flovsitometri ile S-faz fraksiyonunun ve İHK ile Kİ-67’nin belirlenmesidir.25,26 2.1.4.7.2. Flovsitometri Bu yöntemle meme tümör örneklerinde, S fazındaki hücrelerin yanı sıra tümör hücrelerinin DNA içeriği de belirlenebilir. Tek değişkenli analizlerde bağımsız bir prognostik faktör olduğu gösterilmiştir.2 Nod (-) ve nod (+) meme kanserli hastalarda mortalite ve rekürrens riskinde artma ile S faz fraksiyonu arasında korelasyon vardır. Ancak rutin kulanım için standardizasyon ve kalite kontrolüne gereksinim vardır ve pratikte önerilmemektedir. Ayrıca östrojen ve progesteron reseptör varlığının düşük S faz fraksiyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir.27-30 2.1.4.7.3. Kİ-67 G0 hariç tüm hücre sikluslarında nükleusta mevcut olan bir nükleer antijene karşı gelişen monoklonal antikordur. DNA içeriğine bakmaksızın herhangi bir siklus fazında bulunan tüm hücreler G0 fazına girebildiği için, Ki-67 fraksiyon tayini, bir tümörün prolifere olan hücre komponenti ile ilgili en anlamlı bilgileri vermektedir. Nod (-) meme kanserlerinde Ki-67 büyüme fraksiyonu ortalaması % 13 iken, dörtten az nod (+) tümörlerde bu fraksiyon % 20’dir. Ayrıca hormon reseptör varlığı ile ters orantılı ilişki vardır.31-35 18 2.1.4.7.4. Timidin Bağlama İndeksi (TBI) S fazındaki hücrelerin oranı belirlenir. Bu yöntemde saptanan S faz fraksiyonu prognozla koraledir. Meme kanserlerinde ortalama TBI % 5’tir. Genellikle müsinöz, adenoid kistik karsinom gibi düşük dereceli karsinomlar düşük TBI’ne sahiptir. TBI’nin tümörün klinik evresi ile zayıf bir korelasyon gösterdiği, ER içeriği ile ters ilişkiye sahip olduğu ve histolojik grade ile doğrudan ilişkili olduğu bilinmektedir.36 2.1.4.7.5. DNA İçeriği Birçok çalışmada DNA analizinin, meme kanserinin prognozunu değerlendirmede kullanılabileceği bildirilmiştir. Bazı çalışmalarda, azalmış hastalıksız ve toplam sağkalımla bağımsız bir ilişki bulunurken, bazı çalışmalarda da hastalığın sonucunu etkilemediği ileri sürülmüştür. Bu konuda henüz fikir birliği sağlanamamıştır. Genel olarak DNA anöploidisi, yüksek histolojik grade ile korelasyon göstermektedir. Meme karsinomlarının yaklaşık olarak % 50-60’ı anöploid popülasyona sahiptir. DNA ploidi analizleri, flovsitometri veya statik sitofotometri ile yapılabilir, ancak flovsitometrinin zaman ve hücre sayısı açısından üstünlüğü mevcuttur.37-39 2.1.4.8. HER-2 (epidermal growth factor receptor-2, c-erb-B2) Meme kanserli hastaların yaklaşık % 20-35’inde aşırı eksprese edilmektedir. Meme kanseri için prognostik ve prediktif özelliği vardır. HER2’nin yüksek seviyelerde ekspresyonu (İHK ile +3 pozitif veya FİSH yöntemiyle pozitif) meme kanserli hastalarda önemli bir prediktif faktördür, bu hastalar HER2’yi hedefleyen trastuzumab gibi ajanlardan fayda görebilir. Ek olarak c-erb-B2, antrasiklin dışı kemoterapi ajanlarına (örneğin CMF - siklofosfamid/metotreksat/florourasil) ve tamoksifene dirençten sorumludur. C-erb-B2 pozitif hastaların antrasiklin ve taksan tabanlı adjuvan kemoterapilere, spesifik hedefleyici tedavi olan trastuzumab ve Her-2/neu kinaz inhibitörlerine yanıtı daha iyidir.40 C-erb-B2 pozitif tümörlerde prognozun daha kötü olduğu, az diferansiye ve ER/PR negatif tümörler olduğu bilinmektedir. Erken evre meme kanserlerinde c-erbB2’nin prognostik değeri tartışmalı olmakla birlikte yapılan çalışmaların çoğunda tedavi edilmeyen hastalarda kötü prognozla ilişkili bulunmuştur. Bazı çalışmalarda HER-2 aşırı ekspresyonu diğer kötü prognostik faktörlerle (tümör boyutu, grade, nodal durum) 19 ile ilişkili bulunmuştur. Lenf nodu pozitif hastalarda kötü prognozla bağımsız olarak açıkça ilişkilidir.41-43 Serum ECD (ekstrasellüler domain) Seviyesi Metastatik hastaların yaklaşık üçte birinde, HER-2’nin ekstrasellüler domaini, ELİSA yöntemi kullanılarak serum veya plazmada yükselmiş bulunmaktadır. HER-2 ECD’nin varlığı genel olarak kötü prognozla ilişkilidir. HER-2 ECD seviyesi tümör yüküyle doğrudan paraleldir. Ancak ASCO (American Society of Clinical Oncology) tarafından, serum ECD seviyesi ölçümü tümör markeri olarak kabul edilmemiştir.44 2.1.4.9. Siklin E ve p27 Siklin E, hücre siklüsünün geç G1 fazında eksprese edilen 50 kD ağırlığında bir proteindir. Siklin’ler, regülatör partnerleri siklin bağımlı kinazlar (CDK) ile birlikte, hücre siklüsünün ilerleyişinde moleküler kontrol mekanizmalarını oluştururlar. Siklin/CDK kompleksi, p21 ve p27 proteinleri ile inhibe edilirler.45,46 Siklin E’nin yüksek seviyelerinde, hücrelerin S fazına girişi stimüle edilmektedir. Meme kanserlerinde hem siklin E geni amplifikasyonu, hem de siklin E ekspresyonu artmıştır. P27, prolifere olmayan hücrelerde yüksek seviyededir ve seviyesi düştüğünde, hücre mitojenik sinyallere prolifere olarak cevap vermektedir. Siklin E ve p27 seviyeleri, tümör progresyonunun değerlendirilmesinde önemlidir. Yüksek siklin E ve düşük p27 seviyeleri, azalmış toplam ve hastalıksız sağkalım ile ilişkilidir. Klinik pratikte kullanımı önerilmektedir.47-49 2.1.4.10. P53 Gen Analizi P53 tümör supresör gen mutasyonları ve mutasyona uğramış genin ürettiği p53 proteininin artışı, meme kanserlerinin % 20-50’sinde rapor edilmiştir. Bu anormallik, herediter meme kanserlerinde (Li-Fraumeni sendromu) daha sık görülmektedir. Birkaç çalışmada, doku p53 protein seviyesi veya p53 genindeki mutasyon ve delesyonların, hem nod (+) hem de nod (-) hastalarda, azalmış hastalıksız ve toplam sağkalım ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Ancak bu veriler yetersizdir ve prognostik faktör olarak kullanımı sınırlıdır.50-55 20 2.1.4.11. Anjiyogenez Markerleri Tümörün büyümesi ve metastaz yapabilmesi anjiyogeneze bağımlıdır. Anjiyogenez, direk olarak yeni kan damarlarının değerlendirilmesi veya indirek olarak anjiyojenik faktörlerin ve reseptörlerinin ölçümü ile yapılabilir. Erken bir raporda, microvessel dansitesinin, hastalıksız ve toplam sağkalımla istatistiksel olarak anlamlı ilişkisi gösterilmiştir. Ancak, microvessel dansite ölçümleri için kullanılan teknik farklılıklar kullanımlarını kısıtlamaktadır. Bu konuda değerlendirilen diğer faktörler, basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2) ve vascular endothelial growth factor (VEGF)’dir. VEGF, meme kanserinde up-regüle edilmekte olup özellikle VEGF ekspresyonu, hem nod (+) hem de nod (-) hastalarda relapssız ve toplam sağkalım ile ilişkilidir. Anjiyojenik faktörler, bazı özel tümör örneklerinin değerlendirilmesinde kullanılabilmektedir, ancak klinik kullanımları ve prognostik rollerinin tanımlanması için geniş prospektif çalışmalara ihtiyaç vardır.56-60 2.1.4.12. Katepsin D Adezyon, invazyon ve metastazın markerlerinin belirlenmesi, özellikle nod negatif meme kanserli hastaların prognozu hakkında önemli bilgiler vermektedir. Bunlardan en yoğun olarak çalışılan belirteç, lizozomal proteolitik bir enzim olan katepsin D’dir. Protein katabolizması ve dokuların yeniden yapılandırılmasında önemli rol oynamaktadır. Yüksek katepsin D seviyesine sahip hastaların prognozuyla ilgili çelişkili sonuçlar olmakla birlikte, çalışmaların çoğunda kötü prognozla ilişkili bulunmuştur.61-64 2.1.4.13. Ürokinaz Plazminojen Aktivatör Sistem Ürokinaz plazminojen aktivatör (uPA), kanser invazyon ve metastazında önemli rol oynayan serin proteazdır. Reseptörüne (uPAR) bağlandığında, plazminojeni plazmine çevirmekte ve tümör invazyonu sırasında ekstrasellüler matriksin uygun hale gelmesine aracılık etmektedir. UPA’nın spesifik inhibitörleri (plazminojen aktivatör inhibitör [PAI] tip 1 ve 2) tanımlanmıştır. PAI-1 düzeyleri, tümör dokusu ve plazmada yüksektir ve PAI-1, uPA’ya bağlandığı zaman inaktive etmektedir. PAI-2 ise, gebelik ve myeloid lösemi gibi durumlar dışında genellikle düşük seviyede bulunmaktadır.65-67 21 Retrospektif bir çalışmada, meme kanserli hastalarda yüksek uPA, uPAR ve PAI1 seviyeleri, kısalmış sağkalım ile ilişkili iken, yüksek PAI-2 seviyesinin ise daha iyi prognozla ilişkili olduğu belirlenmiştir. 8377 hasta içeren bir analizde, uPA ve PAI-1 seviyelerinin, lenf nodu durumundan sonra, tüm hastalar için hastalıksız ve toplam sağkalımın güçlü bir prediktörü olarak gösterilmiştir. Özellikle lenf nodu negatif hastalarda, her ikisinin birlikte ekspresyonu durumunda bu ilişki daha belirgindir.68 Sonuç olarak, en az 300 mg. taze veya donmuş dokuda ELİSA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) yöntemiyle uPA ve PAI-1 ölçümü, yeni tanı almış nod negatif meme kanserli hastalarda prognozun belirlenmesi için kullanılabilir. Her ikisinin düşük seviyesi, özellikle adjuvan hormonal tedavi alan ER/PR pozitif hastalarda düşük rekürrens riski ile ilişkilidir ve ilave kemoterapinin yararı minimaldir. Yüksek uPA ve PAI-1 seviyesi olan hastalarda, ilaçsız takip edilen hastalara göre CMF tabanlı kemoterapinin önemli faydası vardır. İHK ve küçük örneklerde ELİSA’nın kullanılması uygun değildir.69 İnvazyon ve metastaz potansiyelinin değerlendirilmesi için; nm23, E-cadherin, kateninler, metaloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP), prostat spesifik antijen, doku faktörü ve osteopontin gibi birçok faktör ileri sürülmüş ve üzerinde çalışılmıştır. Ayrıca, allel kaybı, mikrosatellit instabilite veya tümör supresör genlerin metilasyonla baskılanması da prognostik bilgi sağlamaktadır.70 2.1.4.14. Tümör Markerleri CA 15-3 ve CA 27-29 periferik kandaki MUC-1 (müsin-1) antijenini bulmak için tanımlanmıştır. Birkaç çalışmada erken evre meme kanserinde MUC-1’in prognostik değeri belirtilmiştir ancak, tedavi kararının verilmesinde MUC-1’e dayanan tümör markerlerinin faydası konusunda hiçbir veri yoktur. Sadece seçilmiş metastatik hastaların izlenmesinde önerilmektedir.71-74 2.1.4.15. Multiparametreli Gen Ekspresyon Analizi Genomik teknolojiler (proteomiks, gen ekspresyon profili [GEP]), meme kanserinde prognostik şema düzenlemek için giderek artan bir şekilde uygulanmaktadır. Moleküler subtipleme halen geliştirilmektedir ve prognostik olarak farklı alt grupları iyi belirleyememektedir. Birçok genin eş zamanlı olarak ekspresyon analizinin yapılması, 22 kanser sınıflaması için yeni bir yaklaşımdır. Bu teknik sıklıkla gen array analizi olarak adlandırılır.75,76 Multiparameter gen assay’in klinik pratikte kullanımı, prognostik sınıflama ve tedavi seçiminde önemlidir. Bununla beraber, luminal (çoğu ER-pozitif), basal-like (çoğu ER-negatif, HER-2 negatif, bazen triple negatif olarak adlandırılır) ve HER2+ (çoğu ER-negatif) arasında ayrım yapmak için klinik faydası henüz belirlenememiştir. Daha önemlisi, birçok genin ekspresyon analizi, erken ever meme kanserli hastaların klinik sonucunu tahmin etmek için kullanılabilmektedir ve klasik klinik ve patolojik prognostik özelliklerle birlikte daha önemli bilgiler elde edilmektedir.77-80 İki genel yaklaşım, DNA microarray yöntemiyle taze-donmuş dokuda gen ekspresyon profilinin belirlenmesi ve real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) yöntemiyle fikse edilmiş parafine gömülü tümör dokusunda, seçilen genin ekspresyonunun miktarının tespit edilmesidir (örneğin Oncotype DX assay).81,82 Gen ekspresyon profili için microarray’e dayanan testler, taze veya donmuş doku gerektirir. Hollanda’da yapılan bir seride, 295 evre I ve II meme kanserli hasta (151 nod negatif ve 144 nod pozitif), daha önceden belirlenen 70-gen profiline göre iyi (n=115) ve kötü (n=180) prognozlu olarak sınıflandırılmış ve on yıllık takipte, toplam ve hastalıksız sağkalım açısından, iyi prognozlu olarak sınıflanan grubun önemli derecede iyi prognoza sahip olduğu belirlenmiştir (% 95’e karşı % 51). Çok değişkenli analizde, tümörün gen ekspresyon profilinin, prognoz için klasik klinik ve histolojik kriterlerden daha güçlü bir prediktör olduğu gösterilmiştir. Aynı yöntemle Avrupa ve Amerika’da yapılan çalışmalarda, istatistiksel olarak anlamlı olmakla beraber daha az pozitif sonuçlar elde edilmiştir. Bu sonuç hipotez olarak değerlendirilmiş ve rutin kullanım için yetersiz bulunmuştur. Randomize klinik çalışmalar halen devam etmektedir.83-86 76 gen ifadesinin değerlendirildiği, adjuvant sistemik tedavi almayan nod negatif 400 hasta içeren bir çalışmanın çok değişkenli analizinde, gen profili 5 ve 10 yıllık uzak metastaz gelişme riski ile korale bulunmuştur. Ancak klinik pratikte kullanım için onaylanmamıştır.87 RT-PCR’a dayanan metotlar – Formalinle fikse edilmiş parafine gömülü dokuların ve özellikle daha küçük tümörlerin değerlendirilmesini sağlayan pratik bir yöntemdir.80 23 DNA microarray analizi ve gen ekspresyon profili, meme kanserinin moleküler profilini belirlemek, prognozunu tahmin etmek ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde kullanılabilir. Bu yöntemlerin geçerliliği için, daha büyük prospektif çalışmalara, metotların standartlaştırılmasına ihtiyaç vardır. Multiparameter gen ekspresyon analizi, yeni tanı almış, nod negatif, tamoksifen tedavisi verilen ER-pozitif meme kanserli hastalarda rekürrens riskinin belirlenmesinde kullanılabilir. Ayrıca düşük rekürrens oranı, tamoksifenden fayda görmesi beklenen ve adjuvant kemoterapi gereken hastaların belirlenmesinde önemli bilgiler sağlamaktadır. Yüksek rekürrens oranına sahip kemoterapi alan hastalar (özellikle CMF rejimi), tamoksifen alan hastalara göre göreceli olarak daha fazla yarar görmektedir.87-93 2.2. Meme Kanserinde Kemik İliği Mikrometastazının Prognostik Önemi 2.2.1. Kemik İliği Mikrometastazının Tanımı ve Erken Metastatik Hastalığın Biyolojisi Solid epitelyal tümörlerde, kemik iliğine dissemine tümör hücreleri (DTC) kavramı 30 yıl önce ortaya atılmıştır.94-96 Minimal rezidüel hastalık (MRD), kemik iliğinden izole edilen tümör hücreleri (İTH) veya gizli metastatik hücreler, DTC ile eş anlamlı olarak kullanılmaktadır. Mikrometastaz, primer tümörden uzak organlara yayılan tümör hücrelerinin, çapı 2 mm.mden küçük mikroskobik metastatik depozitleri olarak tanımlanmaktadır.94,97,98 Kemik iliğindeki sıklıkla tek tek veya gruplar halinde bulunan bu tümör hücreleri, kemik iliği mikrometastazları olarak tanımlanmaktadır. (Şekil 1’de A45B/B3 monoklonal antikoru ile immünositokimyasal olarak boyanmış tek ve grup halinde bulunan mikrometastatik hücreler)99 Bu hücreler klasik görüntüleme yöntemleri ile tespit edilememektedir. Tümör gelişiminin olasılıkla erken döneminde meydana gelen mikrometastatik yayılım, kan, lenf nodları veya kemik iliğine olabilmekte, kemik iliği, primer tümörden köken alan mikrometastatik hücrelerin en sık yayıldığı organ olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler yıllarca iskelet metastazı veya tekrar dolaşıma geçerek karaciğer veya akciğer metastazı geliştirmeden dormant halde kalmaktadır.100 Gelişmiş ülkelerde solid tümörlerin çoğunluğunu epitelyal kaynaklı meme, akciğer, gastrointestinal sistem ve prostat karsinomları oluşturmaktadır. Metastatik kaskadın ilk basamağında lokal olarak tümör hücre invazyonu meydana gelmekte, bunu 24 takiben lokal lenf nodlarına veya kan dolaşımı yoluyla ikincil organlara yayılım gerçekleşmektedir. Tümör hücreleri ikincil organlarda ya apopitozise uğramakta ya da immün sistem tarafından ortadan kaldırılmaktadır. (Şekil 2: Apopitotik ve nonapopitotik hücreler gösterilmiştir)101 Hayatta kalanlar ise metastatik lezyonlar için potansiyel prekürsörlerdir. Günümüzde tümör evreleme yöntemleri genellikle manifest uzak metastazları içermekte fakat uzak organlardaki bu tek tümör hücrelerini içermemektedir. Metastazın başlangıcında erken dönemde tespit edilmesi, metastatik tümör yükünün daha küçük olması ve kemoterapötik ajanlara solid metastazlardan daha duyarlı olmaları nedeniyle önemlidir.100 Lenf nodu tutulumu (evre N0) veya uzak metastazın klinik ve histopatolojik bulgusu olmayan (evre M0) epitelyal tümörlerde (meme, prostat, kolon ve akciğer karsinomları gibi) kemik iliği mikrometastazı oranı % 20-40 bulunmuştur. Bu konuda en fazla araştırma meme kanserinde yapılmıştır. Cerrahi sırasında kemik iliğindeki bu erken metastatik hücrelerin bulunması, gelecekte kemik veya diğer organlarda meydana gelebilecek relaps için bir prediktördür.100 25 Şekil 1. A45B/B3 monoklonal antikoru ile immünositokimyasal olarak boyanmış tek ve grup halinde bulunan mikrometastatik hücreler99 26 Şekil 2. Apopitotik ve nonapopitotik mikrometastatik hücreler (a) Nonapopitotik mikrometastatik hücreler (APAAP kit metodu) (b) Apopitotik mikrometastatik hücrede membran düzensizliği ve nükleer daralma (APAAP kit metodu) (c) FİSH yöntemiyle Apopitotik mikrometastatik hücrede membran düzensizliği ve nükleer daralma (d) Apopitotik mikrometastatik hücrede kromatin yokluğu İn vivo videomikroskobinin kullanıldığı hayvan deneylerinde, metastazın hem yeterlilik hem de yetersizlik adımlarından oluşan bir süreç olduğu gösterilmiştir.100,102,103 Metastatik hastalığın başlangıç aşamasında (dolaşımda hayatta kalma, mikrosirkülasyonda tutunma ve ekstravazasyon) etkin bir şekilde gerçekleştirilir. Ancak hücrelerin malign potansiyelinden bağımsız olarak, mikrometastatik depozitlerin daha sonraki büyüme ve klinik olarak metastaz geliştirmelerinde yetersizlik söz konusudur. Tümör hücrelerinin bu büyümeyi başlatma yeteneğine ve daha az derecede hedef organın fiziksel özelliklerine bağlı olarak metastaz ortaya çıkmaktadır.102,104,105 Yeni deneysel bir çalışmada, flovsitometri yöntemiyle kemik iliği ve diğer dokularda 27 tümör hücrelerinin gösterilmesine rağmen, deney hayvanlarının % 13’ünden daha azında uzak metastaz gelişmiştir.106 Bu bulgulara dayanarak, metastatik hastalık, insan vücudunun çeşitli bölgelerinde bulunan tüm malign hücrelerin relatif olarak küçük bir bölümünden oluşan tek hücrelerin bir subpopülasyonu olarak tanımlanabilir.103,107 Metastaz kapasitesi olan bu tek hücreleri diğer tümör hücrelerinden ayıran ve metastatik büyümeyi başlatabilmelerini sağlayan özellikleri vardır.108 Tümör uykusu (dormant tümör hücreleri); kemik iliği gibi bir rezervuarda gizli durumda çoğalmadan yaşayan tümör hücrelerinin yayılmasının sonucu olarak, gros hastalığın tamamen eradikasyonundan yıllar sonra kanserin rekürrensini açıklayabilen klinik olarak kabul edilen bir durumdur.109,110 DTC’nin bu uyku halinde kaldığına inanılır ve bilinmeyen bir zamanda, iskelet metastazı gelişmeden, kemik iliğinden uzak organlara yayılmaktadır.94 Klinik ve deneysel verilerin bu teoriyi güçlü bir şekilde desteklemesine rağmen, bu fenomenin mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Mikrometastatik hücre popülasyonu, henüz belirlenemeyen faktör ve durumların etkisi altında, çoğalmadan ve başka yerlere yayılmadan yaşayabilen tümör hücrelerinden oluşmaktadır. Tümör anjiyogenezisi, hücre proliferasyonu, hücre siklüsünün durması, immün regülasyon ve kanser hücrelerinin mikroçevre ile etkileşiminin bu duruma katkıda bulunduğu ileri sürülen olası sebeplerdir.109,111-114 M0 evre epitelyal kanserli hastaların kemik iliğinden elde edilen tümör hücrelerinin kullanıldığı hücre kültürlerinde, bu hücrelerin zaman-sınırlı proliferatif aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu da, prolifere olan hücreleri hedefleyen kemoterapötik ajanlara dirençli olmalarını açıklamaktadır.94,115 Bazı araştırmacılar, mikrometastazın, benzer proliferasyon ve apopitozis dereceleri olan, metabolik olarak aktif fakat fonksiyonel olarak dormant haldeki hücrelerden kaynaklandığını; bazı araştırmacılar da, metastaz yeteneğine bakmadan, ne çoğalan ne de apopitozise uğrayan, yaşayan fakat inaktif soliter dormant haldeki hücrelerden kaynaklandığını ileri sürmüşlerdir.109,116-119DTC, gerektirmeyen, kritik nutrisyon boyutun desteği çok için altında, anjiyogenezi preanjiogenik başlatmayı evrede bulunmaktadır.109,116,117,120 Bu evrenin, primer tümörün kendisi tarafından da uyarılmış olabileceğine ilişkin kanıtlar vardır.116 Daha önceki çalışmalarda, bazı primer tümörlerin, anjiostatin veya endostatin gibi antianjiyogenetik medyatörler salarak, metastazların büyümesini inhibe ettiğini göstermiştir.118,121,122 Guba ve arkadaşları, 28 deneysel verilere dayanarak, primer tümörün, soliter dormant haldeki tümör hücrelerinin büyümesini suprese edebileceğini ileri sürmüştür. Bu gözlemlerini, uyku halinin başlamasını, primer tümörün anjiyogenezisi inhibe etmesi ya da henüz bilinmeyen moleküllerin sekresyonu yoluyla, yayılan tümör hücrelerini suprese etmesinin bir sonucu olduğu şeklinde açıklamışlardır.109 Kanserin büyümesinin kontrolünde konak immün sisteminin rolü açıkça ortaya koyulmuştur. Bununla beraber, tümör uykusu fenomenine katkısı bilinmemektedir. Mürin lenfoma modelinde immünizasyon yoluyla deneysel tümör uykusu gerçekleştirilmiştir. İnterferon gama gibi sitokinler dahil bir çok faktörün, uyku halinin oluşturulmasında ve sürdürülmesindeki etkisi gösterilmiştir.123-127 Çalışmalar immün sistemin, mikrometastatik hücreleri en azından başlangıçta, çoğalmadan ve diğer organlara yayılmadan tuttuğunu göstermiştir. Solid tümörlerde ise, bu modellerin kanser büyümesinde uygulanıp uygulanamayacağı henüz açıklığa kavuşmamıştır.128 Mikrometastatik hücrelerin MHC-1 (major histocompatibility complex) genlerini eksprese etmemesi nedeniyle, bu hücrelerin lenfositlerce tanınmasından ve sitotoksik T hücreleri tarafından lizise uğratılmasından korunduğu düşünülmektedir.129-132 Bu nedenle, hematolojik malignensilerin aksine solid tümörler, immün sisteme karşı tamamen korumasız değildir.133 Bu faktör ve durumlara ek olarak, kemik iliği mikroçevresi, mikrometastatik hücrelerin hayatta kalması ve çoğalmasını etkilemektedir. Birçok büyüme faktörü ve hücresel integrinlerin ligandları, kemik iliğindeki normal hematopoietik hücrelerin yanı sıra tümör hücrelerine de modülatör etkilere sahiptir.134 Malign hücrelerle lokal çevre arasındaki bu etkileşim, gerçek erken metastatik hastalık ile kemik iliğine implante olmadan geçici tümör yayılımı arasında kritik rol oynamaktadır.129,135,136 Tümör hücrelerinin çoğu, kemik iliği stromasına uygun bir şekilde bağlanamamakta ve ölmektedir, hayatta kalanlar ise iyi diferansiye evrede kalmaktadır.134 Korah ve arkadaşları, uyku hali ve kemik iliğindeki meme kanseri hücrelerinin ölüme direncini açıklamak için bir in vitro model öne sürmüştür. Buna göre integrin alfa5-beta1fibronektin etkileşimi, fibroblast büyüme faktörü (FGF-2)’ ne duyarlı meme kanseri hücrelerinde kısmen fosfatidil-inositol 3-kinaz/Akt yolağının aktivasyonu, dormant tümör hücrelerinin hayatta kalmasını sağlamaktadır.134 29 Mikrometastatik hücreler G0 fazında dormant halde olmalarına rağmen, yeniden prolifere olabilme, büyüme ve metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle kanser rekürrensi için her zaman potansiyel bir tehdit oluştururlar. Bu olasılıkla, malign bir fenotipin oluşmasına ve kemik iliği mikroçevresinin spesifik selektif baskısının sonucudur.94,137,138 Bu görüş, yeni verilerle desteklenmektedir. DTC’nin proliferatif potansiyeli klinik sonucu belirler ve azalmış toplam sağkalımla ilişkilidir.108,115 Önceki bilgilere göre, karsinoma hücrelerinin invaziv özellik kazanmaları, başlıca epitelyalmezenkimal dönüşüm ve bazı integrin subünitleri ve laminin reseptörleri gibi bazı adezyon moleküllerinin ekspresyonunda değişikliklerle sağlanmaktadır.102,138,139 Metastatik meme tümörlerinde com1 olarak adlandırılan bir faktörün eksprese edildiği bulunmuştur. Bu molekül, büyümeye cevap olarak intrasellüler sinyal iletimine aracılık etmekte ve mikrometastatik hücrelerin implantasyonu ve uzak metastaz geliştirmelerini sağlamaktadır.135 Hematojen metastazın bir başka düzenleyicisi, transkripsiyon faktörü HIF-1a (hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 alfa)’dır. Bu faktör kemik iliğinin mikrometastatik tutulumu ile ilişkili görünmektedir.94 Kemik iliği mikroçevresi ile bu etkileşimlerin yanısıra yeni kan damarı oluşumu, DTC’nin daha primitif hale farklılaşmasını ve uzak metastaz gelişimini büyük ölçüde etkilemektedir.140-143 Bu farklılaşma sırasında, çeşitli transkripsiyon supresörleri (örneğin poliklonal grup protein EZH-2) aşırı eksprese edilirken, KİSS-1 ve NM23 gibi metastaz-supresör genlerin down regülasyonu söz konusudur.94,144,145 Mikrometastazın, primer tümörün progresyonu sırasında hangi evrede meydana geldiği de tartışma konusudur.146,147 Tümör hücresi yayılımının, gros olarak büyük bir primer tümörün gelişiminden önce, karsinogenezin erken dönemlerinde gerçekleştiği konusunda giderek artan kanıtlar vardır.127,148,148 Mikrometastatik hücreler, yüksek genetik heterojenite ve heterojen proliferatif potansiyele sahiptir. Primer tümörden erken evrede ayrılmaları ve kalan tümör dokusundan bağımsız gelişim göstermeleri nedeniyle, primer tümörlerine fazla benzerlik göstermezler.115,150 Bu genetik heterojenite karşılaştırmalı genomik hibridizasyon yöntemiyle ortaya koyulmuştur ve metastaz gelişimini azalttığı gösterilmiştir.137,151 Gangnus ve arkadaşları, DTC’de kopya sayısının büyük ölçüde değiştiğini ileri sürmüşlerdir. İleri evre kanserlerde kromozomal sapmaların stabilize olduğu düşünüldüğünde, mikrometastazların erken evrede gerçekleştiği daha olası görünmektedir.108,152 30 2.2.2. Mikrometastazın Prognostik ve Klinik Önemi Meme kanseri erken tanı ve tedavisindeki gelişmelere rağmen, halen yüksek morbidite ve mortalite oranına sahiptir. Erken evre hastalarda, konvansiyonel yöntemlerle gösterilemeyen gizli metastatik hücreler, uzak metastaz gelişimi ve kanser ilişkili ölümün en önemli nedenidir. Daha önceleri meme kanserinin ilk olarak lenf nodlarına metastaz yaptığı düşünülürken, günümüzde lokalize meme kanserli hastaların yaklaşık % 50’sinde hematojen yayılımın olduğu ileri sürülmektedir. Bu nedenle, primer lokorejyonel tedaviden önce kemik iliği mikrometastazının değerlendirilmesi, rekürrens riski yüksek hastaların belirlenmesi, adjuvan-neoadjuvan tedavi kararı ve tedaviye cevabın izlenmesi açısından önemlidir. Örneğin kemik iliği bulguları olmayan lenf nodu negatif erken evre hastalarda, tek başına cerrahi tedavi yeterli olmakta ve ilave adjuvan kemoterapiye nadiren gerek duyulmaktadır. Operabl meme kanserli hastalarda uzak metastaz riski; primer tümörün boyutu, aksiller lenf nodu tutulumu ve primer tümör markerleri gibi prognostik göstergelerle korelasyon göstermektedir. aksiller lenf nodu negatif hastalarda; tümör boyutu, HER2 pozitifliği, hormon reseptör durumu, lenfovasküler invazyon ve yüksek histolojik grade gibi faktörler, sistemik tedavi ihtiyacını ve rekürrens riskini belirlemek için kullanılmaktadır. Buna rağmen, lokalize hastalığı olan ve aksiller lenf nodu metastazı olmayan meme kanserli hastaların yaklaşık % 25’inde sistemik relaps gelişmekte; buna karşın aksiller lenf nodu metastazı olan hastaların en az % 30’unda primer tedaviyi takip eden 5-10 yıl içinde relaps gelişmemektedir.153-156 Bu gözlemler, tümör yayılımının önemli bir bölümünün, lenfojen yol ile birlikte ve bazı vakalarda lenfojen yoldan bağımsız olarak hematojen yolla olabileceğini akla getirmiştir. aksiller lenf nodu negatif meme kanseri hastalarının % 20-40’ında kemik iliğinde DTC saptanabilir.157 Günümüzde kullanılan prognostik faktörlerin, hastaların relaps riskini yeterli doğrulukla belirleyememesi nedeniyle, yeni prognostik parametrelere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, metastaz gelişiminden önce kemik iliğinde MRD’in değerlendirilmesi ile daha doğru risk sınıflaması yapılabilir, bu hücrelerin ortadan kaldırılması için ek konvansiyonel veya bu hücreleri hedefleyen yeni biyolojik tedaviler kullanılabilir. Tek merkezli, önemli sayıda hastayı kapsayan ve yeterli izlem süresi olan çalışmaların çoğunda, kemik iliği mikrometastazı ile prognoz arasındaki ilişki gösterilmiştir. Mansi ve arkadaşları, anti-EMA antikoru kullanarak, ortalama 12,5 yıllık 31 takip süresi sonrası, ilk tanı anındaki kemik iliği durumu ile uzak metastaz gelişimi ve toplam sağkalım arasında önemli bir prognostik ilgi bulmuştur.136 Diel ve Arkadaşları 727 hastayı kapsayan bir grupta, 36 ay takipten sonra, kemik iliği mikrometastazı ile hastalıksız ve toplam sağkalım arasındaki ilişkiyi göstermiştir. İTH’nin prognostik değeri; lenf nodu tutulumu, tümör boyutu ve grade’dan daha üstün bulunmuştur.158 Son dört prospektif çalışma toplam 2316 hastayı kapsamış ve klasik prognostik faktörlerden bağımsız olarak kötü prognoz ile ilişkisi gösterilmiştir.99,159-161 Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan 4703 hastayı kapsayan bir metaanalizde; evre I-II ve III operabl meme kanseri hastalarda, immünositokimyasal yöntemlerle saptanan kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 olarak bildirilmiştir. Bu çalışmaya alınan hastaların % 90’ı T1 ve T2 tümöre sahipti ve hastalarda uzak metastaz saptanmadı. % 58’i nod negatif ve % 70’i adjuvan kemoterapi almıştı. Kemik iliği mikrometastazı özellikle büyük tümör boyutu, yüksek tümör grade, lenf nodu metastazı varlığı ve hormon reseptör negatifliği ile ilişkili bulunmuştur. Bu hastalarda çok değişkenli analizde, kemik iliği mikrometastazları diğer prognostik faktörlerden bağımsız olarak, azalmış genel ve meme kanseri spesifik sağkalım oranlarıyla ilişkili bulunmuştur.158 Bugüne kadar başlıca immünositokimyasal yöntemlerin kullanıldığı çalışmalarda, kemik iliğinde DTC’nin bulunmasının toplam ve hastalıksız sağkalımın bağımsız bir göstergesi ve kötü prognostik faktör olduğu ortaya koyulmuştur.3,99,159,162168 Bununla beraber, prognozla ilişkisi gösterilemeyen çalışmalar da vardır.169-170 Kemik iliği aspirasyon teknikleri, materyallerin hazırlanması, kullanılan antikorlar, zenginleştirme yöntemlerinin kullanılıp kullanılmaması, analiz edilen hücre sayıları, hastaların evreleri ve takip süreleri arasındaki farklılıklar nedeniyle çelişkili sonuçlar ortaya çıkmaktadır. Tablo 5’de erken evre meme kanserli hastalarda immünositokimyasal yöntemle belirlenmiş kemik iliği mikrometastazlarının prognozla ilişkisini gösteren başlıca çalışmaların listesi gösterilmiştir. 2.2.3. Mikrometastazın Klinik ve Tedaviye Yanıtın İzlenmesindeki Yeri Kemik iliği mikrometastazının prognostik önemine ek olarak, tümör hücrelerinin fenotiplerinin belirlenmesi sayesinde tedavinin etkinliğinin izlenmesi için bir araç olarak kullanılabileceği ileri sürülmüştür. Meme kanserli hastaların evrelendirilmesi ve tedavi seçimi üzerine etkisi tartışılmaktadır. Ayrıca primer tedaviden sonra kemik iliği 32 mikrometastazlarının eradike edilememesi, adjuvan tedavinin uzatılması veya farklı tedavi yöntemleri için bir endikasyon olarak değerlendirilmektedir. Tablo 5. Erken evre meme kanserli hastalarda immünositokimyasal yöntemle belirlenmiş kemik iliği mikrometastazlarının prognozla ilişkisi Prognostik değeri Çalışma (yıl) [referans] Mikrometastaz oranı (%) (hasta sayısı) Schlimok ve Ark. (1987) [171] 18 DDFS (155) Cote ve Ark. (1991) [172] 37 DFS, OS (49) Harbeck ve Ark. [173] 38 DFS, OSa (100) Diel ve Ark. (1996) [158] 31 DFSa, OSa (727) Molino ve Ark. (1997) [174] 31 İlişki bulunamadı (109) Mansi ve Ark. (1999) [156] 25 DFS, OS (350) Braun ve Ark. (2000) [99] 36 DFSa, OSa (552) Gebauer ve Ark. (2001) [159] 42 DFSa, OSa (393) Gerber ve Ark. (2001) [160] 31 DFSa, OSa (484) Wiedswang ve Ark. (2003) [161] 13 DDFSa, BCSSa (817) Braun ve Ark. meta-analiz (2005) 31 DDFSa, OSa (4,703) [3] a: Çok değişkenli analiz ile doğrulanmış. BCSS: Meme kanseri spesifik sağkalım DDFS: Uzak metastazsız hastalıksız sağkalım DFS: Hastalıksız sağkalım OS: Toplam sağkalım Üçten fazla metastatik lenf nodu ve kutanöz lenf damarlarına yaygın invazyonu olan yüksek riskli meme kanserli hastaları kapsayan bir çalışmada, hastalar taksan veya antrasiklin içeren kemoterapileri almadan önce ve kemoterapi sonrası kemik iliği mikrometastazı açısından değerlendirilmişlerdir. Hastaların kemoterapi öncesi ve sonrası kemik iliği bulgularının değişmediği saptanmıştır.175 Ayrıca kemik iliğinde tümör hücrelerinin varlığı özellikle kötü prognoz ve tedaviye heterojen cevabın bir göstergesiydi. İki pilot çalışmada, yüksek doz kemoterapi [ifosfamid, karboplatin, epirubicin (n=18) veya vinblastin, ifosfamid, karboplatin (n=10)] sonrası otolog kök hücre nakli yapılan hastalar değerlendirilmiştir. Bu iki hasta grubunda tedavi tamamlandıktan ve hastaların çoğunda tam klinik remisyon elde edildikten sonra yapılan kemik iliği analizlerinde, sırasıyla ilk grupta 15 hastada (% 83) ve ikinci grupta 3 hastada (% 30) mikrometastaz saptanmıştır.95 Bu bulgular, klinik ile kemik iliği mikrometastazı tarafından belirlenen relaps riski arasındaki çelişkiyi göstermektedir. Bu gözlem, yüksek doz kemoterapinin tedavideki yetersizliğini açıklamaktadır. Agresif sistemik tedavi sonrası mikrometastaz varlığının devam etmesi, etkinliği kanıtlanmış tamamlayıcı stratejilerin ve hücre siklüsünden bağımsız olarak tümör hücrelerine seçiciliği olan tedavilere ihtiyacı ortaya koymaktadır. 33 Daha sonra yapılan çalışmalarda da, uzak metastaz bulgusu olmayan erken evre meme kanserli incelenmiştir. 176-178 hastalarda kemik iliği mikrometastazı ve prognoz ilişkisi İlk çalışmada, T1-T2, N0-N3 M0 evre 228 hastadan kemik iliği alınmış. Ortalama 21,3 ay takipten sonra tek değişkenli ve çok değişkenli analizde mikrometastaz varlığı ile artmış relaps ve kanser ilişkili ölüm riski arasındaki ilişki gösterilmiştir. Kemoterapi sonrası mikrometastaz saptanmayan hastalar anlamlı derecede uzun yaşama sahipti.(162,1 aya karşı 98,7 ay) Çok değişkenli cox-regresyon analizinde kalıcı mikrometastaz varlığı, azalmış hastalıksız sağkalımla ilişkili bulunmuştur. İkinci çalışmada, Wiedswang ve arkadaşları, primer tanıdan 3 yıl sonra kemik iliğinde sitokeratin pozitif tümör hücrelerinin bulunmasının prognozla ilişkisini ortaya koymuştur.(n=356)207 Hastaların % 15’indemikrometastaz saptanmış ve ortalama 66 ay takipten sonra, hem hastalıksız sağkalım hem de toplam sağkalım için bağımsız güçlü bir prognostik gösterge olduğu belirlenmiştir. Çok değişkenli analizde; başlangıç kemik iliği durumu, aksiller LN durumu, tümör boyutu, Her2/neu aşırı-ekspresyonu, vasküler invazyon ve takip kemik iliği durumu, meme kanseri spesifik ölüm oranı ile ilişkili bulunmuştur. Bu hücrelerin non-proliferatif durumda olması nedeniyle standart tedaviye dirençli olmaları, hücre siklüsünden bağımsız, monoklonal antikorlara dayanan tedavi rejimlerinin geliştirilmesi için bir seçenek oluşturmaktadır.179,180 Sitokeratin pozitif meme kanser hücrelerinde Ki-67 proliferasyon markeri negatif bulunmuştur.179 Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir pilot çalışmada, ileri evre 10 hastada, tek doz 500 mg. edrecolomab tedavisi uygulamıştır. Edrecolomab, meme tümörlerinde yaygın olarak eksprese edilen epcam’a (epitelyal hücre adezyon molekülü) karşı kullanılan monoklonal antikordur. Çalışmada, edrecolomab tedavisinden 5-7 gün sonra yapılan kontrol kemik iliğinde, tedavi öncesine göre tümör yükünde belirgin azalma saptanmış ve 4 hastada CK+/epcam+ metastatik hücrelerin tamamen eradike edildiği gözlenmiştir. Ancak bu tedavi hastaların klinik sonucunda herhangi bir değişikliğe neden olmamıştır. Bu sonuç, antikorun tümör kitlesindeki fizyolojik bariyerlerden yeterince penetre olamamasına bağlanmıştır. Bununla beraber edrocolomab tedavisinin adjuvan kemoterapi rejimlerinde daha etkin olduğu gösterilmiştir. Dukes C kolorektal kanserlerin adjuvan tedavisinde 34 plaseboya karşı edrecolomabın klinik yararı kanıtlanmıştır.181 Epcam kolorektal kanserlerde homojen olarak eksprese edilmektedir. Hastalara toplam 5 doz edrecolomab tedavisi uygulanmış ve hastalar 7 yıllık takipten sonra değerlendirildiğinde edrecolomab alan grubun kontrol grubuna göre % 30 daha az mortalite ve uzak metastaz oranına sahip olduğu gözlenmiştir. Sonraki faz III çalışmada ise, 2761 evre III kolon kanserli hastada, adjuvan kemoterapiye edrecolomab ilavesinin hayatta kalım üzerine bir etkisi olmadığı rapor edilmiştir. Edrecolomab monoterapisi alan hastalar, kombine kemoterapi alan hastalara göre daha kısa toplam ve hastalıksız sağkalım oranlarına sahipti.182 Primer kolon ve pankreas tümörlerinde epcam sık eksprese edilmesine karşın, erken evre meme kanserli hastaların kemik iliğindeki epcam (+) mikrometastatik tümör hücreleri sıklığı % 7 bulunmuştur. Ancak ileri evre meme kanserlerinde bu oran % 68’e çıkmaktadır.183 Bu nedenle, edrecolomabın bazı çalışmalarda etkinliğinin düşük saptanması, uygun hastaların seçilememesine ve afinitesi daha fazla olan yeni ajanların ek fayda sunmalarına bağlanabilir. Seçilen hasta popülasyonuna uygun tedavi seçenekleri göz önünde bulundurulmalıdır. Örneğin mikrometastatik hücrelerin fenotipinin belirlenmesi gelecekte ümit verici tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. İmmünofloresan çift boyama veya floresan in situ hibridizasyon (FİSH) gibi farklı teknikler, mikrometastatik hücrelerin antijenik profilini göstermek amacıyla kullanılabilir. Trastuzumab (herceptin) gibi antikorlara dayanan tedavi yöntemleri daha efektif olabilir.184 Primer tümörlerinde hormon reseptörleri negatif olsa da, mikrometastatik hücrelerde hormon reseptörleri pozitif olabileceği için, adjuvan endokrin tedavi kararı için bu hücrelerin hormon reseptör analizinin yapılması uygun bir yaklaşımdır.185 Zolendronik asit gibi bifosfonatların da bu hücrelerin elimine edilmesindeki etkinliği gösterilmiştir.186-188 2.2.4. Mikrometastatik Kanser Hücrelerinin Moleküler ve Fonksiyonel Tanımlaması DTC’nin genetik özelliklerinin tanımlanması, kemik iliği gibi uzak bir organda onlara erken dönemde yayılışını, kemik iliğine seçiciliğini ve burada hayatta kalmalarını sağlayan biyolojik özelliklerinin belirlenmesini sağlar. Kemik iliğindeki DTC’ler, oldukça geniş bir fenotipik heterojenite gösterir; özel antijenler, HER2/neu gibi proto- 35 onkogenler bu hücrelerde sıklıkla eksprese edilmektedir. HER2/neu, DTC’nin çok agresif bir alt tipini tanımlamakta ve meme kanserinin sistemik tedavisinde biyolojik hedef olarak önem kazanmaktadır.189,190 Klein ve arkadaşları, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) yöntemini kullanarak, klinik olarak uzak metastaz bulguları olmayan meme kanserli hastaların kemik iliğinde, genetik olarak heterojen özellikleri olan sitokeratin-pozitif hücreleri göstermiştir.191 Şaşırtıcı olarak, çalışmada bu hücrelerin kendi primer tümörlerine çok az benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Bu bulgular, yayılan kanser hücrelerinin, onların primer tümörlerinden erken bir evrede ayrılmış olabileceği şeklinde yorumlanabilir. Bu hipotez, M0 hastalardaki çok az sayıdaki tek metastatik hücrelerin TP53 mutasyonlarını içermesiyle de desteklenmektedir.191,192 Sonuç olarak, bu hücrelerin bir kısmı primer tümör hücrelerinden bağımsız olarak yayılabilir ve bu mikro-evrim, kemik iliği mikroçevresinin spesifik selektif baskısı altında sürdürülebilir.193 Açık metastazların prekürsörü olan bu hücrelerin tanınması, mikrometastaz araştırmalarının gelecekteki büyük tartışmalarından biri olacaktır. Şimdiye kadar, M0 evre hastalarda erken metastatik hücrelerdeki hangi genomik sapmaların daha sonraki uzak metastazlarla ilişkili olduğu açık değildir.194 Deneysel veriye göre, tek hücre evresinden solid metastazlara ilerleyen hücre sayısı muhtemelen çok azdır.195 2.2.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle İlgili Gen Ekspresyon Paternleri ve Yolaklar Meme tümörlerinde hematojen yayılımı belirleyen genler araştırılmaktadır. Ancak, tümör hücre yayılmasının ilk evresini, özel genlerin aracılığıyla mı rasgele bir olay mı olduğu tartışmalıdır. Son olarak geliştirilen cDNA-array tekniği, her tümör örneğinde eşzamanlı olarak binlerce genin ekspresyonunu belirleyen, bu konuyu araştırmak için değerli bir araç olduğu görünmektedir. Microarray yöntemiyle gen ekspresyon profilinin belirlenmesi, meme kanserlerinin moleküler portrelerinin ve subgruplarının tanımlanmasını (örneğin bazal-benzeri grup, normal meme-benzeri grup ve luminal grup), meme karsinomlarının sınıflandırılmasını ve klinik sonucu hakkında prognostik bilgi elde edilmesini sağlamaktadır.196-198 Son olarak 2003 yılında Woelfle ve arkadaşları, metastatik kaskatın daha erken basamaklarında, kemik iliğinde DTC’nin varlığı veya yokluğuyla ilişkili bilgi elde 36 etmek için primer meme tümörlerinin gen ekspresyon analizini yapmıştır.199 Küme analizi ile eksprese edilen genlerin görüntülenmesi, tümörlerin kemik iliği durumunu tam olarak yansıtan iki ayrı gen ekspresyon profiline sahip olduğunu göstermiştir. Bu analizin dikkat çekici bir sonucu da, kemik iliği tutulumu olan tümörlerin çoğunda, gen ekspresyonunun baskılanmış olmasıdır. Sonuç olarak, birçok genin baskılanması, tümör progresyonu için önemli bir mekanizma olabileceği yeni görüşlerle de desteklenmektedir.200 Tümör hücrelerinin farklılaşması sürecinde, transkripsiyon baskılayıcılar (örneğin son olarak tanımlanan polycomb grup proteini EZH2) aşırı eksprese edilebilmektedir, bunun sonucu olarak metastaz-supresör genler dahil birçok gen baskılanmaktadır.201 Ayrıca KİSS-1 ve NM23 gibi iki metastaz supresör gen tanımlanmış ve bunların kemik iliği pozitif tümörlerde, kemik iliği negatif tümörlere göre daha az eksprese edildiği gösterilmiştir.199 Kemik iliği pozitif tümörlerde, sitokeratinlerin down-regüle edildiği gösterilmiştir. Bu da, bu yapısal proteinlerin metastaz supresör olarak rol oynayabileceğini akla getirmiştir. Örneğin meme kanserinde yükselmiş sitokeratin 18 düzeyleri, azalmış metastatik relaps oranları ile ilişkilidir.202 Solid tümörlerde mevcut verilere ve ekspresyon profili çalışmalarına dayanarak, meme tümör hücrelerinin hücre iskeleti kompozisyondaki değişimler, epitelyal tümör hücrelerinin mobil hale gelmesiyle sonuçlanabilir.197,203,204 Kemik iliği mikrometastazı ile ilişkili olduğu belirlenen yolaklardan biri, metastatik yayılım için potansiyel gücü olduğu bilinen hipoksi ile indüklenen faktör 1alfa (HIF-1 alfa) yolağıdır. En önde gelen faktör, hipoksi ile ilgili çeşitli süreçlerin (örneğin, proliferasyon, anjiyogenez ve hücre ölümü) transkripsiyon faktörü HIF-1 alfa’dır ve kemik iliği pozitif tümörlerde up-regüle edildiği bilinmektedir. Kemik iliği pozitif tümörlerde, HIF 1-alfa’nın baskılanmasından sorumlu genlerin downregülasyonu (örneğin VHL ve cullin2) tümör hücrelerinde HIF 1-alfa’nın birikmesine neden olabilir. HIF 1-alfa protein düzeyleri, meme kanserlerinin erken evrelerinde yüksektir, bu nedenle meme tümör hücrelerinin erken metastatik yayılımına katkıda bulunabilmektedir.205 Staller ve arkadaşları HIF 1-alfa’nın, CXCR4’ü aktif hale getirdiğini göstermiştir.206 CXCR4 ligand CXCL12’yi eksprese eden ve hücrelerin uzak organlara (kemik iliği, lenf nodu, akciğer ve karaciğer gibi) göçünü uyaran ve kemotaksisinde rol oynayan G-proteinine bağlı bir kemokin reseptörüdür. Bu veriler, 37 HIF 1-alfa yolağı tümör hücrelerinin hematojen yolla organ-spesifik yayılımına katkı sağladığını göstermektedir.207 Kemik iliği mikroçevresinin DTC’yi farklılaşmamış durumda tuttuğu düşünülmektedir. Bu hücrelerin hayatta kalması ve/veya daha sonra uzak organlara metastaz yapabilmesinin mikroçevre koşulları tarafından belirlendiği düşünülmektedir. Bu hipotez metastatik meme kanseri için kabul edilirken kolon kanseri için henüz gösterilememiştir. Tümör hücreleri daha sonra yayıldığı karaciğer ve akciğer gibi organlarda daha kolay büyüme gösterebilir. Bu görüş Paget’in seed ve soil (tohum ve toprak) hipoteziyle uyumludur.208,209 C-DNA-array yöntemiyle primer tümörler metastatik kapasitelerinin olup olmamasına göre iki gruba ayrılmaktadır ve primer tümördeki metastatik klonların relatif olarak daha fazla sayıda olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, metastatik genotip ve fenotipin tümör gelişiminin geç evresinde kazanıldığını ve bu metastatik subklonların primer tümörün çok küçük bir subpopülasyonunu oluşturduğunu savunan klasik görüşlerle tezat oluşturmaktadır.197,201 Alternatif görüşe göre, tümör hücreleri metastatik kapasitelerini sağlayan genetik değişimleri karsinogenezisin erken safhalarında kazanmaktadır ve metastatik potansiyeli olan bu hücreler primer tümörün göreceli olarak büyük bir kısmını temsil etmektedir.209,210 Bu durum ayrıca erken evre meme kanserli hastaların kemik iliğinde gizli metastatik hücrelerin varlığını da açıklayabilir. 2.2.6. Kemik İliği Mikrometastazının Belirlenmesi İçin Kullanılan Yöntemler Erken tümör yayılımı genellikle klasik histopatolojik analizler (kemik iliği biyopsisi) veya yüksek rezolüsyonlu görüntüleme yöntemleriyle tespit edilememektedir. Kemik iliği biyopsi serilerinde mikrometastaz bulunma oranı % 4’den azdır. Meme ve diğer solid tümörlerde kemik iliği mikrometastazlarını belirlemek için birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Lenf nodları, kan ve kemik iliğinde çok az sayıda ve tek tek bulunan bu hücreleri bulabilmek için sensitif immünositokimyasal, flovsitometrik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir. Kullanılan yöntem, kanser hücrelerini normal hematopoietik hücrelerden ve kemik iliği alınırken ciltten kontamine olan epitelyal hücrelerden ayırt edebilmelidir. Kemik iliği, kan ve lenf nodlarında mikrometastatik 38 hücrelerin belirlenmesi için yapılan çalışmalar, kullanılan yöntemler ve mikrometastaz bulunma yüzdeleri aşağıdaki tablo 6’da özetlenmiştir. Tablo 6. Meme kanserli hastalarda kemik iliğinde, kanda ve lenf nodlarında minimal rezidüel hastalık ile ilgili çalışmaların özeti. Marker Çalışma (yıl) [Referans] Doku Teknik Hasta sayısı Mikrometastaz oranı (%) Datta ve ark. 1994 (211) Kİ CK19 RT-PCR 34 26 Fields ve ark. 1996 (212) Kİ CK19 RT-PCR 83 71 Vannucchi ve ark. 1998 (213) Slade ve ark. 1999 (214) Kİ CK19 RT-PCR 33 48 Kan 61 Kİ RT-PCR İSK İSK 23 Braun ve ark. 2000 (99) CK19/ CK CK 552 36 Gerber ve ark. 2001 (160) Landys ve ark. 1998 (215) Funke ve ark. 1996 (216) Mathieu ve ark. 1990 (217) Singletary ve ark.1991 (218) Cote ve ark. 1991 (219) Kİ Kİ Kİ Kİ İSK İSK İSK İSK 484 128 234 93 31 19 38 1 İSK 71 38 İSK 49 37 Harbeck ve ark. 1994 (173) Diel ve ark. 1996 (190) Mansi ve ark. 1999 (154) Porro ve ark. 1988 (220) Salvadori ve ark. 1990 (221) Redding ve ark. 1983 (222) Berger ve ark. 1988 (223) de Mascarel ve ark. 1992 (224) Cote ve ark. 1999 (172) de Mascarel ve ark. 1992 (224) Cote ve ark. 1999 (172) Gerber ve ark. 2001 (160) Bussolati ve ark. 1986 (225) Noguchi ve ark. 1994 (226) Schoenfeld ve ark. 1994 (227) Zhong ve ark. 2000 (228) Kİ İSK 100 38 Kİ Kİ Kİ Kİ CK CK CK18 MUC/ CK MUC/ CK MUC/ CK MUC/ CK MUC MUC MUC MUC İSK İSK İSK İSK 727 350 159 121 43 25 16 17 Kİ MUC İSK 110 31 Kİ LN MUC - İSK H&E 285 1.680 27 7 LN LN CK İHK İHK 736 129 20 10 LN LN LN İHK İHK İHK 736 484 50 20 11 23 LN CK CK MUC/ CK MUC-1 RT-PCR 15 30 LN CK19 RT-PCR 75 31 Kİ CK19 26 87/81 Berois ve ark. 2000 (229) Kİ 42 48/29 Berois ve ark. 2000 (229) Kan CK19/ CEA CK19/ CEA RT-PCR İSK RT-PCR RT-PCR 37 35/3 Kİ Kİ 39 Tablo 6’ın devamı de Cremoux ve ark. 2000 (230) Kahn ve ark. 2000 (231) Fabisiewicz ve ark. 2004 (232) Kan MUC-1 Kan Kan CK19 MAM/ βhCG ve CK19 CK19/ MAM ve CK19 MAM A/B CK19 Benoy et al. 2006 (233) Kİ Janku ve ark. 2004 (234) Kİ Stathopoulou ve ark. 2003 (235) Han ve ark. 2003 (236) Silva ve ark. 2001 (237) Zach ve ark.2002(238) Lin ve ark. 2003 (239) Lin ve ark. 2003 (239) Kan LN Kan Kan Kan Kan Ooka ve ark 2001 (240) Aihara ve ark. 2000 (241) Silva ve ark. 2001 (237) Kİ LN Kan İMS ve RT-PCR RT-PCR RT-PCR MAM A MAM MAM MAM MAM/ CEA MAM A MAM B CK19/ MAM A MAM A 94 37 109 55 44 38/38/38 İSK/RTPCR 25 62/40/80 RT-PCR 34 12/0 RT-PCR 124 35 RT-PCR RT-PCR RT-PCR RT-PCR RT-PCR 70 78 59 111 33 84 24 34 37 54/51 RT-PCR RT-PCR RT-PCR 111 111 45 28 23 49/60 Cerveira ve ark. 2004 Kan RT-PCR 54 41 (242) Marchetti ve ark. 2001 LN MAM A RT-PCR 248 53/41 (243) CEA βhCG, β-human koryonik gonadotropin; Kİ, kemik iliği; CEA, karsino embriyonik antijen; CK, sitokeratin; H&E, hematoksilen-eozin; MAM, mammaglobin; İSK, immünositokimya; İHK, immünohistokimya; İMA, immünomanyetik ayırma; LN, lenf nodu; MUC, müsin; RT-PCR, reverse transcription–polymerase chain reaction. 2.2.6.1. İmmünositokimyasal Yöntemler Mikrometastatik hücrelerin epitelyal veya tümör ilişkili antijenlerini belirleyen monoklonal antikorlarla boyanarak tespit edildiği, bugüne kadar en sık kullanılan yöntemdir.159,215,216,244 Sitokeratinler, lenf nodu, kan veya kemik iliği gibi mezenkimal dokularda epitelyal tümör hücrelerini tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan markerlerdir.3 Bununla beraber farklı boyama teknikleri, değerlendirilen hücre sayısı, kullanılan antikor ve zenginleştirme metodları, yöntemin özgüllüğünü önemli ölçüde etkilemektedir. Yapılan çalışmalarda immünositokimyasal yöntemlerle kemik iliği mikrometastazı bulunma oranının, kullanılan antikora bağlı olarak % 4-48 arasında değiştiği bildirilmiştir.245,246 Bu nedenle uluslararası organizasyonlar, immünositokimyasal yöntemlerin prospektif çalışmalarla değerlendirilerek standart hale getirilmesini önermektedir.247-249 40 İmmünositokimyasal analizler genellikle, dansite gradient santrifüjü, immünomanyetik işlemler veya hücre filtrasyon metodları gibi zenginleştirme yöntemleriyle birlikte kullanılmaktadır.250-253 Son zamanlarda daha iyi zenginleştirme elde edebilmek için geliştirilmiş dansite gradient ve antikor-bağlı manyetik partiküller kullanılmıştır.254-257 Mononükleer hücre fraksiyonunu izole etmek için kullanılan yeni zenginleştirme tekniklerinin standart dansite gradient yöntemine üstünlüğü gösterilememiştir. İmmünositokimyasal yöntemle boyanmış lamların mikroskopda taranması, manuel olarak ışık mikroskobuyla veya imaj-analiz tarama sistemleri ile yapılabilir. Yeni otomatik sistemlerin kullanımı sonuçların daha hızlı elde edilmesini ve verimliliği sağlamaktadır.255,258-262 CellSearch™ system, otomatik immünomanyetik zenginleştirme ile kan örneklerinde sitokeratin pozitif hücreleri saymak için giderek daha fazla kullanılan bir yöntemdir. Kemik iliğine dissemine olmuş tümör hücrelerini bulmak için farklı monoklonal ve poliklonal antikorlar veya antikor karışımları kullanılmıştır. Kullanılan antikorlar; EMA (epitelyal hücre yüzey antijeni)3, TAG12 (tümör-ilişkili glikoprotein)215 ve sitokeratinlere (epitelyal hücre iskeletinin başlıca yapısal proteinleri)160,216,244 karşı olabilir. Bununla beraber, hem immünositokimyasal hem de moleküler yöntemlerin klinikle ilgisi, metodolojik farklılıklar nedeniyle tartışmalı yorumlara sebep olmuştur. Ayrıca, sitokeratin 19 (CK19), epitelyal membran antijen (EMA) ve müsin-1 gibi bazı antijenlerin, eritroblastlar gibi hematopoietik prekürsör hücrelerle çapraz reaksiyon vermeleri nedeniyle, marker ve antikor seçilirken yanlış pozitiflik sorunu göz önünde bulundurulmalıdır. Normal mononükleer hücrelerde polimorfik epitelyal müsinlerin (PEM) yanlış pozitiflik oranı % 2-10’dur. Sitokinlere yönelik antikorlar oldukça spesifiktir, ancak normal bir kemik iliğinde çok nadiren plazmasitoid hücrelerde yanlış pozitiflik görülebilir. Yanlış pozitifliğin dışlandığı durumlarda ise, henüz tanı koyulmamış başka bir epitelyal tümörün varlığı araştırılmalıdır. Farklı sitokeratin antijenlerine karşı bazı antikorların kombinasyonları veya farklı sitokeratin proteinlerinin ortak epitopunu tespit edebilen antikorlar (örneğin sitokeratin 8, 18 ve 19’u tanıyan A45B/B3), tek sitokeratin proteinini hedefleyen monospesifik antikorlara (örneğin sitokeratin 18’i tanıyan sitokeratin 2) göre daha üstün görünmektedir.3,246,247 Çünkü solid tümör hücreleri, önemli derecede antijenik heterojeniteye sahiptir. Kemik 41 iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için en sık A45B/B399,115,246,263-265 ve AE1/AE3161,177,266 kullanılmıştır ve her ikisininde de yanlış pozitiflik oranları düşüktür. A45B/B3’ün kullanıldığı çalışmalarda özgüllüğü ve duyarlılığı ispatlanmıştır (Yanlış pozitiflik oranları % 5’den azdır). AE1/AE3 ve CAM 5.2 gibi pansitokeratin antikorları, immünohistokimyasal yöntemlerle lenf nodlarında mikrometastazın belirlenmesi için kullanılmıştır. Bu yöntemin doğruluğu için en az 2x106 mononükleer hücrenin değerlendirilmesi gereklidir. Bu yaklaşımla, milyonlarca hematopoetik hücre içinde tek bir tümör hücresi bulunabilir ve halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Bu yaklaşımın bir avantajı da, tümör hücrelerinin moleküler düzeyde daha iyi tanımlanması ve morfolojik analizinin yapılabilmesidir. Ayrıca bu yöntem hücrelerde c-erb-B2 gibi önemli biyolojik markerlerin ekspresyonunun belirlenmesine yardımcı olmaktadır (c-erb-B2 gen amplifikasyonu FİSH yöntemiyle kombine edilerek belirlenmektedir). Bununla beraber sitokeratinler gibi hücre içinde bulunan hedeflerin boyanması için, antikorun hücreye permeabilizasyonu gereklidir. Bu işlem hücrelerin canlılığını yitirmesiyle sonuçlanabilir ve bu yöntemle hücrelerin ölü veya canlı olduğunu tespit etmek imkânsızdır. Ayrıca hematopoetik hücreler direk olarak alkalen fosfataza karşı reaktif olabilir veya endojen peroksidaz üretebilir. Kronik inflamasyon gibi durumlarda veya anormal plazma hücrelerinin varlığında, yüzeylerindeki kappa ve lambda hafif zincirler alkalen fosfataz ile reaksiyona girerek, nonspesifik boyanmalarına neden olabilir. Eğer bu enzimler tam olarak bloke edilmezse, alkalen fosfataz veya peroksidaza dayalı metotlarda yanlış (+) sonuçlar elde edilebilir.246,267,268 İmmünositokimyasal yöntem, rutin uygulama açısından zaman alıcı, pahalı ve yorumlayan kişiye bağlı olarak sonuçları değişkenlik gösterebilen bir yöntemdir. Kalitatif flovsitometri ise immünositokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, yüksek duyarlılıkla tümör yükünü belirlemek için kantitatif ölçümlerin yapıldığı, rezolüsyonu iyi, hızlı, tekrar edilebilir ve istatistiksel olarak daha güvenilir bir yöntemdir.269 2.2.6.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Kemik iliğinde mikrometastatik tümör hücrelerini bulmak için, moleküler yöntemler yaygın olarak kullanılmıştır. PCR kalitatif ve kantitatif olarak, tümör hücrelerinin genetik (allel-spesifik ekspresyon, mikro-satellit instabilite, heterozigosite 42 kaybı) ve epigenetik sapmalarının (metilasyon durumu) belirlenmesi ve özelliklerinin ortaya konması için üzerinde çalışılan bir yöntemdir. Bu araştırmalara onkogen veya tümör supresör genlerdeki tümör-ilişkili nokta mutasyonları da dahildir. Ayrıca tümörler arasındaki genetik varyasyonlar bu yöntemle karşılaştırılabilir. Örneğin, TP53 geni, P53 proteinini kodlamaktadır. Meme tümörlerinin % 25’inde mutasyona uğramıştır, ancak bu gende 1400’den fazla mutasyon bildirilmiştir.268 PCR yöntemiyle plazmadaki serbest DNA bulunabilir. Meme kanserinde spesifik genlerin (ESR1, APC, HSD17B4, HIC1, RASSF1A) DNA’sındaki metilasyon analizininin prognostik değeri gösterilmiştir. Örneğin RASSF1A metilasyonunun ölçümü, adjuvan tamoksifen tedavisinin etkinliğini izlemek için önemlidir. Ancak PCR’ın burada kullanımı, düşük özgüllüğü nedeniyle sınırlıdır.269 Kemik iliğinden PCR ile nükleik asit amplifiye edilebilir, böylece heterojen bir hücre popülasyonu içinde yüksek bir duyarlılıkla çok az sayıdaki tümör hücreleri bulunabilir. Bununla beraber, tümör hücrelerinin DNA ve mRNA ekspresyon paternleri, çevrelerindeki hematopoetik hücrelerden ayırt edilmeleri için farklı olmalıdır. Meme karsinomları DNA seviyeleri genetik olarak tamamen heterojendir, genel olarak uygulanabilir bir DNA markeri yoktur. Bu nedenle, meme karsinomlarında moleküler tanısal yöntemler geliştirmek için araştırmacılar genellikle RNA markerlerini kullanmıştır. Dissemine olan tümör hücreleri bulabilme duyarlılığını artırmak açısından, tümör-spesifik mRNA markerlerinin kullanıldığı çok markerli yaklaşımlar, tek markerli yöntemlere göre daha üstündür. Çünkü mikrometastatik hücrelerde mRNA ekspresyonu önemli farklılıklar göstermektedir. Bu yaklaşımla yanlış pozitiflik oranları azaltılırken, yöntemin duyarlılığı artırılır.270,271 Sitokeratin 18, sitokeratin 19, sitokeratin 20, müsin-1 ve karsino-embriyojenik antijen gibi birçok transkript; tümör spesifik markerler olarak değerlendirilmiştir.272,273 Ancak, bu transkriptlerin çoğu, RT-PCR ile normal kemik iliği, kan ve lenf nodlarında da saptanabilir. Ayrıca bu yöntemle canlı-ölü hücrelerin ayrımı ve hücrelerin morfolojik analizi yapılamamaktadır. Önemli bir nokta da, mikrometastatik tümör yükü hakkında net bilgi elde edilememesidir.274-276 Analiz öncesi örneklere karışan normal hücre fraksiyonunun azaltılması (örneğin, granülositler sitokeratin 20 eksprese etmektedir) veya cut-off değeri iyi belirlenmiş kantitatif RTPCR yönteminin kullanılması, bu problemin çözülmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, 43 mRNA markeri ekspresyonu down-regüle edilebilir, bu durumda çok parametreli RTPCR kullanılması daha uygun bir yöntemdir.277,278 Bununla beraber birkaç çalışmada, RT-PCR yönteminin, 107 normal hücre içinde tek bir tümör hücresini bulacak hassasiyette olduğu ve immünositokimyasal yönteme üstün olduğu ileri sürülmüştür.211,279-281 Bu çalışmalarda kullanılan markerler immüsitokimyasal metodlarla benzerdir ve genellikle sitokeratin 19 kullanılmıştır. Smith ve arkadaşları, periferik kanda immünositokimyasal ve PCR yöntemini birlikte değerlendirmiştir. PCR yöntemiyle hastaların % 50’sinde, immünositokimyasal yöntemle ise hastaların % 42’sinde pozitiflik saptamışlar ve bu nedenle PCR yönteminin daha hassas bir yöntem olduğunu ileri sürmüşlerdir.282 2.2.6.3. Enzim-Bağlı İmmunospot (ELİSPOT) Teknolojisi Hem immünositokimya hem de RT PCR yönteminin canlı ve apopitotik hücreler arasında ayrım yapamaması nedeniyle, son zamanlarda mikrometastatik hücrelerin analizi için bu önemli farkı ayırt etmeye olanak tanıyan yeni bir teknik geliştirilmiştir.283 ELİSPOT tekniği spesifik marker proteinlerin sekresyon veya aktif salınımını kullanan enzim-bağlı immünospot teknolojisinin adapte edilmiş şeklidir. ELİSPOT sadece canlı tümör hücrelerinin bulunmasını sağlayabilir ve protein sekresyonu tek bir hücre düzeyinde belirlenebilir.284 Primer tümörden köken alan dolaşımdaki ve kemik iliğindeki mikrometastatik hücrelerin bulunması için, MUC1 ve CK19 marker proteinleri olarak kullanılmaktadır.285 MUC1-sekrete eden dolaşımdaki tümör hücreleri, analiz edilen bütün metastatik meme kanserli hastalarda bulunmuştur, ancak bu hücreler, sağlıklı kontrol grubunda gözlenmemiştir. Bu yöntemle MUC1 ve CK19 sekrete eden hücrelerin sayılması yoluyla, uzak metastazı olan meme kanserli hastaların % 90’ında, uzak metastazı olmayan hastaların ise % 54’ünde kemik iliğinde mikrometastatik hücreler tespit edilmiştir.285 Bu veriler yeni EPİSPOT teknolojisinin, yüksek duyarlılık ve özgüllüğünü göstermiştir, bu nedenle erken metastatik yayılımın biyolojisinin anlaşılması için umut vadeden bir yöntem gibi gözükmektedir. 44 2.2.6.4. Flovsitometrik Yöntem Flovsitometrik yöntem, kan ve kemik iliğindeki göreceli olarak çok az sayıdaki kanser hücrelerini bulmak için geliştirilmiştir.286-288 Bu yöntem özellikle 106 hücre içinde tek bir hücreyi belirleyebilecek duyarlılığa sahip olduğu rapor edilmiştir, ancak bu duyarlılık tüm çalışmalarda gösterilememiştir.289 Clevenger ve arkadaşları CD45 ve sitokeratin18 monoklonal antikorları kullanılarak tümör hücrelerinin normal hematopoietik hücrelerden yüksek duyarlılıkla ayırt edilebileceğini bildirmiştir.287 Leers ve arkadaşları, anti-sitokeratin antikorların kullanıldığı çok parametreli flovsitometri (MP-FCM) yöntemiyle, meme kanserli hastaların lenf nodlarında mikrometastatik tümör hücrelerini immünohistokimyasal bulmayı amaçlamışlardır. yöntemlerle lenf nodu Hematoksilen metastazı eozin saptanan (HE) 38 ve hasta, flovsitometrik yöntemle değerlendirilmiş ve % 1 hatayla hastaların 37’sinde lenf nodlarında tümör hücreleri bulunmuştur. MP-FCM’nin yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğunu, bu yöntemle tüm lenf nodunun değerlendirilebileceği, ploidi hakkında bilgi edinilerek moleküler çalışmalara yardımcı olabileceğini ileri sürmüşlerdir.290 Flovsitometrik yöntemin en büyük dezavantajı, pozitif sonuçların morfolojik özelliklerinin ortaya koyulamamasıdır. Ayrıca hem RT-PCR hem de flovsitometrik yöntemde normal kontrol hastalarında yanlış pozitiflik bildirilmiştir.230,291,292 Bununla beraber geliştirilmiş hücre-sınıflandırma teknolojileri kullanılarak, seçilen hücre popülasyonunun morfolojik değerlendirmesi yapılabilir. İmmünositokimyasal ve flovsitometrik yöntemlerin karşılaştırıldığı çalışmalarda, farklı sonuçlar elde edilmiştir.286,293-295 Molino, Vredenburgh ve arkadaşları immünohistokimyanın daha üstün bir yöntem olduğunu öne sürmüşlerdir.293,295 Bunun aksine, Gross ve arkadaşları yüksek duyarlılığa sahip bir flovsitometrik yöntem geliştirmiştir ve bu yöntemle kemik iliği mikrometastazı bulma oranı % 10-40 olarak bildirilmiştir. Ancak bu duyarlılığa ulaşmak için, örneğin 40 saat analiz edilmesi gerekmektedir ve çok sayıdaki örneğin analizi için oldukça zaman alıcı bir yöntemdir. Buna rağmen flovsitometri lenfoma ve lösemi hastalarında rezidüel hastalığın belirlenmesi için önemli bir yöntemdir.296,297 Epitelyal tümörlerde kemik iliği mikrometastazını belirlemek için, flovsitometrinin immünositokimyasal yönteme üstünlüğünü gösteren herhangi bir çalışma yoktur. Mikrometastazın belirlenmesi için kullanılan bazı örnek hücre dizilerinin özellikleri tartışmalara neden olmaktadır.298 45 Örneğin, eğer sitokeratin antikorları kullanılırsa, sitokeratin ekspresyon kaybı bu hücrelerin bulunmasını engellemektedir. Meme kanser hücreleri çok parametreli DNA flovsitometri ile araştırıldığında, sitokeratin kaybının, mevcut hücresel faktörlerin ve kullanılan hazırlık prosedürünün bir sonucu olduğu gösterilmiştir.294 Bu nedenle, in vivo kanser hücrelerinin seçilmiş in vitro hücrelere göre farklı özellikler gösterebilmesi nedeniyle, DNA içeriğinin değerlendirilmediği çalışmalarda bu metodun klinikle ilişkisi tartışmalıdır. Çabioğlu ve arkadaşları tarafından yapılan ve immünomanyetik zenginleştirme sonrası flovsitometrinin kullanıldığı bir çalışmada meme kanserli hastaların % 33,3’ünde kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır.299 Bu çalışmada sitokeratin 7 ve 8’e yönelik CAM5-2 monoklonal antikoru ve flovsitometrik değerlendirme için spesifik MCF-7 meme kanseri hücre dizisi kullanılarak non-spesifik boyanma nedeniyle oluşan yanlış pozitiflik dışlanmıştır. Ayrıca, flovsitometriye ilave olarak morfolojik analiz için başka bir tekniğin kullanılmadığı durumlarda, tekniğin güvenirliğini artırmak için negatif ve pozitif kontrollerin değerlendirilmesi önerilmiştir. Braun ve arkadaşları, özellikle erken meme kanserli hastaların kemik iliğinde mikrometastatik hücre sayısının çok az olması nedeniyle, uygun zenginleştirme yönteminin kullanılmadığı çalışmalarda yöntemin başarısız olacağını ileri sürmüşlerdir.158 2.2.7. Çalışmamızda Kullandığımız Markerler Çalışmamızda, flovsitometrik yöntemle evre I-IV meme kanserli 52 hastada kemik iliği mikrometastazı prevalansı, sitokeratin pozitif hücrelerin meme kanseri kök hücresi ile benzerliği ve bu hücrelerde çeşitli sitokeratinlerin ekspresyon paternlerinin değerlendirilmesi amaçlandı. Günümüze kadar kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için en yaygın olarak sitokeratinleri tanıyan monoklonal antikorlar kullanılmıştır. 2.2.7.1. Sitokeratinler Sitokeratinler, epitelyal dokuda intrasitoplazmik hücre iskeletini oluşturan ara filamanlardır. Biyokimyasal özellikleri birbirinden farklı 20 polipeptit tanımlanmıştır. Moleküler ağırlıkları 40-68 kDa, izoelektrik pH’ları 4.9-7.8 arasında değişmektedir. Düşük moleküler ağırlıklı asidik tip I ve yüksek moleküler ağırlıklı bazik veya nötral tip 46 II sitokeratinler olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Sitokeratinler genellikle biri tip I ve diğeri tip II sitokeratinden oluşan çiftler halinde heterotetramerleri oluştururlar. Yüksek moleküler ağırlıklı bazik veya nötral tip II sitokeratinler; CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8 ve CK9 alt tiplerini kapsamaktadır. Düşük moleküler ağırlıklı asidik tip I sitokeratinler ise CK10, CK12, CK 13, CK14, CK16, CK17, CK18, CK19 ve CK20’dir. Sitokeratinlerin ekspresyonu çoğunlukla organ ve dokuya spesifiktir. Örneğin CK7 genellikle genitoüriner sistem epitelinde, CK20 ise gastrointestinal sistem epitelinde eksprese edilmektedir. Histopatolojide çeşitli tümörlerin orjinini bulmak için bu farklılıklardan yararlanılmaktadır. Epitelyal hücrelerde eksprese edilen sitokeratinlerin alttipleri, başlıca epitelin tipi, matürasyon ve farklılaşma derecesiyle ilişkilidir. Bu nedenle, epitelyal dokular sitokeratin ekspresyon profillerine göre sınıflandırılmaktadır. Epitelden köken alan karsinomlarda sitokeratin profili değişmemektedir. Tümörlerin ayırıcı tanısı ve cerrahi patolojide; immünositokimya, sitopatoloji ve flovsiyometri yöntemleriyle sitokeratin profilinin belirlenmesi yaygın olarak kullanılmaktadır. Sitokeratinler 30 geni kapsayan bir gen ailesi tarafından kodlanmaktadır. Sitoplazmada keratin filamentleri kompleks bir yapı oluşturarak hücre membran yüzeyinden nükleusa uzanmaktadır. Plazma membranı ve nükleer yüzey arasındaki bu etkileşim, sitoplazma ve hücresel iletişim mekanizmaları (mitoz, post-mitotik periyot, hücre hareketi ve farklılaşma) için çok önemlidir. Sitokeratinler desmozom ve hemidesmozomlarla etkileşmektedir. Bu sayede hücre-hücre adezyonu ve bazal hücrelerin konnektif dokuyla bağlantısı sağlanmaktadır.300,301 Epitel hücrelerinde başlıca CK8, CK18, CK19 ve CK20 eksprese edilmektedir. Bunlar arasında meme kanserinde kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için en fazla kullanılan CK19’dur. Ancak diğer tümörler için özgüllük ve duyarlılığı düşüktür. CK6 ve CK16 baş-boyun tümörlerinde, CK7 küçük hücreli dışı akciğer kanserinde, CK17 oral ve orofarinks skuamoz hücreli karsinomlarda, CK20 ise peritoneal, gastrik, kolorektal ve hepatik tümörlerde mikrometastazları belirlemek amacıyla kullanılmıştır. 2.2.7.1.1. Sitokeratin 4 Sitokeratin 4, kornea ve transizyonel epitel (mesane) dahil non-kornifiye skuamoz epitelde (dil, larinks, farinks, epiglottis, özofagus, ekzoserviks, vajina) bulunmaktadır. 47 Silialı psödostratifiye epitel (bronş) ve çeşitli egzokrin glandlardaki duktal epitelde zayıf pozitiftir. Normalde sitokeratin 4 epidermisde bulunur, fakat derinin glandüler dokularında da (ter bezleri) fokal pozitif bulunabilir. Deri epidermisi başlıca bazal tabakada sitokeratin 14 ve 19, kornifiye tabaka ise sitokeratin 1 ve 10 içermektedir. Sitokeratin 4, kornifiye skuamoz epitelden köken alan skuamoz hücreli karsinomlarda eksprese edilmektedir. Monoklonal anti-sitokeratinler epitelyal tümörlerin tanımlanması ve sınıflandırılması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Monoklonal anti-sitokeratin 4 zincir spesifik antikordur ve normal, metaplazik veya neoplazik hücreleri tanımlamak için kullanılmaktadır. Meme kanserlerinin büyük kısmı lüminal hücrelerden köken almaktadır. Meme kanserinde grade ve sitokeratin profili arasında korelasyon vardır. grade 1 ve 2 tümörlerde genellikle basit (luminal) epitele özgü sitokeratinleri, yüksek grade tümörler ise stratifiye epitelyal keratinler (yüksek molekül ağırlıklı CK4, CK14 ve/veya CK17) eksprese etmektedir.300 Bu sitokeratin fenotipi, özellikle lenf nodu pozitif hastalarda azalmış toplam ve hastalıksız sağkalım, ER negatifliği ile ilişkilidir. Ayrıca bu alt grubun diğer bir özelliği de HER2(-) olmasıdır. Normal meme bazal hücreleri dışında, meme kanserinde % 2-18 ve grade 3 benign meme lezyonlarında % 25 oranında bu yüksek molekül ağırlıklı sitokinler saptanmaktadır. Bu nedenle bu meme kanseri grubu bazal/miyoepitelyal fenotip gösteren grup olarak adlandırılır. Ayrıca bazal-benzeri, bazaloid grup da sinonim olarak kullanılmaktadır. Meme kanserlerinin hemen hemen tamamında basit (luminal) epitelyal sitokeratinler eksprese edilmektedir (CK7, CK8, CK18 ve CK19). grade 3 karsinomların yaklaşık % 60’ı bimodal ekspresyon paternine sahiptir ve stratifiye epitelyal keratinlerden en az biri ko-eksprese edilmektedir. (CK4 % 36, CK5 % 18, CK14 % 20 ve CK17 % 38)302,303,304 2.2.7.1.2. Sitokeratin 6a Sitokeratin 6, epitelyal dokularda normal şartlarda heterojen olarak eksprese edilmektedir, ancak stratifiye epitelin indüklendiği hücre proliferasyonu veya anormal farklılaşma durumlarında ekspresyonu artmaktadır. Bu nedenle hiperproliferasyon ile ilişkili keratin olarak adlandırılmaktadır. CK6a, CK6 izoformları arasında deride ve hücre kültürlerinde üretilen epitelyal hücre dizilerinde baskın olarak eksprese edilen sitokeratindir. (% 77) Sitokeratin6, kıl folliküllerinde, baş-boyun skuamöz hücreli 48 karsinomlarında, çeşitli internal çok katlı epitelin suprabazal hücrelerinde, hem normal hem de hiperproliferatif durumlarında eksprese edilmektedir. Normal meme dokusunda eksprese edilmemektedir. Moll ve arkadaşları tarafından western-blott yöntemi kullanılarak, meme duktuslarının bazal ve progenitör hücrelerinde sitokeratin5 ve 6’nın baskın olarak eksprese edildiği gösterilmiştir.305,306 Meme kanserlerinde sitokeratin6 ekspresyonu, ER negatifliği, c-erb-B2 pozitifliği yüksek nükleer grade ve tek odaklı DCİS varlığı ile ilişkili bulunmuştur. Sitokeratin6 pozitif tümörlerin, negatif tümörlere göre daha primitif hücrelerden köken aldığı düşünülmektedir.307 2.2.7.1.3. Sitokeratin 8 Tip II yüksek moleküler ağırlıklı keratinlerdendir ve hücrelerde sitokeratin 18 ile birleşmiş halde bulunmaktadır. Sitokeratin 8, başlıca normal non-skuamöz epitel (endokrin ve ekzokrin glandüler epitel), sindirim (karaciğer, pankreas ve ince ve kalın bağırsak), solunum ve genitoüriner sistem epiteli ile beraber adenokarsinom ve duktal karsinomların hemen tamamında pozitiftir. Skuamöz hücreli karsinomlar da ise negatiftir. Hepatosellüler karsinomlarda sitokeratin 8 ve 18’e bağlanan antikorların pozitifliği ile tanı koyulmaktadır. Sitokeratin 8, 18 ve 19, mikrometastatik hücrelerde pozitif olduğu için, kemik iliği mikrometastazının belirlenmesi için özellikle immünositokimyasal yöntemlerde yaygın olarak kullanılmıştır. Sitokeratin 8 ve 18’in ekspresyon profili sitokeratin 19 ile benzerdir. Sitokeratin 8, meme epitelinde bazal benzeri hücrelerden ziyade luminal benzeri hücrelerde eksprese edilmektedir. Dolayısıyla bazal benzeri tümörlerden köken alan mikrometastatik hücreleri bulmak göreceli olarak daha zordur.269 2.2.7.1.4. Sitokeratin 10 Sitokeratin 10, iki tip I ve iki tip II sitokeratinden oluşan heterotetramer yapıda bir sitokeratindir. Genel olarak sitokeratin 1 ile birlikte bulunmaktadır. Stratum korneum dahil tüm suprabazal hücre tabakalarında bulunmaktadır. Çalışmamızda kullandığımız monoklonal antikor, keratinize çok katlı yassı epitel ve iyi diferansiye skuamöz karsinomlarda pozitiftir ve mikrometastatik hücreleri, cilt epitelinden kontamine olmuş hücrelerden ayırt etmek için kullanılmıştır. 49 2.2.7.1.5. Sitokeratin 18 Sitokeratin 18, non-skuamöz epitelde ve adenokarsinomlar ve duktal karsinomların çoğunda pozitif olan asidik keratindir. Skuamöz hücreli karsinomlarda negatiftir. Sitokeratin 8 ile kombinasyon halinde bulunmaktadır. Çalışmada kullanılan monoklonal antikor çeşitli basit epitelde pozitifken stratifiye skuamöz epitelde negatiftir. Meme, gastrointestinal kanal, akciğer, pankreas, over ve tiroid gibi epitelyal kanserlerde kullanılmaktadır. Meme kanserinde ise CK18 ekspresyonu CK8 ile birlikte özellikle luminal hücrelerden köken alan tümörlerde görülmektedir.269 CK18, epitelyal tümörlerde kemik iliğindeki mikrometastazların belirlenmesi için en sık kullanılan markerlerden biridir. Ancak bazal hücrelerden köken alan mikrometastatik hücreleri belirlemek için uygun bir marker değildir. Mikrometastatik hücrelerde ortak bir sitokeratin epitopunu belirleyen A45B/B3; CK8, CK18 ve CK19’u tanımaktadır. Bu antikor immünositokimyasal yöntemlerde yaygın olarak kullanılmıştır. Meme, prostat, gastrointestinal sistem tümörlerinde de flovsitometrik yöntemlerle yapılan çalışmalarda en sık kullanılan markerdir. Bizim çalışmamızda bu sitokeratini tanıyan monoklonal antikoru kullanılmıştır. Normal hücrelerin kanser hücrelerine dönüşümü sırasında hücre iskeletinde meydana gelen değişiklikler açıkça ortaya koyulmuştur. Primer meme tümörlerinde CK18 ekspresyonu ile metastatik potansiyeli arasında ilişki bulunmuştur. Yüksek oranda CK18 ekspresyonuna sahip tümörlerin metastatik potansiyeli düşüktür. CK18 ekspresyon kaybı, tümör hücrelerinin daha mobil olmasına neden olmakta ve meme tümörlerinde prognostik önemi olduğu düşünülmektedir.269,308 Metastatik tümörlerde ise CK18 ekspresyonu down-regüle edilmektedir.202 Ayrıca, farelerde yapılan bir çalışmada, meme kanser hücrelerine keratin 18 geninin transfeksiyonu sağlanarak, adezyon molekül ekspresyonunun indüklendiği ve in vivo veya in vitro olarak metastazların gerilediği gösterilmiştir.309 CK18 ayrıca meme kanserinde bazı kemoterapi ajanlarına yanıtın değerlendirilmesi için kullanılmıştır. ELİSA yöntemiyle CK18 yıkım ürünleri ve parçalanmamış CK18 düzeyleri ölçülmüş; dosataksel alan hastalarda apopitozisin indüklenmesi nedeniyle CK18 yıkım ürünleri, florourasil, epirubisin ve siklofosfamid 50 (FEC) alan hastalarda ise hücre yıkımı nedeniyle parçalanmamış CK18 düzeylerinin yükseldiği gösterilmiştir.310 2.2.7.2. Epitelyal Hücre Adezyon Molekülü (EpCAM) Epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM), 40 kDa ağırlığında bir hücre yüzey antijenidir. Bu antijen farklı gruplar tarafından farklı isimlendirilmiştir. (CD326, ESA, HEA125 ve TACSTD1 gibi) Epitelyal karsinomlarda tümör spesifik molekül olan EpCAM’a karşı birçok monoklonal antikor geliştirilmiştir. EpCAM tip I transmembran glikoproteindir. Erişkin skuamöz epiteli, hepatosit ve gastrik epitel gibi bazı spesifik epitelyal hücreler dışında, epitelyal dokuların çoğunda bazolateral membranda eksprese edilmektedir. EpCAM’ın, tümör hücrelerinde ekspresyonunun artması nedeniyle erken malignensinin olası bir markeri olabileceği rapor edilmiştir. Metastatik meme kanser hücrelerinin % 60’dan fazlasında EpCAM eksprese edilmektedir. Ayrıca displastik skuamöz epitelde de novo ekspresyonu görülebilir.269,311,312 Meme kanserinde EpCAM’a yönelik monoklonal antikorlar, mikrometastatik hücrelerin immünomanyetik olarak ayrılması ve RT-PCR analizi için zenginleştirme yöntemlerinde kullanılmıştır.268 Bu antijeni tanımlayan monoklonal antikorlar tanısal yöntemler yanında tedavi seçeneği olarak da kullanılmıştır. Meme kanseri dahil epitelyal malignensiler için yüksek duyarlılığı olmasına rağmen, dolaşan tümör hücrelerini bulmak için kullanıldığında normal periferik kan hücrelerinde düşük sayıda eksprese edildiği gösterilmiştir.313 Meme ve kolorektal kanserlerde antikora dayalı immünoterapi için mikrometastatik hücreler uygun bir hedeftir. (örneğin EpCAM için edrekolomab gibi) Ancak hedef antijenler bu hücrelerde heterojen olarak eksprese edilmektedir ki monospesifik antikor tedavisinin etkinliğini sınırlamaktadır. Tek doz 500 mg. edrekolomab ile tedavi edilen, kemik iliği mikrometastazı tespit edilmiş, metastatik ve lokal nüks olan 10 meme kanseri hastası tedaviden 5-7 gün sonra değerlendirildiğinde, mikrometastatik hücre sayısının önemli ölçüde azaldığı ve 4 hastada tamamen elimine edildiği gözlenmiştir.314 Primer meme tümörlerinde EpCAM aşırı eksprese edilmektedir. Hastalıksız sağkalım ile ilişkilidir. Meme kanseri gelişmesinde direk olarak katkısı bulunmaktadır. İn vitro çalışmalarda EpCAM ekspresyonunun baskılanarak meme kanseri fenotipinin 51 dramatik olarak değiştiği, proliferasyon ve invaziv potansiyelin azaldığı gösterilmiştir.315,316 2.2.7.3. CD24 CD24 (ısıya dayanıklı antijen olarak bilinir) 30 aminoasitten oluşan kor polipeptiti ve yüksek karbonhidrat içeriği olan fosfatidil-inositol ile bağlı bir hücre yüzey glikoproteinidir. Fare lenfoma hücrelerinden molekül ağırlığı 40-60 ve 23-30 kDa arasında değişen iki formu izole edilmiştir. CD24 B hücrelerinin gelişiminin tüm evrelerinde ve timüsten gelişen çoğu T hücre prekürsörlerinde (timosit) eksprese edilmektedir. T hücrelerinin matürasyonu ile CD24 ekspresyonu kaybolurken CD4 veya CD8 eksprese edilmeye başlanmaktadır. CD24 ayrıca granülosit, monosit, Langerhans hücreleri ve eritrositlerde pozitiftir. P selektin için alternatif bir ligantdır. Endotelyal hücrelerde ve trombositlerde adezyon moleküllerinin ekspresyonunu artırmaktadır. CD24 B hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. CD24 ayrıca pankreas kanseri için pozitif bir markerdir. Tümör hücrelerinde CD24 ekspresyonu metastaz potansiyelini artırmaktadır ve karsinomlar dahil birçok kanserde aşırı eksprese edilmektedir. Bu nedenle potansiyel olarak erken tümör markeri gibi düşünülebilir.317-320 Meme kanserinde immünositokimyasal ekspresyonunun kötü prognozla ilişkili olduğu bulunmuştur. 321 yöntemle CD 24 Son veriler meme tümörlerinde karsinogenez sırasında CD24 ekspresyonunun azaldığı veya kaybolduğu gösterilmiştir. Bu da kanser kök hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir.322,323 CD24 stromal hücrelerden salınan faktör-1 ile ilişkili olarak migrasyon ve sinyal iletimini sağlamaktadır. Bu nedenle mikrometastatik hücrelerde CD24 ekspresyon kaybı, bu hücrelerin metastatik potansiyelini baskılamaktadır. Meme kanserinde kemik iliğinde bulunan mikrometastatik hücrelerin, mezenkimal kök hücre ile benzer özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler meme kanseri kök hücresi olarak değerlendirilmiştir. Mezenkimal kök hücresi gibi bu hücrelerde de CD44+/CD24zayıf+/- olarak tespit edilmiştir. Biz de çalışmamızda bu nedenle mikrometastatik hücrelerde CD24 ve CD44 ekspresyonunun değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 52 2.2.7.4. CD44 CD44, fagositik glikoprotein-1 (pgp-1) veya HCAM olarak bilinen tip 1 transmembran glikoproteinidir. CD44, hyaluronik asit için reseptördür ve birçok izoformu vardır. Başlıca izoformu olan tip 1 glikolize transmembran proteini, lenfosit, myeloid hücreler ve eritrositlerde eksprese edilmektedir. Diğer izoformları glikozaminoglikan içermektedir ve hematopoietik veya hematopoietik olmayan hücrelerde eksprese edilmektedir. CD44 lökositlerin endotelyal hücrelere, stromal hücrelere ve ekstrasellüler matrikse adezyonu ile ilişkilidir.324,325 CD44’ün v6 epitopu meme kanserlerinde yaygın olarak eksprese edilmekle beraber prognostik önemine dair tartışmalı bilgiler vardır. Meme tümörleri ve meme glandındaki fonksiyonu henüz bilinmemektedir. Normal meme dokusundaki kök hücreler ile ilişkilidir ve CD44 ekspresyonu, meme epitelinin büyüme ve farklılaşmasını sağlamaktadır. CD44 ekspresyonu kısmen hormonlar, IGF-1 ve EGF gibi büyüme faktörleri tarafından düzenlenmektedir. Meme karsinomlarında CD44 ekspresyonu, tümörün kök hücre ilişkili olduğunu göstermektedir. Biz çalışmamızda CD44, CD24 ile birlikte mikrometastatik hücrelerin CD44+/CD24zayıf+/- ekspresyon paternini değerlendirmek için kullanılmıştır.321 2.2.7.5. CD45 CD45, tek zincirli transmembranöz bir glikoproteindir. Dört ayrı izoformu vardır. (220, 205, 190, 180 kDa) Ekstrasellüler alanı ileri derecede glikolizedir. CD45, matür eritrositler dışında insan hematopoietik hücrelerinde (hematopoietik kök hücreler dahil) eksprese edilmektedir. Diğer dokuların farklılaşmış hücrelerinde ise eksprese edilmemektedir. CD45, sinyal iletiminde, immünolojik olayların inhibisyon veya upregülasyonunda önemli rol oynamaktadır. Genellikle izoformların hepsinde ortak olan bir epitopu tanıyan antikorlar kullanılmaktadır. Biz çalışmamızda CD45, sitokeratin pozitif hücreleri normal hematopoietik hücrelerden ayırt etmek için kullanılmıştır. Mikrometastatik hücrelerde CD45 eksprese edilmemektedir.326,327 2.2.8. Meme Kanseri Kök Hücresi Kavramı Meme kanseri kök hücresi varlığı ile ilgili giderek artan delillerin ortaya koyulması, normal meme dokusundaki yetişkin meme epitelyal kök hücreleri üzerine 53 yapılan çalışmalara hız vermiştir. Bu hücreler rutin doku yenilenmesinden ve gebelik sırasında meme dokusundaki masif genişlemeden sorumludur. Ayrıca tamamı olmasa bile çoğu meme tümörlerinin kaynağı olarak meme kanseri kök hücreleri gösterilmektedir. Birçok teorik öneri ve incelemede, metastazın oluşmasında kanser kök hücrelerinin rolü olduğu ileri sürülmüştür, ancak bu konu halen tartışmalıdır.328-331 Deneysel olarak, CD44+/CD24zayıf+/- kanser hücreleri, kök hücre paterniyle benzer bir fenotipe sahiptir ve metastaz için gerekli olan invaziv özellikleri vardır.331,332 50 hastayı kapsayan bir seride, kemik iliğindeki mikrometastatik kanser hücrelerinin çoğunun, kök hücre benzeri bir immünohistokimyasal fenotip sergilediği gösterilmiştir.321 Meme kanserleri fenotipik olarak farklı hücre gruplarından meydana gelmektedir. Bu hücre tipleri, tam olarak anlaşılamamış olmakla beraber tümör gelişimine katkıda bulunmaktadır. Myeloid lösemilerde tümör oluşumunu başlatabilen ve spesifik hücre yüzey markerleri ile ayırt edilebilen farklı hücre alt grupları gösterilmiştir. Bu konuda iki önemli hipotez öne sürülmüştür. Birinci hipotez, hücre popülasyonundaki her hücrenin mutasyona uğrayarak tümör geliştirme kapasitesine sahip olabileceğini; ikinci hipotez ise, bu yeteneğin sadece seçkin bir gruba özgü olduğunu savunmaktadır.207Son olarak Al-Hajj ve arkadaşları tarafından, tümör geliştirme yeteneği olmayan hücrelerden farklılaşan, tümör başlatıcı veya tümörijenik meme hücrelerini belirlemek için bir yöntem ileri sürülmüştür. Bu çalışma kanser kök hücresi üzerine solid tümörlerde yapılmış ilk çalışmadır. Flovsitometri yöntemiyle 1000 meme tümör hücresi içinde 100 hücrenin CD44+/CD24zayıf+/-Lineage- fenotipe sahip olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler obez olmayan diyabetik/ciddi kombine immün yetmezliği olan farelerin yağ dokusu içine enjekte edildiğinde, 12 hafta içinde tümör geliştiği gözlenmiştir. Ayrıca bu hücrelerin EpCAM+ alt grubu da tanımlanmıştır. (CD44+/CD24zayıf+/-Lineage- EpCAM+)333 Tümörijenik meme kanser hücreleri, normal kök hücrelerle benzer olarak kendilerini yenileyebilme, proliferasyon ve farklılaşma özelliklerine sahiptir. Bu fenomen, meme kanserli hastalarda klinik olarak metastatik hastalığın gelişmesine neden olan kemik iliği mikrometastazını açıklamaya yardımcı olabilir. Mikrometastazlar tümörijenik veya tümörijenik olmayan meme kanser hücreleri ile meydana gelse de sadece tümörijenik hücreler klinik olarak önemli progresyona neden olmaktadır. Güncel medikal tedaviler tümörde regresyona neden olabilir, ancak yeni 54 çalışmalar kanser-başlatıcı hücreler hedef alınmadıkça tümörün tamamen yok edilemeyeceğini göstermiştir. Bu bulgular gelecekteki araştırmalar ve yeni tedavi stratejileri için bir başlangıç oluşturmuştur.334 2.2.9. Dolaşımdaki Tümör Hücreleri (CTC) Metastatik malignensiler kanser ilişkili ölümün en önemli sebebidir. Tümör progresyonu sırasında, dolaşan tümör hücreleri (CTC) primer tümörden ayrılarak uzak organlara kolinize olmaktadır. CTC metastaz oluşturulması için gereklidir, bununla beraber bu proses için yeterli değildir ve dolaşımdaki çoğu tümör hücresi hedef organlarda metastaz geliştirme konusunda başarısız olmaktadır. Az sayıda CTC migrasyon sırasında ölürken diğerleri yıllarca dormant halde kalmakta ve çok azı makrometastaz geliştirebilmektedir. CTC kanser hastalarında gösterilmiş olmasına rağmen, klinikle ilişkisi halen tartışmalıdır ve bu hücrelerin biyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. Şu anda CTC için kullanılan markerler yetersizdir ve bu hücrelerin alt grupları arasında ayrım yapılamamaktadır. Güncel metotların CTC’nin bulunması ve özelliklerinin ortaya koyulması için duyarlılığı ve özgüllüğü düşüktür. Metastatik meme, kolorektal ve prostat kanserli hastalarda CTC varlığı, azalmış progresyonsun ve toplam sağkalım ile ilişkili bulunmuştur, ancak erken evre kanserlerde böyle bir ilişki gösterilememiştir.335-344 CTC’nin bulunması ve sayısının belirlenmesi için CellSearch sistem tasarlanmıştır. Bu yöntemde immünomanyetik zenginleştirme sonrası flovsitometri kullanılarak CD45 (-) ve sitokeratin8, 18, 19, EpCAM (+) hücreler, epitelyal tümör hücreleri olarak değerlendirilmektedir. Kemik iliğinde mikrometastatik hücreleri bulmak için kullanılan zenginleştirme yöntemleri CTC’ye yönelik işlemler içinde önerilmektedir. (örneğin dansite Gradient, filtrasyon, immünomanyetik ayrıştırma gibi) CTC’yi bulmak immünositokimyasal yöntemler ve RT-PCR kullanılmıştır. için 345 aynı zamanda Anti-epitelyal hücre antikorlarının daha uygun olması nedeniyle, meme kanserinde CTC’nin bulunması için birçok çalışmada, sitometrik metotlar kullanılmıştır. Metastatik meme kanserli hastalarda CTC’in varlığı, yeni bir tedavi basamağına başlamağına başlanılan hasta gruplarda, progresyonsuz ve toplam sağkalım ile ilişkili bulunmuştur. Prognostik değeri, tedavinin basamağından bağımsızdır (örneğin, birinci veya ikinci basamak). Ayrıca çok değişkenli analizde, metastazın yeri, tedavi şekli ve primer cerrahiden sonra 55 rekürrense kadar geçen zamanın uzunluğundan bağımsız olarak, CTC’nin prognostik değeri daha üstün bulunmuştur.346 Bu bilgiler, CTC’in varlığı nedeniyle, ileri evre hastalık için evreleme sisteminin yeniden gözden geçirilmesi gereğini ortaya koymaktadır. Meme kanseri ve kolorektal kanserler, melanoma ve prostat kanseri dahil diğer tümörlerde, sitometrik veya PCR’a dayanan yöntemlerin geçerliliği ortaya konmuştur.347-356 Lösemi hastalarında minimal rezidüel hastalığın belirlenmesi için yapılan çalışmalar, daha uygun tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Metastatik meme kanserinde, standart veya anti HER2’ye yönelik ajanlarla tedaviden sonra periferik kanda CTC sayısındaki değişim yanıtın değerlendirmesi için önemlidir.212 56 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Hasta Seçimi ve Klinik Evreleme Çalışmamızda, flovsitometrik yöntemle evre I-IV meme kanserli 52 hastada kemik iliği mikrometastazı prevalansı, sitokeratin pozitif hücrelerin meme kanseri kök hücresi ile benzerliği ve mikrometastatik hücrelerde çeşitli sitokeratinlerin ekspresyon paternlerinin değerlendirilmesi amaçlandı. Kontrol grubu olarak, epitelyal malignensisi olmayan, remisyonda lösemi ve lenfoma tanısı olan 16 hastadan kemik iliği aspirasyonu alındı. 2007 yılında prospektif olarak çalışmaya başlandı. Kemik iliği mikrometastatik hastalığı prevalansını değerlendirmek için, opere olmuş, adjuvan kemoterapi almak üzere Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi İç hastalıkları Onkoloji Bilim Dalına başvuran 40 evre I-III ve daha önce kemoterapi almış relaps hastalığa sahip veya yeni tanı metastatik hastalığa sahip 12 evre IV meme kanserli hasta çalışmaya alındı. Çalışmaya, aksiller lenf nodu metastazı (-) 20 hasta, aksiller lenf nodu metastazı (+) 20 hasta ve kemik, kemik iliği, karaciğer, akciğer veya serebral metastazı olan 12 hasta olmak üzere toplam 52 hasta dahil edildi. Opere olmuş hastalara, adjuvan kemoterapi başlanmadan operasyon sonrası en geç 3 hafta içinde kemik iliği aspirasyonu yapıldı. Tüm hastalar uzak metastaz açısından akciğer grafisi, batın ultrasonografisi ve kemik sintigrafisi ile değerlendirildi. Modifiye radikal mastektomi ve aksiller lenf nodu diseksiyonu yapılmış aksiller lenf nodu metastazı (+) veya (-) hastalarda uzak metastaz saptanmadı. Hastalara yapılacak işlem anlatıldı, aydınlatılmış onam formu onayları alındı. Hastalar 2002 yılında American Joint Commitee on Cancer (AJCC) tarafından yayınlanan, (T) tümör boyutu, (N) lenf nodu durumu ve (M) uzak metastaz durumu temel alınarak evrelendi. Hastaların, yaşı, cinsiyeti, tümör boyutu, metastatik aksiller lenf nodu sayısı, evresi, tümör alt tipi, histolojik grade, lenfovasküler invazyon ve karsinoma in situ varlığı, östrojen ve progesteron reseptör durumu, c-erb-B2 ekspresyonu, menopozal durumu ve metastatik hastalarda metastaz yerleri not edildi. 3.2. Kemik İliği Hazırlanması Tüm hastalardan posterior iliak çıkıntıdan, lokal anestezi altında aseptik teknikle kemik iliği aspirasyonu yapıldı. Aspirasyon öncesi cilt epitelinden kontaminasyonu 57 önlemek için bisturi ile insizyon yapıldı ve aspire edilen ilk 0.5 cc. kemik iliği atıldı. Tüm hastalardan ortalama 9 cc. kemik iliği alınarak EDTA (etilen diamin tetra asetik asit) içeren iki ayrı mor tüpe koyuldu. Kemik iliğinin hazırlanması için yapılan işlemler önceki yayınlarda açıklanmıştır.99,156,158,175,186,246 Mononükleer hücrelerin ayrıştırılması için, kemik iliği 15’er cc’lik falkon tüplere aktarıldı. Üzerine, her 1 cc. kemik iliği için 1 cc. PBS (phosphate buffered saline) ilave edildi. Daha sonra ayrı bir falkon tüpe 5 cc ficoll-hypack solüsyonu koyularak üzerine kemik iliği-PBS karışımı damla damla yayıldı. Örnekler 900 devirde 30 dakika santrifüj edildi. Mononükleer hücreleri içeren bufy coat tabakası pipetle toplanarak ayrı bir falkon tüpe koyuldu. Üzerine 15 cc’ye kadar PBS eklenerek 150 devirde 5 dakika santrifüj edildi. Oluşan süpernatant atıldı. Üzerine 15 cc’ye kadar PBS eklenerek 150 devirde 5 dakika santrifüj edildi. Oluşan süpernatant atıldı. Aynı işlem bir kez daha tekrarlanarak hücreler için toksik olan ficollhypack solüsyonu uzaklaştırıldı. Materyal DMSO (dimetil sülfoksit) ile dondurularak 80 0C’de saklandı. DMSO hücre zarlarından kolayca geçerek nükleusun etkilenmeden saklanmasını sağlayan ve hematopoietik kök hücrelerin saklanması yaygın olarak kullanılan bir kriyoprotektandır. Materyal kullanılacağı zaman avuç içinde eritilerek üzerine fetal bovin serum içeren % 10’luk PBS eklendi. 400 devirde 10 dakika santrifüj edildi. Üzerindeki süpernatant atıldı. Fetal bovin serum içeren % 10’luk PBS ile tekrar 400 G’de 10 dakika yıkama yapıldı. Aynı işlem üç kez tekrarlanarak DMSO uzaklaştırıldı. 3.3. Flovsitometrik Değerlendirme DMSO uzaklaştırma işlemi sonrası, kemik iliği materyallerinin bir kısmı damla damla % 70’lik alkol eklenerek +4ºC’de FITC ile konjuge sitokeratin 18 monoklonal antikoru ile boyandı. (Abcam, Cambridge, ABD) Antikor, PBS ile 1/20 seyreltildi ve 100 µl örnek için 10 µl antikor eklendi. PBS ile tekrar yıkama sonrası DNA içeriği RNAaz içeren propidyum iyodit (Pİ) ile boyandı.357 Kemik iliğinin diğer bir kısmı ise alkol ile fikse edilmeden, CD45 ile yüzey ve CK18 ile intrasellüler olarak boyanarak flovsitometride incelendi.293 Sitokeratin 4, 6, 8, 10 için intrasellüler; CD24, CD44, CD45 ve EpCAM için yüzey boyama yapıldı. Tüm hastalarda en az 105 hücre analiz edildi. BD FACSCaliburTM flovsitometri (Becton Dickinson) ile örnekler değerlendirildi. Pİ negatif-sitokeratin18 pozitif ve diğer grupta CD45 negatif- 58 sitokeratin18 pozitif hücreler mikrometastatik tümör hücreleri olarak değerlendirildi. Non-spesifik boyanmalar veya sahte boyanan debrisler negatif kabul edildi. Remisyonda lösemi ve lenfomalı 16 hastadan elde edilen normal kemik ilikleri, kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edildi. Kemik iliğinde sitokeratin18 pozitifliği saptanan hastalarda, CD44, CD24, sitokeratin4, sitokeratin6, sitokeratin8, sitokeratin10 ve EpCAM monoklonal antikorları (Abcam, Cambridge, ABD) kullanılarak flovsitometride değerlendirildi. 3.4. İstatistiksel Analiz Elde edilen tüm veriler SPSS (Statistical Package for Social Sciences) Windows 12,0 programına kaydedildi. Mikrometastaz saptanan veya saptanmayan tüm hastalarda, stepwise multivariate Cox regresyon analizi ile diğer prognostik faktörler arasındaki ilişki değerlendirildi. Mikrometastaz varlığının ayrı ayrı her değişkenle ilişkisinin belirlenmesi için Ki-Kare testi kullanıldı. P değeri 0.05’in altında olan değerler istatistiksel açıdan anlamlı kabul edildi. 59 4. BULGULAR Çalışmaya 12’si evre I (% 23), 20’si evre II (% 38,5), 8’i evre III (% 15,5) ve 12’si evre IV (% 23) hasta olmak üzere 52 hasta dahil edildi. Hastaların ortanca yaşı 45 (27-82), ortalama yaşı 47,92 bulundu. Hastaların demografik, klinik ve tümör özellikleri tablo 7’de gösterilmiştir. Flovsitometride pozitif kabul edilen alan şekil 3’de gösterilmiştir. CD 45 negatif CK18 pozitif bölüm mikrometastatik hücreler olarak değerlendirildi CK18 FITC Şekil 3. Flovsitometride pozitif bulunmuş mikrometastatik hücreler 4.1. Kemik İliği Mikrometastazı İle Cinsiyet İlişkisi Hastaların 50’si kadın, 2’si erkek cinsiyete sahipti. Erkek hastalarda kemik iliğinde mikrometastatik hücreye rastlanmadı (% 0). 50 kadın hastanın 11’inde kemik iliği mikrometastazı saptandı (% 22). Cinsiyet ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,455). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde kemik iliği mikrometastazı ile cinsiyet arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,732). Kemik iliği mikrometastazı cinsiyet arasındaki ilişki tablo 8’de gösterilmiştir. 60 Tablo 7. Hastaların genel özellikleri Yaş grupları Menopozal durum Cinsiyet Tümör boyutu Lenf nodu metastazı Metastatik lenf nodu sayısı Evre Tümör histopatolojisi Östrojen Reseptörü (ER) Progesteron Reseptörü (PR) c-erb-B2 Grade Lenfovasküler İnvazyon DCİS komponenti Mikrometastaz oranı Parametreler <50 >50 Pre Post Erkek Kadın T1 T2 T3 T4 Yok Var N0 N1 N2 N3 I II III IV İDK İLK Müsinöz Diğer Negatif Pozitif Negatif Pozitif 0 1+ 2+ 3+ 1 2 3 Negatif Pozitif Yok Var LN (-) grup LN(+) grup Metastatik grup Sayı (%) 32 (61,5) 20 (38,5) 23 (44) 27 (56) 2 (4) 50 (96) 21 (40,5) 24 (46) 6 (11.5) 1 (2) 22 (42,5) 30 (57,5) 22 (42,5) 9 (17) 11 (21) 10 (19,5) 12 (23) 20 (38,5) 8 (15,5) 12 (23) 43 (82,5) 4 (7,5) 1 (2) 4 (8) 12 (23) 40 (77) 18 (34,5) 34 (65,5) 16 (31) 6 (11,5) 12 (23) 18 (34,5) 4 (8) 22 (42,5) 26 (49,5) 20 (38,5) 32 (61,5) 27 (52) 25 (48) % 25 %5 % 41,7 4.2. Kemik İliği Mikrometastazı İle Yaş İlişkisi Kemik iliğinde mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca yaş 45 (27-82), ortalama yaş 46,22 bulunurken, mikrometastaz saptanan grupta ortanca yaş 53 (32-76), ortalama yaş 54,27 bulundu. Yaş arttıkça mikrometastaz sıklığının arttığı belirlendi. Çok değişkenli analizde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,036). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna 61 göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,759) Kemik iliği mikrometastazı ile yaş arasındaki ilişki tablo 9’da gösterilmiştir. Tablo 8. Kemik iliği mikrometastazı cinsiyet arasındaki ilişki Kadın Cinsiyet Erkek Toplam N Cinsiyet içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Cinsiyet içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Cinsiyet içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı Yok Var 39 11 % 78 % 22 % 95,1 % 100 2 0 % 100 %0 % 4,9 %0 41 11 % 78,8 % 21,2 % 100 % 100 Toplam P değeri 50 % 100 % 96,2 2 % 100 % 3,8 52 % 100 % 100 0, 455 Tablo 9. Kemik iliği mikrometastazı yaş ilişkisi Kemik iliği mikrometastazı Yok Var Toplam Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N 62 Yaş P değeri 46,22 10,919 45,00 27 82 41 54,27 12,313 53,00 32 76 11 47,92 11,587 45,00 27 82 52 0,036 4.3. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Boyutu İlişkisi Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca tümör boyutu 4 cm. (0,7-10), ortalama tümör boyutu 3,882 cm. bulunurken, mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca tümör boyutu 2,5 cm. (0,5-10), ortalama tümör boyutu 3 cm. bulundu. Tümör boyutu arttıkça mikrometastaz oranının arttığı tespit edildi. Çok değişkenli analizde tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,092). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu ilişkisi tablo 10’da gösterilmiştir. 4.4. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenf Nodu Metastazı Arasındaki İlişki Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca metastatik lenf nodu sayısı 1 (0-34), ortalama lenf nodu sayısı 6,64 bulunurken, mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca metastatik lenf nodu sayısı 2 (0-16), ortalama metastatik lenf nodu sayısı 3,9 bulundu. Ancak lenf nodu metastazı pozitif olan grupta sadece bir hastada mikrometastaz saptandı. Mikrometastaz pozitif grupta ortanca ve ortalama lenf nodu sayısı yüksekliği metastatik gruba bağlandı. Çok değişkenli analizde metastatik lenf nodu sayısı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,843). Lenf nodu negatif 20 hastanın 5’inde (% 20), lenf nodu pozitif 20 hastanın 1’inde (% 5) ve uzak metastaz saptanan 12 hastanın 5’inde (% 41,6) kemik iliğinde mikrometastatik tümör hücreleri tespit edildi. Hastalar lenf nodu metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, lenf nodu metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile metastatik lenf nodu sayısı arasındaki ilişki tablo 11’de; lenf nodu veya uzak metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki tablo 12’de gösterilmiştir. 63 Tablo 10. Kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu ilişkisi Kemik iliği mikrometastazı Yok Var Toplam Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Tümör boyutu 3,000 1,8889 2,500 0,5 10,0 41 3,882 2,3714 4,000 0,7 10,0 11 3,187 2,0083 2,850 0,5 10,0 52 P değeri 0,092 Tablo 11. Kemik iliği mikrometastazı ile metastatik lenf nodu sayısı arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı Yok Var Toplam Metastatik Lenf Nodu Sayısı 3,90 4,969 2,00 0 16 41 6.64 10,481 1,00 0 34 11 4,48 6,494 2,00 0 34 52 Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N 64 P değeri 0,843 Tablo 12. Lenf nodu veya uzak metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki Lenf nodu (+) GRUP Lenf nodu (-) Metastatik Toplam N Grup içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Grup içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Grup içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Grup içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı Yok Var 19 1 % 95 %5 % 46,3 % 9,1 15 5 % 75 % 25 % 36,6 % 45,5 7 5 % 58,3 % 41,7 % 17,1 % 45,5 41 11 % 78,8 % 21,2 % 100 % 100 Toplam P değeri 20 % 100 % 38,5 20 % 100 % 38,5 12 % 100 % 23,1 52 % 100 % 100 0,001 4.5. Kemik İliği Mikrometastazı İle Tümör Alt Tipi Arasındaki İlişki Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta 11 hastadan 10’unda (% 90) primer tümör invaziv duktal karsinom, 1’inde (% 1) invaziv lobüler karsinom alt tipine sahipti. Kemik iliği mikrometastazı saptanmayan grupta ise 33 hasta (% 80) invaziv duktal karsinom, 3 hasta (% 7,3) invaziv lobüler karsinom, 1 hasta (% 2,4) müsinöz karsinom ve 4 hasta (% 10) diğer tümör alt tiplerine sahipti. Çok değişkenli analizde tümör alt tipi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,377) Hastalar lenf nodu metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, tümör alt tipi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,680). 4.6. Kemik İliği Mikrometastazı İle Evre Arasındaki İlişki Kemik iliği mikrometastazı saptanan hastalardan 1 hasta evre I (% 9), 4 hasta evre II (% 36), 1 hasta evre III (% 9) ve 5 hasta evre IV (% 46) grubunda idi. Evre I 12 hastanın 1’inde (% 8,3), evre II 20 hastanın 4’ünde (%20), evre III 8 hastanın 1’inde (% 12,5) ve evre IV 12 hastanın 5’inde (% 41,6) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Çok değişkenli analizde tümörün evresi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,227). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, tümörün evresi ile kemik iliği mikrometastazı 65 arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile tümörün evresi arasındaki ilişki tablo 13’de gösterilmiştir. Tablo 13. Kemik iliği mikrometastazı ile tümörün evresi arasındaki ilişki GRUP EVRE Ortalama 3,00 Standart sapma 1,298 Ortanca 4,00 Lenf nodu (+) Minimum 2 Maksimum 6 N 20 Ortalama 1,40 Standart sapma 0,503 Ortanca 1,00 Lenf nodu (-) Minimum 1 Maksimum 2 N 20 Ortalama 4,00 Standart sapma 0 Ortanca 4,00 Metastatik Minimum 4 Maksimum 4 N 12 Ortalama 3,00 Standart sapma 2,00 Ortanca 3,00 Toplam Minimum 1 Maksimum 4 N 52 P değeri 0,277 4.7. Kemik İliği Mikrometastazı İle Östrojen Reseptör Durumu Arasındaki İlişki Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca östrojen reseptörü pozitifliği % 30 (0-100), ortalama östrojen reseptörü pozitifliği % 36,36 bulunurken, mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca östrojen reseptörü pozitifliği % 80 (0-100), ortalama östrojen reseptörü pozitifliği % 59,15 bulundu. Çok değişkenli analizde östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,1). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki 66 istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,901). Kemik iliği mikrometastazı ile östrojen reseptör durumu arasındaki ilişki tablo 14’de gösterilmiştir. Tablo 14. Kemik iliği mikrometastazı ile östrojen reseptör durumu arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı Yok Var Toplam Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Östrojen Reseptörü (%) 59,15 38,437 80,00 0 100 41 36,36 40,749 30,00 0 100 11 54,33 39,656 60,00 0 100 52 P değeri 0,1 4.8. Kemik İliği Mikrometastazı İle Progesteron Reseptör Durumu Arasındaki İlişki Kemik iliği mikrometastazı saptanan grupta ortanca progesteron reseptörü pozitifliği % 0 (0-95), ortalama progesteron reseptörü pozitifliği % 26,36 bulunurken, mikrometastaz saptanmayan grupta ortanca progesteron reseptörü pozitifliği % 30 (0100), ortalama progesteron reseptörü pozitifliği % 39,34 bulundu. Çok değişkenli analizde progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,155). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,733). Kemik iliği mikrometastazı ile progesteron reseptör durumu arasındaki ilişki tablo 15’de gösterilmiştir. 67 Tablo 15. Kemik iliği mikrometastazı ile progesteron reseptör durumu arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı Yok Var Toplam Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Ortalama Standart sapma Ortanca Minimum Maksimum N Progesteron Reseptörü (%) P değeri 39,34 36,775 30,00 0 100 41 26,36 40,006 0.00 0 95 11 36,60 37,459 30,00 0 100 52 0,155 4.9. Kemik İliği Mikrometastazı İle c-erb-B2 Durumu Arasındaki İlişki C-erb-B2 negatif 16 hastanın 2’sinde, 1 pozitif 6 hastanın 3’ünde, 2 pozitif 12 hastanın 1’inde, 3 pozitif 18 hastanın 5’inde kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Cerb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,147) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, c-erb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,222). Kemik iliği mikrometastazı ile c-erb-B2 durumu arasındaki ilişki tablo 16’da gösterilmiştir. 68 Tablo 16. Kemik iliği mikrometastazı ile c-erb-B2 arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı 0 1 c-erb-B2 2 3 Toplam Toplam Yok Var N c-erb-B2 içindeki % 14 % 87,5 2 % 12,5 16 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 34,1 % 18,2 % 30,8 N c-erb-B2 içindeki % 3 % 50 3 % 50 6 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 7,3 % 27,3 % 11,5 N c-erb-B2 içindeki % 11 % 91,7 1 % 8,3 12 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 26,8 % 9,1 % 23,1 N c-erb-B2 içindeki % 13 % 72,2 5 % 27,8 18 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 31,7 % 45,5 % 34,6 N c-erb-B2 içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % 41 % 78,8 % 100 11 % 21,2 % 100 52 % 100 % 100 P değeri 0,147 4.10. Kemik İliği Mikrometastazı İle Histolojik Grade Arasındaki İlişki Histolojik grade 1 olan 4 hastanın 2’sinde (% 50), histolojik grade 2 olan 22 hastanın 3’ünde (% 13,6), histolojik grade 3 olan 26 hastanın 6’sında (% 23,1) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Histolojik grade ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,247). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, histolojik grade ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,435). Kemik iliği mikrometastazı ile histolojik grade arasındaki ilişki tablo 17’de gösterilmiştir. 69 Tablo 17. Kemik iliği mikrometastazı ile histolojik grade arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı 1 Histolojik Grade 2 3 Toplam Toplam Yok Var N Histolojik Grade içindeki % 2 % 50 2 % 50 4 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 4,9 % 18,2 % 7,7 N Histolojik Grade içindeki % 19 % 86,4 3 % 13,6 22 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 46,3 % 27,3 % 42,3 N Histolojik Grade içindeki % 20 % 76,9 6 % 23,1 26 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 48,8 %54,5 % 50 N Histolojik Grade içindeki % 41 % 78,8 11 % 21,2 52 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 100 % 100 % 100 P değeri 0,247 4.11. Kemik İliği Mikrometastazı İle Lenfovasküler İnvazyon Arasındaki İlişki: Lenfovasküler invazyonu olan 32 hastanın 6’sında (% 18,8), lenfovasküler invazyonu olmayan 20 hastanın 5’inde (% 25) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,591). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile lenfovasküler invazyon arasındaki ilişki tablo 18’de gösterilmiştir. Tablo 18. Kemik iliği mikrometastazı ile lenfovasküler invazyon arasındaki ilişki: Kemik iliği mikrometastazı Toplam Yok Var N 15 5 20 Lenfovasküler invazyon içindeki % % 75 % 25 % 100 Yok Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 36,6 % 45,5 % 38,5 Lenfovasküler N 26 6 32 İnvazyon Lenfovasküler invazyon içindeki % % 81,3 % 18,8 % 100 Var Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 63,4 % 54,5 % 61,5 N 41 11 52 Lenfovasküler invazyon içindeki % % 78,8 % 21,2 % 100 Toplam Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 100 % 100 % 100 70 P değeri 0,591 4.12. Kemik İliği Mikrometastazı İle Menopozal Durum Arasındaki İlişki Premenopozal 28 hastanın 4’ünde (% 14,3), postmenopozal 22 hastanın 7’sinde (% 31,9) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Menopozal durum ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,144) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, menopozal durum ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,435) Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki tablo 19’da gösterilmiştir. Tablo 19. Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki: Kemik iliği mikrometastazı Toplam Yok Var N 24 4 28 Menopozal durum içindeki % % 85,7 % 14,3 % 100 Pre menopozal Kemik iliği mikrometastazı % 61,5 % 36,3 % 56 içindeki % Pre/Post Menopozal N 15 7 22 Menopozal durum içindeki % % 68,1 % 31,9 % 100 Post menopozal Kemik iliği mikrometastazı % 38,5 % 63,7 % 44 içindeki % N 39 11 50 Menopozal durum içindeki % % 78 % 22 % 100 Toplam Kemik iliği mikrometastazı % 100 % 100 % 100 içindeki % P değeri 0,144 4.13. Kemik İliği Mikrometastazı İle DCİS Komponenti Arasındaki İlişki Primer tümörde DCİS komponenti içeren 25 hastanın 5’inde (% 20), DCİS komponenti içermeyen 27 hastanın 6’sında (% 22,2) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. DCİS komponenti varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,845). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, DCİS komponenti varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,88). Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki tablo 20’de gösterilmiştir. 71 Tablo 20. Kemik iliği mikrometastazı ile DCİS komponenti arasındaki ilişki Yok DCİS komponenti Var Toplam 4.14. N DCİS komponenti içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N DCİS komponenti içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N DCİS komponenti içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Kemik İliği Mikrometastazı Kemik iliği mikrometastazı Yok Var 21 6 % 77,8 % 22,2 % 51,2 % 54,5 20 5 % 80 % 20 % 48,8 % 45,5 41 11 % 78,8 % 21,2 % 100 % 100 İle Kemik Toplam P değeri 27 % 100 % 51,9 25 % 100 % 48,1 52 % 100 % 100 0,591 İliği Biyopsisinde İmmünohistokimyasal Yöntemle Gösterilmiş Kemik İliği Metastazı Arasındaki İlişki Kemik iliği biyopsisinde immünohistokimyasal yöntemle kemik iliği metastazı saptanan 2 hastanın 2’sinde de flovsitometrik yöntemle mikrometastatik hücreler gösterildi. (% 100). Kemik iliği metastazı olmayan 50 hastanın 9’unda (% 18) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik iliği metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik iliği metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,031). Kemik iliği mikrometastazı ile menopozal durum arasındaki ilişki tablo 21’de gösterilmiştir. Tablo 21. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik iliği biyopsisinde immünohistokimyasal yöntemle gösterilmiş kemik iliği metastazı arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı Toplam P değeri yok var N 41 9 50 Kemik iliği metastazı içindeki % % 82 % 18,2 % 100 Yok Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 100 % 81 % 96,2 Kemik iliği metastazı N 0 2 2 0,005 Kemik iliği metastazı içindeki % %0 % 100 % 100 Var Kemik iliği mikrometastazı içindeki % %0 % 18,2 % 3,8 N 41 11 52 Toplam Kemik iliği metastazı içindeki % % 78,8 % 21,2 % 100 Kemik iliği mikrometastazı içindeki % % 100 % 100 % 100 72 4.15. Kemik İliği Mikrometastazı İle Karaciğer Metastazı Arasındaki İlişki Karaciğer metastazı saptanan 5 hastanın 3’ünde (% 60), karaciğer metastazı olmayan 47 hastanın 8’inde (% 17) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Karaciğer metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,025). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, karaciğer metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile karaciğer metastazı arasındaki ilişki tablo 22’de gösterilmiştir. Tablo 22. Kemik iliği mikrometastazı ile karaciğer metastazı arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı Toplam Yok Karaciğer metastazı Var Toplam N Karaciğer metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Karaciğer metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Karaciğer metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Yok Var 39 % 83 % 95,1 2 % 40 % 4,9 41 % 78,8 % 100 8 % 17 % 72,7 3 % 60 % 27,3 11 % 21,2 % 100 47 % 100 % 90,4 5 % 100 % 9,6 52 % 100 % 100 P değeri 0,025 4.16. Kemik İliği Mikrometastazı İle Serebral Metastaz Arasındaki İlişki Serebral metastaz saptanan 3 hastanın 1’inde (% 33,3), serebral metastazı olmayan 49 hastanın 10’unda (% 20,4) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Serebral metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,595). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, serebral metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,005). Kemik iliği mikrometastazı ile serebral metastaz arasındaki ilişki tablo 23’de gösterilmiştir. 73 Tablo 23. Kemik iliği mikrometastazı ile serebral metastazı arasındaki ilişki: Yok Serebral metastaz Var Toplam N Serebral metastaz içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Serebral metastaz içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Serebral metastaz içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı Yok Var 39 10 % 79,6 % 20,4 % 95,1 % 90,9 2 1 % 66,7 % 33,3 % 4,9 % 9,1 41 11 % 78,8 % 21,2 % 100 % 100 Toplam P değeri 49 % 100 % 94,2 3 % 100 % 5,8 52 % 100 % 100 0,595 4.17. Kemik İliği Mikrometastazı İle Akciğer Metastazı Arasındaki İlişki Akciğer metastazı saptanan 2 hastanın 2’sinde (% 100), akciğer metastazı olmayan 50 hastanın 9’unda (% 18) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Serebral metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, akciğer metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,031). Kemik iliği mikrometastazı ile akciğer metastazı arasındaki ilişki tablo 24’de gösterilmiştir. Tablo 24. Kemik iliği mikrometastazı ile akciğer metastazı arasındaki ilişki Kemik iliği mikrometastazı Toplam Yok Akciğer Metastazı Var Toplam N Akciğer metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Akciğer metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Akciğer metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Yok Var 41 % 82 % 100 0 %0 %0 41 % 78,8 % 100 9 % 18 % 81,8 2 % 100 % 18,2 11 % 21,2 % 100 50 % 100 % 96,2 2 % 100 % 3,8 52 % 100 % 100 P değeri 0,013 4.18. Kemik İliği Mikrometastazı İle Kemik Metastazı Arasındaki İlişki Kemik metastazı saptanan 10 hastanın 5’inde (% 50), kemik metastazı olmayan 42 hastanın 6’sında (% 14,3) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu. 74 (p=0,013) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Kemik iliği mikrometastazı ile kemik metastazı arasındaki ilişki tablo 25’de gösterilmiştir. Tablo 25. Kemik iliği mikrometastazı ile kemik metastazı arasındaki ilişki (p=0,013) Kemik iliği mikrometastazı Toplam Yok Kemik Metastazı Var Toplam N Kemik metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Kemik metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % N Kemik metastazı içindeki % Kemik iliği mikrometastazı içindeki % Yok Var 36 % 85,7 % 87,8 5 % 50 % 12.2 41 % 78.8 % 100 6 % 14,3 % 54,5 5 % 50 % 45.5 11 % 21.2 % 100 42 % 100 % 80,8 10 % 100 % 19.2 52 % 100 % 100 Tablo 26. Klinik değişkenlere göre kemik iliği mikrometastazı prevalansı Klinik Değişken Yaş - % 20-35 yaş 36-50 yaş 51-65 yaş >65 yaş Tümör boyutu T1 T2 T3 T4 Lenf nodu Metastazı N0 N1 N2 N3 Menopozal durum Premenopozal Postmenopozal Histolojik Grade 1 2 3 Östrojen reseptörü Pozitif Negatif Toplam hasta Kemik iliği mikrometastazlı hastalar Kemik iliği mikrometastazı olmayan hastalar 7 26 15 4 1 2 6 3 6 24 9 1 21 24 6 1 2 8 0 1 19 18 6 0 22 9 12 11 5 1 2 3 17 8 10 8 28 22 4 7 24 15 4 22 26 2 3 3 2 19 23 40 12 6 5 34 7 75 P değeri 0,036* 0,092 0,843 0,144 0,247 0,1 Tablo 26’nın devamı Progesteron reseptörü Pozitif Negatif C-erb-b2 0 +1 +2 +3 Tümör alt tipi İDK İLK Müsinöz Mikst Evre I II III IV Lenfovasküler invazyon Pozitif Negatif DCİS komponenti Pozitif Negatif Cinsiyet Erkek Kadın Kemik iliği metastazı Pozitif Negatif Kemik metastazı Pozitif Negatif Karaciğer metastazı Pozitif Negatif Akciğer metastazı Pozitif Negatif Serebral metastaz Pozitif Negatif * istatistiksel olarak anlamlı 0,155 35 17 4 7 31 10 14 6 11 18 2 3 1 5 12 3 10 13 43 4 1 3 10 1 0 0 33 3 1 0 12 20 8 12 1 4 1 5 11 16 7 7 32 20 6 5 26 15 25 27 5 6 20 21 0,591 2 50 0 11 2 39 0,455 2 50 2 11 0 39 10 42 5 6 5 36 5 47 3 8 2 39 0,025* 2 50 2 9 0 41 0,005* 3 49 1 10 2 39 0,595 76 0,147 0,377 0,227 0,591 0,005* 0,013* 5. TARTIŞMA Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir ve akciğer kanserinden sonra, kansere bağlı ölümlerin ikinci en sık sebebidir. Kadınlarda görülen kanserlerin üçte birinden sorumludur.1,2 Meme kanseri erken tanı ve tedavisinde ilerlemelere rağmen, halen yüksek morbidite ve mortalite oranına sahiptir. Hastalar genellikle uzak metastazlar nedeniyle kaybedilmektedir. Adjuvan kemoterapinin yaygın olarak kullanılması, meme kanseri mortalitesini azaltmıştır. Bununla beraber, bu tedaviyi alan bazı hastalar, tedavinin faydasından çok, gereksiz toksisitesine maruz kalmaktadır. Klinik pratikte, meme kanseri ile ilgili en önemli prognostik ve prediktif bilgi; patolojik evrelendirme (tümör boyutu, aksiller lenf nodu tutulumu, lenfatik ve vasküler invazyon varlığı, tümörün grade ve östrojen/progesteron reseptör durumu) ile elde edilmektedir. Lenf nodu metastazı halen en önemli prognostik faktör olarak kabul edilmektedir. Metastatik lenf nodu sayısı arttıkça sistemik metastaz riski daha fazla, prognoz daha kötüdür. Bununla beraber, olumlu prognostik faktölere sahip (lokalize hastalığı olan ve lenf nodu metastazı olmayan) meme kanserli hastaların yaklaşık % 25’inde sistemik relaps gelişmekte; buna karşın kötü prognostik faktörlere sahip (lenf nodu metastazı olan) hastaların en az % 30’unda primer tedaviyi takip eden 5-10 yıl içinde relaps gelişmemektedir.153-156 Bu nedenle, adjuvan sistemik tedaviden fayda görecek hastaların seçimi ve gereksiz toksisite ve maliyetten kaçınmak için; yeni, daha doğru ve güvenilir prognostik faktörlere ihtiyaç vardır. Solid epitelyal tümörlerde, dissemine tümör hücreleri (DTC) kavramı 30 yıl önce ortaya atılmıştır.94-96 Kemik iliği mikrometastazı için en geniş çalışmalar meme kanserinde yapılmıştır. DTC (dissemine tümör hücreleri) terimi en doğru tanımlamadır; ayrıca minimal rezidüel hastalık (MRD), kemik iliğinden izole edilen tümör hücreleri (İTH), gizli metastatik hücreler veya kemik iliği mikrometastazı gibi terimlerde kullanılmaktadır. Mikrometastaz, primer tümörden uzak organlara yayılmış tümör hücrelerinin, mikroskobik metastatik depozitleri olarak tanımlanabilir.95,97,98 Kemik iliğinde sıklıkla tek tek veya gruplar halinde bulunan tümör hücreleri, kemik iliği mikrometastazları olarak tanımlanmaktadır. Bu hücreler klasik görüntüleme yöntemleri ile tespit edilememektedir. Tümör gelişiminin olasılıkla erken döneminde meydana gelen mikrometastatik yayılım; kan, lenf nodları veya kemik iliğine olabilmekte; kemik 77 iliği primer tümörden köken alan mikrometastatik hücrelerin en sık yayıldığı organ olarak kabul edilmektedir. Bu hücreler yıllarca iskelet metastazı veya tekrar dolaşıma geçerek uzak metastaz geliştirmeden G0 fazında kalmaktadır.99 Lenf nodu tutulumu (evre N0) veya uzak metastazın klinik ve histopatolojik bulgusu olmayan (evre M0) epitelyal tümörlerde (meme, prostat, kolon ve akciğer karsinomları gibi) kemik iliği mikrometastazı oranı % 20-40 arasında değişmektedir. Tek merkezli, önemli sayıda hastayı kapsayan ve yeterli izlem süresi olan çalışmaların çoğunda, kemik iliği mikrometastazı varlığı ile kötü prognoz arasındaki ilişki gösterilmiştir. Mansi ve arkadaşları, anti-EMA antikoru kullanarak, ortalama 12,5 yıllık takip süresi sonrası, ilk tanı anındaki kemik iliği durumu ile uzak metastaz gelişimi ve toplam sağkalım arasında önemli bir prognostik ilişki bulmuştur.136 Diel ve Arkadaşları 727 hastayı kapsayan bir grupta, 36 ay takipten sonra, kemik iliği mikrometastazı ile hastalıksız ve toplam sağkalım arasındaki ilişkiyi göstermiştir. Bu çalışmada kemik iliği mikrometastazının prognostik değeri; lenf nodu tutulumu, tümör boyutu ve tümörün histolojik grade’inden daha üstün bulunmuştur.158 Son dört prospektif çalışma toplam 2316 hastayı kapsamış ve kemik iliği mikrometastazı varlığının klasik prognostik faktörlerden bağımsız olarak kötü prognoz ile ilişkisi gösterilmiştir.99,159-161 Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan, evre I-III operabl meme kanserli 4703 hastayı içeren bir meta-analizde, kemik iliğinde immünositokimyasal yöntemle gösterilen DTC varlığının, kötü prognozla ilişkisi gösterilmiştir.3 Bu hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 bulunmuştur. Bu çalışmaya % 90’ı T1 ve T2 tümöre sahip, uzak metastazı olmayan, % 58’i nod negatif ve % 70’i adjuvan kemoterapi almış hastalar dahil edilmiştir. Kemik iliği mikrometastazı varlığı özellikle büyük tümör boyutu, yüksek tümör grade, lenf nodu metastazı varlığı ve hormon reseptör negatifliği ile ilişkili bulunmuştur. Çok değişkenli analizde, kemik iliği mikrometastazları diğer prognostik faktörlerden bağımsız olarak, azalmış genel ve meme kanseri spesifik sağkalım oranlarıyla ilişkili bulunmuştur.3 Bugüne kadar başlıca immünositokimyasal yöntemlerin kullanıldığı çalışmalarda, kemik iliğinde DTC’nin bulunmasının toplam ve hastalıksız sağkalımın bağımsız bir göstergesi ve kötü prognostik faktör olduğu ortaya koyulmuştur.3,99,159,162-168 Bununla beraber, prognozla ilişkisi gösterilemeyen çalışmalar da vardır.169,170 Kemik iliği aspirasyon teknikleri, materyallerin hazırlanışı, kullanılan antikorlar, zenginleştirme yöntemlerinin kullanılıp kullanılmaması, analiz edilen hücre 78 sayıları, hastaların evreleri ve takip süreleri arasındaki farklılıklar nedeniyle çelişkili sonuçlar ortaya çıkmaktadır. Metastatik hastalarda ise kemik iliğinde mikrometastaz varlığından çok dolaşımda tümör hücreleri varlığı prognozla ilişkili olduğu gösterilmiştir.358 Kemik iliği mikrometastazının meme kanserinde prognostik faktör olarak kullanımı, veri yetersizliği ve standart yöntemin henüz ortaya koyulamaması nedeniyle ASCO tarafından onaylanmamıştır. Meme ve diğer solid tümörlerde kemik iliği mikrometastazlarını belirlemek için birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Lenf nodları, kan ve kemik iliğinde çok az sayıda ve tek tek bulunan bu hücreleri bulabilmek için immünositokimyasal, flovsitometrik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir. İmmünositokimyasal yöntemler, mikrometastatik hücrelerin epitelyal veya tümör ilişkili antijenlerini belirleyen monoklonal antikorlarla boyanarak tespit edildiği, bugüne kadar en sık kullanılan yöntemdir.159,215,216,244 Bu yöntem kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesi için halen altın standart olarak kabul edilmektedir. Yapılan çalışmalarda evre I-III meme kanserli hastalarda immünositokimyasal yöntemlerle kemik iliği mikrometastazı bulunma oranının, kullanılan antikora bağlı olarak % 4-48 arasında değiştiği bildirilmiştir.245,246 İmmünositokimyasal yöntemin diğer yöntemlere üstünlüğü, sitokeratin (+) hücrelerin görerek değerlendirilmesi ve yanlış pozitifliğin dışlanabilmesidir. Dezavantajları ise, gözlemcinin yorumuna bağımlı subjektif bir yöntem olması ve oldukça zaman alıcı bir yöntem olmasıdır. Sadece bir hastanın bu yöntemle değerlendirilmesi ortalama 4 gün sürmektedir. RT-PCR yönteminin kullanıldığı çalışmalarda, 107 normal kemik iliği hücresi içinde tek bir tümör hücresini bulabilecek hassasiyette olduğu ve immünositokimyasal yönteme daha üstün olduğu ileri sürülmüştür.211,279-281 Bugüne kadar RT-PCR yönteminin kullanıldığı çalışmalarda kemik iliği mikrometastazı bulunma oranı kullanılan primerlere bağlı olarak % 0-71 arasında değişmektedir. Bu kadar değişken sonuçların ortaya koyulması yanlış pozitif sonuçlara bağlanmıştır. Kullanılan primerler normal kemik iliği hücreleri ile çapraz reaksiyon vermektedir. Hem immünositokimya hem de RT PCR yönteminin canlı ve apopitotik hücreler arasında ayrım yapamaması nedeniyle, son zamanlarda mikrometastatik hücrelerin analizi için bu önemli farkı ayırt etmeye olanak tanıyan yeni bir teknik geliştirilmiştir.283 ELİSPOT tekniği spesifik marker proteinlerin sekresyon veya aktif salınımını kullanan enzim-bağlı immünospot teknolojisinin adapte edilmiş şeklidir. Bu yöntemle MUC1 ve 79 CK19 sekrete eden hücrelerin sayılması yoluyla, uzak metastazı olan meme kanserli hastaların % 90’ında, uzak metastazı olmayan hastaların ise % 54’ünde kemik iliğinde mikrometastatik hücreler tespit edilmiştir.285 Flovsitometrik yöntem, hematolojik malignensilerde kan ve kemik iliğindeki göreceli olarak çok az sayıdaki kanser hücrelerini bulmak için geliştirilmiştir.286-288 Bu yöntemin özellikle 106 hücre içinde tek bir hücreyi belirleyebilecek duyarlılığa sahip olduğu rapor edilmiştir, ancak bu duyarlılık tüm çalışmalarda gösterilememiştir.289 Clevenger ve arkadaşları, meme kanserli hastalarda CD45 ve sitokeratin18 monoklonal antikorları kullanılarak tümör hücrelerinin normal hematopoietik hücrelerden yüksek duyarlılıkla ayırt edilebileceğini bildirmiştir.287 Flovsitometrik yöntemin immünositokimyasal ve diğer ışık mikroskobik yöntemlere üstünlüğü, ploidi durumunun belirlenebilmesi, apopitotik ve ölü hücreleri ayırt edebilmesi, objektif bir yöntem olması ve çok sayıdaki hücrenin kısa sürede sayılabilmesidir. Biz de çalışmamızda, günlük pratikte kullanılabilirliği, hızlı sonuç alınabilmesi ve ilgili çalışmaların çok az sayıda olması nedeniyle flovsitometri yöntemini kullandık. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde, T1 tümör boyutuna sahip hastaların % 25,2’sinde, T2 tümör boyutuna sahip hastaların % 33,3’ünde, T3 tümör boyutuna sahip hastaların % 38’inde, T4 tümör boyutuna sahip hasta % 60,4’ünde kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (p<0,001 anlamlı).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, T1 tümör boyutuna sahip 13 hastanın 1’inde (% 7,6), T2 tümör boyutuna sahip 7 hastanın 4’ünde (% 57) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, T1 tümör boyutuna sahip 5 hastada, T2 tümör boyutuna sahip 10 hastada ve T3 tümör boyutuna sahip 4 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Bu grupta T4 tümör boyutuna sahip 1 hastada kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan, T1 tümör boyutuna sahip 3 hastanın 1’inde (% 33,3), T2 tümör boyutuna sahip 7 hastanın 4’ünde (% 57) kemik iliği mikrometastazı saptanırken, T3 tümöre sahip 2 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu. Tüm hastalar birlikte değerlendirildiğinde T1 tümör boyutuna sahip 21 hastanın 2’sinde (% 9,5), T2 tümör boyutuna sahip 24 hastanın 8’inde (% 33,3), T3 tümör boyutuna sahip 6 hastanın 0’ında (% 0), T4 tümör boyutuna sahip 1 hastada (% 100) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Bizim çalışmamızda çok değişkenli analizde tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki 80 istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,092) Hastalar lenf nodu ve uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) ve uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, tümör boyutu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu. (p<0,001) T3 tümör boyutuna sahip hastalar dışlandığında, tümör boyutu arttıkça kemik iliği mikrometastazı oranının arttığı bulundu. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde ise tek değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazı ile ilişkili bulunurken, çok değişkenli analizde ilişki gösterilememiştir. Bizim çalışmamızda ise alt grup analizinde ilişkili bulundu ancak tüm hastalar birlikte ele alındığında ilişki gösterilemedi.3 Bizim çalışmamızda bu bulgularla uyumlu bulgular elde edildi. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde, N0 lenf nodu metastazına sahip hastaların % 26,4’ünde, N1 lenf nodu metastazına sahip hastaların % 30’unda, N2 lenf nodu metastazına sahip hastaların % 39,4’ünde ve N3 lenf nodu metastazına sahip hastaların % 50’sinde kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (p=0,001).3 Bizim çalışmamızda lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, N1 lenf nodu metastazına sahip 9 hastanın 1’inde (% 11,1) kemik iliği mikrometastazı saptanırken, N2 lenf nodu metastazına sahip 6 hastada ve N3 lenf nodu metastazına sahip 5 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Lenf nodu metastazı negatif (N0) 20 hastanın 5’inde (% 25) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan, N0 lenf nodu metastazına sahip 2 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu. (% 0) Oniki metastatik hastadan; N1 lenf nodu metastazına sahip hasta yoktu, N2 lenf nodu metastazına sahip 6 hastanın ikisinde (% 33,3) ve N3 lenf nodu metastazına sahip 6 hastanın üçünde (% 50) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Tüm hastalar birlikte değerlendirildiğinde N0 lenf nodu metastazına sahip 22 hastanın 5’inde (% 22,7), N1 lenf nodu metastazına sahip 9 hastanın 1’inde (% 11,1), N2 lenf nodu metastazına sahip 12 hastanın 2’sinde (% 16,6) ve N3 lenf nodu metastazına sahip 11 hastanın 3’ünde (% 27,2) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Bizim çalışmamızda çok değişkenli analizde metastatik lenf nodu sayısı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,843) Hastalar lenf nodu metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, lenf nodu metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu 81 (p<0,001). Bizim çalışmamızda, Braun ve arkadaşlarının yaptığı meta-analizle karşılaştırıldığında lenf nodu pozitif grup dışında uyumlu bulgular elde edildi. Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde yaşa göre kemik iliği mikrometastaz oranı, 20-35 yaş arasındaki hastalarda (% 34,8), 36-50 yaş arasındaki hastalarda (% 33,3), 51-65 yaş arasındaki hastalarda (% 29,5), 65 yaş üstü hastalarda (% 27,8) bulunmuştur (p=0,001 anlamlı).3 Çalışmamızda hastaların yaşı ile kemik iliği mikrometastazı varlığı arasındaki ilişki değerlendirildiğinde, lenf nodu negatif 20 hastadan 20-35 yaş arasındaki 3 hastanın 1’inde (% 33,3), 36-50 yaş arasındaki 9 hastanın 2’sinde (% 22,2), 51-65 yaş arasındaki 7 hastanın 2’sinde (% 28,5) kemik iliği mikrometastazı saptanırken, 65 yaş üstü 1 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu (% 0). Lenf nodu pozitif 20 hastadan 20-35 yaş arasındaki 2 hastada, 36-50 yaş arasındaki 13 hastada, 51-65 yaş arasındaki 3 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulunurken, 65 yaş üstü 2 hastanın 1’inde (% 50) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan 20-35 yaş arasındaki 2 hastada ve 36-50 yaş arasındaki 4 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulunurken, 51-65 yaş arasındaki 5 hastanın 4’ünde (% 80), 65 yaş üstü 1 hastada kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 100). Tüm hastalar beraber ele alındığında 20-35 yaş arasındaki 7 hastanın 1’inde (% 14,2), 36-50 yaş arasındaki 26 hastanın 2’sinde (% 7,6), 51-65 yaş arasındaki 15 hastanın 6’sında (% 40), 65 yaş üstü 4 hastanın 3’ünde (% 75) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Bizim çalışmamızda, çok değişkenli analizde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,036). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, yaş ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,759) Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; premenopozal hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 32,7), postmenopozal hastalarda (% 29,5) bulunmuştur (p=0,02).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, premenopozal 9 hastanın 3’ünde (% 33,3), postmenopozal 11 hastanın 2’sinde (% 18,1) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, premenopozal 13 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı, postmenopozal 7 hastanın 1’inde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 14,2) Oniki metastatik 82 (evre IV) hastadan premenopozal 7 hastanın 1’inde (% 14,2), postmenopozal 5 hastanın 4’ünde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 80). Tüm hastalar beraber ele alındığında, premenopozal 28 hastanın 4’ünde (% 14,3), postmenopozal 22 hastanın 7’sinde (% 31,9) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Menopozal durum ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,144) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, menopozal durum ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,435) Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; reseptör negatif hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 34,5), herhangi bir reseptörü (östrojen ve/veya progesteron) pozitif hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 29,4) bulunmuştur (p=0,003).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, östrojen reseptörü negatif 6 hastanın 3’ünde (% 50), östrojen reseptörü pozitif 14 hastanın 2’sinde (% 14,2) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, östrojen reseptörü negatif 3 hastanın 1’inde (% 33,3) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunurken, östrojen reseptörü pozitif 17 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Oniki metastatik (evre IV) hastadan östrojen reseptörü negatif 3 hastanın 1’inde (% 33,3), östrojen reseptörü pozitif 9 hastanın 4’ünde (% 44,4) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Tüm hastalar beraber ele alındığında, östrojen reseptörü negatif 12 hastanın 5’inde (% 41,6), östrojen reseptörü pozitif 40 hastanın 6’sında (% 15) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Çok değişkenli analizde östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,1) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, östrojen reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,901) Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; reseptör negatif hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 34,5), herhangi bir reseptörü (östrojen ve/veya progesteron) pozitif hastalarda kemik iliği mikrometastazı oranı (% 29,4) bulunmuştur (p=0,003).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, progesteron reseptörü negatif 7 hastanın 4’ünde (% 57,1), progesteron reseptörü pozitif 83 13 hastanın 1’inde (% 7,6) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, östrojen reseptörü negatif 6 hastanın 1’inde (% 16,6) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunurken, progesteron reseptörü pozitif 14 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Oniki metastatik (evre IV) hastadan progesteron reseptörü negatif 4 hastanın 2’sinde (% 50), progesteron reseptörü pozitif 8 hastanın 3’ünde (% 37,5) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Tüm hastalar beraber ele alındığında, progesteron reseptörü negatif 17 hastanın 7’sinde (% 41,1), progesteron reseptörü pozitif 35 hastanın 4’ünde (% 11,4) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Çok değişkenli analizde progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,155) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, progesteron reseptörü durumu ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,733) Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; çalışmaların yapıldığı dönemde c-erb-B2 rutin olarak değerlendirilmediği için bu çalışmada klinik parametre olarak kullanılmamıştır.3 C-erb-B2 ekspresyonu azalmış sağkalım ile ilişkilidir ve meme kanserli hastaların % 20-35’inde aşırı-eksprese edilmektedir. Aynı zamanda kemik iliğindeki mikrometastatik hücrelerde c-erb-B2 aşırı-ekspresyonu kötü prognoz için bir prediktördür.220 Bu nedenle, mikrometastatik hücrelerde c-erb-B2’nin hem mRNA (RT-PCR) değerlendirilmesi, hem de immünoterapi DNA (FİSH) (trastuzumab) yöntemleriyle için ekspresyonunun giderek daha sık kullanılmaktadır.368 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, c-erb-B2 negatif 8 hastanın 2’inde (%25), c-erb-B2 1(+) 4 hastanın 2’sinde (%50), c-erb-B2 2(+) 2 hastanın 0’ında (% 0), c-erb-B2 3(+) 6 hastanın 1’inde (% 16,6) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, c-erb-B2 negatif 5 hastada, c-erb-B2 1(+) 1 hastada ve c-erb-B2 2(+) 8 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu; c-erb-B2 3(+) 6 hastanın 1’inde (% 16,6) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan c-erb-B2 negatif 2 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulunurken, c-erb-B2 1(+) 1 hastada (% 100), c-erb-B2 2(+) 1 hastada (% 100), c-erb-B2 3(+) 6 hastanın 3’ünde (% 50) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Tüm hastalar beraber ele alındığında, c-erb-B2 negatif 14 hastanın 2’sinde (% 14,2), c-erb-B2 1(+) 6 hastanın 3’ünde (% 50), c-erb-B2 2(+) 11 hastanın 84 1’inde (% 9), c-erb-B2 3(+) 18 hastanın 5’inde (% 27,7) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. c-erb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,147). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, c-erb-B2 ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,222). Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; mikrometastaz oranları invaziv duktal karsinom alt tipine sahip hastalarda (% 30,7), invaziv lobüler karsinom alt tipine sahip hastalarda (% 31,4), mikst alt tipe sahip hastalarda (% 28,4), inflamatuar alt tipe sahip hastalarda (% 47,8) bulunmuştur (p=0,08).3 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, invaziv duktal karsinom alt tipine sahip 16 hastanın 4’ünde (% 25), invaziv lobüler karsinom alt tipine sahip 2 hastanın 1’inde (% 50) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Bu grupta müsinöz karsinomu olan 1 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, invaziv duktal karsinom alt tipine sahip 16 hastanın 1’inde (% 6,25) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu, invaziv lobüler karsinom alt tipine sahip 2 hastada ve mikst tip alt tipe sahip 2 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Oniki metastatik (evre IV) hastadan invaziv duktal karsinom alt tipine sahip 11 hastanın 5’inde (% 45,4) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Bu grupta mikst alt tipe sahip 1 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Tüm hastalar beraber ele alındığında, invaziv duktal karsinom alt tipine sahip 43 hastanın 10’unda (% 23,2), invaziv lobüler karsinom alt tipine sahip 4 hastanın 1’inde (% 25) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu, mikst alt tipe sahip 3 hastada ve müsinöz karsinomu olan 1 hastada kemik iliği mikrometastazı saptanmadı. Çok değişkenli analizde tümör alt tipi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,377). Hastalar lenf nodu metastazı (+), (-) ve uzak metastatik hastalar olarak alt gruplara ayrıldığında, tümör alt tipi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,680). Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; evre I-III hastalar değerlendirilmiş ve evre arttıkça mikrometastaz oranının arttığı belirtilmiştir.3 Bidard ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, uzak metastazlı 138 hastanın kemik iliği mikrometastazı açısından immünositokimyasal yöntemle değerlendirilmiş ve hastaların 85 % 59’unda kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır. Ancak azalmış toplam sağkalım ile ilişkisi gösterilememiştir.358 Çalışmamızda kemik iliği mikrometastazı saptanan 11 hastadan; 1 hasta evre I (%9), 4 hasta evre II (% 36), 1 hasta evre III (% 9) ve 5 hasta evre IV (% 46) grubunda idi. Evre I 12 hastanın 1’inde (% 8,3), evre II 20 hastanın 4’ünde (% 20), evre III 8 hastanın 1’inde (% 12,5) ve evre IV 12 hastanın 5’inde (% 41,6) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Çok değişkenli analizde tümörün evresi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,227). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, tümörün evresi ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; histolojik grade 1 tümöre sahip hastalarda (% 22,5), histolojik grade 2 tümöre sahip hastalarda (% 29,9), histolojik grade 3 tümöre sahip hastalarda (% 34,5) oranında kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunmuştur (p<0,001). Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, histolojik grade 1 tümöre sahip 3 hastanın birinde (% 33,3), histolojik grade 2 tümöre sahip 9 hastanın 2’sinde (% 22), histolojik grade 3 tümöre sahip 8 hastanın 2’sinde (% 25) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, histolojik grade 1 tümöre sahip hasta yoktu, histolojik grade 2 tümöre sahip hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu, histolojik grade 3 tümöre sahip 12 hastanın 1’inde (% 8,3) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan histolojik Grade 1 tümöre sahip 1 hastada (% 100), histolojik grade 2 tümöre sahip 5 hastanın 1’inde (% 20), histolojik grade 3 tümöre sahip 6 hastanın 3’ünde (% 50) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Tüm hastalar beraber ele alındığında, grade 1 tümöre sahip 4 hastanın 2’sinde (% 50), histolojik grade 2 tümöre sahip 22 hastanın 2’sinde (% 9), histolojik grade 3 tümöre sahip 26 hastanın 6’sında (% 23) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Histolojik grade ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,247). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, histolojik grade ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,435). 86 Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; lenfovasküler invazyon varlığı klinik parametre olarak değerlendirilmemiştir. Naume ve arkadaşları tarafından yapılan ve 920 hastayı kapsayan bir çalışmada, immünositokimyasal yöntem kullanılarak, kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu, aksiller lenf nodu tutulumu, lenfovasküler invazyon varlığı, c-erb-B2 ekspresyonu ve ER/PR durumu arasında pozitif korelasyon bulmuşlardır.357 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, lenfovasküler invazyon pozitif 3 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu, lenfovasküler invazyon negatif 17 hastanın 5’inde (% 29,4) kemik iliği mikrometastazı saptandı. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, lenfovasküler invazyon pozitif 19 hastanın 1’inde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 5,2), lenfovasküler invazyon negatif 1 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan lenfovasküler invazyon negatif 2 hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu, lenfovasküler invazyon pozitif 10 hastanın 5’inde kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 50). Tüm hastalar beraber ele alındığında, lenfovasküler invazyon negatif 20 hastanın 5’inde (% 25), lenfovasküler invazyon pozitif 32 hastanın 6’sında (% 18,75) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu (% 50). Lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,591). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Braun ve arkadaşları tarafından yayınlanan meta-analizde; DCİS komponenti varlığı klinik parametre olarak değerlendirilmemiştir. Yonksik Jonk ve arkadaşları tarafından yapılan ve RT-PCR yönteminin kullanıldığı bir çalışmada DCİS tanısı olan 4 hastanın birisinde kemik iliği mikrometastazı saptanmış ve klinik takiplerinde 4 hastanın hiç birisinde rekürrens gözlenmemiştir.166 Bizim çalışmamıza DCİS (Tis) tümöre sahip hastalar dahil edilmedi. Primer tümörlerde DCİS varlığı c-erb-B2 ve p53 pozitifliği ile güçlü bir şekilde ilişkilidir.359,360 Kutun ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada 49 meme kanserli hastanın 21’inde DCİS komponenti pozitif bulunmuş, DCİS pozitif hastaların 9’unda (%42,8) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunmuştur. (p=0,002) DCİS lezyonları genellikle heterojendir ve çeşitli histolojik subtipler relaps ve uzak metastaz olasılığında önemli farklara neden olmaktadır. Bu nedenle DCİS’in 87 histolojik subtipleri ile kemik iliği mikrometastazı arasında bir korelasyon olabileceği düşünülmektedir.361,362 Çalışmamızda, lenf nodu metastazı negatif 20 hastadan, primer tümörde DCİS komponenti pozitif 10 hastanın 1’inde (% 10), negatif 10 hastanın 4’ünde (% 40) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Lenf nodu metastazı pozitif 20 hastadan, primer tümörde DCİS komponenti pozitif 10 hastanın 1’inde (% 10) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu, DCİS komponenti negatif 10 hastada ise kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu. Oniki metastatik (evre IV) hastadan DCİS komponenti pozitif 5 hastanın 3’ünde (% 60), negatif 7 hastanın 2’sinde (% 28,5) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Tüm hastalar beraber ele alındığında, DCİS komponenti pozitif 25 hastanın 5’inde (% 20), negatif 27 hastanın 6’sında (% 22,2) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı. (p=0,591) Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, lenfovasküler invazyon ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Daha önceki çalışmalarda cinsiyet ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki araştırılmamıştır. Çalışmamızda, 50’si kadın, 2’si erkek toplam 52 hasta dahil edildi. Çalışmaya dahil edilen iki erkek hastada kemik iliği mikrometastazı negatif bulundu. Çok değişkenli ve alt grup analizlerinde cinsiyet ile kemik iliği mikrometastazı arasında istatistiksel anlamlılığa ulaşan ilişki bulunamadı. Çalışmamıza 12 metastatik (evre IV) hasta dahil edildi. Hastaların 5’inde 1, 5 hastada 2 ve 2 hastada 3 metastaz odağı saptandı. Şimdiye kadar patolojik olarak gösterilmiş kemik iliği metastazı olan hastalarda CK pozitifliğinin flovsitometri yöntemiyle değerlendirildiği herhangi bir çalışma yoktur. Çalışmamızda biyopside immünohistokimyasal olarak kemik iliği metastazı saptanan 2 hastada flovsitometrik yöntemle CK pozitif hücreler gösterildi (% 100). Kemik iliği metastazı olmayan 50 hastanın 9’unda (% 18) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik iliği metastazı varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik 88 iliği metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,031). Bidard ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, 138 metastatik hastadan, kemik metastazı olan 74 hastanın 57’sinde (% 77), kemik metastazı olmayan 64 hastanın 24’ünde (% 37) kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadığı görülmüştür).358 Çalışmamızda kemik metastazı saptanan 10 hastanın 5’inde (% 50), kemik metastazı olmayan 42 hastanın 6’sında (% 14,3) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Kemik metastazı varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,013). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, kemik metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p<0,001). Bidard ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, 138 metastatik hastadan, karaciğer metastazı olan 62 hastanın 41’inde (% 66), karaciğer metastazı olmayan 76 hastanın 53’ünde (% 53) kemik iliği mikrometastazı saptanmıştır (gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmamıştır).358 Çalışmamızda karaciğer metastazı bulunan 5 hastanın 3’ünde (% 60), karaciğer metastazı olmayan 47 hastanın 8’inde (% 17) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Karaciğer metastazı varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,025). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, karaciğer metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,001). Magire ve arkadaşları, serebral metastaz pozitif olan 10 gastrointestinal (özofagogastrik, rektum, kolon) ve 2 meme kanserli hastada flovsitometrik yöntemle kemik ilikleri değerlendirilmiş ve tüm hastalarda kemik iliği mikrometastazı varlığı gösterilmiştir (% 100). Bu nedenle serebral metastazı bulunan ve küratif cerrahi yapılan hastalarda kemik iliği mikrometastazlarının değerlendirilmesi ve tedavinin buna göre seçilmesi önerilmiştir.364 Çalışmamızda serebral metastazı olan 3 hastanın 1’inde (% 33,3), serebral metastazı olmayan 49 hastanın 10’unda (% 20,4) kemik iliğinde mikrometastaz saptandı. Serebral metastaz varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlılığa ulaşmadı (p=0,595). Hastalar lenf nodu 89 veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, serebral metastaz ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,005). Şimdiye kadar akciğer metastazı varlığı ile kemik iliği mikrometastazı ilişkisinin değerlendirildiği herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Çalışmamızda akciğer metastazı bulunan 2 hastanın 2’sinde (% 100), akciğer metastazı olmayan 50 hastanın 9’unda (% 18) kemik iliği mikrometastazı pozitif bulundu. Akciğer metastazı varlığı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,005). Hastalar lenf nodu veya uzak metastaz durumuna göre; lenf nodu (+), (-) veya uzak metastatik olarak alt gruplara ayrıldığında, alt grup analizinde, akciğer metastazı ile kemik iliği mikrometastazı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p=0,031). Çalışmamızda, tüm hastalar birlikte değerlendirildiğinde, kemik iliği mikrometastaz oranı % 21,1 bulundu. Alt grup analizinde kemik iliği mikrometastazı oranı, lenf nodu negatif grupta % 25; lenf nodu pozitif grupta % 5 ve uzak metastazlı hastalarda ise % 41,6 bulundu. Tüm hastalar birlikte değerlendirildiğinde, çok değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu, metastatik lenf nodu sayısı, evre, kemik iliği, kemik, karaciğer ve akciğer metastazları arasında anlamlı ilişki saptandı. Lenf nodu metastazı ve uzak metastaz varlığına göre alt grup analizinde ise; kemik iliği mikrometastazı ile yaş, lenfovasküler invazyon, değerlendirmeye alınan tüm uzak metastazlar (kemik iliği, kemik, beyin, karaciğer, akciğer) arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulundu. Braun ve arkadaşları tarafından evre I-III 4703 hastayı kapsayan meta-analizde ise kemik iliği mikrometastazı oranı % 30,6 bulunmuştur. Bu çalışmada tek değişkenli analizde yaş, tümör boyutu, lenf nodu metastazı varlığı ve sayısı ile ilişki saptanırken, çok değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazının tüm klinik değişkenlerden bağımsız bir prognostik faktör olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaya göre, kemik iliği mikrometastazı olmayan hastalarla karşılaştırıldığında, mikrometastaz saptanan hastaların primer tümörlerinin daha büyük boyutta ve daha yüksek histolojik grade’e sahip olduğu, bu hastalarda lenf nodu metastazının ve hormon reseptörleri negatifliğinin daha sık olduğu belirlenmiştir. Kemik iliği mikrometastazı pozitif hastaların toplam ve meme kanseri spesifik hayatta kalımı önemli derecede kısa bulunmuştur (tek değişkenli mortalite oranı sırasıyla 2,15 ve 2,44; her ikisi için P değeri <0,001)3 Uzak metastazlı hastaların değerlendirildiği Bidard ve arkadaşlarının yaptığı 90 çalışmada, kemik iliği mikrometastazı oranı % 59 bulunmuş ancak prognozla ilişkisi gösterilememiştir. Yöntemin özgüllüğünü belirlemek için çalışmaya, epitelyal tümörü olmayan remisyonda lösemi ve lenfomalı 16 hasta dahil edildi. Bu hastaların ikisinde 100.000 hücre içinde 2 sitokeratin pozitif hücre saptandı. Bu sonuçların eritroid prekürsörlerde yanlış pozitif boyanmaya veya kemik iliği alırken cilt epitelinden kontaminasyona bağlı olabileceği düşünüldü. RT-PCR veya flovsitometri gibi yöntemlerde pozitif sonuçların immünositokimyasal yöntemle doğrulanması, yanlış pozitifliğin dışlanması açısından önemlidir. İmmünositokimyasal yöntemin diğer yöntemlerden bir diğer üstünlüğü bu noktadadır. Çalışmamızda mikrometastatik hücre tespit edilen 12 hastada çeşitli CK’lerin ve EpCAM’ın ekspresyonu değerlendirildi. CK4 pozitifliği lenf nodu metastazı olmayan, östrojen ve progesteron reseptörü negatif ve c-erb-B2 negatif olan bir hastada saptandı. CK4 pozitifliği bazal benzeri meme kanserlerinde eksprese edilmektedir ve bu tümörler özellikle lenf nodu pozitif hastalarda luminal benzeri tümörlere göre daha kötü prognoza sahiptir. Meme kanserlerinin % 2-18’i CK4 eksprese etmektedir.302-304 Mikrometastatik hücrelerde CK6 ve CK10 pozitifliği saptanmadı. Meme kanserlerinde sitokeratin6 ekspresyonu, ER negatifliği, c-erb-B2 pozitifliği yüksek nükleer grade ve tek odaklı DCİS varlığı ile ilişkili bulunmuştur. Sitokeratin6 pozitif tümörlerin, negatif tümörlere göre daha primitif hücrelerden köken aldığı düşünülmektedir.307 Kemik iliği mikrometastazlarının erken dönemde gerçekleştiği düşünüldüğünde, bu hücrelerin CK6 eksprese etmeleri olasıdır. Ancak mikrometastatik hücrelerde CK6 ekspresyonu ile ilgili araştırma yapılmamıştır. Çalışmamızda CK10, mikrometastatik hücreleri cilt epitelinden kontamine olmuş hücrelerden ayırt etmek için kullanılmıştır. Hastaların tamamında ciltten kontaminasyon olmadığı veya yöntemin duyarlılığının düşük olması nedeniyle negatif bulunmuş olabileceği düşünüldü. Çalışmamızda kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunan lenf nodu negatif 1 hastada ve uzak metastazlı 2 hastada EpCAM pozitifliği mevcuttu. EpCAM hücrelerin metastaz yapabilmesi için gereken bir yüzey antijenidir. Metastatik meme kanser hücrelerinin %60’dan fazlasında EpCAM eksprese edilmektedir. EpCAM meme kanseri hücrelerinde heterojen olarak eksprese edilmektedir. Meme kanserinde EpCAM’a yönelik monoklonal antikorlar, mikrometastatik hücrelerin immünomanyetik olarak 91 ayrılması ve RT-PCR analizi için zenginleştirme yöntemlerinde kullanılmıştır.268 Bu antijeni tanımlayan monoklonal antikorlar tanısal yöntemler yanında tedavi seçeneği olarak da kullanılmıştır. Ancak bizim çalışmamızda EpCAM eksprese eden mikrometastatik hücre sayısı yöntemin düşük duyarlılığı nedeniyle az sayıdadır. Meme kanserinde kemik iliğinde bulunan mikrometastatik hücrelerin çoğunluğunun mezenkimal kök hücre ile benzer özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Bu hücreler meme kanseri kök hücresi olarak değerlendirilmiştir. Mezenkimal kök hücresi gibi bu hücrelerde de CD44+/CD24zayıf+/- olarak tespit edilmiştir. Ancak bizim çalışmamızda, flovsitometrik yöntemle, kemik iliğinde 105-106 hücrede 1 tane gibi çok az sayıda bulunan mikrometastatik hücrelerde bu ekspresyon profili gösterilemedi. Güncel medikal tedavilerle kanser kök hücrelerinin tamamen yok edilememesi nedeniyle hedef tedavilerin önemi artmaktadır. Çalışmamızda flovsitometrik yöntemin duyarlılığı % 21, özgüllüğü % 87,5, yanlış pozitiflik oranı % 15, pozitif prediktif değeri % 84, negatif prediktif değeri % 25 bulundu. Literatürde şu ana kadar yapılan çalışmalarda genel olarak kontrol grubu alınmadan immünositokimyasal yöntemler kullanılmıştır. Bu tekniğin kullanılan antikora ve farklı boyama tekniklerine bağlı olarak özgüllüğü ve duyarlılığında farklılıklar bildirilmiştir. Farklı sitokeratin antijenlerine karşı bazı antikorların kombinasyonları veya farklı sitokeratin proteinlerinin ortak epitopunu tespit edebilen antikorlar (örneğin sitokeratin 8, 18 ve 19’u tanıyan A45B/B3), tek sitokeratin proteinini hedefleyen monospesifik antikorlara (örneğin sitokeratin 18’i tanıyan sitokeratin 2) göre daha üstün görünmektedir.3,246,247 Çünkü solid tümör hücreleri, önemli derecede antijenik heterojeniteye sahiptir. Kemik iliği mikrometastazlarının belirlenmesinde immünositokimyasal yöntem için en sık A45B/B399,115,246,263-265 ve AE1/AE3161,177,266 kullanılmıştır ve her ikisininde de yanlış pozitiflik oranları düşük bulunmuştur. A45B/B3’ün kullanıldığı çalışmalarda özgüllüğü ve duyarlılığı ispatlanmıştır (Yanlış pozitiflik oranları % 5’den az bulunmuştur). Flovsitometrik yöntem kemik iliği mikrometastazının belirlenmesi için prostat, mesane ve gastrointestinal sistem tümörlerinde kullanılmıştır. Meme kanserinde ise kan ve lenf nodlarında mikrometastatik hücrelerin belirlenmesi için kullanılmakla beraber kemik iliğinde bu amaçla kullanıldığı çalışma sayısı çok azdır. Yöntemin doğruluğunun belirlenmesi için, diğer yöntemlerle karşılaştırıldığı, yeterli hasta sayısı içeren ve 92 hastaların yeterli süre prognoz açısından takip edildiği çalışmalara ihtiyaç vardır. Ayrıca yanlış pozitifliğin azaltılması için meme kanseri hücre dizileri (örneğin MCF7 cell line) ve duyarlılığının artırılması için daha gelişmiş zenginleştirme yöntemleri (örneğin immünomanyetik zenginleştirme) kullanılabilir. Çalışmamızda lenf nodu metastazı pozitif grupta mevcut literatürle uyumlu olmayan bulgular elde edildi. Bunun nedenleri, çalışmamızın daha önceki çalışmalara göre heterojen bir hasta grubunu kapsaması, hasta sayımızın azlığı ve özellikle lenf nodu metastazı pozitif grupta mikrometastaz oranının düşüklüğüne bağlı olabilir. Mevcut çalışmalarda genellikle erken evre meme kanserli hastalar değerlendirilmiştir. Lenf nodu metastazı olan hastaların kemik ilikleri daha uzun süre dondurulmuş halde kaldı. Lenf nodu metastazı olmayan ve metastatik hasta gruplarında dondurulma işlemi uygulanan hasta sayısı daha azdı. Dondurulmadan direk olarak flovsitometride çalışılan hastalarda mikrometastaz oranı daha yüksek bulundu. Kemik iliğinin mononükleer hücre fraksiyonunun ayrıştırılması için kullanılan ficoll-hypack solüsyonu ve dondurma işlemi için kullanılan DMSO (dimetil sülfoksit) hücreler için toksik etkilere sahiptir. Bu nedenle, her ne kadar ikisi için de uzaklaştırma işlemi uygulansa da bu iki ajana maruz kalan hücrelerin sayılarında ciddi düşüşler olduğu gözlendi. Bazı hastalarda % 60’lara varan hücre kaybı tespit edildi. DMSO, hücre zarlarından kolayca geçerek nükleusun etkilenmeden saklanmasını sağlayan ve hematopoietik kök hücrelerin saklanması yaygın olarak kullanılan bir kriyoprotektandır. DMSO ile hücre dondurma işlemlerinin yapıldığı çalışmalarda hücre kaybının en fazla % 30-40 olabileceği bildirilmiştir. Ancak DMSO için ex-vivo çalışmalarda antitümöral etkisi olduğu bildiren çalışmalar vardır. Bu nedenle mikrometastatik tümör hücrelerinin DMSO’dan etkilenmesi olasıdır.365-367 Braun ve arkadaşları tarafından yapılan meta-analizde metastatik lenf nodu sayısının arttıkça mikrometastaz oranının arttığı bulunmuştur. Woelfle ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada kemik iliği pozitif ve negatif tümörlerin gen ekspresyon profillerinin birbirinden farklı olduğu gösterilmiştir. Farklı eksprese edilen genlerin; ekstrasellüler matriks remodeling, adezyon, hücre iskeleti plastisitesi ve sinyal iletimi [özellikle RAS ve HIF-1a (hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 alfa)] olduğu gösterilmiştir. Kemik iliği mikrometastazı olan tümörlerde başlıca özellik transkripsiyonun baskılanmasıdır ve lenfatik metastaz yapan tümörlerden farklı bulunmuştur.144 93 Erken evre epitelyal kanserli hastalarda, kemik iliğinde mikrometastatik hücrelerin değerlendirilmesi, ilave prognostik parametre olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır. Özellikle erken evre meme kanserli hastalarda, doğru risk sınıflaması açısından mikrometastazların araştırılması önemlidir. Bu yolla hastaların kemoterapinin gereksiz toksisitesine maruz kalması önlenebilir veya adjuvan kemoterapi planlanmayan hastaların prognozunu olumsuz etkileyecek olan kemik iliği mikrometastazları için uygun tedavi seçenekleri uygulanarak, relaps riski azaltılabilir veya ortadan kaldırılabilir. Mikrometastazların bulunmasının, daha etkili antikanser stratejilerinin geliştirilmesine yardım edebileceğine yönelik kanıtlar vardır. Ancak, bu markerin bağımsız prognostik değeri ve klinikle ilişkisi, klinik pratikte rutin kullanıma girmeden önce tam olarak belirlenememiştir. Minimal rezidüel hastalığın prognostik ilişkisini destekleyen deneysel ve klinik kanıtların çokluğuna rağmen, yayımlanan verilerin büyük kısmının, erken metastatik hastalığının biyolojisinin tam olarak anlaşılamaması nedeniyle, yorumlanmalarının zorluğu yanı sıra, zayıf temellere dayanmaktadır. Ayrıca, mikrometastazın bulunması için kullanılan tekniklerin çoğunun, özgüllüğü ve duyarlılığı yetersizdir. Geniş prospektif çalışmalarda, prognoz ve hasta yönetimindeki etkisini göstermek ve mikrometastazın gerçek değerine ilişkin kesin sonuçlar elde etmek için, güvenilir ve tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış teknikler kullanılmalıdır. Manifest metastazın gelişiminden önce, erken metastatik hastalığın oluşumunun belirlenmesi, dormansi fenomenine karışan mekanizmaların aydınlatılması, moleküler olayların ve etkileşimlerin tanımlanması, medikal onkoloji alanında daha doğru ve klinik yönden faydalı bilgiler sağlayacaktır. Minimal rezidüel hastalığın eradike edilmesi veya büyümesinin kontrol edilmesini sağlayan yeni ilaçların geliştirilmesi, hücre siklüsünden bağımsız olarak, standart kemoterapi ile kombinasyon halinde antikorlara dayanan tedavilerin kullanılması umut verici terapötik yaklaşımlardır. Son olarak, deneysel ve klinik çalışmalarla mikrometastatik hücrelerin gen ekspresyon profilinin belirlenmesi gibi yeni teknolojilerle birleştirilmesi, bu ilerlemeleri hızlandırmaktadır. 94 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 1. Operabl meme kanserli hastalarda kemik iliği mikrometastazları prognostik açıdan önemlidir. 2. Mikrometastatik hücrelerin büyük kısmı mezenkimal kök hücre fenotipine sahiptir ve G0 fazında olmaları, klasik kemoterapi rejimleri ile eradike edilmelerini zorlaştırmaktadır. 3. Mikrometastatik hücreler, kemik iliğindeki geniş hücre popülasyonu içinde çok nadir bir hücre grubudur. Bu hücrelerin bulunabilmesi için duyarlı ve özgül yöntemlere ihtiyaç vardır. 4. Çalışmamızda flovsitometrik yöntemle 52 evre I-IV meme kanserli hastada kemik iliği mikrometastazı oranı araştırıldı. Tüm hasta grupları birlikte değerlendirildiğinde, kemik iliği mikrometastaz oranı % 21,1 bulundu. Alt grup analizinde ise lenf nodu negatif grupta % 25; lenf nodu pozitif grupta % 5 ve uzak metastazlı hastalarda % 41,6 bulundu. Bulgularımız lenf nodu pozitif grup dışında literatür ile uyumluydu. 5. Çalışmamızda çok değişkenli analizde kemik iliği mikrometastazı ile tümör boyutu, metastatik lenf nodu sayısı, evre, kemik iliği, kemik, karaciğer ve akciğer metastazları arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptandı. Lenf nodu metastazı ve uzak metastaz durumuna göre alt grup analizi yapıldığında; kemik iliği mikrometastazı ile yaş, lenfovasküler invazyon, değerlendirmeye alınan tüm uzak metastazlar (kemik iliği, kemik, beyin, karaciğer, akciğer) arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulundu. Bu bulguya benzer sonuçlar literatürde bulunmakla birlikte, hasta sayımızın az olması önemli bir dezavantajdır. 6. Kemik iliğinde mikrometastatik hücre pozitif bulunan 11 hastada, çeşitli CK’lerin ve EpCAM’ın ekspresyonu değerlendirildi. CK4 pozitifliği, lenf nodu metastazı olmayan, östrojen-progesteron reseptörü negatif ve c-erb-B2 negatif olan bir hastada saptandı. Bu 11 hastanın tamamında mikrometastatik hücrelerde CK6 ve CK10 negatif bulundu. Kemik iliği mikrometastazı pozitif bulunan lenf nodu negatif 1 hastada ve uzak metastazlı 2 hastada EpCAM pozitifliği bulundu. Flovsitometrik yöntemle, kemik iliğinde 105-106 hücrede 1 tane gibi çok az sayıda bulunan mikrometastatik 95 hücrelerde CD44+/CD24zayıf+/- ekspresyon profili gösterilemedi. Bulgularımız literatürle uyumlu değildi. 7. Mikrometastatik hücrelerin belirlenmesi için flovsitometri uygun bir yöntem olmakla birlikte, bu hücrelerin ekspresyon profillerinin belirlenmesi için duyarlılığı düşüktür. 8. Kemik iliği materyallerinin saklanması için DMSO kullanılması önemli hücre kaybına yol açtığı ve mikrometastatik hücreler için toksik etkilere neden olabildiği için, ficoll-hypack santrifüjü sonrası örneklerin hemen değerlendirilmesi daha doğru bir yaklaşımdır. 9. Flovsitometrik yöntemde CKpozitif/CD45negatif hücrelerin mikrometastatik hücre olarak kabul edilmesi daha uygundur. CKpozitif/Pİnegatif hücreler değerlendirildiğinde, pozitif kabul edilen mikrometastatik hücre sayısının daha az olduğu gözlenmiştir. 10. Flovsitometrik yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğünün daha doğru belirlenmesi, prognoz ve hasta yönetimindeki etkisinin gösterilmesi ve mikrometastazın gerçek değerine ilişkin kesin sonuçların elde edilmesi için, geniş prospektif çalışmalarla, güvenilir, tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış yöntemlere ihtiyaç vardır. 96 7. KAYNAKLAR 1. Anthony S. Fauci, Eugene Braunwald, Dennis L. Kasper Breast Cancer Harrison’s Principles of İnternal Mehdicine 17th Ed. New York: The McGraw-Hill Companies, Inc. 2008. 2. Rosen, Paul P. Rosen's Breast Pathology. Third Edition Lippincott Williams & Wilkins (LWW) 2008. 3. Braun S, Vogl FD, Naume B, Janni W, Osborne MP, Coombes RC. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med 2005;353(8):793-802. 4. Ewertz M, Duffy SW, Adamı HO. Ege at first birth, parity and risk of breast cancer: a meta-analysis of 8 studies from the Nordic countries. Int J Cancer 1990;46:597. 5. Cancer Research UK. Epidemiology unit, University of Oxford UK. Endogenous sex hormon and breast cancer in postmenopausal women: Reanalaysis of nine prospective studies. J Natl. Cancer Inst. 2002. Apr. 17;94 (8): 606-16. 6. Evans JS, Wennberg JE, McNeil BJ. The influence of diagnostic radiography on the incidence of breast cancer and leukemia. N Engl J Med 1986;315:810. 7. Dickson RB, Lippman ME: Moleculer basis of breast cancer, in Molecular Basis of Cancer. Mendelson J, Howley PM, Israel MA, Liotta LA (eds) Philadelphia, Saunders 2001, pp.313. 8. Data on SEER (Surveillance, Epidemiology and End Results) cancer statistics available online at http://seer.cancer.gov/csr/1975_2003/results_merged/sect_04_breast.pdf (accessed October 11,2008). 9. American Cancer Society Breast Cancer Facts and Figures 2008 available online at www.cancer.org/docroot/STT/STT_0.asp (accessed April 15, 2008). 10. Howe, HL, Wu, X, Ries, LA. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2003, featuring cancer among U.S. Hispanic/Latino populations. Cancer 2006; 107:1711. 11. Dupont WD, Page DL, Rogers LW. Risk factors for breast cancer in women with proliferative breast disease. N Engl J Med 1985 Jan 17;312(3):146-51. 12. Tavasoli F, DevilleP. WHO classification of tumours, Tumours of the Breast and Female Genital Tract, ed.Tavasoli F, Deville P, IARC Pres, 2003. 13. Davis BW, Gelber R, Goldhirsch A. Prognostik significance of peritumoral lymphatic invasion in clinical trials of adjuvant therapy for breast cancer with axillary lymph node metastasis. Hum Pathol 1985; 16: 1212-1218. 14. Güler G Ulusal Meme Hastalıkları Kongresi (5-9 Eylül 2007) Ankara. 97 15. Hunter DJ, Spiegelman D, Adami HO. Cohort studies of fat intake and the risk of breast cancer a pooled analysis. N Engl J Med 1996;334:356-61 16. Schnitt, SJ, Guidi, AJ. Pathology of invasive breast cancer. In: Diseases of the Breast, Harris, JR, Lippman, ME, Morrow, M, Osborne, CK, (Eds), 3rd ed, Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia 2004. p.393. 17. Cianfrocca M, Goldstein J L. Prognostic and predictive marker of early stage breast cancer. The Oncologist. 2004;9:606-616. 18. Elston CW, Ellis JO. Pathological prognostic factory in breast cancer: Experience from a long study with long-term follow up. Histopathology 1991; 19: 403-410. 19. Singletary SE, Allred C, Ashley P, Bassett LW, Berry D, Bland KI, Borgen PI, Clark G, Edge SB, Hayes DF, Hughes LL, Hutter RV, Morrow M, Page DL, Recht A, Theriault RL, Thor A, Weaver DL, Wieand HS, Greene FL. Revision of the American Joint Committee on Cancer staging system for breast cancer. J Clin Oncol 2002 Sep 1;20(17):3628-36. 20. Page, DL. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favorable prognostic types. Am J Surg Pathol 1991; 15:334. 21. Simpson, JF, Page, DL. Status of breast cancer prognostication based on histopathologic data [published erratum appears in Am J Clin Pathol 1995 Jan;103(1):115]. Am J Clin Pathol 1994; 102:S3. 22. Rosen, PP, Groshen, S, Kinne, DW, Norton, L. Factors influencing prognosis in node-negative breast carcinoma: Analysis of 767 T1N0M0/T2N0M0 patients with long-term follow-up. J Clin Oncol 1993; 11:2090. 23. Fitzgibbons, PL, Page, DL, Weaver, D. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000; 124:966. 24. Cianfrocca M, Goldstein J L. Prognostic and predictive marker of early stage breast cancer. The Oncologist. 2004;9:606-616. 25. Colozza, M, Azambuja, E, Cardoso, F. Proliferative markers as prognostic and predictive tools in early breast cancer: where are we now?. Ann Oncol 2005; 16:1723. 26. Lackowska, B, Niezabitowski, A, Rys, J. S-phase fraction and menopausal status as the most important prognostic factors of disease-free survival for node negative patients with breast cancer. A prospective study. Pol J Pathol 2003; 54:101. 27. Merkel, DE, Winchester, DJ, Goldschmidt, RA. DNA flow cytometry and pathologic Gradeing as prognostic guides in axillary lymph node-negative breast cancer. Cancer 1993; 72:1926. 98 28. Silvestrini, R, Daidone, MG, Luisi, A. Biologic andclinicopathologic factors as indicators of specific relapse types in node-negative breast cancer. J Clin Oncol 1995; 13:697. 29. Jones, S, Clark, G, Koleszar, S. Low proliferative rate of invasive node-negative breast cancer predicts for a favorable outcome: a prospective evaluation of 669 patients. Clin Breast Cancer 2001; 1:310. 30. Malmstrom, P, Bendahl, PO, Boiessen, P. S-phase fraction and urokinase plasminogen activator are better markers for distant recurrences than Nottingham Prognostic Index and histologic Grade in a prospective study of premenopausal lymph node-negative breast cancer. J Clin Oncol 2001; 19:2010. 31. Urruticoechea, A, Smith, IE, Dowsett, M. Proliferation marker Ki-67 in early breast cancer. J Clin Oncol 2005; 23:7212. 32.Mauri, FA, Girlando, S, Palma, PD. Ki-67 antibodies (Ki-S5, MIB-1, and Ki-67) in breast carcinomas. A brief quantitative comparison. Appl Immunohistochem 1994; 2:171. 33. Weidner, N, Moore, DH, Vartanian, R. Correlation of Ki-67 antigen expression with mitotic figure index and tumor Grade in breast carcinomas using the novel "paraffin"-reactive MIB1 antibody. Hum Pathol 1994; 25:337. 34. Pinder, SE, Wencyk, P, Sibbering, DM. Assessment of the new proliferation marker MIB1 in breast carcinoma using image analysis: Associations with other prognostic factors and survival. Br J Cancer 1995; 71:146. 35. Trihia, H, Murray, S, Price, K. Ki-67 expression in breast carcinoma. Cancer 2003; 97:1321. 36. Keshgegian, AA, Cnaan, A. Proliferation markers in breast carcinoma. Mitotic figure count, S-phase fraction, proliferating cell nuclear antigen, Ki-67 and MIB-1. Am J Clin Pathol 1995; 104:42. 37. Chassevent, A, Jourdan, ML, Romain, S. S-phase fraction and DNA ploidy in 633 T1T2 breast cancers: a standardized flow cytometric study. Clin Cancer Res 2001; 7:909. 38. Mandard, AM, Denoux, Y, Herlin, P. Prognostic value of DNA cytometry in 281 premenopausal patients with lymph node negative breast carcinoma randomized in a control trial: multivariate analysis with Ki-67 index, mitotic count, and microvessel density. Cancer 2000; 89:1748. 39. Baak, JP, van Diest, PJ, Voorhorst, FJ. Prospective multicenter validation of the independent prognostic value of the mitotic activity index in lymph node-negative breast cancer patients younger than 55 years. J Clin Oncol 2005; 23:5993. 40. Fehm, T, Maimonis, P, Weitz, S. Influence of circulating c-erbB-2 serum protein on response to adjuvant chemotherapy in node-positive breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 1997; 43:87. 99 41. Kandl, H, Seymour, L, Bezwoda, WR. Soluble c-erbB-2 fragment in serum correlates with disease stage and predicts for shortened survival in patients with early-stage and advanced breast cancer. Br J Cancer 1994; 70:739. 42. Mehta, RR, McDermott, JH, Hieken, TJ. Plasma c-erbB-2 levels in breast cancer patients: prognostic significance in predicting response to chemotherapy. J Clin Oncol 1998; 16:2409. 43. Leitzel, K, Teramoto, Y, Sampson, E. Elevated soluble c-erbB-2 antigen levels in the serum and effusions of a proportion of breast cancer patients. J Clin Oncol 1992; 10:1436. 44. Yamauchi, H, O'Neill, A, Gelman, R. Prediction of response to antiestrogen therapy in advanced breast cancer patients by pretreatment circulating levels of extracellular domain of the HER-2/c-neu protein. J Clin Oncol 1997; 15:2518. 45. Ohtsubo, M, Theodoras, AM, Schumacher, J. Human cyclin E, a nuclear protein essential for the G1-to-S phase transition. Mol Cell Biol 1995; 15:2612. 46. Dulic, V, Lees, E, Reed, SI. Association of human cyclin E with a periodic G1-S phase protein kinase. Science 1992; 257:1958. 47. Keyomarsi, K, Conte, D Jr, Toyofuku, W, Fox, MP. Deregulation of cyclin E in breast cancer. Oncogene 1995; 11:941. 48. Buckley, MF, Sweeney, KJ, Hamilton, JA. Expression and amplification of cyclin genes in human breast cancer. Oncogene 1993; 8:2127. 49. Porter, DC, Zhang, N, Danes, C. Tumor-specific proteolytic processing of cyclin E generates hyperactive lower-molecular-weight forms. Mol Cell Biol 2001; 21:6254. 50. Patocs, A, Zhang, L, Xu, Y. Breast-cancer stromal cells with TP53 mutations and nodal metastases. N Engl J Med 2007; 357:2543. 51.Thor, AD, Moore, DH, Edgerton, SM. Accumulation of p53 tumor suppressor gene protein: An independent marker of prognosis in breast cancers. J Natl Cancer Inst 1992; 84:845. 52. Allred, DC, Clark, GM, Elledge, R. Association of p53 protein expression with tumor cell proliferation rate and clinical outcome in node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 1993; 85:200. 53. Barnes, DM, Dublin, EA, Fisher, CJ. Immunohistochemical detection of p53 protein in mammary carcinoma: An important new independent indicator of prognosis? Hum Pathol 1993; 24:469. 54. Isola, K, Visakorpi, T, Holli, K, Kallioniemi, OP. Association of overexpression of tumor suppressor protein p53 with rapid cell proliferation and poor prognosis in node-negative breast cancer patients. J Natl Cancer Inst 1992; 84:1109. 100 55. Olivier, M, Langerod, A, Carrieri, P. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res 2006; 12:1157. 56. Weidner, N, Folkman, J, Pozza, F. Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1992; 84:1875. 57. Horak, ER, Leek, R, Klenk, N. Angiogenesis assessed by platelet/endothelial cell adhesion molecule antibodies as indicator of node metastases and survival in breast cancer. Lancet 1992; 340:1120. 58. Gasparini, G, Toi, M, Gion, M. Prognostic significance of vascular endothelial growth factor protein in node-negative breast carcinoma. J Natl Cancer Inst 1997; 89:139. 59. Heimann, R, Ferguson, D, Powers, C. Angiogenesis as a predictor of long-term survival for patients with node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 1996; 88:1764. 60. Guidi, AJ, Berry, DA, Broadwater, G. Association of angiogenesis in lymph node metastases with outcome of breast cancer. J Natl Cancer Inst 2000; 92:486. 61. Westley, BR, May, FE. Cathepsin D and breast cancer. Eur J Cancer 1996; 32A:15. 62. Tandon, AK, Clark, GM, Chamness, GC. Cathepsin D and prognosis in breast cancer. N Engl J Med 1990; 322:297. 63. Siitonen, SM, Kononen, JT, Helin, HJ. Reduced E-cadherin expression is associated with invasiveness and unfavorable prognosis in breast cancer. Am J Clin Pathol 1996; 105:394. 64. Ferrandina, G, Scambia, G, Bardelli, F. Relationship between cathepsin-D content and disease-free survival in node-negative breast cancer patients: a meta-analysis. Br J Cancer 1997; 76:661. 65. Stephens, RW, Brunner, N, Janicke, F, Schmitt, M. The urokinase plasminogen activator system as a target for prognostic studies in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1998; 52:99. 66. Foekens, JA, Peters, HA, Look, MP. The urokinase system of plasminogen activation and prognosis in 2780 breast cancer patients. Cancer Res 2000; 60:636. 67. Chappuis, PO, Dieterich, B, Sciretta, V. Functional evaluation of plasmin formation in primary breast cancer. J Clin Oncol 2001; 19:2731. 68. Look, MP, van Putten, WL, Duffy, MJ. Pooled Analysis of Prognostic Impact of Urokinase-Type Plasminogen Activator and Its Inhibitor PAI-1 in 8377 Breast Cancer Patients. J Natl Cancer Inst 2002; 94:116. 69. Harbeck, N, Kates, RE, Schmitt, M. Clinical relevance of invasion factors urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1 for individualized therapy decisions in primary breast cancer is greatest when used in combination. J Clin Oncol 2002; 20:1000. 101 70. Janicke, F, Prechtl, A, Thomssen, C. Randomized adjuvant chemotherapy trial in high-risk, lymph node-negative breast cancer patients identified by urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1. J Natl Cancer Inst 2001; 93:913. 71. Ebeling, FG, Stieber, P, Untch, M. Serum CEA and CA 15-3 as prognostic factors in primary breast cancer. Br J Cancer 2002; 86:1217. 72. Gion, M, Boracchi, P, Dittadi, R. Prognostic role of serum CA15.3 in 362 node-negative breast cancers. An old player for a new game. Eur J Cancer 2002; 38:1181. 73. Kumpulainen, EJ, Keskikuru, RJ, Johansson, RT. Serum tumor marker CA 15.3 and stage are the two most powerful predictors of survival in primary breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2002; 76:95. 74. Martin, A, Corte, MD, Alvarez, AM. Prognostic value of pre-operative serum CA 15.3 levels in breast cancer. Anticancer Res 2006; 26:3965. 75. Sorlie, T, Tibshirani, R, Parker, J. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100:8418. 76. Sorlie, T. Molecular portraits of breast cancer: tumour subtypes as distinct disease entities. Eur J Cancer 2004; 40:2667. 77. Perou, CM, Sorlie, T, Eisen, MB. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000; 406:747. 78. Brenton, JD, Carey, LA, Ahmed, AA, Caldas, C. Molecular classification and molecular forecasting of breast cancer: ready for clinical application?. J Clin Oncol 2005; 23:7350. 79. Ahr, A, Karn, T, Solbach, C. Identification of high risk breast-cancer patients by gene expression profiling. Lancet 2002; 359:131. 80. Espinosa, E, Vara, JA, Redondo, A. Breast cancer prognosis determined by gene expression profiling: a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction study. J Clin Oncol 2005; 23:7278. 81. van't, Veer LJ, Dai, H, van de, Vijver MJ. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415:530. 82. van de, Vijver MJ, He, YD, van't Veer, LJ. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002; 347:1999. 83. Huang, E, Cheng, SH, Dressman, H. Gene expression predictors of breast cancer outcomes. Lancet 2003; 361:1590. 102 84. Sotiriou, C, Neo, SY, McShane, LM. Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100:10393. 85. Wang, Y, Klijn, JG, Zhang, Y. Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymphnode-negative primary breast cancer. Lancet 2005; 365:671. 86. Foekens, JA, Atkins, D, Zhang, Y. Multicenter Validation of a Gene Expression-Based Prognostic Signature in Lymph Node-Negative Primary Breast Cancer. J Clin Oncol 2006; 24:1665. 87. Buyse, M, Loi, S, van't Veer, L. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 2006; 98:1183. 88. Liu, R, Wang, X, Chen, GY. The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast-cancer cells. N Engl J Med 2007; 356:217. 89. Acharya, CR, Hsu, DS, Anders, CK. Gene expression signatures, clinicopathological features, and individualized therapy in breast cancer. JAMA 2008; 299:1574. 90. Paik, S, Shak, S, Tang, G. A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, nodenegative breast cancer. N Engl J Med 2004; 351:2817. 91. Desmedt, C, Piette, F, Loi, S. Strong time dependence of the 76-gene prognostic signature for nodenegative breast cancer patients in the TRANSBIG multicenter independent validation series. Clin Cancer Res 2007; 13:3207. 92. Fisher, B, Dignam, J, Bryant, J, Wolmark, N. Five versus more than five years of tamoxifen for lymph node-negative breast cancer: Updated findings from the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-14 randomized trial. J Natl Cancer Inst 2001; 93:684. 93. Ma, XJ, Hilsenbeck, SG, Wang, W. The HOXB13:IL17BR expression index is a prognostic factor in early-stage breast cancer. J Clin Oncol 2006; 24:4611. 94. Pantel, K., & Woelfle, U. Cancer micrometastasis: Detection, clinical relevance, and molecular description. In American Society of Clinical Oncology (ASCO) (Ed.), ASCO 2004 educational book (pp. 701–708). USA: Lisa Graves Publisher. 95. Zhu, L., Lam, C. K., & Chow, L. W. C. Sentinel lymph node biopsy or detection of micrometastasis in bone marrow: Which might be an alternative to axillary lymph node dissection in breast cancer patients? Asian Journal of Surgery, 2004, 27, 279–283. 96. Dearnaley, D. P., Sloane, J. P., Ormerod, M. G., Steele, K., Coombes, R. C., Clink, H. M. Increased detection of mammary carcinoma cells in marrow smears using antisera to epithelial membrane antigen. British Journal of Cancer, (1981) 44, 85–90. 103 97. Timar, J., Csuka, O., Orosz, Z., Jeney, A., & Kopper, L. Molecular pathology of tumor metastasis: II. Molecular staging and differential diagnosis. Pathology Oncology Research, (2002) 8, 204–219. 98. Guinebretiere, J. M., & Contesso, G. “Micrometastases”: The pathologist’s point of view. Bulletin du Cancer, 88, (2001) 549–550, 555–560. 99. Braun S, Pantel K, Muller P. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med 2000;342:525–533. 100. MacDonald, I. C., Groom, A. C., & Chambers, A. F. (2002). Cancer spread and micometastasis development: Quantitative approaches for in vivo models. Bioessays, 24, 885–893. 101. Tanja Fehm , Sven Becker Presence of apoptotic and nonapoptotic disseminated tumor cells reflects the response to neoadjuvant systemic therapy in breast cancer Breast Cancer Research 2006, 8:R60. 102. Chambers, A. F. (2004). Biology of the metastatic process. In American Society of Clinical Oncology (ASCO) (Ed.), ASCO 2004 educational book (pp. 696–700). USA: Lisa Graves Publisher. 103. Chambers, A., F, MacDonald, I. C., Schmidt, E. E., Morris, V. L., & Groom, A. C. 1999). Preclinical assessment of anticancer therapeutic strategies using in vivo videomicroscopy. Cancer Metastasis Reviews, 17, 263–269. 104. Fidler, I. J. (1975). Biological behavior of malignant melanoma cells correlated to their survival in vivo. Cancer Research, 35, 218–224. 105. Cameron, M. D., Schmidt, E. E., Kerkvliet, N., Nadkarni, K. V., Morris, V. L., Groom, A. C. (2000). Temporal progression of metastasis in lung: Cell survival, dormancy and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research, 60, 2541–2546. 106. Murphy, B. O., Joshi, S., Kessinger, A., Reed, E., & Sharp, J. G. (2002). A murine model of bone marrow micrometastasis in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis, 19, 561–569. 107. Tarin, D., Price, J. E., Kettlewell, M. G., Souter, R. G., Vass, A. C., & Crossley, B. (1984). Mechanisms of human tumor metastasis studies in patients with peritoneovenous shunts. Cancer Research, 44, 3584–3592. 108. Gangnus, R., Langer, S., Breit, E., Pantel, K., & Spercher, M. R. (2004). Genomic profiling of viable and proliferative micrometastatic cells from early-stage breast cancer patients. Clinical Cancer Research, 10, 3457–3464. 109. Naumov, G. N., MacDonald, I. C., Weinmeister, P. M., Kerkvliet, N., Nadkarni, K. V., Wilson, S. M. (2002). Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: A possible contributor to dormancy. Cancer Research, 62, 2162–2168. 104 110. Demicheli, R., Abbattista, A., Miceli, R., Valagussa, P., & Bonnadonna, G. (1996). Time distribution of the recurrence risk for breast cancer patients undergoing mastectomy: Further support about the concept of tumor dormancy. Breast Cancer Research and Treatment, 41, 177–185. 111. Gimbrone,M. A., Jr., Leapman, S. B., Cotran, R. S., & Folkman, J. (1972). Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization. Journal of Experimental Medicine, 136, 261–276. 112. Michelson, S., & Leith, J. T. (1994). Dormancy, regression and recurrence: Towards a unifying theory of growth control. Journal of Theoretical Biology, 169, 327–338. 113. Stewart, T. H. (1996). Immune mechanisms and tumor dormancy. Medicina (Buenos Aires), 56, 74–82. 114. Yu, W., Kim, J., & Ossowski, L. (1997). Reduction in surface urokinase receptor forces malignant cells in a protracted state of dormancy. Journal of Cell Biology, 137, 767–777. 115. Solakoglu, O., Maierhofer, C., Lahr, G., Breit, E., Scheunemann, P., Heumos, I. (2002). Heterogeneous proliferative potential of occult metastatic cells in bone marrow of patients with solid epithelial tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 2246–2251. 116. Guba, M., Cernaianu, G., Koehl, G., Geissler, E. K., Jauch, K.- W., Anthuber, W. F. (2001). A primary tumor promotes dormancy of solitary tumor cells before inhibiting angiogenesis. Cancer Research, 61, 5575–5579. 117. Holmgren, L., O’Reilly, M. S., & Folkman, J. (1995). Dormancy of micrometastases: Balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nature Medicine, 1, 149–153. 118. O’Reilly, M. S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R. A., Moses, M. (1994). Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell, 79, 315–328. 119. Luzzi, K. J., MacDonald, I. C., Schmidt, E. E., Kerkvliet, N., Morris, V. L., Chambers, A. F. (1998). Multistep nature of metastatic inefficiency: Dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology, 153, 865– 873. 120. Murray, C. (1995). Tumor dormancy: Not so sleepy after all. Nature Medicine, 1, 117–118. 121. O’Reilly, M. S., Boehm, T., Shing, Y., Fukai, N., Vasios, G., Lane, W. S. (1997). Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 88, 277–285. 122. O’Reilly, M. S., Pirie-Shepherd, S., Lane, W. S., & Folkman, J. (1999). Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin. Science, 285, 1926–1928. 105 123. Farrar, J. D., Katz, K. H., Windsor, J., Thrush, G., Scheuermann, R. H., Uhr, J. W. (1999). Cancer dormancy VII. A regulatory role for CD8+ T cells and IFN-γ in establishing and maintaining the tumor dormant state. Journal of Immunology, 162, 2842–2849. 124. Stevenson, F. K., George, A. J., & Glennie, M. J. (1990). Antiidiotypic therapy of leukemias and lymphomas. Chemical Immunology, 48, 126–166. 125. Schirrmacher, V. (2001). T-cell immunity in the induction and maintenance of a tumor dormant state. Seminars in Cancer Biology, 11, 285–295. 126. Dyke, R. J., McBride, H., George, A. J., Hamblin, T. J, & Stevenson, F. K. (1991). Idiotypic vaccination against B-cell lymphoma leads to dormant tumor. Cellular Immunology, 132, 70–83. 127. Uhr, J. W., Tucker, T., May, R. D., Siu, H., & Vitetta, E. S. (1991). Cancer dormancy: Studies of the murine BCL1 lymphoma. Cancer Research, 51, 50455–50535. 128. Meng, S., Tripathy, D., Frenkel, E. P., Shete, S., Naftalis, E. Z., Huth, J. F. (2004). Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research, 10, 8152–8162. 129. Pantel, K., Cote, R. J., & Fodstad, O. (1991). Detection and clinical importance of micrometastatic disease. Journal of the National Cancer Institute, 91, 1113–1124. 130. Andratschke, M., Pauli, C., Stein, M., Chaubal, S., &Wollenberg, B. (2003). MHC-class I antigen expression on micrometastases in bone marrow of patients with head and neck squamous cell cancer. Anticancer Research, 23, 1467–1471. 131. Schlimok, G., Kutter, D., Schaller, G., Geuz, T., Wiebecke, B., Backmann, R. (1991). Frequent down-regulation of major histocompatibility class I antigen expression on individual micrometastatic carcinoma cells. Cancer Research, 51, 4712–4715. 132. Schlimok, G., Funke, I., Bock, B., Schweiberer, B., Witte, J., & Riethmuller, G. (1990). Epithelial tumor cells in bone marrow of patients with colorectal cancer: immunocytochemical detection, phenotypic characterization and prognostic significance. Journal of Clinical Oncology, 8, 831–837. 133. Reynolds, T. (1998). Researchers slowly unveil where cancer cells hide. Journal of the National Cancer Institute, 90, 1690–1691. 134. Korah, R., Boots, M., & Wieder, R. (2004). Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: An in vivo paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Research, 64, 4514–4522. 135. Ree, A. H., Tvermyr, M., Engebraaten, O., Rooman, M., Rosok, O., Hovig, E. (1999). Expression of a novel factor in human breast cancer cells with metastatic potential. Cancer Research, 59, 4675–4680. 106 136. Mansi, J. L., Berger, U., McDonnell, T., Pople, A., Rayter, Z., Gazet, J. C. (1989). The fate of bone marrow micrometastases in patients with primary breast cancer. Journal of Clinical Oncology, 7, 445–449. 137. Pantel, K. (2005). Symposium 34-2. Bone marrow: Homing organ for dormant micrometastatic cancer cells. Proceedings of the American Association for Cancer Research, 46, 1477–1478. 138. Putz, E.,Witter, K., Offner, S., Stosiek, P., Zippelius, A., Johnson, J. (1999). Phenotypic characteristics of cell lines derived Cancer Metastasis Rev (2006) 25:507–519 515 from disseminated cancer cells in bone marrow of patients with solid epithelial tumors: Establishment of working models for human micrometastases. Cancer Research, 59, 241–248. 139. Willipinski-Stapelfeldt, B., Riethdorf, S., Assmann, V., Woelfle, U., Rau, T., Sauter, G. (2005). Changes in cytoskeletal proteins composition indicative of an epithelial–mesenchymal transition in human micrometastatic and primary breast carcinoma cells. Clinical Cancer Research, 11, 8006–8014. 140. Fodstad, O., & Kjonniksen, I. (1994). Microenvironment revisited: Time for reappraisal of some prevailing concepts of cancer metastasis. Journal of Cellular biochemistry, 56, 23–28. 141. Fidler, I. J. (1995). Modulation of the organ microenvironment for treatment of cancer metastasis. Journal of the National Cancer Institute, 87, 1588–1592. 142. Uhr, J. W., Scheuermann, R. H., Street, N. E., & Vitetta, E. S. (1997). Cancer dormancy: Opportunities for new therapeutic approaches. Nature Medicine, 3, 505–509. 143. Folkman, J. (1995). Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases. Nature Medicine, 1, 27–31. 144. Woelfle, U., Cloos, J., Sauter, G., Riethdorf, L., Janicke, F., van Diest, P. (2003). Molecular signature associated with bone marrow micrometastasis in human breast cancer. Cancer Research, 63, 5679–5684. 145. Varambally, S., Dhanasekaran, S. M., Zhou, M., Kumar-Sinha, C., Sanda, M. G., Ghosh, D. (2002). The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature, 419, 624–629. 146. Benoy, I. H., Salgado, R., Elst, H., Van Dam, P., Weyler, J., Van Marck, E. (2005). Relative microvessel area of the primary tumor, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Research, 7, R210–R219. 147. Z’graggen, K., Centeno, B. A., Fernandez-del Castillo, C., Jimenez, R. E., Werner, J., & Warshaw, A. L. (2001). Biological implications of tumor cells in blood and bone marrow of pancreatic cancer patients. Surgery, 129, 537–546. 107 148. Zippelius, A., & Pantel, K. (2000). RT-PCR based detection of occult disseminated tumor cells in peripheral blood and bone marrow of patients with solid tumors. An overview. Annals of the New York Academy of Sciences, 906, 110–123. 149. Vona, G., Sabile, A., Louha, M., Sitruk, V., Romana, S., Schutze, K. (2000). Isolation by size of epithelial tumor cells: A new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells. American Journal of Pathology, 156, 57–63. 150. Mehes, G., Luegmayr, A., Amros, I. M., Ladenstein, R., & Ambros, P. F. (2001). Combined automatic immunological and molecular cytogenetic analysis allows exact identification and quantification of tumor cells in the bone marrow. Clinical Cancer Research, 7, 1969–1975. 151. Klein, C. A., Blakenstein, T. J., Schmidt-Kittler, O., Petronio, M., Polzer, B., Stoecklein, N. H. (2002). Genetic heterogeneity of single disseminated tumor cells in minimal residual disease. Lancet, 360, 683–689. 152. Albertson, D. G., Collins, C., McCormick, F., & Gray, J. W. (2003). Chromosome aberrations in solid tumors. Nature Genetics, 34, 369–376. 153. Bernard Fisher, M.D., Stewart Anderson, Ph.D., John Bryant Twenty-Year Follow-up of a Randomized Trial Comparing Total Mastectomy, Lumpectomy, and Lumpectomy plus Irradiation for the Treatment of Invasive Breast Cancer Volume 347:1233-1241 October 17, 2002 Number 16. 154. Attiqa N. Mirza, MD, Nadeem Q. Mirza, MD, Georges Vlastos Prognostic Factors in NodeNegative Breast Cancer A Review of Studies With Sample Size More Than 200 and Follow-Up More Than 5 Years Ann Surg. 2002 January; 235(1): 10–26. 155. Pantel K, Brakenhoff RH Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer 4, 448-456 (June 2004) | doi:10.1038/nrc1370. 156. Mansi JL, Gogas H, Bliss JM. Outcome of primary-breast-cancer patients with micrometastases: a long-term follow-up study. Lancet 354(9174), 197–202 (1999). 157. Pantel K, Woefle U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors J Biol Regul Homeost Agents 2004 Apr-Jun;18(2):120-5. 158. Diel IJ, Kaufmann M, Costa SD. Micrometastatic breast cancer cells in bone marrow at primary surgery: prognostic value in comparison with nodal status. J Natl Cancer Inst 1996;88:1652–1658. 159. Braun S, Pantel K, Muller P. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med 2000;342:525–533. 160. Gebauer G, Fehm T, Merkle E. Epithelial cells in bone marrow of breast cancer patients at time of primary surgery: clinical outcome during long-term follow-up. J Clin Oncol 2001;19:3669–3674. 108 160. Gerber B, Krause A, Muller H. Simultaneous immunohistochemical detection of tumor cells in lymph nodes and bone marrow aspirates in breast cancer and its correlation with other prognostic factors. J Clin Oncol 2001;19:960–971. 161. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R. Detection of isolated tumor cells in bone marrow is an independent prognostic factor in breast cancer. J Clin Oncol 2003;21:3469–3478. 162. Harbeck N. (1994) Tumour cell detection in the bone marrow of breast cancer patients at primary therapy: results of a 3-year median follow-up. Br J Cancer 1991 69: 566–571. 163. Solomayer EF, Becker S, Pergola-Becker G, Bachmann R, Kramer B, Vogel U, Neubauer H, Wallwiener D, Huober J & Fehm TN Comparison of HER2 status between primary tumor and disseminated tumor cells in primary breast cancer patients. Breast Cancer Research and Treatment 2006 98 179–184. 164. WiedswangG,BorgenE,Karesen R,Kvalheim G,Nesland JM, Qvist H, Schlichting E, Sauer T, Janbu J, Harbitz T. Detection of isolated tumor cells in bonemarrow is an independent prognostic factor in breast cancer. Journal of Clinical Oncology 2003 21 3469–3478. 165. Nogi H, Takeyama H. Detection of MUC1 and Keratin 19 mRNAs in the Bone Marrow by Quantitative RT-PCR Predicts the Risk of Distant Metastasis in Breast Cancer Patients. Breast Cancer vol: 10 issue: 1 page: 74-81 year: 2003 166. Yong-Sik Jung1, Kug-Jong Lee Clinical Significance of Bone Marrow Micrometastasis Detected by Nested RT-PCR for Keratin-19 in Breast Cancer Patients Jpn J Clin Oncol 2003;33(4)167–172. 167. Freire T, Berois N, Sonora C, Varangot M, Barrios E & Osinaga E UDP-N-acetyl-Dgalactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 6 (ppGalNAc-T6) mRNA as a potential new marker for detection of bone marrow-disseminated breast cancer cells. International Journal of Cancer 2006 119 1383–1388. 168. Benoy IH, Elst H, Philips M. Prognostic significance of disseminated tumor cells as detected by quantitative real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction in patients with breast cancer. Clinical breast cancer ISSN 1526-8209 2006, vol. 7, no2, pp. 146-152. 169. Masuda TA, Kataoka A, Ohno S, Murakami S, Mimori K, Utsunomiya T, Inoue H, Tsutsui H, Kinoshita J, Masuda N. Detection of occult cancer cells in peripheral blood and bone marrow by quantitative RT-PCR assay for cytokeratin-7 in breast cancer patients. International Journal of Oncology 2005 26 721–730. 170. Gebauer G, Fehm T. Micrometastases in axillary lymph nodes and bone marrow of lymph nodenegative breast cancer patients: Prognostic relevance after 10 years. Anticancer research ISSN 02507005 2003, vol. 23, no5B, pp. 4319-4324. 109 171. Schlimok G, Funke I, Holzmann B, Gottlinger G, Schmidt G, Hauser H, Swierkot S, Warnecke HH, Schneider B, Koprowski H: Micrometastatic cancer cells in bone marrow: in vitro detection with anti-cytokeratin and in vivo labeling with anti-17-1A monoclonal antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84: 8672-8676. 172. Cote RJ, Peterson HF, Chaiwun B, Gelber RD, Goldhirsch A, Castiglione-Gertsch M. Role of immunohistochemical detection of lymph-node metastases in management of breast cancer. International Breast Cancer Study Group. Lancet 1999;354(9182):896-900. 173. Harbeck N Untch M, Pache L, Eiermann W. (1994) Tumour cell detection in the bone marrow of breast cancer patients at primary therapy: results of a 3-year median follow-up. Br J Cancer 1991 69: 566–571. 174. Molino A, Pelosi G, Turazza M, Sperotto L, Bonetti A, Nortilli R, Fattovich G, Alaimo C, Piubello Q, Pavanel F, Micciolo R, Cetto GL: Bone marrow micrometastases in 109 breast cancer patients: correlations with clinical and pathological features and prognosis. Breast Cancer Res Treat 1997, 42:23-30. 175. Braun S, Kentenich C, Janni W. Lack of effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high-risk breast cancer patients. J Clin Oncol 2000;18:80– 86. 176. Janni W, Hepp F, Rjosk D. The fate and prognostic value of occult metastatic cells in the bone marrow of patients with breast carcinoma between primary treatment and recurrence. Cancer 2001;92:46–53. 177. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R. Isolated tumor cells in bone marrow three years after diagnosis in disease-free breast cancer patients predict unfavorable clinical outcome. Clin Cancer Res 2004;10:5342–5348. 178. Janni W, Rack B, Schindlbeck C. The persistence of isolated tumor cells in bone marrow from patients with breast carcinoma predicts an increased risk for recurrence. Cancer 2005;103:884–891. 179. Pantel K, Schlimok G, Braun S. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst 1993;85:1419–1424. 180. Pantel K, Izbicki JR, Angstwurm M. Immunocytological detection of bone marrow micrometastasis in operable non-small cell lung cancer. Cancer Res 1993;53:1027–1031 181. Riethmuller G, Schneider-Gadicke E, Schlimok G. Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes’ C colorectal carcinoma. German Cancer Aid 17-1A Study Group. Lancet 1994;343:1177–1183. 182. Punt CJ, Nagy A, Douillard JY. Edrecolomab alone or in combination with fluorouracil and folinic acid in the adjuvant treatment of stage III colon cancer: a randomised study. Lancet 2002;360:671–677. 110 183. Thurm H, Ebel S, Kentenich C. Rare expression of epithelial cell adhesion molecule on residual micrometastatic breast cancer cells after adjuvant chemotherapy. Clin Cancer Res 2003;9:2598–2604. 184. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;344:783–792. 185. Goss PE, Ingle JN, Martino S. A randomized trial of letrozole in postmenopausal women after five years of tamoxifen therapy for early-stage breast cancer. N Engl J Med 2003;349:1793–1802. 186. Diel IJ, Solomayer EF, Costa SD. Reduction in new metastases in breast cancer with adjuvant clodronate treatment. N Engl J Med 1998;339:357–363. 187. Rack B, Janni W, Schindlbeck C. Effect of zoledronate on persisting isolated tumor cells (ITC) in the bone marrow (BM) of patients without recurrence of early breast cancer. Proc Am Soc Clin Oncol 2004;22:9515. 188. R. Aft, M. Watson, L. Ylagan. Effect of zolendronik acid on bone marrow micrometastases in women undergoing neoadjuvant chemotherapy for breast cancer J Clin Oncol 26:2008 (May 20 suppl; abstr 1021) 189. Braun S, Schlimok G, Heumos I. ErbB2 overexpression on occult metastatic cells in bone marrow predicts poor clinical outcome of stage I-III breast cancer patients. Cancer Res 2001; 61: 1890-5. 190. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001; 344: 783-92. 191. Klein CA, Blankenstein TJF, Schmidt-Kittler O. Genetic heterogeneity of single disseminated tumour cells in minimal residual cancer. Lancet 2002; 360: 683-9. 192. Offner S, Schmaus W, Witter K. p53 gene mutations are not required for early dissemination of cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 6942-6. 193. Gray JW. Evidence emerges for early metastasis and parallel evolution of primary and metastatic tumors. Cancer Cell 2003; 4: 4-6. 194. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999; 286: 531-7. 195. Chambers AF, Groom AC, MacDonald IC. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer 2002; 2: 563-72. 196. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB. Molecular portraits of human breast tumours. Nature, 2000; 406: 747-52. 111 197. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 10869-74. 198. van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415: 530-6. 199. Woelfle U, Cloos J, Sauter G. Molecular signature associated with bone marrow micrometastasis in human breast cancer. Cancer Res 2003; 63: 5679-84. 200 Zetter BR, Banyard J. Cancer. The silence of the genes. Nature 2002; 419: 572-3. 201. Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M. The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature 2002; 419: 624-9. 202. Woelfle U, Sauter G, Santjer S, Brakenhoff R, Pantel K. Down-regulated expression of cytokeratin 18 promotes progression of human breast cancer. Clin Cancer Res 2004; 10: 2670-4. 203. Lonning PE, Sorlie T, Perou CM, Brown PO, Botstein D, Borresen-Dale AL. Microarrays in primary breast cancer-lessons from chemotherapy studies. Endocr Relat Cancer 2001; 8: 259-63. 204. MacDonald TJ, Brown KM, LaFleur B. Expression profiling of medulloblastoma: PDGFRA and the RAS/MAPK pathway as therapeutic targets for metastatic disease. Nat Genet 2001; 29: 143-52. 205. Bos R, Zhong H, Hanrahan CF. Levels of hypoxiainducible factor-1 alpha during breast carcinogenesis. J Natl Cancer Inst, 2001; 93: 309-14. 206. Staller P, Sulitkova J, Lisztwan J, Moch H, Oakeley EJ. Chemokine receptor CXCR4 downregulated by von Hippel-Lindau tumour suppressor pVHL. Nature 2003; 425: 307-11. 207. Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature 2001; 414: 105-11. 208. Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the “seed and soil” hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 2003; 3: 453-8. 209. Bernards R, Weinberg RA. A progression puzzle. Nature 2002; 418: 823. 210. Ramaswamy S, Ross KN, Lander ES, Golub TR. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat Genet 2003; 33: 1-6. 211. Datta YH, Adams PT, Drobyski WR. Sensitive detection of occult breast cancer by the reversetranscriptase polymerase chain reaction. J Clin Oncol 1994; 12:475–482. 112 212. Fields KK, Elfenbein GJ, Trudeau WL. Clinical significance of bone marrow metastases as detected using the polymerase chain reaction in patients with breast cancer undergoing high-dose chemotherapy and bone marrow transplantation. J Clin Oncol 1996; 14: 1868–1876. 213. Vannucchi A, Bosi MA, Glinz S. Evaluation of breast tumour contamination in the bone marrow and leukapheresis collections by RT-PCR for cytokeratin-19 mRNA. Br. J. Haematol. 1998; 103: 610– 17. 214. Slade MJ, Smith BM. Sinnet HD. (1999) Quantitative polymerase chain reaction for the detection of micrometastases in patients with breast cancer. J Clin Oncol 17: 870–879. 215. Landys K, Persson S, Kovarik J, Hultborn R, Holmberg E: Prognostic value of bone marrow biopsy in operable breast cancer patients at the time of initial diagnosis: results of a 20-year median follow-up. Breast Cancer Res Treat 1998, 49:27-33. 216. Funke I, Fries S, Rolle M. (1996) Comparative analyses of bone marrow micrometastases in breast and gastric cancer. Int J Cancer 65: 755–761. 217. Mathieu MC, Friedman S, Bosq J, Caillou B. (1990) Immunohistochemical staining of bone marrow biopsies for detection of occult metastasis in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 15: 21–26. 218. Singletary SE, Lillie Larry, MS, Susan L. Tucker. (1991) Detection of micrometastatic tumor cells in bone marrow of breast carcinoma patients. J Surg Oncol 47: 32–36. 219. Cote RJ, Rosen PP, Lesser ML, Old LJ, Osborne MP. (1991) Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases. J Clin Oncol 9: 1749–1756. 220. Porro G, Sylvie Ménard, PhD, Elda Tagliabue. (1988) Monoclonal antibody detection of carcinoma cells in bone marrow biopsy specimens from breast cancer patients. Cancer 61: 2407–2411. 221. Salvadori B, Squiccarni P, and Rovini D. (1990) Use of monoclonal antibody MBr1 to detect micrometastases in bone marrow specimens of breast cancer patients. Eur J Cancer 26: 865–867. 222. Redding WH, J C Gazet, A McKinna, T J Powles, and R C Coombes (1983) Detection of micrometastases in patients with primary breast cancer. Lancet 2: 1271–1274 223. Berger U, Bettelheim R, Mansi JL. (1988) The relationship between micrometastases in the bone marrow, histopathologic features of the primary tumor in breast cancer and prognosis. Am J Clin Pathol 90: 1–6. 224. de Mascarel I, Bonichon F. (1992) Prognostic significance of breast cancer axillary lymph node micrometastases assessed by two special techniques: reevaluation with longer follow-up. Br J Cancer 66: 523–527. 113 225. Bussolati G, Gugliotta P, Morra I. (1986) The immunohistochemical detection of lymph node metastases from infiltrating lobular carcinoma of the breast. Br J Cancer 54: 631–636. 226. Noguchi S, Tomohiko Aihara, Shoji Nakamori. (1994) The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer 74: 1595–1600. 227. Schoenfeld A, Luqmani İ, D. Smith, S. (1994) Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by using polymerase chain reaction. Cancer Res 54: 2986–2990. 228. Zhong XY, Kaul S, Lin YS, Eichler A. (2000) Sensitive detection of micrometastases in bone marrow from patients with breast cancer using immunomagnetic isolation of tumor cells in combination with reverse transcriptase/polymerase chain reaction for cytokeratin-19. J Cancer Res Clin Oncol 126: 212–218. 229. Berois N, M. Varangot, B. Aizen. (2000) Molecular detection of cancer cells in bone marrow and peripheral blood of patients with operable breast cancer: comparison of CK19, MUC1 and CEA using RT-PCR. Eur J Cancer 36: 717–723. 230. De Cremoux, P., Extra, J. M., Denis, M. G., Pierga, J. Y., Bourstyn, E., Nos, C., Clough, K. B., Boudou, E., Martin, E. C., Muller, A., Pouillart, P., and Magdelenat, H. Detection of MUC1expressing mammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast cancer patients by real-time polymerase chain reaction. Clin. Cancer Res., 6: 3117–3122, 2000. 231. Kahn HJ, Yang LY, Blondal J. (2000) RT-PCR amplification of CK19 mRNA in the blood of breast cancer patients: correlation with established prognostic parameters. Breast Cancer Res Treat 60: 143–151. 232. Fabisiewicz A, Kulik J, Kober P. (2004) Detection of circulating breast cancer cells in peripheral blood by a twomarker reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Acta Biochim Pol 51: 747– 755. 233. Benoy IH, Elst H, Philips M, Wuyts H. (2006) Real-time RT-PCR detection of disseminated tumour cells in bone marrow has superior prognostic significance in comparison with circulating tumour cells in patients with breast cancer. Br J Cancer 94: 672–680. 234. Janku F, Kleibl Z, Novotny J. (2004) Mammaglobin A, a novel marker of minimal residual disease in early stages breast cancer. Neoplasma 51: 204–208. 235. Stathopoulou A, Anna Gizi, Maria Perraki. (2003) Real-time quantification of CK-19 mRNApositive cells in peripheral blood of breast cancer patients using the lightcycler system. Clin Cancer Res 9: 5145–5151. 236. Han JH, Kang Y, Shin HC. (2003) Mammaglobin expression in lymph nodes is an important marker of metastatic breast carcinoma. Arch Pathol Lab Med 127: 1330–1334. 114 237. Silva JM, Gemma Dominguez, Javier Silva. (2001) Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics. Clin Cancer Res 7: 2821–2825. 238. Zach O, Kasparu H, Wagner H. (2002) Prognostic value of tumour cell detection in peripheral blood of breast cancer patients. Acta Med Austriaca 29 (Suppl 59): S32–S34. 239. Lin YC, Chen SC, Hsueh S. (2003) Lack of correlation between expression of human mammaglobin mRNA in peripheral blood and known prognostic factors for breast cancer patients. Cancer Sci 94: 99–102. 240. Ooka M, Yasuhiro Tamaki, Isao Sakita. (2001) Bone marrow micrometastases detected by RTPCR for mammaglobin can be an alternative prognostic factor of breast cancer. Breast Cancer Res Treat 67: 169–175. 241. Aihara T, Fujiwara, Y. Miyake. (2000) Mammaglobin B gene as a novel marker for lymph node micrometastasis in patients with abdominal cancers. Cancer Lett 150: 79–84. 242. Cerveira N Y, Lurdes Torres, Patrícia Rocha. (2004) Highly sensitive detection of the MGB1 transcript (mammaglobin) in the peripheral blood of breast cancer patients. Int J Cancer 108: 592–595. 243. Marchetti A. Buttitta F. Bertacca G. (2001) mRNA markers of breast cancer nodal metastases: comparison between mammaglobin and carcinoembryonic antigen in 248 patients. J Pathol 195: 186– 190. 244. Pierga JY, Bonneton C, Magdelenat H, Vincent-Salomon A, Nos C, Boudou E, Pouillart P, Thiery JP, de Cremoux P: Real-time quantitative PCR determination of urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression of isolated micrometastatic cells from bone marrow of breast cancer patients. Int J Cancer 2005, 114:291-298. 245. Braun S, Vogl FD, Naume B, Janni W, Osborne M, Coombes RC, Schlimok G, Diel I, Gerber B, Gebauer G, Pierga J-Y, Marth C, Oruzio D, Wiedswang G, Solomayer E-F, Kundt G, Strobl B, Fehm T, Wong GYC, Bliss J, Vincent-Salomon A, Pantel K: International pooled analysis of prognostic significance of bone marrow micrometastasis in patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med 2005, 353:793-802. 246. Pantel K, Schlimok G, Angstwurm M, Weckermann D, Schmaus W, Gath H, Passlick B, Izbicki JR, Riethmuller G: Methodological analysis of immunocytochemical screening for disseminated epithelial tumor cells in bone marrow. J Hematother 1994, 3: 165-173. 247. Borgen E, Naume B, Nesland JM, Kvalheim G, Beiske K, Fodstad O, Diel I, Solomayer E, Theocharous P, Coombes RC, Smith B, Wunder E, Marolleau J-P, Garcia J, Pantel K: Standardization of the immunocytochemical detection of cancer cells in BM and blood: I. establishment of objecive criteria for the evaluation of immunostained cells. Cytometry 1999, 1:377-388. 115 248. Fehm T, Braun S, Müller V, Janni W, Marth C, Pantel K, Schindlbeck C, Solomayer E: A concept for the standardized detection of disseminated tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer and its clinical implementation. Cancer 2006, 107:885-892. 249. Dismal Project [http://www.dismal-project.eu/] 250. Zach O, Lutz D: Tumor cell detection in peripheral blood and bone marrow. Curr Opin Oncol 2006, 18:48-56. 251. Paterlini-Brechot P, Benali NL: Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Lett 2007, 18:180-204. 252. Pinzani P, Salvadori B, Simi L, Bianchi S, Distante V, Cataliotti L, Pazzagli M, Orlando C: Isolation by size of epithelial tumor cells in peripheral blood of patients with breast cancer: correlation with real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction results and feasibility of molecular analysis by laser microdissection. Hum Pathol 2006, 37:711-718. 253. Wong NS, Kahn HJ, Zhang L, Oldfield S, Yang LY, Marks A, Trudeau ME: Prognostic significance of circulating tumour cells enumerated after filtration enrichment in early and metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2006, 99:63-69. 254. Rosenberg R, Gertler R, Friederichs J, Fuehrer K, Dahm M, Phelps R, Thorban S, Nekarda H, Siewert JR: Comparison of two density Gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood. Cytometry 2002, 49:150-158. 255. Witzig TE, Bossy B, Kimlinger T, Roche PC, Ingle JN, Grant C, Donohue J, Suman VJ, Harrington D, Torre-Bueno J, Bauer KD: Detection of circulating cytokeratin-positive cells in the blood of breast cancer patients using immunomagnetic enrichment and digital microscopy. Clin Cancer Res 2002, 8:1085-1091. 256. Wiedswang G, Borgen E, Karesen R, Kvalheim G, Nesland JM, Qvist H, Schlichting E, Sauer T, Janbu J, Harbitz T, Naume B: Detection of isolated tumor cells in bone marrow is an independent prognostic factor in breast cancer. J Clin Oncol 2003, 21:3469-3478. 257. Woelfle U, Breit E, Zafrakas K, Otte M, Schubert F, Muller V, Izbicki JR, Loning T, Pantel K: Bi-specific immunomagnetic enrichment of micrometastatic tumour cell clusters from bone marrow of cancer patients. J Immunol Methods 2005, 300:136-145. 258. Kraeft SK, Ladanyi A, Galiger K, Herlitz A, Sher AC, Bergsrud DE, Even G, Brunelle S, Harris L, Salgia R, Dahl T, Kesterson J, Chen LB: Reliable and sensitive identification of occult tumor cells using the improved rare event imaging system. Clin Cancer Res 2004, 10:3020-3028. 259. Borgen E, Naume B, Nesland JM, Nowels KW, Pavlak N, Ravkin I, Goldbard S: Use of automated microscopy for the detection of disseminated tumor cells in bone marrow samples. Cytometry 2001, 46:215-221. 116 260. Kraeft SK, Sutherland R, Gravelin L, Hu GH, Ferland LH, Richardson P, Elias A, Chen LB: Detection and analysis of cancer cells in blood and bone marrow using a rare event imaging system. Clin Cancer Res 2000, 6:434-442. 261. Bauer KD, de la Torre-Bueno J, Diel IJ, Hawes D, Decker WJ, Priddy C, Bossy B, Ludmann S, Yamamoto K, Masih AS, Espinoza FP, Harrington DS: Reliable and sensitive analysis of occult bone marrow metastases using automated cellular imaging. Clin Cancer Res 2000, 6:3552-3559. 262. Mehes G, Luegmayr A, Ambros IM, Ladenstein R, Ambros PF: Combined automatic immunological and molecular cytogenetic analysis allows exact identification and quantification of tumor cells in the bone marrow. Clin Cancer Res 2001, 7: 1969-1975. 263. M. Cristofanilli MD. Slade MJ, Singh A, Smith BM. (2005) Persistence of bone marrow micrometastases in patients receiving adjuvant therapy for breast cancer: results at 4 years. Int J Cancer 114: 94–100. 264. Stephan Braun, B. Semeni Cevatli, Cyamak Assemi. (2001) Comparative analysis of micrometastasis to the bone marrow and lymph nodes of node-negative breast cancer patients receiving no adjuvant therapy. J Clin Oncol 19: 1468–1475. 265. Braun S and Pantel K (2001) Clinical significance of occult metastatic cells in bone marrow of breast cancer patients. Oncologist 6: 125–132. 266. Naume Bjørn, Gro Wiedswang, Elin Borgen. (2004) The prognostic value of isolated tumor cells in bone marrow in breast cancer patients: evaluation of morphological categories and the number of clinically significant cells. Clin Cancer Res 10: 3091–3097. 267. Borgen E, Naume B, Nesland JM. Standardization of the immunocytochemical detection of cancer cells in BM and blood: I. establishment of objecive criteria for the evaluation of immunostained cells. Cytometry 1999; 1:377–388. 268. Zieglschmid V, Hollmann C & Bo¨cher O 2005 Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 42 155–196. 269. Marc Lacroix Significance, detection and markers of disseminated breast cancer cells. EndocrineRelated Cancer 13 (4) 1033 -1067 2006 DOI: 10.1677/ERC-06-0001. 270. Symmans WF, Liu J, Knowles DM, Inghirami G: Breast cancer heterogeneity: evaluation of clonality in primary and metastatic lesions. Hum Pathol 1995, 26:210-216. 271. Braun S, Hepp F, Sommer HL, Pantel K: Tumor-antigen heterogeneity of disseminated breast cancer cells: implications for immunotherapy of minimal residual disease. Int J Cancer 1999, 84:1-5. 272. Stathopoulou A, Ntoulia M, Perraki M. A highly specific real-time RTPCR method for the quantitative determination of CK-19 mRNA positive cells in peripheral blood of patients with operable breast cancer. Int J Cancer 2006. 117 273. Xenidis N, Perraki M, Kafousi M. Predictive and prognostic value of peripheral blood cytokeratin19 mRNA-positive cells detected by real-time polymerase chain reaction in node-negative breast cancer patients. J Clin Oncol 2006; 24:3756–3762. 274. Zippelius A, Kufer P, Honold G, Kollermann MW, Oberneder R, Schlimok G, Riethmuller G, Pantel K: Limitations of reversetranscriptase polymerase chain reaction analyses for detection of micrometastatic epithelial cancer cells in bone marrow. J Clin Oncol 1997, 15:2701-2708. 275. Bostick PJ, Chatterjee S, Chi DD, Huynh KT, Giuliano AE, Cote R, Hoon DS: Limitations of specific reverse-transcriptase polymerase chain reaction markers in the detection of metastases in the lymph nodes and blood of breast cancer patients. J Clin Oncol 1998, 16:2632-2640. 276. Jung R, Kruger W, Hosch S, Holweg M, Kroger N, Gutensohn K, Wagener C, Neumaier M, Zander AR: Specificity of reverse transcriptase polymerase chain reaction assays designed for the detection of circulating cancer cells is influenced by cytokines in vivo and in vitro. Br J Cancer 1998, 78:1194-1198. 277. Lankiewicz S, Rivero BG, Bocher O: Quantitative real-time RTPCR of disseminated tumor cells in combination with immunomagnetic cell enrichment. Mol Biotechnol 2006, 34: 15-27. 278. Sidransky D Nucleic acid-based methods for the detection of cancer. Science 7 November 1997: Vol. 278. no. 5340, pp. 1054 – 1058. 279. Cross NC, Feng L, Chase A, Bungey J. (1993) Competitive polymerase chain reaction to estimate the number of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia patients after bone marrow transplantation. Blood 82: 1929–1936. 280. Ghossein RA and Rosai J (1996) Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. Cancer 78: 10–16. 281. Schoenfeld A, Luqmani, H.O. Sinnett. (1996) Keratin 19 mRNA measurement to detect micrometastases in lymph nodes in breast cancer patients. Br J Cancer 74: 1639–1642. 282. Smith BM, Martin J. Slade, Jacqueline English. (2000) Response of circulating tumor cells to systemic therapy in patients with metastatic breast cancer: comparison of quantitative polymerase chain reaction and immunocytochemical techniques. J Clin Oncol 18: 1432–1439. 283. Pantel K, Alix-Panabieres C: The clinical significance of circulating tumor cells. Nat Clin Pract Oncol 2007, 4:62-63. 284. Czerkinsky C, Moldoveanu Z, Mestecky J, Nilsson L, Ouchterlony O: A novel two colour ELISPOT assay. I. Simultaneous detection of distinct types of antibody-secreting cells. J Immunol Methods 1988, 115:31-37. 118 285. Alix-Panabières C, Vendrell J-P, Pellé O, Riethdorf S, Müller V, Fabbro M, Pantel K: Detection and characterization of putative metastatic precursor cells in cancer patients. Clin Chem 2007, 53:537-539. 286. Gross HJ, Verwer B, Houck D, Hoffman RA, Recketenwald D. Model study detecting breast cancer cells in peripheral blood mononuclear cells at frequencies as low as 10-7. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:537–541. 287. Clevenger, C. V., Khandewal, M., Stadtmauer, E., and Jardines, L. Detection of bone marrow breast carcinoma metastasis using multiparameter flow cytometry. Ann. NY Acad. Sci., 677: 400–401, 1993. 288. Ryan, D., Mitchell, S. J., Hennessey, L. A., Bauer, K. D., Horan, P. K., and Cohen, H. J. Improved detection of rare CALLA-positive cells in peripheral blood using multiparameter flow cytometry. J. Immunol. Methods, 74: 115–128, 1984. 289. Leslie DS, Johnston WW, Daly L, et al. Detection of breast carcinoma cells in human bone marrow using fluorescent-activated cell sorting and conventional cytology. Am J Clin Pathol 1990;94:8– 13. 290. Leers MPG, Schoffelen RHMG, Hoop JGM, et al. Multiparameter flow cytometry as a tool for the detection of micrometastatic tumour cells in the sentinel lymph node procedure of patients with breast cancer. J Clin Pathol 2002;55:359–366. 291. De Luca, A., Pignata, S., Casamassimi, A., D’Antonio, A., Gridelli, C., Rossi, A., Cremona, F., Parisi, V., De Matteis, A., and Normanno, N. Detection of circulating tumor cells in carcinoma patients by a novel epidermal growth factor receptor reverse transcription-PCR assay. Clin. Cancer Res., 6: 1439– 1444, 2000. 292. Racila, E., Euhus, D., Weiss, A. J., Rao, C., McConnell, J., Terstappen, L. W., and Uhr, J. W. Detection and characterization of carcinoma cells in the blood. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4589– 4594, 1998. 293. Molino A, Colombatti M, Bonetti F, Zardini M, Pasini F, Perini A, et al. A comparative analysis of three different techniques for the detection of breast cancer cells in bone marrow. Cancer 1991;67:1033–6. 294. Wingren S, Guerrieri C, Franlund B, Stal O. Loss of cytokeratins in breast cancer cells using multiparameter DNA flow cytometry is related to both cellular factors and preparation procedure. Anal Cell Pathol 1995;9: 229–33. 295. Vredenburgh JJ, Silva O, Tyer C, DeSombre K, Abou-Ghalia A, Cook M, et al. A comparison of immunohistochemistry, two-color immunofluorescence, and flow cytometry with cell sorting for the detection of micrometastatic breast cancer in the bone marrow. J Hematother 1996;5:57–62. 296. Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood 1997;90:2863–92. 119 297. Ciudad J, San Miguel JF, Lopez-Berges MC, Vidriales B, Valverde B, Ocqueteau M, et al. Prognostic value of immunophenotypic detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 1998;16:3774–81. 298. Simpson SJ, Vachula M, Kennedy MJ, Kaizer H, Coon JS, Ghalie R, et al. Detection of tumor cells in the bone marrow, peripheral blood, and apheresis products of breast cancer patients using flow cytometry. Exp Hematol 1995;23:1062–8. 299. Neslihan Cabioglu, Aysegul Sahin, Michele Doucet, Ekrem Yavuz, Abdullah Igci, Engin O. Yildirim, Esin Aktas, Sema Bilgic, Bayram Kiran, Gunnur Deniz & Janet E. Price Chemokine receptor CXCR4 expression in breast cancer as a potential predictive marker of isolated tumor cells in bone marrow. Clinical & Experimental Metastasis (2005) 22: 39–46. 300. Bajpai Manisha, Jianying Lıu, Xın Geng. Repeated exposure to acid and bile selectively induces colonic phenotype expression in a heterogeneous Barrett's epithelial cell line. Lab Invest 88:64351(2008).WB;Human. 301. van Muijen GN, DJ Ruiter, WW Franke. Cell type heterogeneity of cytokeratin expression in complex epithelia and carcinomas as demonstrated by monoclonal antibodies specific for cytokeratins nos. 4 and 13. Exp Cell Res 162:97-113 (1986). 302. Malzahn K, Mitze M, Thoenes M, Moll R: Biological and prognostic significance of stratified epithelial cytokeratins in infiltrating ductal breast carcinomas. Virchows Arch 1998, 433: 119-129. 303. Abd El-Rehim DM, Pinder SE, Paish CE, Bell J, Blamey RW, Robertson JFR, Nicholson RI, Ellis IO: Expression of luminal and basal cytokeratins in human breast carcinoma. J Pathol 2004, 203:661-671. 304. Nagle RB, Bocker W, Davis JR, Heid HW, Kaufmann M, Lucas DO, Jarasch ED: Characterization of breast carcinomas by two monoclonal antibodies distinguishing myoepithelial from luminal epithelial cells. J Histochem Cytochem 1986, 34:869-881. 305. Boecker W, Moll R, Poremba C, et al. Common adult stem cells in the human breast give rise to glandular and myoepithelial cell lineages: a new cell biological concept. Lab Invest 2002;82:737–745. 306. Moll R. Cytokeratins as markers of differentiation in the diagnosis of epithelial tumors. Subcell Biochem 1998;31:205–262. 307. Jo BH, Kim HJ, Kim YJ, Park Y, Lee IK, Kim DI, Lee WH, Yoon SO. Expression of the Markers for the Mammary Stem Cells and the Cellular Lineages of the Mammary Gland on Ductal Carcinoma In Situ. J Breast Cancer. 2006 Sep;9(3):184-192. Korean. 308. Gerhard Schaller, Ilka Fuchs. Elevated keratin 18 protein expression indicates a favorable prognosis in patients with breast cancer. Clinical Cancer Research 1996 Nov; vol 2, 1879-1885. 120 309. Helmut Bühler Gerhard Schaller Transfection of Keratin 18 Gene in Human Breast Cancer Cells Causes Induction of Adhesion Proteins and Dramatic Regression of Malignancy In vitro and In vivo (Mol Cancer Res 2005;3(7):365–71). 310. Maria Hagg Olofsson,Takayuki Ueno Cytokeratin-18 Is a Useful Serum Biomarker for Early Determination of Response of Breast Carcinomas to Chemotherapy. Clin Cancer Res 2007;13(11) June 1, 2007. 311. Tsubura A, Senzaki H, Sasaki M. Immunohistochemical demonstration of breast-derived and/or carcinoma-associated glycoproteins in normal skin appendages and their tumors. J Cutan Pathol 19:73-9 (1992). 312. Villadsen R, Fridriksdottir AJ, Ronnov-Jessen L. Evidence for a stem cell hierarchy in the adult human breast. J Cell Biol 177:87-101 (2007). 313. de Graaf H, Maelandsmo GM, Ruud P, Forus A, Oyjord T, Fodstad O & Hovig E Ectopic expression of target genes may represent an inherent limitation of RT-PCR assays used for micrometastasis detection: studies on the epithelial glycoprotein gene EGP-2. International Journal of Cancer 1997 - 72 191–196. 314. Braun S, Hepp F, Kentenich CR. Monoclonal antibody therapy with edrecolomab in breast cancer patients: monitoring of elimination of disseminated cytokeratin-positive tumor cells in bone marrow. Clin Cancer Res 1999;5:3999–4004. 315. Zhong XY, Kaul S, Eichler A & Bastert G Evaluating GA733-2 mRNA as a marker for the detection of micrometastatic breast cancer in peripheral blood and bone marrow. Archives of Gynecology and Obstetrics 1999 - 263 2–6. 316. Walid A. Osta, Yian Chen EpCAM Is Overexpressed in Breast Cancer and Is a Potential target for Breast Cancer Gene Therapy. Cancer Research 64, 5818–5824, August 15, 2004. 317. Pirruccello SJ, LeBien TW. The human B-cell associated antigen CD24 is a single chain sialoglycoprotein. J Immunol 1986; 136:3779-3784. 318. Fischer GF, Majdic O, Gadd S, Knapp W. Signal transduction in lymphocytic and myeloid cells via CD24 a new member of phosphoinositol-anchored membrane molecules. J Immunol 1990;144:638641. 319. Akashi T, Shirasawa T, Hirokawa K. Gene expression of CD24 core polypeptide molecule in normal rat tissues and human tumor cell lines. Virchows Arch 1994; 425:399-406. 320. Goldsby RA, KindtTJ, Osborne BA. CDantigens. In: Kuby Immunology. 4th ed. NewYork:W.H. Freeman and Company; 2000. p. 593^607. 121 321. Marija Balic, Henry Lin. Most Early Disseminated Cancer Cells Detected in Bone Marrow of Breast Cancer Patients Have a Putative Breast Cancer Stem Cell Phenotype Clin Cancer Res 2006;5615 12(19) October 1, 2006. 322. Jackson D,Waibel R,Weber E, Bell J, Stahel RA. CD24, a signal-transducing molecule expressed on human B cells, is a major surface antigen on small cell lung carcinomas. Cancer Res 1992;52:5264^70. 323. Kristiansen G, Schluns K, Yongwei Y, Denkert C, Dietel M, Petersen I. CD24 is an independent prognostic marker of survival in nonsmall cell lung cancer patients. BrJCancer 2003;88:231^6. 324. Goodison S, Urquidi V,Tarin D. CD44 cell adhesion molecules. Mol Pathol 1999;52:189^96. 325. Lionel Hebbard, Anja Steffen. CD44 expression and regulation during mammary gland development and function. Journal of Cell Science 113, 2619-2630 (2000) 326. Kirchberger S, O. Majdic, S. Bluml, C. Schrauf, J. Leitner. The cytoplasmic tail of CD45 is released from activated phagocytes and can act as an inhibitory messenger for T cells. Blood : (2008). 327. Bazil V, Ivan Hilgert, Hana Kristofova. Sialic acid-dependent epitopes of CD45 molecules of restricted cellular expression. Immunogenetics 29:202-5 (1989). 328. Wicha MS. Cancer stem cells and metastasis: lethal seeds. Clin Cancer Res 2006;12:5606–7. 329. Vaidya JS. An alternative model of cancer cell growth and metastasis. Int J Surg 2007;5:73–5. 330. Brabletz T, Jung A, Spaderna S. Opinion: migrating cancer stem cells—an integrated concept of malignant tumour progression. Nat Rev Cancer 2005;5:744–9. 331. Hill A, McFarlane S, Mulligan K. Cortactin underpins CD44-promoted invasion and adhesion of breast cancer cells to bone marrow endothelial cells. Oncogene 2006;25:6079–91. 332. Sheridan C, Kishimoto H, Fuchs RK. CD44+/CD242 breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Res 2006;8:R59.F. 333. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke MF: Prospective identification of tumourigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100:3983-3988. 334. Matthew Smalley and Alan Ashworth. Stem cells and breast cancer: a fıeld ın transıt november 2003 | volume 3 www.nature.com/reviews/cancer. 335. Ellis M, Hayes DF, Lippman ME. Treatment of metastatic disease. In: Harris J, Lippman M, Morrow M, et al., eds. Diseases of the breast. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven, 2004:1101-59. 122 336. Ashworth TR. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Med J 1869;14:146. 337. Carey RW, Taft PD, Bennett JM, Kaufman S. Carcinocythemia (carcinoma cell leukemia): an acute leukemia-like picture due to metastatic carcinoma cells. Am J Med 1976;60:273-8. 338. Engell HC. Cancer cells in the circulating blood: a clinical study on the occurrence of cancer cells in the peripheral blood and in venous blood draining the tumour area at operation. Acta Chir Scand Suppl 1955;201: 1-70. 339. Myerowitz RL, Edwards PA, Sartiano GP. Carcinocythemia (carcinoma cell leukemia) due to metastatic carcinoma of the breast: report of a case. Cancer 1977;40:3107-11. 340. Gallivan MV, Lokich JJ. Carcinocythemia (carcinoma cell leukemia): report of two cases with English literature review. Cancer 1984;53:1100-2. 341. Sile CC, Perry DJ, Nam L. Small cell carcinocythemia. Arch Pathol Lab Med 1999; 123:426-8. 342. Rodriguez-Salas N, Jimenez-Gordo AM, Gonzalez E. Circulating cancer cells in peripheral blood: a case report. Acta Cytol 2000;44:237-41. 343. Seronie-Vivien S, Mery E, Delord JP. Carcinocythemia as the single extension of breast cancer: report of a case and review of the literature. Ann Oncol 2001;12:1019-22. 344. Yam LT, Janckila AJ. Immunocytodiagnosis of carcinocythemia in disseminated breast cancer. Acta Cytol 1987;31:68-72. 345. Karine Jacob; Caroline Sollier; Nada Jabado. Circulating Tumor Cells: Detection, Molecular Profiling and Future Prospects. Expert Rev Proteomics. 2007;4(6):741-756. © 2007 Future Drugs Ltd. 346. Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351(8), 781–791 (2004). 347. Kang Y, Massague J. Epithelial–mesenchymal transitions: twist in development and metastasis. Cell 118(3), 277–279 (2004). 348. Mansi JL, Gogas H, Bliss JM. Outcome of primary-breast-cancer patients with micrometastases: a long-term follow-up study. Lancet 354(9174), 197–202 (1999). 349. Iakovlev VV, Goswami RS, Vecchiarelli J, Arneson NC, Done SJ. Quantitative detection of circulating epithelial cells by Q-RT-PCR. Breast Cancer Res. Treat. 107(1), 145–154 (2007). 123 350. Schmidt-Kittler O, Ragg T, Daskalakis A. From latent disseminated cells to overt metastasis: genetic analysis of systemic breast cancer progression. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100(13), 7737–7742 (2003). 351. Hayes DF, Cristofanilli M, Budd GT. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12(14 Pt 1), 4218–4224 (2006). 352. Wulfing P, Borchard J, Buerger H. HER2-positive circulating tumor cells indicate poor clinical outcome in stage I to III breast cancer patients. Clin. Cancer Res. 12(6), 1715–1720 (2006). 353. Ulmer A, Schmidt-Kittler O, Fischer J. Immunomagnetic enrichment, genomic characterization, and prognostic impact of circulating melanoma cells. Clin. Cancer Res. 10(2), 531–537 (2004). 354. Moreno JG, Miller MC, Gross S. Circulating tumor cells predict survival in patients with metastatic prostate cancer. Urology 65(4), 713–718 (2005). 355. Bozionellou V, Mavroudis D, Perraki M. Trastuzumab administration can effectively target chemotherapy-resistant cytokeratin-19 messenger RNA-positive tumor cells in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer. Clin. Cancer Res. 10(24), 8185–8194 (2004). 356. Oscar B. Goodman, Jr., Louis M. Fink, James T. Symanowski. Circulating Tumor Cells in Patients with Castration-Resistant Prostate Cancer Baseline Values and Correlation with Prognostic Factors. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 18, 1904, June 1, 2009. 357. Gerald C. O’Sullivan, J. Kevin Collns. Micrometastases in bone marrow of patients undergoing curative surgery for gastrointestinal cancer. Gastroenterology 1995;109: 1535-1540. 358. Bidard, F., Vincent-Salomon, A., Sigal-Zafrani, B., et al. Prognosis of women with Stage IV breast cancer depends on detection of circulating tumor cells rather than disseminated tumor cells. Annals of Oncology. 2008. 19(3): 496-500. 359. Naume B, Borgen E, Kvalheim G, et al. Detection of isolated tumor cells in bone marrow in earlystage breast carcinoma patients: comparison with preoperative clinical parameters and primary tumor characteristics. Clin Cancer Res 2001;7:4122–29. 360. William L. Donegan, MD Tumor-Related Prognostic Factors for Breast Cancer CA Cancer J Clin 1997;47:28-51. 361. N. Özdemir, Y.Erhan, O.Zekioğlu. Duktal Hiperplazi, Karsinoma İn Situ ve İnvaziv Meme Kanserlerinde ER, PR, Kİ-67, P53 ve HER-2/NEU’nin önemi. Türkiye Ekopatoloji Dergisi 2000;6(34):131-141. 362. Bijker N, Peterse JL, Duchateau L, et al. Risk factors for recurrence and metastasis after breastconserving therapy for ductal carcinomain-situ: analysis of European Organization for Research and Treatment of Cancer Trial 10853. J Clin Oncol 2001;19:2263–71. 124 363. Jeanne J. Yu, MD,* Meghan Brennan, RN, ONP. Bone Marrow Micrometastases and Adjuvant Treatment of Breast Cancer The Breast Journal, Volume 10, Number 3, 2004 181–185. 364. D.Magire, G.C. O’Sullivan, B. McNamara. Bone marrow micrometastases in patient with brain metastases from epithelial cell tumours. Q J Med 2000; 93:611-615. 365. Laroche, Vincent; McKenna, David H.; Moroff, Gary; Schierman, Therese; Kadidlo, Diane; McCullough, Jeffrey Cell loss and recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of postthaw and postwash samples. Transfusion. 45(12):1909-1916, December 2005. 366. Elgio K, Clausen OP. Mouse epidermal cell proliferation after a single application of dimethyl sulphoxide (DMSO). Cell Tissue Kinet. 1983 Jul;16(4):343-9. 367. Karl G. Blume, Stephen J. Forman, Frederick R. Appelbaum Thomas' hematopoietic cell transplantation. 4th edition. 368. Emens LA, Reilly RT & Jaffee EM Breast Cancer vaccines: maximizing cancer treatment by tapping into host immunity. Endocrine-Related Cancer 2005 12 1–17. 369. Suat Kutun, Alper Çelik, Olga Koçkar, Abdullah Çetin Outcomes of bone marrow micrometastases in breast carcinoma Cumhuriyet Tıp Derg 2009; 31: 52-59. 125 ÖZGEÇMİŞ Adı-Soyadı : Mustafa Salih AKIN Doğum Tarihi ve Yeri : 02 / 05 / 1976 – Turhal/TOKAT Medeni Durumu : Evli Adres : Kurttepe Mahallesi Arıkök Apt. Kat 8 Daire 16 Çukurova/ADANA Telefon : 0-505-7185221 e-mail : salihakinmd@gmail.com Mezuniyet : Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Mezuniyet Yılı :1999 Yabancı Diller : İngilizce 126
