tc yıldız teknik üniversitesi fen bilimleri enstitüsü visseral

advertisement
T.C.
YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
VİSSERAL LEİSHMANİASİS ETMENİ LEİSHMANİA İNFANTUM
ANTİJENİNE KARŞI HİBRİDOMA TEKNİĞİ İLE MONOKLONAL
ANTİKOR ELDE EDİLMESİ
SERKAN YAMAN
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOMÜHENDİSLİK ANABİLİM DALI
DANIŞMAN
YRD. DOÇ. DR. MELAHAT BAĞIROVA
İSTANBUL 2012
T.C.
YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
VİSSERAL LEİSHMANİASİS ETMENİ LEİSHMANİA İNFANTUM
ANTİJENİNE KARŞI HİBRİDOMA TEKNİĞİ İLE MONOKLONAL
ANTİKOR ELDE EDİLMESİ
Serkan YAMAN tarafından hazırlanan tez çalışması 15.06.2012 tarihinde aşağıdaki jüri
tarafından Yıldız Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyomühendislik
Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.
Tez Danışmanı
Yrd. Doç. Dr. Melahat BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi
Jüri Üyeleri
Yrd. Doç. Dr. Melahat BAĞIROVA
Yıldız Teknik Üniversitesi
_____________________
Prof. Dr. Adil M. ALLAHVERDİYEV
Yıldız Teknik Üniversitesi
_____________________
Prof. Dr. Murat HÖKELEK
İstanbul Üniversitesi
_____________________
ÖNSÖZ
Visseral leishmaniasis etmeni Leishmania infantum hücre yüzey antijenine karşı
hibridoma tekniği ile monoklonal antikor elde edilmesi konu başlıklı yüksek lisans tez
yolculuğum süresince engin bilgi ve deneyimi ile bu yolda ilerlememde yardımcı olan
çok değerli danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Melahat BAĞIROVA’ya sonsuz saygı ve
şükranlarımı sunarım.
Bilgi, tecrübe ve çalışma aşkı ile çalışmalarımın ve bilimsel altyapımın
sağlamlaşmasında destek olan değerli hocam Sayın Prof. Dr. Adil
ALLAHVERDİYEV’e
Bu çalışmanın yerine getirilmesine imkan sağlayan Kimya-Metalurji Fakültesi
Dekanlığına, Fen Bilimleri Enstitüsüne, Biyomühendislik Bölümü Başkanı Sayın Prof.
Dr. İbrahim IŞILDAK’a ve bölümümüzün değerli öğretim üyeleri ile asistanlarına
Hücre temini konusundaki nazik yardımları için Ege Üniversitesi Biyomühendislik
Bölümü Öğretim Üyesi Sayın Prof. Dr. S. İsmet Deliloğlu GÜRHAN’a ve Arş. Gör.
Mehmet Özgün ÖZEN’e
Deneysel çalışmam boyunca benden yardımlarını esirgemeyen ve desteklerini
unutamayacağım doktora öğrencileri Rabia ÇAKIR KOÇ, Serhat ELÇİÇEK, Arş. Gör.
Emrah Şefik ABAMOR, Arş. Gör. Murat TOPUZOĞULLARI, Olga Nehir ÖZTEL, Dr.
Sezen CANIM ATEŞ, Serap YEŞİLKIR BAYDAR ile Yüksek Lisans öğrencisi Gökçe
ÜNAL’a
Akademik hayatımın başlaması, devam etmesi ve olgunlaşmasında maddi, manevi her
türlü desteği veren İLİM YAYMA VAKFI AİLESİ’nin çok değerli mensuplarına ve
İLİM YAYMA EĞİTİM MERKEZİ’ne,
Ayrıca öğrenim hayatım boyunca her türlü zorluğa rağmen hiçbir desteği benden
esirgemeden bugünlere gelmeme vesile olan sevgili annem Fatma YAMAN, sevgili
babam İsmail YAMAN’ ve sevgili anneannem Ayşe ORHAN’a, çalışkanlık, disiplin,
özgüven ve vazgeçmemeyi öğrenerek örnek aldığım sevgili abilerim Kemalettin
YAMAN ile Cihat YAMAN’a ve hayatım boyunca her türlü desteğiyle yanımda olan
sevgili kardeşim Seval YAMAN’a bütün içtenliğimle teşekkürü bir borç bilirim.
Mayıs, 2012
Serkan YAMAN
İÇİNDEKİLER
Sayfa
SİMGE LİSTESİ ..................................................................................................................... viii
KISALTMA LİSTESİ ............................................................................................................... ix
ŞEKİL LİSTESİ ....................................................................................................................... xii
ÇİZELGE LİSTESİ ................................................................................................................. xiii
ÖZET ....................................................................................................................................... xiv
ABSTRACT ............................................................................................................................ xvi
BÖLÜM 1
GİRİŞ ......................................................................................................................................... 1
1.1 Literatür Özeti ........................................................................................................... 1
1.2 Tezin Amacı .............................................................................................................. 3
1.3 Hipotez ...................................................................................................................... 4
BÖLÜM 2
GENEL BİLGİLER .................................................................................................................... 5
2.1 Leishmaniasis ............................................................................................................ 5
2.2 Leishmania Parazitlerinin Hayat Döngüsü ................................................................ 5
2.2.1 Promastigot Form ............................................................................................ 6
2.2.2 Amastigot Form............................................................................................... 7
2.3 Leishmaniasis Hastalığının Formları ........................................................................ 8
2.3.1 Kütanöz Leishmaniasis ................................................................................... 8
2.3.2 Mukokütanöz Leishmaniasis ........................................................................... 9
2.3.3 Visseral Leishmaniasis .................................................................................... 9
2.4 Visseral Leishmaniasis etkeni L. infantum’un Özellikleri ...................................... 10
2.5 Visseral Leishmaniasisin Epidemiyolojisi .............................................................. 10
2.6 Hastalığın Tedavisi ve Kliniği ................................................................................. 12
iv
2.7.1 İmmün Sistem ............................................................................................... 12
2.7.1.2 Adaptif İmmünite .............................................................................. 13
2.7.2 Antikorlar (İmmünoglobulinler) ................................................................... 15
2.7.2.1 Antikorların Yapısı ............................................................................ 15
Antikor İzotipleri ve Fonksiyonları………………………………17
2.7.3 İmmün Sistemin Leishmaniasisdeki Rolü ve Leishmaniasise Karşı İmmün
Cevap ............................................................................................................. 18
2.8 Leishmaniasis’in Laboratuvar Tanısında Kullanılan Yöntemler ............................ 19
2.8.1 Mikroskobik Tanı Yöntemleri ....................................................................... 20
2.8.2 Kültür Yöntemleri ......................................................................................... 20
2.8.3 Moleküler Yöntemler .................................................................................... 21
2.8.4 Serolojik Yöntemler ...................................................................................... 21
2.9 Monoklonal Antikor Teknolojisi ............................................................................. 21
2.9.1 Monoklonal Antikorların Poliklonal Antikorlar ile Kıyaslanması ................ 22
2.9.2 Hibridoma Teknolojisi .................................................................................. 23
2.9.2.1 İmmünizasyon İçin Seçilen Hayvanların Özellikleri ........................ 24
2.9.2.2 Füzyon Çalışmalarında Kullanılacak Hücrelerin Özellikleri ............ 25
2.9.2.3 Füzyon Çalışmaları Sonrası Hibrid Hücrelerin Seçilmesi ................ 25
2.9.3 Monoklonal Antikorların Uygulama Alanları ............................................... 27
2.9.4 Leismaniasisin Tanısında Monoklonal Antikorların Önemi ......................... 28
2.9.4.2 Antikor Saptanması ........................................................................... 29
2.9.4.1 Antijen Saptanması ........................................................................... 29
BÖLÜM 3
DENEYSEL ÇALIŞMALAR .................................................................................................. 30
3.1 MATERYAL ........................................................................................................... 30
3.1.1 Ekipman ........................................................................................................ 30
3.1.2 Kimyasallar ................................................................................................... 32
3.1.3 Deneylerde Kullanılan Tampon, Kültür Ortamları ve Kimyasalların
Hazırlanışı ..................................................................................................... 34
3.1.3.1 Tamponlar ......................................................................................... 34
3.1.3.2 Besiyerleri ......................................................................................... 36
3.1.4 Deneylerde Kullanılan Deney Hayvanları .................................................... 37
3.1.5 Deneylerde Kullanılan Hücreler.................................................................... 37
3.2 METOT ................................................................................................................... 39
3.2.1 L. infantum (MONI/EP126) Suşunun Kriyobanktan Çıkarılması ................. 39
3.2.2 L. infantum (MONI/EP126) Promastigot Kültürünün Yapılması ................. 39
v
3.2.3 Parazitlerin Thoma Lamında Sayımı ............................................................. 39
3.2.4 P3-X63-Ag8.653 Myeloma Hücrelerinin Kriyobanktan Çıkarılması ........... 40
3.2.5 P3-X63-Ag8.653 Myeloma Hücrelerinin Kültürünün Yapılması .................. 40
3.2.6 P3-X63-Ag8.653 Myeloma Hücrelerinin Aminopterin Hassasiyetlerinin
Sağlanması .................................................................................................... 41
3.2.7 Füzyon Sonrası Besleyici Hücrelerin Hazırlanması ....................................... 42
3.2.7.1 Fare Periton Makrofajlarının Besleyici Hücre Olarak Elde Edilmesi 42
3.2.7.2 Besleyici Besiyeri Hazırlanması Amaçlı J774 Makrofaj Hücre
Kültürünün Elde Edilmesi ................................................................. 43
3.2.7.3 J774 Makrofaj Hücre Kültüründen Destekleyici Besiyerlerinin
Toplanması ........................................................................................ 43
3.2.8 Parazitlerden Antijen Elde Edilmesi ve Miktarının Belirlenmesi .................. 44
3.2.9 Fare Deneyleri ................................................................................................ 44
3.2.9.1 Balb/c Farelerin L. infantum Tüm Parazitleri ile İmmünizasyonu .... 44
3.2.9.2 İndirekt ELISA Testi ile İmmünizasyon, Çapraz Reaksiyon ve Pozitif
Kuyuların Kontrolü ........................................................................... 45
3.2.10 Füzyon Deneyleri ......................................................................................... 46
3.2.10.1 İmmünize Olmuş Fareden Dalak Hücrelerinin Eldesi .................... 46
3.2.10.2 Tripan Mavisi ile Hücrelerin (Myeloma, Peritonel Makrofaj, J774
Makrofaj ve İmmün Dalak Hücreleri) Sayımı ve Canlılık Tayini 47
3.2.10.3 İmmun Dalak Hücrelerinin Myeloma Hücreleri ile Füzyonu ......... 48
Hücre Füzyonu ............................................................................. 49
3.2.11 Füzyon Yapılan Hücrelerin Ekimi ve Kültürü ............................................. 49
3.2.12 Sınırlayıcı Sulandırma Yöntemi ile Hibridoma Hücre Hatlarının Alt
Klonlarına Ayrılması .................................................................................... 51
3.2.13 Hibridoma Hücre Hatlarının Dondurulması ve Geri Kazanımı ................... 52
3.2.13.1 Hibridoma Hücre Hatlarının Dondurulması ................................... 52
3.2.13.2 Hibridoma Hücre Hatlarının Kriyobanktan Çıkarılması ................ 52
3.2.14 Üretilen Antikorların Western Blot Yöntemiyle Antijen Spesifikliğinin
Belirlenmesi ................................................................................................ 52
3.2.14.1 SDS-Page Jel Elektroforezi ............................................................ 52
3.2.14.2 Western Blotlama ........................................................................... 53
3.2.15 Antikor İzotiplerinin Belirlenmesi ............................................................... 54
3.2.16 Monoklonal Antikorların Saflaştırılması ..................................................... 54
3.2.16.1 Amonyum Sülfat Çöktürmesi ......................................................... 54
3.2.16.2 Protein G İmmün Afinite Kolon Kromatografisi ........................... 55
vi
BÖLÜM 4
DENEYSEL SONUÇLAR ....................................................................................................... 56
4.1 İmmünizasyon Kontrolleri ...................................................................................... 56
4.1.1 Birinci Füzyon Çalışmaları İçin İmmünize Edilen Farelerin Antikor Yanıtları
....................................................................................................................................... 56
4.1.2 İkinci Füzyon Çalışmaları İçin İmmünize Edilen Farelerin Antikor Yanıtları
....................................................................................................................................... 57
4.2 Füzyon Sonuçları..................................................................................................... 58
4.2.1 Birinci Füzyon Sonuçları ............................................................................... 58
4.2.2 İkinci Füzyon Sonuçları ................................................................................. 60
4.3 Çapraz Reaksiyon Sonuçları ................................................................................... 62
4.4 Western Blot Sonuçları ........................................................................................... 62
4.6 Monoklonal Antikorların Saflaştırılması ................................................................ 63
BÖLÜM 5
SONUÇ ve ÖNERİLER ........................................................................................................... 66
KAYNAKLAR ......................................................................................................................... 71
EK- A
ETİK KURUL TUTANAĞI .................................................................................................... 84
ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................................. 85
vii
SİMGE LİSTESİ
A260
A280
B6
Balb/c
bp
cc
cm
cm2
Da
J774
kDa
M
Mb
Mg
ml
mm
mM
nm
Sb
α
β
γ
δ
ε
κ
µ
µg
µl
µm
°C
260 nm dalga boyunda alınan absorbans değeri
280 nm dalga boyunda alınan absorbans değeri
Tirozinaz gen mutasyonlu albino deney faresi
Albino laboratuvar soy deney faresi (Albino laboratory bred mouse
strain)
Baz çifti
Santimetre küp
Santimetre
Santimetre kare
Dalton
Fare tümör monosit hücre hattı
Kilo Dalton
Molar
Megabaz
Miligram
Mililitre
Milimetre
Milimolar
Nanometre
Antimon
Alfa
Beta
Gama
Delta
Epsilon
Kappa
Mü
Mikrogram
Mikrolitre
Mikrometre
Santigrat Derece
viii
KISALTMA LİSTESİ
AIDS
AMP
Anti-HER2/neu
AP
APRT
APS
BSA
C bölgesi
CD4+
CD8+
CFA
CH1
CL
CO2
COOH
DAT
Dk
DMSO
DNA
dTMP
dUMP
EDTA
ELISA
Fab
Fc
FACS
FBS
GMP
GMP
Gp63
H zinciri
H2O
HAT
HCl
HEPES
HGPRT
Edinilmiş Bağışıklık Eksikliği Sendromu (Acquired Immunodeficiency
Syndrome)
Adenozin Monofosfat
İnsan meme kanseri hücre yüzey antijenine karşı üretilmiş antikor
Alkalin Fosfataz
Adenin Fosforibozil Transferaz
Amonyum per sülfat
Sığır Serum Albumin (Bovine Serum Albümine)
Antikor yapısında değişmez “Constant” bölge
CD4 hücre yüzey antijeni bulunduran lenfosit
CD8 hücre yüzey antijeni bulunduran lenfosit
Complete Freund’s Adjuvan
Antikor yapısında Ağır zincirdeki değişmez bölgenin 1. kıvrımı
Antikor yapısında hafif zincirdeki değişmez bölge
Karbondioksit
Karboksilik asit
Direk Aglütinasyon Testi
Dakika
Dimetil sülfoksit
Deoksiribonükleik asit
Deoksitimidin monofosfat
Deoksiüridin monofosfat
Etilen Diamin Tetra Asetik asit
Enzim Bağlı İmmunosorbent Test (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)
Fragment antigen binding (antijen bağlayan bölge)
Fragment crystallizable (kristalize olabilen bölge)
Floresan Aktive Hücre Ayırımı (Fluorescence-activated cell sorting)
Sığır Fetal Serum (Fetal Bovine Serum)
İyi Üretim Uygulamaları (Good Manufacturing Practice)
Guanozin monofosfat
Leishmania yüzey membran metaloproteazı
Antikor yapısında ağır “heavy” zincir
Su
Hipoksantin, Aminopterin, Timidin
Hidroksi klorik asit
4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit
Hipoksantin-Guanin Fosforibozil Transferaz
ix
HGPRTHGPRT+
HT
ICT
IFAT
IFN-γ
IgA
IgD
IgE
IgG
IgM
IHA
IL-10
IL-12
IL-13
IL-4
IL-5
IMP
K2HPO4
KATEX
KCl
kDNA
KH2PO4
KL
KOH
L zinciri
L.inf 15kDa ag
LAT
LPG
MACS
MgCl2
MHC
MKL
MKY
mRNA
MW
Na2HPO4
NaCl
NaH2PO4
NaHCO3
NaN3
NFB
NH2
(NH4)2SO4
NK
NO
OD
PBS
PZR
PEG
Hipoksantin-Guanin Fosforibozil Transferaz mutant
Hipoksantin-Guanin Fosforibozil Transferaz normal
Hipoksantin Timidin
İmmünokromatografik test (Immunocromatografic Test)
İmmunofloresan antikor testi (Immunofluorescent Antibody Test)
İnterferon gama
İmmünoglobulin A
İmmünoglobulin D
İmmünoglobulin E
İmmünoglobulin G
İmmünoglobulin M
İndirekt Hemaglutinasyon Testi (Indirect Hemagglutination Test)
İnterlökin 10
İnterlökin 12
İnterlökin 13
İnterlökin 4
İnterlökin 5
İnozin monofosfat
Potasyum fosfat (di)
Yeni Latex Aglütinasyon Testi (New Latex Agglutination Test)
Potasyum klorür
Kinetoplasta ait deoksiribonükleik asit
Potasyum fosfat (mono)
Kütanöz Leishmaniasis
Potasyum hidroksit
Antikor yapısında hafif “light” zincir
Leishmania infantum 15 kDA antijen
Lateks Aglütinasyon Testi (Latex Agglutination Test)
Lipofosfoglikan
Manyetik Aktive Hücre Ayırımı (Magnetic Activated Cell Sorting)
Magnezyum klorür
Major Histocompatibility Complex
Mukokütönöz leishmaniasis
Mikro kültür yöntemi
Mesajcı Ribonükleik Asit
Moleküler Ağırlık (Molecular Weight)
Disodyum fosfat
Sodyum klorür
Monosodyum fosfat
Sodyum bikarbonat
Sodyum azid
Nükleer faktör B
Amin
Amonyum sülfat
Doğal öldürücü hücreler (Natural Killer cells)
Azot monoksit (Nitrik Oksit)
Optik Yoğunluk (Optical Density)
Fosfat Tampon Solüsyonu (Phosphate buffered saline)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction)
Polietilen Glikol
x
PET
pH
PNNP
PVDF
RFLP
RIA
Rk39
RNA
RPM
RPMI-1640
SDS
SDS-PAGE
SPECT
TEMED
TGF-β
Th1
Th2
TK
TMP
TNF-α
UMP
UV
V bölgesi
VL
WB
ZnCl2
Pozitron Emisyon Tomografisi (Positron Emission Tomography)
Potansiyel hidrojen
Para-Nitrofenilfosfat
Poliviniliden florid (Polyvinylidene fluoride)
Kesilmiş parça uzunluğu polimorfizmi (Restriction fragment Length
Polymorphism)
Radyo İmmün Testi (Radio Immune Assay)
Leishmania LcKin proteini 39 aminoasit tekrar bölgesi)
Ribonükleik asit
Bir dakikadaki devir sayısı (Revolutions per minute)
Roswell Park Memorial Institute-1640
Sodium Dödesil Sülfat
Sodium dödesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi
Tek Foton Emisyon Bilgisayarlı Tomografi (Single Photon Emission
Computerized Tomography)
Tetrametil etilen diamin
Transforming growth factor β (transforme büyüme faktörü beta)
T helper 1 (Yardımcı T hücre yanıtı alt sınıf 1)
T helper 2 (Yardımcı T hücre yanıtı alt sınıf 2)
Timidin Kinaz
Timidin monofosfat
Tümör nekroz faktör alfa
Üridin monofosfat
Ultraviyole
Antikor yapısında değişken “Variable” bölge
Visseral Leishmaniasis
Western Blotting
Çinko klorür
xi
ŞEKİL LİSTESİ
Sayfa
Şekil 2.1
Şekil 2.2
Şekil 2.3
Şekil 2.4
Şekil 2.5
Şekil 2.6
Şekil 2.7
Şekil 2.8
Şekil 2.9
Şekil 3.1
Şekil 3.2
Şekil 3.3
Şekil 3.4
Şekil 3.5
Şekil 3.6
Şekil 3.7
Şekil 3.8
Şekil 3.9
Şekil 3.10
Şekil 3.11
Şekil 4.1
Şekil 4.2
Şekil 4.3
Şekil 4.4
Şekil 4.5
Şekil 4.6
Şekil 4.7
Şekil 4.8
Şekil 4.9
Şekil 4.10
Şekil 4.11
Leishmania türlerinin hayat döngüsü ……………………………………..
Leishmania parazitlerinin promastigot ve amastigot formları ...………….
Eski ve yeni kıtada VL’in coğrafik dağılımı ……………………………..
Türkiye'de leishmaniasis dağılımı ...………………………………………
Antijenlere karşı B lenfositlerinin gösterdiği birincil ve ikincil yanıtlar …
İmmünoglobulin G’nin 3 boyutlu kurdele modellemesi …...……………..
Hibridoma teknolojisi ile in vitro monoklonal antikor üretim aşamaları….
Hibridoma deneylerinde kullanılan BALB/c deney fareleri ……………...
Nükleotid sentezi için de novo ve kurtarma (salvage) yolakları ………….
MONI/EP126 L. infantum parazitlerinin kültürdeki durumu (20X) ……...
Log faz P3-X63-Ag8.653 myeloma hücreleri (20X) …………………….
8-azaguaninden 1 gün sonra hücrelerin durumu(40X) ……………..……..
Fare peritonel makrofajların alınması …………………………………….
Log faz J774 fare makrofaj hücreleri (20X) ………………………………
İmmünize Balb/c faresinden alınan dalaktan lenfosit izolasyonu ………...
Thoma lamı üzerindeki yivler …………………………………………….
Füzyon sonrası hücrelerin kültürdeki durumu (20X) ……………………..
5 gün sonra hücrelerin HAT içeren kültürdeki durumu (20X) ……………
Hücrelerin 10 gün sonra kültürdeki durumu (20X) ………………….........
Hibridoma kültürünün büyük ölçekli kültürdeki durumu (20X) …….........
İkinci immünizasyon sonrası Balb/c farelerin immün cevap seviyeleri…..
Dördüncü immünizasyon sonrası Balb/c farelerin immün cevap seviyeleri
Birinci füzyon birinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum
antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları……………………………
Birinci füzyon ikinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum
antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları……………………………
İkinci füzyon birinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum
antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları …………………………
İkinci füzyon ikinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum
antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları……………………………
Genişletilen klonların diğer proteinlerle çapraz reaksiyon testlerinin
indirekt ELISA testi ile 405 nm ‘de değerlendirilmesi……………………
1C3 Monoklonal antikorunun L. infantum tüm hücre lizat antijenine karşı
gösterdiği spesifikliğin western blot analizi ile gösterilmesi………………
1C3 klonunun ürettiği antikorların izotipinin belirlenmesi………………...
Kolon sonrası toplanan tüplerin UV spektrofotometrik olarak protein
içeriklerinin ölçülmesi…………………………………………………….
Protein verlığı görülen tüplerin L. infantum parazitlerine karşı antikor
spesifikliğinin indirekt ELISA yöntemi ile belirlenmesi…………………..
xii
6
7
11
12
14
16
23
25
26
39
41
41
42
43
47
47
49
50
50
51
56
57
58
59
60
61
62
63
63
64
64
ÇİZELGE LİSTESİ
Sayfa
Çizelge 2.1
Çizelge 2.2
Çizelge 3.1
Çizelge 3.2
Çizelge 4.1
Çizelge 4.2
Çeşitli klinik formala neden olan Leishmania türleri …………...…………….
L. infantum genom özellikleri …………………………………...……………
Deney gruplarının immünizasyon tarihleri …………………………………...
SDS-PAGE yöntemi için dökülecek jelerin hazırlanışı ………………………...
Birinci füzyon sonuçları (*1C2; 1. plak, C-2. kuyu) ……….......……………
İkinci füzyon sonuçları(*1C3; 1. plak, C-3. kuyu, 2B2; 2. plak, B-2. kuyu)...
xiii
8
10
44
53
59
61
ÖZET
VİSSERAL LEİSHMANİASİS ETMENİ LEİSHMANİA İNFANTUM
ANTİJENİNE KARŞI HİBRİDOMA TEKNİĞİ İLE MONOKLONAL
ANTİKOR ELDE EDİLMESİ
Serkan YAMAN
Biyomühendislik Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Tezi
Tez Danışmanı: Yard. Doç. Dr. Melahat BAĞIROVA
Leishmaniasis, enfekte kum sineklerinin (Phlebotomus) kan emme esnasında memeli
konaklara bulaştırdıkları hücre içi Leishmania protozoonlarının oluşturduğu bir hastalık
grubudur. Hastalığın Visseral (VL), Kütanöz (KL) ve Mukokütanöz (MKL) olmak üzere 3
klinik formu mevcuttur. Dünyada her yıl 1,0-1,5 milyon kişi KL’e, 500.000 kişi ise VL’e
yakalanmaktadır. Ayrıca son yıllarda hastalığın etkenlerinde kullanılan antileishmanial
ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı dirençliliğin gelişmesi ve küresel ısınmanın
dünya üzerindeki etkisini arttırması nedeniyle hastalığın dünyada giderek yayılması
beklenmektedir. Leishmaniasis aynı zamanda Türkiye’nin de ciddi halk sağlığı
problemlerinden biri olup Ege, Akdeniz, Orta Anadolu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde
görülmektedir. Hastalığın visseral formu tedavi edilmediğinde ölüme neden olmaktadır.
Hastalığın tanısında çeşitli yöntemler (mikroskobik, kültür, moleküler ve serolojik)
kullanılmaktadır. Bu yöntemler içerisinde parazite özel antijenleri hedefleyen monoklonal
antikorların temel alındığı serolojik teknikler, yüksek duyarlılıkları ve spesifiklikleri ile
leishmaniasis tanısının koyulabilmesi adına büyük bir avantaj sağlamaktadır. Ancak
leishmaniasis’in tanısında kullanılmak üzere geliştirilen serolojik tanı kitleri genellikle yurt
dışından ithal edilmekte ve bu da ülke ekonomisine fazladan bir külfet oluşturmaktadır.
Ülkemizde ise konu ile ilgili yeterince çalışma bulunmamaktadır. Şu ana kadar yapılan tek
çalışmada KL’e (Leishmania tropica) karşı monoklonal antikor geliştirme çalışması
yapılmıştır. Ancak literatürden de bilindiği gibi KL için serolojik yöntemlerin duyarlılığı
yüksek değildir. Diğer yandan ülkemizde, erken teşhisine daha çok ihtiyaç duyulan ve
zamanında tanısı konulup tedavi edilmediğinde ölümcül olduğu bilinen VL’e karşı
monoklonal antikor geliştirilmesine yönelik ülkemizde yapılan hiçbir çalışma
bulunmamaktadır. Ayrıca hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin tamamen in vitro hale
getirilmesinde sorunların yaşandığı da bilinmektedir. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı;
ilk kez olarak ülkemizde VL’nin tanısında kullanılan L. infantum antijenlerine karşı
xiv
monoklonal antikorun üretilmesi ve L. infantum antijenlerine karşı monoklonal antikorun
üretilmesi için hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin in vitro hale getirilmesi ile mevcut
yöntemin optimize edilmesi olmuştur. Tez çalışması kapsamında, Hücre Kültürü ve Doku
Mühendisliği Laboratuvarı’nda hücre kültürü, ELISA, western blot, hibridoma, saflaştırma
tekniklerine dayalı çeşitli yöntemler kullanıldı. Deneylerde L. infantum tüm parazit antijenleri
6-8 haftalık BALB/c farelere Freund adjuvanı ile birlikte enjekte edildi. Yüksek antikor yanıtı
veren fareler ile füzyon çalışmaları gerçekleştirildi. Füzyon deneylerinde immünize farelerden
izole edilen ve B lenfosit kaynağı olan dalak hücreleri, fare myeloma hücreleri (P3-X63Ag8.653) ile polietilen glikol (MW 4000) varlığında birleştirildi. Füzyon sonrası hibridoma
hücrelerinin gelişimini desteklemek amacıyla fare periton makrofajlarının yanı sıra, J774 fare
monosit makrofaj hücre hattı metaboliti de kullanıldı. Deney sonuçlarına göre, incelenen 456
kuyunun 233’unda hibridoma hücrelerinin oluştuğu tespit edildi. ELISA testi ile incelenen
233 kuyunun 46’sında pozitiflik görüldü. Çapraz reaksiyon testlerinde en yüksek absorbans
alınan 3 kuyunun kültürü büyük çapta üretildi. Sınırlayıcı sulandırımlar sonucu elde edilen
1C3 kuyusundaki hibridoma hücre hattının ürettiği monoklonal antikorlar western blot
yöntemi ile 15kDa ağırlığında olan L. infantum antijenine karşı spesifik olduğu saptandı.
Çalışmanın son aşamasında elde edilen süpernatant dializ ve protein G afinite kromatografi
yöntemleri ile saflaştırıldı ve böylece L. infantumun 15 kDa antijenine karşı spesifik olan
monoklonal antikor elde edildi.
Sonuç olarak bu çalışmada, ilk kez olarak ülkemizde L. infantum’a karşı monoklonal antikor
üreten hücre hattı elde edildi ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirilerek kriyobankı oluşturuldu.
Ayrıca leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin in vitro hale
getirilmesi için ilk kez olarak fare periton makrofajları yerine J774 metabolitlerinin
kullanılmasının uygun olabileceği gösterildi ve hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin
tamamen in vitro hale getirilmesi amacıyla mevcut yöntem optimize edildi. Bu tez
kapsamında elde edilen sonuçlar, ülkemizin ciddi halk sağlığı problemlerinden birisi olan
VL’nin tanısında monoklonal antikorlara dayalı yerli tanı kitlerinin geliştirilmesine yol
açacaktır. Ayrıca bu hastalığa karşı üretilen monoklonal antikorların ileride farklı enzimatik,
kemilüminesan ve manyetik ajanlarla konjuge edilmesi sonucunda çeşitli tanı sistemlerinde
(Western Blot (WB), Enzim bağlı immunosorbent test (ELISA), İndirekt floresan Antikor
testi (IFAT),İmmünokromatografik test (ICT) gibi) kullanılabileceğini göstermesi açısından
oldukça önemli olacağı düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Hibridoma teknolojisi, Leismaniasis, Leishmania 15kDa promastigot
antijeni, Monoklonal antikor, Tanı kitleri
YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
xv
ABSTRACT
MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION WITH HYBRIDOMA
TECHNIQUE AGAINST THE ANTIGEN OF LEISHMANIA
INFANTUM, CAUSATIVE AGENT OF VISCERAL LEİSHMANİASİS
Serkan YAMAN
Department of Bioengineering
MSc. Thesis
Advisor: Assist. Prof. Melahat BAĞIROVA
Leishmaniasis is a parasitic disease which is transmitted to mammalian hosts by the bites of
sand flies (phlebotomus) with infected intracellular Leishmania protozoon during
bloodsucking. Different Leishmania species cause to the various important forms of the
disease such as; visceral (VL), cutaneous (CL) and mucocutaneous (MCL) leishmaniasis
depending on the parasite types and the host factors. In every year 1-1,5 million people suffer
from Cutaneous Leishmaniasis (CL) and 500.000 people from visceral leishmaniasis (VL) all
around the world. Furthermore impact area of the disease is expected to extend over the world
as a result of developing resistance to antileishmanial drugs in parasites and to insecticides in
vectors, also by virtue of global warming. Therewithal leishmaniasis is one of the serious
public health problems that occurs prevalently in Aegean, Mediterranean, Middle Anatolian
and Southeast Anatolian regions of Turkey. Untreated VL form of the disease ends up with
deaths. A variety of techniques (microscopic, culture, molecular and serological) are used in
the diagnosis of the disease. Among these techniques, monoclonal antibody based serological
techniques provide a great advantage with high sensitivity and specificity for diagnosis that is
special to the parasite antigens. However, diagnostic kits used in the diagnosis of
leishmaniasis are generally imported products and make a great expense to the economy of
the country. The studies about the issue to overcome these kinds of problems are inadequate
in our country. Up to now, only one medical specialization thesis has been completed about
this issue and in that study monoclonal antibody has been produced against Leishmania
tropica which is a factor of Cutaneous Leishmaniasis. However as it is known in literature
serological techniques are not sensitive techniques for diagnosis of CL. On the other hand, in
our country there is no study about development of monoclonal antibody against VL which is
known as fatal if doesn’t diagnose in time and to be treated. Furthermore, it is known that
there are some problems in hybridoma techniques for providing in vitro whole processes.
xvi
According to this, the aim of this thesis study as a first time in our country is to produce
monoclonal antibody against L. infantum antigen which was used in the diagnosis of VL and
to optimize the present method by optimizing the hybridoma technology process into in vitro
stage. Within the scope of the thesis, in Cell Culture and Tissue Engineering Laboratory, cell
culture, ELISA, western blot, hybridoma and purification techniques were used. In the
experiments; L. infantum whole parasite antigens were injected to 6-8 week old BalB/c mice
with adjuvant. Then the fusion studies were started with the mice which gave response of high
antibody. In the fusion experiments the spleen cells which are the source of B lymphocyte
were fused with the mouse myeloma cells (P3-X63-Ag8.653) in the existence of polyethylene
glycol (MV 4000). After the fusion, in order to support hybridoma cells besides mouse
peritoneal macrophages, J774 mouse monocyte-macrophage cell line metabolite was also
used. According to the experimental results, it was detected that hybridoma cells were formed
in examined 233 of 456 wells. It was seen that the 46 of 233 wells were positive according to
ELISA test. The culture of three wells which showed the highest absorbance in cross-reaction
tests, was largely produced. The monoclonal antibodies, the products of 1C3 hybridoma cell
line which was obtained as a result of limiting dilutions. It was detected that the antibodies
which were examined with western blot method, are specific to the L. infantum antigen which
weights 15kda. At the end-stage of the study, supernatant which are obtained from culture
were purified with dialysis and protein G affinity chromatography methods, so the
monoclonal antibody which is specific to 15 kDa antigen of L. infantum was obtained.
As a result of this study for the first time in Turkey monoclonal antibody producing
hybridoma cell line have been obtained against L. infantum and cryopreserved in cryobank.
Additionally, in order to render whole in vitro processes of hybridoma technology,
hybridomas were firstly supported with J774 macrophages cell line metabolites and in vitro
current processes of hybridoma technique was optimized. Furthermore we showed that J774
metabolites provide the appropriate supporting environment. Obtained results within this
thesis can lead to development of diagnostic kits to VL that is one of the important public
health problems of Turkey. Furthermore the obtained monoclonal antibodies in this study is
important in terms of showing that they can be also used in various diagnosis systems (such
as; Western blot (WB), Enzyme Linked Immune Sorbent Assay (ELISA), Immune
Fluorescein Assay (IFAT)and Immuno chromatographic test ICT)) by conjugating with
enzymatic, chemiluminescence and magnetic agents.
Key words: Hybridoma technology, Leishmaniasis, Leishmania 15 kDa promastigot antigen,
Monoclonal antibody, Diagnostic kits
YILDIZ TECHNICAL UNIVERSITY
GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
xvii
BÖLÜM 1
GİRİŞ
1.1 Literatür Özeti
Leishmaniasis, zorunlu hücre içi Leishmania parazitleri ile enfekte kum sineklerinin
(Phlebotomus) kan emerken memelilere bulaştırdıkları protozoon bir hastalıktır.
Leishmaniasisin tedavisinde ve kontrolünde yaşanan zorluklar nedeniyle ortalama yıllık
50.000 ölüm vakası ile parazitik hastalıklar arasında malarya‘dan sonra ikinci önemli
hastalık olarak gelmekte; ayrıca dünyada 12 milyon kişinin leishmaniasis ile enfekte
olduğu ve her yıl 2 milyon yeni olgunun (1.5 milyon KL, 500.000 VL) eklendiği tahmin
edilmektedir [1], [2], [3], [4]. Küresel ısınmaya bağlı olarak da hastalığın endemik
alanının giderek genişlemesi beklenmektedir.
Leishmaniasis ülkemizin de içinde bulunduğu Akdeniz bölgesi ile birlikte dünyada 5
kıtada görülmekte; özellikle tropikal ve sub-tropikal bölgelerde endemik seyretmektedir
[5]. Akdeniz bölgesinde L. major, L. tropica ve L. infantum olmak üzere üç Leishmania
türüne rastlanılırken [6], ülkemizde en sık karşılaşılan türler L. infantum ve L. tropica’
dır [7]. VL’in görüldüğü Ege ve Akdeniz kıyılarında L. infantum, KL’in görüldüğü
Güney ve Güneydoğu kesimlerinde ise L. tropica hastalığın etkeni olarak karşımıza
çıkmaktadır. Son zamanlarda ise Akdeniz bölgesinin doğu kesimlerinde KL etkeni
olarak yine L. infantum görüldüğüne dair çalışmalar mevcuttur [8]. Ülkemizde endemik
alanlarda yaklaşık 20 milyon insan leishmaniasis enfeksiyonu riski altında
yaşamaktadır. Uzun yıllardan beri leishmaniasis’e karşı mücadele yapılmasına rağmen,
hastalığın halen giderek yayılmasının esas nedeni; hastalığı taşıyan vektörlerde
kullanılan insektisitlere, hastalığın etkenlerinde ise kullanılan ilaçlara karşı dirençliliğin
gelişmesidir. AIDS ve diğer immün yetmezliklerin artması, seyahatler, savaşlar ve
laboratuvar tanısındaki problemler de hastalığın yayılmasında önemli rol oynamaktadır
1
[9]. Bunun yanında VL’ nin neden olduğu immün yetersizliğe bağlı olarak, hastalarda
bakterilerin neden olduğu süper enfeksiyonlar da görülebilmektedir [10]. Ayrıca
şimdiye kadar leishmaniasise karşı çeşitli aşı geliştirme çalışmaları yapılmasına rağmen
henüz geçerli bir aşı bulunamamıştır [2].
Leishmaniasis’in tanı, tedavi ve kontrolü ise parazitik hastalıklar içerisinde zorlukları
ile dikkat çekmektedir. Bu sebeplerden dolayı leishmaniasisle mücadele edebilmek için,
tanı ve tedavi noktasında, hastalığı doğru ve ayırıcı olarak değerlendirmek esastır [11].
Ülkemizde 2005 yılından itibaren hekimlerin standart vaka tanımına göre tanı
koyabildikleri VL hastalarını Sağlık Bakanlığı Bulaşıcı Hastalıklar Birimine
bildirmeleri zorunludur [12].
Leishmaniasis’in tanısında çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerden en
yaygın ve uygulanması kolay olanı mikroskobik yöntemlerdir. Ancak mikroskobik
yöntemlerde, duyarlılığın, örnekteki parazit sayısına bağlı olması ve deneyimli
araştırmacıya gereksinim duyulması yöntemin birer dezavantajı olarak karşımıza
çıkmaktadır [13]. Leishmaniasis tanısında kullanılan diğer yöntemlerden biri de klasik
kültür yöntemidir. Klasik kültür yönteminin en büyük avantajı parazitin direk olarak
gözle görülebilmesidir. Fakat yapılan bazı çalışmalarda, duyarlılığının örnekteki parazit
sayısına bağlı olarak azaldığı ve tanı koyulabilmesi için uzun sürelere gereksinim
duyulduğu rapor edilmiştir [14], [15]. Bununla birlikte bu yöntem kullanılarak
asemptomatik enfeksiyonların tespit edilmesinin de oldukça zor olması önemli
dezavantajlardır [16], [17]. Kültür yöntemleri içerisinde son yıllarda dünyanın çeşitli
bölgelerinde uygulanan yeni mikro kültür yöntemi ise duyarlılığının örnekteki parazit
sayısına bağlı olmaksızın hem KL’de hem de VL de bir veya birkaç güne kadar sonuç
verebilen bir yöntem olarak göze çarpmaktadır [14], [18], [19], [20], [21]. Hastada
parazite ait genom parçalarını saptamaya yönelik moleküler yöntemlerin kullanılması
ise moleküler tanı yöntemleri başlığı altında ver almaktadır. VL tanısında kullanılan
moleküler yöntemlerden biri restriksiyon parça polimorfizmine dayalı polimeraz zincir
reaksiyonudur (PZR-RFLP) [22] Ancak PZR hastada bulunan ölü parazit DNA’sından
dolayı yanlış pozitif sonuç verebilmekte [23] ve bazı asemptomatik kültür pozitif
örneklerde PZR negatif sonuç verebilmektedir [24].
VL tanısında kullanılan enzim-bağlı immünosorbent testi, western blot, rk39
immünkromatografik tanı testi, immünfloresan antikor testi, direk aglütinasyon testi gibi
serolojik yöntemler ise bu hastalığa tanı koyulmasında günümüzde en çok geliştirilen ve
2
kullanılan yöntemler olmuştur. Bu yöntemlerin büyük avantajı hasta serumunda veya
idrarında parazite karşı oluşan antikor veya parazit antijenlerinin belirlenmesine
dayanan invaziv olmayan yöntemler olmalarıdır [25], [26]. Serolojik tanı yöntemleri VL
tanısında KL’e göre daha sık kullanılmaktadır. Bu durum KL olgularında lezyonun
lokal etkisinden dolayı antikor yanıtının tanı için yeterince belirleyici düzeylerde
olmamasından kaynaklanmakta [27] ve araştırıcıları alternatif değerlendirme sistemleri
geliştirmeye yöneltmektedir [28], [29], [30].
1.2 Tezin Amacı
Serolojik yöntemler temel olarak parazitin yüzey antijenlerini hedef alan primer veya
sekonder monoklonal antikor temelli olarak geliştirilmekte ve erken teşhis için büyük
bir avantaj sağlamaktadır. Fakat çeşitli hastalıkların tanısında kullanılan tanı kitleri ithal
olarak temin edildiğinden, ülke ekonomisine olumsuz etki oluşturmaktadır. Bu gibi
sorunları aşmak amacıyla konu ile ilgili ülkemizde yapılan çalışmalar da oldukça
yetersizdir. Ülkemizde konu ile alakalı sadece bir tıpta uzmanlık tezi tamamlanabilmiş
[31] ve bu çalışmada da KL etkeni olan L. tropica’ya karşı monoklonal antikor
üretilmiştir. Erken teşhisine daha çok ihtiyaç duyulan ve serolojik olarak daha yüksek
spesifiteye sahip VL’e karşı ise ülkemizde hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Dünyada
ise diğer tanı sistemlerine karşı monoklonal antikor üretilmesinde yaşanan zorluklarla
beraber leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere monoklonal antikor üretilmesi
çalışmalarında da çeşitli sorunlar mevcuttur. Böyle ki hali hazırda monoklonal antikor
üretiminde
kullanımına
ihtiyaç
duyulan
deney
hayvanlarının
oluşturduğu
kontaminasyon riskleri, etik ve ekonomik dezavantajlar nedeni ile monoklonal antikor
üretim sürecinin yüksek derecede in vitro hale getirilmesi gibi gereklilikler de
bulunmaktadır. Bu gibi ihtiyaçlar doğrultusunda VL’nin tanısında kullanılan L.
infantum antijenine karşı monoklonal antikorun üretilmesi ve mevcut yöntemin
optimize edilmesi, VL enfeksiyon ajanlarının belirlenmesi, tiplendirilmesi ve tedavisi
gibi birçok alanı kapsayan geniş bir yelpazede yararlı olabilecektir. Buna göre de bu tez
çalışmasının amacı; ilk kez olarak ülkemizde VL’nin tanısında kullanılan L.
infantum antijenlerine
infantum antijenlerine
karşı
karşı
monoklonal
monoklonal
antikorun
antikorun
üretilmesi
üretilmesi
için
ve
L.
hibridoma
teknolojisinde kullanılan sürecin kısmen in vitro hale getirilmesi ile mevcut yöntemin
optimize edilmesi olmuştur.
3
1.3 Hipotez
Bu çalışmanın çıktıları üretilen monoklonal antikorların serolojik yöntemler arasında en
yaygın şekilde kullanılan enzim bağlı immüno sorbent test (ELISA) sistemlerinde
uygulanabilirliğinin ölçülmesi ve spesifikliğin belirlenmesi için gerekli alt yapıyı
oluşturacaktır. Buna göre bu çalışma dahilinde hedefe ulaşmak için;

Hibridoma
çalışmalarında
antijen
olarak
kullanılması
amacıyla
L.
infantum
parazitlerinin kültürlerinin elde edilmesi ve kültürlerden antijen izolasyonu,

6-8 haftalık Balb/c farelerin immünizasyonlarının periyodik olarak yapılması ve ELISA
yöntemleri ile immünite kontrolllerinin gerçekleştirilmesi,

Uygun füzyon hücreleri olan P3-X63-Ag8.653 myeloma hücrelerinin devamlı
kültürünün elde edilmesi,

İmmün hayvanlardan elde edilen dalak hücrelerinden lenfosit izolasyonu ve myeloma
hücreleri ile füzyonlarının gerçekleştirilmesi,

Farelerden alınan periton makrofaj hücrelerinin ve J774 fare monosit tümör makrofaj
kültür metabolitlerinin hibrid hücrelerinin gelişiminin desteklenmesi amacıyla
kullanılması,

Füzyon sonrası hücrelerin seçici besiyerlerinde kültürlerinin yapılarak poliklonal
hibridoma hücre serilerinin elde edilmesi ve kültür ortamında antikor varlığı tespiti,

Leishmania antijenlerine karşı pozitif reaksiyon veren kuyuların büyük ölçekte
çoğaltılarak dondurulması ve aynı zamanda kültürü yapılan hibridoma hücrelerinin
destekleyici besiyeri içerisinde sınırlayıcı sulandırımları yapılarak tek klon hibrid
hücrelerin çoğaltılması ve monoklonal antikor üreten hücre hatlarının elde edilmesi,

Monoklonal antikor üreten hücre hatlarının ELISA test sistemleri ile özgünlüğünün
kontrol edilmesi ve kültür ortamından saflaştırılması,

Üretilen monoklonal antikorların ileride farklı enzimatik, kemilüminesan ve manyetik
ajanlarla konjuge edilmesi ile çeşitli tanı sistemlerinde (Western blot, Enzim bağlı
immünosorbent test, immünokromatografik test, İndirekt floresan antikor testi gibi)
kullanılabileceğinin önerilmesi stratejileri belirlenmiştir.
4
BÖLÜM 2
GENEL BİLGİLER
2.1 Leishmaniasis
Zorunlu hücre içi Leishmania parazitleri, trypanosomatidae ailesinin kinetoplastida
sınıfına ait kan kamçılılarındandır. Leishmaniasis, enfekte dişi kum sinekleri tarafından
kan emerken memeli konağa bulaştırılır [32], [33]. Leishmaniasisin konakta
gelişebilmesi ve parazitin bulaşması; enfekte ettiği dokulara ulaşabilmesi, enfektivitesi
ve konağın bağışıklık sistemi arasındaki kompleks etkileşimlere bağlıdır. Leishmaniasis
konakta, klinik belirti vermeyen asemptomatik formdan iç organlarda gelişen ve tedavi
edilmediğinde ölümcül olan VL gibi ağır formlara kadar farklı şekillerde seyredebilir
[34]. Leishmania türleri hayat döngülerini omurgalı ve omurgasız olmak üzere iki
konakta tamamlarlar. Omurgalı konak insan veya diğer memeliler, omurgasız konak ise
kum sinekleridir (Phlebotomus). Leishmania parazitleri omurgalılarda amastigot
formda, omurgasızlarda ise promastigot formda bulunur. Amastigot form büyük bir
nükleusa ve küçük bir kinetoplasta sahip olup hareketsiz ve oval şekillidir. Promastigot
form ise mekik biçiminde ve parazitin hareketini sağlayan kamçıya sahiptir.
Leishmania’nın bilinen türlerinden 12’si insanları enfekte edebilmektedir [35].
Ülkemizde ise L. donovani, L. infantum, L. tropica, L. major türlerinin neden olduğu
enfeksiyonlar görülmektedir. Bu türlerden L. donovani ve L. infantum, insanlarda
retiküloendotelyal sistem hücrelerine yerleşerek VL ‘e, L. tropica ve L. major türleri
ise deride KL ‘e sebep olurlar [36], [37].
2.2 Leishmania Parazitlerinin Hayat Döngüsü
Enfekte bireylerden dişi kum sineklerinin kan emmeleri sırasında kanda bulunan
makrofajlar içerisindeki Leishmania parazitlerinin amastigot formları dişi kum
sineklerinin midesine geçer [38], [39]. Amastigotların bir kısmı, makrofajlar ile beraber
5
sindirilirken, bazı amastigotlar iğsi bir yapı alır ve burada kamçıları da gelişerek
enfektif olmayan promastigotlara dönüşürler [34], [40], [41] (Şekil 2.1).
Şekil 2.1 Leishmania türlerinin hayat döngüsü [42]
2.2.1 Promastigot Form
Parazitin enfekte Phlebotomus’un bağırsaklarında görülen iğ şeklinde, 15- 20 μm
uzunluğa ve 1,5- 2,5 μm genişliğe sahip formdur. Promastigotlar hareketli formlar olup
bu hareketlerini 15- 28 μm uzunluğunda bir ucundan uzanan kamçıları ile sağlarlar.
Promastigotların elektron mikroskobu ile incelendiğinde; ortada nukleus, nukleus
içerisinde nukleolus, kinetoplast, fibriler yapı gösteren kamçı, sitoplazmalarında
endoplazmik retikulum, golgi aygıtı gibi yapıların varlığı görülmektedir [41], [43], [44]
Kum sineklerinin midesine alınan parazitler ilk olarak burada bölünerek çoğalmaya
başlarlar. Enfektif olmayan bu forma “prosiklik” promastigot denilmektedir [45].
Promastigotlar midenin ucuna geldikleri zaman kamçıları ile bağırsak epitel
hücrelerinin mikrovilluslarına tutunurlar. Daha sonra promastigotlar [45] buradan göç
ederek özofagus ve farinks duvarına tutunurlar. Özofagustan ayrılan promastigotlar 4.-7.
günler arasında uzun ve küçük formlar halinde ağıza ulaşmakta ve burada bölünmeden
hortuma göç etmektedirler. Enfektif form olan bu promastigotlara ise “metasiklik”
promastigot adı verilmektedir [34], [40], [41]. Metasiklik promastigotlar vektörün ağız
kısmına geçerek bir sonraki kan emiliminde memeli konağa girerler [38], [39].
6
Şekil 2.2 Leishmania parazitlerinin promastigot ve amastigot formları [46], [47]
Kum sineklerinin memelilerden kan emmeleri sırasında salgıladıkları tükrük salgısı ile
birlikte metasiklik promastigotlar konağa verilir. Konağa geçen bu promastigotların bir
kısmı konağın immün sistemi tarafından öldürülür. Canlı kalan promastigotlar
makrofajlar veya dendritik hücreler tarafından fagosite edilir [44]. Fagosite edilmeleri
işleminde hücre yüzeylerinde bol miktarda bulunan lipofosfoglikanlar (LPG) ve
makrofajlardaki C3 reseptörlerinin rol oynadığı bilinmektedir. Fagositoz işleminde
özellikle promastigot yüzey antijenleri olan gp63 ve LPG ’nin önemli rol oynadığı
bildirilmiştir [48], [49]. Bu şekilde hücrelerin fagozomlarına alınan promastigotlar
burada amastigot formuna dönüşürler. Ayrıca retiküloendoteliyal sistem hücrelerini de
enfekte edebilen promastigotlar girdikleri hücrelerde çoğalıp hücreleri patlatarak
serbest kalırlar [34], [40], [44], [50], [51].
2.2.2 Amastigot Form
Amastigotlar, lökositler, monositler, makrofajlar veya endotel hücreleri içerisinde
bulunan
oval
şekilde
ve
genelde
2,5-5
μm
çapındadırlar.
Amastigotların
sitoplazmasında bir nükleus ve kinetoplast bulunmaktadır. Kinetoplast nükleusa ek
olarak farklı bir DNA içermektedir. Mitokondri ise bütün Leishmania türlerinde olduğu
gibi sitoplazmada yalnızca bir tane bulunur. Amastigotlar da promastigotlara benzer
şekilde bir kamçıya sahip olmakla beraber kamçı, kamçı cebi içinde bulunup hücre
dışına çıkmamaktadır. Amastigotlar makrofajların asidik fagolizozomlarına dayanıklı
olduklarından makrofaj içinde çoğalabilirler [34], [41], [52], [53]. Serbest hale geçen
bu amastigotlar yeni makrofajları ve retiküloendoteliyal sistem hücrelerini enfekte
ederek çoğalmaya devam ederler [44], [50]. Bu döngü dişi tatarcığın beslenmek için
enfekte konağın kanını emmesiyle devam etmekte ve tam bir döngü çevre ısısına bağlı
olarak ortalama 4-25 gün sürmektedir [54], [55].
7
2.3 Leishmaniasis Hastalığının Formları
Leishmaniasisin klinik formları; iç organlarda görülen VL şeklinde, deride meydana
gelen KL şeklinde ve muköz dokularda ortaya çıkan MKL şeklinde olmak üzere 3 tip
olarak karşımıza çıkmaktadır [56], [57]. Ülkemizde ise hastalık KL ve VL olmak üzere
iki şekilde görülmektedir [32], [58].
Çizelge 2.1 Çeşitli klinik formlara neden olan Leishmania türleri [59]
Leishmaniasis Kliniği
Visseral Leishmaniasis
Kütanöz Leishmaniasis
Diffüz Kütanöz Leishmaniasis
Mukokütanöz Leishmaniasis
Hastalık etkeni
L.donovani
L. infantum
L.chagasi
L.tropica
L.mexicana
L.major
L.aethiopica
L.amazonensis
L.brasiliansisguyanensis
L. b. panamensis
L.peruviana
L. pifanoi
L. mexicana
L. Brasiliensis(espundia)
2.3.1 Kütanöz Leishmaniasis
KL; genelde L. tropica ve L. major türlerinin derinin retikuloendoteliyal hücrelerini
enfekte etmesi ile oluşan [60], [61], deride papül, nodül ve yara oluşumu ile seyreden
bir leishmaniasis formudur [62]. Papüller yaklaşık olarak 2 cm’lik çaplarda olup
lezyonlar kaşıntılıdır. İlk lezyon parazit memeli konağa girdikten ortalama 2 hafta ile 3
aylık bir süre sonra görülmeye başlar [63]. KL ‘in geniş bir endemi alanı bulunmakta ve
ülkemiz de dahil olmak üzere [64] dünyanın yaklaşık 83 ülkesinde endemik olarak
görülmektedir [60], [61]. Ülkemizde KL, Güney-doğu bölgesi [65], [66] ve İç anadolu
bölgesinde [32], [33], [58] konağın immunolojik durumu ve parazitin virulanslığı ile
alakalı olarak pek çok klinik varyant halinde [64], endemik ve epidemik olarak
görülmektedir [65], [66]. Ülkemizdeki başlıca KL etmeni L. tropica’dır. Ancak L.
infantum'un da KL'e neden olduğu son yıllarda yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [8],
[67].
8
2.3.2 Mukokütanöz Leishmaniasis
MKL genelde Güney Amerika ‘da endemik olarak görülen bir hastalık olup etkeni L.
braziliensis‘tir. Bu etken deri ve mukozalarda çoğalarak enfeksiyonlara neden
olmaktadır [68]. Hastalığın belirtilerinin görülmesi nazal septumda, yumuşak ve sert
damak kısımlarında çaplarının 10 cm’ye kadar ulaşabildiği nodül, papül ya da vezikül
benzeri lezyonlarının 10 gün ila birkaç ay arasında görülmesi ile gerçekleşir [69], [70].
KL ‘e göre hayati tehlikesi daha yüksek olan ve acil tedavi gerektiren bir formdur [68].
MKL ‘de hastalığın seyri, hastanın immünitesine ve parazitin immünolojisine bağlı
olarak değişmekte ve hastaların %1-10 ‘unda enfeksiyon mukozaya kadar ilerlemektedir
[71], [72], [73]. Mukozaya ulaşan lezyonlar doku harabiyeti oluşturarak kendiliğinden
iyileşmeyen yüz ve solunumla ilgili bozukluklar ile beraber burun ve çevresinde ciddi
patolojik değişikliklere neden olur [63], [69].
2.3.3 Visseral Leishmaniasis
VL, kala-azar olarak da bilinen kronik bir hastalık olup küresel yaygınlıkta ağır
enfeksiyon tablolarına ve ölümlere neden olan bir formdur [74]. VL etkeni eski dünyada
(Afrika, Asya, Avrupa) L. donovani, L. infantum, yeni dünyada (Güney Amerika) ise L.
chagasi’dir [68], [75]. VL’in etkeni olan bu parazitler zorunlu hücre içi parazitler olarak
makrofaj hücrelerini enfekte ederek buralarda çoğalırlar. Promastigotlar mononükleer
fagositlere tutunurlar ve ardından makrofajlar içerisinde sindirilmesi amacıyla fagositoz
ile fagozom içerisine alınırlar. Makrofaj içerisine alınan promastigotlar, önemli
biyokimyasal ve metabolik değişimler geçirerek zorunlu hücre içi form olan
amastigotlara farklılaşır. Amastigotlar makrofaj içerisinde çoğalarak yeni hücreleri
enfekte etmek üzere makrofajları patlatarak ortama yayılırlar [74], [76]. VL etkenleri (L.
donovani, L. infantum/chagasi) retiküloendoteliyal sistem, karaciğer, dalak, kemik iliği,
lenf bezleri hücrelerini de enfekte edebilmektedirler [44], [50]. Ayrıca konağın
immünite durumuna bağlı olarak (çeşitli sebeplerle azalması veya baskılanması)
tonsiller, larinks, özofagus ve barsak gibi organlar da etkilenebilmektedir [77], [78].
Belirtilerin ortaya çıkma süresi ortalama 2-4 aydır. Bu belirtiler vektörün kan emdiği
bölgede 2-3 mm boyunda bir lezyon ile birlikte günde iki defa yükselen ateş (ortalama
39-40°C bazen 40-40.5 °C), hepatosplenomegali, anemi ve lökopeni kilo kaybı gibi
klinik semptomlardır [79]. Bu klinik belirtilerin görüldüğü bireyler tedavi edilmezse
ciddi enfeksiyonlara ve ölümler meydana gelebilir [80]. Ülkemizde daha çok Akdeniz
9
ve Ege Bölgelerinde görülen VL diğer bölgelerimizde de sporadik olarak
görülebilmektedir [81], [82].
2.4 Visseral Leishmaniasis etkeni L. infantum’un Özellikleri
L. infantum, Euglenozoa şubesine mensup Kinetoplastida sınıfından Trypanosomatidae
ailesine ait ökaryotik bir Leishmania türüdür [83]. Parazitin, diğer leishmania türleri
gibi insan ve diğer memelilerde amastigot formunda, kum sineklerinde ise promastigot
formunda geçirdiği evreler olmak üzere üzere iki yaşam formu bulunmaktadır [53].
Parazitin her formunda bulunan Kinetoplastlar, çubuk şeklinde mitokondriyal bir
yapıdır. İçerilerinde sayıları on bini bulan çok küçük halkasal DNA’lar ve 50 civarında
da büyük halkasal DNA’lar bulunmaktadır. Bu DNA’lar genel olarak kinetoplastik
DNA olarak adlandırılmakta ve kDNA şeklinde kısaltılmaktadır. Kinetoplasttaki büyük
halkaların mitokondrial ribozomal RNA’yı kodladığı, küçük halkaların ise mRNA’nın
düzenlenmesinde rol oynayan genleri kodladığı bilinmektedir [84].
Çizelge 2.2 L. infantum genom özellikleri [85], [86]
Toplam genom boyutu (Mb)
32.1
Kromozom sayısı
36
Kromozom boyut dağılımı
0.3-2.8
Toplam gen sayısı
8.154
Pseudogen sayısı
41
Ortalama gen boyutu (bp)
1.868
Gen yoğunluğu (Mb başına)
235
Genom kodlama yüzdesi
44.0
Kodlanan genlerde (G+C) yüzdesi
62.4
Toplam tRNA sayısı
62
2.5 Visseral Leishmaniasisin Epidemiyolojisi
VL dünyada 88 ülkede görülen ve bu ülkelerde yaşayan milyonlarca kişiyi tehdit eden
bir hastalık olup hali hazırda yaklaşık 12 milyon kişinin bu parazit ile enfekte olduğu ve
her yıl bu sayıya 500,000 kişinin eklendiği tahmin edilmektedir [87]. Bildirilen bu
olgulardan yaklaşık her yıl 50,000 kişi VL nedeniyle hayatını kaybetmektedir.
Antarktika kıtası dışında dünyanın bütün bölgelerinde endemik veya sporadik olarak
10
görülebilen VL etkenleri (L. donovani, L. infantum) genelde tropikal ve subtropikal
bölgelerde görülmektedir. Dünyadaki VL olgularının %90’ı Hindistan’ın belirli
bölgeleri Bangladeş, Nepal, Sudan, Etiyopya ve Brezilya’da görülmektedir [4], [88].
Şekil 2.3 Eski ve yeni kıtada VL’in coğrafik dağılımı [1]
Avrupa ve Akdeniz Bölgesinde de endemik olarak görülen VL, Türkiye’den Portekiz’e
kadar olan Akdeniz kıyılarında görülmektedir. VL etkenlerinin bölgelere özel alt türleri
de bulunmaktadır. Bunlar arasında; Çin, Hindistan, Sudan, Akdeniz ve Güney Amerika
alt türleri bilinmektedir [3], [35]. Leishmania türlerinin sınıflandırılması oluşturdukları
klinik belirtiler, coğrafik dağılımları ve etkenin çeşitli özelliklerine göre yapılmıştır.
Son yıllarda ise izoenzim analiz teknikleri ve monoklonal antikorlar kullanılarak daha
net tür ayrımlarına gidilmektedir [33], [89]. VL genelde ülkemizin kıyı bölgelerinde
görülür. Fakat İç Anadolu, Doğu Anadolu, Marmara ve Batı Karadeniz bölgelerinden de
vaka bildirimlerinin olması bu hastalığın ülkemizin her bölgesinde görülme riskinin
bulunduğunu göstermektedir [53], [90], [91], [92], [93], [94], [95] (Şekil 2.4).
11
Şekil 2.4 Türkiye'de leishmaniasis dağılımı [96]
2.6 Hastalığın Tedavisi ve Kliniği
VL’e karşı günümüzde geliştirilmiş herhangi bir aşı ve kesin tedavi bulunmamakla
beraber [2] hastaların tedavisinde günümüze kadar çeşitli antibiyotikler ve 3 değerlikli
antimon (Sb) bileşikleri denenmiştir. Antibiyotiklerden istenilen sonuçlar alınamamış ve
3 değerlikli antimon bileşikleri ise yüksek toksisitesi nedeni ile tedavi amaçlı
kullanılamamıştır. Günümüzde ise 5 değerlikli antimon bileşikleri daha az toksik
olmaları ve tedaviye diğer ajanlardan daha net sonuçlar vermeleri nedeniyle tedavide
kullanılmaktadır [97], [98], [99].
Klinik olarak VL’de kırgınlık, ateş, kilo kaybı ve dalak büyüklüğü gibi belirtiler ortaya
çıkar. Hastalık ilerledikçe hastalarda anemi, nötropeni ve poliklonal B hücresi
çoğalmasına bağlı olarak hipergamaglobulinemi oluşur [59], [100]. VL tanısı, tanıda
elde edilen klinik ve laboratuar bulgularının, tifo, malarya ve tüberküloz gibi diğer
hastalıkların bulgularına benzer sonuçlar göstermesi dolayısıyla hastalığın tanısının
koyulmasını zorlaştırmaktadır. Bundan dolayı tanıda laboratuvar metodlarının önemi
fazladır [23].
2.7 Leishmaniasisin İmmünitesi
2.7.1 İmmün Sistem
İmmün
sistem,
yabancı
mikroorganizma
istilalarına,
özellikle
patojen
mikroorganizmaların yol açtığı enfeksiyon hastalıklarına karşı koyma görevini üstlenen,
vücudun organ, doku ve hücrelerinde kurulu bir sistemi ve bu sistemin ortaya koyduğu
direnci ifade eder. Bu sistemin enfeksiyonlara karşı verdikleri tepkiye immün yanıt adı
12
verilir [101]. Vücuda giren patojen mikroorganizma ve moleküllerin tanınmasında ve
temizlenmesinde görev alan immün sistem hücreleri lenfosit adı verilen hematopoietik
kökenli hücrelerdir. Bu hücreler genelde lenfoid dokularda, dolaşımda ve lenf sıvısında
bulunurlar [102]. Vücudun herhangi bir patojen ile karşılaşması sonucu, immün sistem
bu yabancı patojenlerin elimine edilmesi için lenfosit hücrelerinin aktifleşmesi
vasıtasıyla harekete geçer. İmmün sistem vücudu bu tür çeşitli tehlikelerden korumak
için 2 temel mekanizmaya sahiptir. Bunlar doğal ve edinsel immünitedir [103].
2.7.1.1 Doğal İmmünite
Doğal immünite, immün sistemin patojen mikroorganizma ve moleküllerin vücuda
girişini engelleyen, doku ve hücrelere girmeyi başaran patojenleri ise ilk aşamada yok
eden mekanizmasıdır. Doğal immünitenin ilk savunma hattını, epitel ve epitelde
bulunan özel hücreler (makrofaj vb.) ile belirli enzimler (lizozim gibi) oluşturur.
Patojenler epitelde bulunan bu bariyerleri bir şekilde geçerek dokulara ya da dolaşıma
girerlerse, buralarda bulunan fagositler, doğal öldürücü hücreler gibi özelleşmiş
lenfositler ve kompleman sistemin proteinlerini de içeren bir sistem tarafından saldırıya
uğrarlar. Doğal immünitenin bütün bu mekanizmaları, patojenleri özgün olarak tanır ve
ilk tepkiyi verir. Doğal bağışıklık yanıtları enfeksiyonlara karşı erken savunma sağladığı
gibi, enfeksiyona yol açan yabancı maddelere karşı gelişen adaptif immün yanıtların
oluşmasında da görev alırlar [104].
2.7.1.2 Adaptif İmmünite
Doğal
immünite
enfeksiyonlara
karşı
etkili
olarak
savaşsa
da,
patojenik
mikroorganizmalar doğal immün yanıta karşı direnecek şekilde gelişirler. Enfektif
ajanlara karşı savunma oluşturmak, adaptif immün yanıtın görevidir. Adaptif immün
sistem, lenfositler ve onların antikor gibi ürünlerinden oluşur. Vücuda giren patojen ve
yabancı antijenler doğal immünitenin elemesinden kaçabilirse adaptif immün yanıt
tetiklenir. Adaptif immün yanıtın değişik tipteki mikroorganizmalarla savaşmak üzere
özel mekanizmaları mevcuttur. Adaptif immünitenin bileşenleri lenfositler (B ve T
hücreleri), antijen sunan hücreler (makrofajlar, B hücreleri, dendritik hücreler) ve
plazma hücreleri (farklılaşmış B hücreleri) gibi hücrelerdir [105]. Adaptif immün
cevabın iki ana alt yanıt sınıfı vardır;
13
Antikor bağımlı hümoral yanıt ve hücre bağımlı immün yanıt. Bu iki alt sınıf adaptif
immün yanıtın iki ana hücre grubu tarafından yönetilir. Antikor bağımlı hümoral
yanıtta, B hücrelerinden üretilen antikorlar vasıtasıyla hücre dışı (hümoral sıvı vs.)
patojenler, hücre bağımlı immün yanıtta ise T lenfositler vasıtasıyla hücre içinde
yaşayan patojenler yok edilir. Adaptif immünitenin hümoral yanıt aşamasında antikorlar
dolaşıma ve diğer vücut sıvılarına salgılanırlar. Vücut sıvılarında bulunan antikorlar
özel olarak üretildikleri toksin, antijen, patojen ve virüs benzeri yapılara bağlanarak bu
patojenlerin etkisiz hale getirilmesini veya immün sistem hücreleri tarafından fagosite
edilmesini sağlarlar. Antikorların önemli özelliklerinden bir tanesi de patojen ve
virüslere bağlanarak konak hücrelere ve ilgili dokulara erişmelerini ve yerleşmelerini
engellemektir [106].
Antikorlar, B hücrelerinin aktivasyonu antijene özgül hücrelerin çoğalması ve antikor
salgılayan efektör hücrelere dönüşmesi ile üretilirler. Birincil yanıtta periferik lenfoid
organlardaki naif B hücreler, antikor salgılayan hücrelere ve bellek hücrelerine
farklılaşmak ve çoğalmak üzere aktive olurlar. İkincil yanıtta ise, bellek hücreleri hızlı
bir şekilde aktive olurlar. Bazı antikor salgılayan plazma hücreleri ise kemik iliğine göç
ederek burada uzun süre yaşayabilir. Daha sonra protein yapısındaki antijenlerle
tekrarlanan karşılaşmalar yüksek antijen afiniteli antikorların üretimine neden olur
(şekil 2.5) [104].
Şekil 2.5 Antijenlere karşı B lenfositlerinin gösterdiği birincil ve ikincil yanıtlar [104]
14
Bu şekilde hümoral immün sistem önceden karşılaştığı patojenlere karşı çok çabuk tepki
verir. Aynı patojen ile uzun süre sonra gerçekleşen sekonder karşılaşmalar immün
sistemi çok daha yüksek ve hızlı bir yanıt vermeye yönlendirir [107].
2.7.2 Antikorlar (İmmünoglobulinler)
Hümoral immünite glikoprotein ailesinden olan antikorlar (immünoglobulinler) ile
yakından ilişkilidir. Antikorlar özel olarak üretildikleri antijenlere hümoral immünitenin
hem tanıma hem de efektör safhasında bağlanabilmektedirler. Antikorlar ilk önce B
lenfositlerinin membran yüzeyine bağlı olarak üretilirler. Antijen ile etkileşime geçen
yüzey antikorları reseptör olarak iş görür ve B hücrelerini aktifleştirir. B lenfositleri
hümoral immün cevabın oluşturulması için antijen tanıma safhasına bu bağlı antikorlar
vasıtasıyla geçerler. Ayrıca antikorlar aktifleşmiş B hücreleri tarafından salgılanan
formda da (IgG, IgA, IgE gibi) üretilirler. İmmunoglobülinlerin iki temel işlevi vardır;
bunlardan birincisi spesifik antijenlerine bağlanmaktır, ikinci grup işlevi arasında
komplement sistemi aktive etmek, opsonizasyon ve sinyal iletimi yer almaktadır. Bu
işlevlerin herbiri immunoglobülinin değişik bölgeleri ile ilişkilidir. Glikoprotein yapıda
olan immunoglobülinlerin yapılarındaki biyolojik olarak iş gören kısımları ise
polipeptid birimleridir. Antikorlar immünojen özelliği bulunan metabolitleri, şekerleri,
lipitleri, hormonları ve daha kompleks olarak fosfolipitleri, nükleik asit ve proteinleri
içeren hemen hemen bütün biyolojik molekülleri tanıyabilme kabiliyetindedirler.
Makromoleküller genelde antikorların antijen bağlayan kısımlarından çok daha
büyüktürler. Bu yüzden bir antijen kendisine karşı üretildiği makromolekülün epitop
veya determinant olarak adlandırılan özel bir bölgesine bağlanır. Makromoleküller
genelde birden çok antikor bağlanan epitop bölgesi içerirler [104], [108].
2.7.2.1 Antikorların Yapısı
Antikorların çok geniş yelpazedeki antijenik yapıları spesifik olarak tanırlar ve immün
yanıtta yer aldıkları görevlerde iş görebilmek için kendi aralarında alt gruplara ayrılırlar.
Antikorların %82-96’sı polipeptid ve %4-18’i ise karbonhidrat yapıdadır [109]. Her
antikor dört alt zincirden oluşan tetramer yapıda olup bunlardan kısa olan iki zincire
hafif zincirler ya da L zincirleri, uzun olan diğer iki polipeptid zincirine ise ağır zincirler
ya da H zincirleri adı verilir. Kollarda bulunan hafif ve ağır zincirlerin arasında ve ana
15
gövdedeki iki ağır zincir arasında bulunan disülfit bağları polipeptid zincirlerini
birbirlerine bağlar (Şekil 2.6) [101], [107], [110].
Şekil 2.6 İmmünoglobulin G’nin 3 boyutlu kurdele modellemesi [111]
Kollardaki ağır (H) ve hafif (L) zincirlerin bir ucu -NH2 ile sonlandığından bu uca ‘amin
uç’, zincirlerin diğer ucu -COOH ile sonlandığından bu uçlara da ‘karboksi uç’ adı
verilir. Her polipeptid zincirinin amin uca yakın kısımları özgül antijene bağlanma
bölgesi olup buna bağlı olarak aminoasit sırasında, diğer bölgelere göre birçok
değişiklik görülür. Bu nedenle bu bölgelere değişken (V) bölge denir. Hafif zincir (L)
ile ağır zincirin (H) değişken bölgeleri (V) bir araya gelerek Y şeklindeki antikorun her
iki kolunda bulunan değişken bölgeleri (V) oluşturur. Yüzlerce değişik kombinasyonda
ve özellikte değişken bölge (V) üretilebilmesi antikorlara geniş bir antijen tanıma
özelliği kazandırmaktadır. Antikorun polipeptid zincirinin kalan ana kısmı genel olarak
değişmez durum gösterdiğinden bu bölge sabit bölge (C) adını alır. Antikor polipeptid
zincirlerindeki sabit bölgeler birkaç belirli sabit bölgeye (C)
göre değişen efektör
yanıtta iş görürler. Antikorun yapısındaki bu değişken (V) ve sabit bölgeler (C) de kendi
aralarında alt kıvrımlara sahiptirler. Bu kıvrımlar polipeptid zincirinde birbirine disülfit
bağlarıyla bağlıdırlar. Ağır (H) zincire bağlı olan değişken bölgelere VH, L zincirlerine
bağlı olanlara da VL kıvrımları adı verilir. Değişken (V) bölgesinin hemen altındaki
sabit bölgedeki (C) ağır zincir (H) üzerindeki kıvrıma CH1, aynı bölgede hafif zincir (L)
üzerindeki kıvrıma CL kıvrımları adı verilir. Şekildeki hafif zincirde (L) bulunan sabit
bölgesi (CL), ağır zincirin (H) değişken bölgesine (VH), bitişik olan CH1 bölgesi ile
16
disülfit bağları ile bağlanarak antikorun kendine özgü Y şeklini almasını sağlamaktadır
[108], [110].

Antikor İzotipleri ve Fonksiyonları
Memelilerde IgA, IgD, IgE, IgG ve IgM olmak üzere 5 sınıf antikor bulunmaktadır
[107]. İmmunoglobülinlerdeki Ağır (H) zincirlerinin yapısı o immunoglobülinin tipini
belirler. Ağır (H) zincirlerinin değişmez (C) bölgeleri arasındaki kimyasal farklılıklara
göre 5 ayrı immünoglobulin tipi belirlenmiştir. Bunlar γ (gama), α (alfa), µ (mü), δ
(delta) ve ε (epsilon) olarak adlandırılmaktadır. IgG’de γ, IgA’da α, IgM’de µ, IgD’de δ
ve IgE’de ε ağır zinciri bulunur. IgG, IgA ve IgD tipi antikorlarda Y şeklindeki
molekülün ana gövde kısmında CH2 ve CH3 olmak üzere iki adet, IgM ve IgE tipi
antikorlarda ise CH2, CH3 ve CH4 olmak üzere üç adet C kıvrımı bulunur.
IgG; molekülününün üç kolunun birleşim noktasından papain enzimi ile yapılan
kesimler Y şeklindeki molekülün kollarını oluşturan antijenin bağlandığı iki değişken
bölge ve biyolojik aktivite gösteren efektör kıvrımlarını taşıyan ana gövde olarak üç
parçaya ayrıldığı görülmüştür. Antijenin bağlandığı iki parçaya Fab parçaları, ana gövde
kısmına ise Fc parçası (kristalize olabilen fragment) adı verilmiştir. IgG serum
antikorlarının yaklaşık %75’ini oluşturmaktadır. Ayrıca IgG sekonder immün yanıtta en
baskın olarak görülen ve fetusa geçerek fetusun pasif olarak bağışıklanmasını sağlayan
tek immünoglobülin tipidir. IgG sahip olduğu gama sabit zincirinin izotiplerine göre;
IgG1, IgG2, IgG3 ve IgG4 olmak üzere 4 alt sınıfa ayrılmaktadır. IgG ayrıca
lökositlerde bulunan Fc reseptörleri vasıtasıyla opsonizasyon, kompleman bağlanması
ve fagositlerin aktifleştirilmesi gibi işlevlerde de iş görmektedir [107], [109], [112].
IgA; mukozal immün sistemin antikor tipidir ve genellikle virüslere karşı etki
mekanizmasında iş görürler. IgA antikorları dimer yapısında olduğundan dolayı
yapısındaki H ve L zincirleri daha çok sayıdadır.
IgM; çoğu antijene karşı oluşturulan erken immün cevabın baskın antikor tipidir. Aynı
zamanda B lenfositlerinin yüzeyinde pentamerik yapıda reseptör olarak bulunmaktadır.
IgM, μ tipi H zincirler barındırır. Aktifleşen B hücresince salgılanan ilk antikor tipidir.
B hücreleri daha sonra sınıf değişimi yaparak diğer tip antikorları salgılamaya başlarlar.
IgD; iki adet δ (delta) yapısında H zinciri ile her birinde ya λ (lamda) ya da κ (kappa)
yapısında ikişer adet L zincirleri bulundurur.
17
IgD serumda çok az miktarda bulunan monomer yapıda bir antikordur. IgM ile birlikte
B lenfositlerinin yüzeyinde de bulunmaktadır. IgD nin fonksiyonu tam olarak
bilinmemekle birlikte B lenfositlerinin gelişimleri ve farklılaşmaları sırasında görev
aldığı ileri sürülmektedir.
IgE; monomer yapısında ve iki adet ε (epsilon) H zinciri bulunur. Genel olarak
alerjilerden sorumlu antikor tipidir. IgE mast hücrelerinin reseptörlerine bağlanarak
antijeni ile bağlantı kurduğu hücrenin üzerine mast hücreleri tarafından degranülasyon
yapılmasını sağlar. IgE tipi antikorlar genelde hücre dışı parazitik enfeksiyonlara karşı
etkilidir. IgE moleküllerinin Fc bölgeleri dokulardaki mast hücrelerinin ve kandaki
bazofillerin Fc reseptörüne yüksek afinite ile bağlanır. Antijenin bağlanması bu
hücrelerin çok çeşitli sitokinler salgılamalarını ve biyolojik olarak aktifleşmelerini
sağlar [113], [114].
2.7.3 İmmün Sistemin Leishmaniasisdeki Rolü ve Leishmaniasise Karşı İmmün
Cevap
Kum sineklerinin ısırığı ile ısırık bölgesinde kan dolu mikrovasküler bir bölge oluşur.
Bu durum küçük çapta inflamatuvar cevap oluşturarak nötrofillerin bölgeye göçüne
neden olur [115], [116], [117]. İlk olarak bölgeye göç eden nötrofilleri hızlı bir şekilde
enfekte eden promastigotlar enfeksiyonu başlatırlar [118]. Ortama göç eden nötrofiller
parazitleri fagosite etmeleri sonucu çeşitli sitokinler sentezleyerek olay bölgesine
makrofajların göçünü uyarır. Ortama gelen makrofajlar enfekte nötrofilleri fagosite
etmekte ancak; bu aşamada transforme büyüme faktörü-β (TGF-β) gibi sitokinlerin
salgılanmasını indükleyen parazitler [119], [120] immün yanıt oluşumunu engelleyerek
makrofajlar içerisine elimine edilmeden girmeyi başarırlar. Ortama gelerek fagositoz
gerçekleştiren bu makrofajlar ortama diğer immün sistem hücrelerinin (Doğal öldürücü
hücreler (NK), dendritik hücreler ve yeni makrofajlar) gelmesini sağlarlar [121]. Yüzey
membran metaloproteazı olan gp63 sayesinde, kompleman sistemin hücre lizisinden de
kaçarak
makrofaj
makrofajlarda
içerisine
fagolizozom
girmeyi
başaran
benzeri
özellikler
promastigotlar
gösteren
enfekte
vakuoller
ettikleri
içerisinde
amastigotlara dönüşerek burada hayatta kalmayı başarır ve çoğalırlar [122], [123],
[124], [125]. Makrofajlar içerisinde bu safhada hayatta kalabilen promastigotların
ağırlıklı olarak metasiklik promastigotlar olduğu rapor edilmiştir [126]. Makrofajların
ise parazitleri elimine etmek için kullandıkları birincil efektör molekül nitrik oksittir
18
(NO). Makrofajların yeterli miktarda NO sentezleyebilmesi için, ortamda bazı immün
faktörlerin bulunması gerekmektedir. Bu faktörler interferon-γ (IFN-γ) ve tümör nekroz
faktör-α (TNF-α) sitokinleridir. IFN-γ tarafından uyarılan makrofajlar, NO sentezi
gerçekleştirmek üzere uyarılmakta ardından TNF-α devreye girerek parazitin
öldürülmesi işlemi başlamaktadır [127]. Ancak parazitlerin de makrofajların
aktivasyonundan kaçmak üzere geliştirdikleri birçok strateji mevcuttur. Bunlar; diğer
immün sistem hücrelerine makrofaj aktivasyonunu engelleyici çeşitli reseptörler
sentezletmeleri [119], [120], makrofajın aktivasyonunda görev alan IL-12 ve nükleer
faktör B (NFB) gibi sitokinlerin sentezini engellemeleri ile TGF-β ve IL-10 gibi
makrofaj inhibe edici moleküllerin üretilmesini indüklemeleri gibi mekanizmalardır
[128], [129]. Makrofaj aktivasyonu, leishmaniasis enfeksiyonlarında CD4+ T hücre
cevabı ile de direkt olarak ilişkilidir. CD4+ hücreleri Th1 immün alt sınıf yanıtını
oluşturan hücreler olarak, enfeksiyona karşı savaşmada temel rolü oynamaktadır [127].
Parazitlere karşı makrofaj aktivasyonu IFN-γ üretimi ve Th1 cavabının gelişimi ile
yakından ilişkilidir [130], [131]. Parazitler IL-4, IL13, IL-10 ve TGF-β gibi sitokinlerin
üretilmesini indükleyerek Th1 cevabını Th2 yönünde yönlendirmekte ve makrofaj
fonksiyonlarını inhibe edebilmektedir [68]. Th1 CD4+ hücre cevabı ile IFN-γ, IL-12 ve
TNF-α gibi sitokinlerin varlığında hastalığın kontrol altına alınabildiği gerçeği [132]
ileride leishmaniasis immünterapi çalışmalarında olumlu sonuçlar elde edilebileceği
umudunu güçlendirmektedir.
B hücreleri ve antikorların leishmaniasisde koruyucu immünitenin sağlanmasındaki
önemleri ise halen tartışmalı bir konudur. VL hastalarında Leishmania spesifik
immünoglobulinlerin serumda yüksek seviyelerde bulunması hastalığın patolojisinin B
hücreleri ve antikorlar ile alakalı olduğunu akla getirmektedir. VL’e karşı oluşturulan
Th1 ve Th2 hücre cevaplarının ikisinde de çeşitli immünoglobulin izotiplerinin
üretildiği rapor edilmiştir, fakat bu antikorların koruyucu immünite ve patolojideki
rolleri halen tam olarak bilinmemektedir [133]. Yine de antikor varlığının, leishmaniasis
enfeksiyonlarından korunmada görev aldığı da literatürde rapor edilmiştir [134].
2.8 Leishmaniasis’in Laboratuvar Tanısında Kullanılan Yöntemler
VL’in laboratuvar tanısı; dokudaki parazitlerin mikroskobik yöntemlerle çeşitli ajanlarla
boyanarak gösterilmesine dayalı (1), mikroskobik in vitro kültür yöntemleri ile
konaktan alınan örneklerin kültür ortamında çoğaltılarak gösterilmesine (2), parazit
19
DNA’sının konakta belirlenmesine (3) ve konakta parazitin antijenlerinin veya parzite
karşı oluşan antikorların gösterilmesine (4) dayanan serolojik yöntemler olarak başlıca 4
grupta incelenebilir.
2.8.1 Mikroskobik Tanı Yöntemleri
Tanıda en sık kullanılan yöntemlerdendir. Dalak, kemik iliği, karaciğer, deri lezyonu,
lenf düğümü gibi dokulardan aspirasyon-yoluyla elde edilen örneklerin giemsa boyası
ile boyanarak mikroskopta Leishmania parazitlerinin amastigot formunun görülmesi ile
tanı konmaktadır [23]. Ancak hasta için ağrılı, riskli ve invaziv bir yöntemdir. Bu
yöntemin bir dezavantajı da hastane koşullarında ve aseptik olarak deneyimli hekimler
tarafından gerçekleştirilmesi gerekliliğidir [135].
2.8.2 Kültür Yöntemleri
Kültür yöntemi, hastadan alınan parazitlerin kültür ortamında üretilerek mikroskobik
olarak hareketli parazitlerin görülmesine dayanan bir tanı yöntemidir. Bu yöntem ayrıca
tür belirleme çalışmaları, serolojik tanı yöntemleri ve in vivo çalışmalarda kullanılmak
için yeterli sayıda antijen elde etmek, makrofajlarla amastigotlar arasındaki ilişkiyi
incelemek, in vitro ilaç çalışmaları yapabilmek için kullanılmaktadır [23]. Akut VL
hastalarında kültürün duyarlılığı %90 olarak bildirilmiştir. Bu gibi yüksek duyarlılığına
rağmen klasik kültür yönteminin tanı koyulabilmesi için uzun süreler gerektirdiği (1535 gün) rapor edilmiştir [14], [18].
Allahverdiyev vd. [18] son zamanlarda geliştirdikleri yeni mikro kültür yöntemi ile
(MKY) kapiler tüpte çok az miktarda (25-50 µl) sıvı besiyeri kullanarak, örnekte parazit
sayısının az olduğu durumlarda bile sıvı kültürde çoğaltılmasının mümkün olduğu
göstermişlerdir. Ayrıca mikroaerofilik bir ortam sağlanarak, kısa sürede amastigotların
promastigotlara dönüştüğü ve bu promastigotların hızlı bir şekilde çoğaldığı da
bilinmektedir [136]. Bu yöntemle promastigotların deri, kemik iliği, dalak aspirasyon
materyallerinden ayrıca periferal kandan da üretilebilmesi mümkündür. MKY’nin diğer
avantajlarından biri ise; mikro kültürde üretilen parazitlerin PZR ile tiplendirilmesinde
ve tanısında bu yöntemin duyarlılığının yükseltilmesini mümkün kılması ve
asemptomatik VL modellerinde de sonuç verebilmesidir [8], [137].
Mikrokültür yönteminin bu gibi avantajları, bu yöntemi antileishmanial ilaç
araştırmaları ve dirençlilik testleri için avantajlı bir yöntem haline getirmektedir [138].
20
2.8.3 Moleküler Yöntemler
Çeşitli moleküler yöntemler ile enfeksiyon tanımı için Leishmania DNA'sını
belirlenmesi temel alınmıştır. Leishmania'ya özgü primerler ile PZR reaksiyonu
gerçekleştirilerek tür tayini ve teşhis koyulmaktadır. Leishmania türlerini tiplendirmek
için nested-PZR, multipleks PZR, kesilmiş parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) ve
DNA dizi analizleri gibi yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler çok hassas oldukları
halde, karmaşık olan prosesleri ve maliyetleri rutin uygulamalarda kullanılmalarını
dezavantajlı hale getirmektedir [23], [139].
2.8.4 Serolojik Yöntemler
VL tanısında dünyanın birçok bölgesinde olduğu gibi ülkemizde de yüksek duyarlılık ve
özgüllükte olan serolojik testler uygulanmaktadır [140]. Serolojik yöntemler hastadan
alınan örneklerde Leishmania parazitlerine karşı üretilmiş antikorların veya Leishmania
spesifik antikorlar vasıtasıyla antijenlerin tespit edilmesi temeline dayanmaktadır [23].
Leishmaniasis tanısında uzun zamandır uygulanan İndirekt Fluoresan Antikor Testi
(IFAT) testinin yanısıra, ELISA, rK39 antijeninin kullanıldıgı dipstick testi ve Direkt
Aglütinasyon Testi (DAT), indirekt Hemaglütinasyon Testi (IHA), lateks aglütinasyon
testi (LAT) ve Western Blot teknikleri de yaygın olarak kullanılmaktadır [141], [142],
[143], [144].
Tanı sistemlerinde ise monoklonal antikorlar antikor-antijen reaksiyonları temel
alınarak daha spesifik ve duyarlı tanı sistemlerinin geliştirilmesine olanak
sağlamaktadır. Örneğin bu antikorlar radyoaktif, floresan, enzimatik veya manyetik
ajanlar ile işaretlenerek ELISA ve Radyo immün test) gibi gelişmiş tanı sistemleri
ortaya koyulmaktadır.
2.9 Monoklonal Antikor Teknolojisi
Monoklonal antikorlar doku kültürü laboratuvarlarında kültüre edilen hibridoma hücre
hatlarından üretilirler. Her hibridoma klon hücresi aktifleştiği antijene özgü ve belirli bir
antikor tipini üreten tek bir B hücresinden üretilmiştir. Bu hücrelerin ürettiği antikorlara
monoklonal antikor denilmektedir. Hibridoma hücre hatları immünize donörlerin B
hücreleri ile ölümsüz myeloma hücrelerinin belli şartlar altında birleştirilmesiyle elde
edilerek monoklonal antikorların in vitro olarak üretilmesinde kullanılmaktadır.
Monoklonal antikor tekniği ilk olarak 1975 yılında Milstein vd. [145] tarafından
21
tanımlanmıştır. Her monoklonal antikor kendisine karşı üretilen antijenin üzerindeki bir
epitopa özgül olarak bağlanır. Monoklonal antikorlar yüksek derecede spesifiklik
göstermekte ve çok nadir olarak diğer proteinlerle çapraz reaksiyon göstermektedirler
[146]. Bu yüksek spesifikliği nedeniyle monoklonal antikorlar klinikte tedavi, antikor
temelli tanımlama ve teşhis sistemleri geliştirilerek uzun zamandır uygulanmaktadır.
Monoklonal antikorların kullanıldığı klinik uygulamalar arasında; kanser tanı ve
tedavisi, organ nakli reddi, otoimmünite ve doku hasarı tedavileri ile tanısal
görüntüleme gibi alanlar bulunmaktadır. Kanser tanısında monoklonal antikorlar hedef
spesifik antikorlar tümör üzerindeki kanser anijenlerinin determinantlarına özgü olarak
bağlanarak tümör yapısı hakkında bilgi verirken, tedavide ise antikor terapisi hastanın
immün sisteminin ve doğal efektör mekanizmalarının kulanılarak tedavi edilmesi
stratejisi üzerine kurulmuştur [112].
2.9.1 Monoklonal Antikorların Poliklonal Antikorlar ile Kıyaslanması
Poliklonal antikorlar farklı B hücre hatlarından kökenlenen ve her bir hücrenin hedef
proteinin farklı epitoplarına karşı antikor üreterek salgılamasıyla oluşurlar. Monoklonal
antikorlar tek antikor izotipine ait antikorlar içerirken poliklonal antikorların her biri
farklı antikor farklı izotiplere (IgG, IgM, IgA vb.) ait olabilir. Monoklonal antikorların
hedef protein spesifikliği olarak da poliklonal antikorlardan avantajları mevcuttur.
Monoklonal antikorlar hedef proteinin tek bir epitopuna spesifik olarak bağlanan
antikorları içermekte ve poliklonal antikor üretiminde kullanılan in vivo üretim yöntemi
yerine hibridoma tekniği ile in vitro olarak üretilmeleri monoklonal antikorları üretim
yönünden daha etik ve aynı spesifiklikteki antikorun sınırsız olarak elde edilmesi adına
daha avantajlı hale getirmektedir. Bu özellikleri monokonal antikorları proteomik
çalışmalarında ve tanı sistemlerinde poliklonal antikorlara göre daha yüksek
spesifiklikte kullanılmalarını sağlamıştır. Tüm bu avantajlara rağmen in vitro
monoklonal antikor üretimi poliklonal antikor üretimine göre halen zaman alıcı,
zahmetli ve pahalı bir yöntemdir [147]. Fakat günümüzde bu gibi sorunları aşmak
amacıyla iyi üretim koşullarında (GMP) ve büyük miktarlarda in vitro monoklonal
antikor üretilebilmesi için biyoproses aşamalarının optimize edilmesi ve üretilmeleri
gibi çalışmalar birçok biyoteknoloji şirketi tarafından büyük bir hızla devam etmektedir
[148].
22
2.9.2 Hibridoma Teknolojisi
Hibridoma teknolojisi Kohler ve Milllstein [145] tarafından 1975 yılında koyun kırmızı
kan hücreleri ile immünize olmuş farelerin dalak hücreleri ile ölümsüz myeloma
hücrelerini füzyona uğratarak sürekli antikor üretebilen ölümsüz hücre hatlarını elde
etmeleriyle ortaya çıkmış ve o günden bu yana araştırıcıların antikorlara bakışında,
hastalıkların tanı ve tedavi stratejilerinde, aşı üretimi, patojenlerin antijenik yapılarının
aydınlatılmasında ve immün yanıtların genetik regülasyonunun anlaşılması konularında
bir devrim niteliğinde gelişmelere neden olmuştur [149]. Kohler ve Millstein [145] bu
çalışmaları sonucunda 1984 yılında nobel ödülü ile ödüllendirilmeleri ve bunun
ötesinde melezleme teknolojisini patentlememek konusundaki kararları, monoklonal
antikorların bilim, ekonomi ve endüstri alanlarında çabucak ve yaygın şekilde kabul
görmesiyle sonuçlanmıştır [150]. Hibridoma teknolojisi; hedef antijen ile immünize
edilmiş hayvanlardan elde edilen lenfositler ile ölümsüz ve belirli bir kimyasal ajana
karşı duyarlı myeloma hücrelerinin füzyonundan elde edilen hibrid hücreler içerisinden
füzyona uğramayan hücrelerin selektif kimyasallar içeren besiyerlerinde seçilimi ve
sınırlayıcı dilüsyon yöntemi ile tek bir hücreden klonlanmış, istenen hedefe özgü
monoklonal antikor üretebilen hibridoma hücrelerinin elde edilmesini kapsamaktadır
(şekil 2.7) [151].
Şekil 2.7 Hibridoma teknolojisi ile in vitro monoklonal antikor üretim aşamaları [152];
23
A-
Balb/c fareler istenilen antijene karşı bağışıklık kazandırılır. Daha sonra, en
etkin bağışıklık kazanan fare ELISA yöntemiyle seçilir.
B-
Bağışıklık kazanan farenin dalağı, antikor üreten B lenfosit hücrelerini ayırmak
için alınır.
C-
Kemik iliği kanser hücreleri olan ölümsüz myeloma hücreleri B lenfositleri ile
füzyon için hazırlanır.
D-
İki hücre polietilen glikol (PEG) 4000 varlığında füzyona uğratılır. Füzyona
maruz kalan hücreler daha sonra seçici besiyerlerinde kültürü gerçekleştirilerek,
füzyona uğramamış hücrelerin ölmesi sağlanır.
E-
İstenen antijene özgü antikorlar üreten hibridoma klonları ELISA yöntemiyle
seçilir. “Sınırlayıcı dilüsyon” yöntemini kullanarak, seçilen hücreler yeniden kültür
plaklarına ekilir ve tek hücreden oluşan hibridoma kolonisi elde edilir.
F-
İstenilen antijene belirli antikor sentezleyen hibridoma kolonileri ELISA ve
Western Blot gibi yöntemlerle seçilebilir.
G-
Seçilen hibrid hücreler in vitro olarak fazla miktarlarda üretilir.
H-
Üretilen antikorlar uygun metotlarla saflaştırılır [153].
2.9.2.1 İmmünizasyon İçin Seçilen Hayvanların Özellikleri
Fareler ve sıçanlar monoklonal antikor üretimi için hibridoma teknolojisinde elde
edilme kolaylıkları, ucuz oluşları ve bağışıklık için iyi sonuç vermeleri nedeniyle tercih
edilirler. İstenen antijene bağışıklık yanıtını almak için bağışıklık yanıtları güçlü olan ve
hastalık geçirmemiş genç hayvanları kullanmak önemlidir. Hastalıklara karşı
oluşturulan antikorlar çapraz reaksiyonlara sepep olabilir. Ayrıca fareler farklı
sebeplerden dolayı bağışıklık sürecinde ölebilirler. Bu gibi problemleri engellemek için,
6-8 haftalık fareler seçilir. Hayvanların cinsiyeti göz önüne alındığında ise, dişi olanlar
tercih edilmelidir, çünkü sosyal etkileşimde daha saldırgan olan erkek farelere göre grup
olarak başarılı bir şekilde barındırılabilirler (Şekil 2.8).
24
Şekil 2.8 Hibridoma deneylerinde kullanılan Balb/c deney fareleri
2.9.2.2 Füzyon Çalışmalarında Kullanılacak Hücrelerin Özellikleri
Füzyon çalışmalarında kullanılacak myeloma hücre hattı lenfositlerin alındığı kaynak
ile uyumu açısından önemlidir. Bundan dolayı füzyon çalışmalarında genellikle Balb/c
fare ırklarından kaynaklanan myeloma hücre hatları kullanılmaktadır. Myeloma hücre
hattı ve lenfositler aynı tür farelerden kökenlendiğinde in vivo’da hibridoma
hücrelerinin üremesini olumlu yönde etkilemektedir. Ayrıca seçilen myeloma hücre
hattının monoklonal antikor üretimi için kendi kendine immunoglobulin salgılama
kapasitesini kaybetmiş hücre hatları kulanılır. Bu durum istenilen antikorun
salgılanmasını sağlayan lenfosit oranının azalmasına ve monoklonal antikor üretilen
ortamın saflığının bozulmasına neden olmaktadır. İmmünoglobin salgılamayan Sp/0Ag14 myeloma hücre hatları ilk defa 1978 yılında rapor edilmiştir [154]. Fakat bu hücre
hattının bir füzyon partneri olarak kullanılmasında değişken etkilerin oluştuğu
gözlemlenmiştir. Kearney vd. [155] ise 1979 yılında Balb/c kaynaklı, immunoglobulin
salgılama kapasitelerini kaybetmiş, fakat hala melez hücre hatları için uygun antikor
salgılanmasını sağlayan uygun bir füzyon partneri olan P3-X63-Ag8.653 myeloma
hücre hattını tanımlamışlardır.
2.9.2.3 Füzyon Çalışmaları Sonrası Hibrid Hücrelerin Seçilmesi
Hibridoma tekniğinin temeli immünize farelerden elde edilen ölümlü B lenfositlerinin
ölümsüz myeloma hücreleriyle füzyona uğratılarak in vitro ortamda ölümsüz hücre
25
hatlarının ürettiği antikorların sınırsız olarak elde edilmesine dayanmaktadır. Bu amaca
binaen gerçekleştirilen füzyon işlemleri sırasında ortamdaki bütün hücreler füzyona
uğramamakta veya istenilmeyen füzyonların oluşumu (B lenfosit-B lenfosit, myelomamyeloma veya füzyona uğramamış B-lenfosit ve myeloma hücreleri) gözlenmektedir.
Fakat füzyon deneylerinin sonucu olarak istenilen ortamda sadece antikor salgılama
yeteneklerini kaybetmemiş myeloma-B lenfosit hibridlerinin bulunmasıdır. Bu sonucu
elde edebilmek için araştırıcılar myeloma hücrelerinde çeşitli duyarlılıklar oluşturarak
bu engeli aşma yoluna gitmişlerdir.
Hayvan hücreleri nükleotid sentezlerini iki ana yolla gerçekleştirirler (şekil 2.9); Birinci
yol temel moleküllerden ya da hücrede bozulmuş nükleik asit ürünlerinden nükleotid
sentezlenildiği
“kurtarma
yolağı”
(salvage
pathway)’dır.
Bu
yolak
HGPRT
(Hipoksantin-Guanin Fosforibozil Transferaz) enziminin varlığına dayanır. Nükleotid
sentezinin ikinci yolu ise; pürin ve pirimidin (İnozin monofosfat (IMP), Adenozin
Monofosfat (AMP), Guanozin Monofosfat (GMP), Üridin monofosfat (UMP),
Deoksiüridin Monofosfat (dUMP) ve Deoksitimidin Monofosfat (dTMP)) öncüllerinden
nükleik asitlerin yeniden üretildiği de novo sentez yolağıdır [156].
Şekil 2.9 Nükleotid sentezi için de novo ve kurtarma (salvage) yolakları [157]
De novo sentez yolağı aminopterin gibi çeşitli kimyasal antifolatlar ile kapatıldığında
hücreler kurtarma yolağı vasıtasıyla nükleotid sentezleyebilirler. Füzyon çalışmalarında
kullanılan myeloma hücre hatları ise HGPRT- (kusurlu) mutasyona uğramış hücre
hatlarıdır. HGPRT+ hücreler hipoksantin ve timidin varlığında aminopterin gibi
antifolatlara dirençlidirler. HGPRT- hücreler ise aminopterine karşı seçici olarak
26
duyarlıdır. B lenfosit-myeloma yönünden antikor üreten aktif saf kültürler elde
edebilmek için füzyon öncesinde myeloma hücreleri 8-azaguanin mutajenik maddesiyle
muamele edilerek HGPRT- mutant duyarlı myeloma hücre hatları elde edilir. Füzyon
aşamalarına geçilmeden önce kültür ortamından 8-azaguanin en az 10 gün önce
kaldırılarak myeloma hücreleri füzyon için hazırlanır. Myeloma hücrelerinde
oluşturulan bu özellik kullanılarak füzyon sonrası HAT (hipoksantin, aminopterin,
timidin) içeren besiyerinde inkübe edilen kültür içerisindeki füzyona uğramamış
HGPRT- myeloma hücreleri aminopterin varlığında de novo sentez yolaklarını
kullanamadıkları için ölürler. Kültür ortamındaki B lenfositleri ise kısa yaşam süreleri
nedeniyle 4-5 gün içerisinde kültür ortamından elimine olacaklardır. Fakat ölümsüzlük
özelliklerini myeloma hücresinden, HGPRT enzimini ise HGPRT+ B-lenfositinden alan
antikor üreten hibridoma hücreleri kültür ortamında devamlı bir şekilde çoğalabilirler
[158]. Normal besiyerinde kültürü yapılan hayvan hücreleri de novo yolak ile pürin
nükleotidlerini (AMP, GMP, IMP) ve timidilat (TMP) ile sentezler (mavi ile gösterilen
kısım). Diagramın üst kısmında görüldüğü gibi (mavi kısım) aminopterin gibi
antifolatlar tetrahidrofolatın aktive formundan formil ve metil gruplarının transferini
engelleyerek, inozin monofosfat (IMP) ve timidin monofosfat (TMP) sentezini önler.
Normal hücreler ayrıca nükleotid sentezlemek için kurtarma yolaklarını (kırmızı kısım)
da kullanabilirler. Füzyon çalışmaları için kullanılan myeloma hücrelerinde kurtarma
yolaklarındaki HGPRT (hipoksantin-guanin fosforibozil transferaz), APRT (adenin
fosforibozil transferaz) veya TK (timidin kinaz) enzimleri eksiktir ve antifolat
bulunduran besiyerinde yaşayamazlar [157].
2.9.3 Monoklonal Antikorların Uygulama Alanları
Monoklonal antikorlar, antikorların spesifik epitoplara bağlanabilme özelliklerinden
yararlanılarak klinik ve araştırma alanlarında geniş bir yelpazede kullanılmaktadır. Bu
uygulamalar basit olarak kalitatif ve kantitatif analizler ana başlığında toplanan
aşağıdaki uygulama alanlarından oluşmaktadır;

Birçok örneğin aynı anda çalışılabilmesine olanak veren çözünür antijenlerin
belirlenmesi amacıyla çok geniş uygulama alanlarında kullanılan ELISA (enzim bağlı
immünosorbent assay) tekniklerinde [159],
27

Dokulardaki veya hücrelerdeki ekspresyonu yapılan belirli antijenlerin
analizlerinin yapılması amacıyla uygulanan immünofloresan veya immünohistokimya
tekniklerinde [160],

Onkolojide monoklonal antikor temelli moleküler tanı tekniklerinde [161]

Çözünür antijenler için, saf antikorların inert resinlere kovalent olarak
bağlanmasıyla elde edilmiş dolgu maddelerinin kromatografi tekniklerinde kullanılarak
antijen saflaştırılmasında [160], [162],

Hücre yüzey antijenlerine özgü üretilmiş antikorların çeşitli floresans (FACS
teknikleri) veya manyetik (MACS teknikleri) ajanlar ile işaretlenerek kullanılmalarını
içeren hücre saflaştırma tekniklerinde [163], [164], [165], [166],

Antikorların nötralizasyon özelliklerinin kullanılarak çeşitli toksinlerin vs.
elimine edilmesinde (Ör; anthrax letal faktör toksininin elimine edilmesi gibi) [167],

Kanser hücrelerinin monoklonal antikorlara dayalı olarak yok edilmesini içeren
immünoterapi uygulamalarında (Ör; Rituxan® (anti-CD20) ve Herceptin® (antiHER2/neu) ticari monoklonal antikorlarının kullanılarak non-hodgkin’s lenfoma ve
göğüs kanseri tedavisinde)[168], [169], [170], [171],

Monoklonal antikorların kullanıldığı ilaç taşıma ve hedefleme sistemlerinde
kullanılmasını içermektedir [171], [172], [173].
2.9.4 Leismaniasisin Tanısında Monoklonal Antikorların Önemi
Monoklonal antikorlar bazı örnekleri yukarıda özetlenen çok geniş alana yayılmış
kullanım alanları içerisinde leishmaniasisin serolojik olarak tanısının koyulması
amacıyla geliştirilmiş teknikleri içerisinde de kendine yer bulmuştur. Monoklonal
antikorların kullanılmasını içeren leishmaniasis tanı sistemleri serolojik yöntemlerin ana
prensibine bağlı olarak olarak iki ana başlıkta toplanmaktadır. Bunlar; Leishmania
spesifik antijen belirleme temelli ve Leishmania spesifik antikor belirleme temelli
saptama yöntemleridir.
28
2.9.4.2 Antikor Saptanması
VL tanısında hastada Leishmania parazitlerine karşı oluşturulmuş antikorların
saptanması
temeline
dayanan
tanı
sistemleri
non-spesifik
metotlar
olarak
uygulanmaktadır. Yükselmiş antikor seviyelerine dayanan bu test sistemleri konağın
durumuna göre pozitif değer verebilmektedirler. Spesifikliğin yüksek olmadığı bu
sistemlerde aynı zamanda yanlış pozitiflikle sonuçlanan geniş bir duyarlılık ölçeği de
görülmektedir [174], [175]. Bu gibi özellikleri antikor saptama temelli tanı sistemlerini
güvenilemez hale getirmektedir. VL tanısında kullanılan, insan vücudunun parazitlere
karşı oluşturduğu yüksek seviyeli antikorların diğer bazı hastalıklara karşı da yüksek
seviyelerde bulunduğunun belirlenmesi [176] araştırıcıları VL hastalarında serolojik
tanı yöntemlerinin antijen saptama temelli olarak geliştirilmesine yönlendirmiştir.
2.9.4.1 Antijen Saptanması
Antijen belirleme temelli yöntemler antikor belirleme temelli serolojik yöntemlerden
daha spesifik yöntemlerdir [177], [178]. Bu metot aynı zamanda immün sistem defekti
sonucu (Ör. AIDS) antikor üretemeyen leishmaniasis hastalarında daha kullanışlı bir
yöntem olarak da göze çarpmaktadır. Ayrıca monoklonal antikorların kullanılarak VL
hastalarından alınan örneklerin incelenmesi çalışmalarında bazı Leishmania antijen
fraksiyonlarının %96 ile %100arasında bir spesifikliğe sahip olduğu belirlenmiştir
[177].
Antijen saptama temelli tanı sistemlerinin, tanı değerine yönelik yapılan bazı
çalışmalarda da enfeksiyonun henüz başlamadan hastada tayin edilebilmesine olanak
sağladıkları da rapor edilmiştir [179]. Bunlar gibi daha birçok örnekte olduğu gibi göze
çarpan avantajlarından dolayı antijen saptama temelli tanı sistemleri giderek geniş alana
yayılmaktadır.
VL tanısında antijen saptama temelli serolojik tanı sistemleri, hastadaki antijenlerin
parazite özgü monoklonal antikorlar vasıtasıyla yakalanarak tespit edilmesi temeline
dayanmaktadır. Bu test sistemleri Competitive sandwich ELISA, new latex
agglutination test (KATEX) [142], [143] gibi çeşitli sistemlerdir. Bu gibi sistemlerin
gösterdiği yüksek spesifiklik ve duyarlılık, araştırıcılar tarafından L. infantum gibi
enfeksizyöz ajanlara karşı geliştirilmiş ve halen geliştirilmekte olan tür spesifik
monoklonal antikorların tanı sistemlerinde ve giderek artan bir uygulama alanlarında
kullanılmalarına yol açmaktadır.
29
BÖLÜM 3
DENEYSEL ÇALIŞMALAR
3.1 MATERYAL
3.1.1 Ekipman

Steril hücre kültür odası

Hava akımlı kabinler (Laminar flow -Thermo Scientific Hera safe, Faster BH-
EN 2006)

Karbondioksitli inkübatör (New Brunswick scientific CO-150 37°C, FrioCell
111 25 °C)

İnverted mikroskop (Olympus CKX41)

Işık mikroskobu (Olympus)

Santrifüj (Eppendorf, Thermo Micromax RF)

Manyetik karıştırıcı (Heidolph MR3000)

pH metre (HANNA instruments)

Hassas terazi (Precisa Gravimetrics AG)

Buz makinesi (Scotsman AF100)

Vortex (LMS(laboratuvary medical supplies) VTX-3000L)

Su banyoları (GFL (gesselschaft für labortechnik) mbH, Kerman)

Isıtıcılı karıştırıcı (Heidolph instruments)

ELISA çoklu plak yıkama cihazı (Thermo)
30

SDS-PAGE jel elektroforez sistemi (Hoefer)

Güç kaynağı (Hoefer)

Dondurucular (Beko(+4,-20°C), Arçelik(+4,-20°C), GFL(-40°C))

-195°C azot tankı ve azot taşıma tankları (DMC air liquid systems)

Otoklav (Kerman, HIRAYAMA)

UV-spektrofotometre (Jasco V-530)

ELISA çoklu plak okuyucusu (spektrometre) (Thermo)

Saf su ve ultra saf su sistemleri (GFL2104)

Blotlama cihazı (Hoefer)

Fraksiyon ayırım makinesi, (Fraction Collector BİO-RAD)

10, 50, 100, 1000 µl’lik mikropipetler (Thermo, Pippetman)

100,300 µl ‘lik çok kanallı pipetler (Thermo)

1-10, 10-100, 100-1000 μl’lik tek kullanımlık pipet uçları (AxyGen)

Santrifüj tüpleri -1, 2, 15, 50 ml. (Eppendorf , IsoLAB)

ELISA 96 kuyulu plakları (TPP)

Hücre kültürü plakları (TPP)

Hücre kültür flaskları -25 cm2, 75 cm2 (TPP, Corning)

Serolojik pipet tabancası (Thermo)

Serolojik pipetler -1,5,10 ml (Blau Brand Germany)

Steril pastör pipeti -3ml (LP ITALIANA SPA)

PVDF membran(Thermo)

Diyaliz membranı (MWCO 50,000 Thermo)

3M Whatman filtre kâğıdı (Whatman 3MM Chr)

Kriyotüpler (TPP)

Makas, diseksiyon seti (Müller - Germany)
31

Süzgeç (BD Falcon)

50-1000ml’lik otoklavlanabilir cam şişeler (ISOLAB, SCHOTT)

Hücre sayımı için thoma lamı (Menzel superior)

1-2,5-5-10-50 cc’lik enjektör (Ayset)

0,22 μm ve 0, 45 μm’lik şırınga filtreleri (MILLIPORE, TPP, Sartorius)

Lateks eldiven (Broche)
3.1.2 Kimyasallar

Anti-fare polyvalen-AP konjugatı(Sigma)

Anti-fare IgG-AP konjugatı (Millipore)

Protein ladder (low range) (Thermoscientific)

Anti-fare polivalent immünoglobulin-AP konjugatı (Sigma)

Freund complete adjuvan (Sigma)

Hidroklorik asit, HCl (Riedel-de Haën)

Protein G immün afinite kolonu (Sigma-P7700)

BSA bovine serum albümin (Sigma)

Tripan mavisi (Biologycal Industry)

Yağsız süt tozu (AppliChem)

8-Azaguanin (Sigma)

Hipoksantin aminopterin timidin, 50X HAT (PAN)

Hipoksantin timidin, 100X HT (Gibco)

Polietilen glikol-4000, PEG-4000 (Sigma)

Amonyum sülfat, (NH4)2SO4 (merck)

Sodyum klorür, NaCl (Sigma)

Sodyum bikarbonat, NaHCO3 (Merck)

Glisin, (Fluka)
32

Magnezyum klorür, MgCl2 (Fluka)

Çinko Klorür, ZnCl2 (Fluka)

Sodyum azid, NaN3 (Sigma)

Potasyum hidroksit, KOH (Merck)

Dipotasyum fosfat, K2HPO4 (Sigma)

Monopotasyum fosfat, KH2PO4 (Sigma)

Sodyum di hidrojen fosfat mono hidrat, NaH2PO4.H2O (Merck)

Disodyum hidrojen fosfat, Na2HPO4 (Merck)

KCl (Sigma)

Akrilamid (Sigma)

Trizma-Baz(Sigma)

β-Merkaptoetanol (Fluka)

EDTA (AppliChem)

Bromofenol mavisi (aMReSCO)

Sodyum dödesil sülfat (SDS) (Sigma)

Sükroz (MERCK)

Amonyum persülfat (MERCK)

N,N,N’,N’-tetrametil etilendiamin (TEMED) (Sigma)

Metanol (Merck)

Formalin (Sigma)

Mouse immunoglobulin subisotyping Kit (Thermoscientific)

Lumi-phos WB kemilüminesasn substrat (Thermoscientific)

Tween-20 (MP Biomedicals LLC)

Paranitrofenil fosfat (Sigma)

RPMI-1640 (Fenol redli ve fenol redsiz) besiyerleri (GIBCO Invitrogen)
33

HEPES (AppliChem)

FBS-fetal bovine serum (GIBCO Invitrogen)

Bis-akrilamid (Sigma)

Tris (Sigma)

DMSO (AppliChem)

Gentamisin (GIBCO)
3.1.3 Deneylerde Kullanılan Tampon, Kültür Ortamları ve Kimyasalların
Hazırlanışı
3.1.3.1 Tamponlar

PBS Tamponu
8 g NaCl, 0,2 g KH2PO4, 1,8 g Na2HPO4.2H2O ve 2 g KCl tartılıp distile su eklenerek
pH’ı 7,4’e ayarlandı, ardından 1 lt’ye tamamlanarak süzüldü ve otoklavlandı.

PBS-Tween 20 Tamponu
Hazırlanan fosfat tamponuna (PBS) %0,05 (hacim/hacim) olacak şekilde tween-20
eklendi.

Kaplama Tamponu (pH; 9,6)
1,59 g Na2CO3, 2,93 g NaHCO3 ve 0,2 g NAN3 tartılarak pH’ı 9,6’ya ayarlandı,
ardından distile su ile 1lt’ye tamamlandı.

Bloklama Çözeltisi
100 ml kaplama tamponuna %2 (ağırlık/hacim) olacak şekilde yağsız süt tozu eklendi.

PBS/Tween20/süt tozu
PBS/Tween20 çözeltisine %2 (ağırlık/hacim) olacak şekilde yağsız süt tozu eklendi.
34

Substrat Tamponu (pH:10,4)
0,02 g ZnCl2, 0,04 g MgCl2 ve 1,5 g glisin tartılarak distile su ile çözüldü pH; 10,4’e
ayarlandı ve 200 ml’ye tamamlandı.

Substrat Çözeltisi
25 mg paranitrofenil fosfat 25 ml substrat tamponunda (pH:10,4) çözdürüldü.

%50 PEG Çözeltisi (ağırlık/hacim)
10 g PEG-4000 (sigma) 121 °C’de 10 dk. boyunca otoklavlandı. Ardından 37°C’de 10
ml. PBS içerisinde çözülerek 1’er ml halinda 4°C’de karanlıkta saklandı.

Stok Akrilamid Çözeltisi
29,2 g akrilamid ve 0,8 g bis tartılarak bir miktar distile suda çözüldü. Ardından distile
su ile 100 ml'ye tamamlandı.

3 M Tris-HCl Tamponu (pH 8,8)
72,68 g Trizma-baz distile su ile çözüldü. 3N HCl ile pH 8,8’e ayarlandı. Ardından
di s t i l e su i l e 200m l ’ye t am am l andı

1,5 M Tris-HCl Tamponu (pH 6,8)
35,35 g Trizma-bazdistile su ile çözüldü. 3N HCl ile pH 6,8’e ayarlandı. Ardından distile su
ile 200 ml'ye tamamlandı.

%10 SDS
10 g Sodyum dödesil sülfat (SDS) distile su ile 100 ml'ye tamamlandı.

%10 Amonyum Persülfat (APS)
0,1 g APS kullanılmadan hemen önce distile su ile 1 ml'ye tamamlandı.

1 x Yürütme Tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin, %0,1 SDS, pH 8.3)
3.03 g tris, 14.4 g glisin ve 1 g sodyum dödesil sülfat (SDS) distile su ile çözüldü. pH
8,3’ ayarlandı. Distile su ile 1 lt’ye tamamlandı.
35

Örnek Yükleme Tamponu
2 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,5 g SDS, 5 g Sukroz, 0,25 ml β-Merkaptoetanol ve 5
ml bromofenol mavisi (% 0,5 ağırlık/hacim) distile su ile 50 ml'ye tamamlandı.

Bloklama Tamponu
5 g yağsız süt tozu tartılarak % 0.05 tween-20 içeren (hacim/hacim) PBS ile 100 ml’ye
tamamlandı.

Transfer Tamponu
3.03 g tris, 14.4 glisin tartılarak, 200 ml metanol eklendi. Distile su eklenerek pH 8,3’e
ayarlandı. Ardından distile su ile 1 lt’ye tamamlandı.

Protein-G İmmün Afinite Kolon Kromatografisi Bağlama Tamponu
26,7 g NaH2PO4.H2O ve 28,4 g Na2HPO4 tartılarak bir miktar distile su eklendi. Ardından
pH 7,0’ye ayarlanarak 1 lt’ye tamamlandı.

Protein-G İmmün Afinite Kolon Kromatografisi Ayırma (elüsyon)
Tamponu
7,5 g glisin tartılarak distile su eklenedi. Ardından 2M HCl ile pH’ı 2,7’ye ayarlanarak
1lt’ye tamamlandı.

Protein-G immün afinite kolon kromatografisi dengeleme tamponu
(nötralize edici)
121,1g Tris tartılarak distile su eklendi. Ardından 2M HCl ile pH 9,0’a ayarlanarak
1litre’ye tamamlandı.
3.1.3.2 Besiyerleri

Kültür Besiyeri
Besiyeri %80 RPMI 1640, %20 fetal bovine serum (FBS), 50 μg/ml gentamisin
oranlarında hazırlanarak +4°C’de kullanıma hazır ve steril bir şekilde muhafaza edildi.
36

Seçici Besiyerleri
A) HAT; Hipoksantin aminopterin timidin (50X HAT) supplement (PAN) 1lt.
kültür besiyerine 20 ml. olacak şekilde eklendi. Kullanıma hazır ve ışık
görmeyecek şekilde steril olarak -20°C’de muhafaza edildi.
B) HT; Hipoksantin timidin (100X HT) suplement 1 lt besiyerine 10 ml. olacak
şekilde eklendi. Kullanıma hazır ve ışık görmeyecek şekilde steril olarak
+4°C’de muhafaza edildi.

Dondurma Besiyeri
%80 FBS, %10 RPMI-1640 ve %10 DMSO olacak şekilde hazırlandı.
3.1.4 Deneylerde Kullanılan Deney Hayvanları
Füzyon çalışmaları için istenen antijene olumlu immün cevap verebilen 6-8 haftalık dişi
Balb/c fare ırkları hibridoma ve immünizasyon çalışmalarında lenfosit donörü olarak
kullanıldı.
3.1.5 Deneylerde Kullanılan Hücreler

Myeloma Hücre Hattı
Hibridoma çalışmalarında Ege Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Hayvan Hücre
Kültürü Laboratuvarı sorumlu öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. S.İsmet Deliloğlu Gürhan
tarafından temin edilen P3-X63-Ag8.653 myeloma hücre hattı kullanıldı.

Antikor üreten lenfosit hücreleri
Periyodik olarak immünize edilmiş Balb/c farelerin dalak lenfosit hücreleri füzyon
çalışmalarında antikor kaynağı hücreler olarak kullanıldı.

Besleyici tabaka olarak fare periton makrofajları
Füzyon sonrası destekleyici katman olarak Balb/c farelerin periton bölgesinden izole
edilen makrofaj hücreleri kullanıldı.
37

J774 makrofaj hücre hattı
Hibridoma hücrelerinin sınırlayıcı dilüsyonları sırasında destekleyici metabolit sağlayıcı
olarak J774 makrofaj hücre hattı kullanıldı.

Antijen eldesinde kullanılan Leishmania parazitleri
İmmünizasyonda kullanılmak üzere antijen elde etmek amacıyla L. infantum
(MONI/EP126) parazitleri hücre antijen kaynağı olarak kullanıldı.
38
3.2 METOT
3.2.1 L. infantum (MONI/EP126) Suşunun Kriyobanktan Çıkarılması
Sıvı azot tankından çıkartılan hücreler 27C su banyosunda çalkalanarak çözdürüldü.
Çözdürülen hücre süspansiyonunun, 5 ml RPMI 1640 (%10 FBS) besiyeri bulunan
flasklara ekimi yapıldı.
3.2.2 L. infantum (MONI/EP126) Promastigot Kültürünün Yapılması
L. infantum parazitlerinin kültürü 27C etüvde (Friocell, 111) RPMI 1640 besiyeri
kullanılarak gerçekleştirildi. Parazitlerin gelişimi ve morfolojik durumu inverted
mikroskopta (Olympus CKX41) incelendi. Kültürün pasajı haftada bir kez yeni flaska 5
ml besiyeri eklenerek üzerine 2x105 parazit/ml olacak şekilde kültürden parazit
eklenerek yapıldı (şekil 3.1).
Şekil 3.1 MONI/EP126 L. infantum parazitlerinin kültürdeki durumu (20X)
3.2.3 Parazitlerin Thoma Lamında Sayımı
Kültür ortamındaki hareketli parazitleri fikse etmek amacı ile kültürden alınan 100µl
örneğin üzerine 1:1 oranında %2’lik formalin eklendi ve 5 dakika bekletildi. Daha sonra
fikse edilen hücrelerin Thoma lamında (Menzel superior) sayımı aşağıdaki formül
kullanılarak yapıldı:
39
Parazit sayısı (1ml) = Ortalama hücre sayısı x Sulandırma katsayısı x Thoma lamı
sabiti
Ortalama hücre sayısı: Thoma lamının alt ve üst kamaralarında bulunan 16 karedeki
hücrelerin aritmetik ortalaması
Sulandırma katsayısı: Stoktan alınan hücrelerin sayımı için yapılan sulandırma
katsayısı
Thoma lamı sabiti: 10.000
3.2.4 P3-X63-Ag8.653 Myeloma Hücrelerinin Kriyobanktan Çıkarılması
Sıvı azot tankından çıkartılan P3-X63-Ag8.653 myeloma hücreleri 37°C su banyosunda
hızlı bir şekilde çözündürüldü. Hücreler 15 ml’lik santrifüj tüplerine aktarılarak
üzerlerine 37°C’de ısıtılan RPMI 1640 besiyerinden 5 ml ilave edildi. Hücreler daha
sonra 700 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve pellete 5 ml
RPMI-1640 (%10 FBS) eklenerek hücreler yeniden süspanse edildi. Süspanse hale
getirilen hücreler 25 cm2’lik kültür flasklarına 5 × 104 hücre/ml olacak şekilde transfer
edildi ve 37°C’de %5 CO2 ve %98 nem içeren etüvde kültüre edildi.
3.2.5 P3-X63-Ag8.653 Myeloma Hücrelerinin Kültürünün Yapılması
Kültüre alınan P3-X63-Ag8.653 myeloma hücrelerinin besiyerleri 2-3 günde bir gerekli
miktarda değiştirilerek inverted mikroskop (Olympus) ile gelişimleri takip edildi.
Tripan mavisi ile hücre sayımları yapılan hücrelerin 5x105 hücre/ml yoğunluğuna
ulaştığında pasajları gerçekleştirildi (Şekil 3.2).
40
Şekil 3.2 Log faz P3-X63-Ag8.653 myeloma hücreleri (20X)
3.2.6 P3-X63-Ag8.653 Myeloma Hücrelerinin Aminopterin Hassasiyetlerinin
Sağlanması
Gelişimleri takip edilen hücrelerin füzyonu sonrası HAT seçici besiyerinde aminopterin
hassasiyetlerinin sağlanması amacıyla kültür ortamına 8-azaguanin (20μg/ml) eklenerek
kültüre devam edildi (Şekil 3.3).
Şekil 3.3 8-azaguaninden 1 gün sonra hücrelerin durumu(40X)
Aminopterin hassasiyeti sağlanan hücrelerin kültür ortamında bulunan 8-azaguanin
füzyon işleminden en az 2 hafta önce kültür ortamından arındırıldı. P3-X63-Ag8.653
41
myeloma hücreleri füzyon aşamasına yakın pasajları yapılarak füzyon aşamasında
>%95 canlılıkta ve log fazında olmaları sağlandı.
3.2.7 Füzyon Sonrası Besleyici Hücrelerin Hazırlanması
3.2.7.1 Fare Periton Makrofajlarının Besleyici Hücre Olarak Elde Edilmesi
Periton makrofaj hücreleri füzyondan bir gün önce hazırlandı. Fare sakrifiye edilmeden
önce 5 ml’lik enjektör 3 mL soğutulmuş RPMI 1640 ile doldurularak 18G iğne
enjektöre takıldı. Fareden alınacak makrofaj hücrelerinin enjektör yüzeyine tutunmasını
engellemek amacıyla besiyeri içeren enjektör soğuk ortamda muhafaza edildi. Ardından
fare yüksek dozda eter inhalasyonu ile sakrifiye edildi ve %70’lik alkol ile dezenfekte
edildi. Steril kabin içerisinde sırt üstü yatırılan farenin karın bölgesi steril pens ve
makas yardımıyla yanlara ve yukarı doğru açıldı ve sabitlendi. Açığa çıkan periton
bölgesinin uygun ve kontaminasyona sebep olmayacak bir bölgesinden içeri soğutulmuş
RPMI 1640 besiyeri organlara değmeden dikkatli bir şekilde dolduruldu (şekil 3.4).
Şekil 3.4 Fare peritonel makrofajların alınması
Besiyeri periton içerisine iyice dağıtıldıktan sonra enjektöre geri çekildi. Enjektör
içindeki periton makrofaj hücreleri soğutulmuş HAT besiyeri ile süspanse edildi. Oda
sıcaklığında 1000 rpm 5 dk. santrifüj sonrası süpernatant uzaklaştırılarak hücrelerin
sayımı gerçekleştirildi. Tripan mavisi ile hücre sayımı sonrası 1 × 105 hücre/ml olacak
şekilde süspanse edilen hücreler çalışılacak hücre kültür plağı sayısına bağlı olarak, her
kuyuya 100 μl besiyeri olacak şekilde dağıtıldı. Ardından plaklar 37°C’lik %5 CO2 ve
42
%98 nem koşullarındaki inkübatörde (New Brunswick scientific CO-150 37°C)
kültüre edildi.
3.2.7.2 Besleyici Besiyeri Hazırlanması Amaçlı J774 Makrofaj Hücre Kültürünün
Elde Edilmesi
Sıvı azot tankından çıkartılan J774 makrofaj hücreleri 37C su banyosunda çözdürüldü
ve 5 ml RPMI 1640 (%10 FBS) besiyeri bulunan flasklara 1 x 105 hücre/ml olacak
şekilde ekimi yapılarak, %5 CO2 içeren etüvde (New Brunswick scientific CO-150
37°C) 37°C de kültüre alındı. 48 saat sonra kültür ortamındaki 5 ml besiyerinin 2,5
ml’si dökülerek yerine taze besiyeri eklendi. Yeterince çoğalan 25 cm2’lik steril kültür
flasklarındaki hücreler pipetleme yardımı ile yüzeyden ayrıldı ve RPMI 1640 (%10
FBS) içeren 15 ml’lik santrifüj tüpü içerisinde 1000 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi.
Süpernatant dökülerek dipteki hücre pelletinden tripan mavisi ile makrofaj sayımı
yapıldı ve yeni flask içindeki 5 ml besiyerinde 1x105 hücre/ml makrofaj olacak şekilde
ekim yapıldı (şekil3.5).
Şekil 3.5 Log faz J774 fare makrofaj hücreleri (20X)
3.2.7.3 J774 Makrofaj Hücre Kültüründen Destekleyici Besiyerlerinin Toplanması
Kültürün durumu her gün inverted mikroskop (Olympus) ile incelendi. Yüzey
kaplamasını tamamladığı tespit edilen makrofaj kültürleri süpernatantların toplanması
amacıyla üzerlerine yeni besiyeri eklenmeden 48 saat boyunca kültüre edildi. 48 saat
sonunda kültürlerden elde edilen besiyerleri 1500 rpm’de 10 dk santrifüj edilerek 0,45
43
μm’lik filtre (Millipore) ile süzüldü ve +4°C’de aktiviteleri kaybolmadan 2 ay kadar
saklandı [180].
3.2.8 Parazitlerden Antijen Elde Edilmesi ve Miktarının Belirlenmesi
Thoma lamında sayımları yapılan L. infantum parazitleri 15 ml’lik santrifüj tüpüne
alınarak 3 kez PBS 2000 rpm’de 10 dk. yıkandı. Yıkanan parazitlerin üzerine dH2O
eklenerek sıvı azotta 5 dk. boyunca dondurularak çözdürüldü. Bu işlem 6 kez
tekrarlandı. Elde edilen antijen çözeltisinin içerdiği protein miktarı spektrofotometrik
olarak belirlendi. Seyreltilen protein çözeltisinin 280nm (A280) ve 260nm (A260) dalga
boylarındaki absorbansları ölçülü.
Protein miktarının belirlenmesinde aşağıdaki formül kullanıldı:
Protein derişimi (mg/ml): (1.5x A280 -0.75x A260)x sulandırım katsayısı
Sulandırma katsayısı: Ölçüm için yapılan sulandırma katsayısı
A280: Protein çözeltisinin 280 nm dalga boyunda gösterdiği absorbans değeri
A260: Protein çözeltisinin 260 nm dalga boyunda gösterdiği absorbans değeri
3.2.9 Fare Deneyleri
3.2.9.1 Balb/c Farelerin L. infantum Tüm Parazitleri ile İmmünizasyonu
6-8 haftalık Balb/c fareler ilk enjeksiyon için PBS içerisinde çözündürülen antijen
complete Freund adjuvant ile sonraki injeksiyonlar için ise saf antijen halinde enjekte
edildi. İmmünizasyon prosedürü belirli aralıklarla en az 4 defa gerçekleştirildi (çizelge
3.1).
Çizelge 3.1 Deney gruplarının immünizasyon tarihleri
1. İmmünizasyon
14.10.2011
2. İmmünizasyon
27.10.2011
3. İmmünizasyon
16.11.2011
4. İmmünizasyon
30.11.2011
Dondurup çözme ile parçalanmış 100 µg L. infantum paraziti ilk immünizasyon için
complete Freund adjuvanı ile birlikte emülsifiye edilerek 6 haftalık farelere
intraperitonal olarak yaklaşık 200 μl kadar enjekte edildi. Bundan sonraki
44
immünizasyonlar için çözünmüş tüm parazit antijenleri saf olarak PBS içerisinde
çözündürülerek kullanıldı. Negatif kontrol olarak PBS ve adjuvan 1:1 oranında
karıştırıldı ve fareye intraperitonel olarak injekte edildi. İkinci ve dördüncü
immünizasyonlardan 7 gün sonra farelerde L. infantum parazitlerine karşı oluşan immun
cevabın seviyesini ölçmek için fare kuyrukları steril makas ile 0.5 cm kesilerek kan
alındı. 100-200 μl kan toplanarak içlerinde 75 µl EDTA bulunan santrifüj tüplerine
aktarıldı. Alınan kanların serumları 3000 rpm’de 5 dk. santrifüj ile ayrılarak oluşan
antikor cevabın kontrolü indirekt ELISA metodu ile gerçekleştirildi. En yüksek antikor
cevabını veren ikinci fare seçilerek füzyondan 3 gün önce adjuvansız yarım doz (50 µg)
antijen ile intraperitonel ve intravenöz olarak immunize edilerek füzyon çalışmaları için
hazır hale getirildi.
3.2.9.2 İndirekt ELISA Testi ile İmmünizasyon, Çapraz Reaksiyon ve Pozitif
Kuyuların Kontrolü
İmmünizasyon, pozitif kuyuların kontrolü ve çapraz reaksiyon testleri için ELISA
testinde kullanılacak promastigotlar kültür ortamından alınarak sayımı yapıldı ve 2000
rpm ‘de 8 dk. santrifüj edildi. Steril PBS ile 1:40 oranında sulandırılan promastigotlar
sıvı nitrojen tankına daldırılarak 5 dk. boyunca 5 kez dondurulup ve 37°C’lik su
banyosunda çözüldü. 10.000 rpm 15 dk. santrifüj sonrası ayrılan supernatant 280 nm de
protein miktarı belirlenerek ELISA testi için kullanıldı. Solüsyon içerisindeki antijen
miktarı 5 µg/ml olacak şekilde ayarlandıktan sonra L. infantum parçalanmış bütün
promastigot antijenleri [181]
96 kuycuklu ELISA plaklarına kaplama tamponu
içerisinde 100 μl olacak şekilde kaplanıp +4 ºC’de bir gece inkübasyona bırakıldı.
Çapraz reaksiyon testleri için ise kuyular kaplama tamponu içerisinde %5 BSA , %2
yağsız süt tozu ve %1 fare serumu ile kaplandı. Ertesi gün plaklar %0,05 tween 20/PBS
(hacim/hacim)
tamponu ile 3 kez yıkanarak %2 süt tozu/kaplama tamponu
(ağırlık/hacim) olarak hazırlanan yağsız süt tozu bloklama çözeltisi bütün kuyulara 150
μl kadar eklendi ve 37 ºC’de bir saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası %0,05
Tween20/PBS (hacim/hacim)
ile 3 kez gerçekleştirilen yıkama işleminin ardından
hibridoma hücre süpernatantı veya 1/100, 1/300, 1/600 oranlarında %2 süt tozu/PBStween 20 (ağırlık/hacim) içerisinde sulandırılmış fare serumundan kuyulara 100’er μl
eklenerek 37 ºC’de bir saat bekletildi. Plaklar %0,05 tween 20/PBS (hacim/hacim) ile
tekrar 3 kez yıkandıktan sonra, 1/1000 oranında %0,05 tween 20/PBS (hacim/hacim) ile
seyreltilmiş anti-fare polivalent antikor-AP eklenerek 37ºC’de bir saat inkübe edildi. Bu
45
işlemden sonra 5 kez %0,05 tween 20/PBS (hacim/hacim) ile tekrar yıkananan plaklara
1 mg/ml PNPP substrat tamponu çözeltisi eklendi. Plaklar oda sıcaklığında karanlıkta
bırakıldı. Oluşan renk değişimi, ELISA okuyucusu ile 405 nm’de 30 dakika ve bir
saatlik okumalar gerçekleştirilerek belirlendi.
3.2.10 Füzyon Deneyleri
3.2.10.1 İmmünize Olmuş Fareden Dalak Hücrelerinin Eldesi
Çözünmüş tüm parazit antijen lizatı ile bağışıklanan fareler arasında en yüksek antikor
yanıtı veren fareye füzyondan üç gün önce hatırlatma amacı ile adjuvansız yarım doz
(50 µg) antijen-PBS süspansiyonu intraperitonal olarak enjekte edildi.
Füzyon günü fare kapalı bir cam kabın içinde yüksek dozda dietil eter inhalasyonu ile
sakrifiye edildi. %70 etanol ile yıkanarak diseksiyon tahtasına yatırılan farenin steril
pensler ile derisi göğüs bölgesinden ayrıldı ve steril makas ile kesildi. Kesilen deri
sıyrılarak diseksiyon tahtasına tutturuldu. Başka bir steril pens ve makas ile farenin
periton boşluğu açılarak karın bölgesinin sol alt kısmından dalak çıkartıldı. 5 ml RPMI
1640 içeren 60 mm petri kabına koyulan dalaktan yağ ve diğer tutunan dokuların steril
makas ve pens ile uzaklaştırıldı. Dalak steril şekilde 5 ml RPMI 1640 içeren 100 mm
petri kabına alındı. 3 cc şırınga 1 ml RPMI 1640 ile dolduruldu ve dalağa birkaç
bölgeden enjekte edilip petri kabı içerisinde yıkanarak organ içerisinde kalmış fazla kan
uzaklaştırıldı. Ardından steril makas ile dalak 3 bölgeye ayrılarak 70 µm’lik filtre
içerisinde steril bir şırınganın tersi ile sadece fibröz doku kalana kadar ezildi (şekil 3.6).
46
Şekil 3.6 İmmünize Balb/c faresinden alınan dalaktan lenfosit izolasyonu
Ardından filtre 2 ml RPMI 1640 ile yıkandı. Dalak hücrelerinin bulunduğu süspansiyon
15 ml ‘lik santrifüj tüpüne alındı ve 3 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Santrifüj
tüpünün üzerindeki %95’lik kısım yeni bir santrifüj tüpüne alındı. Tripan mavisi ile
boyanarak hücre sayımı yapıldı ve canlı hücre yüzdesi hesaplandı.
3.2.10.2 Tripan Mavisi ile Hücrelerin (Myeloma, Peritonel Makrofaj, J774
Makrofaj ve İmmün Dalak Hücreleri) Sayımı ve Canlılık Tayini
Hücre süspansiyonunda ml’de bulunan hücre sayısını ve hücre canlılıklarını hesaplamak
için üzerinde alt ve üst kamaralarda olmak üzere çizgilerle 16 büyük kareye ayrılmış 1
mm2lik alan ve 0,1 mm derinliğe sahip bölgeler bulunduran Thoma lamı kullanıldı
[182] (Şekil 3.7).
Şekil 3.7 Thoma lamı üzerindeki yivler
47
Myeloma, peritonel makrofaj, J774 makrofaj hücreleri ve immün dalak hücreleri belirli
oranlarda süspanse edildikten sonra tripan mavisi solüsyonundan (Biologycal Industry,
628255) 50 µl, PBS çözeltisinden 48 µl ve hücre süspansiyonundan 2 µl alınarak
süspanse edildi. Süspansiyondan yaklaşık 20 µl alınarak lamel ile örtülmüş Thoma
lamına yayıldı. İnverted mikroskop kullanılarak Thoma lamının alt ve üst
kamaralarındaki 16şar büyük karedeki boyanmamış tüm hücreler sayılıp aritmetik
ortalamalar alındı ve hücrelerin canlılıkları hesaplandı.
Daha sonra aşağıdaki formül ile hücre sayısı hesaplandı;
Hücre sayısı (1ml) = Ortalama canlı hücre sayısı x Sulandırma katsayısı x Thoma
lamı sabiti
Ortalama hücre sayısı: Thoma lamının alt ve üst kamaralarında bulunan 16 karedeki
canlı hücrelerin aritmetik ortalaması
Sulandırma katsayısı: Stoktan alınan hücrelerin sayımı için yapılan sulandırma
katsayısı
Thoma lamı sabiti: 10.000
3.2.10.3 İmmun Dalak Hücrelerinin Myeloma Hücreleri ile Füzyonu
Fareler sakrifiye edilmeden hemen önce, myeloma hücrelerinin canlılık yüzdesi tripan
mavisi ile saptandı ve >%95 canlılıktaki 1×107 P3-X63-Ag8.653 myeloma hücreleri 50
ml’lik santrifüj tüpüne aktarıldı. Ardından dalak hücrelerinin bulunduğu süspansiyon
tripan mavisi ile sayılarak 1x108 canlı dalak hücresi 15 ml’lik santrifüj tüpüne alındı.
Myeloma hücreleri 50 ml RPMI 1640 ile 1000 rpm ‘de 5 dakika santrifüj edilerek 2
kere yıkandı ve 5 ml RPMI 1640 ile resüspanse edildi. 50 ml’lik santrifüj tüpündeki
myeloma hücrelerine dalak hücreleri eklenerek tüp RPMI 1640 ile dolduruldu.
Süspansiyon 1000 rpm’de 5 dk. oda sıcaklığında santrifüj edildi. Hücre pelleti 50 ml
RPMI-1640 ile yıkanarak tekrar santrifüj edildi. Hücre pelleti 37°C’lik karıştırmalı su
banyosunda 2 dakika ısıtıldı. Tüpe hafifçe vurarak pellet çözdürüldü.
Bu aşamadan sonra %50 PEG (polietilen glikol) 4000 solüsyonu ile füzyon aşamasına
geçildi. Bu aşama kritik bir safha olduğu için kronometre kullanılarak aşağıdaki füzyon
prosedürü izlendi;
48

Hücre Füzyonu
Dalak ve P3-X63-Ag8.653 hücreleri ile steril %50 PEG solüsyonu;
İlk 1. dk. boyunca---------tüp içerisine 1 ml %50 PEG 37°C’de eklendi ve yavaşça
karıştırıldı.
Sonraki 2.dk. boyunca-----700 rpm ‘de santrifüj edildi.
Sonraki 3 dk. boyunca-----4 ml RPMI 1640 yavaşça eklendi.
Sonraki 2 dk. boyunca-----5 ml RPMI 1640 yavaşça eklendi.
Tüp tamamen RPMI 1640 ile dolduruldu. 700 rpm.’de 5 dakika oda sıcaklığında
santrifüj edildi. Süpernatant atıldı ve hücre pelleti 35 ml HT medyum ile süspanse
edildi. Hücre süspansiyonu 37°C’de, %5 CO2 ve %98 nemli CO2 inkübatörde 30 dk.
inkübasyona bırakıldı.
Şekil 3.8 Füzyon sonrası hücrelerin kültürdeki durumu (20X)
3.2.11 Füzyon Yapılan Hücrelerin Ekimi ve Kültürü
İnkübatörden alınan hücre süspansiyonu resüspanse edilerek 24 saat öncesinden 1x104
fare peritonal makrofajları ekilmiş 96 kuyucuklu plakların iç taraftaki 60 kuyucuğun her
birine 100 μl hücre süspansiyonu olacak şekilde eklendi. Dışarıdaki 36 kuyucuk
antibiyotikli PBS ile doldurularak 37°C, %5 CO2 ve %98 nemli CO2 inkübatörde
inkübasyona bırakıldı. Kültürün 5. günü 100 μl HAT medyum her bir kuyucuğa eklendi.
49
Kültürün 5. gününden sonra hibrid hücrelerin HAT besiyerinde küçük koloniler
şeklinde bölünerek gelişmeye başladıkları gözlendi (şekil 3.9).
Şekil 3.9 5 gün sonra hücrelerin HAT içeren kültürdeki durumu (20X)
Kültürün 7. günü her bir kuyucuktan 100 μl alındı ve taze 100 μl HAT medyum eklendi.
Bu kısım hibrid hücreler yüzeyin %10-50’sini kaplayana kadar tekrar edildi.
Gelişimlerini sürdüren hibrid hücrelerin HAT medyumunda 2 hafta boyunca kültürleri
devam ettirildi. 2 hafta sonra besiyeri HT medyumu ile değiştirildi. Hibrid’ler klonlama
prosedürleri tamamlanana kadar HT besiyeri ile büyütüldü. Füzyon sonrası elde edilen
monoklonal antikor üreten hibrid hücrelerin belirlenmesi için indirekt ELISA yöntemi
kullanıldı.
Şekil 3.10 Hücrelerin 10 gün sonra kültürdeki durumu (20X)
50
3.2.12 Sınırlayıcı Sulandırma Yöntemi ile Hibridoma Hücre Hatlarının Alt
Klonlarına Ayrılması
ELISA yöntemiyle pozitif reaksiyon veren ve monoklonal antikor ürettiği belirlenen
hibrid hücrelerin tek klondan oluşan soyunu elde etmek için klonlanacak hibridoma
hücreleri kuyucuk başına 0.8 hücre düşecek şekilde hesaplanarak HT besiyeri ile
seyreltildi. İlk adımda ml’de 8 hücre olacak şekilde 100 μl dilüsyon ilave edildi (0.8
hücre/kuyucuk). Bunu takiben diğer bir plağa da ml’de 80 hücre olacak şekilde 100 μl
dilüsyon ilave edildi (8 hücre/kuyucuk). Bu dilüsyon, yapılan istatistiki çalışmalara göre
kuyucukların %36’sında kuyucuk başına 1 hücrenin düşmesini sağlar [182]. Ardından
sınırlayıcı sulandırma ile seyreltilen hücre süspansiyonlarına J774 ile 48 saat inkübe
edilmiş kültür süpernatantları %25 oranında eklenerek 48 kuyucuklu plaklara 0,3 ml
olacak şekilde aktarıldı ve 37°C, %5 CO2 ve %98 nemli CO2 inkübatörde inkübe edildi.
İnkübasyonun 6. gününde, kuyucuk başına 150 μl olacak şekilde %25 J774 süpernatantı
ilaveli taze besiyeri eklendi. Bundan sonraki hergün her kuyucuktan 150 μl eski besiyeri
alınarak yerine 150 μl taze besiyeri ilave etmek suretiyle hücreler yeniden beslendi.
Tam olarak kalıcı hücre hattı elde edildiğinde, hibrid hücrelerin kültürü myeloma hücre
hattına benzer şekilde RPMI 1640 besiyerinde büyük ölçeklerde (25 cm2, 75 cm2 flask)
sürdürüldü (şekil 3.11) ve hücreler daha sonra sıvı nitrojen tankında saklandı.
Şekil 3.11Hibridoma kültürünün büyük ölçekli kültürdeki durumu (20X)
51
3.2.13 Hibridoma Hücre Hatlarının Dondurulması ve Geri Kazanımı
3.2.13.1 Hibridoma Hücre Hatlarının Dondurulması
Sınırlayıcı sulandırma çalışmalarından önce ELISA pozitif sonuç veren kuyulardaki ve
daha sonraki çalışmalarda büyük ölçeğe alınan hibridoma hücreleri pipetle steril
santrifüj tüplerine aktarılıp +4C’ de 1000 rpm’de 5 dk., santrifüj edildi. Santrifüj edilen
tüplerdeki pellet süspanse edildi ve son hacime eşit miktarda, %20 DMSO içeren
dondurma solüsyonu yavaşça ilave edilerek kriyo tüplere aktarıldı. Kriyo tüpler +4C’
de 1 saat, – 20C’ de 2 saat kaldıktan sonra, – 40C derin dondurucuda 24 saat
bekletildi, 24 saat sonunda sıvı nitrojen tankına aktarıldı.
3.2.13.2 Hibridoma Hücre Hatlarının Kriyobanktan Çıkarılması
Hücreler 37°C su banyosunda hızlı bir şekilde çözündürüldü. Kriyotüplerin üst kısmı
alkollü bir bez ile iyice temizlendi. Daha sonra hücreler 15 ml’lik santrifüj tüplerine
aktarılarak üzerlerine 37°C’de ısıtılan RPMI 1640 besiyerinden 5 ml ilave edildi.
Hücreler daha sonra 700 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve
pellete 5 ml RPMI 1640 eklenerek hücreler yeniden süspanse edildi. Süspanse hale
getirilen hücreler 25 ve 75 cm2’lik kültür flasklarına transfer edildi ve 37°C’de %5 CO2
ve %98 nem içeren etüvde inkübe edildi.
3.2.14 Üretilen Antikorların Western Blot Yöntemiyle Antijen Spesifikliğinin
Belirlenmesi
3.2.14.1 SDS-Page Jel Elektroforezi
Sınırlayıcı sulandırma yöntemi ile alt klonlarına ayrılan hibridoma hücre hattının
ürettiği antikorların L. infantum parazitlerinde hangi proteine karşı reaksiyon verdiğinin
saptanması amacıyla antikorlara western blot yöntemi uygulandı. Öncelikle jelin
döküleceği camlar %70 alkol ile temizlendi ve jel kaseti hazırlandı. Önce jelin ayırıcı
kısmı çizelge 3.2’de belirtilen miktarlarda hazırlanarak kasete döküldü ve hava ile
teması engellemek üzere jel yüzeyi 1 ml distile su ile kapatıldı. Polimerizasyon
tamamlandıktan sonra yüzeydeki su uzaklaştırıldı ve üzerine yine çizelge 3.2’de
belirtilen miktarlarda hazırlanmış yükleme jeli dökülerek tarak yerleştirildi.
52
Çizelge 3.2 SDS-PAGE yöntemi için dökülecek jelerin hazırlanışı
%12’lik ayırıcı jel
%4lük Yükleme jeli
Saf Su
4.65ml
7.35 ml
3M Tris-HCl pH 8.8
1.25 ml
-
1.5M Tris-HCl pH6.8
-
1,25 ml
%10(ağırlık/hacim) SDS
0.1 ml
0,1 ml
Akrilamid/Bisakrilamid (%29,2/%0.8 4.0ml
1.34 ml
ağırlık/hacim)
%10 amonyum persülfat (APS)
0,05ml
0.04 ml
TEMED
7µl
15µl
Polimerizasyon sonunda tarak dikkatlice çıkarıldı ve jel distile su ile yıkanarak
elektroforez aletine (Hoefer) yerleştirildi ve sistem yürütme tamponu ile dolduruldu. Örnek
yüklenmeden önce tüm cepler yükleme tamponuyla yıkandı.
Western Blot testinde kullanılacak promastigotlar kültür ortamından alınarak sayımı
yapıldı. Ardından 3x108 kadar L. infantum promastigotu 2000 rpm 8 dk. santrifüj edildi.
Promastigotlar sıvı nitrojen tankında 5 kez dondurulup çözüldükten sonra 10.000 rpm
15 dk santrifüj sonrası ayrılan supernatantın UV spektrometrede protein miktarları
ölçülerek kuyu başına 30 ug protein düşecek şekilde 1:1 oranında örnek yükleme
tamponu ile karıştırılıp 5 dakika boyunca 100°C’de denatüre edildi. Denatüre edilen
örnekler jeldeki her bir kuyucuğa 30 ul kadar yüklendikten sonra yaklaşık 40 dk. 200
voltta elektroforez işlemi gerçekleştirildi. Bromofenol mavisine ait bant jelin alt
kenarına ulaştığında akım kesildi ve jel elektroforez tankından ve kasetten ayrılarak
blotlama işlemleri için hazırlandı.
3.2.14.2 Western Blotlama
1
Örneklerin bulunduğu jel metanol içerisinde bekletilerek doyuruldu. Ardından jel ile
aynı boyutlarda olmak üzere 6 adet 3M whatman kağıdı ve bir adet PVDF membran
kesildi ve transfer tamponu içerisinde bir süre bekletilerek doyuruldu. Blotlama cihazına
sırasıyla transfer tamponu ile ıslatılmış 3 adet whatman kağıdı, jel, membran ve en üste
tekrar 3 adet whatman kağıdı arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde konularak sistem
hazırlandı. Blotlama yapılacak jelin alanı cm2 cinsinden hesaplanarak 0,8 ile çarpıldı ve
bulunan rakam güç kaynağına miliamper cinsinden yazıldı. 30 dk. kadar blotlama işlemi
uygulanarak proteinler PVDF membrana aktarıldı. Blotlama işleminden sonra PVDF
53
membrana markerların geçip geçmediği kontrol edilerek membran sistemden ayrıldı.
Transfer sonrası proteinlerin bağlanmış olduğu membran 1.5 saat bloklama tamponu
içinde çalkalamaya bırakıldı. Bu süre sonunda membran 3 kez PBS-tween 20 tamponu
ile 15’er dakika boyunca yıkandı. Ardından membran hibridoma hücre kültür
süpernatantı ile l saat çalkalamaya bırakıldı. Ardından membran 3 kez PBS-tween 20
tamponu ile 15’er dakika süre ile tekrar yıkandı. Membran bloklama çözeltisi içinde
1:1000 oranında dilüe edilmiş alkalen fosfataz (AP) antikor ile 1 saat oda sıcaklığında
inkübe edildi. Bu süre sonunda membran 3 kez kez PBS-tween 20 tamponu ile 15’er
dakika süre ile yıkandı. AP işaretli sekonder antikor taşıyan spesifik bantları içeren
membran üzerine substrat tamponu (Thermo Lumi-phos) eklenrek 3-5 dakika beklendi.
Mavi renk oluşumu gözlenen bant kısımları L. infantum antijen tespiti için incelemeye
alındı.
3.2.15 Antikor İzotiplerinin Belirlenmesi
Üretilen antikorların izotiplerinin belirlenmesi bir sonraki aşama olan saflaştırma
yönteminin belirlenebilmesi için gerekli olmaktadır. Bu amaçla elde edilen monoklonal
antikorun izotipinin belirlenmesi için hibridoma hücre kültür süpernatantı 1:50 oranında
sulandırılarak fare immunoglobulin Subisotyping Kit (Thermoscientific) içerisindeki
her alt izotipe özgü (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA ve IgM) anti-immünoglobulin
emdirilmiş striplerin bulunduğu kasetlerdeki örnek haznelerine eklendi. 5-10 dakika
beklendikten sonra kasetlerde bir adet kontrol “C” hizasında ve bir adet antikorun ait
olduğu alt sınıf adının (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA veya IgM) yazılı olduğu bölgenin
hizasında iki adet kırmızı bant oluşumu ile alt izotipler belirlendi.
3.2.16 Monoklonal Antikorların Saflaştırılması
Büyük ölçekte üretilen hibridoma hücrelerinden antikor saflaştırılması amacıyla hücre
kültür üst sıvıları 1500 rpm’de santrifüj edildikten sonra süpernatant 0,45 μm’lik filtre
(Millipore) ile süzülerek +4ºC’de saklandı.
3.2.16.1 Amonyum Sülfat Çöktürmesi
Hücre kültür ortamından toplanan supernatantın üzerine +4ºC’de, bir karıştırıcı üzerinde
doygun amonyum sülfat çözeltisi hacimce %33 olacak şekilde 30 dk.’lık süre içerisinde
eklendi. Bir gece +4ºC’de karıştırıldıktan sonra 12.000 rpm’de 30 dk. +4ºC’de santrifüj
54
edildi. Pellet 20 ml PBS ile çözüldü ve iki gün boyunca PBS tamponu periyodik olarak
değiştirilerek +4ºC’de diyaliz edildi.
3.2.16.2 Protein G İmmün Afinite Kolon Kromatografisi
Hibridoma hücrelerinin ürettikleri monoklonal alt izotipleri belirlendikten sonra, immün
afinite kolon kromatografisi ile saflaştırma aşamasına geçildi. Protein G afinite kolonu
(Sigma) ilk önce 100 ml bağlama tamponu ile yıkandı. Hibridoma hücre kültürü
ortamından amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz ile saflaştırılan hibridoma üst sıvısı
0,45 μl’lik filtreden (millipore) geçirildikten sonra ileri saflaştırma için kolon içerisine
yüklendi. Ardından kolon bağlama tamponu ile tekrar doldurularak fraksiyonlar 1’er
ml’lik eppendorf tüplere toplandı. Tüplerin absorbans 280 nm’deki değerleri ölçülerek
değer 0 olduğunda kolon eleme tamponu ile yüklendi. Bağlı antikorların kolondan
çıkmasını sağlayan eleme tamponu tüplerin absorbans değeri tekrar 280 nm ‘yi
gösterinceye kadar içlerinde 100 μl dengeleme tamponu içeren eppendorf tüplerde 1’er
ml olacak şekilde toplandı. Toplanan fraksiyonlar ELISA ile test edilerek antikor
bulunan tüpler saptandı. Ardından saflaştırılan monoklonal antikorlar %0.02’lik
(ağırlık/hacim) sodyum azid (NaN3) içerisinde -20ºC’de saklandı.
55
BÖLÜM 4
DENEYSEL SONUÇLAR
4.1 İmmünizasyon Kontrolleri
4.1.1 Birinci Füzyon Çalışmaları İçin İmmünize Edilen Farelerin Antikor Yanıtları
Füzyon deneylerinde kullanılan Balb/c farelerin L. infantum tüm promastigot lizat
antijenleri ile ikinci immünizasyonlarından sonra, indirekt ELISA testi ile ölçülen
immün cevap seviyeleri şekil 4.1’de verilmiştir.
1,2
1
OD 405 nm
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrol 1. Fare
2. Fare
3. Fare
4. Fare
5. Fare
Şekil 4.1 İkinci immünizasyon sonrası Balb/c farelerin immün cevap seviyeleri
Şekil 4.1’de görüldüğü gibi immünize edilen tüm farelerin kuyruklarından alınan
serumların 1/600 sulandırımda yapılan indirekt ELISA test sonuçlarına göre immünize
edilen farelerden alınan antikor seviyesi kontrole göre daha yüksektir. Bu da
immünizasyonların başarılı bir şekilde gerçekleştiğini göstermektedir. Ancak en yüksek
56
immün cevap 2 nolu farede belirlendi. Ayrıca 4 nolu farede de yüksek bir antikor cevabı
olduğu da belirlenmiştir. Bu nedenle monoklonal antikor eldesi için en yüksek antikor
seviyesinin görüldüğü 2 nolu fare seçilmiş ve füzyon deneylerine bu hayvan ile devam
edilmiştir. Daha sonraki deneylerde de yine immunizasyon durumlarına göre fare
seçimleri yapılmış, deney gruplarının tamamında immunizasyon oluşmasına rağmen
yine de en yüksek cevabı veren fare tercih edilmiştir.
4.1.2 İkinci Füzyon Çalışmaları İçin İmmünize Edilen Farelerin Antikor Yanıtları
İkinci füzyon çalışmaları için daha önceden immünize edilen Balb/c fareleri L. infantum
tüm
lizat
antijenleri
ile
immünize
edilmeye
devam
edilmiş
ve
dördüncü
immünizasyonlardan sonraki antikor seviyeleri şekil 4.2’de verilmiştir.
1,8
1,6
1,4
OD 405 nm
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrol
1.Fare
3. Fare
4. Fare
5.Fare
Şekil 4.2 Dördüncü immünizasyon sonrası Balb/c farelerin immün cevap seviyeleri
Şekil 4.2 ‘de farelerden alınan serumların 1/600 sulandırmalarında gerçekleştirilen test
sonuçlarına göre farelerin tümünde immün yanıt oluştuğu görülmektedir. L. infantum
tüm antijen lizatına karşı ELISA sonrasında 4 nolu fareden (OD405 = 1,58) en iyi
immün cevap alınarak ikinci füzyon deneylerinin sonraki adımları için seçildi ve füzyon
çalışmaları için hazırlandı.
57
4.2 Füzyon Sonuçları
4.2.1 Birinci Füzyon Sonuçları
L. infantum promastigotlarına özgü monoklonal antikor elde edilmesi için farelerin
dalaklarından alınan B hücreleri myeloma hücreleri ile PEG 4000 (sigma) varlığında
füzyona uğratıldı. Seçici besiyerinde üreme gerçekleşen kuyulara ELISA testi
uygulandı. Test sonuçları şekil 4.3 ve şekil 4.4’ de gösterilmektedir.
1,6
1,4
1.füzyon
OD 405 nm
1,2
1
1A
0,8
1B
0,6
1C
0,4
1D
1E
0,2
1F
0
1G
1H
1. Plak
Şekil 4.3 Birinci füzyon birinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum antijenine
karşı gösterdikleri antikor cevapları
Şekil 4.3 ‘de birinci füzyon sonucu elde edilmiş birinci plaktaki hibridoma hücrelerinin
L. infantum antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları görülmektedir. ELISA testi
ile antikor oluşumu tespit edilen 14 kuyudaki hibridoma hücreleri büyük ölçekli kültüre
alındı.
58
1.füzyon
1,4
OD 405 nm
1,2
1
2A
0,8
2B
0,6
2C
0,4
2D
0,2
2E
0
2F
2G
2H
2.Plak
Şekil 4.4 Birinci füzyon ikinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum antijenine
karşı gösterdikleri antikor cevapları
Birinci füzyon sonucu elde edilmiş ikinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum
antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları görülmektedir. ELISA testi ile antikor
oluşumu tespit edilen 20 kuyudaki hibridoma hücreleri büyük ölçekli kültüre alındı.
Birinci füzyon sonunda 187 hibrid oluşumu gözlenen kuyudan antikor aktivitesine sahip
34 kuyu belirlendi. Bu 34 kuyudan en yüksek antikor cevabını veren kuyular arasından
antikor salgılamaya devam eden 1 kuyu seçilerek sınırlayıcı sulandırma, Western Blot
ve çapraz reaksiyon işlemleri için büyük ölçekte kültüre alındı. Füzyon sonuçları çizelge
4.1’de görülmektedir.
Çizelge 4.1 Birinci füzyon sonuçları (*1C2; 1. plak, C-2. kuyu)
Lenfosit hücresi
108
Myeloma hücresi
107
Çalışılan kuyu sayısı
360
Hibridoma oluşan kuyu sayısı
187
Antikor aktivitesi veren kuyu sayısı
34
L.
infantum
antijenine
özgü
Oluşan 1C2*
monoklonal antikor
59
4.2.2 İkinci Füzyon Sonuçları
L. infantum promastigotlarına özgü monoklonal antikor elde edilmesi için
immünizasyonlarına devam edilen farelerin 4. immünizasyon sonrası ikinci füzyon
deneyleri gerçekleştirilmiş ve seçici besiyerinde (48 kuyulu plakta) üreme gerçekleşen
kuyulara indirekt ELISA testi uygulandı. Sonuçları şekil 4.5 ve şekil 4.6’da
gösterilmektedir.
2.Füzyon
1,6
1,4
OD 405 nm
1,2
1
1A
0,8
1B
0,6
1C
0,4
1D
0,2
1E
1F
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Pozitif Negatif
Kontrol Kontrol
1.Plak
Şekil 4.5 İkinci füzyon birinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum antijenine
karşı gösterdikleri antikor cevapları
Şekil 4.5’ de ikinci füzyon sonucu elde edilmiş birinci plaktaki hibridoma hücrelerinin
L. infantum antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları görülmektedir. ELISA testi
ile antikor oluşumu tespit edilen 7 kuyudaki hibridoma hücreleri büyük ölçekli kültüre
alındı.
60
2. Füzyon
1,6
1,4
OD 405 nm
1,2
1
2A
0,8
2B
2C
0,6
2D
0,4
2E
0,2
2F
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Pozitif Negatif
Kontrol Kontrol
2. Plak
Şekil 4.6 İkinci füzyon ikinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum antijenine
karşı gösterdikleri antikor cevapları
İkinci füzyon sonucu elde edilmiş ikinci plaktaki hibridoma hücrelerinin L. infantum
antijenine karşı gösterdikleri antikor cevapları görülmektedir. ELISA testi ile antikor
oluşumu tespit edilen 5 kuyudaki hibridoma hücreleri büyük ölçekli kültüre alındı.
İkinci füzyon sonunda 46 hibrid oluşumu gözlenen kuyudan gerçekleştirilen ELISA
testleri sonucu yüksek antikor aktivitesine sahip 12 kuyu seçildi ve bu kuyuların
kültürleri büyük ölçeğe alındı. Bu 12 kuyudan en yüksek antikor cevabını veren ve
antikor salgılamaya devam eden 2 kuyu seçilerek sınırlayıcı sulandırma, Western Blot
ve çapraz reaksiyon işlemleri için büyük ölçekte kültüre alındı. Füzyon sonuçları çizelge
4.2’de görülmektedir.
Çizelge 4.2 İkinci füzyon sonuçları(*1C3; 1. plak, C-3. kuyu, 2B2; 2. plak, B-2. kuyu)
Lenfosit hücresi
108
Myeloma hücresi
107
Çalışılan kuyu sayısı
96
Hibridoma oluşan kuyu sayısı
46
Antikor aktivitesi veren kuyu sayısı
12
L.
infantum
antijenine
özgü
oluşan 2(1C3, 2B2)
monoklonal antikor
61
4.3 Çapraz Reaksiyon Sonuçları
Şekil 4.7’de göründüğü gibi 1(1C3) klonun L. infantum promastigotlarına karşı yüksek
spesifiklik gösterdiği saptandı. Elde edilen monoklonal antikorların BSA, fare serumu
ve süt tozu gibi antijenik yapılara karşı antikor cevabı göstermediği tespit edildi. Bu da
elde edilen antikorların çapraz reaksiyonlarının olmadığını göstermektedir. Çapraz
reaksiyon testleri sonucu L. infantum promastigotlarına özgü monoklonal antikor üreten
üç klon (1C2, 1C3 ve 2B2) dan 1C3 klonu saflaştırma ve izotip analizi işlemleri için
büyük ölçekte kültüre alındı. Diğer klonlar dondurma işlemleri gerçekleştirilerek sıvı
azot içerisinde saklandı.
1,6
1,4
OD 405 nm
1,2
1
1C2
0,8
1C3
0,6
2B2
0,4
0,2
0
Şekil 4.7 Genişletilen klonların diğer proteinlerle çapraz reaksiyon testlerinin indirekt
ELISA testi ile 405 nm ‘de değerlendirilmesi
4.4 Western Blot Sonuçları
Büyük ölçekte üretilen 1C3 klonunun ürettiği antikorun L. infantum antijen spesifikliği
Western Blot yöntemi ile belirlendi. Şekil 4.8’de görüldüğü üzere 1C3 klonunun ürettiği
antikorlar L. infantum 15 kDa proteinine karşı reaksiyon verdiği görülmektedir.
62
Şekil 4.8 1C3 Monoklonal antikorunun L. infantum tüm hücre lizat antijenine karşı
gösterdiği spesifikliğin western blot analizi ile gösterilmesi
4.6 Monoklonal Antikorların Saflaştırılması
L. infantum promastigot antijenlerine özgü monoklonal antikor üreten 1C3 klonu büyük
ölçekte üretildikten sonra saflaştırma işlemleri için antikor alt tipi belirlendi (şekil 4.9).
Şekil 4.9 1C3 klonunun ürettiği antikorların izotipinin belirlenmesi
Şekil 4.9’da görülen kontrol bölgelerinde (C) ve izotipin ait olduğu bölgede daha koyu
olarak görülen renk değişimi, antikor tipinin IgG1 alt sınıfına ait olduğunu
göstermektedir.
IgG1 alt sınıfına ait olduğu tespit edilen monoklonal antikorları içeren hücre kültür
süpernatantları toplanarak amonyum sülfat ile çöktürüldü, dializleri gerçekleştirildi ve
protein G immünafinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Kolon sonrası toplanan
fraksiyonların 280 nm dalgaboyunda absorbansları ölçülerek içerdiği protein varlığı
şekil 4.10’da gösterilmektedir. Şekilde görüldüğü gibi 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, tüpler ve
26, 27, 28. tüplerde protein varlığı tespit edildi.
63
0,6
OD 280 nm
0,5
0,4
0,3
OD 280
0,2
0,1
0
1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Şekil 4.10 Kolon sonrası toplanan tüplerin UV spektrofotometrik olarak protein
içeriklerinin ölçülmesi
Kolon sonrası toplanan fraksiyonların saflaştırılan antikor aktiviteleri açısından
değerlendirilmesi ELISA yöntemi ile 405 nm’de yapıldı. ELISA sonuçları şekil 4.11’de
görülmektedir.
1,4
1,2
OD 405
1
0,8
0,6
OD 405
0,4
0,2
0
1
3
5
7
9
11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Tüp No
Şekil 4.11 Protein verlığı görülen tüplerin L. infantum parazitlerine karşı antikor
spesifikliğinin indirekt ELISA yöntemi ile belirlenmesi
64
Şekil 4.11’de görülen ELISA sonuçlarına göre 26. 27. ve 28. tüpler L. infantum
promastigot antijenlerine özgü antikor aktivitesine sahip ve protein içeriği bakımından
zengin bulundu. Bu antikorları üreten hücre hatları kriyobankta dondurularak saklandı.
Bu tüplerden yaklaşık 1,5 mg protein elde edilerek -20°C’de saklandı.
65
BÖLÜM 5
SONUÇ ve ÖNERİLER
Leishmaniasis dünyada 88 ülkede görülen ve bu ülkelerde yaşayan milyonlarca kişiyi
tehdit eden bir hastalık olup hali hazırda yaklaşık 12 milyon kişinin bu parazit ile
enfekte olduğu ve her yıl bu sayıya 500,000 kişinin eklendiği tahmin edilmektedir [87].
Bildirilen bu olgulardan yaklaşık her yıl 50,000 kişi VL nedeniyle hayatını
kaybetmektedir. [4]. Ülkemizde ise VL’nin Ege, Akdeniz ve Orta Anadolu bölgelerinde,
KL’nin ise Güney-doğu ve Akdeniz bölgelerinde endemik olarak görüldüğü
bildirilmiştir. Ülkemizde bu alanlarda yaklaşık 20 milyon insan enfeksiyon riski altında
yaşamaktadır [92], [93], [94], [95]. VL asemptomatik veya sub-klinik formlardan akut,
sub-akut veya mononükleer fagosit sistemin tamamen enfekte olduğu ölümcül kronik
formlara varıncaya kadar çok geniş bir enfeksiyon tablosu ortaya koymaktadır.
Leishmaniasisin klinik tanısında ise malarya, tropikal splenomegali sendromu,
sistozomyas, siroz, afrikan tripanasoma, miliyer tüberkülozu, bruselloz, tifo, bakteriyel
endokarditis, lenfoma ve lösemi gibi hastalıklardan klinik belirtilerinin benzer olması
nedeniyle ayırıcı tanısı konulması gerekmektedir [37]. Visseral leishmaniasisin
belirtildiği gibi klinik açıdan spesifikliğinin bulunmaması tanısı konulamayan hastaların
yanlış tedavisinin önüne geçebilecek onaylayıcı laboratuvar testlerini gerekli hale
getirmektedir. Ayrıca bu test sistemlerinin ucuz ve uygulanabilir olması önemlidir [88].
Bugüne kadar leishmaniasis tedavisinde seroloji temelli tanı sistemleri geliştirilerek
başarıyla uygulanmaktadır. Leishmaniasisin serolojik olarak tanısının koyulması
amacıyla geliştirilmiş teknikler serolojik yöntemlerin ana prensibine bağlı olarak olarak
iki ana başlıkta toplanmaktadır. Bunlar; Leishmania spesifik antijen temelli ve
Leishmania spesifik antikor temelli saptama yöntemleridir. Leishmania spesifik antikor
belirleme sistemleri içerisinde rk39 Leishmania hücre yüzey antijeni temelli strip test
66
sistemi ucuz, elde edilebilir ve saha tanısında kullanımı kolay olan bir test sistemi
olarak öne çıkmaktadır. Fakat bütün Leishmania türlerinde ortak olarak bulunan 230
kDa’lık LcKin proteininin 39 aminoasitlik tekrar bölgesi olan rk39 antijeni sadece L.
chagasi ve L. donovani türlerinde yüksek oranda korunmuş olarak bulunmaktadır [183].
Dolayısıyla L. infantum parazitlerine karşı rk39 strip test sisteminin duyarlılığı
tartışmalı bir konudur. Bunun yanı sıra hastadaki yükselmiş antikor seviyelerini saptama
temelli tanı sistemleri non-spesifik metotlar olarak uygulanmakta ve konağın durumuna
göre pozitif değer verebilmektedir. Spesifikliğin yüksek olmadığı bu sistemlerde aynı
zamanda yanlış pozitiflikle sonuçlanan geniş bir duyarlılık ölçeği de görülmektedir
[174], [175]. Bu gibi özellikleri antikor saptama temelli tanı sistemlerini güvenilemez
hale getirmektedir. Primer ve sekonder monoklonal antikorlar kullanılarak tanı
koyulmasına dayanan antijen belirleme temelli serolojik yöntemler ise spesifik
yöntemler olarak avantaj sağlamaktadır [177], [178]. Ayrıca antijen saptama temelli tanı
sistemlerinin enfeksiyonun henüz başlamadan, hastada tayin edilebilmesine olanak
sağladıkları rapor edilmiştir [179]. Ancak leishmaniasisin tanısında kullanılmak üzere
geliştirilen bu tanı kitleri genellikle yurt dışından ithal edilmekte ve bu da ülke
ekonomisine fazladan bir külfet oluşturmaktadır. Bu gibi sorunları aşmak amacıyla
konu ile ilgili ülkemizde yapılan çalışmalar da oldukça yetersizdir. Şu ana kadar konu
ile alakalı ülkemizde sadece 1 tıpta uzmanlık tezi tamamlanabilmiş ve bu çalışmada da
KL etmeni olan L. tropica’ya karşı monoklonal antikor üretilmiştir. Erken teşhisine
daha çok ihtiyaç duyulan ve zamanında tanısı konulup tedavi edilmezse ölüme neden
olan VL’e karşı ise ülkemizde konu ile alakalı hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Bu tez
çalışmasında ilk kez olarak VL’in tanısında kullanılmak üzere hibridoma teknolojisi ile
L. infantum 15 kDa antijenine karşı monoklonal antikor üreten hücre hattı elde edilmiş
ve ürettiği antikor karakterize edilmiştir.
Hedefe ulaşmak için aşağıdaki çalışmalar gerçekleştirilmiştir;

Monoklonal antikor üretimi; farelerin seçimi, antijen seçimi ve işlenmesi, adjuvan
seçimi ve immünizasyon şekli ve miktarı gibi birçok kritik safha içermektedir. Bu
çalışmada B lenfosit donörü olarak dişi Balb/c fareleri, myeloma hücresi olarak da dişi
Balb/c fareden elde edilmiş P3-X63-Ag8.653 myeloma hücreleri seçilmiştir. Çalışmada
kullanılan Freund adjuvanı güçlü immün stimülan özellik gösteren, hümoral cevabı
indükleyen ve immünizasyonlarda uygun bir adjuvan olarak görülmektedir. Bunun
sebebi Freund adjuvanı ile immünize edilen hayvanlarda bu immün cevabın çok uzun
67
süreler korunduğu ve içeriğindeki mikobakteri lizatının T hücrelerini aktifleştirerek B
hücrelerinin stimülasyonunu ve olgunlaşmasını indüklediğinin bilinmesidir [184].

6-8 haftalık Balb/c fareler çözünebilir L. infantum promastigot lizatı ile 4 kez 100 µg
intraperitonel ve sonraki immünizasyon için ise 50 µg antijen ile intraperitonel ve
intravenöz olarak immünize edildi. Çözünebilir parazit antijenlerinin saf antijen
immünizasyonlarına göre çok daha yüksek miktarlarda kullanılması (~100 µg) ise
antijenlerin immünojenliklerini artırması bakımından önemlidir [182]. Şekil 4.1’deki
immünizasyon sonuçlarına bakıldığında ise ikinci immünizasyonlar sonucu yapılan
kontrollerde hayvanlardan elde edilen 1/600 oranında sulandırılmış serumların 0,3891,083 OD (405 nm) değerleri arasındaki absorbans değerleri alınarak birinci füzyon
deneyleri gerçekleştirilmiştir. Şekil 4.2’de görülen dördüncü immünizasyon sonuçlarına
bakıldığında ise deney gruplarından 1/600 sulandırımda 0,932-1,578 (OD 405) arasında
absorbans değerleri alınarak ikinci füzyon deneylerine geçilmiştir. Birinci ve ikinci
füzyon deneylerinin sonunda gerçekleştirilen indirekt ELISA test sonuçlarını gösteren
şekil 4.3, şekil 4.4, şekil 4.6 ve şekil 4.7’de görüldüğü üzere 3 füzyon kuyusunun ( 1C2,
1C3, 2B2) L. infantum tüm promastigot antijenine karşı yüksek absorbans değeri verdiği
görülerek bu kuyuların kültürleri genişletilmiş ve bir kısmı dondurulmuştur.

Pozitif sonuç alınan kuyuların sınırlayıcı sulandırım çalışmalarında ise L. infantum
spesifik monoklonal antikor üretilmesinde ilk kez olarak sınırlı sulandırım yönteminde
hibridoma klonlarının gelişimleri, farelerden alınan peritonel hücreler yerine J774 hücre
hattı metaboliti ile desteklenmiştir. Bu teknik 1986 yılında Deborah ve Carolyn [180]’
in peritonel makrofajların yerine fare monosit tümör hücre hatlarının süpernatantlarının
hibridoma hücre kültürlerini desteklemede kullanılabileceğinin göstermeleri ile
hibridoma çalışmalarında besleyici hücrelerin elde edilmesi amacıyla gereksiz yere fare
öldürülmesinin önüne geçilebileceğine dair umut verici bir gelişme olmuştur. Bu
bilgilerin ışığında bu tezde yaptığımız çalışma dahilindeki füzyon çalışmalarımızda
gereksiz yere fare öldürülmesinin önüne geçilmesi, farelerden peritonel makrofaj
hücrelerinin izolasyonu sırasında açığa çıkabilecek kontaminasyon risklerinin önüne
geçilmesi ve büyük ölçek üretim yapılabilmesinin önündeki engellerden biri olan
devamlı destekleyici hücre gerekliliğinin kaldırılması amacıyla L. infantum spesifik
hibridoma hücrelerinin desteklenmesinde J774 makrofaj hücre kültür metabolitinin
seçici besiyeri (HAT) içerisinde %25 oranında kullanılabileceğini gösterdik.
68

Ardından yapılan çalışmalar L. infantum’a karşı geliştirildiği düşünülen monoklonal
antikorların çapraz reaksiyonlar açısından kontrol edilmesi aşamasıdır. Çapraz
reaksiyonlarda kullanılan yağsız süt tozu, BSA ve fare serumundaki diğer proteinlerin
ELISA çalışmalarında yanıltıcı sonuçlar verebileceği düşünülerek çapraz reaksiyon
testleri gerçekleştirilmiş ve şekil 4.7 de görüldüğü gibi L. infantum promastigot tüm
antijenine göre yaklaşık 6-7 kat daha düşük absorbans değerleri alınarak çapraz
reaksiyon vermedikleri tespit edilmiştir.

Çapraz raksiyonları gerçekleştirilen 1C3 klonunun ürettiği antikorların immunoglobulin
tipinin belirlenmesi saflaştırma sırasında izelenecek yöntemler için gerekmektedir.
Antikorların alt izotipleri sub-izotipleme kiti ile belirlenmiştir. 1C3 monoklonal
antikorunun izotipleri IgG1 olduğu yapılan gözlemler sonucu görülmüştür (Şekil 4.9).
Üretilen IgG antikorlarının bağlanma kapasitesi açısından ise IgM tipi antikorlardan
daha spesifik olmalarıyla göze çarpmaktadır. Böylece primer ve sekonder antikor olarak
IgG antikorlarının kullanılması IgM kaynaklı yanlış pozitif sonuçların önüne
geçilebilmesine de olanak sağlayacaktır.

Elde edilen 1C3 monoklonal antikorunun protein spesifikliğinin belirlenmesi amacıyla
gerçekleştirilen western blot analizi sonucunda ise 1C3 klonunun L. infantum 15 kDa
antijenine karşı reaksiyon verdiği saptanmıştır (şekil 4.8).

Elde edilen monoklonal antikorların saflaştırılması işlemlerine gelindiğinde 1C3 klonu
büyük ölçekli kültüre alınmış ve 150 ml kadar hücre kültür süpernatantı biriktirilerek
amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve protein G afinite kromatografisi gibi
saflaştırılma işlemleri gerçekleştirilmişir. Saflaştırma işlemleri sonrası gerçekleştirilen
UV spektrofotometre analizlerinde 1-16. tüpler arasında kolondan elenen proteinlerin
göstermiş olduğu absorbans değerleri, 26, 27 ve 28. tüplerde ise kolonda tutulan
antikorların absorbans değerleri (0,47 ile 0,38 arası) şekil 4.10’da görülmektedir.
Spektorofotometre analizi sonrası fraksiyon içerikleri ile gerçekleştirilen ELISA testi
sonuçlarına göre (Şekil 4.11) ise 26, 27 ve 28. tüplerin antikor içerikleri bakımından
yüksek olduğu görüldü.
Sonuç olarak bu çalışmada ülkemizde ilk kez olarak L. infantum’a karşı monoklonal
antikor üreten hücre hattı elde edildi ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirilerek
kriyobankı oluşturuldu. Ayrıca leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisinde kullanılan
sürecin in vitro hale getirilmesi için ilk kez olarak fare periton makrofajları yerine J774
69
metabolitlerinin
kullanılmasının
uygun
olacağı
gösterildi.
Bunun
en
büyük
avantajlarından birisi de kontaminasyon olasılığının giderilmesine ve aynı zamanda
ekonomik ve etik olarak boş yere fare kullanılmasının önüne geçebilmesidir. Ülkemizde
VL’e karşı ilk kez elde edilen bu monoklonal antikorlar ileride çeşitli enzimatik,
kemilüminesan ve manyetik ajanlarla konjuge edilerek çeşitli tanı sistemlerinde (WB,
ELISA, IFAT, ICT gibi) kullanılmasına imkan sağlayacaktır.
70
KAYNAKLAR
[1]
World Health Organisation , Leishmaniasis, Essential Leishmaniasis Maps,
http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/index.html, 12 nisan
2010.
[2]
Allahverdiyev, A.M., Bağirova, M., Cakir, K.R., Oztel, O., Elçıçek, S., Ateş,
S.C. ve Karaca, T.D., (2010). "Approaches and problems in vaccine
development against Leishmaniasis", Türkiye parazitoloji dergisi, 34: 122.
[3]
Desjeux, P., (2001). "The increase in risk factors for leishmaniasis worldwide",
Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 95: 239243.
[4]
One World Health Organization, Kala-azar The
http://www.oneworldhealth.org/kala-azar, 20 Nisan 2012.
[5]
Desjeux, P. ve Alvar, J., (2003). "Leishmania/HIV co-infections: epidemiology
in Europe", Annals of tropical medicine and parasitology, 97: 3-15.
[6]
Uzun, S., Durdu, M., Culha, G., Allahverdiyev, A.M. ve Memisoglu, H.R.,
(2004). "Clinical features, epidemiology, and efficacy and safety of intralesional
antimony treatment of cutaneous leishmaniasis: recent experience in Turkey",
Journal of Parasitology, 90: 853-859.
[7]
Akman, L., Aksu, H., Wang, R.Q., Ozensoy, S., Ozbel, Y., Alkan, Z., Ozcel,
M., Culha, G., Ozcan, K. ve Uzun, S., (2000). "Multi‐Site DNA
Polymorphism Analyses of Leishmania Isolates Define their Genotypes
Predicting Clinical Epidemiology of Leishmaniasis in a Specific Region",
Journal of Eukaryotic Microbiology, 47: 545-554.
[8]
Serin, M.S., Daglioglu, K., Bagirova, M., Allahverdiyev, A.M., Uzun, S.,
Vural, Z., Kayar, B., Tezcan, S., Yetkin, M. ve Aslan, G., (2005). "Rapid
diagnosis and genotyping of Leishmania isolates from cutaneous and visceral
leishmaniasis by microcapillary cultivation and polymerase chain reaction–
restriction fragment length polymorphism of miniexon region", Diagnostic
microbiology and infectious disease, 53: 209-214.
[9]
Dujardin, J.C., Campino, L., Cañavate, C., Dedet, J.P., Gradoni, L.,
Soteriadou, K., Mazeris, A., Ozbel, Y. ve Boelaert, M., (2008). "Spread of
vector-borne diseases and neglect of leishmaniasis, Europe", Emerging
infectious diseases, 14: 1013.
[10]
Totan, M. ve Hokelek, M., (2003). "Pneumonia Associated with Visceral
Leishmaniasis in Childhood", Journal of Tropical Pediatrics, 49: 61-61.
71
Global
Challenge,
[11]
Özdener, N., Kayar, B., Köksal, F. ve Akbaba M., (2005). "Leishmania
Sempozyumu Kursu Degerlendirme ve Öneri Formuna Verilen Yanıtlar", XIV.
Ulusal Parazitoloji Kongresi Özet kitabı. İzmir, 167-168.
[12]
T.C.S. Bakanlığı, (2005). Bulaşıcı hastalıkların ihbarı ve bildirim sistemi
genelgesi, Genelge no: 156, Ankara.
[13]
Piarroux, R., Gambarelli, F., Dumon, H., Fontes, M., Dunan, S., Mary, C.,
Toga, B., ve Quilici, M., (1994). "Comparison of PZR with direct examination
of bone marrow aspiration, myeloculture, and serology for diagnosis of visceral
Leishmaniasis in immunocompromised patients", Journal of clinical
microbiology, 32: 746-749.
[14]
Allahverdiyev, A.M., Bagirova, M., Uzun, S., Alabaz, D., Aksaray, N.,
Kocabas, E. ve Koksal, F., (2005). "The value of a new microculture method
for diagnosis of visceral leishmaniasis by using bone marrow and peripheral
blood", The American journal of tropical medicine and hygiene, 73: 276-280.
[15]
Campino, L., Cortes, S., Pires, R., Oskam, L. ve Abranches, P., (2000).
"Detection of Leishmania in immunocompromised patients using peripheral
blood spots on filter paper and the polymerase chain reaction", European Journal
of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 19: 396-398.
[16]
Silva, L.A., Romero, H.D., Nogueira Nascentes, G.A., Costa, R.T.,
Rodrigues, V. ve Prata, A., (2011). "Antileishmania immunological tests for
asymptomatic subjects living in a visceral leishmaniasis-endemic area in Brazil",
Am J Trop Med Hyg, 84: 261-266.
[17]
Rodríguez-Cortés, A., Ojeda, A., Francino, O., López-Fuertes, L., Timón, M.
ve Alberola, J., (2010). "Leishmania infection: laboratory diagnosing in the
absence of a “gold standard”", The American journal of tropical medicine and
hygiene, 82: 251-256.
[18]
Allahverdiyev, A.M., Uzun, S., Bagirova, M., Durdu, M. ve Memisoglu,
H.R., (2004). "A sensitive new microculture method for diagnosis of cutaneous
leishmaniasis", Am J Trop Med Hyg, 70: 294-297.
[19]
Boggild, A.K., Miranda-Verastegui, C., Espinosa, D., Arevalo, J., Adaui, V.,
Tulliano, G., Llanos-Cuentas, A. ve Low, D.E., (2007). "Evaluation of a
microculture method for isolation of Leishmania parasites from cutaneous
lesions of patients in Peru", J Clin Microbiol, 45: 3680-3684.
[20]
Aydenizöz, M., Yağcı, B.B., Özkan, A.T., Duru, S.Y. ve Gazyağcı, A.N.,
(2010). "Kırıkkale’deki Köpeklerde Mikrokültür Yöntemi ve IFAT ile Visseral
Leishmaniosisin Prevalansının Araştırılması", Türkiye parazitolojii dergisi, 34:
1-5.
[21]
Novruzova M.S., (2010). Leismaniazisin tanısında çeşitli mikrobiyolojik
yöntemlerin değerlendirilmesi, Doktora Tezi, Azerbaycan Tıp Üniversitesi,
Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Bakü.
[22]
da Silva, E.S., Gontijo, C., Pacheco Rda, S. ve Brazil, R.P., (2004).
"Diagnosis of human visceral leishmaniasis by PZR using blood samples spotted
on filter paper", Genet Mol Res, 3: 251-257.
[23]
Sundar, S. ve Rai, M., (2002). Laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis,
Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9: 951-958.
72
[24]
Ateş C S., (2011). İstanbul'daki Kan Merkezlerinden Elde Edilen Donör Kan
Örneklerinde, Leishmania Parazitlerinin Yeni Mikrokültür Yöntemi ve Diğer
Yöntemler ile karşılaştırmalı ncelenmesi, Doktora Tezi, Yıldız Teknik
Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, İstanbul:
[25]
Dye, C., Vidor, E. ve Dereure, J., (1993). "Serological diagnosis of
leishmaniasis: on detecting infection as well as disease", Epidemiology and
Infection, 110: 647-647.
[26]
Singh, S., ve Sivakumar, R., (2003). "Recent advances in the diagnosis of
leishmaniasis", Journal of postgraduate Medicine, 49: 55.
[27]
Khan, S.J. ve Muneeb, S., (2005). "Cutaneous leishmaniasis in Pakistan",
Dermatol Online J, 11: 4.
[28]
Gonçalves, C.C.M., Reiche, E.M.V., De Abreu Filho, B.A., Silveira, T.G.V.,
Felizardo, T.C., Maia, K.R., Costacurta, R., Padovesi, E.J., Dias Filho, B.P. ve
Jankevicius, S.I., (2002). "Evaluation of antigens from various Leishmania
species in a Western blot for diagnosis of American tegumentary leishmaniasis",
The American journal of tropical medicine and hygiene, 66: 91-102.
[29]
Isaza, D.M., Restrepo, M. ve Mosca, W., (1997). "Immunoblot analysis of
Leishmania panamensis antigens in sera of patients with American cutaneous
leishmaniasis", Journal of clinical microbiology, 35: 3043-3047.
[30]
Romero, G.A.S., Orge, M.G.O., Guerra, M.V.F., Paes, M.G., Macędo, V.O.
ve Carvalho, E.M., (2005). "Antibody response in patients with cutaneous
leishmaniasis infected by Leishmania (Viannia) braziliensis or Leishmania
(Viannia) guyanensis in Brazil", Acta Tropica, 93: 49-56.
[31]
Ocak A R., (2009). Hibridoma yöntemi ile Leishmania tropika parazitinin cell
surface antijenine karşı monoklonal antikor üretimi ve saflaştırılması, Tıpta
Uzmanlık Tezi, Harran Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü. Şanlıurfa.
[32]
Ak, M., Özbel, Y., Özensoy, S. ve Turgay N., (1995). İmmun Yetmezlikte
Önemi Artan Parazit Hastalıkları, İzmir: Ege Üniversitesi Basım Evi.
[33]
Desjeux, P., (2004). "Leishmaniasis: current situation and new perspectives",
Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 27: 305-318.
[34]
Topçu, WA., Söyletir, G. ve Doganay, M., (2002). Enfeksiyon Hastalıkları ve
Mikrobiyolojisi, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi.
[35]
Peters W. ve Killick-Kendrick, R., (1987). The leishmaniases in biology and
medicine, Orlando: Academic Press.
[36]
Kuman, H A., (2002). Leishmania Türleri, S.G. Topçu WA, Doganay M., ed.
Enfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi. İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri,
1870-1878.
[37]
Herwaldt, BL., (1999). "Leishmaniasis", The Lancet, 354: 1191-1199.
[38]
Descoteaux, A. ve Turco, S.J., (2002). "Functional aspects of the Leishmania
donovani lipophosphoglycan during macrophage infection", Microbes Infect, 4:
975-981.
[39]
Çakır K.R., (2008). Polimerlerin Toksisitesinin İncelenmesinde Yeni Kültür
Modelinin Geliştirilmesi, Yüksek Lisans Tezi, Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen
Bilimleri Enstitüsü. İstanbul.
73
[40]
Takken, W. ve Knols, B.G.J., (2007). Emerging pests and vector-borne
diseases in Europe: Wageningen Academic Pub.
[41]
Mandell L.G., Bennett E.J. ve Dolin, R., (2010). "Mandell, Douglas, and
Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases", JAMA: The Journal of
the American Medical Association, 304: 2067-2068.
[42]
National
Institute
of
Allergy
and
Incetious
Diseases,
http://www.niaid.nih.gov/topics/leishmaniasis/pages/lifecycle.aspx, 25 Mayıs
2012.
[43]
Yaşarol Ş. ve Orhan, V., (1981). Leishmaniasis, İzmir.
[44]
Cook, G.C. ve Zumla, A., (1996). Manson's tropical diseases, WB Saunders
Company Ltd. Newberg.
[45]
Özcel, M. A., Özbel,Y. ve Ak M., (2007). Özcel'in Tıbbi Parazit Hastalıkları,
META Basım, , İzmir.
[46]
Özbel, Y. Ve Özensoy. T.S., (2007). Leishmaniosis, Meta Basım matbaacılık
hizmetleri, İzmir.
[47]
Chiodini, P.L., Moody, A.H., Manser, D.W. ve Jeffrey, H.C., (2001). Atlas of
medical helminthology and protozoology: Churchill Livingstone.
[48]
Bogdan, C., Röllinghoff, M. ve Solbach, W., (1990). "Evasion strategies of
Leishmania parasites", Parasitology Today, 6: 183-187.
[49]
Tait, A. ve Sacks, D.L., (1988). "The cell biology of parasite invasion and
survival", Parasitol Today, 4: 228-234.
[50]
Jeronimo, S.M. ve Pearson, R.D., (1992). "The Leishmania. Protozoans
adapted for extracellular and intracellular survival", Subcell Biochem, 18: 1-37.
[51]
Pearson, R., Queiroz Sousa, A., Mandell, G., Douglas Jr, R. ve Bennett, J.,
(1990). "Leishmania species: visceral (kala-azar), cutaneous, and mucosal
leishmaniasis", Principles and practice of infectious diseases.: 2066-2077.
[52]
Kuman H.A. ve Altıntaş, N., (1996). Leishmanialar. Protozoon Hastalıkları.,
İzmir: Ege Üniversitesi Basımevi.
[53]
Alexander, J., Satoskar, A.R. ve Russell, D.G., (1999). "Leishmania species:
models of intracellular parasitism", J Cell Sci, 112 Pt 18: 2993-3002.
[54]
Elçiçek S., (2009). Polimerlerin Leishmania-Konak Hücre Etkileşimi Üzerine
Etkisinin İncelenmesi, Yüksek Lisans Tezi, Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen
Bilimleri Enstitüsü İstanbul.
[55]
Despommier, D., Gwadz, R., Hotez, P. ve Knirsch, C., (2005). Parasitic
diseases, Apple trees production, New york.
[56]
Kocabaş, E., Antmen, B., Alhan, E., Yıldıztaş, D. ve Aksaray, N., (1998).
"Çocukluk çağında kala-azar", Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 23:
95-101.
[57]
Köktürk, A., Baz, K., Aslan, G. ve Kaya, T., (2002). İçel’de Kutanöz
Leishmaniasis’ in Durumu. Türkiye Parazitoloji Dergisi, 26: 367-369.
74
[58]
Unat, E., Yücel, A., Altaş, K. ve Samastı, M., (1995). "Unat’ın Tıp
Parazitoloji", İnsanın Ökaryonlu Parazitleri ve Bunlarla Oluşan Hastalıkları.
İstanbul Üniv Cerrahpaşa Tıp Fak Vakfı Yay, Beşinci baskı İstanbul: 271-285.
[59]
Pearson, R.D. ve de Queiroz Sousa, A., (1996). "Clinical spectrum of
leishmaniasis", Clinical Infectious Diseases: 1-11.
[60]
Alrajhi, A., (2003). "Cutaneous leishmaniasis of the Old World", Skin therapy
letter, 8: 1.
[61]
Zare, S. ve Baghestani, S., (2001). "Cutaneous leishmaniasis in Hormozgan,
Iran", International journal of dermatology, 40: 629-631.
[62]
Lewin, K. ve Desjeux, P., (1996). "Leishmaniasis Public Health Aspects and
Control", Clinics in Dermatology, 14: 417-423.
[63]
Memisoglu, HR., Kotogyan, A., Acar, MA. ve Özpoyraz, M.,
Leishmaniosis. , İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri.
[64]
Erdoğan, F.G., Çakır, A.G., Gököz Ö. ve Gürler A., (2011). "A Case of
Sporotrichoid
Cutaneous
Leishmaniasis",
Turkish
Society
of
Dermatovenerology, 23: 100-1003.
[65]
Uzun, S., Uslular, C., Yucel, A., Acar, M.A., Ozpoyraz, M. ve Memisoglu,
H.R., (1999). "Cutaneous leishmaniasis: evaluation of 3,074 cases in the
Cukurova region of Turkey", Br J Dermatol, 140: 347-350.
[66]
Gurel, M.S., Ulukanligil, M. ve Ozbilge, H., (2002). "Cutaneous leishmaniasis
in Sanliurfa: epidemiologic and clinical features of the last four years (19972000)", Int J Dermatol, 41: 32-37.
[67]
Özcel, MA. ve Özbilgin, A., (1995). Güney Doğu Anadolu Projesini Tehdit
Eden Parazit Hastalıkları Bornova-İzmir, Bornova-İzmir.
[68]
Murray, H.W., Berman, J.D., Davies, C.R. ve Saravia, N.G.,
"Advances in leishmaniasis", The Lancet, 366: 1561-1577.
[69]
Amato, SV., Tuon, F., Siqueira MA., Nicodemo CA. ve Neto AV., (2007).
"Treatment of Mucosal Leishmaniasis in Latin America: Systematic Review",
Am J Trop Med Hyg, 77: 266-274.
[70]
Saygı, G., (1998). Temel tıbbi parazitoloji, Esnaf Ofset Matbaacılık, Sivas: 158163.
[71]
Blum, J., Desjeux, P., Schwartz, E., Beck, B. ve Hatz, C., (2004). "Treatment
of cutaneous leishmaniasis among travellers", Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 53: 158-166.
[72]
Machado-Coelho, G.L.L., Caiaffa, W.T., Genaro, O., Magalhães, P.A. ve
Mayrink, W., (2005). "Risk factors for mucosal manifestation of American
cutaneous leishmaniasis", Transactions of the Royal Society of Tropical
Medicine and Hygiene, 99: 55-61.
[73]
Konecny, P. ve Stark, D.J., (2007). "An Australian case of New World
cutaneous leishmaniasis", Medical journal of Australia, 186: 315.
[74]
Gupta, S., (2011). "Visceral leishmaniasis: Experimental models for drug
discovery", The Indian Journal of Medical Research, 133: 27.
75
(1994).
(2005).
[75]
Lukeš, J., Mauricio, I.L., Schönian, G., Dujardin, J.C., Soteriadou, K., Dedet,
J.P., Kuhls, K., Tintaya, K., Jirků, M. ve Chocholová, E., (2007).
"Evolutionary and geographical history of the Leishmania donovani complex
with a revision of current taxonomy", Proceedings of the National Academy of
Sciences, 104: 9375.
[76]
Berman, J.,
(1997). "Human leishmaniasis: clinical, diagnostic, and
chemotherapeutic developments in the last 10 years", Clinical Infectious
Diseases, 24: 684-703.
[77]
Ashford, R.W., (1996). "Leishmaniasis reservoirs and their significance in
control", Clinics in Dermatology, 14: 523.
[78]
Desjeux, P., (1996). "Leishmaniasis: public health aspects and control", Clinics
in Dermatology, 14,5:417-423.
[79]
Gülez, P., Hızarcıoğlu, M. ve Dinçel, N., (2011). "Viseral Leishmaniasis ile
Birlikte Hemofagositik Sendrom: İki Olgu Sunumu", Journal of Pediatr
Infections, 5: 106-109.
[80]
Sundar, S. ve Rai, M., (2002). "Advances in the treatment of leishmaniasis",
Current opinion in infectious diseases, 15: 593.
[81]
Bodur, H., Korkmaz, M., Akıncı, E., Çolpan, A., Sırrı, S., Erbay, A.,, (2003).
"Viseral Layşmanyaz: iki Olgu Bildirisi", Türk Klinik Mikrobiyoloji ve
infeksiyon hastalıkları (Klimik) Dergisi, 16: 95-97.
[82]
Özbel, Y., Turgay, N., Alkan, M., Babaoğlu, A., Özensoy, S. ve Babalıoğlu,
N., (2002). "Batı Karadeniz Bölgesi’nde zoonotik visceral leishmaniasis odağı:
Karabük", Turkiye Parazitol Derg, 26: 362-366.
[83]
National Library of Medicine - Medical Subject Headings 2011,
http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=Leishmania+inf
antum, 14 mart 2012.
[84]
Brewster, S., Aslett, M. ve Barker, D.C., (1998). "Kinetoplast DNA minicircle
database", Parasitol Today, 14: 437-438.
[85]
Smith, D.F., Peacock, C.S. ve Cruz, A.K., (2007). "Comparative genomics:
from genotype to disease phenotype in the leishmaniases", International journal
for parasitology, 37: 1173-1186.
[86]
Peacock, C.S., Seeger, K., Harris, D., Murphy, L., Ruiz, J.C., Quail, M.A.,
Peters, N., Adlem, E., Tivey, A. ve Aslett, M., (2007). "Comparative genomic
analysis of three Leishmania species that cause diverse human disease", Nature
genetics, 39: 839-847.
[87]
World Health Organization, Leishmaniasis, Magnitude the Problem,
http://www.who.int/leishmaniasis/burden/magnitude/burden_magnitude/en/inde
x.htm 22 mayıs 2012.
[88]
Chappuis, F., Sundar, S., Hailu, A., Ghalib, H., Rijal, S., Peeling, R.W.,
Alvar, J. ve Boelaert, M., (2007). "Visceral leishmaniasis: what are the needs
for diagnosis, treatment and control ?", Nature Reviews Microbiology, 5: 873882.
[89]
Kılıç S.S., (2002). Kala-azar ve Diğer Leishmania infeksiyonları, Nobel Tıp
Kitabevi, İstanbul.
76
[90]
Alexander, B., (2000). "Sampling methods for phlebotomine sandflies",
Medical and Veterinary Entomology, 14: 109-122.
[91]
Almeida, M.A., Jesus, E.E., Sousa-Atta, M.L., Alves, L.C., Berne, M.E. ve
Atta, A.M., (2005). "Antileishmanial antibody profile in dogs naturally infected
with Leishmania chagasi", Vet Immunol Immunopathol, 106: 151-158.
[92]
Alptekin, D., Kasap, M., Luleyap, U., Kasap, H., Aksoy, S. ve Wilson, M.L.,
(1999). "Sandflies (Diptera: Psychodidae) associated with epidemic cutaneous
leishmaniasis in Sanliurfa, Turkey", Journal of medical entomology, 36: 277281.
[93]
Ok, Ü.Z., Balcıoğlu, I.C., Taylan Özkan, A., Özensoy, S. ve Özbel, Y.,
(2002). "Leishmaniasis in Turkey", Acta Tropica, 84: 43-48.
[94]
Altıntaş, N.,
(1993). GAP (Güneydoğu Anadolu Projesi) ve Paraziter
Hastalıklar (Özcel MA, ed) İzmir, Ege Üniversitesi Basımevi: 89-120.
[95]
Alten, B. ve Çağlar, S., (1998). Vektör ekolojisi ve Mücadelesi, TC Sağlık
Bakanlığı Sağlık Projesi Genel Koord.. Bizim Büro Basımevi, Ankara. 242 s.
[96]
Rezaeı Azizi, S.N., (2008).
Epidemiyolojisinin Araştırılması,
Bilimleri Ensititüsü. İzmir.
[97]
Berman, J.D.,
(1988). "Chemotherapy for leishmaniasis: biochemical
mechanisms, clinical efficacy, and future strategies", Rev Infect Dis, 10: 560586.
[98]
Olliaro, P.L. ve Bryceson, A.D., (1993). "Practical progress and new drugs for
changing patterns of leishmaniasis", Parasitol Today, 9: 323-328.
[99]
Santos, D.O., Coutinho, C.E.R., Madeira, M.F., Bottino, C.G., Vieira, R.T.,
Nascimento, S.B., Bernardino, A., Bourguignon, S.C., Corte-Real, S. ve
Pinho, R.T., (2008). "Leishmaniasis treatment—a challenge that remains: a
review", Parasitology research, 103: 1-10.
Bodrum Yarımadasında Leishmaniasis
Doktora Tezi, Ege Üniversitesi, Sağlık
[100] Zijlstra, E.E. ve el-Hassan, A.M., (2001). "Leishmaniasis in Sudan. Visceral
leishmaniasis", Trans R Soc Trop Med Hyg, 95 Suppl 1: S27-58.
[101] Janeway, C., Travers, P. ve Walport, M., (2005). Immunobiology: Immune
system in health and disease", Garland Science, New York.
[102] Miller, J., (1996). The thymus in immunity, Principles of Medical Biology, 6: 120.
[103] Paul, W. E., (1993). The Immune System: An Introduction, Fundamental
Immunology 3rd Ed., W. E. Paul (Ed), Raven Press Ltd, New York.
[104] Abbas, A.K., Lichtman, A.H. ve Baker, D.L., (2004). Basic immunology:
functions and disorders of the immune system, Saunders Company Ltd,
Newberg.
[105] Delves, P.J., Martin, S.J., Burton, D.R. ve Roitt, I.M., (2011). Roitt's essential
immunology, Wiley-Blackwell, New Jersey.
[106] Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M. ve Shlomchik, M., (2005).
Immunobiology: The Immune System in Health & Disease, Garland Science,
New York.
77
[107] Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. ve Walter, P.,
(2002). Molecular biology of the cell, Garland Science, New York: 1227-1242.
[108] Nezlin, R.S., (1998). The immunoglobulins: structure and function, Academic
Press, New York.
[109] Lefranc, M.P. ve Lefranc, G.,
Academic Press,California.
(2001). The immunoglobulin factsbook,
[110] Lewin B., (2004). Genes VIII., Pearson Prentice Hall Publishing, Upper Saddle
River, USA.
[111] Harris, L.J., Skaletsky, E. ve McPherson, A., (1995). "Crystallization of intact
monoclonal antibodies", Proteins, 23: 285-289.
[112] Minn, A., Quintans, J., (1996). Designer antibodies, JAI Press, Greenwich.
[113] Walsh, G. ve Headon, D.R., (1994). Protein biotechnology, John Wiley &
Sons,New Jersey.
[114] Kontermann, R.,
Heidelberg.
(2010). Antibody engineering, Springer Verlag, Berlin
[115] Teixeira, C.R., Teixeira, M.J., Gomes, R.B.B., Santos, C.S., Andrade, B.B.,
Raffaele-Netto, I., Silva, J.S., Guglielmotti, A., Miranda, J.C. ve Barral, A.,
(2005). "Saliva from Lutzomyia longipalpis induces CC chemokine ligand
2/monocyte chemoattractant protein-1 expression and macrophage recruitment",
The Journal of Immunology, 175: 8346.
[116] Kamhawi, S., Belkaid, Y., Modi, G., Rowton, E. ve Sacks, D., (2000).
"Protection against cutaneous leishmaniasis resulting from bites of uninfected
sand flies", Science, 290: 1351-1354.
[117] Belkaid, Y., Valenzuela, J.G., Kamhawi, S., Rowton, E., Sacks, D.L. ve
Ribeiro, J., (2000). "Delayed-type hypersensitivity to Phlebotomus papatasi
sand fly bite: An adaptive response induced by the fly?", Proceedings of the
National Academy of Sciences, 97: 6704.
[118] Peters, N.C., Egen, J.G., Secundino, N., Debrabant, A., Kimblin, N.,
Kamhawi, S., Lawyer, P., Fay, M.P., Germain, R.N. ve Sacks, D., (2008). "In
vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis
transmitted by sand flies", Science, 321: 970-974.
[119] Rosenthal, L.A., Sutterwala, F.S., Kehrli, M.E. ve Mosser, D.M., (1996).
"Leishmania major-human macrophage interactions: cooperation between Mac1 (CD11b/CD18) and complement receptor type 1 (CD35) in promastigote
adhesion", Infection and immunity, 64: 2206-2215.
[120] Wanderley, J.L.M., Moreira, M.E.C., Benjamin, A., Bonomo, A.C. ve
Barcinski, M.A.,
(2006). "Mimicry of apoptotic cells by exposing
phosphatidylserine participates in the establishment of amastigotes of
Leishmania (L) amazonensis in mammalian hosts", The Journal of Immunology,
176: 1834-1839.
[121] Badolato, R., Sacks, D.L., Savoia, D. ve Musso, T., (1996). "Leishmania
major: infection of human monocytes induces expression of IL-8 and MCAF",
Experimental parasitology, 82: 21-26.
78
[122] Dermine, J.F., Goyette, G., Houde, M., Turco, S.J. ve Desjardins, M., (2005).
"Leishmania donovani lipophosphoglycan disrupts phagosome microdomains in
J774 macrophages", Cellular microbiology, 7: 1263-1270.
[123] Antoine, J.C., Lang, T., Prina, E., Courret, N. ve Hellio, R., (1999). "H-2M
molecules, like MHC class II molecules, are targeted to parasitophorous
vacuoles of Leishmania-infected macrophages and internalized by amastigotes
of L. amazonensis and L. mexicana", Journal of cell science, 112: 2559-2570.
[124] Antoine, J.C., Prina, E., Lang, T. ve Courret, N., (1998). "The biogenesis and
properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine
macrophages", Trends in microbiology, 6: 392-401.
[125] Courret, N., Fréhel, C., Gouhier, N., Pouchelet, M., Prina, E. Roux, P. ve
Antoine, J.C., (2002). "Biogenesis of Leishmania-harbouring parasitophorous
vacuoles following phagocytosis of the metacyclic promastigote or amastigote
stages of the parasites", Journal of cell science, 115: 2303-2316.
[126] Ueno, N., Bratt, C.L., Rodriguez, N.E. ve Wilson, M.E., (2009). "Differences
in human macrophage receptor usage, lysosomal fusion kinetics and survival
between logarithmic and metacyclic Leishmania infantum chagasi
promastigotes", Cellular microbiology, 11: 1827-1841.
[127] Jones, D.E., Elloso, M.M. ve Scott, P., (1998). "Host susceptibility factors to
cutaneous leishmaniasis", Front. Biosci, 3: D1171-D1180.
[128] McDowell, M.A. ve Sacks, D.L., (1999). "Inhibition of host cell signal
transduction by Leishmania: observations relevant to the selective impairment of
IL-12 responses", Current opinion in microbiology, 2: 438-443.
[129] Kima, P.E., (2007). "The amastigote forms of Leishmania are experts at
exploiting host cell processes to establish infection and persist", International
journal for parasitology, 37: 1087-1096.
[130] Murray, H.W. ve Nathan, C.F., (1999). "Macrophage microbicidal mechanisms
in vivo: reactive nitrogen versus oxygen intermediates in the killing of
intracellular visceral Leishmania donovani", The Journal of experimental
medicine, 189: 741-746.
[131] Wei, X., Charles, I.G., Smith, A. Ure, J. Feng, G. Huang, F. Xu, D. Mullers,
W. Moncada, S. ve Liew, F.Y., (1995). "Altered immune responses in mice
lacking inducible nitric oxide synthase", nature, 375: 408-411.
[132] Gurunathan, S., Stobie, L., Prussin, C., Sacks, D.L., Glaichenhaus, N.,
Fowell, D.J., Locksley, R.M., Chang, J.T., Wu, C.Y. ve Seder, R.A., (2000).
"Requirements for the maintenance of Th1 immunity in vivo following DNA
vaccination: a potential immunoregulatory role for CD8+ T cells", The Journal
of Immunology, 165: 915-924.
[133] Abbas, A.K., Murphy, K.M. ve Sher, A., (1996). "Functional diversity of
helper T lymphocytes", Nature, 383: 787-793.
[134] Borja-Cabrera, G.P., Santos, F.N., Bauer, F.S., Parra, L.E., Menz, I.,
Morgado, A.A., Soares, I.S., Batista, L.M. ve Palatnik-de-Sousa, C.B., (2008).
"Immunogenicity assay of the Leishmune vaccine against canine visceral
leishmaniasis in Brazil", Vaccine, 26: 4991-4997.
79
[135] Piarroux, R., Gambarelli, F., Dumon, H., Fontes, M., Dunan, S., Mary, C.,
Toga, B., ve Quilici, M., (1994). "Comparison of PZR with direct examination
of bone marrow aspiration, myeloculture, and serology for diagnosis of visceral
Leishmaniasis in immunocompromised patients", J Clin Microbiol, 32: 746-749.
[136] Daldal, N. ve Özkan, T.A., (2011). Parazit Kültürleri, editörler, Ok, U.Z.,
Korkmaz, M.,Parazitolojide Laboratuvar, Türkiye Parazitoloji Derneği
Yayınları, 87-118, İzmir.
[137] Allahverdiyev, A M., Bağırova, M., Cakir-Koc R., Elcicek S., Oztel O N.,
Canim-Ates S., Abamor E S. ve Yeşilkır-Baydar, S., (2012). "Utility of the
Microculture Method in Non-Invasive Samples Obtained from an Experimental
Murine Model with Asymptomatic Leishmaniasis (Baskıda)", American Journal
of Tropical Medicine and Hygiene.
[138] Bölükbaş B., (2007). Amfoterisin B,vorikonazol, kaptopril ve lisinopril'in
leishmania tropica üzerindeki antileishmanial etkinliklerinin mikrokültür
yöntemi ile belirlenmesi, Tıpta Uzmanlık Tezi, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp
Fakültesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Samsun.
[139] Eroğlu, F., (2008). Kutanöz Leyişmanyozlu Hastalarda Etken Türlerin PZR-Rflp
Yöntemi İle Tanımlanması,Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi, Sağlık
Bilimleri Enstitüsü, Adana.
[140] Özensoy, S., Ozbel, Y., Turgay, N., Alkan, M.Z., Gul, K., Gilman-Sachs, A.,
Chang, K.P., Reed, S.G. ve Ozcel, M.A., (1998). "Serodiagnosis and
epidemiology of visceral leishmaniasis in Turkey", Am J Trop Med Hyg, 59:
363-369.
[141] El Roufaie Mohammed, E.A., Wright, E., Kager, P.À., Laarman, J. ve
Pondman, K., (1985). "ELISA using intact promastigotes for immunodiagnosis
of kala-azar", Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and
Hygiene, 79: 344-350.
[142] Gavgani, A.S.M., Vatan, S.K. ve Ghazanchaei, A., (2008). "KAtex antigendetection test as a diagnostic tool for latent visceral leishmaniasis cases",
African Journal of Biotechnology, 7:852-859.
[143] Boelaert, M., Bhattacharya, S., Chappuis, F., El Safi, S.H., Hailu, A.,
Mondal, D., Rijal, S., Sundar, S., Wasunna, M. ve Peeling, R.W., (2007).
"Evaluation of rapid diagnostic tests: visceral leishmaniasis", Nature Reviews
Microbiology, 5: S30-S39.
[144] Mary, C., Lamouroux, D., Dunan, S. ve Quilici, M., (1992). "Western blot
analysis of antibodies to Leishmania infantum antigens: potential of the 14-kD
and 16-kD antigens for diagnosis and epidemiologic purposes", The American
journal of tropical medicine and hygiene, 47: 764.
[145] Kohler, G. ve Milstein, C., (1975). "Continuous cultures of fused cells
secreting antibody of predefined specificity", Nature, 256: 495-497.
[146] Walker, J.M., (1996). The protein protocols handbook, Humana Pr Inc, New
Jersey.
[147] Lipman, N.S., Jackson, L.R., Trudel, L.J. ve Weis-Garcia, F., (2005).
"Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics,
applications, and information resources", ILAR JOURNAL, 46: 258.
80
[148] Antibody Resource Companies that Specialize in Large Scale Antibody
Production
and
Development,
http://www.antibodyresource.com/contractantibody.html, 20 Nisan 2012.
[149] Siddiqui, M., (2010). "Monoclonal antibodies as diagnostics; an appraisal",
Indian journal of pharmaceutical sciences, 72: 12.
[150] Albitar, M., (2007). Monoclonal antibodies: methods and protocols, Humana Pr
Inc, New Jersey.
[151] Chiarella, P. ve Fazio, V.M., (2008). "Mouse monoclonal antibodies in
biological research: strategies for high-throughput production", Biotechnology
letters, 30: 1303-1310.
[152] Cancer
and
the
Immune
System:
Techniques,
http://www.cancerresearch.org/Resources.aspx?id=600, 25 mayıs 2012.
[153] Marx, U., Embleton, M.J., Fischer, R., Gruber, F.P., Hansson, U., Heuer, J.,
De Leeuw, W.A., Logtenberg, T., Merz, W. ve Portetelle, D., (1997).
"Monoclonal antibody production", ATLA-NOTTINGHAM-, 25: 121-138.
[154] Shulman, M., Wilde, C. ve Köhler, G., (1978). "A better cell line for making
hybridomas secreting specific antibodies", Nature, 276:269-270.
[155] Kearney, J.F., Radbruch, A., Liesegang, B. ve Rajewsky, K., (1979). "A new
mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits
the construction of antibody-secreting hybrid cell lines", The Journal of
Immunology, 123: 1548.
[156] McMurry, J. ve Begley, T.P., (2005). The organic chemistry of biological
pathways, Roberts & Company publishers, Colorado.
[157] Lodish, H. Ca, K. Berk, A. Krieger, M. Matsudaira, P. ve Scott,P.M., (2003).
Molecular Cell Biology, Freeman Company, New York.
[158] Liddell, J.E. ve Cryer, A., (1991). A practical guide to monoclonal antibodies,
John Wiley & Sons Inc, New Jersey.
[159] Hornbeck, P., (1991). Unit 2. Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays, Current
protocols in immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New
Jersey.
[160] Harlow, E. ve Lane, D., (1999). Using antibodies: a laboratory manual: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
[161] Brennan, D.J., O'Connor, D.P., Rexhepaj, E., Ponten, F. ve Gallagher, W.M.,
(2010). "Antibody-based proteomics: fast-tracking molecular diagnostics in
oncology", Nat Rev Cancer, 10: 605-617.
[162] Springer, T.A., (2001). Unit 8. Immunoaffinity chromatography, Curr Protoc
Immunol, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New Jersey.
[163] Givan, A.L., (2001). Flow cytometry: first principles, John Wiley & Sons, New
Jersey.
[164] Horgan, K., Shaw, S. ve Boirivant, M., (2009). Immunomagnetic purification
of T cell subpopulations, Current protocols in immunology, 7: 1-7.4.
[165] Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W. ve Radbruch, A., (1990). "High
gradient magnetic cell separation with MACS", Cytometry, 11: 231-238.
81
[166] Thornton, A.M., (2003). Fractionation of T and B cells using magnetic beads,
Current protocols in immunology, Greene Pub. Associates and WileyInterscience, New Jersey.
[167] Zhao, P., Liang, X., Kalbfleisch, J., Koo, H.M. ve Cao, B., (2003).
"Neutralizing monoclonal antibody against anthrax lethal factor inhibits
intoxication in a mouse model", Human antibodies, 12: 129-136.
[168] Baselga, J. ve Albanell, J., (2001). "Mechanism of action of anti-HER2
monoclonal antibodies", Annals of oncology, 12: S35-S41.
[169] Cartron, G., Watier, H., Golay, J. ve Solal-Celigny, P., (2004). "From the
bench to the bedside: ways to improve rituximab efficacy", Blood, 104: 26352642.
[170] Clynes, R.A., Towers, T.L., Presta, L.G. ve Ravetch, J.V., (2000). "Inhibitory
Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets", Nature
medicine, 6: 443-446.
[171] Waldmann, T.A., (2003). "Immunotherapy: past, present and future", Nature
medicine, 9: 269-277.
[172] Börjesson, P.K.E., Postema, E.J., de Bree, R., Roos, J.C., Leemans, C.R.,
Kairemo, K.J.A. ve van Dongen, G.A.M.S., (2004). "Radioimmunodetection
and radioimmunotherapy of head and neck cancer", Oral oncology, 40: 761-772.
[173] Britz-Cunningham, S.H. ve Adelstein, S.J., (2003). "Molecular targeting with
radionuclides: state of the science", Journal of Nuclear Medicine, 44: 19451961.
[174] Bray, R. ve Chang, K., (1985). "Immunodiagnosis of leishmaniasis",
Leishmaniasis. Human Parasitic Diseases Vol. 1: 177-182.
[175] Bray, R., (1976). Immunodiagnosis of leishmaniasis. 65-76, S. Cohen and E. H.
Sadun, Immunology of parasitic infections. Blackwell Scientific Publications,
Oxford, United Kingdom.
[176] Galvao-Castro, B., Ferreira, J.A.S., Marzochi, K., Marzochi, M., Coutinho, S.
ve Lambert, P., (1984). "Polyclonal B cell activation, circulating immune
complexes and autoimmunity in human american visceral leishmaniasis",
Clinical and experimental immunology, 56: 58.
[177] De Colmenares, M., Portus, M., Riera, C., Gallego, M., Aisa, M., Torras, S.
ve Munoz, C., (1995). "Detection of 72-75-kD and 123-kD fractions of
Leishmania antigen in urine of patients with visceral leishmaniasis", The
American journal of tropical medicine and hygiene, 52: 427-428.
[178] Vinayak, V., Mahajan, D., Sobti, R., Singla, N. ve Sundar, S., (1994). "Anti66 kDa antileishmanial antibodies as specific immunodiagnostic probe for
visceral leishmaniasis", The Indian Journal of Medical Research, 99: 109.
[179] Attar, Z.J., Chance, M.L., el-Safi, S., Carney, J., Azazy, A., El-Hadi, M.,
Dourado, C. ve Hommel, M., (2001). "Latex agglutination test for the detection
of urinary antigens in visceral leishmaniasis", Acta Tropica, 78: 11-16.
[180] Rathjen, D.A. ve Geczy, C.L., (1986). "Conditioned medium from macrophage
cell lines supports the single-cell growth of hybridomas", Hybridoma, 5: 255261.
82
[181] Maalej, I.A., Chenik, M., Louzir, H., Ben Salah, A., Bahloul, C., Amri, F. ve
Dellagi, K., (2003). "Comparative evaluation of ELISAs based on ten
recombinant or purified Leishmania antigens for the serodiagnosis of
Mediterranean visceral leishmaniasis", Am J Trop Med Hyg, 68: 312-320.
[182] Smith J A., (2000). Immunology, B.R. Ausubel F M., Kingston E R., Moore D
D., Seidman J.G., Smith J A., Struhl K., ed. Current protocols in molecular
biology, John Wiley & Sons inc., New Jersey.
[183] Burns, J.M., Shreffler, W.G., Benson, D.R., Ghalib, H.W., Badaro, R. ve
Reed, S.G., (1993). "Molecular characterization of a kinesin-related antigen of
Leishmania chagasi that detects specific antibody in African and American
visceral leishmaniasis", Proceedings of the National Academy of Sciences, 90:
775.
[184] Fuh, G., Wu, P., Liang, W.C., Ultsch, M., Lee, C.V., Moffat, B. ve
Wiesmann, C., (2006). "Structure-function studies of two synthetic antivascular endothelial growth factor Fabs and comparison with the Avastin™
Fab", Journal of Biological Chemistry, 281: 6625-6631.
83
EK- A
ETİK KURUL TUTANAĞI
84
ÖZGEÇMİŞ
KİŞİSEL BİLGİLER
ADI SOYADI
:Serkan YAMAN
DOĞUM TARİHİ VE YERİ
: 24.12.1986/Gerede
YABANCI DİLİ
:İngilizce
E-POSTA
:serkan-yaman@windowslive.com
ÖĞRENİM DURUMU
Derece
Alan
Okul/Üniversite
Lisans
Moleküler Biyoloji
İstanbul Üniversitesi
2010
Gerede Hacı Sadık
2005
Mezuniyet
Yılı
ve Genetik
Lise
Fen Bilimleri
Öztosun Anadolu Lisesi
YAYINLARI
Kitap
1. THE IMPORTANCE OF ALDEHYDE DEHYDROGENASES OF STEM
CELLS IN REGENERATIVE MEDICINE, İn Dehydrogenases (ISBN: 978953-307-019-3), book chapter, (in press)
2. A Problem in Treatment of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD)
Deficient Patients Infected with Malaria : Primaquine-Induced Hemolysis , İn
Dehydrogenases (ISBN: 978-953-307-019-3), book chapter, (in press)
85
Download