Dilek Nas Tez - Erciyes Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

advertisement
1
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ
ECZACILIK FAKÜLTESİ
İLAÇLARDAKİ ORGANİK SAFSIZLIKLARIN
TANIMLANMASI VE TAYİNİ
Hazırlayan
Dilek NAS
Danışman
Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ
Analitik Kimya Anabilim Dalı
Bitirme Tezi
Mayıs–2013
KAYSERİ
i
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK
Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde
edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu
çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve
referans gösterdiğimi belirtirim.
Dilek NAS
ii
YÖNERGEYE UYGUNLUK
“İlaçlardaki Organik Safsızlıkların Tanımlanması ve Tayini” adlı bitirme ödevi
Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ ne uygun olarak
hazırlanmıştır.
Hazırlayan
Dilek NAS
Danışman
Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ
Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı
Prof. Dr. İbrahim NARİN
iii
“İlaçlardaki Organik Safsızlıkların Tanımlanması ve Tayini” adlı Bitirme Ödevi
Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak
hazırlanmış ve Analitik Kimya Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul
edilmiştir.
Hazırlayan
Danışman
Dilek NAS
Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ
Analitik Kimya Anabilim Dalı Başkanı
Prof. Dr. İbrahim NARİN
ONAY:
Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı’ nın................... tarih ve
…………..……………sayılı kararı ile onaylanmıştır.
…/…/……
Prof. Dr. Müberra KOŞAR
Dekan
iv
TEŞEKKÜR
Bu tezin hazırlanmasında bana destek olan ve hiçbir zaman yardımlarını esirgemeyen
danışmanım Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ’a, hayatım boyunca maddi ve manevi
desteğini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Dilek NAS
Kayseri, Mayıs 2013
v
İLAÇLARDAKİ ORGANİK SAFSIZLIKLARIN
TANIMLANMASI VE TAYİNİ
Dilek NAS
Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi
Analitik Kimya Anabilim Dalı
Bitirme Ödevi, Mayıs 2013
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ
ÖZET
Farmasötik dünyada, ilaç maddesi dışında kalan diğer organik maddeler ya da API
kalıntıları gibi istenmeyen kimyasallar ve sentez dışında ortaya çıkan maddeler,
safsızlık olarak kabul edilir. Safsızlık, formülasyon sırasında ya da ilaçtaki API ya da
formüle edilmiş API’nin kalitesini kaybetmesiyle oluşabilir. Bu istenmeyen kimyasal
maddelerin küçük miktardaki varlığı bile, farmasötik ürünlerin etkinliğini ve
güvenliğini etkileyebilir. Bir başka deyişle; safsızlık, etken maddenin ya da ilaç
maddesinin saflığını etkileyen herhangi bir maddedir. Kullanım bakımından, bir ilaç
maddesi safsızlık olarak üstün farmakolojik veya toksikolojik özellikleri olan bir madde
içerse dahi, saflığı tehlikeye girer. GC-MS ve HPLC-MS gibi kombine analitik teknikler
ilaçlardaki organik safsızlıkların (parçalanma ürünleri, yan reaksiyon ürünleri gibi)
tanımlanması ve tayini için vazgeçilmez araçlardır.
Anahtar kelimeler: Safsızlık, organik safsızlık, ilaç
vi
IDENTIFICATION AND DETERMINATION OF
ORGANIC IMPURITIES IN DRUGS
Dilek NAS
Erciyes University, Faculty of Pharmacy
Department of Analytical Chemistry
Graduation Project, May 2013
Advisor: Yrd. Doç. Dr. Vedat YILMAZ
ABSTRACT
In the pharmaceutical world, an impurity is considered as any other organic material,
besides the drug substance, or ingredients, arise out of synthesis or unwanted chemicals
that remains with API’s. The impurity may be developed either during formulation, or
upon aging of both API’s and formulated API’s in medicines. The presence of these
unwanted chemicals, even in small amount, may influence the efficacy and safety of the
pharmaceutical products. In other words, the impurity is any material that affects the
purity of the material of interest viz. active ingredient or drug substance. From the
standpoint of its usage, the drug substance is compromised in terms of purity even if it
contains another material with superior pharmacological or toxicological properties.
Hyphenated techniques, such as GC-MS and HPLC-MS, are inevitable tools in the
identification and determination of organic impurities (degradation products, products
of side-reaction etc) in drugs.
Keywords: Impurity, organic impurities, drug
vii
İÇİNDEKİLER
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK .................................................................................. i
YÖNERGEYE UYGUNLUK......................................................................................... ii
KABUL ONAY ...............................................................................................................iii
TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iv
ÖZET................................................................................................................................ v
ABSTRACT .................................................................................................................... vi
İÇİNDEKİLER ............................................................................................................. vii
ŞEKİLLER LİSTESİ ..................................................................................................... ix
KISALTMALAR ............................................................................................................ x
1. GİRİŞ VE AMAÇ ....................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 5
2.1. İLAÇLARDAKİ SAFSIZLIKLARIN KAYNAKLARI VE YAPISI.................... 5
2.1.1. Organik Safsızlıklar ......................................................................................... 5
2.1.1.1. Sentezde Son Ara Ürün ............................................................................ 5
2.1.1.2. Sentezdeki Tamamlanmamış Reaksiyon Ürünleri .................................... 6
2.1.1.3. Aşırı Reaksiyon Ürünleri .......................................................................... 8
2.1.1.4. Sentezde Kullanılan Başlangıç Maddesinden Kaynaklanan Safsızlıklar 10
2.1.1.5. Reaksiyon Çözücüsünden Kaynaklanan Safsızlıklar .............................. 10
2.1.1.6. Katalizör Kaynaklı Safsızlıklar ............................................................... 11
2.1.1.7. Yan Reaksiyon Ürünleri .......................................................................... 11
2.1.1.8. Parçalanma Ürünü Safsızlıklar................................................................ 13
2.1.1.9. Enantiomerik Safsızlıklar ........................................................................ 14
2.1.2. İnorganik Safsızlıklar..................................................................................... 14
2.1.3. Çözücü Kalıntısı Safsızlıklar ......................................................................... 15
2.1.4. Sıvağdaki Safsızlıklar .................................................................................... 17
2.2. ORGANİK SAFSIZLIKLARIN PROFİLİ İÇİN STRATEJİLER ...................... 19
2.2.1. Organik Safsızlıkların Belirlenmesi............................................................... 21
viii
2.2.1.1.
Bilinen
Potansiyel
Safsızlıklar
ile
Bilinmeyen
Safsızlıkların
Kromatografik Tutunma Değerlerinin Eşleştirilmesi Yöntemi............................ 22
2.2.1.2. Safsızlık Yapılarının Belirlenmesinde Kromatografik, Spektroskopik ve
Kombine Tekniklerin Uygulamaları .................................................................... 23
2.2.2. Safsızlıkların Sentezi ..................................................................................... 27
2.2.3. Safsızlıkların Kantitatif Tayini ...................................................................... 28
3. SONUÇ ....................................................................................................................... 30
4. KAYNAKLAR .......................................................................................................... 32
ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 34
ix
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1. Aspirin ve içerdiği organik safsızlıkların kimyasal yapıları. ............................... 3
Şekil 2. 17-oksosteroidlerin etinilasyonu ve sentezde gerçekleşen üç yan reaksiyon ...... 6
Şekil 3. Etinodiol diasetat’ın kimyasal yapısı ................................................................... 7
Şekil 4. Pipekuroniyum bromür’ün kimyasal yapısı....................................................... 7
Şekil 5. Enalapril (1a), lisinopril (2d) ve bunların dönüşümleri ....................................... 8
Şekil 6. Tolperison sentezi ve oluşan 3 safsızlık .............................................................. 9
Şekil 7. Piridinol karbamatın sentezi ve safsızlıklarının kaynakları ............................... 10
Şekil 8. Propranolol ve sentezi sırasında oluşan safsızlık (dimerik yapı) ...................... 12
Şekil 9. 2 Yan reaksiyonla 17α-etinil-17-hidroksi steroid’deki 17-hidroksi grubunun
asetilasyonu ...................................................................................................... 12
Şekil 10. Danazolün oluşumu ve İsodanazol safsızlığı ................................................... 13
Şekil 11. İlaçlardaki safsızlıkların tanımlanması, yapı aydınlatması ve tayini. .............. 20
x
KISALTMALAR
API
: Aktif İlaç Bileşeni
CE
: Kapiler Elektroforez
CEC
: Kapiler Elektrokromatografi
FT-IR
: Fourier Dönüşüm Kızılötesi Spektroskopisi
GC
: Gaz Kromatografisi
HCl
: Hidroklorik Asit
HPLC
: Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
IR
: İnfrared Spektroskopisi
IUPAC : Uluslar Arası Saf ve Uygulamalı Kimya Birliği
İTK
: İnce Tabaka Kromatografisi
LC
: Sıvı Kromatografisi
MS
: Kütle Spektrometresi
NaOH
: Sodyum Hidroksit
NMR
: Nükleer Manyetik Rezonans
Rf
: İTK’da Yürüme Hızı
SFC
: Süperkritik Akışkan Sıvı Kromatografisi
UV
: Ultraviole
1
1. GİRİŞ VE AMAÇ
İlaç, tıpta kullanılan ve biyolojk etkinliği olan (biyoaktif) saf bir kimyasal maddeyi ya
da ona eşdeğer olan bitkisel veya hayvansal kaynaklı, standart miktarda aktif madde
içeren bir karışımı ifade eder. Dünya Sağlık Örgütü ise ilacı ‘fizyolojik sistemleri veya
patolojik durumları, alanın yararı için değiştirmek veya incelemek amacıyla kullanılan
veya kullanılması öngörülen bir madde ya da ürün’ olarak tanımlar (1).
Etkinlik ve güvenlik ilaç tedavisinde iki önemli temel konudur. Sentetik, biyoteknolojik,
farmakolojik ve klinik araştırmalarda, en etkili ilaç materyalinin ve onun optimum dozaj
formunun belirlenmesinde, ilaç analisti, analitik kimyacı olarak destek vererek, dolaylı
fakat çok önemli rol oynar (2).
İlaç tedavisinin güvenliği iki önemli faktör ile belirlenir:
• İlaç maddesinin farmakolojik ve toksikolojik profili, yani, ilaç materyalinin insan
organizmasına yararlı ve advers (ters) etkileri arasındaki ilişkidir. Saf bir ilaç
materyalinin ters etkileri, onun kendisine ait özelliklerinden kaynaklandığı için, ilaç
analisti bu noktada ilaç tedavisinin güvenliğinin arttırılmasında çok fazla bir şey
yapamaz.
• Bulk ilaç materyalinde ve onun dozaj formlarındaki safsızlıkların neden olduğu ters
etkiler. Safsızlıkların izlenmesi ve kontrolü dikkate alındığında analitik kimyacının ilaç
tedavisinin güvenliğine katkısı açık ve ortadadır. Bu yüzden, safsızlıklar ile ilgili
analitik aktiviteler modern farmasötik analizde en önemli konular anasındadır.
Safsızlık, başlangıç maddesi, ortamdaki bileşenler veya yan reaksiyonlar sonucu oluşan
ve orijinal ilaçla birlikle bulunabilen herhangi bir madde olarak tarif edilmektedir (3).
Diğer bir deyişle, safsızlık; bir aktif ilaç bileşeninin (API) veya bir ilacın saflığını
etkileyen herhangi bir madde olarak tanımlanır. “Safsızlık profili” ise ilaç
hammaddelerinde ve farmasötik formülasyonlardaki organik, inorganik, sıvağ ve
2
çözücü kalıntılarının belirlenmesi, tanımlanması ve kantitatif tayinini hedefleyen bir
analitik aktiviteler grubunun genel bir ismi olarak kabul edilmektedir. (2)
Endüstriyel ve ilaç kontrol laboratuarlarında gerçekleştirilen analitik çalışmaların nihai
hedefi, ilaç üreticilerine terapötik kulanım için yüksek kalitede ilaç üretiminde yardımcı
olmaktır. Bir ilaç hammaddesi örneğinin kalitesini tanımlamanın en iyi yolu onun
saflığının belirlenmesidir. Bu amaca ulaşmak iki şekilde mümkündür. Bunlar; yüksek
doğruluğa ve kesinliğe sahip spesifik bir metot ile aktif ilaç bileşeninin veya onun
safsızlıklarının tayinidir. İlaç analizinin ilk yıllarında, kromatografik tekniklerin henüz
uygulanabilir olmadığı zamanlarda, ilaçların saflık kontrolü spesifik olmayan titrimetrik
ve fotometrik metotlarla aktif ilaç bileşeninin tayinine dayanmaktaydı. Analitik cihaz
teknolojisinin son birkaç on yılda muazzam gelişmesiyle ilaç materyallerinin saflığının
belirlenmesi için yeni yöntemler ortaya çıkarılmaktadır. Böylece, günümüzde, spesifik
olmayan tayin metotlarının hayli spesifik ve kesin metotlar (çoğunlukla HPLC) ile yer
değiştirmesi sağlanarak ilaç hammaddesi materyallerinin aktif ilaç bileşeninin daha
doğru ve kesin tayini mümkün olmaktadır. Buna rağmen, farmakopelerin son
baskılarında uygun fonksiyonel gruplar içeren ilaç maddelerinin tayinleri hala klasik ve
spesifik olmayan metotlara dayanmaktadır ve HPLC metotları sınırlı sayıda tayin için
kullanılmaktadır. Bunun muhtemel iki sebebi vardır (2).
Birincisi, maliyet ve harcanan zaman açısından bu iki yaklaşım arasında muazzam bir
fark olmasıdır. Titrasyonlar ve spektrofotometrik ölçümler minimum maliyetle çok kısa
bir süre içinde gerçekleştirilebiliyorken, bir HPLC metodu genellikle zaman isteyen
sistem, uygunluk testleri, test materyalinin ve referans standardın pek çok paralel
çalışmasını ve aynı zamanda pahalı ensturmentasyon, kolonlar ve çözücüler gerektirir.
Diğer taraftan, tabii ki, iki yaklaşımla elde edilen sonuçların değeri spesifiklik ve
doğruluk bakımından birbirleriyle karşılaştırılamaz.
İkincisi, ilaç materyallerinin tayininde HPLC metotlarının, yukarıda bahsedilen analitik
teknoloji gelişiminin bir sonucu olarak, genel ilerleme eksikliğinin sebebi olarak
safsızlıkların incelenmesinde assay metotlarından daha büyük bir şekilde gelişim
göstermesine neden olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, IUPAC’ın bahsettiği gibi, bir
ilacın kalitesi (saflığı) safsızlıklarının karakterizasyonu ve kantitatif olarak tayiniyle çok
daha verimli bir şekilde incelenebilir. Örneğin, bir ilaç hammaddesi materyalinin aktif
3
ilaç bileşeni yüzdesi hayli spesifik, doğru ve kesin bir metot kullanılarak %0,5 bağıl
standart sapma ile %99,0 bulunur ise, saflık % 99,0 ± 0.5 dır ve tolere edilemeyen
belirsizlik içerir. Aksine, safsızlıklar doğrudan tayin edilerek çok daha iyi bir şekilde
karakterize edilebilirler. Analitik teknolojideki değişiklerin ve ilaç saflığı konusunda
sürekli artan taleplerin bir sonucu olarak, farmasötik analizdeki düşünce şekli büyük
oranda değişmektedir. Modern farmasötik analizlerde, safsızlıkların incelenmesinin
önemi artarken, assay metotlarının öneminin azaldığı görülmektedir (2).
En klasik ilaçlardan birisi olan aspirinin durumu (saflığı ve safsızlığı), yukarıda
bahsedilen değişikliğe örnek olarak verilebilir. Farmakopelerde, aspirinin (1 nolu
bileşik) saflığı (kalitesi) ve içerisindeki safsızlığı olmak üzere iki şekilde belirlenir.
Saflığı, ilaç hammaddesi örneğindeki aspirinin aşırı NaOH ile reaksiyonu ve artan
NaOH’in ayarlı HCl ile geri titrasyonu ile tayin edilmektedir. Safsızlığı ise, aspirinin
başlıca safsızlık veya bozunma ürünü olan serbest salisilik asit (2 nolu bileşik) için bir
renk testi ile belirlenmektedir. Yaklaşık 20-25 yıl önce, farmasötik analizde HPLC
yönteminin kullanımının yaygınlaşmaya başlamasıyla, ilaç hammaddesi örneklerin ve
aspirin tabletlerin salisilik aside ek olarak üç tane (3-5 nolu bileşikler) daha safsızlık
içerdiği bulunmuştur (Şekil 1.). Bunlardan 4 nolu safsızlık bazı durumlarda %1
düzeylerine kadar ulaşmıştır (4,5). Bu safsızlıkların protein amino fonksiyonları ile
reaksiyon verme özelliğinin, aspirinin alerjik etkilere sebep olmasına yol açtığı
düşünülmüştür (6). Yukarıda bahsedilen safsızlıkların hepsi, aspirinin saflık tayininde
kullanılan titrasyon yönteminde NaOH harcamaktadır. Bu yüzden bu safsızlıkların
varlığı bu yöntemle belirlenemez (2).
Şekil 1. Aspirin ve içerdiği organik safsızlıkların kimyasal yapıları.
4
Bu çalışmada, ilaç hammaddesi materyali ve farmasötik formülasyonlarda bulunan
organik safsızlıkların kaynakları, tanımlanması, tayini ve karakterizasyonu için
geçmişten günümüze kadar kullanılan metotlardaki gelişmeler incelenmiştir.
5
2. GENEL BİLGİLER
2.1. İLAÇLARDAKİ SAFSIZLIKLARIN KAYNAKLARI VE YAPISI
2.1.1. Organik Safsızlıklar
İlgili, sıradan ve sentezle ilgili safsızlıklar olarak adlandırılan organik safsızlıklar, ilaç
hammaddesi sentezinin çeşitli evrelerinden ve ilaç dozaj formlarının hazırlanmasından
kaynaklanabilir. Sentezle veya prosesle ilgili safsızlıklar ile parçalanma ürünleri
arasında net bir ayırım yapmak her zaman mümkün değildir. Parçalanma ürünleri,
sentez, son ürünün izolasyonu, hammaddenin depolanması ve özellikle dozaj
formlarının formülasyonu ve depolanması sırasında oluşabilir (7).
Bu bölümde görüldüğü gibi safsızlıkların çoğunluğu ilacın üretim sürecinin sentetik
yolağının karakteristiğidir. Burada aynı ilaç maddesinin hazırlanması için birkaç
sentetik yolak vardır ve bu ilaçlardan jenerik olanların çoğu pratikte kullanılabilir.
Avrupa Farmakopesi tarafından sunulan muhtemel safsızlıkların yapıları birçok
durumda verilememektedir (8). Farklı sentezler diğer yapıların ortaya çıkmasına neden
olabilir. Organik safsızlıkların kaynaklarına göre sınıflandırılması aşağıda verilmektedir
(9).
2.1.1.1. Sentezde Son Ara Ürün
Bu kategoriye giren safsızlıklar genellikle ‘olası’ ya da ‘beklenen’ safsızlıklar olarak
adlandırılır. Örneğin; parasetamol sentezinde en son basamak, 4-aminofenol’ün
asetilasyonudur. 4-aminofenol, Avrupa Farmakopesi’inde fotometrik olarak ölçülen,
bulk ilaç hammaddesindeki olası bir safsızlıktır (8). Farmasötik açıdan birçok önemi
olan 17α-etinil-17-hidroksi-steroidler, 17-oksosteroidlerin etinilasyonu ile hazırlanır. Bu
nedenle 17-oksosteroidler (Şekil 2.), etinilsteroidlerin olası safsızlığıdır. Steroidlerden
başka bir örnek de prednisolondur. Prednisolon sentezinin son aşamasında
6
mikrobiyolojik dehidrogenasyonla yapıya (delta1) bir çift bağ girişi sağlanır. Bu
nedenle
prednisolonda
olasılığı
yüksek
safsızlık
1,2-dihidro
türevi
olan
hidrokortizon’dur (10).
Şekil 2. 17-oksosteroidlerin etinilasyonu ve sentezde gerçekleşen üç yan reaksiyon
2.1.1.2. Sentezdeki Tamamlanmamış Reaksiyon Ürünleri
Eğer son ara ürün, iki fonksiyonel gruba sahipse ve son aşama bunların her ikisinin de
aynı reaksiyonunu içeriyorsa, her zaman için olası durum bunlardan sadece birinin
reaksiyona girmesi ve reaksiyonda kısmen safsızlık olarak görülmesidir. Bu tür
safsızlıklar da olası safsızlıklar kategorisinde yer alır. Örneğin; etinodiol diasetat
sentezlerinden birinde (Şekil 3.) etinodiolün diasetilasyonu (17α-etinilestra-4-en-3β,17diol) son aşamadır. Sekonder 3-hidroksi grubunun aktivitesi, tersiyer 17-hidroksilin
aktivitesinden daha yüksek olduğu için olası (ve gerçek) safsızlık etinodiol-3-asetattır.
Benzer şekilde, pipekuroniyum bromür (2β, 16β-bis-(4dimethylpiperazino)-3α, 17α-
7
diacetoksi-5α-androstane dibromür) (Şekil 4.) sentezinin son aşaması 3α, 17β-dihidroksi
türevinin diasetilasyonudur ve muhtemel safsızlık da 17β-monoasetil türevidir (10).
Şekil 3. Etinodiol diasetat’ın kimyasal yapısı
Tamamlanmamış reaksiyon gibi safsızlık kaynakları, sentezlerin son aşamasıyla kısıtlı
değildir. Örneğin; enalapril maleat ve lisonopril sentezlerinden birinde (şekil 5.) -CH2Ph yapısı -CO-Ph molekülü olarak girdirilir. Bu molekül okso grubun katalitik
hidrogenasyonuyla –CH2-Ph e dönüştürülür. Azalmamış ya da kısmen azalmış okso
grubu (CH(OH)-Ph), safsızlık olarak enalapril ve lisinoprilin okso ve hidroksi
türevlerini oluşturur (10).
Şekil 4. Pipekuroniyum bromür’ün kimyasal yapısı
8
Şekil 5. Enalapril (1a), lisinopril (2d) ve bunların dönüşümleri
2.1.1.3. Aşırı Reaksiyon Ürünleri
Birçok durumda son reaksiyon basamağı yeterince seçici değildir ve ortamdaki reaktif
son ara ürüne atak eder. Örneğin nandrolonun (19-nortestosteron,17β-hidroksi-estra-4en-3-on) dekanolasyonuyla oluşan nandrolon dekanoatta 4-en-3-on, bir enol ester tipi
safsızlık olan estra-3,5-dien-3,17B-diol-bis-dekanoat’ı dekanoasyonla oluşturabilir.
Aşırı reaksiyonlar sadece son aşamada değil, sentezin önceki aşamalarında da
gerçekleşebilir. Örneğin yukarıda bahsedilen enalapril maleat ve lisinopril sentezinde –
9
CO-Ph redüksiyonu sadece tamamlanmamış reaksiyon kısmında gerçekleşmeyebilir,
bunun için artı bir redüksiyon şartı aranır. Fakat bu durum da fenil halkasının
hidrogenasyonuna yol açar; bu siklohekzil-enalapril ve siklohekzil-lisinopril safsızlık
kaynağıdır. Aşırı reaksiyon ihtimaline başka bir örnek de redüksiyon gerektiren
kompleks metal hidrürleriyle yukarda bahsedilen etinodiol, noretisteronun (17α-etinil17-hidroksi-estr-4-en-3-on) 3-okso grubunun redüklenmesiyle oluşur. Şekil 2.’de fazla
reaksiyon 4-en-3-okso grubu içeren steroidlerde gösterilmiştir. 4-en-3,17-dion
etinilasyonunda, etinilasyon tamamen bölge seçici değildir: 17α-etinil-17-hidroksi
steroidlerin formülasyonunda safsızlığı 3,17-dietinil türevleri oluşturur (10).
Aşırı reaksiyonun diğer türleri de gerçekleşebilir. Şekil 6.’da görüldüğü gibi, tolperison
Mannich kondensasyonuyla hazırlanır (4-metilpropiyofenonun, 1 mol formaldehit ve
piperidinle reaksiyonu). Eğer reaksiyona 2 mol formaldehit katılırsa, hidroksimetil
grubu içeren bir safsızlık görülebilir.
Şekil 6. Tolperison sentezi ve oluşan 3 safsızlık
Diğer bir örnek de, piridinol karbamat sentezinde klorlama (klorinasyon) aşamasıdır.
2,6-lutidinin fotokataliz yoluyla klorlama reaksiyon ürünü, bis-klorometil türevidir. Bu
da iki adımla sonuç ürününe dönüştürülür. 2,6-lutidinin klorlama sırasında oluşan fazla
10
reaksiyon ürünü trikloro türevidir. Şekil 7.’de gösterildiği gibi hidroksi türevi piridinol
karbamatın prokürsörüdür (9).
Şekil 7. Piridinol karbamatın sentezi ve safsızlıklarının kaynakları
2.1.1.4. Sentezde Kullanılan Başlangıç Maddesinden Kaynaklanan Safsızlıklar
İlaç sentezindeki başlangıç maddesinin içerdiği safsızlıklar, ilaç maddesindeki
safsızlıkların kaynağı olabilir. Bu durumda başlangıç maddesindeki safsızlık, aynı
başlangıç maddesi gibi reaksiyon verir ve oluşan bileşikler çoğu zaman izomerik
safsızlıkları oluşturur. Örneğin; 3-triflorometil-α-etilbenzhidrol (flumecinol)’deki
izomerik
4-triflorometil
safsızlığı,
sentez
başlangıç
maddesi
olan
3-
triflorometilbromobenzen’deki 4-triflorometilbromobenzen safsızlığının bir sonucu
olarak oluşmaktadır (11,12). Tolperison senteziyle ilgili başka bir örnek önceki
bölümde ele alınmıştır. Eğer mannich reaksiyonunun başlangıç maddesi olan 4metilpropiyofenon, safsızlık olarak 2-metilpropiyofenonu içerirse, tolperisonun 2-metil
analoğu da safsızlık olarak bulunabilir (10).
2.1.1.5. Reaksiyon Çözücüsünden Kaynaklanan Safsızlıklar
Bazı durumlarda reaksiyondaki çözücü ya da çözücüdeki safsızlık, sentez sırasında
başka bir safsızlığın oluşumuna yol açar. Örneğin; yukarıda bahsedilen pipekuroniyum
bromürün
sentezinde
ilk
adımlarından
biri,
3β-hidroksi-5α-androstan-17-on
metansülfonat’tan metansülfonik asitin katalitik eliminasyonuyla 5α-androst-2-en-17-
11
on’un oluşmasıdır. Bu reaksiyondaki safsızlık, 3β-fenil-5α-androstan-17-on olarak
tanımlanmıştır. Bu deneyde çözücü karışımı, benzen ile silica ve alüminyum klorid
katalizörlerini içerir. 3-fenil türev oluşumunun temel nedeni, aktif ester ve benzen
arasındaki Friedel-Crafts tipi reaksiyondur (13). Yukarıda bahsedilen enalapril maleat
sentezinin ilk adımı, benzen ve maleik anhidrit arasındaki Friedel-Crafts reaksiyonu ile
1-fenil-1-oksobut-2-en-4-oik asittir. Eğer benzen, reaksiyon çözücüsü olarak çok fazla
kullanılırsa, söz konusu ara üründeki 4 metil türevinde toluenin izleri yer alır ve bu da
son üründeki safsızlıkların kaynağı olabilir (14). Eğer diklorometan, reaksiyon için
çözücü olarak seçilirse, bu çözücü Friedel –Crafts reaksiyonuyla safsızlığın yapısına
katılabilir. Burada safsızlık dklorometanın ara üründeki 2 molekülün 4’pozisyonuna
metilen köprüsü ile bağlanmasıyla oluşur (10).
2.1.1.6. Katalizör Kaynaklı Safsızlıklar
Homojen katalizörlerin kullanımı nadir olarak safsızlıkların oluşumuna yol açabilir. Bu
duruma bir örnek; mazipredon sentezinde 21. posisyondan piridinle katalizlenmesinde
prednisolunun tolisasyonudur. Prednisolon-21-tosilat ara ürünündeki bir safsızlık,
prednisolonun kuaterner 21-piridinyum türevi olarak bulunmuştur (15).
2.1.1.7. Yan Reaksiyon Ürünleri
Olguların çoğunda, saf başlangıç maddeleri ve reaktifler kullanılıp reaksiyon koşulları
dikkatli bir şekilde sağlanmış olsa da organik sentezlerin ana reaksiyonları yanında yan
reaksiyonlar da kaçınılmazdır. Yeni analitik teknolojiler % 0,01 oranında bulunabilen
yan reaksiyon ürünlerinin yapısını belirleyebildiği için, yan reaksiyonlar sonucu
oluşabilen safsızlıklar ile ilgili tecrübeler giderek artmaktadır. İlaç maddelerinin sentezi
sırasında gerçekleşen sayısız yan reaksiyon arasındaki örneklerden bazıları aşağıda
verilmiştir (11).
Steroidlerin 17-okso grubunun 17α-etinil-17-hidroksi steroidler’i oluşturmak üzere
alkali asetiller ile reaksiyonu (aynı zamanda aşırı reaksiyon tipi yan reaksiyonunun da
yer aldığı reaksiyon) Şekil 2.’de gösterilmiştir. Şekil 2.’deki reaksiyon şemasında 2
tipik yan reaksiyonlar da yer almaktadır.
12
Şekil 8. Propranolol ve sentezi sırasında oluşan safsızlık (dimerik yapı)
Şekil 8.’de epimerik 17β-etinil-17-hidroksi türevi olan Propranolol ve asetilen köprülü
dimerik türevinin oluşumu gösterilmiştir. Dimerik türevlerin oluşumu, diğer ilaç
sentezlerinde yan reaksiyonlarda sık olarak görülür. Örneğin; bu gibi safsızlıklar
Avrupa Farmakopesinde propranololün safsızlıkları arasında yer almaktadır (8).
4-Dimetilaminopiridin ile katalizlenmiş, etinodioldeki (17α-ethinilestra-4-ene-3/3,17diol))sterik olarak engellenmiş 17-hidroksi grubunun asetilasyonu ilginç bir yan
reaksiyon oluşumuna örnektir. Şekil 9.’da görüldüğü gibi yan reaksiyon, 17α-etinilestra-4-en-3β,17-diol-3-asetat-17-(3’-asetoksi-2’-butenoat)’ın Z ve E izomerlerinin
oluşumuna yol açar (9).
Şekil 9. 2 Yan reaksiyonla 17α-etinil-17-hidroksi steroid’deki 17-hidroksi grubunun
asetilasyonu
13
Yan reaksiyonlar sonucu izomerlerin oluşumu sıklıkla meydana gelmektedir.
Danazol’de safsızlık olarak isodanazol oluşumu (Şekil 10.), safsızlık olarak pozisyonel
izomerlerin oluşumuna tipik bir örnektir (13). Diasteromerler çoğunlukla peptid
türevlerinde safsızlık olarak meydana gelir. Peptid türevlerinin ve aynı zamanda
diketopiperazin türevlerinin (peptid ilaçları içinde safsızlıkların diğer önemli grubu)
diasteromerleri, Avrupa Farmakopesinde enalapril ve lisinoprilin safsızlıkları olarak
tanımlanmaktadır (8).
Şekil 10. Danazolün oluşumu ve İsodanazol safsızlığı
2.1.1.8. Parçalanma Ürünü Safsızlıklar
İlaç sentezlerinin son ürününün dönüşümü veya parçalanması, reaksiyonun son
basamağında veya izolasyon, kurutma gibi işlemler sırasında meydana gelebilmektedir.
Bu yüzden parçalanma ürünleri ilaçlarda bulunan safsızlık grubunda yer alır. Örneğin;
Şekil 6.’da tolperisonun oluşmasını sağlayan Mannich reaksiyonu sırasında piperidin ve
formaldehit, ilaç maddesinden ayrılarak (parçalanarak) 1-(4-metilfenil)-prop-2-en-1-on
bileşiği oluşabilir. Papaverin sentezinin son aşamasındaki şartlarda oksitlenerek
papaverinol ve papaveraldin’e dönüşebilir. Bu maddelerin miktarı saklama koşulları
altında artar; bu yüzden bunlar safsızlık ve parçalanma ürünü olarak kabul
edilebilmektedir (10).
14
2.1.1.9. Enantiomerik Safsızlıklar
Kiral ilaçların saf enantiyomer antipodu, safsızlık olarak kabul edilebilir. Burada
enantiyomerlerden birisi ilaç etken maddesi olarak kabul edilirken, diğer enantiyomer
safsızlık olarak kabul edilir. Safsızlık olarak kabul edilen enantiyomerin diğer
enantiyomerden ayrılması ve miktarının belirlenmesi gerekir (10).
2.1.2. İnorganik Safsızlıklar
İlaçlardaki inorganik safsızlıklar için çeşitli olası kaynaklar şunlardır:
• Sentetik üretim işleminin başlangıç maddeleri, reaktifleri ve çözücüleri inorganik
asitlerin tuzları için kaynak olabilir (Klorürler, sülfatlar, fosfatlar vb). Aynı şekilde
çeşitli ağır metaller de içerebilir.
• Ağır metaller, üretim işleminde kullanılan reaksiyon kaplarından ve tüplerden de
kaynaklanabilir.
• İlaç hammaddelerinin kristalizasyonu ve kromatografik saflaştırmaları sırasında ilaç
hammaddesi çözeltisini renksizleştirmek için sıklıkla kullanılan filtreler, süzme
aparatları ve adsorbanlar ağır metallerin ve inorganik asit tuzlarının serbest hale geçerek
safsızlık oluşturmasına neden olabilir.
• Bazı inorganik reaktiflerin kendileri ya da dönüşüm ürünleri de olası safsızlıklardır.
Örneğin; Selenyum dioksit, krom trioksit, permanganat ve civa(II) tuzları gibi
yükseltgen ajanlarla yapılan oksidasyonun reaksiyon ürünlerinde selenyum, krom,
manganez ya da çinkonun izleri tespit edilebilir. Lityum alüminyum hidrür ya da
sodyum borhidrür gibi indirgeyici ajanların kullanımıyla son üründe alüminyum ya da
bor izlerine rastlanabilir.
• Paladyum ve nikel gibi heterojen katalizörler safsızlık içerebilir. Bunlar iyonize
olabilir ya da reaksiyon sırasında oluşabilir. Bu da ilaç hammaddesinde safsızlık
kaynağı olabilir.
• İlaç maddesinin parçalanması da inorganik safsızlıklara yol açabilir (Örneğin; fosfat
esterlerinin hidrolizinden fosfat tuzları oluşumu, hidrazidlerin ve hidrazonların
hidrolitik parçalanmasından hidrazin oluşumu)(10).
15
2.1.3. Çözücü Kalıntısı Safsızlıklar
Çözücüler ilaç endüstrisinin hemen hemen her aşamasında kullanılır. Çözücü kalıntıları,
ilaç hammaddesinde ve farmasötik formülasyonlarda çoğunlukla bulunur. İlaç
hammaddesindeki çözücü kalıntılarının kaynakları şunlardır:
• Çözücü kalıntılarının en muhtemel kaynağı, ilaç hammaddesinin kristalizasyonunda
kullanılan çözücüdür. Kristalizasyon çözücüsünün seçiminde dikkate alınması gereken
birçok faktör vardır. Kristalizasyon işlemi, ilaç maddesinin geri kazanımını mümkün
olduğunca en yüksek oranda sağlarken, safsızlıkların miktarını da mümkün olduğunca
en düşük miktara düşürmelidir. İlaç maddesinin seçilen çözücü ile kristalizasyonu,
istenen kristal morfolojisini oluşturmalıdır. Buna ek olarak, çözücü çok yüksek
sıcaklığın olmadığı kurutmayla uzaklaşabilecek kadar uçucu olmalıdır. Bazı çözücülerin
kristalizasyonda verimli bir şekilde kullanılabilecek olmasına rağmen, onların yüksek
fiyat, sağlık veya çevresel tehlikelerinden dolayı kullanılamadığı da dikkate alınmalıdır.
Bazı durumlarda, kendileri saf olmayan çözücülerin bazı karışımlarının kristalizasyon
için kullanımı söz konusudur (Örneğin; petrol eterinin farklı fraksiyonları). Bazı başka
durumlarda ise çözücüler safsızlık olarak uçucu bileşenler içerebilir (Örneğin; hekzanda
bulunan
2-metilpentan,
3-metilpentan
ve
metilsiklopentan).
Bunlar
da
ilaç
hammaddesinde olası safsızlık olarak yer alır. Bu nedenle kristalizasyon için kullanılan
çözücünün önce gaz kromatografisi ile dikkatli bir şekilde kontrolü yapılmalı ve
bununla ilaç hammaddesindeki çözücü kalıntı profilinin tahmini yapılmalıdır.
• Bazı durumlarda kristalizasyon öncesi ilaç maddesine bazı çözücülerin çok güçlü bir
şekilde bağlanması, kristalizasyon sonrasında bile ilaç hammaddesinde çözücünün eser
düzeylerde bulunmasına neden olabilir. Bu safsızlıklar, reaksiyonun son basamağının
veya son reaksiyon basamağında kullanılan uçucu reaktiflerin çözücüsü veya uçucu
ürünleri olabilir (Örneğin; asetik asit ya da trifloroasetik asit).
• İlaç hammaddesinin son saflaştırma işlemi kolon kromatografisi ile olursa,
kromatografide kullanılan çözücü de ortamda bulunabilir. Eğer iyon-değiştirme
kromatografisi kullanılırsa yukarda bahsedilen asetik asit ve trifloroasetik asit ve uçucu
reaktifler de safsızlık olarak ortamda bulunabilir.
16
• İlaç hammaddesi, uçucu bileşenleri havadan adsorplayarak bağlayabilir. Bu durum
için en tipik örnek, higroskopik bileşikler için suyun safsızlık olarak bulunmasıdır.
Fakat bazen en hassas analitik metotlar, kurutma, paketleme gibi işlemler sırasında ilaç
maddesine temas eden havadaki uçucu safsızlıkları belirleyebilmektedir.
Eğer çözücülerin miktarları ilaç hammaddesinin bütün karışımlarında stokiyometrik
olarak bulunmazsa (Örneğin; 0.5, 1, 2 mol kristal suyu gibi), çözücüler X-ray, IR ve
termal analiz ile karakterize edilebilir. Bulunan herhangi bir çözücü, mesala su, safsızlık
olarak kabul edilir ve safsızlık miktarının sınırları farklı farmakopeler tarafından
belirlenir (10).
İlaç hammaddesinden uçucu safsızlıkların uzaklaştırılması için kullanılan yöntem,
maddenin tercihen düşük basınç altında uygun sıcaklıkta kurutulmasıdır. Birçok
durumda çözücülerin son kalıntılarını uzaklaştırmanın çok zor hatta bazen imkânsız
olabileceğini belirtmek gerekir. Çok yüksek sıcaklıkta uzun süreli kurutma ilaç
molekülünün parçalanmasına neden olabilir. Yükseltgen özelliğe sahip parçalanma
ürünlerinin oluşmasına rağmen bu oluşum kurutmada inert atmosfer gazı kullanılarak en
aza indirilebilir ya da önlenebilir. Çözücü kalıntılarının sınırları farmakopeler tarafından
belirlenen sınırların altına düşürülür. Kristalizasyon için kullanılacak çözücü madde
seçildiğinde çeşitli kuralların dikkate alınması önemlidir. İlaç hammaddesi için en
uygun çözücüyü ve kurutma için uygun koşulları bulmak sadece araştırmanın her
aşamasında analitik kimyacıların aktif işbirliği ile mümkündür (10).
Katı dozaj formları çeşitli kaynaklardan meydana gelen uçucu bileşenler içerebilir,
bunlar;
• İlaç hammaddesinden kaynaklı çözücü kalıntıları,
• Sıvağlardan kaynaklanan çözücü kalıntıları. Laktoz monohidrat stokiyometrik
miktarlarda su içerirken diğerleri (örneğin nişasta) %10 kadar su içerir.
• Su, alkol, 2-propanol, kloroform, diklorometan ve diğer çözücüler ıslak granülasyon
teknolojilerinde kullanılır ve etkin maddelerin sıvağların toz karışımlarına püskürtme ile
uygulamalarında,
17
• Aynı çözücüler film kaplı tabletlerin ve çeşitli uzun süreli salınımlı formülasyonların
hazırlanmasında kullanılan çeşitli polimerik maddeleri çözmek için kullanılır.
Kurutmayla uzaklaştırılan çözücüler ve bunların katı dozaj formlarındaki miktarları ilaç
hammaddesinde kullanılan aynı metotlarla kontrol edilir (10).
2.1.4. Sıvağdaki Safsızlıklar
İlaç endüstrisinde ilaç maddelerini farmasötik formülasyona dönüştürmede kullanılan
farmasötik sıvağların tahmini sayısı yaklaşık 1000 civarındadır. Monografiler dahil
başlıca farmakopeler, sıvağ olarak yaklaşık 200 madde içerir. En çok kullanılan
sıvağlar; laktoz ve sükroz gibi şekerler, nişasta ve mikrokristalin selüloz gibi
karbonhidrat tipi biyopolimerler, selüloz türevleri, polietilen glikol (makrojeller) gibi
polimerik maddeler, polivinilpirolidon (povidon), bitkisel kökenli çeşitli yağlar, stearik
asit ve onun magnezyum tuzu, kalsiyum fosfat gibi inorganik maddeler, silisik asitin
çeşitli formlarıdır (10).
Bu maddelerin çoğunun nispeten sadece küçük bir kısmı farmasötik örneklerin (ilaç
formülasyonlarının) hazırlanmasında kullanılır: çoğu gıda ve kozmetik endüstrisinde
kullanılır. Bu durumun ve sıvağların çoğunun karmaşık yapısının bir sonucu olarak
sıvağların kalitesini ve özellikle saflığını belirlemek ilaç maddelerine göre çok daha
zordur. Ancak, bu maddelerin farmasötik formülasyonlardaki miktarı aktif ilaç bileşeni
miktarından pek çok durumda daha yüksek olduğu için bunların saflığı önemli bir
konudur (16,17).
Yeterince kontrol edilmeyen sıvağ maddelerinin en küçük safsızlığı bile insan
organizması için tehlikeli olabilir. Safsızlıklar ilaç ürününün kararlılığını istenmeyen
şekilde de etkileyebilir. Örneğin sıvağda bulunabilecek eser metaller etkin maddenin
parçalanmasını katalizleyebilir. Örneğin; polietilen glikollerdeki peroksit safsızlığı,
oksitlenebilen ilaçların parçalanmasına neden olabilir (18).
İlaç maddelerindeki sıvağ miktarlarının düzenlenmesi yönünde büyük çabalar
harcanmaktadır (19,20). Bu durum birçok konferans ve derste de ele alınmaktadır (10).
Sıvağdaki safsızlıklar ve Avrupa Farmakopesine göre bunların belirlenmesinde
kullanılan limitler ve metotlar çeşitli örneklerle aşağıda belirtilmiştir (8). Klorür ve
18
sülfat iyonları bazı analitik metotlar ile tayin edilmektedir. Fakat limitler ilaç
maddesindeki sIvağlara göre değişebilmektedir, örneğin klorür ve sülfat sınırları
sırasıyla magnezyum stearat için %0,025 ve %0,5 iken; kalsiyum fosfat için %0,15 ve
%0,5’tir.
Ağır metaller için limit kalsiyum fosfatta 30 ppm, magnezyum stearatta 20 ppm,
hidroksietil ve hidroksipropilselülozda 20 ppm, povidonda 10 ppm’dir. Toksik metaller
için limitler daha düşüktür. Örneğin; hidrojelenmiş yerfıstığı yağında nikel 1 ppm
(atomik absorpsiyon spektroskopisi ile belirlenen), kalsiyum fosfatta arsenik 4 ppm’dir.
Polimerik sıvağlardaki monomerlerin tespiti bu sıvağların kontrolünde önemli bir kısmı
oluşturur. Örneğin; povidonda 1-vinilpirolidin-2-on HPLC (limit 10 ppm) ile tespit
edilir, makrogol’de etilen oksit (1 ppm) gaz kromatografisi ile tespit edilir. Farmasötik
polimerde bulunan monomerik 4,4’-metilenbissiklohekzilaminin tespiti katı faz
ekstraksiyonu ile yapılır ve ekstraksiyondan sonra heptaflorobutiramide dönüştürülür ve
GC-MS ile analizi yapılır. Povidonda bulunan hidrazin için limit testi onun
salisilaldehitli türevinin (1 ppm) ince tabaka kromatografisine dayanır. Aldehit için
belirlenen limit 500 ppm’dir (21).
Hidroksipropil selüloz gibi peroksit (Hidrojen peroksit olarak ifade edilir.) içerenler için
limit 400 ppm’dir (titanyum(III) klorür ile renk testi).
Biyopolimerlerin patates nişastasındaki protein içeriği sülfürik asitle çözülmesi sonrası
amonyak olarak tespit edilir (limit %0.1). Demir ve kükürt dioksit için izin verilen
sınırlar sırasıyla 10 ppm ve 50 ppm’dir.
Hidroksietilselülozun analitik incelemedeki önemli testleri, gaz kromatografisi ile etilen
oksit (1 ppm) ve 2-kloroetanol’ün (10 ppm), renk reaksiyonuyla da glioksal’ın (20 ppm)
belirlenmesidir.
Doygun yağların analitik kontrolü, yabancı doygun asit ve sterollerin gaz kromatografisi
ile tayinini içerir (10).
19
2.2. ORGANİK SAFSIZLIKLARIN PROFİLİ İÇİN STRATEJİLER
İlaç maddelerindeki organik safsızlıkların kaynakları Bölüm 2.1.1.’de anlatılmıştır. İzin
verilen organik safsızlık oranı pek çok durumda %0,1 iken, ilaç düzenleme otoriteleri,
sentetik araştırma kimyacıları, teknolojistler ve ilaç maddesi tüketicileri bu oranı %0,1
ile % 1 arasında kabul etmektedirler (22).
Şekil 11.’de ilaçlardaki safsızlık profilinin uygun mevcut metotlar kullanarak
çıkarılması şematize edilmiştir. Bu şema araştırmacılara uygulamaları gereken
stratejilerin ve izlenmesi gereken yolların belirlenmesinde büyük bir kolaylık sağlar.
İlaçların
safsızlık
profili
için
laboratuarlarda
kullanılan
stratejiler
farklılık
gösterebilmektedir. Bütün laboratuarlarda yaklaşık aynı teknikler kullanılmasına
rağmen, bu metotların kullanım sırası ve yöntemi bireysel laboratuarlarda oldukça farklı
olabilmektedir.
Bu
farklılıklar
ve
zorluklardan
dolayı,
aşağıdaki
yollar
kullanılabilmektedir;
• İlaçların safsızlık profilinin belirlenmesinde araştırmaların büyük bir çoğunluğu
endüstriyel firmaların araştırma ve kalite kontrol laboratuarlarında yapılmaktadır.
• Safsızlık profilinin belirlenmesinde kullanılan metotlar çok hızlı bir şekilde
gelişmektedir. Önceleri, ilaçlardaki ana safsızlıklar klasik farmasötik araştırmalar ile
belirlenmekteydi. 40-50 yıl önce bu çok zaman alıcı ve emek isteyen bir yol ile
gerçekleştirilirdi. Çoğunlukla, safsızlıkların kolon kromatografisi ile ayrılması ve
sonrasında günümüzdeki spektroskopik tekniklerin çok gerisinde bir spektroskopik
teknikle karakterizasyonuna dayanmaktaydı. 1960’ların başlarında ince tabaka
kromatografisinin (İTK) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinin (HPLC)
geliştirilmesi ve yaygınlaşması, aynı zamanda 1990’lı yıllarda HPLC-MS-(MS) ve
HPLC-NMR(MS) gibi kombine tekniklerin ortaya çıkmasıyla farmasötik araştırmalar,
analizler ve safsızlık profilleri tamamıyla yepyeni bir statü kazanmıştır. Güçlü ayırma
gücüne sahip kromatografik tekniklerin sürekli gelişen spektroskopik metotlarla on-line
kombinasyonu düşük düzeydeki safsızlıkların bile çok kısa sürede ve büyük bir
kesinlikle tanımlanmasını ve tayinini sağlamıştır.
• Safsızlık profilinin stratejisi büyük oranda çalışmanın gerçekleştiği laboratuarın
yapısına ve finansal imkânlarına bağlıdır.
Farklı laboratuarlardaki en yaygın yaklaşım safsızlığın belirlenmesi ve onun muhtemel
safsızlıklarla (kromatografik tutunma olarak) çakıştırılmasıdır (22).
20
İTK,HPLC (GC,CE,CEC,SFC) ile Tespit
3 Kromatografik sistemde önceki örneklerin
potansiyel safsızlıklarının çakıştırılması
var
Tespit?
yok
Tanımlanamayan safsızlıklar
Kromatografisiz NMR,MS
UV (HPLC,CE,CEC/DAD)
UV,IR (İTK spektrumu)
var
Yeterli bilgi?
yok
Yarıpreperatif
İTK
GC(IR)/MS
HPLC’den
küçük örnek
HPLC(CE,CEC,SFC)/MS
MS(IR)
var
Yeterli bilgi?
yok
Önerilen yapı
Safsızlığın sentezi
Preperatif HPLC’den
(ya da İTK) örnek
HPLC/NMR(MS)
Kayıtla eşleştirme
Safsızlıkların tespiti
NMR
Birleştirilmiş bilgiler
UV,IR,MS,NMR
Kromatografik veri
Miktar tayini için
metot geliştirme
Şekil 11. İlaçlardaki safsızlıkların tanımlanması, yapı aydınlatması ve tayini için genel şema.
20
21
2.2.1. Organik Safsızlıkların Belirlenmesi
Şekil 11.’de görüldüğü gibi safsızlık profilinde ilk adım safsızlığın tespitidir. Yüksek
çözünürlüklü NMR ve kütle spektroskopisi, ilaç örneğindeki safsızlıktan parmak izi gibi
bir görüntü almada önemli bir rol oynamasına rağmen, safsızlık profilinin daha sonraki
aşamasında
karakterize
olan
safsızlıklar,
kromatografik
(veya
elektroforetik)
tekniklerden biriyle tespit edilir. Bu ilk adımda bile temel olan husus ayırma
yöntemlerini
dikkatli
bir
şekilde
seçmektir.
Aşırı
yüksek
ya
da
düşük
polarite/hareketliğe sahip safsızlıklar, güvenli bir şekilde tayin edilebilmesi için çok
yavaş veya hızlı bir şekilde hareket edebilirler ve hatta böyle bir durum olmasa bile, bir
safsızlığı ana bileşen ya da diğer safsızlıklardan ayırmak gerekmez. Bu nedenle
görünmeyen bir tehlike vardır ve sadece bir ayırma tekniği kullanıldığında kullanılırsa
ihmal dahi edilebilir. Bu yüzden safsızlık profilindeki birçok safsızlığın elde edilmesi
için çeşitli mekanizmaya sahip ayırma yöntemlerinin kullanılması çok önemlidir. İnce
tabaka kromatografisi (İTK) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)
tekniklerinin (hem ters faz hem de normal faz modu) kullanımı zorunludur, ayrıca
süperkritik akışkan sıvı kromatografisi (SFC), yüklü moleküller için kapiller
elektroforez (CE), oldukça uçucu ve sıcaklığa dayanıklı materyaller için ise gaz
kromatografisi (GC) yararlı veriler sağlayabilir. Tüm safsızlıkların başarılı şekilde tespit
edilmesinin başka bir önemli yönü de tayinin duyarlılığıdır. Yukarıda bahsedilen
yöntemler optimum şartlarda kullanıldığında %0.01 düzeyindeki bir safsızlığın tahmin
edilmesi genellikle mümkündür. Aksi taktirde bu düzeylerin yükselme ihtimali artar.
Örneğin; fluoreskamin ile primer amino grubunun yüksek frorosens özelliğe sahip
türevini oluşturmak üzere ön-kolon türevlendirmesi HPLC sonrası zayıf oranda aktifliğe
sahip safsızlıkların spektrofotometrik olarak tayin edilebilirliğini (tayin düzeyini) çok
yüksek oranda geliştirmiştir (23).
Araştırmanın bu aşamasında çeşitli ayırma teknikleri arasındaki bağlantıları bulmak
çoğu zaman gereklidir. Bu demektir ki bu tespit için aynı safsızlığın İTK’da leke, HPLC
veya GC’de de pik olarak görülmesi şarttır. İTK’da leke elüsyonu ve elde edilen
çözeltinin tutunma çakıştırması için yüksek performanslı sıvı kromatografisine, gaz
kromatografisi ya da kapiller elektroforez cihazına enjeksiyonu büyük teknik zorluklar
olmaksızın yapılabilir. Aynı uygulama HPLC fraksiyonu için de geçerlidir. Ancak,
tamponlanmış ters-faz HPLC sistemlerinin kullanılması durumunda, İTK’da plaka
22
üzerine uygulama veya gaz kromatografisinde enjekte öncesinde apolar bir çözücü ile
ekstraksiyon yapmak gerekir. Sık kullanılmamasına rağmen, İTK plağı üzerine HPLC
ya da GC fraksiyonlarının uygulanma sorunu çözülmüştür (26,27). Kromatografik
verilerin yanında, safsızlıkların HPLC (CE, CEC)/diot-array UV spektrumuyla birlikte
İTK spektrumu ya da kütle spektrumu ile tanımı, çeşitli pik ve lekelerin ardından
safsızlığın tanımlanması için yararlı kanıtlar sağlayabilecek olan, on-line ya da off-line
moddaki İTK, HPLC ve CE fraksiyonlarından elde edilir (22).
2.2.1.1. Bilinen Potansiyel Safsızlıklar ile Bilinmeyen Safsızlıkların Kromatografik
Tutunma Değerlerinin Eşleştirilmesi Yöntemi
Birçok safsızlık hakkında net bir görüntü oluşturduktan sonra bunların ele alınması ve
ana bileşikten ve birbirlerinden ayrılması için uygun kromatografik (elektroforetik)
metotların seçilmesi gerekir. Safsızlık profili prosedüründe bir sonraki adım bilinen
potansiyel safsızlıklarla bunların tanımlanmasıdır (22).
Bu aşamada başarı, analitik kimyacılar ile sentetik kimyacıların ortak çalışma güç ve
düzeyine bağlıdır. Yeteri kadar çok sayıda potansiyel safsızlık örnekleri sayesinde
analitik kimyacı safsızlıkları iyi bir şekilde tahmin ederler ve bu safsızlıkları ya da en
azından bir kısmını tanımlarlar. Bu şekilde, kromatografik ve spektroskopik çalışma
için gerekli olan zaman ve iş gücü en aza indirilir. Potansiyel safsızlıklar; ilaç
materyalinin sentezindeki son ara ürünü, tamamlanmamış reaksiyon ürünü (ilaç
materyali diasetattaki dihidroksi monoasetat bileşeni gibi.), aşırı reaksiyon ürünleri (ilaç
materyali monoasetattaki analog durumundaki diasetat gibi.), yan ürünler (yan
reaksiyon ürünleri), reaksiyonun son adımında oluşması muhtemel olan parçalanma
ürünleri, izole son üründür. Sentetik kimyacılar ve teknolojistler potansiyel safsızlıklar
olarak kabul edilebilen daha önceki araştırmalarından birkaç analog bileşiğe sahiptirler.
Tüm bu örneklerin kimyagerler tarafından kullanılabilir olması çok önemlidir (22).
Ellerinde potansiyel safsızlıkların örnekleri ile öncesinde olası safsızlıkları belirleyip
sonra gerçek safsızlıkları tanımlamak ilaç analistlerinin görevidir. En kolay metot
olması ve bu nedenle en yaygın kullanılan metot tutunma çakıştırmasıdır (Kayıtla
eşleştirme). Analitik hedef, safsızlıkların ayrılması ve belirlenmesi olduğu durumda; eş
zamanlı olarak birkaç kromatografik ve ilgili ayırma tekniğinin kullanım gerekliliği
zaten önceki bölümde vurgulanmıştır. Bu aşamada sorumluluk tabi ki analitik
23
kimyacılara düşüyor: Tek bir kromatografik yönteme güvenmemek gerekir çünkü
yanıltıcı olabilir. Safsızlıkları tanımlamada, tanımlama değerlerinden en az ikisi varsa
kromatografik alıkonma (tutunma) zamanlarının, elektroforetik göç zamanlarının veya
Rf değerlerinin başarılı sonuca ulaşmada önemli olduğu kabul edilebilir. Fakat tercih
edilen üç farklı sistem, farklı ayırma mekanizmalarına dayanır. Bu deneylerde, iki
kromatografik/elektroforetik metotla bulunan alıkonma/göç zamanlarını karşılaştırmak
yeterli değildir: potansiyel safsızlıkların ilave edildiği ilaç örneği çözeltilerine yukarıda
bahsedilen yöntemlerin uygulanması gereklidir (22).
Tutunma çakışmasına (kayıtlı eşleştirme) dayalı başarılı tanımlama, potansiyel ve
gerçek safsızlıkların tanımlanması için ileriki kanıtların, kolaylıkla erişilebilen spektral
verilerin karşılaştırılmasına imkan vermektedir. Örneğin; HPLC ya da CE ayrımından
sonrası diyot-array UV spektrumu; İTK ile ayrım sonrası UV veya floresans spektrumu
(veya en azından noktaların rengi gün ışığında veya kısa veya uzun dalgaboylu UV
lambası altında aynı olmalıdır. Safsızlıkların tanımlanmasının kontrolünde GC/MS ya
da HPLC/MS kullanılması tanımlamada büyük ölçüde güvenirlik sağlar. Bu konuda
Nicolas ve Scholz kağıt-dergileri özeldir. Çalışanlar, yeni ilaç bileşeni için araştırma
sırasında sentezlenen olası safsızlıkları, gerçek safsızlıkları ve ilgili bileşenleri, HPLC
diyot-array UV spektrumu (26) ve HPLC/MS/MS spektrumlarının kütüphanelaboratuarını oluşturmuşlardır. %0.01 in altındaki safsızlıkların HPLC de kayıtla
eşleştirme ile safsızlıkların tanımlanmasında UV analizi ve MS/MS spektrumu büyük
ölçüde katkı sağlar (27).
2.2.1.2. Safsızlık Yapılarının Belirlenmesinde Kromatografik, Spektroskopik ve
Kombine Tekniklerin Uygulamaları
Şekil 11.’ de görüldüğü üzere ilk spektroskopik veriler genellikle, ilaç safsızlık
profilinde kromatografik ve spektroskopik tekniklerin birleşik uygulanması sırasında
elde edilen safsızlıkların UV spektrumudur. Bunlara (ve aynı zamanda floresans
spektrumu),
safsızlıkların
ayrılması
için
düzlemsel
kromatografik
teknikler
kullanıldığında, spektrum alma yoluyla kolaylıkla ulaşılabilir. Düzlemsel kromatografi
sonrası alınan FT-IR spektrumu safsızlık yapılarının aydınlatılması için yararlı bilgilerin
bulunmasında önemli bir rol oynamıştır. Safsızlıkları ayırmak için HPLC ya da kapiller
elektroforetik tekniklerden biri kullanıldığında, hızlı tarama (genellikle diyot-array) UV
24
dedektörler iyi kalitede UV spektrumları üretebilir. Gaz kromatografisi UV
spektrumları eldeki ticari cihazlar ile alınamadığı durumlarda sadece ayırma tekniğidir.
Safsızlıkların spektrumları ve ana bileşeni arasında bazen oldukça küçük farklar vardır
ve tanısal değere sahiptir. Bazı avantajlı durumlarda bu noktada safsızlığın yapısını
tahmin etmek bile mümkündür. Fakat buna ek olarak safsızlıkların kromatografik
yöntemdeki davranışı UV spektrumu ile kimyagerlerin sentez prosedürü hakkında
bilgiler de dikkate alınır. Pek çok durumda UV spektrumundan elde edilen bilgiler
safsızlığın yapısını belirlemede yeterli bilgi vermese de, kütle ve NMR’dan elde edilen
sonuçlar için faydalı ve tamamlayıcı bilgiler sağladığı için, UV spektrumunun
yorumlanmasında harcanan zamana ve enerjiye değmektedir (22).
Eğer UV spektrumundan elde edilen bilgiler yeterli değilse, safsızlık yapısının
aydınlatılması prosedüründe genellikle bir sonraki adım safsızlığın kütle spektrumunun
alınmasıdır. Bunu en verimli bir şekilde yapmanın yolu, safsızlık profili ile ilgili yeterli
bir şekilde gelişmiş laboratuarlardaki mevcut imkânlarla on-line GC/MS ve HPLC/MS
yöntemlerini kullanmaktır. Bu tekniklerin en büyük avantajı, %0.01 in altındaki birçok
safsızlığın eşzamanlı olarak tayin edilebilmesine imkân vermesidir. GC/MS tekniğinin
özel avantajı, kimyasal iyonizasyon kullanılarak molekül ağırlığının güvenilir bir
şekilde belirleyebilmesidir. Daha hassas yapı değerlendirme problemlerinin çözümü
için gerekli parçalanma ürünleri (fragmentler) hakkındaki bilgi elektron etki
iyonizasyon tekniği kullanılarak elde edilebilir. Dezavantajı ise uçuculuk ve termal
stabilite problemleri nedeniyle uygulanabilirliğinin kısıtlı olmasıdır. Eğer reaksiyonun
kantitatif yapısı tespit edilebilirse, GC/MS analizinin diğer alanlarında yaygın olarak
kullanılan türevlendirme reaksiyonu burada kullanılabilir. Böylece gerçek safsızlıklarla
türevlendirme reaksiyonunda yan ürünlerin kafa karıştırma riski önlenir (22).
HPLC/MS tekniğinin en büyük avantajları genel uygulanabilirliği ve diyot-array UV
dedektörleriyle (HPLC/UV/MS) eşleşme olasılığının olmasıdır. Dezavantajı ise ilk
jenerasyon cihazlar kullanılarak yumuşak iyonizasyon tekniklerinin sadece molekül
ağırlığı hakkında bilgi vermesidir. Modern cihazlarda fragmentasyon (parçalanma) da
elde edilebilmektedir. Safsızlık profili için en verimli cihazlar, şimdiye kadar tartışılan
tüm bilgileri eşzamanlı olarak verebilen HPLC/UV/MS/MS cihazlarıdır. Bu teknikler
mevcut olduğu laboratuarlarda, bu cihazların sayısı bunların kullanımıyla birlikte
25
safsızlık profili problemlerinin tamamının eş zamanlı olarak ortaya çıkmasını sağlar ve
safsızlık profilinin stratejisi büyük ölçüde kolaylaştırılabilir (22).
HPLC/UV/MS/MS için tarif edilen bu durum aşağı yukarı SFC, kapiller elektroforetik
yöntemler, CE ve CEC ile ikame edilen HPLC nin bütün teknikleri için geçerlidir. Bu
yeni tekniklerin, özellikle CEC yönteminin, ilaç safsızlık profilinde parlak bir
geleceğinin olması beklenmektedir.
Şekil 11.‘de görüldüğü gibi, kombine metotlara ek olarak kütle spektrumundan elde
edilen bilgiler kullanılması gibi başka birçok seçenek de vardır. Doğrudan kütle
spektrokopisinde numumenin ön bir kromatografik bir ayırma yöntemi uygulanmadan
incelenmesi söz konusudur. Modern kombine tekniklerin bulunmadığı laboratuarlarda
safsızlıkların kütle spektrumu genellikle HPLC yada İTK ile ayrılıktan sonra off-line
modunda alınır. Kütle spektrometrisinin yüksek duyarlılığının bir sonucu olarak özel
cihaz gerektirmez: Safsızlıklar İTK ile ayrımı sonrası doğrudan kütle spektrometrisi ile
incelenebilir. Preparatif HPLC ile numunedeki safsızlığı elde etmek için gerekli araçlar
yoksa uygulamalar hemen hemen HPLC ile aynıdır: Fraksiyondaki safsızlık miktarı
numune inorganik tuz ya da tampon içermedikçe MS ile incelenebilir. Bu yaklaşım
kombine tekniklerin kullanımda olmadığı laboratuarlarda bile bazen yararlı olabilir.
Böyle bir yaklaşımla bilgi hızlı bir şekilde elde edilir. Böylece uygun sistemlerin
geliştirilme ve optimize gerekliliği önlenir. Örneğin; HPLC/MS sistemlerine uygun
safsızlıkların HPLC ile ayrımı (22).
Bu noktada, ilaç analisti safsızlık profilinin karmaşık prosedüründe, UV, IR ve kütle
spektrumundan den elde edilen bilgilere sahip olarak çok önemli bir karar vermelidir.
Safsızlık için bir yapı önermeyi mümkün kılan sentetik kimya bilgisi ve ana bileşen ile
ilgili safsızlığın kromatografik verileri ile birlikte bu birleştirilmiş bilginin dikkatli bir
şekilde değerlendirilip değerlendirilmemesi gerektiği kararı verilmelidir. Şayet bu
soruların cevabı evet ise, prosedür Şekil 11’de görüldüğü ve sonraki bölümlerde tasvir
edildiği gibi işletilir (daha sonraki bölümde açıklanacaktır. Örneğin önerilen yapının
sentezi) Eğer cevap hayırsa, zaman ve emek isteyen NMR çalışmaları bundan önce
yapılmalıdır. Literatürde rapor edilen verilerin büyük bir kısmı ve laboratuar
çalışanlarının deneyimleri çalışmanın burada sonlandırılmasının mümkün olduğunu
26
gösteriyor. Bu durumda, bazen ilgili safsızlığın tam yapısı ile ilgili belirsizlikler devam
etmektedir.
Bir safsızlığın kimyasal yapısının belirlenmesinde en son metot NMR spektroskopisidir.
Bir ön kromatografik ayırma yapılmaksızın NMR spektroskopisinin kullanılabilirliği
oldukça sınırlıdır. NMR spektroskopisi genellikle, karışımdaki bileşenlerin bir
kromatografik ayırma sonrası kullanıldığı bir yapı aydınlatma aracıdır. İyi kalitede
NMR spektrumu elde etmek için minimum örnek miktarının olması gerekliliği, yeni
tekniklerin ortaya çıkmasını büyük oranda azaltsa da, genellikle sıradan İTK veya
analitik HPLC kolonları ile ayırma sonrası safsızlıkların NMR spektrumunu almak
mümkün değildir. Başka bir ihtimal ise, bu alandaki en son gelişmeleri kullanmaktır,
ticari olarak elde edilebilen on-line HPLC/NMR, HPLC/NMR/MS, LC/MS/MS gibi
kombine teknikleri kullanmaktır. Fakat bu teknikler,
sınırlı sayıda laboratuarlarda
bulunmakta ve bu teknikler ile yapılan safsızlık profili çalışmaları ile literatürde
yayınlanmış makale sayısı sadece birkaç tanedir. İleriki zamanlarda bu yeni tekniklerin
yaygınlaşması ve ilaçlardaki safsızlık profilinin çıkartılmasında yeni prosedurler ortaya
çıkarması beklenmektedir (22).
NMR spektrumu ve yukarda özetlenen çalışmalarda elde edilen diğer spektrumlarla
safsızlıkların yapısı tahmin edilebilir ki edilmelidir de. Bu noktada, safsızlıkların
yapısının aydınlatılması spektroskopistlerin, kromatograficilerin ve sentetik (organik)
kimyacıların yakın işbirliğinden oluşan bir takım çalışması ile gerçekleştiği
vurgulanmalıdır. Kromatograficilerin buradaki rolü, sadece safsızlıkların ayrılması ve
tayini için sistemler geliştirmek değildir. Çalışma süresi boyunca sadece spektral veri
değil, aynı zamanda İTK için Rf değerleri, HPLC ve GC için tutunma zamanları ile ilgili
bilgi sağlamada çok önemli görevleri vardır. Bunların ana bileşen ve diğer potansiyel
safsızlıklarla
karşılaştırılması
safsızlığın
polaritesi
hakkında
faydalı
veriler
sağlamaktadır. Aynı zamanda, bu bilgiler safsızlığın yapısının tahmin edilmesinde
önemli bir bilgi kaynağıdır. Yukarıda bahsedilen takımın bir üyesi ve ilaç sentezinin
bütün yönlerine aşina olan organik kimyacının problemli durumlarda görüşünün dikkate
alınması da gereklidir (22).
27
2.2.2. Safsızlıkların Sentezi
Yukarıdaki bölümün son kısmında da bahsedildiği üzere safsızlık yapısının
belirlenmesinde ekibin önemli bir üyesi de organik kimyacılardır. Şekil 11’de
görüldüğü gibi prosedürün bir sonraki basamağında organik kimyacılar önerilen
(tahmin edilen) yapıya sahip safsızlığın sentezinde önemli bir role sahiptir.
Bu noktada analitik kimyacılardan oluşan takım üyelerinin de sorumlulukları olduğu
vurgulanmalıdır. Önerilen yapıya sahip safsızlığın sentezlenmesi ana bileşenin
sentezlenmesinden daha zordur ve bu aşamalı sentezler birkaç hafta yoğun çalışma
gerektirir. Bu nedenle, özellikle karmaşık yapıların sentezinde, önce yapı son derece
dikkatli ve doğru bir şeklide tahmin edilmeli sonra sentezlenmelidir. Fakat bu genel bir
kural değildir. Bazı durumlarda, çalışmanın erken aşamasında yapının tahmin edilmesi
sentezi kolaylaştırabilir. Çoğu durumlarda, UV ve kütle spektrumu temelinde tahmin
edilen yapının sentezi, sonraki NMR çalışmaları için safsızlığın preparatif HPLC ile
hazırlanmasından daha kolaydır ve daha az zamanda gerçekleşir. Safsızlık profili
prosedürünün çeşitli aşamalarında nasıl ilerlendiği sorusu, durumdan duruma her
noktayı dikkate alınarak ayrı ayrı cevaplandırılmalıdır (22).
Safsızlığın gram skala sentezi şu şekildedir:
• Sentezlenen
maddenin
başarılı
sentezi,
tüm
spektroskopik
ve
analitik
incelenmesinden sonra, ilaç maddesinde bulunan safsızlık ile sentezlenen maddenin
kromatografik ve spektral eşleştirmesi yapılır. Bölüm
2.2.1.1.’de kromatografi
temelinde gerçek safsızlıkların nasıl tanımlandığı ve olası safsızlıklara nasıl on-line
spektral eşleştirme yapılması gerektiği ayrıntılı olarak anlatılmıştır. Aynı kurallar bu
durum için de geçerlidir. Başarılı bir eşleştirme sonucunda tahmin edilen yapı belirlenir.
• Sentezlenen maddeden elde edilen spektrum kalitesi genellikle, izole edilmiş küçük
numune spektrumlarından ya da online modda alınmış spektrumlardan daha iyidir.
Daha kaliteli olarak tanımlanmış spektrumlar ispat edildikten sonra makale ve kayıt
amacıyla kullanılabilir.
• Sentezlenen safsızlığın gram düzeyindeki miktarı safsızlık standardı olarak
kullanılabilir. Bu safsızlık standardı kullanılarak safsızlığın kantitatif analizi için seçici
28
analitik metotlar geliştirmek mümkündür. Böyle bir seçici analitik metot analitik test
protokolünün parçası haline geldiğinde, bu safsızlık standardı rutin olarak
kullanılmalıdır. Sentez edilen bu standartlar ilaç endüstrisine ve ilaç hammaddesi
tüketicilerine verilmesi gerekebilir.
• Sentezlenen safsızlıklar toksikoloji testlerinde kullanılabilir. Büyük safsızlıkların
olması durumunda, bu zorunluluktur.
Bazen, safsızlıkların sentezi çok problemli olabilir, hatta mümkün olmayabilir. Böyle
istisnai durumlarda sentezler safsızlık profili protokolünden ayrılabilir ve safsızlık
standardı preparatif HPLC kullanılarak hazırlanabilir (22).
2.2.3. Safsızlıkların Kantitatif Tayini
Safsızlıkların (özellikle parçalanma ürünlerinden kaynaklanan safsızlıkların) kantitatif
tayininin doğruluğu ve güvenilirliği ve büyük oranda bir safsızlık standardının mevcut
olup
olmadığına
bağlıdır.
Farmakopeler
genellikle
safsızlık
standartlarının
bulunabilirliğini dikkate almazlar ve seçici olmayan, genel kantitatif HPLC veya yarı
kantitatif İTK ve çok az sıklıkla GC metotlarının kullanımını içerirler. Sadece çok
sınırlı sayıda adlandırılmış safsızlıkların belirlenmesi için spesifik metotlar kullanılır.
Olguların çoğunda, safsızlıklar isimlendirilmemiştir ki böyle olsa bile seçici olmayan
metotlar safsızlıkların belirlenmesi için kullanılmaktadır. Bundan dolayı yukarıda
bahsedilen metotlar safsızlıkların belirlenmesi için kullanıldığında, safsızlıkların miktarı
ve bunların toplamı ana bileşen olarak ifade edilebilir (22).
Genel olarak bu testler ve bu şekilde elde edilen sonuçların güvenilirliği çeşitli
faktörlere bağlıdır ve bunlar kabul edilebilir ya da tamamen yanıltıcı sonuçlara yol
açabilir. HPLC ya da İTK yöntemleri tek dalga boylu UV dedektörü ile kullanıldığında
ve ana bileşen ve safsızlığın UV spektrumlarının birbirine yakın olduğunda sonuçlar
kabul edilebilir ve tayin dalga boyu doğru bir şekilde seçilir. Eğer spektrumlar farklı ve
dedektörün dalga boyu optimum değere ayarlanmamışsa, aynı teknikleri kullanarak
hatalı sonuçlar elde edilebilir. Spektrofotometrik olarak inaktif ilaç maddesi içerisinde
spektrofotometrik olarak aktif olan bir safsızlığın olması durumunda 10’lık katlık bir
fazla tahmin kolaylıkla gerçekleşebilir. Aksine, ilaç maddesi spektrofotometrik olarak
aktif, safsızlık inaktif olması durumunda aynı büyüklükte düşük tahmin gerçekleşebilir.
29
Aynı durum farmakopede CE ve CEC yöntemleri için de geçerlidir. İTK da eğer
lekelerin görsel olarak karşılaştırılması işlemi, plakaya bu ilaçla farklı bir şekilde
reaksiyona girebilecek olan bir reaktifi püskürttükten sonra yapılırsa, bu işlem sırasında
ilaca ait safsızlık farklı renklerde lekelere yol açar ve bu şekilde ciddi hatalı sonuçlar
elde edilebilir. GC kullanıldığında alev iyonizasyon dedektöründe safsızlığın yapısına
ilgili sinyaller ve ilaç sinyalleri arasında genellikle büyük farklılıklar yoktur (22).
Safsızlık standardı sentezlendiğinde bütün bu zorlukların ve belirsizliklerin üstesinden
kolayca gelinebilir. Bunu başarmak için de 3 genel olasılık vardır:
• Yukarıda bahsedildiği gibi, pek çok durumda ilaca ve bu ilacın safsızlığına ait
dedektör sinyalleri arasında büyük farklılıklar yoktur: bağıl dedektör sinyali birim
sinyale yakındır ve bu sebeple bu sinyal ihmal edilebilir. İngiliz Farmakopesine göre
dedektör sinyalleri 0.8 ile 1.2 arasında olduğunda bu prensip geçerlidir.
• Eğer sinyal aralığı büyük ise (ör: 0.2-5), dedektör sinyali sıkı bir şekilde belirlenmiş
deneysel şartlar altında tayin edilmelidir ve bütün durumlarda bir düzeltme faktörü
olarak kullanılır. Bu basit yaklaşımın avantajı metot geliştirme ve validasyonundan
sonra çoğunlukla pahalı olan safsızlık standardının geliştirilen metot rutin olarak
kullanıldığında gerek duyulmasıdır.
• Dedektör sinyalleri arasında büyük farklılıklar olduğunda, genel olarak safsızlığın
yarı kantitatif tayini İTK plaklarındaki lekelerin görünür karşılaştırmasıdır. Safsızlığın
tayini için safsızlık standardı kullanılarak bir metot geliştirilmeli, valide edilmeli ve
daha sonra rutin olarak kullanılmalıdır (22).
30
3. SONUÇ
İlaç etken maddelerindeki (API) safsızlıklar tespit edilerek tanımlanabilmektedir. Bu
safsızlıkların nitelikleri belirli bir süreçte elde edilerek değerlendirilmekte, bu da tek bir
safsızlığın biyolojik güvenliği hakkında bilgi sağlamaktadır. Böylece ilaç araştırmada
ilaçların safsızlık profilinin kapsamı ve gereksinimi ortaya çıkmaktadır
Safsızlıkların tespiti, çeşitli kromatografik ve spektroskopik tekniklerle tek başına ya da
diğer tekniklerle kombine halinde yapılır. Bu tekniklerle safsızlıkları tespit etmek ve
tanımlamak için HPLC, İTK gibi farklı yöntemler kullanılır. Özellikle HPLC safsızlık
profilinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Geniş aralıklı dedektör ve sabit fazın
kullanıldığı HPLC’nin çeşitli uygulamaları ile duyarlı ve uygun maliyetli ayırma
sağlanabilmektedir. Çeşitli düzlemsel kromatografik yöntemler arasında; HPLC ile
karşılaştırıldığında düşük maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle İTK, safsızlıkların
izolasyonu için en yaygın kullanılan ayırma yöntemidir. GC, çözücü kalıntılarının
tanımlanmasında en çok tercih edilen yöntemlerden biridir. Kombine tekniklerin ortaya
çıkışı safsızlık profilinde adeta devrim yaşatmıştır. Bu sayede sadece ayırma değil
bununla birlikte safsızlıkların yapıları da belirlenebilmiştir. Bu kombine teknikler
arasından ilaç safsızlık profilinde en çok kullanılan yöntemler, LC-MS-MS, LC-NMR,
LC-NMR -MS, GC-MS ve LC-MS’dir. Doğru metot geliştirme ve validasyon
prosedürleri safsızlık profilinin çıkarılması görevini kolaylaştırır.
Kalite güvencesi, geniş bir kavramdır. Bu kavram, safsızlık profilini geniş bir alana
yayar. Bir maddenin safsızlık profili incelenerek madde içinde mevcut olan
safsızlıkların olası maksimum miktarı bulunabilir. İlaç maddesinde ve ürününde
safsızlık seviyeleri için kuralların oluşturulması üreticiler için kalite kriterlerini
belirlemektedir. Bunun önemli bir yönü de yeni bir kimyasal işletmenin safsızlık
profilini yeterli şekilde göstermesi gerektiğidir. % 0.1 yeterlilik eşiği ya da bu oranın
altındaki yüksek doz bileşenler için ilaç analistleri kullanılacak analitik tekniği dikkatli
31
bir şekilde düşünerek karar vermelidir. Özellikle metot geliştirme evrelerinde, kombine
yöntemler gibi yüksek seçiciliğe sahip metotları kullanmak gerekli olabilir.
32
4. KAYNAKLAR
1.
Kayaalp S.O. Genel Farmakoloji, Farmakokinetik ve Toksikoloji, Rasyonel Tedavi
Yönünden Tıbbi Farmakoloji (12), 1, Prof. Dr. S. Oğuz Kayaalp, Pelikan
Yayıncılık, Ankara, 2009: 704
2.
Gorog S, Various Aspects of the Estimation of Impurities in Drugs, Identification
and Determination of Impurities in Drugs (1), 1, Sandor Görög, Elsevier Science
B.V., Amsterdam, The Netherlands, 2000: 1-4
3.
ICH Guideline: Impurities in New Drug Substances, CPMP/ICH/142/95, 1995
4.
Reepmeyer J.C. and R.D. Kichhoefer, J. Pharm. Sci. 68, 1979: 1167-1169
5.
Kirchhoefer R.D., Reepmeyer J.C. and Juhl W.E., J. Pharm. Sci. 69,1980: 550-553
6.
Bundgaard H., J. Pharm. Pharmacol. 26, 1974: 18-22
7.
Husain S. and Rao R.N., Proc. Control Qual. 10, 1997: 41-57
8.
European Pharmacopoeia, 3rd edn, Council of Europe, Strasbourg ,1997
9.
Gorog S., Balogh G., Csehi A., Csizor T., Gazdag M., Halmos Zs., Hegedfis B.,
Heronyi B., P. Horv-th and Lauko A., J. Pharm. Biomed. Anal. 11, 1993: 12191226
10. Gorog S, Various Aspects of the Estimation of Impurities in Drugs, Identification
and Determination of Impurities in Drugs (1), 1, Sandor Görög, Elsevier Science
B.V., Amsterdam, The Netherlands, 2000: 9-21
11. Gorog S, Lauko A. and Her~nyi B., J. Pharm. Biomed. Anal. 6, 1988: 697-705
12. Gorog S, Heronyi B. and Ronyei M., J. Pharm. Biomed. Anal. 10,1992: 831-835
33
13. Gorog S, Lauko A., Heronyi B., Georgakis A., Csizor I, Balogh G., Gy. Gfilik, S.
Maho and Z. Tuba, Chromatographia 26, 316-320 (1988)
14. Gorog S, Balogh G. and Gazdag M., J. Pharm. Biomed. Anal. 9, 1991: 829-833
15. Gorog S, in Steroid Analysis in the Pharmaceutical Industry. (S. G6r6g, Ed.), Ellis
Horwood, Chichester ,1989: 181-211
16. Smolinske S.C., Handbook of Food, Drug and Cosmetic Excipients, CRC
17. Fiedler H.P., Lexikon der Hilfstoffe fiir Pharmazie, Kosmetik und angrenzende
Gebiete, Editio Cantor, Aulendorf ,1996
18. McGinity J.W., J.A. Hill and A.L. La-Via, J. Pharm. Sci 64,1975: 356-357
19. Chowhan Z.T., Pharm. Technol. 19, 1995: 43-48
20. Chowhan Z.T., Pharm. Technol. 21, 1997: 56-67
21. Watson D.G., L. Li Xin, J.M. Midgley and D. Carr, J. Pharm. Biomed. Anal. 19,
1999: 917-921
22. Gorog S., Identification, Structure Elucidation and Determination of Related
Organic Impurities, Identification and Determination of Impurities in Drugs (1), 1,
Sandor Görög, Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands, 2000: 67-81
23. Berridge J.C., J. Pharma. Biomed. Anal. 14,1996: 7-12
24. Hofstraat J.W., Engelsmai M. Van de Nesse R.J., Goojier C., Velthorst N.H. and
U. Brinkman A.T., Anal. Chim. Acta 186,1986: 247-259
25. Banks C.T., J. Pharm. Biomed. Anal. 11, 1993: 705-710
26. Nicolas E.C. and Scholz T.H., J. Pharm. Biomed. Anal. 16,1998: 813-824
27. Nicolas E.C. and Scholz T.H. , J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 1998: 825-836
34
ÖZGEÇMİŞ
KİŞİSEL BİLGİLER
Ad, soyadı
: Dilek NAS
Uyruğu
: Türkiye (TC)
Doğum Tarihi ve Yeri
: 15 Temmuz 1989, Aksaray
Medeni Durumu
: Bekar
E–mail
: nas_dilek7@hotmail.com
Tel
: 05055635098
EĞİTİM
Derece
Kurum
Mezuniyet Tarihi
Lisans
E.Ü Eczacılık Fakültesi
2013
Lise
Hazım Kulak Anadolu Lisesi
2007
Download