Sitogenetik
advertisement
Sitogenetik Fenotiplerle kromozomal anormalilerini eşleştiren bilim dalı. Karyotip Bir bireyin kromozomlarının sayısı, yapısı ve büyüklüğü. Kromozom anormalileri. Işık mikroskobu ile incelenebilen anormaliler. Kromozomlar Sentromerin yerine göre kromozomlar sınflandırılırlar Sentromere göre kısa ve uzun kol taşırlar. Sentromer İğ ipliği bağlanma yeri 100,000s of 171 baz tekrarları, alpha satellite dizi taşırlar Sentromer proteinleri de vardır Telomeres : Kromozomların uçları tekrarlı TTAGGG taşırlar Tarihsel gelişimde sito-genetik • İnsan sito-genetiği, 19. yüzyılın sonlarında, kromozomların yapı, işlev ve evrimini araştıran bir araştırma alanı olarak ortaya çıkmıştır. • Flemming 1882’de ilk kromozom çizimlerini yayımlamış, 1888’de ise ilk kez Waldeyer “kromozom” terimini kullanmıştır. • 1955 yılında Hsu, Ford ve Levan insan kromozomlarının sayısının 2n=46 olduğunu göstermiştir. • 1970’li yılların başında G-, R-, C- ve NOR bantlama teknikleri başarılı uygulamalarda kullanılmaya başlanmış, • Bunu High-Resolution bantlama teknikleri ve FISH teknikleri izlemiştir. • Bu derste Fluoresan in situ Hibridizasyon ve alt tiplerini göreceğiz. Human spermatogonial metaphase in a mitotic cell. Camera Lucida drawing from Painter, 1923. 48 Kromozom? İnsan sitogenetiğinin doğuşu • 1956: Tjio ve Levan count 46 kromozom 1959 Lejeune et al : +21 in Down syndrome Ford et al. : 45,X in Turner syndrome Jacobs et al : 47,XXY in Klinefelter syndrome 1960 Nowel and Hungerford Philadelphia chromosome in CML 1973 Rowley: t(9;22)(q34;q11) in CML Kromozomların Gözlemlenmesinde Kullanılan Kimyasallar • Hücre bölünmesinin teşviki • Hücre eşleşmesi • Fitohemaglutinin • Hidroksiürea, ametopterin, soğuk uygulaması • İğ ipliklerinin durdurulması ve kromozomların ayrılması • Kromozom boyama • Kolşisin, α-bromonaftalin, hidroksikuinolin, hipotonik uygulaması • Feulgen (DNA’ ya özel), giemsa, karmin Conferences and Documents Denver Conference London Conference Chicago Conference Paris Conference Paris Conference (Supplement) Stockholm-1977 ISCN Paris-1980 ISCN ISCN Cancer Supplement ISCN Memphis-1994 ISCN Year * 1960 1963 1966 1971 1975 1978 1981 1985 1991 1995 Kromozom incelemeleri Doku alınması – Fetal doku: amniocentesis – chorionic villi sampling – fetal cell sorting – Erişkin doku: kan ( lenfositler) – (ağız epiteli) – deri – doku Preparasyon Boyama inceleme Beyaz Kan ( Lökosit ) – Lenfosit – T-Lenfosit Kromozomların elde edilmesi: Direkt - Kemik iliği Doku Kültürleri - Kan, Fibroblast (deri) Amnion, Koryon vili, Kord kanı Kemik İliği: Steril enjektör ile (heparinize edilmiş) 0.2 cc kemik iliği alınır. İn vivo mitoz sık. Direk ve 24 saat doku kültürü Doku Kültürü a) Kan: Heparinize enjektör ile ~ 0.3cc kan 5cc steril besi ortamı içine konur. 72 saat etüv 37oC . b) Fibroblast: Primer ve Devamlı. Primer: Yıkama Doku Steril makas parçalama Devamlı: Hela, LMTK- Besi ortamı Besi ortamı c) Amnion: Amniosentez – 15-18 hafta. Amnion sıvısı ile alınan fötüs hücre. Santrifuj- besi ortamı- etüv-37oC. d) Korion villi: 9-11 hafta a) abdominal b) vajinal olarak girip fötüsün villus hücrelerinden doku kültürü yapmak. 0.075M KCl Kolçisin --- 1 , 1.5 veya 2 saat Dökelti at Santrifuj 10001200 rpm Besi Ortamı Fiksatif 3 kez yıkama Besi Ortamı Eritrositler eridi at Santrifuj Fiksatif 1 GAA 3 Metanol Besi Ortamı Hücre Hipotonik at Santrifuj Santrifuj Lökositler Hücre Pastör pipeti 1 damla Havada kurutma Mikroskop Boyama : Karıştır Giemsa, floresan DNA Boyaları Mikroskop Fotograf İnsan kromozomlarının sayısal ve yapısal değişiklikleri metafaz evresinde mikroskop altında incelenir KARYOTİP- Kromozomların belirli bir düzende sıralanması (Boy, sentromer) 7 Grup A-G A grubu 1,2,3 B grubu 4,5 C grubu 6-12 D grubu 13-15 E grubu 16-18 F grubu 19,20 G grubu 21,22 Seks X submetasentrik Y akrosentrik met+sub sub sub satellit-akro sub met satellit-akro Özel Teknikler Bandlama- Tripsin * Giemsa bandlama (300-900 - haploid set) C bandlama - Sadece sentromer * R bandlama - G bandlama tersi boyama * Floresan NOR - Gümüş ile sadece satellitlerin boyanması HRB - Premetafaz SCE - Kardeş kromatid değişimi Budr --- Timin yerine. Prekanserojen. Kırıklar DERMATOGLİFİK İNCELEME İN SİTU HİBRİDİZASYON MOLEKÜLER SİTOGENETİK Boyama veya bantlama Araştırıcı Yıl yöntemi Q-bantlama Caspersson,Zech,Johansson 1970 G-bantlama (tripsin) Seabright 1971 G- bantlama (acetic-saline) Sumner, Evans, Buckland 1971 C-bantlama R-bantlama (sıcak ve Giemsa) Arrighi, Hsu Dutrillaux, Lejeune 1971 1971 G-11 boyama Bobrow, Madan, Pearson 1972 Antikor bantlama Dev ve ark. 1972 Kromozom Bandlama Yöntemlerinin önemi (1970 Casperson ve ark.) • Tek tek kromozomları tanımlayabiliyoruz. • Kromozom çiftlerini doğru eşleştiriyoruz. • Ufak yapı değişimlerini gözleyebiliyoruz. ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature grup A (1-3) grup B (4-5) grup C (6-12, X) grup D (13-15) grup E (16-18) grup F (19-20) Kromozom anormalileri belli fenotipleri oluşturabilir. Down sendromu. R-bantlama (fluoresans) Bobrow, Madan 1973 In vitro bantlama (aktinomisin D) Shafer 1973 T-bantlama Dutrillaux 1973 Replikasyon bantlama Latt 1973 Gümüş (NOR) boyama Howell, Denton Diamond 1973 Yüksek Ayırıcı bantlama Yunis 1975 DAPI/distamisin A boyama Schweizer, Ambros 1978 Andrle Restriksiyon endonukleaz bantlama Hsu Sahasrabuddhe, Pathak 1978 Giemsa bandlama R Bandlama Q Bandlama Q Bandlama Fluoresan yöntemlerle Bandlama NOR Bandlama DAPI/Distamisin A Kromozom painting CGH Telomer fish Sentromer fish 1 Nolu kromozomu boyama DNA dizi boyama http://www.sanger.ac.uk/HGP/ Cytogenetics/ Three-Dimensional Visualization of a Human Chromosome Using Coherent XRay Diffraction PRL 102, 018101 (2009) PHYSICAL REVIEW LETTERS 9 JANUARY 2009 Kardeş Kromatid değişim testi genellikle insan periferal lenfositlerine uygulanır. G0 fazındaki hücreler, fitohemaglutinin ile bölünmeye teşvik edilir. İkinci mitozun metafazında hücreleri durdurmak ve mitotik hücre toplamak için, iğ ipliklerini inhibe eden kolşemid ilave edilir ( 72. saatte). İki hücre döngüsü boyunca araşırıcıya kromatidleri ayırma fırsatı veren BrdU (bromodeoxy-uridine) kültür ortamına eklenir. Sadece bir zincirde DNA BrdU almışsa normal karanlık Giemsa boyaması olur, diğer zincir daha açık renkle boyanır. Eğer değişim gerçekleştiyse, kromatid parça parça açık ve koyu renklerde görülür: "harlequin kromozomları“. X ve Y kromatini (X kromozomu ve Y kromozomunun interfazda tanısı) Dozaj Konpansasyonu Xist RNA 18 Kb İnterfazda koyu boyanmış (1-1.5µm) hücre zarının altındaki, yuvarlak oval veya üçgen şeklindeki yapılar. X kromatin = X kromosom sayısı - 1 X kromatini (Barr cismi) sayısı Y Kromatini Y kromatin = Y kromosom sayısı İnsan Y Kromozomu Kromozomal nomenklatürü İdeogramda kromozomlar şematik olarak gösterilir. Belli band bölgeleri numaralanır. Sucrose intolerance 3q.26 dedir. (kromozom 3, uzun kol, ana band 26) Kromozom Nomenklatür Kısaltma Anlam 46, XY Normal erkek 46, XX Normal dişi 45, X Turner sendromlu dişi 47, XXY Klinefelter sendromlu erkek 47, XYY Jacobs syndrome erkek 46, XY, del (7q) Delesyon 7 47, XX, 21+ Dişi trisomi 21 46, XY, t (7;9) (p21.1;q34.1) Erkek translokasyon 46, XX 46, XY ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature http://www.waisman.wisc.edu/cytogenetics/abnormalities/abnor malities.html Robertsonian translocation 45,XX,der(13;14)(q10;q10) Reciprocal translocation 46,XY,t(6;9)(q24;p23) ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature http://www.waisman.wisc.edu/cytogenetics/abnormalities/abnor malities.html Reciprocal translocation (unbalanced) 46,XY,t(6;9)(q24;p23) 46,XY,der(6)t(6;9)(q24;p23) ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature inversion insertion 46,XY,ins(5;2)(p14;q22q32) 46,XX,inv(9)(p13q13) ISCN 1995 International System for Human Cytogenetic Nomenclature duplication 46,X,dup(X)(p11.2p22.1) deletion del(18)(pterp11.2) del(18)(p11.2) Fluorescence in situ hybridisation DNA Commercial Cot1 DNA Labeling: nick translation Mix 10ml culture Denaturation and incubation at 37°C Wash, detection and counterstain Denaturation Hybridisatie o/n CGH part I CGH part I 2 X chromosome 13 2 X chromosome 18 2 X chromosome 21 1 X chromosome Y Control lymphocytes (FISH 952-35) Further progress in human cytogenetics is fueled by technical innovations (II) The Karyotip: an international description Total kromozom sayısı Eşem kromozomları, Anormalik. 46,XY 47,XX, 21+ 47,XXX 69,XXY Trisomy 21 (Down syndrome) Triple X syndrome Triploidy 45,XX,der(13;14)(p11;q11) 46,XY,t(2;4)(p12;q12) Robertsonian translocation Reciprocal translocation 46,XX,del(5)(p25) 46,XX,dup(2)(p13p22) 46,XY,inv(11)(p15q14) 46,XY,fra(X)(q27.3) 46,XY/47,XXY Deletion tip of chromosome 5 Duplication of part of short arm Chr 2 Pericentric inversion chromosome 11 Fragile X syndrome Mosaicism normal/Klinefelter syndrome Kromozom anormalileri Etkilenen birey sayısı Genetik hastalıkların yaşla ilişkisi Kromozomal multifactorial single-gene (Mendelian) doğum ergenlik erişkin (redrawn from Gelherter et al 2nd ed) Sitogenetik kusurların etkisi 1/2 ilk üç aydaki düşüklerin 2% 35 yaşın üzerindeki hamileliklerin 1% tüm doğumların Kromozom anormalileri • Sayı (genelde mayozda hata) Aneuploidy - monosomy - trisomy • Polyploidy - triploidy • Yapı Translokasyon - Resiprok - Robertsonian (sentrik füzyon) Delesyon Duplikasyon İnversiyon İzokromozom • Faklı hücre hatları (zigot sonrası) Mosaiklik, Kimera Kromozom anormalileri 1. Kromozom sayı anormalileri. Öploid - normal set (2n) Poliploidy –.(3n, 4n vb) Anöploidy – Kromozomlardan bir veya birkaçımın sayı değişimi. Monosomi Trisomi - (2n-1) (2n+1) Sayı anormallikleri PoliploidiTriploidi (3N) 69,XXX 69,XXY 69,XYY Yaşamla bağdaşmaz. Tetraploidi (4N) 92,XXXX 92,XXYY Yaşamla bağdaşmaz. Polyploidy nasıl oluşur? Triploidi - 69XXX, 69XXY, 69XYY - dispermy - haploid sperm + diploid egg - 1% oranında tüm gebeliklerde triploid - 99% doğum öncesi ölüm - 17% tüm düşüklerde - triploidi 1 / 10,000 canlı doğumda - bir ay içersinde çoğu ölür Tetraploidi - 5% oranında tüm gebeliklerde - sitokinez hatası - letal Anöploidy - Bireysel kromosom sayısı değikliği non-disjunction veya anafaz lag - non-disjunction mayoz I’de - tüm gametler anormal - homologous çiftler gametlerdevar veya yok - non-disjunction mayoz II’de - 2 normal ve 2 anormal gamet - anormal gamet her iki kardeş kromatidi de taşır. Non-disjunction Anöploidy Otosomal monosomi nadir ve genelde yaşamla bağdaşmaz. Otosomal trisomilerin çoğu da letaldir. Yaşamla bağdaşan anöploidiler Otosomal Kromozom 21 – Down sendromu- ~25% Kromozom 13 – Patau sendromu~2.5% Kromozom 18 – Edwards sendromu~5% Diğer kromozomlarda fetal Herbir kromozom için trisomi frekansı Trisomy 13 Patau syndrome - nadir - 1 / 15,000 canlı doğum, çoğu in utero ölür. - letal – ½ çoğu ilk bir ayda - geri kalanı ilk 6 ayda ölür. - anne yaşı önemli Trisomy 18 Edward syndrome - nadir - 1 /10,000 canlı doğum, çoğu in utero ölür. -Çoğu ilk 6 ayda ölür, pek azı erginliğeulaşır. - fiziksel kusurlu Trisomy 21 Down’s sendromu - 1866 da John Down gözledi. - 21 trisomisi -1 / 20 si 21 14 translokasyonu ile oluşur. - 90% – non-disjunction mayoz I oositte 10% - non-disjunction mayoz I veya II erkeklerde 47,XX, 21 + Trisomi 21 – Down sendromu 1/800 Down syndrome Trisomi 21 Translokasyonlu (13,14,15,21,22) Mosaik Trisomy 13 – Patau Sendromu 1/20,000 Trisomi 18 – Edwards sendromu Trisomi kökeni Trisomi 2 7 15 16 18 21 22 XXY XXX # vaka 18 14 34 104 143 642 38 142 50 % Origin Maternal Paternal MI MII MI MII 54 17 76 100 33 65 94 38 60 13 26 9 56 23 3 14 16 28 3 3 46 - 15 5 6 Post zigotik mitosis 6 57 11 3 3 18 6th week of development Fallopian tubes, Uterus, Upper vagina Male genital ducts, Seminiferous tubules Seminiferous tubules Leydig cells HCG from placenta induces Leydig cells to make The mesonephric ducts regress The paramesonephric ducts develop into the female duct system. In the absence of testis, female external genitalia develop regardless of whether an ovary is present Sertoli cells Paramesonephric ducts Factors necessary for normal sexual development Testosterone, dihydroxytestosterone Turner sendromu • 50% 45,X • 25% mosaics Turner sendromu Anöploidly eşem kromozomları - 1 / 400 erker canlı doğanlarda - 1 / 650 dişi canlı doğanlarda Turner sendromu (45, X) - 1 /2,000 dişi doğumlarda - Seksüel gelişimde gerilik - Kısa boylu, boyun kalın, - 1% tüm gebeliklerde 45,X - 99% fetus doğum öncesi ölür - 75% baba kökenli Triplo- X (47, XXX) - 1:1000 dişilerde XXX - fenotype - Eşem bozuklıkları, mental gerilik - X-inaktivasyonu ile etkilenir Klinefelter Sendromu (47, XXY) - erkek ekstra X-chromosomu - 1 / 1000 canlı doğumda - XXYY, XXXY, XXXXY - Çoğu Klinefelter normal görünümlü - Fenotip bozuklukları. - Erkek sterilitesi. - Testesteron tedavisi 47,XXY - Klinefelter sendromu 1/1000 male births Variantları – 48,XXYY; 48,XXXY; 49,XXXXY – Klinelter de X kromatini XYY syndrome (Jacobs Syndrome) 1/ 1000 male births 1961 1965 - Patricia Jacobs - 197 suçlu Scotland’da - 7 ekstra Y chromosomu Agresif davranım? 47,XYY X Y YY Eşem Kromozom Anöploidileri Situation Normal Female Nondisjunction Oocyte Sperm Consequence X Y 46, XY normal male X X 46, XX normal female XX Y 47, XXY Klinefelter syndrome XX X 47, XXX triplo-X Y 45, Y nonviable X 45, X Turner syndrome Male Nondisjunction (meiosis I) X X XX 47, XXX triplo-X Male nondisjunction (meiosis II) X YY 47, XYY Jacobs syndrome X 45, X Turner syndrome 45, X Turner syndrome Canlı doğumda en çok rastlanan sayı anormalileri Otozomlar Down sendromu (trisomy 21: 47,XX, 21+) Edwards sendromu (trisomy 18: 47,XX, 18+) Patau sendromu (trisomy 13: 47,XX, 13+) Gonozomlar Turner sendromu 45,X Klinefelter sendromue 47,XXY Tüm kromozomlar Triploidy (69 kromozom)