tc istanbul üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü danışman prof.dr

advertisement
T.C.
ĐSTANBUL ÜNĐVERSĐTESĐ
SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
(DOKTORA TEZĐ )
ANTĐOKSĐDAN-OKSĐDAN ETKĐLEŞĐMLERĐNĐN
OKSĐDATĐF STRES VE FARKLI HÜCRE ÖLÜM
SÜREÇLERĐNE ETKĐSĐ
SABĐHA TOK
DANIŞMAN
PROF.DR.RÜSTEM NURTEN
BĐYOFĐZĐK ANABĐLĐM DALI
BĐYOFĐZĐK PROGRAMI
ĐSTANBUL-2015
iv
ĐTHAF
Aileme ithaf ediyorum…
v
TEŞEKKÜR
Bu tez çalışmasının yürütülmesinde bana destek olan tez danışmanım sayın Prof.
Dr. Rüstem Nurten’e, tecrübelerini benimle paylaşan sayın Doç. Dr. Handan
Akçakaya’ya, tüm Biyofizik Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve çalışanlarına, sayın Ali
Öztürk’e, DETAE Đmmünoloji Anabilim Dalı’ndan sayın Doç. Dr. Suzan Adın Çınar’a,
aileme ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Bu çalışma, Đstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
desteklenmiştir. Proje No: 20372
vi
ĐÇĐNDEKĐLER
TEZ ONAYI .................................................................................................................... ĐĐ
BEYAN........................................................................................................................... ĐĐĐ
ĐTHAF.............................................................................................................................ĐV
TEŞEKKÜR..................................................................................................................... V
ĐÇĐNDEKĐLER ...............................................................................................................VĐ
TABLOLAR LĐSTESĐ..................................................................................................... X
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ ......................................................................................................XĐ
SEMBOLLER / KISALTMALAR LĐSTESĐ ..............................................................XVĐ
ÖZET ...........................................................................................................................XĐX
ABSTRACT.................................................................................................................. XX
1. GĐRĐŞ VE AMAÇ......................................................................................................... 1
2. GENEL BĐLGĐLER ...................................................................................................... 6
2.1. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller ...................................................................... 6
2.2. Antioksidanlar ........................................................................................................ 10
2.2.1. β-karoten ........................................................................................................... 11
2.3. Hücre Ölüm Çeşitleri ............................................................................................. 15
2.3.1. Apoptoz ............................................................................................................. 23
2.3.1.1. Apoptotik Hücrede Meydana Gelen Yapısal Değişimler............................. 24
2.3.1.2. Apoptoz Mekanizmaları ve Mitokondrinin Apoptozdaki Rolü ................... 25
2.3.2. Nekroz ............................................................................................................... 29
2.3.3. Otofaji ............................................................................................................... 30
2.4. Kanser Hücreleri ve Kanser Hücrelerinin Hücre Kültüründeki Davranışları ........ 33
2.4.1. K562 ve MCF-7 Kanser Hücreleri .................................................................... 34
2.5. Hücre Döngüsü ...................................................................................................... 36
3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................................... 38
3.1. GEREÇLER ........................................................................................................... 38
3.1.1. Kimyasal Maddeler ........................................................................................... 38
3.1.2. Kitler ................................................................................................................. 39
3.1.3. Antikorlar .......................................................................................................... 39
3.1.4. Antioksidanlar ................................................................................................... 40
vii
3.1.5. Çalışmada Kullanılan cihazlar .......................................................................... 40
3.1.6. Çalışmada Kullanılan Eriyikler......................................................................... 41
3.1.6.1. FACS Analizi ve Floresan Boyama ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi için
Kullanılan Eriyikler................................................................................................... 41
3.1.6.2. Sitozolik ve Mitokondriyal Hücre Kesimlerinin Hazırlanması Đçin
Kullanılan Eriyikler................................................................................................... 41
3.1.6.3. PAGE Đçin Kullanılan Eriyikler ................................................................... 42
3.1.6.4. Western Emdirimi Đçin Kullanılan Eriyikler ................................................ 43
3.1.6.5. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulaması Đçin Kullanılan Eriyikler ........ 43
3.2. YÖNTEMLER ....................................................................................................... 43
3.2.1. Hücre Kültürü ................................................................................................... 43
3.2.1.1. Hücrelerin Bakımı ........................................................................................ 43
3.2.1.2. Hücrelerin Pasajlanması ............................................................................... 43
3.2.1.3. Hücre Sayımı ve Ekimi ................................................................................ 44
3.2.1.4. Hücrelerin Dondurulması ............................................................................. 45
3.2.1.5. Hücrelerin Çözülmesi................................................................................... 45
3.2.2. Hücre Canlılığının Belirlenmesi ....................................................................... 45
3.2.3. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulamaları .................................................. 46
3.2.3.1. Hücrelere H2O2 Uygulanması....................................................................... 46
3.2.3.2. Hücrelere β-Karoten Uygulanması .............................................................. 46
3.2.3.3. Hücrelere H2O2 ve β-Karoten’in Birlikte Uygulanması ............................... 47
3.2.4. FACS Analizi ile Mitokondri Membran Potansiyelinin (∆Ψm) Belirlenmesi . 47
3.2.5. Đmmünfloresan Yöntemi ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi......................................... 48
3.2.6. Erken Apoptotik Hücrelerin AnnV Uygulaması Đle Belirlenmesi .................... 48
3.2.7. Nekrotik ve Apoptotik Hücrelerin AnnV - PI Uygulaması ile Belirlenmesi .... 49
3.2.8. Hücrelerin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlere Ayrılması ........................... 49
3.2.9. Liyofilizasyon ................................................................................................... 50
3.2.10. Protein Derişimlerinin Fluorometre ile Belirlenmesi ..................................... 51
3.2.11. Elektroforez ve Membrana Aktarım ............................................................... 51
3.2.12. Western Emdirim Analizi ............................................................................... 51
3.2.13. DNA (Hücre Döngüsü) Analizi ...................................................................... 52
4. BULGULAR............................................................................................................... 53
4.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi ......................................... 53
viii
4.2. Oksidatif Stresin K562 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği Değişiklikler
....................................................................................................................................... 54
4.3. Oksidatif Strese Maruz Kalan K562 Hücrelerinde Apoptoz ve Nekrozun
Belirlenmesi .................................................................................................................. 57
4.4. β-karoten’in K562 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi ........................................... 62
4.5. K562 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı
βkarotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi .............................................................. 65
4.5.1. K562 Hücrelerine H2O2 ve β-karotenin Aynı Anda Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................................................... 65
4.5.2. K562 Hücrelerine Önce H2O2 Sonra β-karoten Uygulanması ile ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................................................... 67
4.5.3. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................................................... 70
4.6. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasından Sonra Erken
Apoptotik Sürecin Belirlenmesi .................................................................................... 72
4.7. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra Yüksek Derişimlerde H2O2
Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler ........................................... 74
4.8. Antioksidan-Oksidan Etkileşimlerinin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine
Etkisi ............................................................................................................................. 76
4.8.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi ....................... 77
4.8.2. β-karoten’in K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi............................... 79
4.8.3. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasının K562 Hücre Döngüsü Fazları
Üzerine Etkisi.............................................................................................................. 80
4.9. Oksidatif Stres Etkisiyle K562 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal
Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler ...... 87
4.10. Antioksidan-oksidan Etkileşimleri Sonucu K562 Hücrelerinin Sitozolik ve
Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki
Değişiklikler .................................................................................................................. 90
4.11. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücreleri Üzerine Etkisi ............................................ 100
4.11.1. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi ............................. 100
4.11.2. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği
Değişiklikler .............................................................................................................. 104
4.11.3. Oksidatif Stres Etkisiyle MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal
Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler .. 109
4.12. β-karoten’in MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi .................................... 111
ix
4.13. MCF-7 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı
βkarotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi ............................................................ 112
4.13.1. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücre Canlılığı ve
Proliferasyonunda Meydana Gelen Değişiklikler ..................................................... 112
4.13.2. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler ................................................................................... 114
4.13.3. Önce β-karoten Sonra H2 O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve
Mitokondriyal Kesimlerindeki Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki
Değişiklikler .............................................................................................................. 119
5. TARTIŞMA .............................................................................................................. 121
KAYNAKLAR ............................................................................................................. 133
ÖZGEÇMĐŞ .................................................................................................................. 149
x
TABLOLAR LĐSTESĐ
Tablo 2-1: Bcl-2 ailesi proteinleri................................................................................... 26
Tablo 2-2: Hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan bazı kanser hücre dizileri. ........ 34
Tablo 4-1: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış canlı ve erken apoptotik hücre
popülasyonundaki değişim yüzdeleri.............................................................................. 60
Tablo 4-2: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama sonucu G2 bölgesinde kapılanmış canlı, erken apoptotik, geç apoptotik ve
nekrotik hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri. .................................................... 62
xi
ŞEKĐLLER LĐSTESĐ
Şekil 2-1: Serbest radikal oluşumu. .................................................................................. 7
Şekil 2-2: Antioksidan-oksidan dengenin bozulması ile oksidatif stres oluşumu. ........... 9
Şekil 2-3: Oksidatif strese maruz kalan hücre. ............................................................... 10
Şekil 2-4: Antioksidan ve serbest radikal etkileşimi. ..................................................... 11
Şekil 2-5: Nekroptoz. ...................................................................................................... 16
Şekil 2-6: Kornifikasyon................................................................................................. 17
Şekil 2-7: NEToz. ........................................................................................................... 18
Şekil 2-8: Mitotik katastrof. ............................................................................................ 19
Şekil 2-9: Anoikis. .......................................................................................................... 20
Şekil 2-10: Entoz. ........................................................................................................... 22
Şekil 2-11: Mitotik katastrof, apoptoz, nekroz ve otofajik vakuolizasyonun yapısal
görüntüleri....................................................................................................................... 22
Şekil 2-12: Apoptozun son evresi. .................................................................................. 25
Şekil 2-13: Mitokondriyal hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz. .......................................... 28
Şekil 2-14: Apoptozun ölüm reseptörü yolu ile mitokondri yolunun etkileşimi. ........... 29
Şekil 2-15: Otofajik hücre ölümü. .................................................................................. 31
Şekil 3-1: Hemositometrede hücre sayımı. ..................................................................... 44
Şekil 3-2: Tripan mavisi ile boyanan hücrelerin lam üzerine aktarımı........................... 45
Şekil 3-3: Tripan mavisi testi ile canlı ve ölü hücrelerin belirlenmesi. .......................... 46
Şekil 4-1: H2 O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak K562 hücre canlılığındaki
değişim. ........................................................................................................................... 54
Şekil 4-2: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık
mikroskobu görüntüsü. ................................................................................................... 54
Şekil 4-3: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen
değişiklikler. ................................................................................................................... 56
Şekil 4-4: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre profilindeki değişiklikler. .................... 57
Şekil 4-5: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama ile apoptoz ve nekrozun belirlenmesi. .......................................................... 60
Şekil 4-6: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnVPI boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış apoptotik (a) ve nekrotik (b) hücre
popülasyonundaki değişim yüzdeleri.............................................................................. 61
xii
Şekil 4-7: 24 saat süre ile farklı derişimlerde β-karoten uygulamasının K562
hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. ........................................................................................... 63
Şekil 4-8: 1 µM β-karotenin uygulama süresine (24, 48, 72 saat) bağlı olarak K562
hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi. ............................................................................................ 64
Şekil 4-9: K562 hücre profilleri ...................................................................................... 64
Şekil 4-10: Farklı derişimlerde H2O2 ve 1 µM β-karoten ile aynı anda işlem görmüş
K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ........................................... 66
Şekil 4-11: K562 hücre profilleri .................................................................................... 66
Şekil 4-12: Aynı anda H2O2 ve β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece
H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı
gösterimi. ........................................................................................................................ 67
Şekil 4-13: Farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulamasından sonra 1 µ M β-karoten ile
işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ..................... 68
Şekil 4-14: K562 hücre profilleri ................................................................................... 69
Şekil 4-15: Önce H2O2 sonra β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2
ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı
gösterimi. ........................................................................................................................ 69
Şekil 4-16: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (100-1000 µM) H2O2 ile
işlem görmüş K562 hücrelerinin zamana bağlı (24, 48, 72 saat) ∆Ψm’nde meydana
gelen değişiklikler. .......................................................................................................... 70
Şekil 4-17: K562 hücre profilleri ................................................................................... 71
Şekil 4-18: Önce β-karoten sonra H2O2 ile işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2
ile işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı
gösterimi. ........................................................................................................................ 71
Şekil 4-19: Önce 1µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562
hücrelerinin zamana bağlı AnnV cevabı......................................................................... 72
Şekil 4-20: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin AnnV
cevabı. ............................................................................................................................. 73
Şekil 4-21: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin 24 ve 48. saatlerdeki
AnnV cevabı ve hücre profili.......................................................................................... 74
Şekil 4-22: Önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş
K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler. ........................................... 75
xiii
Şekil 4-23: Önce 1 µM β-karoten sonra 10 mM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş K562
hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüsü. ........................................................................ 76
Şekil 4-24: Farklı şekillerde işlem görmüş K562 hücrelerinin ışık mikroskobu
görüntüleri....................................................................................................................... 76
Şekil 4-25: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA
analizi. ............................................................................................................................. 77
Şekil 4-26: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hüce döngüsü
falarındaki değişiklikler .................................................................................................. 78
Şekil 4-27: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi. ............ 79
Şekil 4-28: Kontrol hücreleri ile 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin
G1, S ve G2 fazlarındaki değişimin karşılaştırmalı grafiği. ........................................... 80
Şekil 4-29: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş
K562 hücrelerinin DNA analizi. ..................................................................................... 81
Şekil 4-30: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş
K562 hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler. ............................................................. 83
Şekil 4-31: Önce 1 µM β-karoten sonra 2 mM, 4 mM ve 10 mM H2O2 ile işlem görmüş
K562 hücrelerinin DNA analizi. ..................................................................................... 84
Şekil 4-32: Kontrol grubu hücreleri ile önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde
(2, 4, 10 mM) H2O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S ve G2 fazlarının
karşılaştırmalı grafiği. .................................................................................................... 85
Şekil 4-33: K562 hücre döngüsü fazlardaki değişim grafiklerinin karşılaştırmalı
gösterimi ......................................................................................................................... 87
Şekil 4-34: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere
ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. .................................................... 88
Şekil 4-35: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere
ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. .................................................... 89
Şekil 4-36: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere
ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim analizi. .................................................... 90
Şekil 4-37: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten
sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim
analizi. ............................................................................................................................. 91
xiv
Şekil 4-38: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten
sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim
analizi. ............................................................................................................................. 92
Şekil 4-39: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten
sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western emdirim
analizi. ............................................................................................................................. 93
Şekil 4-40: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile
işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin
western emdirim analizi .................................................................................................. 94
Şekil 4-41: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile
işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin
western emdirim analizi .................................................................................................. 95
Şekil 4-42: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile
işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin
western emdirim analizi .................................................................................................. 96
Şekil 4-43: Farklı deney gruplarındaki a) Sitokrom c, b) Smac/D, c) Bcl-2, d) BCL-X,
e) AIF, f) Apaf-1’in mitokondriyal ve sitozolik hücre kesimlerindeki miktarlarındaki
değişikliklerin western emdirim analizi ile gösterimi ve ImageJ programı kullanılarak
belirlenen bant yoğunluklarının histogram gösterimi. .................................................... 99
Şekil 4-44: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücre canlılığındaki
değişim. ......................................................................................................................... 101
Şekil 4-45: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücre
proliferasyonundaki değişim......................................................................................... 101
Şekil 4-46: Farklı derişimlerde H2O2 ile a) 24 saat, b) 48 saat, c) 72 saat işlem görmüş
MCF-7 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık mikroskobu görüntüsü. ..................... 103
Şekil 4-47: Oksidatif stres etkisiyle MCF-7 ve K562 hücre canlılıklarındaki değişimin
karşılaştırmalı gösterimi. .............................................................................................. 104
Şekil 4-48: 100 µM H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm ve hücre
profilindeki değişim. ..................................................................................................... 105
Şekil 4-49: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen
değişiklikler. ................................................................................................................. 106
Şekil 4-50: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücre profilindeki değişiklikler. ............. 107
xv
Şekil 4-51: MCF-7 hücrelerinin Rho123 ile ∆Ψm analizinin floresan mikroskobu
görüntüsü. ..................................................................................................................... 108
Şekil 4-52: Farklı Derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin
floresan mikroskobu görüntüsü. ................................................................................... 108
Şekil 4-53: Farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin western
emdirim analizi ............................................................................................................. 110
Şekil 4-54: Farklı derişimlerde 24 saat β-karoten uygulamasının MCF-7 hücrelerinin
∆Ψm’ne etkisi. .............................................................................................................. 111
Şekil 4-55: Farklı derişimlerde β-karoten ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücre
profilleri. ....................................................................................................................... 112
Şekil 4-56: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde 24 saat H2O2 uygulanmış
MCF-7 hücrelerinin a) canlılık b) proliferasyonundaki değişim. ............................... 113
Şekil 4-57: Önce 2 µM β-karoten sonra 24 saat farklı derişimlerde H2O2 uygulanmış
MCF-7 hücrelerinin canlılığındaki değişim.................................................................. 114
Şekil 4-58: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (250-1000 µM) H2 O2 ile 24
ve 48 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler.115
Şekil 4-59: 1 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile
muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. ........................ 116
Şekil 4-60: Önce 2 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF7 hücrelerinin a) ∆Ψm’ndeki değişiklikler, b)hücre profillerindeki değişiklikler. ....... 117
Şekil 4-61: 2 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile
muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü. ........................ 118
Şekil 4-62: Önce β-karoten (1 µM ve 2 µM) sonra H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF7 hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin
karşılaştırmalı gösterimi. .............................................................................................. 119
Şekil 4-63: Önce β-karoten (1 ve 2 µM) sonra H2O2 (500, 750 ve 1000 µ M) ile işlem
gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış MCF-7 hücrelerinin
sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirim analizleri. ......................... 120
xvi
SEMBOLLER / KISALTMALAR LĐSTESĐ
AA
Akrilamit
AIF
Apoptoz indükleyici faktör
AnnV
Anneksin V
Apaf-1
Apoptotik proteaz aktifleştirici faktör-1
APS
Amonyum per sülfat
ATP
Adenozin trifosfat
BA
Bis-Akrilamit
BCIP
Bromokloroindolfosfat
BSA
Sığır serum albumini
β-karoten
Beta-karoten
Ca
Kalsiyum
cDMEM
complete DMEM
CEN
Tavuk eritrosit çekirdeği
CTN
Buzağı timosit çekirdeği
Cu
Bakır
CV
Varyasyon katsayısı
Cyt c
Sitokrom c
dH2O
distile su
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimetil sülfoksit
DNA
Deoksiribonükleikasit
DSBs
DNA çift zincir kırıkları
EDTA
Etilen diamin tetra asetik asit
ER
Endoplazmik Retikulum
FACS
Floresan Aktif Hücre Ayırıcı
FBS
Fetal sığır serumu
Fe
Demir
FITCH
Floreseinizotiyosiyonat
xvii
g
gram
Gap
Aralık
Go
Go fazı
G1
G1 fazı
G2
G2 fazı
G6PD
Glukoz-6-fosfat-dehidrogenaz
H2O2
Hidrojen peroksit
IgG
Đmmunglobulin G
Kaspaz
Sistein bağımlı aspartat spesifik proteaz
K562
Đnsan eritrolösemi hücresi
M
Mitoz
MET
Merkaptoetanol
mg
miligram
Mg
Magnezyum
ml
mililitre
mM
milimolar
NET
Nötrofil hücre dışı tuzağı
NCCD
Hücre Ölümü Nomenklatür Komitesi
NBT
Nitrobluetetrazolyum
ort
ortalama
PBS
Fosfat tuzu tamponu
PI
Propidyum Iyodid
PMSF
Fenilmetilsülfonilflorit
PS
Fosfotidil serin
QC
Kalite kontrol
Rho123
Rodamin 123
RIP1
Reseptörle etkileşen protein1
RIP3
Reseptörle etkileşen protein3
ROS
Reaktif oksijen türleri
S
Sentez
xviii
SDS-PAGE
Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Smac/D
Smac/DIABLO
SOD
Süperoksit Dismutaz
Std
Standart
TEMED
Tetrametilendiamin
TNF
Tümör Nekroz Faktör
Tris
Tris (hidroksimetil) aminometan
µl
Mikrolitre
µM
Mikromolar
∆Ψm
Mitokondri membran potansiyeli
xix
ÖZET
Tok, S. Antioksidan Oksidan Etkileşimlerinin Oksidatif Stres ve Farklı Hücre Ölüm
Süreçlerine Etkisi. Đstanbul Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik Anabilim
Dalı. Doktora Tezi. Đstanbul. 2015
Hücrede normal metabolik olaylar sırasında oluşan reaktif oksijen türleri
antioksidan savunma mekanizmalarıyla ortadan kaldırılarak dengelenmektedir.
Antioksidan-oksidan dengenin bozulması ise kanser başta olmak üzere birçok hastalığın
patogenezinden sorumlu tutulan oksidatif strese neden olmaktadır. Oksidatif stres etkisi
ile protein, lipid ve membran yapılarının hasarlanması apoptoz veya farklı hücre
ölümlerinin aktifleşmesine yol açar. Oksidatif stres antioksidan savunma
mekanizmalarıyla önlenir ya da onarılır. Antioksidanlar, serbest radikallerle reaksiyona
girerek hücresel düzeydeki hasarı engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu
durdurmaktadırlar. Bu nedenle hastalıkların tanı ve tedavisine yönelik çalışmalarda,
antioksidan uygulamaları ile antioksidan-oksidan etkileşimleri ve farklı hücre ölüm
süreçlerinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır.
Antioksidan-oksidan etkileşimlerinin oksidatif stres ve farklı hücre ölüm
süreçlerine etkisini belirlemek amacı ile K562 ve MCF-7 kanser hücrelerinde H2 O2 ve
β-karoten farklı şekillerde etkileşime sokularak çeşitli analiz yöntemleri kullanılarak
oksidatif hasar, mitokondri membrane potansiyelindeki değişiklikler, hücre döngüsü
fazlarındaki değişiklikler, apoptotik ve nekrotik hücreler, sitozolik ve mitokondriyal
hücre kesimlerindeki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin miktarındaki
değişiklikler, farklı ölüm süreçleri, yapısal (morfolojik) değişiklikler ve hücre
canlılıkları belirlendi. H2O2 ile indüklenen oksidatif strese karşı K562 hücrelerinin
MCF-7 hücrelerinden daha dirençli olduğu gösterildi. Oksidatif stres etkisiyle K562
hücrelerinin apoptotik yolla ölüme gittiği belirlendi. H2O2 ile farklı şekillerde etkileşime
sokulan β-karotenin, uygulama şekline ve zamana bağlı olarak, antioksidan ve
prooksidan olarak etki ettiği gösterildi. K562 hücrelerindeki oksidatif hasarın 1 µM
β-karoten ile önlenebildiği, MCF-7 hücrelerinde ise ancak 2 µM β-karotenin etkili
olduğu belirlendi. K562 hücreleri, 1 mM’dan daha yüksek derişimlerde H2O2
uygulanmadan önce β-karoten ile muamele edildiğinde ise hücrelerin farklı bir ölüm
sürecine girdiği ve bu ölüm şeklinin hücre döngüsü fazlarından bağımsız olarak
gerçekleştiği gösterildi.
Anahtar Kelimeler: Oksidatif stres, hücre ölümü, antioksidan, mitokondri, β-karoten
Bu çalışma, Đstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
desteklenmiştir. Proje No: 20372
xx
ABSTRACT
Tok, S. Effect of Antioxidant-Oxidant Interactions on Oxidative Stress and Different
Cell Death Processes. Đstanbul University, Institute of Health Science, Department of
Biophysics. Doctoral Thesis. Đstanbul. 2015
Reactive oxygen species formed in the cell during regular metabolic events are
balanced via removal of those by antioxidant defense mechanisms. Disruption of
antioxidant-oxidant balance gives rise to oxidative stress which is responsible for
pathogenesis of many diseases, especially cancer. Damaging proteins, lipids and
membrane structures via oxidative stress causes activation of apoptosis or different cell
death mechanisms. Oxidative stress is prevented or repaired by antioxidant defense
mechanisms. Reacting with free radicals, antioxidants prevent damage at the cellular
level and suspend generation of degenerative diseases. Therefore, to study diagnosis and
treatment of many diseases; antioxidant treatment and to identify antioxidant-oxidant
interactions and different cell death processes are very crucial.
To identify the effects of antioxidant-oxidant interactions on oxidative stress and
different cell death processes, via interacting H2O2 with β-carotene in different ways in
K562 and MCF-7 cancer cells and employing several analysis methods; oxidative
damage, changes in mitochondrial membrane potential, changes in cell cycle phases,
apoptotic and necrotic cells, changes in proapoptotic and antiapoptotic protein quantities
in
cytosolic
and
mitochondrial cell fractions,
different
death
mechanisms,
morphological changes, and cell viabilities are identified. It’s shown that compared to
MCF-7 cells K562 cells are more resistant to oxidative stress induced by H2O2. It’s also
identified that K562 cells dies via apoptotic ways with the effect of oxidative stress. It’s
shown that β-carotene reacting with H2 O2 in various ways acts as antioxidant or
prooxidant depending on treatment procedure and time. It’s identified that oxidative
damage in K562 cells could be prevented by 1 µM β-carotene whereas the effective
dose in MCF-7 cells is 2 µM. Finally, it’s shown that when K562 cells are treated with
β-carotene before treatment of H2O2 concentrations above 1 mM, they enter different
cell death processes and this death mechanism proceeds independent of cell cycle
phases.
Key Words: Oxidative stress, cell death, antioxidant, mitochondria, β-carotene.
The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project
No. 20372
1. GĐRĐŞ VE AMAÇ
Oksijenin belirli koşullarda kısmen indirgenmesi sonucu çok kısa ömürlü ve
güçlü oksidan nitelikli reaktif oksijen türleri (ROS) oluşmakta ve bunlar organizmada
moleküler düzeyde birçok biyolojik etkiye neden olmaktadırlar. ROS’daki artış; nükleik
asitler, proteinler ve lipidleri de içeren hücre komponentlerinin hasarına neden olduğu
için nörodejeneratif bozukluklar ve kanser başta olmak üzere birçok hastalığın
patogenezinde rol oynamaktadır. Kanserde gen anlatımına (ekspresyonuna) neden olan
DNA hasarında da ROS rol oynamaktadır. Hücre döngüsüyle ilişkili protein
anlatımındaki değişiklikler, protoonkogenlerin aktifleşmesinde ve bazı tümor süpresör
genlerin inaktifleşmesinde de ROS’un rol oynadığı bildirilmiştir1–3. ROS’ların hücre
dışı ve hücre içi apoptoz tetikleme mekanizmalarında etkili oldukları ve apoptotik süreci
gen düzeyinde etkiledikleri yapılan in vitro ve in vivo çalışmalar sonucunda
ıspatlanmıştır. ROS’ların hücre ölümünü tetikleme kapasitesinin belirlenmesi ile son
yıllarda kanser tedavisinde de ROS’ların kemoterapatik ajanları destekleyici olarak
kullanılması ile ilgili çalışmalar yoğunlaşmıştır.
ROS’lar çok düşük derişimlerde, bazı sinyal ileti yolaklarında ikinci haberci
olarak davranabilmektedirler4 fakat, aşırı üretildikleri zaman hücrenin birçok hayati
bileşeninde oksidatif hasara neden olmaktadırlar. Normalde, hücrede oluşan ROS
antioksidan savunma mekanizmalarıyla ortadan kaldırılır. Antioksidan savunma
mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROS oluşumu birçok
hastalığın patogenezinden sorumlu tutulan oksidatif strese neden olmaktadır.
Alzheimer, Parkinson, Đskemi/reperfüzyon hasarı gibi birçok hastalık sürecinde
oksidatif stres görülmektedir.
Mitokondri hücre içi ROS oluşturan etkenlerin başında gelmektedir çünkü
mitokondriyal solunum zinciri ROS’ların ana kaynağını oluşturmaktadır. Antioksidan
enzimler ve pek çok antioksidan sistem mitokondride bulunmasına rağmen mitokondri
ROS’ların hem birincil kaynağı hem de ana hedefi konumundadır. Normal solunum
sırasında yaklaşık olarak tüketilen moleküler oksijenin bir kısmı süperoksid anyonuna
dönüşmektedir ve süperoksid anyonunun dismutasyonu ile de hidrojen peroksit (H2O2)
oluşmaktadır. H2O2 radikali; ATP düzeyini azaltır; hücre membranı, DNA, kalsiyum
depoları ve mitokondri gibi hedef yapıların hasarına neden olur. Bu tür radikaller
2
yüksek derişimlerde hücrenin parçalanmasına yol açarlar5. H2 O2 ile indüklenen
mitokondriyal oksidatif stres etkisi ile protein, lipid ve membran yapılarının
hasarlanması hücre ölümünün aktifleşmesine yol açmaktadır. Bu nedenle, hücre ölüm
mekanizmalarıyla
ilgili
yapılan
çalışmaların
büyük
bir
bölümü
apoptozun
düzenlenmesinde önemli rolü olan mitokondride yoğunlaşmaktadır. ROS’ların oluşumu,
mitokondri membran potansiyelinde (∆Ψm) azalmaya ve membranda por oluşumuna
neden olmaktadır. ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler ve oluşan porlar apoptotik ve
proapoptotik proteinlerin sitoplazmaya salınımına ve apoptotik sürecin tetiklenmesine
neden olmaktadır. Dolayısı ile ∆Ψm analizi hücrenin apoptoza yönlendiğini gösteren
önemli belirteçlerden biridir. Bu nedenden dolayı oksidatif stres, hücre ölüm şekilleri ve
bunların mekanizmaları ile ilgili çalışmalarda mitokondriyal parametrelerin incelenmesi
de önem taşımaktadır.
Bugün birçok hücre ölüm şekli tanımlanmaktadır. Çeşitli hücresel strese karşı
ortaya çıkan ve birbirinden farklı mekanizmalara sahip olan hücre ölümleri; genel
olarak apoptotik, nekrotik ve otofajik hücre ölümü olmak üzere üç tipte toplanmaktadır.
Diğerleri ise normalden farklı olan hücre ölüm modellerinin geçici (kesin olmayan)
tanımlarıdır. Şimdiye kadar tanımlanmış hücre ölüm şekilleri nekroptoz, kornifikasyon,
NEToz, mitotik katastrof, anoikis, eksitotoksisite, ‘wallerian’ dejenerasyonu, paraptoz,
piroptoz ve entoz’dur. Bazı dokularda ve belli koşullarda, bazı hücre ölüm
morfolojilerinin birkaç tipi birden aynı hücrede görülebilmektedir. Kanserlerinin
yarısından fazlasında hücre ölümü yolaklarında rol alan genlerden bir veya birkaçında
mutasyon izlenmektedir. Bu yolakların çalışılması, yeni tedavi hedeflerini bulma
açısından büyük önem taşımaktadır. Son yıllarda kanser tedavisi gibi metabolik stres
yaratan durumlarda otofaji kanser tedavisi araştırmalarında önemli yer tutmaya
başlamıştır. Ayrıca nekroz da kanser gelişiminde ve özellikle kanser tedavisi sürecinde
sıklıkla karşılaşılan hücre ölüm mekanizmalarından biridir. Kanser ilaçlarının bir kısmı
tümör hücrelerinde nekrozu uyararak etkili olmaktadır. Klinisyenler tarafından şimdiye
kadar üzerinde en fazla çalışılan hücre ölümü ise apoptozdur.
Apoptoz, çok hücreli organizmaların genetik şifrelerinde bulunan “hücre
intiharı” programlarının gelişimsel ve/veya çevresel uyarımlarla etkinleşmesi sonucu
ortaya çıkan, gelişim ve farklılaşma sırasında organ yapısı ve işlevlerinin aktif
değişimini sağlayan fizyolojik hücre ölümü olarak tanımlanmaktadır6. Apoptoz hücresel
3
homeostazın sürdürülmesinde önemli role sahiptir. Birçok patalojik ve fizyolojik olayda
etkin rol oynamaktadır. Apoptoz ve hücre çoğalması arasında kontrollü bir denge vardır.
Bu denge apoptoz lehine bozulduğunda Alzheimer, Parkinson gibi nörodejeneratif
hastalıklar, hücre çoğalması lehine bozulduğunda ise kanser ve otoimmün hastalıklar
meydana gelmektedir. Bu hastalıkların engellenmesi ya da tedavi edilebilmesi için
apoptozu kontrol eden mekanizmaların iyi anlaşılması gerekmektedir. Çünkü dejeneratif
hastalıklarda apoptoz mekanizmaları hızlı ve kontrol dışı çalışırken, kanserlerde tam
tersine apoptoz tetikleyici mekanizmalarda işlev kaybı görülmektedir. Dolayısyla kanser
tedavisinde apoptotik mekanizmalar hedef alınmaktadır ve temel olarak kanser
kemoterapilerinin amacı hücre ölümünü apoptoz yolu ile uyarmaktır. Hücre
metabolizmasında oluşan veya dışarıdan uygulanan oksidanların hücrede mitokondri
kontrollü apoptoz sürecini tetiklediği bilinmektedir7,8. Sitotoksik ilaçlar ve radyoterapi
tümör hücrelerinde apoptozu başlatabilir fakat bu tedaviler normal hücrelerde de
apoptozu uyarabilir, ayrıca daha birçok olumsuz yan etkileri de vardır. Bu nedenle, son
yıllarda antioksidan uygulamaları ile antioksidan-oksidan etkileşimleri üzerindeki
çalışmalara yoğunlaşılarak farklı tedavi yöntemleri aranmaktadır.
Antioksidanlar, serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel düzeydeki hasarı
engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu durdurmaktadırlar. Oksidatif stres
vücuttaki antioksidan savunma mekanizmalarıyla önlenir ya da onarılır. Antioksidanlar,
aktif oksijen oluşumunu engelleyerek ya da oluşan aktif oksijenleri tutarak,
oksitlenmenin neden olduğu zararları, hücresel düzeyde engellemekte ve dejeneratif
hastalıkların oluşumunu durdurmaktadırlar9. Antioksidan özelliği keşfedilen birçok
farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını vücut diyetle alırken, bir kısmını
kendisi, serbest radikallere karşı bir savunma sistemi olarak üretir. Vücudun serbest
radikallere karşı savunma olarak ürettiği antioksidanlar; katalaz, glutatyon peroksidaz
ve SOD gibi enzimlerdir. Đnsan sağlığı bakımından antioksidan işlevleri ile ön plana
çıkan maddeler ise A, E ve C vitaminleri, fenolik maddeler ve karotenoidlerdir. Kanser
ve hücre ölümü çalışmalarında en çok kullanılan karotenoid ise β-karotendir.
β-karotenin şimdiye kadar üzerinde en fazla çalışılan bileşik olmasının sebebi, birçok
ülkede yetişen meyve ve sebzelerde en çok görülen ortak karotenoid olmasıdır.
β-karoten serbest oksijen radikallerinin oluşumunu önlemesinin yanı sıra radikallerle
doğrudan reaksiyona girebilir10. A vitamininin suda eriyebilen öncülü olan β-karoten
güçlü bir antioksidan olup dokularda peroksil radikallerinin yakalanmasından
4
sorumludur. β-karotenin özellikle kimyasal karsinogenezde koruyucu rolü olduğu
bilinmektedir11. β-karoten’nin apoptoz ve hücre döngüsünü G2/M fazında tutuklayarak,
birçok
insan
kolon
adenokarsinoma
hücre
soyunun
çoğalmasını engellediği
bildirilmiştir12. Bu etkilerin doza ve zamana bağlı olarak ve tamamen hücrenin
karotenoidleri depolama yeteneği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. β-karoten’nin
bcl-2 gen ailesinden olan ve programlı hücre ölümünde inhibitör olarak görev yapan
Bcl-2 ve Bcl-xL anlatımlarını da azalttığı belirlenmiştir. Đnsan ve hücre kültüründe
yapılan bazı çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre belli koşullarda β-karoten’nin
oksidan etki gösterdiği de belirlenmiştir. β-karoten’nin derişime ve hücrenin biyolojik
çevresine bağlı olarak antioksidan ya da prooksidan olarak etki eden bir hücreiçi redoks
ajanı olabileceği bildirilmiştir.
Oksidanlara maruz kalan hücrelerin apoptoza yönlenmesinde hücre döngüsünün
hangi aşamasında olduğu da belirleyici bir etmendir13. Hücre döngüsü farklı moleküler
mekanizmaların tetiklenmesiyle farklı metabolik süreçlerin işlev gördüğü fazlardan
oluşmaktadır. Bunlar, genel olarak Go (dinlenme fazı), G1 (Gap1), S (DNA sentezi), G2
(Gap2) ve M (mitoz bölünme) fazları olarak ifade edilmektedir. Her bir fazda enerji
gereksinimleri farklı olduğundan, enerji üretiminden sorumlu olan mitokondri
reaksiyonları da farklılık göstermektedir. Kanserle ilgili yapılan çalışmalarda hücre
döngüsü çalışmaları önemli yer tutmaktadır. Çünkü kanser aşırı hızda bölünen ya da
apoptoza direnen hücrelerin yarattığı bir
sorundur. Hücreler bir sorun
ile
karşılaştıklarında, önce DNA’da oluşan hasarlarını hücre döngüsünü G2 fazında
tutuklayarak DNA tamir mekanizmaları ile tamir etmekte, çevresel faktörlerin iyi
olmaması durumunda ise hücre bölünmesini G1 fazında durdurarak şartların
iyileşmesini beklemektedirler. Bu şekilde de mümkün olmuyorsa apoptotik yolla intihar
etmekte ya da farklı programlı hücre ölümleri ile yok edilmektedirler. Dolayısıyla,
oksidatif stres ve hücre ölümüyle ilgili yapılan çalışmaların DNA analizleriyle de
desteklenmesi önemlidir. DNA analizleri, uygulanan tedavilerin geçerliliği ve tedaviye
cevap alınıp alınamadığı konusunda önemli bilgiler verir.
Bu çalışmada, serbest radikallerin farklı kanser hücre soylarında (K562 ve
MCF-7) meydana getirdiği oksidatif hasara karşı, antioksidan özelliği ile ön plana
çıkmış olan β-karoten’in etkisi ve antioksidan-oksidan etkileşimlerinin farklı hücre
ölüm
süreçlerine
etkisinin
araştırılması
amaçlanmıştır.
Antioksidan-oksidan
5
uygulamalarına bağlı olarak hücrelerde meydana gelen yapısal ve işlevsel değişiklikler
farklı analiz yöntemleri kullanılarak araştırıldı. ∆Ψm’ndeki değişiklikler floresan
mikroskobu ve FACS “Florescein Activating Cell Sorter” analizleriyle, apoptotik ve
nekrotik hücreler AnneksinV-Propidyum iyodid (AnnV-PI) analiziyle, hücre döngüsü
fazlarındaki değişiklikler DNA analizleriyle, sitozolik ve mitokondriyal hücre
kesimlerindeki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin miktarındaki değişiklikler
‘western’ emdirim analizleriyle, hücre canlılıkları tripan mavisi testiyle, yapısal
değişiklikler ise ışık ve floresan mikroskobu ile belirlendi.
6
2. GENEL BĐLGĐLER
2.1. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller
Serbest oksijen radikalleri, dış orbitallerinde bir veya daha fazla eşlenmemiş
elektron içeren moleküler yapılar olarak tanımlanırlar (Şekil 2-1). Oksijenin belirli
koşullarda kısmen indirgenmesi sonucu oluşan çok kısa ömürlü ve güçlü oksidan
nitelikli oksijen metabolitleridir. Bu reaktif maddeler bazı biyolojik molekülleri hasara
uğratabilirler. Çevrelerindeki moleküller ile reaksiyona girerek onlardan elektron alıp
kararlı hale gelirler14. Organizmada serbest oksijen radikallerinin oluşturduğu
reaksiyonlar, radikalin başka bir radikalle veya radikal olmayan ajanlar ile karşılaşması
ile oluşur. Böylece serbest radikaller organizmada moleküler düzeyde birçok biyolojik
etkiye neden olmaktadır. ROS’daki artış, kanser ve norolojik bozukluklar gibi birçok
patalojide merkezi rol oynar15–18. Reaktif oksijen türlerindeki artış toksiktir ve nükleik
asitler, proteinler ve lipidleri de içeren hücre komponentlerini hasara uğratabilir ve bu
artış apoptoz ve nekrozun da gelişmesine neden olmaktadır19. ROS, DNA hasarına,
özellikle en önemli nükleer lezyon olarak kabul edilen DNA çift zincir kırıklarına
(DSBs) neden olmaktadır17–19.
Serbest radikaller, hücrelerde iç ve dış kaynaklı etmenlere bağlı olarak oluşurlar.
Dış kaynaklı etmenler arasında; bazı kimyasalların etkisi altında kalma, ilaç
toksikasyonları, iyonize ve ultraviyole radyasyon, hava kirliliği yapan fitokimyasal
maddeler, sigara dumanı, solventler gibi çevresel faktörler, antineoplastik ajanlar, alkol
ve uyuşturucular gibi alışkanlık yapıcı maddeler bulunması nedeniyle, serbest radikaller
toksikolojik açıdan da önemlidir20. Aerobik organizmalar için serbest radikallerin
başlıca kaynağı moleküler oksijendir. Çünkü oksijen, ortamda sürekli bulunan ve
elektrofilik ataklara en müsait olan moleküldür21. Moleküler oksijen (O2), paralel spin
durumlu iki eşlenmemiş elektrona sahiptir. Oksijen, çok güçlü bir oksidan olmamasına
rağmen, suya redüksiyonu sonucu çok reaktif ara ürünler oluşmasına neden olur; diğer
radikallerle reaksiyona girme özelliğine sahiptir22. Organizmada geçiş metallerini
(Fe
2+
ve Cu
+
gibi metaller) içeren enzimler vasıtasıyla moleküler oksijene tek
elektronların transferi suretiyle oksitlenme reaksiyonları meydana gelir. Moleküler
oksijen, yüksek derecede reaktif oksijen türleri oluşturma eğilimindedir. ROS, normal
7
·−
oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O2 ), hidrojen
.
peroksit ve hidroksil radikali (OH )' dir23. Oksijenin kısmi indirgenmesiyle oluşan
singlet oksijen, süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali gibi
aktifleşmiş oksijen türleri oldukça reaktiftir ve kalp gibi organlarda toksik etkilere yol
açmaktadır24. Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal
•
zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R ),
•
•
•
peroksit radikalleri (ROO ), alkoksi radikalleri (RO ), tiyil radikalleri (RS ), sülfenil
•
•
radikalleri (RSO ), tiyil peroksit radikalleri (RSO2 ) gibi çeşitli serbest radikallerin
oluşumuna neden olurlar23.
Normal oksijen atomu
Elektron kaybı
Serbest radikal
Şekil 2-1: Serbest radikal oluşumu.
H2O2, süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron alması veya
moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan
+
peroksidin iki proton (H ) ile birleşmesi sonucu meydana gelir23. Biyolojik sistemlerde
·−
hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O2 ) dismutasyonu ile olur. Đki
süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak H2O2
ve moleküler oksijeni oluştururlar. Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana
geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da SOD
enzimi tarafından katalizlenir. H2 O2 bir serbest radikal olmadığı halde ROS kapsamına
2+
girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli rol oynar. Çünkü Fe veya diğer geçiş
8
·−
metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin (O2 )
varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen
•
radikali olan hidroksil radikali (OH ) oluşturur. H2 O2 radikali; ATP düzeyini azaltır;
hücre membranı, DNA, kalsiyum depoları ve mitokondri gibi hedef yapıların hasarına
neden olur. Bu tür radikaller yüksek derşimlerde oldukları zaman hücrenin
parçalanmasına yol açarlar5.
ROS’nin zararı dışında yararlı olabildiği durumlar da vadır. ROS sinyal iletim
yolağında aracı olarak fizyolojik rol oynar25. Çok düşük derişimlerde, bazı sinyal ileti
yolaklarında ikinci haberci olarak davranabilmektedir4. Ancak, aşırı üretildiği zaman
hücrenin birçok hayati bileşeninde oksidatif hasara neden olur. Belli hücre sistemlerinin
antioksidan kapasitesi ile ROS üretimi arasında dinamik bir ilişki bulunmaktadır26.
Hücrede oluşan reaktif oksijen türleri, antioksidan savunma mekanizmalarıyla
ortadan kaldırılırlar. Fakat bazen hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan
kaldırılandan daha fazla ROS oluşabilir. Organizmada hücresel savunma mekanizması
vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla ROS’nin meydana gelmesi yani normal
fizyolojik şartlarda bir denge halinde olan bu durumun bozulması sonucunda, birçok
hastalığın patogenezinden sorumlu tutulan oksidatif stres meydana gelir27 (Şekil 2-2).
Kısaca; oksidatif stres, serbest radikallerin oluşumu ve çeşitli antioksidan savunma
sistemlerinin
dengesizliği
olarak
tanımlanabilir28.
Đskemi/reperfüzyon
hasarı,
Alzheimer, Parkinson ve Diyabet ‘diabetes mellitus’u da içeren birçok hastalık
sürecinde oksidatif stres görülmektedir. Kanserde gen anlatımına neden olan DNA
hasarında da ROS rol oynamaktadır. Bu nedenle, hücre döngüsüyle ilişkili protein
anlatımındaki değişiklikler, protoonkogenlerin aktifleşmesi ve bazı tümor süpresör
genlerin inaktifleşmesinde de ROS’un rol oynadığı bildirilmiştir1–3.
9
Denge
AO=ROS
Antioksidan (AO)
Reaktif Oksijen Türleri (ROS)
Oksidatif stres
AO < ROS
Aşırı ROS üretimi
Oksidatif Stres
AO < ROS
Antioksidan eksikliği
Şekil 2-2: Antioksidan-oksidan dengenin bozulması ile oksidatif stres oluşumu.
Oksidatif stres etkisi ile serbest radikallere maruz kalan hücrelerin membran
yapısında bozulmalar meydana gelmektedir (Şekil 2-3). Oksidatif stresin, serbest
oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarıyla birçok kronik hastalığın oluşumuna
katkıda bulunduğu düşünülmektedir23. Oksidatif
stresin etkilediği en önemli
hastalıklardan biri kalp yetersizliğidir. Kalp yetersizliği gelişen hastalarda SOD, CAT,
GSH-Px ve E vitamini gibi miyokardiyal antioksidanlar azalırken, serbest oksijen
radikallerinin ve oksidatif stresin arttığı gösterilmiştir29. Kalp yetersizliği olan
hastalarda olduğu gibi, miyokard infarktüsü geçiren hastalarda da miyokardın infarkt
bölgelerinde miyositlerin apoptozu söz konusudur24. Ayrıca, in vitro çalışmalar ve
hayvan modellerinde, iskemi-reperfüzyon, miyokard infarktüsü ve kronik basınç
yüklenmesi (hipertansiyon) gibi durumların oksidatif stres oluşturarak apoptoz yoluyla
miyosit kaybına neden olduğu gösterilmiştir30.
Oksidatif stresin apoptozdaki rolü
birçok hücre tipinde ortaya konmuştur. Adriamisin, UV ışın ve tümör nekroz faktörü
(TNF), serbest radikal oluşturarak apoptozu hızlandırır. Öte yandan, SOD, E vitamini ve
troloks gibi antioksidanların apoptozu engellediği gösterilmiştir24. Beyin hücreleri
özellikle oksitlenmenin sebep olduğu hasar riskini taşıdığından, oksidatif stres;
Alzheimer hastalığını da içeren çeşitli nörodejeneratif düzensizliklerin patogenezi ile
10
ilişkilendirimektedir31,32. Antioksidanların, kültür nöronlarını oksidatif zarardan
koruyabilidikleri ve son zamanlarda birçok antioksidan bileşiğin sinir koruyucu olduğu
gösterilmiştir28.
Şekil 2-3: Oksidatif strese maruz kalan hücre.
2.2. Antioksidanlar
Antioksidanlar, ROS oluşumu sonucunda gelişen hasarı önlemek için vücutta
geliştirilmiş olan savunma sistemleri olarak bilinirler33. Aktif oksijen oluşumunu
engelleyerek ya da oluşan aktif oksijenleri tutarak, oksitlenmenin neden olduğu
zararları, hücresel düzeyde engellemekte ve dejeneratif hastalıkların oluşumunu
durdurmaktadırlar9. Antioksidanlar serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel
düzeydeki hasarı engellemektedirler (Şekil 2-4). Antioksidanlar, düşük derişimlerde bile
hedeflerinin oksitlenme hızını anlamlı şekilde engelleyen moleküllerdir27. Antioksidan
özelliği keşfedilen birçok farklı madde vardır. Bu maddelerin bir kısmını vücut diyetle
alırken, bir kısmını kendisi, serbest radikallere karşı bir savunma sistemi olarak üretir.
Vücudun serbest radikallere karşı savunma olarak ürettiği antioksidanlar; katalaz,
glutatyon peroksidaz ve SOD gibi enzimlerdir. Đnsan sağlığı bakımından antioksidan
işlevleri ile ön plana çıkan maddeler A, E ve C vitaminleri, karotenoidler ve fenolik
maddelerdir. Fenolik maddeler, meyve, sebze, baharat, tahıl ve içecekler gibi bitkisel
gıdalarda yaygın olarak bulunmaktadırlar. Flavanolleri de içeren flavonoidlerin serbest
radikalleri temizleme, güçlü antioksidan özelliği, hidrolitik ve oksidatif enzimleri
(fosfolipaz A2, sitokrom oksigenaz, lipoksigenaz) tutma ve iltihap önleyici etkinlikleri
bilinmektedir9,34. β-karoten ve α-tokoferol gibi antioksidan özellikleri bilinen maddeler
kanser ve hücre ölümü çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır. Bunlara ek olarak bilimsel
araştırmalar ve klinik protokollerde antioksidan aktiviteleri yaygın olarak kullanılan
11
likopen (domates)35, kuersetin (soğan)36,37, kaempferol (siyah çay)38, proantoyanidin
(sarımsak)39, kateşin (yeşil çay)40, luteolin (enginar)41, resveratrol (üzüm ve kırmızı
şarap)42 ve sülforafanı da (brokoli)43 içeren fitokimyasal maddeler bulunmaktadır44.
Antioksidanların çeşitli çalışma mekanizmaları vardır. Onarıcı etki: serbest
radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması; lipid, protein, ve DNA gibi yapılarda
oluşmakta olan biyolojik moleküler hasarın onarılması45, toplayıcı etki: serbest oksijen
radikallerini etkileyerek onların tutulması veya daha zayıf yeni moleküle çevrilmesi,
zincir kırıcı etki: serbest oksijen radikallerini bağlayarak, zincirlerini kırıp işlevlerinin
engellenmesi46; serbest radikal üreten kimyasal reaksiyonların durdurulması47,
baskılayıcı etki: serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak
etkinliklerinin azaltılması veya inaktif şekle dönüştürülmesi23; reaksiyon hızının
azaltılması48,
hücresel
kinaz
yapılarını
önleyip
oksitlenme
reaksiyonlarının
durdurulması47, organizmadaki SOD gibi antioksidan enzimler ile enzimatik olmayan
antioksidanların sentezininin artırılmasıdır49.
Antioksidan tüketimindeki artış ve kanser görülme sıklığındaki düşüş arasındaki
ilişki ile ilgili de bugüne kadar çok fazla şey irdelenmiştir. Hayvan modelleri ve hücre
kültürleriyle yapılan çalışmalarla desteklenmiş epidemiyolojik çalışmaların sonuçları
karsinogenez sürecinde oksidatif DNA hasarı olduğu teziyle uyuşmaktadır46. Bu
sebeplerden, antioksidan destekleyiciler sık sık kanser önleyici diyet olarak önerilir50.
e=
Antioksidan
Serbest radikal
Normal atom
Şekil 2-4: Antioksidan ve serbest radikal etkileşimi.
2.2.1. β-karoten
A vitamininin suda eriyebilen öncülü olan β-karoten güçlü bir antioksidan olup
dokularda peroksil radikallerinin yakalanmasından sorumludur. β-karotenin özellikle
kimyasal karsinogenezde koruyucu rolü olduğu bilinmektedir11. β-karoten, özellikle
12
düşük oksijen geriliminde, peroksil radikallerini yakalar. Tek değerlikli oksijen
radikallerini bağlayan serbest radikal tutucu olarak etkili bir antioksidan olmasının yanı
sıra, kimyasal karsinogenezi de önler ve bu etkisini, diğer antioksidanlardan farklı
olarak karsinojen ajanlarla çapraz bağlar kurarak gerçekleştirir51.
Karotenoidler, bitkiler ve mikroorganizmalar tarafından sentezlenip, hayvanlar
tarafından sentezlenemeyen, birçok meyve ve sebzeye parlak rengini kazandıran, doğal
pigmentlerdir. Yediğimiz besinlerde onlarca karotenoid vardır ve bu karotenoidlerin
çoğu antioksidan etkiye sahiptir. β-karoten şimdiye kadar üzerinde en fazla çalışılan
karetenoidtir; bunun nedeni ise β-karotenin birçok ülkede yetişen meyve ve sebzelerde
en çok görülen ortak karotenoid olmasıdır. β-karoten ve diğer karotenoidlerin in vitro ve
hayvan modellerinde antioksidan özellikleri belirlenmiştir. Karotenoidlerin karışımı ya
da diğer antioksidanlarla birlikteliği serbest radikallere karşı olan etkilerini arttırır52.
Doğada 600’ün üzerinde karotenoid bulmaktadır. Bunlardan ortalama 40’ı normal bir
insanın diyetinde mevcuttur. Bu karotenoidlerden 14’ü ve bazılarının da metabolitleri
insan kanında ve dokularda tespit edilmiştir53. Birçok epidemiyolojik çalışma
karotenoid tüketiminin artmasıyla, kronik hastalık görülme sıklığının azaldığına işaret
eder. Ne var ki; bu koruyucu mekanizma tamamen anlaşılabilmiş değildir. Bu konuda
çeşitli olasılıklar mevcuttur; bazı karotenoidler, retinoidlere dönüşebilirler (proenzim A
etkinliğine sahiptirler), lipoksigenazların enzimatik etkinliğinini düzenleyebilirler
(proinflamatuar veya bağışıklık düzenleyici molekül), antioksidan özelliğe sahip
olabilirler, bir proteinin üretiminden sorumlu gen anlatımını aktifleştiriyor olabilirler54.
Karotenoidlerin antioksidan etkisinin altında yatan; tek oksijeni tutma özellikleri ve
peroksil radikalleri yakalama yetenekleridir55. Diyette en bol bulunan karotenoid olan
β-karoten insan vücudunda A vitamini molekülüne dönüşmektedir. β-karoten serbest
oksijen radikallerinin oluşumunu önlemesinin yanı sıra radikallerle doğrudan
reaksiyona girebilir10. Sebze ve meyve yeme alışkanlığı az olan bireylerin plazma
retinol ve β-karoten düzeyleri bu tür alışkanlığı fazla olan bireylerden düşük çıkmıştır56.
Meyve ve sebzelerde flovanoidlerin önemli kısmı kabuklarında yer alır. Bu nedenle
kabuklarıyla beraber ya da kabuğu fazla derinden soymadan yemek daha faydalıdır.
Sebzelerin az haşlanması da, vücudun β-karoteni daha iyi absorbe etmesine yardımcı
olur. Havuç, domates, patates, kavun, karpuz, kayısı ve mango zengin β-karoten
kaynaklarıdır.
13
A vitamini oksidatif nedenlerle oluşan hücre yıkımının tamirinde önemli rol
oynayan bir vitamindir. A vitamini eksikliği olan sıçanlarda süperoksit dismutaz ve
glutatyon peroksidaz enzim düzeylerinde azalma ve lipid peroksidasyonunda artma
saptanmıştır. Bazı epidemiyolojik çalışmalarda ateroskleroz va kanser insidansının
uygun miktarda β-karoten ve diğer karotenoidleri alan kişilerde daha düşük olduğu
belirlenmiştir57. β-karoten’nin yanında izoflavon, retinoik asit ve α-tokoferol gibi birçok
beslenme
faktörünün
kanser
gelişimini
engellediği
öne
sürülmektedir58–63.
Bu beslenme faktörlerinin; anti-kanser etkilerini, apoptozu indükleyerek, antioksidan
gibi davranarak, anti-inflamatuvar ajan gibi davranarak veya farklılaşmayı indükleyerek
ortaya koyduğu düşünülmektedir58,64. Çok sayıda epidemiyolojik çalışmada; fazla
miktarda karotenoidlerce zengin meyve ve sebze tüketen ve/veya yüksek miktarlarda
β-karoten serumu alan bireylerin diğerlerine oranla özellikle akciğer olmak üzere birçok
tümör bölgesindeki kansere karşı düşük risk taşıdığı gösterilmiştir60,65,66. Hücre kültürü
ve hayvan deneylerinden elde edilen bulgular65,67 en fazla provitamin A aktivitesine
sahip karotenoid olan β-karoten’nin, bu ilişkiden sorumlu bileşik olabileceğini
göstermektedir65. Bu bulgulara dayanarak β-karoten’nin kronik farmakolojik dozları
kullanılarak insan çalışmaları da yapılmıştır. Beklenmedik bir şekilde insan aracılı
denemeler, sigara içenlerde akciğer kanseri oluş sıklığını düşürmemiş hatta daha da
arttırmıştır65,68,69. Bu nedenle; β-karoten ve diğer karotenoidlerin, fizyolojik işlevleri
ayarlama ve hücre çoğalmasındaki rolünün etki mekanizmasının anlaşılması için büyük
bir çaba harcanmıştır. β-karoten’nin hücre içi redoks konumunu düzenleyebilme
yeteneği, onun kanseri önlemede hem faydalı hem de zararlı bir ajan olarak rolünü
açıklayabilecek bir mekanizma gibi düşünülmektedir. Bu bileşik, kendi özelliklerinin
yanında etki gösterdiği biyolojik çevrenin redoks potansiyeline de bağlı olarak, serbest
radikal üretimini engelleyerek antioksidan65,67,70,71 ya da serbest radikallerle indüklenen
reaksiyonları ilerleterek prooksidan olarak görev yapıyor olabilir65,72,73. Her iki durumda
da, bu molekül hücre proliferasyonundaki değişime katkıda bulunmaktadır. Bu hipoteze
göre, birçok hücreiçi redoks modülatörünün, hücre proliferasyonu ve apoptozla ilgili
farklı sinyal yolaklarının düzenlenmesinde anahtar rol oynadığı bildirilmiştir65,74.
Geçmiş epidemiyolojik bildirilerde de, karotenoidlerce zengin yiyeceklerin
besinlerle alınması ve
kanser oluş sıklığı arasında ters bir
ilişki olduğu
gösterilmiştir75–77. Daha sonraları, Barrett’s özofagusu ve oral lökoplaki hastaları ile
yürütülen çalışmalarda, β-karoten alımından sonra NK ‘Natural Killer’ hücrelerinde
14
artış olduğu gösterilmiştir75,78. Buna rağmen, sağlıklı bireylerde herhangi bir etkiye
rastlanmamıştır79. Sigara ile indüklenen DNA hasarı (kansere neden olan) ile ilişkili
çalışmalarda β-karoten’nin herhangi bir koruyucu etkisi görülmemiştir80. Bunun
yanında; β-karotenin, seçili mitojenlere karşı hücre aracılı bağışık (immün) yanıtta
makul bir artış gösterdiği belirlenmiştir75,80. Başka bir çalışmada; β-karoten’nin apoptoz
ve hücre döngüsünü G2/M fazında tutuklayarak, birçok insan kolon adenokarsinoma
hücre soyunun (COLO 320 HSR, LS-174, HT-29 ve WiDr) çoğalmasını engellediği
bildirilmiştir12. Bu etkilerin doza ve zamana bağlı olarak ve tamamen hücrenin
karotenoidleri depolama yeteneği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. β-karoten’nin
inhibe edici derişimlerinin, G2/M geçişinin anahtar düzenleyicisi olan siklin A
anlatımını azalttığı gösterilmiştir12. Epidemiyolojik çalışmalar, fazla miktarda β-karoten
ve diğer karotenoidlerce zengin besinlerin alımının, kolon neoplazisine karşı riskin
azaldığını göstermektedir12,81,82. β-karoten alımının; adenom polipleri olan hastalarda
kolon hücre proliferasyon oranını azalttığı bildirilmiştir83. Đlginç bir şekilde; bu
karotenoidin insandaki kolonik neoplastik dokularda biriktiği gösterilmiştir12,84,85 ve
birçok
deneysel çalışmada;
kemoterapötiklerin
sitotoksisitesini arttırmak
için
önerilmektedir12,86. Sonuç olarak, birçok bildiride, hayvan modellerinde kolon kanseri
oluşumuna karşı β-karoten’nin koruyucu etkisinin olduğu gösterilmiştir12,87–90 ve
karotenoidlerin insan kolon kanseri hücre soylarının üremesini engelleyici etkileri
gözlemlenmiştir12,91–93. Buna rağmen, β-karoten’nin kolon kanserine karşı koruyucu
mekanizması çok iyi anlaşılamamıştır. β-karoten’nin apoptozu indükleyerek insan kolon
adenokarsinoma
hücre
soylarının
çoğalmasını engellediği düşünülmektedir12,94.
β-karoten’nin, kolon91 kanser hücreleri dışında, melanoma95, prostat96, ağız, akciğer ve
göğüs97 kanseri hücrelerini de içeren birçok tümör hücresinin çoğalmasını inhibe edici
etkisi olduğu bilinmektedir. β-karoten’nin hücre içine alımının iki farklı mekanizma ile
gerçekleşiyor olabileceği; bunlardan birinin bu karotenoidin pasif transportla hücre
membranından geçişi olduğu, diğerinin ise metabolik olarak endositozla geçişi
olabileceği düşünülmektedir98. β-karoten’nin bcl-2 gen ailesinden olan ve programlı
hücre ölümünde inhibitör olarak görev yapan Bcl-2 ve Bcl-xL anlatımlarını da azalttığı
belirlenmiştir12. Fakat proapoptotik Bax’ın, karotenoid muamelesinden etkilenmediği
görülmüştür. Bcl-2’nin antioksidan yolağındaki rolü, bu proteinin ROS oluşumunu ve
lipid peroksidasyonu ürünlerini azaltarak hücre ölümünü engellemesi ile açıklanmıştır99.
Bu bulgular, β-karoten’nin derişime ve hücrenin biyolojik çevresine bağlı olarak
15
antioksidan ya da prooksidan olarak etki eden bir hücreiçi redoks ajanı olabileceğini
göstermektedir12.
2.3. Hücre Ölüm Çeşitleri
Çok hücreli organizmalarda hücre bölünmesi ile artan hücre popülasyonu hücre
ölümleriyle dengelenir. Yine organizmada hücreler çeşitli fizyolojik ve fizyolojik
olmayan olaylar ve yaşlanma sonucu ölürler100. Hücre ölümü ile ilgili yapılan ilk
çalışmalar 19. yüzyılın ortalarında başlamış ve artan bir ilgiyle günümüze kadar
gelmiştir. Yapılan birçok çalışma ile farklı mekanizmalara sahip çeşitli hücre ölüm
tipleri tanımlanmış ve bu ölüm tipleri arasındaki ortak yolakların keşfi ile hücre ölümü
tanım ve sınıflandırılması konusunda büyük karışıklıklar yaşanmıştır. Hücre ölümü
araştırmalarında ortak bir dil kullanılması amacıyla 2005’de ‘Hücre Ölümü
Nomenklatür Komitesi’ (NCCD) kurulmuştur. NCCD, hücre ölümü ve farklılaşması
üzerine önerilerini yapmış ve yeni varsayılan hücre ölüm şekilleri tanımlanmıştır. Bu
komite tarafından, daha önceleri yapısal özelliklere göre yapılan hücre ölümü
sınıflandırması yerine, ölçülebilir biyokimyasal ve işlevsel özelliklere dayanan yeni bir
hücre ölümü sınıflandırmasının yapılabileceği önerilmiştir101.
Hücre ölümü yapısal görünüme göre (apoptotik, nekrotik, otofajik ya da mitozla
ilişkili), enzimolojik kriterlere göre (nükleaz ya da kaspazlar, katepsinler ve
transglutaminazlar gibi farklı proteaz sınıflarını içerip içermemelerine), işlevsel
kriterlere göre (programlı ya da rastgele, fizyolojik ya da patolojik) ya da immünolojik
kriterlere göre (immunogenik veya immunogenik olmayan) sınıflandırılmaktadır102.
Şimdiye kadar birçok hücre ölüm tipi tanımlanmıştır. Bu ölüm tipleri, Apoptoz (kaspaz
bağımlı veya bağımsız hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz, ölüm reseptörleri yolu ile hücre
dışı ölüm uyaranlı apoptoz), Otofaji, Nekroz, Nekroptoz, Kornifikasyon, NEToz,
Mitotik Katastrof, Anoikis, Eksitotoksisite, ‘Wallerian’ Dejenerasyonu, Paraptoz,
Piroptoz, Entoz vs olmak üzere çeşitli şekillerde sınıflandırılmıştır. Fakat çeşitli
hücresel strese karşı ortaya çıkan ve birbirinden farklı mekanizmalara sahip olan hücre
ölümleri; yapısal, fizyolojik ve biyokimyasal olarak ele alındığında apoptotik, nekrotik
ve otofajik hücre ölümü olmak üzere üç tipte toplanmaktadır. Diğerleri ise normalden
farklı olan (belirli bir tipe uygun özellikte olmayan) hücre ölüm modellerinin geçici
(kesin olmayan) tanımlarıdır.
16
Đlk keşfedilen programlı hücre ölüm şekli Apoptoz’dur ve hücre intiharı olarak
da tanımlanmaktadır. Apoptoz, fizyolojik koşullarda çalışan bir ölüm mekanizması
olmasına rağmen bazı patolojik koşullar da apoptotik hücre ölümü tetiklenir.
Enerji üretim yetmezliği, iyon kanallarındaki bozukluklar veya pH dengesindeki
aşırı değişimler gibi bazı fizyolojik koşulların aşırı derecede bozulması sonucu ortaya
çıkan hücre ölümü Nekroz olarak tanımlanmıştır. Programlı nekroz ise, DNA hasarı ile
veya ölüm reseptörleri yolu ile uyarılmaktadır. Eğer kaspaz-8 inaktif olursa, reseptörle
etkileşen
protein1
(RIP1)
ve
protein3
(RIP3)
aktifleşerek
nekrotik
ölümü
gerçekleştirirler. Bu kontrollü mekanizma Nekroptoz olarak isimlendirilmektedir103
(Şekil 2-5).
Şekil 2-5: Nekroptoz.
Sinyal kompleksleri TNFα tarafından tetiklenerek NF-κB’nin aktifleşmesine, apoptoza ve nekroptoza aracılık eder.
(Kaynak104’den alınarak düzenlenmiştir)
Hücrenin kendini yemesi şeklinde gelişen hücre ölümü ise otofaji olarak
adlandırılmaktadır. Otofajik hücre ölümünde, devamlı işleyen otofaji sonrasında
17
yaşamsal organellerin ve proteinlerin ortadan kaldırılması ile yetmezliğe giren hücre
kaspaz-bağımsız yoldan ölüme gider.
Kornifikasyon;
programlı
hücre
ölümünün
epidermiste
keratinositlerde
gerçekleşen, hem yapısal hem de biyokimyasal olarak apoptozdan oldukça farklı olan
çok özel bir çeşididir105. Kornifikasyon, kornifiye olmuş deri katmanının işlevi için
gerekli
olan,
korneositlerin
oluşumuna
neden
olur.
Kornifikasyon
bazen
‘keratinizasyon’ veya ‘kornifiye olmuş zarf formasyonu’ olarak adlandırılır106,107 ve
diğer çekirdeksizleşmiş dokulardaki (lenf epitelyum ve olgun kırmızı kan hücreleri) gibi
ölümle son bulan farklılaşma programı olarak düşünülmektedir108,109 (Şekil 2-6). Bunun
nedeni, temelde bu süreçlerin hücre ölümünün moleküler mekanizmasının ( özellikle
kaspazların) aktifleşmesinde rol oynamasına bağlı oluşudur109–112. Fakat korneositlerin
tersine hem olgun kırmızı kan hücreleri hem de lenf epitel hücreleri stresle indüklenen
ölüm sürecine girme özelliklerini devam ettirirler113,114 ve bundan dolayı kornifikasyon
iyi niyetli (gerçek) bir hücre ölüm programı olarak düşünülmektedir101.
Şekil 2-6: Kornifikasyon.
Deri farklılaşması sırasında epidermisin farklı katmanlarında sentezlenen proteinler görülmektedir. Bazal
katmanlarda apoptoz gerçekleşirken üst katmanlarda kornifikasyon meydana gelmektedir.
(Kaynak106’den alınarak düzenlenmiştir)
18
Diğer bir hücre ölüm şekli olan NEToz (Netotik hücre ölümü) sadece
granülositlerde gözlenir115. Kaspaz bağımsız, kaspaz inhibitörlerinden ve nekroztatinden
etkilenmez. Otofajik ölüm mekanizması ile ortak yanları vardır. NET’ler ‘Neutrophil
extracellular traps’ (Nötrofil hücre dışı tuzağı), DNA ve histonlar gibi bileşenlerden
oluşurlar ve üzerleri çeşitli proteinlerle bezenmiştir106. Mitokondriler de NET oluşumu
için DNA kaynağı olabilmektedir116. NET oluşumu NEToz-bağımlı bir süreç tarafından
düzenlendiği düşünülen çok hızlı ve aktif bir süreçtir116 (Şekil 2-7). NEToz farklı bir
ölüm tipi olarak sınıflandırılmakla birlikte üzerinde daha fazla araştırılmaya gereksinim
vardır.
Şekil 2-7: NEToz.
Netotik hücre ölümü ile NET oluşumu. (Kaynak117 ’dan alınarak düzenlenmiştir)
Mitotik katastrof (mitotik çöküş); hatalı mitoz sırasında veya hemen sonrasında
meydana gelen bir hücre ölüm modelidir. Mitotik katastroftaki yapısal değişimler
mikro-çekirdekleşme (kromozom ve/veya kromozom parçalarının yavru çekirdekler
arasında eşit dağılmaması) veya multi-çekirdekleşmedir (sitokinez sırasında eksik veya
hatalı ayrılmadan dolayı benzer veya farklı boyutlarda iki veya daha fazla çekirdek
bulunması) (Şekil 2-8). Fakat bu terimin kullanımında yaygınlaşmış bir kabul
yoktur118–120 ve mitotik katastrof apoptotik morfoloji ve nekrozu tetikleyebilir121. Bu
nedenlerden dolayı NCCD, mitotik katastrof için daha kesin ve daha çok bilgi içeren
‘multi çekirdekleşmeyle başlayan hücre ölümü’ veya ‘metafaz sırasında oluşan hücre
ölümü’ ifadelerinin kullanılmasını önermiştir101.
19
Şekil 2-8: Mitotik katastrof.
Mitotik mekanizmalarda kimyasal veya genetik düzensizlikler olmadığı sürece, hücre diploid döller oluşturmak üzere
hücre döngüsünün farklı fazlarında normal şekilde ilerler (a). Fakat, M fazında mitotik mekanizmayı etkileyen
problemler veya kromozomal hatalar meydana gelirse, mitotik katastrof tetiklenerek hücre M fazında tutuklanır (b-d).
Bu hücrenin akıbeti 3 şekilde olabilir. Hücre mitoz tamamlanmadan ölür (b), bir sonraki döngünün G1 fazına ulaşır
(mitotik kayma) ve daha sonra ölür (c) veya mitozu tamamlar ve yaşlanır (d).
(Kaynak122’den alınarak düzenlenmiştir)
20
Anoikis, substratlara veya diğer hücrelere bağlanma kaybı ile tetiklenen
apoptoza denir123 (Şekil 2-9). NCCD tarihsel nedenler ve literatürde yaygın olarak
kullanılmasıdan dolayı bu terimin kullanılmasını onaylamaktadır.
Şekil 2-9: Anoikis.
Đntegrin yokluğunda anoikis. (Kaynak124’den alınarak düzenlenmiştir)
Eksitotoksisite, nöronlarda meydana gelen bir hücre ölüm şekli olarak
tanımlanmıştır fakat apoptoz ve nekroz gibi diğer hücre ölüm şekilleri ile örtüşüyor gibi
görünmektedir ve bu nedenle eksitotoksisite aslında farklı bir ölüm şekli olarak
düşünülmemektedir101.
‘Wallerian’ Dejenerasyonu, sinir sisteminde meydana gelmektedir. Nöron ya da
aksonun bir parçası, ana hücre gövdesini etkilemeden dejenere olur. ‘Wallerian’
dejenerasyonundan etkilenen nöronlar sağ kaldığı için bu terimin hücre ölüm şekli
olarak tanımlanması doğru bulunmamaktadır125.
21
Paraptoz terimi ilk olarak, yapısal ve biyokimyasal açıdan apoptozdan farklı bir
programlı hücre ölüm şeklini tanımlamak için kullanılmıştır126. Birçok hücre çeşidinde
paraptoz, ‘insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü I’ anlatımı ile tetiklenir ve
sitoplazmik vakuollenme ve mitokondriyal şişme meydana gelir fakat apoptoza ait
herhangi bir yapısal özelliği taşımaz126. Paraptozun meydana gelmesi kaspaz
inhibitörleriyle veya anti-apoptotik Bcl-2 benzeri proteinlerin aşırı sentezlenmesiyle
engellenemez ve mitojenle-aktif protein kinaz ailesinin bazı üyelerini içeren sinyal
kaskadlarından kaynaklandığı düşünülmektedir127. Bu nedenlerden dolayı paraptozun
farklı bir ölüm çeşidi olup olmadığı çok net değildir.
Piroptoz (patojen uyarılı konak hücre ölümü), ilk defa ‘salmonella typhimurium’
ile enfekte makrofajlarda gözlemlenmiştir128. Piroptoz kaspaz-1’in apikal aktifleşmesini
içerir fakat kaspaz-3’ün aktifleşmesini içermez. Hücre ölümünün bu çeşidi IL-1β ve
IL-18 salınımına neden olduğundan hem lokal hem de sistemik inflamatuar
reaksiyonlarda
önemli
rolü
olduğu
düşünülmektedir129,130.
Piroptoza
uğrayan
makrofajlar apoptoza özgü yapısal özellikler sergilemenin yanında nekroza özgü
özellikler de sergileyebilmektedir131.
Entoz, ilk olarak ‘Huntington’ hastalarından alınan lenfoblastlarda gözlemlenen
bir çeşit hücresel kannibalizm (saldıran hücrenin lizozom aracılı sindirimi) olarak
tanımlanmıştır132. Bu hücre ölüm çeşidinde bir hedef hücre komşu bir ev sahibi hücreyi
istila eder ve ev sahibi hücre tarafından özümsenir. Özümsenen hücre fagozom içinde
ölür133. Entotik özümseme sürecinde özümsenen hücrede; aktin polimerleşmesi ve
miyozin II, Rho ve Rho kinaz ROCK aktivitesi gerekmektedir134. Entoz, Bcl-2 ve
z-VAD-fmk tarafından inhibe edilemez ve yutulan hücre görsel olarak normal görünür,
daha sonra ortadan kaybolur. Bu da büyük ihtimalle lizozomal bozulma yoluyla
gerçekleşir. Nadiren, yutulan hücreler yutan hücrenin içinde bölünebilir veya tekrar
dışarı salınabilirler133 (Şekil 2-10). Entoz hücre ölüm mekanizmasının gerçekleşebilmesi
için her iki hücre aynı türden olmalı ve homotipik bağlantı kurulmalıdır. ‘Hücre içinde
hücre’ morfolojisini incelemek zor olduğundan, bu hala araştırılmaya açık bir hücre
ölüm modelidir135.
22
Şekil 2-10: Entoz.
Matriks-bağımsız bir hedef hücre komşu bir hücreyi istila eder. Hedef hücre ev sahibi hücre tarafından özümsenir.
Özümsenen hücre lizozamal enzimler tarafından bozulabilir, ev sahibi hücre içinde bölünebilir veya ev sahibi
hücreden tekrar dışarı salınabilir. (Kaynak134’den alınarak düzenlenmiştir)
Farklı hücre ölüm şekillerinin belirlenebilmesi için moleküler mekanizmaların
aydınlatılmasına yönelik çalışmaların yanında hücre morfolojilerinin mikroskobik
görüntüleme yöntemleriyle de izlenmesi önem taşımaktadır. Şekil 2-11’de farklı
katabolik süreçlere giren hücrelerin electron mikroskobu görüntüleri karşılaştırmalı
olarak gösterilmiştir.
Şekil 2-11: Mitotik katastrof, apoptoz, nekroz ve otofajik vakuolizasyonun yapısal
görüntüleri.
(a) Đnsan kolorektal karsinoma HCT-116 hücrelerinin multi-çekirdekleşmesi, (b) Đnsan servikal karsinoma HeLa
hücrelerinde piknoz, kromatin yoğunlaşması, plazma membranında kabarcık oluşumu, (c) Murine kolorektal
karsinoma CT26 hücrelerinde membran dilasyonu ve hücre hacminin artması, (d) Murine striatal hücrelerinde
otofajik vakualizasyon. (Kaynak134’den alınarak düzenlenmiştir)
23
Hücre ölüm şekilleri ile ilgili doğru bir sınıflandırmanın yapılabilmesi için
kullanılacak tekniklerin çok dikkatli seçilmesi gereklidir. Bir hücre ölüm tipi için
belirlenen özellikler farklı bir ölüm tipinde de gözlemlenebilir. Bu nedenle hücre
ölümlerini ayırt edici özellikler gözönüne alınarak farklı biyokimyasal ve işlevsel
yöntemler kullanılmalıdır.
2.3.1. Apoptoz
Apoptoz terimi ilk defa 1972’de Kerr ve arkadaşları136 tarafından hücre
ölümünün özel yapısal bir şeklini ifade etmek için kullanılmıştır. Apoptoz programlı bir
hücre ölüm şekli olup, hücre intiharı olarak tanımlanmaktadır. Gelişim, dokularda hücre
popülasyonunun korunması ve yaşlanma gibi homeostatik bir mekanizmanın
sağlanması amacıyla fizyolojik olarak meydana gelir. Bunun yanında hücreler,
hastalıklar veya zararlı ajanlar tarafından zarar gördüğünde veya bağışık reaksiyonlarda,
koruyucu bir mekanizma olarak apoptoz oluşur137–139.
Apoptotik hücre sayısı kişinin ya da organizmanın sağlıklı ya da hasta oluşunu
belirlediğinden, apoptozun işlevsel mekanizmaları hücrede denge unsurudur140.
Apoptotik hücreler organizmanın bazı dokularında ve hücrelerinde sürekli olarak
oluşmaktadırlar ve bu oluşum ömür boyu devam etmektedir. Böylece ölüm (apoptoz) ve
yeniden yapım (mitoz) bu dokularda doku homeostazını oluşturmak üzere dinamik bir
denge halinde süregelir137. Her hücre çoğalır (proliferasyon), farklılaşır (diferansiasyon)
ve ölür. Yeniden yapım ve yıkımın bir düzen içinde oluşu, apoptoz ve proliferasyon
dengesinin sağlıklı bir şekilde sürdürülmesine bağlıdır141–143. Son yıllarda bu dengenin
bozulmasının birçok önemli hastalığın patogenezinde rol aldığı gösterilmiştir144. Artmış
proliferasyon ve azalmış apoptozun karsinogenezde rol oynadığı düşünülmektedir145.
Ayrıca bazı durumlarda, apoptoza direnç göstermek, hücre kaybını azaltarak tümöre
avantaj sağlamaktadır146.
Apoptoz sürecinde rolü olan biyokimyasal ve genetik komponentlerin
aydınlatılması, apoptozun aktifleşmesine ya da inhibisyonuna yönelik çalışmalar;
kanser, AIDS ve otoimmün bozukluklar gibi birçok hastalıkta yeni tedavi olanaklarını
gündeme getirmektedir147.
24
2.3.1.1. Apoptotik Hücrede Meydana Gelen Yapısal Değişimler
Apoptoz süreci; DNA hasarına genlerin yanıtı, hücre membranı tarafından ölüm
sinyallerinin alınması (Fas ligandı), hücreye doğrudan proteolitik enzim girişi (granzim)
olmak üzere üç farklı şekilde işleyebilir148. Apoptoz sürecinde belli başlı üç anahtar
bileşen vardır. Bunlar; Bcl-2 ailesi proteinleri, kaspazlar ve Apaf-1 (Apoptotik proteaz
aktifleştirici faktör-1) proteinidir. Bu bileşenlerin biyokimyasal olarak aktifleşmesi,
apoptozda gözlenen mitokondriyal hasar, çekirdek zarı kırılması, DNA fragmentasyonu,
kromatin
yoğunlaşması
ve
apoptotik
cisimlerin
şekillenmesi
gibi
yapısal
değişikliklerden sorumludur149.
Apoptotik sinyal alındıktan sonra hücrede yapısal ve biyokimyasal değişimler
başlar. Hücre küçülmeye ve kondanse olmaya başlar, hücre iskeleti dağılır ve çekirdek
zarı yer yer erir. Çekirdek DNA’sı parçalara ayrılır150,151. Apoptoza uğrayan bir hücrede
laminin ve aktin flamentlerinin kesilmesi sonucu sitoplazma çekilmeye ve küçülmeye
başlar. Kromatin ve çekirdekte bulunan yapısal proteinlerin parçalanması sonucu
çekirdekte kondensasyon başlar ve çoğu zaman çekirdek kromatinin çekirdek
membranının iç yüzüne yerleşmesi nedeniyle at nalı biçiminde görülür. Hücre
büzülmeye ve küçülmeye devam eder ve makrofajların tanıyabileceği ve normal
hücrelerden daha kolay ayırt edilebileceği membranla çevrili küçük parçalara ayrılır.
Đçlerinde sitoplazma ve sıkıca paketlenmiş organeller ve bazılarında çekirdek parçaları
da bulunan apoptotik cisimler meydana gelir152–154. Çekirdek de hücre gibi büzüşür ve
bazen membranla sarılı olarak birkaç parçaya ayrılabilir. Nükleer porlar kromatinin
membrana komşu olmadığı bölgelerde yoğunlaşırlar152. Apoptoz sırasında apoptotik
hücrelerin membranlarındaki en belirgin değişim, normalde hücre membranının
sitoplazmik yüzeyinde yer alan negatif yüklü fosfotidilserin (PS) birimlerinin hücre
membranının dış yüzüne çıkmasıdır. Bu durum apoptotik cisimciğin fagositozu için bir
uyarıdır. Apoptotik cisimcikler, sitokin salgılanmasını ve inflamasyon oluşumunu
uyarmaksızın, makrofajlar ya da komşu hücreler tarafından fagosite edilirler
(Şekil 2-12). Hücre iskeleti apoptozda önemli bir role sahiptir155. Apoptozun en belirgin
özelliklerinden biri de hücre içi Ca ve Mg bağımlı endojen endonükleaz enziminin
aktifleşmesi ile kromozomal DNA’nın nükleozomal birimlere parçalanmasıdır.
Apoptotik hücrelerin DNA’sı agoroz jel elektroforezinde merdiven basamağına benzer
(ladder formasyonu) bir yapı biçiminde görülür. Bu, apoptoz için tipik bir görünüm
sağlar150,156,157.
25
Şekil 2-12: Apoptozun son evresi.
(Kaynak158’den alınarak düzenlenmiştir)
2.3.1.2. Apoptoz Mekanizmaları ve Mitokondrinin Apoptozdaki Rolü
Hücrenin kendi otomatik saati olan genlerin aktifleşmesi veya çevreden gelen
sinyallerle apoptoz başlamaktadır142. Organizmada apoptozu uyaran ve engelleyen çok
sayıda gen bulunmaktadır159. Apoptozu etkileyen hücre içi uyaranlar arasında sitokinler,
hücre içi kalsiyum miktarında artış, TNF, DNA hasarı nedeniyle bir tümör süpressör
gen olan p53’ün aktifleşmesi, viral bakteriyel enfeksiyonlar, glukokortikoidler ve
onkogenlerin yer aldığı bilinmektedir. Ayrıca radyasyon, hipertermi, sitotoksik
antikanser ilaçları ve hipoksi gibi nekroz oluşturabilen etkenler hafif dozlarda apoptoz
meydana getirirler. Apoptoz çevreye rahatsızlık vermeksizin gelişse de bazen apoptoz
dolaylı olarak çevre dokuda nekrozu başlatabilir ya da tam tersi nekroz apoptoz
gelişimine yol açabilir159.
Apoptozun düzenlenmesi Bcl2 / Bax gen ailesi ile sağlanır. Bu ailenin 20’den
fazla üyesi tanımlanmıştır; bunlardan bazıları apoptoz inhibitörüdür (antiapoptotik),
bazıları ise apoptozu uyarır ve proapoptotik genler olarak tanımlanırlar160 (Tablo 2-1).
Apoptotik sinyalin alınmasından sonra kısaca; Bax (proapoptotik) proteinleri,
mitokondri
membranının
iyon
geçirgenliğini
(permeabilitesini)
değiştirir.
26
Membrandaki bu değişiklikler nedeniyle sitokrom c ve AIF (Apoptoz Đndükleyici
Faktör) gibi mitokondri membranı içinde yer alan faktörler sitoplazmaya geçerler161.
AIF
doğrudan
yoğunlaşan
kromatine
ve
parçalanan
çekirdeğe
yönelirken,
sitoplazmadaki sitokrom c apoptozun en son basamağında görev alır ve bir sitoplazma
proteini olan Apaf-1’e bağlanarak prokaspaz-9’u aktifleştirir ve oluşan bu kompleks
‘apoptosom’ olarak isimlendirilir. Prokaspaz-9’un aktifleşmesi, bir seri kaspazın
aktifleşmesine neden olur160,162.
Tablo 2-1: Bcl-2 ailesi proteinleri.
Antiapoptotik üyeler
Bcl-2
Bcl-XL
Bcl-W
Mcl-1
Bfl-1/A1
Bcl-G
Proapoptotik üyeler
Bax
Bak
Bok
Bcl-Xs
Bad
Bik
Bid
Bim
Krk
Mtd
Nip3
Nix
Nora
Bcl-B
Kaspazlar (cystein-dependent aspartate specific protease), sistein proteaz
ailesine ait, apoptotik hücre ölümünün ana düzenleyicileri olarak görev yapan
enzimlerdir. Bu enzimler sadece apoptozun başlangıç evresinde değil sonlanma
aşamasında da 400’den fazla substratı proteolitik olarak keserek apoptotik hücre
ölümünün karakteristiklerinin oluşmasından sorumludurlar. Yani apoptoz sırasında
kaspazlar özgün substratlarının kesilmesinden ve tipik apoptoz ile ilişkili biyokimyasal
ve yapısal değişikliklerden sorumludurlar163–165. Kaspazlar post-transkripsiyonel
seviyede düzenlenip aktif olmayan pro-kaspaz olarak sentezlenmektedir. Çeşitli
kaynaklardan gelen proapoptotik sinyallerin tetiklenmesi ile prokaspazlar proteazlar
tarafından sindirilerek aktif kaspazlar haline dönüştürülür. Mitokondriyal dinamikler
apoptotik yolaklara esas olarak kaspazların tetiklenmesi ve kromozomal parçalanma ile
katılırlar166,167. Bugüne kadar memelilerde 14 adet kaspaz tanımlanmıştır. Kaspaz
enzimleri apoptozu başlatıcı kaspazlar (kaspaz-2, -8, -9, -10) ve apoptozu sonlandırıcı
kaspazlar
(kaspaz
-3,
-6,
-7)
olmak
üzere
iki
grupta
incelenmektedir.
27
Diğer kaspazlar ise proinflamatuar sitokinlerin inflamasyon sürecinde görev almaktadır.
Son yıllarda yapılan çalışmalar, kaspaz aktifleşme sürecinin başlatıcı kaspazlar ve
sonlandırıcı kaspazlar için farklı olduğunu göstermektedir168,169.
Mitokondri apoptozun düzenlenmesinde en önemli rolü oynayan organeldir.
Apoptotik kaskad iki ana yol ile başlatılır. Bunlar; ölüm reseptörü yolu (ekstrinsik-dış
yolak) ve mitokondri yolu (intrinsik-iç yolak)’dur170. Mitokondriyal hücre içi ölüm
uyaranlı apoptoz kaspaz bağımlı ve kaspaz bağımsız olarak gerçekleşebilir (Şekil 2-13).
Apoptoz esnasında, mitokondri membran geçirgenliği artar ve proapoptotik faktörler
sitoplazmaya salınarak apoptotik fenotipin oluşmasına neden olur25. Dış mitokondri
membranında bulunan antiapoptotik Bcl-2 ailesi proteinleri (Bcl-2 ve Bcl-XL) hücrenin
yaşlanmasını teşvik ederken, bu protein grubunun proapoptotik üyeleri olan Bad ve Bax
mitokondri membranında doğrudan etkileşerek ya da antiapoptotik üyelere bağlanarak
heterodimerik molekülleri oluştururlar ve hücreyi ölüme sürükler. Bax, dış mitokondri
membranında por oluşturarak ∆Ψm’nin değişimini sağlayarak sitokrom c ile AIF’in bu
pordan salınmasına aracılık eder. Bcl-2 ve Bcl-XL por oluşumunu önlemektedir. Bax ya
da Bad’ın Bcl-2 ve Bcl-XL ile heterodimer oluşturması da bu proteinlerin koruyucu
etkilerini ortadan kaldırır171.
28
Şekil 2-13: Mitokondriyal hücre içi ölüm uyaranlı apoptoz.
Mitokondri dış membran permeabilizasyonu, MOMP; mitokondri transmembran potansiyeli, ∆ψm; reaktif oksijen
türleri, ROS; mitokondri iç membran boşluğu, IMS; sitokrom c, CYTC; apoptoz inhibe edici protein, IAP;
endonükleaz G, ENDOG; apoptoz indükleyici faktör, AIF; mitokondiriyel iç membran, IM; mitokondiriyel dış
membran, OM; geçirgenlik değişim por kompleksi, PTPC. (Kaynak122’den alınarak düzenlenmiştir)
Proapoptotik
ve
antiapoptotik
aile
üyeleri
mitokondri
yüzeyinde
karşılaştıklarında burada henüz tam olarak aydınlatılamamış bir mekanizma ile sitokrom
c salınımının kontrolü için yarışmaya girerler. Eğer proapoptotik moleküller baskın
gelirse mitokondriden sitokrom c gibi bir dizi molekül salınır. Ölüm reseptörü yolağı ile
mitokondriyal yolak, kaspaz-3 aktifleşmesi düzeyinde birleşir. Kaspaz-3’ün aktifleşmesi
IAP (apaptoz inhibitörleri) proteinleri tarafından inhibe edilir. Mitokondriden salınan
Smac/DIABLO proteinleri de IAP inhibitörleridir. Kaspaz-3 yolağının altında apoptotik
program dallanmaya başlar ve bu dallanmanın sonucunda sinyal tüm hücreye iletilir ve
hücre sonunda ortadan kaldırılır171.
29
Ölüm reseptörü yolu, sitokinin hücre yüzeyine bağlanması sonucu, kaspaz 8
veya kaspaz-10’un reseptör aracılığı ile aktifleşmesi ve onu izleyen kaspaz-3 ve kaspaz7’nin aktifleşmesini kapsamaktadır172. Mitokondri ve ölüm reseptörü yolakları
arasındaki çapraz etkileşim ve birleşmeler proapoptotik Bcl-2 ailesi üyelerinden Bid
tarafından sağlanır. Bid’in kaspaz-8 tarafından kesilmesi ölüm etkinliğini arttırır ve
proteinin mitokondriye girmesine olanak verir. Bid mitokondriden sitokrom c çıkışını
gerçekleştirir (Şekil 2-14). Birçok durumda bu iki yolak arasındaki etkileşim minimum
düzeydedir ve her bir yolak bağımsız bir biçimde çalışır171.
Şekil 2-14: Apoptozun ölüm reseptörü yolu ile mitokondri yolunun etkileşimi.
(Kaynak173’den alınmıştır)
2.3.2. Nekroz
Nekrotik hücre ölümü veya nekroz, yapısal olarak hücrenin hacim kazanması,
organellerin şişmesi, plazma membranının parçalanması ve buna bağlı olarak
intraselüler içeriğin kaybı ile belirlenir101.
30
Uzun süre nekroz sadece kontrolsüz rastgele meydana gelen hücre ölüm çeşidi
olarak düşünülmüştür fakat nekrotik hücre ölümünün meydana gelmesinde hassas
şekilde düzenlenmiş birtakım sinyal ileti yolakları ve katabolik mekanizmaların rol
oynadığına dair deliller bulunmaktadır174,175. Programlı nekroz, DNA hasarıyla veya
ölüm reseptörleri yolu ile uyarılır. Kaspaz-8 inaktif olursa, RIP1 ve RIP3 aktifleşerek
nekrotik
ölümü
gerçekleştirirler.
Bu
kontrollü
mekanizma
nekroptoz olarak
isimlendirilir103. Nekroptozun programlı ve tesadüfi nekroz çeşitlerini ayırmak için
uygun bir yol olduğu düşünülmektedir101.
Nekroz; ATP miktarının azalıp, hücre homeostazının hızla bozulduğu,
inflamasyon (iltihap) yanıtının geliştiği patolojik bir hücre ölüm şekli olup çeşitli
fiziksel ve kimyasal dış etmenlerle gerçekleşir. Oksijensiz kalma, aşırı ısı değişimi ve
çeşitli toksinlerin etkileri nedeniyle meydana gelen travmatik hücre ölüm şeklidir.
Nekroz sırasında hücrede meydana gelen olaylar şu şekilde özetlenebilir: Endoplazmik
retikulum, mitokondri, golgi kompleksi gibi organellerde şişme; hücre zarının su ve
iyon taşıma dengesinin bozulması, dış ortamdan Ca+2 iyonlarının hücre içine geçmesi,
su girişinin aşırı derecede artması; hücre içinde artan Ca+2’ların endonükleazları
aktifleştirmesi ile DNA da kırıklar oluşması, nüklear kromatinin dağılması, çekirdek
zarının parçalanması; giren su nedeniyle hücre zarının parçalanması, hücre içi
bileşenlerin etrafa yayılması ve o bölgede inflamasyonun meydana gelmesidir100. Çeşitli
aracıların, organellerin ve hücresel işlemlerin nekrotik hücre ölümünde rol oynadığı
bilinmektedir fakat bunların kendi aralarındaki ilişkilere tam olarak açıklık
getirilememiştir. Şimdiye kadar nekrozu net bir şekilde belirleyebilecek biyokimyasal
bir değişim üzerinde tam olarak uzlaşılamamıştır101.
2.3.3. Otofaji
Otofaji, kendi kendini (auto) yeme (phagy) anlamına gelmektedir ve hücrenin
açlıkla karşılaştığı fizyolojik koşullarda, besin elde etmek için hücre içindeki yapıları ne
şekilde parçaladığını ifade etmek amacı ile kullanılmıştır176. Otofaji, hücre içi makro
moleküllerin ve organellerin bir kesecik içine alınarak lizozomlara yönlendirilmesi ve
burada lizozomla birleşerek parçalanmasına yol açan bir mekanizmadır (Şekil 2-15).
Uzun ömürlü proteinler ve hücre içi organeller otofaji sistemi tarafından parçalanırlar ve
oluşan yapıtaşları hücre kulanımı için yeniden kazandırılır177,178. Yapılan ilk
çalışmalarda; otofajinin, besin yokluğunda hücre içi moleküllerin geri dönüşümünü
31
sağlayarak hücrenin stres ortamına uyumuna yardım ettiği ve böylelikle hücre
homeostazının etkili bir yol olduğu gösterilmiştir177,178. Son on yılda yapılan çalışmalar
ise otofajinin; metabolizmanın düzenlenmesi, forfogenez, hücre farklılaşması,
yaşlanma, hücre ölümü ve bağışıklık sisteminin bir parçası olarak hücre içi patojenlerin
yıkımında da etkili bir rol oynadığını ortaya koymuştur178,179. Yapılan araştırmalar,
otofaji anormalliklerinin, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve enfeksiyon hastalıkları
gibi önemli sağlık sorunlarının da nedenleri arasında yer aldığını göstermektedir180.
Şekil 2-15: Otofajik hücre ölümü.
(Kaynak122’den alınarak düzenlenmiştir)
Otofaji, makrootofaji, mikrootofaji ve şaperon aracılı otofaji şeklinde en az üç
farklı mekanizma ile gerçekleşmektedir176. Otofaji mekanizmalarında rol oynayan
proteinlerin çoğu ‘otofaji ile bağlantılı proteinler’ (Autophagy-related proteins) ya da
kısaca Atg proteinleri, mayada yapılan çalışmalar sonucunda bulunmuş ve günümüzde
30’dan fazla Atg geni tanımlanmıştır181.
Açlık, hipoksi ve çeşitli stres koşulları, hücredeki otofajik etkinliği
uyarmaktadır. Otofajik hücre ölümünde en belirgin yapısal değişiklik, sitoplazmada
oluşan iki veya daha fazla katmanlı zarla (lipid bilayer) çevrili keseciklerin oluşmasıdır.
Bu kesecikler sitoplazma parçaları ve/veya mitokondri, endoplazmik retikulum (ER)
gibi organelleri içerirler ve lizozomla kaynaşıp, içlerinde taşıdıkları yüklerin lizozomal
enzimler tarafından parçalanmasını sağlarlar. Bu, hücre için hayati önem taşıyan bazı
protein ve mitokondri gibi enerji metabolizmasında rol oynayan organellerin yıkımına
yol açmaktadır176. Otofaji görülen hücrelerde, apoptozdan farklı bir ölüm gözlenmesine
32
rağmen, hücre ölümüne yol açan moleküler mekanizmaları hala ayrıntılı olarak
tanımlanmadığından, otofajinin bu ölümde aktif rol oynayıp oynamadığı hala
tartışılmaktadır182,183. Artmış otofaji görülen hücrelerde meydana gelen programlı ölüm,
apoptozdan çok farklı yapısal ve moleküler özellikler taşımaktadır. Otofajik hücre
ölümünde, kromatin yoğunlaşması gibi çekirdeğe özgü değişiklikler apoptotik hücre
ölümüne nazaran çok daha sonra olmaktadır. Ölüm, kaspaz etkinliğine bağımlı
olmadığından,
ne
DNA
merdivenleri
ne
de
apoptotik
cisimcik
oluşması
gözlenmemektedir. Ayrıca, otofajide, ölü hücrelerin fagositoz tarafından temizlenmesi
apoptozdakinden çok daha geç ve düzensiz bir biçimde olmaktadır176. Otofajik hücre
ölümü daha çok sitoplazmada gelişen bir hücre ölümüdür, apoptozun en önemli hedefi
ise DNA’nın bulunduğu hücre çekirdeğidir. Lenfositler gibi küçük sitoplazmalı
hücrelerin yok edilmesi için apoptoz genellikle yeterli olurken, büyük sitoplazmalı
moleküllerin yok edilmesi birden fazla mekanizmanın aynı anda aktifleşmesini
gerektirebilir176. Böylece, apoptotik moleküler mekanizmalar çekirdeği yok ederken,
otofaji sitoplazmayı ve buradaki organelleri temizleyerek ölümü hızlandırıyor olabilir
görüşü literatürde bazı çalışmalarla desteklenmektedir176,184,185.
Otofajinin açlık durumunda hücresel yapı taşlarının yıkılarak geri dönüşümü ve
hücrenin enerji depolarını yenileyerek apoptotik hücre ölümünü engellediği ya da zıt
olarak hücre ölümüne yol açtığının gösterilmesine ek olarak apoptozla karmaşık bir
ilişkide olduğu pek çok yayında ifade edilmektedir176,186. Otofaji özellikle apoptotik
hücre ölümünün baskılandığı koşullarda aktifleşerek, apoptozla ölmesi mümkün
olmayan hücrelerin ölümüne yol açabilir. Bu özelliğiyle, bazı durumlarda apoptoz
yanında bir ‘B planı hücre ölümü’ şeklinde görev yapabilir176. Bununla birlikte, otofaji
ve apoptoz arasında en az üç farklı bağlantı gözlenmiştir. Otofaji; apoptoza paralel
olarak hücre ölümüne yol açabildiği gibi, apoptozu baskılayarak hücrenin hayatta
kalmasını sağlayabilir ya da apoptoz için bir ön koşul olabilir187. Bazı durumlarda
otofaji ve apotoz hücrede birbirine zıt etkiler yaratabilmektedir. Bu durumda, otofaji
hücre ölümüne karşı bir hayatta kalma mekanizması olarak çalışarak, apoptozun
durdurulmasına ve ölümün engellenmesine yol açmaktadır176. Otofaji metabolik stres,
ilaç ya da radyasyon hasarıyla karşı karşıya kalan hücrelerde anormal ve hasarlı
proteinlerin yok edilmesinde ve genomik DNA’nın hasardan korunmasında önemli rol
oynar. Otofaji yokluğunda tümor hücrelerinde, DNA hasarı, gen amplifikasyonu ve
kromozomal anormallikler artmaktadır188. Ayrıca otofajinin; meme, prostat ve kolon
33
kanserlerindeki inhibisyonu, bu hücrelerin radyoterapiye ölüm yanıtını artırmaktadır189.
Bazı durumlarda, otofaji kendi başına hücre ölümüne sebep olmaksızın apoptotik hücre
ölümüne yardımcı olabilmektedir. Örneğin; besin yokluğunda otofaji bağımlı hücresel
ATP düzeyinin sürdürülmesi apoptozun önemli belirteçlerinden olan fosfotidilserinlerin
hücre zarının dışına transferini sağlar176. Bundan başka, apoptozda görülen hücre zarı
tomurcuklanması (blebbing) enerji bağımlıdır ve aktin-miyozin kasılması ATP ile
meydana gelmektedir190. Bu gözlemlerden ortaya çıkan karmaşık ilişkiler, moleküler
düzeyde otofaji yolaklarının apoptoz sistemi ile birlikte düzenlenebileceğine, aynı
sinyal bağlantılarıyla uyarılabileceklerine ve bazı ortak proteinlerin bu iki sistemin
birbiriyle ilişkilerini düzenleyebileceğine işaret etmektedir176.
2.4. Kanser Hücreleri ve Kanser Hücrelerinin Hücre Kültüründeki Davranışları
Hücre
kültürü
besiyerleri,
hücrelerin
normal
metabolik
aktivitelerini
sürdürebilmeleri için gerekli olan ortamı sağlayan besleyici çözeltilerdir. Đçeriklerindeki
aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla gerekli ozmolarite ve pH’yı da sağlarlar
ve hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi
için uygun sıcaklık, nem ve pH’nın sağlanması çok önemlidir.
Kanser hücrelerinin kültürde gözlenen en önemli özelliği sınırsız çoğalma
yetenekleri yani ölümsüzlükleridir. Bu hücrelerin çoğalma faktörlerine normal hücreler
kadar gereksinim duymamaları hatta transformasyona yol açan faktörleri (TGF)
salgılayabilmeleri onların değişmiş çoğalma özelliklerini yansıtır191. Tablo 2.2’de hücre
kültüründe yaygın olarak kullanılan bazı kanser hücre soyları gösterilmiştir.
Normal hücrelerin karşılıklı temas üzerine, çoğalmalarının durmasına yol açan
kontakt inhibisyonu kanser hücrelerinde gözlenmez. Bu nedenle kanser hücreleri
bulundukları kültür şişelerinin tabanlarını örtecek bir yoğunluğa geldikten sonra da
çoğalmalarını sürdürüp hücre yığınları oluştururlar. Aralarındaki ilginin düşük olması
nedeniyle, normal somatik hücrelerin kültürlerinde gözlendiği gibi, normal dokuları
anımsatan yapılar oluşturmazlar. Kanser hücrelerinde, hormal hücrelerde görülen, katı
yüzeylere bağlanarak çoğalma eğiliminin de büyük öçüde ortadan kalktığı gözlenir.
Buna rağmen, kanser hücreleri normal hücrelerin aksine, düşük lektin (membran
proteinlerinin şeker molekülleriyle etkileşen çok sayıda bağlanma bölgesine sahip bitki
kökenli proteinler) derişimlerinde bile topaklaşırlar. Kanser hücrelerinin fibronektin
ağından yoksun olmaları ve sıklıkla çevrelerine plasminojeni aktifleştiren bir proteaz
34
salgılamaları, yüzeylerinde meydana gelen yapısal ve işlevsel değişiklikleri yansıtan
özellikler arasındadır. Aktif mikroflamentlerinin yokluğundan kaynaklanan bozuk hücre
iskeleti ve ‘Warburg etkisi’ olarak tanımlanan ve glikozu büyük ölçüde glikolitik yolla
değerlendirme eğilimleri, değişik kanser hücrelerinin ortak olan diğer genel özellikleri
arasında sayılabilir191.
Tablo 2-2: Hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan bazı kanser hücre dizileri.
Hücre Serisi
Hücre Tipi ve Kökeni
K562
CML transforme eritrolösemi hücre dizisi
MCF-7
Meme adenokarsinoma hücresi dizisi
HL60
Lösemi hücre dizisi (insan)
HCT-116
Kolon karsinoma hücre dizisi
A-2780
Yumurtalık kanser hücre dizisi
A-549
Akciğer kanseri epitel hücre dizisi (insan)
ARH-77
Plazma lösemi hücre dizisi
2.4.1. K562 ve MCF-7 Kanser Hücreleri
K562 hücreleri, kronik miyeloid löseminin blastik kriz evresinden kaynaklanan
miyeoid hücre dizileridir192,193. Kronik miyeloid löseminin hücresel işeretleyicilerinden
biri olan Philadelphia kromozomu, hücrelerin granülositik serilerinde bulunur193. Bu
hücreler, oksidatif stres, anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesi, eritroid farklılaşma ve
glutatyon sistemi ile ilgili çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır194,195.
K562 hücrelerine elektron mikroskobunda bakıldığında, düzgün şekilli, kısa
mikrovillüslü, farklılaşmış lösemi hücrelerine benzer şekilde görülebilir193. Giemsa ile
hazırlanmış preparatlarda ise yaklaşık 20 µ m çapında iki ya da daha fazla parçalı
çekirdekli farklılaşmamış blast hücreleri olarak görülebilirler. Basofilik sitoplazmaları
35
hiç granül içermez193,194. K562 lösemi hücreleri kendilerini yenileme özellikleriyle
hemopoetik pluripotent hücrelere benzerler. Bu hücre dizilerinde, B hücrelerine ait
immunoglobulinler, Epstein-Barr virüs (EBV) genomu nükleer antijenine karşı
reseptörler yoktur193,196. K562 hücre soyu lenfositik karaktere sahip değildir197. Bu
hücreler, T lenfosit serilerinde bulunan B lenfosit serilerinde görülmeyen C’/Fc
reseptörlerini bulundurmazlar; MLC (Mikst lenfosit
kültürü) reaksiyonlarını
uyaramazlar. Diğer tarafdan, T antijeni bulunmayan K562 hücreleri, yüksek radyasyona
karşı hassastır ve timidin tarafından büyüme inhibisyonu söz konusudur. K562,
immunoglobulin Fc alıcıları ve pinositoz için güçlüdür fakat fagosit değildir veya
antikor bağımlı fagositoz ya da sitolize aracılık etmez193.
Kültür medyumunda süspansiyon olarak büyüyen K562 hücrelerinin sayılarının
iki katına çıkma süreleri ortalama 12 saattir198,199. Miyeloid lösemi hücreleri normal
hücrelere göre daha yavaş proliferasyon ve büyüme hızına sahiptirler. Lösemi hücreleri
belirli olgunluğa erişmedikçe bölünmezler. Olgunlaşma ve proliferasyon birbirine bağlı
olaylardır194. K562 hücrelerinde normal kromozom sayısının yaklaşık 1,5 katı
kromozom bulunur. Bu nedenle bu hücre serilerinde abl/bcr füzyon geni anlatımı
nedeniyle apoptoza karşı direnç vardır200. Fakat sitotoksisite ve apoptoz çalışmaları için
kullanımı oldukça yaygındır. Kültürde spontan olarak apoptoza gitmeyen K562
hücrelerinde farklı maddelerle apoptozu indüklemek iyi sonuçlar vermektedir201.
MCF-7 hücreleri ise meme kanseri ile ilgili in vitro çalışmalarda en çok
kullanılan hücre soylarından biridir. Bu hücreler, bulundukları kültür kabının tabanına
yapışma özelliği gösteren adherent hücrelerdir. 1973 yılında Herbert Soule and
arkadaşları bu hücreleri keşfetmiş ve Dentroit’deki ‘Michigan Cancer Foundation-7’
enstitüsüne atıf olarak bu ismi vermişlerdir202. MCF-7 meme kanseri hücreleri, insan
adenokarsinomu kaynaklıdır. Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanser türüdür ve
meme kanserinin tedavisi oldukça zordur, çünkü tedavide farklı cevaplar sergileyen,
farklı tümör sınıfları mevcuttur. Meme kanser gelişiminde, apoptoz ve hücre
proliferasyonu arasında bir dengesizlik söz konusudur ve hücre döngüsünün sorunsuz
olarak çalışması, hücre büyümesi ve hücre proliferasyonu için önemlidir203–206. Bu
konuda yapılan çalışmalarda, MCF-7 meme kanseri hücreleri sıklıkla tercih
edilmektedir.
36
2.5. Hücre Döngüsü
Đnsan vücudundaki hücrelerin bir bölümü yaşam boyunca bölünme geçirirler. Bu
nedenle sürekli bir farklılaşma söz konusudur. Hücrelerin bölünme hızları, hücrenin
türüne, bulunduğu yere ve ihtiyaca göre değişmektedir. Bir hücrenin bölünebilmesi için,
DNA, sitoplazma ve diğer hücre içeriğini iki katına çıkarması ve dolayısıyla belli bir
büyüklüğe ulaşması gerekir207.
DNA sentezi, bakterilere zıt olarak ökaryotik hücrelerde sürekli değildir. Hücre
bölünmesinden önce sentez işlemi gerçekleşir. DNA sentezi, ökaryotik hücrelerde hücre
döngüsünün sentez evresi olarak adlandırılan S fazında gerçekleşmektedir. S fazından
önce ve sonra birer zaman aralığı (Gap) ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle hücre döngüsü
G1 (ilk aralık), S (sentez), G2 (ikinci aralık) ve M (mitoz) olmak üzere dört evreden
oluşur. G1, S ve G2 evrelerinin hepsine birden interfaz adı verilir. Interfaz, mitoza
hazırlık evresidir. Đnterfazın G1 evresinde; hücre için gerekli RNA ve proteinler
sentezlenir, DNA için sentez hazırlığı yapılır. S evresinde, RNA sentezi devam ederken
protein sentezi en üst düzeye ulaşır, DNA sentezi yapılarak DNA miktarı iki katına
çıkar. G2 evresinde; DNA sentezi tamamlanmıştır fakat RNA ve protein sentezi G1
evresindeki kadar olmamakla birlikte devam eder. Dokulardaki birçok bölünmeyen
hücre, S evresinden hemen önce, yeteri kadar büyümemişlerse, hücre döngüsünü
durdururlar. Böyle dinlenme durumundaki hücrelere Go durumundaki hücreler denir.
Go birkaç gün, birkaç hafta sürebilir ya da hücre bölünmekten tamamen vazgeçebilir100.
Hücre döngüsünün süresi hücre türüne göre farklılık göstermektedir. Bu süre hayvan
hücrelerinde ortalama 18-26 saat iken bakteri hücresinde 20-30 dakikadır. Ancak bu
süre, yüksek yapılı organizmalarda hücrenin bulunduğu dokuya göre değişebilmektedir.
Örneğin, hızlı bölünebilen insan hücresinin iki yavru hücre oluşturması sırasında mitoz
için 30 dakika, G1 için 9 saat, S için 10 saat, G2 için ise 4.5 saatlik süre
gerekmektedir207.
Hücre döngüsünün farklı evrelerindeki koordinasyon, kontrol noktaları
(checkpoints) tarafından sağlanır. Hücre döngüsü kontrol noktalarının görevi,
tamamlanmamış veya hasarlı kromozomların eşleşmesini engellemek ve bunların yavru
hücrelere geçişini önlemektir. Hücre döngüsü boyunca belirlenmiş 3 kontrol noktası
vardır, bunlar G1, M ve G2 kontrol noktalarıdır. G1 kontrol noktası; DNA’da bir hasar
olduğunda hücre döngüsünün G1 de durmasını sağlar. Bu safhada çok iyi bilinen bir
37
kontrol noktası p53 proteinidir208. p53 DNA hasarına yanıt olarak salınır ve hücre
döngüsü durur. p53 proteininin, hipoksi, bazı onkojenlerin aktifleşmesi, DNA hasarı
gibi olaylar sonrası hücrenin; hücre döngüsünde duraklamaya veya apoptoza gitmesinde
karar mekanizmasında önemli bir rolü vardır209,210. Yapılan çalışmalarda bazı kanser
tiplerinde bu genin mutasyona uğradığı belirlenmiştir. p53’ün işlevini yitirmesi, G1’de
hücre döngüsünün durdurulmasını önler ve hasarlı DNA içeren hücre, bölünme
aşamalarını tamamlar ve bunun sonucunda mutasyonlar ortaya çıkar211,212. G2 kontrol
noktası; DNA eşlemesinde bir hata olur ve ortamda eşleşmemiş DNA bulunursa, hücre
döngüsünün G2 de durmasını sağlar100. Örneğin, rasyasyon ile hasara uğrayan DNA
tamamen tamir oluncaya kadar G2 safhasında kalır213,214. M kontrol noktası ise; mitoz
esnasında yavru kromozomlar mitotik iğcik üzerinde uygun şekilde dizilmezlerse,
döngüyü M evresinde durdurmaktadır100.
38
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. GEREÇLER
3.1.1. Kimyasal Maddeler
Akrilamit (Sigma)
APS (Sigma)
Aprotinin (Sigma)
Bis-akrilamit (Sigma)
Brome fenol mavisi (sigma)
BSA “Bovine Serum Albumin” (Santa Cruz)
CAPS (Merck)
DMEM F-12 (Gibco)
EDTA (Sigma)
FBS (Gibco)
H2O2 (Merck)
MET (Sigma)
NP 40 (Merck)
Penicilin streptomycin (Gibco)
PMSF (Sigma)
Rho123 (Santa Cruz)
SDS (Sigma)
Standart (Invitrogen)
TEMED (Sigma)
Tripan Mavisi (Sigma)
Tripsin EDTA (Gibco)
Triton X-100 (Merck)
39
Tween 20 (Riedel)
Gliserin, metanol, etanol, Tris, MgCl2, HCl, NaCl, KCl, KH2 HPO4,
Na2HPO4.2H2O ve diğer tüm kimyasal malzemeler Sigma ve Merck firmalarından
sağlandı.
3.1.2. Kitler
Annexin V:FITC Apoptoz Belirleme Kiti (AbD Serotec)
Kromojenik Substrat ‘Chromogenic Substrate’ (BCIP/NBT) (Invitrogen)
Hücre Fraksiyonlama Kiti ‘Cell Fractionation Kit’ (MitoSciences)
DNA Analiz Kiti ‘Cycle Test Plus DNA Reagent Kit’ (Becton Dickinson)
DNA Kalite Kontrol Boncukları ‘DNA QC Particles’ (Becton Dickinson)
Jel Aktarım Kiti ‘iBlot Gel Transfer Stacks, Nitrocellulose’ (Invitrogen)
Protein Miktarı Belirleme Kiti ‘Quant-iT Protein Kit’ (Invitrogen)
Western Emdirim Arttırıcı Kiti ‘Western Blot Enhancer Kit’ (Thermo Scientific)
3.1.3. Antikorlar
‘Anti-Cytochrome c, Rabbit Monoclonal Antibody’ (Millipore)
‘Anti-Smac/DIABLO, Mouse Monoclonal IgG’ (Upstate, Millipore)
‘Rabbit Polyclonal to Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase’ (Abcam)
‘Anti-AIF, Rabbit Monoclonal IgG’ (Millipore)
‘Purified Mouse Anti-Human Apaf-1’ (Becton Dickinson)
‘Anti-Bcl2, Mouse Monoclonal IgG’ (Millipore)
‘Mouse Anti-BCL-X Monoclonal Antibody’ (Upstate, Millipore)
‘Anti-Caspase 3, Rabbit Monoclonal IgG’ (Millipore)
‘Alkaline Phosphatase Conjugated Affinity Purified Secondary Antibody’
(Millipore)
‘Alkaline Phosphatase Conjugated Affinity Purified Goat Anti Rabbit IgG’
(Millipore)
40
3.1.4. Antioksidanlar
β-karoten (Sigma)
3.1.5. Çalışmada Kullanılan cihazlar
Floresan mikroskobu (Olympus BX51)
Görüntüleme sistemi (DP2-BSW)
Liyafilizatör (LABCONCO)
Güç kaynağı (BĐO-RAD)
Jel aktarım cihazı (Invitrogen)
Fluorometre (Invitrogen)
Buz Makinesi (HOSHIZAKI)
Derin Dondurucu (-80 oC) (NUAIRE)
Derin Dondurucu (-20 oC) (Şenocak)
Isıtıcı (120 oC) (BIOSAN)
Distile Su Cihazı (GFL)
Elektroforez Tankı ( Đnvitrogen)
Etüv (Sanyo)
FACS Cihazı (Becton Dickinson)
Hassas Tartı (SCALTEC)
Laminar Hava Akım Cihazı ELB 2472 (Heraus)
Manyetik Karıştırıcı (BIOSAN)
Orbital Çalkalayıcı (BIOSAN)
Karıştırıcı “Vorteks” (BIOSAN)
Otoklav (HIRAYAMA)
pH Metre (Hanna)
Santrifüj Aletleri Tipleri (Hettich)
Sıvı Azot Tankı (34 XT Taylor Wharton)
41
Su Banyosu (37 oC) (Heidolph)
Ters Mikroskop (Olympus)
3.1.6. Çalışmada Kullanılan Eriyikler
3.1.6.1. FACS Analizi ve Floresan Boyama ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi için
Kullanılan Eriyikler
PBS
8,0 g NaCl
0,2 g KCl
1,44 g Na2HPO4.2H2 O
0,2 g KH2HPO4
dH2O ile 1000 ml’ye tamamlandı (HCl ile pH: 7,4’e ayarlandı).
Rodamin123
Rho123 1 mg/ml olacak şekilde % 95’lik mutlak etanolde çözüldü.
3.1.6.2. Sitozolik ve Mitokondriyal Hücre Kesimlerinin Hazırlanması Đçin
Kullanılan Eriyikler
Hipertonik Eriyiği
20 mM HEPES (pH:7,4)
10 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM EDTA
1 mM PMSF
10 µg/ml Aprotinin
Hücre Parçalama (Lizis) Eriyiği
150 mM NaCl
5 mM EDTA
50 mM Tris-HCl (pH: 8.0)
%1 NP 40
42
%1 CAPS
%2 Triton X-100
1 mM Aprotinin
3.1.6.3. PAGE Đçin Kullanılan Eriyikler
%12’lik Alt jel
AA/BA (30/0,8)
1,5 M Tris HCl (pH:8,8)
%10 SDS
%10 APS
6,5 M TEMED
dH2O
%5’lik Üst jel
AA/BA (30/0,8)
%10 SDS
%10 APS
6,5 M TEMED
1 M Tris HCl (pH:6,8)
dH2O
Yükleme eriyiği (2x)
1 M Tris HCl (pH: 6,8)
14 M MET
% 10 SDS
% 99 Gliserin
% 0,1 Bromfenol mavisi
dH2O
43
Durdurma Eriyiği
20 mM Tris HCl (pH:8,0)
5 mM EDTA
3.1.6.4. Western Emdirimi Đçin Kullanılan Eriyikler
TBST
10 mM Tris HCl (pH: 8,0)
150 mM NaCl
% 0,05 Tween 20
dH2O’da çözüldü.
BSA’lı TBST
% 0,5’lik BSA, TBST içerisinde çözüldü.
3.1.6.5. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulaması Đçin Kullanılan Eriyikler
H2O2 Stok
1M H2O2, %35’lik H2O2 kullanılarak, steril dH2O ile hazırlandı.
β-karoten Stok
10 mM β-karoten, metanolde β-karotenin çözülmesi ile hazırlandı.
3.2. YÖNTEMLER
3.2.1. Hücre Kültürü
3.2.1.1. Hücrelerin Bakımı
Hücreler (K562, MCF-7), kültür şişelerinde (flask) %10 FBS ve %1 antibiyotik
(100 µg/ml streptomisin ve 100 U/ml penisilin) içeren DMEM F-12 medyumu
(complete DMEM) içerisinde, 37 0C’de % 5 CO2’li kültür ortamında yetiştirildi. 2-3
günde bir ters (invert) mikroskopta kontrol edilen hücreler semikonfluent duruma
geldikçe pasajları yapıldı.
3.2.1.2. Hücrelerin Pasajlanması
K562 hücreleri (süspansiyon hücreler) kültür şişelerinden hücre kazıyıcı (cell
scraper) ile kaldırılıp 15 ml’lik steril falkon tüplerine aktarılarak 3000 devir/dakika’da 5
44
dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonrası süpernatant (üst sıvı) uzaklaştırılırken hücre
pelleti (çöken kısım) taze cDMEM’de çözüldü. Kültür şişelerinde 1-2 x 105 hücre/ml
olacak şekilde hücre ekimi gerçekleştirildi ve etüve kaldırıldı.
Tabana yapışan (adherent) MCF-7 hücrelerinin pasajı ise tripsinleme ile yapıldı.
Hücreler semikonfluent duruma geldikçe kültür şişelerindeki üst sıvıları dökülerek
üzerlerini kaplayacak kadar tripsin-EDTA ile 2-5 dakika muamele edildi. Tabandan
kaldırılan hücreler santrifüj tüplerine aktarılarak üzerlerine 4-5 ml DMEM eklendikten
sonra 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonrası üst sıvı
uzaklaştırılıp, hücreler 5 ml cDMEM’le yıkandıktan (3000 devir/dakika, 5 dakika
santrifüj) sonra kültür şişelerine ekildi ve etüve kaldırıldı.
3.2.1.3. Hücre Sayımı ve Ekimi
Kültür ortamında çoğaltılan hücreler yüzeyden kaldırılarak santrifüj tüplerine
aktarıldı. Yıkama işlemlerinden sonra pelet cDMEM’de çözülerek hücre süspansiyonu
içinden bir miktar çekilip, tam ortasına lamel yerleştirilen hemositometreye (Neubauer
tipi) aktarıldı (Şekil 3-1).
Şekil 3-1: Hemositometrede hücre sayımı.
Mikroskopta incelenen hemositometrenin köşelerinde bulunan 16’şar kareden
bir kısmı sayılarak ortalama hücre sayısı (ort.h.s.) bulundu. Daha sonra 1 ml’deki hücre
sayısı;
Ort. h. s. x 16 x 104
şeklinde hesaplandı. Toplam hücre sayısı ise seyreltme faktörü (s.f.) ile ml’deki hücre
sayısı çarpılarak elde edildi;
45
Ort. h. s. x 16 x 104 x s.f.
Hücre sayısı belirlendikten sonra ekilmek istenen hücre sayısı, ml’deki hücre
sayısı ile orantı kurularak hesaplandı. Belirlenen hacim, hücre süspansiyonundan
çekilerek içinde cDMEM bulunan kültür şişelerine aktarıldı.
3.2.1.4. Hücrelerin Dondurulması
Hücreler
bulundukları
kültür
şişelerinden
toplanıp
santrifüj
tüplerine
aktarıldıktan sonra 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüj edildi. Pelet, tüp içerisindeki
hücre sayısı 2-8x106 olacak şekilde FBS ile süspanse edildi. Hücreler, DMSO/hücre
süspansiyonu oranı 1:9 olacak şekilde hızlı bir şekilde kryo tüplere aktarılarak
-80 0C’ye kaldırıldı. 24 saat -80 0C’de bekletildikden sonra -196 0C’lik sıvı azot tankına
alındı.
3.2.1.5. Hücrelerin Çözülmesi
Hücreler sıvı azot tankından alınarak 37 0C’de su banyosunda veya avuç içinde
ısıtılarak çözüldü. Hücreler çözülür çözülmez DMSO’yu uzaklaştırmak amacı ile 2 kez
medyum ile yıkandı (3000 devir/dakika’da 5 dakika). Son olarak pelet medyumda
çözülerek içinde cDMEM bulunan kültür şişelerine aktarıldıktan sonra mikroskopta
incelenip etüve kaldırıldı. Hücrelerin üst sıvıları 24 saat sonra tekrar değiştirildi.
3.2.2. Hücre Canlılığının Belirlenmesi
Hücre canlılığı Tripan mavisi (Trypan Blue Exclusion) testi ile belirlendi.
Hücreler kültür şişelerinden toplanıp santrifüj tüplerine aktarılarak dakikadaki devir
sayısı 3000 olacak şekilde 5 dakika santrifüjlendikten sonra PBS ile bir kez yıkandı.
Hücre süspansiyonu 1:1 oranında % 0,4’lük Tripan mavisi ile karıştırılarak 4-5 dakika
oda sıcaklığında bekletildi. Karışımdan alınan örnek lam üzerinde ışık mikroskobunda
incelendi (Şekil 3-2).
Şekil 3-2: Tripan mavisi ile boyanan hücrelerin lam üzerine aktarımı.
46
Canlı hücreler membran bütünlükleri ve geçirgenlikleri bozulmadığı için boyayı
içine almayacaklarından, boyanmamış hücreler canlı, mavi boyanmış hücreler ise ölü
olarak kabul edildi (Şekil 3-3).
Şekil 3-3: Tripan mavisi testi ile canlı ve ölü hücrelerin belirlenmesi.
Hücre canlılığı (%); ‘canlı hücre sayısı (x100) / toplam hücre sayısı’ ile
belirlendi.
3.2.3. Oksidatif Stres ve Antioksidan Uygulamaları
3.2.3.1. Hücrelere H2O2 Uygulanması
K562 ve MCF-7 hücreleri, kültür şişelerinde veya 6 kuyulu kültür plaklarında
eşit sayıda hücre/cDMEM olacak şekilde ekildi. Ekimden bir gün sonra hücrelere farklı
derişimlerde H2O2 verilerek 24, 48 ve 72 saat boyunca etüvde bekletildi. Bu sürelerin
sonunda, H2O2’nin hücrelerde yarattığı oksidatif etkiler farklı yöntemler kullanılarak
belirlendi.
3.2.3.2. Hücrelere β-Karoten Uygulanması
β-karoten’in K562 ve MCF-7 hücrelerinde tek başına etkisinin olup olmadığını
belirlemek amacıyla, hücreler 6 kuyulu kültür plaklarının her bir kuyusunda 25x104
hücre / 2 ml cDMEM olacak şekilde ekildi ve ekimden 24 saat sonra hücrelere farklı
derişimlerde (0,1 nM-100 µM) ve (1-4 µM) β-karoten verilerek 37 oC’de 24 saat
bekletildi. Bu süre sonunda Akım Sitometri analizleri ile ∆Ψm’ndeki değişiklikler
incelendi. Elde edilen sonuçlara göre, β-karoten’in bu derişimlerde tek başına ∆Ψm
47
açısından herhangi bir etkisinin olmadığı görüldü ve çalışılacak derişim 1 µM olarak
seçildi. Daha sonra 1 µM β-karoten’in zamana bağlı etkisini belirlemek amacı ile
hücreler 24, 48 ve 72 saat süreyle β-karoten ile muamele edilerek FACS analizleri
yapıldı.
3.2.3.3. Hücrelere H2O2 ve β-Karoten’in Birlikte Uygulanması
H2O2 ve β-karotenin hücrelere aynı anda uygulanması: K562 hücreleri 6 kuyulu
kültür plaklarının her bir kuyusunda 25x104 hücre/2ml cDMEM olacak şekilde
ekildikten 24 saat sonra, 100 µM, 250 µM, 500 µM, 750 µ M, 1000 µM H2O2 ve 1 µM
β-karoten hücrelere aynı anda verildi. Hücreler 24, 48 ve 72 saat süre ile 37 oC’de
bekletildikten sonra FACS analizleri ile ∆Ψm’ndeki değişiklikler incelendi.
Önce H2O2 sonra β-karoten uygulanması: Hücreler 6 kuyulu kültür plaklarına
ekildikten bir gün sonra 100 µM, 250 µM, 500 µM, 750 µM, 1000 µM H2O2 verildi. 24
saat sonra H2O2’yi uzaklaştırmak için kuyulardaki hücreler toplanıp kuyu içerikleri
tüplere aktarıldı ve tüplerdeki hücreler 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlenip üst
sıvılar atıldı. Çöken hücreler 2 ml medyumda çözülerek aynı kuyulara tekrar ekildi.
Daha sonra 1 µM β-karoten hücrelere verilip 24 saatlik zaman aralıkları ile 72 saat
boyunca inkübe edilelerek FACS analizleri yapıldı.
Önce β-karoten sonra H2O2 uygulanması: Hücreler 6 kuyulu kültür plaklarına
ekildikten bir gün sonra 1 µM β-karoten ile muamele edildi. 24 saatlik β-karoten
muamelesinden sonra β-karoteni uzaklaştırmak için kuyulardaki hücreler toplanıp kuyu
içerikleri tüplere aktarıldı ve 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlenip üst sıvı atıldı.
Çöken hücreler 2 ml medyumda çözülerek aynı kuyulara tekrar ekildikten sonra
100 µM, 250 µM, 500 µM, 750 µM ve 1000 µM H2O2 hücrelere uygulandı. Hücrelerin
24, 48 ve 72 saat süre ile 37 oC’deki inkübasyonundan sonra FACS analizleri yapıldı.
3.2.4. FACS Analizi ile Mitokondri Membran Potansiyelinin (∆Ψm) Belirlenmesi
∆Ψm, lipofilik katyonik bir floresan boya olan Rodamin123 (Rho123)
kullanılarak belirlendi. Deney sürecini tamamlamış hücreler kültür şişelerinden toplanıp
FACS tüplerine aktarıldı ve 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendikten sonra
hücre peleti 2 ml serumsuz medyumda çözüldü. Kontrol dışındaki tüm tüplere 0,5 µg/ml
Rho123 eklendi ve tüpler 37 0C’de 15 dakika karanlıkta inkübe edildi. Đnkübasyon
süresi sonunda hücreler 3000 devir/dakika’da 5 dakika santrifüjlendikten sonra üst
48
sıvılar uzaklaştırıldı. Çöken hücreler 2,5 ml PBS’de çözüldü ve 3000 devir/dakika’da
tekrar 5 dakika santrifüj edildi. Son olarak 500 µ l PBS’de çözülen hücreler FACS
cihazından
geçirilerek
Rho123’ün
floresan
yogunluğu
üzerinden
∆Ψm’ndeki
değişiklikler belirlendi.
3.2.5. Đmmünfloresan Yöntemi ile ∆Ψm’nin Belirlenmesi
MCF-7
hücrelerinde
∆Ψm’ndeki
değişimin
floresan
mikroskobunda
görüntülenebilmesi için, hücrelerin 2 ml cDMEM’li ortamda, 6 kuyulu plaklardaki
lameller üzerine bir gün önceden ekilerek yapışmaları sağlandı. Oksidan ve antioksidan
maddeler deney gruplarına göre uygulanıp, hücreler deney sürecini tamamladıktan
sonra PBS ile 3 kez yıkandı. Her bir kuyuda 0,75 µ l Rho123 / ml DMEM olacak şekilde
Rho123-DMEM karışımı uygulandıktan sonra hücreler 15 dakika 37 0C’de karanlıkta
bekletildi. Bu süre sonunda hücreler tekrar PBS ile 3 kez yıkandı ve lameller lamların
üzerine kapatılarak hücrelerin Olympus BX51 floresan mikroskobunda belli
büyütmelerde görüntüleri alınıp fotoğrafları çekildi.
3.2.6. Erken Apoptotik Hücrelerin AnnV Uygulaması Đle Belirlenmesi
Normal hücrelerde hücre zarının sitoplazmik yüzünde membran lipitlerinden biri
olan fosfotidilserin (PS) bulunmaktadır. Eğer hücre apoptoza giderse normalde iç yüzde
yerleşmiş olan PS molekülleri hücre zarının dış yüzeyine geçmektedir. Bu yer
değişitirme hücre membran bütünlüğünün bozulmadığı apoptotik hücre ölümünün erken
dönemlerinde meydana gelir. AnnV, hücrenin dış yüzeyine geçen PS' e bağlanabilen bir
protein olduğu için, floresan bir madde (FITC) ile işaretlenerek apoptotik hücre görünür
hale
getirilebilir215–217.
AnnV'ın
PS'e
bağlanma
oranı
FACS
analizleri
ile
ölçülebilmektedir.
Önce β-karoten sonra H2O2 uygulanan deney grubundaki hücrelerin erken
apoptotik döneme girip girmediği AnnV'ın PS'e bağlanma oranı ile akım sitometride
ölçüldü. AnnV uygulaması için kültür şişelerindeki hücreler toplanıp FACS tüplerine
aktarılarak dakikadaki devir sayısı 3000 olacak şekilde 5 dakika santrifüjlendikten sonra
2,5 ml soğuk PBS ile yıkandı. Daha sonra hücre peletleri 100 µl yükleme tamponunda
çözülerek üzerlerine 5 µl AnnV eklenip karıştırıldı. Hücreler 15 dakika oda sıcaklığında
karanlıkta bekletildikten sonra üzerlerine 400’er µl yükleme tamponu eklenerek FACS
analizleri yapıldı.
49
3.2.7. Nekrotik ve Apoptotik Hücrelerin AnnV - PI Uygulaması ile Belirlenmesi
Apoptotik hücrelerde olduğu gibi nekrotik hücrelerin yüzeyinde de AnnV
bağlanması görülebildiği için ikinci boya olarak PI kullanılarak FACS analizleri ile
erken apoptotik, nekrotik, geç apoptotik ve canlı hücre ayrımı yapılabilmektedir. Analiz
sonucu AnnV(-) PI(-) olan hücreler canlı, AnnV(+) PI(-) olan hücreler erken apoptotik,
AnnV(+) PI(+) olan hücreler geç apoptotik, AnnV(-) PI(+) olan hücreler nekrotik olarak
birbirinden ayrılmaktadır218. Bu ayrımın yapılabilmesi için deney grubu hücrelerinin
analizinden önce akım sitometri cihazının kalibrasyonu için; canlı-boyanmamış,
canlı-AnnV ile boyanmış, canlı-PI ile boyanmış, apoptotik-AnnV ile boyanmış ve
nekrotik-PI ile boyanmış hücreler hazırlandı.
Apoptotik hücreler 500 µM H2 O2 uygulaması ile elde edilirken, nekrotik
hücreleri elde etmek için canlı hücreler 3000 devir/dakikada 5 dakika santrifüj edildi.
Santrifüj sonrası hücreler lizis tamponunda çözülerek, buz içerisinde insülin enjektörü
ile 25 kez çek-bırak yapılıp patlatılarak nekroza uğratıldı. Canlı, apoptotik ve nekrotik
hücreler çeşitli yıkama işlemlerinden sonra AnnV veya PI ile boyanarak analiz için
hazır hale getirildi. Deney grubu hücreleri ise bulundukları kültür şişelerinden
toplanarak FACS tüplerine aktarıldı ve ‘‘Annexin V: FITC’’ kit protokolüne uygun
olarak hazırlandı. Bu protokole göre, hücreler 3000 devir/dakika’da 5 dakika
santrifüjlendikten sonra PBS ile 1 kez yıkandı. Daha sonra hemositometrede sayılarak,
kit içeriğinde bulunan ve dH2 O ile 1:4 oranında seyreltilen bağlama tamponunun
200 µl’nde hücre yoğunluğu 5x105 hücre/ml olacak şekilde süspanse edildi. Her bir tüpe
195 µl hücre süspansiyonu, 5 µ l AnnV-FITC eklenerek karıştırıldı ve karanlıkta, oda
sıcaklığında 10 dakika bekletildi. Đnkübasyon süresi sonunda hücreler 200 µl bağlama
tamponu ile 1 kez yıkandıktan sonra tekrar 190 µl bağlama tamponunda süspanse edildi.
Son olarak hücre süspansiyonu üzerine 10 µl PI eklenerek akım sitometri analizleri
yapıldı.
3.2.8. Hücrelerin Sitozolik ve Mitokondriyal Kesimlere Ayrılması
Manual
olarak
hücre
kesimlerinin
hazırlanması:
Hücre
kesimlerinin
hazırlanması için deney grubu hücreleri 24, 48 ve 72. saatlerde kültürlendikleri
ortamlardan toplanarak santrifüj tüplerine aktarıldı ve dakikadaki devir sayısı 3000
olacak şekilde 10 dakika santrifüjlendi. Hücreler 1 kez soğuk PBS ile yıkandı ve pelet
üzerine soğuk hipertonik eriyiği eklenerek 30 dakika buz üzerinde bekletildi.
50
Daha sonra insülin enjektörüyle yaklaşık 20-25 kez çek-bırak yapılarak hücre membranı
parçalandı. Hücre lizatı 10 000 x g’de 10 dakika +4oC’de santrifüjlendi ve süpernatant
başka bir tübe aktarılarak (sitozolik kesim) -80 0C’ye kaldırıldı. Hücre peleti soğuk lizis
eriyiğinde çözülerek buz üzerinde 30 dakika bekletildikten sonra 12 000 x g’de +4oC’de
20 dakika santrifüjlendi. Süpernatant başka bir tübe aktarılarak (mitokondriyal kesim)
-80 oC’ye kaldırıldı.
Hücre fraksiyonlama kiti ile hücre kesimlerinin hazırlanması: Hücreler 24, 48
ve 72. saatlerde kültürlendikleri ortamlardan toplanarak santrifüj tüplerine aktarıldı ve
3000 devir/dakika'da 10 dakika santrifüjlendi. Daha sonra 1 kez DMEM ile yıkanan
hücreler ‘‘Cell Fractionation Kit’’ içeriğinde bulunan A tamponunda çözüldü ve
hemositometrede sayılarak hücre yoğunluğu 6,6 x 106 hücre/ml olacak şekilde hücre
süspansiyonu hazırlandı. Kit içeriğindeki ‘Deterjan I’ ve A tamponu 1:1000 oranında
karıştırılarak B tamponu hazırlandı. Hücre süspansiyonu üzerine aynı hacimde B
tamponu eklenerek 7 dakika oda sıcaklığında orbital çalkalayıcıda inkübe edildi.
Đnkübasyon sonunda hücreler 5000 x g’de 4 0C’de 1 dakika santrifüjlendi. Santrifüj
sonrası pellet buzda bekletilirken süpernatant başka bir tüpe aktarılıp 10 000 x g’de
4 0C’de 1 dakika santrifüjlendikten sonra elde edilen süpernatant (sitozolik kesim) başka
bir tüpe aktarılıp -80 0C’ye kaldırıldı, hücre peleti ise buzda bekletildi. Daha sonra
‘Deterjan II’ ve A tamponu 1:25 oranında birbirine karıştırılarak C tamponu hazırlandı.
Buzda bekletilen peletler eşit hacimlerde A tamponunda süspanse edilip birbirleri ile
karıştırıldıktan sonra üzerlerine aynı hacimde C tamponu eklenip karıştırıldı ve 10
dakika oda sıcaklığında orbital çalkalayıcıda inkübe edildi. Đnkübasyon sonrasında
hücreler 5000 x g’de 4 0C’de 1 dakika santrifüjlendi. Süpernatant 10 000 x g’de 4 0C’de
1 dakika tekrar santrifüjlendi ve santrifüj sonrası elde edilen yeni süpernatant
(mitokondriyal kesim) başka bir tüpe aktarılarak -80 0C’ye kaldırıldı.
3.2.9. Liyofilizasyon
Sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış olan hücreler -80 0C’den alınıp
buz içinde bulundukları tüplerin kapakları delinerek hızlı bir şekilde liyofilizasyon
aletine yerleştirilip yaklaşık 0,3 mBar, -40 0C’de liyofilize edildi. 1 ml’lik örnekler
yaklaşık 9-10 saatte liyofilize edildikten sonra 200 µ l’lik uygun tamponlarda çözülerek
5 kat yoğunlaştırıldı ve -80 0C’ye kaldırıldı.
51
3.2.10. Protein Derişimlerinin Fluorometre ile Belirlenmesi
Sitozolik ve mitokondriyal hücre kesimleri hazırlanıp liyofilize edilen örnekler
‘Quant-iT Protein Kit’’protokolüne uygun olarak hazırlandıktan sonra protein
derişimleri ‘Qubit Fluorometre’ aletinde µg/µl cinsinden ölçüldü. Her bir örnek için kit
içeriğinde bulunan ‘protein reagent’ 1:200 oranında ‘protein buffer’ da seyreltilerek
çalışma çözeltisi hazırlandı. Aletin kalibrasyonu için kitte bulunan standartların (std1,
std2 ve std3) herbirinden 10’ar µl alınarak 190 µl çalışma çözeltisinde çözüldü. Ölçümü
yapılacak olan örneklerden 2’şer µl alınıp 198’er µ l çalışma çözeltisinde çözülerek
toplam hacim 200 µ l olacak şekilde ayarlandı. Standartlar ve örnekler 15 dakika oda
sıcaklığında bekletildikten sonra fluorometri aletinde protein derişimleri ölçüldü. Daha
sonra derişimi en düşük olan örneğe göre tüm örneklerin protein konsantasyonları çeşitli
hesaplamalarla eşitlendi.
3.2.11. Elektroforez ve Membrana Aktarım
Protein derişimleri eşitlenen örnekler jellere yüklenmeden önce belirlenen
miktarlarda yükleme tamponu ile karıştırılarak 72 0C’de 10 dakika denatürlendi. Daha
sonra hazırlanan jellere veya ‘% 12’lik Nupage jel’ lere örnekler ve uygun standartlar
yüklenerek ‘Surelock Xcell’ elektroforez cihazı ile çift jel çalışılarak elektroforez
yapıldı. Elektroforez sonrası ‘IBLOT Jel Transfer Cihazı’ kullanılarak membrana
aktarım işlemi gerçekleştirildi.
3.2.12. Western Emdirim Analizi
‘Western’ emdirim analizleri için nitroselüloz membran % 0,5’lik BSA’lı TBST
(Tris tamponlu tuz çözeltisi) ile oda sıcaklığında 2 saat çalkalanarak doyurulduktan
sonra TBST ile 2 kez 5’er dakika yıkandı. Primer antikor ile gece boyunca +4 0C’de
karanlıkta bekletildi. Ertesi gün 3 kez 5’er dakika TBST ile yıkandıktan sonra sekonder
antikor ile 1,5 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. Daha sonra 3 kez 5’er dakika TBST
ile yıkanıp ‘BCIP/NBT’ substrat tamponu ile karanlıkta oda sıcaklığında 1-60 dakika
bekletildi. Son olarak membran dH2 O ile 2 kez 2’şer dakika yıkanarak kurutuldu.
Jeldeki bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldükten sonra analizleri
yapıldı.
52
3.2.13. DNA (Hücre Döngüsü) Analizi
Deney sürecini tamamlamış hücreler “Cycle test plus DNA reagent” kitindeki
protokole uygun olarak hazırlandıktan sonra FACS cihazı ve ‘Modfit’ yazılım programı
kullanılarak hücre döngüsü analizleri yapıldı. Analizden önce ‘‘DNA QC Particles’’ kiti
kullanılarak FACS cihazının DNA analizi için kalibrasyonu yapıldı. Kalibrasyon işlemi
için üç farklı örnek hazırlandı. Birinci örnek, 1 ml PI içine kit içerisinde bulunan
CEN’den “Chicken Erythrocyte Nucleus” (tavuk eritrosit çekirdekleri) 40 µl eklenerek;
ikinci örnek, 1 ml PI içine CTN’den “Calf Thymocyte Nucleus” (buzağı timosit
çekirdekleri) 40 µl eklenerek; üçüncü örnek ise 1 ml PBS içerisine bir damla QC
boncuklarından damlatılarak hazırlandı ve örnekler FACS cihazından geçirilerek
kalibrasyon işlemi yapıldı. Daha sonra ‘‘Cycle test plus DNA reagent’’protokolüne
göre; deney grubu hücreleri FACS tüplerine aktarılarak, oda sıcaklığında 300 x g’de 5
dakika santrifüjlendi. Üst sıvıları uzaklaştırılan hücreler 1 ml’lik tampon çözelti
içerisinde çözülerek tekrar 300 x g’de 5 dakika santrifüjlendi. Yıkama işlemi aynı
şekilde bir kez daha tekrarlandıktan sonra hücreler 1x106 hücre/ml olacak şekilde
tampon çözeltide süspanse edildi. Boyama işlemi için hücre süspansiyonları oda
sıcaklığında 400 x g’de 5 dakika santrifüjlendikten sonra üst sıvılar uzaklaştırılarak her
bir tüpe 250’şer µl çözelti A’dan (tripsin tampon) eklenip 10 dakika oda sıcaklığında
bekletildi. Daha sonra her bir tüpe 200’er µl çözelti B’den (tripsin inhibitörü ve RNaz
tamponu) eklenip karıştırıldıktan sonra tüpler 10 dakika daha oda sıcaklığında
bekletildi. Son olarak tüplere 200’er µl soğuk çözelti C’den (PI boyama çözeltisi)
eklenerek +4 0C’de karanlıkta 10 dakika bekletildi ve bu süre sonunda örnekler FACS
cihazından geçirilerek ModFit programı ile DNA analizleri yapıldı.
53
4. BULGULAR
4.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi
Oksidatif stresin K562 hücrelerinde etkisini belirlemek amacı ile hücrelere farklı
derişim (100, 250, 500, 750, 1000 µM) ve sürelerde (24, 48 ve 72 saat) H2O2
uygulamasının ardından ‘Gereç ve Yöntemler’ bölümünde anlatıldığı şekilde hücre
canlılık testi yapıldı. Bu test sonuçlarına göre, H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı
olarak K562 hücrelerinin canlılığının azaldığı belirlendi. Şekil 4-1’de H2 O2’nin
derişime bağlı etkisine bakıldığında 24. saatte 500 µM H2O2 derişiminde hücre
canlılığının %90’lara düştüğü, 750 µM’da %65’lere, 1000 µM’da ise %25’lere düştüğü
görüldü. Zamana bağlı olarak H2O2’in etkisi incelendiğinde ise hücrelere 24 saat süre ile
750 µM H2O2 uygulandığında %65’lerde olan hücre canlılığının, 48.saatte %40’ın
altına, 72.saatte ise %20’lere düştüğü görüldü. Sonuç olarak; K562 hücrelerinde
oksidatif stresin H2O2 derişim ve uygulama süresi ile doğru orantılı olarak arttığı
belirlendi. Hücrelerin ışık mikroskobu ile elde edilen yapısal görüntüleri de canlılık testi
sonuçlarını desteklemektedir. Şekil 4-2’de, kontrol hücrelerinin (madde uygulanmayan
hücreler) canlı, 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile muamele görmüş hücrelerin ise
tamamına yakınının ölü (parçalanmış, membran bütünlüğü bozulmuş) hücreler olduğu
görüldü.
54
Şekil 4-1: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak K562 hücre canlılığındaki
değişim.
Kontrol
1000 µM H2O2 (72. saat)
Şekil 4-2: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık
mikroskobu görüntüsü.
4.2. Oksidatif Stresin
Değişiklikler
K562
Hücrelerinin
∆Ψm’nde
Meydana
Getirdiği
Hidrojen peroksidin K562 hücrelerinde oluşturduğu oksidatif hasar ∆Ψm’nde
meydana getirdiği değişiklikler açısından Akım Sitometri analizleri ile Rodamin 123’ün
floresan yoğunluğu üzerinden belirlendi. Lipofilik katyonik bir boya olan Rho123 hücre
içine girdiğinde yüksek negatif membran potansiyeline sahip olan mitokondride
birikmektedir. ∆Ψm depolarize olduğunda Rho123’ün mitokondride tutulumu azalır ve
bu
durum
hücre
içi
floresan
yoğunluğunun
azalması
şeklinde
sonuçlanır.
55
∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler ve oluşan porlar apoptotik ve proapoptotik
proteinlerin sitoplazmaya salınımına ve apoptotik sürecin başlamasına neden
olmaktadır. Bu nedenle ∆Ψm analizi hücrenin apoptoza yönlendiğini gösteren önemli
belirteçlerden biridir.
K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikleri belirlemek amacı ile
hücrelere 24, 48 ve 72 saat süre ile 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 verildi. Akım
sitometride yapılan analizlere göre; 100 µM H2O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde
floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark görülmedi. 250 µM
H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan
ikinci bir hücre popülasyonunun ortaya çıktığı ve bu popülasyonun büyüklüğünün H2O2
derişimi ve uygulama süresi arttıkça arttığı görülmektedir. 72 saat süreyle 1000 µM
H2O2 ile muamele gören hücrelerin ise tamamına yakınının floresan yoğunluğunun
azaldığı
belirlendi
(Şekil
4-3).
Floresan
yoğunluğundaki
bu
düşüş
∆Ψm
depolarizasyonunu göstermektedir. Sonuç olarak, depolarizasyonun tetiklenmesi için
minimum 250 µM H2 O2 derişimine gereksinim olduğu ve H2O2 derişimi ile uygulama
süresi arttıkça K562 hücrelerinin ∆Ψm’nin azaldığı belirlendi. FACS analizlerinde,
kapılanmış hücrelere bakıldığında ise, hücrelerin granülite (SSC-Side Scatter) ve
büyüklüklerinde (FSC-Forward Scatter) değişiklikler olduğu görüldü (Şekil 4-4).
56
24 Saat
48 Saat
72 Saat
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-3: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen
değişiklikler.
K562 hücrelerine 24, 48 ve 72 saat süre ile 100-1000 µM H2O2 verilerek FACS analizleri yapıldı.
(Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.)
57
24 Saat
48 Saat
72 Saat
Kontrol
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-4: Oksidatif stres etkisi ile K562 hücre profilindeki değişiklikler.
K562 hücrelerine 24, 48 ve 72 saat süre ile 100-1000 µM H2O2 verilerek FACS analizinde kapılanmış hücreler
incelendi.
4.3. Oksidatif Strese Maruz Kalan K562 Hücrelerinde Apoptoz ve Nekrozun
Belirlenmesi
K562 hücrelerine 24 saat süreyle farklı derişimlerde H2O2 uygulandıktan sonra
apoptotik ve nekrotik hücreler, ‘AnnexinV:FITC’ kiti kullanılarak ‘Gereç ve
Yöntemler’ bölümünde anlatıldığı şekilde belirlendi. FACS cihazında hücreler, canlı
(G1) ve ölü (G2) hücrelerin ayrı kapılandığı noktasal grafiklerle incelendi. Analiz
sonuçlarına göre; G1’deki hücre popülasyonu H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak
azalırken G2’deki hücre popülasyonunun ise giderek arttığı gözlemlendi (Şekil 4-5 a).
58
G1’deki hücre popülasyonuna göre dörde ayrılmış nokta grafik histogramında
canlı kabul edilen boyanmamış hücre popülasyonunun giderek azaldığı, yalnız AnnV,
yalnız PI ve AnnV + PI ile boyanmış hücre popülasyonunun giderek arttığı gözlemlendi
(Şekil 4-5 b). Analiz sonucu elde edilen sayısal değerlere göre; canlı hücre popülasyonu
kontrol hücrelerinde % 93,3 iken 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde
% 18,9’a düştüğü; erken apoptotik hücre popülasyonunun ise % 1,1’den % 3,7’ye
yükseldiği belirlendi (Tablo 4-1). Apoptotik hücre popülasyonunun kontrol hücrelerinde
% 2,2 iken 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 68,1’e yükseldiği görüldü
(Şekil 4-6 a). Nekrotik hücre popülasyonunun ise % 3,4’den % 9,4’e kadar arttığı
belirlendi (Şekil 4-6 b).
G2’deki hücre popülasyonuna göre dörde ayrılmış nokta grafik histogramında,
H2O2 derişimi arttıkça, AnnV + PI ile boyanan hücre popülasyonunun arttığı;
boyanmamış hücreler
ile
yalnız AnnV ve yalnız PI ile boyanmış hücre
popülasyonlarının ise giderek azaldığı gözlemlendi (Şekil 4-5 c). Analiz sonucu elde
edilen sayısal değerlere göre; apoptotik hücre popülasyonu kontrol hücrelerinde % 26,6
iken 1000 µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 97,1’e yükseldiği görüldü. Canlı
hücre popülasyonunun % 36,4’den % 0,4’e, erken apoptotik hücre popülasyonunun
% 3,6’dan % 0,4’e; nekrotik hücre popülasyonunun ise % 33,4’den % 2,1’e düştüğü
belirlendi (Tablo 4-2).
59
a
G2
G1
250 µM
Kontrol
750 µM
500 µM
1000 µM
b
Kontrol
250 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
60
c
Kontrol
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-5: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI
boyama ile apoptoz ve nekrozun belirlenmesi.
a) FSC/SSC parametrelerine göre kapılanmış canlı (G1-kırmızı) ve ölü (G2-yeşil) hücre profillerindeki değişim,
b) Yalnız canlı hücrelerin kapılandığı G1 bölgesindeki hücrelerin değişimini gösteren noktasal grafik, c) Yalnız ölü
hücrelerin kapılandığı G2 bölgesindeki hücrelerin değişimini gösteren noktasal grafik.
Tablo 4-1: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI
boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış canlı ve erken apoptotik hücre
popülasyonundaki değişim yüzdeleri
G1’deki hücreler
H2O2 Derişimi
0 µM (%) 250 µM (%) 500 µM (%) 750 µM (%) 1000 µM (%)
Canlı Hücreler
PI(-) AnnV(-)
Erken Apoptotik Hücreler
PI(-) AnnV(+)
93,3
73,5
66,4
23,9
18,9
1,1
5,5
3,8
4,9
3,7
61
a
b
Şekil 4-6: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI
boyama sonucu G1 bölgesinde kapılanmış apoptotik (a) ve nekrotik (b) hücre
popülasyonundaki değişim yüzdeleri.
62
Tablo 4-2: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinde AnnV-PI
boyama sonucu G2 bölgesinde kapılanmış canlı, erken apoptotik, geç apoptotik
ve nekrotik hücre popülasyonundaki değişim yüzdeleri.
G2’deki Hücreler
H2O2 Derişimi
0 µM (%) 250 µM (%) 500 µM (%) 750 µM (%) 1000 µM (%)
Canlı Hücreler
PI(-) AnnV(+)
Erken Apoptotik Hücreler
PI(-) AnnV(+)
Geç Apoptotik Hücreler
PI(+) AnnV(+)
Nekrotik Hücreler
PI(+) AnnV(-)
36,4
18,6
3,2
0,3
0,4
3,6
4,4
0,8
0,6
0,4
26,6
70,7
93,0
96,6
97,1
33,4
6,3
3,0
2,6
2,1
4.4. β-karoten’in K562 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi
Güçlü bir antioksidan olan β-karotenin K562 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi FACS
analizleri ile belirlendi. K562 hücreleri 24 saat süreyle 100 µM, 10 µM, 1 µM, 1 nM ve
0,1 nM β-karoten ile muamele edildi. Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden yapılan
analizlerde β-karotenin tek başına K562 hücrelerinde ∆Ψm açısından bir değişikliğe
neden olmadığı görüldü (Şekil 4-7). Bunun üzerine; antioksidan-oksidan etkileşimlerini
belirlemek amacı ile yapılacak olan deneylerde kullanılacak β-karoten derişimi 1 µM
olarak seçildi. Daha sonra, 1 µM β-karotenin deney takip süresi olan 24, 48 ve 72.
saatlerde K562 hücrelerine etkisinin olup olmadığı araştırıldı ve analiz sonuçlarına göre
zamana bağlı olarak da β-karotenin K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde kontrole kıyasla
herhangi bir değişikliğe neden olmadığı görüldü (Şekil 4-8). FACS analizleri sırasında
kapılanmış hücre profilleri incelendiğinde, hücrelerin granülite ve büyüklüklerinde de
herhangi bir farka rastlanmadı (Şekil 4-9).
63
100 μM
1 μM
10 μM
1 nM
0,1 nM
Şekil 4-7: 24 saat süre ile farklı derişimlerde β-karoten uygulamasının K562 hücrelerinin
∆Ψm’ne etkisi.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.)
64
1 µM
24 Saat
48 Saat
72 Saat
Şekil 4-8: 1 µM β-karotenin uygulama süresine (24, 48, 72 saat) bağlı olarak K562
hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.)
a
b
Şekil 4-9: K562 hücre profilleri
a) Kontrol hücreleri, b) 1 µM β-karoten ile 48 saat işlem görmüş hücreler.
65
4.5. K562 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı
β-karotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi
K562 hücrelerinde β-karotenin derişim ve uygulama süresine bağlı olarak tek
başına ∆Ψm’ni, hücre büyüklük ve granülitesini değiştirmediği belirlendikten sonra,
H2O2’nin meydana getirdiği oksidatif hasarına karşı bir antioksidan etki gösterip
gösteremeyeceğini belirlemek amacıyla hücrelere H2O2 ile muamele etmeden önce,
sonra ve H2O2 ile birlikte 1 µM β -karoten verilerek ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi.
4.5.1. K562 Hücrelerine H2O2 ve β-karotenin Aynı Anda Uygulanmasıyla
∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler
K562 hücrelerine farklı derişimlerde H2O2 ve 1 µM β-karoten aynı anda
uygulanarak 24, 48 ve 72. saatlerde FACS analizleri ile ∆Ψm’nde meydana gelen
değişiklikler belirlendi. Buna göre, 1 µ M β-karoten ile birlikte artan derişimlerde H2O2
uygulamasının K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde azalmaya neden olduğu (Şekil 4-10), hücre
granülite ve büyüklüğünün de değiştiği görüldü (Şekil 4-11). Bu sonuçlar, K562
hücrelerinin ∆Ψm’nde, H2 O2 ve β-karoten’in birlikte yarattığı etkinin, H2O2’nin tek
başına yarattığı etkiye benzer olduğunu hatta zamana bağlı olarak hücrelerdeki oksidatif
etkinin biraz daha arttırdığını göstermektedir (Şekil 4-12).
66
24 Saat
48 Saat
72 Saat
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-10: Farklı derişimlerde H2O2 ve 1 µM β-karoten ile aynı anda işlem görmüş K562
hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise H2O2 ve β-karoten ile aynı anda muamele görmüş hücreleri
göstermektedir.)
a
b
Şekil 4-11: K562 hücre profilleri
a) Kontrol hücreleri, b) H2O2 ve β-karoten ile aynı anda 72 saat işlem görmüş hücreler.
67
Şekil 4-12: Aynı anda H2O2 ve β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile
işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı
gösterimi.
4.5.2. K562 Hücrelerine Önce H2O2 Sonra β-karoten Uygulanması ile ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler
K562 hücrelerine önce 24 saat süre ile 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2
24, 48 ve 72 saat süreyle uygulandı. H2 O2 uzaklaştırıldıktan sonra hücrelere 24 saat
süreyle 1 µM β-karoten verilip, ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. Elde edilen
sonuçlara göre, bu gruptaki hücrelerin ∆Ψm’nin azaldığı (Şekil 4-13), hücre granülite
ve büyüklüklerinin de değiştiği (Şekil 4-14) görüldü. H2 O2 ile muamele edildikten sonra
24 ve 72 saat süreyle β-karotenle muamele edilen hücrelerdeki ∆Ψm’ndeki
değişikliklerin, yalnız H2O2 ile muamele edilen hücre gruplarındaki ∆Ψm değişiklikleri
68
ile benzer olduğu fakat 48. saatte β-karotenin H2O2’nin yarattığı oksidatif etkiyi arttırıcı
yönde etki ettiği görüldü (Şekil 4-15).
24 Saat
48 Saat
72 Saat
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-13: Farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulamasından sonra 1 µM β-karoten ile
işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce H2O2 sonra β-karoten ile muamele görmüş hücreleri
göstermektedir.)
69
a
b
Şekil 4-14: K562 hücre profilleri
a) Kontrol hücreleri, b) Önce H2O2 sonra β-karotenle 48 saat işlem görmüş hücreler.
Şekil 4-15: Önce H2O2 sonra β-karotenle işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile
işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı
gösterimi.
70
4.5.3. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler
K562 hücrelerine önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 verilerek
24, 48 ve 72. saatlerde ∆Ψm’nde değişiklikler belirlendi. Bu gruptaki hücrelerde
floresan yoğunluğunda bir farklılık olmadığı yani ∆Ψm’nin değişmediği (kontrol gubu
ile aynı olduğu) görüldü (Şekil 4-16). ∆Ψm’nde depolarizasyon söz konusu değilken
hücre profilinin kontrole kıyasla değiştiği gözlemlendi (Şekil 4-17). β-karoten, hücrelere
H2O2 uygulanmadan önce verildiğinde antioksidan özelliği ön plana çıkmakta yani
∆Ψm açısından tam koruma sağlamaktadır. Şekil 4-18’de görüldüğü gibi yalnız H2O2
uygulanan hücrlelerde ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonu H2O2 uygulama
süresi ve derişimine bağlı olarak artmakta fakat hücrelere önce β-karoten sonra H2O2
uygulandığında ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonu ortaya çıkmamakta,
β-karoten H2O2’nin oksidatif etkisine karşı tam koruma sağlamaktadır.
24 Saat
48 Saat
72 Saat
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-16: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (100-1000 µM) H2O2 ile işlem
görmüş K562 hücrelerinin zamana bağlı (24, 48, 72 saat) ∆Ψm’nde meydana
gelen değişiklikler.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra H2O2 ile muamele görmüş hücreleri
göstermektedir.)
71
b
a
Şekil 4-17: K562 hücre profilleri
a) Kontrol hücreleri, b) Önce β-karoten sonra H2O2 ile 72 saat işlem görmüş hücreler.
H2O2
24 Saat
Önce β-karoten sonra H2O2
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-18: Önce β-karoten sonra H2O2 ile işlem görmüş K562 hücreleri ile sadece H2O2 ile
işlem görmüş K562 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki değişikliklerin karşılaştırmalı
gösterimi.
72
4.6. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasından Sonra Erken
Apoptotik Sürecin Belirlenmesi
Farklı derişimlerde H2O2’ye maruz bırakılmadan önce β-karoten ile muamele
edilen hücrelerde ∆Ψm değişmezken hücre granülite ve büyüklüğünün değişmesi, bu
hücrelerin apoptoza yönlenmiş olabileceğini düşündürdü. Apoptotik sürecin ilk
belirtileri hücre profilinin değişmesidir, ∆Ψm değişimi ise bundan sonraki aşamadır. Bu
nedenle hücrelerin erken apoptotik sürece girip girmediğini belirlemek için hücreler
floresan işaretli AnnV ile muamele edilerek AnnV'ın PS'e bağlanma oranı FACS
analizleri ile belirlendi. Sonuçlar, H2O2 derişim ve uygulama süresi ile doğru orantılı
olarak floresan yoğunluğunun arttığını yani AnnV cevabının pozitif çıktığını, hücrelerin
apoptoza yönlendiğini gösterdi (Şekil 4-19). Bu çalışmanın kontrolü olarak yalnız H2O2
ve yalnız β-karoten uygulanan hücre gruplarında da AnnV analizi yapıldı ve beklendiği
gibi farklı derişimlerde H2O2 uygulanan hücre grubunda floresan yoğunluğunun hızla
arttığı (Şekil 4-20), yalnız β-karoten uygulanan grupta ise değişmediği görüldü
(Şekil 4-21).
24 Saat
AnnV
48 Saat
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
Şekil 4-19: Önce 1µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562
hücrelerinin zamana bağlı AnnV cevabı.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra H2O2 ile muamele görmüş hücreleri
göstermektedir.)
73
AnnV
100 µM
250 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
Şekil 4-20: Farklı derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin AnnV
cevabı.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise H2O2 ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.)
74
AnnV
Kontrol
β-karoten (1 µM)
24 saat
Kontrol
β-karoten (1 µM)
48 saat
Şekil 4-21: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin 24 ve 48. saatlerdeki AnnV
cevabı ve hücre profili.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten ile muamele görmüş hücreleri göstermektedir.)
4.7. K562 Hücrelerine Önce β-karoten Sonra Yüksek Derişimlerde H2O2
Uygulanmasıyla ∆Ψm’nde Meydana Gelen Değişiklikler
K562 hücrelerine önce β-karoten sonra H2O2 uygulanmasından sonra ∆Ψm’nin
değişmemesi yani β-karotenin ∆Ψm açısından tam koruma sağlaması fakat bu gruptaki
hücre profilinin değişmesi ve AnnV analiziyle hücrelerin apoptoza yönlenmiş
olduğunun gözlemlenmesi üzerine hücrelere önce 1µM β-karoten daha sonra yüksek
derişimlerde (2000, 3000, 4000, 5000, 10000 µM) H2O2 verilerek, β-karotenin hücreleri
hangi H2 O2 derişimine kadar koruyabileceği test edildi. Analiz sonuçlarına göre, daha
2000 µM H2O2 derişiminde ∆Ψm’nin hızlı bir şekilde değiştiği, floresan yogunluğu
azalmış ikinci hücre grubunun ortaya çıktığı görüldü. 24 ve 48. saatlerde 10.000 µM’da
hücrelerin tamamında ∆Ψm’nin azaldığı yani tüm hücre popülasyonunun sola kaydığı
gözlemlenirken, 72. saatte ise daha 4000 µM’da hücrelerin tamamında floresan
yoğunluğunun azaldığı belirlendi (Şekil 4-22). Bu gruptaki hücrelerin morfolojileri ışık
75
mikroskobunda incelendiğinde oldukça ilginç görüntüler elde edildi (Şekil 4-23). Yalnız
H2O2 uygulanan hücre grubunda 1000 µM’da hücrelerin tamamına yakınının ölü ve
parçalanmış hücreler olduğu, önce β-karoten sonra yüksek derişimde H2O2 uygulanan
hücrelerde 10000 µM’da bile hücrelerin membran bütünlüklerinin bozulmadığı hücre
içeriklerinin kutuplaşmış olduğu görüldü (Şekil 4-24). Bu durum, hücrelerin ölüm
şeklinin apoptoz dışında farklı bir programlanmış hücre ölüm şekli olduğunu
düşündürdü.
sonra
48.saat
72.saat
2000 µM
2
24.saat
3000 µM
4000 µM
5000 µM
10000 µM
Şekil 4-22: Önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş K562
hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikler.
(Siyah çizgi kontrol hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra yüksek derişimlerde H2O2 ile muamele görmüş
hücreleri göstermektedir.)
76
Şekil 4-23: Önce 1 µM β-karoten sonra 10 mM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş K562
hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüsü.
(100x büyütme)
Şekil 4-24: Farklı şekillerde işlem görmüş K562 hücrelerinin ışık mikroskobu görüntüleri.
a) Kontrol hücreleri, b) Yalnız 1000 µM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş hücreler, c) Önce 1 µM β-karoten sonra 10
mM H2O2 ile 72 saat işlem görmüş hücreler (100x büyütme).
4.8. Antioksidan-Oksidan Etkileşimlerinin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine
Etkisi
Antioksidan oksidan etkileşimlerinin K562 hücre döngüsü fazları üzerine etkisi
H2O2 ve β-karoten üzerinden ModFit yazılım programı kullanılarak DNA analizleri ile
belirlendi. K562 hücrelerine yalnız H2O2 uygulamasıyla oksidatif stresin hücre döngüsü
fazları üzerine etkisi belirlendikten sonra tek başına β-karoten etkisi incelendi. Daha
sonra hücrelere önce 1µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (100-1000 µM ve
2000-10000 µM) H2 O2 uygulanarak antioksidan-oksidan etkileşimlerinin hücre döngüsü
fazları üzerine etkisi inceledi.
77
4.8.1. Oksidatif Stresin K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi
K562 hücrelerine artan derişimlerde H2O2 uygulandıktan sonra yapılan DNA
analizine göre H2O2’nin hücre döngüsü fazlarındaki değişimi indüklediği görüldü
(Şekil 4-25). G1 fazındaki hücre popülasyonunun kontrol grubunda % 33.25 iken 100,
500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde sırasıyla % 30.08, % 5.02,
% 4.42’ye düştüğü görüldü (Şekil 4-26 a). G2/M fazındaki hücre popülasyonunun ise
kontrol grubunda % 9.69 iken 100, 500 ve 1000 µM H2O2 uygulanan hücrelerde
sırasıyla % 17.74, % 36.47, % 23.30’a yükseldiği belirlendi (Şekil 4-26 b). S fazındaki
hücre popülasyonunun ise kontrol grubunda % 57.07 iken 1000 µM H2O2 ile işlem
gören hücrelerde % 72.28’lere kadar yükseldiği görüldü (Şekil 4-26 c). S fazındaki bu
birikim (akümülasyon) hücre döngüsü inhibisyonunu işaret etmektedir.
G1: % 30.08
S: % 52.19
G2: % 17.74
G1: % 33.25
S: % 57.07
G2: % 9.69
Kontrol
100µM H2O 2
G1: % 5.02
S: % 58.52
G2: % 36.47
500µM H2O2
G1: % 4.42
S: % 72.28
G2: % 23.30
1000µM H2O 2
Şekil 4-25: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA
analizi.
78
a
G1 fazındaki hücre popülasyonu (%)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrol
100
500
1000
H2O2 (µM)
b
40
G2 fazındaki hücre popülasyonu (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrol
100
500
1000
H2O2 (µM)
c
80
S fazındaki hücre popülasyonu (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrol
100
500
1000
H2O2 (µM)
Şekil 4-26: Farklı derişimlerde H2O2 ile 48 saat işlem görmüş K562 hüce döngüsü
falarındaki değişiklikler
a) G1 fazındaki değişim b) G2 fazındaki değişim c) S fazındaki değişim grafikleri.
79
4.8.2. β-karoten’in K562 Hücre Döngüsü Fazları Üzerine Etkisi
Antioksidan oksidan etkileşimlerinin hücre döngüsü fazları üzerine etkisinin
belirlenebilmesi için, öncelikle β-karoten’in tek başına hücre döngüsü fazları üzerine
etkisinin olup olmadığı DNA analizleriyle belirlendi. 1 µM β-karoten K562 hücrelerine
uygulandıktan sonra yapılan analizlerden elde edilen sonuçlara göre; hücre döngüsü
fazlarında anlamlı bir değişikliğe rastlanmadı (Şekil 4-27). G1 ve G2 fazlarındaki hücre
popülasyonu kontrol grubuna göre sadece % 2,3 , S fazındaki hücre popülasyonu ise
% 4,6 civarında değişmektedir (Şekil 4-28). Bu fark, DNA analizi farklı zamanlarda
yapılan kontrol hücreleri arasında bile görülebilmektedir. β-karoten’in tek başına K562
hücre döngüsü fazları üzerine herhangi bir etkisinin olmaması, daha önce ∆Ψm üzerine
yapılan deney sonuçlarıyla da uyumludur.
G1: % 33.25
S: % 57.07
G2: % 9.69
Kontrol
G1: % 35.56
S: % 52.48
G2: % 11.96
1 µM β-karoten
Şekil 4-27: 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin DNA analizi.
80
70
Hücre popülasyonu (%)
60
50
G1
40
S
G2
30
20
10
0
Kontrol
β-karoten
Şekil 4-28: Kontrol hücreleri ile 1 µM β-karoten ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S
ve G2 fazlarındaki değişimin karşılaştırmalı grafiği.
4.8.3. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasının K562 Hücre Döngüsü Fazları
Üzerine Etkisi
K562 hücrelerine önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2
uygulandıktan sonra yapılan DNA analizleri; hücrelere oksidatif stres uygulamasından
önce β-karoten uygulanmasının hücre döngüsü fazları üzerinde değişikliğe neden
olduğunu göstermektedir (Şekil 4-29). G1 fazındaki hücre popülasyonu kontrol
grubunda % 33.25 iken önce β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem
görmüş hücrelerde sırasıyla % 34.74, % 6.01, % 5.79’a düşmektedir (Şekil 4-30 a).
G2/M fazındaki hücre popülasyonu ise kontrol grubunda % 9.69 iken önce β-karoten
sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 uygulanan hücrelerde sırasıyla % 12.91, % 64.61,
% 67.95’e yükselmektedir (Şekil 4-30 b). S fazındaki hücre popülasyonu kontrol
grubunda % 57.07 iken önce β-karoten sonra 100 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde
% 52.35’e, 500 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde % 29.39’a, 1000 µM H2O2 ile
işlem görmüş hücrelerde ise % 26.26’ya düşmektedir (Şekil 4-30 c). Bu sonuçlar, önce
β-karoten sonra H2O2 (100, 500, 1000 µM) uygulamasının K562 hücrelerinin G2/M
fazında tutuklanmasına neden olduğunu göstermektedir.
81
G1: % 34.74
S: % 52.35
G2: % 12.91
G1: % 33.25
S: % 57.07
G2: % 9.69
Kontrol
1 µM β-k-100µM
H2O2
G1: % 6.01
S: % 29.39
G2: % 64.61
1 µM β-k-500µM
H2O2
G1: % 5.79
S: % 26.26
G2: % 67.95
1 µM β-k1000µM H2O2
Şekil 4-29: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş K562
hücrelerinin DNA analizi.
82
a
G1 fazındaki hücre Popülasyonu (%)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrol
100 µM
500 µM
1000 µM
H2O2
G2 fazındaki hücre Popülasyonu (%)
b
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrol
100 µM
500 µM
H2O2
1000 µM
83
c
S fazındaki hücre Popülasyonu (%)
60
50
40
30
20
10
0
Kontrol
100 µM
500 µM
1000 µM
H2O2
Şekil 4-30: Önce 1 µM β-karoten sonra 100, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş K562
hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler.
a) G1 fazındaki değişim, b) G2 fazındaki değişim, c) S fazındaki değişim grafikleri.
K562 hücrelerine yüksek derişimde (2, 4, 10 mM) H2O2 uygulanmadan önce
1 µM β-karoten uygulanıp yapılan DNA analizleri, hücre döngüsü fazları oranlarında
önemli bir değişikliğin olmadığını, kontrol grubu ile aynı hücre döngüsü profilinin
ortaya çıktığını fakat hücre sayısının azaldığını göstermektedir (Şekil 4-31). Kontrol
grubu hücreleri ile 2, 4 ve 10 mM H2O2 ile işlem görmüş hücreler karşılaştırıldığında
G1 fazında kontrole göre en fazla % 3,23 (4 mM’da), S fazında en fazla % 5,31
(2 mM’da) ve G2 fazında en fazla % 4,85 (10 mM’da) değişiklik olduğu belirlendi
(Şekil 4-32).
84
G1: % 33.25
S: % 57.07
G2: % 9.69
G1: % 31.02
S: % 62.38
G2: % 6.60
1 µM β-k-2mM
H2O 2
Kontrol
G1: % 34.87
S: % 60.29
G2: % 4.84
G1: % 36.48
S: % 55.30
G2: % 8.23
1 µM β-k-4mM
H 2O2
1 µM β-k-10mM
H2O 2
Şekil 4-31: Önce 1 µM β-karoten sonra 2 mM, 4 mM ve 10 mM H2O2 ile işlem görmüş
K562 hücrelerinin DNA analizi.
85
80
70
Hücre popülasyonu (%)
60
50
G1
40
S
30
G2
20
10
0
Kontrol
2000
4000
10000
H2O2
Şekil 4-32: Kontrol grubu hücreleri ile önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde
(2, 4, 10 mM) H2 O2 ile işlem görmüş K562 hücrelerinin G1, S ve G2 fazlarının
karşılaştırmalı grafiği.
K562 hücre döngüsü fazlarında, yalnız H2 O2 muamelesinin yarattığı etki ile önce
β-karoten sonra normal (100, 500, 1000 µ M) ve yüksek derişimde (2000, 4000, 10000
µM) H2O2 muamelesinin yarattığı etkinin birbirlerinden farklı ve bağımsız olduğu
görülmüştür (Şekil 4-33).
86
a
H2O2 Grubu
90
80
Hücre popülasyonu (%)
70
60
Kontrol
100 µM
500 µM
1000µM
50
40
30
20
10
0
G1
b
S
G2
Önce β-karoten sonra H2O2 Grubu
70
Hücre popülasyonu (%)
60
50
Kontrol
40
100 µM
500 µM
30
1000 µM
20
10
0
G1
S
G2
87
c
Önce β-karoten sonra H2O2 Grubu (yüksek derişim)
90
Hücre popülasyonu (%)
80
70
60
Kontrol
2000
50
4000
40
10000
30
20
10
0
G1
S
G2
Şekil 4-33: K562 hücre döngüsü fazlardaki değişim grafiklerinin karşılaştırmalı gösterimi
a) Yalnız H2O2 (100-1000 µM), b) Önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 (100-1000 µM), c) Önce 1 µM β-karoten sonra
yüksek derişimde H2O2 (2000-10000 µM) ile işlem görmüş hücreler.
4.9. Oksidatif Stres Etkisiyle K562 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal
Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki
Değişiklikler
K562 hücrelerine 250, 500 ve 1000 µM H2 O2 uygulandıktan 48 saat sonra
sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayırım işlemi Gereç ve Yöntemler Bölümü’nde
anlatıldığı şekilde yapıldı. Kesimleme işleminin tam olarak gerçekleşip gerçekleşmediği
sitoplazmik bir enzim olan Glukoz-6-fosfat-dehidrogenaz (G6PD) ile yapılan ‘western’
emdirim analizi ile belirlendi. Elde edilen sonuçlar, G6PD sinyallerinin sitoplazmik
kesimde var olduğunu mitokondriyal kesimde ise hiç bant olmadığını yani
mitokondriyal ve sitozolik ayırımın tam olarak yapılabildiğini göstermektedir
(Şekil 4-34 a). Daha sonra yapılan ‘western’ emdirim analizleri ile apoptotik
proteinlerden Sitokrom c (Cyt c) ve Smac/DIABLO’nun (Smac/D) mitokondriden
sitoplazmaya salınımına bakıldı. Farklı derişimlerde H2O2 uygulanmış hücre gruplarında
Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya salındığı ve bu proteinlerin
sitoplazmik miktarlarının H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak arttığı belirlendi
(Şekil 4-34 a). ‘Đmage J’ programı kullanılarak ölçülen bant yoğunluklarından elde
88
edilen sayısal değerler, Cyt c miktarının sitoplazmik kesimde
kontrol hücrelerinde
yaklaşık % 16 iken 250, 500 ve 1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin sitoplazmik
kesiminde sırasıyla % 19, % 29 ve % 46’ya yükseldiğini göstermektedir. Sitozolik
kesimdeki Smac/D miktarının ise kontrol hücrelerinde yaklaşık % 25 iken 250, 500 ve
1000 µM H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin sitoplazmik kesiminde sırasıyla % 28, % 39
ve % 77’ye yükseldiği belirlendi (Şekil 4-34 b).
a
H2O 2 (µM)
K 250 500 1000
H2O 2 (µM )
K 250 500 1000
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
Sitokrom c
Smac/D
Glikoz-6-fosfatdehidrogenaz
b
80
70
45
40
35
K
250
30
25
500
1000
20
15
10
5
0
Smac/D miktarı (%)
Sitokrom c miktarı (%)
50
60
K
250
500
1000
50
40
30
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-34: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış
K562 hücrelerinin western emdirim analizi.
a) Fare kökenli anti-Smac/D, sıçan kökenli anti-Sitokrom c ve anti-Glikoz-6-fosfat dehidrogenaz varlığında western
emdirimi, b) H2O2 etkisi ile mitokondriden sitozole salınan Sitokrom c ve Smac/D miktarları. Bant yoğunlukları
‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü. Sitozolik kesimde Sitokrom c’nin üst kısmında bulunan bantlar non-spesifik
bantlar olup dikkate alınmamıştır.
K562 hücrelerine oksidatif stres uygulaması sonucu apoptotik proteinlerden
Sitokrom c ve Smac/D’nun mitokondriden sitozole salınımı yani apoptotik sürecin
tetiklenmesi üzerine Bcl-2, Apaf-1, AIF, BCL-X, kaspaz-3 gibi diğer pro-apoptotik ve
anti-apoptotik proteinlerin mitokondriyal ve sitozolik kesimlerdeki miktarındaki
89
değişiklikler ‘western’ emdirim analizi ile belirlendi. H2O2 derişimine bağlı olarak
mitokondriyal antiapoptotik proteinlerden Bcl-2 ve BCL-X’in anlatımının arttığı
görülürken mitokondriyal proteinlerden AIF’nin ise H2 O2 derişimi ile doğru orantılı
olarak sitozole salındığı belirlendi (Şekil 4-35). Sitoplazmik kesimde apoptotik
proteinlerden Kaspaz-3’ün miktarı çok az değişirken Apaf-1 miktarının kontrole göre
arttığı, bu artışın en fazla 500 µM’da olduğu görüldü (Şekil 4-36).
a
b
H2O 2 (µM )
100
K 250 500 1000
Bcl-2 miktarı (%)
H2O2 (µM)
K 250 500 1000
Bcl-2
BCL-X
80
40
20
AIF
0
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
Mitokondriyal hücre kesimi
100
100
90
90
80
70
K
250
500
1000
60
50
40
30
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
BCL-X miktarı (%)
AIF miktarı (%)
K
250
500
1000
60
80
70
K
250
500
1000
60
50
40
30
20
10
0
Mitokondriyal hücre kesimi
Şekil 4-35: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış
K562 hücrelerinin western emdirim analizi.
a) Fare kökenli anti-Bcl-2, anti-BCL-X ve sıçan kökenli anti-AIF varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine
bağlı olarak mitokondriyal kesimdeki Bcl-2 ve BCL-X ile sitoplazmik kesimdeki AIF miktarlarındaki değişiklikler.
Bant yoğunlukları ‘ImageJ’ programı kullanılarak ölçüldü.
90
a
H2O2 (µM )
250 500 1000
K
Kaspaz-3
Apaf-1
Sitozolik hücre
kesimi
b
90
80
70
K
250
500
1000
60
50
40
30
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
Apaf-1 miktarı (%)
Kaspaz-3 miktarı (%)
100
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
250
500
1000
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-36: H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış
K562 hücrelerinin western emdirim analizi.
a) Fare kökenli anti-Apaf-1 ve sıçan kökenli anti-Kaspaz-3 varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı
olarak sitozolik kesimdeki Apaf-1 ve Kaspaz-3 miktarlarındaki değişiklikler. Bant yoğunlukları ‘ImageJ’ programı
kullanılarak ölçüldü.
Oksidatif stres etkisiyle K562 hücrelerinin mitokondriyal ve sitoplazmik
kesimlerindeki proapoptotik ve anti-apoptotik protein miktarlarındaki değişiklikler
belirlendikten sonra aynı yöntemler kullanılarak, H2O2 uygulamasından önce β-karoten
ile işlem görmüş hücre gruplarında bu protein miktarlarında değişiklik olup olmadığı
belirlendi.
4.10. Antioksidan-oksidan Etkileşimleri Sonucu K562 Hücrelerinin Sitozolik ve
Mitokondriyal Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin
Miktarlarındaki Değişiklikler
K562 hücreleri önce 1 µM β-karoten ile 24 saat muamele edildikten sonra
normal ( 250, 500 ve 1000 µM) ve yüksek (2000, 4000 ve 10000µM) derişimlerde H2O2
ile 48 saat muamele edildikten sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayrıldı.
Daha sonra Cyt c, Smac/D, Bcl-2, Apaf-1, AIF, BCL-X gibi apoptotik ve anti-apoptotik
proteinlerin miktarlarında değişiklik olup olmadığı ‘western’ emdirim analizi ile
91
incelendi. Önce normal (250, 500 ve 1000 µM) derişimlerde H2O2 uygulanarak
yürütülen deney sonuçlarına göre; bu gruptaki hücrelerde Cyt c ve Smac/D’nun
sitozoldeki miktarlarının kontrol grubu ile aynı olduğu yani mitokondriden sitozole
salınım olmadığı belirlendi (Şekil 4-37). Anti-apoptotik proteinlerden Bcl-2’nin
mitokondriyal kesimde miktarının arttığı, BCL-X’in miktarının ise 1000 µM H2O2
derişiminde % 40 civarında arttığı görüldü (Şekil 4-38). Apoptotik proteinlerden AIF
miktarının sitoplazmik kesimde değişmediği, Apaf-1’in ise sitoplazmik hücre kesiminde
500 ve 1000 µM H2O2 derişiminde sırasıyla %10 ve %20 oranında arttığı belirlendi
(Şekil 4-39).
a
K
H2O2 (µM)
250 500 1000
K
H2O2 (µM )
250 500 1000
Sitokrom c
Smac/D
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
K
250
500
1000
Sitozolik hücre kesimi
Smac/Diablo miktarı (%)
Sitokrom c miktarı (%)
b
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
250
500
1000
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-37: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten
sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western
emdirim analizi.
a) Fare kökenli anti-Smac/D ve sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirimi, b) Sitozolik Sitokrom c
ve Smac/D miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü.
92
a
H2O2 (µM)
K 250 500 1000
K 250 500 1000
H2O2 (µM )
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
Bcl-2
BCL-X
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
250
500
1000
Mitokondriyal hücre kesimi
BCL-X miktarı (%)
Bcl-2 miktarı (%)
b
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
250
500
1000
Mitokondriyal hücre kesimi
Şekil 4-38: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten
sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western
emdirim analizi.
a) Fare kökenli anti-Bcl-2 ve anti-BCL-X varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı olarak mitokondriyal
Bcl-2 ve BCL-X miktarlarındaki değişim. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü.
93
a
K
H2O 2 (µM)
250 500 1000
H2O 2 (µM )
K 250 500 1000
AIF
Apaf-1
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
b
90
K
250
500
1000
Sitozolik hücre kesimi
AIF miktarı (%)
Apaf-1 miktarı (%)
100
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
K
250
500
1000
60
50
40
30
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-39: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem gördükten
sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin western
emdirim analizi.
a) Fare kökenli anti-Apaf-1 ve sıçan kökenli anti-AIF varlığında western emdirimi, b) Sitozolik AIF ve Apaf-1
miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü.
Daha sonra K562 hücrelerine önce 24 saat süreyle 1 µM β-karoten sonra yüksek
derişimde (2 ve 4 mM) H2 O2 48 saat süre ile uygulandıktan sonra sitoplazmik ve
mitokondriyal kesimlere ayrılan hücrelerde, Cyt c, Smac/D, Bcl-2, Apaf-1, AIF ve
BCL-X gibi apoptotik ve anti-apoptotik proteinlerin miktarlarındaki değişiklikler
‘western’ emdirim analizi ile incelendi. Elde edilen sonuçlara göre; bu gruptaki
hücrelerde H2O2 derişimine bağlı olarak Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitozole
salındığı görüldü (Şekil 4-40). Antiapoptotik proteinlerden Bcl-2’nin mitokondriyal
kesimde anlatımının arttığı, BCL-X miktarının ise kontrole göre azaldığı fakat bu
azalmanın 2 mM H2 O2 derişiminde daha belirgin olduğu görüldü (Şekil 4-41).
Mitokondriyal proapoptotik proteinlerden AIF’nin H2O2 derişimine bağlı olarak
sitoplazmik miktarının arttığı, Apaf-1 miktarının ise 2 mM’da arttığı 4 mM’da azaldığı
belirlendi (Şekil 4-42).
94
a
K
H2 O2
2 mM 4mM
H 2 O2
2 mM 4mM
K
Sitokrom c
Smac/D
Mitokondriyal
kesim
100
100
90
90
80
70
60
K
2 mM
4 mM
50
40
30
20
Smac/D miktarı (%)
Sitokrom c miktarı (%)
b
Sitozolik
kesim
80
70
50
40
30
20
10
10
0
0
Sitozolik hücre kesimi
K
2 mM
4 mM
60
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-40: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem
gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin
western emdirim analizi
a) Fare kökenli anti-Smac/D ve sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirimi, b) H2O2 etkisi ile
mitokondriden sitozole salınan Sitokrom c ve Smac/D miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak
ölçüldü. Sitozolik kesimde Sitokrom c’nin üst kısmında bulunan bantlar non-spesifik bantlar olup dikkate
alınmamıştır.
95
a
K
H2O 2
2 mM 4mM
H2O 2
2 mM 4mM
K
Bcl-2
BCL-X
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
2 mM
4 mM
Mitokondriyal hücre kesimi
BCL-X miktarı (%)
Bcl-2 miktarı (%)
b
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
2 mM
4 mM
Mitokondriyal hücre kesimi
Şekil 4-41: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem
gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin
western emdirim analizi
a) Fare kökenli anti-Bcl-2 ve anti-BCL-X varlığında western emdirimi, b) H2O2 derişimine bağlı olarak mitokondriyal
Bcl-2 ve BCL-X miktarlarındaki değişim. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü.
96
a
K
H2O2
2 mM 4mM
H2O2
2 mM 4mM
K
AIF
Apaf-1
Sitozolik
Kesim
Mitokondriyal
kesim
100
100
90
90
80
70
60
K
2 mM
4 mM
50
40
30
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
Apaf-1 miktarı (%)
AIF miktarı (%)
b
80
70
K
2 mM
4 mM
60
50
40
30
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-42: Önce 24 saat β-karoten sonra farklı derişimlerde (2 mM, 4 mM) H2O2 ile işlem
gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış K562 hücrelerinin
western emdirim analizi
a) Fare kökenli anti-Apaf-1 ve sıçan kökenli anti-AIF varlığında western emdirimi, b) Sitozolik AIF ve Apaf-1
miktarları. Bant yoğunlukları ‘Image J’ programı kullanılarak ölçüldü.
H2O2 grubu, önce β-karoten sonra normal (250, 500, 1000 µM) ve yüksek
(2, 4 mM) derişimli H2O2 gruplarındaki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin
miktarlarındaki değişimin karşılaştırmalı gösterimi şekil 4-43’de verilmiştir.
97
Sitokrom c
a
K
H2O2 (µM)
250 500 1000
H2O 2 (µM )
K
H 2O2 grubu
250 500 1000
100
H2O2 grubu
90
H2O 2 (mM)
H2O2 (mM)
2
4
K
K
2
4
Önce β-k sonra
H2O 2 grubu
Mitokondriyal
kesim
80
Sitokrom c miktarı (%)
Önce β-k sonra
H2O2 grubu
70
K
60
250
50
500
40
1000
30
20
Sitozolik
kesim
10
0
Mitokondriyal
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(2 -10 mM)
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(250-1000 µM)
100
100
90
90
80
70
K
60
250
50
500
40
1000
30
20
80
Sitokrom c miktarı (%)
Sitokrom c miktarı (%)
Sitozolik
70
60
K
50
2 mM
40
4 mM
30
20
10
10
0
0
Mitokondriyal
Mitokondriyal
Sitozolik
b
Sitozolik
Smac/DIABLO
K
H2O2 (µM)
250 500 1000
H2O 2 (µM )
K
H 2O2 grubu
250 500 1000
100
Önce β-k sonra
H2O 2 grubu
H2O 2 (mM)
H2O2 (mM)
2
4
K
K
2
4
Önce β-k sonra
H2O2 grubu
Mitokondriyal
kesim
Smac/Diablo miktarı (%)
H2O2 grubu
Sitozolik
kesim
90
80
70
K
60
50
250
0
Mitokondriyal
90
80
K
250
500
40
1000
30
20
10
Smac/Diablo miktarı (%)
Smac/Diablo miktarı (%)
100
90
50
Sitozolik
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(2 -10 mM)
100
60
1000
20
10
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(250-1000 µM)
70
500
40
30
80
70
60
K
50
2 mM
40
4 mM
30
20
10
0
0
Mitokondriyal
Sitozolik
Mitokondriyal
Sitozolik
98
c
Bcl-2
H2O 2 (µM)
250 500 1000
K
K
H2O2 (µM )
250 500 1000
H2O2 grubu
100
H2O 2 grubu
90
80
H2O 2 (mM)
2
4
K
K
Bcl-2 miktarı (%)
Önce β-k sonra
H2O2 grubu
H2O2 (mM)
2
4
Önce β-k sonra
H2O 2 grubu
Mitokondriyal
kesim
70
K
60
50
250
1000
30
20
10
Sitozolik
kesim
0
Mitokondriyal hücre kesimi
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(250-1000 µM)
Önce β-k sonra H 2O2 grubu
(2 -10 mM)
100
90
80
70
K
60
50
250
40
1000
Bcl-2 miktarı (%)
Bcl-2 miktarı (%)
500
40
500
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Mitokondriyal hücre kesimi
K
2 mM
4 mM
Mitokondriyal hücre kesimi
d
BCL-X
H2O 2 (µM)
250 500 1000
K
K
H2O2 (µM )
250 500 1000
H2O2 grubu
100
H2O 2 grubu
Önce β-k sonra
H2O2 grubu
K
H2O 2 (mM)
2
4
K
H2O2 (mM)
2
4
Önce β-k sonra
H2O 2 grubu
BCL-X miktarı (%)
90
80
70
K
60
50
250
40
30
1000
20
Mitokondriyal
kesim
10
0
Sitozolik
kesim
Mitokondriyal
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(250-1000 µM)
Sitozolik
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(2 -10 mM)
100
100
90
90
80
80
70
K
60
250
50
500
40
1000
30
BCL-X miktarı (%)
BCL-X miktarı (%)
500
70
2 mM
50
4 mM
40
30
20
20
10
10
0
K
60
0
Mitokondriyal kesim
Sitozolik kesim
Mitokondriyal
Sitozolik
99
e
AIF
H2O 2 (µM)
250 500 1000
K
H2O2 (µM )
250 500 1000
K
H2 O2 grubu
100
AIF miktarı (%)
H2O 2 grubu
Önce β-k sonra
H2O 2 grubu
K
H2O2 (mM)
H2O2 (mM)
2
4
K
2
4
Önce β-k sonra
H2O2 grubu
Mitokondriyal
kesim
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Sitozolik
kesim
0
Mitokondriyal kesim
100
100
90
90
80
80
70
K
250
500
1000
50
40
Sitozolik kesim
Önce β-k sonra H2 O2 grubu
(2 -10 mM)
AIF miktarı (%)
AIF miktarı (%)
Önce β-k sonra H 2O2 grubu
(250-1000 µM)
60
K
250
500
1000
30
70
50
4 mM
40
30
20
20
10
10
0
K
2 mM
60
0
Mitokondriyal kesim
Sitozolik kesim
Mitokondriyal kesim
f
Sitozolik kesim
Apaf-1
K
250
H2 O2 grubu
H2O 2 (µM)
500 1000
H2O2 grubu
K
Apaf-1 miktarı (%)
Önce β-k sonra
H2O2 grubu
H2O2 (mM)
2
4
Önce β-k sonra
H2O 2 grubu
Sitozolik hücre
kesimi
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
250
500
1000
Sitozolik hücre kesimi
100
90
80
70
60
50
40
30
Önce β-k sonra H 2O2 grubu
(2 -10 mM)
K
250
500
1000
20
10
0
Sitozolik hücre kesimi
Apaf-1 miktarı (%)
Apaf-1 miktarı (%)
Önce β-k sonra H2O2 grubu
(250-1000 µM)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
K
2 mM
4 mM
Sitozolik hücre kesimi
Şekil 4-43: Farklı deney gruplarındaki a) Sitokrom c, b) Smac/D, c) Bcl-2, d) BCL-X,
e) AIF, f) Apaf-1’in mitokondriyal ve sitozolik hücre kesimlerindeki
miktarlarındaki değişikliklerin western emdirim analizi ile gösterimi ve ImageJ
programı kullanılarak belirlenen bant yoğunluklarının histogram gösterimi.
100
Oksidatif stres ve antioksidan-oksidan etkileşimlerinin K562 hücrelerindeki
etkisi belirlendikten sonra farklı bir kanser hücre soyu olan MCF-7 meme kanseri
hücrelerinde de bu etkileşimler çeşitli yöntemler kullanılarak belirlendi.
4.11. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücreleri Üzerine Etkisi
MCF-7 hücrelerine farklı derişim ve sürelerde H2O2 uygulanarak oksidatif stres
etkisine; hücre canlılığı, ∆Ψm’ndeki değişimler, ışık ve floresan mikroskobu
görüntüleri, AnnV-PI analizi ve çeşitli antikorlarla yapılan ‘western’ emdirim analizleri
ile bakıldı.
4.11.1. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi
Oksidatif stresin MCF-7 hücrelerinde etkisini belirlemek amacı ile hücrelere
250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2; 24, 48 ve 72 saat süre ile uygulandı. Tripan mavisi
hücre canlılık testi sonuçlarına göre, H2O2 derişimi ve uygulama süresi arttıkça MCF-7
hücre canlılığının da hızlı bir şekilde azaldığı belirlendi. Şekil 4-44’e bakıldığında; daha
24. saat 500 µM H2O2 derişiminde hücre canlılığının %50’nin altına düştüğü
görülmektedir. Zamana bağlı olarak H2 O2 etkisi incelendiğinde, 1000 µM H2O2
uygulamasında hücre canlılığının 24. saatte %25’lere, 48.saatte %10’lara, 72.saatte ise
%5’lere düştüğü görülmektedir. Ayrıca H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak
hücre proliferasyonunda da ciddi azalmalar olduğu belirlendi (Şekil 4-45). Hücrelerin
ışık mikroskobundan elde edilen yapısal görüntüleri de bu sonuçları desteklemektedir
(Şekil 4-46). Elde edilen tüm bu veriler; MCF-7 hücrelerinde de H2O2 derişim ve
uygulama süresi arttıkça oksidatif stresin arttığı ve bu artışın K562 hücrelerininkinden
daha fazla olduğu belirlendi (4-47).
101
Şekil 4-44: H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücre canlılığındaki
değişim.
Şekil 4-45: H2O2 derişim ve uygulama
proliferasyonundaki değişim.
süresine
bağlı olarak
MCF-7
hücre
102
24.saat
250 µM H2O2
Kontrol
a
750 µM H2O2
500 µM H2O2
1000 µM H2O2
10X büyütme
48.saat
250 µM H2O2
Kontrol
b
750 µM H2O2
500 µM H2 O2
1000 µM H2O2
10X büyütme
103
72.saat
250 µM H2O2
Kontrol
c
750 µM H2O2
500 µM H 2O2
1000 µM H2O 2
10X büyütme
Şekil 4-46: Farklı derişimlerde H2O2 ile a) 24 saat, b) 48 saat, c) 72 saat işlem görmüş
MCF-7 hücre morfolojilerindeki değişimin ışık mikroskobu görüntüsü.
104
MCF-7
K562
Şekil 4-47: Oksidatif stres etkisiyle MCF-7 ve K562 hücre canlılıklarındaki değişimin
karşılaştırmalı gösterimi.
4.11.2. Oksidatif Stresin MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde Meydana Getirdiği
Değişiklikler
MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için
hücrelere 24, 48 ve 72 saat süre ile 100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 verildi. Akım
sitometride yapılan analizlere göre; 100 µM H2O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde
floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark olmadığı fakat hücre
granülite ve büyüklüğünün değiştiği görüldü (Şekil 4-48). 250 µM H2O2 ile işlem
görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan ikinci hücre
popülasyonunun ortaya çıktığı, H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça bu
105
popülasyonun büyüklüğünün de hızlı bir şekilde arttığı görüldü. En düşük deney
uygulama süresi olan 24 saatte bile, 1000 µM H2O2 derişiminde mitokondri membran
potansiyelinin etkili bir şekilde azaldığı görüldü (Şekil 4-49). Hücre profillerindeki
değişimin de H2O2 derişim ve uygulama süresiyle doğru orantılı olarak arttığı belirlendi
(Şekil 4-50).
24 saat
kontrol
100 µM
Şekil 4-48: 100 µM H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm ve hücre
profilindeki değişim.
(Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.)
106
48 saat
72 saat
1000 µM
750 µM
500 µM
250 µM
24 Saat
Şekil 4-49: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen
değişiklikler.
(Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise H2O2’ye maruz kalmış hücreleri göstermektedir.)
107
24 saat
kontrol
250 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
Şekil 4-50: Oksidatif stres etkisi ile MCF-7 hücre profilindeki değişiklikler.
Floresan mikroskobu ile yapılan ∆Ψm analizlerinde de akım sitometri ile yapılan
analizleri destekler nitelikte sonuçlar elde edildi. Kontrol grubu hücrelerinde Rho123
yoğunluğu belirgin bir şekilde görülürken (Şekil 4-51), H2 O2 ile işlem görmüş
hücrelerde, derişim arttıkça Rho123 yoğunluğunun hızla azaldığı ve hücre profilinin
değiştiği görüldü (Şekil 4-52).
108
Şekil 4-51: MCF-7 hücrelerinin Rho123 ile ∆Ψm analizinin floresan mikroskobu
görüntüsü.
(Oklar Rho123 ile belirgin hale gelen mitokondrileri göstermektedir.)
250 µM
100 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
Şekil 4-52: Farklı Derişimlerde H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin floresan
mikroskobu görüntüsü.
(40x Büyütme).
109
4.11.3. Oksidatif Stres Etkisiyle MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik ve Mitokondriyal
Kesimlerinde Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin Miktarlarındaki Değişiklikler
MCF-7 hücrelerine artan derişimlerde (0-1000 µM) H2O2 uygulandıktan 24 saat
sonra sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayırım işlemi Gereç ve Yöntemler
Bölümü’nde anlatıldığı şekilde yapıldı. Daha sonra yapılan ‘western’ emdirim analizleri
ile Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya salınımına bakıldı. 250 µ M’dan
sonraki H2O2 derişimlerinde Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya
salındığı ve bu proteinlerin sitoplazmik miktarlarının H2O2 derişimi ile doğru orantılı
olarak arttığı belirlendi (Şekil 4-53).
110
a
H2 O2 (µM)
K
100
250
H2O2 (µM)
500
K
100 250
500
Sitokrom c
Smac/D
Glikoz-6-fosfatdehidrogenaz
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
b
H2O2 (µM)
K
500
750 1000
H2O2 (µM)
K
500
750
1000
Sitokrom c
Smac/D
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
Şekil 4-53: Farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin western
emdirim analizi
a) 100, 250 ve 500 µM H2O2 b) 500, 750 ve 1000 µM H2O2 ile işlem gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal
kesimlere ayrılmış MCF-7 hücrelerinin fare kökenli anti-Smac/D, sıçan kökenli anti-Sitokrom c ve
anti-Glikoz-6-fosfat dehidrogenaz varlığında western emdirimi.
111
4.12. β-karoten’in MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm Üzerine Etkisi
β-karotenin MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’ne etkisi FACS analizleri ile belirlendi.
MCF-7 hücreleri 24 saat süreyle 1 µM, 2 µM, 3 µM ve 4 µM β-karoten ile muamele
edildi. Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden yapılan analizlerde β-karotenin tek
başına MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm açısından bir değişikliğe neden olmadığı görüldü
(Şekil 4-54). FACS analizleri sırasında kapılanmış hücre profilleri incelendiğinde
hücrelerin granülite ve büyüklüklerinde de herhangi bir farka rastlanmadı (Şekil 4-55).
1 µM
3 µM
2 µM
4 µM
Şekil 4-54: Farklı derişimlerde 24 saat β-karoten uygulamasının MCF-7 hücrelerinin
∆Ψm’ne etkisi.
(Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise β-karoten uygulanmış hücreleri göstermektedir.)
112
Kontrol
2 µM
1 µM
3 µM
4 µM
Şekil 4-55: Farklı derişimlerde β-karoten ile 24 saat işlem görmüş MCF-7 hücre profilleri.
4.13. MCF-7 Hücrelerinde H2O2 ile Meydana Gelen Oksidatif Hasara Karşı
β-karotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi
MCF-7 hücrelerine 24 saat süreyle farklı derişimlerde uygulanan β-karotenin tek
başına ∆Ψm ve hücre profilininde herhangi bir değişikliğe neden olmadığının
belirlenmesi üzerine, H2O2’nin meydana getirdiği oksidatif hasarına karşı bir
antioksidan etki gösterip gösteremeyeceğini belirlemek amacıyla hücreler, H2O2 ile
muamele edilmeden önce β-karoten ile muamele edilerek hücre canlılığı, hücre
proliferasyonu ve ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi.
4.13.1. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücre Canlılığı ve
Proliferasyonunda Meydana Gelen Değişiklikler
Hücrelere 24 saat süreyle β-karoten (1 ve 2 µM) verilip uzaklaştırıldıktan sonra
100, 250, 500, 750 ve 1000 µM H2O2 24 saat uygulanarak hücre canlılığı ve
proliferasyonuna bakıldı. Elde edilen sonuçlara göre, H2O2 uygulanmadan önce 1 µM
β-karoten ile muamele gören MCF-7 hücre canlılığının 1000 µM H2O2 derişiminde bile
113
%70’lerde olduğu (Şekil 4-56 a), hücre proliferasyonunun ise hızlı bir şekilde azaldığı,
1000 µM H2O2 derişiminde %20’lere kadar düştüğü görüldü (Şekil 4-56 b).
a
100
90
80
Kontrol
70
% Canlılık
100 µM
60
250 µM
500 µM
50
750 µM
1000 µM
40
30
20
10
0
b
100
90
80
Hücre Sayısı
(x104 )
70
Kontrol
100 µM
250 µM
500 µM
750 µM
1000 µM
60
50
40
30
20
10
0
24 saat
Şekil 4-56: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde 24 saat H2O2 uygulanmış
MCF-7 hücrelerinin a) canlılık b) proliferasyonundaki değişim.
114
β-karoten derişimi arttırılıp MCF-7 hücrelerine H2O2 uygulanmadan 24 saat önce
2 µM β-karoten uygulandığında da hücre canlılığında anlamlı bir değişimin olmadığı,
aynı şekilde 1000 µM H2O2 derişiminde bile %70 oranında canlı hücre olduğu görüldü
(Şekil 4-57).
100
% canlılık
90
80
Kontrol
70
100 µM
250 µM
60
500 µM
50
750 µM
1000 µM
40
30
20
10
0
24 saat
Şekil 4-57: Önce 2 µM β-karoten sonra 24 saat farklı derişimlerde H2O2 uygulanmış
MCF-7 hücrelerinin canlılığındaki değişim.
4.13.2. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin ∆Ψm’nde
Meydana Gelen Değişiklikler
MCF-7 hücrelerine önce β-karoten (1-2 µM) sonra farklı derişimlerde
(100-1000µM) H2O2 verilerek ∆Ψm’ndeki değişiklikler belirlendi. Hücreler 24 ve 48
saat süre ile H2O2 uygulanmadan önce 1 µM β-karoten ile 24 saat muamele edilerek
yapılan FACS analizi sonuçlarına göre, 100 µM H2O2 derişiminde ∆Ψm’nin
değişmediği görüldü. Artan H2O2 derişimlerinde (250, 500, 750, 1000 µ M) ise floresan
yoğunluğu azalmış ikinci hücre popülasyonunun 24. saatte ortaya çıktığı fakat bu
popülasyonun küçük olduğu yani 1 µM β-karoten’in ∆Ψm açısından etkili olduğu ve
tam olmasa da bir koruma sağladığı görüldü. Fakat zamana bağlı olarak ∆Ψm’ndeki
değişimin arttığı, 1 µM β-karoten’in etkili olamadığı belirlendi (Şekil 4-58).
115
Floresan mikroskobunda elde edilen görüntülerde de Rho123 yoğunluğunun H2O2
grubuna göre daha fazla olduğu görüldü (Şekil 4-59).
48 saat
1000 µM
750 µM
500 µM
250 µM
24 saat
Şekil 4-58: Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde (250-1000 µM) H2O2 ile 24 ve
48 saat işlem görmüş MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’nde meydana gelen
değişiklikler.
(Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise önce 1 µM β-karoten sonra H2O2’ye maruz kalmış hücreleri
göstermektedir.)
116
100 µM
250 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
Şekil 4-59: 1 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile
muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü.
(40x Büyütme)
β-karoten derişimi arttırılıp MCF-7 hücreleri aynı şekilde H2 O2 uygulanmadan
önce 2 µM β-karoten ile muamele edildiğinde ise floresan yoğunluğu azalmış hücre
grubunun ortaya çıkmadığı yani ∆Ψm’nin değişmediği (kontrol gubu ile aynı olduğu)
görüldü (Şekil 4-60 a). FACS analizleri sırasında kapılanmış hücre profilleri
incelendiğinde ise 250-1000 µM H2O2 derişimlerinde hücrelerin granülite ve
büyüklüklerinin az miktarda değiştiği gözlemlendi (Şekil 4-60 b). Bu sonuçlara göre,
β-karoten, MCF-7 hücrelerine H2O2 uygulanmadan önce verildiğinde 2 µM derişimde
∆Ψm açısından koruma sağlamaktadır.
Floresan mikroskobu ile elde edilen görüntülerde de Rho123 alımının bu
gruptaki hücrelerde arttığı, kontrol grubu hücreleri ile benzer olduğu görüldü
(Şekil 4-61).
117
a
100 µM
250 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
b
Kontrol
500 µM
100 µM
750 µM
250 µM
1000 µM
Şekil 4-60: Önce 2 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile işlem görmüş MCF-7
hücrelerinin a) ∆Ψm’ndeki değişiklikler, b)hücre profillerindeki değişiklikler.
(Şekil a’da siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise önce 2 µM β-karoten sonra H2O2’ye maruz
kalmış hücreleri göstermektedir.)
118
100 µM
250 µM
750 µM
500 µM
1000 µM
Şekil 4-61: 2 µM β-karotenle 24 saat işlem gördükten sonra farklı derişimlerde H2O2 ile
muamele edilen MCF-7 hücrelerinin floresan mikroskobu görüntüsü.
Şekil 4-62’de yalnız H2O2 uygulanan MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm azalmış olan
ikinci hücre popülasyonunun H2 O2 derişimi ile doğru orantılı olarak arttığı fakat
hücrelere önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulandığında, bu popülayonunazaldığı;
önce 2 µM β-karoten sonra H2O2 uygulandığında ise β-karoten’in H2O2’nin oksidatif
etkisine karşı ∆Ψm açısından tam koruma sağladığı görülmektedir.
119
1 µM β-karoten-H2O2
2 µM β-karoten-H2O2
1000 µM
750 µM
500 µM
250 µM
H2O2
Şekil 4-62: Önce β-karoten (1 µM ve 2 µM) sonra H2O2 ile 24 saat işlem görmüş MCF-7
hücreleri ile sadece H2O2 ile işlem görmüş hücrelerin ∆Ψm’ndeki
değişikliklerin karşılaştırmalı gösterimi.
(Siyah çizgi kontrol grubu hücrelerini, mor dolgu ise önce β-karoten sonra (1 ve 2 µM) H2O2’yle işlem görmüş
hücreleri göstermektedir.)
4.13.3. Önce β-karoten Sonra H2O2 Uygulamasıyla MCF-7 Hücrelerinin Sitozolik
ve Mitokondriyal Kesimlerindeki Apoptotik Süreçle Đlgili Proteinlerin
Miktarlarındaki Değişiklikler
MCF-7 hücrelerine önce β-karoten (1 ve 2 µM) sonra artan derişimlerde
(500, 750 ve 1000 µM) H2O2 uygulandıktan 24 saat sonra sitoplazmik ve mitokondriyal
kesimlere ayırım işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra yapılan ‘western’ emdirim
analizleri ile sitokrom c miktarındaki değişiklikler incelendi. Hücrelere önce 1 µM
β-karoten sonra H2O2 uygulandığında sitokrom c’nin mitokondriden sitozole salındığı
görüldü. β-karoten derişimi 2 µM’a çıkarıldığında ise sitokrom c salınımının olmadığı
görüldü (Şekil 4-63). Bu sonuç, H2O2 ile oluşturulan oksidatif stresin 2 µM β-karoten ile
önlenebildiği sonucunu desteklemektedir.
120
H2O 2 (µM)
K
500
750 1000
H2O2 (µM)
K
500 750 1000
1 µM β-karoten
2 µM β-karoten
Mitokondriyal
kesim
Sitozolik
kesim
Şekil 4-63: Önce β-karoten (1 ve 2 µM) sonra H2O2 (500, 750 ve 1000 µM) ile işlem
gördükten sonra sitozolik ve mitokondriyal kesimlere ayrılmış MCF-7
hücrelerinin sıçan kökenli anti-Sitokrom c varlığında western emdirim analizleri.
121
5. TARTIŞMA
Organizmada moleküler düzeyde birçok biyolojik etkiye sahip olan ve normal
metabolik olaylar sırasında doğal olarak oluşan reaktif oksijen türleri, vücutta
antioksidanlar tarafından dengelenmektedir. Antioksidan-oksidan dengesinin bozulduğu
durumlar da ise birçok hastalığın oluşumuna neden olan oksidatif stres meydana gelir.
Başta kanser olmak üzere oksidatif stresin neden olduğu hastalıkların tanı ve tedavisine
yönelik çalışmalarda, antioksidan uygulamaları ve farklı hücre ölüm süreçlerinin
belirlenmesi büyük önem taşımaktadır.
Bu tez çalışmasında, antioksidan-oksidan etkileşimlerinin oksidatif stres ve
farklı hücre ölüm süreçlerine etkisi; K562 ve MCF-7 hücrelerine, oksidan (H2O2) ve
antioksidan (β-karoten) maddeler farklı şekillerde uygulanarak çeşitli analiz yöntemleri
kullanılarak belirlendi. Hücre canlılıkları tripan mavisi testiyle, mitokondri membran
potansiyelindeki değişiklikler floresan mikroskobu ve FACS analizleriyle, erken
apoptotik süreçteki hücreler Ann V analiziyle, apoptotik ve nekrotik hücreler AnnV-PI
analiziyle, hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler DNA analiziyle, sitozolik ve
mitokondriyal hücre kesimlerindeki proapoptotik ve antiapoptotik proteinlerin
miktarındaki değişiklikler ‘western’ emdirim analiziyle, yapısal değişiklikler ise ışık ve
floresan mikroskobu ile belirlendi.
Oksidatif stres hücre içinde birçok molekülü etkileyerek hücre hasarına ve buna
bağlı olarak da hücrelerin canlılığını yitirmesine neden olmaktadır. Hücrelerin geri
dönüşümlü veya geri dönüşümsüz ölüm sürecine girmesi, oksidanların derişimine ve
etki sürelerine bağlı olarak değişmektedir. Farklı derişim (100-1000 µM) ve sürelerde
(24-72 saat) H2O2 uygulanarak oksidatif strese maruz bırakılan K562 hücrelerinde,
H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça hücre canlılığının azaldığı belirlendi.
Hücrelerin ışık mikroskobu ile elde edilen yapısal görüntülerinin de canlılık testi
sonuçlarını destekler nitelikte olduğu görüldü. Kontrol hücrelerinin tamamı canlı iken
H2O2 derişim ve uygulama süresi arttıkça canlı hücre sayısının azaldığı ve hücre
yapılarının bozulduğu gözlemlendi. 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile muamele görmüş
hücrelerin tamamına yakınının ölü (parçalanmış ve membran bütünlüğü bozulmuş)
hücreler
olduğu
görüldü.
Aynı
şekilde
MCF-7
hücrelerine
oksidatif
stress
uygulandığında, H2O2 derişimi ve uygulama süresi arttıkça MCF-7 hücre canlılığının da
122
hızlı bir şekilde azaldığı belirlendi. Ayrıca H2O2 derişim ve uygulama süresine bağlı
olarak hücre proliferasyonunda da ciddi azalmalar olduğu görüldü. Hücrelerin ışık
mikroskobunda elde edilen yapısal görüntüleri de elde edilen verilerle uyuşmaktadır.
MCF-7 hücrelerinde oksidatif stress etkisi ile hücre ölümünün tetiklenmesi ve hücre
canlılığındaki azalmanın, K562 hücrelerininkinden daha fazla olduğu görüldü. MCF-7
hücrelerinin K562 hücrelerine göre oksidatif stresten daha fazla etkilenmeleri;
ROS’ların farklı hücre soylarında yarattığı etkinin de farklı olabileceği teziyle
uyuşmaktadır. Son yıllarda, ROS’ların hücre ölümünü tetikleme kapasitesinin
belirlenmesi ve kanser tedavisinde ROS’ların kemoterapatik ajanları destekleyici olarak
kullanılması
son
derece
önem
kazanmıştır.
ROS’ların
apoptoz
tetikleme
mekanizmalarında etkili oldukları ve apoptotik sürecini gen düzeyinde etkiledikleri
yapılan in vitro ve in vivo çalışmalar sonucunda ıspatlanmıştır.
ROS’lar hücre içi ve hücre dışı birçok etkenle oluşabilmektedirler. Hücre içi
ROS oluşturan etkenlerin başında mitokondri gelir. Tüm aerobik organizmalarda
mitokondriyal solunum zinciri ROS ürünlerinin ana kaynağını oluşturmaktadır. Hücre
ölüm mekanizmalarıyla ilgili yapılan çalışmaların büyük bir bölümü apoptoz
düzenlenmesinde önemli rolü olan mitokondride yoğunlaşmaktadır. Antioksidan
enzimler ve birçok antioksidan sistem mitokondride bulunmasına rağmen mitokondri
ROS’ların hem birincil kaynağı hem de ana hedefi konumundadır. ROS’ların oluşumu,
∆Ψm’nde azalmaya ve membranda por oluşumuna neden olmaktadır. ∆Ψm’nde
meydana gelen değişiklikler ve oluşan porlar apoptotik ve proapoptotik proteinlerin
sitoplazmaya salınımına ve apoptotik sürecin tetiklenmesine neden olmaktadır. Dolayısı
ile ∆Ψm analizi hücrenin apoptoza yönlendiğini gösteren önemli belirteçlerden biridir.
Bu nedenden dolayı oksidatif stresle ilgili çalışmalarda mitokondriyal parametrelerin
incelenmesi de büyük önem taşımaktadır. Çalışmamızda, hidrojen peroksidin farklı
kanser hücre soylarında oluşturduğu oksidatif hasar, ∆Ψm’nde meydana getirdiği
değişiklikler açısından FACS analizleri ile Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden
belirlendi. Lipofilik katyonik bir boya olan Rho123 hücre içine girdiğinde yüksek
negatif membran potansiyeline sahip olan mitokondride birikmektedir. ∆Ψm depolarize
olduğunda Rho123’ün mitokondride tutulumu azalır ve bu durum hücre içi floresan
yoğunluğunun azalması şeklinde sonuçlanır. Farklı derişim ve sürelerde H2O2
uygulanan K562 hücrelerinde 100 µM H2 O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde
floresan yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark görülmedi. 250 µM
123
H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu açısından daha düşük olan
ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı ve bu popülasyonun büyüklüğünün H2O2
derişim ve uygulama süresi arttıkça arttığı belirlendi. 72 saat süreyle 1000 µM H2O2 ile
muamele gören hücrelerin ise tamamına yakınının floresan yoğunluğunun azaldığı
görüldü. Floresan yoğunluğundaki bu düşüş ∆Ψm depolarizasyonunu göstermektedir.
Depolarizasyonun tetiklenmesi için minimum 250 µM H2 O2 derişimine gereksinim
olduğu ve H2O2 derişimi ile uygulama süresi arttıkça K562 hücrelerinin ∆Ψm’nin
azaldığı belirlendi. FACS analizlerinde, kapılanmış hücrelere bakıldığında ise,
hücrelerin granülite ve büyüklüklerindeki değişiklikler de bu bulguları destekledi.
MCF-7 hücrelerine aynı şekilde oksidatif stres uygulayarak yapılan ∆Ψm analizi
sonuçlarına göre de 100 µM H2O2 ile 24 saat işlem görmüş hücrelerde floresan
yoğunluğu açısından kontrole kıyasla herhangi bir fark olmadığı fakat hücre granülite
ve büyüklüğünün değiştiği görüldü. Bu da, hücrelerin 100 µM H2O2 derişiminde henüz
∆Ψm değişim aşamasına gelmese de bir şekilde oksidatif stresten etkilendiğini
göstermektedir. 250 µ M H2 O2 ile işlem görmüş hücrelerde ise floresan yoğunluğu
açısından daha düşük olan ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı, H2 O2 derişim ve
uygulama süresi arttıkça bu popülasyonun büyüklüğünün de hızlı bir şekilde arttığı
görüldü. En düşük deney uygulama süresi olan 24 saatte bile, 1000 µM H2O2
derişiminde ∆Ψm etkili bir şekilde azalmaktadır. Kapılanmış hücre profillerindeki
değişim de, H2O2 derişim ve uygulama süresiyle doğru orantılı olarak artmaktadır. H2O2
derişim ve uygulama süresine bağlı olarak MCF-7 hücrelerinin ∆Ψm’ndeki
değişikliklerin K562 hücrelerininkinden daha fazla olduğu görüldü. Canlılık testinde
olduğu gibi ∆Ψm analizinde de, oksidatif stresin MCF-7 hücrelerini K562 hücrelerine
göre daha fazla etkilediği görülmektedir. Rho123 ile yapılan floresan mikroskobu
çalışmasında, MCF-7 hücrelerinin mitokondrileri kontrol grubu hücrelerinde çok net bir
şekilde noktasal olarak görüntülenirken, H2O2 ile işlem görmüş hücrelerde, derişim
arttıkça Rho123 yoğunluğunun yani mitokondri sinyallerinin hızla azaldığı ve hücre
profilinin değiştiği görüldü. Mitokondri sinyallerinin hücre içinde difüzlenmiş bir
görüntü oluşturması, mitokondri yapılarınının bozulduğunu dolayısıyla ∆Ψm’ndeki
değişimi göstermektedir. Mitokondriyal oksidatif stres etkisi ile hücre yaşamını
yakından ilgilendiren protein, lipid ve membran yapılarının hasarlanması hücre
ölümünün aktifleşmesine yol açmaktadır. Dolayısıyla, H2O2’nin oluşturduğu oksidatif
hasar apoptotik süreci tetiklediği sonucuna varıldı.
124
Kanser gelişiminde ve özellikle kanser tedavisi sürecinde sıklıkla karşılaşılan
hücre ölüm mekanizmalarından biri de kontrolsüz hücre ölümü olarak adlandırılan
nekrozdur. Bağışık yanıtı uyarabilen nekroz sürecinin, doğal olarak tümör gelişimini de
engelleyebileceği öngörülmüştür. Kanser ilaçlarının bir kısmı da tümör hücrelerinde
nekrozu uyararak etkili olmaktadır. Bu nedenle, apoptotik hücreler ile birlikte nekrotik
hücrelerin belirlenmesi de önem taşımaktadır. Ayrıca hücrelerin apoptozun hangi
aşamasında olduğu da tedavide belirleyici bir özelliktir. Bu nedenle, K562 hücrelerine
24 saat süreyle artan derişimlerde H2O2 uygulandıktan sonra Ann V-PI boyama ile
FACS analizleri yapıldı. Canlı ve ölü hücrelerin ayrı kapılandığı noktasal grafikler
incelendiğinde; canlı hücre popülasyonunun H2O2 derişimi ile doğru orantılı olarak
azaldığı, ölü hücre popülasyonunun ise giderek arttığı belirlendi. Canlı kabul edilen
boyanmamış hücre popülasyonunun giderek azaldığı, yalnız AnnV, yalnız PI ve AnnV
+ PI ile boyanmış hücre popülasyonlarının giderek arttığı gözlemlendi. Analiz sonucu
elde edilen sayısal değerlere göre; canlı hücre popülasyonunun kontrol hücrelerine göre
1000µM H2O2 ile muamele edilen hücrelerde % 74 oranında düştüğü belirlendi.
Apoptotik hücre popülasyonunun, kontrol hücrelerine göre, 1000 µM H2O2 ile muamele
edilen hücrelerde % 66 oranında arttığı görüldü. Erken apoptotik hücre popülasyonunun
% 2,6 , nekrotik hücre popülasyonunun ise %6 oranında arttığı görüldü. Bu veriler,
hücrelerin büyük bir kısmının geç apoptotik evrede olduğunu yani apoptozun geri
dönüşümsüz aşamasına girdiğini göstermektedir ve bu sonuçlar ∆Ψm ve canlılık
analizlerinden elde edilen sonuçlarla da uyuşmaktadır.
Oksidatif stres vücuttaki antioksidan mekanizmalarıyla önlenir ya da onarılır.
Antioksidanlar, serbest radikallerle reaksiyona girerek hücresel düzeydeki hasarı
engellemekte ve birçok hastalığın oluşumunu durdurmaktadırlar. A vitamini oksidatif
nedenlerle oluşan hücre yıkımının tamirinde önemli rolü olan bir vitamindir. A
vitamininin suda eriyebilen öncülü olan β-karoten ise güçlü bir antioksidan olup
dokularda peroksil radikallerinin yakalanmasından sorumludur ve serbest oksijen
radikallerinin oluşumunu önlemesinin yanı sıra radikallerle doğrudan reaksiyona
girebilir10. β-karoten kanser ve hücre ölümü çalışmalarında sıkça kullanılmaktadır.
Bunun nedeni β-karotenin birçok ülkede yetişen meyve ve sebzelerde en çok görülen
ortak karotenoid olmasıdır. Bazı epidemiyolojik çalışmalar, ateroskleroz va kanser
insidansının uygun miktarda β-karoten ve diğer karotenoidleri alan kişilerde daha düşük
olduğunu göstermektedir57. β-karoten’nin apoptoz ve hücre döngüsünü G2/M fazında
125
tutuklayarak, birçok insan kolon adenokarsinoma hücre soyunun çoğalmasını
engellediği bildirilmiştir12. β-karoten’nin, melanoma95, prostat96, ağız, akciğer ve
göğüs97 kanseri hücrelerini de içeren daha birçok tümör hücresinin çoğalmasını inhibe
edici etkisi olduğu bilinmektedir. Fakat, β-karoten’nin kronik farmakolojik dozları
kullanılarak yapılan insan aracılı denemelerde beklenmedik bir şekilde β-karotenin,
sigara içenlerde akciğer kanseri oluş sıklığını düşürmediği hatta daha da arttırdığı
görülmüştür65,68,69. Bu nedenle; β-karoten’nin, kendi özelliklerinin yanında, etki
gösterdiği biyolojik çevrenin redoks potansiyeline de bağlı olarak; serbest radikal
üretimini engelleyerek antioksidan55,65,67,70 ya da serbest radikallerle indüklenen
reaksiyonları ilerleterek prooksidan olarak görev yaptığı düşünülmektedir65,72,73. Bu
nedenle,
birçok
deneysel
kemoterapötiklerin
çalışmada;
sitotoksisitesini
β-karoten,
arttırmak
için
kolon
kanserine
önerilmektedir12,86.
karşı
Ayrıca,
β-karoten’nin bcl-2 gen ailesinden olan ve programlı hücre ölümünde inhibitör olarak
görev yapan Bcl-2 ve Bcl-xL anlatımlarını da azalttığı gösterilmiştir65. Bu bulgular,
β-karoten’nin derişime ve hücrenin biyolojik çevresine bağlı olarak antioksidan ya da
prooksidan olarak etki eden bir hücreiçi redoks ajanı olabileceğini göstermektedir65. Bu
bilgiler ışığında, K562 ve MCF-7 hücrelerinde H2O2’nin neden olduğu oksidatif hasara
karşı antioksidanların etkisini belirlemek amacıyla, hücrelere H2O2 uygulanmadan önce,
sonra ve H2O2 ile eş zamanlı olarak β-karoten verildi. Öncelikle, β-karoten’in tek başına
etkisinin olup olmadığı ve uygulanacak uygun dozun belirlenebilmesi amacıyla
hücrelere 24 saat süreyle farklı derişimlerde (0,1 nM-100 µM) β-karoten uygulanarak
Rho123’ün floresan yoğunluğu üzerinden FACS analizleri yapıldı. β-karotenin
uygulanan dozlarda tek başına ∆Ψm’ni değiştirmediği görüldü. Deneylerde kullanılacak
β-karoten derişimi 1µM olarak seçildi ve bu derişimde β-karotenin zamana bağlı
(24-72 saat) olarak da ∆Ψm’nde kontrole kıyasla herhangi bir değişikliğe neden
olmadığı
belirlendi.
FACS
analizleri
sırasında
kapılanmış
hücre
profilleri
incelendiğinde, hücrelerin granülite ve büyüklüklerinde de herhangi bir farka
rastlanmadı. Bunun üzerine, β-karoten’nin H2O2’nin meydana getirdiği oksidatif
hasarına karşı, bir antioksidan etki gösterip gösteremeyeceğini belirlemek için,
hücrelere farklı derişimlerde H2O2 ile birlikte 1 µM β-karoten verilerek ∆Ψm’ndeki
değişiklikler belirlendi. Đlginç bir şekilde β-karoten’nin H2O2’nin oksidatif etkisini daha
da arttırdığı görüldü. β-karoten, H2O2 uygulandıktan sonra hücrelere verildiğinde ise 24.
ve 72. saatlerdeki ∆Ψm değişikliklerinin, yalnız H2O2 ile muamele edilen hücre
126
gruplarındaki ∆Ψm değişiklikleri ile benzer olduğu fakat 48. saatte β-karotenin
H2O2’nin yarattığı oksidatif etkiyi arttırıcı yönde etki ettiği görüldü. Hücreler H2O2
uygulanmadan önce β-karoten ile muamele edildiğinde ise ∆Ψm’nin hiçbir şekilde
değişmediği görüldü. β-karoten hücrelere H2O2 uygulanmadan önce verildiğinde
antioksidan özelliği ön plana çıkmış, H2 O2’nin oksidatif etkisine karşı incelenen
parametreler açısından tam koruma sağlamış ve hücrelerin apoptoza gitmesini tamamen
engellemiştir. Uygulama şekline ve zamana bağlı olarak β-karoten, antioksidan ve
prooksidan olarak etki göstermiştir. β-karoten’nin farklı şekillerde oksidanlarla
etkileşime sokulması sonucu elde edilen bu veriler daha önce bahsedilen literatür
bilgisiyle de uyuşmaktadır; hücrelere H2O2 ile aynı anda uygulandığında, H2 O2’nin
sitotoksitesini arttırırken, öncesinde uygulandığında ise oksidatif etkisini azalttığı hatta
tamamen ortadan kaldırdığı görüldü.
Hücrelere önce β-karoten sonra H2O2 uygulandığında, ∆Ψm’nde depolarizasyon
söz konusu değilken hücre profilinin kontrole kıyasla az da olsa değiştiği gözlemlendi.
∆Ψm değişmezken hücre granülite ve büyüklüğünün değişmesi, bu hücrelerin apoptoza
yönlenmiş olabileceğini düşündürdü, çünkü apoptotik sürecin ilk belirtisi hücre
profilinin değişmesidir, ∆Ψm değişimi ise bundan sonraki aşamadır. Normalde
hücrelerde hücre zarının iç yüzünde membran lipidlerinden biri olan PS bulunmaktadır
ve eğer hücre apoptoza yönlenmiş ise PS molekülleri hücre membranının dış yüzeyine
transloke olurlar. Bu yer değiştirme hücre membran bütünlüğünün bozulmadığı
apoptotik hücre ölümünün erken dönemlerinde meydana gelir. AnnV, PS’e bağlanabilen
bir protein olduğundan, floresan bir madde ile işaretlenek erken apoptotik hücreler
belirlenebilir. Bu nedenle, hücreler floresan işaretli AnnV ile muamele edilerek,
AnnV'ın PS'e bağlanma oranı FACS analizleri ile belirlendi. Sonuçlar, H2O2 derişim ve
uygulama süresi ile doğru orantılı olarak floresan yoğunluğunun arttığını yani AnnV
cevabının pozitif çıktığını, hücrelerin apoptoza yönlendiğini gösterdi. Bunun üzerine,
hücrelere 1µM β-karoten uygulandıktan sonra yüksek derişimlerde (2-10 mM) H2O2
verilerek, β-karotenin K562 hücrelerinde H2O2’nin hangi derişimine kadar koruyucu
etki göstereceği test edildi. Elde edilen verilere göre, daha 2 mM H2 O2 derişiminde
∆Ψm’nin hızlı bir şekilde değiştiği görüldü. 24. ve 48. saatlerde 10 mM H2O2
derişiminde hücrelerin tamamının ∆Ψm’nin azaldığı, 72. saatte ise daha 4 mM H2O2
derişiminde hücrelerin tamamının floresan yoğunluğunun azaldığı belirlendi. Yalnız
H2O2 uygulanan hücrelerde, daha 1000 µM derişimde hücrelerin tamamında ∆Ψm
127
değişimi görülürken, 1000 µM’dan daha yüksek derişimlerde H2O2 uygulanmadan önce
β-karoten ile muamele edilen hücrelerde, çok yüksek derişimlere çıkılmasına rağmen
β-karoten’in antioksidan olarak etkili olduğu fakat yüksek H2O2 derişimlerinde oksidatif
hasara karşı tam olarak etki göstermesi için bu dozun (1 µM) yeterli olmadığı
görülmüştür.
Önce 1 µM β-karoten sonra 1000 µM’dan daha yüksek derişimde H2O2 ile
muamele edilen hücrelerin yapıları ışık mikroskobunda incelendiğinde ise oldukça
ilginç görüntüler elde edildi. Yalnız H2 O2 uygulanan hücre grubunda 1000 µM
derişimde bile hücrelerin tamamına yakını ölü ve parçalanmış hücreler olmasına
rağmen, önce β-karoten sonra yüksek derişimde H2 O2 uygulanan hücre grubunda ise 10
mM H2 O2 derişiminde bile hücrelerin membran bütünlüklerinin bozulmadığı, hücre
içeriklerinin kutuplaşmış olduğu görüldü. Elde edilen bu görüntülere dayanarak
hücrelerin ölüm şeklinin apoptoz dışında farklı bir programlanmış hücre ölüm şekli
olduğu sonucuna varıldı. Literatürde K562 hücreleri ile yapılan bir çalışmada219 elde
ettiğimiz görüntülerle benzer hücre profili elde edilmiş ve bu hücre ölüm şekli ‘nekrozbenzeri hücre ölümü’ şeklinde yorumlanmıştır. Şartlara ve uygulama şekline göre, bazı
hücre ölümü morfolojilerinin birkaç tipi aynı hücrede görülebilmektedir ve bu da aynı
hücrede
birden
fazla
hücre
ölüm
mekanizmasının
aynı
uyaran
tarafından
etkinleştirilebileceğini göstermektedir. Şimdiye kadar literatürde birçok hücre ölüm tipi
tanımlanmıştır. Fakat, çeşitli hücresel strese karşı ortaya çıkan ve birbirinden farklı
mekanizmalara sahip olan hücre ölümleri; genel olarak apoptotik, nekrotik ve otofajik
hücre ölümü olmak üzere üç tipte toplanmaktadır. Diğerleri ise normalden farklı olan
hücre ölüm modellerinin geçici (kesin olmayan) tanımlarıdır. Hücre ölümü ile ilgili
çalışmalar hızla devam etmekte olup doğru bir sınıflandırmanın yapılabilmesi ve hücre
ölüm tipinin doğru bir şekilde belirlenebilmesi için hücre ölümlerini ayırt edici
özellikler gözönüne alınarak farklı biyokimyasal ve işlevsel yöntemler kullanılarak daha
fazla araştırmaya gereksinim vardır.
β-karotenin K562 hücrelerinde oluşturulan oksidatif strese karşı etkisi
belirlendikten sonra farklı kanser hücre soylarında meydan gelen oksidatif hasara karşı
etkisi ise MCF-7 hücreleri üzerinden belirlendi. Hücreler 24 saat süreyle (1-4 µM)
β-karoten ile muamele edildi ve bu derişimlerde β-karotenin tek başına MCF-7
hücrelerinde ∆Ψm açısından bir değişikliğe neden olmadığı, hücre granülite ve
128
büyüklüklerinin de değişmediği gözlemlendi. Hücreler H2O2 uygulanmadan önce 24
saat süreyle β-karoten (1 ve 2 µM) ile muamele edildiğinde ise hücre canlılıklarının her
iki β-karoten derişiminde de korunduğu (1000 µM’da bile % 70), hücre
proliferasyonunun ise azaldığı görüldü. Önce 1 µM β-karoten sonra farklı derişimlerde
H2O2 ile işlem gören hücrelerin ∆Ψm analizlerine bakıldığında, 100 µM H2O2
derişiminde ∆Ψm’nin değişmediği, diğer derişimlerde (250-1000 µ M) ise floresan
yoğunluğu azalmış ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıktığı fakat bu popülasyonun
az olduğu yani 1 µM β-karoten’in ∆Ψm açısından etkili olduğu fakat bu dozun MCF-7
hücreleri için yeterli olmadığı sonucuna varıldı. Bunun üzerine β-karoten derişimi
2 µM’a kadar arttırıldı ve bu derişimde ∆Ψm’nin değişmediği, floresan yoğunluğunun
kontrol grubu hücreleri ile bire bir örtüştüğü belirlendi. Sonuç olarak, yalnız H2O2
uygulanan MCF-7 hücrelerinde ∆Ψm azalmış olan ikinci hücre popülasyonu H2O2
derişimi ile doğru orantılı olarak artarken önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulanan
hücrelerde, bu popülayonun büyüklüğünün azaldığı; β-karoten derişimi 2 µM’a
çıkarıldığında ise ∆Ψm düşük olan ikinci hücre popülasyonunun ortaya çıkmadığı yani
β-karoten’in, H2O2’nin oksidatif etkisine karşı, incelenen parametreler açısından tam
koruma sağladığı belirlendi. Floresan mikroskobu ile yapılan analizlerde de Rho123
alımının önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 uygulanan hücre grubunda arttığı görüldü.
β-karoten derişimi 2 µM’a çıkarıldığında ise Rho123 ile işaretlenen mitokondrilerin
sayılarının daha da arttığı yani mitokondri yapılarının korunduğu görülmüştür. Hücre
morfolojilerinin 1000 µM H2O2 derişiminde bile kontrol grubu hücreleri ile benzer
olduğu dikkat çekmiştir. Bu sonuçlara göre; β-karoten K562 hücrelerinde oksidatif
hasara karşı 1 µM derişimde etkili olurken, MCF-7 hücrelerinde H2O2’nin neden olduğu
oksidatif hasara karşı ancak 2 µM derişimde tam olarak antioksidan etki göstermektedir.
Bunun nedeni ise daha önce elde ettiğimiz sonuçlardan da görülebileceği gibi MCF-7
hücrelerinin oksidanlara karşı K562 hücrelerinden daha duyarlı olması ve oksidatif
stresten daha fazla etkilenmeleridir. Bu nedenle, β-karoten’in antioksidan olarak etki
gösterebileceği doz da yükselmiştir.
Oksidatif stress etkisiyle apoptotik ölüm sinyallerinin alınması, mitokondri
membranının iyon geçirgenliğini değiştirmekte ve bunu ∆Ψm’ndeki değişiklikler
izlemektedir. Membrandaki bu değişimler ve oluşan porlar nedeniyle sitokrom c,
Smac/D ve AIF gibi mitokondriyal kesimde yer alan moleküller sitoplazmaya salınırlar.
AIF,
doğrudan
yoğunlaşan
kromatine
ve
parçalanan
çekirdeğe
yönelirken,
129
sitoplazmadaki sitokrom c ise Apaf-1’e bağlanarak prokaspaz-9’u aktifleştirir
(apoptozom) ve prokaspaz-9’un aktifleşmesi bir seri kaspazın aktifleşmesine neden
olur. Yapılan analizler sonucu, K562 hücrelerinde H2 O2’nin neden olduğu oksidatif
stresin apoptotik hücre ölümünü tetiklediğinin belirlenmesi üzerine, hücreler
sitoplazmik ve mitokondriyal kesimlere ayrıldıktan sonra proapoptotik ve antiapoptotik
proteinlerin (Cyt c, Smac/D, Bcl-2, Bcl-X, AIF, Kaspaz-3, Apaf-1 gibi) miktarlarındaki
değişiklikler ‘western’ emdirim analizleri ile belirlendi ve bant yoğunlukları ‘ImageJ’
programı kullanılarak değerlendirildi. Farklı derişimlerde (250-1000 µM) H2O2
uygulanmış hücre grubu ile önce 1 µM β-karoten sonra yüksek derişimde (2, 4 mM)
H2O2 uygulanmış hücre grubunda Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitoplazmaya
salındığı ve bu proteinlerin sitoplazmik miktarlarının H2O2 derişimi ile doğru orantılı
olarak arttığı görüldü. Önce 1 µM β-karoten sonra 250, 500 ve 1000 µM derişimlerinde
H2O2 uygulanarak yürütülen deneylerin sonuçlarına göre; bu gruptaki hücrelerde Cyt c
ve Smac/D’nun sitozoldeki miktarlarının kontrol grubu ile aynı olduğu yani
mitokondriden
sitoplazmaya
herhangi bir
şekilde
salınım olmadığı
görüldü.
Mitokondriyal proteinlerden AIF’nin de yalnız H2O2 grubu ve önce β-karoten sonra
yüksek derişimli H2O2 (2, 4 mM) uygulanan hücre grubunda mitokondriden
sitoplazmaya salındığı, önce β-karoten sonra H2O2 (250-1000 µM) grubunda ise
değişmediği belirlendi. Sitozolik proteinlerden Apaf-1 miktarı yalnız H2O2 grubu ve
önce β-karoten sonra yüksek derişimli H2 O2 grubunda artarken önce β-karoten sonra
H2O2 (250-1000 µM) grubunda ise anlamlı bir değişikliğin olmadığı görüldü.
Mitokondriyal proteinlerden Bcl-2 ve BCL-X anlatımının yalnız H2O2 grubu ve önce
β-karoten sonra H2O2 (250-1000 µM) grubunda arttığı, önce β-karoten sonra yüksek
derişimli H2 O2 grubunda ise Bcl-2 nlatımı artarken BCL-X miktarının azaldığı
belirlendi. Tüm bu sonuçlar, H2O2 ile oksidatif strese maruz kalan hücrelerin geri
dönüşümsüz apoptotik sürece girdiğini ve 250, 500, 1000 µM H2O2 uygulanmadan önce
β-karoten ile muamele edilen hücrelerin ise beklendiği gibi apoptotik ölüm sürecine
girmediği görüldü. Elde edilen bu veriler, diğer tüm analiz sonuçları ile de
uyuşmaktadır. Mitokondriyal ve sitozolik kesimlere ayrılan MCF-7 hücrelerinde ise
250 µM’dan sonraki H2O2 derişimlerinde Cyt c ve Smac/D’nun mitokondriden sitozole
salındığı belirlendi. Hücrelere farklı derişimlerde H2O2 uygulanmadan önce 1 µM
β-karoten verildiğinde Cyt c ve Smac/D’nun sitozole salındığı; H2O2 uygulanmadan
önce 2 µM β-karoten verildiğinde ise bu proteinlerin sitozole salınmadığı görüldü.
130
Çeşitli hastalıkların tedavisinde kaspaz ailesi üyeleri ve Bcl-2/Bax ailesindeki genlerin
anlatımları önemli yer tutmaktadır. Temel olarak kanser kemoterapilerinin amacı hücre
ölümünü apoptoz yolu ile uyarmaktır220. Apoptoz ve hücre çoğalması arasında kontrollü
ve hassas bir denge vardır. Bu dengenin apoptoz lehine bozulması Alzheimer, Parkinson
gibi hastalıklara, hücre çoğalması lehine bozulması ise kanser ve otoimmün hastalıklara
neden olmaktadır. Tüm bu hastalıkların oluşumunun engellenmesi, tedavi edilebilmesi
amacı ile apoptozu kontrol eden mekanizmaların daha iyi anlaşılması gerekmektedir.
Kanserlerde apoptoz tetikleyici mekanizmalarda işlev kaybı ya da hücre çoğalmasını
tetikleyici mekanizmalarda aşırı aktiflik görülmektedir. Bu nedenle, apoptotik
mekanizmalar, kanser tedavisinde hedef alınmakta ve daha az yan etkiye sahip ilaçların
geliştirilmesine çalışılmaktadır.
Kanserle ilgili yapılan çalışmalarda hücre ölüm şekilleri ile birlikte hücre
döngüsü çalışmaları da son 25 yılın araştırma konularının başında gelir. Çünkü kanser
aşırı hızda bölünen ya da apoptoza direnen hücrelerin yarattığı bir sorundur.
Oksidanlara maruz kalan hücrelerin ölüme yönlenmesinde hücre çevriminin hangi
aşamasında olduğu da belirleyici bir etmendir. Hücre çevrimi farklı moleküler
mekanizmaların tetiklenmesiyle farklı metabolik süreçlerin işlev gördüğü fazlardan
oluşmakta ve her bir fazda enerji gereksinimleri farklı olduğundan, enerji üretiminden
sorumlu olan mitokondri reaksiyonları da farklılık göstermektedir. Hücreler bir sorun ile
karşılaştıklarında, önce DNA’da oluşan hasarlarını hücre döngüsünü G2 fazında
tutuklayarak DNA tamir mekanizmaları ile tamir etmekte, çevresel faktörlerin iyi
olmaması durumunda ise hücre bölünmesini G1 fazında durdurarak şartların
iyileşmesini beklemektedirler. Bu şekilde de mümkün olmuyorsa apoptotik yolla intihar
etmekte ya da farklı programlı hücre ölümleri ile elimine edilmektedirler. Dolayısıyla,
oksidatif stres ve hücre ölümüyle ilgili çalışmaların DNA analizleriyle de desteklenmesi
son derece önemlidir. Bu nedenle K562 hücrelerine 48 saat süreyle artan derişimlerde
(100-1000 µM) H2O2 uygulandıktan sonra hücre döngüsü fazlarındaki değişiklikler
FACS analizleri ile belirlendi ve bu derişimlerde H2O2’nin hücre döngüsü fazlarındaki
değişimi indüklediği görüldü. 100 µM H2O2 derişiminde hücre döngüsü fazlarında
anlamlı bir değişiklik olmazken, 500 ve 1000 µ M H2O2 derişiminlerinde G1 fazındaki
hücre popülasyonunun azaldığı belirlendi. G1 fazındaki azalmayı; 500 µM H2O2
derişiminde G2’deki artış izlerken, 1000 µM H2O2 derişiminde ise S fazındaki artış
izlemektedir. 1000 µM’da S fazındaki bu akümülasyon hücre döngüsü inhibisyonunu
131
işaret etmektedir. Bu gruptaki hücreler apoptotik yolla ölüme gitmektedirler.
Literatürde, farklı hücre soylarında aynı H2O2 derişimleri uygulanarak yapılan bir
çalışmada221, hücre döngüsü fazlarındaki değişim bizim bulgularımızla örtüşmektedir.
Hücrelere yalnız 1 µM β-karoten uygulandıktan sonra yapılan DNA analizlerinde ise,
beklendiği gibi hücre döngüsü fazlarında herhangi bir değişikliğe rastlanmamıştır. K562
hücrelerine önce 1 µM β-karoten sonra H2O2 (100-1000 µM) uygulandıktan sonra
yapılan DNA analizleri; hücrelerin G2 fazında tutuklandığını (500 µM’da %55,
1000 µM’da %58 oranında artış), G1 ve S fazlarındaki hücre popülasyonunun azaldığını
göstermektedir. Bu gruptaki hücrelerin ∆Ψm’nin değişmediği, hücreler ölüme gitmediği
halde granülite ve büyüklüklerinin değiştiği, AnnV cevabının da pozitif çıktığını
gösterdik.
DNA
analizlerinden
elde
edilen
sonuçlar
da
bu
bulgularımızı
desteklemektedir. Bu gruptaki hücrelerin, DNA’da oluşan hasarı hücre döngüsünü G2
fazında tutuklayarak DNA tamir mekanizmaları ile tamir ettiklerini ve bu nedenle geri
dönüşümsüz apoptotik sürece girmeden, H2 O2’nin neden olduğu oksidatif hasarın
onarıldığını düşünmekteyiz. 100 µM H2O2 derişiminde ise bu grupta da anlamlı bir
değişikliğe rastlanmadı. K562 hücrelerine yüksek derişimde (2-10 mM) H2O2
uygulanmadan önce 1 µM β-karoten uygulanarak yapılan DNA analizleri ise ilginç bir
şekilde hücre döngüsü fazlarında herhangi bir değişikliğin olmadığını, kontrol grubu ile
aynı hücre döngüsü profilinin ortaya çıktığını göstermektedir. Elde edilen bu veriler, bu
gruptaki hücrelerin ölümünün hücre döngüsünden bağımsız olarak gerçekleştiğini
göstermektedir. Farklı gruplardaki hücrelerin farklı metabolik süreçlerden geçtiği
görülmektedir. Literatürde, oksidatif stresle indüklenen hücre ölümünün, hücre döngüsü
bağımlı veya bağımsız yolla gerçekleşebileceğini gösteren çalışmalar bulunmaktadır222,
bu da bizim bulgularımızı desteklemektedir. Ayrıca, önce β-karoten sonra yüksek
derişimde H2 O2 uygulanan hücrelerin ∆Ψm analizi, yapısal görüntüleri ve DNA
analizlerinden elde edilen sonuçlar, bu gruptaki hücrelerin apoptoz dışında farklı bir
ölüm sürecinden geçtiğini göstermektedir. Đnsan kanserlerinin yarısından fazlasında
hücre ölümü yolaklarında rol alan genlerden bir veya birkaçında mutasyon
izlenmektedir. Bu yolakların çalışılması ve farklı hücre ölüm şekillerinin belirlenmesi,
özellikle kanserli hastaların prognozunu saptamada, tedavi yanıtını izlemede ve yeni
tedavi hedeflerini bulma açısından büyük önem taşımaktadır.
Bu çalışmada antioksidan-oksidan etkileşimlerinin oksidatif stres ve farklı hücre
ölüm süreçlerine etkisi farklı kanser hücre soyları üzerinden gösterildi. Özetle, K562 ve
132
MCF-7 kanser hücrelerinde hidrojen peroksit ile indüklenen oksidatif stres arttıkça
hücre canlılıklarının azaldığı; K562 hücrelerinin oksidatif strese karşı MCF-7
hücrelerinden daha dirençli olduğu gösterildi. K562 hücrelerinde H2O2 ile indüklenen
oksidatif stres etkisiyle hücrelerin apoptotik yolla ölüme gittiği gösterildi. Hücrelere
farklı derişimlerde uygulanan β-karotenin tek başına her iki hücre soyunda da kullanılan
dozlar ve incelenen parametreler açısından herhangi bir değişikliğe neden olmadığı
gösterildi. β-karotenin, K562 hücrelerinde H2O2 ile farklı şekillerde etkileşime
sokulduğunda ise uygulama şekline ve zamana bağlı olarak, antioksidan veya oksidan
olarak etkili olduğu gösterildi. Hücrelere oksidanlarla birlikte verildiğinde sitotoksik
etkiyi arttırdığı; oksidanlardan önce uygulandığında ise oksidatif hasarı azalttığı ya da
önlediği gösterildi. K562 hücrelerine hidrojen peroksitten önce uygulanan 1 µM
β-karoten antioksidan olarak etki gösterirken, oksidatif strese daha duyarlı olan MCF-7
hücrelerinde ise ancak 2 µM derişimde antioksidan olarak etkili olduğu gösterildi. K562
hücrelerine 1 µM β-karoten uygulandıktan sonra 1000 µ M’dan daha yüksek
derişimlerde H2O2 uygulanarak oksidatif stres arttırıldığında ise hücrelerin apoptoz
dışında farklı bir programlanmış hücre ölüm sürecine girdiği ve bu ölüm şeklinin hücre
döngüsü fazlarından bağımsız olarak gerçekleştiği gösterildi. Elde edilen tüm bu
bulgular, sadece kanser değil oksidatif stresin neden olduğu birçok hastalığın tanı ve
tedavisine yönelik çalışmalara katkı sağlayacaktır. Bugün birçok hastalığın hücre ölümü
ya da yaşamı ile ilgili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle apoptotik sürece müdahale
ederek yeniden düzenlenmesi, önemli tedavi yöntemlerini gündeme getirmektedir.
Ayrıca apoptoz dışında farklı hücre ölüm şekillerinin belirlenmesi ve bunların
mekanizmalarının anlaşılması da birçok hastalığa karşı tedavi yöntemlerinin
geliştirilmesine katkı sağlayacaktır. Günümüzde kanser tedavisinde hücreleri genellikle
apoptoz yoluyla ölüme götürmek için radyoterapi ve kemoterapiden sıklıkla
yararlanılmaktadır. Fakat bu yöntemler normal hücrelerde de apoptozu başlatabilmekte
ve birçok olumsuz yan etkiye neden olabilmektedirler. Bu nedenle antioksidan-oksidan
etkileşim
mekanizmalarının
anlaşılması
geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır.
ve
antioksidan
tedavi
yöntemlerinin
133
KAYNAKLAR
1.
Matés JM, Sánchez-Jiménez FM. Role of reactive oxygen species in apoptosis:
implications for cancer therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2000;32:157-170.
2.
Ambs S, Hussain SP, Marrogi AJ, Harris CC. Cancer-prone oxyradical overload
disease. IARC Sci Publ. 1999:295-302.
3.
Lee JM, Bernstein A. Apoptosis, cancer and the p53 tumour suppressor gene.
Cancer Metastasis Rev. 1995;14:149-161.
4.
Suzuki YJ, Forman HJ, Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal
transduction. Free Radic Biol Med. 1997;22:269-285.
5.
Al-Omar MA., Beedham C., Alsarra IA. Pathological roles of reactive oxygen
species and their defence mechanisms. Saudi Pharm J. 2004;12:1-18.
6.
Alles a, Alley K, Barrett JC, et al. Apoptosis: a general comment. FASEB J.
1991;5:2127-2128.
7.
Hoye AT, Davoren JE, Wipf P, Fink MP, Kagan VE. Targeting mitochondria.
Acc Chem Res. 2008;41:87-97.
8.
Sun K-H, de Pablo Y, Vincent F, Shah K. Deregulated Cdk5 promotes oxidative
stress and mitochondrial dysfunction. J Neurochem. 2008;107:265-278.
9.
Tosun Đ, Karadeniz B. Çay ve çay fenoliklerinin antioksidan aktivitesi. Zir Fak
Derg. 2005;20:78-83.
10.
Burton GW. Antioxidant action of carotenoids. J Nutr. 1989;119:109-111.
11.
Prakash P, Russell RM, Krinsky NI. In Vitro Inhibition of Proliferation of
Estrogen-Dependent and Estrogen-Independent Human Breast Cancer Cells
Treated with Carotenoids or Retinoids. J Nutr. 2001;131:1574-1580.
12.
Palozza P. Induction of cell cycle arrest and apoptosis in human colon
adenocarcinoma cell lines by beta-carotene through down-regulation of cyclin A
and Bcl-2 family proteins. Carcinogenesis. 2002;23:11-18.
13.
Chen QM, Liu J, Merrett JB. Apoptosis or senescence-like growth arrest:
influence of cell-cycle position, p53, p21 and bax in H2O2 response of normal
human fibroblasts. Biochem J. 2000;347:543-551.
14.
Gutteridge JMC. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue
damage. Clin Chem. 1995;41:1819-1828.
134
15.
Toyokuni S, Akatsuka S. Pathological investigation of oxidative stress in the
post-genomic era. Pathol Int. 2007;57:461-473.
16.
Halliwell B. Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem J.
2007;401:1-11.
17.
Halliwell B. The wanderings of a free radical. Free Radic Biol Med.
2009;46:531-542.
18.
Dröge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev.
2002;82:47-95.
19.
Thannickal VJ, Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000;279:L1005-L1028.
20.
Mercan U. Toksikolojide Serbest Radikallerin Önemi. 2004;15:91-96.
21.
Adali M, Inal-Erden M, Akalin A, Efe B. Effects of propylthiouracil,
propranolol, and vitamin E on lipid peroxidation and antioxidant status in
hyperthyroid patients. Clin Biochem. 1999;32:363-367.
22.
Cherubini A, Ruggiero C, Polidori MC, Mecocci P. Potential markers of
oxidative stress in stroke. Free Radic Biol Med. 2005;39:841-852.
23.
Altınışık M. Serbest oksijen radikalleri ve antioksidanlar.
www.mustafaaltinisik.org.uk/21-adsem-01.pdf. May 28, 2007.
24.
Singal PK, Khaper N, Palace V, Kumar D. The role of oxidative stress in the
genesis of heart disease. Cardiovasc Res. 1998;40:426-432.
25.
Fleury C, Mignotte B, Vayssière J-L. Mitochondrial reactive oxygen species in
cell death signaling. Biochimie. 2002;84:131-141.
26.
Kannan K, Jain S. Oxidative stress and apoptosis. Pathophysiology. 2000;7:153163.
27.
Maxwell SR. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs. 1995;49:345361.
28.
Behl C. Vitamin E protects neurons against oxidative cell death in vitro more
effectively than 17-beta estradiol and induces the activity of the transcription
factor NF-kappaB. J Neural Transm. 2000;107:393-407.
29.
Hill MF, Singal PK. Antioxidant and oxidative stress changes during heart failure
subsequent to myocardial infarction in rats. Am J Pathol. 1996;148:291-300.
30.
Giordano FJ. Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure. J Clin Invest.
2005;115:500-508.
135
31.
Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. Oxidants, antioxidants, and the
degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90:7915-7922.
32.
Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative
disorders. Science. 1993;262:689-695.
33.
Halliwell B. Cellular stress and protection mechanisms. Biochem Soc Transac.
1996;24:78-83.
34.
Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents
in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem.
1999;64:555-559.
35.
O’Neill ME, Thurnham DI. Intestinal Absorption of Beta-Carotene, Lycopene
and Lutein in Men and Women Following a Standard Meal: Response Curves in
the Triacylglycerol-Rich Lipoprotein Fraction.; 1998.
36.
Young JF, Nielsen SE, Haraldsdóttir J, et al. Effect of fruit juice intake on
urinary quercetin excretion and biomarkers of antioxidative status. Am J Clin
Nutr. 1999;69:87-94.
37.
Scambia G, Ranelletti FO, Benedetti Panici P, et al. Synergistic antiproliferative
activity of quercetin and cisplatin on ovarian cancer cell growth. Anticancer
Drugs. 1990;1:45-48.
38.
Sanz MJ, Ferrandiz ML, Cejudo M, et al. Influence of a series of natural
flavonoids on free radical generating systems and oxidative stress. Xenobiotica.
1994;24:689-699.
39.
Prasad K, Laxdal VA, Yu M, Raney BL. Antioxidant activity of allicin, an active
principle in garlic. Mol Cell Biochem. 1995;148:183-189.
40.
Lotito SB, Fraga CG. (+)-Catechin prevents human plasma oxidation. Free Radic
Biol Med. 1998;24:435-441.
41.
Brown JE, Rice-Evans CA. Luteolin-rich artichoke extract protects low density
lipoprotein from oxidation in vitro. Free Radic Res. 1998;29:247-255.
42.
Jang DS, Kang BS, Ryu SY, Chang IM, Min KR, Kim Y. Inhibitory effects of
resveratrol analogs on unopsonized zymosan-induced oxygen radical production.
Biochem Pharmacol. 1999;57:705-712.
43.
Barceló S, Macé K, Pfeifer AMA, Chipman JK. Production of DNA strand
breaks by N-nitrosodimethylamine and 2-amino- 3-methylimidazo[4,5f]quinoline in THLE cells expressing human CYP isoenzymes and inhibition by
sulforaphane. In: Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms
of Mutagenesis.Vol 402.; 1998:111-120.
136
44.
Lopaczynski W, Zeisel SH. Antioxidants, programmed cell death, and cancer.
Nutr Res. 2001;21:295-307.
45.
Evelson P, Ordónez CP, Llesuy S, Boveris A. Oxidative stress and in vivo
chemiluminescence in mouse skin exposed to UVA radiation. J Photochem
Photobiol B Biol. 1997;38:215-219.
46.
Cooke MS, Evans MD, Dizdaroglu M, Lunec J. Oxidative DNA damage:
mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 2003;17:1195-1214.
47.
Van Der Meulen JH, McArdle A, Jackson MJ, Faulkner JA. Contraction-induced
injury to the extensor digitorum longus muscles of rats: the role of vitamin E. J
Appl Physiol. 1997;83:817-823.
48.
Packer L. Protective role of vitamin E in biological systems. Am J Clin Nutr.
1991;53:1050S - 1055S.
49.
Stratton S, DC L. Determination of singlet oxygen-specific versus radicalmediated lipid peroxidation in photosensitized oxidation of lipid bilayers: Effect
of beta-carotene and alpha-tocopherol. Biochemistry. 1997;36:12911-12920.
50.
Prasad KN, Kumar A, Kochupillai V, Cole WC. High doses of multiple
antioxidant vitamins: essential ingredients in improving the efficacy of standard
cancer therapy. J Am Coll Nutr. 1999;18:13-25.
51.
Hanukoglu I. Antioxidant protective mechanisms against reactive oxygen species
(ROS) generated by mitochondrial P450 systems in steroidogenic cells. Drug
Metab Rev. 2006;38:171-196.
52.
Paiva SA, Russell RM. Beta-carotene and other carotenoids as antioxidants. J Am
Coll Nutr. 1999;18:426-433.
53.
Gerster H. The potential role of lycopene for human health. J Am Coll Nutr.
1997;16:109-126.
54.
Bendich A. Biological functions of dietary carotenoids. Ann N Y Acad Sci.
1993;691:61-67.
55.
Stahl W, Sies H. Lycopene: a biologically important carotenoid for humans?
Arch Biochem Biophys. 1996;336:1-9.
56.
Aras K, Erşen G, Karahan S. Tıbbi Biyokimya. Ankara: Ankara Üniversitesi
Basımevi; 1976.
57.
Di Mascio P, Murphy ME, Sies H. Antioxidant defense systems: The role of
carotenoids, tocopherols, and thiols. In: American Journal of Clinical
Nutrition.Vol 53.; 1991.
137
58.
Divisi D, Di Tommaso S, Salvemini S, Garramone M, Crisci R. Diet and cancer.
Acta Biomed. 2006;77:118-123.
59.
Larsson SC, Bergkvist L, Näslund I, Rutegård J, Wolk A. Vitamin A, retinol, and
carotenoids and the risk of gastric cancer: a prospective cohort study. Am J Clin
Nutr. 2007;85:497-503.
60.
Mayne ST. Beta-carotene, carotenoids, and disease prevention in humans.
FASEB J. 1996;10:690-701.
61.
Nagata Y, Sonoda T, Mori M, et al. Dietary isoflavones may protect against
prostate cancer in Japanese men. J Nutr. 2007;137:1974-1979.
62.
Touillaud MS, Thiébaut ACM, Fournier A, Niravong M, Boutron-Ruault MC,
Clavel-Chapelon F. Dietary lignan intake and postmenopausal breast cancer risk
by estrogen and progesterone receptor status. J Natl Cancer Inst. 2007;99:475486.
63.
Weinstein SJ, Wright ME, Lawson KA, et al. Serum and Dietary Vitamin E in
Relation to Prostate Cancer Risk.; 2007.
64.
Pfahl M. Retinoid related molecules: new promises against lung and breast
cancer. Expert Opin Investig Drugs. 1998;7:601-606.
65.
Palozza P. Can beta-carotene regulate cell growth by a redox mechanism? An
answer from cultured cells. Biochim Biophys Acta. 2005;1740:215-221.
66.
Ziegler RG, Mayne ST, Swanson CA. Nutrition and lung cancer. Cancer Causes
Control. 1996;7:157-177.
67.
Krinsky NI. Actions of carotenoids in biological systems. Annu Rev Nutr.
1993;13:561-587.
68.
Group. TA-TBCCPS. The effect of vitamin E and beta carotene on the incidence
of lung cancer and other cancers in male smokers. N Engl J Med. 1994;330:10291035.
69.
Omenn GS, Goodman GE, Thornquist MD, et al. Effects of a combination of
beta carotene and vitamin A on lung cancer and cardiovascular disease. N Engl J
Med. 1996;334:1150-1155.
70.
Palozza P, Krinsky NI. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro: an
overview. Methods Enzymol. 1992;213:403-420.
71.
Sies H, Stahl W. Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids as
antioxidants. Am J Clin Nutr. 1995;62:1315S - 1321S.
72.
Burton GW, Ingold KU. beta-Carotene: an unusual type of lipid antioxidant.
Science. 1984;224:569-573.
138
73.
Palozza P. Prooxidant actions of carotenoids in biologic systems. Nutr Rev.
1998;56:257-265.
74.
Jacobson MD. Reactive oxygen species and programmed cell death. Trends
Biochem Sci. 1996;21:83-86. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8882579.
April 13, 2015.
75.
K. Ashfaq, Hina S. Zuberi, M. Anwar M. Vitamin E and β-carotene affect natural
killer cell function. Int J Food Sci Nutr. 2000;51:S13-S20.
76.
Peto R, Doll R, Buckley JD, Sporn MB. Can dietary beta-carotene materially
reduce human cancer rates? Nature. 1981;290:201-208.
77.
Ziegler RG. A review of epidemiologic evidence that carotenoids reduce the risk
of cancer. J Nutr. 1989;119:116-122.
78.
Prabhala RH, Garewal HS, Hicks MJ, Sampliner RE, Watson RR. The effects of
13-cis-retinoic acid and beta-carotene on cellular immunity in humans. Cancer.
1991;67:1556-1560.
79.
Ringer T V., DeLoof MJ, Winterrowd GE, et al. Beta-carotene’s effects on serum
lipoproteins and immunologic indices in humans. Am J Clin Nutr. 1991;53:688694.
80.
Van Poppel G, Spanhaak S, Ockhuizen T. Effect of Beta-Carotene on
Immunological Indexes in Healthy Male Smokers.; 1993.
81.
Giovannucci E, Stampfer MJ, Colditz G, Rimm EB, Willett WC. Relationship of
diet to risk of colorectal adenoma in men. J Natl Cancer Inst. 1992;84:91-98.
82.
Giovannucci E. Tomatoes, tomato-based products, lycopene, and cancer: review
of the epidemiologic literature. J Natl Cancer Inst. 1999;91:317-331.
83.
Cahill RJ, O’Sullivan KR, Mathias PM, Beattie S, Hamilton H, O’Morain C.
Effects of vitamin antioxidant supplementation on cell kinetics of patients with
adenomatous polyps. Gut. 1993;34:963-967.
84.
Phillips RW, Kikendall JW, Luk GD, et al. beta-Carotene inhibits rectal mucosal
ornithine decarboxylase activity in colon cancer patients. Cancer Res.
1993;53:3723-3725.
85.
Tang G, Shiau A, Russell RM, Mobarhan S. Serum Retinoic Acid Levels in
Patients with Resected Benign and Malignant Colonic Neoplasias on BetaCarotene Supplementation.; 1995.
86.
Conklin KA. Dietary antioxidants during cancer chemotherapy: impact on
chemotherapeutic effectiveness and development of side effects. Nutr Cancer.
2000;37:1-18.
139
87.
Temple NJ, Basu TK. Protective effect of beta-carotene against colon tumors in
mice. J Natl Cancer Inst. 1987;78:1211-1214.
88.
Alabaster O, Tang Z, Frost A, Shivapurkar N. Effect of beta-carotene and wheat
bran fiber on colonic aberrant crypt and tumor formation in rats exposed to
azoxymethane and high dietary fat. Carcinogenesis. 1995;16:127-132.
89.
Tanaka T, Kawamori T, Ohnishi M, et al. Suppression of azoxymethane-induced
rat colon carcinogenesis by dietary administration of naturally occurring
xanthophylls astaxanthin and canthaxanthin during the postinitiation phase.
Carcinogenesis. 1995;16:2957-2963.
90.
Kim JM, Araki S, Kim DJ, et al. Chemopreventive effects of carotenoids and
curcumins on mouse colon carcinogenesis after 1,2-dimethylhydrazine initiation.
Carcinogenesis. 1998;19:81-85.
91.
Iftikhar S, Lietz H, Mobarhan S, Frommel TO. In vitro beta-carotene toxicity for
human colon cancer cells. Nutr Cancer. 1996;25:221-230.
92.
Palozza P, Maggiano N, Calviello G, et al. Canthaxanthin induces apoptosis in
human cancer cell lines. Carcinogenesis. 1998;19:373-376.
93.
Palozza P, Calviello G, Maggiano N, Lanza P, Ranelletti FO, Bartoli GM. Betacarotene antagonizes the effects of eicosapentaenoic acid on cell growth and lipid
peroxidation in WiDr adenocarcinoma cells. Free Radic Biol Med. 2000;28:228234.
94.
Palozza P, Calviello G, Serini S, et al. β-Carotene at high concentrations induces
apoptosis by enhancing oxy-radical production in human adenocarcinoma cells.
Free Radic Biol Med. 2001;30:1000-1007.
95.
Hazuka MB, Edwards-Prasad J, Newman F, Kinzie JJ, Prasad KN. Beta-carotene
induces morphological differentiation and decreases adenylate cyclase activity in
melanoma cells in culture. J Am Coll Nutr. 1990;9:143-149.
96.
Williams AW, Boileau TW, Zhou JR, Clinton SK, Erdman JW. Beta-carotene
modulates human prostate cancer cell growth and may undergo intracellular
metabolism to retinol. J Nutr. 2000;130:728-732.
97.
Schwartz J, Shklar G. The selective cytotoxic effect of carotenoids and alphatocopherol on human cancer cell lines in vitro. J Oral Maxillofac Surg.
1992;50:364-367.
98.
Wei RR, Wamer WG, Lambert LA, Kornhauser A. beta-Carotene uptake and
effects on intracellular levels of retinol in vitro. Nutr Cancer. 1998;30:53-58.
99.
Kane DJ, Sarafian TA, Anton R, et al. Bcl-2 inhibition of neural death: decreased
generation of reactive oxygen species. Science. 1993;262:1274-1277.
140
100. Güneş HV. Moleküler Hücre Biyolojisi. Eskişehir: Kaan Kitabevi; 2006.
101. Kroemer G, Galluzzi L, Vandenabeele P, et al. Classification of cell death:
recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell
Death Differ. 2009;16:3-11.
102. Melino G. The Sirens’ song. Nature. 2001;412:23.
103. Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular
mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol.
2010;11:700-714.
104. Christofferson DE, Yuan J. Necroptosis as an alternative form of programmed
cell death. Curr Opin Cell Biol. 2010;22:263-268.
105. Lippens S, Hoste E, Vandenabeele P, Agostinis P, Declercq W. Cell death in the
skin. Apoptosis. 2009;14:549-569.
106. Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in
the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6:328-340.
107. Lippens S, Denecker G, Ovaere P, Vandenabeele P, Declercq W. Death penalty
for keratinocytes: apoptosis versus cornification. Cell Death Differ. 2005;12
Suppl 2:1497-1508.
108. Counis MF, Chaudun E, Arruti C, et al. Analysis of nuclear degradation during
lens cell differentiation. Cell Death Differ. 1998;5:251-261.
109. Testa U. Apoptotic mechanisms in the control of erythropoiesis. Leuk Off J Leuk
Soc Am Leuk Res Fund, UK. 2004;18:1176-1199.
110. Garrido C, Kroemer G. Life’s smile, death's grin: Vital functions of apoptosisexecuting proteins. Curr Opin Cell Biol. 2004;16:639-646.
111. Galluzzi L, Joza N, Tasdemir E, et al. No death without life: vital functions of
apoptotic effectors. Cell Death Differ. 2008;15:1113-1123.
112. Weber GF, Menko AS. The canonical intrinsic mitochondrial death pathway has
a non-apoptotic role in signaling lens cell differentiation. J Biol Chem.
2005;280:22135-22145.
113. Yan Q, Liu JP, Wan-Cheng Li D. Apoptosis in lens development and pathology.
Differentiation. 2006;74:195-211.
114. Lang KS, Lang PA, Bauer C, et al. Mechanisms of suicidal erythrocyte death.
Cell Physiol Biochem. 2005;15:195-202.
141
115. Remijsen Q, Kuijpers TW, Wirawan E, Lippens S, Vandenabeele P, Vanden
Berghe T. Dying for a cause: NETosis, mechanisms behind an antimicrobial cell
death modality. Cell Death Differ. 2011;18:581-588.
116. Piacentini M, Fesus L, Farrace MG, Ghibelli L, Piredda L, Melino G. The
expression of “tissue” transglutaminase in two human cancer cell lines is related
with the programmed cell death (apoptosis). Eur J Cell Biol. 1991;54:246-254.
117. Mantovani A, Cassatella M a, Costantini C, Jaillon S. Neutrophils in the
activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol.
2011;11:519-531.
118. Roninson IB, Broude E V, Chang BD. If not apoptosis, then what? Treatmentinduced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells. Drug Resist Updat.
2001;4:303-313.
119. Castedo M, Perfettini J-L, Roumier T, Andreau K, Medema R, Kroemer G. Cell
death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene. 2004;23:28252837.
120. Okada H, Mak TW. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour
cells. Nat Rev Cancer. 2004;4:592-603.
121. Vakifahmetoglu H, Olsson M, Zhivotovsky B. Death through a tragedy: mitotic
catastrophe. Cell Death Differ. 2008;15:1153-1162.
122. Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, et al. Molecular definitions of cell death
subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death
2012. Cell Death Differ. 2012;19:107-120.
123. Gilmore AP. Anoikis. Cell Death Differ. 2005;12:1473-1477.
124. Vural F, Cebesoy S, Karakaş M. Classification of cell death. 2013;1:120-126.
125. Raff MC, Whitmore A V, Finn JT. Axonal self-destruction and
neurodegeneration. Science. 2002;296:868-871.
126. Sperandio S, de Belle I, Bredesen DE. An alternative, nonapoptotic form of
programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:14376-14381.
127. Sperandio S, Poksay K, de Belle I, et al. Paraptosis: mediation by MAP kinases
and inhibition by AIP-1/Alix. Cell Death Differ. 2004;11:1066-1075.
128. Brennan MA, Cookson BT. Salmonella induces macrophage death by caspase-1dependent necrosis. Mol Microbiol. 2000;38:31-40.
129. Martinon F, Tschopp J. Inflammatory caspases and inflammasomes: master
switches of inflammation. Cell Death Differ. 2007;14:10-22.
142
130. Fink SL, Cookson BT. Pyroptosis and host cell death responses during
Salmonella infection. Cell Microbiol. 2007;9:2562-2570.
131. Labbé K, Saleh M. Cell death in the host response to infection. Cell Death Differ.
2008;15:1339-1349.
132. Mormone E, Matarrese P, Tinari A, et al. Genotype-dependent priming to selfand xeno-cannibalism in heterozygous and homozygous lymphoblasts from
patients with Huntington’s disease. J Neurochem. 2006;98:1090-1099.
133. Overholtzer M, Mailleux AA, Mouneimne G, et al. A Nonapoptotic Cell Death
Process, Entosis, that Occurs by Cell-in-Cell Invasion. Cell. 2007;131:966-979.
134. Yuan J, Kroemer G. Alternative cell death mechanisms in development and
beyond. Genes Dev. 2010;24:2592-2602.
135. Doukoumetzidis K, Hengartner MO. Cell biology: dying to hold you. Nature.
2008;451:530-531.
136. Kerr J. F. R., Wyllie A. H. C a. R. Apoptosis : a Basic Biological Phenomenon
With Wide-. Br J Cancer. 1972;26:239-257.
137. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol.
2007;35:495-516.
138. Thompson CB. Apoptosis in the Pathogenesis and Treatment of Disease. Science
(80- ). 1995;267:1456-1462.
139. Vaux DL, Flavell RA. Apoptosis genes and autoimmunity. Curr Opin Immunol.
2000;12:719-724.
140. Thompson EB. Apoptosis and steroid hormones. Mol Endocrinol. 1994;8:665673.
141. Akşit H, Bildik A. Apoptozis. YYÜ Vet Fak Derg. 2008;19:55-63.
142. Erdoğan BB, Uzaslan EK. Apoptozis Mekanizmaları: Tümör Gelişiminde FasFasL Bağımlı Apoptozis. Turkiye Klin Arch Lung. 2003;4:165-174.
143. Hikim AP, Wang C, Leung A, Swerdloff RS. Involvement of apoptosis in the
induction of germ cell degeneration in adult rats after gonadotropin-releasing
hormone antagonist treatment. Endocrinology. 1995;136:2770-2775.
144. McPhie DL, Coopersmith R, Hines-Peralta A, et al. DNA synthesis and neuronal
apoptosis caused by familial Alzheimer disease mutants of the amyloid precursor
protein are mediated by the p21 activated kinase PAK3. J Neurosci.
2003;23:6914-6927.
143
145. Kerr JF, Winterford CM, Harmon B V. Apoptosis. Its significance in cancer and
cancer therapy. Cancer. 1994;73:2013-2026.
146. Rashed MM, Ragab NM, Haematol TJ. The pattern of expression of the apoptotic
inducer Fas and the apoptotic inhibitor bcl-2 oncogenes immunohistochemicaly
in bone-marrow invaded by the non-Hodgkin lymphomas. 2004:141-147.
147. Estaquier J, Idziorek T, de Bels F, et al. Programmed cell death and AIDS:
significance of T-cell apoptosis in pathogenic and nonpathogenic primate
lentiviral infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9431-9435.
148. Roshal M, Zhu Y, Planelles V. Apoptosis in AIDS. Apoptosis. 2001;6:103-116.
149. Staley K, Blaschke AJ, Chun J. Apoptotic DNA fragmentation is detected by a
semi-quantitative ligation-mediated PCR of blunt DNA ends. Cell Death Differ.
1997;4:66-75.
150. Cohen JJ. Programmed cell death and apoptosis in lymphocyte development and
function. Chest. 1993;103:99S - 101S.
151. Squìer MK, Miller AC, Malkinson AM, Cohen JJ. Calpain activation in
apoptosis. J Cell Physiol. 1994;159:229-237.
152. Mountz J, Zhou T. Apoptosis and autoimmunology. In: Koopman WJ, ed.
Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology. 14th ed.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2001.
153. Pınarbaşı E. Apoptozis (Programlı Hücre Ölümü). In: Yıldırım A, Bardakçı F,
Karataş M, Tanyolaç B, eds. Moleküler Biyoloji. Ankara: Nobel Yayın;
2007:423-468.
154. Trump BF, Berezesky IK, Chang SH, Phelps PC. The pathways of cell death:
oncosis, apoptosis, and necrosis. Toxicol Pathol. 25:82-88.
155. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis.
Cardiovasc Res. 2000;45:528-537.
156. Bortner CD, Oldenburg BEN, Cidlowski JA, Oldenburg NBE. The role of DNA
fragmentation in apoptosis. Trends Cell Biol. 1995;5:21-26.
157. Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet. 1993;341:1251-1254.
158. Final stage of apoptosis. 2015.
http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/apoptosismacrophage.
159. Öktem S, Özhan MH, Özol D. Apoptozisin Önemi. Toraks Derg. 2001;2:91-95.
160. Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell. 1997;88:355-365.
144
161. Kaneda K, Kashii S, Kurosawa T, et al. Apoptotic DNA fragmentation and
upregulation of Bax induced by transient ischemia of the rat retina. Brain Res.
1999;815:11-20.
162. TOMATIR AG. Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü. Türkiye Klin Tıp Bilim Derg.
2003;23:499-508.
163. Droin N, Cathelin S, Jacquel A, et al. A role for caspases in the differentiation of
erythroid cells and macrophages. Biochimie. 2008;90:416-422.
164. Lamkanfi M, Festjens N, Declercq W, Vanden Berghe T, Vandenabeele P.
Caspases in cell survival, proliferation and differentiation. Cell Death Differ.
2007;14:44-55.
165. Nhan TQ, Liles WC, Schwartz SM. Physiological functions of caspases beyond
cell death. Am J Pathol. 2006;169:729-737.
166. Heath-Engel HM, Shore GC. Mitochondrial membrane dynamics, cristae
remodelling and apoptosis. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res.
2006;1763:549-560.
167. Kim R, Emi M, Tanabe K, Murakami S, Uchida Y, Arihiro K. Regulation and
interplay of apoptotic and non-apoptotic cell death. J Pathol. 2006;208:319-326.
168. Kumar S. Mechanisms mediating caspase activation in cell death. Cell Death
Differ. 1999;6:1060-1066.
169. Salvesen GS. Caspases and apoptosis. Essays Biochem. 2002;38:9-19.
170. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science. 1998;281:1309-1312.
171. Yıldırım A, Fevzi B, Karataş M, Tanyolaç B, eds. Moleküler Biyoloji. 1st ed.
Ankara: Nobel Yayın; 2007.
172. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000;407:770-776.
173. Lüleyap HÜ. Moleküler Genetiğin Esasları. 1st ed. Adana: Nobel Kitabevi;
2008.
174. Golstein P, Kroemer G. Cell death by necrosis: towards a molecular definition.
Trends Biochem Sci. 2007;32:37-43.
175. Festjens N, Vanden Berghe T, Vandenabeele P. Necrosis, a well-orchestrated
form of cell demise: Signalling cascades, important mediators and concomitant
immune response. Biochim Biophys Acta - Bioenerg. 2006;1757:1371-1387.
176. Arslan DÖ, Korkmaz G, Gözüaçık D. Otofaji: Bir Hücresel Stres Yanıtı ve Ölüm
Mekanizması. 2011.
145
177. Ohsumi Y. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. Nat
Rev Mol Cell Biol. 2001;2:211-216.
178. Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a double-edged
sword. Science. 2004;306:990-995.
179. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ. Autophagy fights disease
through cellular self-digestion. Nature. 2008;451:1069-1075.
180. Yang Z, Klionsky DJ. Eaten alive: a history of macroautophagy. Nat Cell Biol.
2010;12:814-822.
181. Xie Z, Klionsky DJ. Autophagosome formation: core machinery and adaptations.
Nat Cell Biol. 2007;9:1102-1109.
182. Gozuacik D, Kimchi A. Autophagy and cell death. Curr Top Dev Biol.
2007;78:217-245.
183. Levine B, Yuan J. Autophagy in cell death: An innocent convict? J Clin Invest.
2005;115:2679-2688.
184. Kroemer G, Mariño G, Levine B. Autophagy and the Integrated Stress Response.
Mol Cell. 2010;40:280-293.
185. Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, Codogno P. Overview of macroautophagy
regulation in mammalian cells. Cell Res. 2010;20:748-762.
186. Wirawan E, Berghe T Vanden, Lippens S, Agostinis P, Vandenabeele P.
Autophagy: for better or for worse. Cell Res. 2012;22:43-61.
187. Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon H-U, Kimchi A. Life and death partners:
apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Differ.
2009;16:966-975.
188. Karantza-Wadsworth V, Patel S, Kravchuk O, et al. Autophagy mitigates
metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis. Genes Dev.
2007;21:1621-1635.
189. Mathew R, Kongara S, Beaudoin B, et al. Autophagy suppresses tumor
progression by limiting chromosomal instability. Genes Dev. 2007;21:13671381.
190. Qu X, Zou Z, Sun Q, et al. Autophagy Gene-Dependent Clearance of Apoptotic
Cells during Embryonic Development. Cell. 2007;128:931-946.
191. Bermek E, Nurten R, Tiryaki D, Gökçe S. Biyofizik Ders Notları (in Turkish).
Đstanbul: Đstanbul Tıp Fakültesi Yayınevi; 1997.
146
192. Lozzio CB, Lozzio BB. Human chronic myelogenous leukemia cell-line with
positive Philadelphia chromosome. Blood. 1975;45:321-334.
193. Klein E, Ben-Bassat H, Neumann H, et al. Properties of the K562 cell line,
derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J cancer. 1976;18:421431.
194. Koeffler HP, Golde DW. Human myeloid leukemia cell lines: a review. Blood.
1980;56:344-350.
195. Nakajima O, Hashimoto Y, Iwasaki S. Enhancement by retinoid of hemininduced differentiation of human leukemia K562 cell line. FEBS Lett.
1993;330:81-84.
196. ANDERSSON LC, JOKINEN M, GAHMBERG CG. Induction of erythroid
differentiation in the human leukaemia cell line K562. Nature. 1979;278:364365.
197. Davis MG, Kawai Y, Arinze IJ. Involvement of Gialpha2 in sodium butyrateinduced erythroblastic differentiation of K562 cells. Biochem J. 2000;346 Pt
2:455-461.
198. LOWRY OH, ROSEBROUGH NJ, FARR AL, RANDALL RJ. Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193:265-275.
199. Singhal SS, Awasthi S, Pandya U, et al. The effect of curcumin on glutathionelinked enzymes in K562 human leukemia cells. Toxicol Lett. 1999;109:87-95.
200. Saydam G, Aydin HH, Sahin F, et al. Involvement of protein phosphatase 2A in
interferon-alpha-2b-induced apoptosis in K562 human chronic myelogenous
leukaemia cells. Leuk Res. 2003;27:709-717.
201. Şencan S, Onaran Đ, Demirtaş H. Warfarin’in sitotoksik etkisinin K562 lösemik
hücre soyunda çalışılması. 2007;16:11-16.
202. Soule HD, Vazguez J, Long A, Albert S, Brennan M. A human cell line from a
pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst.
1973;51:1409-1416.
203. Sun J, Hai Liu R. Cranberry phytochemical extracts induce cell cycle arrest and
apoptosis in human MCF-7 breast cancer cells. Cancer Lett. 2006;241:124-134.
204. Lowe SW, Lin AW. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 2000;21:485-495.
205. Parton M. Studies of apoptosis in breast cancer. BMJ. 2001;322:1528-1532.
206. Yu Z, Zhang L, Wu D, Liu F. Anti-apoptotic action of zearalenone in MCF-7
cells. Ecotoxicol Environ Saf. 2005;62:441-446.
147
207. Dilsiz N. Hücre ve hücre döngüsü. In: Moleküler Biyoloji. Ankara: Palme
Yayıncılık; 2004:111-113.
208. Caspari T. Checkpoints: How to activate p53. Curr Biol. 2000;10.
209. Prives C, Hall PA. The p53 pathway. J Pathol. 1999;187:112-126.
210. Niida H, Nakanishi M. DNA damage checkpoints in mammals. Mutagenesis.
2006;21:3-9.
211. Nojima H. Cell cycle checkpoints, chromosome stability and the progression of
cancer. Hum cell Off J Hum Cell Res Soc. 1997;10:221-230.
212. Hartwell L, Weinert T, Kadyk L, Garvik B. Cell cycle checkpoints, genomic
integrity, and cancer. In: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative
Biology.Vol 59.; 1994:259-263.
213. Çoğulu Ö, Alpman A, Durmaz B, Özkınay F. Mitoz ve Mayozun Moleküler
Temelleri. Türkiye Klin Tıp Bilim Derg. 2007;27:725-737.
214. Fei P, El-Deiry WS. P53 and radiation responses. Oncogene. 2003;22:5774-5783.
215. Gatti R, Belletti S, Orlandini G, Bussolati O, Dall’Asta V, Gazzola GC.
Comparison of annexin V and calcein-AM as early vital markers of apoptosis in
adherent cells by confocal laser microscopy. J Histochem Cytochem.
1998;46:895-900.
216. Koopman G, Reutelingsperger CPM, Kuijten GAM, Keehmen RMJ, Pais ST, van
Oers MHJ. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine
expression on B cells undergoing apoptosis. Blood1. 1994;84:1415-1420.
217. Zhang G, Gurtu V, Kain SR, Yan G. Early detection of apoptosis using a
fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 1997;23:525-531.
218. Tesarik J, Greco E, Cohen-Bacrie P, Mendoza C. Germ cell apoptosis in men
with complete and incomplete spermiogenesis failure. Mol Hum Reprod.
1998;4:757-762.
219. Verrax J, Stockis J, Tison A, Taper HS, Calderon PB. Oxidative stress by
ascorbate/menadione association kills K562 human chronic myelogenous
leukaemia cells and inhibits its tumour growth in nude mice. Biochem
Pharmacol. 2006;72:671-680.
220. Yurtcu E. Vinkristinin Uyardığı Apoptozis Üzerine β-Karoten ve Folik.
Apoptosis. 2007;14:237-240.
221. Pizarro JG, Folch J, Vazquez De la Torre A, et al. Oxidative stress-induced DNA
damage and cell cycle regulation in B65 dopaminergic cell line. Free Radic Res.
2009;43:985-994.
148
222. Langley B, Ratan RR. Oxidative stress-induced death in the nervous system: cell
cycle dependent or independent? J Neurosci Res. 2004;77:621-629.
149
ÖZGEÇMĐŞ
Kişisel Bilgiler
Adı
Doğ.Yeri
Uyruğu
Email
Soyadı
Doğ.Tar.
TC Kim No
Tel
Sabiha
Đstanbul/Bakırköy
T.C.
toks@istanbul.edu.tr
Tok
15/12/1979
23447731900
0533 423 94 05
Eğitim Düzeyi
Doktora
Yük.Lis.
Lisans
Lise
Mezun Olduğu Kurumun Adı
Đstanbul Üniversitesi/Đstanbul Tıp Fakültesi/Biyofizik ABD
Đstanbul Üniversitesi/ Đstanbul Tıp Fakültesi/Biyofizik ABD
Işık Üniversitesi/Fen Edebiyat Fakültesi/Fizik Bölümü
Ataköy Hasan Polatkan Süper Lisesi, Uğur Koleji
Mez. Yılı
2015
2009
2005
1999
Đş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın)
Görevi
Kurum
1. Araştırma görevlisi
Đstanbul Üniversitesi/ ĐTF / Biyofizik
2. Araştırma görevlisi
3.
Işık Üniversitesi / Fizik Bölümü
Yabancı
Dilleri
Đngilizce
Okuduğunu
Anlama*
iyi
Konuşma*
Yazma*
iyi
iyi
KPDS/ÜDS
Puanı
62,5
Süre (Yıl - Yıl)
2006-devam
etmekte
2005-2006
(Diğer)
Puanı
67,5
*Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin
LES Puanı
(Diğer)
Sayısal
65,8
Eşit Ağırlık
65,2
Puanı
Bilgisayar Bilgisi
Program
MS Office
C
Matlab
Zemax
Image J
Kullanma becerisi
iyi
iyi
iyi
iyi
iyi
Sözel
65,7
150
Uluslararası Yayın ve Bildiriler
1. Handan Akcakaya, Fulya Dal, Sabiha Tok, Suzan-Adin Cinar and Rustem
Nurten. K562 cells display different vulnerability to H2O2 induced oxidative stres
in differing cell cycle phases. Cell Biol Int 9999, 1-9, 2015.
2. Tok S, Zengin A, Nurten A, Nurten R. The Effect of Diphtheria Toxin on
Different Tissues of Guinea Pig and the Role of Antioxidants on this Effect. 2nd
International Biophysics Congress and Biotechnology at GAP & 21st National
Biophysics Congress Abstract Book, p.37, Diyarbakır (Turkey), 5-9 October,
2009.
Ulusal Bildiriler
1. Tok S., Çınar S., Nurten R. MCF-7 hücrelerinde Hidrojen Peroksidin Oksidatif
Etkisine Karşı β-Karotenin Antioksidan Etkisinin Belirlenmesi. 25.Ulusal
Biyofizik Kongresi, Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bildiri Özet
Kitabı, P-47, Trabzon, 24-27 Eylül, 2013.
2. Dal F., Akçakaya H., Tok S., Adın Çınar S., Nurten R. Oksidatif Stresin Hücre
Döngüsü Fazları Üzerindeki Etkileri. 25.Ulusal Biyofizik Kongresi, Karadeniz
Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bildiri Özet Kitabı, P-36, Trabzon, 24-27
Eylül, 2013.
3. Güven C., Tok S., Akçakaya H., Nurten R. NIH3T3 Fibroblast ve HUVEC
Hücrelerine Uygulanan Streptozotosin ve Leptin’in Aktin Flamentlerine Etkisi.
24.Ulusal Biyofizik Kongresi, Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Program ve
Bildiri Özetleri Kitabı, P-15, Đstanbul, 25-28 Eylül, 2012.
4. Fulya DAL, Handan AKÇAKAYA, Sabiha TOK, Suzan ADIN ÇINAR,
Rüstem NURTEN. Eşfazlı K562 hücrelerinin elde edilmesinde mimozin ve
genisteinin etkisi. 23.Ulusal Biyofizik Kongresi,Trakya Üniversitesi Tıp
Fakültesi, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, s-48, P-28, Edirne, 13-16 Eylül,
2011.
5. Tok S., Dal F., Akçakaya H., Adın-Çınar S., Nurten R. β-Karotenin K562
hücrelerindeki antioksidan etkisi. 22.Ulusal Biyofizik Kongresi, Adnan
Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, s-53, P-58, Aydın, 28 Eylül-1
Ekim, 2010.
6. Akçakaya H., Tok S., Dal F., Adın-Çınar S., Nurten R. K562 hücrelerinde
H2O2’nin oksidatif etkisinin belirlenmesi. 22.Ulusal Biyofizik Kongresi, Adnan
Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, s-30, P-15, Aydın, 28 Eylül-1
Ekim, 2010.
7. Tok S, Zengin A, Nurten A, Nurten R. Kobay Sinir-Kas Kavşağında Difteri
Toksini ve Antioksidanların Etkisi. 15th National Biomedical Engineering
Meeting
(BIYOMUT),
IEEE
XPLORE
Conference
Proceedings
DOI:10.1109/BIYOMUT2010.5479768, Antalya, 21-24 Nisan, 2010.
151
Sözlü Sunum
Tok S., Akçakaya H., Dal F., Adın-Çınar S., Nurten R. Antioksidan ve oksidan
etkileşimlerinin K562 hücrelerinde farklı ölüm süreçlerine etkisi. 23.Ulusal Biyofizik
Kongresi, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, s-15,
Edirne, 13-16 Eylül, 2011.
Ödüller
Poster bildirisi 1. lik ödülü. 25.Ulusal Biyofizik Kongresi, 2013.
Özel Đlgi Alanları (Hobileri): Yelken, sörf, kayak, buz pateni, müzik, go oynamak,
bisiklete binmek, balık tutmak, şiir okumak-yazmak.
Diğer Ödüller
•
Channel Regatta Rodos-Marmaris, 22-24 Haziran 2013 (2. lik ve 3. lük)
•
Su-Sail Match Race 2013 (2. lik)
Download