Untitled

advertisement
BAKIR OKSİT VE SİLİKON DİOKSİT
NANOPARTİKÜLLERİNİN ALLIUM CEPA’daki GENOTOKSİK
ETKİLERİ
Özlem ÇALBAY
YÜKSEK LİSANS
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
EKİM 2014
iv
BAKIR OKSİT VE SİLİKON DİOKSİT NANOPARTİKÜLLERİNİN ALLIUM
CEPA’daki GENOTOKSİK ETKİLERİ
(Yüksek Lisans Tezi)
Özlem ÇALBAY
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Ekim 2014
ÖZET
Bakır oksit nanopartikülleri (CuO NP) ve silikon dioksit nanopartikülleri (SiO2 NP)
nanoteknolojide birçok üründe yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır. Bu nedenle
hem üretim, hem kullanım ve hem de çevreye salınmaları her geçen gün artış
göstermektedir. Yapılan bazı çalışmalarda, nanopartiküllerin toksik ve özellikle genotoksik
etkileri olduğu belirtilmektedir. Bu çalışmanın amacı, indikatör bir organizma olan Allium
cepa kök ucu hücreleri kullanılarak CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin genotoksik etkilerini
incelemektir. Allium cepa kök uçları, CuO NP’lerinin 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik ve SiO2
NP’lerinin 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonları ile 24, 48 ve 72 saat muamele
edilmiştir. CuO nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve uygulama süreleri, Allium
cepa kök ucu hücrelerinde mitotik indekste kontrole kıyasla önemli düzeyde düşüşe sebep
olmuştur. Özellikle en yüksek konsantrasyonda, mitotik indeks en düşük seviyeye
ulaşmıştır. Bu nanopartiküller mitotik faz frekanslarında da değişikliklere sebep olmuştur.
SiO2 NP’leri de Allium cepa kök uçlarında mitotik indekste düşüşe sebep olmuş ancak bu
düşüş, kontrole kıyasla, 24 saatlik uygulamada sadece 50 ve 1000 µg/ml’de, 48 saatlik
uygulamada sadece 1000 µg/ml’de ve 72 saatlik uygulamada ise 50 µg/ml’de anlamlı
düzeydedir. CuO ve SiO2 NP’lerinin bütün konsantrasyonları her üç uygulama süresinde
de kontrole göre kromozom anormalliklerinde önemli düzeyde artışa sebep olmuştur.
Geçirmeli elektron mikroskobu analizleri, CuO ve SiO2 NP’lerinin hücre duvarına,
sitoplazmaya, çekirdeğe, mitokondriye ve diğer bazı organellere alınabildiklerini
göstermiştir. Bütün bu sonuçlar, CuO ve SiO2 NP’lerinin hücre içine, organellere ve
genetik materyale ulaşabildiklerini ve hücre bölünmesinde C-metafaz, yapısı bozulmuş
pro-, meta- ve ana-telofaz, kromozom kırığı, asenkron bölünme, multipolarlık, geri ve ileri
kromozomlar, yıldız anafaz, mikronukleus ve genetik materyal kaybı gibi anormalliklere
sebep olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, CuO ve SiO2 NP’lerinin
klastogenik/genotoksik ve sitotoksik ajanlar olabileceğini desteklemektedir. Bu bulgular
aynı zamanda Allium cepa sitogenetik testinin, bir çok tüketici ürününde kullanılan yeni
nanomateryallerin genotoksisite açısından değerlendirilmesinde kullanılabileceğini de
desteklemektedir.
Bilim Kodu
:
Anahtar Kelimeler :
Sayfa Adedi
Danışman
:
:
203.1.048
CuO nanopartikülleri, SiO2 nanopartikülleri, Allium cepa,
Genotoksisite, TEM
98
Prof.Dr. Fatma ÜNAL
v
GENOTOXIC EFFECTS OF COPPER OXIDE AND SILICON DIOXIDE
NANOPARTICLES IN ALLIUM CEPA
(M. Sc. Thesis)
Özlem ÇALBAY
GAZİ UNIVERSITY
GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
October 2014
ABSTRACT
Copper oxide nanoparticles (CuO NPs) and silicon dioxide nanoparticles (SiO2 NPs) are
widely used in many nanotechnological products. So production, usage and release of
these nanoparticles to the environment are increasing every day. It is reported in some
studies that nanoparticles have toxic, particularly genotoxic effects. This study aims to
investigate genotoxic impacts of CuO and SiO2 NPs using root tip cells of Allium cepa as
an indicator organism. Allium cepa root tips were treated with 25, 50, 75 ve 100 µg/ml
concentrations of CuO NPs and, 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml concentration of SiO2
nanoparticles for 24, 48 and 72 hours. All the concentrations and treatment periods of CuO
NP’s significantly decreased the mitotic index in Allium cepa root tip cells compared to the
control. Especially at the highest concentration, mitotic index reached its lowest level.
These nanoparticles induced changes in mitotic phase frequencies. SiO2 NPs also
decreased the mitotic index in Allium cepa root tips cells however this decrease was
significant at 50 ve 1000 µg/ml concentrations at 24 h, 1000 μg/ml concentration at 48 h
and, 50 μg/ml concentration at 72 h treatment, compared to the control. All of the
concentrations of CuO and SiO2 NPs increased the frequency of chromosome
abnormalities at all the concentrations and three treatment periods compared to the control.
Transmission electron microscopy analyses have shown that CuO and SiO2 NP’s can be
taken into the cell wall, cytoplasm, cell nucleus, mitochondria and some other organelles.
All of these results show that CuO and SiO2 NP’s can reach to the cell, organelles and
genetic material and, may impair stages of cell division causing C-metaphase, disturbed
pro-, meta- and ana-telophase, chromosomal breaks, asenkron division, multipolarity,
lagging and vagrant chromosomes, star anaphase, micronuclei and loss of genetic material.
These results indicated that CuO and SiO2 NPs can be clastogenic/genotoxic and cytotoxic
agents. This finding also suggest that Allium cepa cytogenetic test can be used fort he
genotoxicity monitoring of novel nanomaterials which are used in many consumer
products.
Science Code
Key Words
:
:
Page Number
Supervisor
:
:
203.1.048
CuO nanoparticles, SiO2 nanoparticles, Allium cepa, Genotoxicity,
TEM
98
Prof. Dr. Fatma ÜNAL
vi
TEŞEKKÜR
Lisansüstü eğitimimi tamamlarken bu günlere gelmemde büyük emeği olan, bana her türlü
konuda yardımını esirgemeyen, anlayış ve sabrıyla beni her zaman destekleyen Sayın
hocam Prof. Dr. Fatma ÜNAL’a saygı ve sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, her
konuda bilgi ve tecrübelerini esirgemeden paylaşan değerli hocam Prof. Dr. Deniz
YÜZBAŞIOĞLU’na, tez çalışmamın bir kısmında emeği geçen ve bana tecrübelerini
aktararak bir adım daha yol almamı sağlayan değerli hocam Prof. Dr. Zekiye
SULUDERE’ye, laboratuvar çalışmalarımda emekleri olan sevgili arkadaşlarım Uzman
Damla AMUTKAN ve Uzman Nurcan ÖZYURT’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Her
türlü sıkıntımda bana desteklerini esirgemeyen tüm Yüksek Lisans ve Doktora öğrencisi
sevgili arkadaşlarıma da sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca benden manevi
desteklerini esirgemeyerek her zaman yanımda olan Mehmet ÇELEPKOLU’ ve canım
kardeşim Özgür ÇALBAY’a çok teşekkür ederim.
vii
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET .............................................................................................................................
iv
ABSTRACT ....................................................................................................................
v
TEŞEKKÜR ....................................................................................................................
vi
İÇİNDEKİLER ..............................................................................................................
vii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ ............................................................................................
ix
ŞEKİLLERİN LİSTESİ ..................................................................................................
x
RESİMLERİN LİSTESİ .................................................................................................
xi
SİMGELER VE KISALTMALAR ................................................................................
xiv
1. GİRİŞ.......................................................................................................
1
2. GENEL BİLGİLER.................................................................................
5
2.1. Nanopartiküller ve Nanoteknoloji.......................................................................
5
2.2. Nanoteknolojinin Kullanım Alanları .................................................................
6
2.3. Nanopartiküllerin Biyosfer ile Etkileşimi ..........................................................
8
2.4. Nanopartiküllerin Bitkiler ile Etkileşimi ...........................................................
10
2.4.1. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine alımı ...........................................................
11
2.4.2. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine translokasyon ve birikimi............................
12
2.5. Nanopartiküllerin Toksisitesi .............................................................................
14
2.6. Nanopartiküllerin Genotoksisitesi .....................................................................
17
2.7. Genotoksisiteyi Değerlendirmede Kullanılan Testler .........................................
19
2.8. Bakır oksit ve Silika Nanopartikülleri ................................................................
23
3. MATERYAL METOT ...........................................................................................
29
3.1. Materyal .............................................................................................................
29
3.1.1. Bitki materyali ......................................................................................................
29
viii
Sayfa
3.1.2. Kullanılan test materyalleri ve diğer kimyasallar ....................................
29
3.2. Metot ...................................................................................................................
30
3.2.1. Test materyallerinin hazırlanması ............................................................
30
3.2.2. Test materyallerinin Allium cepa ya uygulanması ...................................
31
3.3. Preparatların hazırlanması ..................................................................................
32
3.3.1. Işık mikroskobu .........................................................................................
32
3.3.2. Elektron mikroskobu ................................................................................
33
4. ARAŞTIRMA BULGULARI ..............................................................................
35
4.1. CuO Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri ..........................................
35
4.2. SiO2 Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri ..........................................
50
5. SONUÇ VE ÖNERİLER .....................................................................................
65
KAYNAKLAR ..............................................................................................................
77
ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................
98
ix
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.1. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların
frekansı ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi ............................................
35
Çizelge 4.2. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa da kromozomal
anormallikler üzerine etkisi........................................................................
39
Çizelge 4.3. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların
frekansı ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi ............................................
51
Çizelge 4.4. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da kromozomal
anormallikler üzerine etkisi ........................................................................
54
x
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil
Sayfa
Şekil 2.1. Kategorilerine göre nanoteknolojik tüketici ürünleri ve oranları ..................
6
Şekil 2.2. Nanopartiküllerin bitkiye alım ve tranlokasyon yolları ..................................
11
Şekil 2.3. Mezofil, epidermis ve stomal hücrelerin şematik gösterimi ...........................
14
Şekil 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı
üzerine etkisi ..................................................................................................
37
Şekil 4.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı
üzerine etkisi...................................................................................................
52
xi
RESİMLERİN LİSTESİ
Resim
Sayfa
Resim 3.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması ................................
31
Resim 3.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması ................................
32
Resim 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da profazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal profaz, B: Yapısı bozulmuş profaz, C: Genetik
materyal kaybı, D: Yapışıklık .......................................................................
40
Resim 4.2. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal metafaz, B-C: Metafazda kromozom
gruplaşmaları, D: Yapısı bozulmuş metafaz .................................................
40
Resim 4.3. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anafaz-telofazda
meydana getirdiği anormallikler. A: Normal telofaz , B: Yapısı bozulmuş
anafaz, C:Geri kalmış kromozom, D: Multipolarite .....................................
41
Resim 4.4. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Binükleat, B: Tomurcuklanma, C: Halter şekilli
çekirdek, D: Mikroçekirdek ..........................................................................
43
Resim 4.5. Kontrol grubundaki Allium cepa kök uçları. A: Genel görünüm, B: Bir
hücrenin görüntüsü........................................................................................
44
Resim 4.6. A: Allium cepa’da hücre duvarlarınnda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,
24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ..............................................................
45
Resim 4.7. A: Allium cepa’da plazmodezmalalarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,
24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ..............................................................
45
Resim 4.8. Allium cepa’da mitokondri (M), golgi cisimciği (G), endoplazmik
retikulum (ER) ve diğer yapılardaki (X) CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,
24 saat) ..........................................................................................................
46
Resim 4.9. A: Allium cepa’da çekirdeğin heterokromatin bölgesinde CuO
nanopartikülleri (100 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ................
46
Resim 4.10. A: Allium cepa’da kofullarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,72 saat).
B: A’nın büyütülmüş hali...........................................................................
47
Resim 4.11. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,
48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ............................................................
47
Resim 4.12. A: Allium cepa’da mitokondrilerde CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,
72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ..................................................................
48
xii
Resim
Sayfa
Resim 4.13. A: Allium cepa’da mitokondri (M), endoplazmik retikulum (ER) ve
sitoplazmada CuO nanopartikülleri (25µg/ml, 24 saat). B: A’nın
büyütülmüş hali ..........................................................................................
48
Resim 4.14. A: Alium cepa’da CuO nanopartiküllerinin hücre membranında
oluşturduğu hasar (100 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ..........
49
Resim 4.15. A: Allium cepa’da hücre duvarlarında CuO nanopartikülleri
(100 µg/ml, 24 saat,). B: A’nın büyütülmüş hali .......................................
49
Resim 4.16. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da profazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal profaz, B: Genetik materyal kaybı, C: Yapısı
bozulmuş profaz, D: Yapışıklık .................................................................
55
Resim 4.17. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal metafaz, B: Yapısı bozulmuş metafaz, C:
Kromozom gruplaşması, D: C-Metafaz .....................................................
55
Resim 4.18. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana
getirdiği anormallikler. A-B: Normal anafaz, C: Normal telofaz, D: Yapısı
bozulmuş anafaz......................................................................................... 56
Resim 4.19. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Binükleat, B-C: Tomurcuklanma, D: Mikroçekirdek ...
58
Resim 4.20. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılardaki SiO2 nanopartikülleri
(250 µg/ml, 24 saat). B:A’nın büyütülmüş hali .........................................
59
Resim 4.21. Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml,
24 saat) .......................................................................................................
59
Resim 4.22. Allium cepa’da farklı bir hücre çekirdeğinde SiO2 nanopartikülleri
(50 µg/ml, 24 saat) .....................................................................................
60
Resim 4.23. A: Allium cepa’da hücre duvarında biriken SiO2 nanopartikülleri
(250 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ........................................
60
Resim 4.24. Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri
(250 µg/ml, 24 saat) ...................................................................................
61
Resim 4.25. A: Allium cepa’da hücre dışında SiO2 nanopartiküllerinin
yoğunlaşması (500 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .................
61
Resim 4.26. A: Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri
(1000 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ......................................
62
xiii
Resim
Sayfa
Resim 4.27. A: Allium cepa’da plazmodezmada SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml,
72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ...........................................................
62
Resim 4.28. A: Allium cepa’da sitoplazma, golgi cisimciği (G) ve
mitokondride (M) SiO2 nanopartikülleri (500 µg/ml, 48 saat). B: A’nın
büyütülmüş hali ..........................................................................................
63
Resim 4.29. A: Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri
(1000 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ......................................
63
xiv
SİMGELER VE KISALTMALAR
Bu çalışmada kullanılmış simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda
sunulmuştur.
Simgeler
Açıklamalar
%
Yüzde
µl
Mikrolitre
C
Santigrat derece
g/ml
Mikrogram/ Mililitre
M
Mikromolar
m
Mikrometre
mA
Miliamper
mg
Miligram
mL
Mililitre
mM
Milimolar
M
Molar
N
Normal
nm
Nanometre
rpm
Devir sayısı
V
Volt
Kısaltmalar
Açıklamalar
Ag
Gümüş
Au
Altın
Al
Alüminyum
Al2O3
Alüminyum oksit
A549
Akciğer kanser hücre hattı
CAT
Katalaz
CEN
Avrupa Standardizasyon Komitesi
xv
Kısaltmalar
Açıklamalar
CNT
Karbon Nanotüpleri
Cu
Bakır
CuO
Bakır oksit
C60
Fulleren
FAO
Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü
Fe2O3
Demir oksit
Fe2O4
Manyetit
DNA
Deoksiribonükleikasit
HaCaT
Keratinosit hücre hattı
H2O2
Hidrojen Peroksit
KA
Kromozomal anormallik
L-132
İnsan akciğer hücre hattı
MDA
Malondialdehit
MgO
Magnezyum oksit
Mİ
Mitotik indeks
NA
Nükleer anormallik
MN
Mikroçekirdek
MWCNT
Çok katmanlı karbon nanotüpleri
NaYbEr4
Sodyum boro hidrid
OH
Hidroksil
OHdG
Hidroksi-deoksiguanozin
OsO4
Ozmiyum tetroksit
POD
Fosfolipid hidroperoksit glutatyon
RAW 264.7
Makrofaj hücre hattı
ROT
Reaktif oksijen türleri
SiO2
Silikon dioksit
SOD
Süperoksit dismutaz
SWCNT
Tek katmanlı karbon nanotüpleri
TEM
Taramalı elektron mikroskobu
TiO2
Titanyum dioksit
Ye2O3
İtriyum oksit
xvi
Kısaltmalar
Açıklamalar
Zn
Çinko
ZnO
Çinko oksit
WHO
Dünya Sağlık Örgütü
1
1. GİRİŞ
Nanoteknoloji, nanometre (metrenin milyarda biri) boyutundaki partiküllerle çalışan
multidisipliner bir bilim dalıdır. En azından bir ebatları 100 nm’nin altında olan
nanomateryaller (NM) (nanopartiküller-NP), çok küçük ebatlarından dolayı bir çok yeni
fiziksel ve kimyasal özellikler kazanırlar. Bu özelliklerinden dolayı NP’ler günümüzde her
geçen gün sayıları artan çok farklı alanlarda kullanılmaya başlanmıştır. NP’ler elektronik,
enerji, havacılık, uzay çalışmaları, savunma sanayii, biyoteknoloji, kozmetik, eczacılık, tıp
ve gıda endüstrisi gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Ayrıca otomotiv sanayiinde, inşaat
sektöründe, cam ve seramik sanayiinde, boya ve plastik sanayiilerinde, tekstilde ve tarımda
da bir çok amaçlar için kullanılmaktadır.
İnsanlar nanopartiküllere hem kullanım, hem üretim ve hem de atık oluşumu sonucu
doğaya salınmaları nedeniyle bilerek ya da bilmeden maruz kalmaktadır. Sadece insanlar
değil, yeryüzünde neredeyse her canlı türü bu nano yapılara maruz kalmakta veya ileride
maruz kalacak görünmektedir. Daha büyük ebatlı formlarına kıyasla nanopartiküllerin
sahip olduğu biyolojik aktiviteler, bu materyallerin toksik etkilerinde, özellikle genetik
materyalde oluşturdukları toksisitede artışlar oluşturabileceğini göstermektedir. Bütün
bunlardan dolayı, nanotoksikoloji ve nanogenotoksikoloji, nanomateryallerin potansiyel
risklerini ve bu riskin olası mekanizmalarını inceleyen yeni bir bilim dalı olarak gelişmeye
ve genişlemeye başlamıştır. NP’lerin etkilerinin değerlendirildiği bazı çalışmalar bunların
genotoksik riskler oluşturmadığını gösterirken, mikroorganizmalarda, çeşitli sucul türlerde,
bitkilerde, çeşitli insan primer hücrelerinde ve hücre hatlarında, çeşitli hayvanlarda primer
hücrelerde ve hücre hatlarında toksik ve genotoksik etkili olduklarını göstermektedir.
Nanomateryallerden özellikle metal oksit nanopartikülleri yarı iletken, optik, piezoelektrik
ve ultraviyoleden koruyucu özellikleri nedeniyle büyük ilgi uyandırmakta ve çok geniş
kullanım alanı bulmaktadır. Bakır oksit (CuO) ve silikon dioksit (SiO2) gibi metal oksit
nanopartikülleri, en fazla üretilen ve kullanılan nanomateryaller arasındadır. Bu
nanopartiküller, sensörler, plastik, toner, boya, vernik, yapıştırıcı ve kurutucularda, diş
macunu ve diğer kişisel bakım ürünlerinde, kataliz, arıtma, gıda paketlemesi, gıda
filtrasyonu, gıda katkı maddeleri, ilaç yapımı, fotodermal terapi ve çevresel iyileştirme gibi
daha pek çok uygulamada geniş kullanım alanına sahiptir. Ancak yapılan bazı çalışmalarda
2
bu metal oksitlerin toksik ve genotoksik riskler oluşturduğu belirlenmiştir. CuO
nanopartiküllerinin farede böbrek, karaciğer ve dalak için toksik olduğu gözlenmiştir.
Reaktif oksijen türlerinin artışına ve sonuçta DNA hasarına sebep olduğu belirlenmiştir.
SiO2 yüksek toksisiteye sahip olup, akciğer kanseri etkenidir. Silikanın insan lenfoblast
hücrelerinde
genotoksik
ve
sitotoksik
etkiler
oluşturduğu
rapor
edilmiştir.
Nanopartiküllerin çeşitli mekanizmalar ile hücre duvarına, hücre içine ve hatta çekirdek,
mitokondri ve kloroplast gibi bir çok organele girebildiği ve lokalize olduğu gözlenmiştir.
Geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile, nanopartiküllerin insan akciğer epitel
hücrelerine ve lizozom, çekirdek ve mitokondri dahil çeşitli organellere girdiği
gözlenmiştir. Bazı nanopartiküllerinin Allium cepa ve diğer bazı bitki türlerinde kök ucu
hücrelerinde mitotik indekste azalma veya artışlara sebep olduğu, yapışık kromozom,
anafaz-telofaz köprüleri, düzensiz anafaz-telofaz hücreleri, fragment, geri kalmış ve kalgın
kromozomlar, mikronukleuslar gibi anormalliklere sebep oldukları rapor edilmiştir.
Fagositozdan
kaçabilecek
kadar
küçük
olmaları
nedeniyle
hücrede
depolanan
nanopartiküller ya bölünmede görev yapan mekanizmaları etkileyerek veya bölünme
sırasında serbest kalan genetik materyal ile direkt etkileşime girerek, bölünme işleminde
veya DNA’da hasarlar oluşturmaktadır. Diğer taraftan NP’lerin kendileri veya serbest
kalan iyonları da hücrelerde reaktif oksijen türlerinin oluşumunu indükler ve böylece
oksidatif strese bağlı inflamasyona sebep olmaktadır. Ayrıca oksidatif stres lipid
peroksidasyonunu indüklemektedir. Bütün bu olaylar, hem mitokondride ve hem de
çekirdekteki genetik materyalde sekonder bir mekanizma ile hasarlar oluşturmaktadır. Bu
hasarlar onarılamadığında çeşitli hastalıkların oluşmasına sebep olduğu gibi, programsız ve
kontrolsüz bir şekilde bölünen hücrelerden kaynaklanan ve günümüzde ikinci derecede
ölüm sebebi olan kanserlerin oluşmasını da tetiklemektedir.
Bu tez çalışmasının amacı, daha önce farklı test sitemlerinde genotoksik risk taşıyabileceği
belirlenmiş olan CuO NP’leri ve SiO2 NP’lerinin genotoksik etkilerini Allium cepa kök
ucu hücrelerinde, mitotik indeks, mitotik faz frekansları ve mitoz bölünme sırasında oluşan
anormallikler
açısından
incelemektir.
Bu
incelemeler
ışık
mikroskobu
ile
gerçekleştirilmiştir Bu çalışmanın bir başka amacı da, geçirimli elektron mikroskobu
kullanılarak bu nanopartiküllerin hücreyle etkileşimlerini incelemek, nanopartiküllerin kök
uçlarındaki hücrelere, hücre duvarına, çekirdeğe, hücresel organellere ve yapılara alınıp
alınmadığını belirlemek ve olası etkilerini incelemektir. Allium cepa, kromozomlarının
3
büyük ve az sayıda olması nedeniyle uygun bir organizmadır. Allium testi,
nanopartiküllerin ve diğer ekzojen kimyasalların risklerinin değerlendirilmesinde
kullanılan ve yüksek hassasiyet gösteren genotoksisite testlerinden biridir. Bu test ucuz,
kolay, hızlı sonuç vermesi, hem mitotik indekste ve hem de kromozomlarda meydana
gelen anormalliklerin aynı anda belirlenmesine imkan vermesi nedeni ile çok kullanılan bir
test sistemidir. Uygulamalar in vivo yapıldığı için, canlı sistemdeki etkilerin gözlenmesi
açısından daha güvenilir sonuçlar vermektedir. Ökaryotik bir organizma olması ve bazı
enzim sistemlerinin memelilerde de bulunması nedeniyle insandakine oldukça yakın
bilgiler sağlamaktadır. En önemlisi de doğadaki atıkların toprak ve su yoluyla bitkiler
tarafından alındığını ve bitkilerin de insan için vazgeçilmez besin maddesi olduğunu
düşündüğümüzde, Allium cepa bu çalışma için en ideal organizma olması nedeni ile tercih
edilmiştir.
4
5
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Nanopartiküller ve Nanoteknoloji
‘Nano’ teknik bir ölçü birimi olarak kullanılır ve herhangi bir birimin milyarda biri
anlamını ifade eder. Nanopartikül ise en az bir boyutu 100 nanometre (nm)'nin altında olan
malzemelerdir (Hoyt ve Mason, 2008).
Nanopartiküller orijinlerine göre 3 ana gruba ayrılmaktadır. Bunlardan birincisi maden
kaynaklı, erozyon kaynaklı ve volkanik patlamalar gibi doğal süreçlerlerle oluşan doğal
nanopartiküller, ikincisi egzos gazları ve kömür yanması gibi insan faaliyetleri sonucu
oluşan raslantısal veya antropojenik nanopartiküller, üçüncüsü ise endüstriyel amaçlı
tasarlanmış nanopartiküllerdir (Monica ve Cremonini, 2009). Endüstriyel nanopartiküller
temel olarak 4 grupta toplanabilir.
Karbon bazlı materyaller; tek katmanlı (SWCNT) ve çok katmanlı (MWCNT)
karbon nanotüpleri ile fullerenleri kapsar,
Metal bazlı materyaller; kuantum noktaları, nano altın (Au), nano çinko (Zn), nano
aliminyum (Al) gibi metal esaslı malzemeler ile nano ölçekli silikon dioksit/silika (SiO2),
bakır oksit (CuO) ve alüminyum oksit (Al2O3) gibi metal oksitleri kapsar,
Dendrimerler; dallanmış birimlerden yapılmış nano-boyutlu polimerlerdir, spesifik
bir kimyasal fonksiyon için uygun hale dönüşme yeteneğindedir,
Kompozitler; diğer nanopartiküllerle veya daha büyük kütleli materyallerle
birleştirilmiş nanopartiküllerdir. Küre, tüp, çubuk ve prizma gibi farklı morfojiler de
sergilerler (Lin ve Xing, 2007).
Nanoteknoloji, endüstriyel nanopartiküllerle, mühendislik manüpülasyon ve uygulama
tekniklerini kullanarak, tasarım, üretim, işleme ve yeniden düzenleme yoluyla, kullanışlı
materyal, araç ve sistem oluşturma sanatı ve bilimidir (Colvin, 2003). Nanoteknolojide
malzemenin geleneksel formülasyonundaki katalitik, manyetik, optik ve mekanik
özellikleri geliştirilir ve eşsiz özellikli yeni malzemeler üretilir. Bu üretimlerin artmasıyla,
nanoteknoloji hızlı bir şekilde büyüyerek pek çok alanda kullanım yolu açılmıştır (Arora,
Rajwade ve Paknikar, 2012).
6
2.2. Nanoteknolojinin Kullanım Alanları
Nanoteknolojik üretimler çok kısa bir süre içinde artarak 2005 yılında 54 olan ürün
envanteri, 2013 yılında 1628 adete yükselmiştir. En büyük alan 788 ürünün bulunduğu
kozmetik, giyim, spor ürünleri, güneş koruyucuları ve medikal uygulamaları içeren, sağlık
ve kişisel bakım kategorisidir (Şekil 2.1).
5%
Sağlık ve Kişisel Bakım
4% 3% 2%
Ev ve Bahçe Ürünleri
13%
Otomotiv
50%
Gıda Ürünleri
9%
Çok Fonkiyonlu Ürünler
Elektronik
14%
Cihazlar
Çocuk Ürünleri
Şekil 2.1. Kategorilerine göre nanoteknolojik tüketici ürünleri ve oranları (Woodrow
Wilson veritabanı, 2014)
Üretilen nano boyutlu malzemelerde belirtilen içerikler dikkate alındığında, en çok
kullanılan malzeme 383 değişik uygulama alanı olan gümüştür (Ag). Nano gümüşten sonra
sırasıyla titanyum dioksit (TiO2)'i de içeren titanyum (179), fullerenleri de içeren karbon
(87), silika (52), çinko oksiti (ZnO) de içeren çinko (Zn) (36) ve altın (Au) (19)’dır
(Woodrow Wilson veritabanı, 2014).
Nanopartiküller günlük hayatımızda oldukça değişik alanlarda kullanım alanı bulmaktadır.
Örneğin nano alüminyum oksit (AlO) şampuan ve deterjanlarda, nanoyapılı titanyum
oksitler pencere camları ve seramik fayanslarında, nano titanyum dioksit ve nano çinko
oksit kozmetik ve güneş koruyucularında, nano titanyum kağıt, boya, mürekkep, diş
macunlarında, nano demir oksit rujlarda ve nano kalsiyum fosfat kristalleri tıbbi
implantlarda kullanılmaktadır (Kiss ve diğerleri, 2008; Remedios, Rosario, ve Bastos,
2012).
7
Nanomateryaller, insan sağlığında magnetik rezonans görüntüleme ve terapötik ilaç
iletiminde de kullanılmaktadır (Leary, Liu ve Apuzzo, 2006; Wu, Wang, Sun ve Xue,
2011). Nano boyutlarından dolayı tümörlü damarları kolayca geçip tümörlü dokulara
ulaşabilirler. Bu amaçla kullanılan nano altın eşsiz optik ve fototermal özellikleri sebebiyle
hem algılama sistemlerinde ve hem de fototermal terapide çokça kullanılmaktadır. Demir
oksit ve magnetit gibi manyetik nanopartiküller, silika tabanlı SiO2 ve mezoporus silika,
kuantum noktacıkları, tek katmanlı ve çok katmanlı karbon nanotüpleri ve bazı
kompozitler de sıkça kullanılan diğer nano yapılı malzemelerdir (Wang, Chuang ve Ho,
2012).
Gıda ve tarımda, nanoteknoloji kullanılarak besinlerde nano iletim sistemleri, nano boyutlu
organik ve inorganik gıda katkı maddeleri, gıda yüzeylerinde nano kaplamalar ve nano
filtrasyon gibi üretimler yapılmaktadır. Gıdalarda kullanılan nano objelerden, nano gümüş
antimikrobiyal ajan olarak kullanılır. Silikanın geleneksel formu hali hazırda gıda katkı
maddesi olarak kullanılmaktadır (SiO2 INS 551). Nano mezoporus silika, nano filtrasyonda
(yiyecek ve içeceklerdeki, örneğin acı tat veren bazı bitki ekstraktları gibi istenmeyen
bileşiklerin temizlenmesinde), amorf yapılı SiO2 toz çorbalardaki akışkanlışı sağlamada,
bira ve şarap temizlenmesinde kullanılır. Nano kaplama yapmak amacıyla 50 nm veya
daha küçük boyutlu TiO2, SiO2 ve MgO (Magnezyum oksit) ile birlikte madde yüzeyinde
ince amorf bir film oluşturularak sürekli bir işlemde kullanılması sağlanır. Nano selenyum
yeşil çaylarda katkı madesi olarak kullanılır. Böylece etkili bir antioksidan olan
selenyumun vücuda alımı güçlendirilir. Nano kalsiyum sakızların içinde kullanılır. Nano
kalsiyum, nano magnezyum ve nano demir sağlık takviyesi olarak da üretilmekte ve
kullanılmaktadır (FAO/WHO, 2010).
Tarımda, nano iletim araçları ile, uygulanan kimyasal miktarı azaltılırken etkinliği
artırılmaktadır (Johnston, 2010). Ayrıca ekinin büyüme ve tarla koşulları gerçek zamanlı
izlenebilir ve bu bilgiler göz önüne alınarak dikim, hasat ve gübreleme işlemleri yapılabilir
(Scott ve Chen, 2013). Nano iletim araçları, bitki hücresi ve organelleri ile hastalık yapıcı
patojen arasında, fiziksel, kimyasal ve biyolojik etkileşimin anlaşılmasını ve böylece bu
patojenlere karşı önlem alınabilmesini sağlar (Cursino ve diğerleri, 2009; Zaini, De La
Fuente, Hoch ve Burr, 2009). Bitkileri tuzluluk, kuraklık gibi çevresel streslere dayanıklı
hale getirmek amacıyla kalsiyum fosfat, karbon nanotüpleri, mezoporus silika, magnetit,
8
altın, stronsiyum fosfat, magnezyum fosfat ve mangan fosfat gibi nano boyutlu malzemeler
ile daha etkili gen aktarımı yapılmaktadır (Rai, Deshmukh ve Gade, 2012).
Nano yapılı malzemeler çevresel sorunların giderilmesinde de kullanılmaktadır (Tratnyek
ve Johnson, 2006; Johnston, 2010). Nanopartiküller daha az yoğun ve daha uygun
maliyetli olduklarından hem kimyasal hem de biyolojik kontaminantların temizlenmesinde
kullanılmaktadır (Tratnyek ve Johnson, 2006). Örnek olarak, suda bulunan bakırın ultra
filtrasyonu (Diallo, Christie, Swaminathan, Johnson ve Goddard, 2005), kurşunun
topraktan uzaklaştırılması ile toprağın yıkanması ve iyileştirilmesi (Farmen, 2009; Xu ve
Zhao, 2006), sudaki asitliğe göre anyon ve katyon bağlayabilen dendrimerler (Diallo,
2009), fotokatalizör olan nano TiO2 (FAO/WHO, 2010), farklı yüzeylere kolay adapte
olabilen nano gümüş (Liu, Xie ve Cui, 2012) kullanılarak yeraltı ve bazı yer üstü
sularındaki mikrobiyal patojenlerin öldürülmesini verebiliriz (Quinn ve diğerleri, 2005).
Karbon nanotüp membranlar ve ince film nanokompozitli membranlar gibi nano yapılarla,
daha düşük enerjili ve etkili sistemler oluşturulur ve deniz suyunun tuzdan arındırılması
sağlanır (Hoek ve Ghosh, 2009).
Son yıllarda yapılan çalışmalar ile bitki ve ağaçlardan nano ölçekli selülozik materyallerin
elde edilebileceği gösterilmiştir. Bu sayede selülozik nano kristaller, nano kompozit olarak
polimerik matris içinde kullanılarak, ambalajlama, inşaat ve ulaşım araçlarının gövde
yapılarında uygulanır (Laborie, 2009). Lignoselülozik nano kılsı yapıların geliştirilmesiyle,
otomotiv parçaları dahil olmak üzere birçok uygulamada, fiber cam ve plastik yerine
biyokompozitler kullanılmaktadır (Hodur, ve Leistritz, 2007).
2.3. Nanopartiküllerin Biyosfer ile Etkileşimi
Nanoteknolojinin bu kadar gelişmesi ve kullanımı nedeniyle endüstriyel nanopartiküller
önemli
miktarlarda
üretilmektedir.
Bu
nanopartiküller
her
ne
kadar
düşük
konsantrasyonlarda kullanılsa da kullanım alanlarının artmasıyla çevreye salınan
nanopartikül konsantrasyonu da giderek artmaktadır. Çevre, dünya yüzeyinde yaşayan
canlılar ile yaşam için gerekli olan hava, su ve topraktan oluşan bir sistemdir (Şahin,
2009).
9
Atmosfer içinde bulunan nanopartiküllerin atmosferde kalma süreleri kısadır fakat birikme
modunda olan partiküllere bağlanabilir ve daha uzun süre kalabilirler (Biswas, ve Wu,
2005). Atmosferde bulunan bu nanopartiküller sıcaklığa, karbon partiküllerinin
konsantrasyonuna veya kalış süresine bağlı olarak fotokimyasal süreçlerden geçerek ikincil
nanopartikül oluşumunu sağlar (Morawska, Ristovski, Jayaratne, Keogh ve Ling, 2008).
Bunun sonucu atmosferde bulunan nanopartikül yoğunluğunun iyice artmasıyla
koagülasyon ve buhar yoğunlaşması artarak iklim değişiklikleri, kirlilik ve atmosferik
optik etkiler oluşur (Nowack ve Bucheli, 2007).
Nanoteknolojik sanayi ürünleri ve atıklarının su yollarına karışmasıyla sulardaki
nanopartikül kontaminasyonu hızla artar. Bu nanopartiküller sudaki kolloidlerle birleşme
eğilimindedir. Kolloidler, 1 nm ile 1 μm aralığındaki organik ve inorganik maddeleri
içeren makromoleküllerdir (Klaine ve diğerleri, 2008; Nowack ve Bucheli, 2007). Metal
nanopartiküller ile kolloidler birleşme eğilimi gösterir. Aslında bu oluşumun su üzerinde
pozitif ekileri de vardır. Suyun arıtılması bu yolla yapılır. Bununla beraber kolloidlerin
nanopartiküllerle etkileşimi nanopartikül davranışlarını da etkiler. Bu etkileşim özellikle
sucul canlılar üzerinde oluşabilecek etkilerin tahmin edilmesini daha da zorlaştırır (Auffan,
Bottero, Chaneac ve Rose, 2010).
Okyanuslarda derinlik, sıcaklık gibi fizikokimyasal özellikler değişeceğinden kolloid
kimyası ve dolayısı ile nanopartiküllerle birleşme davranışı da değişir. Ayrıca tatlı sularla
birleşmiş nanopartiküllerin okyanusa karışmasıyla, okyanuslarda bu nanopartiküller ya
okyanus tabanına batmakta ya da soğuk ve sıcak su arasında bir arayüz oluşturmaktadır.
Bu arayüz, bu tabakadan beslenen pelajik türler açısından bir tehlike oluştururken, okyanus
tabanında sedimenlerde birikmesi ise bentik türleri etkileyebilir. Okyanus yüzeyinde
biriken nanopartiküller ise deniz kuşları, memeliler ve yüzey alanda yaşayan canlıları
etkileyebilir (Kennedy, Scott, ve Ferris, 2004; Simkiss, 1990). Oberdörster ve arkadaşları,
C60 nanopartiküllerine maruz kalmış canlı türlerinden tatlı su kabuklusu Daphnia magna,
deniz kopepodu Hyalella azteca, Pimephales promelas ve Oryzias latipes balıklarında
toksik etki rapor etmişlerdir (Oberdörster, Zhu, Blickley, McClellan-Green ve Haasch,
2006).
Arıtma tesislerinden, asmosferde birikme yoluyla veya atıkların geri dönüşümüyle
doğrudan veya dolaylı olarak serbest kalan nanopartiküllerin en son durakları toprak ve
10
sedimenlerdir. Bu nedenle toprak maruziyeti çevresel risklerin tahmin edilmesinde çok
önemli bir sistemdir (Unrine ve diğerleri, 2010). Biyojeokimyasal olaylarda önemli rol
oynayan killer, demir oksitler ve diğer mineraller nanopartikül içermektedir. Bu nedenle
endüstriyel üretilmiş nanopartiküller ekosistemdeki doğal nanopartikülleri değiştirebilir ve
böylece toprak gelişmesini ve davranışlarını (dağılma gibi) etkileyebilir (Cameron, 1915;
Klaine ve diğerleri, 2008).
Nanopartiküllerin topraktaki olası etkileri, hayatını toprağa bağlı olarak sürdüren bütün
canlılara etki etmektedir. Au nanopartiküllerine maruz kalmış Eisenia fetida toprak
solucanlarında nanopartiküllerin vücut yüzeylerinden emildiği, biyodağılımın dokular
aracılığıyla gerçekleştiği ve sonuçta üremelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalış
olduğu belirlenmiştir (Unrine ve diğerleri, 2010). Nanopartiküller antimikrobiyal ajan
olarak patojenik bakterilere karşı kullanılmaktadır. Fakat bu kullanım bitki büyümesini
teşvik eden, yaşam döngülerinde rol alan ve kirleticilerin bozulmasını sağlayan topraktaki
yararlı mikroorganizmalarda olumsuz etkilere yol açmaktadır. Nano yapılardan gümüş,
CuO ve ZnO partiküllerinin hem Escherichia coli ve Staphylococcus aureus gibi patojenik
türlerde hem de köklerde kolonize olan ve biyo iyileştirme etkisi olan Pseudomonas putida
gibi yararlı mikroorganizmalar üzerinde toksik etkili oldukları belirlenmiştir (Molina,
Ramos ve Espinosa-Urgel, 2006; Ramos-Gonzalez, Campos ve Ramos, 2005).
Nanopartiküllerin karakteristik özelliklerinin karasal ekosistemlerde ne tür etkileşimlere
sebep olabileceği ve olası etkilerinin ne olabileceğini tahmin etmek zordur. Bitkilere
girebilen nanopartiküllerin insanlara ulaşması endişe uyandıran önemli bir durumdur
(Unrine ve diğerleri, 2010).
2.4. Nanopartiküllerin Bitkiler ile Etkileşimi
Bitkiler, biyosfer ve canlılar arasındaki geçişi sağlayan çok önemli ara birimlerdir. Bitkiler
su, toprak ve atmosferik çevre elemanlarıyla doğrudan etkileşim halinde olup bu
etkileşimler nanopartiküllerin yayılmasında farklı yollar oluşturabilmektedir (Miralles,
Church ve Harris, 2012).
11
2.4.1. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine alımı
Nanopartiküller bitki yüzeylerine tutunur ve doğal nano veya mikro ölçekli açıklıklardan
bitki içine alınırlar (Dietz ve Herth 2011). Nanopartiküller hem sürgünler hem de kökler
aracılığıyla bitkiye giriş yapabilirler (Zhu, Han, Xiao ve Jin 2008). Nanopartiküllerin bitki
içine alımında tahmin edilen yollar Şekil.2.2’de gösterilmiştir.
Şekil 2.2. Nanopartiküllerin bitkiye alım ve tranlokasyon yolları. Kalın çizgiler önemli
olduğu düşünülen alım yollarını, kırık çizgiler ise düşük oranlı alım yollarını
gösterir (Dietz ve Herth 2011)
Sürgün yüzeyleri mumsu kutikula ile kaplı olduğundan lipofiliktir (Barthlott ve Neinhuis,
1997), bu nedenle çok küçük ve lipofilik nanopartiküller doğrudan kutikulanın apolar sıvı
alanlarına katılır. Büyük nanopartiküllerin penetrasyonları hidatod, çiçeklerdeki stigmalar
ve stomalar gibi kutikuladan bağımsız alanlardan gerçekleşir (Dietz ve Herth 2011).
Trikomlar sürgün yüzeylerde bulunan epidermal çıkıntılar olup (Glover, 2000),
nanopartikül alımını artıran yapılar olduğu düşünülmektedir (Dietz ve Herth 2011).
Nanopartiküllerin epidermal hücrelerdeki kutikula, trikom veya stomalardaki geçirgenliği
birbirinden farklıdır (Schreiber, 2010).
Kök uçlarından nanopartikül alımının sürgünlerden daha etkili olabileceği bildirilmiştir
(Zhu ve diğerleri, 2008). Kök ve yumru gibi yer altı organları arayüz olarak süberin
tabakalar geliştirir (Schreiber, 2010). Süberin, hücre duvarı iç yüzeyinde bulunan tek veya
çok katmanlı bir depolama tabakasıdır. Çoğunlukla birincil köklerde süberinli
12
ekzodermisin yanında süberinli endodermis de gelişir. Ekzodermis, eriyiklerin ve suyun
topraktan merkezi silindire apoplastik geçişini önler (Steudle ve Peterson, 1998). Ancak
bazal kök bölgesinde yan kökler gelişir, oluşan bu yan kökler rizodermis korteksini deler
ve apoplastik geçiş mümkün olur. Böylece nanopartiküller bu alanlardan ksilemler ile
korteks ve merkezi silindire geçebilir (Faiyue, Al-Azzawi ve Flowers, 2010).
Nanopartiküllerin bitki içine alımı otçullardan kaynaklanan veya mekanik hasarlar sonucu
oluşan yaralardan da olabilir. Bakteriler için de bir giriş yolu olan bu yol (James ve
Olivares, 1998), partikül alımı için de oldukça elverişli bir yoldur (Dietz ve Herth 2011).
Nanopartiküllerin alımları, nanopartikül çeşidine bağlı olduğu gibi, bitki türüne göre de
farklılık gösterir (Lin ve diğerleri, 2009).
2.4.2. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine translokasyon ve birikimi
Bitkilere özgü olan hücre duvarının sınırlayıcı etkisine rağmen, bazı bitkilerde
nanopartiküllerin transloke olabildikleri ve bir süre sonra uzak bölgelere kadar
taşınabildikleri belirlenmiştir. Çim köklerine, ZnO nanopartiküllerinin (20 nm çaplı)
sudaki 8-1000 mg/L aralığındaki değişik konsantrasyonları uygulandığında, en yüksek
konsantrasyonda, bazı ZnO partiküllerinin endodermis ve stelar hücrelerine yerleşebildiği,
kökte ciddi hasara ve hücrelerin çökmesine sebep olduğu görülmüştür (Lin ve Xing, 2008).
Lüminesanslardan sodyum boro hidrid (NaYbEr4) (45 nm çaplı) nanopartikülleri %1
oranında olacak şekilde sulamayla toprak içindeki Arabidopsis thaliana ya verilmiştir. Bu
nanopartiküllerin yaprak ve çiçek sapında bulunduğu ve 6 günün sonunda merkezi silindire
kadar ulaşabildiği belirlenmiştir (Hischemöller, Nordmann, Ptacek, Mummenhoff ve
Haase, 2009).
Hücre duvarı, su molekülleri ve diğer eriyiklerin köke alınabilmesi için gözenekleri olan
polisakkarit yapılı fiber matristir. Por boyutları genel olarak 3-8 nm aralığındadır ve bu
aralık birçok endüstriyel nanopartikülden çok daha küçük bir boyuttur (Carpita ve Gibeaut,
1993). Navarro ve arkadaşlarının hipotezine göre, doğal elek olan hücre duvarı kalınlığı
yaklaşık 5-20 nm arasındadır. Küçük boyutlu endüstriyel nanopartikül agregatlarının en
büyük pordan kolayca geçebilmesi ve plazma membranına kadar ulaşması beklenir. Büyük
partikül agregatları ise bitki içine giremeyecektir. Fakat bazı araştırıcılar porlardan
geçebilen daha küçük boyutlu nanopartiküllerin yeni oluşumları uyarabileceği ve büyük
13
yapılı nanopartiküllerin hücre duvarından geçişini sağlayacak yeni ve büyük boyutlu
gözenekler oluşturabileceğini ifade etmişlerdir (Navarro ve diğerleri 2008). Konfokal lazer
taramalı mikroskopla, Au nanopartiküllerininin 10 nm ve yukarısının, turgor basıncı
altında olmasına rağmen, hücre duvarını aşamadıkları belirlenmiştir (Proseus ve Boyer,
2005). Fakat birçok bitki türünde farklı boyut ve bileşimlerdeki endüstriyel
nanopartiküllerin hücre duvarını geçebildikleri gösterilmiştir (Lin ve diğerleri, 2009; Liu
ve diğerleri, 2009).
Makro veya mikro ölçekli moleküller bitki hücre duvarına girdikten sonra plazmodesmalar
yoluyla hücre içi organellere taşınırlar (Dashevskaya, Kopito, Friedman, Elbaum ve Epel,
2008).
Plazmodezmalar
interselüler
sitoplazma
kanallarıdır.
Bitkiler
interselüler
etkileşimde 2 yol kullanmaktadır. Bunlardan biri, hücre duvarlarındaki ligand reseptör
aracılı apoplastik yol (hücre duvarı yolu), diğeri ise plazmodesmalar aracılı simplastik yol
(sitoplazma yolu). Bu simplastik yolda düzenleyici proteinler ve RNA’lar rol oynar (Kim,
2005). Maddeler apoplastik yolla hücre duvarına trasloke olabilirken, simplastik yolla
sitoplazmik elemanlara kadar ulaşabilmektedir (Clarkson, 1974).
Bitki türlerine göre translokasyonda farklılıklar ortaya çıkmaktadır (Zhu ve diğerleri,
2008). Mısırda 4.9 nm'den küçük nanopartiküller küçük ölçüde perfüze olabilirken, 20
nm'den büyük çaplı partiküller engellenmektedir. Yapılan bu araştırmada nanopartikül
alım sınırı 3,5 nm olarak tahmin edilmektedir. Bu boyut sınırının Abies nordmanniana,
Thuja plicata, Gingko biloba ve Eucalyptus regnans gibi türlerde daha büyük olduğu
bildirilmiştir (Shane, McCully ve Canny, 2000). Şekil. 2.3’te gösterildiği gibi, hasarsız
hücre duvarlarından sadece 5 nm çapından küçük nanopartiküller etkili bir şekilde
geçebilmektedir. Yapılan bir çalışmada, yaklaşık 3 nm çapındaki nanopartiküllerin, hücre
çeperini geçerek çeşitli epidermal hücrelere dağılabildikleri ve hatta vakuollere kadar
ulaşabildikleri gösterilmiştir. Bu dağılma floemler aracılığı ile olmaktadır (Kurepa ve
diğerleri, 2010). Hücre-hücre geçişi, bitişik hücreler arasındaki plasmodezmaların boyutu
ve nanopartikül boyutuna bağlıdır (Imlau, Truernit ve Sauer, 1999). Genel olarak bitkilerde
nanopartikül dağılım düzeyi düşüktür. Nanopartiküller, komşu hücreler arasındaki
plazmodezmalarda veya hücre duvarı boşluklarında biriktirilebilmektedir (Birbaum ve
diğerleri, 2010).
14
Şekil 2.3. Mezofil, epidermis ve stomal hücrelerin şematik gösterimi (Dietz ve Herth,
2011)
2.5. Nanopartiküllerin Toksisitesi
Nanopartiküllerin şekli, büyüklüğü, yüzey alanı, yüzey özellikleri, yüzey yükü ve
agregasyon eğilimi gibi temel bileşenleri hem nanopartiküllerin çok çeşitli amaçlar için
kullanılmasında önemli bir parametre oluşturmakta ve hem de ekosisteme ve özellikle
insan dahil tüm canlı sistemlere yayılmasında ve toksik potansiyellerinde önemli bir rol
oynamaktadır (Hoshino ve diğerleri, 2004; Singh ve diğerleri, 2009). Bir partikülün şekli
ve boyutu o partikülün yüzey alanı büyüklüğünü etkilemektedir. Yüzey alanı ise
reaksiyona girme potansiyellerini değiştirmektedir. Bir molekülün partikül boyutu
azaldıkça yüzey alanı artar ve sonuçta o molekülün reaksiyona girme potansiyeli artar
(Buzea, Pacheco ve Robbie, 2007; Jiang, Oberdörster ve Biswas, 2009). Bu özellikleri
nedeniyle
nano
boyutlu
partiküllerin
aynı
konsantrasyondaki
mikron
boyutlu
partiküllerden daha toksik olduğu belirlenmiştir (Lee ve diğerleri, 2010; Shi, Abid,
Kennedy, Hristova ve Silk, 2011). Nanopartikülün yüzey özellikleri, agregasyon durumunu
etkilemektedir. Nanopartiküller genelde içinde bulunduğu sulu ortamda agregasyon
oluşturma eğilimindedir. Agregasyon durumu, nanopartikülün boyut ve yüzey alanı gibi
özelliklerini değiştirmek suretiyle etkilerini de değiştirmektedir. Nanopartiküllerin yüzey
yükü hücresel alımında önemli bir rol oynamaktadır (Buzea ve diğerleri, 2007; Jiang ve
diğerleri, 2009). Nanopartiküller hücre içine endositik veya endositik olmayan yol ile giriş
15
yapar. Endositozda nanopartiküller hücre yüzeyindeki reseptörler aracılığıyla hücrelere
girebilir (Peters ve diğerleri, 2006). Endositik olmayan yolda nanopartiküllerin hücrelere
girişi Van der Waals kuvvetleri, elektrostatik yükler veya arayüzey gerilimi gibi
etkileşimlerle olmaktadır (Geiser ve diğerleri, 2005).
Doğal, antropojenik ve endüstriyel nanopartiküller, partikülün sahip olduğu özgün
özellikleri ve biyolojik aktivitesi sebebiyle, deri, akciğer, mide ve bağırsak sistemi gibi
çeşitli giriş noktalarından insan vücuduna ulaşabilirler. Nanopartiküller ince kılcal
damarlar yoluyla dokulara derinlemesine nüfuz edebilir ve bu yolla doku, organ, hücre ve
hücresel
yapılarla
kolayca
etkileşime
girebilir
(Gajewicz
ve
diğerleri,
2012).
Nanopartiküller hedef organ olarak çoğunlukla akciğer, karaciğer, dalak ve böbrek
dokularında toksik etki oluşturur (Chen ve diğerleri, 2006; Wang ve diğerleri, 2009).
Farmokokinetik çalışmalar sonucu farklı tipte nanopartiküllerin mitokondri (Xia ve
diğerleri, 2006), lipit vezikülleri (Penn A, Murphy, Barker, Henk ve Penn, L. 2005),
fibroblastlar (Tian, Cui, Schwarz, Estrada ve Kobayashi, 2006), çekirdek veya makrofajlar
(Chen ve Mikecz, 2005) gibi çeşitli yapılarda bulunduğu da belirlenmiştir.
Nanopartiküller fiziko-kimyasal özellikleri nedeniyle hücrelerde reaktif oksijen türlerinin
(ROT) oluşumunu indükleyebilir ve böylece oksidatif stres veya oksidadif stres aracılı
inflamasyon oluşturabilirler. Hücrede oksidatif stresin artışı ROT’lerinin oluşumunu artırır,
bunun sonucunda hücre bütünlüğünü korumak amacıyla antioksidan savunma sistemleri
devreye girer. Fakat bazı durumlarda bu sistemler yetersiz kalarak oksidan-antioksidan
arasında dengesizlikler meydana gelir. Bunun sonucunda hücre hasarı ve hatta hücre
ölümü gerçekleşebilir (Shvedova, Pietroiusti, Fadeel ve Kagan, 2012).
Yapılan bazı çalışmalar nanomateryallerin sitotoksik (Auffan ve diğerleri, 2006; Asare ve
diğerleri 2012; Nirmala ve diğerleri, 2011; Thill ve diğerleri 2006; Wiesner, Lowry,
Alvarez, Dionysiou ve Biswas, 2006), nörotoksik (Long, Saleh, Tilton, Lowry, ve
Veronesi, 2006; Win-Shwe ve Fujimaki, 2011; Wu ve diğerleri, 2011), genotoksik
(Kumari, Khan, Pakrashi, Mukherjee ve Chandrasekaran, 2011; Sharma, Singh, Anderson,
Tobin ve Dhawan, 2011), ekotoksik (Colvin, 2003; Ellegaard-Jensen, Jensen ve Johansen,
2012) ve bakteri öldürücü (Tran ve diğerleri, 2010; Yamakoshi ve diğerleri, 2003)
olabileceğini göstermiştir. Örneğin, SWCNT ve MWCNT'nin insan hücreleri için toksik
etkili olduğu (Tian ve diğerleri, 2006), nano yapılı SiO2 ve ZnO'in, insan ve kemirgenlerde
16
akciğer inflamasyonuna sebep olduğu (Chen Y, Chen J, Dong ve Jin, 2004), antibakteriyel
olarak kullanılan gümüş nanopartiküllerinin çevreye salınmasıyla ekolojik dengeyi önemli
derecede ekilediği (Parashar ve diğerleri, 2011) tespit edilmiştir.
Nanopartiküllerin bitkilere olası toksik etkilerini değerlendirmede daha ziyade çimlenme
indeksi ve kök uzaması gibi parametreler kullanılmaktadır. Manyetit (Fe3O4), TiO2 ve
karbon nanopartiküllerinin Cucumis sativus bitkisinde, tohum çimlenme oranı ve özellikle
kök uzaması üzerinde inhibitor etki oluşturduğu bildirilmiştir (Mushtaq, 2011).
Arabidopsis thaliana bitkisinin kök uzaması, tohum çimlenmesi ve yaprak sayısı üzerine
Al2O3, SiO2, Fe3O4 ve ZnO gibi metal oksit nanopartiküllerinin etkisinin anlaşılması için,
her bir partikülün 400, 2000 ve 4000 mg/L konsantrasyonlarıyla muamele edilmiştir. Söz
konusu parametreler bakımından ZnO en fitotoksik, Fe3O4 ve SiO2 toksik etkili, Al2O3 ise
nontoksik olarak bulunmuştur (Lee ve diğerleri, 2010).
Nanopartiküllerin
klorofiller
üzerinde
de
etkili
olduğu
tespit
edilmiştir.
CuO
nanopartikülleri ve çözünebilen bakır (Cu)’ın, Landoltia punctata bitkisine uygulandığı bir
çalışmada, her iki kimyasalın da büyümeyi % 50 oranında inhibe ettiği belirlenmiştir.
Ayrıca 1.0 mg\L’lik CuO nanopartiküllerinin klorofil oranında anlamlı bir azalmaya yol
açtığı gözlenmiştir. Bu azalmanın, CuO nanopartiküllerinin, çözünebilen Cu’a oranla
yapraklarda 4 kat daha fazla birikmesinden kaynaklandığı belirtilmiştir (Shi ve diğerleri,
2011).
Nanopartüküllerin etkileri uygulandıkları türlere göre de farklılıklar oluşturmaktadır. Cu
nanopartiküllerinin farklı konsatrasyonlarına maruz bırakılan Phaseolus radiatus ve
Triticum aestivum türlerinde büyüme inhibisyonu incelenmiştir. Cu nanopartiküllerinin
Phaseolus
radiatus
ve
Triticum
aestivum
da
sırasıyla
336
ve
570
mg\L
konsantrasyonlarının etkili olduğu ve buna göre Phaseolus radiatus un daha hassas olduğu
belirtilmiştir. Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak yapılan incelemede, Cu
nanopartiküllerinin
artan
konsantrasyonuyla
biyoakümülasyonun
artış
gösterdiği
gözlenmiştir (Lee, An, Yoon ve Kweon, 2008).
Nanopartiküllerin
bitkilerde
oluşturdukları
oksidatif
stres
sonucunda
lipid
peroksidasyonunu indüklediği belirlenmiştir. Nanopartiküllerin, mikro boyutlu formlarına
kıyasla daha fazla birikebildiği ve bunların, katalaz ve süperoksit dismutaz antioksidan
17
enzim kapasitelerinde 1,5-2 kat daha fazla artışa sebep oldukları belirlenmiştir (Nekrasova,
Ushakova, Ermakov, Uimin ve Byzov, 2011). Cumumis sativus bitkisi, CuO ve ZnO
nanopartiküllerinin 1,000 mg/L konsatrasyon ile muamele edilmiş ve fidelerin
biyokütlesinde kontrole kıyasla sırasıyla % 75 ve % 35 oranında azalma olduğu
belirlenmiştir. CuO ve ZnO nanopartiküllerinin kök hücre duvarlarına büyük oranda
yapıştığı ve süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve fosfolipid hidroperoksit
glutatyon (POD) aktivitelerinde anlamlı bir artışa yol açtıkları gözlenmiştir (Kim, Lee S ve
Lee I, 2012).
2.6. Nanopartiküllerin Genotoksisitesi
Nanomateryallerin
genotoksik
mekanizması
henüz
tam
olarak
anlaşılamamıştır.
Nanomateryallerin boyut, form, muamele süresi, kullanılan test organizması, agregasyon
durumu, konsantrasyonu, uygulanan hücre tipi ve in vivo/in vitro uygulanması gibi
parametrelere bağlı olarak gösterecekleri genotoksik etki de farklılık göstermektedir.
Nanopartiküllerin genotoksik etkileri konusunda bitkilerde yapılmış sınırlı sayıda çalışma
mevcuttur. Memeli hücrelerinde ise farklı boyut, form ve test organizmaları kullanılarak
nanopartiküllerin
etki
potansiyelleri
anlaşılmaya
çalışılmaktadır.
Örneğin,
TiO2
nanopartiküllerinin farklı iki formu memeli hücre hattına muamele edildiğinde, anataz
formun DNA zincir kırıkları ve kromozom hasarları oluşturduğu, rutil formun ise
genotoksik etki göstermediği belirlenmiştir (Falck ve diğerleri, 2009; Petkovic ve diğerleri,
2011). TiO2 nanopartiküllerinin rutil formu transgenik farelere in vivo muamele
edildiğinde epidermisten penetre olamadığı ve deri tümörlerinin oluşturulduğu dermise
ulaşamadığı gözlenmiştir (Xu ve diğerleri, 2011). Fakat TiO2 nanopartiküllerinin anataz
formunu da kapsayan kristal formunun genellikle genotoksik potansiyeli olduğu
belirlenmiştir. TiO2 nanopartiküllerinin %75 anataz + %25 rutil formunun içme suyuna
karıştırılarak verilmesiyle farelerin karaciğerlerinde 8-hidroksi-deoksiguanozin (8-OhdG)
adductlarının, periferal kan hücrelerinde büyük kromozomal hasarların ve fetüsün maternal
maruziyetiyle DNA delesyon frekansında artışların olduğu belirlenmiştir (Trouiller,
Reliene, Westbrook, Solaimani ve Schiestl, 2009). Yapılan başka bir çalışmada rutil
formun anataz formdan daha büyük olduğu ve bu nedenle oluşturdukları genotoksik
cevabın da farklı olduğu sonucuna ulaşılmıştır (Gurr, Wang, Chen ve Jan, 2005).
18
Demir oksit (Fe2O3), itriyum oksit (Y2O3) ve ZnO nanopartiküllerinin 0,0001-50 µg/ml
konsantrasyonları insan vasküler endotel hücrelerine 1-8 saat boyunca uygulandığında her
üç nanopartikülün de endotel hücrelerine girebildikleri fakat oluşturdukları genetik
cevapların farklı olduğu belirlenmiştir. Fe2O3 nanopartiküllerinin inflamasyon yanıtı
oluşturamadığı fakat Y2O3 ve ZnO nanopartiküllerinin 10 µg/ml ve yukarısının akut
maruziyet oluşturmasıyla inflamasyonu tetikleyebildikleri belirtilmiştir. İnflamasyon
oluşumu nanopartikülün türü ve konsantrasyonuna göre farklılık göstermektedir. Endotel
hücrelerdeki inflamasyon kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde de kritik bir rol
oynamaktadır (Gojova ve diğerleri, 2007).
Silikanın genotoksisitesi komet analiziyle değerlendirildiğinde genellikle önemli derecede
DNA hasarı oluşturmadığı fakat mikroçekirdek değerlendirmelerinde önemli genotoksik
cevap oluşturduğu bildirilmiştir (Wang J, Sanderson ve Wang H, 2007). Aynı anda iki test
sistemiyle yapılan bir başka çalışmada, silikanın mikroçekirdek frekansında önemli bir
artışa sebep olduğu fakat komet kuyruk uzuluğunda bir artış oluşturmadığı belirtilmiştir
(Gonzalez ve diğerleri, 2010). Bu sonuçlar genotoksisitenin araştırılmasında farklı test
sistemlerinin kullanılmasının önemini göstermektedir. Manyetit nanopartiküllerinin,
memeli
hücrelerinde
ROT'lerinin
etkisiyle
çift
DNA
kırıkları,
kromozomlarda
mikronükleus ve kardeş kromatit değişimi oluşturdukları bildirilmiştir (Kawanishi ve
diğerleri, 2012) TiO2, sentetik amorf silika ve MWCNT'lerin insan lenfositleri üzerindeki
olası genotoksik etkileri mikroçekirdek analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. TiO2 ve
MWCNT'lerin bazı formlarının genotoksik etki oluşturdukları, sentetik amorf silikanın
mikroçekirdek
oluşturmadığı
bildirilmiştir.
Genotoksisitenin
değerlendirilmesinde
mikroçekirdek oluşumlarının önemli bir parametre olduğu vurgulanmıştır (Tavares ve
diğerleri, 2014). Mikroçekirdek oluşumları bitkilerde de önemli bir parametredir. Allium
cepa’da mikronükleus ve kromozom anormallikleri ile kök büyümesi arasında ters bir
korelasyon olduğu belirlenmiştir (Ghosh, Bandyopadhyay ve Mukherjee, 2010).
Gümüş nanopartikülleri (25, 50, 75 ve 100 µg/ml konsantarsyonları) Allium cepa kök ucu
hücrelerinde genotoksik ve sitotoksik etkiler oluşturmuş ve mitotik indekste kontrole
kıyasla anlamlı bir azalmaya sebep olmuştur. Bu nanopartiküllerin kromatin köprüleri,
yapışıklık ve yapısı bozulmuş metafazlara sebep olduğu, özellikle 75 µg/ml’lik
konsantrasyonda kromozom kırıkları ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonda ise hücre
duvarında
parçalanmalara
sebep
olduğu
belirlenmiştir
(Kumari,
Mukherjee
ve
19
Chandrasekaran, 2009). Gümüş nanopartikülerinin Vicia faba’da da genotoksik etkiler
oluşturduğu, kromozomal aberasyonların kontrole kıyasla anlamlı bir artış gösterdiği
belirlenmiştir (Patlolla, Berry, May ve Tchounwou, 2012). ZnO nanopartikülleri Allium
sativum’da kromozom yapışmaları, köprüler, kırıklar ve geri kalmış kromozomlar
oluşturmuştur. Bu hasarlı hücrelerin sayısı konsantrasyon ve muamele süresinin artışıyla
beraber yükselmiştir (Shaymurat ve diğerleri, 2012). Nanopartiküllerin bitkilerde plazma
membranlarını, memeli hücrelerine benzer şekilde endositik yollarla geçebildikleri tahmin
edilmektedir (Etxeberria, Gonzalez, Baroja-Fernandez ve Romero, 2006). Demir oksit,
aliminyum oksit ve seryum oksit gibi diğer bazı metal oksit nanopartiküllerinin de bazı in
vivo ve in vitro çalışmalarda genetik değişiklikler oluşturdukları belirlenmiştir (Auffan ve
diğerleri, 2009; Balasubramanyam ve diğerleri, 2009; Singh, Jenkins, Asadi, Doak, 2010).
Bütün bu çalışmalar metal oksit nanopartiküllerinin genotoksik potansiyele sahip olduğunu
göstermektedir.
2.7. Genotoksisiteyi Değerlendirmede Kullanılan Testler
Çeşitli ekzojenlere maruz kalan canlılarda bazı toksik etkiler ortaya çıkmaktadır. Bu toksik
etkilerin en önemlisi genetik materyalde oluşan değişikliklerdir. Genetik değişiklikler
gametik hücrelerde meydana gelirse oluşan bu anormallikler direkt olarak yeni nesillere
aktarılır. Genetik değişiklikler somatik hücrelerde gerçekleşirse, günümüzde kalp damar
hastalıklarından sonra ikinci derecede ölüme sebebiyet veren kanser hastalığına sebep
olmaktadır. Kanserli hücrelerde çok sayıda gende ve kromozomda mutasyonlar olduğu
belirlenmiştir. Bu veriler, ekzojen bir maddenin genlerde ve/veya kromozomlarda
mutasyon oluşturma potansiyeli ile kanser oluşturma potansiyeli arasında bir korelasyon
olduğunu göstermektedir (Chandirasekar ve diğerleri, 2014; Madia, Phrakonkham, ve
Corvi, 2014). Bu nedenle çeşitli ekzojen kimyasalların genetik materyalde hasar
oluşturabilme risklerinin belirlenmesi amacıyla çeşitli testler geliştirilmiştir. Bu testler
nanomateryallerin genotoksik risklerinin belirlenmesi amacı ile de kullanılmaktadır
(Bolognesi, 2003; Garcia-Sagredo, 2008; Yüzbaşıoğlu, Zengin ve Ünal, 2014).
Nanopartiküllerin genotoksik etkileri, in vitro ve in vivo olmak üzere iki farklı yolla
incelenmektedir. In vitro modeller birincil genotoksisiteyi değerlendirmeye imkan
tanırken, in vivo modeller ile birincil genotoksisteye ilave olarak, inflamasyon gibi ikincil
20
genotoksisite etkileri de değerlendirilebilmektedir (Dusinska ve Collins, 1996;.Kisin ve
diğerleri, 2007; Vega-Villa ve diğerleri, 2008; Arora, ve diğerleri, 2012).
Nanomateryallerin genotoksitesinin belirlenmesinde en sık kullanılan testlerden bazıları
şunlardır:
Ames testi (Bakteriyel geri mutasyon testi): Bu testte Salmonella typhimuriun bakterisinin
histidin sentezleme yeteneğini kaybetmiş özel mutant suşları kullanılmaktadır. Söz konusu
kimyasalın çeşitli konsatrasyonları ile belli sürelerde muamele edilen bu bakterilerden
bazıları histidin sentezleme yeteneğini tekrar geri kazanırlar ve histidinsiz ortamlarda
üreyebilirler. Üreyebilen bu kolonilerin yani geri mutasyon geçiren bakterilerin frekansı
belirlenerek, incelenen kimyasalın mutajen olup olmadığı değerlendirilir. Ames testi,
nanopartikülleri de kapsayan bir çok ekzojen maddenin mutajenitesini belirlemede
kullanılan, kolay ve ucuz bir testtir (Ames, Mccann ve Yamasaki, 1975; Chen ve diğerleri,
2014; Li ve diğerleri, 2012; Mortelmans ve Zeiger, 2000;. Woodruff ve diğerleri, 2012).
Kromozom anormalliği testi: Söz konusu kimyasalın etkisiyle kromozomlarda meydana
gelen kırıkların tamir edilememesi sonucunda, hücrede çeşitli yapısal ve sayısal
anormallikler oluşmaktadır. Test edilecek ekzojen maddeye maruz bırakılan çeşitli primer
hücreler veya hücre hatları, metafaz safhasında durdurulur ve bu evrede kromozomlardaki
anormallikler mikroskopla analiz edilir. Bunun için en sık kullanılan hücrelerden biri insan
periferal lenfositleridir (Yılmaz S, Ünal, Yılmaz E, Yüzbaşıoğlu ve Erkal-İlhan 2014;
Varshney, Chandra, Chauhan, ve Goel, 2014). Bu yöntem, oldukça zahmetli ve uzun
zaman alıcı bir test olup, iyi bir sitogenetik deneyim gerektirmektedir (Aoshima, Yamana,
Nakamura ve Mashino, 2010; Galloway ve diğerleri, 1987; Ginzkey ve diğerleri, 2014;
Mosesso, Cinelli, Natarajan ve Palitti, 2013).
Mikroçekirdek testi: Mikroçekirdekler, çekirdek bölünmesi sırasında oluşan, tüm bir
kromozomdan ya da kromozom fragmanlarından köken alan ve ana çekirdeğe dahil
olmayan küçük çekirdeklerdir. Bu testte bir aktin polimeraz inhibitörü olan sitokalasin B
ile sitokinez durdurulur ve sonuçta bir hücre bölünmesi geçirmiş binükleat (iki çekirdekli)
hücreler oluşur. Bu binükleat hücrelerde, uygulanan ekzojen maddenin etkisi ile oluşmuş
mikroçekirdekler analiz edilir. Basit ve güvenilir bir yöntemdir. Mikroçekirdek frekansı ile
kanser insidansı arasında bir korelasyon olduğu belirlenmiştir (Fenech ve diğerleri, 2011;
21
Ginzkey ve diğerleri, 2014; Jumagazieva ve diğerleri, 2011; Laingam, Froscio ve
Humpage, 2008; Li ve diğerleri, 2012; Mosesso ve diğerleri, 2013; Shibai-Ogata ve
diğerleri, 2014 ).
Komet (tek hücreli jel elektroforezi) testi: Son yıllarda oldukça yaygın kullanılan
genotoksisite testlerinden biridir. Bu testte mikroskop lamı üzerinde agaroza gömülen
hücrelerdeki histonlar ve bazı hücre bileşenleri, yüksek tuz konsantrasyonu içeren bir
deterjan ile temizlenir ve spesifik bir pH’da DNA sarmalı çözünerek elektroforez
uygulanır. Takiben, preparatlara nötralizasyon uygulanır, DNA spesifik boyalarla (örneğin,
etidyum bromür) boyanır ve sonunda bir floresan mikroskop ile incelenir. Muamele edilen
ekzojen madde sonucu DNA’da hasar oluşmuşsa, çekirdekler mikroskopta kuyruklu yıldız
görünümü oluşturur. Kuyruk momenti, kuyruktaki DNA yüzdesi ve kuyruk uzunluğu gibi
parametreler kullanılarak DNA hasarı kantitatif olarak belirlenir. Bu teknik ile düşük
seviyedeki hasarlar hızlı ve hassas bir şekilde tespit edilebilir. Bu test çok çeşitli doku ve
hücre tiplerinde kullanılabilmektedir (Ginzkey ve diğerleri, 2014; Karlsson, 2010; Singh,
McCoy, Tice ve Schneider, 1988; Woodruff ve diğerleri, 2012)
Allium testi: Çevresel kirleticilerin genotoksik etkilerini değerlendirmede yüksek yapılı
bitkiler de çokça kullanılmaktadır. Bitkilerin kullanılma amacı, sadece farklı çevrelerdeki
mutajenlerin etkisine duyarlı olmalarından değil, aynı zamanda polen, kök, yaprak gibi
farklı organlardaki kromozom anormalliklerini değerlendirme imkanı sağlamalarından da
kaynaklanmaktadır. Genotoksik çalışmalarda en sık kullanılan bitki türleri Allium cepa,
Vicia faba, Zea mays, Tradescantia, Nicotiana tabacum, Crepis capillaris, Hordeum
vulgare’dir. Allium testi ile, mitotik indeks (Mİ), kromozom anormallikleri (KA), çekirdek
anormallikleri (NA) ve mikroçekirdek (MN) gibi çeşitli parametreler aynı anda
değerlendirilebilmektedir (Leme ve Marin-Morales, 2009; Michalska-Kacymirow, Kurek,
Smolis, Wierzbicka ve Bulska, 2014).
Allium cepa hücrelerinde mitotik indeksteki azalma ve artış, en çok kullanılan
parametlerden biridir. Mİ’teki azalma, sitotoksisite belirteci olarak değerlendirilmektedir.
Mİ’te gözlenen azalma, maruz kalınan ekzojen maddenin etkisiyle bitkide büyüme ve
gelişmenin engellendiği sonucuna varılabilirken, Mİ’te gözlenen artış, düzensiz hücre
bölünmeleri ve tümörlü bir doku anlamına gelmektedir (Fernandes, Mazzeo ve Marin-
22
Morales, 2007; Karaismailoglu, 2014; Konotop ve diğerleri, 2014; Paul, Nag, ve Sinha,
2013; Türkoğlu, 2012).
Kromozomal anormallikler (KA), kromozom sayısı veya yapısındaki değişimler olup,
spontan ya da maruz kalınan ekzojen maddenin etkisiyle oluşabilir. Yapısal kromozomal
değişiklikler, DNA kırıkları, DNA sentezinin inhibisyonu ve DNA replikasyonundaki
hatalar gibi birçok faktör tarafından indüklenebilir. Poliploidi gibi sayısal anormallikler ise
anojenik ajanların mitotik iplikleri etkilemesi ve kromozomların düzensiz şekilde
ayrılmasından kaynaklanır (Albertini ve diğerleri, 2000; Kaur, Singh, Batish ve Kohli,
2014; Türkoğlu, 2012). KA’lar hücre döngüsünün bütün fazlarında gözlenebilir. Bu
nedenle değerlendirme yaparken bütün fazların göz önüne alınması daha sağlıklı sonuçlar
vermektedir (Fiskesjo, 1985). Kromozom köprüleri, kromozom kırıkları, fragmentler
klastojenik etkiyi gösterirken, kromozom kayıpları, yapışıklık, multipolarlık, C-metafaz ise
anojenik etkiyi göstermektedir (Ateeq, Abul-Farah, Niamat-Ali ve Ahmad, 2002;
Karaismailoglu, 2014; Kumari ve diğerleri, 2009, 2011).
Nükleer anormallikler, maruz kalınan ajanın interfazdaki çekirdeklerde oluşturduğu
morfolojik değişikliklerdir. Bu değişiklikler genellikle halter şekilli çekirdekler, nükleer
tomurcuklanma taşıyan çekirdek, çok çekirdekli hücreler (binükleat gibi) ve mini hücreler
gibi anormalliklerdir. Loblu çekirdekler ve çok çekirdekli hücreler, hücre ölüm sürecinin
belirteçleridir. Nükleer tomurcuklar ise polipliodiden kaynaklanan genetik materyal
fazlalığından oluşmaktadır (Arora, Singh, Srivastava ve Srivastava, 2014; Fernandes ve
diğerleri, 2007; Leme, Angelis ve Marin-Morales, 2008; Tan ve diğerleri, 2014).
Mikroçekirdekler, maruz kalınan ekzojen maddenin sebep olduğu hasarlar sonucu genetik
materyalden ayrılan bütün kromozomlardan veya kromozom fragmentlerinden, yanlış
tamir edilen veya tamir edilemeyen hasarlardan kaynaklanan, ana çekirdekten küçük
çekirdeklerdir. Maruz kalınan ajanın anojenik veya klastojenik olmasına göre farklı
yollarla oluşan anormallik tipidir. Anojenik etkiden oluşanlar daha büyük MN’ler
oluştururken, klastojenik etkiden kaynaklananlar daha küçük yapılıdır (Fernandes ve
diğerleri, 2007; Leme ve diğerleri, 2008; Pandey, Kumar, ve Roy, 2014; Pekol, 2014).
23
2.8. Bakır oksit (CuO) ve Silika (SiO2) Nanopartikülleri
Bakır oksit nanopartikülleri, çok geniş uygulama alanı olan önemli nanopartikülerden
biridir. Cam ve seramik sanayiinde, güneş enerjisi üretiminde, elektrik iletkenliğinde,
termoelektrik ve algılama malzemelerinde, manyetik depolama ortamlarında, gaz
sensörlerinde, roketlerde ve bazı teknik ürünlerde katalizör olarak kullanılmaktadır (Li ve
diğerleri, 2008). Biyosidal madde olarak tekstilde (çoraplarda), yara bantlarında ve
boyalarda tercih edilmektedir (Rubilar ve diğerleri, 2013). Anti mikrobiyal özelliklerinden
dolayı mürekkeplere, plastiklere, madeni yağlara ve kozmetik ürünlerine katkı maddesi
olarak eklenmektedir (Hanagata ve diğerleri, 2011). Antimikrobiyal ajan olarak kulanılan
CuO nanopartikülleri, gümüş nanopartiküllerine kıyasla daha ucuzdur ve bakırın temel bir
element olması nedeniyle biyomedikal uygulamalarda ve ayrıca sabun ve boyalarda daha
fazla tercih edilmektedir. Çürümeyi önleme özelliklerinden dolayı tekne gövdelerini
kaplamada da bu nanopartiküllerden faydalanılır (Jia, Mei, Cheng, Zhou, ve Zhang, 2012;
Saison ve diğerleri, 2010). Tıpta, teşhis ve tedavi amacı ile yaygın bir şekilde kullanılmaya
başlanmıştır (Ku ve diğerleri, 2012).
CuO nanopartiküllerin farede, özellikle 23.5 nm boyutunun hedef organ olarak karaciğer,
dalak ve böbrek dokularına ulaşabildikleri ve toksik etki oluşturdukları belirlenmiştir.
Ayrıca birikimlerinin bazı hastalıklarla bağlantılı olduğu ifade edilmiştir (Chen ve
diğerleri, 2006). Biriken bakır, oksidatif strese bağlı olarak hidroksil (OH) radikalleri
oluşturabilen fenton tipi reaksiyonları katalize eder. Bu radikaller nükleik asit, membran
lipitleri ve membran proteinleri gibi hücresel bileşenlere zarar verebilirler (Jomova, Baros
ve Valko, 2012).
Bakır canlı sistemlerinde geçiş metallerinden olan eser bir elementtir ve 30'dan fazla
enzimin kofaktörüdür (Rana, 2008). Bu yüzden bakırın homeostazisteki dengesinin
bozulması pek çok hastalıkla sonuçlanmaktadır. Bakır dengesinin bozulmasıyla insanlarda,
kansere eğilim, hipertansiyon, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif rahatsızlıklar
ortaya çıkmaktadır (Double, 2012; Hung, Bush ve La Fontaine, 2013). Diğer taraftan aşırı
bakır birikimi ile Wilson hastalığı (Scheiber, Dringen ve Mercer, 2014) oluşmaktadır.
Bakır, bitki büyüme ve gelişmesinde de hayati önemi olan bir mikro besindir. Fotosentezde
elektron transferinde, mitokondriyal solunumda, hücre duvarı metabolizmasında, hormonal
sinyalizasyonda, protein metabolizmasında ve demir mobilizasyonunda rol almaktadır
24
(Raven, Evans, ve Korb, 1999; Yruela, 2005, 2009). Fakat bakırın yüksek
konsantrasyonları bitkide şiddetli toksik etkiyi uyararak; kloroz, nekroz, bodurluk ve kök
gelişimi inhibisyonu oluşturduğu belirlenmiştir (Yruela, 2005; Xiong and Wang, 2005).
CuO nanopartiküllerinin etkileri tam olarak bilinmemekle beraber, bitkilerde DNA
lezyonları oluşturabileceği rapor edilmiştir (Atha ve diğerleri, 2012). DNA lezyonlarının
bitkideki birikimi genomik kararsızlığa, bitki büyümesinde azalmaya ve bitki hastalıklarına
yol açabilmektedir (Britt 1999).
CuO nanopartiküllerinin küçük boyutlu ve geniş yüzey alanına sahip olmaları nedeniyle,
bitkilerde, mikron boyutlu formlarından daha fazla birikebildiği, büyüme inhibisyonu
oluşturduğu ve yapraklarda klorofil sayısında azalmaya sebep olduğu rapor edilmiştir (Kim
ve diğerleri, 2012; Lee ve diğerleri, 2008; Shi ve diğerleri, 2011). Bakırın nanoformları,
çeşitli organizmalarda farklı tipte toksik etkiler oluşturmaktadır (Bulcke, Thiel ve Dringen,
2014; Karlsson, Cronholm, Gustafsson ve Möller, 2009; Semisch, Ohle, Witt ve Hartwig,
2014).
Örneğin,
CuO
nanopartiküllerinin
teratojenik
etkileri
Fetaks
testi
ile
değerlendirilmiş ve sonuçta bu nanopartiküllerin embriyoda teratojenik ve letal etkiler
gösterdiği belirlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin hedef organın bağırsaklar olduğu ifade
edilmiştir (Bacchetta ve diğerleri, 2012). CuO nanopartiküllerinin mikro boyutlu CuO ile
kıyaslandığı komet çalışmasında, nanopartiküllerin daha genotoksik olduğu gözlenmiştir
(Karlsson ve diğerleri, 2009). CuO nanopartiküllerinin tekne gövdelerinin kaplanmasında
kullanılması, sulardaki yoğunluğunu iyice artırarak sucul organizmalar üzerinde olumsuz
etkilere de yol açar. Sucul bir organizma olan midyeler nano CuO'e 4 hafta boyunca maruz
bırakılmış ve bakırın birikimi, kabuk gelişimi üzerine etkisi ve temizlenme oranı
incelenmiştir. En yüksek konsantrasyonda (3 mg/L) kontrole kıyasla 60 kat daha fazla
birikme, büyüme oranında % 68'lik ve temizlenme oranında % 48’lik bir azalma olduğu
belirlenmiştir (Hanna, Miller ve Lenihan, 2014). CuO nanopartiküllerinden salınan bakır,
çinko bağlayıcı proteinlere, genomik kararlılığı sağlayan bazı enzimlere, DNA hasarını
belirleyen ve DNA tamirinde rol oynayan sinyalizasyon enzimlerine bağlanarak bu
yapıların bozulmasına yol açmaktadır (Hartwig, 2013; Schwerdtle ve diğerleri, 2007).
Silikon dioksit (özellikle amorf yapılı) nispeten düşük maliyetli, daha kolay üretildiği ve
güvenilir bir madde olarak kabul edildiği için çok geniş kullanım alanı olan bir
nanopartiküldür. Boyalarda, verniklerde, yapıştırıcılarda, kurutucularda, plastiklerde, diş
macunlarında,
ilaçlarda,
gıda
paketlemesinde,
gıda
filtrasyonunda,
gıda
katkı
25
maddelerinde, tıpta tanı ve tedavi yöntemlerinde, tarımda ve daha pek çok biyoteknolojik
uygulamada geniş kullanım alanına sahiptir (Chang J, Chang K, Hwang ve Kong, 2007;
Dekkers ve diğerleri 2011; FAO/WHO 2010; Ma, ve diğerleri, 2013).
Silika nanopartiküllerinin düşük dozlarda toksik etkili olmadığı kabul edilmektedir. Ancak
yüksek dozlarda olumsuz etkiler oluşturabildikleri belirlenmiştir. Silika nanopartiküllerinin
fibroblastlarda oluşturduğu etkilerin değerlendirildiği bir çalışmada, yüksek dozlarda hücre
canlılığını azalttığı belirlenmiştir. Laktat dehidrogenez testiyle (özellikle kalp ve karaciğer
hastalıklarının tanısında kullanılan bir enzim testi olup, bu enzim hücre hasarının olduğu
tüm durumlarda artış gösterir) yüksek dozlu silikanın hücrede membran hasarına yol açtığı
gösterilmiştir. Bu iki test sonucuna göre, silikaya maruziyet fibroblastlarda hasara
yatkınlığı artırmaktadır (Chang ve diğerleri, 2007). SiO2 nanopartiküllerinin hemolitik
etkili oldukları ve özellikle inflamasyona sebep oldukları belirlenmiştir (Cho ve diğerleri,
2007). Silika nanopartiküllerinin fare ve makrofaj hücre hattına (RAW264.7) uygulanması
sonucunda farede peritonal makrofajların aktive olduğu ve makrofajlardan salınan nitrik
oksitlerin seviyesi ve inflamasyon yanıt göstergelerinin (TNF-α, IL-1 gibi) arttığı tespit
edilmiştir. RAW264.7 hücre hattında ise ROT'lerinin oluştuğu ve nitrik oksit salınmasıyla
hücre içi gulutatyon düzeyinin azaldığı belirlenmiştir. Kısaca silika nanopartikülleri hem in
vivo hem de in vitro ortamlarda ROT'lerinin üretimine bağlı inflamasyon yanıtı
oluşturmuştur (Park, E. J. ve Park, K. 2009). Amorf yapılı silika nanopartiküllerinin 0, 100,
200, 300, 400 and 500 μg/ml’lik konsantrasyonlarının etkileri sağlıklı insan akciğer hücre
hattında (L-132) incelenmiş ve bu nanopartiküllerin konsantrasyona bağlı olarak hücre
canlılığını azalttığı, antioksidan enzim aktivitesini azaltarak ROT'lerini artırdığı,
iflamasyon belirteci olan interlökin-8 ve siklooksijenaz-2 ekspresyonunu artırdığı ve L-132
hücrelerinde DNA hasarına sebep oldukları belirlenmiştir (Sahu, Vijayaraghavan ve
Kannan, 2014 ).
Nanopartiküllerin etkisinde rol oynayan parametrelerden biri de yüzey alanlarıdır. Amorf
silika nanopartiküllerinin endotelyal hücre kültürlerinde 14, 15 ve16 nm boyutlarının (3347 µg/cm2), 19 nm’lik partiküllerin (89 µg/cm2) ve 60 nm’lik partiküllerin (254 µg/cm2)
uygulaması sonucunda, büyük nanopartiküllerin sitotoksik etkilerinin çok yavaş olduğu
fakat küçük nanopartiküllerin bir kaç saat içinde nekroz yoluyla hücre ölümüne sebep
oldukları gözlenmiştir (Napierska ve diğerleri, 2009). Silika nanopartikülleri, bulundukları
hücre ortamına göre de faklı etki göstermektedir. Aynı özelliklerdeki silika
26
nanopartiküllerinin insan akciğer hücre hattı, endotel hücre hattı ve makrofaj-nötrofil hücre
hattındaki etkileri aynı koşullarda olacak şekilde incelenmiştir. Bu 3 hücre hattında da
sitotoksik etki oluştuğu ve oluşan bu cevabın nanopartikülün kütle/boyut/yüzey alanına ve
konsantrasyona bağlı olduğu vurgulanmıştır (Lison ve diğerleri, 2008). Silikanın 15 nm ve
30 nm boyutlarının epidermal keratinosit hücre hattında (HaCaT), hücre canlılığı, hücre
döngüsü, apoptozis ve protein ekspresyonlarını nasıl etkiledikleri değerlendirilmiştir.
Hücre canlılığı doza bağlı bir azalış göstermiştir. Bu azalışın partikül boyutunun
azalmasıyla ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Apoptozis doza bağlı indüklenmiştir.
Proteomik analizi ile oksidatif stres ve hücre iskeletiyle ilgili proteinlerin, moleküler
şaperonların, apoptozis ve tümör-ilişkili proteinlerin ekspres edildiği ve bunların
nanopartikül boyutuyla ilişkili olduğu rapor edilmiştir. (Yang ve diğerleri, 2010). Füme
silika (toz halinde, amorf silikanın oldukça düşük kütle yoğunluklu ve yüksek yüzey alanlı
bir türevi) ve porlu silikanın karşılaştırmalı etkileri, insan bronşiyal epitel hücre hatlarında
değerlendirilmiştir. Bu hücre hatlarında silika nanopartiküllerinin oksadatif stres
oluşturabildikleri, porlu silikaya maruz kalan hücrelerin, füme silikaya maruz kalanlardan
daha fazla etkilendikleri belirlenmiştir (Eom ve Choi, 2009).
Metal
oksitlerden
olan
SiO2
nanopartikülleri
özellikle
karaciğer
ve
dalakta
birikebilmektedir (Park E J ve Park K, 2009). Ticari olarak yaygın kullanılan bu NP’ler, in
vitro genotoksik etkilerin araştırılmasında da oldukça çok kullanılan nanopartiküllerdendir.
Yapılan çalımalarda, hem boyutuna göre ve hem de faklı hücre tiplerine göre, bu
nanopartiküllerin farklı etkiler gösterdiği belirlenmiştir. Hatta, aynı nanopartikülün aynı
hücre hattında faklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda dahi farklı sonuçlar ortaya
çıktığı gözlenmiştir Örneğin silika nanopartiküllerinin 3T3 fare fibroblastlarında
genotoksisite oluşturmadığı bildirilmiştir (Barnes ve diğerleri, 2008). Fakat daha sonra
aynı hücrelerde yapılmış başka bir çalışmada, pozitif genetik cevap oluşturabildiği rapor
edilmiştir (Park ve diğerleri, 2011). Benzer bir çelişki A549 akciğer kanser hücre
hatlarında da görülmüştür (Gonzalez ve diğerleri, 2010; Jin, Kannan, Wu ve Zhao, 2007).
Ancak bu farklılığın kullanılan genotoksisite testinden de kaynaklanabileceği belirtilmiştir
(Barnes ve diğerleri, 2008; Jin ve diğerleri, 2007). Farelerde silika nanopartiküllerinin 70
nm boyutunun karaciğer hasarı oluşturduğu, fakat makro boyutlu silikanın 300 nm hatta
1000 nm'lik uygulamalarının bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir (Nishimori ve diğerleri,
2009). Silika nanopartiküllerinin hücre kültür ortamlarında çok hızlı aglomere olmalarına
rağmen, küçük boyutlu nanopartiküllerin büyük olanlardan daha toksik oldukları
27
belirlenmiştir (Napierska ve diğerleri, 2009). Tıpta kullanılan silika nanopartiküllerinin
ilaçların yan etkilerine sinerjik etkilerini araştırmak amacıyla 70 nm silika nanopartikülleri,
inflamatuar bağırsak hastalığında kullanılan 5-aminosalisilik asit, antibiyotik etkisi için
kullanılan tetrasiklin, ateş düşürücü olarak kullanılan asetaminofen ve antidepresan etkili
trazodon ile birlikte farelere verilmiştir. Trazodon ile eş zamanlı uygulanan silika
nanopartiküllerinin karaciğerdeki hasarı gösteren biyokimyasal belirteçlerde artış
yapmadığı, fakat diğer ilaçların hepatoksisitesinde artış oluşturdukları, silika-tetrasiklin eş
muamelesinin ise letal etkili olduğu belirlenmiştir (Lia ve diğerleri, 2011).
Silikon, birçok bitki türünün büyümesinde, verimliliğinde ve biyotik/abiyotik direnci
sağlamada çeşitli etkileri olan bir elementtir (Ma ve Yamaji, 2006; Pilon-Smits, Quinn,
Tapken, Malagoli ve Schiavon, 2009). Silikon çok önemli bir fizikomekanik bariyer olup
epidermisin duvarlarında ve özellikle tek çeneklilerde kök, gövde ve yaprak kılıflarının
vasküler dokuları üzerinde birikmektedir (Ma ve Yamaji, 2006). Ayrıca bitkilerde
fizyolojik faaliyetleri düzenlemede de rolü vardır (Bao-shan, Chun-hui, Li-jun, Shu-chun
ve Min, 2004). Silikon elementinin stres koşulları altında bitki büyüme ve gelişmesini
düzenleyici etkisi olduğu bilinmektedir (Liang, Sun, Zhu ve Christie, 2007). Bakır
nanopartiküllerinde olduğu gibi, silikon dioksit nanopartiküllerinden gelen silikonun
artmasıyla ne tür etkiler oluşturabileceği henüz bilinmemektedir. Bu nanopartiküllerin
memeli hücre hatlarında ve in vivo koşullarda bazı toksik etkiler oluşturabildiklerine dair
yukarıda birkaç örnek verilmiştir. Ancak, SiO2 nanopartiküllerinin bitkilerde toksik ve
genotoksik etkileri konusunda her hangi bir çalışmaya rastlanmamıştır.
Yukarıdaki kısaca özetlendiği gibi, nanopartiküller, son yıllarda bir çok nanoteknolojik
üründe yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu nedenle insanlar, bu nanopartiküllere hem
üretim ve hem de kullanımları sırasında maruz kalmaya başlamıştır. Diğer taraftan bu
ürünler hem üretimleri sırasında ve hem de kullanımdan sonra doğaya atılmakta ve böylece
dünyadaki tüm canlıların bu nanopartiküllerle teması zorunlu hale gelmektedir. En
önemlisi ise, yapılan bir çok çalışmada nanopartiküllerin çok çeşitli hücrelerde ve
canlılarda genotoksik riskler oluşturduğu belirlenmiştir. Bu çalışma, bütün bu anlatılanlar
dikkate alınarak, insan yaşamında oldukça yaygın kullanım alanı bulmaya başlayan CuO
ve SiO2 nanopartiküllerinin genotoksik etkilerini Allium cepa da incelemek amacıyla
planlanmıştır. Allium cepa, ekzojen kimyasalların genotoksik risklerinin belirlenmesinde
yaygın şekilde kullanılan bir bitkidir. Hem bir test materyali olması, hem ökaryotik bir
28
organizma olması, hem bundaki bazı enzim sistemlerinin memelilerde de bulunması, hem
kromozom sayısının az ve hem de oldukça büyük olması ve en önemlisi de doğadaki
atıkların toprak ve su yoluyla bitkiler tarafından alındığını düşündüğümüzde, Allium cepa
bu çalışma için en ideal organizma olduğu için tercih edilmiştir.
29
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
3.1.1. Bitki materyali
Bu çalışmada canlı materyal olarak Allium cepa L. (mutfak soğanı) kullanılmıştır. Bu türde
kromozom sayısının az (2n=16) ve kromozomların büyük olması mikroskobik gözlemlerde
avantaj sağlamaktadır. Ucuz ve kolay elde edilebilir olması ve kolay çimlenmesi gibi diğer
bazı avantajları da dikkate alındığında, genotoksisite çalışmalarında çokça tercih edilen bir
organizmadır (Fiskesjo, 1985). Bütün bu sebeplerden dolayı, bu çalışmada da sitotoksik ve
genotoksik risk değerlendirmesinde mükemmel bir biyoindikatör olan Allium cepa bitkisi
tercih edilmiştir.
3.1.2. Kullanılan test materyalleri ve diğer kimyasallar
Bakır oksit nanopartikülleri (CuO NP)
Bu çalışmada kullanılan CuONP’leri (CuO nanopowder) Sigma-Aldrich’den (CAS-No:
1317-38-0) temin edilmiştir. Siyah renkli ve toz halinde olan bu partikülün boyutu <50 nm,
yüzey alanı 29 m2/g, molekül ağırlığı: 79,54 g/mol, erime noktası 1.336°C’dir.
Silika (Silikon dioksit) nanopartikülleri (SiO2NP)
SiO2 NP’leri (Silica nanopowder) ortalama 12 nm olup, Sigma-Aldrich’den (CAS-No:
7631-86-9) temin edilmiştir. Toz halinde olan bu partikülün yoğunluğu 2.6 g/cm 3, molekül
ağırlığı ise 60.09 g/mol’dür.
Kullanılan diğer kimyasallardan bazik fuksin (CAS-No: 632-99-5) Carlo Erba’dan,
potasyum metabisülfit (CAS-No: 16731-55-8) ve hidrojen peroksit (CAS-No:7722-84-1)
Applichem’den, etanol (asbolu etanol) (CAS-No: 64-17-5) Sigma-Aldrich’ten; hidroklorik
asit, glasial (asetik asit) asit, entellan ve charcoal Merck’ten temin edilmiştir. Monobazik
sodyum fosfat, dibazik sodyum fosfat, gluteraldehit (CAS-No: 111-30-8), metilen boyası,
30
propilen oksit Fluka’dan, araldit Serva’dan, ozmiyum tetroksit (OsO4) ve DMP-30 (2,4,6
Tri Dimethylaminoethyl phenol) Electron Microscopy Science’tan, dibütil fitalat Agar
Scientific’ten temin edilmiştir.
3.2. Metot
3.2.1. Test materyallerinin hazırlanması
CuO NP’lerinin hazırlanması
CuO NP’lerinin, deiyonize suda 100 µg/ml olacak şekilde hazırlanan stok süspansiyonu,
ultrasonik banyoda (J.P. Selecta, v:50-60 Hz) 30 dakika sonike edilmiştir. Bu stok
süspansiyon, deiyonize su ile 25, 50 ve 75 µg/ml’lik konsantrasyonlara seyreltilmiş ve
takiben tüm süspansiyonlar 10 dk ekstra sonikasyona tabi tutulmuştur. Hazırlanan
konsantrasyonların pH’ları ölçülerek, daha önceden kurulan deney düzeneğindeki tüplere
ilave edilmeden önce 5 dakika vortekslenmiştir. Bu çalışmada, CuO NP’lerinin, 25, 50, 75
ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonları, aynı laboratuvarda, daha önce Saygılı (Saygılı, 2014)
tarafından, insan lenfositlerinde kullanılan konsantrasyonlar olmaları nedeniyle tercih
edilmiştir.
SiO2 NP’lerinin hazırlanması
CuO NP’lerinde olduğu gibi, konsantrasyon seçiminde, yine Saygılı (Saygılı, 2014)
tarafından insan lenfositlerinde kullanılan konsantrasyonlar tercih edilmiştir. 4 farklı
konsantrasyon kullanılmış olup bunlar 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’dir. Stok olarak SiO2
NP’lerinin 1000 µg/ml’lik konsantrasyonu deiyonize suda süspanse edilmiş ve ultrasonik
banyoda 30 dakika sonikasyon uygulanmıştır. Daha sonra ana stok gerekli oranlarda
seyreltilerek diğer konsantrasyonlar elde edilmiştir. Tüm süspansiyonlar 10 dk daha sonike
edilmiştir. Yine önceki uygulamada olduğu gibi, tüplere ilave edilmeden önce pH’ları
ölçülen süspansiyonlar, 5 dakika vortekslenmiştir.
Her iki uygulamada da, kontrol olarak musluk suyu (pH ~7.5) ve pozitif kontrol olarak 0.3
M hidrojen peroksit (H2O2) kullanılmıştır
31
3.2.2. Test materyallerinin Allium cepa’ya uygulanması
Nanomateryaller ile muamele edilecek 2,6-6 gram ağırlığındaki ve 12-15 mm çapındaki
soğanların dış kabukları ve kurumuş kökleri temizlenerek, musluk suyu içeren tüplerde,
kök uzunluğu 2-3 cm olana kadar (2 gün) çimlendirilmiştir (Kumari ve diğerleri, 2011).
Çimlenen soğanlar, CuO NP’lerinin 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik, SiO2 NP’lerinin 50, 250,
500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonları ile, 24, 48 ve 72 saat boyunca oda sıcaklığında
muamele edilmiştir. Her iki uygulamada da, negatif ve pozitif kontrol (0.3M H2O2)
bulundurulmuştur. Tüplerdeki süspansiyonların buharlaşması ve azalması nedeniyle, her
gün, sabah ve akşam eksilen miktarlar tamamlanmış ve nanopartiküllerin dağılmasını
sağlamak amacı ile pipetaj yapılmıştır. Kurulan test düzeneği güneş ışığına doğrudan
maruz kalmayacak şekilde konumlandırılmıştır. Her bir konsantrasyon ve kontrol grupları
için toplam 7 soğan kullanılmıştır. Bunların 5 tanesinden 24., 48. ve 72. saatlerde kök
uçları alınmıştır. Soğanlardan 2 tanesi, genel görünümün takip edilmesi için ayrılmış ve
bunlardan kök ucu alınmamıştır. Bu soğanlardan hazırlanan düzenekler Resim 3.1 ve
Resim 3.2’de gösterilmiştir.
Resim 3.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması
32
Resim 3.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması
Allium testinde kullanılmak üzere, her bir konsantrasyon ve muamele süresi sonunda, her
soğandan 4-5 tane olmak üzere, rastgele seçilen toplam 15-20 adet kök ucu, 3:1 absolu
alkol/glasiyal asetik asit karışımı içeren tüplere konularak buz dolabında bir gece
bekletilmiştir. Tespit edilen kökler daha sonra %70’lik alkol karışımında kullanılana kadar
muhafaza edilmiştir.
Elektron mikroskobu incelemelerinde kullanılacak kökler de, rastgele seçilen 2 soğandan
yukarıdakine benzer şekilde alınmış, fosfat tamponu (pH 7,2) içinde yıkanmış ve %2,5’luk
gluteraldehit (pH 7,2) içeren farklı tüplerde buzdolabında saklanmıştır.
3.3. Preparatların hazırlanması
3.3.1. Işık mikroskobu
Allium testi ile mitotik indeks, faz frekansları ve kromozomal anormalliklerin tipleri ve
frekanslarının belirlenmesi için Allium cepa kök uçlarından preparatlar hazırlanmıştır
(Fiskesjo, 1985). Bu amaçla, her bir konsantrasyonun her bir uygulama süresi için, 5 farklı
kök ucu, 1N HCl içinde 12 dakika hidroliz edilmiştir. Kök uçları oda sıcaklığında
Feulgende 1 saat boyanmıştır. Köklerin koyu boyanan yaklaşık 2 mm’lik uç kısımları lam
üzerine alınarak %45’lik asetik asitte pirinç çubuk yardımıyla ezilmiş ve üzeri lamelle
kapatılarak ezme preparatlar hazırlanmıştır. Bu preparatlar sıvı azotta dondurularak, lam ve
lamel birbirinden ayrılmıştır. Bir gece oda sıcaklığında kurutulan lamların üzerine entellan
33
damlatılıp lamelle kapatılarak devamlı preparatlar elde edilmiştir (Rank ve Nielsen, 1993;
Yüzbaşıoğlu, Ünal ve Sancak, 2009).
Nanopartiküllerin uygulama ve kontrol gruplarında, her bir konsantrasyon ve uygulama
süresi için hazırlanan her bir preparatta 1000 hücre olmak üzere toplam 5000 hücre
incelenmiştir. Bu hücreler içinde bölünmekte olan hücreler tespit edilmiştir. Bölünen bu
hücrelerin mitoz bölünmedeki fazları ve varsa anormallikleri tespit edilmiş ve
kaydedilmiştir. Bölünmekte olan hücrelerin, incelenen tüm hücreler içindeki frekansından
yararlanarak mitotik indeks elde edilmiş ve mitozun her bir safhasındaki hücrelerin
frekansları belirlenmiştir. Ayrıca, bölünen hücrelerdeki anormallik frekansı ve hücre
başına düşen anormallik sayısı belirlenmiştir. Uygulama ve kontrol gruplarında, Mİ
bakımından farklılık olup olmadığı z-testi ile, kromozomal anormalliklerin frekansı χ2testi (Nielsen ve Rank, 1994) ile değerlendirilmiştir. İncelemeler Leica DMLB2
mikroskopta X1000 büyütmede yapılmış ve fotoğraflar Leica DFC320 kamera ile
çekilmiştir.
3.3.2. Elektron mikroskobu
Kök uçları gluteraldehitten çıkarılarak fosfat tamponunda 2-3 defa 5’er dakika yıkanmış ve
takiben ikinci tespit için % 2’lik Ozmiyum tetroksit (OsO4) (pH 7,2, fosfat tampolu) ile 6
saat oda sıcaklığında bekletilmiştir. Tespitten çıkarılan kökler fosfat tamponunda 3 kez 15
dk yıkanmıştır. Yükselen etil alkol serilerinden 10’ar dk arayla geçirilerek dehidrasyon
uygulanan kök uçları %100 etil alkolde yapılan iki değiştirmeden sonra propilen oksit içine
alınmıştır. Propilen oksitte 30 dk bekletilen kök uçları daha sonra 1:3 ve 1:1
araldit:propilen oksit serilerinde 3’er saat, sonra 3:1 araldit:propilen oksitte 1 gece
bekletilmiş ve en sonunda saf araldit içine gömülmüştür. Kök uçlarının gömüldüğü
kalıplar, polimerizasyon amacıyla 60◦C'lik etüvde 1 gece bekletilmiştir. Kalıplardan
çıkarılan örneklerden Leica Ultramikrotomda yarı ince ve ultra ince kesitler hazırlanmıştır.
Yarı ince kesitler, Toluidin mavisi-Bazik fuksin ile boyanmıştır. Hazırlanan ultra ince
kesitler gridin üstüne alınarak oda sıcaklığında kurutulduktan sonra incelenmiştir
(Wierzbicka, 1998). İnce kesitlerden sadece birkaç örnek genel yapıyı görmek amacıyla
ağır metal tuzları (Reynold’s Kurşun sitrat ve Uranil asetat) ile boyanmıştır. Yarı ince
kesitler ışık mikroskobuyla incelenmiş ve fotoğrafları çekilmiştir. İnce kesitler
34
boyanmadan Jeol JEM 1400 Geçirimli Elektron Mikroskop (Transmission Electron
Microscope-TEM) ile 80-100 kV de incelenmiştir. Görüntüler dijital ortamda alınmıştır.
35
4. ARAŞTIRMA BULGULARI
4.1. CuO Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri
Mitotik indeks ve faz frekansları: CuO nanopartiküllerinin 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik
konsantrasyonlarına, 24, 48 ve 72 maruz bırakılan Allium cepa kök ucu hücrelerinde
mitotik fazların frekansı ve mitotik indeks Çizelge 4.1’de, gözlenen anormallikler ve
bunların frekansları da Çizelge 4.2'de gösterilmiştir.
Çizelge 4.1. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların frekansı ve
mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi
İncelenen
Hücre
Sayısı
Bölünen
Hücre
Sayısı
Profaz
(%)
Metefaz
(%)
Anafaz
(%)
Telofaz
(%)
Mİ
%±SE
24h
Kontrol
Pozitif Kontrol
25
50
75
100
5000
5000
5000
5000
5000
5000
314
79
196
243
86
67
2,50
0,86
1,50
2,42
0,90
0,48
1,46
0,62
1,00
1,04
0,62
0,64
0,38
0,00
0,46
0,32
0,08
0,02
1,94
0,01
0,96
1,08
0,12
0,20
6,28±0,34
1,58±0,18***
3,92±0,27***
4,86±0,30**
48h
Kontrol
Pozitif Kontrol
25
50
75
100
5000
5000
5000
5000
5000
5000
379
90
311
285
240
96
3,22
1,08
2,42
2,82
1,96
1,08
1,76
0,66
1,84
1,36
2,14
0,38
0,88
0,06
0,80
0,48
0,32
0,10
1,72
0
1,16
1,04
0,38
0,36
7,58±0,37
1,80±0,19***
6,22±0,34**
5,70±0,33***
4,80±0,30***
1,92±0,19***
72h
Kontrol
Pozitif Kontrol
25
50
75
100
5000
5000
5000
5000
5000
5000
370
75
319
276
217
88
3,08
0,76
2,54
2,36
1,78
0,72
1,84
0,56
2,02
1,60
1,28
0,56
0,80
0
0,68
0,46
0,46
0,14
1,68
0,18
1,08
1,10
0,82
0,34
7,40±0,37
1,50±0,17***
6,38±0,35*
5,52±0,32***
4,34±0,29***
1,76±0,19***
Konsantrasyon
(µg\µl)
1,72±0,18***
1,34±0,16***
* P < 0.05 (z test), ** P < 0.01 (z test), ***P < 0.001 (z test)
CuO nanopartiküllerinin 24 saatlik uygulamasında, mitozun farklı evrelerinin (profaz,
metafaz, anafaz ve telofaz) frekansında kontrole göre düşüşler olduğu belirlenmiştir. Bu
düşüş 100 µg\µl’de kontrole kıyasla profazda yaklaşık olarak 1/5’e, metafazda 1/2’ye,
anafazda 1/19’a, telofazda 1/10’a kadar inmiştir. 48 saatlik uygulamada bütün
konsantrasyonların kontrole kıyasla profaz, anafaz ve telofaz frekanslarında azalmaya,
metafaz frekansında ise özellikle 25 ve 75 µg\µl’lik konsantrasyonların artışa sebep
olduğu, 100 µg\µl’lik konsantrasyonun ise 1/5 oranında düştüğü gözlenmiştir. 72 saatlik
uygulamada, sadece 25 µg\µl’lik konsantrasyonun metafaz frekansında artışa sebep
36
olduğu, diğer tüm konsantrasyonların faz frekanslarını kontrole kıyasla azalttığı
belirlenmiştir.
CuO nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve uygulama süreleri Allium cepa’da
mitotik indeksi kontrole göre anlamlı düzeyde düşürmüştür. Bu düşüş 48 ve 72 saatlik
uygulamada doz artışına bağlı olarak gerçekleşmiştir.
Kromozomal anormallikler: CuO nanopartiküllerinin 25, 50, 75 ve 100 µg\µl’lik
konsantrasyonlarının Allium cepa kök ucu hücrelerinde 24, 48 ve 72 saat uygulaması
sonucunda mitoz bölünmenin değişik fazlarında meydana getirdiği anormallikler, bunların
frekansları, hücre başına düşen kromozom anormalliği sayısı (KA/Hücre) ve interfazdaki
anormalliklerin frekansı Çizelge 4.2’de gösterilmiştir.
CuO
nanopartiküllerinin
bütün
konsantrasyonları,
bütün
uygulama
sürelerinde
kromozomal anormalliklerin frekansını kontrole göre anlamlı düzeyde artırmıştır (Şekil
4.1’de). CuO nanopartiküllerinin 24 saatlik muamelede oluşturduğu anormallik frekansları
kontrole kıyasla 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonlarda yaklaşık 3 katı kadar artış
gösterirken, 75 µg\µl’lik konsantrasyonda bu frekans 8 katına kadar yükselmiştir. 100
µg\µl’lik konsantrasyonda ise yaklaşık 6 kata varan düzeylerde artış göstermiştir. 48
saatlik muamele süresi sonunda, kontrole kıyasla, 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonlarda 2
katı kadar, 100 µg\µl’lik konsantrasyonda 3 katı kadar, 75 µg\µl’lik konsantrasyonda ise 7
katından daha fazla düzeyde kromozom anormalliği olduğu belirlenmiştir. CuO
nanopartiküllerinin 24 ve 48 saatlik uygulamalar sonucunda en yüksek anormallik frekansı
ve hücre başına düşen anormallik sayısının 75 µg\µl’lik konsantrasyonda olduğu
gözlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin 72 saatlik muamelesinde ise 25 ve 50 µg\µl’lik
konsantrasyonların, kontrole kıyasla yaklaşık 3 katı kadar, 75 µg\µl’lik konsantrasyonun 2
katından daha fazla ve 100 µg\µl’lik konsantrasyonun ise 4 katından daha fazla etkili
oldukları
belirlenmiştir.
Bu
uygulamada
KA/Hücre
konsantrasyonda en yüksek düzeyde olduğu tespit edilmiştir.
sayısının
100
µg\µl’lik
37
90
80
70
Frekans
60
50
24
40
48
30
72
20
10
0
Kontrol
Kontrol
H2O2
H2O2
2525
50
50
75
75
100 µg/m
100
Konsantrasyon (µg/ml)
Şekil 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı üzerine etkisi
CuO nanopartikülleri, profazda, sayılarına göre sırasıyla yapışıklık, yapısal bozulmalar ve
genetik materyal kaybına sebep olmuştur (Resim 4.1). Metafazda en fazla anormallik Cmetafazda gözlenmiştir. Gözlenen diğer anormallikler ise miktarlarına göre sırasıyla,
yapışıklık, kromozom gruplaşması, geri kalmış kromozom, yapısal olarak düzensiz
metafazdır. Diğer olarak adlandırılan gruptaki hücrelerde birden fazla sayıda anormallik
bulunmaktadır ve metafazda yapışıklık ve fragmentin bir arada olduğu hücreleri ifade
etmektedir (Resim 4.2). Anafaz-telofazda en fazla gözlenen anormallik ileri gitmedir.
Diğer anormallikler ise miktarlarına göre sırasıyla yapısal bozukluğu olan anafaz-telofaz,
kutupsal sapma, köprü, yapışıklık, diğer anormallikler (köprü+yapışıklık, geri kalmış
kromozom+ileri gitme, ileri gitme+kutupsal sapma), asenkron bölünme, star anafaz-geri
kalmış kromozom, fragment-multipolarlık olarak belirlenmiştir (Resim 4.3).
İnterfazdaki anormal hücre frekansları da, bazı uygulamalarda kontrole kıyasla artış
göstermiştir. 24 saatlik uygulamada sırasıyla en yüksek 25, 75, 100 µg\µl konsantrasyonda
gözlenmiştir. 50 µg\µl’de ise kontrolden daha az düzeydedir. 48 saatlik muamelede
interfazdaki anormal hücre frekansları 75 ve 100 µg\µl’de kontroldeki ile aynı düzeyde
olup %0.04’tür. 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonlarda ise sırasıyla % 0.13 ve % 0.12’dir.
72 saatlik uygulamada ise interfazdaki anormal hücre frekansı 75
µg\µl’lik
konsantrasyonda en yüksek olup, %0.10’dur. En düşük frekans 100 µg/ml’de olup
%0,04’tür. Diğerlerinde bu ikisi arasındadır. Ancak bu frekansların hiç biri kontrole göre
anlamlı değildir. İnterfazda binükleat hücreler (28 hücrede), mikroçekirdekler (20 hücrede)
38
ve tomurcuklanma (1 hücrede) gözlenmiştir. En yüksek konsantrasyonda bunların dışında
halter şekilli hücre (2 hücre) bulunmuştur (Resim 4.4).
TEM analizi: CuO nanopartiküllerinin 25 µg/ml ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonlarının 24,
48 ve 72 saatlik muamelelerinden sonra Allium cepa dan elde edilen kök uçlarında yapılan
TEM analizlerine ait seçilen bazı görüntüler Resim 4.5-Resim 4.15’de verilmiştir. Bu
analizlerde, nanopartikülleri kurşun sitrat ve uranil asetat gibi ağır metal tuzlarından ayırt
edebilmek amacıyla ince kesitler boyanmamıştır. İncelemelerde, CuO nanopartiküllerinin
her hücre duvarlarında biriktiği ve sitoplazmaya geçiş yaptığı belirlenmiştir. Sitoplazmada
nanopartiküllerin tutundukları bazı yapılar veya organeller net seçilememiştir. Ancak,
nanopartiküllerin
golgi
kompleklerine,
mitokondrilere
ve
granüllü
endoplazmik
retikulumlara ve hatta vakuollere penetre olabildikleri belirlenmiştir. Sitoplazmadaki bazı
nanopartiküllerin komşu hücreler arasında plazmodezmalar vasıtasıyla geçiş yaptıkları da
net bir şekilde gözlenmiştir. Nanopartiküllerin çekirdeğe de geçiş yapabildikleri, genellikle
kromatinlere tutunmuş halde bulundukları, özellikle heterokromatin bölgelerinde
yoğunlaştıkları belirlenmiştir. Bu gözlemler tüm uygulama sürelerinde elde edilmiştir. 24
saatlik muamelede NP yoğunluğunun daha seyrek olduğu, 48 ve 72 saatlik uygulamalarda
özellikle çekirdeğe, partiküllerin daha yoğun olarak geçiş yaptığı gözlenmiştir. 100
µg/ml’lik konsantrasyonun 72 saatlik muamelesinde partikül yoğunluğuna bağlı olarak
hücre bütünlüğünde bozulmalar olduğu ve vakuollerin içinde, nanopartikülün etkisine
bağlı olarak lifli bir oluşum gözlenmiştir.
2
-
7
Kontrol
Pozitif Kontrol
25
50
75
100
Kontrol
Pozitif Kontrol
25
50
75
100
Kontrol
Pozitif Kontrol
25
50
75
100
Toplam
24
48
72
20
8
2
2
-
14
1
2
3
4
8
7
3
-
Yapışıklık
*P < 0,01 (χ2 test), **P < 0,001 (χ2 test)
1
2
1
1
CuO
Konsantrasyon
(μg/ml)
Genetik materyal
Kaybı
Süre
(saat)
Yapısı bozulmuş
profaz
16
7
1
1
3
1
1
1
1
1
1
C-metafaz
120
21
2
1
3
-
1
22
2
7
72
1
1
24
1
1
22
8
Yapışıklık
46
3
2
12
5
3
4
2
5
7
3
2
2
4
3
5
2
Kromozom
gruplaşması
8
-
4
1
1
-
1
1
14
4
1
1
1
2
2
2
2
Geri kalmış
kromozom
Gözlenen Anormallikler
Yapısı bozulmuş
metafaz
10
2
2
-
3
3
-
Diğer
2
2
1
-
-
1
-
İleri gitme
102
6
2
10
25
12
8
4
6
9
10
4
3
2
7
8
1
2
Yapısı bozulmuş
Anafaz-Telofaz
54
8
2
8
5
4
-
18
1
9
11
3
2
7
1
6
4
1
1
Multipolarite
2
-
1
-
1
-
Köprü
10
1
1
-
2
1
-
3
1
1
-
3
2
-
-
1
-
11
2
-
1
1
2
2
-
1
3
-
Star anafaz
3
-
1
-
2
-
Anafaz-Telofaz
Geri kalmış
kromozom
Metafaz
Kutupsal sapma
Profaz
5
3
-
1
1
-
-
Asenkron bölünme
Çizelge 4.2. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa’da kromozomal anormallikler üzerine etkisi
Fragment
2
2
-
-
-
Yapışıklık
8
1
2
-
2
1
2
1
Diğer
7
1
-
1
1
1
1
2
1
-
4,59
56,67**
16,30**
15,94**
12,44**
18,18*
6,60
51,11**
12,22*
12,98**
38,75**
19,79**
5,41
81,90**
16,33**
14,81**
40,70**
28,36**
Anormal
Hücre
(%)
0,05
0,52
0,17
0,17
0,13
0,18
0,07
0,51
0,13
0,13
0,40
0,21
0,05
0,53
0,17
0,16
0,43
0,28
KA/
Hüc
re
0,02
0,08
0,09
0,08
0,10
0,04
0,04
0,02
0,13
0,11
0,04
0,04
Anormal
İnterfaz
Hücre
(%)
0,11
0,12
0,21
0,04
0,10
0,08
39
39
40
A
B
C
D
Resim 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da profazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal profaz, B: Yapısı bozulmuş profaz, C: Genetik
materyal kaybı, D: Yapışıklık
A
B
C
D
Resim 4.2. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal metafaz, B-C: Metafazda kromozom gruplaşmaları,
D: Yapısı bozulmuş metafaz
41
E
F
G
H
Resim 4.2. (devam) CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği
anormallikler. E: C-Metafaz, F: Yapışıklık, G: Kromozom kaybı H:
Kromozom kırığı
A
C
B
D
Resim 4.3. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anafaz-telofazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal telofaz , B: Yapısı bozulmuş anafaz, C:Geri kalmış
kromozom, D: Multipolarite
42
E
F
G
H
I
İ
J
K
Resim 4.3. (devam) CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anafazda meydana getirdiği
anormallikler. E:Fragment , F: Kutupsal sapma, G: Yapışıklık, H: Köprü, I:
İleri gitme, İ: Asenkron bölünme, J: Star anafaz, K: Multipolarite
43
A
B
C
D
Resim 4.4. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Binükleat, B: Tomurcuklanma, C: Halter Şekilli çekirdek, D:
Mikroçekirdek
44
A
B
Resim 4.5. Kontrol grubundaki Allium cepa kök uçları. A: Genel görünüm, B: Bir
hücrenin görüntüsü
45
A
B
Resim 4.6. A: Allium cepa’da hücre duvarlarınnda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24
saat). B: A’nın büyütülmüş hali
A
B
Resim 4.7. A: Allium cepa’da plazmodezmalalarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24
saat). B: A’nın büyütülmüş hali
46
M
G
ER
X
Resim 4.8. Allium cepa’da mitokondri (M), golgi cisimciği (G), endoplazmik retikulum
(ER) ve diğer yapılardaki (X) CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat)
B
A
Resim 4.9. A: Allium cepa’da çekirdeğin heterokromatin bölgesinde CuO nanopartikülleri
(100 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali
47
A
B
Resim 4.10. A: Allium cepa’da kofullarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 72 saat). B:
A’nın büyütülmüş hali
A
B
Resim 4.11. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 48
saat). B: A’nın büyütülmüş hali
48
B
A
Resim 4.12. A: Allium cepa’da mitokondrilerde CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 72 saat).
B: A’nın büyütülmüş hali
A
M
ER
B
Resim 4.13. A: Allium cepa’da mitokondri (M), endoplazmik retikulum (ER) ve
sitoplazmada CuO nanopartikülleri (25µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş
hali
49
A
B
Resim 4.14. A: Alium cepa’da CuO nanopartiküllerinin hücre membranında oluşturduğu
hasar (100 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali
B
A
Resim 4.15. A: Allium cepa’da hücre duvarlarında CuO nanopartikülleri (100 µg/ml, 24
saat,). B: A’nın büyütülmüş hali
50
4.2. SiO2 Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri
Mitotik indeks ve faz frekansları: SiO2 nanopartiküllerinin 50, 250, 500 ve 1000 µg\µl’lik
konsantrasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik uygulamalarının Allium cepa
kök ucu
hücrelerinde mitotik indeks ve mitotik fazla frekanslarına etkisi Çizelge 4.3’te, gözlenen
anormallikler ve frekansları ise Çizelge 4.4’te gösterilmiştir.
Mitoz bölünme geçiren hücre sayısının toplam hücrelere yüzde cinsinden oranı ile
belirlenen Mİ, SiO2 nanopartiküllerinin 24 saatlik muamelesi sonucunda 500 µg/ml’lik
konsantrasyon dışındaki diğer konsantrasyonlarda kontrole kıyasla bir düşüş göstermiş
fakat bu düşüş sadece 50 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlarda anlamlı düzeye ulaşmıştır.
48 saatlik uygulamada 500 µg/ml’lik konsantrasyon, kontrole kıyasla Mİ’te çok az bir
artışa sebep olmuştur. Diğer tüm konsantrasyonlarda Mİ’te düşüş gözlenmiştir fakat bu
düşüş sadece 1000 µg/ml’lik konsantrasyonda anlamlı bir düzeye ulaşmıştır. 24 ve 48
saatlik uygulamalarda 1000 µg/ml’lik konsantrasyonun Mİ’teki etkisinin pozitif kontrolden
bile daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 72 saatlik uygulamada ise 250 µg/ml’lik
konsantrasyon dışındaki diğer tüm konsantrasyonlar Mİ’te bir miktar azalmaya sebep
olmuştur ancak sadece 50 µg/ml’lik konsantrasyonda anlamlı bir farklılık olduğu
belirlenmiştir.
SiO2 nanopartikülleri Allium cepa da, 24 ve 48 saatlik uygulamalarda kontrole kıyasla
sadece 1000 µg\µl konsantrasyonda tüm mitotik faz frekanslarında azalmaya sebep
olmuştur. Bu azalmalar 24 saatlik uygulamada profazda yaklaşık 1/4, metafazda 1/2,
anafazda 1/4, telofazda ise 1/3 oranındadır. 48 saatlik uygulamada faz frekanslarındaki
azalmaların profaz, metafaz ve telofazda yaklaşık 1/2, anafazda ise 1/3 oranında olduğu
belirlenmiştir. 72 saatlik uygulamada ise 50 ve 1000 µg\µl’lik konsantrasyonlar bütün
fazlarda azalmalara sebep olmuştur. 250 ve 500 µg/ml’lik konsantrasyonlar anafazda bir
miktar artışa sebep olmuştur.
51
Çizelge 4.3. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların frekansı
ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi
İncelenen
Hücre
Sayısı
Bölünen
Hücre
Sayısı
Profaz
(%)
Metefaz
(%)
Anafaz
(%)
Telofaz
(%)
MI
(%)±SE
24h
Kontrol
Pozitif Kontrol
50
250
500
1000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
238
125
175
200
259
88
2,46
1,56
1,52
1,76
2,06
0,74
1,10
0,54
0,68
1,06
1,38
0,64
0,48
0,20
0,44
0,30
0,54
0,14
0,72
0,20
0,86
0,88
1,20
0,24
4,76±0,30
2,50±0,22***
3,50±0,26**
4,00±0,28
5,18±0,31
1,76±0,18***
48h
Kontrol
Pozitif Kontrol
50
250
500
1000
5000
5000
5000
5000
5000
5000
255
233
245
237
267
137
2,30
2,52
1,62
1,78
2,04
1,16
1,40
1,68
1,56
1,20
1,38
0,66
0,50
0,04
0,44
0,36
0,64
0,20
0,90
0,42
1,28
1,40
1,28
0,72
5,10±0,31
4,66±0,30
4,90±0,31
4,74±0,30
5,34±0,32
2,74±0,23***
349
134
250
352
313
310
2,40
1,38
1,96
2,40
1,58
2,30
2,50
0,62
1,64
2,22
2,28
2,08
0,56
0,12
0,52
0,94
1,04
0,48
1,52
0,56
0,88
1,48
1,36
1,34
6,98±0,36
2,68±0,23***
5,00±0,31***
7,04±0,36
6,26±0,34
6,20±0,34
Konsantrasyon
(µg\µl)
72h
Kontrol
5000
Pozitif Kontrol 5000
50
5000
250
5000
500
5000
1000
5000
** P < 0.01, *** P < 0.001
Kromozomal anormallikler: SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa kök ucu hücrelerinde
meydana getirdiği anormallikler, bunların frekansları, hücre başına düşen kromozom
anormalliği sayısı (KA/Hücre) ve anormal interfaz hücrelerinin frekansı Çizelge 4.4’te
gösterilmiştir.
SiO2 nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve bütün uygulama süreleri, A. cepa kök
uçlarında kromozomal anormallik frekansında, kontrole kıyasla anlamlı bir artış
oluşturmuştur (Şekil 4.2). Bu artış, 24 ve 48 saatlik uygulamalarda doz artışına bağlıdır.
Anormallik frekansı, 24 saatlik uygulamada en yüksek dozda kontrole kıyasla yaklaşık 3
kat, 48 saatlik uygulamada ise yaklaşık 5 kat artış göstermiştir. 72 saatlik uygulamada en
yüksek anormallik frekansı 50 µg\µl’lik konsantrasyonda gerçekleşmiş ve kontrole kıyasla
yaklaşık 4 kat artış göstermiştir. Anormal interfaz hücrelerinin frekansları 24 saatlik
uygulamada 50 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlarda kontrole kıyasla artış göstermiştir.
Bu frekans, 48 ve 72 saatlik uygulamalarda bütün konsantrasyonlarda kontrole kıyasla
yükselmiştir. 48 saatlik uygulamada en yüksek anormal interfaz hücre frekansı 500
µg/ml’de, 72 saatlik uygulamada ise 250 µg/ml’de gözlenmiştir. Hücre başına düşen
anormallik sayısı 24 ve 48 saatlik uygulamalarda kontrole kıyasla konsantrasyona bağlı bir
artış göstermiştir. Bu artış kontrole kıyasla en yüksek konsantrasyonda 24 saatte 3 kat ve
52
48 saatte ise 5 kata kadar olmuştur. 72 saatlik uygulamada ise hücre başına düşen
anormallik sayısı kontrole kıyasla tüm konsantrasyonlarda artmış ve en yüksek frekans 50
Frekans
µg/ml’de elde edilmiştir.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
24
48
72
Kontrol
Kontrol
H2O2
H2O2
5050
250
250
500
500
1000
1000
Konsantrasyon (µg/ml)
Şekil 4.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı üzerine etkisi
SiO2 nanopartiküllerinin A. cepa da, mitoz bölünmenin değişik fazlarında oluşturduğu
anormallik çeşitleri Resim 4.3’te gösterilmiştir. Profaz safhasında, gözlenme sıklığına göre
sırasıyla yapışıklık, yapısal bozukluklar ve genetik materyalde kayıplar meydana gelmiştir
(Resim 4.16). Metafazda en çok gözlenen anormallikler sırasıyla yapışıklık, C-metafaz,
yapısal bozukluklar, geri kalmış kromozomlar, fragment, kromozom gruplaşmaları,
kromozom kırığı gibi yapısal anormalliklerin dışında, 48 saatlik uygulamada en yüksek
konsantrasyonda sayısal anormalliklerden olan poliploidi de gözlenmiştir (Resim 4.17).
Anafaz-telofazda en sık gözlenen anormallikler sırasıyla ileri gitme, bir kromozomda
birden fazla hasarı temsil eden diğer kategorisi (multipolarlık+geri kalmış kromozom,
köprü+ileri gitme, köprü+ileri gitme+geri kalmış kromozom, ileri gitme+kromozom kırığı,
köprü+yapışıklık, ileri gitme+geri kalmış kromozom, köprü+kutupsal sapma), yapısı
bozulmuş bölünme, geri kalmış kromozom, yapışıklık, köprü, multipolarlık, fragment ve
star anafazdır (Resim 4.18). İnterfazdaki anormalliklerden en sık gözleneni binükleat
hücrelerdir (42). Bunun dışında tomurcuklanma (15) ve mikroçekirdek (13) oluşumları da
gözlenmiştir (Resim 4.19).
53
TEM
analizi:
Silika
nanopartiküllerinin
50,
250,
500
ve
1000
µg/ml’lik
konsantrasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik muamelelerinin Allium cepa kök uçlarındaki
etkileri TEM ile incelenmiş ve bunlara ait seçilen bazı görüntüler Resim 4.20- Resim
4.29’da verilmiştir. Bu nanoapartiküllerin özellikle hücre duvarlarına ve plazma
membranlarına yoğun olarak biriktiği ve bu birikimin muamele süresi ve konsantrasyon
artışıyla doğru orantılı olduğu belirlenmiştir. Plazmodezmalarda da yoğunlaşan bu
nanopartiküller, sitoplazmaya da ulaşabilmiştir. SiO2 nanopartiküllerinin koful, çekirdek ve
mitokondriye de girebildikleri belirlenmiştir. Çekirdekte özellikle heterokromatin
bölgelere tutundukları, koful ve hücre duvarlarında yoğun kümeler oluşturdukları ve
mitokondrilere tutunabildikleri kolayca görülmektedir.
Kontrol
Pozitif Kontrol
50
250
500
1000
Kontrol
Pozitif Kontrol
50
250
500
1000
Kontrol
Pozitif Kontrol
50
250
500
1000
24
48
72
Toplam
*P < 0,001 (χ2 test)
SiO2
Konsantrasyon
(µg/ml )
Süre
(saat)
Genetik materyl Kaybı
9
1
1
-
2
1
1
-
1
4
2
Yapışıklık
29
7
1
3
2
-
12
3
2
3
5
1
23
9
1
Yapısı bozulmuş profaz
15
1
6
1
2
1
-
1
1
4
1
-
C-metafaz
29
2
3
1
1
1
52
-
2
14
9
6
8
Yapışıklık
70
10
10
14
5
8
1
14
2
3
12
6
5
6
2
2
6
-
Krmozom gruplaşması
5
1
2
2
-
-
Geri kalmış kromozom
18
3
2
2
6
3
3
1
1
1
1
1
-
22
5
1
1
2
2
1
4
3
3
Yapısı bozulmuş
metafaz
Fragment
7
1
2
-
1
1
2
Kromozom kırığı
1
-
1
-
Poliploidi
1
-
1
-
Enderoduplikasyon
-
-
1
-
-
İleri gitme
99
9
5
6
8
9
8
5
5
11
14
9
5
5
2
7
3
16
3
Yapısı bozulmuş
Aanafaz-Telofaz
59
7
2
10
8
10
8
4
4
5
6
2
9
1
4
1
-
Multipolarite
6
1
1
1
1
-
1
-
1
1
14
4
2
1
1
2
1
1
1
2
1
1
3
2
3
1
1
Anafaz-Telofaz
40
3
3
9
7
7
1
1
1
4
2
2
2
3
1
Geri kalmış kromozom
Metafaz
17
1
2
3
4
2
1
1
3
-
1
3
-
Kutupsal sapma
Gözlenen Anormallikler
Profaz
Köprü
Çizelge 4.4. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da kromozomal anormallikler üzerine etkisi
54
1
1
-
-
-
Star anafaz
Asenkron bölünme
-
4
-
-
-
Fragment
4
-
1
2
-
1
2
-
Yapışıklık
15
1
3
2
1
1
1
1
-
2
6
1
Diğer
48
1
2
3
2
-
1
4
8
7
5
4
1
4
9
3
5,73
33,58*
20,40*
15,91*
15,02*
16,45*
5,10
40,34*
13,88*
16,46*
17,98*
24,09*
11,35
45,60*
16,57*
21,50*
22,78*
29,55*
Anormal
Hücre
(%)
0,06
0,34
0,21
0,18
0,16
0,16
0,05
0,41
0,16
0,19
0,21
0,28
0,11
0,49
0,18
0,24
0,23
0,34
KA/
Hücre
0,09
0,06
0,04
0,26
0,13
0,17
0,06
0,21
0,19
0,15
0,25
0,21
Anormal
İnterfaz
Hücre
(%)
0,08
0,14
0,15
0,00
0,00
0,14
54
55
A
B
C
D
Resim 4.16. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da profazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal profaz, B: Genetik materyal kaybı, C: Yapısı
bozulmuş profaz, D: Yapışıklık
A
B
C
D
Resim 4.17. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Normal metafaz, B: Yapısı bozulmuş metafaz, C:
Kromozom gruplaşması, D: C-Metafaz
56
E
F
G
H
Resim 4.17. (devam) SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği
anormallikler. E: Kromozom kırığı, F: Yapışıklık, G: Fragment, H: Poliploidi
A
B
C
D
Resim 4.18. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana getirdiği
anormallikler. A-B: Normal anafaz, C: Normal telofaz, D: Yapısı bozulmuş
anafaz
57
E
F
G
H
I
İ
J
K
Resim 4.18. (devam). SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana
getirdiği anormallikler. E:Yapısı bozulmuş anafaz-telofaz, F: Geri kalmış
kromozom, G-H: Köprü, I: Fragment, İ:Yapışıklık, J: İleri gitme, K: Star
anafaz
58
L
N
M
O
Resim 4.18.(devam) SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana
getirdiği anormallikler. L: Kutupsal sapma, M: Kromozom kırığı, N- O:
Multipolarite
A
B
C
D
Resim 4.19. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği
anormallikler. A: Binükleat, B-C: Tomurcuklanma, D: Mikroçekirdek
59
B
A
Resim 4.20. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılardaki SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24
saat). B:A’nın büyütülmüş hali
Resim 4.21. Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml, 24 saat)
60
Resim 4.22. Allium cepa’da farklı bir hücre çekirdeğinde SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml,
24 saat).
A
B
Resim 4.23. A: Allium cepa’da hücre duvarında biriken SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml,
24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali
61
Resim 4.24. Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat).
A
B
Resim 4.25. A: Allium cepa’da hücre dışında SiO2 nanopartiküllerinin yoğunlaşması (500
µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali
62
A
B
Resim 4.26. A: Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 24
saat). B: A’nın büyütülmüş hali
A
B
Resim 4.27. A: Allium cepa’da plazmodezmada SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 72
saat). B: A’nın büyütülmüş hali
63
A
M
G
B
Resim 4.28. A: Allium cepa’da sitoplazma, golgi cisimciği (G) ve mitokondride (M) SiO2
nanopartikülleri (500 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali
A
B
Resim 4.29. A: Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 48 saat). B:
A’nın büyütülmüş hali
64
65
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
Nanoteknolojinin hızlı bir şekilde ilerlemesiyle ticari amaçlar için nano boyutlu
partiküllerin kullanımı da hızla artmaktadır. Nanopartiküller, savunma sanayii, otomotiv
sanayii, tarım, tıp, testil, gıda endüstrisi, kozmetik ve çevresel sorunların iyileştirilmesi
gibi alanlarda kullanılmakta olup nanoteknolojinin yakında bir trilyon dolarlık bir endüstri
haline geleceği ön görülmektedir. Nanoteknolojinin bu kadar gelişmesi ekonomi, sağlık ve
çevre
üzerinde
de
önemli
etkiler
oluşturmaktadır.
Bu
teknolojide
kullanılan
nanopartiküllerin özellikle çevre ve sağlık üzerindeki potansiyel etkilerinin, bunların ticari
olarak yaygınlaştırılmasından önce değerlendirilmesi oldukça önemli bir husustur (Nel,
Xia, Madler ve Li, 2006).
Günümüzde nanopartiküllerin potansiyel etkileri konusunda çok çeşitli açılardan
incelemeler yapılmaktadır fakat bunlar henüz yetersiz kalmaktadır. Daha büyük boyutlu
olanlarına göre nano boyuttaki maddelerin kazandıkları yeni fizikokimyasal karakterler,
bunların hücresel alımlarını, hücre içi lokalizasyonlarını, hücre ve dokularla etkileşimlerini
ve toksisitelerini de etkilemektedir. Bunların dışında nanopartikülün büyüklüğü, şekli,
yüzey alanı, yüzeyin kimyasal yapısı, aglomerasyon durumu, kullanılan hücre tipi, in
vivo/in vitro koşullarda uygulanması, uygulama konsantrasyonu, uygulama süresi,
kullanılan değerlendirme testleri gibi pek çok parametreler de nanopartiküllerin toksik
etkilerini değiştirmektedir (Auffan ve diğerleri, 2006; Stone ve diğerleri,. 2010). Bütün bu
parametreler nedeni ile nanopartiküllerin toksik ve genotoksik etkileri konusunda yapılan
çalışmalarda çelişkili sonuçlar gözlenmekte ve bunların güvenliği konusunda farklı
yorumlar yapılmaktadır.
Nano malzemelerin toksikolojik reaksiyonları, ilgili malzemedeki iyonların ulaşacağı
hücresel elemanlardaki (sitoplazma, çekirdek, mitokondri, lizozom) etkinliğine de bağlıdır
(Hanagata ve diğerleri, 2011). Nano CuO ve mikron boyutlu CuO'ten salınan bakırın
etkilerinin kıyaslandığı bir çalışmada, en belirgin çözünmenin lizozomal sıvıda olduğu ve
nano boyutun mikro boyuttan daha fazla yayıldığı belirtilmiştir (Semisch ve diğerleri,
2014). Silikanın nano boyutunun mikron boyutuna kıyasla daha toksik olduğu ve
lizozomlarda birikebildiği gözlenmiştir (Al-Rawi, Diabate ve Weiss, 2011). Silika
nanopartiküllerinin 21 nm boyutunun insan karaciğer hücre hattında apoptozisi indüklediği
belirlenmiştir (Ye ve diğerleri, 2010). Gümüş nanopartiküllerinin 18 nm boyutunun
66
ratlarda akciğer hasarına sebep olduğu ve kronik alveolar inflamasyon ve küçük akciğer
lezyonları ortaya çıkardığı bildirilmiştir (Sung ve diğerleri, 2008). Karbon nanotüplerinin
etkisiyle, mitokondri aracılı ROT’lerinin fagositik hücrelerde inflamasyona sebep olduğu
rapor edilmiştir (Shvedova ve diğerleri, 2012). Bunun dışında nanopartiküllere maruziyetin
artmasının ciddi sağlık sorunları oluşturabileceği de belirtilmektedir. Örneğin, SiO2
maruziyetinin silikozis ve akciğer kanseri başta olmak üzere, oto-immün hastalıklardan,
skleroderma, romatizmal artrit, sistemik lupus eritematoz gibi hastalıklara katkı yaptığı
düşünülmektedir (Noonan, Pfau, Larson ve Spence, 2006). Ayrıca çekirdeğe ulaşabilen
silika nanaopartikülleri nörodejeneratif bozukluklar oluşturabilmektedir (Chen ve Mikecz,
2005).
Yapılan literatür taramalarında nanopartiküller ile ilgili çalışmaların her geçen arttığı
gözlenmektedir. Özellikle metal oksit nanopartikülleri çok değişik alanlarda kullanıldığı
için, bunlarla ilgili toksisite, özellikle genotoksisite çalışmaları da giderek artış
göstermektedir. Metal oksit nanopartikülleri, fizikokimyasal özelliklerine ek olarak
oldukça farklı biyolojik etkinlikler de göstermektedir. Metal oksit nanopartiküllerinin
genotoksik etkilerinin incelenmesinde genellikle fare, sıçan, çin hamster ovaryumu, insan
lenfositleri, akciğer hücre hattı, endotel hücre hattı, makrofaj-nötrofil hücre hattı,
epidermal keratinosit hücre hattı, embriyonik üreme hücre hattı, bazı mikroorganizmalar
ve Vicia faba, Allium sativum ve Allium cepa gibi bazı bitki türleri kullanılmaktadır. Bu tez
çalışmasında, bir çok kullanım alanı olan metal oksit nanopartiküllerinden CuO ve SiO2
nanopartiküllerinin Allium cepa’da oluşturabileceği genotoksik etkiler araştırılmıştır. Bu
etkilerin değerlendirilmesinde Birleşik Devletler Çevre Koruma Ajansı Genetik
Toksikoloji
programı
(US-EPA-Gene-Tox)
tarafından
çevresel
risklerin
değerlendirilmesinde en güvenilir test olarak seçilen Allium testi kullanılmıştır. Bu test,
hem mitotik indeksteki değişikliklerin ve mitoz bölünmede oluşan anormalliklerin ve hem
de kromozomal anormalliklerin aynı anda belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Geçmişten
günümüze doğaya salınan bir çok ekzojenin başta insan olmak üzere diğer canlılar ve çevre
üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla pek çok test kullanılmaktadır. Allium testi
bunlardan biri olup, pestisitlerin, gıda katkı maddelerinin, çeşitli ilaç etken maddelerinin ve
günümüzde neredeyse her alanda kullanılmaya başlanan ve bitkilerin yaşam döngülerine
de katılabilen mühendislik ürünü nanomalzemelerin etkilerinin değerlendirilmesi için de
güvenilir bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda Allium testi ile gümüş (Kumari
ve diğerleri, 2009), ZnO (Kumari ve diğerleri, 2011), TiO2 (Ghosh ve diğerleri, 2010) ve
67
çok duvarlı karbon nanotüleri (Gosh, Chakraborty, Bandyopadhyay ve Mukherjee, 2011)
gibi çeşitli nanopartiküllerin genotoksik etkileri incelenmiştir.
Nanopartiküllerin bitkilerde veya diğer organizmalardaki genotoksik etkilerini araştırmak
amacı ile kullanılan konsantrasyonların seçimi rastgele (Liman, 2013) yapılabildiği gibi,
söz konusu nanopartiküle maruz bırakılan Allium cepa kök ucu hücrelerinde kontrole
kıyasla büyümeyi %50 oranında azaltan konsantrasyon (EC50) dikkate alınarak da (Ghosh
ve diğerleri, 2010) yapılmaktadır. Bu çalışmada kullanılan konsantrasyonlar, daha önce
Saygılı (Saygılı, 2014) tarafından insan lenfositlerinde mitotik indeks üzerine etkileri
dikkate alınarak belirlenen ve genotoksik etkilerini değerlendirmek amacı ile kullanılan
konsantrasyonlardır. Bu konsantrasyonlar CuO nanopartikülleri için, 25, 50, 75 ve 100
µg/ml ve SiO2 nanopartikülleri için 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlardır.
Literatürde Allium cepa da nanopartiküllerin farklı konsantrasyonları ile yapılmış
çalışmalar mevcuttur. Örneğin, TiO2 NP’lerinin 2, 4, 6, 8 ve 10 mM (Ghosh ve diğerleri,
2010), MWCNT’lerinin 10, 20 ve 50 µg/ml (Gosh ve diğerleri, 2011), gümüş (Kumari ve
diğerleri, 2009) ve ZnO NP’lerinin (Kumari ve diğerleri, 2011) 25, 50, 75 ve 100 µg/ml,
bizmut (Liman, 2013) ve TiO2 NP’lerinin (Pakrashi ve diğerleri, 2014) 12,5, 25, 50, 75 ve
100 µg/ml’lik konsantrasyonları kullanılmıştır. Kullanılan nanopartiküllerin boyutları
genellikle 100 nm’nin altında olmakla beraber, mikron boyutlu partiküller de
değerlendirilmektedir (Ghosh ve diğerleri, 2010; Karlsson ve diğerleri, 2009; Kumari ve
diğerleri, 2009; Semisch ve diğerleri, 2014). Bu tez çalışmasında kullanılan ve ticari olarak
temin edilen CuO nanopartikülleri < 50 nm ve SiO2 nanopartikülleri ise ortalama 12
nm’dir.
Yapılan
araştırmalarda
nanopartiküllerin
sulu
süspansiyonlarının
hazırlanmasında
genellikle deiyonize su (Kumari ve diğerleri, 2009), bidistile su (Ghosh ve diğerleri, 2010)
veya distile su (Liman, 2013) kullanılmaktadır. Muamele işlemi ise genelde saksıda
toprağa verilerek (Ghosh ve diğerleri, 2010) veya tüp içindeki nanopartiküllü süspansiyona
soğan köklerinin direkt daldırılması yolu ile yapılmaktadır (Kumari ve diğerleri, 2009).
Bitkilerin nanopartiküller ile muamelesinde genellikle 4, 12 ve 24 saatlik süreler
kullanılmıştır (Ghosh ve diğerleri, 2010; Kumari ve diğerleri, 2009; Liman, 2013). Yapılan
bir başka çalışmada muamele süresini takiben, 24 saatlik iyileştirme periyodu
uygulanmıştır (Ghosh ve diğerleri, 2011). Bu tez çalışmasında hem CuO ve hem de SiO2
nanopartiküllerinin sulu süspansiyonlarının hazırlanmasında deiyonize su kullanılmıştır.
68
Deiyonize su, nanopartiküllerin dağılmasında daha homojen bir ortam oluşturduğu için
tercih edilmiştir (Saygılı, 2014). Bir gece suda bekletilen ve kökleri yaklaşık 2 cm kadar
uzayan Allium cepa yumruları, bu nanopartiküllerin sulu süspansiyonunu içeren tüplerde
24, 48 ve 72 saat muamele edilmiştir. Allium cepa da hücre çemberinin yaklaşık 24 saatte
tamamlandığı (Rank ve Nielsen, 1997) göz önüne alınarak, uygulama süreleri 24 saat ve
katları şeklinde seçilmiştir.
Bu araştırmada CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa daki genotoksik etkilerinin
değerlendirilmesi amacı ile mitotik indeks, mitotik fazların frekansları, mitoz bölünmede
ve
kromozomlarda
meydana
gelen
anormallikler
ve
interfazdaki
anormallikler
değerlendirilmiştir. Mitotik indeksin belirlenmesinde her bir preparatta 1000 hücre olmak
üzere beş ayrı kök ucundan hazırlanan 5 preparatta toplam 5000 hücre incelenmiştir. CuO
nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve uygulama süreleri Allium cepa kök ucu
hücrelerinde mitotik indeksi kontrole göre anlamlı düzeyde düşürmüştür. Bu düşüş, 48 ile
72 saatlik uygulama sürelerinde doza bağlıdır. SiO2 nanopartiküllerine maruz kalan Allium
cepa kök uçlarında da mitotik indekste, birkaç uygulama dışında, genellikle azalma
gözlenmiştir. Ancak bu azalma, kontrole kıyasla, 24 saatlik uygulamada 50 ve 1000
µg/ml’de, 48 saatlik uygulamada sadece 1000 µg/ml’de, 72 saatlik uygulamada ise sadece
50 µg/ml’de anlamlı düzeydedir. 24 ve 48 saatlik uygulamada 500 µg/ml, 72 saatlik
uygulamada 250 µg/ml’lik konsantrasyonlar, mitotik indekste küçük bir artışa sebep
olmuştur. Mitotik indekste anlamlı azalmaların gözlendiği konsantrasyonlar, Allium cepa
kök ucu hücrelerinde mitodepresif etki oluşturmuştur. CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin
mitotik indekste oluşturduğu düşüşün sebebi, bu nanopartiküllerin güçlü toksik etkisinden
kaynaklanmaktadır. Mitotik indeks, hücre bölünme sıklığının tahminini sağlayan bir
parametre olarak kabul edilmektedir (Goujon ve diğerleri, 2014). Nanomateryal kaynaklı
toksik etki DNA’da ciddi hasarlar oluşturmuş ve hücre döngüsündeki geçişleri yavaşlatmış
olabilir. Mitotik indeksteki azalma, hücre çoğalmasının azaldığının göstergesidir (Webster
ve Davidson, 1969). Toksik etkili bir maddeye maruz kalan hücrelerde, DNA’da meydana
gelen hasarın döngüdeki yerine göre, hücre döngüsü kontrol noktaları G1’den S fazına
veya G2’den mitoza geçişi engeller. DNA’da meydana gelen bir hasar DNA sentezini ve
dolayısıyla RNA ve protein sentezini de inhibe edebilir. DNA’sı replike olmamış
hücrelerde kinaz komplekslerinin inaktivasyonu ile mitoza giriş engellenir (Vermeulen,
Van Bockstaele ve Berneman, 2003). Gümüş nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerine
muamelesiyle elde edilen mitotik indeks % 60.30’dan (kontrol) % 27.62’ye varan bir
69
azalma göstermiş ve bu azalmanın sebebinin hücrelerin S fazında birikmesi ve diğer
fazlara geçişlerin engellenmesinden kaynaklandığı ifade edilmiştir (Kumari ve diğerleri,
2009). Gümüş nanopartiküllerinin normal insan akciğer fibroblast hücreleri ve insan
glioblastoma hücrelerine uygulanması sonucunda, bu hücrelerin G2/M safhasında tutuklu
kaldıkları gözlenmiştir. Hücrelerin bu evrede tutuklu kalmasının, DNA hasarından
kaynaklandığı belirtilmiştir (Asharani, Low Kah Mun, Hande ve Valiyaveettil, 2008).
DNA sentezindeki azalmanın bir başka sebebinin enerji üreten merkezin işlevinin
baskılanarak ATP seviyesindeki azalma ile bağlantılı olabileceği bildirilmiştir (Epel,
1963). Bu çalışmada CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa kök ucu hücrelerinde
TEM ile yapılan analizlerde, nanopartiküllerin hem sitoplazma ve çekirdekte ve hem de
mitokondrilerde bulundukları gözlenmiştir. Nanopartiküllerin bu birikiminin, ya direkt
veya indirekt yollarla mitotik indekste azalmaya sebep olduğu görülmektedir. CuO ve SiO 2
nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerinde mitotik indekste oluşturduğu azalmalar, bu
nanopartiküllerin büyüme ve gelişmeyi engelleyici etkili olduğunu göstermektedir.
Nanopartiküller, mitotik indekste değişmelere sebep olduğu gibi, interfazda ve bölünmekte
olan hücrelerde de bazı mitotik ve kromozomal anormalliklere de sebep olmaktadır.
Kromozomal anormallikler, kendiliğinden veya maruz kalınan ekzojen maddenin etkisiyle
oluşabilir. Kromozom sayısı ve/veya yapısındaki anormallikler, DNA kırıkları, DNA
sentezinin inhibisyonu, DNA replikasyonundaki hatalar, RNA ve protein sentezinin inhibe
olması, mitotik ipliklerin etkilenmesi ve kromozomların düzensiz ayrılması gibi
mekanizmalardan kaynaklanmaktadır (Albertini ve diğerleri, 2000; Kaur ve diğerleri,
2014; Türkoğlu, 2012). Ekzojen maddelerin etkisiyle oluşabilecek anormalliklerin Allium
testi
ile
incelenmesinde
bazı
araştırıcılar
sadece
anafaz-telofaz
safhalarındaki
anormallikleri dikkate almaktadır. Bu analizin yeterli, hızlı ve güvenilir sonuçlar verdiği
düşünülmektedir (Rank ve Nielsen, 1994). Fiskesjo, kromozomal anormalliklerin hücre
döngüsünün bütün fazlarında oluşabileceğinden yola çıkarak, bütün fazların göz önüne
alınmasının daha sağlıklı ve güvenilir sonuçlar verdiğini vurgulamıştır. (Fiskesjo, 1985).
Nanopartiküllerin
genotoksik
risklerinin
belirlenmesinde
sadece
anafaz-telofaz
safhalarında oluşabilecek anormallikleri değerlendiren (Ghosh ve diğerleri, 2010; Liman,
2013) veya tüm safhalarda oluşabilecek anormallikleri değerlendiren (Kumari ve diğerleri,
2009, 2010, 2011) çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında kromozomal anormallik
frekansları ve çeşitlerinin belirlenmesinde hücre bölünmesinin tüm safhaları göz önüne
alınmıştır. CuO ve SiO2 nanopartikülleri Allium cepa kök ucu hücrelerinde kromozomal
70
anormalliklerin frekansını bütün konsantrasyonlarda ve bütün uygulama sürelerinde
kontrole kıyasla önemli düzeyde artırmıştır. CuO ve SiO2 NP’leri hücre bölünmesinin
değişik fazlarında çeşitli anormalliklerin oluşmasına sebep olmuştur. Bu iki nanopartikülün
de etkisiyle Allium cepa kök ucu hücrelerinin bütün fazlarında (profaz, metafaz, anafaztelofaz evrelerinde) kromozomlarda yapışıklık ve mitotik fazlarda yapısal bozulmalar,
metafaz ve anafaz-telofazda, fragment ve geri kalmış kromozomlar; metafazda kromozom
kırıkları, C-metafaz, kromozom gruplaşmaları, poliploidi; anafaz-telofazda multipolarite,
kromatin köprüleri, kutupsal sapma, star anafaz, asenkron bölünme ve ileri gitme gibi
mitotik ve kromozomal anormalliklerin oluştuğu belirlenmiştir.
İnterfaz evresini tamamlayıp mitoza girecek hücrelerde, kromozomların mitotik ipliklere
düzgün tutunamamasına duyarlı olan kontrol noktası bulunur. Bu kontrol noktasının
görevini tam olarak yapamaması sonucu bazı anormalliklerin ortaya çıkabileceği
belirtilmiştir (Li ve diğerleri, 1998). Nanopartiküller bölünme sırasında ya mitotik
olaylarla veya kromozomlar ile etkileşime girerek anojenik ve/veya klastojenik etkilere
sebep olmaktadır. Nanopartiküller mekanik veya kimyasal bağlanmalarla, klastojenik
etkiye yol açarak kromozomlar içinde kırıklara veya anojenik etki oluşturarak bütün bir
kromozom kaybına veya mitoz bölünme safhalarında bozulmalara sebep olabilir
(Magdolenova ve diğerleri, 2014). DNA kırıklarından kaynaklanan kromozomal
anormallikler, DNA bütünlüğünü korumak amacı ile DNA tamir mekanizmaları tarafından
onarılmaktadır (Vodicka ve diğerleri, 2004). Fakat bu tamir mekanizmalarının yetersiz
kalması veya görevini yerine getirememesi sonucunda da bazı kromozomal anormallikler
ortaya çıkmaktadır. Fragmentler, kromatit ve kromozom kırıkları sonucunda oluşan
anormalliklerdir. Kromozom köprüleri, kırılan kromozomların yapışkan uçlarının
birleşmesiyle meydana gelmektedir (Chauhan, Dikshith ve Sundararaman, 1986; Patil ve
Bhat, 1992). C-mitoz, kolşisin etkisine benzer şekilde iğ ipliklerinin inhibisyonuna işaret
eder (Badr, 1983; Shahin ve El-Amoodi, 1991; Njagi ve Gopalan, 1982). Multipolarite ve
geri kalmış kromozomlar da iğ ipliklerinin etkilenmesinden oluşmaktadır. Multipolarite
anafazdaki başarısız ayrılma veya eşit olmayan translokasyon sonucu oluşabileceği gibi,
geri kalmış kromozomların kutuplara çekilememesinden de kaynaklanıyor olabilir (Pandey
ve diğerleri, 2014). Geri kalmış kromozomlar (veya kalgın) ve star anafaz gibi
anormalliklerin meydana gelişi, iğ ipliklerinin oluşumunda rol alan mikrotübül
polimerizasyonunun yapılamadığının göstergesi de olabilir (Voutsinas, Zarani ve Kappas,
1997). Yapışıklık, kromozomlar arasındaki kromatin liflerinin dolaşmasıyla veya DNA
71
topoizomeraz gibi periferal proteinlerin etkilenmesiyle oluşabilir (Gaulden, 1987).
Yapışıklık bir kromatid tipi anormallik olabilir ve maruz kalınan ajanın etkisiyle DNA'nın
bozulması veya depolimerizasyonu olarak ifade edilir (Darlington ve McLeish, 1951).
Yapışıklık DNA yoğunlaşması veya kromozomlar arasındaki yoğunlaşma olarak da ifade
edilmektedir (Österberg, Persson ve Bjursell, 1984). Yapışkanlık geri dönüşü olmayan bir
anormallik tipi olup, hücre ölümüne yol açmaktadır (Savage, 1975). İnterfazda ortaya
çıkan binükleat hücreler, hücre plağının inhibe edilmesinden kaynaklanmış olabilir (Ma ve
diğerleri, 1995). Loblu nükleus ve tomurcuklanma ise nanopartiküllerin soğan DNA'sında
morfolojik değişiklikler oluşturabildiklerinin göstergesi olabilir (Tan ve diğerleri, 2014).
İnterfazda gözlenen mikronükleuslar, bu nanopartiküllerin anojenik veya klastojenik
etkilerle
fragment
ve
kromozom
kayıpları
gibi
kromozom
aberasyonları
oluşturabildiklerini göstermektedir (Arora ve diğerleri, 2014; Fernandes ve diğerleri, 2007;
Leme ve diğerleri, 2008).
DNA polimeraz için gerekli olan belirli iyonlarla rekabete giren metaller, DNA tamir
mekanizmalarını önleyerek, dolaylı şekilde DNA hasarına sebep olabilir (CebulskaWasilewska, Panek, Zabinski, Moszczynski ve Au, 2005; Hartwig, 1994). CuO
nanopartikülleri ile yapılan uygulamalar sonucunda anormalliklerin frekansındaki artışın,
CuO nanopartiküllerinden salınan bakırın DNA polimeraz etkinliğini önleyerek, DNA
tamirini aksatması sonucu olabileceği düşünülmektedir. Ayrıca düşük konsantrasyondaki
kimyasallar, dolaylı yoldan genotoksik etkilere sebep olabilir ve kromozomal anormallik
frekansında önemli artışlar oluşturabilir (Vodicka ve diğerleri, 2004). Kimyasal aracılı
meydana gelen kromozom aberasyonlarının, klastojenitenin göstergesi olduğu belirtilmiştir
(Topaktaş ve Rencüzogulları, 1993). Manyetit nanopartiküllerinin, memeli hücrelerinde
oluşturduğu DNA çift zincir kırıklarının, ROT'lerinin etkisi ile doğrudan veya dolaylı
şekilde indüklendiği, MN ve KKD oluşumlarının ise klastojenik etkinin belirteci olduğu
ifade edilmiştir (Kawanishi ve diğerleri, 2012).
Bu çalışmada, hem CuO ve hem de SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerine ve
hücresel
elemanlarına
olası
geçişi
TEM
ile
incelenmiştir.
Muamele
edilen
nanopartiküllerin, boya olarak kullanılan maddeler ile karışıklığını önlemek için ince
kesitler kurşun sitrat ve uranil asetat gibi ağır metal tuzları ile boyanmamıştır. Bu nedenle,
hücre organelleri çok belirgin şekilde ayırt edilmemektedir. Ancak, çekirdek, mitokondri,
granüllü endoplazmik retikulum, golgi kompleksi ve vakuollere nanopartiküllerin penetre
72
olabildikleri
açıkça
ayırt
edilebilmektedir.
Özellikle
hücre
duvarlarında
ve
plazmodezmalarda yoğun bir şekilde tutundukları gözlenmiştir. Gözlenen bu sonuçlara
göre CuO ve SiO2 nanopartikülleri, hücre duvarı ve plazmodezmalar aracılığı ile hücre
içine giriş yapmış olabilir. Ancak bazı çalışmalarda, nanopartiküllerin bitkilerdeki
geçişlerinin, memelilerdeki gibi endositoz aracılığıyla olabileceği belirtilmektedir (Peters
ve diğerleri, 2006). Nanopartiküllerin meydana getirdiği hasar nanopartikülün çekirdeğe
ulaşması sonucu direkt DNA ile etkileşimiyle olabileceği gibi (Ghosh ve diğerleri, 2010),
mitokondrilerin
etkilenmesiyle
oluşabileceği
de
belirlenmiştir.
CuO
ve
SiO2
nanopartiküllerinin özellikle mitokondrilere girebildikleri açıkça görülmektedir. Bu
nedenle, bu nanopartiküllerin meydana getirdiği genetik hasarların mitokondrilerle
bağlantılı olabileceği de düşünülebilir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, nanopartiküllerin
mitokondrilere ulaşabildikleri gösterilmiştir (Asharani, Low-Kah-Mun, Hande ve
Valiyaveettil, 2009). Benzer şekilde ZnO nanopartiküllerinin Allium cepa hücre matriksine
plazmodezmalar
aracılığıyla
girebildikleri
belirlenmiştir.
Apoptozis
ve
DNA
fragmanlarının nanopartikül alımıyla bağlantılı olabileceği bildirilmiştir (Ghosh ve
diğeleri, 2011). ZnO nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerinde yoğun birikimi
sonucunda kromozomlarda ciddi hasarlar oluşturduğu belirlenmiştir (Ghodake, Seo ve Lee,
2011). CuO nanopartikülleri Oryza sativa cv. Swarna hücrelerinde hidroksil radikalleri ve
H2O2 oluşumunu indükler. CuO nanopartiküllerinin oluşturduğu stres, antioksidan
süpürücülerinin
artmasına
sebep
olur.
Koruyucu
mekanizmalara
rağmen,
CuO
nanopartiküllerinin sebep olduğu oksidatif hasar engellenememiştir (Shaw ve Hossain,
2013). TiO2 nanopartiküllerinin de hidroksil radikallerinin oluşumu tetiklediği ve sonuçta
oksidatif stres oluşturarak DNA hasarına sebep olduğu belirlenmiştir (Ghosh ve diğerleri,
2010; Shaw ve Hossain, 2013). Abiyotik stresin de bitkilerde doğrudan ve dolaylı yolla
DNA hasarı oluşturabileceği belirtilmiştir (Kumari ve diğerleri, 2009; Zhang ve diğerleri,
2005). Bitkilerdeki hidroksil radikallerinin lipit peroksidasyonunu tetikleyerek oksidatif
stres oluşturdukları ve biyolojik membran hasarlarına sebep olduğu gözlenmiştir (Zhang ve
diğerleri, 2005).
Nanopartiküllerin
genotoksik
mekanizması
konusunda
bazı
görüşler
vardır.
Nanomateryallerin primer (direkt, indirekt) ve sekonder olmak üzere iki ana mekanizma ile
etkili oldukları düşünülmektedir (Magdolenova ve diğerleri, 2014). Nanopartiküller gibi
ekzojenik ajanların hücresel internalizasyonu ile oluşturabilecekleri primer etki genetik
materyalde ya direkt yada indirekt yolla oluşur. Direkt etkide nanopartiküller DNA ile
73
doğrudan temas haline geçerek, genetik materyalde fiziksel veya kimyasal hasarlar
oluşturur. Nanopartiküller DNA molekülünde bazı alanlarda nükleotiti kararsızlaştırabilir.
Bu nükleotitler DNA tamiri esnasında uzaklaştırılarak abazik alanlar oluşturulabilir.
Replikasyon sırasında polimeraz enziminin nükleotitleri rastgele yerleştirmesinden
kaynaklanan hatalı bazlar gözden kaçarak ifade edilir ve sonuçta nokta mutasyonları veya
zincir kırıkları oluşabilir (Doak ve diğerleri, 2007; Jenkins ve diğerleri, 2005). Direkt etkili
olan nanopartiküller çift heliks arasına yerleşerek DNA replikasyonu sırasında çift zincir
kırıkları veya nükleotit eklemelerine de sebep olabilirler (Ferguson ve Denny, 2007).
Nanomateryaller hücre çekirdeğine penetre olarak veya bölünme sırasında sitoplazmada
serbest kalan DNA ile doğrudan temasa geçer (Berry, De La Fuente, Mullin, Chu ve
Curtis, 2007). Titanyum dioksit, çinko oksit, silika ve kuantum noktaları gibi bazı nano
maddelerle yapılan çalışmalarda bu partiküllerin nükleer bölgelere kadar girebildikleri
gözlenmiştir (Chen ve Mikecz, 2005; Hackenberg ve diğerleri, 2010, 2011; Nabiev ve
diğerleri, 2007; Shukla ve diğerleri, 2011) Buna rağmen nanomateryallerin DNA ile direkt
etkileşim yoluyla hasar oluşturup oluşturmadıkları kesin değildir. Nanopartiküllerin
bitkilerde de direkt olarak DNA ile etkileşime girebildikleri belirlenmiştir. SWCNT’lerin
bitki hücreleri tarafından alınabildikleri ve SWCNT-DNA bileşimi oluşturdukları
belirtilmiştir (Liu ve diğerleri, 2009). Mezoporus silikalarla yapılan bir çalışmada, bunların
protoplastlara alınabildikleri ve DNA'ya ulaşabilme potansiyelleri olduğu gösterilmiştir
(Vivero-Escoto, Slowing, Trewyn ve Lin, 2010).
İndirekt etkili nanopartiküller hücre bölünmesinde rol alan biyomoleküllere etki ederek
genetik hasara yol açarlar. DNA replikasyonu ve hücre bölünmesi gibi süreçler çok sayıda
multifonksiyonlu protein taşıyan süreçlerdir. Bu proteinler dolaylı etki için hedef
noktalardır. Örneğin sentriol, kinetekor ve mikrotübül gibi mekanik ayrılmayı sağlayan
kromozomal yapılar; polimeraz, topoizomeraz gibi DNA replikasyon enzimleri; DNA
tamir enzimleri veya kromozom replikasyonu ve bölünmesi süreçlerindeki hücre döngüsü
kontrol noktalarını içeren sinyal trandüksiyon proteinleri dolaylı etkili ajanlara hedef
olabilen bazı yapılardır (Ferguson ve Denny, 2007). Bu indirekt DNA hasarları oksidatif
stresin indüklenmesiyle de oluşabilir. DNA, lipid veya protein gibi biyomoleküller kolayca
oksidasyona uğrayarak, normal bir yan ürün olan reaktif oksijen türleri oluşturabilir.
Oksidadif hasar, hücre içinde antioksidan düzeyi ile ROT'leri arasındaki dengesizlik
sonucu oluşmaktadır. Bütün bu etkiler DNA lezyonlarına ve son olarak mutasyonlara
sebep olabilir (Cooke, Evans, Dizdaroglu ve Lunec, 2003). Bazı çalışmalarda
74
nanomalzemelerin dolaylı etki ile DNA hasarı oluşturduğu vurgulanmaktadır. Örneğin,
nanosilika özellikle topoizomeraz gibi önemli enzimleri de içeren protein agregasyonuna
sebep olabilir (Chen ve Mikecz, 2005). Ayrıca oral yollu nanopartikül uygulanmasında
karaciğer ve akciğerlerde oksidatif strese bağlı DNA lezyonları görülmüştür (Folkmann ve
diğerleri, 2009). Bitkilerde indirekt etkileşime dair sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır.
CuO nanopartikülleri ve Cu iyonlarının tarım ve çayır bitkilerinde DNA hasarına sebep
olduğu rapor edilmistir. Turp (Raphanus sativus), çok yıllık çim (Lolium perenne) ve yıllık
çimde (Lolium rigidum) CuO nanopartiküllerinin ve Cu iyonlarının sebep olduğu oksidatif
artışların mutajenik DNA lezyonları (7,8-dihidro-8-OxoGuanine, 2,6-diamino-4-hidroksi5-formamidopyrimidine, 4,6 diamino-5-ormamidopyrimidine) oluşturduğu belirlenmiştir
(Atha ve diğerleri, 2012). Hem direkt ve hem de indirekt etkiler sonucu ortaya çıkan
hasarlı oluşumlar gen mutasyonlarına ve sayısal ve/veya yapısal kromozomal
anormalliklere yol açmaktadır.
Sekonder genotoksisite, in vivo olarak bir eksojen ajana/nanopartiküle maruziyet sonucu
bu alandaki nötrofil ve makrofajlar tarafından üretilen ROT’nin indüklediği kronik
inflamasyon cevabıdır. Bu akut iltihap genelikle bağışıklık hücreleri tarafından işgalci
patojenlere karşı vücudu korumaya yönelik bir savunma mekanizmasıdır. Fakat ROT’leri
sonucu oluşan oksidatif stresle serbest radikaller meydana gelir, DNA’yı da içeren
biyomoleküllerde hasarlara yol açar ve sonuçta kronik inflamasyon oluşur (Federico,
Morgillo, Tuccillo, Ciardiello ve Loguercio, 2007). Nanomalzemeler in vitro sistemlerde
herhangi bir genotoksik potansiyel göstermeyebilir fakat bunların in vivo sistemlerde
dokudaki hücrelerin içinde birikmesiyle oluşan ROT'leri tarafından kronik immün yanıt
oluşabilmektedir. Bu tür ikincil genotoksisitenin klasik örneği asbest solunmasıdır. Bu
asbest liflerinin bağışıklık hücreleri tarafından bozunamamaları ve boyutları (çok uzun ve
ince olmaları) sebebiyle fagositozdan kaçarak ikincil genotoksisite oluştururlar. Asbest
insan mesotelyal hücrelerinde nekroza sebep olur. Bunun sonucunda inflamasyon cevapları
meydana gelir. Böylece mesotelyal hücreler kısmen korunmaya çalışılır. Fakat ikincil
genotoksisite aracılı kronik inflamatuvar yanıt sonucunda fibrozis ve en sonda da
mezotelyomaya sebep oldukları görülmüştür (Kane, Jean, Knuutila ve Jaurand,
2014).Yapılan çalışmalarla karbon nanotüpleri ile asbest arasında boy-en ve biyosüreklilik
açısından paralellikler bulunmuştur. MWCNT'lerin periton içine verilmesiyle, asbeste
benzer yanıtlarla inflamasyon oluşturduğu ve granülomaya sebep oldukları belirlenmiştir.
75
Meydana gelen kronik inflamasyon cevapları ile kanser arasında bir bağlantı olabileceği de
düşünülmektedir (Wang ve diğerleri, 2014).
Sonuç olarak nanopartiküllerin kullanım alanlarının bu kadar çok artması bu partiküllere
maruziyeti kaçınılmaz hale getirmiştir. Özellikle metal oksit nanopartikülleri endüstride
çok yaygın kullanım alanı olan nanopartiküllerdir ve benzersiz fizikokimyasal
özelliklerinin yanında, çok farklı biyolojik etkileri de bulunmaktadır. Bu nedenle, metal
oksit nanopartiküllerinin etkilerinin neler olabileceğinin anlaşılması büyük önem
taşımaktadır. Bu amaçla bir çok çalışma yapılmaktadır ancak nanopartiküllerin etkilerinin
neler olabileceğinin belirlenmesi çok zor olup, günümüzde yapılmış çalışmalar bu etkileri
tam olarak açıklamakta yetersiz kalmaktadır. Çünkü nanopartikül çalışmaları çelişkili
sonuçlar
verebilmektedir.
Gelecekte
nanopartiküllerin
etkilerinin
anlaşılıp
sınıflandırılmasını sağlamak amacıyla, nanopartiküller farklı test sistemlerinde ve farklı
canlılarda çalışılmalıdır. Nanopartiküllere maruziyetin özellikle genetik materyalde
oluşturabileceği etkilerin belirlenmesi çok önemlidir. Çünkü genetik materyalde meydana
gelen değişimler mutasyonları ve hatta kanserli hücrelerin oluşumunu tetikleyebilir.
Nanopartiküllerin
doğrudan
veya
dolaylı
etkilerle
genetik
materyalde
riskler
oluşturabildikleri görülmektedir. Bu nedenle nanopartiküllerin genotoksik riskleri, değişik
test sitemleri ile ayrıntılı olarak incelenmeli ve belirlenmelidir. Bu çalışmalardan elde
edilecek sonuçlar, hem bu partiküllerin genetik materyaldeki risklerinin ve hem de
bunların çok geniş kullanım alanı bulan nanoteknolojideki risklerinin belirlenmesi
açısından büyük önem taşımaktadır.
Yapılan bu çalışmaya göre, hayatımızda yaygın kullanım alanı bulmaya başlayan CuO ve
SiO2 nanopartikülleri, güvenilir bir test sitemi olan Allium cepa da hem mitotik indekste
mitotik fazlarda değişimlere, hem de mitotik evrelerde kromozom anormallikler doğrudan
veya dolaylı mekanizmalarla meydana getirmiştir. Ancak oluşan bu toksik cevaplarda
hangi mekanizmaların etkili olduğunun net bir şekilde ortaya konulması yapılacak
moleküler ve biyokimyasal çalışmalar ile gerçekleştirilebilecektir. Bu nedenle bizim
yaptığımız çalışma sonuçlarından faydalanılarak ileride moleküler veya biyokimya
çalışmaları da yapılabilecektir. Allium cepa’dan elde edilen sonuçların memeli test
sitemlerinden elde edilen sonuçlarla oldukça yakınlık göstermesi nedeni ile, buradan elde
edilen veriler diğer organizmalarda, özellikle insan için de zararlı olabileceğini
göstermektedir. TEM analizi, CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin bitkilere penetre olduğunu
76
göstermiştir. Nanopartiküllerin hücre içi komponentlere ulaşması, hücre bölünmesinde
inhibitör etki oluşturduğu gibi yapışıklık, köprü, fragment, C-mitoz, geri-ileri kromozomlar
ve kromatin köprüleri gibi anormalliklere de sebep olmuştur. Nanopartiküllerin bitki
genetik materyalinde değişim oluşturabilmesi kötü huylu tümör oluşumunu veya bitki
hastalıklarını tetikleyebilir. Hatta bitki mutasyonları oluşturarak gelecek nesillerdeki
bireylerin de bundan etkilenmesine sebep olabilir. Bu etkiler direkt olarak bitki aracılı veya
besin zinciri yoluyla diğer canlıları etkileyerek insanlara kadar ulaşabilir. Bu yüzden
nanopartiküllerin zararlı etkilerinin en aza indirilmesi amacı ile daha fazla çalışma
yapılarak
bir
sağlanmalıdır.
an
önce
Bütün
nanopartiküllerin
bu
bulgular,
sınıflandırılarak
nanomateryallerin
bilinçli
kullanılmaları
genotoksik
risklerinin
belirlenmesinde, çevresel ve ekolojik sistemin bir parçası olan bitkilerin de
değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedir.
Bu çalışmadan elde edilen veriler, nanopartiküllerin genotoksik riskleri konusunda hem
kullanıcıların ve hem de üreticilerin bilgi sahibi olmasını sağlayacaktır. NP’lerin etkilerinin
anlaşılması daha bilinçli ve daha güvenilir bir şekilde kullanılmalarını sağlayacaktır.
NP’lerin özellikle genetik materyalde hasar oluşturup oluşturmadığının belirlenmesi, hem
bu materyalleri kullanan bu gününün insanlarının ve hem de gelecek nesillerin sağlığı
açısından büyük önem taşımaktadır. Genetik hasarlar vücut hücrelerinde gerçekleşirse,
çeşitli hastalıklara ve en önemlisi de kanser oluşumuna sebep olurken, hasarın üreme
hücrelerinde meydana gelmesi gelecek nesillerde büyük problemlere sebep olabilecektir.
Kısaca bu tür çalışmalar hem nanopartiküllerin genotoksik risklerinin belirlenmesine ve
hem de bunların gelecekte daha güvenli şekilde kullanımlarına imkan sağlayacaktır.
77
KAYNAKLAR
Albertini, R. J., Anderson, D., Douglas, G. R., Hagmar, L., Hemminki, K., Merlo, F.,
Natarajan, A.T., Norppa, H., Shuker D. E. G., Tice, R., Waters, M. D., and Aitio, A.
(2000). IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in
humans. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 463(2), 111-172.
Al-Rawi, M., Diabate, S., and Weiss, C. (2011). Uptake and intracellular localization of
submicron and nano-sized SiO2 particles in HeLa cells. Archives of toxicology,
85(7), 813-826.
Ames, B. N., McCann, J., and Yamasaki, E. (1975). Methods for detecting carcinogens and
mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test. Mutation
Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 31(6), 347-363.
Aoshima, H., Yamana, S., Nakamura, S., and Mashino, T. (2010). Biological safety of
water-soluble fullerenes evaluated using tests for genotoxicity, phototoxicity, and
pro-oxidant activity. The Journal of Toxicological Sciences, 35(3), 401-409.
Arora, K., Singh, N., Srivastava, S., and Srivastava, A. (2014). Evaluation of genotoxic
risks due to temporal changes in soil urea: using Allium cepa L. root rip bioassay.
Cytologia, 79(1), 85-93.
Arora, S., Rajwade, J. M., and Paknikar, K. M. (2012). Nanotoxicology and in vitro
studies: The need of the hour. Toxicology and Applied Pharmacology, 258(2), 151165.
Asare, N., Instanes, C., Sandberg, W. J., Refsnes, M., Schwarze, P., Kruszewski, M., and
Brunborg, G. (2012). Cytotoxic and genotoxic effects of silver nanoparticles in
testicular cells. Toxicology, 291(1), 65-72.
Asharani, P. V., Hande, M. P., and, Valiyaveettil, S. (2009). Anti-proliferative activity of
silver nanoparticles. BMC Cell Biology, 10(1), 65.
AshaRani, P. V., Low Kah Mun, G., Hande, M. P., and Valiyaveettil, S. (2008).
Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells. ACS nano,3(2),
279-290.
Ateeq, B., Abul-Farah, M., Niamat-Ali., M., and Ahmad, W. (2002). Clastogenicity of
pentachlorophenol, 2, 4-D and butachlor evaluated by Allium root tip test. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 514(1), 105-113.
Atha, D. H., Wang, H., Petersen, E. J., Cleveland, D., Holbrook, R. D., Jaruga, P.,
Dizdaroglu, M., Xing, B., and Nelson, B. C. (2012). Copper oxide nanoparticle
mediated DNA damage in terrestrial plant models. Environmental Science and
Technology, 46(3), 1819-1827.
Auffan, M., Bottero, J. Y., Chaneac, C., and Rose, J. (2010). Inorganic manufactured
nanoparticles: how their physicochemical properties influence their biological effects
in aqueous environments. Nanomedicine, 5(6), 999-1007.
78
Auffan, M., Decome, L., Rose, J., Orsiere, T., De Meo, M., Briois, V., Chaneac, C., Olivi
L., Berge-lefranc, J. L., Botta A., Wiesner M. R., and Bottero, J. Y., (2006). In vitro
interactions between DMSA-coated maghemite nanoparticles and human fibroblasts:
a physicochemical and cyto-genotoxical study. Environmental Science and
Technology, 40(14), 4367-4373.
Auffan, M., Rose, J., Orsiere, T., De Meo, M., Thill, A., Zeyons, O., Proux, O., Masion A.,
Perrine Chaurand, Olivier Spalla, Alain Botta, Mark R. Wiesner,and Bottero, J. Y.
(2009). CeO2 nanoparticles induce DNA damage towards human dermal fibroblasts
in vitro. Nanotoxicology, 3(2), 161-171.
Bacchetta, R., Santo, N., Fascio, U., Moschini, E., Freddi, S., Chirico, G., Camatini, M.,
and Mantecca, P. (2012). Nano-sized CuO, TiO2 and ZnO affect Xenopus laevis
development. Nanotoxicology, 6(4), 381-398.
Badr, A. (1983). Mitodepressive and chromotoxic activities of two herbicides in Allium
cepa. Cytologia, 48(3), 451-457.
Balasubramanyam, A., Sailaja, N., Mahboob, M., Rahman, M. F., Hussain, S. M. and
Grover, P. (2009). In vivo genotoxicity assessment of aluminium oxide
nanomaterials in rat peripheral blood cells using the comet assay and micronucleus
test. Mutagenesis, 24(3), 245-251.
Bao-shan, L., Chun-hui, L., Li-jun, F., Shu-chun, Q. and Min, Y. (2004). Effect of TMS
(nanostructured silicon dioxide) on growth of Changbai larch seedlings. Journal of
Forestry Research, 15(2), 138-140.
Barnes, C. A., Elsaesser, A., Arkusz, J., Smok, A., Palus, J., Lesniak, A., Salvati, A.,
Hanrahan, J. P., De Jong, W. H., Dziubałtowska, E., Stepnik, M., Rydzynski, M.,
McKerr,G., Lynch, I., Dawson, K. A., and Howard, C. V. (2008). Reproducible
comet assay of amorphous silica nanoparticles detects no genotoxicity. Nano Letters,
8(9), 3069-3074.
Barthlott, W., Neinhuis, C. (1997). Purity of the sacred lotus, or escape from
contamination in biological surfaces. Planta, 202(1), 1-8.
Berry, C. C., De La Fuente, J. M., Mullin, M., Chu, S. W. L., and Curtis, A. S. G. (2007).
Notice of Violation of IEEE Publication Principles Nuclear Localization of HIV-1
Tat Functionalized Gold Nanoparticles. NanoBioscience, IEEE Transactions on,
6(4), 262-269.
Birbaum, K., Brogioli, R., Schellenberg, M., Martinoia, E., Stark, W. J., Günther, D., and
Limbach, L. K. (2010). No evidence for cerium dioxide nanoparticle translocation in
maize plants. Environmental Science and Technology, 44(22), 8718-8723.
Biswas, P., Wu, C. Y. (2005). Nanoparticles and the environment. Journal of the Air and
Waste Management Association, 55(6), 708-746.
Bolognesi, C. (2003). Genotoxicity of pesticides: a review of human biomonitoring
studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 543(3), 251-272.
79
Britt, A. B. (1999). Molecular genetics of DNA repair in higher plants. Trends in Plant
Science, 4(1), 20-25.
Bulcke, F., Thiel, K., and Dringen, R. (2014). Uptake and toxicity of copper oxide
nanoparticles in cultured primary brain astrocytes. Nanotoxicology, 8(7), 775-785.
Buzea, C., Pacheco, I. I., and Robbie, K. (2007). Nanomaterials and nanoparticles: sources
and toxicity. Biointerphases, 2(4), 17-71.
Cameron, F. K. (1915). Soil colloids and the soil solution. The Journal of Physical
Chemistry, 19(1), 1-13.
Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering
plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls
during growth. The Plant Journal, 3(1), 1-30.
Cebulska-Wasilewska, A., Panek, A., Żabinski, Z., Moszczynski, P. and Au, W. W.
(2005). Occupational exposure to mercury vapour on genotoxicity and DNA repair.
Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 586(2),
102-114.
Chandirasekar, R., Kumar, B. L., Sasikala, K., Jayakumar, R., Suresh, K., Venkatesan, R.,
Jacob, R., Krishnapriya, E.K., Kavitha, H., Ganesh, G. K. (2014). Assessment of
genotoxic and molecular mechanisms of cancer risk in smoking and smokeless
tobacco users. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis, 767, 21-27.
Chang, J. S., Chang, K. L. B., Hwang, D. F., and Kong, Z. L. (2007). In vitro cytotoxicitiy
of silica nanoparticles at high concentrations strongly depends on the metabolic
activity type of the cell line. Environmental Science and Technology, 41(6), 20642068.
Chauhan, L. K. S., Dikshith, T. S. S., and Sundararaman, V. (1986). Effect of deltamethrin
on plant cells cytological effects on the root meristems of Allium cepa Mutation
Research/Genetic Toxicology, 171(1), 25-30.
Chen, M., Mikecz, A. (2005). Formation of nucleoplasmic protein aggregates impairs
nuclear function in response to SiO2 nanoparticles. Experimental Cell Research,
305(1), 51-62.
Chen, Y. T., Wu, J. H., Tsai, F. J., Chang, Y. W., Hsu, S. H., Lin, J. J., and Liao, J. W.
(2014). Genotoxicity tests of polystyrene comaleic anhydride-coated silver
nanoparticles in vivo and in vitro. Journal of Experimental Nanoscience, 1-9.
Chen, Y., Chen, J., Dong, J., and Jin, Y. (2004). Comparing study of the effect of
nanosized silicon dioxide and microsized silicon dioxide on fibrogenesis in rats.
Toxicology and İndustrial Health, 20(1-5), 21-27.
80
Chen, Z., Meng, H., Xing, G., Chen, C., Zhao, Y., Jia, G., Wang, T., Yuan, H., Ye, C.,
Zhao, F., Chai, Z., Zhu, C., Fang, X., Ma, B.,and Wan, L. (2006). Acute
toxicological effects of copper nanoparticles in vivo. Toxicology Letters, 163(2),
109-120.
Cho, W. S., Choi, M., Han, B. S., Cho, M., Oh, J., Park, K., Kim, S. J., Kim, S. H., Jeong,
J., and Jeong, J. (2007). Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation
of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters, 175(1), 24-33.
Clarkson, D. T. (1974). Ion transport and cell structure in plants. Biochemical Society
Transactions, 3, 202–204.
Colvin, V. L. (2003). The potential environmental impact of engineered nanomaterials.
Nature biotechnology, 21(10), 1166-1170.
Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., and Lunec, J. (2003). Oxidative DNA
damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal, 17(10), 11951214.
Cursino, L., Li, Y., Zaini, P. A., De La Fuente, L., Hoch, H. C., and Burr, T. J. (2009).
Twitching motility and biofilm formation are associated with tonB1 in Xylella
fastidiosa. FEMS Microbiology Letters, 299(2), 193-199.
Darlington, C. D., McLeish, J. (1951). Action of maleic hydrazide on the cell. Nature, 167,
407-408.
Dashevskaya, S., Kopito, R. B., Friedman, R., Elbaum, M., and Epel, B. L. (2008).
Diffusion of anionic and neutral GFP derivatives through plasmodesmata in
epidermal cells of Nicotiana benthamiana. Protoplasma, 234(1-4), 13-23.
Dekkers, S., Krystek, P., Peters, R. J., Lankveld, D. P., Bokkers, B. G., van HoevenArentzen, P. H., Bouwmeester, H., and Oomen, A. G. (2011). Presence and risks of
nanosilica in food products. Nanotoxicology, 5(3), 393-405.
Diallo, M. S. (2009). 11 Water Treatment by Dendrimer-Enhanced Filtration: Principles
and Applications. Nanotechnology Applications for Clean Water: Solutions for
Improving Water Quality, 143-155.
Diallo, M. S., Christie, S., Swaminathan, P., Johnson, J. H., and Goddard, W. A. (2005).
Dendrimer enhanced ultrafiltration. 1. Recovery of Cu (II) from aqueous solutions
using Pamam dendrimers with ethylene diamine core and terminal NH 2 groups.
Environmental Science and Technology, 39(5), 1366-1377.
Dietz, K. J., Herth, S. (2011). Plant nanotoxicology. Trends in Plant Science, 16(11), 582589.
Doak, S. H., Jenkins, G. J., Johnson, G. E., Quick, E., Parry, E. M., and Parry, J. M.
(2007). Mechanistic influences for mutation induction curves after exposure to
DNA-reactive carcinogens. Cancer Research, 67(8), 3904-3911.
81
Double, K. L. (2012). Neuronal vulnerability in Parkinson's disease. Parkinsonism and
Related Disorders, 18, 52-54.
Dusinska, M., Collins, A. (1996). Detection of oxidised purines and UV-induced
photoproducts in DNA of single cells, by inclusion of lesion specific enzymes in the
comet assay. Alternatives to Laboratory Animals, 24(3), 405-411.
Ellegaard-Jensen, L., Jensen, K. A., and Johansen, A. (2012). Nano-silver induces doseresponse effects on the nematode Caenorhabditis elegan. Ecotoxicology and
Environmental Safety, 80, 216-223.
Eom, H. J., Choi, J. (2009). Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial
epithelial cell, Beas-2B. Toxicology in Vitro, 23(7), 1326-1332.
Epel, D. (1963). The effects of carbon monoxide inhibition on ATP level and the rate of
mitosis in the sea urchin egg. The Journal of Cell Biology, 17(2), 315-319.
Etxeberria, E., Gonzalez, P., Baroja-Fernandez, E., and Romero, J. P. (2006). Fluid phase
endocytic uptake of artificial nano-spheres and fluorescent quantum dots by
sycamore cultured cells: evidence for the distribution of solutes to different
intracellular compartments. Plant Signaling and Behavior, 1(4), 196.
Faiyue, B., Al Azzawi, M. J., and Flowers, T. J. (2010). The role of lateral roots in bypass
flow in rice (Oryza sativa L.). Plant, Cell and Environment, 33(5), 702-716.
Falck, G. C. M., Lindberg, H. K., Suhonen, S., Vippola, M., Vanhala, E., Catalan, J., and
Norppa, H. (2009). Genotoxic effects of nanosized and fine TiO2. Human and
Experimental Toxicology, 28(6-7), 339-352.
Farmen, L. (2009). Commercialization of nanotechnology for removal of heavy metals in
drinking water. Nanotechnology Applications for Clean Water: Solutions for
Improving Water Quality, 115-130.
Federico, A., Morgillo, F., Tuccillo, C., Ciardiello, F., and Loguercio, C. (2007). Chronic
inflammation and oxidative stress in human carcinogenesis.International Journal of
Cancer, 121(11), 2381-2386.
Fenech, M., Kirsch-Volders, M., Natarajan, A. T., Surralles, J., Crott, J. W., Parry, J.,
Norppa, H., Eastmond, D. A., Tucker, J. D., and Thomas, P. (2011). Molecular
mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in
mammalian and human cells. Mutagenesis, 26(1), 125-132.
Ferguson, L. R., Denny, W. A. (2007). Genotoxicity of non-covalent interactions: DNA
intercalators. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of
Mutagenesis, 623(1), 14-23.
Fernandes, T. C., Mazzeo, D. E. C., and Marin-Morales, M. A. (2007). Mechanism of
micronuclei formation in polyploidizated cells of Allium cepa exposed to trifluralin
herbicide. Pesticide Biochemistry and Physiology, 88(3), 252-259.
82
Fiskesjö, G. (1985). The Allium test as a standard in environmental monitoring. Hereditas,
102(1), 99-112.
Folkmann, J. K., Risom, L., Jacobsen, N. R., Wallin, H., Loft, S., and Moller, P. (2009).
Oxidatively damaged DNA in rats exposed by oral gavage to C60 fullerenes and
single-walled carbon nanotubes. Environmental Health Perspectives, 117 (5),703708
Gajewicz, A., Rasulev, B., Dinadayalane, T. C., Urbaszek, P., Puzyn, T., Leszczynska, D.,
and Leszczynski, J. (2012). Advancing risk assessment of engineered nanomaterials:
application of computational approaches. Advanced Drug Delivery Reviews, 64(15),
1663-1693.
Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C.,
Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, B. H.,
Resnick, M. A., Anderson B., and Zeiger, E. (1987). Chromosome aberrations and
sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: evaluations of chemicals.
Environmental and Molecular Mutagenesis, 10(10), 1-35.
Garcia-Sagredo, J. M. (2008). Fifty years of cytogenetics: a parallel view of the evolution
of cytogenetics and genotoxicology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene
Regulatory Mechanisms, 1779(6), 363-375.
Gaulden, M. E. (1987). Hypothesis: some mutagens directly alter specific chromosomal
proteins (DNA topoisomerase II and peripheral proteins) to produce chromosome
stickiness, which causes chromosome aberrations. Mutagenesis, 2(5), 357-365.
Geiser, M., Rothen-Rutishauser, B., Kapp, N., Schürch, S., Kreyling, W., Schulz, H.,
Semmler, M., Hof, V. I., Heyder, J., and Gehr, P. (2005). Ultrafine particles cross
cellular membranes by nonphagocytic mechanisms in lungs and in cultured cells.
Environmental Health Perspectives, 1555-1560.
Goujon, E., Sta, C., Trivella, A., Goupil, P., Richard, C., and Ledoigt, G. (2014).
Genotoxicity of sulcotrione pesticide and photoproducts on Allium cepa root
meristem. Pesticide biochemistry and physiology, 113, 47-54.
Ghodake, G., Seo, Y. D., and Lee, D. S. (2011). Hazardous phytotoxic nature of cobalt and
zinc oxide nanoparticles assessed using Allium cepa. Journal of hazardous
materials, 186(1), 952-955.
Ghosh, M., Bandyopadhyay, M., and Mukherjee, A. (2010). Genotoxicity of titanium
dioxide (TiO2) nanoparticles at two trophic levels: Plant and human lymphocytes.
Chemosphere, 81(10), 1253-1262.
Ghosh, M., Chakraborty, A., Bandyopadhyay, M., and Mukherjee, A. (2011). Multi-walled
carbon nanotubes (MWCNT): Induction of DNA damage in plant and mammalian
cells. Journal of Hazardous Materials, 197, 327-336.
83
Ginzkey, C., Steussloff, G., Koehler, C., Burghartz, M., Scherzed, A., Hackenberg, S.,
Hagen, R., and Kleinsasser, N. H. (2014). Nicotine derived genotoxic effects in
human primary parotid gland cells as assessed in vitro by comet assay, cytokinesisblock micronucleus test and chromosome aberrations test. Toxicology in Vitro,
28(5), 838-846.
Glover, B. J. (2000). Differentiation in plant epidermal cells. Journal of Experimental
Botany, 51(344), 497-505.
Gojova, A., Guo, B., Kota, R. S., Rutledge, J. C., Kennedy, I. M., and Barakat, A. I.
(2007). Induction of inflammation in vascular endothelial cells by metal oxide
nanoparticles: effect of particle composition. Environmental Health Perspectives,
115(31), 403-409.
Gonzalez, L., Thomassen, L. C., Plas, G., Rabolli, V., Napierska, D., Decordier, I.,
Roelants, M., Hoet, P. H., Kirschhock, C. E. A., Martens, J. A., Lison, D., and
Kirsch-Volders, M. (2010). Exploring the aneugenic and clastogenic potential in the
nanosize range: A549 human lung carcinoma cells and amorphous monodisperse
silica nanoparticles as models. Nanotoxicology, 4(4), 382-395.
Gurr, J. R., Wang, A. S., Chen, C. H., and Jan, K. Y. (2005). Ultrafine titanium dioxide
particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human
bronchial epithelial cells. Toxicology, 213(1), 66-73.
Hackenberg, S., Friehs, G., Froelich, K., Ginzkey, C., Koehler, C., Scherzed, A., Koehler,
C., Marc Burghartz, Rudolf Hagen and Kleinsasser, N. (2010). Intracellular
distribution, geno-and cytotoxic effects of nanosized titanium dioxide particles in the
anatase crystal phase on human nasal mucosa cells. Toxicology Letters, 195(1), 9-14.
Hackenberg, S., Scherzed, A., Technau, A., Kessler, M., Froelich, K., Ginzkey, C.,
Burghartz, M., Hagen, R., and Kleinsasser, N. (2011). Cytotoxic, genotoxic and proinflammatory effects of zinc oxide nanoparticles in human nasal mucosa cells in
vitro. Toxicology in vitro, 25(3), 657-663.
Hanagata, N., Zhuang, F., Connolly, S., Li, J., Ogawa, N., and Xu, M. (2011). Molecular
responses of human lung epithelial cells to the toxicity of copper oxide nanoparticles
inferred from whole genome expression analysis. ACS nano, 5(12), 9326-9338.
Hanna, S. K., Miller, R. J., and Lenihan, H. S. (2014). Accumulation and toxicity of copper
oxide engineered nanoparticles in a Marine Mussel. Nanomaterials, 4(3), 535-547.
Hartwig, A. (1994). Role of DNA repair inhibition in lead and cadmium induced
genotoxicity: a review. Environmental Health Perspectives, 102 (3), 45.
Hartwig, A. (2013). Metal interaction with redox regulation: an integrating concept in
metal carcinogenesis. Free Radical Biology and Medicine, 55, 63-72.
Hischemöller, A., Nordmann, J., Ptacek, P., Mummenhoff, K., and Haase, M. (2009). Invivo imaging of the uptake of up conversion nanoparticles by plant roots. Journal of
Biomedical Nanotechnology, 5(3), 278-284.
84
Hodur, N. M., Leistritz, F. L. (2007). Estimating the economic impact of event tourism: a
review of issues and methods. Journal of Convention and Event Tourism, 8(4), 6379
Hoek, E. M., Ghosh, A. K. (2009). Nanotechnology-based membranes for water
purification. Nanotechnology Applications for Clean Water, 5, 47.
Hoshino, A., Fujioka, K., Oku, T., Suga, M., Sasaki, Y. F., Ohta, T., Ohta, T., Yasuhara,
M., Suzuki, K., and Yamamoto, K. (2004). Physicochemical properties and cellular
toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano
Letters,4(11), 2163-2169.
Hoyt, V. W., Mason, E. (2008). Nanotechnology: emerging health issues. Journal of
Chemical Health and Safety, 15(2), 10-15.
Hung, Y. H., Bush, A. I., and La Fontaine, S. (2013). Links between copper and
cholesterol in Alzheimer's disease. Frontiers in Physiology, 4, 111.
Imlau, A., Truernit, E., and Sauer, N. (1999). Cell to cell and long-distance trafficking of
the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein
into sink tissues. The Plant Cell Online, 11(3), 309-322.
İnternet: Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health
Organization.URL:http://www.webcitation.org/query?url=http%3A%2Fwhqlibdoc.c
ho.int%2Fpublications%2F2010%2F9789241563932_eng.pdf&date=2014-11-05,
Son Erişim Tarihi: 18.08.2014.
İnternet:WoodrowWilsonURL:http://webcitation.org/query?url=http%3A%2F%2Fwww.n
anotechproject.org%2Fcpi%2F8&date=2014-11-05, Son erişim tarihi: 18.08.2014.
James, E. K., Olivares, F. L. (1998). Infection and colonization of sugar cane and other
graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences,
17(1), 77-119.
Jenkins, G. J. S., Doak, S. H., Johnson, G. E., Quick, E., Waters, E. M., and Parry, J. M.
(2005). Do dose response thresholds exist for genotoxic alkylating agents?.
Mutagenesis, 20(6), 389-398.
Jia, B., Mei, Y., Cheng, L., Zhou, J., and Zhang, L. (2012). Preparation of copper
nanoparticles coated cellulose films with antibacterial properties through one-step
reduction. ACS Applied Materials and İnterfaces, 4(6), 2897-2902.
Jiang, J., Oberdörster, G., and Biswas, P. (2009). Characterization of size, surface charge,
and agglomeration state of nanoparticle dispersions for toxicological studies.
Journal of Nanoparticle Research, 11(1), 77-89.
Jin, Y., Kannan, S., Wu, M., and Zhao, J. X. (2007). Toxicity of luminescent silica
nanoparticles to living cells. Chemical Research in Toxicology, 20(8), 1126-1133.
Johnston, C. T. (2010). Probing the nanoscale architecture of clay minerals. Clay
Minerals, 45(3), 245-279.
85
Jomova, K., Baros, S. ve Valko, M. (2012). Redox active metal-induced oxidative stress in
biological systems. Transition Metal Chemistry, 37(2), 127-134.
Jumagazieva, D. S., Maslyakova, G. N., Suleymanova, L. V., Bucharskaya, A. B., Firsova,
S. S., Khlebtsov, B. N., Terentyuk, G. S., Kong, S. M., Khlebtsov, N. G., and
Khlebtsov, N. G. (2011). Mutagenic effect of gold nanoparticles in the micronucleus
assay. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 151(6), 731-733.
Kane, A. B., Jean, D., Knuutila, S., and Jaurand, M. C. (2014). Malignant mesothelioma:
mechanism of carcinogenesis. In Occupational Cancers, 299-319.
Karaismailoglu, M. C. (2014). Investigation of the Cytotoxic and genotoxic effects of
Artemisia annua Methanol extract with the Allium test. Ekoloji, 23(91), 64-74.
Karlsson, H. L. (2010). The comet assay in nanotoxicology research. Analytical and
Bioanalytical Chemistry, 398(2), 651-666.
Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., and Moller, L. (2008). Copper oxide
nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and
carbon nanotubes. Chemical Research in Toxicology, 21(9), 1726-1732.
Karlsson, H. L., Gustafsson, J., Cronholm, P., and Möller, L. (2009). Size-dependent
toxicity of metal oxide particles a comparison between nano and micrometer size.
Toxicology Letters, 188(2), 112-118.
Kaur, G., Singh, H. P., Batish, D. R. ve Kohli, R. K. (2014). Pb-inhibited mitotic activity
in onion roots involves DNA damage and disruption of oxidative metabolism.
Ecotoxicology, 23(7), 1292-1304.
Kawanishi, M., Ogo, S., Ikemoto, M., Totsuka, Y., Ishino, K., Wakabayashi, K., and Yagi,
T. (2012). Genotoxicity and reactive oxygen species production induced by
magnetite nanoparticles in mammalian cells. The Journal of Toxicological
Sciences, 38(3), 503-511.
Kennedy, C. B., Scott, S. D., and Ferris, F. G. (2004). Hydrothermal phase stabilization of
2-line ferrihydrite by bacteria. Chemical Geology, 212(3), 269-277.
Kim, J. Y. (2005). Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Current
Opinion in Plant Biology, 8(1), 45-52.
Kim, S., Lee, S., and Lee, I. (2012). Alteration of phytotoxicity and oxidant stress potential
by metal oxide nanoparticles in Cucumis sativus. Water, Air, and Soil Pollution,
223(5), 2799-2806.
Kisin, E. R., Murray, A. R., Keane, M. J., Shi, X. C., Schwegler-Berry, D., Gorelik, O.,
Arepalli, S., Castranova, V., Wallace, W. E., Kagan, V. E., and Shvedova, A. A.
(2007). Single-walled carbon nanotubes: geno and cytotoxic effects in lung fibroblast
V79 cells. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 70(24), 20712079.
86
Kiss, B., Biro, T., Czifra, G., Toth, B. I., Kertesz, Z., Szikszai, Z., and Hunyadi, J. (2008).
Investigation of micronized titanium dioxide penetration in human skin xenografts
and its effect on cellular functions of human skinderived cells. Experimental
Dermatology, 17(8), 659-667.
Klaine, S. J., Alvarez, P. J., Batley, G. E., Fernandes, T. F., Handy, R. D., Lyon, D. Y.,
Mahendra, S., McLaughlin, M. J., and Lead, J. R. (2008). Nanomaterials in the
environment: behavior, fate, bioavailability, and effects. Environmental Toxicology
and Chemistry, 27(9), 1825-1851.
Konotop, Y. O., Kovalenko, M. S., Ulynets, V. Z., Meleshko, A. O., Batsmanova, L. M.,
and Taran, N. Y. (2014). Phytotoxicity of colloidal solutions of metal containing
nanoparticles. Cytology and Genetics, 48(2), 99-102.
Ku, G., Zhou, M., Song, S., Huang, Q., Hazle, J., and Li, C. (2012). Copper sulfide
nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging
at 1064 nm. ACS Nano, 6(8), 7489-7496.
Kumari, M., Khan, S. S., Pakrashi, S., Mukherjee, A., and Chandrasekaran, N. (2011).
Cytogenetic and genotoxic effects of zinc oxide nanoparticles on root cells of Allium
cepa Journal of Hazardous Materials, 190(1), 613-621.
Kumari, M., Mukherjee, A., and Chandrasekaran, N. (2009). Genotoxicity of silver
nanoparticles in Allium cepa Science of the Total Environment, 407(19), 52435246.
Kurepa, J., Paunesku, T., Vogt, S., Arora, H., Rabatic, B. M., Lu, J., Wanzer, M. B.,
Woloschak, G. E., and Smalle, J. A. (2010). Uptake and distribution of ultrasmall
anatase TiO2 alizarin red S nanoconjugates in Arabidopsis thaliana. Nano letters,
10(7), 2296-2302.
Laborie, M. P. (2009). Bacterial cellulose and its polymeric nanocomposites. The
nanoscience and technology of renewable biomaterials. Wiley, Chichester, 231271.
Laingam, S., Froscio, S. M., and Humpage, A. R. (2008). Flow-cytometric analysis of in
vitro micronucleus formation: Comparative studies with WIL2-NS human
lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 656(1), 19-26.
Leary, S. P., Liu, C. Y., and Apuzzo, M. L. (2006). Toward the emergence of
nanoneurosurgery: Part III Nanomedicine: Targeted nanotherapy, nanosurgery, and
progress toward the realization of nanoneurosurgery. Neurosurgery, 58(6), 10091026.
Lee, C. W., Mahendra, S., Zodrow, K., Li, D., Tsai, Y. C. Braam, J., and Alvarez, P. J.
(2010). Developmental phytotoxicity of metal oxide nanoparticles to Arabidopsis
thaliana. Environmental Toxicology and Chemistry, 29(3), 669-675.
87
Lee, W. M., An, Y. J., Yoon, H., and Kweon, H. S. (2008). Toxicity and bioavailability of
copper nanoparticles to the terrestrial plants mung bean (Phaseolus radiatus) and
wheat (Triticum aestivum): Plant agar test for water insoluble nanoparticles.
Environmental Toxicology and Chemistry, 27(9), 1915-1921.
Leme, D. M., Marin-Morales, M. A. (2009). Allium cepa test in environmental monitoring:
A review on its application. Mutation Research/Reviews in Mutation Research,
682(1), 71-81.
Leme, D. M., Angelis, D. D. F. D., and Marin-Morales, M. A. (2008). Action mechanisms
of petroleum hydrocarbons present in waters impacted by an oil spill on the genetic
material of Allium cepa root cells. Aquatic Toxicology, 88(4), 214-219.
Li, C., Wang, Z., Wang, P. I., Peles, Y., Koratkar, N., and Peterson, G. P. (2008).
Nanostructured copper interfaces for enhanced boiling. Small, 4(8), 1084-1088.
Li, F., Ambrosini, G., Chu, E. Y., Plescia, J., Tognin, S., Marchisio, P. C., and Altieri, D.
C. (1998). Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature,
396(6711), 580-584.
Li, Y., Chen, D. H., Yan, J., Chen, Y., Mittelstaedt, R. A., Zhang, Y., Biris, A. S., Heflich,
R. H., and Chen, T. (2012). Genotoxicity of silver nanoparticles evaluated using the
Ames test and in vitro micronucleus assay. Mutation Research/Genetic Toxicology
and Environmental Mutagenesis, 745(1), 4-10.
Lia, X., Kondoh, M., Watari, A., Hasezaki, T., Isoda, K., Tsutsumi, Y., and Yagi, K.
(2011). Effect of 70-nm silica particles on the toxicity of acetaminophen,
tetracycline, trazodone, and 5-aminosalicylic acid in mice. Die Pharmazie-An
International Journal of Pharmaceutical Sciences, 66(4), 282-286.
Liang, Y., Sun, W., Zhu, Y. G., and Christie, P. (2007). Mechanisms of silicon-mediated
alleviation of abiotic stresses in higher plants: a review. Environmental Pollution,
147(2), 422-428.
Lin, D., Xing, B. (2007). Phytotoxicity of nanoparticles: inhibition of seed germination and
root growth. Environmental Pollution, 150(2), 243-250.
Lin, D. ve Xing, B. (2008). Root uptake and phytotoxicity of ZnO nanoparticles.
Environmental Science and Technology, 42(15), 5580-5585.
Lin, S., Reppert, J., Hu, Q., Hudson, J. S., Reid, M. L., Ratnikova, T. A., Rao, A. M., Luo
H., and Ke, P. C. (2009). Uptake, translocation, and transmission of carbon
nanomaterials in rice plants. Small, 5(10), 1128-1132.
Liman, R. (2013). Genotoxic effects of bismuth (III) oxide nanoparticles by Allium and
comet assay. Chemosphere, 93(2), 269-273.
Lison, D., Thomassen, L. C., Rabolli, V., Gonzalez, L., Napierska, D., Seo, J. W., KirschVolders, M., Hoet, P., Kirschhock C. E. A., and Martens, J. A. (2008). Nominal and
effective dosimetry of silica nanoparticles in cytotoxicity assays. Toxicological
Sciences, 104(1), 155-162.
88
Liu, C., Xie, X., and Cui, Y. (2012). Antimicrobial nanomaterials for water disinfection.
Nano-Antimicrobials, 465-494.
Liu, Q., Chen, B., Wang, Q., Shi, X., Xiao, Z., Lin, J., and Fang, X. (2009). Carbon
nanotubes as molecular transporters for walled plant cells. Nano letters, 9(3), 10071010.
Long, T. C., Saleh, N., Tilton, R. D., Lowry, G. V., and Veronesi, B. (2006). Titanium
dioxide (P25) produces reactive oxygen species in immortalized brain microglia
(BV2): implications for nanoparticle neurotoxicity. Environmental Science and
Technology, 40(14), 4346-4352.
Ma, F., Chen, R., Li, P., Zhang, Q., Zhang, W., and Hu, X. (2013). Preparation of an
immunoaffinity column with amino-silica gel microparticles and its application in
sample cleanup for aflatoxin detection in agri products. Molecules, 18(2), 22222235.
Ma, J. F., Yamaji, N. (2006). Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends in
Plant Science, 11(8), 392-397.
Ma, T. H., Xu, Z., Xu, C., McConnell, H., Valtierra Rabago, E., Adriana Arreola, G., and
Zhang, H. (1995). The improved Allium/Vicia root tip micronucleus assay for
clastogenicity of environmental pollutants. Mutation Research/Environmental
Mutagenesis and Related Subjects, 334(2), 185-195.
Madia, F., Phrakonkham, P., and Corvi, R. (2014). Current and Emerging In Vitro
Methods for Genotoxicity and Carcinogenicity. In Vitro Toxicology Systems , 307332.
Magdolenova, Z., Collins, A., Kumar, A., Dhawan, A., Stone, V., and Dusinska, M.
(2014). Mechanisms of genotoxicity. A review of in vitro and in vivo studies with
engineered nanoparticles. Nanotoxicology, 8(3), 233-278.
Michalska-Kacymirow, M., Kurek, E., Smolis, A., Wierzbicka, M., and Bulska, E. (2014).
Biological and chemical investigation of Allium cepa L. response to selenium
inorganic compounds. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406(15), 3717-3722.
Miralles, P., Church, T. L., and Harris, A. T. (2012). Toxicity, uptake, and translocation of
engineered nanomaterials in vascular plants. Environmental Science and
Technology, 46(17), 9224-9239.
Molina, M. A., Ramos, J. L., and Espinosa‐Urgel, M. (2006). A two partner secretion
system is involved in seed and root colonization and iron uptake by Pseudomonas
putida KT2440. Environmental Microbiology, 8(4), 639-647.
Monica, R. C., Cremonini, R. (2009). Nanoparticles and higher plants. Caryologia, 62(2),
161-165.
89
Morawska, L., Ristovski, Z., Jayaratne, E. R., Keogh, D. U., and Ling, X. (2008). Ambient
nano and ultrafine particles from motor vehicle emissions: characteristics, ambient
processing and implications on human exposure. Atmospheric Environment, 42(35),
8113-8138.
Mortelmans, K., Zeiger, E. (2000). The Ames Salmonella microsome mutagenicity assay.
Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis,
455(1), 29-60.
Mosesso, P., Cinelli, S., Natarajan, A. T., and Palitti, F. (2013). In Vitro cytogenetic
assays: Chromosomal aberrations and micronucleus tests. Genotoxicity Assessment
Humana Press, 123-146.
Mushtaq ,Y.K. (2011). Effect of nanoscale Fe3O4, TiO2 and carbon particles on cucumber
seed germination. Journal of Environmental Science and Health, Part A, 46(14),
1732-1735.
Nabiev, I., Mitchell, S., Davies, A., Williams, Y., Kelleher, D., Moore, R., Gunko, Y,
K.,Byrne, S., Rakovich, Y. P.,Donegan, J. F., Sukhanova, A., Conroy, J., Cottell, D.,
Gaponik, N., Rogach, A., and Volkov, Y. (2007). Nonfunctionalized nanocrystals
can exploit a cells active transport machinery delivering them to specific nuclear and
cytoplasmic compartments. Nano Letters, 7(11), 3452-3461.
Napierska, D., Thomassen, L. C., Rabolli, V., Lison, D., Gonzalez, L., Kirsch-Volders, M.,
Martens, J. A., and Hoet, P. H. (2009). Size Dependent Cytotoxicity of
Monodisperse Silica Nanoparticles in Human Endothelial Cells. Small, 5(7), 846853.
Navarro, E., Baun, A., Behra, R., Hartmann, N. B., Filser, J., Miao, A. J., Quigg, A.,
Santschi, P. H., and Sigg, L. (2008). Environmental behavior and ecotoxicity of
engineered nanoparticles to algae, plants, and fungi. Ecotoxicology, 17(5), 372-386.
Nekrasova, G. F., Ushakova, O. S., Ermakov, A. E., Uimin, M. A., and Byzov, I. V.
(2011). Effects of copper (II) ions and copper oxide nanoparticles on Elodea densa
Planch. Russian Journal of Ecology, 42(6), 458-463.
Nel, A., Xia, T., Mädler, L., and Li, N. (2006). Toxic potential of materials at the
nanolevel. Science, 311(5761), 622-627.
Nielsen, M. H., Rank, J. (1994). Screening of Toxicity and genotoxicity in wastewater by
the use of the use of the Allium test. Hereditas, 121(3), 249-254.
Nirmala, R., Park, H. M., Kalpana, D., Kang, H. S., Navamathavan, R., Lee, Y. S., and
Kim, H. Y. (2011). Bactericidal activity and in vitro cytotoxicity assessment of
hydroxyapatite containing gold nanoparticles. Journal of Biomedical
Nanotechnology, 7(3), 342-350.
Nishimori, H., Kondoh, M., Isoda, K., Tsunoda, S. I., Tsutsumi, Y., and Yagi, K. (2009).
Silica nanoparticles as hepatotoxicants. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, 72(3), 496-501.
90
Njagi, G. D. E., and Gopalan, H. N. B. (1982). Cytogenetic effects of the food
preservatives sodium benzoate and sodium sulphite on Vicia faba root meristems.
Mutation Research/Genetic Toxicology, 102(3), 213-219.
Noonan, C. W., Pfau, J. C., Larson, T. C., and Spence, M. R. (2006). Nested case-control
study of autoimmune disease in an asbestos-exposed population. Environmental
Health Perspectives, 1243-1247.
Nowack, B., Bucheli, T. D. (2007). Occurrence, behavior and effects of nanoparticles in
the environment. Environmental Pollution, 150(1), 5-22.
Oberdörster, E., Zhu, S., Blickley, T. M., McClellan-Green, P., and Haasch, M. L. (2006).
Ecotoxicology of carbon-based engineered nanoparticles: Effects of fullerene on
aquatic organisms. Carbon, 44(6), 1112-1120.
Österberg, R., Persson, D., and Bjursell, G. (1984). The condensation of DNA by
chromium (III) ions. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 2(2), 285290.
Pakrashi, S., Jain, N., Dalai, S., Jayakumar, J., Chandrasekaran, P. T., Raichur, A. M.,
Chandrasekaran, N., and Mukherjee, A. (2014). In Vivo genotoxicity assessment of
titanium dioxide nanoparticles by Allium cepa root tip assay at high exposure
concentrations. PloS one, 9(2), 87789.
Pandey, H., Kumar, V., and Roy, B. K. (2014). Assessment of genotoxicity of some
common food preservatives using Allium cepa L. as a test plant. Toxicology Reports,
1, 300-308.
Parashar, U. K., Kumar, V., Bera, T., Saxena, P. S., Nath, G., Srivastava, S. K., Giri, R.,
and Srivastava, A. (2011). Study of mechanism of enhanced antibacterial activity by
green synthesis of silver nanoparticles. Nanotechnology, 22(41), 415104.
Park, E. J., Park, K. (2009). Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by
silica nanoparticles in vivo and in vitro. Toxicology Letters, 184(1), 18-25.
Park, M. V., Verharen, H. W., Zwart, E., Hernandez, L. G., van Benthem, J., Elsaesser, A.,
Barnes, C., McKerr, G., Howard, C. V., Salvati, A., Lynch, I., Dawson, K. A., and de
Jong, W. H. (2011). Genotoxicity evaluation of amorphous silica nanoparticles of
different sizes using the micronucleus and the plasmid lacZ gene mutation assay.
Nanotoxicology, 5(2), 168-181.
Patil, B. C., Bhat, G. I. (1992). A comparative study of MH and EMS in the induction of
chromosomal aberrations on lateral root meristem in Clitoria ternatea L. Cytologia,
57(2), 259-264.
Patlolla, A. K., Berry, A., May, L., and Tchounwou, P. B. (2012). Genotoxicity of silver
nanoparticles in Vicia faba: a pilot study on the environmental monitoring of
nanoparticles. International Journal of Environmental Research and Public
Health, 9(5), 1649-1662.
91
Paul, A., Nag, S., and Sinha, K. (2013). Cytological effects of blitox on root mitosis of
Allium cepa. International Journals of Scientific Research Publications, 3(5), 1-7.
Pekol, S. (2014). Ecotoxicological assessment of metalworking fluids using the Allium
cepa test procedure. Chemistry and Ecology, 30(1), 66-75.
Penn, A., Murphy, G., Barker, S., Henk, W., and Penn, L. (2005). Combustion-derived
ultrafine particles transport organic toxicants to target respiratory cells.
Environmental Health Perspectives, 113(8), 956-963.
Peters, A., Veronesi, B., Calderón-Garciduenas, L., Gehr, P., Chen, L. C., Geiser, M.,
Reed, W., Rothen-Rutishauser, B., Schürch, S., and Schulz, H. (2006). Translocation
and potential neurological effects of fine and ultrafine particles a critical update.
Particle and Fibre Toxicology, 3(13), 1-13.
Petkovic, J., Zegura, B., Stevanovic, M., Drnovsek, N., Uskokovic, D., Novak, S., and
FilipiC, M. (2011). DNA damage and alterations in expression of DNA damage
responsive genes induced by TiO2 nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells.
Nanotoxicology, 5(3), 341-353.
Pilon-Smits, E. A., Quinn, C. F., Tapken, W., Malagoli, M., and Schiavon, M. (2009).
Physiological functions of beneficial elements. Current Opinion in Plant Biology,
12(3), 267-274.
Proseus, T. E., Boyer, J. S. (2005). Turgor pressure moves polysaccharides into growing
cell walls of Chara corallina. Annals of Botany, 95(6), 967-979.
Quinn, J., Geiger, C., Clausen, C., Brooks, K., Coon, C., O Hara, S., and Holdsworth, T.
(2005). Field demonstration of DNAPL dehalogenation using emulsified zero-valent
iron. Environmental Science and Technology, 39(5), 1309-1318.
Rai, M., Deshmukh, S. and Gade, A. (2012). Strategic nanoparticle mediated gene Transfer
in plants and animals a novel approach. Current Nanoscience, 8(1), 170-179.
Ramos-Gonzalez, M. I., Campos, M. J., and Ramos, J. L. (2005). Analysis of
Pseudomonas putida KT2440 gene expression in the maize rhizosphere: in vitro
expression technology capture and identification of root-activated promoters.
Journal of Bacteriology, 187(12), 4033-4041.
Rana, S. V. S. (2008). Metals and apoptosis: recent developments. Journal of Trace
Elements in Medicine and Biology, 22(4), 262-284.
Rank, J., Nielsen, M. H. (1993). A modified Allium test as a tool in the screening of the
genotoxicity of complex mixtures. Hereditas, 118(1), 49-53.
Rank, J., Nielsen, M. H. (1994). Evaluation of the Allium anaphase-telophase test in
relation to genotoxicity screening of industrial wastewater. Mutation
Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 312(1), 17-24.
92
Rank, J., Nielsen, M. H. (1997). Allium cepa anaphase–telophase root tip chromosome
aberration assay on N-methyl-N-nitrosourea, maleic hydrazide, sodium azide, and
ethyl
methanesulfonate.
Mutation
Research/Genetic
Toxicology
and
Environmental Mutagenesis, 390(1), 121-127.
Raven, J. A., Evans, M. C., and Korb, R. E. (1999). The role of trace metals in
photosynthetic electron transport in O2 evolving organisms. Photosynthesis
Research, 60(2-3), 111-150.
Remedios, C., Rosario, F., and Bastos, V. (2012). Environmental nanoparticles interactions
with plants: morphological, physiological, and genotoxic aspects. Journal of
Botany, 2012, 8.
Rubilar, O., Rai, M., Tortella, G., Diez, M. C., Seabra, A. B., and Durán, N. (2013).
Biogenic nanoparticles: copper, copper oxides, copper sulphides, complex copper
nanostructures and their applications. Biotechnology Letters, 35(9), 1365-1375.
Sahu, D., Vijayaraghavan, R., and Kannan, G. M. (2014). Silica nanoparticle induces
oxidative stress and provokes inflammation in human lung cells. Journal of
Experimental Nanoscience, (Baskıda), 1-18.
Saison, C., Perreault, F., Daigle, J. C., Fortin, C., Claverie, J., Morin, M., and Popovic, R.
(2010). Effect of core shell copper oxide nanoparticles on cell culture morphology
and photosynthesis (photosystem II energy distribution) in the green alga,
Chlamydomonas reinhardti. Aquatic Toxicology, 96(2), 109-114.
Savage, J., R., (1975), Classification and relationships of induced structural changes
Journal of Medical Genetics, 12, 103–122
Saygılı, Y. (2014). Bazı Nanopartiküllerin (CuO, Fe2O3, SiO2) İnvitro Periferal İnsan
Lenfositlerinde Genotoksik Etkileri, Devam eden Doktora Tezi, Gazi Üniversitesi
Eğitim Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Scheiber, I. F., Mercer, J. F., and Dringen, R. (2014). Metabolism and functions of copper
in brain. Progress in Neurobiology, 116, 33-57.
Schreiber, L. (2010). Transport barriers made of cutin, suberin and associated waxes.
Trends in Plant Science, 15(10), 546-553.
Schwerdtle, T., Hamann, I., Jahnke, G., Walter, I., Richter, C., Parsons, J. L., Dianov, G.,
and Hartwig, A. (2007). Impact of copper on the induction and repair of oxidative
DNA damage, poly (ADP ribosyl) ation and PARP1 activity. Molecular Nutrition
and Food Research, 51(2), 201-210.
Scott, N., Chen, H. (2013). Nanoscale science and engineering for agriculture and food
systems. Industrial Biotechnology, 9(1), 17-18.
Semisch, A., Ohle, J., Witt, B., and Hartwig, A. (2014). Cytotoxicity and genotoxicity of
nano-and microparticulate copper oxide: role of solubility and intracellular
bioavailability. Particle and Fibre Toxicology, 11(10).
93
Shahin, S. A., and El-Amoodi, K. H. (1991). Induction of numerical chromosomal
aberrations during DNA synthesis using the fungicides nimrod and rubigan-4 in root
tips of Vicia faba L. Mutation Research/Genetic Toxicology, 261(3), 169-176.
Shane, M. W., McCully, M. E., and Canny, M. J. (2000). The vascular system of maize
stems revisited: Implications for water transport and xylem safety. Annals of
Botany, 86(2), 245-258.
Sharma, V., Singh, S. K., Anderson, D., Tobin, D. J., and Dhawan, A. (2011). Zinc oxide
nanoparticle induced genotoxicity in primary human epidermal keratinocytes.
Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 11(5), 3782-3788.
Shaw, A. K., Hossain, Z. (2013). Impact of nano-CuO stress on rice (Oryza sativa L.)
seedlings. Chemosphere, 93(6), 906-915.
Shaymurat, T., Gu, J., Xu, C., Yang, Z., Zhao, Q., Liu, Y., and Liu, Y. (2012). Phytotoxic
and genotoxic effects of ZnO nanoparticles on garlic (Allium sativum L.): A
morphological study. Nanotoxicology, 6(3), 241-248.
Shi, J., Abid, A. D., Kennedy, I. M., Hristova, K. R., and Silk, W. K. (2011). To
duckweeds (Landoltia punctata), nanoparticulate copper oxide is more inhibitory
than the soluble copper in the bulk solution. Environmental Pollution, 159(5), 12771282.
Shibai-Ogata, A., Tahara, H., Yamamoto, Y., Fujita, M., Satoh, H., Yuasa, A., and
Kasahara, T. (2014). An automated new technique for scoring the in vivo
micronucleus assay with image analysis. Mutagenesis, 29(1), 63-71.
Shukla, R. K., Sharma, V., Pandey, A. K., Singh, S., Sultana, S., and Dhawan, A. (2011).
ROS-mediated genotoxicity induced by titanium dioxide nanoparticles in human
epidermal cells. Toxicology in Vitro, 25(1), 231-241.
Shvedova, A. A., Pietroiusti, A., Fadeel, B., and Kagan, V. E. (2012). Mechanisms of
carbon nanotube-induced toxicity: focus on oxidative stress. Toxicology and Applied
Pharmacology, 261(2), 121-133.
Simkiss, K. (1990). Surface effects in ecotoxicology. Functional Ecology, 303-308.
Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., and Schneider, E. L. (1988). A simple technique
for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell
Research, 175(1), 184-191.
Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., and Doak, S. H. (2010). Potential toxicity of super
paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews, 1.
Singh, N., Manshian, B., Jenkins, G. J., Griffiths, S. M., Williams, P. M., Maffeis, T. G.,
Wright, C. J., and Doak, S. H. (2009). NanoGenotoxicology: the DNA damaging
potential of engineered nanomaterials. Biomaterials, 30(23), 3891-3914.
Steudle, E., Peterson, C. A. (1998). How does water get through roots?. Journal of
Experimental Botany, 49(322), 775-788.
94
Stone, V., Nowack, B., Baun, A., van den Brink, N., von der Kammer, F., Dusinska, M.,
Handy, R., Hankin, S., Hassellöv, M., Joner, E., and Fernandes, T. F. (2010).
Nanomaterials for environmental studies: classification, reference material issues,
and strategies for physico-chemical characterisation. Science of the Total
Environment, 408(7), 1745-1754.
Sung, J. H., Ji, J. H., Yoon, J. U., Kim, D. S., Song, M. Y., Jeong, J., Han, B. S., Han, J.
H., Chung, Y. H., Kim, J., Kim, T. S., Chang, H. K., Lee, E. J., Lee, J. H., and Yu, I.
J. (2008). Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation
exposure to silver nanoparticles. Inhalation Toxicology, 20(6), 567-574.
Şahin, S. Su arıtma teknolojisindeki kolloidlerin kararlılık esasları. (2008)., Fen Bilimleri
Enstitüsü Dergisi, 1(2).
Tan, D., Bai, B., Jiang, D., Shi, L., Cheng, S., Tao, D., and Ji, S. (2014). Rhodamine B
induces long nucleoplasmic bridges and other nuclear anomalies in Allium cepa root
tip cells. Environmental Science and Pollution Research, 21(5), 3363-3370.
Tavares, A. M., Louro, H., Antunes, S., Quarre, S., Simar, S., De Temmerman, P. J.,
Verleysen, E., Mast, J., Keld A. Jensen, K. A., Norppa, H., Nesslany, F., and Silva,
M. J. (2014). Genotoxicity evaluation of nanosized titanium dioxide, synthetic
amorphous silica and multi-walled carbon nanotubes in human lymphocytes.
Toxicology in Vitro, 28(1), 60-69.
Thill, A., Zeyons, O., Spalla, O., Chauvat, F., Rose, J., Auffan, M., and Flank, A. M.
(2006). Cytotoxicity of CeO2 nanoparticles for Escherichia coli. Physico-chemical
insight of the cytotoxicity mechanism. Environmental Science and Technology,
40(19), 6151-6156.
Tian, F., Cui, D., Schwarz, H., Estrada, G. G., and Kobayashi, H. (2006). Cytotoxicity of
single-wall carbon nanotubes on human fibroblasts. Toxicology in Vitro, 20(7),
1202-1212.
Topaktaş, M., Rencüzoğullar, E. (1993). Chromosomal aberrations in cultured human
lymphocytes treated with Marshal and its effective ingredient carbosulfan. Mutation
Research/Genetic Toxicology, 319(2), 103-111.
Tran, N., Mir, A., Mallik, D., Sinha, A., Nayar, S., and Webster, T. J. (2010). Bactericidal
effect of iron oxide nanoparticles on Staphylococcus aureus. International Journal
of Nanomedicine, 5, 277.
Tratnyek, P. G., and Johnson, R. L. (2006). Nanotechnologies for environmental cleanup.
Nano Today, 1(2), 44-48.
Trouiller, B., Reliene, R., Westbrook, A., Solaimani, P., and Schiestl, R. H. (2009).
Titanium dioxide nanoparticles induce DNA damage and genetic instability in vivo
in mice. Cancer Research, 69(22), 8784-8789.
95
Türkoğlu, Ş. (2012). Determination of genotoxic effects of chlorfenvinphos and
fenbuconazole in Allium cepa root cells by mitotic activity, chromosome aberration,
DNA content, and comet assay. Pesticide Biochemistry and Physiology, 103(3),
224-230.
Unrine, J. M., Hunyadi, S. E., Tsyusko, O. V., Rao, W., Shoults-Wilson, W. A., and
Bertsch, P. M. (2010). Evidence for bioavailability of Au nanoparticles from soil and
biodistribution within earthworms (Eisenia fetida). Environmental Science and
Technology, 44(21), 8308-8313.
Varshney, M., Chandra, A., Chauhan, L. K. S., and Goel, S. K. (2014). In vitro cytogenetic
assessment of trichloroacetic acid in human peripheral blood lymphocytes.
Environmental Science and Pollution Research, 21(2), 843-850.
Vega-Villa, K. R., Takemoto, J. K., Yánez, J. A., Remsberg, C. M., Forrest, M. L., and
Davies, N. M. (2008). Clinical toxicities of nanocarrier systems. Advanced Drug
Delivery Reviews, 60(8), 929-938.
Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., and Berneman, Z. N. (2003). The cell cycle: a
review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell
Proliferation, 36(3), 131-149.
Vivero-Escoto, J. L., Slowing, I. I., Trewyn, B. G., and Lin, V. S. Y. (2010). Mesoporous
silica nanoparticles for intracellular controlled drug delivery. Small, 6(18), 19521967.
Vodicka, P., Kumar, R., Stetina, R., Sanyal, S., Soucek, P., Haufroid, V., Maria Dusinska,
M., Kuricova, M., Zamecnikova, M., Musak, L., Buchancova, J., Norppa, H.,
Hirvonen, A., Vodickova, L., Naccarati1, A., Matousu Z., and Hemminki, K.
(2004). Genetic polymorphisms in DNA repair genes and possible links with DNA
repair rates, chromosomal aberrations and single-strand breaks in DNA.
Carcinogenesis, 25(5), 757-763.
Voutsinas, G., Zarani, F. E., and Kappas, A. (1997). The Effect of Environmental
Aneuploidy Inducing Agents on The Microtubule Architecture of Mitotic
Meristematic Root Cells in Hordeum Vulgare. Cell Biology İnternational, 21(7),
411-418.
Wang, C., Ma, Q., Dou, W., Kanwal, S., Wang, G., Yuan, P., and Su, X. (2009). Synthesis
of aqueous CdTe quantum dots embedded silica nanoparticles and their applications
as fluorescence probes. Talanta, 77(4), 1358-1364.
Wang, J. J., Sanderson, B. J., and Wang, H. (2007). Cytotoxicity and genotoxicity of
ultrafine crystalline SiO2 particulate in cultured human lymphoblastoid cells.
Environmental and Molecular Mutagenesis, 48(2), 151-157.
Wang, L. S., Chuang, M. C., and Ho, J. A. A. (2012). Nanotheranostics a review of recent
publications. International Journal of Nanomedicine, 7, 4679.
96
Wang, L., Stueckle, T. A., Mishra, A., Derk, R., Meighan, T., Castranova, V., and
Rojanasakul, Y. (2014). Neoplastic-like transformation effect of single-walled and
multi-walled carbon nanotubes compared to asbestos on human lung small airway
epithelial cells. Nanotoxicology, 8(5), 485-507.
Webster, P. L., and Davidson, D. (1969). Changes in the duration of the mitotic cycle
induced by colchicine and indol-3yl-acetic acid in Vicia faba roots. Journal of
Experimental Botany, 20(3), 671-685.
Wierzbicka, M. (1998). Lead in the apoplast of Allium cepa L. root tips ultrastructural
studies. Plant Science, 133(1), 105-119.
Wiesner, M. R., Lowry, G. V., Alvarez, P., Dionysiou, D., and Biswas, P. (2006).
Assessing the risks of manufactured nanomaterials. Environmental Science and
Technology, 40(14), 4336-4345.
Win-Shwe, T. T., and Fujimaki, H. (2011). Nanoparticles and neurotoxicity. International
Journal of Molecular Sciences, 12(9), 6267-6280.
Woodruff, R. S., Li, Y., Yan, J., Bishop, M., Jones, M. Y., Watanabe, F., Biris, A. S., Rice,
P., Zhou, T., and Chen, T. (2012). Genotoxicity evaluation of titanium dioxide
nanoparticles using the ames test and comet assay. Journal of Applied Toxicology,
32(11), 934-943.
Wu, J., Wang, C., Sun, J., and Xue, Y. (2011). Neurotoxicity of silica nanoparticles: brain
localization and dopaminergic neurons damage pathways. ACS nano, 5(6), 44764489.
Xia, T., Kovochich, M., Brant, J., Hotze, M., Sempf, J., Oberley, T., Sioutas, C., Yeh, J. I.,
Wiesner, M. R., and Nel, A. E. (2006). Comparison of the abilities of ambient and
manufactured nanoparticles to induce cellular toxicity according to an oxidative
stress paradigm. Nano Letters, 6(8), 1794-1807.
Xiong, Z. T., Wang, H. (2005). Copper toxicity and bioaccumulation in Chinese cabbage
(Brassica pekinensis Rupr.). Environmental Toxicology, 20(2), 188-194.
Xu, J., Sagawa, Y., Futakuchi, M., Fukamachi, K., Alexander, D. B., Furukawa, F.,
Ikarashi, Y., Uchino, T., Nishimura, T., Morita, A., Suzui, M., and Tsuda, H. (2011).
Lack of promoting effect of titanium dioxide particles on ultraviolet B-initiated skin
carcinogenesis in rats. Food and Chemical Toxicology, 49(6), 1298-1302.
Xu, Y., Zhao, D. (2006). Removal of lead from contaminated soils using poly
(amidoamine) dendrimers. Industrial and Engineering Chemistry Research, 45(5),
1758-1765.
Yamakoshi, Y., Umezawa, N., Ryu, A., Arakane, K., Miyata, N., Goda, Y., Masumizu, T.,
and Nagano, T. (2003). Active oxygen species generated from photoexcited fullerene
(C60) as potential medicines: O2-versus O2. Journal of the American Chemical
Society, 125(42), 12803-12809.
97
Yang, X., Liu, J., He, H., Zhou, L., Gong, C., Wang, X., Yang, L., Yuan J., Huang H., He
L., Zhang, B., and Zhuang, Z. (2010). SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and
protein expression alteration in HaCaT cells. Part Fibre Toxicology, 7(1), 1.
Ye, Y., Liu, J., Xu, J., Sun, L., Chen, M. and Lan, M. (2010). Nano-SiO2 induces apoptosis
via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell
line. Toxicology in Vitro, 24(3), 751-758.
Yilmaz, S., Ünal, F., Yilmaz, E., Yüzbaşioğlu, D. and Erkal İlhan, S. (2014). Evaluation of
the genotoxicity of clomiphene citrate. Mutation Research/Genetic Toxicology and
Environmental Mutagenesis, 759, 21-27.
Yruela, I. (2005). Copper in plants. Brazilian Journal of Plant Physiology, 17(1), 145156.
Yruela, I. (2009). Copper in plants: acquisition, transport and interactions. Functional
Plant Biology, 36(5), 409-430.
Yüzbaşıoğlu, D., Ünal, F., and Sancak, C. (2009). Genotoxic effects of herbicide Illoxan
(Diclofop-Methyl) on Allium cepa L. Turkish Journal of Biology, 33(4), 283-290.
Yüzbaşıoğlu, D., Zengin, N. ve Ünal, F. (2014). Gıda Koruyucuları ve Genotoksisite
Testleri. Gıda/The Journal of Food, 39(3).
Zaini, P. A., De La Fuente, L., Hoch, H. C., and Burr, T. J. (2009). Grapevine xylem sap
enhances biofilm development by Xylella fastidiosa. FEMS Microbiology Letters,
295(1), 129-134.
Zhang, H., Jiang, Y., He, Z., and Ma, M. (2005). Cadmium accumulation and oxidative
burst in garlic (Allium sativum). Journal of Plant Physiology,162(9), 977-984.
Zhu, H., Han, J., Xiao, J. Q., and Jin, Y. (2008). Uptake, translocation, and accumulation
of manufactured iron oxide nanoparticles by pumpkin plants. Journal Environment
Monitoring, 10(6), 713-717.
98
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Soyadı, adı
: ÇALBAY, Özlem
Uyruğu
: T.C.
Doğum tarihi ve yeri
: 25.10.1988, Tunceli
Medeni hali
: Bekâr
Telefon
: 0 (312) 362 43 29
e-mail
: calbay.ozlem@gazi.edu.tr
Eğitim
Derece
Okul/Program
Mezuniyet tarihi
Lise
Mobil Anadolu Lisesi
2005
Lisans
Gazi Üniversitesi/ Biyoloji
2011
Yabancı Dil
İngilizce
Yayınlar
Çalbay Ö., Ünal F., Yüzbaşıoğlu D., (2014) Bakır oksit Nanopartiküllerinin Allium
cepa’daki Genotoksik Etkileri. Eskişehir Osmangazi Üniversitesi 22. Ulusal Biyoloji
Kongresi, 23-27 Haziran.
Hobiler
Buz pateni, Dans
GAZİ GELECEKTİR...
Download