T. C GENELKURMAY BAŞKANLIĞI GÜLHANE ASKERİ TIP AKADEMİSİ HAYDARPAŞA EĞİTİM HASTANESİ GENEL CERRAHİ SERVİSİ PAPİLLER TİROİD KANSERİNİN KLİNİK SEYRİ VE PROGNOZU ÜZERİNE GENETİK FAKTÖRLERİN ETKİLERİ Mesut GÜNDÜZ Dz.Tbp.Kd.Bnb. GENEL CERRAHİ TIPTA UZMANLIK TEZİ İSTANBUL 2015 T. C GENELKURMAY BAŞKANLIĞI GÜLHANE ASKERİ TIP AKADEMİSİ HAYDARPAŞA EĞİTİM HASTANESİ GENEL CERRAHİ SERVİSİ PAPİLLER TİROİD KANSERİNİN KLİNİK SEYRİ VE PROGNOZU ÜZERİNE GENETİK FAKTÖRLERİN ETKİLERİ Mesut GÜNDÜZ Dz.Tbp.Kd.Bnb. Gülhane Askeri Tıp Akademisi Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Komutanlığı Lisansüstü Eğitim-Öğretim Yönetmeliği’nin Genel Cerrahi Uzmanlık Proğramı için öngördüğü ‘’ TIPTA UZMANLIK TEZİ’’ olarak hazırlanmıştır. TEZ DANIŞMANI Bülent GÜLEÇ Prof.Tbp.Kd.Alb. İSTANBUL 2015 ONAY SAYFASI Bu çalışma jürimiz tarafından Genel Cerrahi Tıpta Uzmanlık Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Danısmanı: Prof.Tbp.Kd.Alb. Bülent GÜLEÇ Üye : Prof.Tbp.Tuğg. Orhan KOZAK Üye : Prof.Dr. M.Bahadır GÜLLÜOĞLU ONAY Dz.Tbp.Kd.Bnb.Mesut GÜNDÜZ’ün………………tarihinde savunduğu bu tez Akademi Kurulu’nca belirlenen yukarıdaki jüri üyeleri tarafından uygun görülmüş ve kabul edilmiştir. Hayati BİLGİÇ Prof.Tbp.Tümamiral Komutan Bilimsel Yardımcısı Askeri Tıp Fakültesi Dekanı Eğitim Hastanesi Baştabibi iii TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim ve tez çalışmam süresince özverili bir şekilde eğitimimle ve tezimle ilgilenen, bilgi ve tecrübelerini bana aktaran tez hocam ve klinik şefimiz sayın Prof.Dr.Bülent GÜLEÇ’e, uzmanlık eğitimim boyunca bilgi ve mesleki tecrübelerini benimle paylaştıkları için saygıdeğer hocalarım (E) Prof.Dr.Mehmet YILDIZ, (E) Prof.Dr.Mehmet Levhi AKIN, Prof.Dr.Taner YİĞİT, Prof.Dr.Yavuz KURT, (E) Doç.Dr.Cengizhan YİĞİTLER, Doç.Dr.İlker SÜCÜLLÜ, Doç.Dr.Ali İlker FİLİZ, Doç.Dr.Ergün YÜCEL, Doç.Dr.Ahmet Ziya BALTA ve Yrd.Doç.Dr.Yavuz ÖZDEMİR’e teşekkür ederim. Tezimin yazımı, verilerin değerlendirilmesi ve istatistik aşamalarında tecrübesi ve bilgisiyle yardımlarını esirgemeyen Yrd.Doç.Dr.Yavuz ÖZDEMİR’e, FİSH ve PCR aşaması için Doç.Dr.Zafer KÜÇÜKODACI ve Yrd.Doç.Dr.İsmail YILMAZ’a, patoloji servisi teknisyen ve çalışanlarına, cerrahi sanatını ve terbiyesini öğrenmemde örnek olan ve emeği geçen uzman abilerime, asistanlık sürecini paylaştığım, birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum asistan arkadaşlarıma ve tüm klinik çalışanlarına teşekkür ederim. Son olarak sevgisini ve desteğini hep sürdüren, asistanlık eğitimim süresince her konuda özveri gösteren, sabırlı ve kanaatkar eşim Sevil GÜNDÜZ’e, oğlum Deniz Kaan’a, tüm yaşamım boyunca varlıkları ile beni mutlu eden anneme, babama ve kardeşime teşekkürlerimi sunarım. Dr.Mesut GÜNDÜZ İSTANBUL 2015 iv ÖZET Giriş ve Amaç: Papiller tiroid kanserinde nüks ve metastaz ile ilişkili olabileceği değerlendirilen BRAF, RAS, TERT gen mutasyonları ile c-Met gen aşırı üretiminin, klinik seyir ve prognoz üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: 2005-2015 yılları arasındaki papiller tiroid karsinomlu 84 olgunun doku bloklarında, FISH Yöntemi ile c-Met gen amplifikasyonu, PCR Temelli Direk Sekanslama Yöntemi ile BRAF, RAS ve TERT gen mutasyonları araştırılmıştır. Bulgular, yaş, cinsiyet, histolojik tip, tümör boyutu, invazyon tipi, multisentrisite, ekstratiroidal yayılım, metastatik lenf nodu varlığı ve nüks gibi klinikopatolojik özellikler ile karşılaştırılmıştır. İstatistiki analiz SPSS programı kullanılarak, kategorik verilerin karşılaştırılmasında ki-kare ve Fisher’s exact testi, hastalıksız sağkalım süreleri üzerine etkili faktörler, Çoklu Değişkenli Varyans Analizi ve Cox Regresyon analizi ile değerlendirimiştir. İstatistiki anlamlılık için p < 0,05 kabul edilmiştir. Bulgular: BRAF mutasyonu 56 klasik varyant olgusunun %80,4’ünde pozitif olup istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur.(p=0,001) Daha önce literatürde tanımlanmayan BRAF 598-599 CTA insersiyon mutasyonu ilk defa saptanmıştır. TERT mutasyonu; ileri yaş (p=0,033), kapsül invazyonu (p=0,004), lenfatik invazyon (p=0,012), daha yüksek tümör derecesi (grade)(p=0,041), ileri TNM evresi (p=0,001), MACIS skor yüksekliği (p=0,001), artmış nüks oranları (p=0,041) ve hastalıksız sağ kalımla (p=0,004) ilişkili bulunmuştur. Klinikopatolojik özellikler ile c-Met gen amplifikasyonu ve RAS mutasyonu arasına ilişkisi saptanmamıştır.(p>0.05) Sonuç: Papiller tiroid kanserinde, klasik varyant olguların sıklıkla BRAF mutasyonu gösterdiği ve TERT gen mutasyonu olanların nüks riski için takip edilmesi gerektiği değerlendirilmiştir. Anahtar Sözcükler : Papiller Tiroid Karsinomu, BRAF, RAS, TERT, c-Met. v İNGİLİZCE ÖZET (ABSTRACT) Background and Aim: We investigated the effects of BRAF, RAS, and TERT gene mutations, and c-Met gene amplification, which are thought to be associated with recurrences and metastasis, on clinical outcomes and prognosis in Papillary Thyroid Carcinoma. Materials and Methods: c-Met gene amplification and BRAF, RAS and TERT gene mutations were investigated by using fluorescence in situ hybridization (FISH), and direct PCR sequencing method, respectively, in tissue blocks of 84 patients with papillary thyroid carcinoma treated between 2005 and 2015. Results were compared with clinical and pathological features including age, gender, histological type, tumor size, invasion type, multicentricity, extrathyroidal spreading, metastatic lymph node, and recurrence. Statistical analysis was performed with SPSS. Chi-square test and Fischer’s exact test were used in the comparison of categorical variables, and factors affecting disease free survival rates were analyzed with multivariable variance analysis and Cox regression analysis. Probability value under 0.05 was considered as significant. Results: BRAF mutation was positive in 80.4% of 56 classic variant patients and this was statistically significant (p=0.001). BRAF 598-599 CTA insertion mutation, which was not previously described in the literature, was detected as a novel mutation. TERT mutation was found to be associated with advanced age (p=0.033), capsular invasion (p=0.004), lymphatic invasion (p=0.012), advanced grade (p=0.041), advanced TNM stage (p=0.001), increased MACIS score (p=0.001), higher recurrence rates (p=0.041), and decreased disease free survival (p=0.004). There was no relationship between the clinicopathologic features and c-Met gene amplification or RAS gene mutation. (p<0.05) Conclusion: BRAF gene mutation is common in classic variant of papillary thyroid carcinoma, and patients with TERT gene mutation should be followed up for recurrences. Key Words : Papillary Thyroid Carcinoma, BRAF, RAS, TERT, c-Met vi İÇİNDEKİLER SAYFA NO TEŞEKKÜR................................................................................................iv ÖZET ......................................................................................................... v İNGİLİZCE ÖZET .......................................................................................vi İÇİNDEKİLER ........................................................................................... vii SİMGELER VE KISALTMALAR ................................................................. x ŞEKİLLER DİZİNİ ......................................................................................xi TABLOLAR DİZİNİ .................................................................................... xii 1.GİRİŞ VE AMAÇ ..................................................................................... 1 2.GENEL BİLGİLER................................................................................... 4 2.1.TİROİD KANSERİ ................................................................................ 5 2.1.1.İnsidans ve Epidemiyoloji .................................................................. 5 2.1.2.Etiyoloji.............................................................................................. 6 2.1.3.Patolojik Sınıflama ............................................................................ 8 2.2.TİROİD KANSERİNDE KARSİNOGENEZ VE GENETİK ................... 10 2.2.1.Onkogen Aracılı Tiroid Kanseri Oluşumu ........................................ 13 2.2.2.Tümör Supresör Gen Aracılı Tiroid Kanseri Oluşumu ..................... 19 2.2.3.Fonksiyonel Gen Aracılı Tiroid Kanseri Oluşumu............................ 21 2.2.4.Mikro RNA Downregülasyonuna Bağlı Tiroid Kanseri Oluşumu...... 23 2.3.PAPİLLER TİROİD KANSERİNİN OLUŞUMUNDA VE KLİNİK SEYRİNDE ÖNEMLİ MOLEKÜLER GENETİK DEĞİŞİKLİKLER ............ 24 2.3.1.RET/PTC ve NTRK-1 Gen Rearanjmanları ..................................... 24 2.3.2.BRAF Mutasyonları ......................................................................... 25 2.3.3.RAS Mutasyonları ........................................................................... 27 vii 2.3.4.TERT Promotor Gen Mutasyonu..................................................... 28 2.3.5.c-Met Gen Aşırı Üretimi................................................................... 28 2.4.PAPİLLER TİROİD KANSERİ KLİNİĞİ .............................................. 30 2.4.1.Papiller Tiroid Kanserinde Prognoz ................................................. 32 2.4.2.Papiller Tiroid Kanserinde Prognostik Sınıflandırma Sistemleri ...... 36 2.4.3.Papiller Tiroid Kanserinde Tedavi ................................................... 44 2.4.4.İzlem ............................................................................................ 47 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER ................................................................... 48 3.1.Olguların Seçimi, Veri Toplanması ve Çalışmanın Dizaynı ................ 48 3.2.PCR Temelli Direk Sekanslama Yöntemi İle BRAF, RAS (H,K,N) ve TERT Genlerinde Mutasyon Analizi ......................................................... 49 3.2.1.DNA Ekstraksiyonu ......................................................................... 49 3.2.2.PCR Reaksiyonu ............................................................................. 50 3.2.3.Agaroz Jelin Hazırlanması .............................................................. 52 3.2.4.Agaroz Jel Elektroforez İşlemi......................................................... 53 3.2.5.PCR Ürünlerinin Pürifikasyonu........................................................ 54 3.2.6.Sekans Analizi ................................................................................ 55 3.3.FISH Yöntemi ile c-Met Gen Amplifikasyonunun Araştırılması .......... 57 3.4.İstatistiksel Analizler ........................................................................... 58 4. BULGULAR ......................................................................................... 59 4.1.Prevalans ........................................................................................... 60 4.2.Yaş ..................................................................................................... 60 4.3.Cinsiyet ............................................................................................. 61 4.4.Tümör Varyantı ................................................................................. 62 4.5.Grade (Derece) ................................................................................. 64 viii 4.6.Tümör Boyutu ................................................................................... 65 4.7.Vasküler İnvazyon ............................................................................. 67 4.8.Kapsüler İnvazyon ............................................................................ 68 4.9.Lenfatik İnvazyon .............................................................................. 69 4.10.Multisentrisite ................................................................................... 70 4.11.Ekstratiroidal Yayılım ...................................................................... 71 4.12.Metastatik Lenf Nodu ...................................................................... 71 4.13.Radyoaktif İyot Tedavisi ................................................................... 72 4.14.Nüks ................................................................................................ 73 4.15.Evreleme (Stage) ............................................................................. 74 4.16.MACIS Skoru ................................................................................... 75 4.17.Ultrasonografik Bulgular ................................................................... 75 4.18.Hastalıksız Sağkalım ....................................................................... 76 4.19.Sekans Analiz Bulguları ................................................................... 80 4.20.FISH Analiz Bulguları ....................................................................... 83 5. TARTIŞMA .......................................................................................... 85 5.1.BRAF ................................................................................................. 90 5.2.RAS ................................................................................................... 98 5.3.TERT ............................................................................................... 100 5.4.c-Met ................................................................................................ 102 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ..................................................................... 104 7. KAYNAKLAR ..................................................................................... 106 ix SİMGELER VE KISALTMALAR ATK ; Anaplastik Tiroid Karsinomu BRAF ; B-Rapidly Accelerated Fibrosarcoma DTK ; Diferansiye Tiroid Karsinomu FİSH ; Floresan In Situ Hibridizasyon FTK ; Folliküler Tiroid Karsinomu HGF ; Hepatocyte Growth Factor (Hepatosit Büyüme Faktörü) HRAS ; Harvey-RAS KRAS ; Kirsten-RAS MACIS ; Metastases, Age, Completeness of resection, Invasion, Size MAPK ; Mitogen Activated Protein Kinase MTK ; Medüller Tiroid Karsinomu NRAS ; Neuroblasthoma RAS PAX8/PPARγ ; Paired Box Gene 8 / Peroxisome Proliferator ActivatedReceptor γ PCR ; Polymerase Chain Reaction PI3K ; Phosphatydil Inositol 3-Kinase PIP3 ; Phosphatydil Inositol Triphosphate PKB ; Protein Kinase B PTK ; Papiller Tiroid Karsinomu RAF ; Rapidly Accelerated Fibrosarcoma RAS ; Rat sarcoma 2 viral oncogene homolog RET ; Rearranged During Transfection RET/PTC ; Rearranged During Transfection/Papillary Thyroid Carcinoma RTK ; Reseptör Tirozin Kinaz TERT ; Telomerase Reverse Transcriptase USG ; Ultrasonografi x ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 2.1: Tiroid Kanserinde PI3K/Akt ve MAP Kinaz Yolakları .................... 10 Şekil 2.2: Tiroid Kanseri Oluşumunda Rol Alan Genetik Faktörler ............... 12 Şekil 2.3: RET/PTC Tarafından Aktive Edilen Sinyal Yolakları .................... 24 Şekil 2.4: BRAF Tarafından Aktive Edilen Hücre İçi Sinyal Yolakları ........... 26 Şekil 2.5: RAS Tarafından Aktive Edilen Sinyal Yolakları ............................ 27 Şekil 3.1: QIAamp DNA FFPE Tissue Protokolü .......................................... 50 Şekil 3.2: KRAS ve NRAS için PCR Ürünlerinin Örnek Jel Görüntüsü......... 54 Şekil 3.3: PCR Ürünlerinin Pürifikasyon Basamakları .................................. 55 Şekil 4.1: BRAF gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi ........... 77 Şekil 4.2: RAS gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi.............. 78 Şekil 4.3: TERT gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi............ 78 Şekil 4.4: c-Met gen amplifikasyonu hastalıksız sağkalım eğrisi .................. 79 Şekil 4.5: BRAF V600E Sekans Elektroferogramı........................................ 80 Şekil 4.6: BRAF 598-599 İns.CTA Sekans Elektroferogramı ....................... 80 Şekil 4.7: KRAS Ekzon 2 Sekans Elektroferogramı ..................................... 81 Şekil 4.8: NRAS Ekzon 3 Sekans Elektroferogramı ..................................... 81 Şekil 4.9: TERT 228 C>T Sekans Elektroferogramı ..................................... 82 Şekil 4.10: TERT 250 C>T Sekans Elektroferogramı ................................... 82 RESİMLER DİZİNİ Sayfa No Resim 4.1: c-Met gen amplifikasyonun FİSH ile değerlendirilmesi............... 83 Resim 4.2: c-Met gen amplifikasyonu pozitifliğinin gösterilmesi. .................. 84 xi TABLOLAR DİZİNİ Sayfa No Tablo 2.1: Tiroid Tümörleri Sınıflandırması (DSÖ) ......................................... 8 Tablo 2.2: Tiroid Kanser Tipleri ve Görülme Sıklığı........................................ 9 Tablo 2.3: Tiroid Kanseri’nde Proto-onkogenler ........................................... 14 Tablo 2.4: Tiroid Kanserinde Etkili Fonksiyonel Genler ................................ 22 Tablo 2.5: Prognoza Etkisi Olan Klinikopatolojik Özellikler .......................... 32 Tablo 2.6: AMES Sınıflaması (Lahey Klinik) ................................................ 37 Tablo 2.7: AGES Sınıflaması ....................................................................... 38 Tablo 2.8: MACIS Sınıflaması ( Mayo Klinik) ............................................... 39 Tablo 2.9: TNM Sınıflaması (AJCC) ............................................................. 41 Tablo 2.10: TNM Sınıflamasında Evre Grupları (AJCC) .............................. 42 Tablo 2.11: Diferansiye Tiroid Kanserinde Prognostik Skor Sistemleri ........ 43 Tablo 2.12: PTK’de Nüks Riskine Göre Sınıflama ( ATA Klavuzu ) ............. 47 Tablo 3.1: Hedef Genin Primer Sekansı ...................................................... 51 Tablo 3.2: PCR Reaksiyon Karışımı ............................................................ 51 Tablo 3.3: PCR Koşulları ............................................................................. 52 Tablo-3.4: Forward ve Reverse Okuma İçin Big Dye Reaksiyon Karışımı ... 55 Tablo 3.5: Sekans Analizi İçin PCR Koşulları............................................... 56 Tablo 4.1: Çalışma Grubunun Demografik ve Tümör Özellikleri .................. 59 Tablo 4.2: Yaş ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ......................................... 61 Tablo 4.3: Cinsiyet ile Genetik Parametrelerin İlişkisi .................................. 62 Tablo 4.4: Tümör Varyantı ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ...................... 64 Tablo 4.5: Grade ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ..................................... 65 Tablo 4.6: Tümör Boyutu ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ......................... 66 Tablo 4.7: Vasküler İnvazyon ile Genetik Parametrelerin İlişkisi .................. 67 xii Tablo 4.8: Kapsüler İnvazyon ile Genetik Parametrelerin İlişkisi .................. 68 Tablo 4.9: Lenfatik İnvazyon ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ................... 69 Tablo 4.10: Multisentrisite ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ....................... 70 Tablo 4.11: Ekstratiroidal Yayılım ile Genetik Parametrelerin İlişkisi............ 71 Tablo 4.12: Metastatik Lenf Nodu ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ........... 72 Tablo 4.13: RAİ Tedavisi ile BRAF Mutasyonu İlişkisi.................................. 73 Tablo 4.14: Nüks ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ..................................... 74 Tablo 4.15: Evre ile Genetik Parametrelerin İlişkisi ...................................... 74 Tablo 4.16: MACIS Skoru İle Genetik Parametrelerin İlişkisi ....................... 75 Tablo 4.17: Ultrasonografik Bulgular ile BRAF Mutasyonu İlişkisi ................ 76 xiii 1. GİRİŞ VE AMAÇ Tiroid kanseri endokrin sisteminin en sık görülen malign tümörüdür. Yeni tanı alan kanser olgularının yaklaşık %1'ini tiroid kanseri oluşturur. Görülme sıklığı son yıllarda artış göstermektedir. Çevresel faktörler bu artışta kısmen etkili olup, teknolojik gelişmeler sayesinde sessiz olguların teşhis edilmesi bu artışta esasen etkili olmaktadır.(1-3) Tiroid kanserlerinin %90’ı iyi diferansiye,%5-9’u medüller, %1-2’si anaplastik tümörlerden ve %1-3’ü lenfomadan oluşmaktadır. İyi diferansiye tiroid kanserinin dağılımı ise %80-85 papiller, %10-15 follikuler, %3-5 Hurtle hücreli veya onkositik karsinom şeklinde bulunur.(4) En sık görülen Papiller Tiroid Karsinomu (PTK), tiroid kanseri genel görülme sıklığı artışında sorumlu bulunmuştur.(5) Papiller tiroid kanseri görülme sıklığı, coğrafi bölgelere göre değişim gösterir. Bu farklılık hem çevresel hem de genetik etiyolojik faktörlerden kaynaklanmaktadır. Etiyolojide, iyonize radyasyona maruz kalmak PTK gelişiminde etkisi ortaya konmuş en önemli çevresel faktördür.(6) Endemik iyot eksikliği olan bölgelerde folliküler kanserin, iyot proflaksisi uygulanan bölgelerde ise papiller kanserin daha sık görüldüğünü bildiren yayınlar bulunmakla birlikte, iyot eksikliği ya da fazlalığı kesin etyolojik faktör olarak suçlanamamaktadır. Tiroid follikül hücreleri de diğer hücrelerde olduğu gibi hücre bölünmesi, farklılaşması ve apoptozis aşamalarıyla yaşam döngüsünü tamamlar. Hücre yaşam döngüsündeki önemli görevleri yapan bazı proteinler; proto-onkogenler, tümör baskılayıcı genler ve mutator genler tarafından kodlanırlar. Bu genlerin fonksiyon bozuklukları hücre yaşam döngüsündeki aşamalarda problemlere neden olarak kanserleşme sürecini başlatabilmektedir.(7) Tiroid karsinogenezinde, özellikle de papiller kanserde, sıklıkla Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) sinyal yolağının aktivasyonuna yol açan genetik değişikliklerin rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu genetik 1 değişiklikler arasında B- Rapidly Accelerated Fibrosarcoma (BRAF) ve Rat Sarcoma (RAS) genlerinin mutasyonları ve Rearranged During Transfection (RET)/Papillary Thyroid Cancer (PTC) düzenlenmesi vardır. Foliküler tiroid karsinomunda ise, (PAX8)/Peroxisome RAS mutasyonları Proliferator-Activated ve Paired Receptor Box (PPAR) Gene 8 gamanın yeniden düzenlemesi gibi değişiklikler Phosphatidylinositol 3 Kinase/Activate Protein Kinase B (PI3K/AKT) sinyal yolağını etkiler. Bu yolağın aktivasyonu ise hücresel transformasyon ve kanser gelişiminde önemli rol oynar.(3) BRAF, RET ve RAS gen mutasyonları papiller karsinomların yaklaşık %70’inde bulunurlar. Bunlar aynı tümörde nadiren birlikte bulunur. MAPK sinyal yolağındaki bir efektörün dahi aktivasyonu kanserin başlatılması için yeterli olup, yolaktaki tek bir değişikliğin hücre transformasyonuna yol açabileceği değerlendirilmektedir.(8-10) Bu mutasyonların MAPK yolağını aktive etme yeteneği ortak olmasına rağmen, her biri özgün etkisi ile hücre transformasyonuna neden olur. Bu mutasyonlar özgün gen ekspresyonlarına yol açarak, papiller karsinomların farklı fenotipik ve biyolojik davranış özelikleri göstermesine neden olurlar.(11,12) Tirozin kinazlar hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde görev alıp, malign hücre transformasyonu sürecinde de kritik rol oynamaktadır. Hepatocyte Growth Factor (HGF; hepatosit büyüme faktörü), tiroid folliküler hücreleri de dahil birçok epitelyal hücrede mitojenik etkili bir proteindir. c-Met geninin aşırı üretimiyle HGF’ye ait tirosit membranında yerleşik bulunan reseptör tirozin kinazın sentezi ve uyarımı artmaktadır.(13) Literatürde PTK olgularının %70-80’inde c-Met geninin aşırı üretimi bildirilmiş olup, agresif olguların lenf nodu metastazlarında c-Met geninin aşırı üretimi yaygın olarak bildirilmektedir.(14) c-Met geninin aşırı üretimi tümör saldırganlığı ve kötü prognozu açısından bir belirteç olabileceği bildirilmektedir. 2 Yine Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) promotor gen mutasyonu bulunan PTK olgularının daha saldırgan klinik seyir izlediği ve sık nüks görüldüğüyle ilgili yayınlar olup, bu mutasyonun da saldırgan tümör davranışı için başka bir belirteç olabileceği değerlendirilmektedir.(15-17) Tiroid kanserinin moleküler etiyolojisinin daha iyi anlaşılması, hem tanı hem tedavi aşamasında yeni bakış açılarının gelişmesine neden olmaktadır.(18) Çeşitli mutasyonların özellikle MAPK yolağının aktivasyonuna yol açması, tiroid kanserinde bu yolağın çeşitli basamaklarının blokajı esasına dayanan hedef tedavileri için yeni araştırmaları başlatmıştır.(3) Sonuç olarak; tiroid kanserlerinin tetiklenmesi ve ilerlemesi, nokta mutasyonlar, translokasyonlar, kromozomlar arası yeniden düzenlemeler, aktif proto-onkogen ve aktif olmayan tümör baskılayıcı gen şeklinde meydana gelen genetik etkiler ile gerçekleşmektedir. Tiroid kanserinin oluşumunda birden çok çevresel etken ve farklı genetik karsinogenez mekanizmaları bir arada yer alabilmektedir. Papiller tiroid kanseri genellikle iyi prognozlu klinik seyir gösterir. Bazı olgular nüks ve metastazlar ile saldırgan bir tablo sergileyebilir. Tümör büyüklüğü, evresi ve patolojik tanısı benzer olan olgularda bu farklı biyolojik davranış ve klinik seyirde moleküler genetik faktörlerin etkisinin olabileceği düşünülmektedir. Dolayısıyla tiroid kanser dokusunda histopatolojik tanımlamaların dışında, genetik temellerin de ortaya konması tümörün göstereceği klinik davranışın takibi, olguların daha doğru yönetimi ve uygulanacak en uygun tedaviye karar verme aşamalarında faydalı olacaktır.(19) GATA Haydarpaşa Eğitim Hastanesinde 2005-2015 yılları arasında opere olan ve papiller tiroid kanseri tanısı almış 84 olgunun kanser dokularında BRAF, RAS (H, N ve K), TERT genlerinde mutasyon ve c-Met gen amplifikasyonu incelenmiştir. Moleküler belirteçleri pozitif bulunan olgularda, klinikopatolojik veriler karşılaştırılmış, hastalığın saldırganlığı üzerine olan etkilerini belirlemek ve bu belirteçlerin prognostik önemini araştırmak amacıyla retrospektif bir çalışma planlanmıştır. 3 2. GENEL BİLGİLER Tiroid kelimesi kalkan anlamına gelen Grekçe’deki “thyreoides” kelimesinden türemiştir. 1811’de Burns Isii ilk olarak primer tiroid kanserinin tam tarifini yapmış, 1862’de tiroide ait ilk malign hücre Gosselin tarafından gösterilmiş, 1932 yılında ise soliter nodül ve kanser arasındaki ilişki açığa kavuşmuştur.(20) 19. yüzyılın başlarına kadar mortalitesi %40‘ın üzerinde iken tiroid cerrahisinde yaptığı başarılı tiroidektomilerle bu oranı %5 seviyesine düşüren ve tiroid fizyolojisi, patolojisi ve cerrahisi alanında çalışmaları ile Nobel tıp ödülü alan Emil Theodor Kocher (1841-1917) bu ödülü alan ilk cerrah olarak tarihe geçmiştir. Günümüzde tiroid cerrahisinde mortalite ve morbidite oranı %0,1- 0,5 seviyelerine kadar gerilemiştir.(21,22) Tiroid bezi, her biri yaklaşık 20-40 follikül içeren lobüllerden oluşur. Folliküller santraldeki kolloidi çevreleyen epitelyal hücrelerle döşelidir. Papiller tiroid kanseri ve Folliküler Tiroid Kanseri (FTK) folliküler epitel hücrelerinden kaynaklanan kanserlerdir. Ayrıca tiroid bezinde follikül duvarının bazal membrana yakın kısımlarında ya da interfolliküler stromada, tek tek ya da küçük gruplar halinde yerleşen, soluk boyanan C hücreleri olarak da adlandırılan parafoliküler hücreler vardır. Yapı ve fonksiyonları follikül epitel hücrelerinden tamamen farklıdır ve kalsitonin sentezlerler. Medüller Tiroid Kanseri (MTK), C hücrelerinden köken alır.(23,24) Tiroid kanseri lenf nodu metastazının yerini tanımlamak için boyunda santral ve lateral bölge olarak iki ayrı alan tanımlanmıştır. Santral bölge yukarıda hyoid kemik, aşağıda juguler çentik ve lateralde karotis arterler arasında yer alan kısımdır. Tiroid bezinin lenfatik drenajı üst kutup hariç esas olarak santral bölgeye doğrudur. Lateral boyun lenf zinciri, lenfatik akımın drene olduğu ikinci bölgedir. Üst kutup bölgerininin lenfatik drenajı çoğunlukla lateral bölgeye olmaktadır.(25) 4 2.1. TİROİD KANSERİ: 2.1.1. İnsidans ve Epidemiyoloji; Tiroid kanseri tüm malignitelerin yaklaşık %1'ini oluşturur ve en sık görülen endokrin kanserdir. Tiroid kanseri endokrin sistem malignitelerinin %94’ünden ve endokrin sistem kanserlerine bağlı ölümlerin %66’sından sorumlu bulunmuştur.(26) Amerika Birleşik Devletlerinde her yıl saptanan 33.500 yeni tiroid kanseri vakasının yaklaşık olarak %90’ı iyi diferansiye kanserler (papiller ve folliküler), %5-9’u medüller kanser, %1-2’si anaplastik kanserler olarak bildirilmiştir.(27) A.B.D. Ulusal Kanser Enstitüsü’nün Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) veri tabanı 1973 yılından 2002 yılına kadar incelendiğinde tiroid kanseri insidansında 2,9 kat artış saptanmıştır.(28) İyonize radyasyona maruziyetteki artışın, kanser tanısı koyduran histolojik incelemelerdeki gelişmelerin, ultrasonografi kullanımındaki yaygınlık ile küçük tiroid nodüllerinin bile saptanabilmesinin bu artışta etkili olduğu düşünülmektedir.(2,29) Türkiye’de tiroid kanser prevalansı ile ilgili epidemiyolojik çalışmalara dayalı kesin veri olmamakla birlikte, 52.214 kanserli hastanın incelenmesi ile İzmirli ve ark.(30) tarafından yapılan çalışmada tiroid kanserinin %4 oranı ile en sık görülen 10 kanser tipi arasında yer aldığı gözlenmiştir. Eser ve ark.(31) 2006 yılında Türkiye’de tiroid kanser insidansını kadınlarda %8,8 erkeklerde ise %2,1 olarak bildirmiştir. Diferansiye tiroid kanserlerine kadınlarda erkeklerden yaklaşık 3-4 kat daha sık rastlanmaktadır. Her yaşta görülebilmekle birlikte tanı konulduğunda medyan yaş, bayan hastalarda 40, erkek hastalarda ise 44 olarak bildirilmiştir.(32) 5 2.1.2. Etiyoloji; Tiroid kanseri etiyolojisinde radyasyon, diyette iyot yetersizliği, coğrafi bölge, guatrojenler, yaş, cinsiyet, ırk, aile öyküsünün rolü olduğu düşünülmüştür.(33) Çevresel kaynaklı mutajen olarak iyonize radyasyon, tiroid kanseri gelişiminde önemli rolü oynar.(34) Ancak radyasyonla karşılaşan her olguda kanser gelişmemektedir. Maruziyet esnasında hücrenin bölünmekte ve S evresinde olması maligniteye dönüşme riskini yükseltir. Radyasyon kromozomal kırıklara, DNA’da genetik yeniden düzenlenmeye, tümör baskılayıcı gen kaybına ve DNA tamir mekanizmalarının bozulmasına yol açarak kanser oluşumuna neden olmaktadır.(35,36) Boyun bölgesine radyasyon uygulanmış insanların %10’unda tiroid kanseri gelişmektedir ve bunların tamamına yakını papiller tiroid kanserdir. Bu kanserler radyasyona maruziyeti izleyen beşinci yıldan itibaren ve en çok 10–25 yıl sonra görülmektedir.(37) Çernobil nükleer kazasından sonra ortaya çıkan ve büyük çoğunluğunu PTK’in oluşturduğu tiroid kanserindeki 3,75 katlık artış, radyasyona maruz kalmanın papiller kanser gelişimindeki rolünü ortaya koymaktadır.(38) Radyasyona maruziyet neticesinde oluşan PTK daha saldırgan ve nüks etmeye eğilimli olmakla birlikte, prognozu diğer papiller karsinomlardan farklı değildir.(39) İyot alımı yeterli olan bölgelerde PTK insidansı daha sık olup, iyot eksikliği olan bölgelerde ise folliküler tiroid ve anaplastik tiroid kanseri daha sık gözlenmektedir.(40) İyot eksikliği, tiroidin hormon üretme yeteneğinde yetersizlik, diyetle veya ilaç olarak alınan guatrojenler gibi faktörler ile TSH artışı meydana gelmekte, sürekli ve şiddetli TSH uyarısı ise tiroid bezinde düzensiz büyümeye neden olmakta ve tiroid kanseri gelişme riskini artırmaktadır.(41) 6 Hayvan deneylerinde TSH’nın böyle bir etki ile tiroid kanseri meydana getirdiği gösterilmiş olmasına rağmen, TSH’nın insanlarda tiroid kanserine yol açan temel bir faktör olduğu gösterilememiştir. Ancak kronik TSH uyarısının mevcut neoplazinin büyümesine ve prognozunun kötüleşmesine katkıda bulunduğu bilinmektedir.(42) Guatr veya benign tiroid nodülünün tiroid kanseri için risk faktörü olabileceği kabul edilmekle beraber, tiroid nodüllerinde malignite oranı %5 olarak bildirilmektedir.(42) Bazı serilerde Graves hastalığında malign tiroid nodüllerinin sık görüldüğü bildirilmiştir. Hashimoto tiroiditinde ise bazı serilerde %30’a varan değişen oranlarda tiroid kanseri birlikteliği bildirilmiştir.(43) Öte yandan fokal veya diffüz tiroiditler, özellikle de Hashimoto tiroiditi ile tiroid kanserinin ilişkisi konusunda sonuçları birbiriyle çelişkili çok sayıda yayın mevcuttur. Hamartom, multinodüler guatr (MNG), tiroid, meme, kolon ve akciğer kanserlerinin bir arada görülmesi ile karakterize Cowden hastalığı, familiyal adenomatöz polipozis, Gardner sendromu, papiller renal neoplazi ve familiyal non-medüller karsinoma gibi genetik geçişli ailesel hastalıklara da tiroid kanseri eşlik edebilmektedir.(32) 7 2.1.3. Patolojik Sınıflama; Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından tiroid tümörleri Tablo 2.1’de gösterildiği gibi sınıflandırılmıştır.(44) Tablo 2.1: Tiroid Tümörleri Sınıflandırması (DSÖ) (44) Epitelyal Tümörler BENİGN; Foliküler Adenom Diğerleri MALİGN Diferansiye Karsinom; Papiller Karsinom, Foliküler Karsinom İndiferansiye (Anaplastik) Karsinom, İğ Hücreli Dev Hücreli, Küçük Hücreli, Skuamoz Hücreli Karsinom Medüller Karsinom Non-Epitelyal Tümörler BENİGN MALİGN Fibrosarkoma Diğerleri Karsinosarkom, Malign Hemangioma Malign Lenfoma Teratomlar Sekonder(Metastatik) Tümörler Sınıflandırılamayanlar Tümör Benzeri Lezyonlar Tiroid folikül hücrelerinden kaynaklanan tiroid kanserleri diferansiye ve indiferansiye (anaplastik) kanserler olarak ikiye ayrılır. Diferansiye tiroid kanserleri papiller ve foliküler kanserler; az diferansiye tiroid kanserleri ise anaplastik kanser olarak bilinir. Diferansiye tiroid kanserlerinde, köken aldığı tiroid hücresine ait birçok özellik halen korunmaktadır. Bu sayede diferansiye tiroid kanserlerinde radyoaktif iyot ile postoperatif lokal nüks ve uzak metastaz belirlenip tedavi edilebilirler. 8 Anaplastik karsinom da tiroid follikül hücresinden kaynaklanır; fakat bunlarda normal tiroid hücresine ait tüm özellikler kaybolur ve oldukça invaziv özellikler taşırlar.(45,46) Medüller tiroid kanseri ise nöral krestten kaynaklanan parafolliküler C hücresinden gelişir. Tiroid bezine en sık meme, kolon, böbrek kanseri ve malign melanomun metastazı görülür. Bunların dışında multipl endokrin neoplazi (MEN) ve izole ailesel meduller tiroid kanserleri de görülmektedir. Tiroid kanserlerinin görülme sıklığı, sık görüldükleri yaş aralıkları ve 10 yıllık sağkalım durumları Tablo 2.2’de özetlenmiştir.(47) Tablo 2.2: Tiroid Kanser Tipleri ve Görülme Sıklığı (47) TİROİD KANSERİ TİPİ SIKLIK (%) GÖRÜLME YAŞI 10 YILLIK YAŞAM (%) Papiller 70-80 30-50 93-98 Folliküler 10-15 20-60 85-93 Medüller 5-10 30-50 75-80 Anaplastik 1-2 60-80 3-14 9 2.2. TİROİD KANSERİNDE KARSİNOGENEZ VE GENETİK; Araştırmalarda bulunan ve her geçen gün sayısı artan kanser patogenezindeki hücre içi sinyal yolakları, birbirleri ile yakın ilişki göstermektedir. Bazı onkojenik olaylar, karsinogenez sürecinde çok sayıda yolağı harekete geçirebilir. Bu yolakların birbirleri ile olan karmaşık ilişkileri, günümüzde halen birçok araştırmaya konu olmaya devam etmektedir. Hücre içi sinyal iletiminde protein kinazlar, protein fosforilasyonu yaparak yolakların aktivasyonunu sağlar. Protein kinazlar, membran yerleşimli tirozin kinazlar ve sitoplazmik tirozin kinazlar olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Membran yerleşimli olanlara Reseptör Tirozin Kinazlar (RTK) denir. Bu reseptörler çeşitli büyüme faktörleri ile bağlandıktan sonra aktif hale geçerler ve sitoplazmadaki hedef proteinler ile etkileşerek hücre içinde sinyal iletimini sağlarlar.(48,49) PI3K/Akt ve MAP Kinaz yolakları tiroid kanseri gelişiminde önemli yolaklardır. Hücre proliferasyonu esnasında PI3K yolağı, MAPK yolağının tamamlayıcısı olarak gereklidir. Şekil 2.1’de bu iki yolak ve temel elemanları şematize edilmiştir. Şekil 2.1: Tiroid Kanserinde PI3K/Akt ve MAP Kinaz Yolakları (19) (RTK; Receptör Tyrosine Kinase, MAPK; Mitogen Activated Protein Kinases PI3K ; Phosphatydil Inositol 3-Kinase, MEK ; Mitogen Extracellular Signal Regulating Kinase, ERK; Extracellular Signal Regulated Kinase, mTOR ; Mammalian Target Of Rapamycin ) 10 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) Sinyal Yolağı MAPK yolağı hücrede proliferasyon, farklılaşma, apopitozis ve sağkalımda görev alan, aşırı uyarıldığında ise tümör gelişiminde rol oynayan bir hücre içi sinyal yolağıdır. Bu yolağın fizyolojik uyarımı, hücre membranındaki reseptörleri sayesinde birçok büyüme faktörü, hormon ve sitokin tarafından tetiklenir. Reseptör Tirozin Kinazdan (RTK) kaynaklanan sinyalleri RAS, MAPK yolağına aktarır. Normal hücrelerde membrana bağlı küçük bir G proteini olan GTP’ye (Guanozin Trifosfat) bağlı RAS ile direkt etkileşim sonrası Rapidly Accelerated Fibrosarcoma (RAF) Kinaz aktive olur. Aktive olmuş olan RAF, hemen altındaki kendisi de bir serin/treonin protein kinaz olan Mitogen Extracellular Signal Regulating Kinase (MEK)’i fosforiller ve aktifler, o da Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK)’i fosforiller ve aktifler. Aktive ERK nükleustaki düzenleyici proteinleri fosforilleyerek gen ekspresyonunu gerçekleştirir ve sonucunda hücrenin biyolojik aktivitelerinde değişme gerçekleşir.(49, 50) Mutant RAS proteinleri, aktif RAS-GTP formunda kalırlar; bu nedenle, hücrenin kontrolsüz uyarılmasından sorumlu tutulmaktadırlar. İnsan tümörlerinin %30’unda bu yolağın aşırı aktivasyonu suçlanmaktadır. PI3K/Akt Yolağı (Phosphatydilinositol 3-kinase/Protein Kinase B) PI3K/Akt yolağının hücre büyümesinin regülasyonu, proliferasyonu, sağkalımı ve tümörogeneziste temel rolü vardır. Reseptör tirozin kinazlar, büyüme faktörleri ile aktive olduktan sonra bu yolaklar aktiflenir ve böylelikle hücre içinde sinyal iletimi başlar. RET/PTC ve RAS her iki yolakta da rol alırlar.(51,52) Fosfatidil İnositol 3 Kinaz (PI3K) büyüme ve yaşama sinyallerinin iletiminden sorumlu proteinlerdir. Reseptörün uyarılmasından sonra PI3K, hücre membranında bulunan fosfolipidlerin fosforilasyonunu katalizler ve Fosfatidil İnositol Trifosfat (PIP3) oluşur. PIP3, PIP3 Bağımlı Kinazlar (PDK) ve Protein Kinaz B (PKB)’nin aktive olmasını sağlar. PKB, Akt geni tarafından 11 kodlanan bir proteindir. Akt, hücre proliferasyonuna ve apoptozisin inhibisyonuna katılır.(49) PKB/Akt uyarısı hücre içinde çeşitli proteinlerin aktivitelerini etkiler. Bunlardan biri olan “mammalian target of rapamycin (mTOR)” proteini, hücre büyümesi ve translasyonda etkilidir. Fosfataz ve PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome Ten) ise bu yolakta negatif düzenleyici olarak rol alırlar. PTEN tümör süpresör bir gen olup, PTEN kaybı hücre büyümesi, proliferasyonu ve sağkalımı ile sonuçlanır.(50) RTK’lar tarafından RAS aktivasyonu ile PI3K/Akt yolağında dolaylı bir aktivasyon oluşabilir. Normal şartlarda VEGF, EGF, PDGF gibi büyüme faktörlerinin PI3K/Akt yolağını uyarmalarında RAS’ın etkinliği minimal düzeydedir. Buna karşılık onkojenik RAS ise, PI3K yolağının güçlü bir aktivatörüdür. Onkojenik RAS bu yolu aktive ederek apoptozisi baskılar ve karsinogenez sürecinde kritik etkenlerden birini oluşturur.(49) Şekil 2.2: Tiroid Kanseri Oluşumunda Rol Alan Genetik Faktörler (53) ( BRAF: B-Rapidly Accelerated Fibrosarcoma, RAS: Rat Sarcoma Virus, RET/PTC: Rearranged During Transfection/Papillary Thyroid Carcinoma, PAX8/PPARγ ; Paired Box Gene 8 / Peroxisome Proliferator Activated-Receptor γ) 12 Şekil 2.2 de şematize edilen ve tiroid kanseri oluşumuna sebep olan başlıca moleküler genetik etyolojik nedenler, ayrıntıları ile aşağıdaki başlıklar altında incelenecektir: - Onkogen aracılı tiroid kanseri oluşumu - Tümör supresör gen aracılı tiroid kanseri oluşumu - Fonksiyonel gen aracılı tiroid kanseri oluşumu - miRNA downregülasyona bağlı tiroid kanseri oluşumu 2.2.1. Onkogen Aracılı Tiroid Kanseri Oluşumu: Normalde hücrelerde inaktif durumda bulunan ve fonksiyon yapmayan proto-onkogenler ya gen yapısında değişiklik oluşması yani mutasyonlar ile ya da DNA dizisinde değişiklik olmadan gen ekspresyonunun değişikliğe uğraması yani epigenetik alterasyon ile onkogenlere dönüşerek tümör oluşumuna neden olurlar. Sağlıklı bir hücrede proto-onkogenlerin promotor gen alt birimleri hipermetile durumdadır ve protein ekspresyonuna katılamazlar. Epigenetik alterasyon yoluyla proto-onkogenler, promotor alt birimlerinin hipometilasyonuna bağlı olarak aktifleşebilir. Böylece hücrede malign transformasyonu başlatan onko-protein sentezi başlar.(54) Onkogen aracılı tiroid kanserinde ilk olarak 1987 yılında RET/PTC rearanjmanı tanımlanmış (55) ve ardından yapılan çalışmalar ile çeşitli onkogenler ortaya çıkarılmıştır. Tiroid kanserinde yaşa bağlı olarak onkogen mutasyon insidansının arttığı iddia edilmektedir. Şimdiye kadar tiroid kanserinde rolü olduğu bildirilen proto-onkogenler Tablo 2.3’te gösterilmiştir. Tiroid kanserinin oluşumunda ve ilerlemesinde görev alan proto-onkogenler, kromozomal lokalizasyonları, yaygın mutasyon tipleri ve tiroid kanserlerindeki görülme sıklıkları bu tabloda özetlenmiştir.(19,56) 13 Tablo 2.3: Tiroid Kanseri’nde Proto-onkogenler (19) PROTOONKOGEN KROMOZOM LOKASYONU BRAF 7q34 H,K,N RAS 12p12 RET 10q11 RET/PTC MUTASYON TİPİ V 600 E, V 600 D, V 600 R, V 600 K Kodon 12, Kodon 13, Kodon 61 PROTEİN PREVALANS (%) METABOLİK YOLAK PTK FTK ADTK Serin/Treonin Kinaz MAP Kinaz 28-83 10 Nadir GTP az MAP Kinaz 10 50 40 Nokta Mutasyon RTK GDNF 35-50 10 Nadir 10q11 Rearanjman RTK GDNF 30-40 - Nadir NTRK 1 (TRK) 1q22 Nokta Mutasyon, Rearanjman GTP az NGF 10 - Nadir β-Catenin 3q22 Nokta Mutasyon B Kaderin WNT - - 65 c-Met 7q31 Amplifikasyon RTK HGF 70-80 10 - Nokta Mutasyon HMG 1 Nükleer Protein Nükleer Transkripsiyon Faktörleri Nadir Nadir Nadir NÜKLEER ONKOGENLER c myc 8q34 c jun 1p32 c fos 14q24 (NTRK 1; Neurotrophic Tyrosine Kinase, Receptor, Type 1, RTK: Receptör Tyrosine Kinase, MAP Kinaz; Mitogen Activated Protein Kinases, GTP az: Guanosin Triphosphatase, GDNF: Glial Cellline Derivated Nörotrofic Factor, NGF: Nerve Growth Factor, WNT: Wingless+İnt 1 gen, HGF: Hepatocyt Growth Factor, HMG1: High-Mobility Group Protein B1, ADTK: Andiferansiye Tiroid Kanseri) 14 BRAF (v-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B1) Protoonkogeni: Memeli hücrelerinde ARAF, BRAF ve CRAF olmak üzere üç farklı RAF (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) izoformu bildirilmiştir. BRAF protoonkogeni çoğunlukla mutasyon yoluyla onkogene dönüşürken, DNA hipometilasyonu yoluyla da onkojenik etki gösterebilir. BRAF mutasyonlarının çesitli insan kanserlerinde değişik sıklıklarda bulunduğu bildirilmiştir. Malign melanomlarda %40-60, hairy cell lösemilerde %100, pleomorfik ksantoastrositomlarda %66, safra yolları karsinomlarında %20, kolorektal karsinomlarda %10, akciğer adenokarsinomlarında %4,6 ve bazı over tümörlerinde ise %13 oranında saptanmıştır.(57,58) MAPK yolağında önemli role sahip bir gen olan BRAF geni, bu yolakları kullanarak hücre proliferasyonunda ve Siklin D1 aktivasyonunda etkili olmaktadır.(59) Papiller tiroid kanserinde BRAF mutasyon prevelansı %28-83 ile en sık bildirilen mutasyon tipidir. Ayrıca papiller tip kanserlerin dediferansiasyonu sonucu gelişen anaplastik kanserlerde de BRAF mutasyonundan söz edilmektedir.(60) Yapılan araştırmalarda PTK ve FTK’da radyasyon nedenli BRAF mutasyonu bildirilmemiştir.(60,61) Papiller tiroid kanserinde BRAF mutasyon pozitifliği ile hastalığın saldırganlığı arasında ilişki ispatlanmamış olmakla birlikte, literatürde BRAF mutasyonlu PTK’nın prognozunun daha kötü olabileceğini savunan çok sayıda yayın bulunmaktadır.(62-75) RAS (Rat Sarcoma 2 Viral Oncogene Homolog) Proto-onkogeni: Werner Kirsten ve Jennifer Harvey tarafından 1960'lı yıllarda ratlarda sarkoma yol açan virüsler tespit edilmiş ve Rat Sarcoma Virüs olarak adlandırılmıştır. Zamanla rat sarcoma virüs gen sekanslarının insanda da homologlarının varlığının fark edilmesiyle bu genler Kirsten-RAS (KRAS) ve Harvey-RAS nöroblastoma (HRAS) olarak hücrelerinden anılmaya üçüncü başlanmıştır. RAS geni Ardından tespit insan edilmiş 15 ve Nöroblastoma RAS (NRAS) olarak isimlendirilmiştir. Günümüze kadar 30’dan fazla RAS geni tanımlanmıştır.(76) RAS, insan tümörlerinde en sık mutasyona uğrayan bir protoonkogendir. RAS proteini GDP’ye bağlandığı zaman inaktiftir; hücrelerin büyüme faktörü ile uyarılması sonucu GDP, GTP’ye dönüşür ve aktif RAS oluşur. Aktif RAS, tirozin kinaz membran reseptörlerinden kaynaklanan sinyalleri MAPK yolağına nakleder. Hücre içerisinde birçok yolakta görevi olan RAS proteini, esas olarak proliferasyon, diferansiyasyon, adezyon, migrasyon ve apoptoziste aktif rol oynayan MAPK yolağının hücre dışı sinyallerinin nükleusa iletiminde rol oynar. Normal RAS proteininin sinyal üreten dönemi kısa sürelidir. Çünkü intrinsik GTPaz aktivitesi GTP’yi GDP’ye hidrolize eder ve RAS inaktif evreye döner.(65) GTPaz aktivitesi GTPaz Aktive Edici Protein (GAP) tarafından hızlandırılır. GAP, GTP’nin GDP’ye hızla hidrolizine ve sinyal iletiminin sonlanmasına neden olarak, kontrolsüz RAS uyarısını engellerler.(23,77) RAS geni sıklıkla nokta mutasyonu ile aktive olmaktadır. Onkojenik RAS aktivasyonu ekzon 1’de GTP bağlayıcı domainini (kodon 12 veya 13) veya ekzon 2’de GTPaz domainini (kodon 61) etkileyen nokta mutasyonlara sebep olur.(77) Mutasyonlar RAS genini etkilediğinde GAP fonksiyonları yavaşlar. Mutant RAS GTP’ye bağlı uyarılmış formda bulunur. Bu durum ise kronik aşırı stimülasyona ve malign transformasyona sebep olur. RAS mutasyonları insanda birden fazla kanser tipinin gelişiminde rol oynamaktadır. Pankreatik adenokarsinomda, kolanjiokarsinomda, kolon, endometrium, tiroid kanseri, akciğer adenokarsinomu ve myeloid lösemide RAS nokta mutasyonları tanımlanmıştır.(13) Çalışmalarda tümöre neden olan RAS geni nokta mutasyonları, en sık KRAS geninde 12-13. kodonda, NRAS ve HRAS genlerinde 61. kodonda bulunmuştur.(78) 16 Folliküler ve anaplastik tiroid kanserlerinin %40-50’sinde KRAS mutasyonu bildirilmekte iken, PTK olgularında KRAS mutasyonu nadiren bildirilmektedir. (79) RET (Rearranged During Transfection) Proto-onkogeni: RET proto-onkogeni, 10. kromozom uzun kolunda lokalize olup, TGFβ-Related Nörotrofik Faktörü bağlayan tirozin kinaz reseptör proteinini kodlar. Nöral krest kökenli hücre tiplerinden eksprese olduğundan sadece nöroektodermal kökenli parafolliküler C hücrelerinden gelişen medüller tiroid kanserinde saptanmaktadır.(13,80) Çeşitli germ-line ve somatik RET mutasyonları ile veya Reseptör Tirozin Kinaz (RTK) sürekli uyarımı ile Multiple Endokrin Neoplazi tip 2 sendromlarına (MEN2A, MEN2B ve familial medüller tiroid kanseri) yol açar.(81) RET/PTC (Rearranged During Transfection/Papillary Thyroid Carcinoma) Proto-onkogeni: RET geni, tiroid dokularında iyonize radyasyona maruziyet sonrası en yaygın rearanjmana uğrayan proto-onkogendir. RET geni şimdiye kadar bildirilmiş 15 tip fonksiyonel donör gen ile bölge değişimi yaparak yeniden düzenlenmeye uğramaktadır. Bu yeniden düzenlenmeler ilk kez 1987 yılında PTK olgularında bildirilmiş olduğundan RET/PTC olarak adlandırılmıştır.(82) Bugüne kadar tanımlanan 15 adet RET/PTC yeniden düzenlenmelerinden ilk üç tanesi tiroid kanseri için önemlidir.(55) Radyasyona bağlı tiroid karsinomunda RET/PTC yeniden düzenlenmesinin daha sık olduğu bildirilmiştir.(82) Rearanjmana uğrayan RET geni aşırı düzeyde tirozin kinaz reseptör proteini sentezleterek hücreleri transformasyona götürebilmektedir. Çernobil nükleer kazasından sonra radyasyon maruziyetine bağlı gelişen tiroid kanserlerinde %80’e varan oranlarda RET/PTC mutasyonları bildirilmiş olup, sporadik PTK olgularının ise %35-50’sinde RET/PTC-1 mutasyonu tanımlanmıştır. 17 Farelerde yapılan bir çalışmada RET/PTC-1’in metastatik olmayan, RET/PTC-3’ün ise metastatik tiroid tümörlerine neden olduğu gösterilmiştir. Bu durum RET/PTC-1’in PTK oluşumunda, RET/PTC-3’ün ise yayılımında rolü olduğunu düşündürmektedir.(83) NTRK-1 (Neurotrophic Tyrosine Kinase Receptor Type 1): NTRK-1(diğer adıyla TRK), sinir büyüme faktörlerinin bağlandığı transmembran tirozin kinaz reseptörünü sentezler. Bir nokta mutasyonu ya da kromozom 1 ve 3 üzerindeki genlerle yeniden düzenlenme sonrası sürekli aktivite göstererek hücrenin transformasyonunu başlatır. Papiller tiroid karsinomunda NTRK-1 aktivasyonu nadiren bildirilirken, medüller tiroid karsinomunun patogenezinde önemli olduğu düşünülmektedir.(84) β-Catenin: β-Catenin hücre adezyonunda ve transkripsiyonunda rol alan bir proteindir. E-cadherin ile sitoplazmada kompleks oluşturup apopitozisin inhibisyonunu ve hücre proliferasyonunu uyaran genlerin aktifleştirilmesini sağlar. Bu nedenle β-Catenin, onkogen olarak tanımlanmaktadır. Zayıf ve kötü diferensiye tiroid kanserinde E-cadherin ekspresyonu düşük seviyede saptanmış, β-Catenin mutasyonu ise %25-65 oranında tespit edilmiştir. Bu birlikteliğin tiroid kanseri dediferansiasyonunun oluşmasına eşlik eden bir faktör olduğu düşünülmektedir.(82,85,86) c-Met : Met geni tarafından kodlanan c-Met, 1987 yılında bir tirozin kinaz reseptörü olarak tanımlanmıştır. c-Met dışardan alınan sinyalleri sitoplazmaya ileten bir integral plazma membran proteinidir.(87) Met proteini esas olarak tüm epitelyal dokulardan sentez edilir.(88) c-Met epitelyal dokularda HGF (Hepatosit Growth Factor) için bir reseptördür. HGF’nin dokudaki c-Met‘e bağlanmasıyla otofosforilasyon gelişir ve hücre içi yolaklarda aktivasyon gerçekleşir. Bu aktivasyon ile başlayan süreç embriyonik gelişmede, yara iyileşmesinde ve doku rejenerasyonunda önemlidir. 18 c-Met reseptöründeki değişiklikler MET/HGF yolağında kontrolsüz aktivasyona neden olur. Bu yolağın aşırı aktivasyonu apopitozun engellenmesiyle hücresel proliferasyona, anjiogeneze, hücresel motiliteye, invazyona ve metastaza yol açabilir.(89) Kanserde kötü prognoza işaret eden Met geninin varlığı en çok over, meme, akciğer, beyin, baş-boyun, tiroid, mide, pankreas ve kolon kanseri gibi malign hastalıklarda görülebilmektedir.(90) Nükleer Onkogenler (c- myc, c-jun ve c-fos): Mutasyona uğrayarak aktif hale gelen c- myc, c-jun, c-fos protoonkogenleri, hücre büyüme ve farklılaşmasının kontrolünde görev alan nükleer transkripsiyon faktörlerini üretirler. Tiroid kanserinde bunların aşırı ekspresyonu bildirilmektedir. Normal tiroid adenomlarda bu ortamda bulunmadığından proteinler dokusunda ve folliküler tiroid malign tümörlerinde önemli bir moleküler belirteç olarak kabul edilmektedirler.(13) 2.2.2. Tümör Supresör Gen Aracılı Tiroid Kanseri Oluşumu: Tümör supresör genlerin temel görevi hücre çoğalmasını kontrol etmektir. Bu güne kadar 50 civarında tümör supresör gen tanımlanmıştır. Tümör supresör genler, bozulmuş hücre döngüsünün devamını engelleyerek gerektiğinde hücreleri apoptozise yönlendirirler. DNA replikasyonu ve tamirinin hatasız şekilde gerçekleşmesini sağlayarak hücre çoğalmasını kontrol ederler. Tüm hücrelerde ve hücrelerin bütün siklusu boyunca aktif halde bulunurlar. Nokta mutasyon, delesyon, mutasyon, promotor metilasyon, miRNA aracılı genetik değişiklikler gibi değişik mekanizmalarla bu genler inaktive olurlar. Bu durumda onkogenez süreci başlar.(91) Tiroid kanserinde pTEN, RASSF1A, PAX8/PPARγ, p53, MGMT, DAPK1, p16, THR beta ve Rap1GAP etkili olduğu bildirilen tümör supresör genlerdir.(19) 19 pTEN (Phosphatase and T ensin Homolog Deleted on Chromosome Ten): PI3K/Akt yolağı hücresel metabolizmanın kontrolünde, glukoz transportu ve kullanımı, hücre büyümesinin regülasyonu, protein biyosentezi ve apopitozisin önlemesinden sorumludur. pTEN ise bu yolağın negatif düzenleyicisidir. Mutasyonlar sonucu pTEN’in inaktive olması, birçok tipte kanser gelişimine katkıda bulunur. Papiller tiroid kanserinde %2, folliküler tiroid kanserde %15, anaplastik tiroid kanserde ise %23 oranlarında pTEN mutasyonları bildirilmektedir.(92) RASSF1A (RAS Association (RalGDS/AF-6) Domain Family Member): RASSF1A hücre döngüsünde Siklin D1’in birikiminin baskılanmasında ve apopitoz yolağının kontrolünde rol alır. Nokta mutasyon, delesyon, promotor metilasyon gibi değişik mekanizmalarla RASSF1A inaktivasyonu gerçekleşebilir.(93) RASSF1A hipermetilasyonu birçok kanser tipinde sıkça rastlanılan tumör supresör gen değişikliğidir.(94) Anaplastik ve medüller tiroid kanserinde %80 oranında, PTK ve FTK’de ise %60-70 oranında RASSF1A promotor hipermetilasyonu bildirilmektedir.(95) PAX8/PPARγ (Paired Box Gene 8 / Peroxisome Proliferator Activated-Receptor Gamma) Rearanjmanı: PAX8 geni, embriyonel dönemde tiroid folliküler hücrelerin ilk farklılaşmasında görev yapar ve promotor gen hipermetilasyonuyla inaktive edilir.(96,97) Bu genler yetişkinlerde hiçbir somatik hücrede eksprese edilmezler. Ancak PAX8 geni, Peroksizom Proliferatör-Aktivatör Reseptör Gama (PPARγ) geniyle sıklıkla rearanjmana uğrayarak yeniden eksprese olabilmektedir. Bu rearanjman sırasında bir tümör supresör gen olan PPARγ’ın inaktive olmasıyla onkogenez sürecinin başladığı sanılmaktadır. RAS mutasyonlarında olduğu gibi PAX8/PPARγ rearanjmanlarının FTK gelişimiyle ilişkili olduğu düşünülmektedir.(98,99) 20 p53: Bir tümör supresör gen olan p53 geni, transkripsiyonu düzenleyen p53 proteinini kodlar. Bu protein, hücre homeostazisinde önemli role sahip olup, hasarlı DNA’nın onarılmasında ve apoptozisin düzenlenmesinde görev alır. Bu gende meydana gelen nokta mutasyonlar sonucunda p53 proteini inaktive olur. Defektif p53 ise karsinogeneziste, kanser progresyonunda ve kanser tedavisi direncinde önemli rol oynar. Bu p53 gen mutasyonlarına iyi diferensiye tiroid kanserinde pek rastlanmazken (%0-9), anaplastik ve kötü diferansiye tiplerinde sıkça (%67-88) görülür.(60,85,100) MGMT (Metilguanin-DNA Metiltransferaz): MGMT normal hücrelerde bulunan hücresel DNA tamir proteinidir. Alkilleyici ajanların sitotoksik etkisini azaltarak karsinogenezisi durdurduğu için tümör supresörü olarak sınıflanır. Alkilleyici ajanlara maruziyet sonrası oluşan DNA hasarını onarmak için MGMT ekspresyonu artar. Literatürde diğer kanser tiplerinde olduğu gibi tiroid kanserlerinde de artmış MGMT ekspresyonunu bildiren yayınlar bulunmaktadır.(100,101) 2.2.3. Fonksiyonel Gen Aracılı Tiroid Kanseri Oluşumu: İnsanda 20-25 bin adet fonksiyonel gen tanımlanmıştır. Organizmanın bütün hücrelerinde ve hücrelerin bütün siklusları boyunca histon protein genleri ve Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) gibi genler aktif halde bulunurken, Sodyum İyodür Simporter (NIS) proteini ve hormonların sentezlendiği bazı genler ise sadece belli doku ve hücre gruplarında aktiftirler. Bu genlere doku spesifik genler de denir. Kanser oluşumunda bazı fonksiyonel genlerin mRNA ekspresyonlarının arttığı veya azaldığı yapılan çalışmalarda görülmüştür. Tiroid kanser gelişiminde etkili olduğu ortaya konabilmiş ve mutasyon sonucu tiroid karsinogenezinde etkili olan fonksiyonel genler, ekspresyon durumları, sentezledikleri fonksiyonel protein ve etkili oldukları tiroid kanser tipleri Tablo 2.4’de gösterilmiştir.(19) 21 Tablo 2.4: Tiroid Kanserinde Etkili Fonksiyonel Genler (19) FONKSİYONEL GEN EKSPRESYON DURUMU PROTEİN TİROİD KANSERİ TSH VE TSH-R Artış TSH, THR A ve B FTK, MTK Na/I Simporter Azalma Sodyum İyodür Simporter PTK, FTK, MTK, ATK TTF-1 Artış Tiroglobulin ve Tiroperoksidaz PTK, FTK, MTK, MTHFR Azalma Hücre içi metil sentezi Genel Onkogenez MDR-1 Azalma Glikoprotein P PTK, FTK, PAX 8 Artış Transkripsiyon Faktörü PTK, FTK, FOXE-1 Artış Transkripsiyon Faktörü PTK CYP 450 Azalma CYP 450 Enzimleri Genel onkogenez MMP 3 ve 9 Artış Matriks Metaloproteinaz PcG Artış Policomb Grup Proteinler COX 2 Artış Sitokin Etkili Protein PTK, Agresif Tümör, Metastaz PTK, Agresif Tümör, Metastaz PTK, ATK (TSH; Thyroid Stimulating Hormone, TSH-R; Thyroid Stimulating Hormone-Receptor, TTF-1; Thyroid Transcription Factor-1, MTHFR; Methylene Tetra Hydro Folate Reductase, MDR-1; Multi-Drug Resistance 1, PAX 8; Paired Box Gene 8, FOXE 1; Forkhead Box Protein E1 CYP 450; Cytochrome P450, MMP; Matrix Metallo Proteinases, PcG; PolyComb Group, COX 2; Cyclooxygenases 2, PTK; Papiller Tiroid Kanseri, FTK; Folliküler Tiroid kanseri, ATK; Anaplastik Tiroid Kanseri ) 22 2.2.4. Mikro RNA (miRNA) Downregülasyonuna Bağlı Tiroid Kanseri Oluşumu: Transkripsiyon sonrası dönemde genin düzenlemesinde miRNA’lar görevlidir. Hücre proliferasyonu, hücre farklılaşması, immün yanıt, hematopoezis ve apoptozis gibi süreçlerde rol alırlar.(102,103) Farklı tümör dokularına özgü olarak değişik tipte ve miktarlarda miRNA sentezi olmaktadır. Şimdiye kadar tanımlanan 1048 miRNA’dan, ancak 22’si kanserle ilişkili bulunmuştur. Çalışmalarda miRNA-200 ailesinin kanser invazyonuyla ilgili olduğu bildirilmiştir.(102,104) Araştırmalar, miRNA-146b, 200, 221 ve 222’nin agresif papiller tiroid kanserinde aşırı eksprese edildiklerini göstermiştir.(105) Bazı tiroid kanser tiplerine özgü miRNA profillerinin olması nedeniyle tiroid kanserinin tanı, tedavi ve prognozunun belirlenmesinde kullanılabilecek bir parametre olabileceği değerlendirilmektedir. 23 2.3. PAPİLLER TİROİD KANSERİNİN OLUŞUMUNDA VE KLİNİK SEYRİNDE ÖNEMLİ MOLEKÜLER GENETİK DEĞİŞİKLİKLER Papiller tiroid kanserin patogenezinde başlıca iki genetik değişiklik yer alır; kromozom rearanjmanı (RET/PTC ve TRK yeniden düzenlenmeleri) ve nokta mutasyonları (BRAF ve RAS mutasyonları).(23) 2.3.1. RET/PTC ve NTRK-1 Gen Rearanjmanları ; 10. kromozomda bulunan RET geni ile 1. kromozomda yerleşik NTRK1 geni, hücre büyümesi ve farklılaşması için hücre dışından gelen iletileri aktaran reseptör tirozin kinaz (RTK) ailesinin üyeleridir. Düzenleyici etkilerinin birçoğunu MAP Kinaz sinyal yolağını kullanarak gösterirler. Papiller tiroid kanserinde kromozom 10’un parasentrik inversiyonu veya kromozom 10 ile 17 arasında resiprokal translokasyonlar sonucu oluşan yeni füzyon genleri RET/PTC olarak bilinir (Şekil 2.3).(8,23) Şekil 2.3: RET/PTC Tarafından Aktive Edilen Sinyal Yolakları (53) (SCH: Src Homology 2 Domain Containing, FRS 2: Fibroblast Growth Factor Receptor Substrate 2, GRB 2: Growth Factor Receptor-Bound Protein 2, SOS; Son of Sevenless, MEK; Mitogen Extracellular Signal Regulating Kinase, ERK; Extracellular Signal Regulated Kinase) 24 Papiller tiroid kanserinde RET/PTC gen rearranjmanları %20-30 oranında görülür. Çocuklarda ve radyasyon maruziyetine bağlı olarak ortaya çıkan PTK’de anlamlı oranda yüksektir.(78,106) Tiroid karsinomlarında en sık RET/PTC 1 (%60-70), ikinci sıklıkta RET/PTC 3 (% 20-30) görülür. RET/PTC 2 ve diğerleri tüm rearanjmanların %5’inden azını oluşturur. Papiller mikrokarsinomlarda ensık RET/PTC 1, solid ve tall cell varyantta ise en sık RET/PTC 3 gen rearanjmanı görülmektedir.(78) Bu genetik değişikliklere sahip olan PTK, olmayanlara göre daha saldırgan seyirlidir.(12,78) Yapısal olarak tirozin kinaz bölgesini aktive eden NTRK 1 geninin translokasyonu PTK’de %5-10 oranında görülür.(23) RET veya NTRK 1 genlerindeki kromozomal yeniden düzenlenmeler ve BRAF mutasyonları tiroid epitelini etkilediğinde bu iki mekanizma da MAP Kinaz sinyal yolağının aktifleştireceğinden PTK bu moleküler anormalliklerinden yalnızca birini taşıyacaktır.(8,23) 2.3.2. BRAF Mutasyonları ; RAF izoformu olan BRAF hücre bölünmesi ve farklılaşmasında önemli olan MAPK sinyal yolağında görev alır.(78) Tüm RAF kinazların içinde MAP Kinaz yolağının en güçlü aktivatörü BRAF’tır.(Şekil 2.4) Papiller tiroid kanserinin patogenezinde önemli oranda rol oynamakta olup, folliküler karsinom ve nodül oluşumunda rolü gösterilmemiştir. Papiller tiroid karsinomunda %40-45 oranında BRAF mutasyonları görülebilir. BRAF mutasyonlarının %80 kadarından T1799A transversiyonu sorumludur.(107) Burada, 1799 pozisyonunda Timin-Adenin transversiyonu sonucunda 600 pozisyonunda valin yerine glutamat geçer. Oluşan V600E nokta mutasyonu, BRAF’ı sürekli aktif hale getirir.(108) BRAF V600E mutasyonunun onkojenik ve transforme edici etkisi, yapılan çalışmalar ile ortaya konmuştur.(107) 25 Şekil 2.4: BRAF Tarafından Aktive Edilen Hücre İçi Sinyal Yolakları (53) (RET ; Rearranged During Transfection, RAS ; Rat Sarcoma Virüs, BRAF ; B-Rapidly Accelerated Fibrosarcoma, MEK ; Mitogen Extracellular Signal Regulating Kinase, ERK; Extracellular Signal Regulated Kinase) BRAF V600E mutasyonu, invaziv tümör büyümesi ve klasik varyant ile ilişkili bulunmuştur. BRAF mutasyonu olan hastaların olmayanlara göre daha kötü prognoza sahip olduğu ve rekürrens riskinin daha yüksek olduğu yapılan farklı çalışmalarla bildirilmiştir.(8,65,78) BRAF mutasyonları bulunan hastalarda ekstratiroidal invazyon ve lenf nodu metastazının daha sık ve tanı esnasında daha ileri evreye sahip oldukları öne sürülmektedir.(109) BRAF V600E mutasyonunun tiroid bezinde sodyum-iyodür simporter (NİS) protein ekspresyonunu bozarak, tedavi amacıyla kullanılan I-131 tutulumunda da azalmaya neden olduğu, bu nedenle radyoaktif iyot tedavisine direnç oluşturarak rekürrens riskini artırdığı bildirilmektedir.(110) Tiroid hücre kültürlerine selektif BRAF inhibitörlerinin eklenmesi ile BRAF mutasyonuna sahip hücre kültürlerinin inhibisyonunun gerçekleştiği gösterilmiş olup, bu inhibitörlerin gelecekte PTK tedavisinde kullanılabileceği düşünülmektedir.(111) 26 2.3.3. RAS Mutasyonları ; Şekil 2.5: RAS Tarafından Aktive Edilen Sinyal Yolakları (53) (PI3K;Phosphatydil Inositol 3-Kinase, AKT=PKB;Protein Kinase B, PLC:Phospholipase-C, DAG:Diacyl Gliserol, PKC:Protein Kinase C BAD:Bcl-2-Associated Death, BCL:B-cell lymphoma, Ral;Ras-related protein) RAS tarafından uyarılan hücre içi önemli yolaklar ve bu yolaklarda görevli elemanlar Şekil 2.5’te gösterilmiş olup, tiroid karsinogenezinde rolü olan yolaklar vurgulanmıştır. Folliküler karsinomda olguların yaklaşık yarısında en yaygını NRAS olmak üzere diğer RAS mutasyonları gözlenmektedir Yapılan çalışmalarda RAS mutasyonlarının FTK’de %40-50 oranında, folliküler adenomlarda %20-40 oranında, PTK’de ve özellikle folliküler varyantta %10-20 oranında bulundukları bildirilmektedir.(23,78,112) Sonuç olarak PTK patogenezinde BRAF, RAS ve RET/PTC genlerinin etkisi ön plana çıkmaktadır. 27 2.3.4. TERT ( Telomerase Reverse Transcriptase ) Promotor Gen Mutasyonu Telomeraz, kromozom uçlarında TTAGGG tekrarı olan telomer RNA komponenti ve reverse transkriptaz aktivitesine sahip bir protein komponentinden oluşan bir ribonükleoprotein polimerazıdır.(113) Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) geni hücre çoğalmasını sağlayan telomerazın, reverse transkiptaz bileşenini kodlar. Telomeraz aktivitesi hücrenin ölümsüzlüğü için gereklidir. TERT mutasyonlarında artan telomeraz aktivitesi ile hücrenin sınırsız çoğalması görülür.(114) Literatürde PTK, uveal, konjonktival ve kutanöz melonoma, mesane tümörü, adrenal tümörler ve glioblastoma olgularında TERT promotor gen mutasyonları tariflenmiştir. Literatürde PTK olgularında TERT mutasyonunun C228T ve C250T olmak üzere iki şeklinin bulunduğu bildirilmiştir. Ayrı ayrı veya iki mutasyonun birlikteliği görülebilmektedir.(16) Bu mutasyonlar PTK’de %12 ve FTK’de %14 oranında mevcut olup, tanı anında ileri yaşta olma ve kötü prognoz ile anlamlı derecede ilişkili bulunmuştur. Medüller tiroid kanserinde ve tiroidin benign lezyonlarda TERT mutasyonlarına rastlanmamıştır. Xing ve ark.(17) PTK olgularında BRAF V600E ile bu mutasyonun C228T formu ile birlikteliğinin daha saldırgan klinik tabloya yol açtığını ve yüksek rekürrens oranları ile ilişkili olduğunu bildirmiştir. Agresif seyir gösteren tiroid kanserinde TERT promotor gen mutasyonunun tespit edilmesiyle bu mutasyonun prognostik bir marker olarak kullanılabileceği değerlendirilmektedir.(15) 2.3.5. c-Met Gen Aşırı Üretimi; Protoonkogen olarak bilinen c-Met geni, Hepatosit Growth Faktör/Scatter Faktör (HGF/SF) tirozin kinaz reseptörünü kodlar. HGF normal embriyonik süreçte epitel hücre farklılaşması, migrasyonu ve proliferasyonunda görev alır.(115) Uygunsuz HGF aktivasyonu ile normal epitel hücreleri invaziv özellik kazanabilirler.(116,117) 28 c-Met aşırı üretimi kolorektal, over, pankreas, küçük hücreli dışı akciğer, renal cell, ve tiroid karsinomları dahil olmak üzere çeşitli epitelyal tümörlerde gözlenmiştir.(118) Aşırı üretimi reseptörde değişikliğe ve kontrolsüz sinyal iletimine yol açarak PTK’de hücre motilitesi ve invazyon artışıyla sonuçlanır.(119-121) Bu nedenle c-Met’in papiller tiroid kanserinin invazyon ve metastazında önemli olduğuna inanılmaktadır.(40) Papiller Tiroid Kanserlerinin %70-80’inde c-Met aşırı üretimi bildirilmekte olup, yine agresif varyant papiller kanserin lenf nodu metastazlarında yaygın olarak aşırı üretim bildirilmektedir.(13,14) Bu sebeple c-Met aşırı üretiminin prognostik bir marker olabileceği değerlendirilmektedir. 29 2.4. PAPİLLER TİROİD KANSERİ KLİNİĞİ; Papiller tiroid kanseri tüm tiroid kanserleri arasında en sık görülen ve radyasyon ile ilişkisi en iyi bilinen tiroid kanseridir.(122) Diyette iyodun replase edildiği gelişmiş ülkelerde; tiroid kanserlerinin %80-85’ini oluşturmaktadır.(123) Her yaş grubunda görülmekle birlikte, en sık 20-50 yaşlarda rastlanır. Kadınlarda erkeklere oranla 3-4 kat daha fazladır.(124) PTK, tiroid bezinin yanı sıra ektopik tiroid dokusunda, teratomlarda (struma ovari) ve tiroglossal duktus kistinde de gelişebilir.(125) Çoğunlukla klinik bulgu vermezler. Olguların büyük çoğunluğunda tanı, boyun görüntülemeleri sırasında saptanan asemptomatik nodüllerin incelenmesi sonucunda konulur. Belirti veren olgularda hastaların en sık hastaneye başvuru nedeni boyunda ağrısız şişliktir. Özofagus basısına veya invazyonuna bağlı yutma güçlüğü, rekürren laringeal sinirin invazyonuna bağlı ses kısıklığı ve trakea basısına bağlı nefes darlığı ender olarak görülen bulgulardır.(126) Ultrasonografide düzensiz sınırlı, solid, hipoekoik, halosu olmayan, mikrokalsifikasyonlar içeren ve dopplerde nodül içinde kanlanması çok ve düzensiz olan nodüllerde PTK’den kuşkulanılır. Tiroid nodülü veya metastatik lenf noduna yapılan ince iğne aspirasyonunun sitolojik değerlendirmesi ile tanı konulur. Tipik hücresel özellikleri nedeniyle folliküler kanserlerden farklı olarak papiller kanserlerde sitolojik inceleme ile tanı konulabilmektedir. Deneyimli ellerde yapılan ultrasonografi eşliğinde ince iğne aspirasyonu ve sitolojik incelemenin yanlış negatif olma olasığı % 2' lere kadar düşmektedir.(127) PTK tanısı; histolojik olarak papiller yapı, psammoma cisimciklerinin olması ve nükleus özelliklerine göre konulur. Genellikle papillaları oluşturan hücreler küboidal yapıda, iyi differansiye, uniform ve düzgün sıralanmış hücrelerden oluşurken, bazı olgularda hücresel ve nükleer morfolojide anaplastik özellikler bulunabilir. 30 Klasik papiller yapı bazı alt gruplarda görülmeyebilir. Ancak papiller kanserlerin hücre çekirdeğine ait özellikleri karakteristiktir. Nükleusun iri ve buzlu cam görünümünde olması ışık mikroskobu altında boş bir nükleus görünümü ortaya çıkarır. Bu görünüm çizgi roman karakteri Orphan Annie’nin gözlerine benzemesinden dolayı bu isimle de anılmaktadır. Papiller tiroid kanseri genellikle kapsülsüz, sınırları belirsiz ve invaziv bir tümördür. Papiller kanserlere ait tümörlerin yaklaşık %10’u kapsüllü de olabilir.(128) Tiroid papiller kanseri, sintigrafide genellikle soğuk nodül olarak görülür. Ancak kolloidal nodüller de soğuk nodül oluşturduğu için sintigrafinin ayırıcı tanıdaki değeri son derece düşüktür. Papiller tiroid kanserleri tiroid içi lenfatik yayılıma bağlı "multifokal" olabilirler. Tiroid bezinin bütünü histopatolojik olarak incelenirse multifokal tümör oranı %87,5'e kadar çıkmaktadır.(129) Rutin histopatolojk incelemelerde bu oran %20 ile 50 arasında bulunur. PTK, hem tiroid bezi içerisinde yayılmaya hem de tiroid kapsülünü ve boyundaki komşu yapıları invaze etmeye eğilimlidir. Papiller tiroid kanser daha çok lenfatik sistem yoluyla yayılır.(130) Sıklıkla lateral ve santral boyun lenf nodlarına ya da mediasten lenf nodlarına metastaz yapar. Tanı anında olguların yaklaşık %50’sinde lenf nodu metastazı vardır. Tümör boyutu arttıkça lenf nodu metastazı da artmaktadır. Servikal lenf noduna yayılım eğilimi olmasına rağmen uygun şekilde tedavi edilirse uzun dönem prognozu oldukça iyidir.(131) Tümör istmusta yerleşimli ise veya her iki tiroid lobunda gelişirse lenf nodu metastazı bilateral olma eğilimindedir ve mediastene de ilerleyebilir ya da yumuşak dokuyu invaze edebilir. Tüm bunlar kötü prognoz kriterleridir.(132) Lenfatik yayılımın yanında hematojen olarak da yayılabilir. Özellikle kemik ve akciğer olmak üzere uzak metastaz yapmaya eğilimlidir.(130) Uzak metastaz tanı sırasında %5’den daha azdır.(128) 31 PTK’de anaplastik tümöre dönüşüm oranı %1’den daha azdır ve bu durum p53 onkogen ekspresyonu ile ilişkili bulunmuştur.(133) 2.4.1. Papiller Tiroid Kanserinde Prognoz Papiller Tiroid Kanserde prognoz oldukça iyidir. 10 yıllık yaşam süresi %90’ın üzerinde, genç hastalarda ise %98’in üzerindedir.(125,126,134) Hastaların çoğunda ilk tedavi sonrası yüksek kür oranları vardır. Ancak bazıları nüksler veya gösterebilmektedirler. uzak metastazlar Prognoza etkisi nedeni açısından, ile bazı kötü prognoz klinikopatolojik özellikler Tablo 2.5’de sıralanmıştır. Tablo 2.5: Prognoza Etkisi Olan Klinikopatolojik Özellikler Hasta İlişkili Faktörler Yaş Cinsiyet Otoimmün tiroid hastalığı Histopatolojik Faktörler Tümörün histolojik tipi ve çeşitleri Tümörün grade ve DNA ploidisi Mikroskopik özellikleri Primer tümör boyutu Multisentrik tümör Ekstratiroidal invazyon Lenf nodu metastazı Uzak metastaz Tedavi İlişkili Faktörler Primer cerrahinin genişliği Tiroid dokusunun iyot 131 ile ablasyonu Tümör Belirteçleri Serum tiroglobulin düzeyi Yaş ve Cinsiyet Tanı sırasındaki yaşın ileri olması ile nüks ve kansere bağlı ölüm riski doğrusal olarak artar.(135-137) Yaşlı hastalarda, klinik relaps ilk tedaviden sonra daha kısa sürede oluşur. Nüks ve ölüm arasındaki zaman aralığı daha kısadır.(138) İleri yaşta hastalarda tanı anında lokal agresif tümöre ve uzak metastaza daha sık rastlanılır. 32 Çocuk ve ergenlerde, metastatik hastalık dahi uzun vadede daha iyi bir prognoza ve çok düşük bir ölüm oranına sahiptir.(139,140) Erkek cinsiyet, kötü prognoz sebebi olup, bazı serilerde bağımsız bir risk faktörü olarak bildirilmiştir. (135,138,141,142) Tümör Boyutu ve Multifokalite Papiller mikrokarsinomlarda sağkalım ve nüks açısından primer cerrahi tedavi sonrası mükemmel bir prognoz vardır. Çok sayıda seride, primer tümörün artan boyutu ile tümöre spesifik mortalite ve nüks riski arasında progresif bir artış bildirilmiştir. Multifokalite, multiple primer tümör odakları ya da tümörün intratiroidal metastazı olarak ifade edilebilir. Multifokalite ile lenf nodu metastazı, lokal persistant hastalık, uzak metastaz, ve 30 yıllık mortalite arasında önemli ölçüde ilişki bulunmuştur.(143,144) Mikroskopik Özellikleri: Literatürde atipi, mitoz, nekroz, vasküler invazyon gibi bulguların kötü prognostik etkisi olduğunu vurgulayan yayınlar vardır.(145) Papiller ve foliküler yapıların oranları, fibrozisin varlığı veya yokluğu, solid alanların varlığı veya yaygınlığı, psammom cisimciklerinin varlığı prognozu etkilemez.(126) Patolojik Alt Tipi (Varyant) Papiller kanserin “tall cell” varyantı, ‘’kolumnar hücreli’’ varyantı, ve ‘’oksifilik’’ varyantı kötü prognoz ile ilişkilidir.(146, 147) Kapsüllü ve foliküler varyantları iyi prognoz gösterirken, diffüz sklerozan varyant ise arada bir prognoz gösterir.(148,149) Lokal İnvazyon Prognozu kötü yönde etkileyen faktörlerin başında gelmektedir. (134, 150) Ekstratiroidal invazyon papiller tümörlerde %5-10 arasında görülür. Lokal tümör invazyonu olan olgularda lokal nüks, uzak metastaz ve tümöre bağlı ölüm oranları daha yüksek oranda görülür.(151) 33 Lenf Nodu Metastazı Lenf nodu metastazı PTK’in farklı alt tiplerinde %37’den %65’e kadar değişen oranlarda görülür. Bazı araştırmalarda bölgesel lenf nodu metastazının, tümör rekürrensi ve kanser spesifik mortalite ile yüksek oranda ilişkili olduğu gösterilmiştir. Diğer yandan, bazı araştırmacılar kümülatif sağkalımı önemli ölçüde etkilemediğini gösterse de, Ohio State Üniversitesinin çalışmasında lenf nodu metastazı varlığının kanserden ölüm tahminlerinde önemli bir bağımsız prognostik faktör olduğu bildirilmiştir.(135,152) Bilateral servikal ve mediastinal lenf nodları varlığı kanser nedenli ölümlerle doğrudan ilgilidir. Erken ve kapsamlı bir tedavi gerektirir. Uzak Metastaz Tanı anında uzak metastaz kötü prognoz belirtisidir. Uzak metastazlı olgularda tümör nedenli ölüm oranları 5 yıllık izlemde %36-47 arasında değişir ve 15 yıllık izlemde %70’lere çıkar.(135,153) Otoimmün Hastalık Öyküsü Bazı istisnalar dışında diferansiye tiroid kanserli olgu serilerinde tedaviye yanıtın klinik izleminde veya tümörle ilişkili ölümlerde, Graves hastalığı olan ya da olmayanlar arasında anlamlı farklılık bulunmamıştır.(154, 155) Aksine, Hashimoto tiroiditi veya lenfositik infiltrasyonu olan PTK olgularının iyi bir prognoz sergilediği gösterilmiştir.(156) Grade (Derece) Papiller tiroid kanserde yaygın olarak kabul edilmiş bir·dereceleme sistemi yoktur. Akslen(157) tarafından, vasküler invazyon, nükleer atipi ve nekrozun değerlendirildiği yeni bir dereceleme şeması hazırlanmıştır. Grade 1, üç faktörün de bulunmadığı; Grade 2, üçünden herhangi birinin bulunduğu; Grade 3 ise üç faktörün en az ikisinin veya hepsinin birlikte bulunduğu derecedir. Yüksek dereceli grupta mortalite anlamlı şekilde yüksek bulunurken, multivaryans analizde derecenin diğer risk faktörlerinden bağımsız olduğu ortaya konmuştur. 34 Üç Avrupa serisinde ve Mayo klinikte PTK ile ilgili yapılan çeşitli istatistiksel analizlerde tümörün derecesi anlamlı prognostik faktör olarak gösterilmiştir.(155) Joensuu ve ark.(158) tarafından yapılan çalışmada, DNA anöploidi tek değişkenli analizde olumsuz bir faktör olarak bulunurken, bağımsız bir prognostik faktör olmadığı rapor edilmiştir. Mayo klinik serisi, anormal DNA içeriği fazla olan tümörleri yüksek kanser mortalitesi ile ilişkili bulmuştur.(135) Günümüzde PTK olgularında derecenin prognostik bir faktör olarak kullanılması halen tartışmalıdır. Uygulanan Cerrahi Tedavi Mayo klinik serisi, cerrahi tedavi biçimin lokal nüks riskini önemli ölçüde etkilediğini göstermiştir.(159) Total veya totale yakın tiroidektomi uygulananlarda daha az kanser nüksü olduğu ve tümöre bağlı ölümlerin daha az gerçekleştiği saptanmıştır.(160) Totale yakın tiroidektomiler ile lobektomi veya bilateral subtotal rezeksiyon tedavileri karşılaştırıldığında, 1 cm'den büyük tümörü olan hastalarda nüks riskinin ve ölüm riskinin azaldığı gösterilmiştir.(161) Rezidü Tiroid Dokusunun Ablasyonu Radyoaktif iyot ablasyonu, cerrahi sonrası neoplastik mikroskopik odakları yok ederek lokal nüks riskini azaltır. Bazı çalışmalar I-131 ablasyonunun nüks ya da tümör ile ilişkili ölüm oranı üzerinde anlamlı bir etkisi olmadığını savunsalar da, başka bir çalışmada 1,5 cm’den büyük tümörü olan hastalarda nüks ve uzun süreli sağkalım açısından yararlı etkileri gösterilmiştir.(135,161) Ablasyon tedavisi, I-131 tarama testinin duyarlılığını ve serum tiroglobulin (Tg) takibinin özgüllüğünü artırır. Serum Tiroglobin Düzeyleri Başlangıç tedavisinden sonra serum tiroglobulin takipleri hastalığın gidişatı hakkında değerli bilgiler verir. Cerrahi tedaviden sonraki I-131 görüntüleme sonucunun negatif olması ve tiroid hormonu yokluğunda serum Tg düzeylerinin çok düşük seviyelerde olması kür elde edildiğinin bir göstergesidir.(162) 35 Aksine, Tg değerinin yüksekliği kapsamlı klinik değerlendirmeyi gerektirir. Tiroglobulin üreten bölgeyi tespit etmek ve en uygun tedaviyi planlamak için, iyot ablasyonundan sonra tüm vücut iyot tarama da dahil olmak üzere görüntüleme çalışmaları yapılmalıdır.(163) 2.4.2. Papiller Tiroid Kanserinde Prognostik Sınıflandırma Sistemleri PTK olgularında genel olarak kötü prognoz ile ilişkili olduğu düşünülen faktörler; ileri yaş, uzak metastaz, histolojik varyant (tall hücreli, kolumnar hücreli, insüler), büyük tümör boyutu, ekstratiroidal invazyon, multisentrik tümör, lenf nodu metastazı, grade ve erkek cinsiyet olup, bu faktörlerin çeşitli kombinasyonları ile prognostik değerlendirmeyi amaçlayan çok sayıda sınıflandırma sistemi tanımlanmıştır. Tiroid kanserlerinde risk guruplarını belirlemek amacıyla bu güne kadar geliştirilen 17 farklı prognostik skorlama sisteminden 8 tanesi sadece PTK için kullanılmıştır.(164) Europian Organisation of Research on Thyroid Cancer (EORTC), tüm tiroid kanserlerinin prognostik değerlendirilmesinin yapıldığı “EORTC prognostik sistemini” tanımlamıştır. Hastanın cinsiyeti, tümörün tipi, tümörün çapı, uzak metastaz varlığı ve sayısını temel alan bu sistem çok farklı biyolojik davranışları olan diferansiye, medüller ve anaplastik tiroid kanserleri birlikte değerlendirdiğinden yaygın bir biçimde kullanılmamıştır.(165) Papiller Tiroid Kanserde riskin belirlenmesini amaçlayan ilk prognostik sistem yaş, uzak metastaz, primer tümörün yaygınlığı ve büyüklüğü (Age, Metastases, Extension, sınıflamasıdır”(Tablo 2.6). Size) özelliklerini 1979 yılında dikkate Lahey Klinikte alan “AMES geliştirilmeye başlanmış ve 1988 yılında 821 diferansiye tiroid kanserli hastanın sonuçlarının değerlendirilmesiyle oluşturulmuştur.(166) 36 Tablo 2.6: AMES Sınıflaması (Lahey Klinik) DÜŞÜK RİSK PARAMETRE (A) Yaş (M) Metastaz (E) Yayılım (S) Tümör Büyüklüğü YÜKSEK RİSK Erkek < 40 Erkek > 40 Kadın < 50 Kadın > 50 Yok Var Tiroid kapsülü invaze değil Tiroid kapsülü invaze < 5cm > 5 cm AMES prognostik sınıflamasına göre 10 yıllık sağkalım düşük risk grubunda %98, yüksek risk grubunda %54 olarak bildirilmiştir. Yirmi yıllık izlemde ise düşük ve yüksek risk gruplarında mortalite oranları sırasıyla %1,2 ve 39,5’tir. Memorial Sloan Kettering Kanser Enstitüsünde AMES sınıflamasına histolojik grade eklenmiş ve bu merkez tarafından “GAMES Prognostik İndeksi” olarak kullanılmaya başlanmıştır.(167) GAMES sisteminde hastalar düşük, orta ve yüksek risk gruplarına ayrılmıştır. Pasieka ve ark.(168) PTK için DNA ploidi analizinin prediktif değerinin yüksek olduğunu göstermeleri ve bir prognostik faktör olarak kullanılmasını önermesi ile DNA içeriği parametresi de sisteme eklenerek “DAMES Sınıflaması” geliştirilmiştir. Ancak işlemin, pahalı oluşu, geç sonuç alınması, özel uzmanlık gerektirmesi ve birçok merkezde yapılamaması gibi nedenlerle yaygın kullanıma girmemiştir. Mayo Klinikte Hay ve ark.(169) 16 prognostik faktörü tek değişkenli ve çok değişkenli analizler ile değerlendirmiş ve sonuçta yaş, tümörün histolojik grade’i, tümörün yaygınlığı (tiroid dışı invazyon veya uzak metastaz) ve tümörün büyüklüğünün istatistiksel olarak kötü prognozu göstermede bağımsız birer faktör olarak anlamlı olduğunu ortaya koymuştur (Tablo 2.7). 37 Tablo 2.7: AGES Sınıflaması PUANLAMA SİSTEMİ PARAMETRE 0,05 x Hasta Yaşı (40 yaş üstü hastalarda) (A) Yaş 1 puan: Grade 1 (G) Grade 3 puan: Grade 2 ve 3 1 puan: Tiroid dışına yayılım varsa (E) Yayılım 3 puan: Uzak metastaz varsa (S) Tümör Büyüklüğü 0,2 x Tümör Çapı (cm) AGES Prognostik Skoru= Yaş + Derece +Yayılım + Büyüklük puanları Risk Grupları: 1.Grup : 0 - 3.99 2.Grup : 4 - 4.99 3.Grup : 5 – 5.99 4.Grup : >6 Prognostik skoru hesaplanan hastalar düşük risk (AGES skoru <4) ve yüksek risk (AGES skoru >4) olarak iki gruba ayrılır. 20 yıllık mortalite oranları düşük risk grubundaki hastalarda %1,1 yüksek riskli grupta ise %39 olarak bildirilmiştir. Mayo Klinik tarafından verilerin yeniden analizi sonrası primer tümör rezeksiyonunun yeterliğinin bağımsız bir prognostik faktör olduğu tespit edilmiştir. Metastaz varlığı, yaş, primer cerrahinin yeterliği, ekstratiroidal invazyon ve tümör boyutu parametreleri esas alınarak “MACIS Skorlaması” (Tablo 2.8) geliştirilmiştir.(170) 38 Tablo 2.8: MACIS Sınıflaması ( Mayo Klinik) PUANLAMA SİSTEMİ PARAMETRE (M) Metastaz (A) Yaş (C) Tam Olmayan Rezeksiyon (I) Tiroid Dışına Yayılım (S) Tümör Büyüklüğü Uzak met. varsa < 39 >40 3 puan 3,1 puan 0,08 x yaş 1 puan 1 puan 0,3 x çap (cm) MACIS Prognostik Skoru = Metastaz+Yaş+Tam rezeksiyon+Yayılım+Büyüklük puanları Risk grupları: 1.Grup : 0 - 5.99 3.Grup : 7 – 7.99 2.Grup : 6 - 6.99 4.Grup : >8 MACİS İndeksi risk gruplarına göre 10 yıllık sağkalım oranları 1.Grup : % 99 2.Grup : % 89 3.Grup : % 56 4.Grup : % 24 Toplam skoru 6'nın altında olan hastalarda -ki bu çalışmada tüm hastaların yaklaşık %84’üne karşılık gelmektedir- 20 yıllık mortalite %1 iken 8 ve üzerinde olan hastalarda %76 olarak bulunmuştur. MACIS sistemi halen yaygın olarak kullanılan en güvenilir skorlama sistemlerinden biridir. ‘’Klinik Sınıflama’’; (De Groot Evrelemesi) Chicago Üniversitesi'nde geliştirilen basit ve etkili bir evreleme sistemidir. Dört alt sınıfa ayrılır: Sınıf I; tek veya birden fazla intratiroidal odağı olan hastaları; Sınıf II; lenf nodu metastazı olan hastaları; Sınıf III; rezeke edilemeyen lenf düğümleri veya ekstratiroidal invazyonu olan hastaları; Sınıf IV; uzak metastazı olan hastaları kapsar.(161) Bu sınıflar ile prognoz arasında anlamlı korelasyon vardır. 39 “Ohio State Universitesi Sistemi”; tümör boyutu, servikal metastaz varlığı ya da yokluğunu, multiple tümör olmasını, lokal tümör invazyonunu ve uzak metastazı dikkate alır.(144) “Inmstitut Gustave-Roussy Sistemi”, tanı yaşı ve histolojik tipe dayalı bir sistemdir.(138) ‘’TNM Sınıflaması’’, American Joint Cancer Committee/Union Internationale Control Cancer (AJCC/UICC), 2010 yılında tiroid kanserleri için TNM sınıflamasının 7. sürümünü (Tablo 2.9) yayınlamıştır. TNM sınıflamasına göre yapılan evrelemede (Tablo 2.10) papiller kanser için en önemli prognostik kriteri hasta yaşı oluşturmaktadır. TNM sınıflamasına göre yapılan evrelendirmede diferansiye tiroid kanserleri için 5 yıllık kansere özgü sağ kalım oranları; Evre I’de %100, Evre II’de %100, Evre III’de %95,8 ve Evre IV C’de %45,3 olarak bildirilmiştir.(171). 40 Tablo 2.9: TNM Sınıflaması (AJCC)(171) PRİMER TÜMÖR (T) TX T0 Primer tümör gösterilemiyor Primer tümöre ait bulgu yok T1a Tm <1 cm ve tiroid dokusu içinde T1b Tm <2 cm ve tiroid dokusu içinde T2 Tm çapı 2-4 cm ve tiroid dokusu içinde veya tümörün küçük bir kısmı tiroid dışında T3 Tm >4 cm ve tümörün küçük bir kısmı tiroid dışına yayılmış T4a Tm çapı farklı olabilir, fakat tümör tiroid kapsulünün dışında yumuşak doku veya komşu organlara invaze T4b Tümör prevertebral fasyayı veya karotis arteri veya mediatinal damarları invaze etmiş Anaplastik Kanser (T4 kabul edilir) T4a Intratiroidal anaplastik kanser T4b Ekstratiroidal anaplastik kanser LENF NODU (N) NX Bölgesel lenf nodu gösterilemiyor N0 Lenf metastazı yok. N1 Bölgesel lenf noduna metastaz N1a Level 6’da metastaz N1b Unilateral, bilateral veya kontrlateral servikal bölgeye metastaz (Level 1.2.3.4.5) veya retrofaringeal, superior mediastinel lenf nodlarına metastaz UZAK METASTAZ (M) M0 Uzak metastaz yok M1 Uzak metastaz var (AJCC; American Joint Cancer Committee ) 41 Tablo 2.10: TNM Sınıflamasında Evre Grupları (AJCC)(171) HİSTOLOJİK TİP EVRE EVRE I EVRE II PTK/FTK<45 yaş MTK ATK Yaş gruplaması yok Yaş gruplaması yok T ve N bakılmaz M0 T ve N bakılmaz M1 HİSTOLOJİK TİP EVRE PTK/FTK≥45 yaş MTK EVRE I T1 N0 M0 T1 N0 M0 EVRE II T2 N0 M0 T2 N0 M0 ATK T3 N0 M0 EVRE III T3 N0 M0 T1 N1a M0 T1 N1a M0 T2 N1a M0 T2 N1a M0 T3 N1a M0 TÜM ANAPLASTİK KARSİNOMLAR EVRE IV KABUL EDİLİR. T3 N1a M0 EVRE IV A T4a N0 M0 T4a N0 M0 T4a N1a M0 T4a N1a M0 T1 N1b M0 T1 N1b M0 T2 N1b M0 T2 N1b M0 T3 N1b M0 T3 N1b M0 T4a N1b M0 T4a N1b M0 T4a Herhangi bir N, M0 EVRE IV B T4b Herhangi bir N, M0 EVRE IV C T ve N bakılmaz M1 42 Papiller tiroid kanser prognozunun belirlenmesinde prognostik sistemlerinin yakın doğrulukta sonuçlar verdiğini savunan çalışmalar mevcut olmakla beraber, Cox model analizinde en iyi skorlama sistemi MACIS olarak belirlenmiştir.(172) 2000 yılı sonrasında PTK’de prognozu değerlendirmek için Alabama Üniversitesi MD Anderson Enstitüsü, Murcia Üniversitesi ve Tokyo Kanser Enstitüsü tarafından üç farklı risk skorlama sistemi daha tanımlanmıştır.(173,174) Ancak günümüzde en çok kabul gören ve sık kullanılan MACIS ve TNM evrelemesi olmuştur. Geçmişten günümüze PTK prognozunu değerlendirmek amacıyla geliştirilmiş önemli prognostik skorlama sistemleri Tablo 2.11’de kıyaslamalı olarak sunulmuştur.(175) Tablo 2.11: Diferansiye Tiroid Kanserinde Prognostik Skor Sistemleri PARAMETRE EORTC TNM AMES AGES Yaş X Cinsiyet X Histoloji X Ekstratiroidal İnvazyon Tümör Boyutu Lenf Nodu X X X X X X X X X X X Uzak Metastaz X X Kapsül Varlığı X Cerrahinin Tipi X IR X X X Grade X Klinik Ohio Sınıflama Univ. X X Metastazı X MACIS X X X X X X X X X X X X X (EORTC; Europian Organisation of Research on Thyroid Cancer, IR; Inmstitut Gustave-Roussy) 43 2.4.3. Papiller Tiroid Kanserinde Tedavi Papiller tiroid kanserinin cerrahi tedavisinde total veya totale yakın tiroidektomi uygulanır. Klinik olarak lenf nodu pozitif ise boyun lenf nodu diseksiyonu cerrahi tedaviye eklenir. Daha sonrasında ise seçilmiş hastalarda radyoaktif iyot tedavisi uygulanır ve TSH baskılayıcı tiroid hormonu replasmanı yapılır. Kemoterapi ve radyoterapinin standart uygulamada yeri yoktur. Ancak de-diferansiye ve unrezektabl olan çok az sayıda olguda daha çok palyatif olarak uygulanabilir. Tiroidektomi Papiller karsinomun çok iyi olan prognozu nedeniyle geçmişte sınırlı cerrahi rezeksiyonların tedavide yeterli olduğu öne sürülmüştür. Ancak bugün papiller kanser tedavisinin total veya en azından totale yakın tiroidektomi olması gerektiği kabul edilmektedir. Düşük risk grubunda bulunan hastalarda tiroid hormonu replasmanı zorunluluğunu engellemek ve morbiditeyi azaltmak için lobektomi ve ilaveten bazen karşı loba subtotal lobektomi gibi sınırlı cerrahi öneren yazarlar mevcuttur.(176) Bu araştırmacılara göre yüksek risk grubunda yer alan radyasyona bağlı kanserlerde, çocukluk çağı tiroid kanserinde, metastaz yapmış veya tiroid kapsülüne invaze olmuş papiller kanser olgularında total tiroidektominin uygulanması zorunluluktur.(177,178) Ancak günümüzde daha yaygın kabul edilen görüş tüm PTK olgularında total veya totale yakın tiroidektominin gerekli olduğu biçimindedir. Çünkü lobektomi yapılan hastaların uzun süreli izlem sonuçlarında, karşı lobdaki nüksler nedeniyle hastalıksız sağkalım oranlarının belirgin şekilde düştüğü ortaya konulmuştur.(179,180) Papiller tiroid kanserinde hastalık yüksek oranda multifokaldir. Nüksü ve az diferansiye formlara dönüşme riskini ortadan kaldırdığından total tiroidektomi uygulanması avantajlıdır. 44 Ayrıca postoperatif radyoaktif iyot taramasının yapılabilmesi, olası metastazların saptanabilmesi ve gerektiğinde radyoaktif iyot ablasyon tedavisi daha düşük doz radyoaktif iyot kullanılmasına olanak verdiği için de yararlıdır. Total tiroidektomi uygulanması sayesinde postoperatif takiplerde tiroglobulin bir izlem belirteci olarak kullanılabilir. Lenfatik Diseksiyon Bazı serilerde klinik ve subklinik düzeyde %40-80 arasında değişen yüksek oranlarda lenf nodu metastazları bildirilmektedir. Sağkalım üzerinde etkisi olmadığı, ancak lokal nükslerin büyük bölümünün lenf nodu metastazı nedeni ile oluştuğu bilinmektedir. Lenf nodu metastazı olan hastaların %85-90’nında santral kompartmanda metastaz mevcuttur. Bu nedenle santral lenfatik kompartman diseksiyonunun tiroid papiller kanseri tedavisinde total tiroidektomi ile birlikte rutin olarak uygulanması gerektiğini savunan yayınlar vardır.(181,182) Santral lenf nodlarında metastaz varlığının preoperatif olarak saptanması güçtür. Tiroidektomi sonrasında bu bölge lenf nodlarında kalacak olan metastatik hücreler, radyoaktif iyotla ablate olmazsa geç nükslere neden olabilirler. Santral kompartman bölgesindeki nüksün tedavisi için önceki operasyon lojuna komplikasyon riski çok yüksek olan ikinci bir girişim gerekmektedir. Bu nedenle tıpkı medüller kanserde olduğu gibi papiller kanserde de proflaktik santral kompartman diseksiyonunun rutin olarak uygulanması gerektiği savunulmaktadır.(183,184) Proflaktik santral diseksiyona karşı olanlar, bu bölgede kalacak rezidü metastatik kanserin radyoaktif iyot ile ablate edileceğini ve lokal nüksün çok sık olmayacağını iddia ederler. Lenf nodu metastazı saptanan hastalarda santral kompartman diseksiyonu mutlaka yapılmalıdır. Bu durumda yapılan işlem proflaktik değil terapötik santral diseksiyondur. Lateral gruptaki metastazın klasik tedavisi sadece metastazın mevcut olduğu tarafa modifiye lateral boyun lenf nodu diseksiyonu uygulanmasıdır. 45 Radyoaktif İyot (RAİ) Tedavisi İnsan vücudunda iyot tutma yeteneği en yüksek olan hücreler tiroid hücrelerdir. İyi diferansiye tiroid kanser hücresinin iyot afinitesi normal tirositlerden daha az olmakla beraber yine de vücuttaki diğer hücrelerden çok daha fazladır. Radyoaktif iyotu hücre içine alan tirosit veya iyi diferansiye tiroid kanser hücresi büyük oranda ölür. Total tiroidektomiden sonra trakea üzerinde kitle oluşturmayan az sayıda tirosit kalabilir. Total veya totale yakın tiroidektomi yapıldıktan sonra verilen radyoaktif iyot rezidü tiroisitlerin varlığını gösterir ve miktar gerçekten az ise ablate edebilir. Aynı zamanda radyoaktif iyot, metastatik tiroid kanseri hücrelerinin saptanmasını ve tedavisini sağlar. Yaşlı, tümör çapı 1 cm'den büyük, tiroid kapsülü invazyonu olan olgularda, lenfatik veya uzak metastazlı olgularda uygulanması konusunda genel kabul vardır. Amerikan Tiroid Birliği (ATA) kılavuzunda ise ancak 4 cm'nin üzerindeki olgulara önerilmektedir. Papiller kanser olgularında radyoaktif iyot tedavisinin endikasyonları konusunda halen tartışmalar devam etmektedir. Yukarıda tanımlanmış olan risk belirleme sistemlerinin geliştirilmesinin asıl amacı da bu tedaviye uygun hastaların saptanmasıdır. TSH Baskılayıcı Tedavi TSH iyi diferansiye tirod kanserleri için büyüme faktörü etkisi gösterir. Bu nedenle diferansiye tiroid kanseri olgularına total tiroidektomi ve gerekiyorsa radyoaktif iyot tedavisi uygulandıktan sonra yaşam boyu TSH'yı baskılı tutacak biçimde tiroid hormonu verilir. Genel kural, hastayı klinik ve laboratuvar olarak hipertiroidiye sokmayacak şekilde TSH'nın baskılanmasıdır. ATA kılavuzunda yüksek riskli ve orta riskli hastalarda TSH 0,1mIU/L’nin altında olacak şekilde, düşük riskli hastalarda ise normal limitlerde veya biraz altında (0,1-0,5 mIU/L) olacak şekilde T4 verilmesi önerilmektedir.(184) 46 2.4.4. İzlem Tiroid papiller kanserinde nüksler hemen daima tiroid lojunda ve/veya boyun lenf nodlarında ortaya çıkar. Bu nedenle lokal nüks izleminde en değerli uygulamalar hastanın fizik muayenesi ve boyun ultrasonografisi yapılmasıdır. Total tiroidektomili ve radyoaktif iyot tedavisi uygulanan hastalarda serum Tg düzeyi sıfır veya sıfıra yakın olacaktır. Bu hastaların takiplerinde serum Tg düzeyinde artış olması nüksü gösterir. İzlemlerin hangi sıklıkta yapılacağı hastanın nüks riskine göre belirlenir. Papiller kanserlerde nüks riskini belirlemek için ATA kılavuzunda üç seviyeli bir sınıflama Tablo 2.12’de önerilmiştir. Buna göre düşük riskli hastaların izleminde yıllık fizik muayene ve TSH baskılı iken bakılan T3, T4 ve TSH yeterlidir.(184) Tablo 2.12: PTK’de Nüks Riskine Göre Sınıflama ( ATA Klavuzu )(184) DÜŞÜK RİSKLİ HASTALAR Lokal invazyon veya uzak metastaz olmaması Tüm makroskopik tümörün rezeke edilmiş olması Lokorejyonel dokularda tümör invazyonu olmaması Tümörde agresif histolojinin (uzun hücre, insular, kolumnar hücre) olmaması Cerrahi sonrası ilk tüm vücut radyoaktif iyot taramasında tiroid yatağında tutulumun olmaması. ORTA RİSKLİ HASTALAR İlk cerrahide peritiroidal yumuşak dokuya mikroskopik invazyon olması Servikal lenf nodlarında metastaz veya remnant I 131 taramasında tiroid yatağında tutulum olması tiroid ablasyonu sonrası Agresif tümör histolojisi veya vasküler invazyon olması YÜKSEK RİSKLİ HASTALAR Makroskopik tümör invazyonu olması Tam olmayan tümör rezeksiyonu Uzak metastaz varlığı veya ihtimalinin olması Tedavi sonrası taramalarda yüksek Tiroglobülin düzeyi ( ATA : American Thyroid Association ) 47 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 3.1. Olguların Seçimi, Veri Toplanması ve Çalışmanın Dizaynı GATA Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Komutanlığı’nın 09 Haziran 2014 gün ve BŞTBP.İLMİ YRD.:1500-150-14/ Cerr.Hst.Bl./Gen.Cerr.Srv. sayılı yazısı ile bu tez çalısmasına karar verilmiş olup, çalışma için GATA Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Baştabipliği Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu’ndan 08.01.2015 gün ve ETİK KRL.:1491-1415/1535 sayılı kararı ile onay alınmıştır. Gülhane Askeri Tıp Akademisi Haydarpaşa Eğitim Hastanesi Genel Cerrahi Servisi’nde Ocak 2005 ve Temmuz 2015 tarihleri arasında opere edilmiş PTK tanısı alan 84 olgunun yeterli tümör dokusu içeren parafin blokları çalışmaya dahil edildi. Olguların elektronik ortamda bulunan tıbbi kayıtlarına ulaşılarak yaş, cinsiyet, tıbbi özgeçmiş ve soy geçmişleri, başvuru yakınmaları, preoperatif ultrason bulguları, ameliyat raporları, biyokimya tetkikleri, patoloji raporları (tümör çapı, tümör tipi, vasküler invazyon, ekstratiroidal yayılım, metastatik lenfadenopati varlığı) ile postoperatif dönemde uygulanan tedavi ve takip bilgilerine ilişkin veriler elde edildi. Patoloji Servisi’nde PTK tanısı konmuş 84 olgunun formalinde fikse parafine gömülü doku bloklarından elde edilen 5-μm kalınlığındaki 5 histolojik doku kesitinden en çok tümör içeren alanlar manuel olarak diseke edildi. PTK’da en sık görülen onkojenik mutasyon bölgeleri olduğu için BRAF geni 15. ekzonu, NRAS geni 2. 3. ve 4. ekzonu, KRAS geni 2., 3. ve 4. ekzonu, HRAS geni 2. ve 3. ekzonu ile TERT geninin en sık görülen C228T ve C250T mutasyonlarını içeren promotor bölgesi, PCR temelli direk sekanslama yöntemi ile incelendi. Ayrıca elde edilen doku kesitlerinde FISH yöntemi kullanılarak c-Met gen amplifikasyonu araştırılması yapıldı. 48 3.2. PCR Temelli Direk Sekanslama Yöntemi İle BRAF, RAS (H,K,N) ve TERT Genlerinde Mutasyon Analizi 3.2.1. DNA Ekstraksiyonu Diseke edilen tümör kesitlerinden, standart deparafinizasyon ve rehidrasyon sonrası QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Katolog No: 56404) (QIAGEN, Hilden, Almanya) kullanarak aşağıdaki protokole uygun olarak DNA ekstraksiyonu yapıldı. Diseke edilen doku kesitleri steril 1.5 ml’lik ependorf tüpüne alındı. Parafini uzaklaştırmak için 1 ml ksilen eklendi ve vorteks cihazında 15 sn çalkalandı. Ardından 14.000 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. Pipetleme ile doku pelletine dokunmadan süpernatant uzaklaştırıldı. Bu işlem bir kez daha tekrarlandı. Ksileni uzaklaştırmak için 1 ml %96-100 etanol eklendi ve vorteks cihazında 15 sn çalkalandı. 14.000 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. Pipetleme ile doku pelletine dokunmadan süpernatant uzaklaştırıldı. Bu işlem bir kez daha tekrarlandı. Etanolü tamamen uzaklaştırmak için 30 dk 56°C’de bekletildi. Tamamen kurumuş doku örneğine 180 µl buffer ATL ve 20 µl proteinaz K konuldu. Vorteks cihazında 15 sn çalkalandı. Doku tamamen eriyene kadar lizis için 56°C’de 8 saat bekletildi. 90 °C’de 1 saat bekletildi. Kısa bir santrifüjden sonra 200 µl buffer AL eklendi ve vorteks cihazında 15 sn çalkalandı. 200 µl %96-100 etanol eklendi ve vorteks cihazında 15 sn çalkalandı. Her bir hasta için ekstraksiyon kitinin içerisinde bulunan toplama tüpü ve filtreli tüpten bir adet hazırlandı ve kısa bir santrifüjden sonra ependorf tüpteki tüm karışım filtreli tüplere aktarıldı. Toplama tüpü ve filtreli tüp 8.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü atılarak yenisi filtreli tüpün altına yerleştirildi ve filtreli tüpe 500 µl Buffer AW1 eklenerek tekrar 8.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü atılarak yenisi filtreli tüpün altına yerleştirildi ve filtreli tüpe 500 µl Buffer AW2 eklenerek 14.000 rpm’de 3 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü yenisi ile değiştirildikten sonra 14.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü atılarak filtreli tüp steril 1.5 ml’lik ependorf 49 tüpüne yerleştirildi ve üzerine 50 μl Buffer ATE ilave edilerek oda ısısında 3 dakika beklendi. Süre sonunda 8.000 rpm’de 1 dakika santrifüj yapılarak filtreli tüpte bulunan sıvının ependorf tüpe geçmesi sağlandı. Elde edilen DNA miktarı ve kalitesi Nanodrop 1000 spektrofotometre cihazında (Thermo Scientific, USA) ölçüldükten sonra, çalışılıncaya kadar -20°C’de saklandı. Örnek Parafinin uzaklaştırılması Lizis Isıtma DNA bağlanması Yıkama Elüsyon Kullanıma hazır DNA Şekil 3.1: QIAamp DNA FFPE Tissue Protokolü ( FFPE: Formalin-Fixed Paraffin-Embedded ) 3.2.2. PCR Reaksiyonu Çalışmaya örneklerindeki dahil BRAF, edilen NRAS, hasta KRAS, grubundan elde HRAS TERT ve edilen DNA genlerindeki mutasyonları tespit etmek için forward ve reverse primerler kullanılarak genlerin en sık mutasyon görülen ekzon bölgeleri PCR ile çoğaltıldı ve sekans analizi ile mutasyon analizi yapıldı. HotStarTaq DNA Polimeraz Kit (Katolog No: 203205) (QIAGEN, Hilden, Germany) ve Tablo 3.1’de listelenen forward ve reverse primerler kullanılarak PCR karışımları son hacmi 50 µl olacak şekilde Tablo 3.2’deki gibi steril biyokabinlerde hazırlandı. 50 Tablo 3.1: Hedef Genin Primer Sekansı HEDEF GEN BÖLGESİ Forward Primer Dizisi (5'→3') Reverse Primer Dizisi (5'→3') BRAF ekzon 15 TCATAATGCTTGCTCTGATAGG GGCCAAAAATTTAATCAGTGG KRAS ekzon 2 GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC KRAS ekzon 3 TTTTTGAAGTAAAAGGTGCACTG TTTAAACCCACCTATAATGGTGAA KRAS ekzon 4 GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC AAGAAGCAATGCCCTCTCAA NRAS ekzon 2 GAAAGCTTTAAAGTACTGTAGATGTGG AGATGATCCGACAAGTGAGAGA NRAS ekzon 3 CCCCTTACCCTCCACACC CACAAAGATCATCCTTTCAGAGAA NRAS ekzon 4 TGGTGCTAGTGGGAAACAAG TGAATATGGATCACATCTCTACCA HRAS ekzon 2 GTGGGTTTGCCCTTCAGAT GGGTCGTATTCGTCCACAA HRAS ekzon 3 AGAGGCTGGCTGTGTGAACT TGGTGTTGTTGATGGCAAAC TERT CAGCGCTGCCTGAAACTC GTCCTGCCCCTTCACCTT Tablo 3.2: PCR Reaksiyon Karışımı PCR MALZEMELERİ MİKTAR (µl) Distile su 35,75 10X PCR tamponu 5 MgCl2 (25 mM) 1* dNTP mix (10 mM) 2 Primer (Fwd+Rev) (4 pmol/µl) 5 Hot Start Taq DNA polimeraz 0,25 DNA (50 ng) 1 Toplam Hacim 50 µl (*; NRAS ekzon 3/4, KRAS ekzon 3/4, HRAS ekzon 2/3 ve BRAF için 2 µl, KRAS ekzon 2 için 3 µl, NRAS ekzon 2 ve TERT için 10 µl Q solüsyonu eklendi.) 51 Oluşturulan PCR karışımı vorteks cihazında karıştırıldıktan sonra, her bir örneğe ait steril 0,2 ml’lik PCR tüplerine 49 µl olacak şekilde paylaştırıldı. Üzerlerine de 1’er µl DNA örneği konulup termal döngü cihazında Tablo 3.3’deki koşullarda amplifiye edildi. Termal döngü cihazında (ABI, Applied Biosystems, USA) reaksiyon tamamlandıktan sonra, örneklere elektroforez uygulanmak üzere +4ºC’ye kaldırıldı. Tablo 3.3: PCR Koşulları REAKSİYON AŞAMASI SICAKLIK (OC) SÜRE DÖNGÜ SAYISI Aktivasyon 95 15 dk. 1 Denatürasyon 95 30 sn. Primer Bağlanması (Annealing) 60 oC (KRAS Ekzon 2 ve 4, BRAF Ekzon 15, NRAS Ekzon 3 ve 4, HRAS Ekzon 2 ve 3) 54 oC (KRAS Ekzon 3) 55 oC (TERT, NRAS Ekzon 2) 30 sn. Zincir Uzaması (Extension) 72 30 sn. Son Uzaması (Extension) 72 10 dk. 1 Bekleme 4 ∞ ∞ 42 3.2.3. Agaroz Jelin Hazırlanması Elektroforez tamponu olarak Tris-Borik Asit-Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) [TBE] kullanıldı. 10X konsantre stok olarak hazırlanan bu tampon kullanılmadan önce 1X olacak şekilde distile su ile sulandırıldı. Bir balon jojede 2 gr agaroz 100 ml 1X TBE solüsyonu içerisinde mikrodalga fırında homojen şeffaf hale gelinceye kadar ısıtıldı. Biraz soğuduktan sonra Etidyum Bromid’den (Et-Br) 5 µl eklendi. Daha sonra jel, tarakların yerleştirildiği jel tepsisine yavaşça döküldü. Katılaşana kadar 25-30 dakika süreyle oda sıcaklığında bekletildi. Daha sonra elektroforez tankına yerleştirilerek amplifiye PCR ürünlerinin yüklenmesine hazır hale getirildi. 52 3.2.4. Agaroz Jel Elektroforez İşlemi PCR ürünleri etidyum bromid (Et-Br) ile boyanmış %1.5’luk agaroz jele yüklenerek ürünlerin elektroforezi yapıldı. Hazırlanan jelde hasta ve negatif kontrol örneklerinde beklenen uzunluklarda (BRAF ekzon 15: 224 bp, KRAS ekzon 2: 224 bp, KRAS ekzon 3: 212 bp, KRAS ekzon 4: 292 bp, NRAS ekzon 2: 221 bp, NRAS ekzon 3: 243 bp, NRAS ekzon 4: 196 bp, HRAS ekzon 2: 246 bp, HRAS ekzon 3: 220 bp, TERT: 163 bp) PCR ürünleri gözlendi. Bu, büyüklükleri belli DNA fragmentlerini içeren moleküler ağırlık standardı ile kıyaslanarak saptandı. Kontaminasyon kontrolü için yapılan genomik DNA içermeyen kuyucukta PCR ürünü yoktu. Termal döngü cihazında reaksiyon tamamlandıktan sonra buzdolabında bekleyen örneklerden 5’er µl alınarak parafilm üzerinde 2 µl DNA loading dye ile karıştırıldı. Daha sonra da elektroforez tankına yerleştirilen jelin kuyucuklarına sırasıyla yüklendi. Tankın kapağı kapatıldıktan sonra güç kaynağı çalıştırıldı. Kullanılan mini tank için 30 mA akım verilerek, örneklerin elektroforezi 50 dakika boyunca gerçekleştirildi. Yükleme tamponunda bulunan brom fenol mavisinin göçü takip ederek jelin 2/3’lük kısmına ulaştığında elektroforez durduruldu. Jel tanktan çıkarılarak 312 nm dalga boyunda ışık veren UV-translüminatöründe incelendi ve jel görüntüleme sisteminde kayıtları yapıldı (Şekil 3.2). Örneklerin beklenen uzunlukta PCR ile amplifiye olduğu, kontrolün çalıştığı ve kontaminasyonun olmadığı görüldükten sonra. PCR ürünlerinin pürifikasyonu aşamasına geçildi. 53 Şekil 3.2: KRAS ve NRAS için PCR Ürünlerinin Örnek Jel Görüntüsü 3.2.5. PCR Ürünlerinin Pürifikasyonu PureLink PCR Purification Kit (Katolog No: K3100-01) (Invitrogen Life Technologies, USA) kullanılarak aşağıdaki protokole uygun olarak gerçekleştirildi. PCR tüplerinde bulunan PCR ürünlerine 4 katı (4 x 45 µl=180 µl) binding buffer eklendi ve vorteks cihazında 5 sn çalkalandı. Her bir hasta için kitin içerisinde bulunan toplama tüpü ve filtreli tüpten bir adet hazırlandı ve karışımın tamamı filtreli tüplere aktarıldı. Toplama tüpü ve filtreli tüp 12.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü atılarak yenisi filtreli tüpün altına yerleştirildi ve filtreli tüpe 650 µl Wash buffer eklenerek tekrar 12.000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü atılarak yenisi filtreli tüpün altına yerleştirildi ve rezidüel wash buffer kalmaması için 14.000 rpm’de 3 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası toplama tüpü atılarak filtreli tüp steril 1.5 ml’lik ependorf tüpüne yerleştirildi ve üzerine 50 μl steril nükleaz free su ilave edilerek oda ısısında 3 dakika beklendi. Süre sonunda 14.000 rpm’de 2 dakika santrifüj yapılarak filtreli tüpte bulunan sıvının ependorf tüpe geçmesi sağlandı. Pürifiye PCR ürünleri bir sonraki basamakta kullanılana kadar –20°C’de saklandı.(Şekil 3.3) 54 Pürifiye PCR ürünleri BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA) ile aşağıdaki protokole uygun olarak çift yönlü (forward ve reverse) olarak ABI-3730 (48 kapiller) DNA Sequencer cihazında (Applied Biosystems, USA) sekanslandı. PCR reaksiyonu son hacmi 20 µl olacak şekilde BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, forward ve reverse primerler (4 pmol/µl), nükleaz free su ve pürifiye edilen PCR ürünleri konularak 96’lık plate’lerde hazırlandı. Her bir örnek için reaksiyon karışımı Tablo-3.4’de belirtilmiştir. Karışım Spin Columna konur PCR ürünlerine Binding Buffer eklenir Spin Column Yıkama Buffer ile yıkanır PCR ürünü 1,5 ml’lik tüpte elüsyon yapılır Şekil 3.3: PCR Ürünlerinin Pürifikasyon Basamakları Tablo-3.4: Forward ve Reverse Okuma İçin Big Dye Reaksiyon Karışımı PCR MALZEMELERİ MİKTAR (µl) Distile Su 11 BigDye Buffer 2 BigDye 4 Forward / Reverse Primer 2 Pürifiye PCR Ürünü 1 Toplam Hacim 20 µl 3.2.6. Sekans Analizi Oluşturulan PCR karışımı vorteks cihazında çalkalandıktan sonra, her bir örneğe ait kuyucuklara 19 µl olacak şekilde paylaştırıldı. Üzerlerine de 1’er µl pürifiye PCR ürünü konulup termal döngü cihazına (ABI, Applied Biosystems, USA) yerleştirildi. Sekans analizi için uygulanan PCR koşulları Tablo-3.5’de gösterilmiştir. PCR döngüsü şu şekilde uygulandı: 55 Termal döngü cihazında reaksiyon tamamlandıktan sonra, örneklere etanol presipitasyonu uygulandı. Etanol %95 4 ml ile Sodyum Asetat 3M 160 µl, pH 5.2’de karıştırıldı. Bu karışımdan 50 µl herbir PCR ürünü içeren kuyucuğa konuldu ve kapaklar kapatıldı. Plate 3000 rpm hızında 45 dakika 4oC soğutmalı santrifüj cihazında (Nüve, Türkiye) santrifüj edildi. Santrifüj sonunda plate ters çerilerek sıvı boşaltıldı ve 2000 rpm’de 1 dakika ters şekilde santrifüj edildi. Presipite olan PCR ürününe %70 etanol eklendi ve 3700 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi. Bu yıkama basamağı bir kez daha tekrarlandı. Santrifüj sonunda plate ters çerilerek sıvı boşaltıldı ve 2000 rpm’de 1 dakika ters şekilde santrifüj edildi. Presipite olan DNA’ların üzerine 30 µl Hi-Di Formamide eklendi. 2000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Örnekler 95oC’de 3 dakika denatüre edildi ve hemen hızlıca buz üzerinde soğutuldu. Daha sonra plate uygun programlama yapıldıktan sonra ABI-3730 (48 kapiller) DNA Analyzer cihazına (Applied Biosystems, USA) yüklendi. Forward ve reverse sekans elektroferogramları, SeqScape Software v3.0 programı (Applied Biosystems, USA) kullanarak ve manuel olarak analiz edildi. Tablo 3.5: Sekans Analizi İçin PCR Koşulları REAKSİYON AŞAMASI SICAKLIK (OC) SÜRE DÖNGÜ SAYISI Aktivasyon 96 1 dk 1 Denatürasyon 96 10 sn Primer Bağlanması (Annealing) 50 5 sn Zincir Uzaması (Extension) 60 4 dk Bekleme 4 ∞ 30 ∞ 56 3.3. Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH) Yöntemi ile c-Met Gen Amplifikasyonunun Araştırılması: Belirlenmiş olgulara ait tüm parafin bloklara ait Hematoksilen Eozin (HE) boyalı kesitler patolog tarafından incelenerek tümör dokusu olan blok seçildi. Vysis MET SpectrumRed FISH Probe Kit (Katalog No: 06N05-020) (Abbott, U.S.A.) kullanılarak aşağıda belirtilen prosedürler takip edildi ve in situ hibridizasyon işlemi uygulandı. Önce mikrotom ile tümör dokusuna ait parafin bloktan ve normal dokuya ait parafin bloktan “poly-L-Lysine” ile kaplanmış lam üzerine 4 mikron kalınlığında kesitler alındı. Lamlar hot plate üzerinde 70 oC ısıda 10 dakika bekletildi. Lamlar onar dakika olmak üzere iki kez Xylene ile inkübe edildi. Lamlar sırasıyla %100, %90, %70‘lik etanol hazırlanarak beşer dakika bu solüsyonlarda inkübe edildi. Lamlar iki kez ikişer dakika distile su ile yıkandı. Lamlar 98oC‘ye kadar ısıtılmış Heat Pretreatment Solution Citric (PT1) solüsyonu ile 15 dakika inkübe edildi. Lamlar iki kez ikişer dakika distile su ile yıkandı. Lamlara Pepsin Solution (ES1) sürüldü ve 10 dakika 37oC sıcaklığındaki nemli bölmede inkübe edildi. Lamlar 5 dakika Wash Buffer SSC (WB1) ile yıkanıp sonrasında 1 dakika distile su ile yıkandı. Sırasıyla %70, %85 ve %100 etanol solüyonlarıyla birer dakika dehidrate edildi. Lamlardaki her örnek üzerine 10 mikrolitre prob karışımı eklendi. Lamlar hot plate üzerinde 75oC sıcaklıkta 10 dakika bekletildi. Lamların etrafı yapıştırıcı rubber cement ile kapatılarak 37oC sıcaklığındaki nemli bölmede bir gece bekletildi. İkinci günün başlangıcında lamlar üzerinden rubber cement dikkatli bir şekilde uzaklaştırıldı. Lamlar iki kez olmak üzere beşer dakika boyunca 98oC sıcaklığındaki Wash Buffer A solüsyonu ile yıkandı. Lamlar sırasıyla %70, %90 ve %100 etanol solüyonlarıyla birer dakika inkübe edildi. Lamlardaki her örnek üzerine 30 mikrolitre DAPI/DuraTect- Solution (MT7) eklendi. Lamlar 15 dakika karanlık ortamda bekletildi. Lamlar üzerinde solüsyonun fazlası dikkatli bir şekilde filtreli kağıtlarla uzaklaştırıldı. 57 Lamlar karanlık ortamda bekletilerek incelenmeye alındı. Lamlar karanlık bir ortamda Leica DFC 300 FX floresan mikroskobunda incelendi ve Leica Qwin V3 For Image Processing görüntüleme sistemi kullanılarak değerlendirme yapıldı. 3.4. İstatistiksel Analizler Bulguların değerlendirilmesinde Statistical Package for Social Sciences for Windows 16.0 (SPSS) (Chicago, USA) programı kullanıldı Kategorik verilerin karşılaştırılmasında ki-kare testi ve Fisher’s exact test kullanıldı. Grup içerisinde sürekli verilerin dağılımının homojen olup olmadığı Kolmogorov Simirnov testi ile bakıldı. Homojen dağılım varlığında Student’s t testi, homojen olmayan dağılımda Mann Whitney U testi ve tek değişkenli varyans analizi testi kullanıldı. Hastalıksız yaşam süresi analizleri Kaplan-Meier yöntemi ile hesaplandı, yaşam eğrileri arasındaki fark log rank testi ile değerlendirildi. Hastalıksız yaşam süresi üzerine etkili faktörler Çoklu Değişkenli Varyans Analizi ve Cox Regresyon analizi ile değerlendirildi. Parametrik verilerde değerler standart sapma veya standart hata ile birlikte ortalamalar verilmiştir. İstatistiksel analizin anlamlılığı için p < 0,05 kabul edildi. 58 4. BULGULAR: Papiller tiroid kanseri nedeniyle takip ve tedavi edilen 84 hastanın demografik özellikleri, tümör özellikleri ve önemli prognostik parametreler ile ilişkisi incelenmiş ve elde edilen verilerin olgulara göre dağılımı Tablo 4.1’de sunulmuştur. Tablo 4.1: Çalışma Grubunun Demografik ve Tümör Özellikleri PARAMETRE Hastalar Dağılım Aralığı % 84 50 26-74 28/56 %33.3 / %66,7 Klasik 56 %66.7 Folliküler 9 %10,7 Onkositik 1 %1,2 Makrofolliküler 1 %1,2 Mikrokarsinom 17 %20,2 12 3-40 Vasküler İnvazyon (Var / Yok ) 11/73 %13,1 Kapsüler İnvazyon (Var / Yok ) 21/63 %25 Lenfatik İnvazyon (Var / Yok ) 15/69 %17,9 Multisentrisite (Var / Yok ) 24/60 %28,6 Ekstratiroidal Yayılım (Var / Yok ) 8/76 %9,5 Metastatik LN (Var / Yok ) 19/9 %67,8 Nüks (Var / Yok ) 8/61 %11,6 1. grup 74 %88,1 2. grup 7 %8,3 3. grup 1 %1,2 4. grup 2 %2,4 N Yaş (yıl) Cinsiyet (E/K) Tümör Tipi Tümör Çapı (mm) MACIS Skorlaması (MACIS : Metastases, Age, Completeness of resection, Invasion, Size) 59 4.1. Prevalans: Çalışmamızda 54 olguda BRAF mutasyonu pozitif bulunmuş ve BRAF mutasyonu prevalansımız %64.2 olarak saptanmıştır. 5 olguda RAS mutasyonu (%6), 5 olguda TERT mutasyonu (%6) ve 5 olguda c-Met gen amplifikasyonu (%6) saptanmıştır. RAS mutasyonu saptanan 5 olgunun 4 tanesinde NRAS, bir tanesinde KRAS mutasyonu gözlendi. TERT mutasyonu saptanan 5 olgunun 4 tanesinde C228T, bir tanesinde C250T mutasyonu gözlendi. 4.2. Yaş: Çalışmamızda incelenen 84 papiller tiroid kanserli hasta 26-74 yaş aralığında olup, ortanca yaş 50’dir. Çalışma grubunda 50 hastanın 40 yaş ve üzerinde, 34 hastanın ise 40 yaş altında olduğu gözlendi. BRAF mutasyonuna göre yapılan incelemede mutasyon pozitif grup hastaların yaş ortalaması, negatif olan gruba göre daha yüksek bulundu. BRAF mutasyonu saptanan 54 hastanın 33 tanesi 40 yaş ve üzerinde, 21 tanesi ise 40 yaş altındaydı. Ancak yapılan analizlerde yaş ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel açıdan anlamlı ilişki saptanmamıştır. RAS ve c-Met pozitif gruplarında bulunan 5 hastadan 4 tanesinin 40 yaş ve üzerinde oldukları gözlenmiştir. BRAF ve TERT mutasyon pozitif gruplarının yaş ortalamasının negatif gruplara oranla daha yüksek olmasına karşın, aksine c-Met ve RAS mutasyonu negatif gruplarda yaş ortalamasının daha yüksek olduğu görüldü. c-Met amplifikasyonu pozitif hasta grubunda 1 hastanın 26 yaşında, diğer 4 tanesinin ise 44 yaş ve üzerinde olduğu halde, bu grubun yaş ortalamasının 43,2 olarak hesaplandığı görüldü. Ancak yapılan analizlerde yaş ile BRAF mutasyonu, RAS mutasyonu ve c-Met amplifikasyonu arasında istatistiksel açıdan anlamlı ilişkiler saptanmamıştır. (p>0.05) 60 TERT mutasyonu pozitif grupta yer alan 5 hastanın da 40 yaş ve üzerinde olduğu, mutasyon pozitif grubun yaş ortalamasının 59.4, negatif olan grubun yaş ortalamasının ise 44.5 olduğu görülmüştür. Yaşlı hastalarda gözlenen TERT mutasyonu sıklığı (Tablo 4.2), istatistiksel açıdan da anlamlı bulunmuştur.(p=0,033) Tablo 4.2: Yaş ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 Yaş BRAF n RAS TERT c-Met POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG 46.6 43.2 39.8 45.6 59.4 44.5 43.2 45.5 Aralık Ort. 26-74 45.4 < 40 34 21 13 1 33 0 34 1 33 ≥40 50 33 17 4 46 5 45 4 46 p Değeri 0,738 0,495 0,033 0,071 4.3. Cinsiyet : 84 olgunun cinsiyete göre 28 erkek, 56 kadın hasta (E/K= ½ ) şeklinde dağılım gösterdiği ve kadın hastaların tüm grubun 2/3’sini oluşturduğu görüldü. Mutasyon pozitif ve negatiflik durumlarının cinsiyete göre dağılımı incelendiğinde E/K=½ oranının mutasyon negatif gruplarda korunduğu gözlendi. Mutasyon pozitif gruplarda ise sadece TERT pozitif grubunda 3 erkek, 2 kadın hasta dağılımı ile aksine bir tablo oluştu. Cinsiyet ile BRAF mutasyonu arasındaki ilişki incelendiğinde her iki cinsiyette de %64.2 oranında mutasyon pozitifliği saptandı. BRAF mutasyonu ile cinsiyet arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı.(p>0.05) Cinsiyet ile RAS mutasyonu arasındaki ilişki incelendiğinde erkeklerde %3.57 oranında, kadınlarda ise %7.14 oranında mutasyon pozitifliği saptandı. RAS mutasyonu ile cinsiyet arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı. (p>0.05) 61 Cinsiyet ile TERT mutasyonu arasındaki ilişki incelendiğinde erkeklerde %10.7 oranında, kadınlarda ise %3.57 oranında mutasyon pozitifliği saptandı. Tersine bir oran gözlenmesine rağmen yapılan analizlerde TERT mutasyonu ile cinsiyet arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı. (p>0.05) Cinsiyet ile c-Met amplifikasyonu arasındaki ilişki incelendiğinde erkeklerde %7,14 oranında, kadınlarda ise %5,35 oranında pozitiflik saptandı. Yapılan analizlerde c-Met amplifikasyonu ile cinsiyet arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı (Tablo 4.3). (p>0.05) Tablo 4.3: Cinsiyet ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 Cinsiyet BRAF n RAS TERT c-Met POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG E 28 18 10 1 27 3 25 2 26 K 56 36 20 4 52 2 54 3 53 p Değeri 0,813 0,195 0,195 0,746 4.4. Tümör Varyantı : Patoloji bloklarından alınan tümör dokusu içeren kesitlere ait preparatlar incelenerek, çalışılan tümör dokularının varyant tipleri yeniden tasnif edildi. Çalışma grubumuzda en sık görülen tümör alt tipi %66,7 oranla klasik varyant olup, bunu mikrokarsinom, foliküler varyant, onkositik varyant ve makrofolliküler varyant (sırasıyla %20,2, %10,7, %1,2 ve %1,2) takip etmektedir. Tümör varyantına göre yapılan incelemede klasik varyant hasta grubunda BRAF mutasyon pozitifliğinin belirgin şekilde yüksek olduğu (%80,35) görülmüştür. Ayrıca 17 mikrokarsinom olgusunun 7 tanesinde (%41,1) ve 9 folliküler varyantın 1 tanesinde (%11,1) BRAF mutasyon pozitifliği saptanmıştır. Grupta bulunan tek makrofolliküler varyant olgu BRAF mutasyon pozitifliği gösterirken, yine tek olan onkositik varyant olguda mutasyon negatif bulunmuştur. 62 BRAF mutasyonu pozitif grupta bulunan 54 olgudan 53 tanesi BRAF V600E mutasyonu gösterirken, bu grupta bulunan tek folliküler varyant olgumuzda farklı olarak BRAF 598-599 CTA insersiyon mutasyonu saptanmıştır. Başka bir bakış açısıyla incelenirse BRAF mutasyonu pozitif saptanan 54 hastalık grubun %83.33’ünü 45 olgu ile klasik varyant, %14’ünü 7 olgu ile mikrokarsinom olguları oluşturmaktadır. Yapılan analizlerde BRAF mutasyonu pozitifliği ile diğer varyantların korelasyonu saptanmazken, klasik varyant ile BRAF mutasyonu birlikteliği istatistiksel olarak da anlamlı bulunmuştur.(p=0,001) Çalışmamızda 4 hastada NRAS-Ekzon-3 mutasyon pozitifliği ve sadece 1 hastada KRAS-Ekzon-2 mutasyon pozitifliği saptanmıştır. NRAS mutasyon pozitifliği saptanan 4 hastadan 3 tanesinin folliküler varyant, 1 tanesinin ise klasik varyant histolojik tipinde olduğu, KRAS pozitifliği saptanan tek olgunun ise klasik varyant olduğu görülmüştür. 9 folliküler varyant olgusunun 3 tanesinde (%33.3) RAS mutasyonu gözlenmesine rağmen, RAS mutasyonunun varyantlara göre dağılımında istatistiksel açıdan anlamlı sonuç saptanmamıştır.(p>0,05) TERT mutasyonunun varyantlara göre dağılımına bakıldığında 4 olgunun klasik varyant (%7.1), bir olgunun ise mikrokarsinom alt tipinde (%5.8) olduğu gözlendi. Mutasyonun varyantlara göre dağılımında istatistiksel açıdan anlamlı sonuç saptanmamıştır.(p>0,05) C-Met amplifikasyonu saptanan 5 olgunun 3 tanesi klasik varyant (%5.3) ve 2 tanesi folliküler varyant (%22.2) alt tipinde olup, söz konusu dağılım analiz edildiğinde istatistiksel açıdan anlamlı sonuç saptanmamıştır (Tablo 4.4).(p>0,05) 63 Tablo 4.4: Tümör Varyantı ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 Tümör Varyantı BRAF n RAS TERT c-Met POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Klasik 56 45 11 2 54 4 52 3 53 Folliküler 9 1 8 3 6 0 9 2 7 Onkositik 1 0 1 0 1 0 1 0 1 Makrofolliküler 1 1 0 0 1 0 1 0 1 Mikrokarsinom 17 7 10 0 17 1 16 0 17 p Değeri 0,991 0,001 0,629 0,629 4.5. Grade (Derece) : Grade hakkında patoloji raporlarında yeterli veri bulunmaması nedeniyle arşiv preparatlarının tamamı tekrar incelenerek olgular, Akslen(157) tarafından önerilen derecelendirme sistemine göre yeniden sınıflandırıldı. Vasküler invazyon, nükleer atipi ve nekroz parametreleri esas alınarak yapılan derecelendirmede Grade 1 grubunda üç parametrenin de negatif olduğu 67 olgu, Grade 2 grubunda parametrelerden en az birinin pozitif olduğu 15 olgu yer aldı. Grade 3 grubunda ise vasküler invazyon ve nükleer atipi içeren 1 olgu ile her üç parametrenin de pozitif olduğu 1 olgu olmak üzere toplam 2 olgu bulunmaktaydı. BRAF mutasyonunun Grade 1 grubunda 41/67 olguda (%61,1) pozitif olduğu, Grade 2 grubunda 12/15 olguda (%80) pozitif ve Grade 3 grubunda 1/2 olguda (%50) pozitif olduğu görülmektedir. Ancak yapılan analizlerde BRAF mutasyonu açısından Grade grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) RAS mutasyonunun Grade 1 grubunda 4/67 olguda (%5,9) ve Grade 2 grubunda 1/15 olguda pozitif olduğu görülmüştür. Grade 3 grubunda ise RAS mutasyonu bulunmadığı (0/2 olgu) saptanmıştır. Yapılan analizlerde RAS mutasyonu açısından Grade grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 64 TERT mutasyonunun Grade 1 grubunda 2 olguda (%2,9) ve Grade 2 grubunda 3 olguda (%20) pozitif olduğu görülmüştür. Grade 3 grubunda ise TERT mutasyonu bulunmadığı saptanmıştır. TERT mutasyon pozitifliği açısından Grade grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmıştır. (p=0,041) c-Met amplifikasyonunun Grade 1 grubunda 5 olguda (%7,4) saptandığı, Grade amplifikasyonunun 2 grubunda ve bulunmadığı Grade 3 saptanmıştır. grubunda c-Met ise c-Met amplifikasyonu açısından (Tablo 4.5) Grade grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) Tablo 4.5: Grade ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Grade Hasta Sayısı = 84 BRAF RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Grade 1 67 41 26 4 63 2 65 5 62 Grade 2 15 12 3 1 14 3 12 0 15 Grade 3 2 1 1 0 2 0 2 0 2 p Değeri 0,36 0,933 0,041 0,514 4.6. Tümör Boyutu : Olgularımızın tümör çapı ortalaması 6,3 mm, ortanca tümör çapı 12 mm olup, dağılımın 3-40 mm aralığında olduğu görülmüştür. İncelenen genetik parametrelerin pozitif ve negatif gruplarında tümör büyüklüğü ortalamaları yakın bulunmuş, tümör çapı ortalamaları ile incelenen parametreler arasında istatistiksel açıdan ilişki olmadığı görülmüştür. Mikrokarsinom olguların 7 tanesinde BRAF mutasyonu pozitif, 10 tanesinde mutasyon negatif iken, 1 cm den büyük çaplı tümör grubunda 46 olguda BRAF mutasyonu pozitif, 21 olguda ise mutasyon negatif saptandı. 65 Yapılan analizler sonucunda 1 cm’den büyük çaplı tümörler ile BRAF mutasyonu pozitifliği arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmıştır.(p=0,036) Ancak olguların daha büyük tümör çaplarına göre tasnif edilerek yapılan analizlerinde; tümör çapı arttıkça BRAF mutasyon pozitifliğinin doğrusal olarak artmadığı saptanmıştır.(p>0,05) Mikrokarsinom gurubunda RAS mutasyonu pozitif 1 olgu bulunurken, 1 cm’den büyük tümör gurubunda RAS mutasyonu pozitif 4 olgu bulunmaktaydı. Ancak yapılan analizlerde tümör büyüklüğü ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) Mikrokarsinom gurubunda TERT mutasyonu pozitif 2 olgu bulunurken, 1 cm’den büyük tümör gurubunda TERT mutasyonu pozitif 3 olgu bulunmaktaydı. Yapılan analizlerde tümör büyüklüğü ile TERT mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) Mikrokarsinom gurubunda c-Met amplifikasyonu pozitif 1 olgu bulunurken, 1 cm’den büyük tümör gurubunda c-Met amplifikasyonu pozitif 4 olgu bulunmaktaydı. Ancak yapılan analizlerde tümör büyüklüğü ile c-Met amplifikasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır (Tablo 4.6).(p>0,05) Tablo 4.6: Tümör Boyutu ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 n BRAF RAS TERT c-Met Tümör <1 cm 17 POZ 7 NEG 10 POZ 1 NEG 16 POZ 2 NEG 15 POZ 1 NEG 16 Boyutu >1 cm 67 46 21 4 63 3 64 4 63 p Değeri 0,036 0,735 0,265 0,735 66 4.7. Vasküler İnvazyon : Çalışma grubumuzda 11 olguda (%13,1) vasküler invazyon izlenmiştir. BRAF mutasyonu açısından yapılan değerlendirmede 8 olgunun (%72.7) mutasyon pozitif grupta, 3 olgunun ise mutasyon negatif grupta yer aldığı gözlenmektedir. Başka bir bakış açısıyla BRAF mutasyonu pozitifliği gösteren olgulardan %14,8’inin (8/54) vasküler invazyon göstermiş olduğu söylenebilir. Ancak yapılan analizlerde vasküler invazyon ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) RAS mutasyonu pozitif grupta 1 olguda (%9) vasküler invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde vasküler invazyon ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) TERT mutasyonu pozitif grupta 2 olguda (%18) vasküler invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde vasküler invazyon ile TERT mutasyonu arasında istatistiksel açıdan anlamlı ilişki saptanmamıştır.(p=0,068) c-Met amplifikasyonu pozitif grupta hiçbir hastada vasküler invazyon gözlenmedi. Vasküler invazyon gösteren olguların tamamı c-Met negatif grupta yeraldı. Yapılan analizlerde vasküler invazyon ile c-Met amplifikasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır (Tablo 4.7).(p>0,05) Tablo 4.7: Vasküler İnvazyon ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 BRAF RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Vasküler Var 11 8 3 1 10 2 9 0 11 İnvazyon Yok 73 46 27 4 69 3 70 5 68 p Değeri 0,739 0,429 0,068 0,374 67 4.8. Kapsüler İnvazyon : 21 olgunun (21/84, %25) patoloji raporunda kapsüler invazyon mevcudiyeti bildirilmiştir. 21 olgunun 15 tanesinde (%71.4) BRAF mutasyonu pozitif, 6 tanesinde (%28,6) negatif bulunurken; BRAF mutasyonu pozitif grup içerisinde 15 olgunun %27.7’lik orana tekabül ettiği görülmektedir. Ancak yapılan analizlerde kapsüler invazyon ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) RAS mutasyonu pozitif grupta sadece 1 olguda kapsüler invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde kapsüler invazyon ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 21 olgunun 4 tanesinde (%19.04) TERT mutasyonu saptanırken, TERT mutasyonu pozitif olan grup içerisinde 5 olgunun 4’ünde kapsüler invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde TERT mutasyonu mevcudiyeti ile kapsüler invazyon arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir korelasyon bulunmuştur.(p= 0,004) c-Met amplifikasyonu pozitif grupta 2 olguda (%9.52) kapsüler invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde kapsüler invazyon ile cMet amplifikasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır(Tablo 4.8).(p>0,05) Tablo 4.8: Kapsüler İnvazyon ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan n Hasta Sayısı = 84 BRAF RAS TERT c-Met POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Kapsüler Var 21 15 6 1 20 4 17 2 19 İnvazyon Yok 63 39 24 4 59 1 62 3 60 p Değeri 0,44 0,24 0,004 0,427 68 4.9. Lenfatik İnvazyon : 15 olgunun (15/84, %17.9) patoloji raporunda lenfatik invazyon bildirilmiştir. 15 olgunun 11 tanesi (%73.3) BRAF mutasyonu pozitif grupta yer almasına rağmen, 11 olgu BRAF mutasyonu pozitif grup içerisinde %20,3’ lük orana tekabül etmektedir. Yapılan analizlerde lenfatik invazyon ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) RAS mutasyonu pozitif grupta sadece 1 olguda lenfatik invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde lenfatik invazyon ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 15 olgunun 2 tanesinde (%20) TERT mutasyonu saptanırken, TERT mutasyonu pozitif grupta 3 olguda (%60) lenfatik invazyon mevcudiyeti görüldü. Yapılan analizlerde TERT mutasyonu mevcudiyeti ile lenfatik invazyon arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir korelasyon bulunmuştur.(p=0,012) c-Met amplifikasyonu pozitif grupta hiçbir olguga lenfatik invazyon saptanmamış, lenfatik invazyon gösteren 15 olgunun tamamının negatif grupta yer aldığı görülmüştür. Yapılan analizlerde lenfatik invazyon ile c-Met amplifikasyonu mevcudiyeti arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır(Tablo 4.9).(p>0,05) Tablo 4.9: Lenfatik İnvazyon ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan BRAF RAS TERT c-Met n Hasta Sayısı = 84 POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Lenfatik Var 15 11 4 1 14 3 12 0 15 İnvazyon Yok 69 43 26 4 65 2 67 5 64 p Değeri 0,556 0,342 0,012 0,285 69 4.10. Multisentrisite : 24 olgunun (24/84, %28.5) patoloji raporunda multisentrik tümör bildirilmiştir. 24 olgunun 17 tanesi (%70,8) BRAF mutasyonu pozitif grupta yer almakta ve 17 olgu BRAF mutasyonu pozitif grup içerisinde %31.4’ lük orana tekabül etmektedir. Ancak yapılan analizlerde multisentrisite ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 24 olgunun hiçbirisinde RAS mutasyonu pozitifliği saptanmamış olup, yapılan analizlerde multisentrisite ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 24 olgunun sadece 1 tanesinde (%4.1) TERT mutasyonu saptanırken, yapılan analizlerde TERT mutasyonu ile multisentrisite arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 24 olgunun 2 tanesinde (%8.2) c-Met amplifikasyonu saptanırken, yapılan analizlerde multisentrisite ile c-Met amplifikasyonu mevcudiyeti arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır(Tablo 4.10). Tablo 4.10: Multisentrisite ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan BRAF Hasta Sayısı = 84 Multisentrisite p Değeri RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Var 24 17 7 0 24 1 23 2 22 Yok 60 37 23 5 55 4 56 3 57 0,455 0,198 0,664 0,562 70 Ekstratiroidal Yayılım : 4.11. 8 olgunun (%9.5) patoloji raporunda ekstratiroidal yayılım bildirilmiştir. 8 olgunun 5 tanesi (%62.5) BRAF mutasyonu pozitif grupta yer almaktadır. 5 olgu BRAF mutasyonu pozitif grup içerisinde %9.25’lik orana tekabül etmektedir. Analizlerde ekstratiroidal yayılım ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel açıdan anlamlı ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 8 olgunun sadece 1 tanesinde RAS mutasyonu pozitifliği saptanmış olup, yapılan analizlerde ekstratiroidal yayılım ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 8 olgunun 2 tanesinde TERT mutasyonu saptanırken, yapılan analizlerde TERT mutasyonu ile ekstratiroidal yayılım arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p=0,069) 8 olgunun sadece 1 tanesinde c-Met amplifikasyonu saptanırken, analizlerde ekstratiroidal yayılım ile c-Met amplifikasyonu mevcudiyeti arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır (Tablo 4.11). Tablo 4.11: Ekstratiroidal Yayılım ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 BRAF RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Ekstratiroidal Var 8 5 3 1 7 2 6 1 7 Yayılım Yok 76 49 27 4 72 3 73 4 72 p Değeri 4.12. 0,971 0,665 0,069 0,402 Metastatik Lenf Nodu : 28 hastaya lenf nodu diseksiyonu uygulanmış, patoloji sonucu 19 hastada (%67,8) maliğn lenf nodu, 9 hastada ise reaktif lenf nodu saptandığı şeklinde raporlanmıştır. 71 19 olgunun 14 tanesi (%73.6) BRAF mutasyonu pozitif grupta yer almaktayken, 14 olgu BRAF mutasyonu pozitif grup içerisinde %25.9’luk orana tekabül etmektedir. Yapılan analizlerde metastatik lenf nodu ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 19 olgunun sadece 1 tanesinde RAS mutasyonu pozitifliği saptanmış olup, yapılan analizlerde metastatik lenf nodu ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 19 olgunun 3 tanesinde (%15) TERT mutasyonu saptanırken, yapılan analizlerde TERT mutasyonu ile metastatik lenf nodu arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 8 olgunun hiçbir tanesinde c-Met amplifikasyonu saptanmamış, yapılan analizlerde metastatik lenf nodu ile c-Met amplifikasyonu mevcudiyeti arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır(Tablo 4.12). Tablo 4.12: Metastatik Lenf Nodu ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 28 Metastatik Lenf Nodu RAS TERT c-Met POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Var 19 14 5 1 18 3 16 0 19 Yok 9 7 2 1 8 0 9 0 9 p Değeri 4.13. BRAF n 0,602 0,911 0,725 0,978 Radyoaktif İyot Tedavisi: Ameliyat sonrası 68 hastaya RAİ tedavisi uygulanmıştır. Nüks gözlenen 8 hastanın hepsinin postoperatif dönemde RAİ tedavisi almış olduğu görülmüş ve ikinci defa RAI tedavisi uygulanması gereği duyulmuştur. BRAF mutasyonu ile RAİ tedavisi uygulanan olguların ilişkisi incelendiğinde gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir korelasyon saptanmamıştır(Tablo 4.13).(p>0,05) 72 Tablo 4.13: RAİ Tedavisi ile BRAF Mutasyonu İlişkisi Çalışmaya Alınan n Hasta Sayısı = 84 RAİ Tedavisi 4.14. BRAF V600E MUTASYONU POZİTİF NEGATİF Var 68 45 23 Yok 16 9 7 P 0,259 Nüks : İletişim sağlanabilen ve izlem kayıtlarına ulaşılabilen 69 hasta üzerinden yapılan değerlendirmede 8 olguda (8/69, %11,6) nüks saptanmıştır. 8 olgunun 6 tanesi (%75) BRAF mutasyonu pozitif grupta yer almasına rağmen, 6 olgu BRAF mutasyonu pozitif grup içerisinde %13.9’ luk orana tekabül etmektedir. Yapılan analizlerde nüks ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) RAS mutasyonu sadece 1 olguda pozitif bulunurken, yapılan analizlerde nüks ile RAS mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır.(p>0,05) 8 olgunun 2 tanesinde (%25) TERT mutasyonu saptanırken, yapılan analizlerde TERT mutasyonu ile nüks arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki saptanmıştır.(p=0,041) c-Met amplifikasyonu pozitif grupta hiçbir olguda nüks olgu saptanmamış ve nüks olguların tamamının negatif grupta yer aldığı görülmüştür. Yapılan analizlerde nüks ile c-Met amplifikasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır (Tablo 4.14).(p>0,05) 73 Tablo 4.14: Nüks ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 69 Nüks BRAF RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Var 8 6 2 1 7 2 6 0 8 Yok 61 37 24 4 57 3 58 4 57 p Değeri 4.15. 0,701 0,396 0,701 0,041 Evreleme (Stage): Olgular TNM sınıflamasına göre tasnif edildikten sonra evrelendiğinde; Evre I grubunda 70 hasta (%83,4), Evre II grubunda 5 hasta (%5,95), Evre III grubunda 2 hasta (%2,3) ve Evre IVA grubunda 7 hasta (%8,3) bulunduğu, Evre IV B ve C gruplarında ise hasta bulunmadığı görülmüştür. Nüks saptanan 8 olgudan; 3 tanesi Evre IV A grubunda, 1 tanesi Evre III grubunda ve 4 tanesi Evre I grubunda yer almıştır. Yapılan analizlerde BRAF, RAS ve c-Met genlerinin hastalığın TNM evresi ile ilişki göstermedikleri saptanmıştır.(p>0,05) TERT mutasyonu pozitif olan olguların ileri evre hasta grubunda yoğunlaştığı görülmüş ve bu ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur(Tablo 4.15).(p=0,001) Tablo 4.15: Evre ile Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan EVRE Hasta Sayısı = 84 BRAF RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG Evre I 70 45 25 3 67 1 69 5 65 Evre II 5 4 1 1 4 0 5 0 5 Evre III 2 1 1 0 2 0 2 0 2 Evre IV A 7 4 3 1 6 4 3 0 7 p Değeri 0,741 0,250 0,001 0,353 74 4.16. MACIS Skoru: Hastaların MACIS prognostik skorları hesaplandığında; birinci risk grubunda 74 (%88), ikinci grupta 7 (%8), üçüncü grupta 1 (%1) ve dördüncü grupta 2 (%3) hasta olduğu saptanmıştır(Tablo 4.1). Nüks saptanan 8 olgunun tamamının MACIS 1 grubunda yeraldığı görülmüştür. BRAF, RAS ve c-Met pozitif gruplarının MACIS skoru ile korelasyon göstermedikleri saptanmıştır.(p>0,05) TERT mutasyonu pozitif olan olgularda ise MACIS skorlarının istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek olduğu (Tablo 4.16) görülmüştür.(p=0,001) Tablo 4.16: MACIS Skoru İle Genetik Parametrelerin İlişkisi Çalışmaya Alınan Hasta Sayısı = 84 BRAF MACIS Aralık Ort. Skoru 3,16-8,19 4,51 P DEĞERİ 4.17. RAS TERT c-Met n POZ NEG POZ NEG POZ NEG POZ NEG 4,58 4,39 4,83 4,49 5,88 4,42 4,47 4,51 0,544 0,526 0,001 0,707 Ultrasonografik Bulgular: Hastaların USG raporlarında bildirilen malignite bulguları ile BRAF mutasyonu arasındaki ilişki (Tablo 4.17) incelendiğinde; hipoekoik nodül yapısı (p=0,031) ve nodülün en boy farkı olmaması (p=0,044) kriterlerinin istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki gösterdikleri tespit edilmiştir. Ancak diğer ultrasonografik bulgular ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişkiler saptanmamıştır.(p>0,05) 75 Tablo 4.17: Ultrasonografik Bulgular ile BRAF Mutasyonu İlişkisi USG PARAMETRESİ BRAF MUTASYONU DURUMU n % POZİTİF NEGATİF P DEĞERİ Belirtilmemiş 51 %60,7 Mikrokalsifikasyon Yok 23 %27,4 14 9 Var 10 %11,9 7 3 0,71 Belirtilmemiş 62 %73,8 Nodüler Ekojenite Nodüler Vaskülarite Nodül Sınırları Hipoekoik 18 %21,4 14 4 İzoekoik 1 %1,2 1 0 Hiperekoik 3 %3,6 0 3 Belirtilmemiş 77 %91,6 18 7 Normal 3 %3,6 1 2 Artmış 4 %4,8 2 2 Belirtilmemiş 59 %70,3 4 3 Düzenli 17 %20,2 11 6 Düzensiz 8 5 3 %9,5 0,031 0,321 0,941 Belirtilmemiş 52 %61,9 Halo Formasyonu Yok 29 %34,5 18 11 Var 3 3 0 %3,6 0,534 Belirtilmemiş 13 %15,5 Nodülde Boy En Farkı Yok 43 %51,2 32 11 Var 28 %33,3 14 14 Belirtilmemiş 7 %8,3 Homojen 68 %81 42 26 Heterojen 9 %10,7 5 4 Parankim 4.18. 0,044 0,73 Hastalıksız Sağkalım: Hastaların ortalama takip süresi 40,9±28.7 aydır. Takip süresi boyunca bir hasta ek hastalığı (hepatosellüler kanser) nedeni ile vefat etmiştir. Takip süresinde hastalık spesfik sağkalım oranı %100’dür. Takip süresi içinde hepatosellüler kanser nedeni ile vefat eden tek hasta MACIS skoruna göre dördüncü grupta yer almaktadır. 76 Hastalıksız sağ kalım açısından incelendiğinde, papiller kanserli hastaların 8’inde (%11,6) nüks saptanmış ve bu hastalara tekrar cerrahi tedavi veya ilave RAİ tedavisi uygulanmıştır. Nüks saptanan hastaların tamamı MACIS grup 1’de yer almaktadır. Nüks saptanan hastaların hastalıksız sağ kalım süreleri ortalama 23.6±8.9 ay bulunmuştur. BRAF V600E mutasyonuna göre yapılan hastalıksız sağkalım analizlerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit edilmemiştir.(p=0,769) Ancak Şekil 4.1’de gösterilen BRAF gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi dikkatle incelenirse; kısa izlem süresinde görülen paralelliğin, mutasyon pozitif grupta daha uzun izlem sürecinde artan nüksler nedeniyle bozulduğu görülmektedir. Şekil 4.1: BRAF gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi 77 RAS gen mutasyonu açısından yapılan hastalıksız sağkalım analizinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır.(p=0,863) RAS mutasyonuna göre oluşan hastalıksız sağkalım eğrisi Şekil 4.2’de gösterilmiştir. Şekil 4.2: RAS gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi TERT gen mutasyonu pozitif grupta hastalıksız sağkalım oranlarının belirgin şekilde azaldığı görülmüş, yapılan analizde de iki grup arasında istatistiksel açıdan anlamlı fark bulunmuştur. (p=0,004) (Şekil 4.3) Şekil 4.3: TERT gen mutasyonuna göre hastalıksız sağkalım eğrisi 78 c-Met gen amplifikasyonu açısından yapılan hastalıksız sağkalım karşılaştırmasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır.(p=0,455) c-Met gen amplifikasyonuna göre oluşan hastalıksız sağkalım eğrisi Şekil 4.4’de gösterilmiştir. Şekil 4.4: c-Met gen amplifikasyonu hastalıksız sağkalım eğrisi 79 4.19. Sekans Analiz Bulguları: BRAF V600E MUTASYONU • 1799. nükletotid olan Timin yerine Adenin geçmesi ile oluşan nokta mutasyonu. (1799 T>A) • Elektroferogramda Timin bazı üstte kırmızı renkli dalga ile ifade edilmekte iken, altta okla gösterilen mutasyon noktasına yeşil renkli dalga ile ifade edilen Adenin bazı gelmiştir. • Mutasyon, 600. Kodon olan Valini, Glutamik aside dönüştürmüştür. (V600E) Şekil 4.5: BRAF V600E Sekans Elektroferogramı BRAF 598-599 CTA İNSERSİYON MUTASYONU • 1793. ve 1794. nükletotidler arasına CTA (Sitozin, Timin ve Adenin) baz üçlüsünün girmesi ile oluşan insersiyon mutasyonu. (1793-1794 İns.CTA) • Üstteki elektroferogramda söz konusu bölgenin negatif kontrolü gösterilirken, altta ok ile mutasyon bölgesine CTA bazlarının insersiyonu (mavi, kırmızı ve yeşil dalgalar) gösterilmektedir. • Bu mutasyon, literatürde daha önce tanımlanmamıştır. Şekil 4.6: BRAF 598-599 İns.CTA Sekans Elektroferogramı 80 KRAS EKZON-2 / G12V MUTASYONU • 35. nükletotid olan Guanin yerine Timin geçmesi ile oluşan nokta mutasyonu. (35 G>T) • Üstteki elektroferogramda Guanin bazı siyah renkli dalga ile ifade edilmekte iken, altta okla gösterilen mutasyon noktasına kırmızı renkli dalga ile ifade edilen Timin bazı gelmiştir. • Mutasyon, 12. Kodon olan Glutamini, Valine dönüştürmüştür. (G12V) Şekil 4.7: KRAS Ekzon 2 Sekans Elektroferogramı NRAS EKZON-3 / Q61R MUTASYONU • 182. nükletotid olan Adenin yerine Guanin’in geçmesi ile oluşan nokta mutasyonu. (182 A>G) • Üstteki elektroferogramda Adenin bazı yeşil renkli dalga ile ifade edilmekte iken, altta okla gösterilen mutasyon noktasına siyah renkli dalga ile ifade edilen Guanin bazı gelmiştir. • Mutasyon, 61. Kodon olan Glutamini, Arginine dönüştürmüştür. (Q61R) Şekil 4.8: NRAS Ekzon 3 Sekans Elektroferogramı 81 TERT 228 C>T MUTASYONU • TERT geni promotor bölgesinde 228. nükleotid olan Sitozin’in yerine Timin’in geçmesi ile oluşan mutasyon. (228 C>T) • Üstteki elektroferogramda mavi renkli dalga ile ifade edilen Sitozin bazının yerine, altta okla gösterilen ve kırmızı renkli dalga ile ifade edilen Timin bazı gelmiştir. Şekil 4.9: TERT 228 C>T Sekans Elektroferogramı TERT 250 C>T MUTASYONU • TERT geni promotor bölgesinde 250. nükleotid olan Sitozin’in yerine Timin’in geçmesi ile oluşan mutasyon. (250 C>T) • Üstteki elektroferogramda mavi renkli dalga ile ifade edilen Sitozin bazının yerine, altta okla gösterilen ve kırmızı renkli dalga ile ifade edilen Timin bazı gelmiştir. Şekil 4.10: TERT 250 C>T Sekans Elektroferogramı 82 4.20. FISH Analiz Bulguları: Resim 4.1: c-Met gen amplifikasyonun FİSH ile değerlendirilmesi (Fotograflar, Leica DFC 300 FX floresan mikroskobunda X1000 büyütme ile çekilmiştir. ) Resim 4.1a: Papiller karsinom hücre nükleusları (DAPI filtre) Resim 4.1b: Papiller karsinom hücre nükleuslarında MET gen sinyalleri (kırmızı filtre) Resim 4.1c: Papiller karsinom hücre nükleuslarında 7. Kromozom sentromerini gösteren sinyaller (yeşil filtre) Resim 4.1d: Papiller karsinom hücre nükleuslarında eşit sayıda 7.kromozom sentromeri ve MET geni varlığının (yeşil ve kırmızı sinyaller eşit sayıda) izlendiği amplifikasyon olmayan vakaya ait kompozit görüntü 83 a b Resim 4.2: c-Met gen amplifikasyonu pozitifliğinin gösterilmesi. Resim 4.2a ve 4.2b: Papiller karsinom hücre nükleuslarında artmış MET genini gösteren kırmızı sinyallerin 7. kromozom sentromerini gösteren yeşil sinyallere oranının arttığı amplifikasyon olan vakaya ait kompozit görüntüler 84 5. TARTIŞMA Papiller tiroid kanseri genellikle selim bir klinik seyir göstermesine rağmen bazı olguların nüks ve metastazlar ile seyreden saldırgan bir tablo sergiledikleri gözlenmektedir. Tümör büyüklüğü, evresi ve klinikopatolojik özellikleri benzer olan olguların bu farklı biyolojik davranışlarının temelinde, karsinogenezde de görev alan bazı moleküler genetik faktörlerin rol oynadıkları düşünülmektedir. PTK olgularında etiyolojik genetik temellerin ortaya konması, olguların daha doğru yönetimi ve tedavisi için fayda sağlayacaktır.(19) Tiroid karsinogenezinde rol oynayan bazı genetik değişikliklerin bazı tiroid kanser formlarında daha fazla oranda bulunduğu gözlenmiştir. PTK olgularında Korede yapılan çalışmalarda %70-80 aralığında bildirilen BRAF mutasyon prevalansı, coğrafi bölgelere göre değişmekle birlikte, çok merkezli ve geniş hasta grupları ile yapılan metaanaliz çalışmalarında ortalama %45 olarak bildirilmiştir. Yine RAS mutasyonlarına folliküler tiroid kanser olgularında ve papiller tiroid kanserin folliküler varyantında daha sıklıkla rastlandığı bilinmektedir.(8, 67,185,186). Son yıllarda folliküler adenom, FTK, FVPTK olgularının İİAB incelemesinde yetersiz sitoloji/indeterminate sitoloji olarak bildirilen durumlarda BRAF, RAS ve RET/PTC mutasyonları araştırılarak ayırıcı tanıya gidilmeye çalışılmaktadır.(3,18,187-189) Tiroid kanserlerinin klinik seyri ve prognozu üzerine genetik faktörlerin etkileri hakkında halen birçok çalışma yapılmaktadır. Bu çalışmaların önemli bir kısmında BRAF V600E mutasyonunun PTK olgularında prognostik bir belirteç olarak kullanılabileceği savunulmuştur.(65,75,190,191) Postoperatif dönemde uygulanan RAI tedavisine direnç nedeni ile oluşan nüks olgularında sıklıkla BRAF mutasyonu suçlanmaktadır. Yine tedavi için gereken radyoaktif iyot tedavi dozu ve ikinci bir kür tedavi ihtiyacı ile BRAF mutasyonu mevcudiyeti arasında korelasyon olduğu bildirilmektedir. 85 PTK olgularının takip sürecinde gösterdikleri saldırgan klinik tablodan sıklıkla sorumlu tutulan BRAF, RAS, TERT mutasyonları ve c-Met gen amplifikasyonu durumları, takip ve tedavi ettiğimiz olgularımız üzerinde retrospektif olarak incelenmiş ve bu genetik etkilerin prognostik önemi ortaya konmaya çalışılmıştır. İncelenen genetik değişikliklerin yaş, cinsiyet, tümör boyutu, tümör alt tipi, ekstratiroidal yayılım, lenf nodu metastazı varlığı ve nüks gibi klinikopatolojik prognostik parametreler ile olan ilişkisi ve sağkalım üzerine olan etkileri değerlendirilmiştir. Papiller tiroid kanseri, sıklıkla 3. ve 4. dekatlar arasında ortaya çıkar. Gilliland ve ark.(47) yaptığı 15.698 tiroid kanseri olgusunu içeren çalışmada, 11.857 PTK’lı hastanın yaş ortalaması 39 olarak saptanırken yaş dağılımı 595 yaşlar arasında bulunmuştur. Mayo Klinikte Hay ve ark.(192) 2444 hastayı içeren çalışmalarında ise tanı anında ortanca yaşın 46 yıl (4-90 yaş) olduğu bulunmuştur. Çalışmamızdaki hastaların yaş özelliklerinin genel literatür bilgileri ile uyumlu olduğu görülmüştür. Erkek cinsiyetin kötü prognostik gösterge olduğu literatürde bazı yazarlarca savunulsa da, aksine cinsiyetin önemli bir prognostik faktör olmadığına dair yayınlar da mevcuttur.(193) AMES, AGES ve MACIS prognostik skorlama sisteminlerine cinsiyet dahil edilmemiş, prognoza etkili olmadığı belirtilmiştir.(169,170) Papiller tiroid karsinomunda kadın/erkek oranı 2/1 ile 4/1 arasında değişmektedir.(126,134,194) Çalışmamız literatür ile uyumlu bulunmuştur. Papiller tiroid kanseri histolojik olarak değişik varyantlara ayrılmaktadır. Bu varyantlardan en sık görüleni klasik tip olup, bunu folliküler varyant takip etmektedir. Diğer alt tipler daha seyrek görülmektedir. PTK varyantları arasında en iyi prognoza sahip olanı klasik tiptir. Tall cell, kolumnar tip ve diffüz sklerozan tipleri daha agresif seyirlidir ve prognozları daha kötüdür.(195,196) 86 Yang ve ark.(197) yaptığı sistematik derleme ve metaanaliz çalışmasında klasik varyant olguları, folliküler varyanttan farklı olarak daha büyük tümör çapı ve 45 yaş üstü hastalarda yaygınlık ile ilişkili bulmuştur. Aksine ekstratiroidal yayılım, lenf nodu metastazı, BRAF mutasyonu ve nüks ile ilişkisini ise daha düşük oranda saptamışlardır. Literatür ile uyumlu olarak çalışmamızda da klasik varyant %66.7’lik oranla en sık saptanan histolojik tip olmuştur. Çalışmamızda klasik varyant ile BRAF mutasyonu birlikteliği istatistiksel açıdan anlamlı bulunurken, folliküler varyant ve diğer varyantların sayıca az olması varyantlar arasında BRAF mutasyonu birlikteliğini kıyaslamamıza olanak sağlamamıştır. Bulgularımız literatür ile uyumlu görülmekle birlikte, bu özelliğin tüm varyantların yeterli sayıda temsil edildiği geniş serilerde değerlendirilmesinin daha anlamlı olacağı düşünülmektedir. Ekstratiroidal invazyon, prognozu kötü yönde etkileyen faktörlerin başında gelmektedir. Prognostik skorlama sistemlerinin hemen hepsinde yer alan önemli bir parametredir.(134,150) Ekstratiroidal invazyon papiller tümörlerde %5-10 arasında görülür. Agresif varyantlar olan özellikle tall cell varyantta ve solid varyantta ekstratiroidal yayılımı daha sık görülmektedir. Solid varyantların ise 1/3’ünde ekstratiroidal yayılım ve vasküler invazyon bildirilmektedir.(125,126,150) Çalışmamızda literatüre uyumlu şekilde %9,5 oranında ekstratiroidal invazyon tespit edilmiştir. Ekstratiroidal yayılım saptanan 8 olgunun 6 tanesinin klasik tip, 2 tanesinin foliküler tip olduğu görülmüş, çalışma grubunda yeralan diğer histolojik tiplerde ise ekstratiroidal yayılım gözlenmemiştir. Bizim çalışma grubumuzda agresif seyir gösterdiği bilinen varyantların bulunmaması nedeni ile söz konusu varyantların ekstratiroidal yayılımı hakkında değerlendirme yapılamamıştır. Grade, bazı prognostik skorlama sistemlerine dahil edilen prognostik önemi olan parametrelerden biri olup üç Avrupa serisinde ve bir Mayo Klinik çalışmasında tümörün derecesi anlamlı prognostik faktör olarak gösterilmiştir.(155) Joensuu ve ark.(158) DNA anöploidisini tek değişkenli 87 analizde olumsuz bir faktör olarak bulurken, bunun bağımsız bir prognostik faktör olmadığını bildirmiştir. Mayo klinik serisi, (135) anormal DNA içeriği oranı yüksek olan olguları, artmış kanser mortalitesi ile ilişkili bulmuştur. Çalışmamızda grade ile TERT mutasyonu arasında anlamlı istatistiksel ilişki saptanmış, incelenen diğer genetik belirteçler ile grade arasında bir ilişki bulunmamıştır. Tiroid kapsül invazyonu ve vasküler invazyon kötü prognostik bulgulardır. Bunlar özellikle tall cell varyantta daha sık gözlenmekte olup, bazı genetik belirteçler ile yakın ilişki gösterdiği yapılan çalışmalarda bildirilmektedir. Çalışmamızda vasküler invazyon 11 hastanın 9’u klasik varyant, 2’si folliküler varyant histolojik tipinde idi. Kapsüler invazyon saptanan 21 olgunun ise 15’inin klasik varyant, 5’inin folliküler varyant ve 1 tanesinin mikrokarsinom alttipinde olduğu görüldü. Olgularımızda folliküler varyant olguların vasküler ve kapsüler invazyon oranlarının, klasik varyanta göre daha yüksek olduğu gözlenmekle birlikte, sağlıklı bir değerlendirme için diğer varyantların da temsil edildiği vaka grupları üzerinde yapılacak çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Hay ve ark.(170) tarafından Mayo Klinik’te geliştirilen ve diğer sistemlerinden farklı olarak rezeksiyon yeterliliği kriteri değerlendirmeye alan MACIS prognostik skorlama sistemi, papiller tiroid kanserinde güvenilir bir skorlama sistemi olarak kabul edilmektedir. MACIS 1 .grupta 10 yıllık sağ kalım %99, 4. grupta ise %24’tür. Özdemir ve ark.(198) diferansiye tiroid kanseri olgularında MACIS ve MSKCC (Memorial Sloan Kattering Cancer Center) skorlama sistemlerinin lokal nüksü öngörü değerini araştırmışlar ve yüksek risk grubunda yer alan olgularda lokal nüks oranlarını yüksek bulmuşlardır. Olgularımızın MACIS skorları gruplandığında; birinci grupta 74 olgu (%88.1) bulunduğu ve nüks saptanan 8 hastanın tamamının MACIS grup 1’de yer aldığı görülmüştür. Çalışmamızda incelenen hastaların MACIS skoruna göre bulunduğu risk grubu ile nüks olguların dağılımı arasında 88 korelasyon olmadığı saptanmıştır. Nüks olgularımızın MACIS grup 4’te yeralması beklenirken tamamının grup 1’de yeralması MACIS prognostik skorlama sisteminin nüksü öngörmedeki etkinliğinin sorgulanması gerektiğini düşündürmektedir. MACIS sisteminde lenf nodu metastazı, ekstratiroidal yayılım ve cerrahi sınırda tümör devamlılığı gibi lokal nükse zemin hazırlayan önemli faktörlerin düşük puanlandırma ile değerlendirmeye alınmasının bu duruma neden olduğu düşünülmüştür. MACIS skorlama sisteminde nükse neden olabilecek bazı genetik etiyolojik faktörlerin hesaba katılmaması bu sistemin bir eksikliği olarak düşünülebilir. Nitekim çalışmamızda kötü prognostik bir belirteç olarak görülen ve hastalıksız sağkalımı etkileyen TERT mutasyon pozitifliği ile bu hastaların MACIS skorlarının yüksekliği arasında korelasyon görülmektedir. Olgularımızın TNM sınıflamasına göre yapılan evrelemesinde TERT mutasyonu pozitifliğinin ileri evre ile ilişkili (p=0,001) saptanması, bu genetik belirtecin prognostik önemini bir kez daha ortaya koymuştur. Ancak TNM evrelemesinde de nüks saptanan 8 olgumuzdan sadece 3 tanesi Evre IV A grubunda yer almaktaydı. TNM evrelemesinde de MACIS Skorlama sisteminde olduğu gibi yaş faktörü hastanın yer alacağı risk grubunu belirleyen başlıca faktör olarak öne çıkmaktadır. TNM evrelemesinde uzak metastazı bulunan olgular bile 45 yaşından küçük olduğu için Evre II olarak sınıflanmaktadır. Yaş faktörü göz ardı edilerek yapılacak TNM evrelemesinde 21 olgumuz Evre IV A grubunda yer alacak ve nüks saptanan 8 olgumuzdan 6 tanesi bu grupta yer alacaktı. Gerek MACIS Skorlama Sistemi, gerekse TNM Evreleme Sistemi kansere özgü sağkalım açısından prognozu belirlemede başarılı sistemler olarak kabul edilmektedirler. Ancak yaş faktörünün risk gurubunu asıl belirleyici etken olarak ön plana çıkarılması nedeniyle nüks saptanan olgularımızı saptamada bu iki sistem de yetersiz kalmıştır. 89 5.1. BRAF Papiller tiroid kanser olgularında en yaygın BRAF mutasyonu BRAF V600E mutasyonu olup, BRAF V601E mutasyonu ve diğer mutasyonlar ender görülmektedir.(199) Diğer BRAF mutasyon çeşitlerinin hastalığın prognozu üzerine literatürde sınırlı sayıda yayın mevcuttur. Çalışmamızda 53 olguda BRAF V600E mutasyonu gözlenirken, bir folliküler varyant olgumuzda literatürde daha önce tanımlanmamış farklı ve yeni bir BRAF 598-599 CTA insersiyon mutasyonu tespit edildi. BRAF mutasyonu ile ekstratiroidal yayılım, rekürrens ve uzak metastaz gibi agresif tümör özellikleri arasındaki ilişki, hepsinde olmasa bile çoğu çalışmada ortaya konmuş ve genellikle güvenilir bir agresivite belirteci olarak kabul edilmiştir.(190, 200-202) Ellisei ve ark.(203) BRAF V600E mutasyonlu olgularının 15 yıllık izlemi sonrasında bu mutasyonun mortaliteyi artırdığını bildirmişlerdir. Öte yandan, bazı araştırmacılar, PTK olgularında BRAF V600E mutasyonunun agresivite ile ilişkili olmadığını savunmuştur. Sancisi ve ark.(204) retrospektif çalışmalarında bu mutasyonun PTK hastalarında uzak metastaz gelişimi veya ölümcül sonuçlar ile ilişkili olmadığı ve agresif davranış belirteci olamayacağı sonucunu çıkarmışlardır. Yine Trovisco ve ark.(202) BRAF mutasyonlu PTK olgularının büyük boyut, vasküler invazyon, ekstratiroidal yayılım ve nodal metastaz gibi yüksek agresivite özellikleri göstermediğini ve daha az sıklıkla multisentrik olduğunu bildirmiştir. Birçok çalışma BRAF V600E mutasyonu ile kötü prognoz özellikleri arasında sıkı bir ilişki bildirmesine rağmen, BRAF V600E mutasyon durumu henüz standart bir PTK yönetim algoritmasına dahil edilmemiştir. BRAF V600E mutasyonu papiller karsinom ve papiller karsinomdan kaynaklanan kötü diferansiye ve anaplastik karsinom olguları ile sınırlıdır. (63, 64, 205) 90 Nikiforov ve ark.(187) yaptıkları prospektif çalışmada 1000 den fazla İİAB örneğinde BRAF mutasyon varlığı araştırılmış, cerrahi materyalde %100 papiller karsinom tanısı ile korele bulunmuştur. Şüpheli tiroid nodüllerinden alınan İİAB materyalinde sitoloji sonucu indeterminate sitoloji olarak bildirilen olguların ayırıcı tanısında diğer genetik moleküler markerler ile birlikte BRAF mutasyonunun çalışılması ve bunun preoperatif tanıda kullanılması ile ilgili çalışmalar halen devam etmektedir. (3, 188, 190, 206, 207) PTK olgularında BRAF mutasyon pozitifliğinin preoperatif dönemde saptanmasıyla, uygulanacak cerrahi tedavi genişliği hakkında karar vermede klinisyenlere rehberlik edebileceğini savunan birçok çalışma mevcuttur. (70, 207-213) Papiller Tiroid Kanserinde BRAF V600E gen mutasyonu prevalansı literatürde %29-%83 arasında değişmekle birlikte ortalama prevalans yaklaşık %45’tir.(8, 67, 185) Korede yapılan çalışmalarda ise bu prevalans %70-%80 olarak bildirilmektedir.(186) BRAF mutasyon prevalansının coğrafik olarak farklı dağılımlar göstermesinde ırksal farklılıkların etkisi olduğu düşünülse de, aynı ülkede yapılan çalışmalarda bile farklı sonuçlara ulaşılabilmektedir. Nitekim, Kurtulmuş ve ark.(68) tarafından 109 PTK olgusu ile Türkiye’de yapılan çalışmada BRAF pozitifliği prevalansı %39.45 olarak saptanmıştır. Olgularımızın % 66,7’si klasik varyant olup, serimizde BRAF mutasyon pozitifliği %64.2 oranında yüksek saptanmıştır. Bu iki çalışma arasındaki prevalans farkının klasik varyant olgularının dağılımından kaynaklandığı düşünülmektedir. BRAF mutasyonunun Türkiye’deki prevalansının net olarak ortaya konabilmesi için geniş hasta grupları ile yapılacak başka çalışmalara ihtiyaç olduğu değerlendirilmektedir. Kebebew ve ark.(214) çalışmasında BRAF mutasyonu ile ileri yaş arasında ilişki saptanırken (p=0,038), Basolo ve ark.(66) tarafından yapılan çalışmada aksine genç yaşta hastalarda kuvvetli ilişki belirtilmiştir. Kurtulmus ve ark.(68) çalışmasında ise 45 yaş ve üzeri hastalarda mutasyon sıklığı açısından fark tespit edilmemiştir. Kim ve ark.(215) ve Xu ve ark.(216) 91 çalışmalarında BRAFV600E mutasyonu ile erkek cinsiyet arasında ilişki olduğu bildirilmiştir. Ancak Chakraborty ve ark.(217) Hindistan’da yaptıkları çalışmada ve Yu-jia Ma ve ark.(218) 2253 PTMK olgusunu içeren metaanaliz çalışmasında BRAF mutasyonu ile yaş ve cinsiyet arasında ilişki saptamamıştır. Literatürdeki genel kabule paralel olarak çalışma grubumuzda da yaş ve cinsiyet ile BRAF mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmamıştır. Yu-jia Ma ve ark.(218) tarafından yapılan metaanaliz çalışmasında BRAF mutasyonu ile tümör çapı arasında ilişki olduğu, 5 mm ve altındaki tömörlerde mutasyon sıklığı %53.4, 5 mm den büyük tümörlerde ise %75.0 olduğu bildirilmiştir. Yine Basolo ve ark.(66) tarafından yapılan retrospektif çalışmada tümör büyüklüğü 20 mm den küçük 1060 PTK olgusunu incelemiş ve BRAF mutasyonu ile tümör büyüklüğü arasında kuvvetli ilişki olduğu bildirilmiştir. Aksine Chakraborty ark.(217) yaptıkları çalışmada tümör büyüklüğü ile BRAF pozitifliği arasında korelasyon görmemişlerdir. Carol Li ve ark.(59) tarafından 2029 hasta ile yapılan metaanaliz çalışmasında 10 mm ve altındaki tümörlerde ise mutasyon sıklığını %45.6, 10 mm den büyük tümörlerde ise mutasyon sıklığı %49.9 olarak bulunmuştur. Bizim çalışmamızda ise BRAF mutasyonu pozitif ve negatif gruplarda tümör büyüklüğü ortalamaları yakın bulunmuş, tümör çapı ortalamaları ile BRAF mutasyonu arasında ilişki olmadığı görülmüştür. Tümör çapları gruplanarak genetik belirteçler ile ilişkisi incelendiğinde 1 cm ve daha küçük tümörler (mikrokarsinomlar) ile 1 cm den büyük tümörler arasında BRAF mutasyonu pozitifliği açısından anlamlı ilişki olduğu görülmüştür. Ancak tümör çapı 1 cm’nin altındaki ve üstündeki gruplarda görülen BRAF mutasyon pozitifliğinin, tümör çapı arttıkça doğrusal olarak artmadığı gözlenmiştir. 92 Yapılan birçok çalışma BRAF mutasyonu ile ekstratiroidal yayılım, lenf nodu metastazı ve sık rekürrens kaynaklı agresif tümör davranışı arasında ilişkili olduğunu bildirmektedir. (62-75) Xing tarafından yapılan metaanalizde (219) BRAF mutasyonu ile tümör özellikleri incelenmiş, tek tek bakılınca ilişki saptanmamasına rağmen toplam değerlendirmede BRAF mutasyonu ile ekstratiroidal invazyonun odds oranı 2.50 olarak bulunmuştur. Basolo ve ark.(66) tarafından yapılan çalışmada BRAF mutasyonu ile ekstratiroidal yayılım arasındaki ilişkinin odds oranı 3.74 olarak bildirilmiştir. Çalışmamızda ekstratiroidal yayılım gösteren 8 olgunun 5 tanesinde BRAF mutasyonu gözlenmiş olup, ekstratiroidal invazyon ile BRAF mutasyonu arasında anlamlı ilişki saptanmamıştır.(p>0.05) Ekstratiroidal yayılım parametresini değerlendirmek için çalışmamızdaki 8 olgu sayı olarak son derece yetersiz olup, grubumuzun çoğunluğunu klasik varyantın oluşturması nedeni ile bu sayının az olduğu düşünülmüştür. Çok sayıda çalışma ve olgu sayısını içeren metaanalizlerde ve bir çok varyantın bir arada değerlendirilerek ulaşılan sonuçların daha güvenilir ve doğru olabileceği düşünülmüştür. Tufano ve ark.(70) tarafından yapılan metaanaliz çalışmasında ve Lim ve ark.(220) Kore’de yaptıkları çalışmada BRAF mutasyonu ile lenf nodu metastazı arasında belirgin ilişki olduğu sonucuna varılmıştır. Başka birçok çalışmada da, BRAF mutasyonu bulunan olgularda lenf nodu metastazlarının daha sık görüldüğü gösterilmiştir. (59, 63-65, 68, 69, 190, 221) Aksine Dutenhefner ve ark.(222) tarafından yapılan prospektif çalışmada 51 PTK olgusuna rutin olarak total tiroidektomi ve beraberinde proflaktik Santral Lenf Nodu Diseksiyonu (SLND) uygulanmış ve BRAF mutasyon durumları incelenerek lenf nodu metastazı ile ilgisi araştırılmıştır. Sonuçta BRAF mutasyonu ile lenf nodu metastazı arasında korelasyon saptanmamış ve bu araştırmacı tarafından preoperatif BRAF mutasyonu durumunun bilinmesinin lenf nodu metastazını saptamaya ve yapılacak cerrahi tedaviye lenf nodu diseksiyonu eklenmesine karar vermede fayda sağlamayacağı savunulmuştur. (222) Yine Paulson ve ark.(223) yaptıkları 93 çalışmada BRAF mutasyonu ile PTK varyantlarının lenf nodu metastazı üzerine etkisi incelenmiş, BRAF mutasyonunun santral lenf nodu metastazını artırmadığı ve SLND’nuna karar vermede iyi bir belirteç olmadığı sonucuna varılmıştır.(223) Çalışma grubumuzun üçte birine tekabül eden sayıda hastaya lenf nodu diseksiyonu yapılmış ve bunların 2/3’ü malign lenf nodu olarak sonuçlanmıştır. Malign lenf nodu tutulumu ile %73,6 oranında BRAF mutasyonu pozitifliği saptanmasına rağmen, yapılan analizlerde sonuç istatistiki olarak anlamlı bulunmamıştır. Çalışma grubumuzdaki olgu sayısının ve lenf nodu diseksiyonu uygulanan hasta sayısının azlığı nedeni ile elde ettiğimiz sonuç bize bu konuda sınırlı şekilde yorum yapma imkanı tanımaktadır. BRAF mutasyonu ile lenf nodu metastazı arasındaki ilişki hakkında çelişkili bulgular ve görüşler, bu konu hakkında geniş hasta serileri ile iyi dizayn edilmiş çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Basolo ve ark.(66) tarafından yapılan çalışmada BRAF mutasyonu ile invazivlik arasında kuvvetli bir ilişki olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Xing ve ark.(190) çalışmasında ise BRAF mutasyonu ile tiroid kapsül invazyonu arasında anlamlı ilişki (p =0,045) saptanmıştır. Yine Kurtulmus ve ark.(68) yaptıkları çalışmada da BRAF pozitifliği ile tiroid kapsül invazyonu arasında korelasyon saptanmıştır.(p=0,04) Aksine Huang ve ark.(191) Çin’de yaptığı prospektif çalışmada tiroid kapsül invazyonu ile BRAF mutasyonu pozitifliği arasında ilişki saptamamışlardır. Çalışmamızda %25 olgumuzda kapsül invazyonu gözlenmiş, 21 hastanın 15’inde BRAF mutasyonu pozitif olmasına rağmen yapılan analizlerde kapsül invazyonu ile BRAF mutasyonu arasında anlamlı ilişki saptanmamıştır. Carol Li ve ark.(59) tarafından yapılan ve 6372 vakanın incelendiği metaanaliz çalışmasında BRAF mutasyonu ile tiroid bezinde birden çok odakta tümör varlığı arasında ilişki olduğu gösterilmiştir. Literatürde benzer sonuca ulaşan bir çok çalışma mevcuttur. (59, 66, 68, 224) 94 Çalışmamızda 24 hastada (%28.6) multisentrisite saptanmış olup, bunların 17 tanesinde BRAF mutasyonu saptanmasına rağmen yapılan analizlerde BRAF mutasyonu ile multisentrisite arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. Yang ve ark.(197) sistematik derleme ve metaanaliz çalışmasında klasik varyantın, folliküler varyanttan daha fazla oranda BRAF mutasyonu ile birliktelik gösterdiği bildirilmiştir. Çalışmamızda da buna paralel olarak klasik varyant olgularda BRAF mutasyonu daha fazla oranda bulunmuş ve bu birliktelik istatistiksel olarak da anlamlı bulunmuştur.(p=0,001) BRAF mutasyonu, sodyum iyodür simporter (NIS) pompasının disfonksiyonuna yol açarak follikül hücrelerinde iyot metabolizmasını etkiler, iyot tutulumunu bozarak radyoaktif iyot tedavisinin etkinliğini azaltır ve tedavi başarısızlığına yol açarak nükse neden olur. (65, 110) Bu nedenle PTK’de %10-15 hastada nüks gelişebilmektedir. (68, 225, 226) PTK olgularının 5 yıllık takiplerinde %5,7 ve 10 yıllık takiplerinde ise %9,4 oranında tümör rekürrensi bildirilmektedir.(177) PTK olgularında rekürrense neden olan en önemli faktörün lenf nodu metastazlarının olduğu bilinmektedir.(142, 227, 228) Birçok çalışmada BRAF mutasyonu ile lenf nodu metastazı korelasyonu ve rekürrens riski açısından belirteç olabileceği bildirilmektedir.(65, 75, 214) Rekürrensin BRAF mutasyonu ile ilişkisi Xing ve ark.(190) yaptığı çalışmada incelenmiş, ortalama 3 yıllık takip sonrasında ise rekürrens durumu mutasyon pozitif grupta %36, mutasyon negatif grupta ise %12 olarak saptanmıştır. Tufano ve ark.(70) sistematik derleme ve metaanaliz çalışmasında; PTK olgularında BRAF mutasyon pozitifliğinde odds oranları rekürrens için 1.93, lenf nodu metastazı için 1.32 bulunmuştur. BRAF mutasyonunun PTK de rekürrens riskinin artışı ile korelasyon gösterdiği bildirilmiştir. Bu nedenle BRAF mutasyonu mevcudiyetinin tedavi aşamasında gözönüne alınması gereken önemli bir belirteç olduğu ifade edilmiştir. 95 Aksine Czarniecka ve ark.(229) 233 PTK olgusu ile yaptığı çalışmada BRAF mutasyonunun klinikopatolojik parametreler ile birlikteliği ve rekürrens üzerine olan etkisi incelenmiş, BRAF mutasyonu ile ne rekürrensin ne de hastalıksız sağkalımın ilişkisi olmadığı sonucuna varılmıştır. Ancak nodal statü, ekstratiroidal invazyon ve tümör çapı ile hastalıksız sağ kalım arasında belirgin ilişki olduğu saptanmıştır. Çalışma grubumuzda 8 nüks olgusunun 6 tanesinde BRAF mutasyonu saptanmış olmasına rağmen, analizlerde literatürdeki genel kabulun aksine BRAF mutasyonu ile rekürrens arasında anlamlı ilişki tespit edilmemiş ve mutasyonun hastalıksız sağkalım üzerinde etkisi olmadığı sonucuna varılmıştır. Ancak çalışmamızdaki BRAF mutasyonu hastalıksız sağkalım eğrisi dikkatle incelenirse; kısa izlem süresinde görülen paralelliğin, mutasyon pozitif grupta zamanla artan nüksler nedeniyle daha uzun izlem sürecinde bozulduğu görülmektedir. Literatürdeki genel kabule paralel olarak uzun vadede BRAF mutasyonu ile hastalığın nüksü arasında anlamlı ilişki olduğu söylenebilir. Kabaker ve ark.(230) yaptıkları çalışmada PTK olgularında USG de malignite şüpheli bulgular (nodülde en boy farkı, düzensiz kenar, hipoekojenite, kalsifikasyon, non kistik kompozisyon ve halo yokluğu) ile BRAF mutasyon pozitifliğinin tanıdaki korelasyonunu araştırmışlardır. BRAF pozitifliği ile USG bulgularından sadece nonkistik komponent parametresi uyumsuz bulunmuş olup, diğer parametreler ile BRAF pozitifliği arasında korelasyon saptanmıştır. BRAF mutasyonu negatif ve USG de malignite şüpheli bulgu içermeyen PTK olgularının daha selim bir seyir izleyerek ekstratiroidal yayılım ve lenf nodu metastazı göstermedikleri ifade edilmiştir. Bu çalışma neticesinde USG deki malignite şüpheli nodül özellikleri ile BRAF mutasyonu birlikteliğinin preoperatif risk değerlendirmesinde kullanılabileceği sonucuna ulaşmışlardır. Nam ve ark.(206) yaptıkları prospektif çalışmada USG de malignite şüpheli nodül özellikleri olan hastalardan PTK tanısı alan hastaların BRAF mutasyon durumlarını incelemişlerdir. USG bulgusu pozitif hastalarda BRAF 96 mutasyonu pozitifliği %67, USG bulgusu negatif grupta ise BRAF mutasyonu pozitifliği %10 oranında saptanmıştır. USG bulgusu pozitif hastalarda sitoloji ile BRAF mutasyonu araştırılmasının sensitiviteyi artırdığı, ancak USG bulgusu negatif olan grupta ise BRAF mutasyonu araştırılmasının tanı açısından fayda sağlamayacağı sonucuna ulaşmışlardır. Çalışmamızda BRAF mutasyonu ile USG de nodülün en boy farkı olmaması (p= 0,044) ve nodülün hipoekojen olması (p=0,031) özellikleri arasında istatistiksel olarak anlamlı korelasyon bulunmuştur. Çalışmamızda 84 hastanın 18 tanesine preoperatif dönemde İİAB yapılmamış olup, İİAB yapılan 66 hastanın Bethesta sınıflamasına göre sonuçları; 1 olgu yetersiz sitoloji (%1.20), 12 olgu benign (%14,3), 2 hasta önemi belirsiz folliküler neoplazi (%2,4), 17 hasta malignite şüphesi (%20,2), 34 hasta malign (%40,5) olarak raporlanmıştır. BRAF mutasyon mevcudiyetinin bu gruplara dağılımı incelendiğinde istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır (p=0,582) Çalışmamızda USG de şüpheli görülen nodüllerden yapılan İİAB sitoloji sonuçlarına göre %60,7’lik bir grupta sitoloji sonucu malign ve malignite şüphesi olarak bildirilmiş, %39,3’lük grupta ise diğer sitolojik tanılar bildirilmiştir. Preoperatif dönemde doğru tanı alamayan bu %39,3’lük hasta grubumuzda USG ile birlikte yapılan sitolojik değerlendirmenin yetersiz kaldığı görülmektedir. BRAF mutasyonu dağılımı bizim olgularımızda istatistiksel açıdan anlamlı bir sonuç vermemiş ve tanıda yetersizlik yaşanan bu gruba tanısal anlamda katkı sağlayamamış görünmektedir. Ancak yine de USG de malignite bulgusu gözlendiği halde sitolojik değerlendirmede paralelinde sonuç elde edilemeyen bu olguların BRAF mutasyonu başta olmak üzere genetik belirteçler desteklenmesinin preoperatif tanıda ve ayırıcı tanıda fayda sağlayacağı değerlendirilmektedir. Nitekim Nikiforov ve ark.(187) yaptıkları prospektif çalışmada 1000 den fazla İİAB örneğinde BRAF mutasyon varlığı araştırılmış, cerrahi materyalde %100 papiller karsinom tanısı ile korele bulunmuştur. Bu bakış açısı ile değerlendirilirse sitolojik değerlendirmede doğru tanı alamayan söz konusu 97 39,3’lük hasta grubunu oluşturan 15 olgunun 9 tanesinde BRAF mutasyonu pozitif olup, bu hasta grubunda BRAF mutasyonu araştırılmasının tanısal açıdan katkı sağlayacağı görülmektedir. 5.2. RAS NRAS, HRAS ve KRAS genlerinin bazı spesifik nokta mutasyonları (KRAS için kodon 12, 13 ve HRAS ve NRAS için kodon 61) papiller kanser olgularının %10-20 sinde saptanmaktadır.(231-233) RAS mutasyonları tiroid papiller karsinoma ile sınırlı olmayıp tiroidin diğer benign ve malign lezyonlarında ve başka dokuların neoplazmlarında da gözlenmektedir. RAS mutasyonları folliküler kanserde %40-50, adenomda ise %20-40 oranında gözlenmektedir.(3, 234-238) Folliküler patern gösteren folliküler varyant PTK (FVPTK), FTK ve Folliküler Adenom olgularının sitolojik tanılarında ve malign benign ayrımında genellikle zorluk yaşanmaktadır. Bu yüzden çoğu FVPTK olgularında sitoloji sonucu çoğunlukla “atypia of undetermined significance or follicular lesion of undetermined significance (AUS/FLUS)” olarak bildirilmektedir.(239, 240) Başlangıçta sitolojik tanısı AUS/FLUS olarak raporlanan malign olguların yarıdan fazlası cerrahi tedavi sonrasında FVPTK tanısı almaktadır.(18, 239) BRAF mutasyonu folliküler varyant PTK olgularında %11-30 oranında pozitif olarak saptanmaktadır.(241, 242) Bu nedenle bu grubun tanısında tek başına değeri sınırlıdır. Birçok çalışma göstermiştir ki FVPTK de RAS mutasyonlarının sıklığı %26-45 seviyesindedir (189, 241, 243) ve PTK deki çoğu RAS mutasyonları FVPTK ile ilişkilidir.(244-246) Hwang ve ark.(210) yaptıkları çalışmada sitoloji sonucu ‘’indeterminate’’ olarak bildirilen 187 FVPTK olgusunda BRAF V600E/K601E ve RAS mutasyonlarını incelemiş, toplam 132 olguda (%70,6) bu genlerde mutasyon pozitiflikleri olduğunu tespit etmişlerdir. (BRAF V600E (n=57), BRAF K601E (n=11), RAS (n=64) ) BRAF ve RAS mutasyonlarının FVPTK olgularının 2/3 ünde pozitif olduğunu ve indeterminate sitoloji saptanan 98 olgularda bu markerlerin incelenmesinin preoperatif tanıda yardımcı olacağını savunmuşlardır. Hemen daima papiller kanserin folliküler varyantında gözlenen RAS mutasyonları PTK olgularında daha az belirgin nükleer özellikler, sık enkapsülasyon ve düşük oranda lenf nodu metastazları ile korele bulunmuştur.(12, 243) Bazı çalışmalarda ise RAS mutasyonları ile papiller kanserde daha yüksek uzak metastaz sıklığı gibi çok agresif davranış arasında ilişki olduğu bildirilmiştir.(247) Hara ve ark.(247) 91 PTK olgusu ile yaptıkları çalışmada RAS mutasyonunu ve yaşı, nüks açısından iki bağımsız prognostik faktör olarak bildirmiştir. Çalışmamızda 5 olguda (%6) RAS mutasyon pozitifliği saptanmıştır. NRAS mutasyon pozitifliği saptanan 4 hastanın 3 tanesi folliküler varyant, 1 tanesi klasik varyant olup KRAS pozitifliği saptanan tek olgunun ise klasik varyant olduğu görülmüştür. Diğer bir bakış açısıyla çalışma grubunda bulunan folliküler varyant 9 hastadan, 3 tanesinde RAS mutasyonu saptanmıştır. RAS mutasyonu saptanan hasta grubunda yaş, cinsiyet, tümör büyüklüğü, histolojik varyant, multisentrisite, lenf nodu metastazı ve vasküler/kapsüler/lenfatik invazyon açısından yapılan değerlendirmelerde istatistiksel olarak anlamlı ilişkiler saptanmamıştır. Çalışma grubumuzda klasik varyantın hakim olması ve folliküler varyantın sadece 9 olgu ile temsil ediliyor olması nedeni ile az sayıda olguda RAS mutasyonu saptandığı değerlendirilmiştir. RAS mutasyonu saptanan olgu sayısındaki azlık nedeni ile literatürde prognozu etkilediği öne sürülen klinikopatolojik özelliklerin RAS mutasyonu ile ilişkisi sınırlı olarak değerlendirilebilmiştir. 99 5.3. TERT Telomeraz, kromozom uçlarında TTAGGG tekrarı olan telomer RNA komponenti ve reverse transkriptaz aktivitesine sahip bir protein komponentinden oluşan bir ribonükleoprotein plomerazıdır.(113) TERT geni hücre çoğalmasını sağlayan Telomerazın, reverse transkipriptaz bileşenlerini kodlar. Telomeraz aktivitesi hücrenin ölümsüzlüğü için gereklidir. TERT mutasyonlarında artan Telomeraz aktivitesi ile hücrenin sınırsız çoğalması gözlemlenmektedir.(114) TERT protein tümör dokularında normal dokuya göre daha fazla eksprese edilmektedir. Tümör ve lenf nodu metastazı dokularında TERT boyanması sitoplazmada nükleustan daha kuvvetlidir. Normal dokularda bu iki kompartman arasında boyanma farklılığı gözlenmemektedir. C228T ve C250T TERT mutasyonları farklı tiroid kanserleri tiplerinde değişen sıklıklarda bulunmaktadır.(248) TERT mutasyonlarının diferansiye tiroid kanserlerinde tanı anında ileri yaş, erkek cinsiyet ve tümör çapı ile ilişkili olduğu ve sağkalımın azalması ile korele olduğu bildirilmektedir. (16) Bu mutasyonlar papiller tiroid kanserlerinin %12 sinde ve foliküler tiroid kanserlerinin %14 ünde saptanmış olup tanı anında ileri yaşta olma ve kötü prognoz ile anlamlı derecede ilişkili bulunmuştur. Medüller tiroid kanserinde ve benign lezyonlarda TERT mutasyonlarına rastlanmamıştır. (249) Muzza ve ark.(249) yaptığı çalışmada PTK de %12, FTK de %14 oranında TERT mutasyonlarına rastlamışlardır. TERT C228T mutasyonu, her iki kanser çeşidinde de TERT C250T mutasyonundan çok daha sık olarak tespit edilmiştir. PTK olgularında TERT mutasyonları ile tanı anında hastanın ileri yaşta olması (p = 0,004) ile klasik varyant haricindeki PTK varyantlarında (p = 0,008) ve hastalığın nüksü (p=0,002) arasında ilişki bulunmuştur. 182 PTK olgusunun 64 ünde (%35) BRAF mutasyonu saptanmış ve bunların 10 tanesinde (10/64 %15.6) TERT ve BRAF mutasyonları eşzamanlı olarak pozitif bulunmuştur. BRAF mutasyonu negatif grupta ise 12 hastada (12/118 %10,1) TERT mutasyonları saptanmıştır.(p =0,34) Lenf nodu metastazı 100 açısından yapılan incelemede BRAF mutasyonu olan gruplarda daha fazla lenf nodu metastazı olgusunun bulunduğu gözlenmiştir. PTK olgularında TERT mutasyonlarının prognostik değeri BRAF mutasyonundan daha kuvvetli bulunmuş olup, BRAF mutasyonu PTK olguları ile sınırlı iken TERT mutasyonlarının FTK ve dediferansiye tümörlerde de prognostik bir belirteç olduğu sonucuna varılmıştır. Landa ve ark.(15) çalışmalarında sadece 80 PTK olgusunun bulunduğu alt grupta 18 hastada (18/80 - %22.5) TERT mutasyonunu pozitif bulmuştur. TERT mutasyonları anaplastik ve az diferansiye tiroid kanserleri gibi agresif tiroid kanserlerinde BRAF/RAS mutasyonlarına göre daha sık görülmekte olup, PTK de ise BRAF mutasyonuna göre daha az sıklıkta rastanmaktadır (15,244). Melo ve ark.(250) çalışmasında 469 tanesi folliküler kaynaklı diferansiye tiroid kanseri olan 647 tiroid nodülü incelenmiş ve papiller kanserlerin %7.5’inde, folliküler tiroid kanserlerinin %17.1’inde, az diferansiye kanserlerin %29’unda ve anaplastik tiroid kanserlerinin %33.3’ünde TERT mutasyonlarına rastlanmıştır. Yine bu çalışmada da normal tiroid dokusunda, tiroidin benign mutasyonlarına lezyonlarında ve rastlanmamıştır. medüller Ortalama tiroid 6 yıllık kanserinde takip TERT sunuçları incelendiğinde TERT mutasyonları ileri yaş, büyük tümör, ileri evre, hastalığın persistansı, uzak metastaz ve hastalığa bağlı mortalite ile ilişkili bulunmuştur. Çalışmamızda 84 PTK olgusunun 5’inde (%6), TERT mutasyonları saptanmış olup, bu oran literatürde bildirilen oranların altında kalmaktadır. TERT mutasyonu pozitif grubun yaş ortalaması 59.4 yıldır. Literatürle uyumlu şekilde yaşlı hastalarımızda TERT mutasyonu istatistiksel olarak anlamlı olup, aksine cinsiyet ve tümör büyüklüğü açısından anlamlı bir fark gözlenmemiştir. TERT mutasyonu ile kapsül invazyonu ve lenfatik invazyon arasında istatistiksel olarak anlamlı bulunan ilişkiler, papiller kanser nükslerinde bu genin etkisi olduğunu düşündürmektedir. 101 Nükleer atipi, vazküler invazyon ve nekroz parametrelerinin değerlendirilmesiyle yapılan tümör derecesi (Grade) ile TERT mutasyonu arasında saptanan ilişki de, bu mutasyonun histolojik olarak saldırgan tümör tipleriyle birlikteliğine işaret etmektedir. TERT mutasyonunun medüller tiroid kanserinde ve benign lezyonlarda gözlenmeyip anaplastik, papiller ve folliküler tiroid kanserlerinde bulunması tanısal açıdan kullanılabilecek bir özellik olmakla birlikte prevalansının düşük olması tanıda yaygın kullanımına sınırlama getirecektir. Çalışmamızda; PTK’de kötü prognostik faktörlerin başında gelen ileri yaş ile yakın ilişkisi gösterilen, hastalıksız sağkalım oranlarında belirgin şekilde azalmaya neden olan, MACIS prognostik skorlama sisteminde yüksek skor birlikteliği saptanan ve TNM Evreleme sisteminde ileri evre ile ilişkili bulunan TERT gen mutasyonu, PTK olgularında önemli bir prognostik belirteç olarak kabul edilmelidir. 5.4. c-Met Protoonkogen c-met, Hepatosit Growth Faktör/Scatter Faktör (HGF/SF) tirozin kinaz reseptörünü kodlar. HGF normal embriyonik süreçte epitel hücre farklılaşması, migrasyonu ve proliferasyonunda görev alır. (115, 251-253) c-met tarafından uygunsuz HGF aktivasyonu ile normal epitel hücreleri invaziv özellik kazanabilirler.(116,117) c-Met aşırı üretimi kolorektal, over, pankreas, küçük hücreli dışı akciğer, renal cell, ve tiroid karsinomları dahil olmak üzere çeşitli epitelyal tümörlerde gözlenmiştir.(118) Aşırı üretim reseptörde değişikliğe ve kontrolsüz sinyal iletimine yol açarak PTK de hücre motilitesi ve invazyon artışıyla sonuçlanır.(119-121) Bu nedenle c-Met in papiller kanserin invazyon ve metastazında önemli rol oynadığına inanılmaktadır.(40) Nardone ve ark.(254) 60 hastanın patoloji materyalinin c-Met ekspresyonunu immünohistokimyasal boyama yöntemiyle incelemiş ve saldırgan seyir gösterdiği bilinen Tall cell varyant PTK olgularında belirgin derecede daha fazla boyanma pozitifliği saptamışlardır. Ayrıca tüm PTK 102 varyantlarının incelenmesi sonucunda ekstrakapsüler yayılım, kas invazyonu ve lenfatik invazyon saptanan olguların patoloji materyallerinde c-Met ekspresyonu artmış olarak saptanmıştır. Bu bulguların papiller kanserde ender görülen saldırgan biyolojik davranış özellikleri sergileyen olguları izah edebileceğini ve Tall cell varyant papiller kanserlerin erken tiplendirmesinde c-Met’in rol alabileceğini savunmuşlardır. Chen ve ark.(255) çalışmalarında folliküler adenom olgularındaki boyanmanın, hücre kompartmanları arasında dağılımı ve yoğunluğunun PTK olgularından daha az olduğunu gözlemişlerdir. PTK olgularında c-Met ekspresyon artışının lenf nodu metastazı ve patolojik evre ile korelasyon gösterdiği gözlenmiştir. c-Met ekspresyonunun yaş, cinsiyet ve tümör büyüklüğü ile korelasyonu bulunmamıştır. c-Met aşırı üretimi durumunun erken lenf nodu metastazı ve patolojik evre değerlendirmesinde bir belirteç olarak olarak kullanılabileceği düşünülmüştür. Ruco ve ark.(256) PTK’de c-Met aşırı üretimi ile tümör hücre motilitesinin artacağını, tiroid içi multifokal yayılımın artacağını ve erken lenf nodu metatstazlarının oluşabileceğini savunmuşlardır. Papiller tiroid kanserde %70-80 oranında c-Met amplifikasyonu bildirilmesine karşın, çalışmamızda 5 olguda (%6) c-Met gen amplifikasyonu gözlenmiştir. Gruptaki dört hasta 44 yaş ve üzerinde iken, bir hastanın 26 yaşında olması nedeniyle yaş ortalaması 43,2 olarak hesaplanmıştır. Bu nedenle yapılan analizlerde yaş ile c-Met pozitifliği arasında istatistiksel açıdan anlamlı sonuçlara ulaşılamamıştır. Literatürde c-Met erken lenf nodu metastazını değerlendirmede önemli bir belirteç olarak gösterilmekte iken, çalışmamızda c-Met pozitif saptanan 5 olgunun hiç birisinde lenf nodu metastazı gözlenmemiştir. c-Met amplifikasyonu pozitif saptanan hasta grubunda yaş, cinsiyet, tümör büyüklüğü, histolojik varyant, multisentrisite, lenf nodu metastazı ve vasküler/kapsüler/lenfatik invazyon açısından yapılan değerlendirmelerde istatistiksel olarak anlamlı ilişkiler saptanmamıştır. 103 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 1. Çalışmamızda PTK’in görülme yaşı ortalama 45 olup, kadınlarda erkeklere göre 2 kat fazla rastlandığı ve en sık görülen histolojik tipin klasik varyant olduğu görülmüştür. 2. Çalışmamızda farklı ve yeni bir BRAF mutasyonu “BRAF 598-599 CTA insersiyon mutasyonu” saptanmıştır. Bu BRAF mutasyonu literatürde ilk defa tarafımızdan ortaya konulmuştur. 3. BRAF mutasyonu, çalışma grubumuzda bulunan 84 olgunun 54’ünde (% 64.2) pozitif saptanmıştır. 4. Klasik varyant alt grubunda BRAF mutasyonu %80,3 oranda pozitif bulunmuştur. 5. BRAF mutasyonu ile USG’de hipoekoik nodül yapısı (p=0,031) ve nodülün en boy farkı olmaması (p=0,044) parametreleri arasında anlamlı ilişkiler saptanmıştır. 6. BRAF mutasyonu açısından mikrokarsinomlar ile 1cm’den büyük PTK olguları arasında anlamlı fark saptanmıştır.(p=0,036) Ancak artan tümör çapı ile BRAF mutasyonu pozitifliği arasında korelasyon olmadığı görülmüştür. 7. BRAF mutasyonuna ait hastalıksız sağ kalım eğrisi incelendiğinde izlem süresi arttıkça mutasyon pozitif ve negatif grupların sağkalım eğrileri arasındaki makasın giderek açıldığı dikkati çekmektedir. 8. Sadece PTK olgularıyla çalışma planlandığından RAS mutasyonu ve c-Met amplifikasyonu pozitif saptanan olgu sayıları kısıtlı bulunmuştur., Bu nedenle RAS mutasyonu ve c-Met amplifikasyonunun prognostik önemi hakkında sonuca varılamayacağı değerlendirilmiştir. 9. TERT gen mutasyonunun ileri yaş, artmış kapsül invazyonu ve lenfatik invazyon oranları, daha yüksek tümör derecesi (grade), ileri hastalık evresi (stage), artmış MACIS skoru ve artmış nüks oranları ile ilişkisi olduğu sonucuna ulaşılmıştır. 104 10. Coğrafi bölgelere ve ırklara göre değişim gösterdiği ifade edilen BRAF mutasyonunun Türkiye’deki gerçek prevalansını belirlemek için geniş hasta serileriyle yapılacak yeni çalışmalara ihtiyaç vardır. 11. USG’de saptanan malignite şüpheli nodüllerden yapılan İİAB sitolojisi ile tanıda zorluk yaşanması halinde, İİAB materyalinde başta BRAF mutasyonu olmak üzere bazı genetik belirteçlerin araştırılması tanısal açısından yardımcı olabilir. 12. konması Genetik belirteçlerin tanısal ve prognostik öneminin ortaya için tüm tiroid kanseri çeşitlerini içeren çalışmalarla değerlendirilmesi uygun olacaktır. 105 7. KAYNAKLAR 1. Davies L, Welch HG. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Jama. 2006;295(18):2164-7. 2. Leenhardt L, Grosclaude P, Cherie-Challine L. Increased incidence of thyroid carcinoma in france: a true epidemic or thyroid nodule management effects? Report from the French Thyroid Cancer Committee. Thyroid. 2004;14(12):1056-60. 3. Nikiforova MN, Nikiforov YE. Molecular genetics of thyroid cancer: implications for diagnosis, treatment and prognosis. Expert Review of Molecular Diagnostics. 2008;8(1):83-95. 4. Zimmerman D. Thyroid carcinoma in children and adolescents: diagnostic implications of analysis of the tumor genome. Current Opinion in Pediatrics. 2013;25(4):528-31. 5. Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, Kloos RT, Lee SL, Mandel SJ, ve diğ. Management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid. 2006;16(2):109-42. 6. DeGroot L, Paloyan E. Thyroid carcinoma and radiation. A Chicago endemic. Jama. 1973;225(5):487-91. 7. Fay DS. Cancer metabolism: feeding a worm to starve a tumor. Current Biology : CB. 2013;23(13):R557-9. 8. Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforov YE, Fagin JA. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer: genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Research. 2003;63(7):1454-7. 9. Soares P, Trovisco V, Rocha AS, Lima J, Castro P, Preto A, ve diğ. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene. 2003;22(29):4578-80. 10. Frattini M, Ferrario C, Bressan P, Balestra D, De Cecco L, Mondellini P, ve diğ. Alternative mutations of BRAF, RET and NTRK1 are associated with similar but distinct gene expression patterns in papillary thyroid cancer. Oncogene. 2004;23(44):7436-40. 11. Giordano TJ, Kuick R, Thomas DG, Misek DE, Vinco M, Sanders D, ve diğ. Molecular classification of papillary thyroid carcinoma: distinct BRAF, RAS, and RET/PTC mutation-specific gene expression profiles discovered by DNA microarray analysis. Oncogene. 2005;24(44):664656. 12. Adeniran AJ, Zhu Z, Gandhi M, Steward DL, Fidler JP, Giordano TJ, ve diğ. Correlation between genetic alterations and microscopic features, clinical manifestations, and prognostic characteristics of thyroid papillary carcinomas. The American Journal of Surgical Pathology. 2006;30(2):216-22. 106 13. Park SJ, Sun JY, Hong K, Kwak JY, Kim EK, Chung WY, ve diğ. Application of BRAF, NRAS, KRAS mutations as markers for the detection of papillary thyroid cancer from FNAB specimens by pyrosequencing analysis. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine : CCLM / FESCC. 2013;51(8):1673-80. 14. Bu R, Uddin S, Ahmed M, Hussain AR, Alsobhi S, Amin T, ve diğ. c-Met inhibitor synergizes with tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand to induce papillary thyroid carcinoma cell death. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 2012;18:167-77. 15. Landa I, Ganly I, Chan TA, Mitsutake N, Matsuse M, Ibrahimpasic T, ve diğ. Frequent somatic TERT promoter mutations in thyroid cancer: higher prevalence in advanced forms of the disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2013;98(9):E1562-6. 16. Liu X, Qu S, Liu R, Sheng C, Shi X, Zhu G, ve diğ. TERT promoter mutations and their association with BRAF V600E mutation and aggressive clinicopathological characteristics of thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2014;99(6):E1130-6. 17. Xing M, Liu R, Liu X, Murugan AK, Zhu G, Zeiger MA, ve diğ. BRAF V600E and TERT promoter mutations cooperatively identify the most aggressive papillary thyroid cancer with highest recurrence. Journal of Clinical Oncology : Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 2014;32(25):2718-26. 18. Nagarkatti SS, Faquin WC, Lubitz CC, Garcia DM, Barbesino G, Ross DS, ve diğ. Management of thyroid nodules with atypical cytology on fine-needle aspiration biopsy. Ann Surg Oncol. 2013;20(1):60-5. 19. Özdemir S, Özdemir Ö. Tiroid kanserinde moleküler etyolojik faktörler. Cumhuriyet Tıp Dergisi. 2014;36(1):128-46. 20. Sadler GP, Clark O, van Heerden JA, Farley DR. Thyroid and parathyroid. Schwartz SI Principles of Surgery 7th ed New York: McGraw-Hill. 1999:1674-6. 21. Rojeski MT, Gharib H. Nodular thyroid disease evaluation and management. The New England Journal of Medicine. 1985;313(7):42836. 22. Brunicardi FC. Schwartz's Principles of Surgery: McGraw-Hill, Health Pub. Division; 2005. 23. Kumar V. AAK, Fausto N. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 7th ed. Philadelphia, Pennsylvania: Elsevier Saunders; 2009. p. 1178-80. 24. Sternberg S.S.(Ed) Histology for Pathologist. . New York: Raven Press; 1992. p. 301-10. 107 25. Skandalakis JE SP, Skandalakis LJ. . Anatomy of the thyroid gland. . In: Skandalakis JE SP, Skandalakis LJ. , editor. Surgical Anatomy and Technique. New York. : Springer-Verlag. ; 1995. p. 31-44. 26. Garcia M, Jemal A, Ward E, Center M, Hao Y, Siegel R, ve diğ. Global cancer facts & figures 2007. Atlanta, GA: American cancer society. 2007;1(3):52.. 27. Rosenberg SA. Cancer of the Endocrine System. In: Devita VT Hellman S, Rosenberg SA,Cancer: Principles and Practice of Oncology. editor Govindan R. 8th Ed. Philadelphia Lippincott Williams&Wilkins; 2008. p. 1655-82. 28. Ries L, Eisner M, Kosary C, Hankey B, Miller B, Clegg L. Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program SEER* Stat Database: Incidence—SEER 9 Regs Public-Use, Nov 2004 Sub (1973–2002). National Cancer Institute, Division of Cancer Control and Population Sciences, Surveillance Research Program, Cancer Statistics Branch. Released April 2005, based on the November 2004 submission. 2008. 29. Mazzaferri EL, Kloos RT. Clinical review 128: Current approaches to primary therapy for papillary and follicular thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2001;86(4):1447-63. 30. İzmirli M, Altın S, Dernek BO, Ünsal M. SSK Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Onkoloji Merkezi’nin 1999-2004 yılları kanser istatistikleri. Türk Onkoloji Dergisi. 2007;22(4):172-82. 31. Eser S, Yakut C, Ozdemir R, Karakilinc H, Ozalan S, Marshall SF, ve diğ. Cancer incidence rates in Turkey in 2006: a detailed registry based estimation. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention : APJCP. 2010;11(6):1731-9. 32. Carling T UR. Thyroid tumors. In: DeVita VT HS, Rosenberg SA, editor. Cancer: Principles and Practice of Oncology. 7th Edition Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins,; 2005. p. 502- 9. 33. Goodman MT, Yoshizawa CN, Kolonel LN. Descriptive epidemiology of thyroid cancer in Hawaii. Cancer. 1988;61(6):1272-81. 34. Weier HU, Ito Y, Kwan J, Smida J, Weier JF, Hieber L, ve diğ. Delineating chromosomal breakpoints in radiation-induced papillary thyroid cancer. Genes. 2011;2(3):397-419. 35. Gimm O. Thyroid cancer. Cancer Letters. 2001;163(2):143-56. 36. Jameson J.L WAP. Thyroid Cancer. In: E.Braunwald ASFDLK, S.L.Hauser, D.L.Longo, J.L.Jameson, editor. Harrison’s Principles of İnternal Medicine. 15 th ed. 2001. p. 2079-83. 37. Fierro-Renoy JF, De Grott, L.J. Radiation Associated Carcinoma. In: Wheeler MH, Lazarus, C.H., editor. Disease of Thyroid. London: Chapmann and Hall 1994. p. 323-40. 108 38. Sherman SI. Thyroid 2003;361(9356):501-11. carcinoma. Lancet (London, England). 39. Reiners C, Demidchik YE, Drozd VM, Biko J. Thyroid cancer in infants and adolescents after Chernobyl. Minerva Endocrinologica. 2008;33(4):381-95. 40. Schlumberger MJ. Papillary and follicular thyroid carcinoma. The New England Journal of Medicine. 1998;338(5):297-306. 41. Collins SL. Controversies and Ethiopathogenesis in Thyroid Diseases In: Falk SE, editor. Thyroid Cancer. Second ed. Philedelphia: Lippincot Raven. ; 1997. p. 495-564. 42. Schneider A.B RE. Carcinoma of Follicular epithelium. In: L.E.Braverman RDU, editor. Werner and Ingbar’s the Thyroid 8th ed 2000. p. 878-86. 43. Di Pasquale M, Rothstein JL, Palazzo JP. Pathologic features of Hashimoto's-associated papillary thyroid carcinomas. Human Pathology. 2001;32(1):24-30. 44. Boyle P, Levin B. World cancer report 2008: IARC Press, International Agency for Research on Cancer; 2008. 45. Ozturk M. Tiroid Kanseri Ve Onkogenleri. . In: Ozturk M., editor. Tiroid Fizyolojisi. 1 ed. İstanbul İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fak. Yayınları; 2000. p. 325-34. 46. Hurng-Seng Wu J, Young M. Clark OH Tiroid Kanserlerine Genel Bakış. Tiroid hastalıkları ve Cerrahisi Avrupa Tıp Kitapçılık İstanbul. 2000:36772. 47. Gilliland FD, Hunt WC, Morris DM, Key CR. Prognostic factors for thyroid carcinoma. A population-based study of 15,698 cases from the Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) program 19731991. Cancer. 1997;79(3):564-73. 48. Pawson T. Regulation and targets of receptor tyrosine kinases. European journal of cancer (Oxford, England : 1990). 2002;38 Suppl 5:S3-10. 49. Doğan AL. Sinyal iletimi mekanizmaları ve kanser. Hacettepe Tıp Dergisi. 2004;35:34-42. 50. Xing M. Genetic alterations in the phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway in thyroid cancer. Thyroid. 2010;20(7):697-706. 51. Mian C, Barollo S, Pennelli G, Pavan N, Rugge M, Pelizzo MR, ve diğ. Molecular characteristics in papillary thyroid cancers (PTCs) with no 131I uptake. Clinical Endocrinology. 2008;68(1):108-16. 52. Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nature Reviews Cancer. 2002;2(7):489-501. 109 53. Nikiforov YE. Genetic alterations involved in the transition from welldifferentiated to poorly differentiated and anaplastic thyroid carcinomas. Endocrine Pathology. 2004;15(4):319-27. 54. Taccaliti A, Boscaro M. Genetic mutations in thyroid carcinoma. Minerva Endocrinologica. 2009;34(1):11-28. 55. Fusco A, Grieco M, Santoro M, Berlingieri MT, Pilotti S, Pierotti MA, ve diğ. A new oncogene in human thyroid papillary carcinomas and their lymph-nodal metastases. Nature. 1987;328(6126):170-2. 56. Vander Poorten V, Hens G, Delaere P. Thyroid cancer in children and adolescents. Current opinion in otolaryngology & head and neck surgery. 2013;21(2):135-42. 57. Routhier CA, Mochel MC, Lynch K, Dias-Santagata D, Louis DN, Hoang MP. Comparison of 2 monoclonal antibodies for immunohistochemical detection of BRAF V600E mutation in malignant melanoma, pulmonary carcinoma, gastrointestinal carcinoma, thyroid carcinoma, and gliomas. Human Pathology. 2013;44(11):2563-70. 58. Marchetti A, Felicioni L, Malatesta S, Grazia Sciarrotta M, Guetti L, Chella A, ve diğ. Clinical features and outcome of patients with nonsmall-cell lung cancer harboring BRAF mutations. Journal of Clinical Oncology : Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 2011;29(26):3574-9. 59. Li C, Lee KC, Schneider EB, Zeiger MA. BRAF V600E mutation and its association with clinicopathological features of papillary thyroid cancer: a meta-analysis. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2012;97(12):4559-70. 60. Fernandez IJ, Piccin O, Sciascia S, Cavicchi O, Repaci A, Vicennati V, ve diğ. Clinical significance of BRAF mutation in thyroid papillary cancer. Otolaryngology--head and neck surgery : Official Journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 2013;148(6):91925. 61. Cappola AR, Mandel SJ. Molecular testing in thyroid cancer: BRAF mutation status and mortality. Jama. 2013;309(14):1529-30. 62. Yip L, Nikiforova MN, Carty SE, Yim JH, Stang MT, Tublin MJ, ve diğ. Optimizing surgical treatment of papillary thyroid carcinoma associated with BRAF mutation. Surgery. 2009;146(6):1215-23. 63. Nikiforova MN, Kimura ET, Gandhi M, Biddinger PW, Knauf JA, Basolo F, ve diğ. BRAF mutations in thyroid tumors are restricted to papillary carcinomas and anaplastic or poorly differentiated carcinomas arising from papillary carcinomas. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2003;88(11):5399-404. 64. Namba H, Nakashima M, Hayashi T, Hayashida N, Maeda S, Rogounovitch TI, ve diğ. Clinical implication of hot spot BRAF mutation, 110 V599E, in papillary thyroid cancers. The Journal Endocrinology and Metabolism. 2003;88(9):4393-7. of Clinical 65. Xing M, Westra WH, Tufano RP, Cohen Y, Rosenbaum E, Rhoden KJ, ve diğ. BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2005;90(12):6373-9. 66. Basolo F, Torregrossa L, Giannini R, Miccoli M, Lupi C, Sensi E, ve diğ. Correlation between the BRAF V600E mutation and tumor invasiveness in papillary thyroid carcinomas smaller than 20 millimeters: analysis of 1060 cases. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2010;95(9):4197-205. 67. Cohen Y, Xing M, Mambo E, Guo Z, Wu G, Trink B, ve diğ. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of the National Cancer Institute. 2003;95(8):625-7. 68. Kurtulmus N, Duren M, Ince U, Cengiz Yakicier M, Peker O, Aydin O, ve diğ. BRAF(V600E) mutation in Turkish patients with papillary thyroid cancer: strong correlation with indicators of tumor aggressiveness. Endocrine. 2012;42(2):404-10. 69. Park AY, Son EJ, Kim JA, Youk JH, Park YJ, Park CS, ve diğ. Associations of the BRAF(V600E) mutation with sonographic features and clinicopathologic characteristics in a large population with conventional papillary thyroid carcinoma. PLoS One. 2014;9(10):e110868. 70. Tufano RP, Teixeira GV, Bishop J, Carson KA, Xing M. BRAF mutation in papillary thyroid cancer and its value in tailoring initial treatment: a systematic review and meta-analysis. Medicine. 2012;91(5):274-86. 71. Fugazzola L, Puxeddu E, Avenia N, Romei C, Cirello V, Cavaliere A, ve diğ. Correlation between B-RAFV600E mutation and clinico-pathologic parameters in papillary thyroid carcinoma: data from a multicentric Italian study and review of the literature. Endocrine-Related Cancer. 2006;13(2):455-64. 72. Lee JH, Lee ES, Kim YS. Clinicopathologic significance of BRAF V600E mutation in papillary carcinomas of the thyroid: a meta-analysis. Cancer. 2007;110(1):38-46. 73. Lassalle S, Hofman V, Ilie M, Butori C, Bozec A, Santini J, ve diğ. Clinical impact of the detection of BRAF mutations in thyroid pathology: potential usefulness as diagnostic, prognostic and theragnostic applications. Current Medicinal Chemistry. 2010;17(17):1839-50. 74. Handkiewicz-Junak D, Czarniecka A, Jarzab B. Molecular prognostic markers in papillary and follicular thyroid cancer: Current status and future directions. Molecular and Cellular Endocrinology. 2010;322(1-2):828. 111 75. Lupi C, Giannini R, Ugolini C, Proietti A, Berti P, Minuto M, ve diğ. Association of BRAF V600E mutation with poor clinicopathological outcomes in 500 consecutive cases of papillary thyroid carcinoma. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2007;92(11):4085-90. 76. Bos JL. RAS oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 1989;49(17):4682-9. 77. Coyne C, Nikiforov YE. RAS mutation-positive follicular variant of papillary thyroid carcinoma arising in a struma ovarii. Endocrine pathology. 2010;21(2):144-7. 78. Bhaijee F, Nikiforov YE. Molecular analysis of thyroid tumors. Endocrine Pathology. 2011;22(3):126-33. 79. Grande E, Diez JJ, Zafon C, Capdevila J. Thyroid cancer: molecular aspects and new therapeutic strategies. Journal of Thyroid Research. 2012;2012:847108. 80. Ferreira CV, Siqueira DR, Ceolin L, Maia AL. Advanced medullary thyroid cancer: pathophysiology and management. Cancer Management and Research. 2013;5:57-66. 81. Wagner SM, Zhu S, Nicolescu AC, Mulligan LM. Molecular mechanisms of RET receptor-mediated oncogenesis in Multiple Endocrine Neoplasia 2. Clinics, 2012;67,77-84. 82. Hamatani K, Eguchi H, Ito R, Mukai M, Takahashi K, Taga M, ve diğ. RET/PTC rearrangements preferentially occurred in papillary thyroid cancer among atomic bomb survivors exposed to high radiation dose. Cancer Research. 2008;68(17):7176-82. 83. de Vries MM, Celestino R, Castro P, Eloy C, Maximo V, van der Wal JE, ve diğ. RET/PTC rearrangement is prevalent in follicular Hurthle cell carcinomas. Histopathology. 2012;61(5):833-43. 84. Mathur A, Weng J, Moses W, Steinberg SM, Rahbari R, Kitano M, ve diğ. A prospective study evaluating the accuracy of using combined clinical factors and candidate diagnostic markers to refine the accuracy of thyroid fine needle aspiration biopsy. Surgery. 2010;148(6):1170-6; discussion 6-7. 85. Soares P, Lima J, Preto A, Castro P, Vinagre J, Celestino R, ve diğ. Genetic alterations in poorly differentiated and undifferentiated thyroid carcinomas. Current Genomics. 2011;12(8):609-17. 86. Rossi ED, Straccia P, Palumbo M, Stigliano E, Revelli L, Lombardi CP, ve diğ. Diagnostic and prognostic role of HBME-1, galectin-3, and betacatenin in poorly differentiated and anaplastic thyroid carcinomas. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 2013;21(3):237-41. 112 87. Park M, Dean M, Kaul K, Braun MJ, Gonda MA, Vande Woude G. Sequence of MET protooncogene cDNA has features characteristic of the tyrosine kinase family of growth-factor receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1987;84(18):6379-83. 88. Birchmeier W, Brinkmann V, Niemann C, Meiners S, DiCesare S, Naundorf H, ve diğ. Role of HGF/SF and c-Met in morphogenesis and metastasis of epithelial cells. Ciba Foundation Symposium. 1997;212:230-40; discussion 40-6. 89. Sadiq AA, Salgia R. MET as a possible target for non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology : Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 2013;31(8):1089-96. 90. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003;4(12):915-25. 91. Makki FM, Taylor SM, Shahnavaz A, Leslie A, Gallant J, Douglas S, ve diğ. Serum biomarkers of papillary thyroid cancer. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 2013;42:16. 92. Miyake Y, Aratake Y, Sakaguchi T, Kiyoya K, Kuribayashi T, Marutsuka K, ve diğ. Examination of CD26/DPPIV, p53, and PTEN expression in thyroid follicular adenoma. Diagnostic Cytopathology. 2012;40(12):104753. 93. Santoro A, Pannone G, Carosi MA, Francesconi A, Pescarmona E, Russo GM, ve diğ. BRAF mutation and RASSF1A expression in thyroid carcinoma of southern Italy. Journal of Cellular Biochemistry. 2013;114(5):1174-82. 94. Kajabova V, Smolkova B, Zmetakova I, Sebova K, Krivulcik T, Bella V, ve diğ. RASSF1A Promoter Methylation Levels Positively Correlate with Estrogen Receptor Expression in Breast Cancer Patients. Translational Oncology. 2013;6(3):297-304. 95. Brait M, Loyo M, Rosenbaum E, Ostrow KL, Markova A, Papagerakis S, ve diğ. Correlation between BRAF mutation and promoter methylation of TIMP3, RARbeta2 and RASSF1A in thyroid cancer. Epigenetics. 2012;7(7):710-9. 96. Patel KN, Singh B. Genetic considerations in thyroid cancer. Cancer control : Journal of the Moffitt Cancer Center. 2006;13(2):111-8. 97. Koenig RJ. Detection of the PAX8-PPARgamma fusion protein in thyroid tumors. Clinical Chemistry. 2010;56(3):331-3. 98. Fagin JA, Mitsiades N. Molecular pathology of thyroid cancer: diagnostic and clinical implications. Best practice & research Clinical Endocrinology & Metabolism. 2008;22(6):955-69. 113 99. Eberhardt NL, Grebe SK, McIver B, Reddi HV. The role of the PAX8/PPARgamma fusion oncogene in the pathogenesis of follicular thyroid cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 2010;321(1):50-6. 100. Lee YM, Lee JB. Prognostic value of epidermal growth factor receptor, p53 and galectin-3 expression in papillary thyroid carcinoma. The Journal of İnternational Medical Research. 2013;41(3):825-34. 101. Yilike X, Kuerban G, Yang X, Wu S, Abudula A. Expression of MGMT and its clinopathological significance in thyroid carcinoma. Journal of Central South University Medical Sciences. 2010;35(12):1219-24. 102. De la Chapelle A, Jazdzewski K. MicroRNAs in thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2011;96(11):3326-36. 103. Sun Y, Yu S, Liu Y, Wang F, Liu Y, Xiao H. Expression of miRNAs in Papillary Thyroid Carcinomas Is Associated with BRAF Mutation and Clinicopathological Features in Chinese Patients. International Journal of Endocrinology. 2013;2013:128735. 104. Zhang X, Li M, Zuo K, Li D, Ye M, Ding L, ve diğ. Upregulated miR-155 in papillary thyroid carcinoma promotes tumor growth by targeting APC and activating Wnt/beta-catenin signaling. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2013;98(8):E1305-13. 105. Zhang J, Liu Y, Liu Z, Wang XM, Yin DT, Zheng LL, ve diğ. Differential expression profiling and functional analysis of microRNAs through stage I-III papillary thyroid carcinoma. International Journal of Medical Sciences. 2013;10(5):585-92. 106. Rabes HM, Demidchik EP, Sidorow JD, Lengfelder E, Beimfohr C, Hoelzel D, ve diğ. Pattern of radiation-induced RET and NTRK1 rearrangements in 191 post-chernobyl papillary thyroid carcinomas: biological, phenotypic, and clinical implications. Clinical Cancer Research : An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 2000;6(3):1093-103. 107. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, ve diğ. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002;417(6892):949-54. 108. Dhillon AS, Kolch W. Oncogenic B-Raf mutations: crystal clear at last. Cancer Cell. 2004;5(4):303-4. 109. Oler G, Ebina KN, Michaluart P, Jr., Kimura ET, Cerutti J. Investigation of BRAF mutation in a series of papillary thyroid carcinoma and matched-lymph node metastasis reveals a new mutation in metastasis. Clinical Endocrinology. 2005;62(4):509-11. 114 110. Riesco-Eizaguirre G, Gutierrez-Martinez P, Garcia-Cabezas MA, Nistal M, Santisteban P. The oncogene BRAF V600E is associated with a high risk of recurrence and less differentiated papillary thyroid carcinoma due to the impairment of Na+/I- targeting to the membrane. EndocrineRelated Cancer. 2006;13(1):257-69. 111. Ball DW. Selectively targeting mutant BRAF in thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2010;95(1):60-1. 112. Nikiforova MN, Lynch RA, Biddinger PW, Alexander EK, Dorn GW, 2nd, Tallini G, ve diğ. RAS point mutations and PAX8-PPAR gamma rearrangement in thyroid tumors: evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2003;88(5):2318-26. 113. Harrington L, McPhail T, Mar V, Zhou W, Oulton R, Bass MB, ve diğ. A mammalian telomerase-associated protein. Science (New York, NY). 1997;275(5302):973-7. 114. Skvortzov DA, Rubzova MP, Zvereva ME, Kiselev FL, Donzova OA. The regulation of telomerase in oncogenesis. Acta Naturae. 2009;1(1):51-67. 115. Di Renzo MF, Narsimhan RP, Olivero M, Bretti S, Giordano S, Medico E, ve diğ. Expression of the Met/HGF receptor in normal and neoplastic human tissues. Oncogene. 1991;6(11):1997-2003. 116. Scarpino S, Stoppacciaro A, Colarossi C, Cancellario F, Marzullo A, Marchesi M, ve diğ. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates tumour invasiveness in papillary carcinoma of the thyroid. The Journal of Pathology. 1999;189(4):570-5. 117. Weidner KM, Behrens J, Vandekerckhove J, Birchmeier W. Scatter factor: molecular characteristics and effect on the invasiveness of epithelial cells. The Journal of Cell Biology. 1990;111(5 Pt 1):2097-108. 118. Di Renzo MF, Olivero M, Ferro S, Prat M, Bongarzone I, Pilotti S, ve diğ. Overexpression of the c-Met/HGF receptor gene in human thyroid carcinomas. Oncogene. 1992;7(12):2549-53. 119. Ponzetto C, Bardelli A, Zhen Z, Maina F, dalla Zonca P, Giordano S, ve diğ. A multifunctional docking site mediates signaling and transformation by the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor family. Cell. 1994;77(2):261-71. 120. De Luca A, Arena N, Sena LM, Medico E. Met overexpression confers HGF-dependent invasive phenotype to human thyroid carcinoma cells in vitro. Journal of Cellular Physiology. 1999;180(3):365-71. 121. Giordano S, Di Renzo MF, Narsimhan RP, Cooper CS, Rosa C, Comoglio PM. Biosynthesis of the protein encoded by the c-met protooncogene. Oncogene. 1989;4(11):1383-8. 122. Mackenzie EJ, Mortimer RH. 6: Thyroid nodules and thyroid cancer. The Medical Journal of Australia. 2004;180(5):242-7. 115 123. Silverberg SG DR, Frable WJ, LiVolsi VA, Wick MR. Silverberg’s Principles and Practice of Surgical Pathology and Cytopathology 2006. p.2119-45. 124. Wenig BM HC. Atlas of Head and Neck Pathology. Second Ed. 2008. p.321-25. 125. Delellis RA WE. Tumours of the thyroid and parathyroid. In: DeLellis RA LR, Heitz PU, Eng C., editor. Pathology and Genetics of Tumours of Endokrine Organs. Lyon: IARC Press; 2004. p. 49-133. 126. Stacey E.M. Stenberg’s Diagnostic Surgical Pathology. 5th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Health, Lipincott Williams & Wilkins; 2010. 127. Gharib H, Goellner JR. Fine-needle aspiration biopsy of the thyroid: an appraisal. Annals of İnternal Medicine. 1993;118(4):282-9. 128. Wartofsky L.. Thyroid Cancer. In: Kenneth L. Becker, editor. Principles and Practice of Endocrinology and Metabolism 3th ed: Lippincott Williams & Wilkins; 2001. p. 382-402. 129. Russell WO, Ibanez ML, Clark RL, White EC. Thyroid Carcinoma. Classification, Intraglandular Dissemination, And Clinicopathological Study Based Upon Whole Organ Sections Of 80 Glands. Cancer. 1963;16:1425-60. 130. Jameson JL WA. Disorders of the thyroid gland. In: Kasper DL FA, Longo DL, Braunwald E, Hauser SL, Jameson JL, editor. Harrison’s Principles of Internal Medicine 16th ed. New York: The McGraw Hill 2005. p. 2014-126. 131. Pacini F DL. Thyroid Neoplasia. In: DeGroot LJ JJ, editor. Endocrinology. 5th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2006.p:374-78 132. Noguchi M, Yamada H, Ohta N, Ishida T, Tajiri K, Fujii H, ve diğ. Regional lymph node metastases in well-differentiated thyroid carcinoma. International Surgery. 1987;72(2):100-3. 133. Wartofsky L. Radioiodine and other treatment and outcomes. In: Braverman LE UR, editor. Werner and Ingbar’s the Thyroid 8th ed: Lippincott Williams & Wilkins; 2000. p. 904-29. 134. Rosai J. Thyroid gland. Ackerman`s Surgical Pathology (Rosai J. Ed.) Ninth Edition 2004.p:529-68 135. Hay ID. Papillary thyroid carcinoma. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 1990;19(3):545-76. 136. Matsubayashi S, Kawai K, Matsumoto Y, Mukuta T, Morita T, Hirai K, ve diğ. The correlation between papillary thyroid carcinoma and lymphocytic infiltration in the thyroid gland. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1995;80(12):3421-4. 116 137. Thoresen S, Akslen LA, Glattre E, Haldorsen T. Thyroid cancer in children in Norway 1953-1987. European Journal of Cancer (Oxford, England : 1990). 1993;29a(3):365-6. 138. Mizukami Y, Noguchi M, Michigishi T, Nonomura A, Hashimoto T, Otakes S, ve diğ. Papillary thyroid carcinoma in Kanazawa, Japan: prognostic significance of histological subtypes. Histopathology. 1992;20(3):243-50. 139. Akslen LA, Myking AO, Salvesen H, Varhaug JE. Prognostic importance of various clinicopathological features in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 1992;29a(1):44-51. 140. Katoh R, Sasaki J, Kurihara H, Suzuki K, Iida Y, Kawaoi A. Multiple thyroid involvement (intraglandular metastasis) in papillary thyroid carcinoma. A clinicopathologic study of 105 consecutive patients. Cancer. 1992;70(6):1585-90. 141. Tscholl-Ducommun J, Hedinger CE. Papillary thyroid carcinomas. Morphology and prognosis. Virchows Archiv A, Pathological Anatomy and Histology. 1982;396(1):19-39. 142. Mazzaferri EL, Jhiang SM. Long-term impact of initial surgical and medical therapy on papillary and follicular thyroid cancer. The American Journal of Medicine. 1994;97(5):418-28. 143. Johnson TL, Lloyd RV, Thompson NW, Beierwaltes WH, Sisson JC. Prognostic implications of the tall cell variant of papillary thyroid carcinoma. The American Journal of Surgical Pathology. 1988;12(1):227. 144. Herrera MF, Hay ID, Wu PS, Goellner JR, Ryan JJ, Ebersold JR, ve diğ. Hurthle cell (oxyphilic) papillary thyroid carcinoma: a variant with more aggressive biologic behavior. World Journal of Surgery. 1992;16(4):66974; discussion 774-5. 145. Akslen LA, LiVolsi VA. Prognostic significance of histologic grading compared with subclassification of papillary thyroid carcinoma. Cancer. 2000;88(8):1902-8. 146. Sobrinho-Simoes MA, Nesland JM, Holm R, Sambade MC, Johannessen JV. Hurthle cell and mitochondrion-rich papillary carcinomas of the thyroid gland: an ultrastructural and immunocytochemical study. Ultrastructural Pathology. 1985;8(2-3):13142. 147. Schlumberger M, Challeton C, De Vathaire F, Travagli JP, Gardet P, Lumbroso JD, ve diğ. Radioactive iodine treatment and external radiotherapy for lung and bone metastases from thyroid carcinoma. Journal of Nuclear Medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 1996;37(4):598-605. 117 148. Hoie J, Stenwig AE, Kullmann G, Lindegaard M. Distant metastases in papillary thyroid cancer. A review of 91 patients. Cancer. 1988;61(1):1-6. 149. McConahey WM, Hay ID, Woolner LB, van Heerden JA, Taylor WF. Papillary thyroid cancer treated at the Mayo Clinic, 1946 through 1970: initial manifestations, pathologic findings, therapy, and outcome. Mayo Clinic Proceedings. 1986;61(12):978-96. 150. Lloyd RV. Endocrine Pathology:: Differential Diagnosis and Molecular Advances: Springer Science & Business Media; 2010. 151. Coburn M, Teates D, Wanebo HJ. Recurrent thyroid cancer. Role of surgery versus radioactive iodine (I131). Annals of Surgery. 1994;219(6):587-93; discussion 93-5. 152. Casara D, Rubello D, Saladini G, Gallo V, Masarotto G, Busnardo B. Distant metastases in differentiated thyroid cancer: long-term results of radioiodine treatment and statistical analysis of prognostic factors in 214 patients. Tumori. 1991;77(5):432-6. 153. Casara D, Rubello D, Saladini G, Masarotto G, Favero A, Girelli ME, ve diğ. Different features of pulmonary metastases in differentiated thyroid cancer: natural history and multivariate statistical analysis of prognostic variables. Journal of Nuclear Medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 1993;34(10):1626-31. 154. Soh EY, Park CS. Diagnostic approach to thyroid carcinoma in Graves' disease. Yonsei Medical Journal. 1993;34(2):191-4. 155. Schroder S, Dralle H, Rehpenning W, Bocker W. [Prognostic criteria of papillary thyroid cancer. Morphologic clinical analysis of 202 cases of tumor]. Langenbecks Archiv fur Chirurgie. 1987;371(4):263-80. 156. Rosai J, Zampi G, Carcangiu ML. Papillary carcinoma of the thyroid. A discussion of its several morphologic expressions, with particular emphasis on the follicular variant. The American Journal of Surgical Pathology. 1983;7(8):809-17. 157. Akslen LA. Prognostic importance of histologic grading in papillary thyroid carcinoma. Cancer. 1993;72(9):2680-5. 158. Basolo F, Molinaro E, Agate L, Pinchera A, Pollina L, Chiappetta G, ve diğ. RET protein expression has no prognostic impact on the long-term outcome of papillary thyroid carcinoma. European Journal of Endocrinology / European Federation of Endocrine Societies. 2001;145(5):599-604. 159. Schlumberger M, De Vathaire F, Travagli JP, Vassal G, Lemerle J, Parmentier C, ve diğ. Differentiated thyroid carcinoma in childhood: long term follow-up of 72 patients. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1987;65(6):1088-94. 160. Mazzaferri EL. Papillary thyroid carcinoma: factors influencing prognosis and current therapy. Seminars in Oncology. 1987;14(3):315-32. 118 161. Schlumberger M.; Parmentier C.; De Vathaire F.; Tubiana M. Iodine 131 and external radiation in the treatment of local and metastatic thyroid cancer. In: Falk SA, editor. Thyroid Disease: Endocrinology, Surgery, Nuclear Medicine, And Radiotherapy. New York, Usa.: Raven Press; 1990. p. 537-52. 162. Tennvall J, Biorklund A, Moller T, Ranstam J, Akerman M. Is the EORTC prognostic index of thyroid cancer valid in differentiated thyroid carcinoma? Retrospective multivariate analysis of differentiated thyroid carcinoma with long follow-up. Cancer. 1986;57(7):1405-14. 163. Sobin LH, Hermanek P, Hutter RV. TNM classification of malignant tumors. A comparison between the new (1987) and the old editions. Cancer. 1988;61(11):2310-4. 164. Lang BH, Lo CY, Chan WF, Lam KY, Wan KY. Staging systems for papillary thyroid carcinoma: a review and comparison. Annals of Surgery. 2007;245(3):366-78. 165. Byar DP, Green SB, Dor P, Williams ED, Colon J, van Gilse HA, ve diğ. A prognostic index for thyroid carcinoma. A study of the E.O.R.T.C. Thyroid Cancer Cooperative Group. European Journal of Cancer. 1979;15(8):1033-41. 166. Cady B, Rossi R. An expanded view of risk-group definition in differentiated thyroid carcinoma. Surgery. 1988;104(6):947-53. 167. Shaha AR, Loree TR, Shah JP. Intermediate-risk group for differentiated carcinoma of thyroid. Surgery. 1994;116(6):1036-40; discussion 40-1. 168. Pasieka JL, Zedenius J, Auer G, Grimelius L, Hoog A, Lundell G, ve diğ. Addition of nuclear DNA content to the AMES risk-group classification for papillary thyroid cancer. Surgery. 1992;112(6):1154-9; discussion 9-60. 169. Hay ID, Grant CS, Taylor WF, McConahey WM. Ipsilateral lobectomy versus bilateral lobar resection in papillary thyroid carcinoma: a retrospective analysis of surgical outcome using a novel prognostic scoring system. Surgery. 1987;102(6):1088-95. 170. Hay ID, Bergstralh EJ, Goellner JR, Ebersold JR, Grant CS. Predicting outcome in papillary thyroid carcinoma: development of a reliable prognostic scoring system in a cohort of 1779 patients surgically treated at one institution during 1940 through 1989. Surgery. 1993;114(6):10507; discussion 7-8. 171. Edge SB BD, Compton CC, Fritz AG, Greene FL, Trotti A, . AJCC cancer staging manual (7th ed). New York Springer; 2010 172. Melmed S, Polonsky KS, Larsen PR, Kronenberg HM. Williams Textbook of Endocrinology: Elsevier Health Sciences; 2011. 119 173. Sebastian SO, Gonzalez JM, Paricio PP, Perez JS, Flores DP, Madrona AP, ve diğ. Papillary thyroid carcinoma: prognostic index for survival including the histological variety. Archives of Surgery (Chicago, Ill : 1960). 2000;135(3):272-7. 174. Sugitani I, Kasai N, Fujimoto Y, Yanagisawa A. A novel classification system for patients with PTC: addition of the new variables of large (3 cm or greater) nodal metastases and reclassification during the follow-up period. Surgery. 2004;135(2):139-48. 175. Brierley JD, Panzarella T, Tsang RW, Gospodarowicz MK, O'Sullivan B. A comparison of different staging systems predictability of patient outcome. Thyroid carcinoma as an example. Cancer. 1997;79(12):241423. 176. Hassanain M, Wexler M. Conservative management differentiated thyroid cancer. Canadian Journal of 2010;53(2):109-18. of wellSurgery. 177. Bilimoria KY, Bentrem DJ, Ko CY, Stewart AK, Winchester DP, Talamonti MS, ve diğ. Extent of surgery affects survival for papillary thyroid cancer. Annals of Surgery. 2007;246(3):375-81; discussion 81-4. 178. Bilimoria KY, Zanocco K, Sturgeon C. Impact of surgical treatment on outcomes for papillary thyroid cancer. Advances in Surgery. 2008;42:112. 179. Hay ID, Hutchinson ME, Gonzalez-Losada T, McIver B, Reinalda ME, Grant CS, ve diğ. Papillary thyroid microcarcinoma: a study of 900 cases observed in a 60-year period. Surgery. 2008;144(6):980-7; discuss. 7-8. 180. Forest VI, Clark JR, Ebrahimi A, Cho EA, Sneddon L, Gao K, ve diğ. Central compartment dissection in thyroid papillary carcinoma. Annals of Surgery. 2011;253(1):123-30. 181. Giles Senyurek Y, Tunca F, Boztepe H, Alagol F, Terzioglu T, Tezelman S. The long term outcome of papillary thyroid carcinoma patients without primary central lymph node dissection: expected improvement of routine dissection. Surgery. 2009;146(6):1188-95. 182. Vergez S, Sarini J, Percodani J, Serrano E, Caron P. Lymph node management in clinically node-negative patients with papillary thyroid carcinoma. European Journal of Surgical Oncology : The Journal of the European Society of Surgical Oncology and the British Association of Surgical Oncology. 2010;36(8):777-82. 183. Sugitani I, Fujimoto Y. Does postoperative thyrotropin suppression therapy truly decrease recurrence in papillary thyroid carcinoma? A randomized controlled trial. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2010;95(10):4576-83. 120 184. Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, Kloos RT, Lee SL, Mandel SJ, ve diğ. Revised American Thyroid Association management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid. 2009;19(11):1167-214. 185. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 2005;12(2):245-62. 186. Kim KH, Kang DW, Kim SH, Seong IO, Kang DY. Mutations of the BRAF gene in papillary thyroid carcinoma in a Korean population. Yonsei Medical Journal. 2004;45(5):818-21. 187. Nikiforov Y, Steward D, Nikiforova M, editors. Role of molecular testing for mutations in improving the fine needle aspiration (FNA) diagnosis of thyroid nodules. Proceedings of the 77th annual meeting of the American Thyroid Association) Thyroid; 2006. 188. Hsiao SJ, Nikiforov YE. Molecular approaches to thyroid cancer diagnosis. Endocrine-Related Cancer. 2014;21(5):T301-13. 189. Lee SR, Jung CK, Kim TE, Bae JS, Jung SL, Choi YJ, ve diğ. Molecular genotyping of follicular variant of papillary thyroid carcinoma correlates with diagnostic category of fine-needle aspiration cytology: values of RAS mutation testing. Thyroid. 2013;23(11):1416-22. 190. Xing M, Clark D, Guan H, Ji M, Dackiw A, Carson KA, ve diğ. BRAF mutation testing of thyroid fine-needle aspiration biopsy specimens for preoperative risk stratification in papillary thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology : official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009;27(18):2977-82. 191. Huang FJ, Fang WY, Ye L, Zhang XF, Shen LY, Han RL, ve diğ. BRAF mutation correlates with recurrent papillary thyroid carcinoma in Chinese patients. Current Oncology (Toronto, Ont). 2014;21(6):e740-7. 192. Hay ID, Thompson GB, Grant CS, Bergstralh EJ, Dvorak CE, Gorman CA, ve diğ. Papillary thyroid carcinoma managed at the Mayo Clinic during six decades (1940-1999): temporal trends in initial therapy and long-term outcome in 2444 consecutively treated patients. World Journal Surgery. 2002;26(8):879-85. 193. Siironen P, Louhimo J, Nordling S, Ristimäki A, Mäenpää H, Haapiainen R, ve diğ.. Prognostic factors in papillary thyroid cancer: an evaluation of 601 consecutive patients. Tumor Biology. 2005;26(2):57-64. 194. DeLellis RA. Pathology and genetics of tumours of endocrine organs: IARC; 2004. 195. Altun H HE. Diferansiye Tiroid Kanserleri. . In: Sayek İ, editor. Temel Cerahi-2. 3 ed. Ankara: Güneş Tıp Kitabevi; 2004. p. 1597 -606. . 196. Başak T. Tiroid tümörlerinin sınıflandırılması ve patolojisi. In: İşgör A, editor. Tiroid hastalıkları ve cerrahisi,. 1 ed. İstanbul: Avrupa Tıp Kitapçılık; 2003. p. 351-5. 121 197. Yang J, Gong Y, Yan S, Shi Q, Zhu J, Li Z, ve diğ. Comparison of the clinicopathological behavior of the follicular variant of papillary thyroid carcinoma and classical papillary thyroid carcinoma: A systematic review and meta-analysis. Molecular and Clinical Oncology. 2015;3(4):753-64. 198. Özdemir B, Kılbaş Z, Yiğit T, Kozak O, Menteş Ö, Arslan İ. Diferansiye Tiroid Kanserli Hastalarda Skorlama Sistemlerinin Lokal Nüksü Öngörü Değeri. Gulhane Tıp Dergisi. 2014;56(3). 199. Wan PT, Garnett MJ, Roe SM, Lee S, Niculescu-Duvaz D, Good VM, ve diğ. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 2004;116(6):855-67. 200. Fugazzola L, Mannavola D, Cirello V, Vannucchi G, Muzza M, Vicentini L, ve diğ. BRAF mutations in an Italian cohort of thyroid cancers. Clinical Endocrinology. 2004;61(2):239-43. 201. Puxeddu E, Moretti S, Elisei R, Romei C, Pascucci R, Martinelli M, ve diğ. BRAF(V599E) mutation is the leading genetic event in adult sporadic papillary thyroid carcinomas. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2004;89(5):2414-20. 202. Trovisco V, Soares P, Preto A, de Castro IV, Lima J, Castro P, ve diğ. Type and prevalence of BRAF mutations are closely associated with papillary thyroid carcinoma histotype and patients' age but not with tumour aggressiveness. Virchows Archiv : An İnternational Journal of Pathology. 2005;446(6):589-95. 203. Elisei R, Ugolini C, Viola D, Lupi C, Biagini A, Giannini R, ve diğ. BRAF(V600E) mutation and outcome of patients with papillary thyroid carcinoma: a 15-year median follow-up study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2008;93(10):3943-9. 204. Sancisi V, Nicoli D, Ragazzi M, Piana S, Ciarrocchi A. BRAFV600E mutation does not mean distant metastasis in thyroid papillary carcinomas. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2012;97(9):E1745-9. 205. Begum S, Rosenbaum E, Henrique R, Cohen Y, Sidransky D, Westra WH. BRAF mutations in anaplastic thyroid carcinoma: implications for tumor origin, diagnosis and treatment. Modern Pathology : an official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2004;17(11):1359-63. 206. Nam SY, Han BK, Ko EY, Kang SS, Hahn SY, Hwang JY, ve diğ. BRAF V600E mutation analysis of thyroid nodules needle aspirates in relation to their ultrasongraphic classification: a potential guide for selection of samples for molecular analysis. Thyroid. 2010;20(3):273-9. 122 207. Joo JY, Park JY, Yoon YH, Choi B, Kim JM, Jo YS, ve diğ. Prediction of occult central lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma by preoperative BRAF analysis using fine-needle aspiration biopsy: a prospective study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2012;97(11):3996-4003. 208. Miccoli P. Application of molecular diagnostics to the evaluation of the surgical approach to thyroid cancer. Current Genomics. 2014;15(3):1849. 209. Niederer-Wüst SM, Jochum W, Förbs D, Brändle M, Bilz S, Clerici T, ve diğ. Impact of clinical risk scores and BRAF V600E mutation status on outcome in papillary thyroid cancer. Surgery. 2015;157(1):119-25. 210. Hwang TS, Kim WY. Preoperative RAS mutational analysis is of great value in predicting follicular variant of papillary thyroid carcinoma. 2015;2015:697068. 211. Danilovic DL, Lima EU, Domingues RB, Brandao LG, Hoff AO, Marui S. Pre-operative role of BRAF in the guidance of the surgical approach and prognosis of differentiated thyroid carcinoma. European Journal of Endocrinology / European Federation of Endocrine Societies. 2014;170(4):619-25. 212. Kim SK, Woo JW, Lee JH, Park I, Choe JH, Kim JH, ve diğ. Role of BRAF V600E mutation as an indicator of the extent of thyroidectomy and lymph node dissection in conventional papillary thyroid carcinoma. Surgery. 2015. 213. Lee JW, Koo BS. The prognostic implication and potential role of BRAF mutation in the decision to perform elective neck dissection for thyroid cancer. Gland Surgery. 2013;2(4):206-11. 214. Kebebew E, Weng J, Bauer J, Ranvier G, Clark OH, Duh QY, ve diğ. The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer. Annals of Surgery. 2007;246(3):466-70; discussion 70-1. 215. Kim SJ, Lee KE, Myong JP, Park JH, Jeon YK, Min HS, ve diğ. BRAF V600E mutation is associated with tumor aggressiveness in papillary thyroid cancer. World Journal Surgery. 2012;36(2):310-7. 216. Fagin JA, Matsuo K, Karmakar A, Chen DL, Tang SH, Koeffler HP. High prevalence of mutations of the p53 gene in poorly differentiated human thyroid carcinomas. The Journal of Clinical İnvestigation. 1993;91(1):179-84. 217. Chakraborty A, Narkar A, Mukhopadhyaya R, Kane S, D'Cruz A, Rajan MG. BRAF V600E mutation in papillary thyroid carcinoma: significant association with node metastases and extra thyroidal invasion. Endocrine Pathology. 2012;23(2):83-93. 123 218. Ma YJ, Deng XL, Li HQ. BRAF(V600E) mutation and its association with clinicopathological features of papillary thyroid microcarcinoma: A metaanalysis. Journal of Huazhong University of Science and Technology Medical Sciences. 2015;35(4):591-9. 219. Xing M. BRAF mutation in papillary thyroid cancer: pathogenic role, molecular bases, and clinical implications. Endocrine Reviews. 2007;28(7):742-62. 220. Lim JY, Hong SW, Lee YS, Kim BW, Park CS, Chang HS, ve diğ. Clinicopathologic implications of the BRAF(V600E) mutation in papillary thyroid cancer: a subgroup analysis of 3130 cases in a single center. Thyroid. 2013;23(11):1423-30. 221. Howell GM, Nikiforova MN, Carty SE, Armstrong MJ, Hodak SP, Stang MT, ve diğ. BRAF V600E mutation independently predicts central compartment lymph node metastasis in patients with papillary thyroid cancer. Annals of Surgical Oncology. 2013;20(1):47-52. 222. Dutenhefner SE, Marui S, Santos AB, de Lima EU, Inoue M, Neto JS, ve diğ. BRAF: a tool in the decision to perform elective neck dissection? Thyroid. 2013;23(12):1541-6. 223. Paulson L, Shindo M, Schuff K, Corless C. The role of molecular markers and tumor histological type in central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma. Archives of Otolaryngology--Head & Neck Surgery. 2012;138(1):44-9. 224. Guo K, Wang Z. Risk factors influencing the recurrence of papillary thyroid carcinoma: a systematic review and meta-analysis. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 2014;7(9):5393-403. 225. Howell GM, Carty SE, Armstrong MJ, Lebeau SO, Hodak SP, Coyne C, ve diğ. Both BRAF V600E mutation and older age (>/= 65 years) are associated with recurrent papillary thyroid cancer. Annals of Surgical Oncology. 2011;18(13):3566-71. 226. Ahn D, Park JS, Sohn JH, Kim JH, Park SK, Seo AN, ve diğ. BRAFV600E mutation does not serve as a prognostic factor in Korean patients with papillary thyroid carcinoma. Auris, Nasus, Larynx. 2012;39(2):198-203. 227. DeGroot LJ, Kaplan EL, McCormick M, Straus FH. Natural history, treatment, and course of papillary thyroid carcinoma. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1990;71(2):414-24. 228. Witt RL, Ferris RL, Pribitkin EA, Sherman SI, Steward DL, Nikiforov YE. Diagnosis and management of differentiated thyroid cancer using molecular biology. The Laryngoscope. 2013;123(4):1059-64. 124 229. Czarniecka A, Kowal M, Rusinek D, Krajewska J, Jarzab M, Stobiecka E, ve diğ. The Risk of Relapse in Papillary Thyroid Cancer (PTC) in the Context of BRAFV600E Mutation Status and Other Prognostic Factors. PloS one. 2015;10(7):e0132821. 230. Kabaker AS, Tublin ME, Nikiforov YE, Armstrong MJ, Hodak SP, Stang MT, ve diğ. Suspicious ultrasound characteristics predict BRAF V600Epositive papillary thyroid carcinoma. Thyroid. 2012;22(6):585-9. 231. Namba H, Rubin SA, Fagin JA. Point mutations of ras oncogenes are an early event in thyroid tumorigenesis. Molecular Endocrinology (Baltimore, Md). 1990;4(10):1474-9. 232. Ezzat S, Zheng L, Kolenda J, Safarian A, Freeman JL, Asa SL. Prevalence of activating ras mutations in morphologically characterized thyroid nodules. Thyroid. 1996;6(5):409-16. 233. Vasko VV, Gaudart J, Allasia C, Savchenko V, Di Cristofaro J, Saji M, ve diğ. Thyroid follicular adenomas may display features of follicular carcinoma and follicular variant of papillary carcinoma. European Journal of Endocrinology / European Federation of Endocrine Societies. 2004;151(6):779-86. 234. Suarez HG, du Villard JA, Severino M, Caillou B, Schlumberger M, Tubiana M, ve diğ. Presence of mutations in all three ras genes in human thyroid tumors. Oncogene. 1990;5(4):565-70. 235. Esapa CT, Johnson SJ, Kendall-Taylor P, Lennard TW, Harris PE. Prevalence of Ras mutations in thyroid neoplasia. Clinical Endocrinology. 1999;50(4):529-35. 236. Motoi N, Sakamoto A, Yamochi T, Horiuchi H, Motoi T, Machinami R. Role of ras mutation in the progression of thyroid carcinoma of follicular epithelial origin. Pathology, Research and Practice. 2000;196(1):1-7. 237. Basolo F, Pisaturo F, Pollina LE, Fontanini G, Elisei R, Molinaro E, ve diğ. N-ras mutation in poorly differentiated thyroid carcinomas: correlation with bone metastases and inverse correlation to thyroglobulin expression. Thyroid. 2000;10(1):19-23. 238. Xing M, Haugen BR, Schlumberger M. Progress in molecular-based management of differentiated thyroid cancer. Lancet (London, England). 2013;381(9871):1058-69. 239. Faquin WC, Baloch ZW. Fine-needle aspiration of follicular patterned lesions of the thyroid: Diagnosis, management, and follow-up according to National Cancer Institute (NCI) recommendations. Diagnostic Cytopathology. 2010;38(10):731-9. 240. Wu HH, Rose C, Elsheikh TM. The Bethesda system for reporting thyroid cytopathology: An experience of 1,382 cases in a community practice setting with the implication for risk of neoplasm and risk of malignancy. Diagnostic Cytopathology. 2012;40(5):399-403. 125 241. Rivera M, Ricarte-Filho J, Knauf J, Shaha A, Tuttle M, Fagin JA, ve diğ. Molecular genotyping of papillary thyroid carcinoma follicular variant according to its histological subtypes (encapsulated vs infiltrative) reveals distinct BRAF and RAS mutation patterns. Modern Pathology : An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2010;23(9):1191-200. 242. Smith RA, Salajegheh A, Weinstein S, Nassiri M, Lam AK. Correlation between BRAF mutation and the clinicopathological parameters in papillary thyroid carcinoma with particular reference to follicular variant. Human Pathology. 2011;42(4):500-6. 243. Zhu Z, Gandhi M, Nikiforova MN, Fischer AH, Nikiforov YE. Molecular profile and clinical-pathologic features of the follicular variant of papillary thyroid carcinoma. An unusually high prevalence of ras mutations. American Journal of Clinical Pathology. 2003;120(1):71-7. 244. Y. E. Nikiforov PWB, and L. D. R. Thompson,. Diagnostic Pathology and Molecular Genetics of theThyroid 2nd edition Baltimore Md, USA: Lippincott Williams & Wilkins; 2012. 245. Gupta N, Dasyam AK, Carty SE, Nikiforova MN, Ohori NP, Armstrong M, ve diğ. RAS mutations in thyroid FNA specimens are highly predictive of predominantly low-risk follicular-pattern cancers. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2013;98(5):E914-22. 246. Park JY, Kim WY, Hwang TS, Lee SS, Kim H, Han HS, ve diğ. BRAF and RAS mutations in follicular variants of papillary thyroid carcinoma. Endocrine Pathology. 2013;24(2):69-76. 247. Hara H, Fulton N, Yashiro T, Ito K, DeGroot LJ, Kaplan EL. N-ras mutation: an independent prognostic factor for aggressiveness of papillary thyroid carcinoma. Surgery. 1994;116(6):1010-6. 248. Killela PJ, Reitman ZJ, Jiao Y, Bettegowda C, Agrawal N, Diaz LA, Jr., ve diğ. TERT promoter mutations occur frequently in gliomas and a subset of tumors derived from cells with low rates of self-renewal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110(15):6021-6. 249. Muzza M, Colombo C, Rossi S, Tosi D, Cirello V, Perrino M, ve diğ. Telomerase in differentiated thyroid cancer: promoter mutations, expression and localization. Molecular and Cellular Endocrinology. 2015;399:288-95. 250. Melo M, da Rocha AG, Vinagre J, Batista R, Peixoto J, Tavares C, ve diğ. TERT Promoter Mutations Are a Major Indicator of Poor Outcome in Differentiated Thyroid Carcinomas. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2014;99(5):E754-E65. 251. Dremier S, Taton M, Coulonval K, Nakamura T, Matsumoto K, Dumont JE. Mitogenic, dedifferentiating, and scattering effects of hepatocyte growth factor on dog thyroid cells. Endocrinology. 1994;135(1):135-40. 126 252. Rosen EM, Nigam SK, Goldberg ID. Scatter factor and the c-met receptor: a paradigm for mesenchymal/epithelial interaction. The Journal of Cell Biology. 1994;127(6 Pt 2):1783-7. 253. Jeffers M, Rao MS, Rulong S, Reddy JK, Subbarao V, Hudson E, ve diğ. Hepatocyte growth factor/scatter factor-Met signaling induces proliferation, migration, and morphogenesis of pancreatic oval cells. Cell growth & differentiation : The Molecular Biology Journal of the American Association for Cancer Research. 1996;7(12):1805-13. 254. Nardone HC, Ziober AF, LiVolsi VA, Mandel SJ, Baloch ZW, Weber RS, ve diğ. c-Met expression in tall cell variant papillary carcinoma of the thyroid. Cancer. 2003;98(7):1386-93. 255. Chen BK, Ohtsuki Y, Furihata M, Takeuchi T, Iwata J, Liang SB, ve diğ. Overexpression of c-Met protein in human thyroid tumors correlated with lymph node metastasis and clinicopathologic stage. Pathology, Research and Practice. 1999;195(6):427-33. 256. Ruco LP, Ranalli T, Marzullo A, Bianco P, Prat M, Comoglio PM, ve diğ. Expression of Met protein in thyroid tumours. The Journal of Pathology. 1996;180(3):266-70. 127