genç ve senesent mezenkimal kök hücre sekretomlarının kanser

advertisement
1
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE
SEKRETOMLARININ KANSER HÜCRE HATLARINA
ETKİLERİNİN İNCELENMESİ
Hazırlayan
Mustafa Burak ACAR
Danışman
Doç. Dr. Servet ÖZCAN
Prof. Dr. Umberto GALDERISI
Yüksek Lisans Tezi
Temmuz 2015
KAYSERİ
2
T.C.
ERCİYES ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE
SEKRETOMLARININ KANSER HÜCRE HATLARINA
ETKİLERİNİN İNCELENMESİ
(Yüksek Lisans Tezi)
Hazırlayan
Mustafa Burak ACAR
Danışman
Doç. Dr. Servet ÖZCAN
Prof. Dr. Umberto GALDERISI
Bu çalışma; Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi
Tarafından FYL-2015-5616 kodlu proje ile desteklenmiştir.
Temmuz 2015
KAYSERİ
iv
ÖNSÖZ / TEŞEKKÜR
Çalışmalarım boyunca farklı bakış açıları ve bilimsel katkılarıyla beni aydınlatan ve
yardımlarını esirgemeyen ve bu günlere gelmemde en büyük katkı sahibi sayın danışman
hocalarım Doç.Dr. Servet ÖZCAN ve Prof. Dr. Umberto GALDERISI’ye teşekkür
ederim.
Tezin yapılmasında büyük katkıları olan Genom ve Kök Hücre Merkezi yöneticileri ile
çalışanlarına, çalışmalarım süresince desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen laboratuvar
arkadaşlarıma desteklerinden dolayı teşekkürlerimi sunarım.
Tez çalışmalarım sırasında yanımda olan desteğini hiç esirgemeyen ve bilgi birikimleri
ile yardımcı olan değerli arkadaşlarım Dr. Güler TOPRAK, Dr. Dilek CEYLAN, Dr.
Nicola ALESSIO, Dr. Ahmet Raşit ÖZTÜRK, Moleküler Biyolog Eda MERT, Yüksek
Biyolog Dilek BAHAR, Biyolog Ebru İBİŞ’e, hayatım boyunca yanımda olan ve
ideallerimi gerçekleştirmemi sağlayan babam, annem, kardeşlerim ve ev arkadaşlarıma
sonsuz teşekkür ederim.
Ayrıca bu tez çalışmasına maddi destek veren Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma
Projeleri Birimi’ne (Proje No: FYL-2015-5616) teşekkür ederim.
Mustafa Burak ACAR
Kayseri, Temmuz 2015
v
GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMLARININ
KANSER HÜCRE HATLARINA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ
Mustafa Burak ACAR
Erciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü
Yüksek Lisans Tezi, Temmuz 2015
Danışmanlar: Doç.Dr. Servet ÖZCAN, Prof. Dr. Umberto GALDERISI
ÖZET
Senesens hücre bölünmesini durduran, ancak hücrelerin metabolik aktivitelerine devam
ettiği, dejeneratif bir süreçtir. Mezenkimal kök hücreler (MKH) birçok dokuda bulunur
ve sekrete ettikleri moleküller ile nişteki hücrelerin regülasyonunda önemli rol oynarlar.
Senesent MKH’ler, kendi mikro çevrelerinde senesens ile ilişkili molekülleri salgılar. Bu
moleküller ortamda bulunan diğer hücreleri (kök hücre, kanser vb.) farklı şekillerde
etkiler. Bu çalışmada mezenkimal kök hücre kültürünün erken ve geç safhasında,
sekretom içeren koşullandırılmış besiyeri (KBY) toplanmıştır. KBY sağlıklı (genç)
MKH’lerin ve kanser hücre hatlarının besiyerlerine eklenmiştir. Senesens, apoptoz,
mitokondri membran potansiyeli ve proliferasyon testleri yapılarak, sekretomun genç kök
hücrelere ve kanser hücre hatlarına biyolojik etkileri incelenmiştir. Elde edilen bulgular,
MKH sekretomunun en fazla genç MKH’lere etki ettiğini göstermektedir. Farklı
koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen MKH grupları arasındaki farklar her testte
anlamlı bulunmuştur. Senesent MKH sekretomunun içeriği kanser hücrelerinin genelinde
senesens mekanizmasını aktive etmiştir. Kolon kanseri hücrelerinin apoptoz testinde
senesent MKH sekretomundan etkilendiği gözlemlenmiştir. Diğer hücre hatlarının
apoptoz testleride, kronik myeloid lösemi (KML) ve meme kanseri hücre gruplarında
anlamlı farklar bulunmamıştır. Mitokondri membran potansiyeli incelenirken,
sekretomun KML hücrelerinin membran depolarizasyonunu arttırdığı gözlenmiştir.
Proliferasyon testinde meme kanseri hücrelerinin senesent MKH sekromu ile kültüre
edildiğinde proliferasyon kapasitesi artmıştır. Sonuç olarak, MKH sekretomunun mikroçevresinde bulunan hücrelerin biyolojik mekanizmalarını etkileyen moleküller içerdiği
ve bu moleküllerin kanser hücre hatlarının farklı mekanizmalarını (apoptoz, senesens vb.)
etkilediği gözlenmektedir. Sekretomun mekanizma ve etkinin boyutu kanser hücresinin
kökeni ve hücre tipine (tutunan, yüzen) göre değişkenlik göstermektedir.
Anahtar Kelimeler: Senesens, sekretom, kök hücre, kanser
vi
INVESTIGATION OF YOUNG AND SENESCENT MESENCHYMAL STEM
CELL SECRETOME EFFECTS ON CANCER CELL LINES
Mustafa Burak ACAR
Erciyes University, Institute of Natural and Applied Sciences
M.Sc. Thesis, July 2015
Supervisors: Doç.Dr. Servet ÖZCAN, Prof. Dr. Umberto GALDERISI
ABSTRACT
Senesence is a degenerative progress in which cells stops cell dividing yet these cells
continue their metabolic activity. Mesenchymal stem cells (MSCs) exist in many tissues
and play an important role in the regulation of cells in a niche with their secreted
molecules. Senescent MSCs secrete molecules related to senescence in their micro
environment. In a tissue these molecules may effect other cells (stem cell, cancer cell etc.)
either positive or negative manner. In this study; conditional media (CM) which includes
secretome was collected from MSCs at early and late stage of culture. CM was added to
the culture medium of young MSCs and cancer cell lines. Effects of secretome to young
MSCs and cancer cell lines was investigated by performing senescence, apoptosis,
mitochondrial membrane potential and proliferation tests. The findings show that the
secretome of MSCs effects mostly young MSCs. Differences between MSCs groups that
incubated with different conditional media was found to be significant for every test.
Molecules that present in senescent MSCs secretome activated senescence mechanism in
all of cancer cell lines used in this study. It was observed that; apoptosis mechanism of
colorectal cancer cells was effected by senescent MSCs secretome. However in the
apoptosis test of other cell lines there were no significant differences between groups.
While investigating the mitochondrial membran potential; it was observed that the
secretome of senescent MSCs increased mitochondrial membrane depolarization of CML
cells. In the proliferation test, proliferation capacity of breast cancer cells were increased
when they were incubated with senescent MSCs secretome. In conclusion, secretome of
MSCs contains molecules which effects biological mechanisms of other cells which were
present in their micro environment and these molecules effected different mechanism
(apoptosis, senescence etc.) of cancer cell lines. The mechanisms that effected by
secretome and the extend of their effect can be changed with the parameters like origin
of cancer cells and type (adherent, floating) of cell.
Key words: Senescence, secretome, stem cell, cancer
vii
İÇİNDEKİLER
GENÇ VE SENESENT MEZENKİMAL KÖK HÜCRE SEKRETOMLARININ
KANSER HÜCRE HATLARINA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ
BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK ..................................................................................... i
YÖNERGEYE UYGUNLUK ...........................................................................................ii
KABUL ONAY ...............................................................................................................iii
ÖNSÖZ / TEŞEKKÜR .................................................................................................... iv
ÖZET................................................................................................................................. v
ABSTRACT ..................................................................................................................... vi
İÇİNDEKİLER ...............................................................................................................vii
KISALTMA VE SİMGELER .......................................................................................... xi
TABLOLAR LİSTESİ ...................................................................................................xiii
ŞEKİLLER LİSTESİ ..................................................................................................... xiv
GİRİŞ ............................................................................................................................... 1
1. BÖLÜM
GENEL BİLGİLER
1.1. Senesens ................................................................................................................ 3
1.1.1. Senesens Nedir? ........................................................................................... 3
1.1.1.1 Replikatif (Kronik) Senesens ............................................................... 4
1.1.1.2. Prematüre Hücresel (Akut) Senesens................................................. 5
1.1.2. Hücresel Senesens Belirteçleri ............................................................... 6
1.1.2.1. Sekretomdaki Senesens Mesajı [Senescence Messaging Secretome
(SMS-ing)] .............................................................................................. 7
1.2. Kök Hücre ............................................................................................................ 9
1.2.1. Mezenkimal Kök Hücre (MKH)................................................................. 9
1.2.1.1. Mezenkimal Kök Hücre Elde Edilen Dokular .................................. 9
1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücre Karakteristik Özellikleri ......................... 10
1.2.1.2.1. Morfoloji ..................................................................................... 10
viii
1.2.1.2.2. Yüzey Belirteçleri ....................................................................... 11
1.2.1.2.3. Farklılaşma Kapasiteleri ........................................................... 11
1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Parakrin Etkisi ................................. 11
1.2.1.3. Mezenkimal Kök Hücrelerin Tıpta Kullanımı ................................ 12
1.3. Kanser................................................................................................................. 13
1.3.1. Meme Kanseri ............................................................................................ 14
1.3.2. Kolon Kanseri ............................................................................................ 15
1.3.3. Kronik Myeloid Lösemi ............................................................................ 17
1.3.4. Çalışmada Kullanılan Hücre Hatları ....................................................... 18
1.3.4.1. MCF-7 (İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı) .................................... 18
1.3.4.2. DLD-1 (İnsan Kolon Kanseri Hücre Hattı) ..................................... 18
1.3.4.3. K562 (İnsan Kronik Myeloid Lösemi Hücre Hattı) ........................ 19
1.4. Hücre Kültürü ................................................................................................... 19
1.4.1. Hücre Kültürünün Tarihçesi .................................................................... 19
1.4.2. Hücre Kültürü İçin Gerekli Ekipmanlar ................................................ 20
1.4.3. Hücre Kültürü Kimyasalları .................................................................... 20
1.4.3.1. Mediumlar .......................................................................................... 20
1.4.3.1.1. Medium İçeriğindeki Maddeler ................................................ 21
1.4.3.1.1.1. Tuzlar................................................................................... 21
1.4.3.1.1.2. Vitaminler ........................................................................... 21
1.4.3.1.1.3. Glukoz.................................................................................. 21
1.4.3.1.2. Medium İçeriğine Dahil Edilen Diğer Maddeler..................... 22
1.4.3.1.2.1. Serum ................................................................................... 22
1.4.3.1.2.2. Aminoasitler ........................................................................ 22
1.4.3.1.2.3. Antibiyotikler ...................................................................... 22
1.4.3.1.2.4. Hormonlar ve Büyüme Faktörleri .................................... 22
1.4.3.2. PBS (Fosfatla Tamponlanmış Tuz Çözeltisi) ....................................... 22
1.4.3.3. Tripsin...................................................................................................... 23
1.5. Testler ................................................................................................................. 23
ix
1.5.1. Testler Senesense Bağlı Beta-Galaktozidaz Aktivitesi Tespiti............... 23
1.5.2. Apoptoz Testi ............................................................................................. 23
1.5.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi .................................................. 24
1.5.4. Proliferasyon Testi ..................................................................................... 24
2. BÖLÜM
GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Mezenkimal Kök Hücrelerin Eldesi ..................................................................... 25
2.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültürü .................................................................. 25
2.2.1. Besiyeri Hazırlanması .................................................................................... 25
2.2.2. Hücre Kültürü Basamakları.......................................................................... 25
2.3. Mezenkimal Kök Hücrelerde Replikatif Senesens Oluşturulması .................... 26
2.4. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilecek MKH’lerin Senesens Testleri ........... 26
2.5. Koşullandırılmış Besiyeri Hazırlanması .............................................................. 27
2.6. Genç MKH’lere Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri ............... 27
2.6.1. Senesens Testi ................................................................................................. 27
2.6.2. Apoptoz Testi .................................................................................................. 28
2.6.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi ....................................................... 28
2.6.4. Proliferasyon Testi ......................................................................................... 29
2.7. Kanser Hücre Hatlarının Hazırlanması .............................................................. 29
2.7.1. Besiyeri Hazırlanması .................................................................................... 29
2.7.2. Kültür Basamakları ....................................................................................... 29
2.8. Kanser Hücre Hatlarına Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri . 30
2.8.1. Senesens Testi ................................................................................................. 30
2.8.2. Apoptoz Testi .................................................................................................. 31
2.8.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi ....................................................... 31
2.8.4. Proliferasyon Testi ......................................................................................... 31
2.9. İstatistiksel Analiz .................................................................................................. 32
x
3. BÖLÜM
BULGULAR
3.1. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testlerinden Elde
Edilen Bulgular ...................................................................................................... 33
3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Testlerinden Elde
Edilen Bulgular ...................................................................................................... 34
3.3. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testlerinden
Elde Edilen Bulgular.............................................................................................. 36
3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran
Potansiyeli Testlerinden Elde Edilen Bulgular ................................................... 37
3.5. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon
Testlerinden Elde Edilen Bulgular ....................................................................... 39
4. BÖLÜM
TARTIŞMA - SONUÇ VE ÖNERİLER
4.1. Tartışma .................................................................................................................. 42
4.2. Sonuç ve Öneriler ................................................................................................... 52
KAYNAKLAR .............................................................................................................. 53
ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 59
xi
KISALTMA VE SİMGELER
Sembol
Anlamı
7-AAD
7-Aminoactinomycin D
APC
Anaphase Promoting Complex
ATM
Ataxia Telangiectasia Mutated
bFGF
Basic Fibroblast Growth Factor
CML
Chronic Myleoid Leukemia
DCC
Deleted in Colorectal Cancer
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimetil Sülfoksit (Dimethyl Sulfoxide)
DPBS
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
EGF
Epidermal Growth Factor
FBS
Fetal Bovine Serum
HEPES
(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )
IFN
Interferon
IGFBP
Insullin Like Growth Factor Binding Protein
IL
Interleukin
K3[Fe(CN)6]
Potasyum Ferrisiyanür
K4[Fe(CN)6]
Potasyum Ferrosiyanür
KML
Kronik Myleoid Lösemi
MKH
Mezenkimal Kök Hücre
MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)
NaHCO3
Sodyum Bikarbonat
PAI
Plasminogen Activator Inhibitör
PDGF
Platelet Derived Growth Factor
PE
Fosfatidil-Etanolamin (Phosphatidylethanolamine)
PS
Fosfatidil-Serin (Phosphatidylserine)
xii
RB
Retinoblastoma
SAHF
Senescence Associated Heterochromatin Foci
SASP
Senescence Associated Secretory Phenotype
SDF
Stromal Cell Derived Factor
STK
Serological Thymidine Kinase
TGF- β
Transforming Growth Factor- Beta
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
X-Gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside)
β-Gal
Beta-galaktozidaz
xiii
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 3.1.
KBY Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testi Sonuçları ........................... 33
Tablo 3.2.
Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Senesens Test
Sonuçları .................................................................................................... 34
Tablo 3.3.
Senesens Testi – T-Test p Değerleri .......................................................... 35
Tablo 3.4.
Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testi
Sonuçları .................................................................................................... 36
Tablo 3.5.
Apoptoz Testi Apoptotik Hücre– T-Test p Değerleri ................................ 36
Tablo 3.6.
Apoptoz Testi Ölü Hücre– T-Test p Değerleri .......................................... 36
Tablo 3.7.
Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri
Membran Potansiyeli Testi Sonuçları ........................................................ 38
Tablo 3.8.
Mitokondri Membran Potansiyeli Testi – T-Test p Değerleri ................... 38
Tablo 3.9.
Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon
Testi Sonuçları ........................................................................................... 39
Tablo 3.10. MTT Testi 24.saat – T-Test p Değerleri .................................................... 40
Tablo 3.11. MTT Testi 48.saat – T-Test p Değerleri .................................................... 40
xiv
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1.1. Senesens’in sebepleri ve sonuçları ................................................................... 4
Şekil 1.2. Kronik ve akut senesens mekanizmlarının izlediği yolaklar ............................ 6
Şekil 1.3. Senesens mekanizmasının önemli molekülleri ................................................. 8
Şekil 3.1. Genç mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü ................................... 33
Şekil 3.2. Senesent mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü ............................. 34
1
GİRİŞ
Senesens metabolizma hızı yüksek, mitotik olarak aktif, sıkça yenilenmeye ihtiyacı olan
dokuları etkileyen, iç ve dış faktörlerin sebep olduğu sistemik, dejeneratif bir yaşlanma
sürecidir. Bu süreçte doku içerisinde, dokunun profilini belirleyen hücrelerde moleküler
değişimler meydana gelir. Hücresel senesens hücre döngüsünün kalıcı olarak durduğu bir
süreçtir. Senesens sürecine giren hücrelerin DNA içeriği tipik olarak hücre döngüsünün
G1 fazındaki hücrelerin DNA içeriği gibi kalır ancak bu hücreler metabolik olarak
aktiftirler. Senesens süreci, dokunun rejenerasyon özelliğini büyük ölçüde azaltır [1].
Hücresel senesens, ilk başlarda hücre içi bir mekanizma olarak değerlendirilmekte iken
son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu yaşlanma sürecinin esasında hücrelerin mikro
çevrelerine salgıladıkları moleküllerle de düzenlendiğini göstermektedir [1]. Doku
içerisinde doku profilini düzenleyen kök hücreler, bu yaşlanma sürecinden etkilenir.
Senesens sürecine girmiş bir kök hücre dokuya salgıladığı moleküllerle dokunun diğer
hücrelerine etki edebilir. Bu etki farklı şekillerde olabilir. Salgılanan faktörler, dokunun
sağlıklı hücrelerini senesens sürecine sokabilir. Bu durum dokuda yaşlanmaya sebep olur.
Salgılanan moleküler, hasarlı komşu hücreleri uyararak neoplastik dönüşüme gitmelerine
engel olurlar. Böylece tümör oluşumu engelerler. Ancak senesens sürecinde salgılanan
faktörler, tümör oluşumunun erken safhalarında baskılayıcı bir rol üstlenmesine rağmen,
geç safhalarda tümör gelişimini destekleyen bir etken olabilirler [2].
Yaşlanma süreci dokuda yer alan kök hücreleri de etkilemektedir. Bu kök hücreler
salgıladıkları faktörler ile doku profilini belirler, dokunun büyümesinde ve
yenilenmesinde önemli rol oynarlar [1]. Bu hücrelerin en önemlilerinden biri mezenkimal
kök hücrelerdir. Mezenkimal kök hücreler (MKH) organizmada birçok dokuda
bulunurlar, dokunun büyümesinde ve hasarlı dokunun yenilenmesinde önemli rol
oynarlar. MKH’lerin tedavi edici potansiyelleri yüksek olduğundan tıpta kullanımı
oldukça fazladır. Ayrıca bilimsel araştırmalar açısından MKH’ler; izolasyonu, kültürü ve
2
manipülasyonu kolay olan bir hücre tipidir. Kemik iliği ve yağ doku başta olmak üzere
birçok dokudan kolaylıkla elde edilebilirler [3].
Senesens MKH’lerin proliferasyon kapasitelerini sınırlandırır, böylece hücrelerin
bölünme süreleri uzar, telomeraz aktivitesini kaybeder ve senesense bağlı betagalaktozidaz aktivitesi artar. MKH’ler parakrin etki potansiyeli yüksek hücreler
olduğundan, senesens sürecine girdikleri zaman bulundukları dokuya senesens ile ilgili
faktörler salgılarlar. Bu faktörler, dokudaki diğer hücreleri ve dolayısıyla dokunun
karakteristik özelliklerini etkiler [4].
Bu çalışmada genç MKH’lerden ve uzun süre kültüre edilerek senesens mekanizması
aktif olmuş MKH’lerden elde edilen ve bu hücrelerin salgıladığı faktörleri içerdiği
öngörülen koşullandırılmış besiyerleri toplanmıştır. Bu koşullandırılmış besiyerleri,
MCF-7 (İnsan meme kanseri hücre hattı), DLD-1 (insan kolon kanseri hücre hattı) ve
K562 (İnsan kronik myeloid lösemi hücre hattı) kanser hücre hatlarının besiyerlerine
eklenmiş, daha sonra kanser hücre hatları testlere tabii tutulmuştur. Elde edilen
koşullandırılmış besiyerleri ayrıca genç MKH’lerin kültür ortamına da eklenip aynı testler
tekrarlanmıştır. Böylece, MKH’lerin hem genç, hem de senesent durumda iken salgıladığı
faktörlerin, kanser hücreleri üzerine ve genç MKH’ler üzerine biyolojik etkilerinin
değerlendirilmesi amaçlanmıştır.
3
1. BÖLÜM
GENEL BİLGİLER
1.1. Senesens
1.1.1. Senesens Nedir?
Hücresel senesens; hücre bölünmesinin kalıcı olarak durduğu, hücreyi strese sokan iç ve
dış faktörler tarafından tetiklenen fizyolojik bir program olarak tanımlanmaktadır. Bu
faktörler telomer kısalması, oksidatif stres, onkojenik aktivite, DNA hasarı ve ya aynı
mikro çevredeki senesent hücrelerin parakrin etkileri olabilir. Senesens zamanla hücrede
fonksiyon kaybına sebep olur ve dokunun kendini yenileme kapasitesinde azalmaya
neden olur [5]. Öte yandan senesens tümör gelişimini durdurur. Senesent hücreler
bölünme yeteneğini kaybetse de metabolik olarak aktiftirler [6].
Hücreler kültür ortamında belli bir bölünme sayısından sonra senesense girer. Örneğin
fibroblastlar kültürde 50 bölünmeden sonra senesent hale gelirler. Bu şekilde aktive olan
senesens mekanizması replikatif senesens veya Hayflick Limiti olarak isimlendirilir [7].
Replikatif senesens dışında farklı senesens türleri vardır. Uyarılmış senesens bunlardan
biridir. Senesent olmayan bir hücrenin serbest radikallere yada kemoterapi ilaçlarına
maruz kalarak senesens mekanizmasının aktive olması, uyarılmış senesens olarak
tanımlanır. Hidrojen peroksit, cisplatin ve doxorubicin en çok bilinen senesens uyarıcı
ajanlardır [8]. Diğer senesens mekanizması ise onkojenik aktivite sonucu uyarılmış
senesenstir. Bu senesens mekanizması; onkogenlerin aktive olması sonucu ya da tümör
baskılayıcı genlerde fonksiyon kaybı olması gibi durumlarda aktive olur ve tümör
baskılayıcı bir mekanizma olarak kabul edilir [9]. Senesens mekanizmasının sebepleri ve
sonuçları Şekil 1.1’de gösterilmiştir.
Senesent hücreler ölçüt olarak aşırı şekilde büyürler, birden fazla çekirdekleri bulunabilir.
Oldukça fazla β-gal aktivitesi sonucunda lizozom sayısında artış gözlenir [10]. Kalitatif
4
ölçüt olarak senesent hücrelerin belirlenmesinde pH:6’daki beta-galaktozidaz aktivitesi
temel alınır. X-gal, 4-MUG gibi beta-galaktozidaz substratları kullanılarak boyama veya
flüoresan ışıma açığa çıkaran reaksiyonlar ile hücredeki beta-galaktozidaz miktarı
belirlenir [11].
Şekil 1.1. Senesens’in sebepleri ve sonuçları [2].
1.1.1.1 Replikatif (Kronik) Senesens
İnsana ait dokulardan bağımsız hücreler elde edildiğinde bu hücrelerin proliferasyon
kapasiteleri 3 fazda incelenmiştir. İlk faz birinci pasajdan önceki çoğalma evresidir. İkinci
faz hızlı bir şekilde hücrelerin çoğaldığı birinci pasaj sonrası evre, 3. faz ise çoğalmanın
azaldığı ve durduğu evredir. Hücrenin yaşamaya ve metabolik aktivitelerini
gerçekleştirmeye devam ettiği halde, proliferasyon kapasitesinin azaldığı bu evre hücresel
senesens olarak isimlendirilmiştir [7].
Ökaryortik, doğrusal DNA’nın ucunda, yapının bütünlüğünü koruyan telomerler
bulunmaktadır. Kültürdeki hücrelerin telomerlerinde her bölünme sonrasında kısalma
meydana gelir. Bunun sebebi kesintili zincirde son Okazaki frangentinden sonra gelen
primerin çıkarılmasından sonra, ligaz enziminin boşluğu kapatamamasıdır. Bu durumu
telomeraz enzimi düzeltir. Ancak telomeraz enzim aktivitesi her bölünmede azalır.
5
Böylece hücre her bölünmede Hayflick Limiti’ne biraz daha yaklaşır. Yani replikatif
senesens, DNA replikasyonu ile birlikte gelen bir durumdur. Telomerler kısalarak
minimum boyuta geldiklerinde kromozomal DNA’yı koruyan yapıları bozulur. Dahası
senesent hücrelerde ATM ve ATR gibi kinazlar aktive olur. Bu mekanizma G1 fazı
kontrol proteini p53’ün de dahil olduğu hücre döngüsü ile ilgili proteinleri fosforile
ederek bölünmeyi durdurur. Bu şekilde hücre kendine hasarı düzeltmek için fırsat sağlar.
Eğer hasar düzeltilemiyorsa hücre senesense ve apoptoza girer [12].
Replikatif senesens p53’e ek olarak p21, RB (Retinoblastoma) tümör baskılayıcı gen
ailesi ve onların sinyal partneri p16INK4A ( RB genlerinin 5’ kısmında çalışan siklinbağımlı kinaz inhibitörü) ile de bağlantılıdır. p53 ve RB- p16INK4A yolakları, insan
hücrelerinin senesens mekanizmasında önemli rol oynarlar [12].
1.1.1.2. Prematüre Hücresel (Akut) Senesens
Senesens telomer fonksiyonundaki bozulmalarla meydana gelebileceği gibi, farklı
koşullar tarafından da uyarılabilir. Bu tür senesens mekanizması prematüre hücresel
senesens olarak adlandırılır [12].
Prematüre senesens türlerinden ilki stres ile uyarılmış senesenstir. Hücrelerde senesens
mekanizmasını uyaran etken kimyasal ajanlar (doxorubicin, cisplatin), yüksek besin ve
büyüme faktörü konsantrasyonu, serbest radikaller (hidrojen peroksit) veya hücre
çevreleyen diğer hücreler olabilir. Fare embriyonik fibroblastlarının yaşam sürelerinin
serum içermeyen ve diğer büyüme faktörleriyle desteklenen besiyerinde arttığı
gözlenmiştir [12].
Onkogen-uyarılmış senesens (OIS) ise onkogen aktivasyonuna karşı verilen güçlü bir
anti-proliferatif bir cevaptır. Tümör oluşumunu erken aşamada baskılar. ARF- p53 ve
RB- p16INK4A sinyal yolakları OIS’te önemlidirler (Şekil 1.2) [9,12].
Onkogen mutasyonu veya aşırı ifadesine benzer olarak, tümör baskılayıcı genlerdeki
fonksiyon kaybı da senesens mekanizmasını tetikleyebilir. PTEN ve NF1 bu duruma
örnek teşkil eder. PTEN proteininin (p53’ün uyarılmasını sağlar.) olmadığı durumda fare
embriyonik fibroblastlarında senesens mekanizması aktive olmaktadır. Benzer olarak
NF1 fonksiyon kaybında RAS aktivitesi artar. Bu durum senesense sebep olmaktadır
[12].
6
Şekil 1.2. Kronik ve akut senesens mekanizmlarının izlediği yolaklar [9].
1.1.2. Hücresel Senesens Belirteçleri
Hücre döngüsünün durması hücresel senesensin önemli belirteçlerinden biridir. Hücre
döngüsü kontrol proteinleri hasarlı hücrelerin hücre döngüsünü dururarak, tümör
oluşumuna engel olurlar. Senesent hücreler genellikle G1 fazında kalırlar [12].
Bir diğer belirteç morfolojik değişikliklerdir. Senesent hücreler giderek büyür ve çok
çekirdekli olurlar. Lizozom miktarı bu hücrelerde artar. [12].
Hücresel senesensin en önemli belirteci β-gal aktivitesidir. β-gal substratları kullanılarak
yapılan boyamalarla, senesent hücreler kalitatif olarak belirlenebilir [12].
Senesens ayrıca kromozom yapısındaki değişikliklerle de alakalı bir durumdur. Normal
hücrelerde, DNA boyaları ile boyandığında homojen desenler gözlenirken, senesent
7
hücreler heterojen şekilde boyanır. Heterojen bir desen gösteren bu bölgeler senesense
bağlı heterokromatik bölgelerdir (SAHF) [12].
Hücrelerin salgıladıkları sitokin ve kemokinler de senesens mekanizmasının önemli
elemanlarıdır. Bu salgılar genel olarak SASP (Senescence Associated Secretory
Phenotype) olarak isimlendirilir [12].
1.1.2.1. Sekretomdaki Senesens Mesajı [Senescence Messaging Secretome (SMSing)]
Senesens mekanizması ilk başlarda, hücre içi bir mekanizma olarak düşünülmekteyken,
son yapılan çalışmalarla; hücresel senesensin, hücreler dışı matriks içeriğindeki
değişimlerle ilgili olduğunu ortaya koyulmuştur. Örneğin insülin benzeri büyüme faktörü
bağlanma proteini 3 (IGFBP3), 1 (IGFBP1) ve plazminojen aktivatör inhibitörü 1’in
(PAI1) dahil olduğu salgılanan faktörlerin ekspresyonu senesenste değişiklik gösterir.
Sonuç olarak, daha önce bahsedilen faktörler, peptitler, proteinler ve hücreler dışı matriks
bileşenleri, senesens mekanizmasının aktive olmasıyla güçlü bir şekilde uyarılır.
Senesens oluşumuna katılan ve senesens oluşması için bolca bulunması gereken birkaç
anahtar faktör rapor edilmiştir. Bunlardan bazıları Wnt, IGF1, plazmin ve interlökin (IL)
ve TGF-β’dır. Literatürde bulunan veriler bu faktörlerin öncelikli fonksiyonlarının
hücreler arasında iletişim sağlanmak olduğunu öngörmektedir. Ancak son yapılan
çalışmalar bu faktörlerin sekretomda bulunan senesens mesajı olduğunu kanıtlar
niteliktedir [9]. Yani bu faktörler senesent hücrelere kendi mikro çevreleri ile iletişime
geçme olanağı sağlar. Eğer ki bu senesent hücre, parakrin etkisi yüksek, doku profilini
belirleyen bir kök hücre ise; salgılanan senesens mesajı dokulardaki diğer hücreleri de
etkiler.
Sekretomda bulunan senesens mesajının senesens oluşumunda etkili olduğundan
bahsedilmektedir. Farklı hücre tiplerinde senesens mekanizmasının uyarılması,
salgılanan faktörlerin etkili olduğu birkaç sisteme bağlıdır. Bu faktörler insülin benzeri
büyüme faktörü bağlanma proteini (IGFBP), interlökin (IL) ailesi, plazmojen aktivatör
inhibitörü ve TGF-β’dır. IGF sinyal sistemi ve IGFBP’ler ve PAI1-plazmin sistemi
senesens mekanizmasında kilit rol oynarlar. TGF-β hücresel senesens oluşumunu
8
uyarırken, WNT2 bu uyarılmayı inhibe eder. IGF’ler ve interferonlar (IFN) da bu şekilde
karşılıklı çalışan moleküllerdir (Şekil 1.3) [9].
Şekil 1.3. Senesens mekanizmasının önemli molekülleri [9].
Sekretomdaki senesens mesajının, hücre içi senesens yolaklarını nasıl etkilediği önemli
bir konudur. Moleküler mekanizmanın tamamı oldukça karışık bir tablo oluşturur. Ancak
salgılanmış faktörler ile hücre içi senesens mekanizmasında rol oynayan iki kritik
molekül vardır [9].
Bunlar RB yolağı inhibitörleri INK4A ve INK4B’dir. INK4B senesens ile alakalı
salgılanmış faktörlerin potansiyel hedefidir. INK4B’nin ekpresyonu, TGF- β ve IL-6 gibi
senesens mekanizmasını uyaran faktörlerin varlığında artar. Bu faktörlerin azalmasıyla
INK4B’in de ifadesi azalır [9].
Sekretomdaki bazı faktörler de p53 yolağını etkiler. p53 tümör baskılayıcı protein
IGFBP3 ve IGFBP5 için sinyal hedefidir. TGF- β’nın p53 üzerinde etkisi yoktur. Bu
durum bu sitokin için önemli bir eksiklik teşkil eder [9].
Benzer durum p53’ün hedefi olan PAI1 içinde geçerlidir. Salgılanan faktörlerden IL-6
ve WNT2 ise, p53 yolağından bağımsız olarak çalışır. Tüm bu kanıtlar salgılanan
faktörler hücre içi senesens mekanizmasını kontrol eden INK4A-RB ve p53 yolaklarını
etkileyerek hücresel senesens mekanizmasının durumunu belirleyebilir [9].
9
1.2. Kök Hücre
Kök hücre hiyerarşik olarak çeşitli hücre tiplerine farklılaşma potansiyeli olan, bölünerek
kendini yenileme ve çoğalma potansiyeline sahip, çok hücreli canlıların doku ve
organlarını oluşturan temel hücrelerdir. Memelilerde kök hücrelerin iki yaygın tipi vardır.
Bunlardan birincisi embriyonun blastokist evresinde, iç hücre kitlesini oluşturan
embriyonik hücrelerdir. Bu hücrelere “pluripotent hücreler” adı verilir ve gelişmiş bir
organizmanın her tabakasında (mezodermal, endodermal ve ekdodermal) yer alan,
hücreleri ve dokuları oluşturabilme potansiyeline sahiptirler. Daha düşük dönüşme
potansiyeline sahip bir diğer kök hücre tipi ise; organizmanın her dokusunda yer alan
multipotent kök hücrelerdir. Multipotent kök hücreler, bulundukları dokunun onarımı ve
yenilenmesinde görev alırlar [13].
1.2.1. Mezenkimal Kök Hücre (MKH)
İlk olarak 1924 yılında Aleksander Maximow tarafından fark edilmiştir. Maximow, kanda
bulunan ve farklılaşma yeteneği olan bu hücrelere mezenkimal kök hücreler adını
vermiştir. 1960'lı yıllarda Ernest McCulloch ve James Till, mezenkimal kök hücre
araştırmalarını ilerleterek kültür ortamında çoğaltmayı başardılar. Mezenkimal kök
hücreler (MKH), çeşitli hücrelere farklılaşma yeteneği olan multipotent stromal kök
hücrelerdir. Mezenkimal kök hücreler, iskelet kası hücrelerini, kan, vasküler ve ürogenital
sistemi ve vücut bağ dokusunu meydana getiren, mezodermal orjinli primordiyal
hücrelerdir. Kemik doku, kıkırdak doku ve yağ doku gibi hücre çeşitlerine
farklılaşabilirler. Hematopoetik kökenli olmayan MKH’ler, hem mezenkimal hem de
mezenkimal olmayan hücre hatlarına farklılaşabilen, multipotent kök hücre benzeri
hücreler olarak değerlendirilmektedir. MKH’ler görevleri bakımından oldukça dikkat
çekicidir. Aslında MKH’ler mezenkimal dokulardaki farklılaşmanın yanı sıra
hematopoezisi destekler ve çok sayıda organ ve dokunun homeostatik dengesinin
korunmasında görev alır. Bulundukları dokudan ayrılıp hasarlı olan dokulara geçerek
hasarlı dokunun tamirini yaparlar [3].
1.2.1.1. Mezenkimal Kök Hücre Elde Edilen Dokular
Mezenkimal kök hücrelerin elde edildiği, kemik iliği, yağ doku, diş pulpası göbek
kordonu gibi çeşitli dokular vardır. Bu doku çeşitlerinden en çok kullanılanlar yağ doku
ve kemik iliğidir.
10
Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler uzun zamandır bilinen ve tıpta tedavi
amaçlı kullanılan hücrelerdir. Uyluk kemiği gibi büyük kemiklerin iç boşluğunda bulunan
ilik alınıp çeşitli yöntemlerle mezenkimal kök hücreler izole edilir ve kültüre edilir.
Kemik iliği kaynaklı MKH’ler fibroblast benzeri bir morfolojiye sahiptir [14].
Yağ doku mezenkimal kök hücre izolasyonu için uygun olan bir diğer dokudur. Hatta
MKH elde edilen dokular arasında en zengin kaynaktır. 1 gram yağ dokuda, 1 gram kemik
iliğine oranla 500 kat daha fazla kök hücre bulunabilir [14].
Bir diğer MKH kaynağı ise diş pulpasıdır. Dişin kemik tabakası kırıldıktan sonra içinden
çıkan öz kısmı önce fiziksel daha sonra enzimatik olarak parçalanır ve kültüre edilir.
Ancak elde edilen kök hücre sayısı yağ doku ve kemik iliğine göre çok daha azdır.
MKH izolasyonunda genellikle yağ doku ve kemik iliği gibi kaynaklar kullanılsa da,
göbek kordonundan da MKH elde edilebilmektedir. En genç ve ilkel MKH’ler göbek
kordonunun Wharton Peltesi (WP) adı verilen jelatinsi kısmından izole edilir. Göbek bağı
doğumdan sonra kolaylıkla alınıp bu hücrelerin kültürü yapılabilmektedir. Göbek
kordonunun bu kısmı benzersiz bir MKH populasyonu içerir. Bu MKH’lerin bağışıklık
ve kök hücre özellikleri yetişkin dokulardaki kök hücrelere kıyasla daha güçlü bir şekilde
ifade edilir [14]. Göbek kordonunun WP bölümünden elde edilen MKH’ler, kemik iliği
ve yağ doku gibi yetişkin dokulardan elde edilen MKH’lere oranla proliferasyon
özelliğine ve daha fazla immün-baskılayıcı özelliğe sahiptir. Ayrıca bu hücreler, terapötik
olarak daha aktiftirler [15].
Bütün bu bahsedilen MKH kaynakları dışında, MKH’ler deri, kas, amniyotik membran,
saç folikülleri, karaciğer, pankreas gibi birçok organ ve dokudan elde edilebilir [14].
1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücre Karakteristik Özellikleri
1.2.1.2.1. Morfoloji
Mezenkimal kök hücreler, kültür ortamında plastik yüzeye tutunan hücrelerdir. Uzun ve
ince fibroblast benzeri bir yapı veya düz yassılaşmış olmak üzere iki tip morfoloji
gösterebilirler [3]. Hücrelerin morfolojisi izole edildikleri doku ve organizmaya göre
farklılık gösterebilir. Hücreler genellikle kromatin partikülleriyle çevrelenmiş bir
çekirdek içerir. Hücrenin geri kalan kısmı; golgi aygıtı, endoplazmik retikulum,
mitokondri ve poliribozomlar ihtiva eder [16].
11
1.2.1.2.2. Yüzey Belirteçleri
Mezenkimal kök hücrelerin karakterizasyonu genellikle yüzey belirteçleri ile karakterize
edilir. MKH’ler için pozitif yüzey belirteçlerinden bazıları CD44, CD71, CD90 ve
CD105’tir. Karakterizasyon için sık kullanılan negatif yüzey belirteçleri ise CD34, CD45,
CD104 ve CD106’dır. Yüzey belirteçlerin iki farklı metot ile belirlenir. Bunlardan ilki
immunositokimyasal boyamadır. Bu yöntemde fikse edilmiş hücreler, yüzey
belirteçlerine bağlanan antibadiler ile boyanıp mikroskop altında incelenir. İkinci yöntem
ise akım sitometri cihazında (FACS), yüzey belirteçleri, antibadilerle boyanmış
hücrelerin incelenmesidir [4].
1.2.1.2.3. Farklılaşma Kapasiteleri
Kültür ortamında MKH’ler kolaylıkla farklı hücrelere farklılaşabilirler. Örneğin fare
mezenkimal kök hücreleri deksametazon, askorbik asit ve β-gliserofosfat varlığında
kemik doku hücrelerine, amfoterisin-b varlığında kas hücrelerine farklılaşırlar. İnsan
mezenkimal kök hücreleri deksametazon, insülin ve indometasin varlığında yağ
hücrelerine, TGF-β3 varlığında, 3 boyutlu kültürde kıkırdak doku hücrelerine
farklılaşırlar. Yine insan mezenkimal kök hücreleri izobütilmetilksantin ve dibütilsiklikamp varlığında nöron benzeri hücrelere farklılaşırlar [3].
Mezenkimal hücreler farklılaştıktan sonra, Alkalin fosfataz, Alizarin Red, Oil Red ve Von
Kossa gibi boyama metotları ile farklılaşmaları belirlenebilir [3].
1.2.1.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Parakrin Etkisi
Parakrin sinyal iletimi, bir hücrenin salgıladığı sinyal molekülünün kendi mikro
çevresinde bulunan hücreler etki etmesidir. Özellikle çok hücreli organizmalarda gelişimi
düzenleyen birçok büyüme faktörü kısa mesafede etkilidir, dolayısıyla parakrin sinyal
iletimi sayesinde taşınır. Bu sinyaller, sinyalin üretildiği hücreden uzaklara yayılmak
suretiyle bir yoğunluk gradiyenti oluşturur ve hedef hücrenin uzaklığına bağlı olarak
farklı hücresel yanıtlar uyarır. Mezenkimal kök hücreler de birçok işi sekrete ettikleri
aktif moleküller sayesinde gerçekleştirirler. Yapılan araştırmalar MKH’lerin doku
onarımı üzerinde etkili olduğunu desteklemektedir ve bu hücrelerin tümör büyümesini
teşvik edici etkilerinin dolaylı olarak parakrin aktivitelerine bağlı olduğu kabul
edilmektedir [17]. Bunun yanı sıra son çalışmalar MKH’lerin doku onarımı için önemli
12
olabilecek faktörleri salgılayarak dokuyu değiştirebileceğini öne sürmektedir. Örneğin
immünyetmezliği olan akut miyokardial infarktüs geçirmiş farelere insan MKH’leri
verildiğinde, enjeksiyondan sonra 3 hafta süresince donör hücrelere rastlanmamasına
rağmen, farelerin kalp fonksiyonlarında iyileşmeler görülmüştür [18]. Ayrıca
osteogenezite problemi olan ve MKH tedavisi alan çocukların büyüme hızı, kemik
mineral yoğunluğu ve hareket etmelerinde önemli iyileşmeler tespit edilmiştir [19].
Hasarlı dokunun tamirinin, dolaşıma katılan MKH’ler tarafından yapıldığının tespiti yeni
fark edilmiş bir durumdur. Bu MKH’ler hasarlı bölgenin iyileştirilmesi için, dokuya özgü
kök hücreleri etkileyecek büyüme faktörlerini salgılar [20]. MKH’lerin tüm bu onarıcı
fonksiyonlarının yanında, organizma için bazı dezavantajları da mevcuttur. MKH’ler
tümör hücresini, endotelyal hücreleri ve düz kas hücrelerini etkileyecek büyüme
faktörleri üreterek veya VEGF, PDGF, bFGF, SDF-1 gibi anjiojenik büyüme faktörlerini
salgılayarak tümör dokusuna damar sağlayabilir [21]. Yapılan son çalışmalar MKH ve
bu hücreden türevlenen hücre tiplerinin, karsinoma hücre davranışına ait kritik
belirteçlerinden biri olan prostaglandin E(2) ve sitokinleri açığa çıkarma yeteneği
sayesinde tümörün ilerlemesine imkan sağlayan bir kanser kök hücre nişi meydana
getirebildiklerini göstermiştir [22].
1.2.1.3. Mezenkimal Kök Hücrelerin Tıpta Kullanımı
Mezenkimal kök hücreler yetişkin kök hücrelerin, klinik uygulamalarda çeşitli doku
mühendisliği uygulamalarında ümit vadeden benzersiz bir türüdür. Bu hücreler insan
vücudunun çeşitli yerlerinden, özellikle kemik iliği ve yağ dokudan kolayca izole
edilebilir [23].
Gerektiğinde bulundukları dokudan ayrılıp, hasarlı dokuya hareket ederek, bu dokunun
tamirini, salgıladıkları faktörler ile gerçekleştirebilirler, hatta yüksek farklılaşma
potansiyelleri ile dokudaki hücrelere farklılaşarak yapıya katkıda bulunurlar [23].
MKH’lerin tüm bu özellikleri, bu hücrelerin tıpta ve doku mühendisliğinde önemli bir
araç olmasını sağlamaktadır. MKH’ler hastalara intravenöz enjeksiyon ile veya hasarlı
dokuya direkt enjeksiyon ile verilebilir. MKH’ler; GVHD, lösemi gibi birçok sistemik
veya onkojenik hastalığın yanı sıra, ortopedik rahatsızlıklarda da hastaya uygulanabilir.
Hastaya uygulanacak MKH’ler izole steril ortamlarda üretilir, kalite kontrol ve
mikrobiyolojik testleri yapıldıktan sonra hastaya verilir.
13
1.3. Kanser
Hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını kontrol eden mekanizmalarda meydana gelen
hasar sonucunda, hücrelerin kontrolsüz bir biçimde çoğalması olayına kanser denir.
Dünyada her yıl 100.000 insandan 100-350’si kanser yüzünden hayatını kaybetmektedir
[13].
Hücrenin gelişimi boyunca karmaşık genetik kontrol sistemleri, hücre oluşumu ve ölümü
arasındaki dengeyi sağlar. Organizmadaki bazı hücre tipleri, doku yenileme stratejisi
olarak, bölünme ve çoğalma yolunu izlerler. Bu hücreler belli bir süre yaşadıktan sonra
ölür ve kaybolurlar. Sıklıkla bölünen ve çoğalan hücrelerdeki kontrol mekanizmalarının
bozulması tümör oluşumuna neden olmaktadır [13].
Genetik kontrol mekanizmalarının bozulması genellikle kimyasallar, hormonlar, viral ve
iyonize radyasyon gibi etkenler aracılığıyla olur. Bu tür etkenler ile DNA’da oluşan hasar,
tamir mekanizmaları tarafından düzeltilmez ise hücreler neoplastik dönüşüme uğrar.
Kanserleşme iki geniş gen gurubundaki mutasyonlar ile ilişkilidir. Bunlar protoonkogenler ve tümör baskılayıcı genlerdir. Proto-onkogenler, normalde hücre
büyümesini teşvik eden genlerdir. Bu genlerde meydana gelen mutasyonlar genin
onkogen’e dönüşmesine ve gen ürününün aşırı şekilde ifade edilmesine sebep olur.
Tümör baskılayıcı genler ise büyümeyi sınırlandıran genlerdir. Bu genlerde meydana
gelen mutasyonlar, genin baskılayıcı özelliğini kaldırır ve olağan dışı hücre bölünmesinin
önü açılmış olur. Örneğin; insan tümör hücrelerinin yarısında, transkripsiyonel
düzenleme için anahtar rol oynayan bir proteini kodlayan p53 tümör baskılayıcı geni
mutasyona uğramıştır. Hücre döngüsünün kontrolünde G1 fazı önemli bir kontrol
noktasıdır. Bu aşamada hasarlı DNA’ya sahip hücreler S fazına geçemezler. DNA’sında
hasar bulunan hücrelerin G1 fazında kalmasını p53 proteini sağlar. Kanser ile ilgili bir
diğer gen grubu ise koruyucu genlerdir [13].
Kanserin genetik temelinde daha önce bahsettiğimiz genlerde meydana gelen
mutasyonlar vardır. Proto-onkogenleri onkogenlere dönüştüren kazandırıcı mutasyonlar
bunlara örnektir. Bu mutasyonların oluşumunda dört farklı mekanizma bilinmektedir. Bu
mekanizmalardan ilki aktif veya hiperaktif protein ürünü oluşmasına sebep olan nokta
mutasyonlarıdır. Diğeri kromozomal yer değiştirmelerdir. Bir diğeri büyüme düzenleyici
bir genin farklı bir genin promotoru altına girmesine sebep olan yer değiştirmelerdir. Bu
14
mutasyon genin aşırı şekilde ifade edilmesine neden olur. Sonuncu mekanizma ise bu
proto-onkogenlerin kopyasının oluşmasıdır [13].
Bazı virüsler genomlarında onkogenler içerir ve bu onkogenlerin enfekte ettiği canlının
genomuma girmesini sağlayarak kanser oluşturabilirler. Virüsler var olan protoonkogenleri de aktifleştirebilirler [13].
Tümör baskılayıcı genlerdeki fonksiyon kaybı mutasyonları da kanser oluşumuna neden
olur. Hücre bölünmesinin kontrol dışına çıkmasını engelleyen bu genlerin ürettiği
proteinlerden en önemlileri şunlardır;

Hücre döngüsünü düzenleyen hücre içi proteinler; p16 ve Rb

Hücre çoğalmasını inhibe eden, reseptörler ya da sinyal değiştiriciler; TGF-β

DNA’nın hasarlı olduğu ya da anormal kromozomların olduğu durumlarda, hücre
döngüsünü durduran, kontrol noktası proteinleri; p53

Apoptozu ilerleten proteinler

Koruyucu genler tarafından kodlanan, DNA tamirinde görevli olan enzimler.
Oksidatif strese sebep olan serbest radikaller, kimyasal ajanlar, virüsler, onkogenler ve
tümör baskılayıcı genlerde meydana gelen bozukluklar gibi iç ve dış etmenler oldukça
karmaşık olan kanser mekanizmasını aktifleştirir [13].
Tümör oluşumunu engelleyen senesens ve apoptoz mekanizmaları, organizmada her gün
oluşan yüzlerce hasarlı hücreyi ortadan kaldırarak dengenin bozulmasını engeller. Bu
çalışma ile farklı dokulara ait kanser hücrelerinin, kendileri ile aynı mikro çevreyi
paylaşan kök hücrelerin salgıladığı, senesens veya apoptoz mesajlarına nasıl tepki
verdiğini incelenecektir. Böylece dış faktörlerin neoblastik dönüşüme uğramış bir hücreyi
nasıl etkilediği sorularına yanıt verilmeye çalışılacaktır.
1.3.1. Meme Kanseri
Meme kanseri, meme hücrelerinden gelişen kanser türüdür. Dünya da en sık görülen
ikinci kanserdir. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre her 8 kadından biri meme
15
kanseri riski taşımaktadır. Erken tanı koyulan hastalarda yaşama şansı %95’tir. Her yıl
yaklaşık 45000 kadın meme kanserinden dolayı hayatını kaybetmektedir [24].
Meme kanseri gelişimin arttıran risk faktörleri arasına; obezite, fiziksel egzersiz azlığı,
alkol kullanımı, menapoz sırasında hormon tedavisi, ve iyonize radyasyon gibi bir çok
faktör dahil edilebilir. Geç çocuk sahibi olma veya hiç olmama da meme kanseri riskini
arttıran önemli bir faktördür [25].
BRCA1 ve BRCA2 genleri dahil olmak üzere bazı genler meme kanseri ile bağlantılıdır.
Vakaların yaklaşık %10’luk kısmına, bu hastalık genetik olarak miras kalmıştır. Bu
hastalar BRCA1 ve BRCA2 gen mutasyonu taşırlar. Bazı diğer genlerdeki mutasyonlar
da meme kanserine sebep olabilirler. Örneğin; p53 genindeki mutasyon SBLA (Sarcoma,
breast, leukaemia and adrenal gland) sendromuna sebep olabilir. Bu sendrom sonucunda
meme kanseri gelişebilir [26]. p53 tümör baskılayıcı bir gen olup p16 geni ile birlikte
senesens oluşumunda önemli role sahiptirler. ATM, STK1, PTEN gibi diğer mutasyonlar
da meme kanseri oluşumunda rol alabilirler. Araştırıcılar meme kanserinin genetik olarak
4 farklı tipinin bulunduğunu ve her tipinin farklı kanser türlerine yol açacak genetik
değişikliklerin göstergesi olduğunu belirtmektedirler [27].
Meme kanserinin tanısı genellikle kanserin etkilediği bölgeden biyopsi ile parça alınarak,
mikroskobik inceleme yapılması sonucu yapılmaktadır. Meme kanseri riski taşıyan
kadınların fiziksel olarak kendilerini kontrol etmeleri de önerilmektedir. Meme
kanserinin tedavisinde hastalığın evresine bağlı olarak farklı yöntemler kullanılır. Bu
yöntemlerden biri ameliyat ile kanserli dokunun uzaklaştırılmasıdır. Bir diğer tedavi
yöntemi ise; hormon terapisidir. Monoklonal antibadilerle bazı faktörlerin ifadesini
engelleyerek hücrelerin büyümesinin durdurulması da diğer bir tedavi yöntemidir. Diğer
kanser türlerinde olduğu gibi radyasyon ve kemoterapi de tedavi yöntemlerinden biridir
[28].
1.3.2. Kolon Kanseri
Kalın bağırsak, rektum ve apandistte görülen kanser türüdür. Kalın bağırsakta meydana
gelen adenom poliplerden oluşur. Dışkıda kan görülmesi, kilo kaybı ve aşırı yorgunluk
kolon kanserinin belirtilerinden bazılarıdır. Her yıl yaklaşık bir milyon insan kolon
kanserine yakalanmaktadır [24, 29].
16
Risk faktörleri arasında obezite, alkol kullanımı, aşırı kırmızı et tüketimi, yetersiz fiziksel
egzersiz ve sigara kullanımı başta gelmektedir. En sık görülen kanserler arasında üçüncü
sıradadır [24].
Kolon kanseri; Wnt sinyal yolağındaki mutasyonların sonucu neoplastik dönüşüme giden,
epitelyal hücrelerden köken almaktadır. Bu mutasyonlar ebeveynlerden bireye geçebilir
ve ya sonradan kazanılabilir. Bu kanser türünde en çok görülen mutasyon APC proteinini
üreten genin mutasyonudur. APC proteini β-katenin üretimini bloklayan proteindir. APC
geninde mutasyon olduğunda hücrede β-katenin birikimi başlar. β-katenin çekirdek
etrafında birikip DNA’ya bağlanır ve bazı transkripsiyon faktörlerini aktive ederek bazı
genlerin aşırı ifade edilmesine sebep olur. Böylece kanser oluşumuna sebep olur. Kolon
kanserinde TGF- β ve DCC (Deleted in Colorectal Cancer) aralarında olduğu diğer
faktörler de etkilidir. TP53 mutasyonu ile p53 yolağının inaktivasyonu da kolon
kanserinde ki bir diğer kritik durumdur [30, 31].
Kolon kanserinde epigenetik değişiklikler genetik mutasyonlara göre daha fazladır.
Vogelstein ve arkadaşları tarafından “sürücü” olarak tanımlanan birkaç onkogen
mutasyonu ve tümör baskılayıcı gen mutasyonunun yanında 60’a yakın “ yolcu” olarak
tanımladıkları mutasyon belirlenmiştir. Kolon kanserindeki epigenetik değişiklikler
yüzlerce geni etkileyebilir. Örneğin 20-25 nükleotit uzunluğundaki, miRNA olarak
isimledirilen küçük RNA tipleri, protein kodlamamalarına rağmen, protein kodlayan
genlerin ifadesini azaltabilirler. miRNA’ların ifadesi de epigenetik olarak değişmiş
olabilir.
Kolon kanserinde miR-137’yi kodlayan DNA sekansının Guanin-Sitozin
adalarındaki (CpG) metilasyon, genin ifadesini azaltır. Bu durum kolon kanserinde sık
görülen bir olaydır ve kolon kanserlerinin %81’inde görülmektedir. miR-137 500 geni
etkileyebilir [30, 32].
Kolon kanserinin tanısı, kolonoskopi, bilgisayarlı tomografi veya lezyon bulunan
bölgeden örnek alınması ile yapılır. Pozitron emisyon tomografisi veya Magnetik
rezonans görüntüleme metotları da, bazı kritik vakalarda kullanılan görüntüleme
metotlarıdır [29].
Tedavi yöntemlerinin başında, kalın bağırsaktaki kanserli bölgenin operasyon ile
uzaklaştırılması gelmektedirErken safha kolon kanserlerinde genellikle kemoterapi
17
önerilir. Kolon kanseri hastalarına radyasyon tedavisi ve hastalığın ilerlemesini
durdurmayı amaçlayan hafifletici tedaviler de uygulanmaktadır [29].
1.3.3. Kronik Myeloid Lösemi
Lösemi; beyaz kan hücrelerinin anormal şekilde çoğalması ile kendini gösteren bir
hastalıktır. Çok sayıdaki kanser hücresinin, ilikteki normal hücrelerin yerini almasıyla,
kan pulcukları ve lökositlerin sayısında azalma meydana gelir. Bu durumda hasta
potansiyel enfeksiyonlara karşı savunmasız kalır. Sonraki aşamalarda alyuvarların
sayısında azalamaya ve solunum yetmezliğine sebep olabilir. Löseminin genel belirtileri;
yorgunluk, ateş ve bazı nörolojik bozukluklardır. Dalak ve karaciğerde büyüme
gözlenebilir. Birçok vakada hastalarda hiçbir belirti gözlenmez. Hastalık rutin laboratuar
testleri sırasında tesadüfen bulunabilir [33].
Kronik Myeloid Lösemi; genellikle yetişkinlerde görülen beyaz kan hücresi kanseridir.
Bu hastalık aşırı büyümüş ve çoğalmış myeloid hücreler ile karakterize olur. Philadelphia
kromozomu olarak adlandırılan kromozomdaki translokasyon sonucu, granulositleri
oluşturan kemik iliği kök hücrelerinde meydana gelen bozukluk KML’ye sebep
olmaktadır. Tirozin kinaz inhibitörü ilaçlarla tedavi edilmektedir. Ancak kanserli hücreler
uzun vadede ilaçlara karşı direnç kazanmaktadır [34].
KML erkekler arasında kadınlara oranla daha yaygındır. İyonize radyasyona maruz
kalmak en önemli risk faktörüdür. Hiroşima ve Nagasaki’de atom bombası
patlamalarından sonra hayatta kalanlarda lösemi oranı yüksektir. Hastalık patlamalardan
yaklaşık 10 yıl sonra büyük bir artış göstermiştir [34].
KML; philadelphia kromozomu olarak bilinen kromozomdaki translokasyondan
kaynaklanan genetik bir bozukluktur. 9. ve 22. kromozomların parçaları KML
hastalarında yer değiştirmiştir. Bu yer değiştirmenin sonucu 22. kromozomdan BCR geni
9. kromozomdan ABL geni ile birleşir. Kromozom parçalarının anormal birleşmesi ile
oluşan BCR-ABL geni bir protein kodlar. BCR-ABL proteini olarak isimlendirilen bu
protein interlökin-3 reseptörünün (CD123) beta alt ünitesi ile etkileşime girer. Hücre
döngüsünü kontrol eden kaskad proteinlerini aktive ederek hücre döngüsünü hızlandırır.
Dahası BCR-ABL, DNA hasar tamir mekanizmalarını inhibe eder. Bu durum daha
karmaşık genetik bozukluklara yol açar [34].
18
KML tanısı genellikle kan sayımını ile yapılmaktadır. KML’de granülositlerin tüm
tiplerinin sayısında artış beklenir. Hastalığın tanısında kemik iliği biyopsisi de sık
kullanılan bir metottur. Philadelphia kromozom’nun var olup olmadığın belirlemek için
sitogenetik yöntemler kullanılabilir. BCR-ABL füzyon geninin var olup olmadığını
belirlemek amacıyla Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ya da flüoresans in situ
hibridizasyon (FISH) yöntemleri kullanılabilir [34].
KML tedavisinde geçmişte; hidroksiüre, alkilleyici ajanlar, interferon alfa 2b, steroidler
kullanılmıştır. Bu tedavi gereçleri 2000’li yıllarda yerini tirozin kinaz inhibitörlerine
bırakmışlardır. Bu inhibitörler BCR-ABL proteinini hedef almaktadır. Bu yeni nesil
ilaçların ilki Imatinib’dir. Ancak hastaların bir bölümünde kanser hücreleri Imatinib’e
karşı direnç gelişmiştir [35].
Imatinib direncinin üstesinden gelmek için iki ilaç geliştirilmiştir. Bunlardan biri birçok
onkojenik proteini bloklayan ve BCR-ABL proteinin kısmen inhibe eden Dasatinib’tir.
Diğeri ise 2010 yılında geliştirilen Nilotinib’tir. Ancak bu iki ilaçta tam olarak direnç
mekanizmasının üstesinden gelememiştir. İlaç direncinin moleküler mekanizması
incelendiğine, BCR-ABL’in yapısında T315I olarak bilinen kısmi bir mutasyon
görülmektedir. [35, 36].
1.3.4. Çalışmada Kullanılan Hücre Hatları
1.3.4.1. MCF-7 (İnsan Meme Kanseri Hücre Hattı)
Meme bezlerinde oluşan adenokarsinomdur. İlk olarak 1970 yılında 69 yaşındaki Kafkas
kökenli bir kadından izole edilmiştir. Epitelyal kökenli, plastik yüzeye yapışan
hücrelerdir. Bu hücrelerde WNT7B onkogeninin ve IGFBP -2, IGFBP-4 ve IGFBP-5
(insülin benzeri büyüme faktörü bağlanma proteini) genlerinin ifadesi fazladır. MCF7’ların büyümeleri tümör nekroz faktör alfa ile inhibe edilir [37].
1.3.4.2. DLD-1 (İnsan Kolon Kanseri Hücre Hattı)
Epitelyal kökenli, plastik yüzeye tutunan hücrelerdir. Kalın bağırsakta oluşan
adenokarsinomlardan izole edilmiştir. D.L. Dexter tarafından ilk olarak 1977’de izole
edilmiştir. DLD-1 hücreleri önemli bir tümör baskılayıcı olan p53 antijen ifadesi
açısından pozitiftir. Ancak aminoasit dizisini 241. pozisyonunda değişikliğe neden olan
bir nokta mutasyonu içermektedir [38] .
19
1.3.4.3. K562 (İnsan Kronik Myeloid Lösemi Hücre Hattı)
İlk olarak 53 yaşında bir kadından izole edilmiştir. Lenfoblastik morfolojiye sahip, kemik
iliği kökenli hücrelerdir. K562 hücreleri kültür kabına tutunmayan yüzücü hücrelerdir
[39]. Bu hücreler kendiliğinden diğer granülosit tiplerine farklılaşma özelliğine sahiptir.
K562’ler BCR-ABL füzyon genini bulundurur. Bazı çalışmalara BCR-ABL proteininin
yüzey tutunma moleküllerinin ifadesini azalttığından, bu hücrelerin plastik yüzeye
tutunma özellikleri olmadığını belirtse de, bir takım araştırmalar tam tersine BCRABL’in aşırı ifade edilmesi, hücrelerin plastik yüzeye tutunma kapasitelerini arttırdığını
göstermektedir [40].
1.4. Hücre Kültürü
Bir dokunun mekanik, kimyasal ve/veya enzimatik yöntemler ile parçalanıp bağımsız
hücrelerinin izole edilerek, bu hücrelerin in vitro koşullarda yaşatılmasına hücre kültürü
denir [41].
İn vitro koşullarda kültüre edilen hücreler, in vivo koşullardaki özelliklerini göstermeye
devam ederler. Böylece bir canlıya ait hücrelerin farklı koşullara, kimyasallara veya
ilaçlara nasıl tepki vereceği hakkında, canlı dışında yapılan deneylerle cevap verilebilir
[13]. Ayrıca hücre biyolojisi araştırmaları için kültüre edilmiş hücreler, kontrol edilebilir
olduğundan ve homojen popülasyon ile çalışmaya olanak sağladığından tam
organizmalara kıyasla daha çok avantaja sahiptirler. Hücre kültürünün, deneysel önemine
ek olarak, kök hücre olarak tanımlanan ve hastalık tedavisinde veya hasarlı dokuların
onarımında önem arz eden hücrelerin, canlı dışında yüksek miktarlarda üretilip hastaya
verilmesi açısından da büyük önemi vardır [41].
1.4.1. Hücre Kültürünün Tarihçesi
Hücre kültürü çalışmaları 20. Yüzyılın başlarında, sistemik varyasyonlardan bağımsız
deneyler yapmak için tekniklerin geliştirilmesiyle ortaya çıkmıştır. 1907 yılında Ross
Harrison, kurbağa embriyosundan aldığı doku parçalarını kültüre etmiş ve üstelik sinir
fibrillerini de yaşatmayı başarmıştır. Harrison büyük ihtimalle soğuk kanlı bir canlı
olduğundan ve inkübasyon gerektirmediğinden kurbağayı tercih etmiştir. 1912’de Carrel
ve Burrows izole ettikleri kalp kas hücrelerini 3 hafta boyunca kasılıp gevşeyebilecek
şekilde kültüre etmişlerdir. Yine Carrel 1923’te fibroblastik hücreleri kültüre etmiştir.
20
1952 yılında Dulbecco kültüre edilen hücreleri pasajlamak için tripsin kullanmaya
başlamıştır. 1991 yılında Caplan yetişkin mezenkimal kök hücreleri kültüre etmiştir.
Thompson 1998 yılında insan embriyonik hücrelerini kültüre etmiştir. 2007 yılında
Shinya Yamanaka belirlediği transkripsiyon faktörleri ile hücreleri transfekte ederek,
somatik bir hücreden indüklenmiş pluripotent kök hücre elde etmeyi başarmıştır [42]. Bu
çalışmalarla birlikte hücre kültürü çalışmalarını bugünkü haline getiren pek çok araştırma
yapılmıştır[41].
1.4.2. Hücre Kültürü İçin Gerekli Ekipmanlar
Hücre kültürü diğer biyolojik deneylerin gerçekleştirildiği ortamlarda yapılamaz. Hücre
kültüründe işlemlerin yapıldığı steril bir ortam ve hazırlık alanı olmalıdır. Hücre kültürü
yapılacak alanın büyüklüğü ve bu alanda çalışan kişi sayısı da önemlidir. Diğer taraftan
hücre kültürü malzemelerinin depolanacağı alan da önem arz etmektedir.
Hücre kültürünü laboratuarının temel ekipmanları steril kabin, hücrelerin yaşaması için
gerekli olan %5 CO2 ve 37 OC’lik ortamı sağlayan karbondioksit inkübatörü, kültür
kabının tabanına yapışmış olan hücreleri görebilmek için gerekli olan invert mikroskop,
hücre yıkama sırasında kullanılan santrifüj, uzun vadeli hücre saklamada kullanılan azot
tankı, kültür malzemelerinin saklanmasında kullanılan +4OC soğutucu, -20 OC ve -80 OC
derece dondurucu en temel hücre kültürü laboratuarı ekipmanlarıdır.
1.4.3. Hücre Kültürü Kimyasalları
1.4.3.1. Mediumlar
Mediumlar hücrelerin yaşaması için gerekli olan besiyerleridir. Hücreler bu besiyerleri
içerisinde askıda, yüzerek yaşayabilir ya da kültür kabının tabanına tutunan hücrelerin
üstü bu besiyerleri ile kaplanarak hücrelerin beslenmesi sağlanır.
Hücrelerin kültüre edilmesinde mediumların hidrojen iyonu konsantrasyonu önemlidir.
Hücreler genellikle pH:7.4’te yaşarlar. Mediumlar içerisinde pH indikatörü olarak fenol
kırmızısı kullanılır. Medium pH’sının artıp azalmasına göre fenol kırmızısı mediumun
rengini değiştirir. Asidik pH’da medium rengi sarıya yaklaşır. Bazik pH’da ise medium
koyu kırmızı, pembe bir renk alır [41].
21
Mediumlarda diğer önemli birleşenler ise CO2, NaHCO3 ve HEPES’tir. Karbondioksit
medium içerisinde gaz halde iken çözünür. Medium içerisinde laktik asitin birikmesi
sonucu pH düşer. Ortamın pH’dengesini korumak adına medium içerine bu birleşenler
eklenir. HEPES bunlar arasında en çok kullanılan tampon birleşenlerden biridirdir.
Mediumun oksijen yoğunluğu bir diğer önemli kriterdir. Ancak oksijenin medium
içersindeki yoğunluğu farklı hücre tiplerinde farklı etkiler yapar.
Hücre kültürü mediumlarının sıcaklıkları, hücreleri etkileyen önemli bir unsurdur.
Memeli hücreleri genellikle -196OC’de donmuş olarak saklanabilirler. +4OC’de birkaç
gün canlılıklarını koruyabilirler. Memeli hücreleri için en uygun kültür sıcaklığı
37OC’dir. Hücre kültüründe kullanılan mediumlar soğutucularda saklandığından,
hücrelerin üzerine koyulmadan önce sıcaklıklarının bu sıcaklığa yaklaştırılması
kültürdeki hücrelerin canlılığı açısından önem arz etmektedir [41].
1.4.3.1.1. Medium İçeriğindeki Maddeler
1.4.3.1.1.1. Tuzlar
Tuzlar mediumun osmolaritesine katkıda bulunan birleşendir. Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-,
SO42-, PO43-, HCO3- mediumların içeriğinde bulunan tuzlardan bazılarıdır. Bu tuzlardan
özellikle Ca2+ hücre-hücre etkileşiminde önemli rol oynadığından dolayı, hücrelerin
büyüme gelişmesinde önemli bir role sahiptir [41].
1.4.3.1.1.2. Vitaminler
B grubu vitaminler, folik asit, inositol, biotin, nikotinamit, A, D, E, K vitaminleri hücre
külütürü mediumlarında bulunan vitaminlerdir. Bu vitaminlerin hücre metabolizasında
önemli yeri olduğundan, besi yeri içerisindeki konsantrasyonu hayati öneme sahiptir [41].
1.4.3.1.1.3. Glukoz
Glukoz bilindiği üzere hücresel anlamda temel enerji kaynağıdır. Mediumlar içersinde
farklı konsantrasyonlarda bulunur. Hücre tipine göre farklı glukoz yoğunluğu olan
mediumlar kullanılır [41].
22
1.4.3.1.2. Medium İçeriğine Dahil Edilen Diğer Maddeler
1.4.3.1.2.1. Serum
Serumlar büyüme faktörleri ihtiva ettiğinden hücrelerin büyümesini ve gelişmesini
desteklerler. Hücre tipine ve fizyolojik durumuna göre farklı oranlarda mediuma eklenir.
Serumlar genellikle büyükbaş hayvanlardan, atlardan veya insanlardan elde edilebilir
[41].
1.4.3.1.2.2. Aminoasitler
Aminoasitler hücrelerin yaşaması ve büyümesinde önemli rolü olan maddelerdir.
Aminoasitler bazal mediumların içinde bulunabileceği gibi sonradan da eklenebilirler. En
çok kullanılan aminoasit glutamindir. Glutamin yarı ömrü kısa olan bir aminoasit
olduğundan uzun süre kullanılmayan mediumlara eklemek gerekebilir [41].
1.4.3.1.2.3. Antibiyotikler
İn vitro hücre kültüründe hücreler doğal ortamından uzakta, bir bağışıklık sistemi
tarafından koruma altından olmadığından, kültürün aseptik koşullarda yapılması ve
besiyerinin steril olması önem arz etmektedir. Bakteri ve fungus kontaminasyonundan
hücreleri korumak amacıyla hücre kültürü mediumlarına antibiyotikler eklenir. Sıklıkla
kullanılan antibiyotikler; penisilin, streptomisin, gentamisin ve amfoterisin’dir [41].
1.4.3.1.2.4. Hormonlar ve Büyüme Faktörleri
Büyüme faktörleri hücre kültürü mediumlarına eklenen bir diğer malzemelerdir. Hücre
kültüründe sıklıkla kullanılmazlar ancak bazı hücrelerin büyümesini ve gelişmesini
desteklemek için mediuma eklenebilirler. b-FGF ve EGF en sık kullanılan büyüme
faktörleridir [41].
1.4.3.2. PBS (Fosfatla Tamponlanmış Tuz Çözeltisi)
PBS hücre kültüründe, genellikle yıkama işlemleri sırasında kullanılır. Tripsinizasyondan
önce hücrelerin üzerinde bulunan serum artıklarını uzaklaştırmak, tripsinizasyondan
sonra ise hücre solüsyonunda bulunan tripsini seyreltmek için kullanılır. Hücre
kültüründe kullanılan iki tipi vardır. İlki kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS’tir. Bu
PBS yıkama işlemleri sırasında kullanılır. Diğeri ise kalsiyum ve magnezyum içeren
PBS’tir. Bu PBS hücre izolasyonu sırasında kollajenaz enzimi ile birlikte kullanılır.
23
Yıkama işlemlerinde kalsiyum ve magnezyum gibi +2 değerlikli iyon içeren PBS
kullanılmaz. Bunu sebebi tripsin enziminin kalsiyum ve magnezyum varlığında
çalışmamasıdır [41].
1.4.3.3. Tripsin
Plastik yüzeye tutunan hücreleri, tutundukları yüzeyden ayırmak için kullanılan bir
enzimdir. Tripsin ile hücrelerin temas ettiği süre önemlidir. Bu süre fazla uzun tutulursa,
membran yüzeyinde bulunan protein yapılar parçalanır. Bu durum hücrenin plastik
yüzeye tutunmasını ve dolayısıyla canlılığını etkiler. Tripsin enzimin durdurmak için
tripsin inhibitörü ya da bol miktarda protein içeren bir bileşen olan serum (FBS vb.)
kullanılır [41].
1.5. Testler
1.5.1. Testler Senesense Bağlı Beta-Galaktozidaz Aktivitesi Tespiti
Bu çalışmada senesent hücreleri belirlemek amacıyla beta-galaktozidaz (β-gal)
boyamasından yararlanılmıştır. Senesent hücrelerin karakteristik özelliklerinden biri de
lizozomal enzimlerin artmasıyla, lizozom miktarındaki artıştır. β-gal’de bu enzimlerden
biridir. Senesense bağlı β-gal aktivitesi pH:6’da gözlenebilen ve kültürdeki senesent
memeli hücrelerini belirlemeye yarayan sitokimyasal bir boyama metodudur. Bu metotta
β-gal ile tepkimeye girdiğinde çözünemeyen mavi renkte ürün oluşturan bir substrat olan
X-gal kullanılır. Glutaraldehit ile fikse edilen hücreler boyama solüsyonu içinde inkübe
edilerek, senesent hücrelerde mavi renk oluşumu gözlenir [11].
1.5.2. Apoptoz Testi
Bu çalışmada farklı durumlardaki MKH’lerden toplanmış olan koşullandırılmış
besiyerinin hücrelerde apoptoz oranını ne ölçüde değiştireceğini bulmak için Muse Cell
Analyzer cihazına ait Annexin V/Dead Cell kiti kullanılmıştır. Annexin V; hücre
yüzeyinde bulunan ve apoptoz veya hücre ölümü gibi durumlarda kanıt olarak gösterilen
fosfatidilserin (PS) ve fosfatidiletanolamin (PE) moleküllerini belirlemeye yarayan bir
işaretçidir [43]. Ayrıca bu kitin içinde ölü hücreleri boyamayan yarayan 7-AAD boyası
vardır. 7-AAD hasarlı fosfolipid zardan geçip DNA’ya bağlanan bir moleküldür. Mikro
santrifüj tüpünde bulunan hücreler Annexin ile muamele edilip akım sitometri temelli bir
cihaz olan Muse Cell Analyzer’da incelenmiş ve apoptoz yüzdesi belirlenir.
24
1.5.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi
Mitokondri bilindiği üzere hücrenin enerji ihtiyacını karşılayan önemli bir organeldir.
Ayrıca serbest radikallerin en çok bulunduğu organeldir. Buna ilave olarak mitokondri
hücre ölümü ve apoptoz mekanizmasının önemli bileşenlerini de içerir. Mitokondri bu
bileşenlerin değişimine karşı oldukça hassastır [44]. Mitokondriyal solunum sırasında,
mitokondri zarı boyunca enerji birikimi meydana gelir ve bu enerji birikimi ATP
üretiminde önemli olan mitokondriyal trans-membran potansiyelini meydana getirir.
Apoptoz ve nekrotik hücre ölümünde mitokondriyal membran potansiyelinde
değişiklikler gözlenir [45]. Mitokondriyal iç membranın depolarizasyonu, mitokondri
fonksiyon bozukluğunun ve apoptozun güvenilir bir göstergesidir. Bu sebepten dolayı,
çalışmada yapılan bir diğer test ise mitokondri membran potansiyeli testidir. Üretici
firmanın MitoPotential (Muse-Millipore) boyası iç membran ile etkileşime geçtiğinde;
eğer membran potansiyeli yüksek ise, boya da yüksek bir flüoresan ışıma yapar. Membran
potansiyeli düşükse, yani membran depolarize durumda ise, flüoresan ışımanın miktarı
az olur. Flüorsan ışıma yapan bu boyanın yanı sıra 7-amino aktinomisin D (7-AAD) bu
testte kullanılmıştır. 7-AAD hücre zarını bütünlüğü bozulduğunda sitozole giren ve
dolayısıyla ölü veya apoptotik hücreleri boyayan bir maddedir. Bu test; mitokondri
potansiyeli ölü ve canlı hücrelerde karşılaştırmaya imkan sağlar [46]. Hücreler bu boyalar
ile inkübe edildikten sonra Muse Cell Analyzer’da incenir.
1.5.4. Proliferasyon Testi
Bu çalışmada hücrelerin proliferasyon potansiyellerini belirlemek amacıyla MTT testi
kullanılmıştır. Bu test temel olarak 96 kuyucuklu plaklara ekilmiş hücrelerin üzerine belli
zaman aralıklarında 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliumbromid (MTT)
olarak adlandırılan kimyasalın eklenmesi ve canlı hücrelerin bu maddeyi işlemesi ile
ortaya çıkan kristallerin çözülmesiyle oluşan sıvının spektrofotometre ile incelenip
kantitatif bir sonuç elde edilmesine ilkesine dayanmaktadır. MTT boyasının tetrazolium
halkasının, canlı hücrelerin mitokondriyal aktivitesi sonucu parçalanması ile MTT;
renkli, suda çözünmeyen formazan kristallerine dönüşür. Bu reaksiyon mitokondriyal bir
enzim olan süksinatdehidrogenaz enziminin aktivitesine bağlıdır. Oluşan formazan
kristalinin miktarı, canlı hücre sayısı ile doğrudan ilişkilidir. Daha sonra oluşan bu
kristaller DMSO veya izopropanol gibi çözücüler ile çözülerek incelenir [47].
25
2. BÖLÜM
GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Mezenkimal Kök Hücrelerin Eldesi
Çalışmada kullanılan mezenkimal kök hücreler, Prof. Dr. Umberto GALDERISI’nin,
Second University of Naples, İtalya’daki laboratuarından temin edilmiştir. [MKH’ler;
Severino ve arkadaşlarının “Insulin-like growth factor binding proteins 4 and 7 released
by senescent cells promote premature senescence in mesenchymal stem cells” başlıklı
(doi:10.1038/cddis.2013.445) çalışmada kullanılan karakterize edilmiş hücrelerdir.]
2.2. Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültürü
2.2.1. Besiyeri Hazırlanması
Mezenkimal Kök Hücreler için %10 FBS (Biological Industries), %1 L-glutamin (Gibco)
ve %1 Penisilin-Streptomisin (PAA) içeren düşük glukozlu DMEM (1 g/L glukoz)
(Biological Industries) besiyeri hazırlandı.
2.2.2. Hücre Kültürü Basamakları
Sıvı azot tankında donmuş halde saklanan hücreler su banyosunda ısıtılarak çözüldü. 1,5
mL dondurma solüsyonu içerisinde bulunan hücrelere 8,5 mL kendi besiyeri eklenerek
dondurma solüsyonu seyreltildi. Böylece dondurma solüsyonunda bulunan DMSO’nun
(dimetil sülfoksit) hücrelere zarar vermesi engellendi. Hücreler 350x g’de 5 dakika
santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatant atıldı. Pellet 10 mL kalsiyum ve magnezyum
içermeyen DPBS’te (Biological Industries) çözüldü. Tekrar 350x g’de 5 dakika santrifüj
yapıldı. Süpernatant uzaklaştırılıp, pellet besiyeri ile çözüldü. Neubauer lamında hücre
sayımı yapıldıktan sonra 75 cm2’lik kültür kabına 10 ml besiyeri içerisinde 4-5x105 hücre
olacak şekilde ekim yapıldı. Hücreler %5 CO2 içeren 37 OC’lik inkübatöre kaldırıldı.
Hücreler her gün gözlenerek büyümeleri ve çoğalmaları kontrol edildi. Hücreler %80
yoğunluğa ulaşınca pasaj yapılmak üzere besiyeri uzaklaştırıldı. Hücreler DPBS ile iki
26
kez yıkandı ve serum artıklarından arındırıldı. 5-6 mL Tripsin (PAA) eklenerek 4 dakika
37
C’de inkübe edildi. Hücreler kültür kabından ayrıldıktan sonra, tripsinizasyon
O
işlemini durdurmak için eklenen tripsin miktarının %10’u kadar FBS veya aynı miktarda
FBS içeren besiyeri hücrelerin üzerine eklendi. Hücreler falkon tüplere alınarak santrifüj
yapıldı. Süpernatant uzaklaştırıldı. Hücreler DPBS ile iki santrifüj edilerek yıkandı.
Hücrelerin bir kısmı alanı genişletmek amacıyla farklı kültür kaplarına ekildi. Bir kısmı
sonraki çalışmalarda kullanılmak amacıyla donduruldu. Hücreler dondurulurken %70
FBS, %20 DMEM ve %10 DMSO içeren dondurma solüsyonu kullanıldı. Hücreler 2
mL’lik kryo tüplerde sırayla 1 saat -20 OC’de, 1 gün -80 OC’de (Myster Frosty Container
içerisinde) bekletildi. Daha sonra uzun süreli saklama için -196 OC’lik sıvı azot tankına
alındı. Pasajlama işlemi hücrelerin yoğunluğu kültür kabında %85-90’a her ulaştığında
yapıldı.
2.3. Mezenkimal Kök Hücrelerde Replikatif Senesens Oluşturulması
Kültürün erken safhalarındaki mezenkimal kök hücreler kültür kabındaki yoğunluğu
%90’a her ulaştığında pasajlanarak 30 gün boyunca kültüre edildi. Kültürün 20. gününden
sonra, senesens fenotipi gözlemlenmeye başlandı.
2.4. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilecek MKH’lerin Senesens Testleri
Boyama Solüsyonu: K₃[Fe(CN)₆] (Potasyum ferrisiyanür) ve K4[Fe(CN)6] (Potasyum
ferrosiyanür) (Sigma) çözelti içindeki konsantrasyonları 5 mM olacak şekilde ve MgCl2
1 M stok solüsyonu, çözelti içindeki konsantrasyonu 2 mM olacak şekilde PBS içine
eklendi.
X-gal Stok Solüsyonu: Toz halindeki X-gal (Thermo), N,N-Dimetilformamit içinde
konsantrasyonu 40 mg/mL olacak şekilde çözüldü. Uzun süreli saklama amacıyla -80 OC
dondurucuya kaldırıldı.
Tam Boyama Solüsyonu: 19.5 mL boyama solüsyonuna 500 µL X-gal stok solüsyonu
eklenerek toplamda 20 mL tam boyama solüsyonu elde edildi.
Fiksatif Solüsyonu: %0.2 glutaraldehit elde etmek için %25 Glutaraldehit’ten (Sigma)
160 µL alınarak 19.84 mL PBS’e eklendi. Toplamda 20 mL fiksatif solüsyonu elde edildi.
Hücreler 6 kuyucuklu plağın, 3 kuyucuğuna genç hücreler, 3 kuyucuğuna kültürde en az
30 gün geçirmiş senesent hücreler, her kuyucuğa yaklaşık 1x105 hücre gelecek şekilde
27
ekildi. Bir gün sonra hücreler tutununca, besiyeri uzaklaştırıldı, hücreler DPBS ile
yıkandı. Her kuyucuğa %0.2 glutaraldehit (Sigma) eklendi ve 15 dakika inkübe edilerek
hücreler fikse edildi. İnkübasyon sırasında önceden hazırlanmış X-gal stok solüyonu,
boyama solüsyonuna eklenerek tam boyama solüyonu oluşturuldu. İnkübasyondan sonra
glutaraldehit uzaklaştırıldı. Hücreler 2 kez DPBS ile yıkandı. Tam boyama solüyonu
eklendi ve plağın etrafı parafilmle çevrilerek hava alması engellendi. 18 saat 37 OC’de
inkübe edildi. 18 saat sonunda her kuyucukta toplam 3 alanda 100’er hücre sayılarak
senesens yüzdesi belirlendi [11].
2.5. Koşullandırılmış Besiyeri Hazırlanması
Bu çalışmada mezenkimal kök hücrelerden iki defa koşullandırılmış besiyeri
toplanmıştır. İlk olarak kültürün erken aşamalarında hücreler senesent değil iken (genç),
ikinci olarak ise kültürün başlangıcından 30 gün sonra (senesent) hücrelerden
koşullandırılmış besiyeri toplandı.
Koşullandırılmış besiyeri toplamak için 75 cm2’lik kültür kaplarına ekilen hücreler %70
yoğunluğa ulaşana kadar inkübe edildi. Yeterli yoğunluğa ulaşan hücreler DPBS ile iki
kez yıkandı.
Hücrelerin bulunduğu kültür kabına serum içermeyen, %1 Penisilin-
Streptomisin ve %1 L-glutamin içeren DMEM besiyeri eklendi. Hücreler 24 saat inkübe
edildi. 24 saat sonunda eklenen besiyeri falkon tüplerde toplandı. Besiyeri +4 OC’de, 10
000x g’de 10 dakika santrifüj edilerek içersindeki kültürden kalabilecek partiküller
uzaklaştırıldı. Hücreler sterilizasyon amaçlı olarak, protein bağlama kapasitesi az olan,
0.22 µm’lik filtrelerden (Millipore) geçirildi. Elde edilen koşullandırılmış besiyeri mikro
santrifüj tüplerine ayrıldı ve uzun süreli saklama için -80 OC’lik dondurucuya kaldırıldı
[48].
2.6. Genç MKH’lere Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri
2.6.1. Senesens Testi
Genç MKH’ler 6 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 1x105 hücre gelecek şekilde ekildi ve
1 gün tutunmaları için inkübe edildi. Ertesi gün kuyucukların içindeki besiyerlerinin
%50’si alındı. 6 kuyucuklu plağın 2 kuyucuğuna kontrol besiyeri (koşullandırılmamış
MKH besiyeri), 2 kuyucuğuna genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 2 kuyucuğuna da
senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. Başka bir kuyucuğa kontrol amaçlı
28
olarak hiç uygulama yapılmadı. Hücreler 48 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra
besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler DPBS ile yıkandı. %0.2 glutaraldehit ile 15 dakika fikse
edildi. 15 dakika sonra glutaraldehit uzaklştırıldı. Tam boyama solüyonunda 18 saat
inkübe edildi. 18 saatin sonunda tam boyama solüsyonu uzaklaştırıldı ve hücrelerin üzeri
%50 gliserol ile kaplandı. Her kuyucukta 300 hücre sayılarak senesent hücrelerin yüzdesi
belirlendi. Senesens testi 3 tekrarlı olarak yapıldı [11]..
2.6.2. Apoptoz Testi
Genç MKH’ler 25 cm2’lik kültür kabına her kültür kabında 2,5x105 hücre olacak şekilde
ekildi. Tutunmaları için 1 gün inkübe edildi. Hücreler tutunduktan sonra; kültür
kaplarının içindeki besiyerlerinin %50’si alındı ve kültür kaplarının birine kontrol
besiyeri, birine genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve birine de senesent MKH
koşullandırılmış besiyeri eklendi. Bir kültür kabına da hiç bir uygulama yapılmadı.
Hücreler 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonucunda hücreler kültür kaplarından
tripsinizasyon ile alındı. DPBS ile 2 kez yıkandı ve üretici firmanın talimatlarına uygun
olacak şekilde; en az %1 FBS içeren 100 µL hücre solüsyonuna, 100 µL Annexin V/Dead
Cell Reagent (Muse-Millipore) eklenip 20 dk oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama
yapılmayan kültür kabındaki hücreler Muse Cell Analyzer cihazında ayarlama yapmak,
kapı belirlemek için kullanıldı. Diğer hücreler Muse Cell Analyzer cihazında incelendi.
Apoptoz testi 3 farklı örnek ile her örnek iki kez okutularak yapıldı [43].
2.6.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi
Genç MKH’ler 25 cm2’lik kültür kabına her kültür kabında 2,5x105 hücre olacak şekilde
ekildi. Tutunmaları için 1 gün inkübe edildi. Hücreler tutunduktan sonra; kültür
kaplarının içindeki besiyerlerinin %50’si alındı ve kültür kabının birine kontrol besiyeri,
birine genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve birine de senesent MKH koşullandırılmış
besiyeri eklendi. Bir kültür kabına da hiç bir uygulama yapılmadı. Hücreler 48 saat inkübe
edildi. İnkübasyon sonucunda hücreler kültür kaplarından tripsinizasyon ile alındı. DPBS
ile 2 kez yıkandı ve üretici firmanın talimatlarına uygun olacak şekilde; MitoPotential
Reagent, Assay Buffer (Muse-Millipore) ile 1/1000 oranında seyreltildikten sonra 100 µL
hücre solüsyonuna 95 µL olacak şekilde eklendi ve 20 dakika 37 OC’de inkübe edildi.
İnkübasyondan sonra örneklerin üzerine 5 µL 7-AAD (Muse-Millipore) eklendi ve 5
dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki hücreler
29
Muse Cell Analyzer cihazında ayarlama yapmak için kullanıldı. Muse Cell Analyzer
cihazında örnekler incelendi. Mitokondri membran potansiyeli testi 3 farklı örnek ile her
örnek iki kez okutularak yapıldı [44-46].
2.6.4. Proliferasyon Testi
Hücrelerin proliferasyon oranlarını belirlemek amacı ile MTT testi yapıldı. Bu amaçla 96
kuyucuklu plakların 54 kuyucuğuna her kuyucuğa 2000 hücre gelecek şekilde ekim
yapıldı. Hücreler tutunduktan sonra kuyucuklardaki besiyerlerinin yarısı alınarak; 18
kuyucuğa kontrol besiyeri, 18 kuyucuğa genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 18
kuyucuğa da senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. Hücrelerin üzerine
besiyeri eklendikten sonra 0.saatte, 24.saatte ve 48.saatte her 18 kuyucuğa, son
konsantrasyonu 1 mg/mL olacak şekilde MTT (Serva) solüsyonu eklendi. Kuyucukların
tamamına MTT eklenmesinden en az 4 saat sonra kuyucuk içindeki besiyeri-MTT
karışımı uzaklaştırıldı. Oluşan kristaller DMSO ile çözüldü. Glomax Elisa Reader
(Promega) cihazında 560nm ve 750nm olmak üzere çift dalga boyunda spektrofotometrik
ölçüm yapıldı. Proliferasyon testi 3 farklı örnek ile 6 tekrarlı olarak yapıldı [47].
2.7. Kanser Hücre Hatlarının Hazırlanması
2.7.1. Besiyeri Hazırlanması
MCF-7 hücre hattı için; %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin, %1 L-Glutamin, %0,11
Sodyum pirüvat (Sigma) ve %0,2 insulin (PAA) içeren DMEM yüksek glukozlu (4,5 g/L)
Besiyeri (Lonza) kullanıldı.
K562 ve DLD-1 hücre hatları için; %10 FBS, %1 Penisilin-Streptomisin, %1 L-Glutamin
içeren RPMI 1640 (Biological Industries) besiyeri kullanıldı.
2.7.2. Kültür Basamakları
Kullanılacak kanser hücreleri sıvı azot tankından çıkarılarak, su banyosunda eritildi. Her
bir kanser hücresi kendi besiyeri ile seyreltilerek dondurma solüsyonunda kullanılan
DMSO’nun etkisi azaltıldı. Hücreler 350x g’de 5 dakika santrifüj yapıldı. Süpernatant
uzaklaştırılıp, DPBS ile bir kez daha yıkama yapıldı. Son yıkamadan sonra hücreler 225
cm2’lik kültür kabında kendi besiyerlerinde ekim yapıldı.
30
Hücreler testler için kullanılacağı zaman, tripsin ile kültür kaplarından kaldırıldı, DPBS
ile 2 kez yıkanıp test yapılacak kültür kaplarına veya çok kuyucuklu plaklara ekildi. Artan
hücreler sonra ki çalışmalarda kullanılmak amacıyla dondurma solüsyonu içinde
dondurularak uzun süreli saklamak için -196 OC azot tankına koyuldu.
2.8. Kanser Hücre Hatlarına Koşullandırılmış Besiyeri Uygulanması ve Testleri
2.8.1. Senesens Testi
MCF-7 ve DLD-1 kanser hücre hatları, kültür kabına tutunan hücreler, K562 hücre hattı
ise yüzen hücreler olduğu için, boyama iki farklı metot ile yapıldı. MCF-7 ve DLD-1
hücreleri 6 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 1x105 hücre gelecek şekilde ekim yapıldı ve
tutunmaları beklendi. Hücreler tutunduktan sonra kuyucukların içindeki besiyerlerinin
%50’si alındı. 6 kuyucuklu plağın 2 kuyucuğuna kontrol besiyeri (koşullandırılmamış
MKH besiyeri), 2 kuyucuğuna genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 2 kuyucuğuna da
senesent MKH koşullandırılmış besiyeri eklendi. 48 saat inkübasyondan sonra hücreler
yıkandı ve 15 dakika boyunca fikse edildi. Fiksasyondan sonra hücreler iki kez DPBS ile
yıkanıp tam boyama solüsyonunda, etrafı parafilm ile çevrilerek 18 saat inkübe edildi. Bu
aşamadan sonra kuyuculara gliserol eklendi. Her kuyucukta 300 hücre sayılarak senesens
yüzdesi belirlendi [11].
K562 hücre hattı 6 kuyucuklu plaklara her kuyucuğa 1x105 hücre gelecek şekilde ekildi.
Hücreler tutunmayan hücreler olduğu için aynı gün koşullandırılmış besiyerleri, diğer iki
hücre hattında olduğu gibi kuyucuklara eklendi. 48 saat inkübasyondan sonra hücreler
mikro santrifüj tüplerine alındı. 350x g’de 5 dakika santrifüj yapılarak besiyeri
uzaklaştırıldı. DPBS ile yıkandıktan sonra, tüplerin içinde %0.2 glutaraldehit eklenerek
fiksasyon işlemi yapıldı. Fiksasyon işlemi sırasında X-gal ve boyama solüsyonu
birleştirilip tam boyama solüsyonu hazırlandı. Fiksasyondan sonra hücreler iki kez DPBS
ile yıkandı. Tam boyama solüsyonu tüplere eklendi ve 18 saat inkübe edildi.
İnkübasyondan sonra tam boyama solüsyonu santrifüj edilerek süpernatant atıldı. Böylece
tam boyama solüsyonu uzaklaştırıldı. Hücreler 1 kez DPBS ile yıkandı. Hücre pelleti
yaklaşık 50 µL DPBS ile çözüldü. Lam üzerine hücre solüsyonu damlatıldı ve antifade
(Invitrogen) eklenip lamel ile (her lam üzerinde iki lamel olacak şekilde) kapatıldı.
Kuruması beklendikten sonra sayım yapıldı. Her lam üzerinde toplamda 600 hücre
sayılarak senesens yüzdesi belirlendi [11].
31
2.8.2. Apoptoz Testi
Kanser hücre hatları 25 cm2’lik kültür kaplarına her kültür kabına 2.5x105 hücre gelecek
şekilde ekildi. MCF-7 ve DLD-1 kanser hücre hatlarının tutunması için 1 gün beklendi
ve kontrol besiyeri ile genç ve senesent MKH’lere ait koşullandırılmış besiyerleri eklendi.
K562 hücre hattının bulunduğu kültür kaplarına ekimin yapıldığı gün koşullandırılmış
besiyerleri eklendi. Her hücre hattı için hiçbir uygulama yapılmamış kültür kabı ayrıldı.
Hücreler Annexin V/Dead Cell Reagent (Muse-Millipore) ile muamele edilip 20 dakika
oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki hücreler Muse
Cell Analyzer cihazında test ayarları yapmak, kapı belirlemek için kullanıldı. Uygulama
yapılan hücreler cihazda okutularak apoptoz yüzdesi belirlendi. Apoptoz testi 3 farklı
örnek 2 kez okutularak gerçekleştirildi [43].
2.8.3. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi
Kanser hücre hatları 25 cm2’lik kültür kaplarına her kültür kabına 2,5x105 hücre gelecek
şekilde ekildi. MCF-7 ve DLD-1 kanser hücre hatlarının tutunması için 1 gün beklendi
ve kontrol besiyeri ile genç ve senesent MKH’lere ait koşullandırılmış besiyerleri eklendi.
K562 hücre hattının bulunduğu kültür kaplarına ekimin yapıldığı gün koşullandırılmış
besiyerleri eklendi. Her hücre hattı için hiçbir uygulama yapılmamış kültür kabı ayrıldı.
MCF-7 ve DLD-1 hücreleri tripsinizasyon işlemi ile kültür kabından alındı. K562 hücre
hattı için tripsinizasyon işlemi gerekli olmadığından santrifüj ile besiyeri uzaklaşıtırıldı.
DPBS ile yıkama aşamasından sonra üretici firmanın talimatları doğrultusunda;
MitoPotential Reagent, Assay Buffer (Muse-Millipore) ile 1/1000 oranında seyreltilerek,
100 µL hücre solüsyonuna 95 µL olacak şekilde eklendi ve 20 dakika 37OC’de inkübe
edildi. İnkübasyondan sonra örneklerin üzerine 5 µL 7-AAD (Muse-Millipore) eklendi
ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Uygulama yapılmayan kültür kabındaki
hücreler Muse Cell Analyzer cihazında ayarlama yapmak için kullanıldı. Muse Cell
Analyzer cihazında örnekler incelendi. Mitotik indeks testi 3 farklı örnek ile her örnek iki
kez okutularak yapıldı [44-46].
2.8.4. Proliferasyon Testi
Kanser hücre hatları 96 kuyucuklu plakların 54 kuyucuğuna her kuyucuğa 2000 hücre
gelecek şekilde ekim yapıldı. MCF-7 ve DLD-1 hücreleri tutunduktan sonra
32
kuyucuklardaki besiyerlerinin yarısı alınarak; 18 kuyucuğa kontrol besiyeri, 18 kuyucuğa
genç MKH koşullandırılmış besiyeri ve 18 kuyucuğa da senesent MKH koşullandırılmış
besiyeri eklendi. K562 hücreleri tutunmayan hücreler olduğundan, ekim yapıldıktan
sonra besiyerinin alınması söz konusu değildir. Ekim sırasında koşullandırılmış
besiyerleri ve K562 besiyeri yarı yarıya karıştırılarak kuyucuklara hücre ekimi yapıldı.
Hücrelerin üzerine koşullandırılmış besiyeri eklendikten sonra 0.saatte, 24.saatte ve
48.saatte 18 kuyucuğa son konsantrasyonu 1mg/ml olacak şekilde MTT solüsyonu
eklendi. Kuyucukların tamamına MTT eklenmesinden en az 4 saat sonra kuyucuk
içindeki besiyeri-MTT karışımı uzaklaştırıldı. K562 hücreleri besiyeri-MTT karışımı
uzaklaştırılmadan önce 1000x g’de 10 dakika santrifüj edildi. Oluşan kristaller dibe
çöktürüldü. Besiyeri-MTT karışımı evaporatör (Eppendorf) ile uzaklaştırıldı. Oluşan
kristaller DMSO ile çözüldü. Promega Glomax Elisa Reader cihazında 560 nm ve 750
nm olmak üzere çift dalga boyunda spektrofotometrik ölçüm yapıldı. Proliferasyon testi
her hücre hattı için 3 farklı örnek ile 6 tekrarlı olarak yapıldı [47].
2.9. İstatistiksel Analiz
Bu çalışmada yapılan testlerinden elde edilen bulgularda, gruplar arasındaki farkların
anlamlılığını belirlemek için T-test (Microsoft Excel) kullanıldı. p < 0.05 anlamlılık
düzeyi kabul edilmiştir. [0.01 <= p < 0.05 (*): İstatistiksel anlamlılık. 0.001 <= p < 0.01
(**):Yüksek düzey istatistiksel anlamlılık. p < 0.001 (***): Çok yüksek düzey
istatistiksel anlamlılık. 0.05 <= p <0.10 (*): Sınırda anlamlılık. p > 0.10: İstatistiksel
olarak anlamlı farklılık bulunamamıştır.]
33
3. BÖLÜM
BULGULAR
3.1. Koşullandırılmış Besiyeri Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testlerinden Elde
Edilen Bulgular
Bu çalışmada mezenkimal kök hücrelerden, kültürün erken ve geç safhalarında
koşullandırılmış besiyeri (KBY) toplanmıştır. Koşullandırılmış besiyeri elde edilen
MKH’ler senesense bağlı beta-galaktozidaz aktivitesini belirlemek için sitokimyasal
yöntemler ile boyanmıştır (Şekil 3.1 ve Şekil 3.2). Boyama sonucu mavi hücreler
sayılarak senesens yüzdesi belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar Tablo 3.1’de
gösterilmiştir.
Tablo 3.1. KBY Elde Edilen MKH’lerin Senesens Testi Sonuçları
Genç MKH β-Gal Pozitif Hücre Yüzdesi: %3.03
Yaşlı MKH β-Gal Pozitif Hücre Yüzdesi: %74.3
Şekil 3.1. Genç mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü
34
Şekil 3.2. Senesent mezenkimal kök hücre β-gal boyama görüntüsü
3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Testlerinden Elde
Edilen Bulgular
Mezenkimal kök hücrelerin farklı kültür evrelerinde elde edilmiş koşullandırılmış
besiyerleri, genç MKH’lerin ve kanser hücrelerinin besiyerlerine %50 oranında
eklenerek, bu koşullandırılmış besiyerinin ihtiva ettiği sekretomun genç MKH’lerin ve
kanser hücrelerinin senesens mekanizmasına etkileri değerlendirilmiştir. Senesense bağlı
β-galaktozidaz aktivitesini belirlemek için sitokimyasal yöntemler ile boyanmıştır.
Boyama sonucu mavi hücreler sayılarak senesens yüzdesi belirlenmiştir. Elde edilen
sonuçların ortalamaları Tablo 3.2’de gösterilmiştir. İstatistiksel analiz sonuçları Tablo
3.3’te gösterilmiştir.
Tablo 3.2. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Senesens Test
Sonuçları
Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i
inkübe edilen hücreler ile
inkübe
edilen
hücreler
Ortalama β-Gal Pozitif
Ortalama β-Gal
Ortalama β-Gal
Hücre Yüzdesi
Pozitif Hücre Yüzdesi Pozitif Hücre Yüzdesi
%1.62
%2.51
%11.50
Kontrol
Hücre
Genç MKH
K562
%14.11
%19.00
%30.33
DLD-1
%11.39
%13.94
%15.11
MCF-7
%16.83
%14.61
%22.22
35
Tablo 3.3. Senesens Testi – T-Test p Değerleri
Senesens Testi – T-Test p Değerleri
Kontrol-Genç
Kontrol-Senesent
Genç-Senesent
MKH
0.055884 *
0.0041 **
0.00391 **
K562
0.101742
0.008586 **
0.000644 ***
DLD-1
0.052812 *
0.038891 *
0.162897
MCF-7
0.01078 *
0.00668 **
0.001318 **
Bu sonuçlara göre genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen mezenkimal kök
hücrelerin senesens yüzdesi kontrol grubunun senesens yüzdesi ile yakındır. Senesent
MKH koşullandırılmış besiyeri ile muamele edilen MKH’lerin senesens oranında
yaklaşık %10’luk artış gözlenmiştir. İstatistik analiz sonucunda gruplar arasındaki farklar
anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.3).
Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen K562 hücrelerinin senesens
yüzdesi, kontrol grubunun senesens yüzdesi ile kıyaslandığında artış gözlenmiştir.
Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen K562 hücrelerinin senesens
yüzdelerinde artış gözlenmiştir. Bu grup ile diğer iki grup arasında anlamlı farklılıklar
bulunmuştur (Tablo 3.3).
Genç MKH ve senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen DLD-1
hücrelerinin senesens yüzdelerinde kontrol grubuna göre düşük bir artış gözlenmiştir.
Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücreler ve kontrol grubu
arasında anlamlı farklılıklar gözlenmiştir (Tablo 3.3). DLD-1 hücrelerinin senesens
testlerinde genç MKH ve senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen
hücreler arasında anlamlı farklılıklar bulunamamıştır (Tablo 3.3).
Genç MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MCF-7 hücrelerinde senesens
yüzdesi kontrol grubuna göre az miktarda artış göstermiştir. Senesent MKH
koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MCF-7 hücrelerinin senesens yüzdesinde,
hem kontrol grubuna göre hemde genç grubuna göre artış gözlenmiştir. İstatistik analiz
sonucunda meme kanseri hücre hattı için tüm gruplar arasındaki farklar anlamlı
bulunmuştur (Tablo 3.3).
36
3.3. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testlerinden
Elde Edilen Bulgular
MKH’lerin erken ve geç kültür evrelerinde elde edilmiş besiyerleri, genç MKH’lerin
besiyerlerine ve kanser hücrelerinin besiyerlerine %50 oranında eklenmiştir. 48 saat
inkübasyondan sonra Annexin V boyanan hücreler Muse Cell Analyzer cihazında
ölçülmüştür. Apoptoz yüzdesi ortalamaları, Tablo 3.4’te gösterilmiştir. İstatistiksel analiz
sonuçları, Tablo 3.5 ve Tablo 3.6’da gösterilmiştir.
Tablo 3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Apoptoz Testi
Sonuçları
Hücre
Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i ile
Kontrol
inkübe edilen hücreler
inkübe edilen hücreler
Ölü
Apoptotik
Ölü
Apoptotik
Ölü
Apoptotik
Genç MKH
%0.02
%0.54
%0
%1.52
%0.17
%12.96
K562
%6.51
%4.17
%7.44
%3.70
%10.56
%3.62
DLD-1
%1.63
%5.68
%1.53
%4.97
%2.06
%11.02
MCF-7
%14.49
%5.26
%15.00
%4.31
%10.55
%3.00
Tablo 3.5. Apoptoz Testi Apoptotik Hücre– T-Test p Değerleri
Apoptoz Testi Apoptotik Hücre– T-Test p Değerleri
Kontrol-Genç
Kontrol-Senesent
Genç-Senesent
MKH
0.030414 *
0.005783 **
0.005768 **
K562
0.225059
0.215799
0.427163
DLD-1
0.275222
0.019149 *
0.013593 *
MCF-7
0.200493
0.008733 **
0.133996
Tablo 3.6. Apoptoz Testi Ölü Hücre– T-Test p Değerleri
Apoptoz Testi Ölü Hücre– T-Test p Değerleri
Kontrol-Genç
Kontrol-Senesent
Genç-Senesent
MKH
0.211325
0.121305
0.1003
K562
0.145846
0.07529 *
0.110625
DLD-1
0.420684
0.217562
0.05694 *
MCF-7
0.448916
0.063571 *
0.155207
37
Elde edilen sonuçlara göre kontrol grubu besiyeri ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri
ile inkübe edilen MKH’lerin apoptoz yüzdesi yakınlık göstermektedir. Senesent MKH
koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen MKH’lerin apoptoz yüzdesinde kontrol
grubuna göre %12’lik artış gözlenmektedir. Senesent grubunun apoptoz oranı, genç
grubunun apoptoz oranından yaklaşık %10 daha düşüktür. Bu üç grup arasındaki farklar
anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.5). MKH’lerin ölü hücre oranları arasında anlamlı farklar
yoktur (Tablo 3.6).
Bulgular K562 hücrelerinin apoptoz oranının üç grupta da birbirine yakın olduğu
göstermektedir. İstatistik analiz sonucu elde edilen bulgulara göre gruplar arasında
anlamlı farklılıklar gözlemlenememiştir (Tablo 3.5). K562 hücrelerinin canlılık testinde
ise kontrol grubu ve senesent grubu arasında fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.6).
DLD-1 hücrelerinde apoptoz oranı kontrol grubu ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri
ile inkübe edilen hücrelerde yakınlık göstermektedir. Kontrol grubu ile genç MKH
besiyerinde inkübe edilen hücreler arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur. Senesent
MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde ise apoptoz oranı artış
göstermiştir. Bu grup ile kontrol grubu arasındaki fark anlamlıdır (Tablo 3.5). DLD-1
hücrelerinin canlılık testinde genç grubu ve senesent grubu arasında fark anlamlı
bulunmuştur (Tablo 3.6).
MCF-7 hücrelerinde apoptoz oranı kontrol grubunda diğer gruplara göre daha fazladır.
Ancak
genel
olarak
baktığımızda
apoptoz
oranının
oldukça
düşük
olduğu
gözlenmektedir. Kontrol grubu ve senesent MKH besiyeri ile inkübe edilen hücreler
arasındaki fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.5). MCF-7 hücrelerinin canlılık testinde ise
kontrol grubu ve senesent grubu arasında fark anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.6).
3.4. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran
Potansiyeli Testlerinden Elde Edilen Bulgular
Mezenkimal kök hücrelerin farklı kültür evrelerinde elde edilmiş besiyerleri, genç
mezenkimal kök hücrelerin besiyerlerine ve kanser hücrelerinin besiyerlerine %50
oranında eklenmiştir. 48 saat inkübasyondan MitoPotential boyası ve 7-AAD ile boyanıp
Muse Cell Analyzer’da incelenmiştir. Yapılan incelemeler sonucunda elde edilen
depolarize (mitokondri membran potansiyeli düşük) hücre yüzdelerinin ortalamaları
Tablo 3.7’te gösterilmiştir. İstatistiksel analiz sonuçları Tablo 3.8’de gösterilmiştir.
38
Tablo 3.7. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Mitokondri Membran
Potansiyeli Testi Sonuçları
Hücre
Kontrol
Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i ile
inkübe edilen hücreler
Depolarize
Hücre Depolarize
inkübe edilen hücreler
Hücre Depolarize
Yüzdesi
Yüzdesi
Yüzdesi
Genç MKH
%14.00
%22.92
%28.62
K562
%25.20
%27.27
%31.38
DLD-1
%13.87
%17.76
%15.44
MCF-7
%37.39
%43.31
%41.88
Hücre
Tablo 3.8. Mitokondri Membran Potansiyeli Testi – T-Test p Değerleri
Mitokondri Membran Potansiyeli Testi – T-Test p Değerleri
Kontrol-Genç
Kontrol-Senesent
Genç-Senesent
MKH
0.035222 *
0.00541 **
0.092511 *
K562
0.172429
0.025445 *
0.006743 **
DLD-1
0.099426 *
0.321043
0.21617
MCF-7
0.246918
0.294284
0.311399
Elde edilen sonuçlara göre genç MKH ve senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde
inkübe edilen MKH’lerin mitokondri membran depolarizasyonu kontrol grubuna göre
artış göstermiştir. Mitokondri membran depolarizasyonu en fazla senesent MKH
koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlenmiştir. İstatistiksel analiz
sonucunda tüm gruplar arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.8).
K562 hücrelerinde mitokondri membran depolarizasyonu en fazla senesent MKH
koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlenmiştir. Genç MKH
koşullandırılmış
besiyerinde
inkübe
edilen
hücrelerin
mitokondri
membran
depolarizasyonu yüzdelerinde de kontrol grubuna göre artış söz konusudur. İstatistiksel
analizlere göre kontrol grubu ile diğer iki grup arasındaki farklar anlamlı bulunmuştur
(Tablo 3.8).
39
DLD-1 hücrelerinde mitokondri membran depolarizasyonu 3 grupta da yakınlık
göstermekle beraber en yüksek oran genç MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre
edilen hücrelerde gözlenmiştir. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre
edilen hücrelerin depolarizasyon yüzdesi, genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe
edilen hücrelere oranla daha düşüktür. Yapılan istatistiksel analizlere göre sadece kontrol
grubu ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücreler arasındaki fark
anlamlı bulunmuştur (Tablo 3.8).
MCF-7 hücrelerinde tüm gruplarda mitokondri membran depolarizasyonu yüksektir.
Ancak en yüksek yüzde DLD-1 hücrelerinde olduğu gibi genç MKH koşullandırılmış
besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde gözlemlenmektedir. Gruplar arasında farklar anlamlı
bulunmamıştır (Tablo 3.8).
3.5. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon
Testlerinden Elde Edilen Bulgular
Genç MKH’ler ve kanser hücreleri 96 kuyucuklu plaklara ekilmiş, üzerine 24 saat sonra
koşullandırılmış besiyeri eklenmiştir. 0 saat, 24 saat ve 48 saat inkübasyondan sonra
kuyucuklara MTT eklenmiştir. Oluşan formazan kristalleri DMSO ile çözülmüş ve
spektrofotometrik ölçüm yapılmıştır. Koşullandırılmış besiyerinin eklendiği saatte
(0.saat) kuyucuklardaki hücre yoğunluğu %100 alınarak hesaplama yapılmış ve 24. ile
48. saatlerdeki kuyucuklardaki canlı hücre yüzdeleri bulunmuştur. Proliferasyon
testlerine ait sonuçların ortalamaları Tablo 3.9’da gösterilmiştir. İstatistiksel analiz
sonuçlar Tablo 3.10 ve Tablo 3.11’de gösterilmiştir.
Tablo 3.9. Koşullandırılmış Besiyerinde Kültüre Edilen Hücrelerin Proliferasyon Testi
Sonuçları
Genç MKH KBY’i ile Senesent MKH KBY’i ile
Kontrol
inkübe edilen hücreler
inkübe edilen hücreler
48.saat
24. saat
48.saat
24. saat
48.saat
Genç MKH 82.79209
47.6757
81.00809
63.31503
96.50879
74.08146
K562
103.2889
120.115
106.389
136.0877
106.055
132.2175
DLD-1
96.04655
87.5266
109.2232
102.3001
101.5178
95.61689
MCF-7
87.38739
71.31477
92.99182
84.6161
94.49084
77.59756
Hücre
24. saat
40
Tablo 3.10. MTT Testi 24.saat – T-Test p Değerleri
MTT Testi 24.saat – T-Test p Değerleri
Kontrol-Genç
Kontrol-Senesent
Genç-Senesent
MKH
0.381673
0.056042 *
0.037423 *
K562
0.412209
0.390342
0.490722
DLD-1
0.031003 *
0.147076
0.081005 *
MCF-7
0.274981
0.231942
0.425806
Tablo 3.11. MTT Testi 48.saat – T-Test p Değerleri
MTT Testi 48.saat – T-Test p Değerleri
Kontrol-Genç
Kontrol-Senesent
Genç-Senesent
MKH
0.011088 *
0.000556 ***
0.031114 *
K562
0.225578
0.180735
0.429176
DLD-1
0.033058 *
0.097268 *
0.007067 **
MCF-7
0.00063 ***
0.035232 *
0.027665 *
Mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon testlerinden elde edilen sonuçlara göre
koşullandırılmış besiyerlerinin eklenmesinden 24 saat sonra tüm grupların canlı hücre
yüzdesi azalmıştır. Ancak azalma oranı en fazla kontrol grubunda, en az senesent MKH
koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerdedir. Kontrol grubu ile diğer gruplar
arasında anlamlı farklar bulunmuştur. Koşullandırılmış besiyeri eklendikten 48 saat sonra
ise kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi yarı yarıya azalmıştır. Bu azalma oranı yine en
fazla kontrol grubunda, en az senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen
hücrelerdedir. Yapılan istatistiksel analiz tüm gruplar arasında anlamlı farklar olduğunu
göstermektedir (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11).
K562 hücrelerinin proliferasyon testlerinden elde edilen sonuçlara göre koşullandırılmış
besiyerinin eklenmesinden 24 saat sonra canlı hücre yüzdelerinde önemli bir değişiklik
gözlenmemiştir. 48 saat sonra hücre yüzdelerinde artış gözlenmiştir. Artış oranı en az
kontrol grubunda, en fazla genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen
hücrelerde görülmüştür. Gruplar arasında anlamlı farklar bulunamamıştır (Tablo 3.10 ve
Tablo 3.11).
41
DLD-1 hücrelerinin proliferasyon testlerinden elde edilen sonuçlara göre koşullandırılmış
besiyerinin eklenmesinden 24 saat sonra kontrol grubunun canlı hücre yüzdesinde azalma
gözlenmiştir. Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerin
yüzdesinde artış gözlemlenirken senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe
edilen hücrelerin yüzdesinde değişiklik olmamıştır. İstatistiksel analiz sonucunda bütün
gruplar arasındaki sonuçlar anlamlı bulunmuştur. Koşullandırılmış besiyerinin
eklenmesinden 48 saat sonra kontrol grubunun canlı hücre yüzdesinde azalma
görülmektedir. 24. saatte artan genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen
hücrelerin yüzdesi, 48. saate tekrar azalma göstermiştir. Senesent MKH koşullandırılmış
besiyeri ile inkübe edilen canlı hücrelerin yüzdesinde 48. saatte 24 saat öncesine göre
küçük bir azalma gözlenmektedir. Yapılan istatistiksel analiz; kontrol grubu ile genç
MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücreler arasında ve genç MKH ile
senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde inkübe edilen hücreler arasındaki farkların
anlamlı olduğunu göstermiştir (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11).
MCF-7 hücrelerine yapılan proliferasyon testleri sonucunda koşullandırılmış besiyeri
eklendikten 24 saat sonra canlı hücre yüzdelerinde azalma gözlenmiştir. Azalma oranları
birbirine yakın olmakla beraber, en çok azalma kontrol grubunda gözlenmiştir.
İstatistiksel analizler sonucunda 24. saatteki hücre oranları arasında anlamlı farklılıklar
bulunamamıştır. Koşullandırılmış besiyeri eklendikten 48 saat sonra hücrelerinin yüzdesi
daha da azalmıştır. 48. saat sonunda en düşük hücre yüzdesi kontrol grubunda, en yüksek
hücre yüzdesi genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen hücrelerde
gözlenmiştir. İstatistiksel analizler tüm gruplar arasında anlamlı farklılıklar olduğu
göstermektedir (Tablo 3.10 ve Tablo 3.11).
4. BÖLÜM
TARTIŞMA – SONUÇ VE ÖNERİLER
4.1. Tartışma
Mezenkimal kök hücrelerin salgıladıkları protein ve peptit yapıdaki faktörlerin ve hatta
RNA’ların, hücrenin bulunduğu mikro çevreye etki ettiği bilinmektedir. Bu parakrin etki
sonucunda nişte bulunan diğer hücrelerin fonksiyonları düzenlemektedir [17].
Senesens hücrenin sağlıklı hücreye göre aşırı büyümesi, proliferasyonunun durması,
hücrede birden fazla çekirdek bulunması, lizozom miktarındaki artış ve buna bağlı olarak
β-galaktozidaz miktarındaki artış ile karakterize edilir [2]. Bu hücreler, bölünme için
birçok kriteri sağlamasına rağmen telomer kısalması, genetik materyalde oluşan hasar
gibi sebeplerden, kontrol mekanizmaları tarafından engellenerek hücre bölünmesinin G1
fazından S fazına geçiş yapamaz ve bölünemezler. Bu kontrol proteinlerine örnek olarak
p53 proteini verilebilir. Tümör baskılayıcı p53 geninin hasar almasında bu mekanizma
ortadan kalkar ve hücre kontrolsüz bölünerek neoplastik dönüşüme girer [5, 9].
Senesens mekanizması da doku profilini belirleyen hücrelerce tetiklenebilen bir
mekanizmadır. Senesens mekanizması, aktive olmuş bir mezenkimal kök hücre çevresine
senesens mesajını veren moleküller salgılar. Bu moleküller dokudaki diğer hücreleri
senesense girmeleri için uyarır. Senesens hasarlı hücrelerin büyümesini inhibe eden bir
mekanizma olduğu gibi, sağlıklı hücreler üzerinde de olumsuz etki yapabilirler.
Alzheimer, pulmoner fibrozis ve arteroskleroz gibi yaşa bağlı hastalıklardan etkilenen
dokularda, oldukça fazla senesent hücreye rastlanmıştır. Bu durum dokunun
yaşlanmasının ve bu tür hastalıkların ortaya çıkmasının sebebi olarak, senesent hücreleri
salgıladığı faktörleri işaret etmektedir [49]. Ayrıca dokuda neoplastik dönüşüme uğramış
hücreler varsa, bu hücreler dokunun diğer hücrelerinden farklı şekilde etkilenebilirler.
Senesent hücrelerin salgıladığı moleküller tümör oluşumunun erken aşamasında
43
neoblastik dönüşümü baskılarken, geç aşamalarda tümör hücrelerinin büyümesini
desteklemektedir [9].
Tümör baskılayıcı mekanizmaları çalışan sağlıklı hücrelerde senesens mekanizmasından
sonraki adım apoptozdur. Apoptoz hücre ölümünden önceki son aşamadır. Hücre
membranında bulunan fosfatidil-serin moleküllerinin miktarındaki artış ile doğru
orantılıdır. Fosfatidil-serin (PS) miktarındaki artış, hücrenin apoptoza girdiğini çevredeki
hücrelere apoptoza girdiğini haber verir [50]. Bu mesaj, kendinin ortadan kaldırılması
için diğer hücrelere bir uyarı olarak nitelendirilebilir.
Apoptozun bir diğer göstergesi ise mitokondri membran potansiyelinin düşüşü ile
hücrenin enerji üretmede sıkıntıya girmesidir. Hücre enerji üretiminde sıkıntı yaşadığı
zaman, apoptoza girer ve fosfatidil-serin ifadesi artar. Tüm bu mekanizmalar aktif hale
geldiğinde hücre bölünmesi durur ve proliferasyon azalır [51].
Kaynaklardan elde edilen bilgiler doğrultusunda, senesent MKH’lerce salgılanan
moleküllerin dokuda bulunan diğer hücrelerde senesens ve apoptoz mekanizmalarının
harekete geçirmesi, mitokondri membran potansiyelini ve proliferasyonu azaltması
beklenmektedir. Ancak senesent MKH sekretomu kanser hücrelerinde tam tersi etki de
yapabilir. Yapılan bu çalışma ile genç ve senesent MKH sekretomlarının kanser
hücrelerine nasıl etki ettiğini gözlemlemek ve bu etkinin hücrelerin hangi biyolojik
mekanizmasına olacağını belirlemek amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda genç ve
senesent mezenkimal kök hücrelerden elde edilen bu hücrelerin salgıladığı molekülleri
içeren koşullandırılmış besiyerileri, kanser hücrelerinin kültür ortamına katılmıştır.
Çalışmada her hücre için 3 grup üzerinde incelemeler yapılmıştır. Bu gruplardan sadece
hücreye özgü besiyeri ve serumsuz MKH besiyeri karışımında inkübe edilenler kontrol
grubu, genç MKH’lerin koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilenler genç grubu ve
kültürde 30 gün geçirmiş MKH’lerin besiyerinde inkübe edilen hücreler ise senesent
grubu olarak isimlendirilmiştir. Bu karışık besiyerleri içerisinde belli bir süre inkübe
edilen kanser hücrelerine senesens, apoptoz, mitokondri membran potansiyeli ve
proliferasyon testleri yapılmıştır.
Ayrıca koşullandırılmış besiyeri elde edilecek MKH’lere, kültürde 30 gün geçirdikten
sonra beta-galaktozidaz boyama yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, kültürde
geçirilen sürenin MKH’lerde senesens mekanizmasını aktive ettiği gözlenmiştir.
44
Kültürde geçirilen zaman sonucunda aktive olan senesens mekanizması replikatif
senensens olarak adlandırılmıştır [9]. Bu senesens mekanizmasına kronik senesens adı da
verilir [8].
Koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücreler kültürden sonra β-galaktozidaz
boyama yapılmıştır. Bu test sonucuna göre mezenkimal kök hücrelerin sekretomunun
yine mezenkimal kök hücreler üzerinde etkisi gözlemlenmiştir. Kontrol grubunun
senesens yüzdesi %1.62, genç grubunun senesens yüzdesi %2.51 ve senesent grubunun
senesens yüzdesi ise %11.50 olarak belirlenmiştir. Kontrol besiyerinde ve genç MKH
koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen MKH’lerin senesens oranları birbirine
yakınken, senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre edilen hücrelerin senesens
oranında artış gözlenmiştir. Bu durum senesent MKH’lerce salgılanan sekretomun bir
başka MKH’de senesens mekanizmasını aktive ettiği şeklinde değerlendirilebilir. Doku
fenotipini belirleyen bu hücrelerin nişteki somatik hücrelere etki ettiği kadar, diğer kök
hücreleri de etkilediği düşünülebilir. Senesent bir kök hücreden, senesens mesajı içeren
sekretomu alan bir başka kök hücre de senesens mekanizmasına özgü moleküller
salgılamaya başlar [2]. Bu durum senesens mesajının artarak devam ettiği anlamına
gelebelir. Böylece dokunun tamamında bulunan hücreler senesens mesajını alabilirler.
MKH’lerin apoptoz testleri de senesens testlerine benzer bir durum göstermektedir.
Kontrol grubu apoptoz oranı %0,54 ve genç grubu apoptoz oranı %1,52 seviyesinde iken;
senesent grubu apoptoz oranının %12,96 seviyesine çıktığı görülmektedir. MKH’lerin
ölü hücre oranları ise oldukça düşüktür. Ölü hücre yüzdelerine bakıldığında kontrol
grubunda %0.02, genç grubunda %0 ve senesent grubunda %0.17 oranları görülmektedir.
Apoptoz oranının senesens oranı ile paralel bir durum göstermesi bu iki mekanizmanın
birbiri ile bağlantılı olduğunu düşündürmektedir. Apoptoz ve senesens mekanizmaları
birbirini takip eden mekanizmalar olabileceği gibi, eş zamanlı ilerleyen süreçler de
olabilir. Eğer bu iki sürecin birbirini takip eden iki mekanizma olduğu varsayımı ile;
senesens mekanizması aktive olmuş hücreler, bu mekanizmayı aktive eden etken
değişmediği taktirde apoptoza girmekte olduğu ifade edilebilir [52]. Bu durum
MKH’lerin, senesent bir hücreden alınan, senesens molekülleri ile başlayan ve apoptoz
hatta hücre ölümüne gidebilen bir mekanizmadan etkilendiklerini sonucunu ortaya
çıkarabilir. Canlı dokusunda bulunan MKH’lerin söz konusu mekanizmaları takip etmesi,
dokuda meydana gelen hücre kaybını dolayısıyla dokunun kendini yenileme kapasitesini
45
kaybetmesini gözler önüne sermektedir [53]. Diğer bir olasılık olan apoptoz ve senesens
süreçlerinin eş zamanlı mekanizmalar olma durumu ise ancak tek hücre çalışmalarıyla
belirlenebilir. Yani çalışmada kullanılan iki farklı metot, aynı hücre grubunu hedef
aldığından, bu grup içerisinde bulunan herhangi bir hücre, hem apoptoz hem de senesens
belirteçlerini ifade ediyor olabilir [54].
Mitokondri membran potansiyeli hücrenin fizyolojik durumu hakkında bilgi veren bir
diğer önemli parametredir [44]. Mitokondri membranının yükü hücrenin enerji
üretebilme kapasitesi hakkında önemli ipuçları vermektedir. Apoptoza giren ve hücre
ölümüne
yaklaşan
hücrelerde
mitokondri
membran
potansiyelinin
düştüğü
gözlenmektedir [52, 53]. MKH’ler üzerinde yapılan mitokondri membran potansiyeli
testleri sonucunda kontrol grubu hücrelerinde depolarizasyon yüzdesi %14 iken genç
grubunda depolarizasyon yüzdesi %22.92 seviyesine yükselmiştir. senesent grubunda
depolarizasyon yüzdesi ise %28.62 olarak ölçülmüştür. Bu durum senesent MKH’lerin
mikro çevrelerindeki diğer MKH’lerin mitokondriyal membran potansiyelin önemli
derecede etkilediğini göstermektedir. Senesent bir kök hücreye yakın olan başka bir kök
hücre enerji üretebilme kapasitesini belli ölçüde kaybetmektedir. Bu durum hücrenin
apoptoza girmesine neden olabilmektedir [45, 54]. Ortaya çıkan tablo bize; senesens,
apoptoz mekanizmasında mitokondri membran potansiyelinin senesens moleküllerinden
etkilenebilen bir parametre olduğunu, apoptoz mekanizmasının önemli bir parçası
olduğunu ve hücre ölümüne sebep olan etkenlerden biri olduğunu düşündürmektedir.
Senesens mekanizması aktive olmuş hücreler artık bölünmeye devam etmezler. Yani bir
diğer deyişle proliferasyon kapasiteleri düşer [2]. MKH’lere yapılan prolifereasyon
testlerinde, kültürün başlangıcında tüm gruplardaki hücre yüzdesi %100 olarak kabul
edildiğinde, kontrol grubu hücrelerinin 24.saatte %82.79 olan canlı hücre yüzdesinin
48.saatte %47.67’ye düştüğü gözlenmiştir. Genç grubunda ise 24.saatte %81 olan canlı
hücre yüzdesi 48.saatte %63.31 olarak ölçülmüştür. Senesent grubunda 24.saate %96.50
olan canlı hücre yüzdesi, 48.saatte %74,08’e düşmüştür. Beklenen sonuçlar 48.saatte en
düşük canlı hücre yüzdesinin senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen
hücrelerin bulunduğu kuyucuklarda olmasıdır. Ancak 96 kuyucuklu plakların her bir
kuyucuğunun yüzey alanı çok küçük olduğundan, beklenen sonuçların tam tersi bir tablo
ortaya çıktığı düşünülmektedir. Karşılaşılan durum şu şekilde açıklanabilir. Kontrol
grubu ve genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin bulunduğunu
46
grubun proliferasyon kapasiteleri, senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe
edilen hücrelerin bulunduğu gruptan daha yüksek olduğu için ilk saatlerde hızla
bölünmeye başlamışlardır. Ancak kuyucuklardaki alanın azlığı,
yoğunluğu artan
hücrelerin ölmeye başlamasına sebep olmuştur. Bu durumda hızlı bölünen hücreler erken
ölmeye başlamışlar, geç bölünen hücreler ise alan azlığını daha geç hissedeceklerinden
yaşamaya devam etmişlerdir. Böylece proliferasyon kapasitesi yüksek kontrol grubu ve
genç grubu hızlı bir şekilde bölünmüşler ve kısa sürede alan yetersizliğinden ölmeye
başlamışlardır. Bu durum 48.saatte kontrol grubunun canlı hücre yüzdesindeki ani
düşüşten anlaşılabilir. Senesent grubunun ise proliferasyon kapasitesi düşük hücrelerden
oluştuğu için, alan yetersizliğini hissedecek kadar fazla çoğalamadıkları ve hücreler
canlılıklarını korumaya devam ettiği düşünülebilir [9].
Test sonuçlarına göre senesent bir kök hücrenin sekretomu, kök hücrenin kendi mikro
çevresinde bulunan kök hücrelerin proliferasyon kapasitesini etkilemektedir. Dokudaki
kök hücrelerin proliferasyon kapasitesinin düşmesi dokunun yenilenebilirliği açısından
önemli bir dezavantajdır [49].
Bir kronik myleoid lösemi hücresi olan K562’ler de senesent hücrelerin koşullandırılmış
besiyeri ile kültüre edildikleri zaman sekretomda bulunan senesens mesajından
etkilendikleri gözlemlenmiştir. Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen
K562’ler ve kontrol grubu arasında anlamlı farklılık görülmemektedir. Kontrol grubu
senesens yüzdesi %14.11 iken genç grubunun senesens yüzdesi %19 olarak ölçümüştür
Ancak senesent MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edilen K562 hücrelerinin
senesens yüzdesi kontrol grubuna göre önemli bir artış göstermiştir. Senesent grubunda
bulunan hücrelerin senesens yüzdesi %30.33’dür. Yani senesens mekanizmasının bir
göstergesi olan β-galaktozidaz miktarının arttığı gözlenmiştir. Bu durum kronik myeloid
lösemi hücrelerinin senesent MKH’lerin sekrete ettikleri faktörlerden etkilendiği
anlamına gelebilir.
K562 hücrelerinin apoptoz testleri sonucunda elde edilen veriler 3 grup arasında anlamlı
farklılıklar olmadığını göstermektedir. MKH’lerin sekrete ettikleri faktörler sayesinde
senesens mekanizması aktive olmuş K562 hücrelerinin apoptoza girmedikleri
gözlenmiştir. Ancak ölü hücre yüzdelerini dikkate alırsak, gruplar arasında az da olsa
farklılıklar göze çarpmaktadır. Kontrol grubunda %6.51, genç grubunda %7.44 ve
47
senesent grubunda %10.56 olarak belirlenen ölü hücre oranları, MKH sekretomunun
K562 hücrelerinin canlılığı üzerinde etkili olduğunu göstermektedir.
Kronik myeloid lösemi hücrelerinin mitotik indeks testlerinden elde edilen sonuçlar
senesens testleri ile orantılıdır. Bu sonuçlara göre; kontrol grubunun depolarizasyon
yüzdesi %25.20 iken bu oran genç grubunda %27.27’ye senesent grubunda ise %31.38’e
yükseldiği gözlenmektedir. K562 hücrelerinin mitokondri membran potansiyelinin MKH
sekretomundan etkilendiği ve bu hücrelerin mitokondri membran potansiyelinin azaldığı
gözlenmektedir.
K562 hücrelerinin proliferasyon testleri sonucuna göre 24. saate ve 48. saatte gruplar
arasında anlamlı farklar gözlemlenmemiştir. 24 saat sonunda kontrol grubunda canlı
hücre yüzdesi %103.28 iken genç grubunda %106.38 ve 30.gün grubunda bu oran
%106.05’tir. 48 saat sonra kontrol grubunda kontrol grubunun canlı hücre yüzdesi
%120.11 iken, genç grubunda %136.08 ve senesent grubunda %132.21 seviyesine
yükselmiştir. Bu hücrelerin yüzen hücreler olması ve kuyucuklar içinde alan sıkıntısı
yaşamamaları, K562 hücrelerinin tutunan hücrelere oranla daha çok çoğalmalarını
açıklayabilir.
Sekretomun kronik myeloid lösemi hücrelerininin mitokondri membran potansiyelini
düşürmesine ve bu hücrelerde senesens yüzdesinde artışa sebep olmasına rağmen,
apoptoz mekanizmasını tetiklememiştir. Ayrıca proliferasyon testlerine bakıldığında
gruplar arasında anlamlı farklar görülmemiştir. Bu doğrultuda genç veya senesent MKH
sekretomunun K562 proliferasyonu üzerine önemli bir etkisi görülmediği söylenebilir
[52].
Kolon kanseri DLD1 hücreleri MKH koşullandırılmış besiyeri ile inkübe edildikten sonra
yapılan senesens testinin sonuçlarına göre, bu kanser hücreleri senesent MKH’lerin
sekretomundan etkilendiği ve senesens oranlarının arttığı gözlenmiştir. Ancak bu artış
miktarı çok fazla değildir. Kontrol grubunun senesens yüzdesi %11.39 iken, genç
grubunda %13.94, senesent grubunda ise %15.11’tir. MKH sekretomunun bu hücrelerin
senesens mekanizmasını etkilediğini söylemek mümkündür ancak bu etki MKH ve ya
K562 hücreleri üzerindeki etki kadar net değildir.
DLD-1 hücrelerinin apoptoz testlerinden elde edilen verilere göre, kontrol grubunda
apoptoz yüzdesi %5.68, genç grubunda apoptoz yüzdesi %4.97 ve senesent grubunda
48
apoptoz yüzdesi ise %11.02’dir. Bu durumda senesent MKH’lerin salgıladığı
moleküllerin DLD-1 hücrelerinde apoptoz mekanizmasını aktive ettiği söylenebilir. Bu
etki senesens oranı ile paralellik göstermektedir. Ancak MKH’lerin sekrete ettikleri
moleküller kolon kanseri hücrelerinde senesens mekanizmasından daha çok apoptoz
mekanizmasını harekete geçirmişlerdir. Ölü hücre yüzdelerine baktığımızda kontrol
grubunda %1.63, genç grubunda %4.97 ve senesent grubunda %2.06 oranları
görülmektedir. DLD-1 hücrelerinin canlılığının MKH sekretomunun varlığından önemli
oranda etkilenmediği söylenebilir.
Kolon kanseri hücrelerinin mitokondriyal membran potansiyeli testleri kontrol grubunda
%13.87, genç grubunda %17.76 ve senesent grubunda %15.44 depolarize hücre olduğunu
göstermektedir. Bu verilere göre; genç MKH sekretomunun kolon kanseri hücrelerinin
enerji üretebilme potansiyelini düşürdüğünü söyleyebiliriz.
DLD-1 hücrelerinin proliferasyon testlerine göre 24. saatte kontrol grubu canlı hücre
yüzdesi %96.04, genç grubunda canlı hücre yüzdesi %109.22 ve senesent grubunda canlı
hücre yüzdesi ise %101.51’dir. 48 saat sonra ise kontrol grubunda canlı hücre yüzdesi
%87.52, genç grubunda %102.30 ve senesent grubunda ise %95.61’tir. Bu sonuçlara
bakılarak kültürün ilk gününde senesent MKH sekretomu DLD-1 hücrelerinin
proliferasyonunu desteklediğini söylemek mümkündür. Kontrol grubunda ve senesent
grubunda ise önemli değişiklikler gözlenmemektedir. 48. saatte ise tüm grupların canlı
hücre yüzdesinde 24. saate göre düşüş gözlenmektedir. Bu düşüş MKH’lerde olduğu gibi
alan darlığı ile ilişkilendirilebilir.
DLD-1 hücrelerinin testlerinden elde edilen sonuçlara genel olarak bakacak olursak,
MKH sekretomunun DLD-1 hücrelerinin apoptoz mekanizmasını etkilediğini ancak bu
durumun mitokondri zar potansiyeli ve hücre proliferasyonu ile ilişkilendirilemeyeceğini
söyleyebiliriz. DLD-1 hücrelerinin senesens mekanizmaları MKH sekretomundan
etkilenmektedir. Ancak test sonuçlarına göre, bu etkileşim MKH-K562 ve MKH-MKH
etkileşiminde olduğu kadar net değildir. Bu durum senesens mekanizması çerçevesinde
salgılanan faktörlerin hücrenin köken aldığı dokuya göre farklılık gösterip
gösteremeyeceği sorusunu akla getirmektedir. Epitelyal kökenli DLD-1 hücrelerinin,
bulundukları dokuda MKH’ler ile sık karşılaşmamalarından dolayı bu hücrelerin MKH
sekretomunda bulunan senesens mesajından daha az etkilenebileceği ihtimalini göz
önüne sermektedir [52].
49
Meme kanseri hücreleri MCF-7’ler de DLD-1 hücreleri gibi epitel kökenli kanser
hücreleridir. MCF-7 hücrelerinin senesens testlerine göre kontrol grubunun senesens
yüzdesi %16.83, genç grubunun senesens yüzdesi %14.61 ve senesent grubunun senesens
yüzdesi ise %22.22’dir. Bu sonuçlar MCF-7 hücrelerinin senesens mekanizmalarının
senesent MKH sekretomundan etkilendiğini göstermektedir. Kontrol grubu ile 1. gün
grubu arasında anlamlı bir fark yoktur.
MCF-7 hücrelerinin apoptoz testi sonuçlarına göre apoptotik hücre yüzdesi kontrol
grubunda %5.26, genç grubunda %4.31 ve senesent grubunda %3 olarak belirlenmiştir.
Bu durum MCF-7 hücrelerinin apoptoz mekanizmalarının MKH sekretomundan
etkilenmediğini göstermektedir. Ancak gruplar içindeki ölü hücre yüzdelerini göz önüne
aldığımızda diğer üç hücre tipine kıyasla daha fazla ölü hücre olduğu görülmüştür. Ölü
hücre oranları kontrol grubunda %14.49, genç grubunda %15 ve senesent grubunda
%10.55 olarak belirlenmiştir. Ölü hücre oranları dikkate alarak, senesent MKH
sekretomunun MCF-7 hücrelerinde canlılığı desteklediğini söyleyenebilir [52].
MCF-7 hücrelerinin mitokondri membran potansiyeli testlerine göre depolarize hücre
yüzdesi kontrol grubunda % 37.39, genç grubunda %43.31 ve senesent grubunda ise
%41.88’dir. Bu sonuçlar arasında anlamlı farklılıklar olmaması apoptoz mekanizmasının
önemli bir parametresi olan mitokondri membran potansiyelinin de MKH sekretomundan
etkilenmediği sonucunu ortaya çıkarabilir. Ancak apoptoz testinin temel birleşeni olarak
kullanılan fosfatidil-serin miktarının az olmasına rağmen depolarize hücre miktarının
yüksek olması ilgi çekici bir durumdur.
MCF-7 hücrelerinin proliferasyon testlerine bakacak olursak 24. saate kontrol grubunda
canlı hücre yüzdesi kontrol grubunda %87.38, genç grubunda %92.99 ve senesent
grubunda %94.49 olarak belirlenmiştir. 48.saatin sonunda ise bu oranlar kontrol grubunda
%71.31, genç grubunda %84.61 ve senesent grubunda %77.59 olarak ölçülmüştür.
Kontrol grubundaki düşüş, hücre bölünmesinin hızlı bir şekilde devam edip, alan
sıkıntısının ortaya çıkmasıyla açıklanabilir. Genç MKH koşullandırılmış besiyeri ile
inkübe edilen hücrelerin proliferasyonunun yavaşladığını, böylece canlı hücre sayılarının
yüksek kaldığını söyleyebiliriz. Senesent MKH koşullandırılmış besiyerinde kültüre
edilen MCF-7 hücreleri ise genç grubundaki hücrelere göre daha fazla bölünerek kısıtlı
alanda canlılıklarını koruyamamışlardır. Bu durumda senesent MKH koşullandırılmış
50
besiyerinin MCF-7 hücrelerinde proliferasyonu desteklediği söylenebilir [52]. Bu veriler
ve apoptoz testindeki ölü hücre oranlarının tutarlı olduğu görülmektedir.
MCF-7 hücrelerinin senesens mekanizmalarının, senesent MKH sekretomu ile harekete
geçtiği söylenebilir. Ancak MKH sekretomunun, bu hücrelerin mitokondri membran
potansiyeli ve apoptoz mekanizmasına etkisi gözlemlenememiştir. Senesent MKH’lerin
sekretomu MCF-7 kanser hücrelerinde canlılığı ve proliferasyonu desteklediği
söylenebilir [52]. Bu durum literatürde yer alan bilgiler göz önüne alındığında, MCF-7
hücrelerinin metastatik bölgede bulunan bir adenokarsinom olmasını dikkate alarak,
neoplastik dönüşümün geç safhalarında, senesent MKH’lerin kanser gelişimini
hızlandırmış olabileceği ihtimalini ortaya çıkarmaktadır [2, 49].
4.2. Sonuç ve Öneriler
Mezenkimal kök hücrelerin farklı durumlarda salgıladıkları moleküllerin, çevredeki diğer
kök hücreleri etkilediğini söylemek mümkündür. Bu durumda moleküller vasıtasıyla
iletilen senesens mesajının diğer kök hücrelerde de aynı etkiyi yaptığı söylenebilir [2].
Böyle bir durumda dokudaki senesent kök hücrelerin sayısının artması, buna bağlı olarak
parakrin etki ile nişe salgılanan moleküllerin miktarında artış olması beklenir. Böylece
dokunun tamamındaki hücrelerde sekretomun etkisi altında kalacaktır. Dolayısıyla doku
profilinde değişiklikler olması mümkündür. Senesent bir mezenkimal kök hücre, parakrin
etkisi sayesinde dokunun kaderini belirleyebilir [49].
Genç veya senesent MKH’nin bulunduğu nişte bulunan kanser hücrelerininde
sekretomdaki moleküllerden etkilendiğini söylemek mümkündür. Ancak bu moleküller,
farklı hücrelerin, farklı mekanizmalarına etki etmektedir. Söz konusu moleküllerin etki
edeceği mekanizma, kanser hücresinin kökenine göre değişkenlik göstermektedir.
Örneğin; senesent MKH sekretomu, kronik myeloid lösemi hücrelerinin senesens
mekanizmasını aktive ederken, epitelyal kökenli kanser hücre hatlarının senesens
mekanizması üzerinde, yapılan çalışma ile gözlemlenebilen bir etkisi yoktur. Apoptoz
mekanizmasında ise kolon kanseri hücrelerinin senesent MKH sekretomundan
etkilendiği gözlenirken, diğer hücre hatlarının apoptoz mekanizmalarında değişkenlik
gözlenmemiştir. Mitokondri membran potansiyeli göz önüne alındığında kronik myleoid
lösemi hücrelerinde senesent MKH sekretomu ile enerji üretebilme kapasitelerinde
azlama görülmektedir. Epitelyal kökenli hücrelerde, MKH sekretomunun mitokondri
51
membran potansiyeline etkisi gözlenmemektedir. K562 ve MCF-7 hücrelerinde,
mitokondri membran depolarizasyonunun yüksek olmasına rağmen, apoptoz oranındaki
azlık ilgi çekici bir durumdur.
Test sonuçlarına göre; MCF-7 ve K562 hücreleri mitokondri membran potansiyelinin
düşük olmasına rağmen apoptoz belirteci olan fosfatidil-serin ifadeleri oldukça azdır. Bu
durum olası bir kaç senaryoyu akla getirmektedir. İlki bu iki mekanizma arasında bulunan
yolakların çalışmasının uzun sürmesi olabilir. İkinci ve daha mümkün olan senaryo ise
bu yolakların bir şekilde inhibe edilmiş olabileceğidir. Fosfatidil-serin ifadesini,
çevredeki hücrelere gönderilen ve hücrenin kendisinin apoptoza girdiğini ve ortadan
kaldırılması gerektiği belirten bir mesaj olduğunu düşünürsek, kanser hücrelerinin bu
mesajı bloke ederek hayatta kalmaya devam etmeleri olasıdır. Bahsedilen durum kanser
hücrelerinin kendini kamufle etmek için kullandığı bir mekanizma olabilir. Bir diğer
olasılık ise bu kanser hücrelerinin enerji ihtiyacını farklı bir yolla karşılıyor
olabilecekleridir. Bazı kanser hücreleri, enerji ihtiyaçlarını karşılamk için mitokondride
piruvatın oksidayonundan ziyade, sitozolde glikolizi takip eden laktik asit
fermantasyonunu tercih ederler. Onkolojide bu durum Warburg Etkisi olarak olarak
bilinir [55, 56].
Senesent MKH sekretomu sağlıklı hücrelerin proliferasyonunu azaltırken, meme kanseri
hücrelerinde proliferasyonu desteklediği gözlemlenmiştir. MCF-7 hücrelerinin metastatik
bölgeden izole edilen hücreler olduğunu düşünürsek, karşılaşılan bu sonuç doğaldır. Daha
önce yapılan çalışmalarda göstermektedir ki, senesent MKH’ler tümör gelişiminin geç
safhalarında, kanser hücrelerini desteklemektedir. Bu durum senesens mekanizmasının
dezavantajıdır [1].
MTT yönteminin, kanser hücreleri gibi çok çabuk çoğalan hücrelerde uygulandığında
alan sıkıntısı yaratma durumu olduğundan, Ki67 gibi farklı proliferasyon belirteçleri ile
daha net sonuçlar elde edilebilir.
Kullanılan kanser hücre hatları üzerinde hücre döngüsü testleri uygulanarak, kanser
hücrelerinin bölünmenin hangi fazında olduğunu öğrenmek, p53 gibi kontrol noktası
proteinlerinin çalışıp çalışmadığı hakkında önemli veriler sunabilir. Yine p53, p16, p21
gibi genlerin ifadeleri RT-PCR metoduyla incelenip hücrelerin fizyolojik mekanizmaları
hakkında önemli bilgiler elde edilebilir.
52
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, kanser hücreleri ile MKH sekretomu arasındaki ilişki
hakkında önemli ipuçları vermektedir. MKH sekretomunun içeriğindeki protein/peptit
karakterdeki moleküllerün tanımlaması yapılarak, bulunan moleküller arasındaki
yolaklar keşfedilebilir. Böylece MKH sekretomunun etki mekanizması çok daha net bir
şekilde gözler önüne serilebilir.
Bilindiği üzere çalışmada MKH sekretomu toplanıp kanser hücrelerine uygulanmıştır.
Ancak bu kanser hücrelerinin nişte MKH’ler ile iletişim halinde olduğunu göz önüne
alırsak, bu durumun sekretomda değişikliklere sebep olabileceği söylenebilir. Yani
kanser hücresini tanımayan naif bir MKH ile kanser hücresinin ne olduğunu bilen bir
MKH’nin salgıladığı faktörlerde değişiklikler olması söz konusudur. Aynı şekilde kanser
hücresinin salgıladığı moleküller MKH üzerine etki edip, salgı profilinde değişikliklere
yol açması oldukça mümkün görünmektedir.
Diğer bir nokta ise, kanser tedavisinde kullanılan kemoterapi ilaçlarının farklı senesens
mekanizmalarını aktive etmesidir. MKH ve kanser hücresinin bulunduğu bir ortama bu
kemoterapi ajanlarının girmesi, hem hücrelere, hem de salgıladıkları faktörlere etki
edecektir. Böyle bir durumda dolaylı etkiler ortaya çıkacaktır. Çok daha kapsamlı
çalışmalar ile bu konulara ışık tutulabilir.
Bu tez çalışmasıyla, MKH sekretomunun kanser hücrelerine etkisine dair önemli bilgiler
elde edilmiştir. Ancak elde edilen bilgilerden çok daha fazla bilimsel sorular ortaya
çıkarmıştır. Ortaya çıkan bu sorular, önemli projelerin ortaya çıkmasına yol açacaktır.
53
KAYNAKLAR
1. Rando, T.A., 2006. Stem cells, ageing and the quest for immortality. Nature, 441
(7097): 1080-1086.
2. Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F., 2007. Cellular senescence: when bad things happen
to good cells. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, 8 (9): 729-740.
3. Nardi, N.B, da Silva Meirelles, L., 2006. Mesenschymal stem cells: isolation, in vitro
expansion and characterization, pp 249-282. In: Stem Cells, Handbook of
Experimental Pharmacology (Eds. A.M. Wobus, K. Boheler) Springer-Verlag,
Berlin Heidelberg, 269 pp.
4. Forte, A., Finicelli, M., Grossi, M., Vicchio, M., Alessio, N., Santè, P., De Feo, M.,
Cotrufo, M., Berrino, L., Rossi, F., Galderisi, U., Cipollaro, M., 2009. DNA damage
and repair in a model of rat vascular injury. Clinical Science, 118 (7): 473-485.
5. Roninson I.B., 2003. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research,
63 (11): 2705-2715.
6. Tollefsbol, T.O., 2007. Techniques for analysis of biological aging. Methods
Molecular Biology 371: 1-7.
7. Hayflick, L., Moorhead, P.S., 1961. The serial cultivation of human diploid cell strains.
Experimental Cell Research, 25: 585–621.
8. Crescenzi, E., Palumbo, G., de Boer, J., Brady, H.J., 2008. Ataxia telangiectasia
mutated and p21CIP1 modulate cell survival of drug-induced senescent tumor cells:
implications for chemotherapy. Clinical Cancer Research, 14 (6): 1877-1887.
9. Kuilman, T., Peeper, D.S., 2009. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular
stress. Nature Reviews, Cancer, 9 (2): 81-94.
10. Acosta, J.C., Gil, J., 2012. Senescence: anew weapon for cancer therapy. Trends in
Cell Biology, 22 (4): 211-219.
11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J.D., Campisi, J., Toussaint, O., 2009. Protocols
to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a
biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols, 4 (12): 17981806.
12. Kuilman, T., Michaloglu, C., Mooi, W.J., Peeper, D.S., 2010. The essence of
senescence. Genes and Development, 24 (22): 2463-2479.
54
13. Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh,
H., 2011. Moleküler Hücre Biyolojisi Altıncı Baskıdan Çeviri (Çev Ed. Geçkil, H.,
Özmen, M., Yeşilada, Ö.,). Palme Yayıncılık, Ankara, 1150 pp.
14. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H., 2012. Mesenchymal stem cells isolated from
adipose and other tissues: basic biological properties and clinical applications, Stem
Cells International, 2012 (2012):1-9.
15. Kim, D.W., Staples, M., Shinozuka, K., Pantcheva, P., Kang, S.D., Borlongan, C.V.,
2013. Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characteization
and optimizing their therapeutic potential for clinical applications, International
Journal of Molecular Sciences, 14 (6): 11692-11712.
16. Netter, F.H., 1987. Muscoloskeletal system: anatomy, physiology and metabolic
disorders. Ciba-Geigy Corporation, New Jersey. 134 pp.
17. Phinney, D.G., Prockop D.J., 2007. Concise review: mesenchymal stem/multipotent
stromal cells: transdifferentiation and modes of tissue repair—current views. Stem
Cells, 25 (11): 2896-2902.
18. Iso, Y., Spees, J.L., Serrano, C., Bakondi, B., Pochampally, R., Song, Y.H., Sobel,
B.E., Delafontaine, P., Prockop, D.J., 2007. Multipotent human stromal cells
improve cardiac function after myocardial infraction in mice without long-term
engraftment. Biochemical and Biophysical Research Communications, 354 (3):
700-706.
19. Horvitz, E.M., Gordon, P.L., Koo, W.K., Marx, J.C., Neel, M.D., McNall, R.Y.,
Muul, L., Hofmann, T., 2002. Isolated allogeneic bone marrow-derived
mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis
imperfecta: Implications for cell therapy of bone. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 99 (13): 8932-8937.
20. Caplan, A.I., 2007. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus
regenerative medicine. Journal of Cellular Physiology, 213 (2): 341-347.
21. Galderisi, U., Giordano, A., Paggi, G.P., 2010. The bad and the good of mesenchymal
stem cells in cancer: Booster of tumor growth and vehicles for targeted delivery of
anticancer agent. World Journal of Stem Cell, 2 (1): 5-12.
55
22. Li, H.J., Reinhardt, F., Herschman, H.R., Weinberg, R.A., 2012. Cancer-stimulated
mesenchymal stem cells crete a carcinoma stem cell niche via prostaglandin E2
signaling. Cancer Discovery, 2 (9): 840-855.
23. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., 2013. Mesenchymal stem
cells, pp 513-524. In: Handbook of Stem Cell Volume 1 Pluripotent Stem Cell.
(Eds. A. Ayala, R. Lanza) Elsevier Inc, San Diego, 524 pp.
24. Stewwart, B.W., Wild, C.P., 2014. World Cancer Report, Chapter 5. World Health
Organization (WHO), 630 pp.
25. Breast cancer treatment, 2014. National Cancer Institute (NCI) (Web sayfası:
http://www.cancer.gov/types/breast/patient/breast-treatment-pdq#section/all
Erişim Tarihi: Kasım 2014).
26. Gage, M., Wattendorf, D., Henry, L.R., 2012. Translational advances regarding
hereditary breast cancer syndromes. Journal of Surgical Oncology, 105 (5): 444–
51.
27. Lin, A.W., Barradas, M., Stone, J.C., van Aelst, L., Serrano, M., Lowe, S.W., 1998.
Premature senescence involving p53
and p16 is activated in response to
constitutive MEK/MAPK mitogenic signalling. Genes and Development, 12 (19):
3008-3019.
28. Jones, K.L., Buzdar, A.U., 2004. A review of adjuvant hormonal therapy in breast
cancer. Endocrine-Related Cancer, 11: 391-406.
29. General Information About Colon Cancer, 2014. National Cancer Institute (NCI)
(Web sayfası: http://www.cancer.gov/types/colorectal/patient/colon-treatment-pdq
Erişim Tarihi: Kasım 2014).
30. Vogelstein, B., Papadopoulos, N., Velculescu, V.E., Zhou, S., Diaz Jr, L.A., Kinzler,
K.W., 2013. Cancer genome landscapes. Science, 339 (6127): 1546–1558.
31. Markowitz, S.D., Bertagnolli, M.M., 2009. Molecular origins of cancer: Molecular
basis of colorectal cancer. The New England. Journal of Medicine, 361 (25):
2449–2460.
56
32. Balaguer, F., Link, A., Lozano, J.J., Cuatrecasas, M., Nagasaka, T., Boland, C.R.,
Goel, A., 2010. Epigenetic silencing of miR-137 is an early event in colorectal
carcinogenesis. Cancer Research, 70 (16): 6609–6618.
33. What You Need To Know About Leukemia, 2014. National Cancer Institute (NCI)
(Web
sayfası:
http://www.cancer.gov/publications/patient-education/wyntk-
leukemia/AllPages Erişim Tarihi: Kasım 2014).
34. Provan, D., Gribben, J.G., 2010. Chapter 7: Chronic myelogenous leukemia. In:
Molecular Hematology (3rd ed.). Wiley-Blackwell, Singapore, 76 pp.
35. Jabbour, E., Cortes, J.E., Giles, F.J., O'Brien, S., Kantarjian, H.M., 2007. Current and
emerging treatment options in chronic myeloid leukemia. Cancer, 109 (11): 2171–
2181.
36. Kimura, S., Ashihara, E., Maekawa, T., 2006. New tyrosine kinase inhibitors in the
treatment of chronic myeloid leukemia. Current Pharmaceutical Biotechnology,
7 (5): 371–379.
37. Huguet, E.L., McMahon, J,A,, McMahon, A.P., Bicknell, R., Harris, A.L., 1994.
Differential expression of human Wnt genes 2, 3, 4, and 7B in human breast cell
lines and normal and disease states of human breast tissue. Cancer Research, 54
(10): 2615-2621.
38. Trainer, D.L., Kline, T., McCabe, F.L., Faucette, L.F., Feild, J., Chaikin, M., Anzano,
M., Rieman, D., Hoffstein, S., Li, D.J., 1988. Biological characterization and
oncogene expression in human colorectal carcinoma cell lines. International
Journal of Cancer, 41 (2): 287-296.
39. Klein, E., Ben-Bassat, H., Neumann, H., Ralph, P., Zeuthen, J., Polliack, A., Vánky,
F., 1976. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic
myeloid leukemia. International Journal of Cancer, 18 (4): 421–431.
40. Jongen-Lavrencic, M., Salesse, S., Delwel, R., Verfaillie, C.M., 2005. BCR/ABLmediated downregulation of genes implicated in cell adhesion and motility leads to
impaired migration toward CCR7 ligands CCL19 and CCL21 in primary
BCR/ABL-positive cells. Leukemia, 19 (3): 373-380.
57
41. Freshney, R.I., Culture of Animal Cells Sixth Edition. Wiley-Blackwell, New Jersey,
796 pp.
42. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K.,
Yamanaka, S.. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human
fibroblasts by defined factors. Cell, 131 (5): 861–872.
43. Koopman, G., Reutelingsperger, C.P., Kuijten, G.A., Keehnen R.M., Pals, S.T., van
Oers, M.H., 1994. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine
expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, 84 (5): 1415–1422.
44. Finkel, E., 2001 The mitochondrion: is it central to apoptosis?. Science, 292: 624626.
45. Zamzami, N., Kroemer, G., 2001. The mitochondrion in apoptosis: how Pandora's
box opens. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2: 67-71.
46. Wang, X., 2001. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes and
Development, 15: 2922-2933.
47. Mosmann, T., 1983. Rapid colorometric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological
Methods, 65 (1-2): 55-63.
48. Dowell, J. A., Johnson, J. A., Li, L., 2009. Identification of astrocyte secreted proteins
with a combination of shotgun proteomics and bioinformatics, Journal of
Proteome Research, 8: 4135–4143.
49. van Deursen, J.M., 2014. The role of senescent cells in ageing. Nature, 509 (7501):
439-446.
50. Elmore, S., 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic
Pathology, 35 (4): 495-516.
51. Bratton, D.L., Fadok, V.A., Richter, D.A., Kailey, J.M., Guthrie, L.A., Henson, P.M.,
1997. Appearance of phosphatidylserine on apoptotic cells requires calciummediated nonspecific flip-flop and is enhanced by loss of the aminophospholipid
translocase. The Journal of Biochemistry, 272 (42): 26159-26165.
58
52. Coppe, J.P., Desprez, P.Y., Krtolica, A., Campisi, J., 2009. The senescence-associated
secretory phenotype: The dark side of tumor supression. The Annual Review of
Pathology: Mechanism of Disease, 5: 99-118.
53. Ashkenazi, A., Salvesen, G., 2014. Regulated cell death signaling and mechanisms.
The Annual Review of Pathology: Mechanism of Disease, 30: 20.1-20.20
54. Vicencio, J.M., Galluzzi, L., Tajeddine, N., Ortiz, C., Criollo, A., Tasdemir, E.,
Morselli, E., Ben Younes, A., Maiuri, M.C., Lavandero, S., Kroemer, G., 2008.
Senescence, apoptosis or autophagy? When a damaged cell must decide its path--a
mini-review. Gerontology, 54 (2): 92-99
55. Gatenby, R.A., Gillies, R.J., 2004. Why do cancer have high aerobic glycosis. Nature
Reviews Cancer, 4: 891-899.
56. Kim, J.W., Dang, C.V., 2006. Cancer’s molecular sweet tooth and Warburg Effect.
Cancer Research, 66 (18) : 8927-8930
59
ÖZGEÇMİŞ
KİŞİSEL BİLGİLER
Adı, Soyadı: Mustafa Burak ACAR
Uyruğu: Türkiye (TC)
Doğum Tarihi ve Yeri: 18 Mayıs 1989, Boğazlıyan
Medeni Durumu: Bekar
Tel: +90 545 979 1905
e-mail: mbrkcr@gmail.com
Yazışma Adresi: Mevlana Mah. Turgut Özal Cad. Akasya Ap 14/55 Talas/KAYSERİ
EĞİTİM
Derece
Kurum
Lisans
E.Ü. Fen Fakültesi
Biyoloji Bölümü/KAYSERİ
Lise
İngilizce
2012
Yozgat Anadolu Lisesi
YOZGAT
YABANCI DİL
Mezuniyet Tarihi
2007
Download