tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü diş hastalıkları ve
advertisement
T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DİŞ HASTALIKLARI VE TEDAVİSİ ANABİLİM DALI ENFEKTE KÖK KANALLARINDA TREPONEMA DENTİCOLA, PORPHYROMONAS GİNGİVALİS VE BU BAKTERİLERE AİT VİRÜLANS FAKTÖRLERİNİN MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİK TEKNİKLER İLE İNCELENMESİ DOKTORA TEZİ Dt. Özgür İlke ATASOY ULUSOY TEZ YÖNETİCİSİ Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL ANKARA Ekim 2007 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DİŞ HASTALIKLARI VE TEDAVİSİ ANABİLİM DALI ENFEKTE KÖK KANALLARINDA TREPONEMA DENTİCOLA, PORPHYROMONAS GİNGİVALİS VE BU BAKTERİLERE AİT VİRÜLANS FAKTÖRLERİNİN MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİK TEKNİKLER İLE İNCELENMESİ DOKTORA TEZİ Dt. Özgür İlke ATASOY ULUSOY TEZ YÖNETİCİSİ Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 03/2005-23 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Ekim 2007 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay i İçindekiler ii Şekiller Resimler Grafikler iv Tablolar v Semboller, Kısaltmalar vi Önsöz viii 1. GİRİŞ VE AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Bakterilerin Pulpaya Giriş Yolları 4 2.2. Oral Kavitenin Mikrobiyolojisi 5 2.3. Oral Mikroorganizmaların Sınıflandırılması 7 2.3.1. Gram Pozitif Koklar 8 2.3.2. Gram Pozitif Çomaklar ve Filamanlar 9 2.3.3. Gram Negatif Koklar 10 2.3.4. Gram Negatif Çomaklar 10 2.4. Porphyromonas gingivalis 14 2.4.1. Porphyromonas gingivalis’in Virulans Faktörleri 15 2.5. Treponema denticola 19 2.5.1. Treponema denticola’nın Virulans Faktörleri 20 2.6. Kök Kanal Patojenlerinin Saptanmasında Kullanılan Yöntemler 22 2.6.1. Kültür Tekniği 24 2.6.2. Moleküler Biyolojik Yöntemler ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu 25 2.6.2.1. PCR’ın Kullanım Alanları 25 ii 2.6.2.2. PCR’da Kullanılan Bileşenler 28 2.6.2.3. PCR’ın Kültür Yöntemine göre Sağladığı Avantajlar 31 3. GEREÇ ve YÖNTEM 33 3.1. Örnek Seçimi 33 3.2. Kök Kanallarından Örnek Alınması 34 3.3. DNA Ekstraksiyonu 34 3.4. PCR Deneyleri 39 3.4.1. Örneklerde T. denticola ve P. gingivalis DNA’sının Saptanması 40 3.4.2 Treponema denticola DNA’sının Pozitif Saptandığı Örneklerde msp’nin İncelenmesi 42 3.4.3. Porphyromonas gingivalis DNA’sının Pozitif Saptandığı Örneklerde prtC’nin İncelenmesi 44 4. BULGULAR 50 5. TARTIŞMA 59 6. SONUÇLAR 68 7. ÖZET 70 8. SUMMARY 71 9.KAYNAKLAR 72 10.ÖZGEÇMİŞ 87 iii ŞEKİLLER, RESİMLER, GRAFİKLER Resimler Resim 1: Porphyromonas gingivalis’in elektron mikroskop görünümü Resim 2: Treponemaların ultra-ince kesitlerinde msp’nin lokalizasyonu Resim 3: DNA ekstraksiyonu işlemi sırasında tüplere Proteinaz K’nın aktarılması Resim 4: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen santrifüj işlemi Resim 5: Santrifüj işlemi için yerleştirilen tüpler Resim 6: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen inkübasyon Resim 7: Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazına yerleştirilmiş tüplerin görünümü Resim 8: Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazı Resim 9: msp DNA’sının araştırılması için kullanılan termal döndürücü Resim 10: msp DNA’sının araştırılmasında PCR ürünlerinin UV altında görüntülenmesi Şekiller Şekil 1: Çift sarmallı DNA molekülünün yapısı Şekil 2: Polimeraz Zincir Reaksiyonunda gerçekleşen basamaklar Şekil 3: Gerçek zamanlı florometrik PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri Şekil 4: PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri Şekil 5: Örneklerde bakteri varlığının saptanmasına yönelik Uni152-F, Uni220-R primer çifti ile Uni177T 5’ hidroliz probunun Escherichia coli 16S rDNA’sı üzerindeki yerleşimi Şekil 6: Örneklerde Treponema denticola DNA’sının saptanmasına yönelik Td1394-f, Td1498-r primer çifti ve Td1444 probunun yerleşimi Şekil 7: Örneklerde Porphyromonas gingivalis DNA’sının saptanmasına yönelik Pg-f, Pg-r primer çifti ve Pgs 5’ hidroliz probunun yerleşimi iv Şekil 8: Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 1’in saptanmasına yönelik tdmsp-f1 ve tdmsp-r1 primer çiftinin yerleşimi Şekil 9: Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 2’nin saptanmasına yönelik tdmsp-f2 ve tdmsp-r2 primer çiftinin yerleşimi Şekil 10: Porphyromonas gingivalis pozitif örneklerde prtC varlığının saptanmasına yönelik pgprtc-f, pgprtc-r primerlerinin ve pgprtc-p 5’ hidroliz probunun prtC’deki yerleşimleri Şekil 11: Gerçek zamanlı florometrik PCR sonunda cihaza B2 – G9 pozisyonlarına yerleştirilen tüplerden okunan son floresans değerlerinin gösterilmesi Şekil 12: ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında gerçekleştirilen çoğaltma sırasında çeşitli dalga boylarında kaydedilen floresans ölçümleri ve sıcaklık döngüsü Şekil 13: ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında gerçekleştirilen Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis hedef bölgelerinin çoğaltılması Şekil 14: Treponema denticola msp genotip 1 ve 2’nin amino asit dizilerinin karşılaştırılması Şekil 15: Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f1 ve tdmsp-r1 primer çifti ile elde edilen msp genotip 1’e ait 320 baz uzunluğundaki PCR ürünleri Şekil 16: Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f2 ve tdmsp-r2 primer çifti ile elde edilen msp genotip 2’ye ait 454 baz uzunluğundaki PCR ürünleri Tablolar Tablo 1: Kültür yöntemi ve diğer yöntemlerle günümüze kadar saptanmış olan başlıca kök kanal patojenleri Tablo 2: Tanımlanmış oral streptokok türleri Tablo 3: Tanımlanmış Aktinomiçes türleri Tablo 4:Siyah pigmentli Bacteroides türleri ve yeni sınıflandırmadaki adları Tablo 5: Pigmentsiz oral Bacteroides türleri Tablo 6: Besin gereksinimlerine göre sınıflandırılmış oral treponemalar v Tablo 7: DNA saflaştırma kitinin içerisinde bulunan materyaller ve miktarları Tablo 8: Proteinaz K’ ya eklenen su miktarları Tablo 9: W1 ve W2 solüsyonlarına eklenen etanol miktarları Tablo 10: Çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler, problar ve PCR yapışma sıcaklıkları Tablo 11: Patolojileri belirten gruplardaki örnek sayıları Tablo 12: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde T. denticola DNA’sı varlığının patolojilere göre Tablo 13: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde P. gingivalis DNA’sı varlığının patolojilere göre dağılımı Tablo 14: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde prtC DNA’sı varlığının patolojilere göre dağılımı Tablo 15: Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde msp DNA’sı varlığının patolojilere göre dağılımı Tablo 16: T. denticola/P. gingivalis DNA’sının birlikte saptandığı örnekler Semboller Kısaltmalar DNA: Deoksiribonükleik asit RNA: Ribonükleik asit PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu Real-time PCR: Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu prtC: Kollajenaz geni msp: Major surface protein (Ana yüzey proteini) CPS: Kapsüler polisakkarit gtf-A: Glikozil transferaz geni LPS: Lipopolisakkarit Hemin: haemin-ferriprotophyrin IX vi fim A: Fimbrilin gen IL-6: İnterlökin 6 MMP: Matrix metalloproteinaz COX: Siklooksijenaz dNTP: Deoksiribonükleotid trifosfat µM: Mikromolar nPCR: Nested PCR QRT-PCR: Kantitatif real-time polimeraz zincir reaksiyonu vii ÖNSÖZ Kök kanal enfeksiyonunda varolan spesifik bakterilerin varlığı ile ağrılı alevlenmeler, periapikal yıkım ve inatçı enfeksiyonlar arasındaki ilişki endodontide önemli bir yere sahiptir. Bu nedenle bu tip mikroorganizmaların doğru tanınması son derece güncel bir konudur. Ancak mikroorganizmaların ve yan ürünlerinin kök kanallarında tanımlanması amacıyla geliştirilen yöntemler son yıllarda büyük değişim göstermiştir. Bu amaçla yıllardan beri ‘altın standart’ olarak kabul gören kültür yöntemlerine alternatif olarak moleküler mikrobiyolojik teknikler gündeme gelmiştir. Mikroorganizmaların belirli gen bölgelerini taklit eden sentetik oligonükleotid primerlerin kullanıldığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu çeşitli hastalıklara neden olan bakterilerin tanımlanması ve prevalanslarının belirlenmesinde devrim niteliğinde bir gelişmedir. Bu nedenle bu tez çalışmasında çeşitli endodontik enfeksiyonlarda bulunan bakterileri ve virulans genlerini Polimeraz Zincir Reaksiyonu kullanıp incelemeye ve bu bakterilerin farklı klinik durumlar olan ilişkisini incelemeye çalıştık. Bu tez çalışmasının gerçekleştirilmesindeki destek, yardım ve doktora eğitimim boyunca büyük bir sabırla hiç esirgemediği ilgi ve anlayışı nedeniyle danışmanım sayın Prof. Dr. Güliz GÖRGÜL’e, anlayış ve desteğini asla esirgemeyen bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Tayfun ALAÇAM’a, katkı ve yardımlarından dolayı Doç. Dr. Meltem Yalınay ÇIRAK ve Dr. Doruk ENGİN’e, emeği geçen tüm hocalarıma ve bölüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. Destek, özveri ve sevgilerini asla esirgememiş olan eşime ve aileme de sonsuz sevgilerimi sunarım. Özgür İlke Atasoy Ulusoy viii 1. GİRİŞ VE AMAÇ Mikroorganizmalar ve ürünlerinin kök kanal enfeksiyonlarındaki dominant etiyolojik rolü ilk kez 1890’da pulpa dokusunda bakterilerin gözlemlenmesi ile anlaşılmıştır. Yine ilk kez 1960’larda mikroorganizmaların tanınması ve saptanması amacıyla mikroskopi, aerob kültür teknikleri ve biyokimyasal reaksiyonlar kullanılmaya başlanmıştır1. 1970’lerde ise endodontik enfeksiyonların çoğunda baskın bakteri türünün zorunlu anaeroblar olduğu ortaya çıkarılmıştır. Günümüzde kök kanal enfeksiyonlarının polimikrobiyal olduğu ve tek bir enfekte kök kanalında sayısı 3-12 arasında değişebilen bakteri türü bulunduğu bilinmektedir1. Kök kanal enfeksiyonunda varolan spesifik bakterilerin varlığı ile ağrılı alevlenmeler, periapikal yıkım ve inatçı enfeksiyonlar arasındaki ilişki, bir çok çalışmada gösterilmiştir2,3,4. Bu nedenle bu mikroorganizmaların iyi tanınması son derece önemlidir. Ancak yeryüzünde yaşayan bakterilerin büyük çoğunluğunun kültürü yapılamamaktadır. Birçok kara ve su ekosistem araştırmaları, mikroorganizmaların % 99’undan fazlasının laboratuvar koşullarında üremeye direnç gösterdiğini ortaya koymuştur5,6,7. İnsan vücudunda ve oral kavitede kolonize olmuş mikrobiyal kompleksin şimdiye kadar kültüve edilemeyen bir çok türü olduğu söylenebilir. Son 15 yıl boyunca mikrobiyal patojenler ve spesifik hastalıklar arasındaki ilişki moleküler yaklaşımlar kullanılarak açığa çıkarılmıştır. ‘Kırmızı kompleks’ olarak adlandırılan Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola ve Tannerella forsythia üçlüsünün kök kanal enfeksiyonlarındaki varlığı ile periapikal hastalığın şiddeti arasında pozitif bir ilişki bulunmaktadır. Bu mikroorganizmalar sahip oldukları çeşitli virulans faktörleri ve birbirleri ile gösterdikleri sinerji nedeniyle akut ve kronik apikal periodontitisin gelişmesinde başrol oynamaktadır. Bu bakterilerin, gereksinim duydukları özel üreme koşullarınının sağlanması çok güç olduğu için konvansiyonel kültür yöntemleri ile incelenmeleri zor olmaktadır. Dolayısıyla moleküler mikrobiyolojik tekniklerdeki ilerlemeden önce, bu mikroorganizmaların kök kanallarında saptanan düşük prevalansları, kök kanal enfeksiyonunun ilerlemesindeki baskın rollerini gölgelemekte idi. Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla kullanılan genotip tabanlı moleküler mikrobiyolojik yöntemlerden günümüzde en popüler olanı, 16S ribozomal RNA genlerindeki özel bölgelerinin çoğaltıldığı ‘Polimeraz Zincir Reaksiyonu’dur (PCR). Daha hassas ve özgül bir yöntem 1 olan PCR’ın araştırma laboratuvarlarına girmesiyle, yıllardan beri ‘altın standart’ olarak kabul görmüş kültür yöntemlerinin bu özellikleri sorgulanmaya başlanmış ve PCR’la karşılaştırıldığında can sıkıcı ve zaman alıcı olarak nitelendirilmiştir. Anaerobik bakterilerin tanımlanması, geleneksel kültür yöntemleri kullanıldığında, 7-14 gün gerektirirken, PCR ile yalnızca birkaç saatte başarılabilmektedir. Bakteri tanımlanması için genellikle basit bir PCR turu kullanılırken, nested PCR, multipleks PCR, Real-time PCR (Gerçek Zamanlı Florometrik Polimeraz Zincir Reaksiyonu) gibi varyasyonlara da başvurulmaktadır. Bu yöntemlerin çoğu niteliksel veya yarı nicelikseldir. Real-time PCR ise reaksiyon boyunca ürünlerin devamlı olarak ölçülmesi ile karakterize olup, diğer PCR yöntemlerine göre daha pratik ve hassastır. Mikroorganizmaların sahip oldukları patojenite derecelerine ‘virülans’ adı verilir. Mikroorganizmalar bünyelerinde barındırdıkları çok çeşitli virülans faktörleri nedeniyle endodontik hasar oluşturabilmektedir. Kollajenaz, P.gingivalisin bağ dokuyu parçalamasına neden olan yıkıcı bir enzimdir ve prt C geni ile kodlanmaktadır. Ana Yüzey Proteini, T.denticola’nın dış membranında bulunan düzgün altıgen yapıda bir adezindir. T.denticola’nın hücre iskeletinin düzenlenmesinde etkileri bulunur ve msp geni ile kodlanır. Mikroorganizmaların enfekte kök kanallarında görülme sıklıklarının PCR ile belirlendiği çalışmalar mevcuttur8-12, ancak literatür gözden geçirildiğinde virülans faktörlerinin Real-time PCR kullanılarak saptandığı çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmanın amacı; üç ayrı klinik durumda, enfekte kök kanallarından elde edilen örneklerden, Porphyromonas gingivalis ve Treponema denticola’nın varlığının ve prevalansının özgül ve hassas bir moleküler mikrobiyolojik teknik olan Real-time PCR ile belirlenmesinin ardından pozitif çıkan örneklerde msp ve kollajenaz (prtC) genlerinin araştırılmasının yapılmasıdır. İncelenecek vakalar semptomlarına göre ‘Akut Apikal Periodontitis’, ‘Kronik Apikal Periodontitis’ ve ‘Akut Apikal Abse’ gruplarına ayrılmış; bu üç patolojik durum ile adı geçen bakteriler ve virülans genlerinin varlığı arasında bir ilişkinin bulunup bulunmadığı incelenmiştir. 2 2. GENEL BİLGİLER Kök kanalına girerek periapikal bölgede hasar oluşturan mikroorganizmaların büyük çoğunluğu bakterilerdir13. Bakterilerin kök kanalında kolonize olduğu bir asırdan daha fazla zamandır bilinmektedir14. Oral florada bulunan mikroorganizmalar, ağız içinde patojen olmasa bile, metabolizma ürünleri, fizikokimyasal değişimler ve virülans faktörleri ile kanal içinde belirgin doku değişimlerine yol açabilmektedir13. İnsan vücudunda bulunan ortalama bakteri sayısının (104), memeli hücre sayısından (103) 10 kat daha fazla olduğu tahmin edilmektedir15. Bakterilerin dokuya invazyonu hasar oluşturduğunda enfeksiyon meydana gelir. Pulpal ve periradiküler endodontik hasar, mikroorganizmaların patojenik etkisiyle buna karşı verilen doku cevabı sonucu oluşur1. Belirli bir bakteri türünü davet edecek koşullar konak dokuda oluştuysa, o bakteri türünün er ya da geç o dokuda kolonize olması organizmanın tüm dokularında olduğu gibi kök kanalı için de geçerli olan bir beklentidir. Bakterinin hangi yolu izleyerek oraya geldiğinin klinik açıdan bir önemi yoktur16. Pulpa ve periapikal inflamasyonda bakterilerin birincil etyolojik rolünün önemi yıllar boyunca değişim göstermiştir17. Son yıllarda yapılan çalışmalar, herhangi bir mikroorganizmanın kök kanalında bulunduğu sürece önemli sayılması gerektiğine işaret etmektedir6,18,19. Deneysel çalışmalar, akut ve kronik enfeksiyonlarda özellikle anaerob bakterilerin önemini vurgulamaktadır20,21,22. Enfekte kök kanalının mikroflorası karışıktır. Kök kanallarında yaklaşık 10 farklı bakteri türü farklı kombinasyonlarda ve etkinlik seviyelerinde bulunmaktadır20. Bu bakteri türlerinden %70’i zorunlu anaeroblar ve mikroaerofiliklerdir. Tedavi boyunca bakteri türlerinin sayısı yapılan tedavi seansları sayesinde azalır ve anaeroblar çoğunlukla elimine edilir. Ancak bazı fakültatif anaerob veya gram pozitif bakteriler başarısız endodontik tedavi görmüş kök kanallarında varlıklarını sürdürebilmektedir20,23. Kök kanallarında mikroorganizmaların varlığı pulpal ve periapikal patolojik oluşumların gelişmesine neden olmaktadır. Endodontik enfeksiyonlar çoğunlukla polimikrobiyaldir ve endodontik hasar mikroorganizmalar arasındaki kooperasyon sonucu gelişir. Spesifik bakterilerin varlığı ile ağrılı alevlenmeler, periapikal yıkım ve inatçı enfeksiyonlar arasındaki ilişki, bir çok çalışmada gösterilmiştir2,3,4,6,24,25. Bu 3 nedenle bu mikroorganizmaların iyi tanınması son derece önemlidir. Ancak yeryüzünde yaşayan bakterilerin büyük çoğunluğunun kültürü yapılamamaktadır7. Birçok kara ve su ekosistem araştırmaları, mikroorganizmaların %99’undan fazlasının laboratuvar koşullarında üremeye direnç gösterdiğini ortaya koymuştur6,7,26. İnsan vücudunda ve oral kavitede kolonize olmuş mikrobiyal kompleksin şimdiye kadar kültüve edilemeyen bir çok türü olduğu söylenebilir. Son 15 yıl boyunca mikrobiyal patojenler ve spesifik hastalıklar arasındaki ilişki moleküler yaklaşımlar kullanılarak açığa çıkarılmıştır7. Bakteri ve ürünleri pulpa odasına en fazla çürük yoluyla ulaşmaktadır. Ayrıca, mine, sement, dentinin belirgin demineralizasyonu, travma ve konjenital durumlar sonucu pulpa ekspoze olabildiği gibi, dentin tübülleri, mine lamelleri ve anakorezis yoluyla da enfekte olabilmektedir27,28,29,30. 2.1. Bakterilerin Pulpaya Giriş Yolları 1. Koronal yol: Mikroorganizmalar, pulpa dokusuna en çok kron yoluyla invaze olmaktadır. Pulpa irritanlara karşı kendini tersiyer dentin oluşumu ve dentin remineralizasyonu ile korumaya çalışır. Bununla birlikte hasarın yayılması çoğu defa tamir olayından daha hızlı ilerlediği için mikrobiyal yayılım pulpaya ulaşır. Pulpanın açılması ve bakteriyel bulaşma iyatrojenik perforasyonlarda ve travma sonucu kırılan dişlerde görülebilir. Ayrıca abrazyon, erozyon ve atrizyon da pulpanın bakterilerce istila edilmesine neden olabilir17. Operatif işlemlerde mikroorganizmalar, tükürük kontaminasyonu ve çürük lezyonu aracılığıyla pulpaya ulaşabilmektedir. Derin çürüklü lezyonlarda çok sayıda mikroorganizma pulpal ekspozür oluşarak veya oluşmadan pulpaya ulaşarak pulpitis geliştirebilir. Normal koşullarda pulpadaki fagositler az sayıda bakteriyi yokederken, sayı, virülans ve direnç arasındaki denge bozulduğunda iltihabi reaksiyon ilerler. 2. Retrograd yol: Periodontal hastalığın pulpa hasarına neden olduğu görüşü hala devam etmektedir31,32,33,34. Mikroorganizmalar ile yan ürünleri pulpa odasına kök apeksinden veya diğer aksesuvar, lateral ve furkasyon kanallarından girebildiği gibi, kök kazıma ve düzleştirme işlemleri sırasında da pulpayı enfekte edebilmektedir17. Yapılan bir çalışmada periodontal kaynaklı abselerde %30-%58 oranlarında spiroket bulunurken, endodontik kaynaklı abselerde bu oranın en fazla %10 olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, endodontik hastalıktaki mikrofloranın marjinal periodontitistekine tam olarak benzemediği, yani periodontal hastalığın, endodontik enfeksiyona neden olamayacağı da ileri sürülmektedir14. 4 3. Hematojen Yol /Anakorezis: Mikroorganizmaların pulpaya giriş yollarından biri de, kan veya lenf dolaşımıdır. Ancak anakorezisin insanlarda belirgin hasar oluşturmaya yardım etmediği düşünülmektedir35,36. Yine de anakorezis, travmaya uğramış dişlerin enfekte olma nedenlerinden biri olarak kabul görmektedir37. 2.2. Oral Kavitenin Mikrobiyolojisi Oral kavite, insan vücudundaki mikroorganizmaların bir çoğunu barındırmaktadır. Günümüze kadar 700’den fazla tür saptanabilmiştir38. Bu oral türlerin %50’si henüz kültüve edilememiştir39. Kültür bağımsız teknikler, sağlıklı ve hastalıklı oral kavitenin bakteri çeşitliliğini daha iyi tayin etmek için kullanılmaktadır. Sağlıklı Oral Kavite Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanılarak yapılan bir çalışmada, sağlıklı oral kavitede bulunan 9 farklı bölge incelenmiştir38. Dilin dorsumu, lateral kenarları, bukkal epitel, sert ve yumuşak damak, diş yüzeyleri, subgingival plak, maksiller anterior vestibülde bulunan mikroorganizmaların %60’ından fazlası kültüve edilememiştir. Bazı bakteriler tüm bölgelerde saptanırken, bazıları yalnızca bölgeye özgü bulunmuştur. Örneğin Streptococcus sangius, Streptococcus gordonii, Abistrophia defectiva, Actinomyces türleri özellikle diş yüzeyinde kolonize olmaktadır38. Çürük Kavitesinin Bakteri Kompozisyonu Çürük kavitelerinde floranın incelendiği bir PCR çalışmasında, 224 bakteri türü ve filotipi saptanmıştır40. Bu çalışmanın bulgularına dayanarak; Streptococcus mutans, Lactobacillus, Bifidobacterium ve Atopobiu’dan başka türlerin de çürük oluşmasında etkili olduğu söylenebilir. Ayrıca Actinomycesler ve mutans olmayan Streptokoklar da çürük başlangıcında etkilidir. 5 Kök Kanal Enfeksiyonundaki Bakteri Kompozisyonu Baumgartner’a41 göre, ilk kez 1890 yılında pulpa hastalığı ile bakteri varlığı arasında bir ilişki olduğu ileri sürülmüştür. 1965 yılında yapılan bir çalışmada, bakterilerin pulpal ve periradiküler hasara neden oldukları kanıtlanmış olup, bu çalışmada pulpaları ekspoze edilen farelerde mikroorganizma bulunmadığında kendi kendine iyileşme gözlenirken, mikroorganizma varlığında pulpa nekrozu ve periradiküler lezyon oluşumu saptanmıştır41. Endodontik enfeksiyonlar polimikrobiyaldir ve endodontik enfeksiyonlardaki bakterilerin çoğu anaerobiktir. 1970’den önce kültür yöntemlerindeki kısıtlılıklar nedeniyle endodontik enfeksiyonlardan yalnızca birkaç tür izole edilebilmekteydi. Kültür yöntemlerindeki gelişmeyle, endodontik enfeksiyonlarda, apikal lezyonla ilişkili her enfekte kanal başına saptanabilen mikroorganizma sayısı 12’ye ulaşmıştır. Enfekte kanallardaki bakteri sayısı ile periradiküler radyolüsensilerin boyutu arasında pozitif bir ilişki bulunmaktadır42. Tablo 1, şimdiye kadar endodontik enfeksiyonlardan en sık izole edilen mikroorganizmaları göstermektedir. 6 Tablo 1: Kültür yöntemi ve diğer yöntemlerle günümüze kadar saptanmış olan 41 başlıca kök kanal patojenleri a. Oral Mikroorganizmaların Sınıflandırılması Bakterilerin farklı hücre yapıları nedeniyle, çeşitli kimyasallarla farklı renklerde boyanmasına ‘Gram boyama’ denir16. Gram pozitif bakterilerin hücre duvarlarında peptidoglikan (mukopeptid) tabakası daha kalındır ve bu kalın tabaka gram negatif bakterilerde bulunmayan teikoik asit içermektedir. Gram negatif bakterilerin hücre duvarı ise lipopolisakkaritten oluşmuştur. Kristal viyole ile lugol, hücre duvarlarından geçerek bakterileri boyar. Gram pozitiflerde bu boyalar hücre çeperinden zor ayrılan bileşikler yaparak alkol uygulandığında mor renklerini kaybetmezler. Gram negatiflerde ise hücre çeperinde bulunan lipitler, alkolle çözünerek, boyayı 7 verirler ve bu tür bakteriler fuksinle boyandığında pembe-kırmızı renge boyanır16. 2.3.1. Gram Pozitif Koklar 43 a) Streptokoklar Streptokoklar oral mikrofloranın geniş çoğunluğunu temsil etmektedir ve ağzın tüm bölgelerinden izole edilebilmektedir. Geleneksel olarak oral streptokoklar, basit biyokimyasal ve fizyolojik testlerle sınıflandırılabilmekte ve birbirinden ayrılabilmektedir. Günümüze kadar tanımlanmış oral streptokoklar Tablo 2’de gösterilmiştir. Tablo 2. Tanımlanmış oral streptokok türleri 43 Grup mutans grubu Tür S.mutans, serotip c,e,f S.sabrinus serotip d,g S.cricetus serotip a S.rattus serotip b S.ferus S.macacae S.downei serotip 4 salivarius grubu S.salivarius S.vestibularis S.constellatus S.intermedius S.anginosus Anginosus grubu mitis grubu S.sangius S.gordonii S.parasonguis S.oralis S.mitis S.crista Diğer oral streptokoklar S. pyogens, P. micros, P. magnus, P. anaerobius, P. micros’tur. 8 b) Enterokoklar Enterokoklar, normal bağırsak florasının üyeleri olarak bilinmektedir. Ayrıca enfekte yara sahası, üriner sistem enfeksiyonları ve kan dolaşımındaki en sık karşılaşılan patojenlerdir44,45. Enterokoklara immün ve medikal olarak baskılanmış hastalarda sıkça rastlanılmaktadır. Uygun seçici ortam kullanıldığında, çeşitli oral bölgelerden düşük sayıda izole edilebilmektedir. En sık karşılaşılan enterokok, Enterococcus faecalistir. Fakültatif anaerob gram negatif bir kok olan E. faecalis, özellikle başarısız endodontik tedavi görmüş dişlerin kök kanallarında sıklıkla bulunmaktadır, çünkü bu bakteri antimikrobiyal ajanlara son derece dirençlidir46. c) Stafilokoklar, Mikrokoklar ve Stomatokoklar Bu gruptaki mikroorganizmalar, oral kaviteden çok sıklıkla izole edilemezler. Ancak stafilokokların, protez kullanan hastaların plak örneklerinde saptandığı bildirilmiştir43. Ayrıca çeşitli oral enfeksiyonlardan ve immun olarak baskılanmış hastalardan elde edilen plak örneklerinde de rastlanmıştır. 2.3.2. Gram-Pozitif Çomaklar ve Filamanlar43 Genellikle dental plaktan izole edilirler. Bu bakterilerin sınıflandırılmasında kemotaksonomik metodlar, (hücre duvar kompozisyonu, asidik fermentasyon ürünlerinin profili,vb.) ve serolojik yaklaşımlar kullanılmaktadır. Actinomyces, Eubacterium, Lactobacillus, Propionibacterium bu gruba dahil edilmektedir. Actinomyces grubunun türleri Tablo 3’ de gösterilmektedir. 9 Tablo 3: Tanımlanmış Aktinomiçes türleri 43 Günümüzdeki ismi Actinomyces georgiae Önceki Sınıflama Subgingival Actinomyces sp. Actinomyces gerencseriae A. israelii serotip 2 A. israelii A. israelii serotip 1 A. odontolyticus A. odontolyticus A. naeslundii genotipler 1 A. naeslundii serotip 1 A. naeslundii genotipler 2 A. naeslundii serotip 2 & 3 A. viscosus serotip 2 A. meyeri A. meyeri A. bernardiae A. radingae A. neuii A. europaeus A. graevenitzii A. turicensis 2.3.3. Gram Negatif Koklar47 Bu grup, Neisseriaceae ve Veillonellae familyasından oluşur. Neisseriaceae familyasına Neisseria, Branhamella, Moraxella, Kingella ve Actinobacter cinsleri dahil edilebilir47. Veillonellae familyası, oral kavitenin bir çok bölgesinden izole edilmekteyse de en fazla dental plakta bulunmaktadır. Bu grup V. parvula, V. dispar ve V. atypica türlerinden oluşmaktadır. 2.3.4. Gram Negatif Çomaklar47 a) Fakültatif Anaerob ve Kapnofilik Genera Ağızdaki fakültatif anaerob gram negatif rodların çoğu, Haemophilus genusuna aittir. Genellikle saliva, dental plak ve epitelyal bölgelerde bulunurlar. H. parainfluenzae (biyotip 1,2 ve 3), H. segnis (biyotip 5), H. paraphrophilus (biyotip 5), H. aphrophilus (biyotip 10), H. haemolyticus (biyotip 10,5), bu gruba dahil edilebilir. Bu türler çene 10 enfeksiyonları ve enfektif endokardit vakalarından izole edilmiş olsa da patojenik özellikleri çok düşüktür. Diğer fakültatif anaerob gram negatif rodlar arasında enfektif endokardit, abse ve periodontal hasarlardan sıkça izole edilen Eikenella corrodens bulunmaktadır. Capnocytophaga, CO2 bağımlı gram negatif rodlar olup subgingival plak ve gingivitis vakalarından izole edilmektedir. Bu türlere, C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena, C. granulosa ve C. haemolytica dahil edilebilir. Actinobacillus actinomycetemcomitans, adelosanlardaki agresif periodontal hasardan sorumlu mikroaerofilik, kapnofilik ve fakültatif anaerob bir mikroorganizmadır. A. actinomycetemcomitans, lökotoksin, kollajenaz ve proteaz gibi çeşitli virülans faktörlerine sahiptir. Simonsiella, insan ve hayvanlardaki oral kavitenin epitel yüzeylerinden izole edilen gram negatif anaerob bir mikroorganizmadır. b) Zorunlu Anaerobik Gram negatif Rodlar Bu gruptaki mikroorganizmalar süperoksit dizmutaz ve katalaz enzimine sahip değildir41. Zorunlu anaerobik gram negatif bakterilerin sınıflandırılması oldukça zordur. Bazı türler o kadar zor üremektedir ki, fermentasyon ve enzim aktivitesi gibi testlerde net sonuçlar elde edilememektedir, çünkü metabolitlerin konsantrasyonu memnun edici bir analiz için çok düşüktür. Bu mikroorganizmaların tanımlanabilmesi için geleneksel kültür yöntemleri ile sağlanamayan özgüllük, moleküler mikrobiyolojik yöntemlerin gelişimi ile başarılabilmektedir. Hatta laboratuvar koşullarında kültüve edilemeyen yeni türler, DNA-DNA hibridizasyon ve 16S rRNA genin çoğaltılmasını esas alan PCR gibi yöntemlerle tanımlanabilmektedir8,10,48,49. Oral anaerobik gram negatif rodların büyük çoğunluğu, Bacteroides genusunun içinde yer almaktadır. Bu gruptaki bazı organizmalar, kanlı agarda üretildiklerinde karakteristik kahverengi veya siyah pigmentli koloniler meydana getirmektedir. Bu nedenle siyah pigmentli anaeroblar olarak bilinirler ve endodontik enfeksiyonlarla yakın ilişki 41,50 50 içerisindedirler . Nisengard’a göre, ilk kez 1921’de Oliver ve Wherry bu mikroorganizmaları oral bölgeden izole etmişler ve başlangıçta bu siyah pigmentin ‘melanin’ olduğunu ileri sürmüşlerdir. Ancak yakın zamanda ‘protoheme’ olduğu anlaşılan bu pigment, oksijenin toksik etkilerinden hücreleri korumaya yardım eden bir defans mekanizması gibi davranır13,41,50. Ayrıca ‘haemin’ de siyah pigmentli mikroorganizmalar için hayati bir büyüme faktörü olarak bilinmektedir41. 11 Yeni sınıflandırmada asakkoralitik ve sakkoralitik oral türler sırasıyla Porphyromonas ve Prevotella generasının içinde yer almaktadır. Prevotella genusunda yer alan sakkarolitik bazı türler asetik süksinik (acetic succinic) ve glukozun diğer asitlerini üretmektedir. Bu türlerin başlıcaları ve yeni sınıflandırmadaki adları Tablo 4’ de gösterilmektedir. Tablo 4: Siyah pigmentli Bacteroides türleri ve yeni sınflandırmadaki adları 41 Porphyromonas: Siyah-pigmentli (asakkarolitik Bacteroides türleri) Porphyromonas asaccharolyticus Porphyromonas gingivalis Porpyromonas endodontalis Prevotella: Siyah-pigmentli (sakkarolitik Bacteroides türleri) Prevotella melaninogenica Prevotella denticola Prevotella loescheii Prevotella intermedia Prevotella nigrescens Prevotella corporis Prevotella tannerae Pigmentsiz oral sakkoralitik türler ve yeni sınıflandırmadaki adları ise Tablo 5’ de gösterilmiştir. Tablo 5: Pigmentsiz oral Bacteroides türleri 41 Prevotella: Pigmentsiz (sakkarolitik Bacteroides türleri) Prevotella buccae Prevotella bivia Prevotella oralis Prevotella oris Prevotella oulorum Prevotella ruminicola Sakkarolitik pigmentsiz türler olarak tanımlanan, ancak metabolik son ürünlerine, fermentasyon profillerine ve esas enzimlerine göre farklılaşma gösteren bakteri türleri Bacteroides capillosus, Bacteroides forsythus, Bacteroides pneumosintes’i kapsamaktadır43. Yeni sınflandırma ile B. forsythusun adı Tannerella forsythia; B. pneumosintes’in adı ise Dialister pneumosintes olarak değişmiştir10,41. 12 Zorunlu anaerob gram negatif bakterilerin bir başka ana grubu Fusobacterium genusuna ait bakterilerdir. Çoğu zaman asakkarolitik olarak tanımlanan ve uzun filamanlar halinde bulunan bu hücreler; Fusobacterium alocis, F.sulci, F.periodonticum, F.nucleatum (alt grupları; F.subsp. nucleatum, F.subsp. polymorphum, F.subsp. fusiforme), F.vincentii’i kapsamaktadır. Diğer gram negatif anaerobik ve mikroaerofilik bakteriler Leptotrichia buccalis, Wolinella succinogens ve Campylobacter türlerini içermektedir. Campylobacter türleri Campylobacter concisus, C. showae, C. sputarum, C. curvus, C. rectus ve C. gracilis’tir. C. curvus, C. rectus ve C. gracilisin eski sınıflandırmadaki adları sırasıyla Wolinella curva ve Wolinella recta ve Bacteroides gracilis’tir. Kök kanal tedavisindeki akut alevlenmeler ve çevre dokulardaki yıkıcı harabiyetlerle özellikle siyah pigmentli mikroorganizmalar arasında anlamlı bir ilişki olduğu düşünülmektedir. Prevotella ve Porphyromonas türleri gibi pulpal lezyonlarda varolan siyah pigmentli bakteriler, iltihabi mediatörlerin, doku yıkımı ve kemik rezorpsiyonunda rol oynayan yıkıcı enzimlerin aktivasyonu ile klinik semptomların gelişiminde önemli rol oynamaktadır 51,52,53,54. Socransky ve arkadaşları55, checkboard DNA-DNA hibridizasyon metodunu kullanarak periodontal hasarın ciddiyeti ile en fazla ilişkili buldukları ‘P. gingivalis, T. forsythia ve Treponema denticola’ üçlüsüne ‘kırmızı kompleks (red complex)’ adını vermişlerdir. Bu kompleksin, aktif marjinal periodontitisin ilerlemesinde önemli role sahip olduğu bilinse de, son çalışmalarda bu birleşim, enfekte kök kanallarında da yüksek oranlarda saptanmış ve periapikal hasarla yakın ilişkili bulunmuştur18,56. Periapikal enfeksiyonlarda en sık rastlanan siyah pigmentli anaerob rodlar P.endodontalis, P.gingivalis, Prevotella intermedia, P.nigrescens’ tir57,58. Siyah pigmentli bakterilere üye olmamasına karşın Treponema denticola kırmızı komplekse dahildir. P.gingivalis ile sinerjist ilişkisi bulunur ve bu sinerjinin akut periapikal semptomlarla yakın ilişkili olduğu gösterilmiştir18,25,56,59. T. denticola, T. forsythia ve P. gingivalis’in bir özellikleri de geleneksel kültür yöntemleriyle kültüve edilmelerinin çok zor olmasıdır. Bu nedenle bu mikroorganizmalar ‘zor üreyen’ mikroorganizmalar olarak da tarif edilirler57. 13 2.4. Porphyromonas gingivalis P.gingivalis, non-fermenter, siyah pigmentli zorunlu gram negatif bir anaerob roddur60. Boyutları 0.5 µm-1.2 µm arasındadır ve kokobasil görünümündedir41,43 (Resim 1). Bu morfoloji besiyerinin özelliklerine göre değişmektedir. P.gingivalis, birincil ekolojik ortamı oral kavitede bulunan önemli bir periodontal patojendir61,62. Çoğunlukla subgingival bölgelerde ve dişeti oluğunda bulunur; dil ve tonsillerden de izole edilebilmektedir. Daha çok periodontal sorunlu dişlerin periodonsiyumlarında rastlanılsa da, son yıllarda yapılan moleküler mikrobiyolojik çalışmalar P.gingivalisin enfekte kök kanalının da başlıca patojenlerinden biri olduğunu 56,58,60,63 göstermiştir . P.gingivalis, kök kanalındaki karışık anaerobik floranın bir üyesidir. Özellikle abseli dişler ve semptomatik periradiküler lezyonlardan izole edilebilmektedir60. Resim 1: Porphyromonas gingivalis’in elektron mikroskop görünümü 43 (N. Mordan, Eastman Dental Institude) P.gingivalis, son on yıl içerisinde üzerinde en fazla durulan iki oral patojenden biridir. Beslenme gereksinimi, konaktaki davranış biçimi, çoğu diş ve dişeti enfeksiyonunda yer alması ve birçok yıkıcı virülans faktörüne sahip olması nedeniyle endodontide ayrı bir öneme sahiptir41. Hemin (haemin-ferriprotophyrin IX), siyah pigmentli diğer mikroorganizmalar için olduğu gibi, P.gingivalis için de önemli bir faktördür. P. gingivalis, üremek için değil ancak hastalık yapabilmek için en az 0.5 µg/ml konsantrasyonda hemine ihtiyaç duyar. Heminden zengin besiyerinde üretilen P.gingivalisin hastalık yapabilme yeteneği de daha fazladır. P.gingivalisin kendisine hemin sağlayabilecek iki kaynağı bulunur: 14 1) Floradaki başka bakterilerin katabolik artıkları 2) Konak dokunun kendisi. P.gingivalis heminden fakir ortamda içerisi toksik enzimlerle dolu ekstraselüler veziküller oluşturur. Bu şekilde konak dokuya zarar verir13. 2.4.1. Porphyromonas gingivalis’in Virülans Faktörleri Mikroorganizmalar tarafından oluşturulan patojeniteye ‘virülans’ denir . P.gingivalis’in başlıca virülans faktörleri şunlardır: 41 a)Kapsül Kapsül, P.gingivalislerin çoğunda bulunan önemli bir virülans faktörüdür. P.gingivalis’te 6 adet kapsüler serotip bulunmaktadır ve kapsüler serotipe bağlı olarak virülans da değişim göstermektedir64. Kapsül, K antijeninin varlığı ile yakın ilişkilidir65. K antijeninin varlığı P.gingivalis’in serum direncini, düşük kemiluminesansını ve fagositoza direncini sağlar66. P. gingivalis CPS (kapsüler polisakkarit) ile aşılanmış farelerin P.gingivalis’in yol açtığı oral kemik kaybından korunduğu gösterilmiştir67. Bu veri, P.gingivalis CPS’ nin, bakteriye bağlı oral kemik kaybından korunmada aşı adayı olduğunu göstermektedir. b) Fimbriya P. gingivalis fimbriyaları, immunojenlik, çeşitli konak proteinlerine bağlanma, sitokin üretimi ve kemik rezorpsiyonunun teşviki gibi çok çeşitli biyolojik aktiviteye sahiptir68. P.gingivalis’in hücre yüzeyinde 2 farklı tipte fimbriyası bulunur. Fimbrilin genin (fimA) DNA dizisi, genin yapısında türler arası farklılıklar olduğunu ancak ortak immunolojik özgüllüklerin kaldığını göstermektedir69. Son zamanlarda, P.gingivalis’in ana fimbriyası, fimA genindeki çeşitliliğe dayanarak 6 tipe (I-V ve Ib) ayrılmıştır70. Tip II fimA klonlarının, diğer tiplerdeki fimA klonlarına göre daha fazla adeziv ve invaziv yeteneğe sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca fimbriyalı P. gingivalislerin fimbriyasız olanlara göre insan dendritik hücrelerine daha kolay girebildiği in vitro olarak gösterilmiştir71. Sonuç olarak, bu tür fimbriya farklılıkları yumuşak doku enfeksiyonlarının gelişimini etkilemektedir. c) Glikozil Transferaz gtf-A geni Narimatsu ve arkadaşları72 yaptıkları çalışmada, varsayılan bir glikozil transferaz genini, Porphyromonas gingivalis’ten izole etmişler ve gtfA olarak adlandırmışlardır. Morfolojik olarak gtfA’ya sahip olmayan 15 P.gingivalis olgun fimbriyadan yoksundur. Ayrıca daha düşük otoagregasyon ve hücrelere bağlanma yeteneği göstermiştir. gtfA geni hücrelere bağlanmak için olduğu kadar otoagregasyon için de P.gingivalis’e gerekmektedir. gtfA geni adezyonu düzenlemek suretiyle P.gingivalis’in patojenitesinde önemli rol oynamaktadır. d) Asetilnörominik ve glukoronik asit P.gingivalisin konak hücrelere bağlanmasında önemli role sahiptir20. e) İnvazyon Konak dokuya ve hücrelere invaze olabilme yeteneği P.gingivalis için önemli bir virülans faktörüdür. P.gingivalis’in gingival epitelyal hücrelere girebilme oranları yüksektir ve bakteriler konak hücre çekirdeğinin çevresindeki bölgede birikirler73. P.gingivalis, konak hücrelerin içinde 24 saatten daha uzun bir süre kalabilir. Hücrelerin şekil ve boyutlarındaki değişiklikler ile birlikte aktin hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini teşvik eder. P.gingivalis, endodontik giriş yolunu kullanarak koroner arter endotelyal hücrelerine doğru ilerleyebilir74. Kök kanal enfeksiyonuyla ilişkili mikroorganizmalar, kardiyovasküler hücrelerin primer kültürlerine invaze olabilmektedir75. P. gingivalis, P. intermedia, A. actinomycetemcomitans ve T. forsythia aterosklerozun gelişimi ve ilerlemesinde rol oynamaktadır76,77. Fare modellerinde, P.gingivalisle uzun süreli temasın aterojenik plak oluşumunu arttırabileceği gösterilmiştir78. f) Kollajenaz (prtC) Kollajenaz, P.gingivalis tarafından salgılanan önemli ve etkin bir virülans faktörüdür. Siyah pigmentli anaerob diğer bakteriler kollajenaz üretiyor olsa da, gerçek kollajenaz üreten tek bakteri P.gingivalis’tir79,80. Kollajenaz geni, periradiküler hasarda P.gingivalis için olası bir yayılma faktörü olarak düşünülmektedir81. Kato ve arkadaşları82, prtC genini düzenleyerek prtC gen ürününün enzimatik analizini yapmışlardır. prtC gen ürününü, tip1 kollajeni ve azokolü enzimatik olarak parçalayabilen 37.8 kDa dimeri olarak karakterize etmişlerdir. Slots ve arkadaşları83, prtC primerleri kullanarak yaptıkları bir çalışmada, endodontik enfeksiyonlardan izole edilen tüm P.gingivalis izolatlarının prtC geni içerdiği gösterilmiştir. Tam tersine Bodinka ve 16 arkadaşları84, prtC’nin 548 baz çiftlik parçasını 21 P.gingivalis’in ancak 16’sında saptamışlardır. Odell ve arkadaşları81, P.gingivalis’in 16 klinik izolatının hepsinde kollajenaz genine rastlamışlardır. g) Toksinler Lipopolisakkarit (LPS), konak dokunun harabiyetine neden olan biyolojik aktiviteleri yöneten bir moleküldür85. Lipopolisakkarit, P.gingivalis için çok önemli bir virülans faktörüdür ve kemik rezorpsiyonunda rol oynayan ana etken olduğu ileri sürülmektedir20. P.gingivalis LPS ile teşvik edilen kemik rezorpsiyonu ve gingival dokudaki interlökin-6 (IL-6) üretimi, CD14’e karşı geliştirilen antikor tarafından engellenir. CD14, insan gingival fibroblastları ve gingival epitelyal hücrelerdeki LPS için belirgin bir reseptördür20. Lipopolisakkarit ve periapikal lezyon varlığı arasında bir doğru orantının var olduğu düşünülmektedir20,85. Apikal periodontitisli dişlerin pulpalarında, yüksek seviyelerde LPS bulunduğu bildirilmiş ve bakterilerin bu mekanizma ile apikal lezyon oluşturdukları ileri sürülmüştür86. Ayrıca enfekte pulpa nekrozlarındaki gram negatif bakterilerin prevalansı ile LPS seviyeleri arasında güçlü bir ilişkinin var olduğu da gösterilmiştir86. h) Proteaz ve Proteaz İnhibitörleri Non-fermenter P. gingivalis büyümek için proteinlerin hidrolizinden elde edilen peptitlere ihtiyaç duyar. Bu enzim virülans belirleyici ana faktördür ve sistein proteinaz ile karakterize olup gingipain adını alır87. P. gingivalisin bu sistein proteinazları, genellikle periodontal patojenlerin başlıca virülans faktörleridir88,89. O-Brien-Simpson ve arkadaşları90, gingipainleri mikrobiyal vampirlerin moleküler dişleri olarak nitelendirmişlerdir. Bradikinin ve trombin, sinerjist çalışan proinflamatuar ajanlardır ve kemik rezorpsiyonunu tetikleyen güçlü bir etkiye sahiptir. Bu proteinazlar rgpA, rqpB ve kgp genleriyle kodludur. Arjinine özgü proteolitik aktivite rgpA/b ile, lys-spesifik aktivite ise kgp ile kodlanır5. Nadkarni ve arkadaşları91, yaptıkları bir çalışmada P.gingivalis’in biyotiplerini Lysgingipain (kgp) gene göre sınıflandırmıştır. Lourbakos ve arkadaşları92, arjinine özgü gingipain-R’lerin (rgpB ve HRgpA), insan trombositlerindeki hücre içi kalsiyumda artışa neden olduğunu ve trombinle yarışacak etkinlikte trombosit kümelenmesi sağladığını bildirmişlerdir. HRgp, P. gingivalis’in virülansında fosfolipit 17 bağlayan ve enzim aktivitesini düzenleyen hemaglütinin/adezyon etki alanı varlığı nedeniyle rgpB’den daha önemlidir93. Gingipainler, ayrıca konak matriks metalloproteinazların kontrolünde güçlü etkiye sahiptir. Gingipainlerin P.gingivalis ve T.forsythia arasındaki patolojik sinerjismde de önemli olabileceği düşünülmektedir94. P. gingivalisin Konak Enzim Ekspresyonundaki Rolü Siyah pigmentli anaerobik bakterilerin proteazları, insan prokollajenazlarını aktive ederek kollajen dokuyu parçalar. Yani bakteri ürünleri konak hücre cevabını tetikleyerek yüksek seviyelerde enzim salımına neden olur. Bakteriler bu şekilde, indirekt olarak da doku yıkımını etkilemektedir95. Matriks metalloproteinaz (MMP), konak bağ dokunun fizyolojik ve patolojik döngüsünde rol oynayan ve hücre dışı matriks elemanlarının salgılanmasına neden olan bir grup endopeptidazdır96. Yara iyileşmesinde, doku tamirinde, anjiyogenezde ve gelişimsel doku morfogenezinde önemli rol oynamaktadır. Matriks metalloproteinazların aktivasyonunun endodontik hasarın patogenezinde de önemli rolü bulunmaktadır, çünkü P.gingivalis gibi siyah pigmentli mikroorganizmalardan salınan virülans faktörleri, MMP’nin de içinde bulunduğu bazı konak enzimleri aktive ederek doku yıkımına neden olmaktadır85. P.gingivalis, P.endodontalis gibi bakterilerin süpernatantları, MMP seviyelerini arttırarak da pulpal ve periapikal hasar oluşmasına neden olmaktadır51. Dolayısıyla bu bakteri türlerinin hareketini anlamak, pulpal ve periapikal lezyonların tedavilerinde önemli bir yer tutmaktadır . Özellikle P.gingivalis’in içinde bulunduğu siyah pigmentli mikroorganizmaların, siklooksijenaz 2 (COX-2), interlökin-6, interlökin-8 gibi inflamasyonda rol oynayan konak doku mediatörlerinin ekspresyonlarını da belirgin biçimde arttırdığı gösterilmiştir52,53,54. Yang ve arkadaşları97, siyah pigmentli mikroorganizmaların vasküler endotelyal büyüme faktörünün ekspresyonunu arttırarak kalp dokusuna hasar verebileceklerini yaptıkları bir çalışmada göstermişlerdir. Bate ve arkadaşları98, PCR kullanarak yaptıkları bir çalışmada, enfektif endokardit ile ilişkili olan stafilokokal fibronektin-bağlayıcı protein (FgBP) ve streptokokal fibronektin-bağlayıcı proteinin (FnBP) enfekte kök kanallarında mevcut olduğunu göstermişlerdir. Streptokokal FnBP primerleri kullanarak P.gingivalis’te de bir PCR bandı amplifiye edilmesi ilginç bir sonuç olup; bu bakterinin de streptokoklar gibi enfektif endokardite neden olabileceği düşüncesini akla getirmektedir. 18 2.5.Treponema denticola Spiroketler (treponema), insan vücudunun birçok bölgesindeki enfeksiyonlarla ilişkili bulunmaktadır. Son yıllarda, spiroketlerin oral hasarların gelişimindeki önemi ve patojenik potansiyeli üzerinde durulmaktadır. Çoğu spiroket türünün, besin ve çevresel gereksinimlerinin sağlanması zordur; bu nedenle kültüre edilmelerinin çok zor, hatta bazen olanaksız olabileceği bilinmektedir99. Morfolojik özelliklerine göre oral spiroketler genellikle küçük, orta boy ve büyük olarak sınıflandırılabilir. Besin gereksinimlerine göre oral treponema türleri Tablo 6’da görülebileceği gibi ikiye ayrılabilir100; Tablo 6: Besin gereksinimlerine göre sınıflandırılmış oral treponemalar 100 1.Sakkoralitik oral treponemalar: T. pectinovorum T. socranskii T. amylovorum T. lecithinolyticum T. maltophilum T. parvum 2. Asakkoralitik oral treponemalar T. denticola T. medium T. vincentii T. putidum Oral spiroket türleriyle endodontik enfeksiyonlarda farklı prevalanslarda karşılaşılmaktadır6,100,101,102,103,104,105. Üretilebilen oral spiroket türlerinin en iyi karakterize edilebileni T.denticola’dır, ancak bu bakterinin kültüve edilmesi çok zordur99. T.denticola, hareketlilik özelliği yüksek, helezonik kıvrım gösteren asakkarolitik, anaerobik gram negatif bir bakteridir. Uzun zamandır periodontal hasarla ilişkilendirilen T.denticolanın patojenitesine katkıda bulunan birçok virülans faktörü bulunmaktadır. Fibroblastlara, epitelyal hücrelere, eritrositlere, fibronektine, hyalürona, serum ve dişeti sıvısına bağlanabilme yeteneğine sahiptir99. Sinerji, birden fazla mikrorganizmanın aynı ortamda bulunduklarında birbirlerinin etkilerini güçlendirmelerine verilen addır. Bakteri türleri arasındaki sinerji, bakterilerin yaşama şanslarını ve konak dokudaki zararlı etkilerini arttırmaktadır56. ‘Kırmızı kompleks’in iki üyesi olan P.gingivalis ve T.denticolanın arasındaki sinerji bir çok çalışmada gösterilmiştir ve bu sinerjinin kök kanal enfeksiyonunun ilerlemesinde 19 önemli bir role sahip olduğu düşünülmektedir18,56,106. Hatta bu sinerjinin bu bakterilerin sahip oldukları bazı virülans faktörlerinden kaynaklanıyor olabileceği ileri sürülmektedir107. 2.5.1. Treponema denticola’nın Virülans Faktörleri T.denticolanın başlıca virülans faktörleri, Major Surface Protein (msp-Ana Yüzey Proteini) ve kemotripsin benzeri proteaz kompleksi (CTLP) gibi sitotoksik aktiviteli yüzey proteinleri; hücre dışı veya membranla ilişkili proteolitik, hidrolitik enzimler ve metabolitlerdir108. T.denticola’nın bazı yüzey proteinleri adeziv, sitotoksik etkiler gösterir ve doku yıkıcı aktivitelere sahiptir. Bu proteinlerin başlıcaları Msp ve CTLP’dir108,109. a) Adezyon ve İnvazyon T.denticola, konak hücrelere ve diğer doku elemanlarına adezyon gösterebilir. Ayrıca hücrelere ve dokulara invaze olabilme yeteneği de bulunmaktadır108. T.denticola, adezyon yeteneği ile konak hücrelerine tutunur ve onların harabiyetine neden olur. Fibronektin, T.denticolanın insan gingival fibroblastlarına adezyonunda çok önemli bir yer tutmaktadır. Anti fibronektin antikorlarının varlığının bu adezyonu engellediği gösterilmiştir110. Ayrıca adezyon, mannoz ve galaktoz tarafından da engellenebilir. b) T.denticola, immunomodüler (bağışıklık düzenleyici) özelliğe sahiptir. Polimorfonükleer lökositlerin degranülasyonunu sağlayarak, onların kollajenaz, jelatinaz ve elastaz salgılamalarına neden olur. Süperoksit ve hidrojen peroksit üretimini engeller. c) T.denticolanın eritrositlerin biraraya gelmesini sağlayıcı etkileri ve hemolitik aktiviteleri bulunur. d) Ana Yüzey Proteini (msp) msp, T.denticola’nın dış membranında bulunan düzgün altıgen yapıda bir adezindir111. T.denticolanın konak hücrelere ve ekstraselüler(hücredışı) matrikse bağlanmasını düzenler ve bağlandığı yüzeylerde por oluşturucu aktivite gösterir111,112. msp’nin T.denticola’nın hücre iskeletinin düzenlenmesinde de etkileri bulunur109. Ana yüzey proteini, hem epitelyal hücre yüzey reseptörlerine hem de sitoplazmik proteinlere bağlanır ve msp kompleksi epitelyal hücrelerin 20 sitoplazmik membranlarındaki iyon kanallarını oluşturur113. Bu özellikler, T.denticolanın konak epitel hücrelerindeki sitopatik etkilerine yardımcı olur. Resim 2: Treponemaların ultra-ince kesitlerinde Mspnin lokalizasyonu. Oklar, dış ve 112 sitoplazmik membranları göstermektedir . e) CTLP (Chymotrypsin-like protease complex) (Kemotripsin benzeri proteaz kompleksi) Bazı T.denticola türlerinin dış membranlarında bulunan ve adezyonda etkili olan bu protein kompleksine ‘dentisilin’ adı da verilmektedir114. Bu kompleks, jelatin, laminin, fibronektin, IgA, IgC, albumin, transferrin, fibrinojen ve diğer biyoaktif peptidleri salgılayan geniş bir substrata karşı enzimatik etkilidir. CTLP ayrıca doku yıkımına neden olan kollajenolitik konak enzimlerinin aktivasyonuna yol açabilir ve T. denticola Msp’nin lokalizasyonuna ve oligomerleşmesine katkıda bulunur. Dentisilin, spiroketlerin konak dokuya invazyonuna ve enfeksiyonu yaymalarına neden olmaktadır109. 21 f) Flajella Spiroketlerin hareket yeteneği, endodontik ve periodontal hasarın gelişiminde önemli rol oynamaktadır. Hareketliliği sağlayan flajella önemli bir virülans faktörüdür ve flajellaya sahip olmayan spiroketler konağı enfekte etmekte başarısız olmaktadır109. T.denticola gibi spiroketlerin yalnızca flajellaya bağlı hareket sistemleri bulunmaz; bu tip spiroketler aynı zamanda kamçısal hareketi yöneten kemotaksis için de gereken genleri içermektedir109. T. denticolanın epitelyal dokulara göçü, hareketlilik ve kemotaksise bağlıdır. flgE, cheA, dmcA ve dmcB genlerinde mutasyon olan T.denticolalar, gingival epitelyal hücrelere penetrasyonda yetersiz kalmışlardır115,116. g) Kısa zincirli yağ asitleri, uçucu sulfur bileşenleri, ekstraselüler veya yüzey proteolitik ve hidrolitik enzimleri oral spiroketlerin diğer virülans faktörleri arasında sayılabilir117. Kök kanallarında varlığını sürdüren en küçük bakteri yükünün bile endodontik hasar oluşturabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle kök kanalında var olduğu ileri sürülen her tür mikroorganizmanın saptanması ve tanımlanması son derece önemlidir. Diş hekimliğinde çoğu oral enfeksiyon, belirli bir etyolojik ajan tanımlanmadan emprik olarak tedavi edilmektedir. Örneğin çoğu abse penisiline cevap verir ve periodontal enfeksiyonların çoğu tetrasiklinle tedavi edilmektedir. Ancak bu emprik yaklaşım her zaman çok başarılı olmamaktadır. Klinik mikrobiyolojide en doğru ve iyi yaklaşım etyolojik mikroorganizmayı tanımlamak, daha sonra uygun tedaviyi seçmek olmalıdır. 2.6. Kök Kanal Patojenlerinin Saptanmasında Kullanılan Yöntemler 50 1) Direkt İnceleme Mikroskopi Gram Boyama 2) Kültür ve Duyarlılık Testleri a)Kültür Teknikleri Aerobik ve Anaerobik Teknikler 22 b)Özelleştirme Teknikleri Gaz-sıvı Kromatografi DNA-DNA Hibridizasyon c)Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Broth Dilusyon Testleri Broth Disk Testi Bakteriyel Disk Difüzyon Testi Antimikrobiyal Duyarlılık için Hızlı Test 3) Immunolojik Testler: İmmunofloresans (IF) Enzim Immunoassays (EIA) Latex Aglutinasyon Immunodot/Blot Flow Sitometri Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 4)Diğer Testler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Antikorların Tanımlanması (ELISA) Bu yöntemlerden en güncel olanı bakteri tanımlanmasında hala ‘altın standart’ olarak kabul edilen kültür yöntemleri ile bakterilerin özgül DNA dizilerini taklit eden oligonükleotid primerlerin kullanıldığı ‘Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)’dur. 23 2.6.1. Kültür Tekniği Kültür işlemleri, mikroorganizmaların laboratuvarda suni büyüme koşullarında üretilmesini esas almaktadır41. Bu teknik, bir örnek içerisindeki çok çeşitli mikrobiyal türlerin tanımlanmasına izin vermektedir. Ayrıca bakterilerin mikrobiyal duyarlılıklarının incelenmesine de olanak sağlamaktedır. Bu avantajlarına karşın kültür yönteminin sahip olduğu bazı kısıtlılıklar ve eksik yönler bulunmaktadır19,118,119,120. a) Kültür yöntemleri, bir çok mikroorganizmayı zor üretmekte veya hiç üretememekte, bu nedenle yanlış negatif sonuçlar doğurabilmektedir. b) Çoğu zaman diagnostik bir sonuç almak için çok yavaş kalmaktadır. c) Bakterilerin fenotipik özellikleri nedeniyle düşük özgüllüğe sahiptir ve bu nedenle mikrobiyal türlerin birbirinden ayrılmasında belirgin sınırlamaları bulunur. d) Düşük sayıdaki ve zor üreyen mikroorganizmaları hesaplamada düşük duyarlılığa sahiptir. e) Örneklerin taşınma tipine göre sonuçlar değişkenlik gösterebilir. Örneklerin taşınma ortamı anaerobik bakterilerin yaşamasına izin vermelidir. f) Zaman alıcı ve pahalıdır. Ayrıca bazı mikroorganizmalar aşağıdaki nedenlerden dolayı üretilememektedir41,121: 1) Suni kültür ortamları bakteriler için gereken besinleri ve büyüme faktörlerini içermemektedir. Mikroorganizmaların konak dokuda yaşamaları için gereken özel büyüme faktörleri hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. Ayrıca kültür ortamının kendisi bazı türler için toksik olup büyümeyi engelleyebilir. 2) Örnekteki diğer mikroorganizmalar, hedef türlerin üremelerini engelleyecek maddeler salgılayabilir. 3) Bir tür büyümek için başka bir türe gereksinim gösterebilir. Örneğin Tannerella forsythia N-asetil muramik aside muhtaçtır, bu nedenle saf kültürde çok zor ürerken diğer türlerin varlığında büyüyebilmektedir. 24 Sonuç olarak eğer bir mikroorganizma kültüve edilemiyorsa fenotip bağımlı metodlarla tanımlanamaz. 2.6.2. Moleküler Biyolojik Yöntemler ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu Endodontik patojenleri tanımlamada, çok çeşitli moleküler biyolojik teknik kullanılmaktadır. Moleküler metodların çoğu mikroorganizmaları tanımlamak için kültüve edilmelerine gerek duymadan, ribozomal RNA genleri başta olmak üzere, varlığı gösterilmek istenen bakteriyel patojenin özgül DNA dizilerinin saptanmasına dayanır. 16S rRNA geni tüm bakterilerde bulunmaktadır. 16S rDNA’nın tüm bakteriler için aynı olan bazı bölgeleri bulunurken, bir türden diğer türe değişim gösteren dizileri de bulunmaktadır; ki bunlar mikroorganizma türlerinin tanımlanmasında ve birbirinden farklılaştırılmasında rol oynar41. Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla kullanılan genotip tabanlı moleküler mikrobiyolojik yöntemlerden günümüzde en popüler olanı, 16S ribozomal RNA genlerindeki özel bölgelerinin çoğaltıldığı ‘Polimeraz Zincir Reaksiyonu’ (PCR) dur. Akar’a122 göre, 1983 yılında Kary Mullis tarafından ilk kez bilim dünyasına sunulan Polimeraz Zincir Reaksiyonu, modern bilimi tamamen değiştirmiştir. Kary Mullis bu buluşundan dolayı 1993 yılında Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmıştır7. Klinik olarak periradiküler lezyon oluşturan bakteri yükü konusunda uzlaşma yoktur. Bu nedenle, kök kanallarında oluşabilecek en küçük sayıdaki bakteri hücrelerinin bile saptanması büyük önem taşır. PCR, diğer saptama yöntemlerinden en az 10- 100 kat daha duyarlıdır ki bu yüksek duyarlılık onu bu amaç için ideal kılar7. Ayrıca PCR yönteminde, saptama için kültür yönteminde olduğu gibi bakteri üretilmesi işlemine gerek duyulmamaktadır. Bu özellik, endodontik enfeksiyonlarda sıkça rastlanan ve zor üreyen anaerobik bakterilerin tanımlanmasında önemli bir avantaj oluşturur. 2.6.2.1. PCR’ın Kullanım Alanları122 1. Kalıtsal hastalıklarda hastanın ve taşıyıcının tanısında 2. Prenatal tanıda 3. Klinik örneklerde patojen organizmaların tanısında 25 4. Adli tıpta 5. Onkogenezisin araştırılmasında 6.Probların oluşturulmasında, araştırmalarında klonlamada, gen ekspresyon 7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında 8. Bilinmeyen dizilerin tayininde 9. Geçmiş DNA’nın incelenmesi ve evriminin aydınlatılmasında 10. RFLP “Restriction Fragment Length Polymorphism” analizinde 11. In vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal doğmasının sağlanmasında 12. DNA protein etkileşiminin araştırılmasında (footprinting) kullanılabilir. PCR yönteminin icadı ve gelişimi, kuşkusuz son yüzyılda moleküler teknolojideki en önemli ilerlemedir. Biyolojik ve tıbbi araştırmalara PCR’ ın etkisi oldukça fazladır. PCR, gen ve genom çalışmalarının sayısını dramatik şekilde arttırmıştır. Günümüzde PCR kullanarak herhangi bir organizmadan herhangi bir geni çoğaltmak mümkündür. Yöntem, DNA’ nın in vitro replikasyonu ve basit reaksiyonların tekrarlayan döngülerinden oluşmaktadır7. Temel olarak, ardı ardına 25-35 siklusta DNA polimeraz enzimi hedef DNA’yı çoğaltmaktadır. PCR bir çeşit in vitro klonlama olarak da tanımlanabilir. Öncelikle ısı çok yükseltilerek çift sarmallı DNA’nın (Şekil 1) tek sarmala denatüre olması sağlanır (denatürasyon). Isı düşürüldüğünde bir çift oligonükleotid primer hedef DNA dizisindeki tamamlayıcı eşlerine yapışır (annealing)(Şekil 2). Primerler kopyalanacak DNA bölgesinin limitlerini tanımlar. Biraz daha arttırılan sıcaklıkta DNA polimeraz enzimi primerlere bağlanarak, nükleotidleri ikinci sarmalı uzatmak için ekler. Devam eden döngülerde bu basamaklar daha fazla DNA kopyası oluşturmak için tekrar edilir. 30 döngüden sonra tek bir başlangıç molekülünden hedef dizinin milyonlarca kopyası üretilebilir41. 26 Şekil 1: Çift sarmallı DNA molekülünün yapısı Şekil 2: Polimeraz Zincir Reaksiyonunda gerçekleşen basamaklar (denatürasyon, yapışma, uzama) 27 Amplifikasyon ürünün saptanması ise; kopyaları çıkarılan primerler arasında kalan belli baz çifti büyüklüğündeki bölgenin jel üzerinde veya amplifikasyon yapılan bölgeye uygun tamamlayıcı prob ile hibridizasyon sonrası belirlenmesi ile gerçekleşmektedir. 2.6.2.2. PCRda Kullanılan Başlıca Bileşenler 7,122,123 1. Hedef DNA İncelenmek istenen örneğin DNA’ sı PCR reaksiyonuna tek veya çift zincirli olarak eklenebilir. DNA’nın uzunluğu PCR’ın etkinliği için önemli bir faktör değildir, ancak uzunluk bir restriksiyon enzimi ile kısaltılırsa, sonuç daha başarılı olur. 2.Oligonükleotid Primerler Hedef DNA’nın dizilerini tamamlayan tek zincirli sentetik oligonükleotid primerler reaksiyona genellikle 1mM konsantrasyonda eklenir. Bu miktar, çoğunlukla 30 döngülük bir PCR için yeterlidir. Primerlerin yüksek konsantrasyonları, ektopik bölgelere yapışmalarına neden olarak, istenen hedef DNA dışındaki bölgelerde çoğalma meydana getirebilir. Yetersiz konsantrasyonları ise PCR ürününün çok az miktarda oluşmasına neden olur. Primer tasarımında dikkat edilmesi gereken kurallar şunlardır: -Oligonükleotid dizisi özgün olmalı -3’ ucunda G-C olmalı -Baz dağılımı ve kompozisyonu rastgele olmalı (G/C oranı % 45-55) -Primer uzunluğu optimum 18-25 bazlık olmalı -İki primer aralığı 100-600 bç (baz çifti) olmalı -Primer kendisi ya da diğer primer ile komplementer (tamamlayıcı) diziler içermemelidir. 3. 4-deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP) DNA sentezi sırasında serbest deoksiribonükleotid trifosfatlara ihtiyaç duyulmaktadır. PCR reaksiyonu sırasında en fazla özgüllüğü sağlamak için dNTP’lerin konsantrasyonu 200 µM düzeyinde olmalıdır. Ardarda yapılacak dondurma-çözdürme işlemleri de dNTP’nin raf ömrünü 28 kısaltacağından; daha sonra kullanılacak miktarlar ayrılıp +20 ºC’ de saklanmalıdır. 4. Tamponlar Standart PCR tamponunun 10 x konsantrasyonundaki stoğu, 500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl, 15 mM MgCl2 içermektedir. PCR sırasında 1 x konsantrasyona sulandırılan tampondan gelen Mg+2 iyonunun optimal konsantrasyonu oldukça düşük olduğundan (1.5 mM), kalıp DNA hazırlanırken yüksek konsantrasyonda şelasyon yapıcı ajanların bulunmaması gerekir. Ayrıca fosfatlar gibi negatif yüklü iyonik gruplar olmamalıdır. Bir PCR ilk kez yürütüldüğünde, Mg+2 konsantrasyonu, optimizasyonu sağlamak için ayarlanmalıdır. Burada TrisCl (10mM) ve KCl (50mM) sabit tutulup MgCl2 konsantrasyonu 0.05-5 mM arasında (0.5 mM artışla) denenir. dNTP, DNA ve proteinlerin tümü Mg+2 iyonunu bağladıklarından, her PCR protokolünde Mg+2 konsantrasyonu ampirik olarak ayarlanmalıdır. Serbest magnezyumu etkileyen faktörler şunlardır: -DNA örneği -Örnekte EDTA, sitrat gibi şelasyon yapan ajanların olması -d NTP -Protein 5. DNA Polimeraz DNA polimerizasyonunda en önemli nokta DNA polimerazın doğruluğudur. Saflaştırılmış DNA polimerazlar, moleküler biyolojinin en önemli araçlarından biridir. En çok kullanılan DNA polimeraz Thermus aquaticus adı verilen termofilik bakteriden izole edilen ve yüksek sıcaklıklara dayanabilen bir enzimdir7,122,123. DNA’ nın DNA polimerazlar aracılığıyla sentezi, hem çok kompleks hem de önemli ölçüde sıralı bir işlemdir. DNA polimerazın reaksiyona fazla miktarda konması ile oluşan PCR ürününün miktarı artmaz, ancak hata oluşma şansı artar. Serbest Mg+2 konsantrasyonunun azalması ve reaksiyonun pH’ının düşürülmesi ile Taq polimerazın doğruluğu arttırılabilir. 29 PCR basamakları için gereken en uygun ısılar, denatürasyon için 94 ºC, annealing için 40-72 ºC , polimerizasyon için 72 ºC’ dir123. Bu üç basamak 25-40 kere tekrarlanır, daha sonra reaksiyonun soğuması için ürünler, PCR tipine göre 4 ºC’ye alınır veya oda sıcaklığında bırakılır. Mikrobiyolojik örneklerde bakteri tanımlanması için genellikle yukarıda anlatıldığı gibi konvansiyonel bir PCR döngüsü kullanılırken, zaman zaman in-situ PCR, nested PCR, multipleks PCR, Real-time PCR (Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu), Arms-PCR, RFLP (Restriction fragment length polimorfism), SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism), Q-PCR (Quantitive PCR) gibi varyasyonlara da başvurulmaktadır7,123. Diş hekimliği biliminde örneklerin incelenmesi amacıyla en sık kullanılan PCR yöntemleri, aşağıda açıklanmaktadır: Nested PCR PCR’ın hem duyarlılığını hem de özgüllüğünü arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemdir1. Nested PCR tekniğinde, bir set primer kullanılarak yapılan ilk amplifikasyonu, ilk PCR ürünündeki daha küçük spesifik dizileri tamamlayan 2. setin kullanılması ile yapılan reamplifikasyon takip eder. nPCR, PCR ile karşılaştırıldığında, daha yüksek duyarlılık ve özgüllük göstermektedir104,123. Eğer amplifikasyonun ilk aşamasında spesifik olmayan diziler oluşur ise, bu non-spesifik ürünler genellikle 2. turda kullanılan nested primerleri tamamlamayacaktır. Amplifikasyonun 2. turu, azaltılmış bir doku debrisi ve ilk turda amplifiye edilemeyen diğer DNA dizileri ile yürütülür104. Yine de manüplasyon sırasında yapılan yanlışlıklar, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir; bunu önlemek için özel stratejiler belirlenmelidir123. Multipleks PCR Multipleks PCR, farklı bakteri türlerinin aynı anda saptanmasına olanak veren bir yöntemdir10. Her biri hedef bakteri türlerine özgü olan bir dizi farklı primer çifti, tek tüplü amplifikasyon reaksiyonunda kullanılır. Bu yaklaşım, analiz süresini, gerekli ayıraç ve kalıp miktarını asgariye indirir. Ancak bir multipleks PCR protokolü geliştirmek primer kombinasyonları ve reaksiyon durumları bağlamında çok kompleks bir süreçtir123. Real-time PCR Çoğu PCR yöntemi niteliksel veya yarı nicelikseldir. Real-time PCR ise bundan farklı olarak reaksiyon boyunca ürünlerin devamlı olarak ölçülmesi ile karakterizedir. Bu ölçümün yapılabilmesi için, DNA’ya bağlanma yeteneğine sahip floresan boyalar kullanılabileceği gibi, hedef diziye özgül floresan maddeler ile işaretli oligonükleotid problar da 30 kullanılabilemektedir. Prob kullanılan deneylerde, probun özgül diziye hibridizasyonu çoğunlukla floresans rezonans enerji transferi (FRET) yöntemi ile saptanmaktadır. Genellikle iki yaklaşım vardır: Birincisi, bildirici (reporter) boya ile baskılayıcı (quencher) boyanın birbirinden ayrılması ile ortaya çıkan floresans; ikincisi ise, iki boyayı birbirlerine çok yakın bir uzaklığa getirerek oluşturulan floresan yayılımıdır123. Birinci yaklaşıma TaqMan sistemi, ikinci yaklaşıma ise Light Cycler örnek olarak gösterilebilir. Özgül primer çiftine ek olarak, TaqMan sistemi, 5’- ucunda florasan reporter boya, 3’- ucunda da quencher boyadan oluşan florojenik probu kullanır26. Prob, PCR işlemi boyunca amplikonun tamamlayıcı zincirine bağlandığında, Taq DNA polimeraz, probu, primerlerden birinin uzaması sırasında parçalar ve boya molekülleri yer değiştirir ve ayrılır. Elektronik olarak uyarılmış reporter boya, artık quencher boya tarafından baskılanmaz ve floresan yayılımı, floresan detektörü tarafından görüntülenir. Her PCR siklusunda floresan yayılımının izlenmesi suretiyle reaksiyonun ilerlemesi gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve örnekteki DNA miktarı belirlenir124. Light Cycler yaklaşımı, iki florasanla işaretli 2 oligonükleotide dayanır ki; bu oligonükleotidler, hedef PCR ürününün komşu bölgelerine yapışır. Bir boya, ışık kaynağı ile hareketlenir, enerjisini ikinci boyaya aktarır ve bu da daha sonra saptanacak olan belli bir dalga boyu yayar. Bu 2 boyanın spesifik florasan işareti üretmek için fiziksel olarak birbirlerine yakın olmaları gerekir. Eğer işaretlenmiş iki prob, spesifik PCR amplikonunun yakın bölgelerini hibridize ederse, iki boya arasındaki sonuç FRET, ürünün miktarı ile orantılı olarak floresanda bir yükselmeye neden olur. Real-time PCR ölçümleri, klinik örneklerdeki total bakteri sayısının yanı sıra, tek tek hedef türlerin de miktarının belirlenmesine olanak verir ve birkaç dakikada bile bakterileri saptayabilir26,120,123,125. 2.6.2.3. PCR’ın Kültür Yöntemine Göre Sağladığı Avantajlar:41,126 1. Hem kültürü yapılabilen hem de yapılamayan bakteri türlerini saptayabilmektedir. 2. Yüksek özgüllük gösterir tanımlanmasına olanak sağlar. 3. Klinik örneklerdeki mikrobiyal türleri üretilmelerine gerek duymaksızın saptayabilmektedir. Başka bir deyişle mikroorganizmaları tanımlamak amacıyla onların canlılıklarına gerek duymamaktadır. ve mikrobiyal türlerin kesin 31 4. Kültür yöntemine ve diğer moleküler biyolojik yöntemlere göre daha duyarlıdır. 5. Genellikle daha kısa zaman gerektirmektedir. 6. Örnekleme ve taşıma sırasında kontrollü anaerobik ortamlara gereksinim göstermemektedir. Zor üreyen bakteriler taşıma sırasında canlılıklarını yitirseler bile saptanabilmektedir. 7. Antimikrobiyal tedavi sırasında da kullanılabilmektedir. 8. Az sayıda mikroorganizmayı bile saptayabilen bir yöntem olduğu için örnek miktarının az olması sorun yaratmaz. 9. Epidemiyolojik çalışmalar için çok sayıda örnek kullanıldığında , örnekler düşük sıcaklıklarda saklanıp bir seferde incelenebilir. 32 3. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışmada çeşitli pulpa ve periapikal doku hastalık tiplerinden elde edilen örnekler, Real-time PCR yöntemi kullanılarak incelendi. İncelenen bu örneklerde Porphyromonas gingivalis ve Treponema denticolanın varlığı ve prevalansı saptandı. Porphyromonas gingivalis DNA’sının pozitif saptandığı örneklerde prtC geninin, Treponema denticola DNA’sının pozitif bulunduğu örneklerde ise Msp geninin varlığı ve prevalansı saptandı. P.gingivalis, T.denticola ve bu iki virülans geninin varlığı ile belirli klinik patolojiler arasındaki ilişki değerlendirildi. 3.1. Örnek Seçimi Bu tez çalışmasında enfekte kök kanallarından örnek almak için öncelikle Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul’undan Etik Kurul Raporu alındı. Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Diş Hastalıkları ve Tedavisi Anabilim Dalı’na başvuran, kök kanal tedavisi endikasyonu konan ve yaş aralığı 18-70 arasında değişen 60 hastanın enfekte pulpaları incelendi. Hastaların son üç ay içerisinde herhangi bir antibiyotik kullanmamış olmalarına dikkat edildi. Seçilen dişler, daha önce endodontik tedavi görmemiş, tek kanallı, nekrotik pulpalı ve periapikal radyografilerinde değişen derecelerde radyolüsensiye sahip olan dişlerdi. Dişler, periapikal hasarın tipine göre üç gruba ayrıldı. Periradiküler hasarın sınıflandırılması, Torabinejad ve Walton127 tarafından yapılan çalışmada göz önüne alınan kriterlere göre gerçekleştirildi: 1. Akut Apikal Periodontitis: Akut ağrı, perküsyon hassasiyeti ve spontan ağrı semptomlarından birinin ya da hepsinin var olduğu durumlar bu gruba dahil edildi. 2. Kronik Apikal Periodontitis: Hiçbir belirgin semptomun bulunmadığı periapikal radyolüsensi gösteren dişler bu gruba dahil edildi. 3. Akut Apikal Abse: Bu gruba dahil edilen tüm örneklerde sorunlu dişle ilgili drenaj gösteren veya göstermeyen lokalize veya diffüz bir şişlik bulunmaktaydı. Bazı vakalarda ağrı şikayeti de mevcuttu. Seçilen tüm dişlerin belirgin bir periodontal sorun göstermemesine ve 4 mm’yi geçen derinliklerde periodontal cep içermemesine dikkat edildi. 33 3.2. Kök Kanallarından Örnek Alınması Örnek alınacak tüm dişlere pomza ve su ile temizleme yapıldıktan sonra rubber-dam izolasyonu uygulandı. Operasyon sahası önce %3’lük hidrojen peroksit ile temizlendi; ardından % 2.5’ lik sodyum hipoklorit (NaOCl) ile dekontamine edildi. Endodontik giriş kaviteleri steril elmas fissür frezlerle (Brasseler Dental Products, Savannah, A.B.D.), su spreyi kullanılmadan açıldı. Pulpa odasını da içeren operasyon sahası, % 2.5’luk sodyum hipoklorit ile yıkandı. Ardından bu solusyon % 5’lik sodyum tiyosülfat kullanılarak inaktive edildi. Eğer kök kanalı kuruysa az miktarda steril salin solüsyonu kanala uygulandı. 15 numaralı K tipi eğe (Dentsply, Maillefer, İsviçre) kullanılarak tanı radyografisinde saptanan çalışma boyutundan 1 mm kısa olacak şekilde, kök kanalında çevirme ve hafifçe kazıma işlemi yapıldı. Ardışık numaralı iki kağıt kon (Diadent, Kore), aynı seviyeye kadar yerleştirilip kanaldaki sıvıyı emmesi sağlandı. Her iki kağıt kon kanal içerisinde birer dakika bekletildi. Daha sonra K tipi eğe ve kağıt konlar 1mL steril fosfat tamponlanmış salin solüsyonu (pH 7.6) içeren kriyotüplere (Taşlıkaya, Türkiye) yerleştirildi. Tüpler, DNA ekstraksiyonundan önce -80 ºC’ ye ayarlanmış derin donduruculara aktarıldı ve burada bekletildi (Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı). Abseli dişlerden alınan pü örnekleri, oral mukozanın % 2’ lik klorheksidinle dezenfekte edilmesinin ardından steril bir şırınga (Set, Türkiye) aracılığıyla aspire edilerek elde edildi. Örnekler yine 1 mL steril fosfat tamponlanmış salin solüsyonu (pH 7,6) içeren kriyotüplere yerleştirildi ve -80 ºC’de donduruldu. a. DNA Ekstraksiyonu Tüplerdeki örneklerin DNA ekstraksiyonları, filtreli kolon DNA saflaştırma kiti (AbsoGene Genomic DNA Isolation KIT, Türkiye) kullanılarak yapıldı. DNA saflaştırma kitinin içerikleri Tablo 7’de gösterilmektedir. 34 Tablo 7: DNA saflaştırma (ekstraksiyon) kitinin içerisinde bulunan materyaller ve miktarları Materyaller 10 test için 50 test için Proteinaz K DL Solüsyonu B Solüsyonu W1 Solüsyonu W2 Solüsyonu E Solüsyonu Spin kolonlar Toplama tüpleri (2 ml) Toplama tüpleri (1.5 ml) 4 mg 3 ml 3 ml 4 ml 6 ml 2.5 ml 10 adet 30 adet 10 adet 20 mg 11 ml 13.75 ml 19 ml 28.5 ml 11 ml 50 adet 150 adet 50 adet 100 test için 40 mg 22 ml 27.5 ml 38 ml 57 ml 22 ml 100 adet 300 adet 100 adet DNA Ekstraksiyon Protokolü 1. Örnekleri içeren her tüpe 200 µl DL solüsyonu ve 20 µl Proteinaz K eklendi (Resim 3). 2. Tüpler vortekslenerek karıştırıldı ve 56 ºC’ de 2 saat inkübe edildi. 3. Tüplere 250 µl B solüsyonu eklendi ve 20 kez vortekslenerek karıştırıldı. 4. Kısa bir santrifüj yapıldı ve 15 dakika boyunca 65 ºC’de 3 dakikada bir karıştırılmak suretiyle inkübe edildi (Resim 4, Resim 5, Resim 6). 5. % 96-100’ lük 200 µl etanol eklendi ve 20 kez vortekslenerek karıştırıldı. 6. Kısa bir santrifüj işleminin ardından karışım, 2 ml’lik toplama tüpü üzerindeki filtreli kolona aktarıldı. 7. 10.000 devirde 1 dakika santrifüj yapıldı, filtreli kolon yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne aktarıldı. 8. 700 µl W1 solüsyonu eklendi ve 10,000 devirde 1 dakika santrifüj yapıldı. Filtreli kolon yeni bir 2 ml’ lik toplama tüpüne aktarıldı. 9. 700 µl W2 solüsyonu eklendi ve 10,000 devirde 1 dakika santrifüj yapıldı. Filtreli kolon yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne aktarıldı. 35 10. Tüpler 14,000 rpm’de 30 saniye santrifüj edilerek arda kalan yıkama çözeltisi uzaklaştırıldı. 11. Filtreli kolon, 1.5 ml’lik toplama tüpüne aktarıldı. 12. Önceden 70 ºC’ye kadar ısıtılan 200 µl E solüsyonu kolon filtresini tamamen ıslatacak şekilde eklenerek 3 dakika oda sıcaklığında inkübasyon yapıldı. 13. Tüpler 14,000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. 14. Santrifüj sonunda filtreli kolonlar uzaklaştırılarak toplama tüplerine elüe edilen DNA çözeltisi polimeraz zincir reaksiyonu deneylerine kadar –20 °C’de saklandı. Bu işlemler sırasında W1, W2 solüsyonları ve Proteinaz K’ya üretici firmanın talimatları doğrultusunda etanol ve su eklendi. Eklenmesi gereken uygun miktarlar Tablo 8 ve Tablo 9’ da gösterilmektedir. Tablo 8: Proteinaz K’ ya eklenen su miktarları Kit Boyutu Proteinaz K (mg) 10 50 100 4 mg 20 mg 2x20 mg Eklenen (ml) 0.2 ml 1 ml 2x1 ml H2O miktarı Tablo 9: W1 ve W2 solüsyonlarına eklenen etanol miktarları Kit boyutu W1 (ml) 10 4 50 19 100 38 Kit boyutu W2 (ml) 10 6 50 28.5 100 57 Solüsyonu Eklenen etanol miktarı Toplam (ml) hacim (ml) 4 8 19 38 38 76 Solüsyonu Eklenen etanol miktarı Toplam (ml) hacim (ml) 2 8 9.5 38 19 76 36 Resim 3: DNA ekstraksiyonu işlemi sırasında tüplere Proteinaz K’nın aktarılması Resim 4: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen santrifüj işlemi 37 Resim 5: Santrifüj işlemi için yerleştirilen tüpler Resim 6: DNA ekstraksiyonu sırasında gerçekleştirilen inkübasyon 38 b. PCR Deneyleri Örneklerde 16S rRNA Geni Saptanması DNA saflaştırma işleminin her örnek için başarıyla gerçekleştirildiğinin doğrulanması amacıyla üniversal bakteriyel primerler (Uni152-F ve Uni220-R) ve floresan işaretli TaqMan prob (Uni177T) kullanılarak gerçek zamanlı florometrik polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirildi. Bu amaçla her örnek için 20 µl’lik reaksiyon karışımı, 1x konsantrasyonunda TaqMan reaksiyon çözeltisi, Uni152-F ve Uni220-R primerlerinin her birinden 1 µM, UniCC probundan 0,2 µM içerecek şekilde hazırlandı. Tüplere hasta örneklerinden elde edilen 4 µl DNA çözeltisi eklendi. Hazırlanan tüpler ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında, 50 °C sıcaklıkta 2 dakika inkübasyonun ardından 95 °C sıcaklıkta denatüre edildi. Denatürasyonun ardından 95 °C’de 15 saniye 60 °C’de 1 dakika olarak belirlenen sıcaklıklar 40 döngü uygulandı. Her döngüde florometrik okumalar 60 °C sıcaklıkta gerçekleştirildi (Şekil 3). Reaksiyonun sonunda, reaksiyon boyunca elde edilen florometrik okumalar cihazın yazılımı kullanılarak analiz edildi ve 16S rRNA geni çoğaltılabilen tüplerde saptandı. Kullanılan primer ve prob dizileri Tablo 10’da gösterilmiştir. Şekil 3. Gerçek zamanlı florometrik PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri. Florometrik okumalar Evre II boyunca gerçekleştirilmiştir. X: Tablo 10’da belirtilen yapışma sıcaklığı. 39 Tablo 10. Çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler, problar ve PCR yapışma sıcaklıkları Primer adı Oligonükleotid dizisi pgprtc-f 5’-cccgaatacgtctatacggtctg-3’ pgprtc-r 5’-tatgaactctccatcataggtgc-3’ pgprtc-p 5’-FAM-aggcttcgatcgcttctttgtagcag-TAMRA-3’ pg-f 5’-cctacgtgtacggacagagctata-3’ pg-r 5’-aggatcgctcagcgtagcatt-3’ Pgs 5’-FAM-tcgcccgggaagaacttgtcttca-TAMRA-3’ Td1394-f 5’-agagcaagctctcccttaccgt-3’ Td1498-r 5’-taagggcggcttgaaataatga-3’ Td1444T 5’-FAM-cagcgttcgttctgagccaggatca-TAMRA-3’ tdmsp-f1 5’-gataagccgtatttaggtatgg-3’ tdmsp-r1 5’-gagatgggtaagtctgaagtc-3’ tdmsp-f2 5’-tgcggaacaggtactaaatatcag-3’ tdmsp-r2 5’-ggctttatccacattgagtcg-3’ Uni152-F 5’-cgctagtaatcgtggatcagaatg-3’ Uni220-R 5’-tgtgacgggcggtgtgta-3’ Uni177T 5’-FAM-cacggtgaatacgttcccgggc-TAMRA-3’ Yapışma sıcaklığı (°C) Hedef bölge/ amplikon uzunluğu 60 16SrDNA/83 60 rgp2 / 70 60 16SrDNA/83 58 msp / 320 58 msp / 454 59 16SrDNA/68 3.4.1. Örneklerde Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis DNA’sının Saptanması P. gingivalis ve T. denticolaya özgül (spesifik) bakteriyel primerler ve TaqMan problar kullanılarak gerçek zamanlı florometrik polimeraz zincir reaksiyonu (Real-time PCR) gerçekleştirildi. Bu amaçla her örnek için 20 µl’lik reaksiyon karışımı, 1x konsantrasyonunda TaqMan reaksiyon çözeltisi, T. denticola’ya özgül Td1394-f ve Td1498-r primerlerinin her birinden 1 µM, Td1444T probundan 0,2 µM; P.gingivalis’e özgül Pg-f ve pg-r primerlerinin her birinden 1 µM ve PgS probundan 0,2 µM içerecek şekilde hazırlandı. Tüplere hasta örneklerinden elde edilen DNA ekstraktından 4 µl eklendi. Hazırlanan reaksiyon tüpleri ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında, 50 °C sıcaklıkta 2 dakika inkübasyonun ardından 95 °C sıcaklıkta denatüre edildi (Resim 7, Resim 8) Denatürasyonun ardından 95 °C’de 15 saniye 60 °C’de 1 dakika olarak belirlenen sıcaklıklar 40 döngü uygulandı. Her döngüde florometrik okumalar 60 °C sıcaklıkta gerçekleştirildi. Reaksiyonun sonunda, reaksiyon boyunca elde edilen florometrik okumalar cihazın yazılımı 40 kullanılarak analiz edildi ve T. denticola 16S rRNA geni çoğaltılabilen tüpler saptandı. Kullanılan primer ve prob dizileri Tablo 10’da gösterilmiştir. Resim 7. Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazına yerleştirilmiş tüplerin görünümü 41 Resim 8. Gerçek zamanlı florometrik PCR cihazı 3.4.2. Treponema denticola DNA’sının Pozitif Saptandığı Örneklerde Msp’nin İncelenmesi Real-time PCR kullanılarak Treponema denticola saptanan örneklerde Msp varlığı PCR ile araştırıldı. Bu amaçla, bu virülans geninin 1. ve 2. genotipi için özgül tdmsp-f1, tdmsp-r1, tdmsp-f2, tdmsp-r2 primerleri kullanıldı (Tablo 10). Her örnek için 50 µl PCR karışımı 50 mM KCl, 8.3 pH’ya sahip 10 mM Tris-HCl, 0.001% (w/v)jelatin, 2 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 0.6 µM forward ve reverse primer, 0.03 U/µl Taq DNA polimeraz (Applied Biosystems, A.B.D.) ve yaklaşık 0.5 µg DNA örneği içerecek şekilde hazırlandı. Msp’ye özgül PCR Pelkin Elmer 9700 termal döndürücüde gerçekleştirildi (Resim 9). DNA denatürasyonu için reaksiyon tüpleri 95 ºC’ de 3 dakika inkübe edildi. Ardından 45 döngü boyunca 95ºC’de 15 saniye, 57ºC’de 45 saniye annealing(yapışma) ve 72ºC’de 1 dakika extension(uzama) gerçekleştirildi. Son uzama için tüpler 72 ºC’de 7 dakika inkübe edildi (Şekil 4). Elde edilen PCR ürünleri %2’lik agaroz jele yüklendi ve 100 V’da 45 dakika elektroforez işlemi uygulandı. Elektroforezi takiben jel 30 dakika 0.5 µg/ml’lik etidyum bromidde boyandı. Ardından 260 nm UV (ultraviyole) ışık altında transiluminasyon ile görüntülendi ve jel dökümantasyon sistemi 42 (Syngene, USA.) kullanılarak fotoğraflandı (Resim 10) 320 ve 454 baz çiftlik DNA bandları, Msp’ye özgü PCR için kabul edildi. Resim 9: Msp DNA’sının araştırılması için kullanılan termal döndürücü Şekil 4. PCR’da kullanılan sıcaklık döngüleri. X: Tablo 10’da belirtilen yapışma sıcaklığı. 43 Resim 10: Msp DNA’sının araştırılmasında PCR ürünlerinin UV altında görüntülemesi 3.4.3. Porphyromonas gingivalis DNA’sının Pozitif Saptandığı Örneklerde prtC’nin İncelenmesi P.gingivalisin varlığının Real-time PCR ile belirlenmesinin ardından, pozitif çıkan örneklerde prtC’nin saptanması amacıyla yine Real-time PCR kullanıldı. Bu amaçla her örnek için 20 µl’lik reaksiyon karışımı, 1x konsantrasyonunda TaqMan reaksiyon çözeltisi, prtC (kollajenaz geni)’ye özgü pgprtc-f ve pgprtc-r primerlerin her birinden 1 µM, pgprtc-p probundan 0,2 µM içerecek şekilde hazırlandı. Tüplere P. gingivalis için pozitif çıkan hasta örneklerinden elde edilen 4 µl DNA çözeltisi eklendi. Hazırlanan tüpler ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında, 50 °C sıcaklıkta 2 dakika inkübasyonun ardından 95 °C sıcaklıkta denatüre edildi. Denatürasyonun ardından 95 °C’de 15 saniye 60 °C’de 1 dakika olarak belirlenen sıcaklıklar 40 döngü uygulandı. Her döngüde florometrik okumalar 60 °C sıcaklıkta gerçekleştirildi. Reaksiyonun sonunda, reaksiyon boyunca elde edilen florometrik okumalar cihazın yazılımı kullanılarak analiz edildi ve 16S rRNA geni çoğaltılabilen tüpler saptandı. Kullanılan primer ve prob dizileri Tablo 10’da gösterilmiştir. 44 Bu çalışmada kullanılan primer ve prob çiftlerinin şematik yerleşimleri, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8, Şekil 9 ve Şekil 10’da gösterilmiştir. Şekil 5. Örneklerde bakteri varlığının saptanmasına yönelik Uni152-F, Uni220-R primer çifti ile Uni177T 5’ hidroliz probunun Escherichia coli 16S rDNA’sı üzerindeki yerleşimi. (Gene Bank kayıt numarası AM184252) Şekil 6. Örneklerde Treponema denticola DNA’sının saptanmasına yönelik Td1394f, Td1498-r primer çifti ve Td1444T probunun yerleşimi (T. denticola 16S rDNA Gene Bank kayıt numarası TRPRR16SA) 45 Şekil 7. Örneklerde Porphyromonas gingivalis DNA’sının saptanmasına yönelik Pgf, Pg-r primer çifti ve Pgs 5’ hidroliz probunun yerleşimi. (P. gingivalis prtC, Gene Bank kayıt numarası PGU85038) 46 Şekil 8. Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 1’in saptanmasına yönelik tdmsp-f1 ve tdmsp-r1 primer çiftinin yerleşimi (msp Gene Bank kayıt numarası TDU66255) 47 Şekil 9. Treponema denticola pozitif örneklerde msp genotip 2’nin saptanmasına yönelik tdmsp-f2 ve tdmsp-r2 primer çiftinin yerleşimi (Msp Gene Bank kayıt numarası TDU66256) 48 Şekil 10. Porphyromonas gingivalis pozitif örneklerde prtC varlığının saptanmasına yönelik pgprtc-f, pgprtc-r primerlerinin ve pgprtc-p 5’ hidroliz probunun prtC’deki yerleşimleri (Porphyromonas gingivalis Gene Bank kayıt numarası AY633706) Verilerin analizinde SPSS 13.0 (SPSS Inc., USA) programı kullanıldı. Klinik patolojiler ile bakteri ve virülans genlerinin varlığı arasındaki ilişki Ki-kare testi kullanılarak değerlendirildi. Ki-kare p değerinin 0.05’ten küçük bulunması istatistiksel olarak önemli kabul edildi. 49 4. BULGULAR Real-time PCR ile incelenen toplam 60 adet örneğin tümünde bakteri DNA’sı tespit edildi. Böylece kullanılan DNA ekstraksiyonu metodu doğrulandı ve PCR’ın kan, tükrük, vb. materyallerle inhibe olmadığı ve doğru olarak yürütüldüğü kesinleştirildi. Çalışmamızda klinik tanısı belirlenen vakalardan elde edilen toplam 60 adet örneğin 26’sı Akut Apikal Periodontitis, 7’si Akut Apikal Abse, 27’si ise Kronik Apikal Periodontitis grubuna dahil edildi. Klinik bulgulara dayanarak tanı konulan gruplar ve gruplardaki örnek sayıları Tablo 11’de gösterilmiştir. Tablo 11. Klinik bulgularına göre tanı konulan gruplardaki örnek sayıları Klinik Tanı Akut apikal periodontitis Prevalans (%) 26 (43,30) Akut apikal apse 7 (11,70) Kronik apikal periodontitis 27 (45,00) Toplam 60 (100,00) Real-time PCR’la incelenen 60 örneğin 25’inde (% 44.1) T. denticola DNA’sı saptandı. Akut Apikal Periodontitis grubundaki toplam 26 vakanın 12’inde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 1’inde ve Kronik Apikal Abse grubundaki 27 örneğin 12’sinde T. denticola saptandı. Bu patolojik durumlarla T. denticolanın varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmadı. (p = 0.29) (Tablo 12) 50 Tablo 12. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde T. denticola DNA’sı varlığının klinik tanı tiplerine göre dağılımı. T. denticola PCR Patoloji Negatif (%) Pozitif (%) AAP 14 (23,33) 12 (20,00) Toplam (%) 26 (43,33) AAA 6 (10,00) 1 (1,67) 7 (11,67) KAP 15 (25,00) 12 (20,00) 27 (45,00) 35 (58,33) 25 (41,67) 60 (100,00) Toplam p = 0,29 Real-time PCR ile incelenen 60 örneğin 10’unda (16.67) P. gingivalis DNA’sı saptandı. Akut Apikal Periodontitis grubundaki 26 vakanın 3’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 2’inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 27 vakanın 5’inde P. gingivalis DNA’sı olduğu belirlendi. Bu üç patolojik durum ile P.gingivalisin varlığı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p = 0.53) (Tablo 13). Tablo 13. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde P.gingivalis DNA’sı varlığının klinik tanı tiplerine göre dağılımı. P. gingivalis PCR Patoloji Negatif (%) Pozitif (%) Toplam(%) AAP 23 (38,33) 3 (5,00) 26 (43,33) AAA 5 (8,33) 2 (3,34) 7 (11,67) KAP 22 (36,67) 5 (8,33) 27 (45,00) Toplam 50 (83,33) 10 (16,67) 60(100,00) p = 0,53 P.gingivalis DNA’sına sahip olan toplam 10 adet örneğin 9’ unda prtC (kollajenaz geni) saptandı. prtC DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis grubundaki toplam 3 vakanın tamamında, Akut Apikal Abse grubundaki toplam 2 vakanın 1’ inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki toplam 5 vakanın tamamında tespit edildi. prtC varlığı ile herhangi bir klinik patolojik 51 durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı değildir (p = 0.17) (Tablo 14). Tablo 14. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde prtC DNA’sı varlığının klinik tanı tiplerine göre dağılımı. prtC PCR Patoloji Negatif (%) Pozitif (%) AAP 0 (0,00) 3 (30,00) Toplam (%) 3 (30,00) AAA 1 (10,00) 1 (10,00) 2 (20,00) KAP 0 (0,00) 5 (50,00) 5 (50,00) Toplam 1 (10,00) 9 (90,00) 10 (100,00) p = 0,17 T. denticola DNA’sına sahip olan toplam 25 adet örneğin 7’sinde msp geni saptandı. msp DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis grubundaki toplam 12 vakanın 4’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki toplam 1 vakanın 1’inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki toplam 12 vakanın 2’sinde tespit edildi. msp varlığı ile herhangi bir klinik patolojik durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı değildir (p = 0.17) (Tablo 15). Tablo 15. Çalışmaya alınan hastaların kök kanal örneklerinde msp DNA’sı varlığının klinik tanı tiplerine göre dağılımı. msp PCR Patoloji Negatif (%) Pozitif (%) AAP 8 (32,00) 4 (16,00) Toplam (%) 12 (48,00) AAA 0 (0,00) 1 (4,00) 1 (4,00) KAP 10 (40,00) 2 (8,00) 12 (48,00) Toplam 18 (72,00) 7 (28,00) 25 (100,00) p = 0,17 52 T.denticola/P.gingivalisin birlikte saptandığı örnek sayısı Akut Apikal Periodontitis grubunda 2, Akut Apikal Abse grubunda 1, Kronik Apikal Periodontitis grubunda ise 2’dir. T.denticola ve P.gingivalisin birarada bulunduğu örnekler ile belirli bir klinik patoloji arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı değidir. İki bakteri türünün birlikte saptandığı örnek sayıları, yüzdeleriyle birlikte Tablo 16’da gösterilmiştir. Tablo 16. T.denticola/P.gingivalis DNA’sının birlikte saptandığı örnekler T.denticola/P.gingivalis PCR Patoloji Negatif (%) Pozitif (%) AAP 24 (40,00) 2 (3,33) Toplam (%) 26 (43,33) AAA 6 (10,00) 1 (1,67) 7 (11,67) KAP 25 (41,67) 2 (3,33) 27 (45,00) Toplam 55 (91,67) 5 (8,33) 60 (100,00) p = 0,832 Real-time PCR sırasında hedef bölgelerin çoğaltılması, floresans ölçümleri, florometrik okumalar ile ilgili kayıtlar; Msp’nin her iki genotipinin aminoasit dizileri ve agar jeldeki görüntüsü Şekil 11,12,13,14,15 ve 16’da gösterilmiştir. 53 Şekil 11. Gerçek zamanlı florometrik PCR sonunda cihaza B2 – G9 pozisyonlarına yerleştirilen tüplerden okunan son floresans değerlerinin gösterilmesi. Şekil 12. ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında gerçekleştirilen çoğaltma sırasında çeşitli dalga boylarında kaydedilen floresans ölçümleri ve sıcaklık döngüsü. Grafikte x ekseni zaman içinde yapılan floresans ölçümlerini, üstteki y ekseni floresans birimlerini, alttaki y ekseni ise termal bloktan ölçülen sıcaklık değerlerini göstermektedir. 54 Şekil 13. ABI Prism 7700 gerçek zamanlı florometrik PCR cihazında gerçekleştirilen Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis hedef bölgelerinin çoğaltılması. Grafiğin x ekseni PCR’nin döngülerini, y ekseni ise birim floresansın logaritmasını göstermektedir. Tepkimenin 40 döngüsü boyunca geometrik çoğalma eğrisi gösteren 1, 2 ve 3 no’lu tüpler pozitif olarak değerlendirilmiştir. Eşik floresans değerinin altında kalan 4, 5 ve 6 no’lu örnekler negatif olarak değerlendirilmiştir. 55 Şekil 14. Treponema denticola Msp genotip 1 ve 2’nin amino asit dizilerinin karşılaştırılması. 56 Şekil 15. Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f1 ve tdmsp-r1 primer çifti ile elde edilen Msp genotip 1’e ait 320 baz uzunluğundaki PCR ürünleri. (S: 100 baz merdiven DNA moleküler ağırlık standardı; NK: PCR negatif kontrol) 57 Şekil 16. Treponema denticola pozitif bulunan örneklerden tdmsp-f2 ve tdmsp-r2 primer çifti ile elde edilen Msp genotip 2’ye ait 454 baz uzunluğundaki PCR ürünleri. (S: 100 baz merdiven DNA moleküler ağırlık standardı; NK: PCR negatif kontrol) 58 5. TARTIŞMA Kök kanalında var olan gram negatif anaerob mikroorganizmaların periapikal enfeksiyonun oluşması ve ilerlemesindeki rolü bir çok araştırmacı tarafından belirtilmiştir3,4,17,21,56,62,63,86,95,128,129. Özellikle ‘kırmızı kompleks’ olarak bilinen bakteriler aralarındaki sinerji ve içerdikleri bir çok virülans faktörleri nedeniyle akut ve kronik apikal periodontitisin oluşmasında başrol oynamaktadır. Ancak bu mikroorganizmaların geleneksel kültür yöntemleri ile üretilmeleri çok zor, hatta çoğu zaman imkansız olmaktadır. Bu nedenle moleküler mikrobiyolojik tekniklerin endodontide kullanılmaya başlanmasından önce, bu mikroorganizmalarla kök kanalında ya hiç karşılaşılmamakta ya da çok düşük prevalanslarda karşılaşılmaktaydı130. Moleküler mikrobiyolojik tekniklerdeki ilerleme ile zorunlu anaerobik gram negatif mikroorganizmaların kök kanallarında hiç de azımsanamayacak prevalanslarda oldukları ortaya çıkmış ve periapikal hasarın ilerlemesindeki önemleri daha iyi anlaşılmıştır21. Treponema denticola ve Porphyromonas gingivalis ‘kırmızı kompleks’in iki önemli üyesi olup kültür tekniğiyle çok zor üretilebilen mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalar moleküler mikrobiyolojik yöntemlerin gelişiminden önce yalnızca periodontal patojenler olarak bilinmekteydi. Özellikle PCR gibi duyarlılık ve özgüllüğü son derece yüksek olan tekniklerin kliniklere girmesiyle, bu mikroorganizmaların kök kanallarının da predominant patojenlerinden olduğu ve periradiküler hasarla yakın ilişkide bulunduğu ortaya çıkarılmıştır21,56,117. Ayrıca bazı çalışmalarda bu iki mikroorganizmanın birbiri ile sinerjizm gösterdiği bildirilmiştir106. Bakteri türleri arasındaki bu sinerji bakterilerin yaşama şansları ile konak dokuda yarattıkları zararlı etkileri arttırarak periradiküler hasarın patogenezinde önemli rol oynamaktadır56. Örneğin Grenier107, P. gingivalis ve T. denticola’yı aynı karışıma inoküle ettiklerinde her iki bakteri türü tarafından üretilen büyüme faktörlerine bağlı olarak aralarındaki ilişkinin arttığını gözlemlemişlerdir. Buna karşın bazı çalışmalar bu iki bakteri türü arasındaki sinerjiyi göstermekte başarısız olmuştur56. Mikroorganizmaların mikrobiyal DNA’larını saptayan yöntemler, klinik ve araştırma laboratuvarlarına girmiştir. Bu yöntemler enfeksiyöz hastalıklar hakkındaki bilgide önemli ölçüde artışa neden olmakta ve çoğu hastalığın etkili ve hızlı tanısına olanak sağlamaktadır131,132. Moleküler mikrobiyolojik teknikler arasında en fazla duyarlılık ve özgüllüğü PCR 59 yöntemi göstermektedir. Örneğin DNA hibridizasyon yöntemi PCR ile karşılaştırıldığında örnek başına 10³ hücre saptayabilirken, PCR tek bir hücreyi bile saptayabilecek duyarlılığa sahiptir24. Mikroorganizmaların tanımlanması için özellikle belirli gen bölgelerini taklit eden sentetik oligonükleotid primerlerin kullanıldığı PCR oral mikrobiyolojide çığır açmıştır. Anaerobik bakterilerin tanımlanması, geleneksel kültür yöntemleri kullanıldığında 7-14 gün gerektirirken, PCR ile yalnızca birkaç saatte başarılabilmektedir7. Hatta bu yöntemin ilerlemesi ile ‘altın standart’ özelliğinde olan kültür yöntemlerinin güncelliği ve etkinliği sorgulanmaya başlanmıştır. Kültür yöntemleri gibi fenotip tabanlı tanımlama yöntemlerinin insan patojenleri hakkında verdiği değerli bilgiye karşı çıkmak mümkün değildir12,133. Ancak enfeksiyöz ajanların tanımlanması ve karakterizasyonu için genotipik özelliklerin daha güvenilir bilgi sağladığının göz önünde bulundurulması gerekir133. Ayrıca genotipik özellikler, mikroorganizmaların izolasyonu ve üretilmelerine gerek duyulmadan klinik örneklerden direkt elde edilebilmektedir134-138. Moleküler biyolojik çalışmalar, endodontik enfeksiyonlardaki baskın anaerobik bakterilerin prevalanslarının belirlenmesinde kültüre dayalı yaklaşımların tartışmalı olduğunu ortaya çıkarmıştır12. Kültür yöntemiyle yıllarca negatif sonuç alınan enfekte kök kanal örneklerinden genotipe dayalı yaklaşımlar kullanılarak pozitif sonuçlar alınmıştır. Bu da fenotipe dayalı yaklaşımların doğal sınırlarını yansıtmaktadır. PCR gibi moleküler tanımlamalar, anaerobik kültürden kaynaklanan birçok zorluğun üstesinden gelerek daha önce kök kanallarında çok az sıklıkla saptanan veya hiç saptanmamış olan bir çok patojen mikroorganizmanın hiç de azımsanmayacak prevalanslarda olduklarını göstermiştir8,10,48,49,57,99,139,140. PCR, mikroorganizmaları tanımlamak için onları saf kültürde izole etme gereği duymadan, klinik örneklerin direkt olarak araştırılmasına olanak vermektedir. Bu da kültür tekniği ile çok zor üretilen veya hiç üretilemeyen bir çok anaerobik bakterinin belirlenmesinde önemli yararlar sağlamaktadır22,24. Bu çalışmada tüm bu avantajlarından dolayı T.denticola ve P.gingivalisin araştırılmasında PCR yöntemi tercih edilmiştir. PCR yönteminin uygulanma tekniğindeki farklılıklar nedeniyle çeşitli varyasyonları bulunmaktadır. Bizim çalışmamızda, diğer PCR tekniklerine göre daha duyarlı, özgül ve hızlı ölçüm yapabildiği düşünülen “Real-time PCR” kullanılmıştır23,141. Konu ile ilgili literatür gözden geçirildiğinde, Realtime PCR’ın yalnızca bir çalışmada P. gingivalis’i saptamak amacıyla kullanıldığı görülmüştür, ancak bu çalışmada örnekler periodontal cepten alınmıştır142. Bu nedenle bu çalışmadan farklılık göstermektedir. Enfekte 60 kök kanallarının mikrobiyolojik açıdan değerlendirilmesinde kullanılan diğer çalışmalarda ise, nPCR, 16S rDNA esas alınarak yapılan PCR veya yine yüksek duyarlılığa sahip multipleks PCR ve QRT-PCR kullanılmıştır8,21,23,48,49,99. P. gingivalis ve T. denticola’nın enfekte kök kanallarındaki prevalanslarını saptamak için şimdiye kadar yapılan çalışmaların bazılarında kültür, bazılarında PCR yöntemi kullanılmıştır. Günümüze kadar yapılmış bazı kültür çalışmalarında P.gingivalis, endodontik enfeksiyonlarda, düşük oranlarda saptanabilmiştir63,128,143,144. Gomes ve arkadaşları58, 50 nekrotik dişten aldıkları örneklerde, P.gingivalis ve bundan başka üç gram negatif bakterinin varlığını hem kültür hem de PCR kullanarak araştırmışlardır. P.gingivalis’in insidansı kültür yöntemiyle %1 oranında saptanırken, PCR ile bu oran %38 olarak belirlenmiştir. Aradaki bu fark PCR’ın kültür yöntemine göre mikroorganizmaları tanımlamada daha yüksek duyarlılığa sahip olduğunu doğrulamaktadır. PCR analizleri sonucunda ortaya çıkan bu daha yüksek prevalansların nedeni kültür işlemleri sırasında üretilmesi zor olan bakterilerin olası kaybı olabilir. T. denticola’nın akut klinik semptomlarla istatistiksel olarak anlamlı ilişkisi bulunmuştur. Bizim çalışmamızın örnek alma prosedürleri, örnek sayısı ve bakterilerin saptanma prevalans yüzdesi bu çalışma ile benzerlik göstermektedir. Ancak bizim çalışmamızda ne T.denticola’nın, ne de P.gingivalis’in her üç patolojik klinik durumla (Akut Apikal Periodontitis, Akut Apikal Abse, Kronik Apikal Periodontitis) istatistiksel anlamlı ilişkisi tespit edilememiştir. Jacinto ve arkadaşları60, karışık endodontik enfeksiyonlarda P.gingivalis’in insidansını ve antimikrobiyal duyarlılığını kültür yöntemiyle incelemişler, P.gingivalis’e 70 abseli dişin 20’sinde rastlamışlardır. Bizim çalışmamızda P.gingivalis, PCR kullanılarak Akut Apikal Abse grubundaki dişlerin %28’inde saptanmıştır. Bu çalışmada kullanılan teknik bizim çalışmamızdakinden farklı olsa da, her iki çalışmanın sonuçları benzerlik göstermektedir. Bu çalışmada kültür yönteminin kullanılmasının bir nedeni, PCR yönteminin eksik kaldığı bir konu olan antimikrobiyal duyarlılığın incelenmesi olabilir. P.gingivalis ve Treponema denticola’nın içinde bulunduğu 10 adet bakteriyel patojenin incelendiği bir PCR çalışmasında, bu bakteriler kök kanalında yüksek prevalansta saptanmış, ancak herhangi bir belirgin klinik semptom ile ilişkisi bulunamamıştır6. Oysa ki bu bakterilerin akut semptomlarla ilişkisi daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir3,106. Bizim 61 çalışmamızda kullanılan teknik Real-time PCR olmakla birlikte bakterilerin saptanma oranları ve semptomlarla ilişkileri açısından bulgular, bu çalışmanınkilerle benzerlik göstermektedir. Gomes ve arkadaşları145, enfekte kök kanallarını kültür yöntemi kullanarak mikrobiyolojik olarak incelemişlerdir. Çok çeşitli mikroorganizma türleri arasındaki kommensal ilişkileri saptamışlar ve bu türlerin semptomlarla olan ilişkilerini incelemişlerdir. Bu çalışmada P.gingivalise %6.7 oranında rastlanmıştır ve bu bakteri pürülan eksuda, şişme, ıslak kanal ve ağrı hikayesi semptomları ile ilişkili bulunmuştur. Bizim çalışmamızda Akut Apikal Abse grubundaki dişler, pürülan eksuda, ağrı ve şişme ile karakterizedir. Ancak bu semptomlar ile P. gingivalisin varlığı arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Ayrıca P. gingivalisin %16.7 oranında saptanmış olması, PCR’ın kültür yöntemine göre daha hassas olduğu sonucunu bir kez daha ortaya koymaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu ile incelenen örneklerde kültür yöntemine göre daha yüksek saptanan prevalansların bir nedeni de PCR’ın mikroorganizmaları tanımlamak için onların canlılıklarına ihtiyaç duymayışı olabilir. Bir başka deyişle PCR ile bir mikroorganizmanın yaşamını sürdürüp sürdürmediği anlaşılamamakta dolayısıyla hastalıkların antimikrobiyal tedavilere verdikleri yanıtlar değerlendirilememektedir. Bu, PCR’ın eksik kaldığı bir konu olarak düşünülebilir. Enfekte kanalların apikal üçlüsündeki mikroorganizmaların PCR ile araştırıldığı bir çalışmada T. denticola’ya %26, P. gingivalis’e de %4 oranında rastlanmıştır12. Bu çalışmada alınan örnekler, çekilmiş dişlerden ve yalnızca apikal üçlü bölgesinden elde edilmiştir. Dolayısıyla bizim çalışmamızda olduğu gibi tüm kök kanalında var olan bakteri popülasyonu değerlendirilmemiştir. Saptanan bakteriyel prevalanslar, kullanılan yöntem benzer olmasına karşın, bizim çalışmamızdakine göre oldukça düşüktür. Kapalı periapikal lezyonlardaki siyah pigmentli anaerob rodların (P.endodontalis, P.gingivalis, Prevotella intermedia ve Prevotella nigrescens) PCR yöntemi ile araştırıldığı bir çalışmada, P.gingivalis, 20 kapalı periapikal lezyonun yalnızca birinde saptanabilmiştir57. Siyah pigmentli mikroorganizmaların tedavi görmemiş nekrotik kök kanallarından ve akut periapikal lezyonlardan sıklıkla izole edilmesine karşın, yıkıcı endodontik harabiyetle ilişkili kapalı periapikal lezyonlarda bu mikroorganizmalara çok az rastlanmaktadır9,146,147,148. Bu sonuç, kapalı periapikal lezyonların göreceli stabil ve kronik doğasıyla açıklanabilir. Anaerobik bakterilerin endodontik tedaviden sonra yaşayamaması da kapalı periapikal lezyonlarda daha az rastlanmalarına neden olabilir. Ayrıca bu çalışmada örnekler, periapikal bölgeye yapılan insizyonla 62 periapikal lezyonlardan direkt olarak elde edilmiştir. Bu örnekleme prosedürü bizim çalışmamızda ve diğer çalışmalarda kullanılandan farklıdır. Bizim çalışmamızda, örnekler primer endodontik enfeksiyonlarla ilişkili enfekte kök kanallarından herhangi bir cerrahi girişim yapılmadan alınmıştır. Bu nedenle sonuçlarımız direkt olarak bu çalışmanınkilerle karşılaştırılamaz. Siqueira ve arkadaşları11, endodontik kaynaklı abselerde farklı Treponema türlerinin varlığını araştırmışlar ve T.denticola’ya %79 oranında rastlamışlardır. Bu çalışma ayrıca T. pectinovorum, T. amylovorum ve T. medium’un enfekte kök kanallarındaki varlığını ilk kez nPCR kullanarak saptamıştır. Bu çalışmada bizimkinden farklı olarak nested PCR kullanılmışır. Bizim deneyimizde PCR yöntemleri arasında en fazla hassasiyete sahip olduğu ileri sürülen Real-Time PCR yöntemi kullanılmıştır ve T.denticola nispeten daha düşük bir prevalansta (% 44.1) saptanmıştır. Prevalanslar arasında saptanan bu fark, kullanılan PCR yönteminin tipine, vaka seçimine ve örnek alma işlemindeki farklılıklara bağlanabilir. Siqueira ve arkadaşları99, 54 vakada T.denticolanın varlığını araştırmışlar ve bizim çalışmamızda olduğu gibi vakaları asemptomatik, semptomatik vakalar ve akut periradiküler abseler olmak üzere 3 gruba ayırmışlardır. Çalışmalarında 16S rDNA bazlı PCR kullanarak asemptomatik vakalarda % 34.5, akut vakalarda % 53.3, akut periradiküler abselerde ise % 50 oranında bu mikroorganizmayı saptamışlardır. Akut ve asemptomatik vakalardaki prevalanslar, bizim çalışmamızın yine aynı vakalardaki prevalansları ile benzerlik göstermektedir. Belirli işaret ve semptomlarla bakteri varlığı arasında pozitif ilişkinin saptanmadığı çalışmanın bulguları, bu açıdan da bizim çalışmamızın bulgularını desteklemektedir. Siqueira ve arkadaşları117, yaptıkları bir başka çalışmada T.denticola’yı, çürüklü, nekrotik pulpalı ve periradiküler kemik kaybına dair radyografik bulgu veren 21 vakada % 52.4 oranında saptamışlardır. Bu çalışmada bakterinin semptomlarla ilişkisine bakılmamıştır. Kullanılan PCR yöntemi farklı olsa da, sonuçlar bizim çalışmamızdakilerle benzerlik göstermektedir. Roças ve arkadaşları56, kırmızı kompleksin kök kanallarındaki prevalanslarını 16S rDNA’yı esas alan PCR kullanarak incelemişlerdir. Bu çalışmada T.denticola % 44, P.gingivalis % 30 oranında saptanmıştır ve belirli klinik semptomlarla bu bakteri türleri arasında bir ilişki bulunamamıştır. Ayrıca bu bakteri türlerinin birarada bulunduğu örnek sayısını da inceleyerek T.denticola ile P.gingivalis arasında herhangi bir 63 pozitif ilişkiye, yani sinerjiye rastlamamışlardır. Bizim çalışmamızın prevalans bulguları ile bu çalışmanınkiler benzerlik göstermektedir. Ayrıca iki bakteri arasında sinerjinin saptanamamış olması da bizim çalışmamızın sonuçlarını desteklemekte, ancak Socransky ve arkadaşlarının55 periodontal hasarlı dişlerle yaptıkları çalışma bulgularıyla uyumsuzluk göstermektedir. Bu fark, kök kanal sistemi ile periodontal cep arasındaki mikroçevresel koşul farklarından kaynaklanıyor olabilir. Ayrıca, kompleksteki her bakteri türünün sayısı doku cevabının şiddetini değiştirebilmektedir. Literatür gözden geçirildiğinde bu çalışmanın, kök kanallarında T.denticola ve P.gingivalis’in Real time-PCR kullanılarak saptandığı ilk çalışma olduğu sonucuna varılmıştır. Ancak Kawada ve arkadaşlarının142 yaptıkları bir çalışmada, P.gingivalisin periodontal hasarlı dişlerin dişeti ceplerinden alınan örneklerdeki varlığını Real time-PCR kullanarak araştırmışlardır. Bu bakterilerin prevalansları ile periodontal hasarın derecesi arasındaki ilişki incelenmiş ve tedavi öncesi ve sonrası bakteri yükü hesaplanmıştır. Bu çalışma, kullanılan test yöntemi ve hedef bakteri türü açısından bizim çalışmamız ile benzerlik göstermektedir. Ancak hastalık türü ve örnek alınan bölge farklıdır. Real-time PCR, tedavi öncesi ve sonrası bakteri yükünün hızlı ve hassas bir şekilde hesaplanmasına olanak vererek, endodontik ve periodontal tedavilerin hangi ölçüde bakteri eliminasyonunu sağladığını gösteren önemli bir ölçüm yöntemidir. Enfekte kök kanallarının PCR kullanılarak mikrobiyolojik yönden incelendiği çalışmalarda, bakteri prevalansları arasındaki bu farklar, kullanılan PCR tekniği, DNA ekstraksiyonu ve örnek alma prosedüründeki farklılıklardan kaynaklanabileceği gibi; çalışılan popülasyonların ırksal ve coğrafi varyasyonları ile örnekleme işlemi sırasında meydana gelebilecek olası kontaminasyona da bağlanabilir149,150,151. Herhangi bir patolojik durum ya da klinik semptom ile belirli bakterilerin varlığı arasındaki istatistiksel ilişkinin bazı çalışmalarda saptanıp bazı çalışmalarda saptanamamış olması; vaka seçimine, endikasyon koyarken göz önüne alınan kriterlere ve gruplardaki örnek sayısına bağlanabilir. ‘Kırmızı kompleks’in önemli iki üyesi olan T.denticola / P.gingivalis pek çok virülans faktörüne sahiptir. Bu genler, bu iki endodontik patojenin konağa zarar verme mekanizmasındaki başlıca etkenlerdir. Bu virülans faktörleri arasından bizim açımızdan önemli sayılan iki tanesi çalışmamızda incelenmiştir. P.gingivalisin kollajenaz geninin çok yıkıcı bir enzim olduğu ve periapikal bölgedeki kemik kaybından sorumlu olabileceği 20,79,81,95 düşünülmektedir . Ancak bu mikroorganizma türünün hepsinde bu 64 genin bulunup bulunmadığı bilinmemektedir ve tarafımızdan araştırılmıştır. T.denticola’nın msp yüzey geninin onu daha potansiyel bir endodontik patojen haline getirdiği düşünülmektedir111,114,152,153. Bu çalışmada her iki virülans faktörünün varlığı ve insidansı pozitif çıkan örneklerde Real-Time PCR kullanılarak incelenmiştir. Ana yüzey proteini (msp), ısı ile modifiye edilebilen, proteaza dirençli, yüksek ağırlıkta immünojenik bir protein kompleksidir154. Bu protein T.denticola’nın dış yüzeyinde organize olmuştur, dış kılıfın ana protein bileşenidir ve yüksek miktarlarda salgılanmaktadır. Ana yüzey proteininin en önemli özelliği bakterinin konak hücrelerine ve doku proteinlerine adezyonunda rol oynaması ve P. gingivalis ile T. denticola’nın biyofilm oluşturmasına katkıda bulunmasıdır111,152. Yakın zamana kadar T.denticola’nın DNA dizilerinden sadece tdpA antijen reaktif bulunmuştur155. Ancak günümüzde bunun tam tersine tdpA, T.denticolada düşük seviyelerde eksprese edilirken, msp proteininin daha yüksek seviyelerde tespit edildiği bildirilmiştir155. Daha önceki çalışmalarda, msp’nin yalnızca T. denticola’nın adezini olarak görev yaptığı bildirilmiştir111,153. Ancak P. gingivalis’le biyofilm oluşumunda bu dış membran proteinin önemli rolünü de gözardı etmemek ve ileriki çalışmalarda incelemek gerekir. Benzer şekile, prolil-fenilalanine özgü serin proteaz, (dentisilin-kemotripsin benzer proteaz olarak da bilinir) T. denticola’nın ürettiği başlıca ekstraselüler (hücre dışı) proteazdır153. prtP ise dentisilini kodlayan gendir ve Ishihara ve arkadaşları156 tarafından 1996 yılında izole edilmiştir. Dentisilin epitelyal hücrelerin adezyonunda ve msp proteininin organizasyonunda etkili olmaktadır156. Ana yüzey proteini, T.denticola’nın P.gingivalis ile biyofilm oluşturmasında önemli rol oynadığı için msp mutantları, in vitroda biyofilm oluşturmada yetersiz kalmaktadır. Ayrıca dentisilin, msp’nin organizasyonundan sorumlu olduğu için, prtP mutant T.denticola’lar da biyofilm oluşturmakta yetersiz kalmaktadır. Daha önceki çalışmalarda, msp’nin biyofilm oluşturma, T.denticola’nın ekstrasellüler matrikse bağlanmasını düzenleme, T.denticola’nın hareketsiz laminin ve fibronektine bağlanma kapasitesini arttırma özellikleri incelenmiştir111,157. Bizim çalışmamızda T.denticola DNA’sının pozitif saptandığı örneklerde msp geninin varlığına bakılmıştır. Toplam 25 adet pozitif örnekte, msp’nin aminoasit dizisindeki farklılıklar nedeniyle, her iki genotipinin varlığı PCR yöntemi kullanılarak incelenmiştir. Literatür gözden geçirildiğinde PCR ile msp geninin prevalansının daha önceden incelenmediği görülmüş olup; bu çalışma bu konudaki ilk çalışma olma özelliğini taşımaktadır. 65 Çalışmamızda T.denticola pozitif çıkan örneklerin ancak %28’inde msp’nin saptanmış olması, bu genin her T.denticola zincirinde bulunmadığı sonucunu ortaya çıkarmaktadır. Bu da, msp’nin T.denticola’nın adezyonunda ve diğer olası patojenik etkilerinde tek başına etkili olmadığı düşüncesini akla getirmektedir. Ana yüzey proteininin pozitif olduğu örneklerle negatif olduğu örnekler arasında endodontik harabiyet açısından da bir fark yoktur. Ayrıca msp’nin varlığı ile belirli bir klinik patolojik durum (akut apikal abse, akut apikal periodontitis, kronik apikla periodontitis gibi) arasındaki ilişki değerlendirildiğinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark çıkmamıştır. Yani msp’nin varlığı ile bazı klinik durumlara özgü belirgin klinik semptomlar (ağrı, şişme, perküsyon, vs.) arasında anlamlı bir ilişki yoktur. Sonuçta msp, T.denticolanın patojenitesinde sınırlı bir etkiye sahip olabilir ve bakterinin patojenitesi diğer olası virülans faktörleri ile birlikte değerlendirilip incelenmelidir. Kollajen, insan ve hayvanlardaki gingival dokunun başlıca bileşenidir158. Periapikal ve periodontal hasarın önemli bir özelliği gingival kollajen lif yoğunluğundaki azalmadır158. Takahashi ve arkadaşları159, P.gingivalis’in prtC geninin ekspresyonu ve klonlamasını ilk kez bildiren araştırmacılardır. Kato ve arkadaşları82, prtC’nin nükleotid dizisini saptamışlar ve amino asit dizisinin 37.8 kDA proteine eşit olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışmada prtC geni, ökaryotik kollajenazlarla yapısal benzerlik göstermese de çözünmüş ve tekrar oluşmuş tip I kollajeni, ısı ile denatüre olmuş (bozulmuş) tipI kollajeni ve azokolü parçalayabilmiştir. Ancak sentetik kollajenazı parçalayamamıştır82. Bazı siyah pigmentli gram negatif mikroorganizmaların nötr proteaz ürettikleri bildirilmiştir79,80. Ancak hangi bakteriyel proteazların nasıl bir moleküler mekanizma ile doku hasarı oluşturdukları açık değildir. Bu virülans faktörleri, konak dokuda direkt olarak harabiyet oluşturdukları gibi, konak dokuları arasında bulunan kollajenazları (konak dokunun enzimleri) aktive ederek de periapikal ve periodontal zarar meydana getirebilir79,80. Bizim çalışmamızda P.gingivalis DNA’sının pozitif saptandığı örneklerde prtC’nin varlığı ve prevalansı Real-time PCR kullanılarak incelenmiştir. Kollajenaz geni, yalnızca bir örnek hariç, tüm P.gingivalis pozitif örneklerde saptanmıştır. Literatürde yer alan çok sınırlı sayıda çalışmada, endodontik enfeksiyonlardan elde edilen P.gingivalis’lerin prtC geni açısından taraması, PCR kullanılarak yapılmıştır. Odell ve arkadaşları81, endodontik enfeksiyonlardan izole ettikleri tüm P.gingivalis izolatlarında prtC’yi 66 saptamışlardır. Slots ve arkadaşları83, endodontik izolatları prtC primerleri kullanarak incelemişler ve tüm P.gingivalis izolatlarının prtC’ye sahip olduklarını bildirmişlerdir. Kullanılan PCR yöntemi farklı olsa da bu bulgular bizim çalışmamızın sonuçlarını desteklemektedir. Bodinka ve arkadaşları84, prtC’yi, 21 P. gingivalis izolatının ancak 16’sında saptayabilmişlerdir. Bu bulgu, Odell ve arkadaşları81, Slots ve arkadaşları83 ve bizim çalışmamızın bulguları ile çelişmektedir. Aradaki bu farklar, P.gingivalisin nükleotid heterojenliğinden kaynaklanıyor olabilir. Kollajenaz geninin nükleotid heterojenliği, amplifikasyon etkinliğindeki farklardan sorumlu tutulabilir. Bakterilerin potansiyel virülans faktörlerinin direkt etkileri yanında indirekt etkileri de değerlendirilmelidir. Çünkü virülans genleri, konak dokudaki bazı enzimlerin ekspresyonlarını arttırarak veya konak dokunun sahip olduğu bu yıkıcı enzimleri bazı mekanizmalarla aktive ederek de indirekt hasar yaratabilmektedir59,95,96,98,160,161. Ayrıca bu genlerin bazılarının, ileride bu bakterilerin meydana getirdikleri doku hasarlarına karşı geliştirilmesi muhtemel aşı adayları olabilecekleri de unutulmamalıdır. Kültür yöntemiyle üretilmesi zor veya imkansız olan mikroorganizmaların 16S rRNA bölgelerinin PCR kullanılarak çoğaltılması moleküler mikrobiyolojide çığır açmıştır. PCR kültür yöntemlerine göre daha hassas, özgül ve hızlıdır; ayrıca daha kesin sonuçlar sağlar. Bu metodların yerinde kullanımı, endodontik hastalıkların nedenlerinin belirlenmesine, anlaşılmasına ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine önemli katkılar sağlayacaktır. 67 6. SONUÇLAR Enfekte kök kanallarında Treponema denticola ile Porphyromonas gingivalisin, kollajenaz (prtC) ve ana yüzey proteini (Msp) genlerinin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real-time PCR) ile incelendiği tez çalışmamızda aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir: 1. Örnek alınan 60 enfekte pulpanın DNA ekstraksiyonlarının başarıyla gerçekleştiğinin doğrulanması için üniversal bakteriyel primer ve problarla yapılan Real-time PCR sonucunda, tüm örneklerde bakteri DNA’sı saptandı. DNA ekstaksiyonunun kan,tükrük, vb. materyallerle inhibe olmadığı belirlendi, 2. Toplam 60 örneğin 25’inde (% 44.1) T. denticola, 10’unda (%16.67) P. gingivalis DNA’sı saptandı, 3. Akut Apikal Periodontitis grubuna dahil olan toplam 26 vakanın 12’sinde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 1’inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 27 vakanın 12’sinde T. denticola DNA’sı saptandı. T.denticola varlığı ile belirli bir klinik patolojik durum arasındaki ilişkinin istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlendi (p>0.05), 4. Akut Apikal Periodontitis grubuna dahil olan toplam 26 vakanın 3’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki 7 vakanın 2’sinde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 27 vakanın 5’inde P. gingivalis DNA’sı saptandı. Bu bakterinin varlığı ile belirli bir klinik patolojik durum arasındaki ilişkinin istatistiksel olarak anlamlı olmadığı belirlendi (p>0.05), 5. T.denticola/P.gingivalisin birlikte saptandığı örnek sayısı Akut Apikal Periodontitis grubunda 2, Akut Apikal Abse grubunda 1, Kronik Apikal Periodontitis grubunda ise 2’dir. T.denticola ve P.gingivalisin birarada bulunduğu örnekler ile üç klinik patoloji arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmamış, yani aralarında herhangi bir sinerjiye rastlanmamıştır, 6. P.gingivalis DNA’sının pozitif olarak belirlendiği toplam 10 adet örneğin 9’unda kollajenaz geni (prt C) saptandı. prtC DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis grubundaki 3 vakanın tamamında, Akut Apikal Abse grubundaki 2 vakanın 1’ inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 5 vakanın tamamında tespit edildi. prtC varlığı ile herhangi bir klinik patolojik durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05), 68 7. T. denticola DNA’sına sahip toplam 25 adet örneğin 7’ inde ana yüzey proteini (msp) geni saptandı. msp DNA’sı, Akut Apikal Periodontitis grubundaki 12 vakanın 4’ünde, Akut Apikal Abse grubundaki 1 vakanın 1’inde, Kronik Apikal Periodontitis grubundaki 12 vakanın 2’sinde tespit edildi. Msp varlığı ile herhangi bir klinik patolojik durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p >0.05), 8. P.gingivalisin kollajenaz geninin hemen hemen tüm P.gingivalis örneklerinde saptanmış olması, bu virülans faktörünün bakterinin yıkıcı patojenik etkilerinden sorumlu tutulabileceğini düşündürmektedir. Ancak Msp’nin yalnızca bazı T.denticola örneklerinde belirlenmiş olması, bu yüzey proteinine sahip olmayan T.denticolaların patojenitesinde azalma olasılığını akıllara getirmektedir. Bu konu hakkında daha ileri araştırmalar gerekmektedir. 9. Tüm bu sonuçlar dikkate alındığında, T.denticola ve P.gingivalis’in enfekte kök kanalında yüksek prevalansta var olan potansiyel iki endodontik patojen olduğu ve kültür yöntemiyle üretilmesi zor olan bu tür anaerob mikroorganizmaların Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile hassas ve gerçekçi bir şekilde tanımlanabileceği saptanmıştır. Ayrıca ‘kırmızı kompleks’in bu iki üyesinin akut ya da kronik semptomlarla direkt olarak ilişkilendirilemeyeceği; enfekte kök kanalında meydana gelen bu değişimlerin bir ya da birkaç mikroorganizma kaynaklı değil, polimikrobiyal ve multifaktöriyel olduğu unutulmamalıdır. 69 Enfekte Kök Kanallarında Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis ve Bu Bakterilere Ait Virulans Faktörlerinin Moleküler Mikrobiyolojik Teknikler ile İncelenmesi 7. ÖZET Bu çalışmanın amacı, enfekte kök kanallarında Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis ve bu patojenlerin msp ve prtC genlerinin varlığı ve prevalanslarının Real-time PCR ile belirlenmesidir. Bu iki endodontopatojen ve virulans genleri ile klinik semptomlar arasındaki ilişki de çalışmamızda değerlendirilmiştir. 60 hastadan elde edilen enfekte pulpalar, akut apikal periodontitis, kronik apikal periodontitis ve akut apikal abse olmak üzere üç gruba ayrıldı. DNA ekstraksiyonunun ardından örnekler, T.denticola ve P.gingivalis için özgül primer ve problar kullanılarak Real-time PCR ile incelendi. P.gingivalis DNA’sının pozitif saptandığı örneklerde, kollajenaz geninin belirlenmesi amacıyla prtC’ye özgül bakteriyel primerler ve TaqMan problar kullanılarak Real-time PCR gerçekleştirildi. T.denticola’nın pozitif saptandığı örneklerde, msp geninin belirlenmesi amacıyla konvansiyonel PCR uygulandı. T.denticola, incelenen tüm örneklerin % 44.1’inde, akut apikal periodontitis grubundaki 26 vakanın 12’inde, akut apikal abse grubundaki 7 vakanın birinde, kronik apikal periodontitis grubundaki 27 vakanın 12’inde saptandı. P.gingivalis, incelenen tüm örneklerin %16.7’inde, akut apikal periodontitis grubundaki 26 vakanın 3’ünde, akut apikal abse grubundaki 7 vakanın ikisinde, kronik apikal periodontitis grubundaki 27 vakanın 5’inde saptandı. msp DNA’sı T.denticola’nın pozitif saptandığı 26 adet örneğin 7’inde, prtC DNA’sı P.gingivalis’in pozitif saptandığı 10 örneğin 9’unda saptandı. Bakteriler ve virülans genleri ile üç klinik patolojik durum arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. (p>0.05) Anahtar sözcükler: Kollajenaz, ana yüzey proteini, Porphyromonas gingivalis, Real-time PCR, Treponema denticola 70 Identification of Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis and Their Virulence Factors in Infected Root Canals by Molecular Microbiologic Techniques 8. SUMMARY The aim of this study was to assess the presence and prevalence of T. denticola, P. gingivalis and their msp and prtC genes in the infected root canals by Real-time PCR. The relationship between the presence of these two endodontopathogens, their virulence genes and the clinical symptomatology was also evaluated. The infected pulps of 60 patients were divided into the following three clinical groups: acute apical periodontitis, chronic apical periodontitis, acute apical abscess. DNA was extracted from samples which were further analysed using the primers and probes that are specific for T. denticola and P.gingivalis. In the samples that yielded positive P.gingivalis DNA amplicon, in order to detect the collagenase gene Realtime PCR were performed using prtC specific bacterial primers and Taq Man probes. The conventional PCR method was employed to identify msp in the samples that were positive for T.denticola. T.denticola was found in 44.1% of the total samples, in 12 of 26 cases with acute apical periodontitis, one of seven cases with acute apical abscess, and 12 of 27 cases with chronic apical periodontitis. P.gingivalis was observed in 16.7% of the total, three of 26 cases with acute apical periodontitis, two of seven cases with acute apical abscess, and five of 27 cases with chronic apical periodontitis. msp DNA was detected in seven of 26 T.denticola positive samples, and prtC DNA was detected in nine of ten P.gingivalis positive samples. The association between the presence of the bacteria, the virulence genes and three clinical pathologies was not statistically significant (p>0.05). Key words: Collagenase, major surface protein, Porphyromonas gingivalis, Real-time PCR, Treponema denticola 71 9. KAYNAKLAR 1. Baumgartner JC. Microbiological and molecular analysis of endodontic infections. Endodontic Topics 2004; 7: 35-51. 2. Griffee MP, Patterson SS, Miller CH, Kafrawy AH, Newton CW. The relationship of Bacteroides melaninogenicus to symptoms associated with pulpal necrosis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1980; 50: 457-461. 3. Sjogren U, Hanstrom L, Happonen P, Sundqvist G. Extensive bone loss associated with periapical infection with Bacteroides gingivalis: a case report. Int Endod J 1990; 23: 254-62. 4. Sundqvist G, Johansson E, Sjogren U. Prevalence of blackpigmented bacteroides species in root canal infections. J Endod 1989; 15: 13-9. 5. Beikler T, Peters U, Ehmke B, Flemmig TF. Sequence analysis of kgp in Porphyromonas gingivalis isolates from periodontitis patients. Oral Microbiol Immunol 2003; 18: 393-7. 6. Fouad AF, Barry J, Caimano M, Clawson M., Zhu Q, Carver R, et al. PCR-based identification of bacteria associated with endodontic infections. J Clin Microbiol 2002; 40: 3223-31. 7. Siqueira JF, Roças IN. PCR methodology as a valuable tool for identification of endodontic pathogens. J Dent 2003; 31: 333-9. 8. Siqueira JF, Roças IN. Bacteroides forsythus in primary endodontic infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29: 390-3. 9. Siqueira JF, Roças IN. Polymerase chain reaction-based analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2004; 97: 85-94. 10. Siqueira JF, Roças IN. Simultaneous detection of Dialister pneumosintes and Filifactor alocis in endodontic infections by 16S rDNA directed Multiplex PCR. J Endod 2004; 30: 851-4. 11. Siqueira JF, Roças IN. Treponema species associated with abscesses of endodontic origin. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 336-40. 72 12. Siqueira JF, Roças IN, Alves FR, Santos KRN. Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals: a molecular investigation. J Endod 2004; 30: 638-43. 13. Alaçam T. Endodonti. 2.Baskı. Ankara: Barış Yayınları; 2000. p.313-83. 14. Trope M, Tronstad L, Rosenberg ES, Listgarten M. Darkfield microscopy as a diagnostic aid in differentiating exudates from endodontic and periodontal abscesses. J Endod 1988; 14: 35-8. 15. Henderson B, Wilson M. Commensal communism and the oral cavity. J Dent Res 1998; 77: 1674-83. 16. Cengiz AT, Mısırlıgil A, Aydın M. Tıp ve Diş Hekimliğinde Genel ve Özel Mikrobiyoloji. 2.Baskı. Ankara: Güneş Kitabevi; 2004. 17. Tronstad L, Sunde PT. The evolving new understanding of endodontic infections. Endodontic Topics 2003; 6: 57-77. 18. Foschi F, Cavrini F, Montebugnoli L, Stashenko P, Sambri V, Prati C. Detection of bacteria in endodontic samples by polymerase chain reaction assays and associations with defined clinical signs in Italian patients. Oral Microbiol Immunol 2005; 20: 289-95. 19. Fredricks DN, Relman DA. Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases. Clin Infect Dis 1999; 29: 475-86. 20. Olsen I, Dahlen G. Salient virulence factors in anaerobic bacteria, with emphasis on their importance in endodontic infections. Endodontic Topics 2004; 9: 15-26. 21. Seol JH, Cha BH, Chung CP, Bae KS. Multiplex polymerase chain reaction detection of black-pigmented bacteria in infections of endodontic origin. J Endod 2006; 32: 110-4. 22. Siqueira JF, Roças IN, Moraes SR, Santos KRN. Direct amplification of rRNA gene sequences for identification of selected oral pathogens in root canal infections. Int Endod J 2002; 35: 345-51. 23. Williams JM, Trope M, Caplan DJ, Shugars DC. Detection and quantitation of E. faecalis by real-time PCR (qPCR), reverse transcriptionPCR (RT-PCR), and cultivation during endodontic treatment. J Endod 2006; 32: 715-21. 73 24. Oliveira JCM, Siqueira JF, Alves G, Hirata RJ, Andrade AFB. Detection of Porphyromonas endodontalis in infected root canals by 16S rRNA gene-directed polymerase chain reaction. J Endod 2000; 26: 72932. 25. Yoshida M, Fukushima H, Yamamoto K, Ogawa T, Toda T, Sagawa H. Correlation between clinical symptoms and microorganisms isolated from root canals of teeth with periapical pathosis. J Endod 1987; 13: 24-8. 26. Belgrader P, Benett W, Hadley D, Richards J, Stratton P, Mariella R, et al. PCR detection of bacteria in seven minutes. Science 1999; 284: 449-50. 27. Berkovitz BKB, Holland GR, Maxham BJ. A Colour Atlas and Textbook of Oral Anatomy. 2nd ed. London: Wolfe Medical Publishing; 1992. 28. Beynon AD. Developing dens invaginatus (dens in dente). Br Dent J 1982; 153: 255-60. 29. Spratt DA. Significance of bacterial identification by molecular biology methods. Endodontic Topics 2004; 9: 5-14. 30. Watts A, Paterson C. Detection of bacteria in histological sections of the dental pulp. Int Endod J 1990; 23: 1-12. 31. Czarnecki RT, Schilder H. A histological evaluation of the human pulp in teeth with varying degrees of periodontal disease. J Endod 1979; 5: 242-53. 32. Langeland K, Rodrigues H, Dowden W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg 1974; 37: 257-70. 33. Mazur B, Massler M. Influence of periodontal disease on the dental pulp. Oral Surg 1964; 17: 592-603. 34. Torabinejad M, Kiger RD. A histologic evaluation of dental pulp tissue of a patient with periodontal disease. Oral Surg 1985; 59: 198-200. 35. Allard U, Nord CE, Sjoberg L, Stromberg T. Experimental infections with Staphylococcus aereus, Streptococcus sangius, Pseudomonas aeruginosa, and Bacteroides fragilis in the jaws of dogs. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1979; 48: 454-62. 74 36. Gier RE, Mitchell DF. Anachoretic effect of pulpitis. J Dent Res 1968; 47: 564-74. 37. Grossman LI. Origin of microorganisms in traumatized, pulpless, sound teeth. J Dent Res 1967; 46: 551-3. 38. Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol 2005; 43: 5721-32. 39. Paster BJ, Boches SK, Galvin JL, Ericson RE, Lav CN, Levanos VA. Bacterial diversity in human subgingival plaque. J Bacteriol 2001; 183: 2770-83. 40. Aas JA, Dardis SR, Griffen AL, Stokes LN, Lee AM, Olsen I, et al. Molecular analysis of bacteria associated with caries in permanent teeth, J Dent Res 2003; 83: IADR Abstract No: 25715. 41. Baumgartner JC, Hutter JW, Siqueira JF. Endodontic Microbiology and Treatment of Infections. In: Cohen S, Hargreaves KM, editors. Pathways of the Pulp. 2nd ed. Canada: Mosby Elsevier; 2006. p. 580-607. 42. Bystrom A, Happonen RP, Sjogren U, Sundqvist G. Healing of periapical lesions of pulpless teeth after endodontic treatment with controlled asepsis. Endod Dent Traumatol 1987; 3: 58-63. 43. Marsh P, Martin MV. Oral Microbiology. 4th ed. Edinburgh: Elsevier Science Ltd ; 2002. 44. Creti R, Imperi M, Bertuccini L, Fabretti F, Orefici G, Rosa RD, et al. Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isolated from different sources. J Med Microbiol 2004; 53: 13-20. 45. Dupre I, Zanetti S, Schito AM, Faddo G, Sechi LA. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis isolates collected in Sardinia (Italy). J Med Microbiol 2003; 52: 491-8. 46. Çolak M, Evcil S, Bayindir YZ, Yiğit N. The effectiveness of three instrumentation techniques on the elimination of Enterococcus faecalis from a root canal: an in vitro study. J Contemp Dent Practice 2005; 15: 94106. 47. Erganiş O, Öztürk A. Oral Mikrobiyoloji & İmmunoloji. Ankara: Nobel Tıp Kitabevleri; 2003. 75 48. Siqueira JF, Roças IN. Treponema socranskii in primary endodontic infections as detected by nested PCR. J Endod 2003; 29: 244-7. 49. Siqueira JF, Roças IN. Pseudoramibacter alactolyticus in primary endodontic infections. J Endod 2003; 29: 735-8. 50. Nisengard & Newman. Oral Microbiology and Immunology. 2nd edn. USA: W.B. Saunders Company; 1994. 51. Chang YC, Lai CC, Yang SF, Chan Y, Hsieh YS. Stimulation of matrix metalloproteinases by black-pigmented Bacteroides in human pulp and periodontal ligament cell cultures. J Endod 2002; 28: 90-3. 52. Chang YC, Huang FM, Yang SF, Liu CM, Lai CC, Chan Y, et al. Induction of cyclooxygenase-2 mRNA and protein expression in human pulp cells stimulated with black-pigmented Bacteroides. J Endod 2003; 29: 240-3. 53. Yang LC, Huang FM, Lin CS, Liv CM, Lai CC, Chang YC. Induction of Interleukin-8 gene expression by black-pigmented Bacteroides, in human pulp fibroblasts and osteoblasts. Int Endod J 2003; 36: 774-9. 54. Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Liu CM, Lai CC, Chang YC. Induction of Interleukin-6 gene expression by proinflammatory cytokines and black-pigmented Bacteroides in human pulp. Int Endod J 2003; 36: 352-7. 55. Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 1998; 25: 134-44. 56. Roças IN, Siqueira JF, Santos KRN, Coelho AMA. ‘Red complex’ (Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola) in endodontic infections: A molecular approach. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 91: 468-71. 57. Bogen G, Slots J. Black-pigmented anaerobic rods in closed periapical lesions. Int Endod J 1999; 32: 204-10. 58. Gomes BPFA, Jacinto RC, Pinheira ET, Sousa ELR, Zaia AA, Ferroz CCR, et al. Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, and Prevotella nigrescens in endodontic lesions detected by culture and by PCR. Oral Microbiol Immunol 2005; 20: 211-5. 76 59. Sorsa T, Ingman T, Suomalainen K, Haapasalo M, Konttinen YT, Lindy O. Identification of proteases from periodontopathogenic bacteria as activators of latent human neutrophil and fibroblast-type interstitial collagenases. Infect Immun 1992; 60: 4491-5. 60. Jacinto RC, Gomes BPFA, Shah HN, Ferraz CC, Zaia AA, SouzaFilho FJ. Incidence and antimicrobial susceptibility of Porphyromonas gingivalis isolated from mixed endodontic infections. Int Endod J 2006; 39: 62-70. 61. Shah HN, Collins MD. Proposal for reclassification of Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides endodontalis in a new genus Porphyromonas. Int J Systemic Bacteriol 1988; 3: 128-31. 62. Van Winkelhoff AJ, Von Steenbergen TJM, Graaff J. The role of black pigmented Bacteroides in human oral infections. J Clin Periodontol 1988; 15: 145-55. 63. Baumgartner JC, Watkins BJ, Bae KS, Xia T. Association of blackpigmented bacteria with endodontic infections. J Endod 1999; 25: 413-5. 64. Laine ML, von Winkelhoff AJ. Virulence of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in a mouse model. Oral Microbiol Immunol 1998; 13: 322-5. 65. Laine ML, Appelmelk BJ, von Winkelhoff AJ. Prevalence and distribution of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in periodontitis patients. J Dent Res 1997; 76: 1840-4. 66. Van Winkelhoff AJ, Appelmelk BJ, Kippuw N, Graaf J. K-antigens in Porphyromonas gingivalis are associated with virulence. Oral Microbiol Immunol 1993; 8: 259-65. 67. Gonzalez D, Tzianabos AO, Genco CA, Gibson FC. Immunization with Porphyromonas gingivalis capsular polysaccharide prevents P. gingivalis-elicited oral bone loss in a murine model. Infect Immun 2003; 71: 2283-7. 68. Xie H, Kozlova N, Lamount RJ. Porphyromonas gingivalis genes involved in fimA regulation. Infect Immun 2004; 72: 651-8. 69. Hamada S, Amano A, Kimura S, Nakagawa I, Kawoboto S, Morisaki I. The importance of fimbriae in the virulence and ecology of some oral bacteria. Oral Microbiol Immunol 2004; 13: 129-38. 77 70. Amano A, Nakagawa I, Okohoshi N, Hamado N. Variations of Porphyromonas gingivalis fimbriae in relation to microbial pathogenesis. J Periodont Res 2004; 39: 136-42. 71. Jotwani R, Cutler CW. Fimbriated Porphyromonas gingivalis is more efficient than fimbria deficient P. gingivalis in entering human dendritic cells in vitro and induces an inflammatory Th 1 effector response. Infect Immun 2004; 72: 1725-32. 72. Narimatsu M, Noiri Y, Itoh S, Noguchi N, Kawahara T, Ebisu S. Essential role for the gtf A gene encoding a putative glycosyltransferase in the adhesion of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun 2004; 72: 2698702. 73. Belton CM, Izutsu KT, Goodwin PC, Pork Y, Lamount RI. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell Microbiol 1999; 1: 215-23. 74. Dorn BR, Dunn WA Jr, Progulske-Fox A. Porphyromonas gingivalis traffics to autophagosomes in human coronary artery endothelial cells. Infect Immun 2001; 69: 5698-708. 75. Dorn BR, Harris LJ, Wujick CT, Vertucci FJ, Progulske-Fox A. Invasion of vascular cells in vitro by Porphyromonas endodontalis. Int Endod J 2002; 35: 366-71. 76. Ishihara K, Nabuchi A, Ito R, Miyachi K, Kuramitsu HK, Okuda K. Correlation between detection rates of periodontopathic bacterial DNA in coronary stenotic artery plaque and in dental plaque samples. J Clin Microbiol 2004; 42: 1313-5. 77. Mastragelopulus N, Haraszthy VI, Zambon JJ, Zofiropoulos GG. Detection of periodontal pathogenic microorganisms in atheromatous plaque. Preliminary results. Chirurg 2002; 73: 585-91. 78. Li L, Messos E, Botista EL, Levine RA, Amor S. Porphyromonas gingivalis infection accelerates the progression of atherosclerosis in a heterozygous apolipoprotein E-deficient murine model. Circulation 2002; 105: 861-7. 79. Birkedal-Hansen H, Taylor RE, Zambon JJ, Barwa PK, Neiders ME. Characterization of collagenolytic activity from strains of Bacteroides gingivalis. J Periodontal Res 1988; 23: 258-64. 78 80. Uitto VJ, Haapasalo M, Laakso T, Salo T. Degradation of basement membrane collagen by proteases from some oral microorganism. Oral Microbiol Immunol 1988; 3: 97-102. 81. Odell LJ, Baumgartner JC, Xia T, David LL. Survey for collagenase gene prtC in Porphyromonas gingivalis and Porphyromonas endodontalis isolated from endodontic infections. J Endod 1999; 25: 555-8. 82. Kato T, Takahashi N, Kuramitsu HK. Sequence analysis and characterization of the Porphyromonas gingivalis prtC gene, which expresses a novel collagenase activity. J Bacteriol 1992; 174: 3889-95. 83. Slots J, Flynn MJ, Li G. Polymerase chain reaction analysis of the Porphyromonas gingivalis collagenase gene. Clin Infect Dis 1995; 20: 1678. 84. Bodinka A, Schmidt H, Henkel B, Fleming TF, Klaiber B, Karch H. Polymerase chain reaction for the identification of Porphyromonas gingivalis collagenase genes. Oral Microbiol Immunol 1994; 9: 161-5. 85. Hang CY, Lin SK, Kok SH, Chang SJ, Lee MS, Wang TM, et al. The role of lipopolysaccharide in infectious bone resorption of periapical lesion. J Oral Pathol Med 2004; 33: 162-9. 86. Trope M, Bergenholtz G. Microbiological basis for endodontic treatment: can a maximal outcome be achieved in one visit. Endodontic Topics 2002; 1: 40-53. 87. Shah HN, Gharbia SE, Knowlesser D, Wilkie E, Brocklehurst K. Gingipain; a cysteine proteinase isolated from Porphyromonas gingivalis. Microbiol Ecol Health Dis 1991; 4: 319-28. 88. Curtis MA, Aduse OJ, Rangarajan M. Cysteine proteases of Porphyromonas gingivalis. Crit Rev Oral Biol Med 2001; 12: 192-216. 89. Genco CA, Potempo J, Mikalajezyk PJ, Travis J. Role of gingipains R in the pathogenesis Porphyromonas gingivalis mediated periodontal disease. Clin Infect Dis 1999; 28: 456-65. 90. O-Brien-Simpson NM, Veith PD, Dashpher SG, Reynolds EC. Porphyromonas gingivalis gingipains: the molecular teeth of a microbial vampire. Curr Protein Pept Sci 2003; 4: 409-26. 79 91. Nadkarni MA, Nguyen KA, Chapple CC, Jacques NA, Hunter N. Distribution of Porphyromonas gingivalis biotypes defined by kgp (LysGingipain) gene. J Clin Microbiol 2004; 42: 3873-6. 92. Lourbakos A, Yuan YP, Jenkins AL, Travis J, Andrade-Gordon P, Santulli R, et al. Activation of protease-activated receptors by gingipains from Porphyromonas gingivalis leads to platelet aggregation: a new trait in microbial pathogenicity. Blood 2001; 97: 3790-7. 93. Imamura T, Potempa J, Travis T. Comparison of pathogenic properties between two types of arginine specific cysteine proteinases (gingipains-R) from Porphyromonas gingivalis. Microb Pathog 2000; 29: 155-63. 94. Yoneda M, Hirofuji T, Anan H, Matsumoto A, Hamochi T, Nakoyamo K, et al. Mixed infection of Porphyromonas gingivalis and Bacteroides forsythus in a murine abscess model: involvement of gingipains in a synergistic effect. J Periodont Res 2001; 36: 237-43. 95. Nakata K, Yamasaki M, Iwato T, Suzuki K, Nakane A, Nakamura H. Anaerobic bacterial extracts influence production of matrix metalloproteinases and their inhibitors by human dental pulp cells. J Endod 2000; 26: 410- 3. 96. Pattamapun K, Tiranathanagul S, Yongchaitrakul T, Kuwatanasuchat J, Pavasant P. Activation of MMP-2 by Porphyromonas gingivalis in human periodontal ligament cells. J Periodont Res 2003; 38: 115-21. 97. Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Su YF, Lai CC, Liu CM, et al. Induction of vascular endothelial growth factor expression in human pulp fibroblasts stimulated with black-pigmented Bacteroides. Int Endod J 2004; 37: 588-92. 98. Bate AL, Ma JKC, Pitt Ford TR. Detection of bacterial virulence genes associated with infective endocarditis in infected root canals. Int Endod J 2000; 33: 194-203. 99. Siqueira JF, Roças IN, Favieri A, Oliveira JCM, Santos KRN. Polymerase chain reaction detection of Treponema denticola in endodontic infections with root canals. Int Endod J 2001; 34: 280-6. 100. Roças IN, Siqueira JF. Occurrence of two newly named oral treponemas –Treponema parvum and Treponema putidum- in primary endodontic infections. Oral Microbiol Immunol 2005; 20: 372-5. 80 101. Baumgartner JC, Khemaleelakul S, Xia T. Identification of spirochetes (treponemas) in endodontic infections. J Endod 2003; 29: 7947. 102. Jung IY, Chai BK, Kum KY, Yoo YJ, Yoon TC, Lee SJ et al. Identification of oral spirochetes at the species level and their association with other bacteria in endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92: 329-34. 103. Roças IN, Siqueira JF, Andrade AFB, Uzeda M. Identification of selected putative oral pathogens in primary root canal infections associated with symptoms. Anaerobe 2002; 8: 200-8. 104. Roças IN, Siqueira JF, Andrade AFB, Uzeda M. Oral treponemas in primary root canal infections as detected by nested PCR. Int Endod J 2003; 36: 20-6. 105. Siqueira JF, Roças IN, Souto R, Uzeda M, Colombo AP. Microbiological evaluation of acute periradicular abscesses by DNA-DNA hybridization. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92: 451-7. 106. Young JI, Bang C, Ki-Yean K, Byoung-Duk R, Seung-Jung L, ChanYoung L, et al. Molecular epidemiology and association of putative pathogens in root canal infection. J Endod 2000; 26: 599-604. 107. Grenier D. Nutritional interactions between periodonto-pathogens, Treponema denticola and gingivalis. Infect Immun 1992; 60: 5298-301. two suspected Porphyromonas 108. Fenno JC, McBride BC. Virulence factors of oral treponemas. Anaerobe 1998; 4: 1-17. 109. Dahle VR, Sunde PT, Tronstad L. Treponemes and endodontic infections. Endodontic Topics 2003; 6: 160-70. 110. Ellen RP, Dawson JR, Yang PF. Treponema denticola as a model for polar adhesion an d cytopathogenicity of spirochetes. Microbiology 1994; 2: 114-9. 111. Fenno JC, Müller KH, McBride BC. Sequence analysis, expression, and binding activity of recombinant major outer sheath protein (Msp) of Treponema denticola. J Bacteriol 1996; 178: 2489-97. 81 112. Caimano MJ, Bourell KW, Bannister TD, Cox DL, Radolf JD. The Treponema denticola major sheath protein is predominantly periplasmic and has only limited surface exposure. Infection and Immunity 1999; 67: 4072-83. 113. Mathers DA, Leung WK, Fenno JC, Hang Y, McBride BC. The major surface protein complex of Treponema denticola depolarizes and induces ion channels in HeLa cell membranes. Infect Immun 1996; 64: 2904-10. 114. Fenno JC, Wong GW, Hannam PM, Müller KH, Leung WK, McBride BC. Conservation of msp, the gene encoding the major outer membrane protein of oral Treponema spp. J Bacteriol 1997; 179: 1082-9. 115. Lux R, Miller JN, Pork NH, Shi W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infect Immun 2001; 69: 6276-83. 116. Lux R, Sim J, Tsai JP, Shi W. Construction and characterization of a che A mutant of Treponema denticola. J Bacteriol 2002; 184: 3130-4. 117. Siqueira JF, Roças IN, Favieri A, Santos KRN. Detection of Treponema denticola in endodontic infections by 16S rRNA gene directed polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol 2000; 15: 335-7. 118. Sixou M. Diagnostic testing as a supportive measure of treatment strategy. Oral Dis 2003 ; 9: 54-62. 119. Tang YW, Procop GW, Persing DH. Molecular diagnostics of infectious diseases. Clin Chem 1997; 43: 2021-38. 120. Zambon JJ, Haroszthy VI. The laboratory diagnosis of periodontal infections. Periodontology 2000; 7: 69-82. 121. Wyss C. Dependence of proliferation of Bacteroides forsythus on exogenous N-acetylmuramic acid. Infect Immun 1989; 57: 1757-9. 122. Akar N. Klinik Moleküler Patoloji’ye Giriş. 2. Baskı. Ankara: Antıp Yayınları; 1999. 123. McPherson MJ, Moller SG. PCR (The Basics). 1st ed. Oxford: BIOS Scientific Publishers Ltd; 2000. 124. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real-time quantitative PCR. Genome Research 1996; 6: 986-94. 82 125. Siqueira JF, Roças IN, Souto R, Uzeda M, Colombo AP. Checkerboard DNA-DNA hybridization analysis of endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000; 89: 744-8. 126. Sundqvist G, Figdor D. Life as an endodontic pathogen. Endodontic Topics 2003; 6: 3-28. 127. Ingle JI, Bakland LK. Endodontics. 4th ed. Baltimore: Williams & Wilkins; 1994. p.439-64. 128. Hoshioka K, Yamasaki M, Nakane A, Hariva N, Nakamura H. The relationship between clinical symptoms and anaerobic bacteria from infected root canals. J Endod 1992; 11: 558-61. 129. Winkelhoff AJ, Von Steenbergen M, Graaff J. Porphyromonas (Bacteroides) endodontalis: Its role in endodontal infections. J Endod 1992; 18: 431-3. 130. Bergenholtz G, Dahlen G. Advances in the study of endodontic infections: introduction, Endodontic Topics 2004; 9: 1-4. 131. Pitt TL, Saunders NA. Molecular bacteriology: a diagnostic tool for the millennium. J Clin Pathol 2000; 53: 71-5. 132. Whelen AC, Persing DH. The role of nucleic acid amplification and detection in the clinical microbiology laboratory. Annual Reviews in Microbiology 1996; 50: 349-73. 133. Herrington CS, McGee J.O’D. Diagnostic Molecular Pathology. 1st ed. New York: Oxford University Press; 1992. 134. Ashimoto A, Chen C, Bakker I, Slots J. Polymerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions. Oral Microbiol Immunol 1996; 11: 266-73. 135. Greisen K, Loeffeholz M, Purohit A, Leang D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1994; 32: 335-51. 136. Hofstad T. Utility of newer techniques for classification and identification of pathogenic anaerobic bacteria. Clin Infectious Diseases 1994; 18: 250-2. 83 137. Kong F, Gordon S, Gilbert GL. Rapid-cycle PCR for detection and typing of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens. J Clin Microbiol 2000; 38: 4256-9. 138. Relman DA. The search for unrecognized pathogens. Science 1999; 284: 1308-10. 139. Gomes BPFA, Drucker DB, Lilley JD. Positive and negative associations between bacterial species in dental root canals. Microbios 1994; 80: 231-43. 140. Xia T, Baumgartner JC. Occurrence of Actinomyces in infections of endodontic origin. J Endod 2003; 29: 549-52. 141. Horz HP, Vianna ME, Gomes BPFA, Conrads G. Evaluation of universal probes and primer sets for assessing total bacterial load in clinical samples: General implications and practical use in endodontic antimicrobial therapy. J Clin Microbiol 2005; 43: 5332-7. 142. Kawada M, Yoshida A, Suzuki N, Nakano Y, Saito T, Oho T, et al. Prevalence of Porphyromonas gingivalis in relation to periodontal status assessed by Real-time PCR. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 289-92. 143. Gomes BPFA, Drucker DB, Lilley JD. Association of specific bacteria with some endodontic signs and symptoms. Int Endod J 1994; 27: 291-8. 144. Jacinto RC, Gomes BPFA, Ferraz CCR, Zaia AA, Souza-Filho FJ. Microbiological analysis of infected root canals from a symptomatic and asymptomatic teeth with periapical periodontitis and the antimicrobial susceptibility of some isolated anaerobic bacteria. Oral Microbiol Immunol 2003; 18: 285-92. 145. Gomes BPFA, Pinheira ET, Gade-Neto CR, Sousa ELR, Ferraz CCR, Zaia AA, et al. Microbiological examination of infected dental root canals. Oral Microbiol Immunol 2004; 19: 71-6. 146. Hancock HH, Sigurdsson A, Trope M, Moiseiwitsch J. Bacteria isolated after unsuccessful endodontic treatment in a North American population. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 91: 579-86. 147. Kaufman B, Spangberg L, Barry J, Fouad A. Enterococcus spp. in endodontically treated teeth with and without periradicular lesions. J Endod 2005; 31: 851-6. 84 148. Sundqvist G. Taxonomy, ecology, and pathogenicity of the root canal flora. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1994; 78: 522-30. 149. Baumgartner JC, Siqueira JF, Xia T, Roças IN. Geographical differences in bacteria detected in endodontic infections using polymerase chain reaction. J Endod 2004; 3: 141-4. 150. Roças IN, Baumgartner JC, Xia T, Siqueira JF. Prevalence of selected bacterial named species and uncultivated phylotypes in endodontic abscess from two geographic locations. J Endod 2006; 32: 1135-8. 151. Siqueira JF, Jung IY, Roças IN, Lee CY. Differences in prevalence of selected bacterial species in primary endodontic infections from two distinct geographic locations. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2005; 99: 641-7. 152. Edwards AM, Jenkinson HF, Woodward MJ, Dymack D. Binding properties and adhesion-mediating regions of the major sheath protein of Treponema denticola ATCC 35405. Infect Immun 2005; 73: 2891-8. 153. Fenno JC, Wong GW, Hannam PM, McBride BC. Mutagenesis of outer membrane virulence determinants of oral spirochete Treponema denticola. FEMS Microbiol Lett 1998; 15: 209-15. 154. Haapasalo M, Muller KH, Uitto VJ, Leung WK, McBride BC. Characterization, cloning and binding properties of the major 53-kilodalton Treponema denticola surface antigen. Infect Immun 1992; 60: 2058-65. 155. Miyamoto T, Noji S, Kakeguchi S, Kato K, Kurihara H, Murayama Y, et al. Molecular cloning and sequence analysis of antigen gene tdpA of Treponema denticola. Infect Immun 1991; 59: 1941-7. 156. Ishihara K, Miura T, Kuramitsu HK, Okuda K. Characterization of the Treponema denticola prtP gene encoding a prolyl-phenylalaninespecific protease (dentisilin). Infect Immun 1996; 64: 5178-86. 157. Vesey PM, Kuramitsu HK. Genetic analysis of Treponema denticola ATCC 35405 biofilm formation. Microbiology 2004; 150: 2401-7. 158. Norris JM, Love DN. The association of two recombinant proteinases of a feline strain of Porphyromonas gingivalis with periodontal disease in cats. Vet Microbiol 2000; 71: 69-80. 85 159. Takahashi N, Kato T, Kuramitsu HK. Isolation and preliminary characterization of the Porphyromonas gingivalis prtC gene expressing collagenase activity. FEMS Microbiol Lett 1991; 84: 135-8. 160. Liv Y, Fletcher HM. The recA gene in Porphyromonas gingivalis is expressed during infection of the murine host. Oral Microbiol Immunol 2001; 16: 218-23. 161. Yang SF, Hsieh YS, Huang FM, Yang LC, Chang YC. Effect of black-pigmented bacteria and the plasminogen-plasmin system in human pulp and osteoblastic cells. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2003; 95: 621-5. 86 10. ÖZGEÇMİŞ Adı: Özgür İlke Soyadı: Atasoy ULUSOY Doğum Yeri ve Tarihi: Ordu – 09.06.1978 Eğitimi (tarih sırasına göre yeniden eskiye doğru) 2002-2007: Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Diş Hastalıkları ve Tedavisi Anabilim Dalı 1996-2001: Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi 1990-1996: Ankara Atatürk Anadolu Lisesi 1986-1989: Ankara Mimar Kemal İlkokulu 1985-1986: Necatibey İlköğretim Okulu, Bozüyük, Bilecik Yabancı Dili: İngilizce, Almanca Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar: Türk Endodonti Derneği, Avrupa Endodonti Derneği 87
