kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve cisplatin uygulamasının

advertisement
KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE
MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ
OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE
ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Süleyman POLAT
Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Tez Danışmanı
Doç. Dr. Adem KARA
Yüksek Lisans Tezi - 2015
T.C.
ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE
MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ
OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN
ARAŞTIRILMASI
Süleyman POLAT
Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Yüksek Lisans Tezi
Tez Danışmanı
Doç. Dr. Adem KARA
ERZURUM
2015
T.C.
ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIP HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI
KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE
CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ
ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Süleyman POLAT
Tez Savunma Tarihi : 06.11.2015
Tez Danışmanı
: Doç. Dr. Adem KARA
Jüri Üyesi
: Prof.Dr.Bünyamin ÜNAL
Jüri Üyesi
: Yrd. Doç. Dr. İsmail CAN
Onay
Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM
Enstitüsü Müdürü
Yüksek Lisans Tezi
ERZURUM 2015
İÇİNDEKİLER
TEŞEKKÜR .................................................................................................................. IV
ÖZET .............................................................................................................................. V
ABSTRACT ................................................................................................................... VI
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................. VII
ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................VIII
TABLOLAR DİZİNİ ..................................................................................................... X
1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 3
2.1. Kanser ........................................................................................................................ 3
2.2. Kanser Patogenezisi ................................................................................................... 4
2.3. Hücre Siklusu ve Karsinogenez ................................................................................. 5
2.4. Kolon Kanseri ............................................................................................................ 9
2.4.1. Kolon Kanseri Patogenezi ...................................................................................... 9
2.4.2. Kolorektal Kanser Etiyolojisi ............................................................................... 10
2.5. Kanserogenezde Tedavi Seçenekleri ....................................................................... 15
2.6. Hücre ölümü ............................................................................................................ 16
2.6.1. Apoptozis .............................................................................................................. 17
2.6.2. Otofaji ................................................................................................................... 20
2.7. Cisplatin Etki Mekanizması ..................................................................................... 25
2.7.1. Cisplatinin doz sınırlayıcı etkileri; ........................................................................ 27
2.8. Kanser Tedavisinde Antioksidanların Rolü ............................................................. 27
2.9. Melatonin ................................................................................................................. 28
2.9.1. Melatonin Hormonunun Biyosentezi ve Salgılanması ......................................... 29
2.9.3. Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi ............................................. 30
3. MATERYAL VE METOT ....................................................................................... 32
3.1. Hücre Kültürü .......................................................................................................... 32
3.1.1. Hücre Kültür Medyumunun Hazırlanışı ............................................................... 32
3.1.2. Hücre İnkübasyon Koşulları ................................................................................. 32
I
3.1.3. Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing) ............................................................... 32
3.1.4. Hücre Dondurma ve Saklanması .......................................................................... 33
3.1.5. Hücre Sayılarının Hesaplanması ........................................................................... 33
3.2. Hücre Canlılığı Analizi ............................................................................................ 34
3.2.1. MTT Yöntemi ....................................................................................................... 34
3.2.2. Yapılış Yöntemi .................................................................................................... 34
3.3. Tunel Boyama Metodu ............................................................................................ 35
3.3.1. Hücrelerin lamda üretilmesi.................................................................................. 35
3.3.2. Fiksasyon .............................................................................................................. 36
3.3.3. Tunel Boyama ....................................................................................................... 36
3.3.4. Tunel Pozitif Hücre Değerlendirmesi ................................................................... 37
3.4. Kantitatif Real Time PCR (qRT-PCR) Analizleri ................................................... 38
3.4.1. RNA İzolasyonu ................................................................................................... 38
3.4.2. cDNA Sentezi ....................................................................................................... 39
3.4.3. Real Time PCR Cihazına Yükleme Aşaması ....................................................... 39
3.4.5. RT-PCR (Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) TP53, MDM2, CDKN1A,
CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA Ekspresyonlarının Ölçülmesi .... 41
3.4.6. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA
Ekspresyon Tayininde Roche Lightcycler 480 Real-Time PCR Cihazı ......................... 41
3.5. İstatistiksel Analiz.................................................................................................... 42
4. BULGULAR .............................................................................................................. 43
4.1. MTT Sitoksisite Sonuçları ....................................................................................... 43
4.2. Tunel Analizi Sonuçları ........................................................................................... 44
4.3. mRNA ekspresyonu Değerleri Sonuçları ................................................................ 50
4.3.1. TP53 mRNA ekspresyonu değerleri ..................................................................... 50
4.3.2. MDM2 mRNA ekspresyon değerleri .................................................................... 52
4.3.3. CDKN1A (P21) mRNA ekspresyonu değerleri.................................................... 54
4.3.4. CDKN1B (P27) mRNA ekspresyonu değerleri .................................................... 56
4.3.5. BECLİN1 mRNA ekspresyonu değerleri ............................................................. 58
4.3.6. ATG-4 mRNA ekspresyonu değerleri .................................................................. 60
4.3.7. LC3 mRNA ekspresyonu değerleri....................................................................... 62
5. TARTIŞMA ............................................................................................................... 64
6. SONUÇ VE ÖNERİLER.......................................................................................... 70
II
KAYNAKLAR .............................................................................................................. 71
EKLER .......................................................................................................................... 82
EK 1. ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 82
EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU ....................................................................... 83
III
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans tezi olarak sunduğum bu çalışmanın her aşamasında yardımlarını
esirgemeyen yapıcı, yönlendirici değerli bilgi, tecrübe ve katkılarıyla bana daima yol
gösteren öğrencisi olmaktan mutluluk duyduğum danışman hocam Doç. Dr. Adem
KARA ‘ ya sonsuz teşekkür ederim.
Tez çalışmam süresince yardım ve birikimlerinden yararlandığım Prof. Dr.
Bünyamin Ünal’a ve Histoloji ve Embriyoloji Anabilim dalı öğretim üyeleri ile eğitim
öğretimim sırasında ilgi ve desteklerini esirgemeyen Atatürk Üniversitesi Acil
Biyokimya çalışma arkadaşlarıma, rahmetle andığım dostum Recep TEPE’ye, yoğun
eğitim dönemim boyunca sabırla beni destekleyen eşime ve evlatlarım Mustafa Göktuğ
Tuğsem Yüsra’ ya dualarını esirgemeyen anneme, babama ve büyüklerime, bana selam
veren ve alan insanlara, varlığıma şahit olan doğada bulunan bütün varlıklara teşekkür
ederim.
Süleyman POLAT
IV
ÖZET
Kolorektal Kanser Hücrelerinde Melatonin ve Cisplatin Uygulamasının Otofaji ve
Apoptoz Üzerine Etkilerinin Araştırılması
Amaç: Melatonin vücutta salgılanan ve güçlü bir antioksidan madde olup günümüzde
anti-kanser etkileri önemle çalışılmaktadır. Cisplatin ise birçok kanser türü tedavisinde
kullanılan ve vücuda önemli toksik bir etki bırakan platin grubu kemoterapotik ajandır.
Çalışmada HT-29 insan kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve/veya cisplatin
uygulamalarının otofajik ve apoptotik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Materyal ve Metot: Tüm uygulamalar in vitro şartlarda insan kolon kanseri
hücrelerinde (HT-29) gerçekleştirildi. Melatonin 5 ve 10 nM ve cisplatin 50 µM dozlarda
uygulanarak 24 ve 48 saat süre ile inkübe edilen gruplarda sitotoksisite değerlendirmesi için
MTT analizi kullanıldı. Tunel analizi ile apoptotik hücreler belirlendi. Ayrıca BECLİN1,
ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3 genleri mRNA ekspresyonu seviyeleri
kantitatif Real-Time PCR yöntemiyle belirlendi.
Bulgular: Çalışma MTT sonuçlarında 24-sa inkübasyon gruplarında en yüksek toksik
etkinin cisplatin uygulamasıyla olduğu görülürken, melatonin grupları önemli oranda sitotoksik
olmamışlarıdır. Kırk-sekiz saatlik gruplardaysa melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının
sitotoksik olduğu belirlendi. Ayrıca, tunel analizlerinde ciplatin ve/veya melatonin gruplarında
pozitif hücre yoğunluklarının hem 24-saat hemde 48-saat inkübasyon gruplarında kontrol
grubuna göre artmış olduğu görüldü. apoptotik ve otofajik genlerdeki mRNA ekspresyon
seviyelerinin melatonin ve/veya cisplatin uygulaması ile değiştiği tespit edildi.
Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları apoptotik ve otofajik etkinliğin melatonin ve cisplatinmelatonin kombine uygulamaları ile anlamlı düzeyde etkilendiğini göstermektedir.
Anahtar Kelimeler: Apoptoz, , cisplatin, kolon kanseri, melatonin, otofaji
V
ABSTRACT
Investigation the Effects of Melatonin and Cisplatin Treatment on Autophagy and
Apoptosis in Colorectal Cancer Cells
Aim: Melatonin is a powerful antioxidant agent and produced in the body what anticancer effects has been investigated. Also, cisplatin is a platinum group chemotherapeutic
agent, which has used for treatment of many cancer types and it has severe toxic effect on body.
In the present study, it was aimed to investigate the apoptotic and autophagic effects of
melatonin and/or cisplatin treatment on HT-29 human colorectal cancer cells.
Material and Method: All experiments were performed in human colon cancer cells
(HT-29). Doses of Melatonin 5 and 10 nM and cisplatin 50 µM were treated with colon cancer
cells for 24 and 48 hours incubation groups and MTT analysis was used for evaluation of
cytotoxicity. Quantitative Real time PCR was used to determine the mRNA expression levels
of TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 and LC3 genes.
Results: In the analysis of MTT, while it was seen that cisplatin showed the highest
cytotoxicity in 24 hours period, melatonin groups has showed no severe cytotoxicity in 24 hours
period. In addition, 48 hours incubation groups, there were cytotoxic effect in the groups of
cisplatin and/or melatonin. As well as in the Tunel analysis, there were increased positive cell
densities in the groups of cisplatin and/or melatonin for 24 and 48-hours incubation periods.
Changed levels of expression of mRNA apoptotic and autophagic genes in cisplatin and/or
melatonin groups.
Conclusion: The results of current study revealed that melatonin and combined of
melatonin and cisplatin treatments significantly effected apoptotic and autophagic activities.
Key words: Apoptosis, autophagy, cisplatin, colon cancer, melatonin
VI
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
APC
: Adenomatous Polyposis Coli
ATG
: Autophagy-related proteins (Otofaji ilişkil proteinler)
CAMKK2
: Kalmodulin bağımlı protein kinaz 2
CDDP
: Cis-dimminedichloroplatinum II
CDKs
: Siklin-bağımlı kinazlar
DCC
: Deleted in colorectal carcinoma (Silinmiş kolorektal
karsinoma)
DMSO
: Dimetilsülfoksit
DNA
: Deoksiribonükleik asit
ER
: Endoplazmik retikulum
FAP
: Familial adenomatous polyposis (Ailesel Adenomatöz
polipozis)
G0
: Gap 0
G1
: Gap 1
G2
: Gap 2
GTP
: Guanozin trifosfat
IAP
: İnhibitors of apoptosis (Apoptoz baskılayıcılar)
MMR
: Mismatch repair gen, yanlış onarılmış gen
mTOR
: Mammalian target of rapamycin (Memeli rapamisin hedefi)
NPCC
: Hereditary non-polyposis colorectal carcinoma (Herediter
non-polipoz kolorektal karsinoma)
PBS
: Fostat tampon solüsyonu
pRb
: Retinoblastoma proteini
qRT-PCR
: Kantitatif rReal time polimeraz zincir reaksiyonu
RNA
: Ribonükleik asit
ROS
: Reaktik oksijen türleri
S
: Sentez fazı
TNF
: Tümör nekroz edici faktör
TOR
: Target of rapamycin (Rapamisin hedefi)
TP53
: Tümör protein 53
VII
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil No
Şekil 2.1
Sayfa No
Hücre siklusu, siklinler ve CDKs ilişkisi ( mitoza G2 fazının geçişini
artırır) komplekslerinin aktivitesini artırır .........................................
Şekil 2.2.
7
Hücre siklusunun düzenlenmesinde siklinler, CDK ve CDK
inhibitörlerinin rolü ............................................................................. 9
Şekil 2.3.
Cisplatin moleküler yapısı ..................................................................
26
Şekil 2.4.
Cisplatine karşı gelişen direnç mekanizması ......................................
27
Şekil 2.5.
Melatonin salgılanmasının fizyolojisi ................................................. 30
Şekil 3.1.
Stereolojik
“Optik
Fractionator
Frame”
metodu
ile
tunel
pozitifliğinin değerlendirilmesi ........................................................... 38
Şekil 4.1.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçları
.............................................................................................................. 43
Şekil 4.2.
Kontrol grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.3.
Mel-5µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.4.
48
Mel-10µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.10.
47
Mel-5µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.9.
47
Kontrol grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.8.
46
Mel-10µM- Cis grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri
hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü .....................................
Şekil 4.7.
46
Cisplatin grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.6.
45
Mel-10µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
Şekil 4.5.
45
48
Cisplatin grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...............................................
49
VIII
Şekil 4.11.
Mel-10µM- Cis grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri
hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...................................... 49
Şekil 4.12.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen
ekspresyon değerleri ............................................................................ 51
Şekil 4.13.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen
ekspresyon değerleri ............................................................................ 53
Şekil 4.14.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen
ekspresyon değerleri ............................................................................ 55
Şekil 4.15.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen
ekspresyon değerleri ............................................................................ 57
Şekil 4.16.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen
ekspresyon değerleri ............................................................................ 59
Şekil 4.17.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen
ekspresyon değerleri ...........................................................................
Şekil 4.18.
61
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen
ekspresyon değerleri ...........................................................................
63
IX
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo No
Sayfa No
Tablo 3.1
cDNA sentezi reaksiyon karışımı ...................................................... 39
Tablo 3.2.
cDNA sentezi için PCR sıcaklık ve süre basamakları ....................... 39
Tablo 4.1.
Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçlar ..
Tablo 4.2.
43
Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait 1000 µm2 alandaki
Tunel pozitif hücre yoğunlukları ........................................................
Tablo 4.3.
44
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 51
Tablo 4.4.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 53
Tablo 4.5.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 55
Tablo 4.6.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 57
Tablo 4.7.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 59
Tablo 4.8.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 61
Tablo 4.9.
Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat
inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen
ekspresyon değerleri ........................................................................... 63
X
1. GİRİŞ
Kanser hem çevresel hem de kalıtsal faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan
mortalitesi yüksek bir hastalıktır. Kanser genellikle deoksiribonükleik asit (DNA)
hasarına bağlı olarak normal hücrelerden orijinlenmektedir. Bununla birlikte bazı
kanserlerin anne babanın DNA’larındaki hasara bağlı olarak ta kalıtımsal olarak meydana
geldiği belirtilmektedir. Kanserde ölüm oranlarının yüksek olması da bu hastalığın insan
sağlığı açısından önemini daha da artırmaktadır.1
Kolon kanseri genetik ve epigenetik değişimlere bağlı olarak ortaya çıkmaktadır.
Kolon kanserinin meydana gelmesinde beslenme tarzının çok önemli olduğu
belirtilmektedir. Yağ ve protein oranı yüksek fakat fiber oranı düşük meyve ve sebzelerle
beslenmenin bu hastalığın oluşumunu artırdığı belirtilmektedir.2,3
Hücre ölümünün düzenlenmesi embriyolojik gelişim ve doku hemostazisi için
önemli bir aşamadır. Son yıllarda hücre ölümünü kontrol eden birçok yolak hücre ve
dokuda tarif edilmiştir. Hücre ölümü sırasında oluşan morfolojik değişikliklerin, apoptoz
ile mi yoksa tip II programlı hücre ölümü olarak bilinen otofaji sonucunda mı
oluştuğunun tanımlanabilmesi zordur.4 Bununla birlikte, otofajik ve apoptotik hücre
ölümü arasında biyokimyasal ve morfolojik farklar bulunmaktadır. Otofajide, kaspaz
uyarımı ve DNA parçalanması ortaya çıkmaz. Otofaji hücresel organellerdeen olan
mitokondri, golgi gibi sitoplazmik organelleri ve sitoplâzma parçalayan inta sitoplazmik
keselerin ortaya çıkmasıyla tanımlanır. İnta sitoplazmik keselerin ortaya çıkmasında
etkili olan hücrenin yoğunluğu, oksijen miktarının konsantrasyonu, ısı, hormonların etkisi
ve besin miktarı gibi durumların otofaji mekanizmasında önemi bulunmaktadır.
Apoptozda, hücre iskelet proteinlerinde erken yıkım olayı ortaya çıkarken organeller geç
aşamaya kadar varlıkları sürdürürler. Otofaji de ise bu durum farklıdır, organeller erken
yıkıma uğrar ve geç döneme kadar hücre iskelet elementleri parçalanmaz.
1
Cisplatin uygulaması ile kanser hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyon
artışının uyarılması sonucunda kemoresistans gelişimi bildirilmiştir.6 Bu direnci ortadan
kaldırmak için cisplatinin yüksek dozlarda uygulanması gerekmektedir ancak yüksek
dozlarda cisplatinin nefrotoksisite ve hepatotoksisite gibi toksik etkileri ortaya
çıkarmaktadır.7, 8 Dolayısıyla, bu kemoterapötiklerden birkaçının kombine kullanımı ya
da antioksidan bir madde ile kombine kullanımı son yıllarda birçok kanser tedavisinde
başvurulan seçeneklerden birisi olmaktadır. Böyle kombine kullanımın sonucu olarak
kanser tedavisinde daha etkin bir sonuç ve daha düşük toksisitenin oluşması
sağlanabilmektedir.9
Diğer
taraftan
melatoninin
kanser
hastalarında
biyolojik
regülasyonu düzenleyerek yeni tümör oluşumlarını engellediği ve kanser hastalarının
yaşam kalitesini iyileştirdiği görülmüştür.10 Bu amaçla, bu çalışmada, melatonin ve/veya
cisplatin kullanımının kolorektal kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik, apoptotik ve
otofajik etkinliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir.
2
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Kanser
Kanser, yüzyıllar öncesinen günümüze kadar gelinen süreçte etkisini sürdürmekte
ve insanları geçmişte olduğundan daha fazla tehdit eden ölümcül bir hastalık olmaktadır.
Kanser terimini ilk olarak, Yunan fizikçi Hippocrates (MÖ 460-370) tarafından
tanımlanmaya çalılşılmıştır. Yunan fizikçi Hippocrates “carcinos ve carcinoma”
terimlerini ülser oluşumuna sebep olan ve ülser oluşturmayan tümörler için
kullanmıştır. Bununla birlikte hastalığın ilk keşfi Hippocrates tarafından olmamıştır.
Kanserin varlığına yönelik olarak daha eski bilgilere mısırdaki mumyalarda ve yazıtlarda
rastlanmıştır.11 Kanserin ilk tanımlandığı günden bugüne asırlar geçmesine rağmen bazı
kanser tiplerinin tedavisinin çok kısıtlı ya da mümkün olmadığı, bazı kanser türlerinin ise
büyük oranda tedavi edilebileceği bildirilmektedir.12 Hücrelerin kontrolsüz çoğalmasına
bağlı olarak ortaya çıkan kanser, sadece bulunduğu dokuda değil aynı zamanda
uzaklardaki doku ve organlarda da işlev kaybına sebep olmaktadır. Kanserde ölüm
oranlarının yüksek olması da bu hastalığın insan sağlığı açısından önemini daha da
artırmaktadır.1 Kanserogenez, hücrelerin kontrolsüz ve aşırı çoğalmalarının yanı sıra,
immün sistemin gözetiminden kaçarak daha uzaktaki dokulara sıçrayarak o dokuları işgal
eden, metabolik ve davranışsal değişikliklere sebep olan çok basamaklı bir süreçtir.13
Kanserli vaka sayısı yıllar içinde artış göstermiş ve 2025 yılına kadar kanser
vakalarının dünya çapında görülme olasılığı yirmi beş milyonu aşacağı öngörülmektedir.
Bu nedenle kanserogenez süreci ve tedavisi bugünkü araştırmacılar tarafından en çok
araştırılan konular arasında olup ve kanserin ortaya çıkma nedenleri ve tedavisi üzerine
yapılan çalışmalar her geçen gün artmakta, daha etkili ve en az yan etkiye sahip tedavi
süreci arayışları sürmektedir.14
3
Tümör hücrelerinin tiplendirilmelerinde çevre dokulara yayılış özellikleri
isimlendirmede önemli bir kriter olup, yayılış özelliğine göre iyi huylu (benign) ve kötü
huylu (malign) tümörler olarak adlandırılır. Benign tümörler büyümezler, çevre dokulara
metastaz yapmaz ve cerrahi yolla uzaklaştırılabilmektedirler. Dolayısıyla da yaşamı
tehdit edici unsurlar değildirler. Oysa malign tümörler, vücudun çeşitli organ ve
dokularına yayılabilir ve sürekli çoğalabilir, Malign tümörler kendilerini apoptozdan
koruyabilirler. Tümör hücrelerinin tiplendirilmesinde, bulundukları hücre, doku ya da
organ çeşitleri de dikkate alınmaktadır. Bu kanser tipleri adlandırılırken köken aldığı yer
ve nerede büyümeye başladığı gibi faktörler göz önünde bulundurulmaktadır.
Lökositlerin kanseri (beyaz kan hücreleri) lösemi, bağdokuda özelleşmiş lenfositlerin
tümörü lenfoma, derinin melanosit denilen pigment hücrelerinden köken alan kanserler
melanoma,
mide, akciğer gibi boşluklu organların epitelinden köken alan tipleri
karsinoma, bağdoku ve kas dokudaki kanserler de sarcomas olarak adlandırılır.12
Terminolojik olarak spesifik tip kanserler; meme, kolon, akciğer ve prostat kanserleri gibi
organ adlarıyla da isimlendirilirler.12
2.2. Kanser Patogenezisi
Kanser hem çevresel hem de kalıtsal faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan mortalitesi
yüksek bir hastalıktır. Kanser genellikle DNA hasarına bağlı olarak normal hücrelerden
orijinlenmektedir. Bununla birlikte bazı kanserlerin anne babanın DNA’larındaki hasara
bağlı olarak ta kalıtımsal olarak meydana geldiği belirtilmektedir. Kanserde diyet,
çevresel faktörler, kalıtılan mutasyonlar ve somatik mutasyonlar gibi birçok durum
kanser nedeni olabilmektedir. Normal vücut hücrelerin kanser hücrelerine dönüşmesi
DNA’nın hasara görmesiyle ya da mutasyonlar ile ortaya çıkar. DNA’daki bu hasar, DNA
replikasyonunda bağlı ya da metabolik bir ürün olan serbest radikallerin organellere ya
da DNA’da hasat oluşturmasına bağlı olarak görülmektedir. DNA iyonize radyasyon,
4
ultraviyole radyasyon ve kimyasal karsinojen gibi maddeler ile de hasarlanabilir. Bu
şekilde DNA hasar görür ve sonraki nesillere mutant DNA’lar aktarılır.15, 16 Diğer taraftan
DNA’nın kendi kendini tamir mekanizması vardır. Fakat DNA onarım mekanizması
bazen yetersiz kalır ve mutasyon adı verilen DNA dizisindeki daimi değişiklikler oluşur.
Normal hücrelerdeki DNA hasarı çoğu zaman tamir edilmektedir. Tam tersine kanser
hücrelerindeki DNA hasarı ise tamir edilememektedir.11
Yapılan araştırmalarda çevresel ve kalıtsal faktörlerin yanı sıra virüslerin de çeşitli
kanserlere sebep olabileceği bildirilmiştir. Örneğin, Hepatit B veya C virüsünün gelişimi
karaciğer kanserine, Epstein-Barr virüsünün non-Hodgkin lenfomaya ve nazofaringeal
kansere, insan papilloma virüsünün servix, vulva ve penis kanserine yine HIV virüsünün
non-Hodgkin lenfomaya sebep olduğu belirtilmektedir.11
Hücre siklusunda iki tip gen grubu rol oynar. Bunlar onkogenler plan Myc, Ras
genleri ve tümör baskılayıcı genler olan P53, Rb geni gibi genlerdir. Onkogenler, kanserin
ortaya çıkmasında dolaylı olarak etkin olan genler olup tümör oluşumunu tetiklerler.
Tümör baskılayıcı genler ise kanser gelişimini engelleyen genlerdir. Hücre siklusunu
baskılayan bu genlerde değişim olursa ve tamir edilmezse bu gen hücre bölünme
kontrolünü sağlayamaz ve kanser oluşur. Normal hücrelerde DNA hasarı oluştuğu
durumda hücre siklusu inhibitör siklinler aracılığı ile G evresi sırasında inhibe
edebilmekte ve hücreye tamir için zaman kazandırmaktadır. DNA hasarı tamir
edilemeyecek boyutta ise hücre apoptozise gider.14
2.3. Hücre Siklusu ve Karsinogenez
Normal hücre siklusunda unipotent kök hücrelerden yeni hücrelerin oluşumu
esnasındaki bölünme (mitoz) ve hazırlık (interfaz) dönemleri halindedir. Hücre bölünme
aşamaları;
5
İnterfaz dönemi: Hücrenin dinlendiği ve mitoz bölünme için bir hazırlık dönemdir.
Genelde memeli hücrelerinde 12- 24 saat sürer. Bu dönemde hücre içerisinde ribonükleik
asit (RNA) sentezi, protein üretimi ve hücre boyutunda artış görülür. İnterfaz aşaması 4
alt döneme ayrılır. Bunlar; Gap 0 (G0), Gap 1 (G1), Sentez dönemi (S), ve Gap2 (G2)
dir.
G0: Hücre bölünme olmadan dinlendiği süreçtir. Bu süreç nöral hücrelerde
olduğu çol uzunca bir süre olabilir.
G1: Hücre hacmini arttırır ve RNA üretimi ve protein sentezi görülür. DNA
sentezi için hazırladık yapılır ve hücre kontrolü mekanizması aktiftir.
Sentez dönemi (S): DNA replikasyonu olur ve DNA iki katına çıkar.
G2: Bu dönem de DNA sentezi biter ve hücre büyümesine devam eder. Daha
sonra protein sentezi olur. Bu aşama sonrasında G2/M kontrol noktası hücrenin mitoz ve
bölünmeye ilerleyişini belirler.
Mitoz veya M dönemi: Bu dönemde hücrede protein sentezi durur ve hücre iki
eşit hücreye bölünür. Mitoz bölünme aşamalarında olan metafazda kontrol noktası
(metafaz kontrol noktası) bulunur. Bu kontrol noktası hücrenin eşit bölünmesini sağlar.
Mitoz sonrası yeni hücreler G0 ya da G1 dönemine geçerler.17
Hücrede bölünme işlemi hücresel mekanizma ile kontrol edilmektedir. Bu
mekanizma hücrenin metabolik fonksiyonlarını bölünmesini kontrol eder. Hücre
içerisinde mitoz bölünme aşamalarını kontrol eden siklin-bağımlı kinazlardan (CDKs)
bulunmaktadır.
Bu siklinler hücrede bir dizi protein ailesi tarafından kontrol
edilmektedir. Bu siklinlerin görevini tamamlamasından sonra, başka bir grup protein
ailesi etkinleşir. Hücre döngüsünün özel evrelerinde aktifleşen bu siklinler, tutundukları
bu aktif olmayan CDK moleküllerini etkinleştirirler. Bu Siklin -CDK molekülleri hücre
içerisinde ardışık bir görev üstlenirler. Aktifleşen bu siklin molekülleri onkogenleri
6
etkinleştirir ve tümör baskılayıcılarının engellerler. Pek çok onkogen ve tümör
baskılayıcılarının genlerin proteinleri S fazı öncesi G1 fazı başlangıcından sorumlu
(hücrenin çeşidine göre değişen CDK4 veya CDK6 ile siklin D1-D3 kompleksleri) olan
ve DNA’nın kendini eşlemesinden sonra (siklinE-CDK2) G1 fazına geçişini kontrol eden
siklin bağımlı kinazların etki alanını arttırır. Hücrede bulunan proteinin yapısındaki
herhangi bir değişiklikle veya proteini kodlayan segmentteki bir değişiklikle
tamamlanabilen onkogene dönüşebilen gen ile tümör baskılayıcılar genler olan siklinACDK2 (DNA eşleşmesinden sorumlu) ve siklin-B-CDK1 (Mitoza G2 safhasında geçişini
artırır) etkinliğinin artıtırlar.5
Şekil 2.1. Hücre siklusu, siklinler ve CDKs ilişkisi ( mitoza G2 fazının geçişini artırır)
komplekslerinin aktivitesini artırır.18
Hücre siklusunun kontrolü siklinler proteinlerin bulunması ve siklinlerin, siklin
bağımlı kinazalar (CDKs) ile tutunması ile sağlanır.
 Erken G1 fazında sentezlenmekte olan siklin D, CDK4 ve CDK6’ya
bağlanmaktadır.
 Geç G1 fazında sentezlenmekte olan siklin E ve CDK2’ye bağlanmaktadır.
7
 Bu üç bileşik, diğer aracılarla beraber hücrenin S evresine girmesine ve S
evresinde ilerlemesini sağlamaktadır.
 CDK2 ve CDK1’e bağlanan Siklin A ile oluşan kompleksler, hücrenin S
fazından çıkıp G2 fazına girmesini sağlar ve Siklin B’nin oluşumunu başlatır.
 İndüklenen Siklin B, CDK1’e bağlanır ve hücre G2 fazından ayrılıp M fazına
geçişine müsaade eder.
Vazifelerini yerine getiren siklinler, ubikuitin-proteazom yoluyla yıkımlanırlar.12
Proteinkinazların aktif hale gelmesi için ekstrasellüler mesajlaşmadan sorumlu
moleküllerinin (mitogenler) kendi almaçlarına bağlanması gerekmektedir. Aktif hale
gelen proteinkinazlar, sitoplazmada bulunan sinyal ileti moleküllerini (Ras ve Jak) ve
transkripsiyon etkenlerini (Jun, Fos, NF-AT, NFκβ, Myc) fosforilleyen kinazları
(proteinkinaz C ve ERK) tetiklerler. Transkripsiyonel düzenlemeyi etkili bir şekilde
sağlayan E2F, pRb (retinoblastoma proteini) ile bağımlıdır ve pRb tarafından baskılanır.
E2F, G1 evresinden çıkıp S evresine girmesini sağlayan kontrol noktasının geçilmesi için
gerekmektedir. DNA’nın sentez evresine girmesi için G1 fazından S fazına geçişi
sağlanmalıdır. Bunun için proteinkinazların uyarısıyla (Siklin D CDK4, Siklin D-CDK 6
bileşikleri ile) E2F bağlı Rb fosforilasyonu sonucu, E2F serbestlerin. DNA replikasyonu
için zorunlu olan proteinler E2F transkripsiyon etkisinin aktif hale gelmesi sonucu,
Deoksiribonükleotit ve bazı düzenleyici proteinlerden üretilirler (Şekil 2.2).
8
Şekil 2.2. Hücre siklusunun düzenlenmesinde siklinler, CDK ve CDK inhibitörlerinin
rolü.19
2.4. Kolon Kanseri
2.4.1. Kolon Kanseri Patogenezi
Kolorektal kanser Kuzey Amerika, Batı Avrupa, Yeni Zelanda, Avustralya gibi
endüstriyel ülkeler başta olmak üzere çok geniş bir coğrafik alanda yayılış
göstermektedir. Ayrıca, bu ülkeler içinde de görülme sıklığı açısından farklı bölgeler
mevcuttur. Örneğin Amerika Birleşik Devletlerinde, endüstriyelin gelişmiş olduğu
kuzeydoğuda oran çok fazla iken, endüstrinin gelişmediği kırsal alan güneydoğuda en
azdır. Japonya, Polonya gibi düşük riskli bölgelerden yüksek riskli bölge olan Amerika
Birleşik Devletleri, Avustralya gibi ülkelere göç edenlerde kolon kanser oranlarında hızlı
bir yükselme görülmektedir.
Kısaca, Amerika, Avusturalya, Yeni Zelanda, Kanada ve Avrupa’nın bazı
kısımlarında kolon kanserinin görülme oranı fazla iken, Çin ve Hindistan’ın yanı sıra
Afrika ve Güney Amerika kıtalarında görülme sıklığı oldukça azdır.17
Türkiye de kaba prevalans tahmini yaptığımızda kanser teşhis edilmiş ve hayatta
olan 350-400 bin kişi olduğu bilinmektedir. 2009 kayıtlarına göre, Türkiye de de ölüm
nedenleri arasında 2. sırada yerini almaktadır. Kanser hastalığı 2015 yılından itibaren tüm
9
dünyada ilk sıradaki ölüm nedeni olacağı öngörülmektedir. Kolekteral kanserin dünyada
100.000 de 20’lerde iken, Avrupa da 100.000 de 37, Türkiye’de ise 100.000 de
17’lerdedir. Dünyada, erkeklerde kanser görülme sıklığına bakıldığında ilk 3 sıra kanser
türü olan prostat, akciğer ve kolon iken, Türkiye’de bu sıralama akciğer, prostat ve
mesane kanseri şeklindedir. Ülkemizde görülme sıklığı açısından erkeler de 4. sırayı
kolon kanseri almaktadır. Dünyada kadınlarda görülme sıklığına bakarsak ilk üç kanser
türü meme, kolon ve akciğer kanseriyken Türkiye’de bu sıralama meme, tiroit ve
kolorektal kanseri şeklindedir.20
Gelişmiş ülkelerde kolon kanseri üçüncü sırada görülen kanser türü olup görülen
bütün kanser vakalarının yaklaşık %9’unu oluşturur. Dünya üzerinde kanser vakalarında
3. sıradadır. Bu kanser tipi ayrıca dünyadaki kanserler arasında ölüm sebepleri arasında
4. sırada yer almaktadır. Kanserin bu tipi genetik ve epigenetik değişimlerden dolayı
ortaya çıkmaktadır. Kolon kanserinin meydana gelmesinde beslenme tarzının çok önemli
olduğu belirtilmektedir. Yağ ve protein oranı yüksek fakat fiber oranı düşük meyve ve
sebzelerle beslenmenin bu hastalığın oluşumunu artırdığı belirtilmektedir.2,3 Kolorektal
karsinomların yeni vaka sayısı tahmini olarak her yıl için 150.000’dir. İnsanının yaşamı
boyunca kolorektal karsinom gelişme riski yaklaşık %’6 dır. Kolon kanseri vakaları he
erkek ve kadınlarda birbirine yakın olmakla birlikte erkeklerde kadınlara oranla biraz
daha yüksektir.21 Bir bireyin hayatı boyunca kolektaral kanser gelişme riski %’6 iken,
birinci derece akrabalarında kolon kanseri veya adenomatöz polip öyküsü olan bireylerde
ise bu oran 2-3 kat daha fazla olarak rapor edilmektedir.22,23
2.4.2. Kolorektal Kanser Etiyolojisi
Kolekteral kanser kolon veya rektumda meydana gelmektedir. Kolekteral
kanserlerin yaklaşık olarak %72’si kolonda, %28’i ise rektumda oluşmaktadır.24
Kolorektal kanser gelişiminde yaş, kolekteral adenom (senkron yada metakron) varlığı,
10
kalıtımsal faktörler, inflamatuar barsak hastalıkları ve çevresel faktörler (Diyet, sigara
tüketimi, alkol) etkili olmaktadır. Yaş: Kanser gelişme riski 40 yasından sonra erkek ve
kadınlar için artmaktadır. Kolon kanserlerinin %90’nından fazlası 50 yaş ve üzerindeki
bireylerde görülmektedir. Kolekteral kanser olguların sadece %5’ine 40 yaşın altında
rastlanmaktadır. Bununla birlikte kolon kanserinin genç insanlarda da meydana gelme
olasılığı gün geçtikçe daha da artmaktadır.25,26,27
Kolekteral adenom (senkron yada metakron) varlığı: Kolorektal kanserlerin
%90’nından daha fazlası daha önce gelişmiş adenom poliplerin varlığından
kaynaklanmaktadır. Diğer bir ifade ile adenoma sahip olan bireylerin, adenoma sahip
olmayanlara oranla kolekteral kansere yakalanma riskleri daha fazladır. Adenomlardan
malignansi gelişmesi için yaklaşık olarak 5-10 sene gibi bir süreye ihtiyaç duyulmaktadır.
Diğer bir ifade ile anormal olmayan bir kolon mukozasından adenom, adenomdan da
displazi, insitu ve invazif kanser gelişiminin yaklaşık 10 sene aldığı bildirilmektedir.
Adenomların malignanta dönüşmeden önce tespit edilmesi ve uzaklaştırılması kolon
kanseri riskini azaltmaktadır.28, 29
Kolon kanseri riski, adenomların sayısı ve büyüklüğü ile de direkt olarak
alakalıdır. Tubuler adenomlarda kanserleşme risk oranı %5 iken, bu oran tubulo-villöz
adenomlarda oran %22, villöz adenomlarda ise oran %40 civarındadır. Polip boyutu 2
cm’den büyük olduğunda da, kanserleşme riski artmakta ve %35-50 düzeyine
ulaşmaktadır.30 Kolorektal kanser oluşumunda rol alan bir takım faktörler vardır. Bunlar;
a- Kalıtımsal Faktörler
Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %5-10’nun kalıtımsal faktörlere bağlı
olarak geliştiği belirtilmektedir.31 Kalıtımsal kolekteral kanserlerin en yaygın tipleri FAP
(Familial Adenomatous Polyposis) ve HNPCC (Hereditary Non-polyposis Colorectal
Carcinoma)’dir.FAP ve HNPCC fertler kalıtıma bağlı olarak mutant genlerle doğdukları
11
için, adenom oluşumu ve adenomdan da karsinoma dönüşüm süreci bu kişilerde daha
hızlı olmaktadır. Lynch sendromu olaraktan bilinen HNPCC tipi DNA tamir
mekanizmalarında görev alan genlerdeki (MLH1 ve MSH2) mutasyonlara bağlı olarak
ortaya çıkar. Bu iki gendeki mutasyonların ayrıca uterus, mide, pankreas, böbrek ve uretra
kanserlerinin ortaya çıkmasında da etkili olduğu da bildirilmektedir. HNPCC kolekteral
kanserlerin %2-6’sını oluşturmaktadır. FAP ise tümör baskılayıcı genlerinden birisi olan
APC genindeki mutasyonlara bağlı olarak meydana gelmektedir. FAP tipi kolekteral
kanserlerin %1’ den daha azını oluşturmaktadır. HNPCC tipi kolekteral kanserde birkaç
adenom gelişimi olurken, bunların tam aksine FAP’lı bireylerde yüzlerce adenom
gelişebilmektedir. APC bağlantılı polipler otozomal dominant kalıtım göstermektedir.21
Kolon kanseri oluşumunda rol alan faktörler; tümör supressör genlerin etkin
olmaması, ve DNA tamiriyle ilgili genlerdeki (MMR: mismatch repair gen) problemler,
genetik değişiklikler (mutasyonlar) ve en önemlilerinden birisi olan proto-onkojenlerin
aktivasyonudur. Proto-onkojenlerin aktivasyonları, hücre yüzeyinden nükleusa gelecek
olan iletileri yanlış iletme, anormal hücre bölünmesine ve neticede tümöre sebep olur.
Mutasyona uğrayan proto-onkojenler onkojen olarak adlandırılır ve baskın olarak
fonksiyon gösterirler. Üzerinde en fazla çalışılan onkojen Ras genidir. İnsanlarda hücre
içi uyarı sistemimin de iletiyi düzenleyen 3 Ras geni (K-Ras, N-Ras, H-Ras)
bulunmaktadır. K-Ras geni mutasyona uğradı zaman, hücre içindeki guanozin trifosfat
(GTP) hidrolizi yapılamadığı, G proteininin ise sürekli aktif formda kaldığı, sonuç olarak
da hücrenin kontrolsüz bir şekilde bölünmesine neden olduğu öngörülmektedir.
Kolekteral kanser vakalarının yaklaşık %65’inde, bir Ras geninde (genellikle K-Ras
geni) nokta mutasyonu saplanmıştır. Fakat tümör gelişimi için K-Ras gen mutasyonu tek
olarak yeterli değildir. Kolon kanserleri ve 100 mm’den büyük adenomların yarısından
12
fazlasında Ras mutasyonu rastlanırken, 100 mm’den küçük adenomlarda bu oran %10’a
kadar inmektedir.30
Mutasyona uğradığı takdirde kolorektal kanser oluşumunda rol alan devamlı
karşılaşılan tümör süpressör genleri; APC (Adenomatous Polyposis Coli), DCC (deleted
in colorectal carcinoma) ve p53 genleridir. Tümör süpressör genler resesif özellik
taşıdığından, tümör gelişiminin başlayabilmesi için her iki allelde de mutasyonun olması
gerekmektedir. APC geninde bulunan bir eksiklik ya da kusurdan dolayı, ilk olarak
FAP’lı bireyli vakalarda bu tanı konulmuştur. Mutasyonların meydana geldiği bu gende,
FAP‘lı ve diğer sporadik kolon adenomlarının gelişiminde çok önemli başlangıç noktası
olduğu tahmin edilmektedir.11,14 APC geni, 5. kromozomun uzun kolunda (q21)
mevcuttur. FAP’lı hastalar, APC geninin bir allelinde ortaya çıkmış olan mutasyonla,
mutasyonlu olarak hayatlarına başlarlar. İkinci allel, bireyin yaşamı sırasında meydana
gelen çevresel etkenlerin de etkisinde kalarak mutasyona uğrarlar. Polip oluşumunun
başlayabilmesi için, birinci ve ikinci APC geninin de mutasyon geçirmesi gerekmektedir.
Ancak, polipin kanserleşmesi için ek genetik mutasyonların da eklenmesi olmazsa
olmazıdır.30 p53 geni 17. kromozomun kısa kolunda (17p) yer almaktadır. p53 proteini,
DNA onarım ve sentezi kontrolü ve programlanmış olan hücre ölümünde (apoptoz) rol
alır. Apoptozu başlatmakta görevli olan bu gendeki mutasyon insanda çeşitli tümörlerin
gelişimine neden olmaktadır. Bu gene ait mutasyon, kolekteral kanserlerin %75’inde
görülmektedir.
b- İnflamatuar Barsak Hastalıkları
Ülseratif kolit ve Crohn hastalığı gibi barsak hastalığı olan kişilerde kolekteral
kanser hastalığına yakalanma riskinin 4-20 kat daha fazla olduğu belirtilmektedir.
13
Dolayısıyla, bu hastalıkları taşıyan kişilerde yaşın kaç olduğuna bakılmaksızın erken
kanser taraması yapılması tavsiye edilmektedir.33
c- Diyet
Hayvansal yağlar başta olmak üzere, yüksek yağ oranına sahip besinler kolekteral
kanserlerin önemli sebeplerinden birisi sayılmaktadır. Bu yüzden özellikle yağlı
besinlerle beslenen batı ülkelerinde kolekteral kanser riski yüksek olmaktadır. Diyette
yağ alımıyla karaciğer tarafından kolesterol ve safra asidi sentezi artar. Kolon bakterileri
bu bileşikleri sekonder safra asitlerine, kolesterol metabolitlerine ve diğer toksik
metabolik bileşiklere dönüştürür. Safra asitleri ve serbest yağ asitlerinin kolon
mukozasında hasar yaptığı ve epitel hücrelerinin proliferatif aktivitesinde artışa yol açtığı
gösterilmiştir. Balık ve tavuk eti yerine kırmızı et tüketiminin artması, kolon kanseri
insidansında artmayla ilişkili bulunmuştur. Kırmızı et tüketimi ile kolekteral kanser
arasındaki ilişki kırmızı etteki hem demirinin varlığı ile açıklanmaktadır. Ayrıca, yüksek
sıcaklıklarda pişirilen etlerde heterosiklik aminlerin ve polisiklik hidrokarbonların
meydana geldiği ve bu maddelerinde kolekteral kansere sebep olduğu belirtilmektedir.3437
Epidemiyolojik çalışmalarda sebze ve meyvenin bol tüketimi, kolon kanseri riskiyle
ters orantılıdır. Diyetteki lif, dışkı hacmini ve buna bağlı transit hızını arttırarak
intraluminal karsinojenlerin mukoza ile temasını azaltır. Ayrıca lifli gıdalar, bağırsaktaki
karsinojen safra asitlerinin derişimini azaltırlar.34-37
d- Çevresel faktörler
Kolekteral kanser riskini artıran çevresel faktörlerden en önemlilerinden birisi
sigara tüketimidir. Sigara dumanı kolon ve rektuma karşı son derece zararlıdır. Kolekteral
kanserlerin yaklaşık olarak %12’sinin sigara tüketimine bağlı olduğu belirtilmektedir.
Sigara dumanının, kolekteral kanserlerin öncüsü olarak kabul edilen adenomo poliplerin
oluşumunu ve büyümesini artırdığı belirtilmektedir. Büyük poliplerin varlığı ise uzun
14
süreli sigara içimi ile ilişkilendirilmektedir. Ayrıca, kadın ve erkeklerde sigara tüketimine
bağlı
olarak
kolekteral
kanserlerin
daha
erken
yaşlarda
ortaya
çıktığında
açıklanmaktadır.38-40 Bir diğer çevresel faktör olan alkol tüketiminin de yine kolekteral
kanseri teşvik ettiği bildirilmektedir. Özellikle alkol tüketimine bağlı olarak kolekteral
kanser oluşumunun çok daha erken yaşlarda başladığı bildirilmektedir. Sigara ile alkolün
birlikte alımının çok daha tehlikeli olduğu da dile getirilmektedir. Bu durumun ise, sigara
kullanımına bağlı olarak DNA mutasyonlarının alkol varlığında onarımında
olasılıklarının çok daha düşük olması gösterilmektedir. Diğer taraftan, bir solvent olarak
görev yapan alkolün diğer karsinojenik maddelerin hücreye girişini artırması
gösterilmektedir. Ayrıca, alkolün hücrelerde serbest radikal oluşumuna, lipit
peroksidayonuna ve prostoglandin üretimine bağlı olarak kolekteral kanser oluşumunu
artırdığı belirtilmektedir.38, 39, 41
Kolorektal kanserin oluşumu sırasında yaş, beslenme şekli, genetik yatkınlık,
önceki kanser öyküsü, polipler, virus (human papilloma virus),vücuda dışarıdan verilen
hormonlar, alkol tüketimi, düşük selenyum ve çevresel etkenler sayılabilmektedir. Birçok
epidemiyolojik çalışma kolorektal kanserde diyetin ve yaşam tarzının ne kadar önemli
olduğunun altını çizmektedir. Yağ, kırmızı et, alkol alımı ve sigara tüketiminin pozitif
korelasyon gösterdiği, sebze ve lifli gıdaların tüketiminin ise ters korelasyon gösterdiği
raporlarla belirtilmektedir. Bunlara ek olarak yüksek fiziksel aktivite, bayanlarda
menopaz öncesi hormon tedavisi, aspirin gibi anti-enflamatuarların düzenli olarak
kullanımı gibi faktörlerin ise koruyucu etkisi olduğu bildirilmiştir.16
2.5. Kanserogenezde Tedavi Seçenekleri
Kanser tedavisinde; cerrahi işlemler, lazer, radyoterapi, kemoterapi, immünoterapi,
adjuvantlar ve hormon uygulamasına başvurulmaktadır. Kanser tedavisinde en çok
kullanılan tedavi şekli; tümörün uzaklaştırılmasını sağlayan cerrahi yöntemleri içine alır.
15
Bu, diğer doku ve organlara yayılmayan ya da yayılamayan birçok kanser türü için etkili
bir tedavi seçeneğidir. Eğer kanser ilerlemiş ya da çevre dokulara yayılmışsa; cerrahi
müdahale, radyoterapi ve kemoterapi ikisi veya üç tedavi yöntemi birlikte uygulanabilir.
Radyasyon tedavisinde kanser tedavisinin yapıldığı bölgeye X ışınları, gama ışınları ve
protonlar kullanılmaktadır. Bu radyoaktif ışınlar; kanserli hücreyi tahrip ederek
etkilemektedir. Örneğin, gamma ışınlarının beyin tümörlerinin uzaklaştırılmasında
kullanıldığı belirtilmektedir. Ancak, yapılan çalışmalar radyasyon tedavisinin normal
hücrelerin yanı sıra sağlıklı hücrelerde zarar verdiğini göstermektedir. İmmünoterapi
yöntemi, BCG aşısı, interlökin ve interferonlar gibi biyolojik molekülleri kullanarak
bağışıklık sisteminin aktif hale getirilerek uyarılmasıdır. Bu uyarı ise hücre büyümesini
kontrol eden hücre sinyallerini etkilemek şeklinde olmaktadır. Adjuvant terapi
ameliyattan sonra kemoterapi kullanılmasıdır. Hormon ile tedavisi yönteminde ise;
hormon salım miktarı ve zamanına bağlı olarak gelişen meme ve prostat kanseri gibi
vakalarda bazı özel hormonların kullanımıyla tatbik edilen tedavidir. Lazer tedavisi ise,
cerrahi müdahalelerde yararlı olabilmektedir. Bundan dolayı, beyin tümörleri ve gırtlak
kanserinde kullanılmaktadır. Kemoterapi ise, kanserin ilaçla tedavi edilmesi olarak
tanımlanır. Kanser kemoterapisi çok kullanılan bir tedavi yöntemi şeklidir. Kemoterapi
sırasında kullanılan ilaçlar, kanserli hücrelerin bölünüp sayılarının artmasını engellemek
de durdurmakta ya da yok etmektedir. Ancak; kemoterapide kullanılan ilaçlar vücuttaki
normal olan hücrelere de etki edebilmekte ve çok ciddi yan etkilere yol açabilmektedirler.
11
2.6. Hücre ölümü
Hücre ölüm mekanizmasının düzenlenmesi embriyolojik gelişim ve doku
hemostazisi için önemli bir aşamadır. Son yıllarda yapılan araştırmalarda hücre ölümünü
kontrol eden birçok yolak hücre ve doku da izah edilmiştir. Hücre ölümü gerçekleşmeye
16
başlayan hücrede aynı anda değişik hücre ölüm yolakları paralel olarak tetiklenmiş
olabileceğinden hücre ölüm mekanizmaları birbirlerini etkileyebilir ve tanımlanması her
zaman kolay olmayabilir. Hücre ölümü gerçekleşmeye başladığı zaman oluşan
morfolojik değişikliklerin, apoptoz ile mi yoksa otofaji sonucunda mı oluştuğunun
tanımlanabilmesi zordur.4 Bununla birlikte, otofajik ve apoptotik hücre ölümü arasında
biyokimyasal ve morfolojik farklar bulunmaktadır. Otofajik hücre ölümünde, kaspaz
aktivasyonu ve DNA fragmentasyonu gözlenememektedir. Otofaji sitoplazmik
organellerin; mitokondri, golgi aygıtı gibi ve sitoplâzmayı yutan sitoplazmik keseciklerin
görülmesiyle tanımlanmaktadır. Otofajide, oluşan membran yapıları otofagozom veya
otofajik vakuol olarak da adlandırılan iki veya ikiden daha fazla yapılar ortaya çıkar.
Hayvan hücrelerinde otofagozomun dış membranı lizozomla, maya ve bitkilerde ise bu
yapı vakuolle bütünleşir. Hücrelerde, DAPK1’in belirtilmesi ise otofajik keseciklerin
meydana gelmesi ve zar balonlaşmasına neden olur. Otofajik veziküller ve bu
veziküllerin içeriğinin yok edilmesi için aynı hücrenin lizozomal hidrolazları tarafından
yararlanılır. Otofaji; hücrelerin hücre içi besine ve enerji üretimine gereksinim duyduğu
zaman hızla up-regüle edilir. Otofajinin kontrolü için hücrenin yoğunluğu, oksijen
konsantrasyon oranı, sıcaklık, hormonal etkenler ve besin miktarının durumu önemli
etkilere sahiptirler.5
2.6.1. Apoptozis
Hücrenin patolojik bir şekilde yok olması olan ve ATP miktarının azaldığı, hücre
homeostazının çok hızla bir şekilde bozulduğu, yangı esnasında gelişen nekrozdan çok
farklı olarak, apoptoz; yangı olmaksızın hücrelerin kendi kendilerini yok ettikleri,
programlı hücre ölümü olup organizmada homeostazı koruyan bir durumdur.42
Günümüzde de bu terimin kullanımı doğru kabul edilmektedir ve fizyolojik etkenlerden
kaynaklanan hücre ölümünü ifade eder. Hormonsal olarak aktif hale gelen çeşitli
17
maddeler, iyonize radyasyon ve kemoterapiyi içeren travmatik ajanlar aracılığıyla
gerçekleşen hücresel hasarların ya da genetik faktörlerle başlatılan hücresel süreç
apoptoza sebep olur. Vücutta fizyolojik bir durum olan apoptoz, anormal olmayan
hücrelerin yok edilmesinden de sorumludur. Apoptotik hücre sayısı bireyin ya da
organizmanın sağlıklı mı yoksa hasta olup olmadığını belirlediğinden, apoptozun
fonksiyonel mekanizmaları hücrede denge unsurudur. Bunun da anlamı; apoptoz oranının
azalması ile hücre sayısı artar tam tersi olarak apoptoz oranı artarsa hücre sayısı azalır ve
istenmeyen doku bozuklukları ortaya çıkar43.
Apoptoz tek hücreli organizmalarda hücrenin yaşamının sonlanmasının
alternatifsiz tek yoludur. Bu durum çok hücreli organizmalarda ise genetik oluşumlu
hücre hasarının durdurulması ya da hücrenin tamamen ortamdan kaldırılması apoptoz
aracılığıyla olur. Bu şekilde hasarlı hücrenin yayılması ve tümör oluşumu gibi zararlı
olasılıkların önüne geçilmiş olur. Apoptoz olayının başlamasından önce hücresel
replikasyon işlemi durur (DNA onarımı) eğer bu esnada tahrip olan DNA’nın tamiri
gerçekleşemezse apoptoz ile sonuçlanan olaylar zinciri başlar. Bu sırada apoptozun
başlayıp başlamaması bozulan yapının büyüklüğüne, hücrenin tipine ve hücrenin
üretkenlik potansiyeli olan tümör geliştirme riskine bağlıdır.43 Apoptoz, hücrede,
stoplazmik azalma ve çevre hücrelerle olan ilişkisinin kaybolması ile ortaya çıkar.
Hücresel büzüşmenin sebebi olarak gösterilen, sodyum (Na), potasyum (K), klor (Cl)
taşıyıcı sisteminin durmasından dolayı hücrenin içi ve dışı arasındaki sıvı hareketinin
olmayışıdır. Apoptotik uyarım alan hücre hacmi azalır ve çevre hücreler ile bağlantısı
kopar mikrovillusları kaybolur.42
Apoptoz, kanser gelişiminin engellenmesinde hücre tarafından başvurulan temel
düzenleyicilerden biridir. Apoptozun bu düzenleyici mekanizmaları ise çok kompleks
özellikler taşımaktadırlar. Tümör nekroz edici faktör (TNF), reaktik oksijen türleri
18
(ROS), kaspazın aktivasyonu, protein kinaz ve mitokondriyal yolak apoptozun önceliğini
olustururmaktadır.44 Apoptozun düzenleyici mekanizmasında kullanılan başlıca yol
kaspazların aktivasyonudur. Proapoptotik kaspazlar kalsiyum bağımsız hücre içi sistein
proteazların atkin bir kısmını meydana getirirler. Bu kaspaz ailesi proteinler biyolojik
fonksiyonlarına göre üç ana grupta incelenirler. Bunlar Sitokin aktivasyonu yapanlar,
apoptozisi başlatanlar ve apoptozu yürütenler (efektör grup). Sitokin aktive eden grup
kaspazlar (kaspaz-1, -4, -5, -11, -12, -13 ve -14) ve apoptozu uyaran kaspazlar (kaspaz2, -8, -9 ve -10) ve apoptozu devam ettiren kaspazlar (kaspaz -3, -6 ve -7) dır. Kaspaz -3’
ise programlı hücre ölümünde çok önemli bir rol- üstlenir.45
Apoptozisi başlatan kaspazlar apoptotik uyarıyla başlama alan ölüm sinyallerini
efektör kaspazlara iletirler. Sinyali alan efektör kaspazlar ise görevli olan proteinleri
parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine sebep olurlar. Kaspazlar
apoptozisi aktive eden sinyaller tarafından tetiklenip, apoptozisin her üç yolunda da
(intrinsik yol, ekstrinsik yol ve endoplazmik retikulum aracılı yol) aktif olarak görev
alırlar.45
Apoptozun genetik olarak düzenlenme mekanizması ilk olarak Caenorhabditis
elegans isimli nematotta belirlenmiştir. Bu nematotta Ced-3, Ced-4 ve Ced-9 adı verilen
3 genin apoptoz sürecini kontrol ettiği tespit edilmiştir. Ced 3 ve Ced 4 hücrede
apoptozise neden olmaktadır. Ced 9 ise Ced 3 ve Ced 4’ ün aktivasyonunu engelleyerek
sağlıklı hücrelerde apaoptozisi engellemektedir. Ced-4 insanlarda apaf-1 ile homoloji
göstermektedir. Ced-9'un insandaki homoloğu ise Bcl-2 proto-onkojen genidir.46,47 Bcl-2
mitokondri dış zarında yer alıp, kaspaz 3’ ün aktivasyonunu engellemektedir. Bu işlevi
ise kazpaz 3’ ün aktivasyonu için kofaktör olarak işlev gören sitokrom C’nin
mitokondriden salınımını engellemek suretiyle yerine getirmektedir.46
19
Apoptoz ve hücre proliferasyonu dengesi kansere yol açan ve onkogen olarak
isimlendirilen genler tarafından bozulabilir. Onkogenler proliferasyon ve hücre ölümü
gibi olayları denetleyip kontrol edebilen ve protoonkogen olarak bilinen anormal
olmayan hücresel genlerin mutasyona uğramış formlarıdır. Büyümenin durdurulması,
DNA tamiri ve apoptozise engel olunması kanserin başlaması ve gelişiminde kritik
yolaklardır. Tümör baskılayıcı genlerde mutasyonlar yapısı bozulmuş hücrelerin hücre
sikluslarının ilerlemesine ve tümör gelişimine sebep olur. Bilinen birçok tümör
baskılayıcı gende etkinin görülebilmesi için her iki allelde de mutasyon olmalıdır ve
kanserlerin çoğunda tümör baskılayıcı gen olarak bilinen ve tümör protein 53 olarak
adlandırılan (TP53) geni mutasyona uğramıştır. TP53 geni hücre siklusunu kontrol eden
düzenleyen bir transkripsiyon etkenidir ve yapılan birçok araştırmada organizmada
kanseri inhibe eden çok önemli bir proteindir. Ayrıca p53 proteini DNA’da mutasyon
olmasını engeller ve DNA’yı mutasyondan korur. Eğer DNA hasar görmüşse DNA tamir
proteinlerini harekete geçirir ve DNA tamir edilemeyecek kadar zarar gördüğünde ise
apoptozu başlatır.48, 14
Kanser hücrelerinin normal hücrelerden farkları: büyüme faktörlerine duyarsızlık,
hücreler arası sinyallerle etkileşmeme, programlanmış hücre ölümünden (apoptoz)
kaçabilme, kontrolsüz ve sınırsız bölünme potansiyelinde olma, genellikle daha büyük
hücre çapına ve nukleusuna sahip olma, anjiogenezi devamlı olarak destekleyebilme,
doku invazyonu ve metastaz yapabilme olarak belirtilmektedir. 49,50
2.6.2. Otofaji
Otofaji, hücre içi makro moleküllerin ve organellerin bir membran içine alınarak
lizozomal enzimler birleşerek burada yıkımlanması olayına verilen isimdir. Daha açık
ifade edersek, bu tip hücre ölümünde en belirgin morfolojik değişiklik, sitoplazmada
oluşan iki veya daha fazla katmanlı membranla çevrili, sitoplazma parçaları ya da
20
mitokondiri, endoplazmik retikulum (ER) gibi hücre içi organelleri içeren veziküllerin
mevcudiyetidir. Bu vesiküller lizozoma birleşip, içerisinde taşıdıkları yüklerinin
lizozomal enzimler tarafından parçalamasını sağlarlar. Ömürleri kısa olan proteinlerin
ubikitin-proteozom sisteminde parçalananıyken, bunun aksine hücre içi organeller ve
uzun ömürlü proteinler otofaji sistemi tarafından parçalanırlar ve hücre kullanımı için
yeniden kazandırılan yapı taşları (örneğin amino asitler) oluşur. Otofaji kelime manası
olarak kendi kendini anlamına gelir ve hücrenin besinsiz kaldığı durumlarda fizyolojik
olarak besin elde etmek için hücre içindeki yapıları parçalandığını anlatmak için
kullanılmıştır.4, 51
Otofaji 4 formda açıklanabilir;
1- Makrootofaji; İki zarla çevrili organellerin sitoplazma içinde parçalanması
2- Mikrootofaji; Membran invajinasyonu ile sitoplazmanın lizozom içine taşınarak
parçalanması
3- Spesifik moleküllerin lizozom içerisine alınması olan şaperon bağımlı otojaji
4- Kanonikal olmayan- alternatif (Atg5/7 bağımsız) makrootofajidir.
Bu dört otofaji formundan makrootofaji, birçok hücrede bazal seviyede meydana
gelmekte, parçalanan protein ve yapısı bozulmuş olan organellerin parçalanmasında çok
önemli bir fonksiyonu vardır. Genel olarak da hücrelerde makrootofaji denildiğinde
otafaji kastedilmektedir.51
Yapılan araştırmalarda günümüzde 30’dan fazla Atg geni (Autophagy-related
proteins) tanımlanmıştır. Atg proteinleri olarak ilk olarak mayalarda bulunmuştur. Atg
proteinlerinin bir kısmı ve çeşitli protein kompleksleri “otofajik kesecik” ya da bir başka
deyişle “izolasyon membranının” ve otofagozom oluşumunda rol almaktadır.51
Otofajiyle ya da otofagozom oluşumuyla ilgili proteinler 4 temel kategoride
incelenmektedir. Bunlardan birincisi, Atg1/Unc-51-like kinase (ULK) kompleksi,
21
ikincisi ubiqutin-benzeri (Atg12 ve Atg8) konjugasyon sistemleri, üçüncüsü sınıf III
fosfotidilinozitol 3-kinaz (PtdIns3K)/Vps34 kompleksi ve dördüncüsü iki transmembran
proteinleri (Atg9 ve VMP1) dir.52
Hücredeki otofajik aktivitevi başlatan açlık, hipoksi ve çeşitli stres faktörleridir.
Otofajik aktivitenin denetiminde rol oynayan, target of rapamycin
(TOR) protein
kompleksi önemlidir. TOR, ilk olarak mayada mantar tedavisi için geliştirilmiş bir ilaç
olan Rapamisinin hedefi olarak ortaya çıkarılmıştır. TOR hücrede protein sentezini ve
hücrenin büyümesinin kontrolünü sağlayan bir kinazdır. Bu proteinin baskılanması ile
mayalarda ve memelilerde otofaji aktif olmuştur. Dolayısıyla, mammalian target of
rapamycin (mTOR) yolağı otafajiden sorumlu bir oluşum olarak kabul edilmektedir.51
mTOR iki farklı kompleksin (mTORC1 ve mTORC2) katalitik alt ünitesi olarak
işlev yapmaktadır. mTORC1, mTOR ve raptor birimlerinden oluşur. Raptor, mTOR’ un
regulasyonundan sorumlu protein birimi olarak görev yapar. mTORC1 ULK1/2
(mayadaki Atg1’in homoloğu), mAtg13 ve FIP200 (mayadaki ATG17’ in insandaki
homoloğu) ile bileşik yapar. mTORC1’ in mTOR kısmı ULK1 ve Atg13’yi fosforlar bu
sayede de ULK1’ nin kinaz aktivitesinin devamını sağlar. Kısaca, besin varlığında mTOR
proteini ULK1 ve Atg1 proteinleri üzerinde gerçekleştirdiği fosforilasyon sayesinde
otofajiyi baskılar. Hücrelerde, mTORC1 aktivitesi inhibe olduğunda ise mTORC1 Atg13’
ü fosforlayamaz ve ULK1’ nin kinaz aktivitesi ortadan kalkar. Buna bağlı olarakta
otofagozom oluşumu ve bunun takibinde otofaji meydana gelir. Dolaysıyla, besinin bol
olduğu durumlarda mTOR proteini, otofaji proteinlerinden biri olan Atg13’u uyarmakta
ve otofajiyi inhibe etmetkedir. Açlık durumunda ise mTOR etkinliğinin azalmasına ile
Atg13 fosforile olmamakta ve otofaji inhibe edilmektedir.52
Hücrelerde mTOR aktivitesinin düzenlenmesinde ise PI3K-Akt-mTOR, LKB1AMPK-mTOR, P53, Beclin1 ve Bcl-2 yolakları görev almaktadır. PI3K-Akt-mTOR
22
yolağındaki Akt aktivasyonu mTOR’u inaktif ettiğinde otafaji inhibisyona uğramaktadır.
PI3K sınıflarıda mTOR üzerindeki etkisini Akt aracılığıyla gerçekleştirmektedir. Sınıf I
PI3K Akt’yi aktive ederek otafajiyi inhibe ederken, sınıf III PI3K Akt’yi inhibe ederek
otofajiyi uyarmaktadır. Bir tümör supresör geni olan PTEN’de Akt aktivitesini inhibe
ederek otofajiyi uyarmaktadır. Yine bir tümor baskılayıcı gen olan ARHI’ de PI3K-Akt
yolunu inhibe ederek otofajiyi indüklemektedir.53
AMPK (Adenosine monophosphate-activated protein kinase) lipid, kolesterol,
glikoz metabolizmalarının yanı sıra kanserlerde yakın ilişkili olan bir moleküldür. Enerji
stresi koşullarında bu molekül mTOR’u baskılayarak otofajiyi başlatmaktadır. LKB1AMPK-mTOR yolağında, serine/threonine kinase LKB1 (ayrıca STK11 olarak bilinir)
AMPK’yı aktive etmekte, AMPK’ da mTOR’u baskılamaktadır. Bu şekilde de LKB1AMPK-mTOR yolağıyla otofayi gerçekleştirilmektedir. Yapılan çalışmalar ayrıca,
AMPK’nın kalsiyum ve kalmodulin bağımlı protein kinaz 2 (CAMKK2) tarafından da
aktif edildiğini göstermiştir.54,55,56,57
Tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesinin yanı sıra, P53 geni DNA hasarlarının
tamirinde de görev almaktadır. Diğer taraftan, P53’ ün AMPK’yı aktive ettiği, mTOR’u
inhibe ettiği ve bu şekilde de otafajiyi uyardığı bilinmektedir. Ayrıca, P53’ ün kanserli
hücrelerde Sestrin2 ve Bax (Bcl-2 bağlantılı X proteini) gibi diğer yolakları da aktive
ederek otofajiyi uyardığı da belirtilmektedir. P53’ ün aktivasyonuna besin eksikliği ve
diğer stres faktörlerinin etken olduğu, aktifleşen p53’ ün ise bahsedilen yolaklar
aracılığıyla otafajiyi uyardığı açıklanmaktadır.53
Beclin 1 (Atg6 olarak ta bilinir) insan dokularında ifade edilir ve endoplazmik
retikulum, mitokondri ve perinukleer aralıkta bulunur. Beclin 1 otofajinin yanı sıra tümor
gelişiminin baskılanmasında görev alır. Otofaji olayında otofaji için gerekli olan çift zarlı
otofagozom oluşumunda görev alır. Beclin 1’in kaybı insanda meme, ovaryum ve prostat
23
kanserlerine sebep olmaktadır.58-60 Beclin 1, hücrede otofaji oluşumu ile ilgili yer alan
Bcl-2, Vps34, p150, UVRAG, Bif1, Atg14L ve Rubicon gibi diğer proteinlerle
bağlanarak büyük bir kompleks meydana getirir ve bu şekilde otafajide görev
üstlenirler.53 Beclin 1’ in aksine, Beclin 2 familyasındaki proteinlerin ise genellikle
apoptozis ve otafajiyi inhibe ettikleri belirlenmiştir.59 Örneğin, Bcl-2’nin knockdown
edilmesiyle meme kanseri hücrelerinde otofajinin indüklendiği belirlenmiştir.61 Yine,
antisens RNA kullanılmasıyla Bcl-2 susturulmuş kanser hücrelerinde otafajinin tekrar
indüklendiği gösterilmiştir.62
Yapılan çalışmalar besin yetersizliğinin, hipoksi, oksidatif stres, patojen
enfeksiyonu, radyasyon ve anti kanser ilaçlarının uygulanması durumunda otofajinin
devreye girerek hücre homeostezisini sağladığını göstermektedir. Bununla birlikte aşırı
veya düzensiz otafaji durumlarında sinirsel bozuklukların, yaşlanmanın ve hatta kanserin
ortaya çıkabileceği belirtilmektedir.63
Özellikle, insan meme, prostat ve ovaryum kanserlerinin %40-70’ inde otafajiden
sorumlu bir gen olan Beclin 1’de monoallelik kaybın olduğu tespit edilmiştir. Bu da
tümör gelişiminin engellenmesinde otafajinin çok önemli bir süreç olduğunu ortaya
çıkarmıştır.64
Otofaji tümör gelişiminin engellenmesinde her ne kadar gerekli bir süreç olduğu
belirtilmiş olsa da, tümörlü hücrelerde stresle oluşturulan yapay otofajinin tümör
hücrelerine tedaviye karşı direnç kazandırdığı ve tümör hücrelerini dormansiye soktuğu
açıklanmaktadır. Nihayetinde de bu durumun tümörlerin yeniden büyümesini ve
ilerlemesini sağladığı rapor edilmektedir. Bununla birlikte, tümör hücrelerindeki otofaji
başlangıcının genetiksel yöntemlerle veya ilaç uygulamalarıyla engellenmesi sayesinde
tümör hücrelerinin öldürülebileceği ve apoptotik hücre ölümünün başlatılabileceği
bildirilmektedir.
Dahası,
kemoterapik
ilaçlarla
otofaji
inhibitörlerinin
birlikte
24
verilmesinin, tek başına kemoterapik ilaç verilmesine oranla in vivo ve in vitro koşullar
altında tümör büyümesini çok daha fazla engellediği ve hücre ölümünü de çok daha fazla
tetiklediği
belirtilmiştir.
Bu
yüzdende
ön
otofajinin
engellenmesi
şeklinde
gerçekleştirilen uygulamanın kanser tedavilerinde çok başarılı bir adım olabileceği ileri
sürülmektedir.52
Normal hücrelerin aksine kanserli hücreler normal hücre ölüm sinyallerine cevap
vermeyerek hayatta kalma başarısı göstermektedirler. Mevcut anti kanser ilaçları ise
kanser hücrelerini apoptoz yolundaki ölüm sinyallerine cevap verecek şekilde
etkilemektedirler. Bununla birlikte, bazı kanser türlerinin apaptotik yollarını tamamen
kaybettiği ve bu yüzdende uygulanan tedavilerden veya antikanser ilaçlarından
etkilenmediği belirlenmiştir. Böyle durumlar içinde, araştırmacılar diğer bir hücre ölüm
mekanizması olan otafajiyi harekete geçirerek kanserli hücreleri yok eden antikanser
ilaçlarına yönelmeye başlamışlardır.65 Bu doğrultuda da mTOR inhibitörleri ve
dolayısıyla da otofaji indükleyici ajanlar olan rafamisin (sirolimus), rafamisin türevleri
(everolimus, temsirolimus vb.),
arsenik triokside ve temozolomide gibi maddeler
apoptozis-dirençli kanserlerde ilaç olarak kullanılmaktadır.66 Yine yapılan bir başka
çalışmada bazı anti-deprasantların (maprotiline ve fluoxetine) apoptozis-dirençli kanserli
hücrelerde otafajiyi harekete geçirerek kanser gelişimini durdurduğu rapor edilmiştir.65
2.7. Cisplatin Etki Mekanizması
Platin bileşikleri kemoterapi de çok kullanılan ilaçlardır. Bu grup içinde bugün için
3 molekül mevcuttur: cisplatin, kaboplatin ve oksaplatin. Bunlardan cisplatin en
nefrotoksik olanıdır.67 Cisplatin (cis-dimminedichloroplatinum II, CDDP) inorganik
divalent, suda çözülebilen platin bir bileşiktir. İki değerlikli bir merkez atomuna bağlı iki
amonyum ve iki klor bağı içerir.68
25
Şekil 2.3. Cisplatin moleküler yapısı68
Birçok kanser türünde kullanılan bir kemoterapötik olan cisplatin yıllardır başarılı
bir şekilde kullanılmaktadır.6, 7 DNA ve RNA gibi nükleofilik moleküllerle kolaylıkla
etkileşime girme özelliğine sahip bir ilaçtır. Sitotoksisitesinin bu özelliğinden
kaynaklandığı sanılmaktadır. Cisplatinin anti kanser özelliği, hücre döngüsüne girerek
onu bloke etmesinden, DNA replikasyonunu ve RNA transkripsiyonunu engellemesinden
ve apoptoza yol açmasından gelmektedir.6
Bütün kemoterapötikler gibi cisplatine karşı da bir direnç oluşmaktadır. Cisplatin
uygulaması ile kanser hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyon artışının
uyarılması sonucunda kemoresistans gelişimi şekillenmektedir.6 Bu direnci ortadan
kaldırmak için cisplatinin yüksek dozlarda uygulanması gerekmektedir ancak yüksek
dozlarda cisplatinin nefrotoksisite ve hepatotoksisite gibi toksik etkileri ortaya
çıkarmaktadır.7,8 Düşük dozlarda ise cisplatinin etki oranı azalmaktadır. Bu oran
cisplatinin diğer kemoterapötiklerle kombine kullanılması ile arttırılabilir ve böylece
toksik etkisi de düşürülebilir.7 Yapılan bir çalışmada gemcitabin ile cisplatinin kombine
kullanımı yalnız gemcitabin kullanımına oranla daha iyi etki ve daha hafif toksisite
gösterdiği rapor edilmektedir.69 Ayrıca bu kemoterapötiklerden birkaçının kombine
kullanımı son yıllarda birçok kanser tedavisinde başvurulan seçeneklerden birisi
olmaktadır. Böyle kombine kullanımın sonucu olarak kanser tedavisinde daha etkin bir
sonuç ve daha düşük toksisitenin oluşması sağlanabilmektedir.9
26
Şekil 2.4. Cisplatin karşı gelişen direnç mekanizması70
2.7.1. Cisplatinin doz sınırlayıcı etkileri;
Cisplatin farklı kanser gruplarında antineoplastik bir ajan olarak kullanılmaktadır.
Ancak bu ilacın yüksek dozlarda alınmasının büyük oranda nefrotoksisiteye neden
olmasının yanısıra hepatotoksisiteye de neden olduğu bilinmektedir.8
Cisplatinin toksisitesinde en büyük hedefi mitokondride meydana gelen oksidatif
strestir. Bunun sonucu olarak mitokondrial protein-sülfidril kaybolmaya başlamakta ve
mitokondrial membran potansiyeli düşmektedir. Yapılan incelemelerde cisplatinin, ALT
ve AST seviyelerinde yükselmeye ve nitrit oksit, kalsiyum ve albümin seviyelerinde de
düşme etkeni olduğu belirtilmektedir.8
Schmid ve ark.’nın akciğer kanserli hastalar üzerinde yapmış olduğu bir çalışmada,
cisplatinin sitotoksite ile hücreleri apoptoza uğrattığını bildirmektedir. p53 seviyelerinin
artıp artmadığı konusunda ise net bir bilgi bulunmamaktadır.71
2.8. Kanser Tedavisinde Antioksidanların Rolü
Kanser tedavisinde hücresel hasara neden olması için serbest radikallere ihtiyaç
vardır. Yapılan bir çalışmada kemoterapi ile eşzamanlı olarak alınan antioksidanların,
kemoterapinin etkinliğini düşürdüğünü göstermektedir. Buna rağmen insanlar üzerinde
yapılan iki çalışmada, melatoninle kemoterapinin kombine kullanımının, yalnız
27
kemoterapi kullanımından daha etkili olduğunu gösterdiler.72 Bu çalışmaların biri, meme
kanserinde tamoxifenin melatonin ile kombine kullanımıdır. Bu çalışmada tomoxifenin
melatonin ile kombine kullanılması, tamoxifenin yalnız kullanılmasından daha etkili
sonuç verdiği
ve kanda tümör büyüme faktörlerinin
seviyelerinin
düştüğü
görülmektedir.73 Bir başka çalışmada ise melatoninin MCF-7 hücrelerinde p53 ve p21
ekspresyonunu arttırdığı ve proliferasyonu düşürdüğü belirtilmektedir.74
2.9. Melatonin
Melatonin hormonunun keşfi 1950’li yılların sonlarında yapılmıştır. Fakat bu
tarihten tam üç yüz yıl önce ünlü Fransız Filozof Rene Descartes melatonin hormonunun
salgılandığı yer olan pineal bezi ruhun sığınağı olarak tanımlamıştır. Günümüzde ise
birçok makalede melatonin uyku, ruh hali, tümör büyümesi ve yaşlanmanın biyolojik
düzenlenmesinde görevli olduğu bulgularına rastlanmaktadır. Yapılan birçok hayvan
deneyi çalışmalarında melatoninin hormonunun asıl görevlerinden başka özelliklerinin
keşfedilmeye başlanmasıyla birlikte bu hormon popular hale gelmiştir. Ancak
melatoninin insan fizyolojisi ve patofizyolojisi üzerine etkileri hala tam olarak
belirsizliğini korumaktadır.75,76
N-asetil 5-metoksi triptamin olarakta bilinen melatonin hormonu ilk olarak sığır
pineal bez kaynaklı molekülün kurbağa derisinin rengini açması ve bu derinin pigment
hücrelerindeki melatonin granüllerini aglutine etmesiyle tanımlanmıştır.75, 77
Melatonin hormonu memelilerde başlıca beynin serebral yarım küreleri arasında
bulunan pineal bezden salgılanmakla birlikte ayrıca over, retina, harder bezi, lakrimal
bez, eritrositler, trombositler ile gastrointestinal sistemden de sentezlenip salgılanan nöro
transmitter bir hormondur. Bu hormon hem yağda hem de suda çözünebilir özelliğin de
olduğu için nucleus dâhil hücrenin her organeline ulaşabilir.78,79 Melatoninin sentezi ve
salınımı karanlıkla uyarılır ışıkla inhibe edilir. Gün ışığı boyunca, fotoreseptör hücreleri
28
hiperpolarizedir yani norepinefrin salınımı inhibe edilir. Sistem çok az miktarda
melatonin salgılar. Karanlıkla birlikte fotoreseptörler norepinefrin salar ve böylece sistem
aktif hale geçer. Aril alkilamin enziminin seviyesinin artmasıyla da melatonin sentezi ve
salınımı artar. Melatonin sentezi arttıkça kan dolaşımına giren melatonin seviyesi de
orantılı biçimde artmaktadır. İnsanlarda melatonin salgılanması karanlıkla birlikte
artmaya başlar ve gece 2-4 saatleri arasında pik noktaya ulaşır ve sonrasında yavaş yavaş
düşmeye başlar.80,81
2.9.1. Melatonin Hormonunun Biyosentezi ve Salgılanması
Memelilerde pieal bez hormonu olan melatonin esansiyel bir amino asit olan
triptofandan sentezlenmektedir. İlk basamakta triptofan hidroksilaz enzimi tarafından 5hidroksi triptofana daha sonrada bunun dekarboksile olmasıyla 5- hidroksitriptamine
(seratonine) dönüşür.
Seratonin arylalkylamine-N- asetilltransferaz enzimiyle N-asetilseratonin formuna
dönüştürülür. Son olarak N-asetilserotonin hidroksiindole-O-metiltransferaz enzimi
aracılığıyla N-asetyl- metoksitriptamine (melatonin) dönüşür. Sentezin düzenlenmesi
pirimer olarak karanlığa bağlıdır. Sentezden sorumlu N-asetiltransferaz’ ın aktivitesi
fotoperiyotik şartlar altında düzenlenmektedir. Işık altında retinada oluşan sinirsel
impulslar hipotalamusta bulunan suprachiasmatic nukleus ve digger hipotalamusta
bulunan yapılara aktarılır. Bu bölgelerin uyarılmasıyla beraber karanlığında etkisiyle
postgangliyonik sempatik liflerden salıverilen nonadrenalin β1 reseptörlerine bağlanarak
serotonin ve N-asetiltransferaz’ ın salıverilmesine neden olur. Nöronlarda ve pineal
bezdeki biyokimyasal sinyallerin etkisiyle melatonin anabolizması hızlanır ve bu
hormonun sirkadiyen ritme bağlı olarak sentez ve salıverilmesi gerçekleşir.19,82-84
29
Şekil 2.5. Melatonin salgılanmasının fizyolojisi
2.9.3. Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi
Melatoninin ile ilgili yapılan birçok in vivo ve invitro çalışmalarda bu hormonun
onkostatik etkiye sahip olduğu, birçok kanser türünde oluşan semptomları hafiflettiği,
tümör anjiogenezisini, poliferasyonunu, metastaz oluşumunu yok edici etkiye sahip
olduğu görülmektedir.85,86 Pinealektomi yapılan hayvanlarda tümör büyümesinin artırdığı
ve daha sonra bu hayvanlara melatonin uygulaması yapıldıktan sonra tümör gelişiminin
yavaşladığı bildirilmiştir.75, 87
Melatoninin etkileri, ileri derece kanserli bazı hastalarda çalışılmış ve olumlu
sonuçlar alınmıştır. Örneğin, glioblastomalı hastaların bir kısmına yalnız radyoterapi
verilirken diğer bir kısmına melatonin ile kombinasyon uygulanmıştır. Kombine kullanım
yalnız radyoterapiye göre çok daha iyi sonuçlar alınmasını sağlamıştır.88
Melatoninin tümör gelişimindeki olumlu etkilerinin;
1- Kanser hücreleri tarafından yağ asidi büyüme faktörü alınımını kısıtlayarak,
2- Telomer uzunluğunu azaltılması yoluyla telomeraz aktivitesini kısıtlayarak
kanser hücrelerinde apoptoza neden olarak,
3- Tümörlerde damar gelişmesini sebep olan anjionik bir faktör olan endotelin-1
sentezini baskılayarak,
30
4- Tümör baskılayıcı bir gen olan P53 geninin ekspresyonunu sağlayarak
gerçekleştirmektedir.85
Son yıllarda yapılan çalışmalarda hastalarda tümör oluşumuyla birlikte uyku
bozukluğunun da görüldüğü bildirilmiştir.89 Melatoninin kanser hastalarında biyolojik
regülasyonu düzenleyerek yeni tümör oluşumlarını engellediği ve kanser hastalarının
yaşam kalitesini iyileştirdiği görülmüştür.10 Hayvan deneyi çalışmaları ve klinik
denemelerde melatonin hormonunun meme kanseri, prostat kanseri, akciğer kanseri,
kolon kanseri ve diğer kanser türlerinin gelişmesini baskılayıcı özelliğinin olduğu
görülmüştür.90,91 Ayrıca melatoninin kemoteröpotik ilaçlarla beraber kullanıldığında
ilaçların yan etkilerini azalttığı bu sebepten dolayı da hastaların yaşam standartlarını
iyileştirdiği görülmüştür.89 Shilian Hu ve ark., akciğer kanserli hastalarda yapmış
oldukları bir çalışmada kemoterapi uygulanan hastaların serumlarında triptofan ve
melatonin hormonunun düşük olduğunu, bu hastalara dışarıdan triptofan verilerek
melatonin sentezini arttırmanın önemli olabileceğini bildirmişlerdir.91
Bizim çalışmamızda melatonin ve/veya cisplatin uygulamaları ile amaçlananlar;
-Kolorektal kanser hücrelerinde melatonin apoptotik ve otojajik etkilerinin
araştırılması
-Kolorektal kanser hücrelerinde cisplatin uygulamasının apoptotik ve otojajik
etkilerinin araştırılması
-Kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve cisplatin uygulamalarının cisplatinin
apoptotik ve otojajik etkinliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir.
31
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Hücre Kültürü
3.1.1. Hücre Kültür Medyumunun Hazırlanışı
 87 ml hazır DMEM hücre kültürü medyumu (Sigma Co., USA)
 2 ml L-Glutamin (Gibco, USA)
 1ml Penisilin+Streptomisin+Amfoterisin B (Sigma Co., USA)
Maddeleri eklenerek100 ml kullanıma hazır hücre kültür medyumu elde edildi.
3.1.2. Hücre İnkübasyon Koşulları
Parental HT-29 monolayer hücre kültürü medyumu içerisinde %5 CO2 37 oC’e
sıcaklıktaki etüvde (Esco) 25 cm2’lik flasklarda steril şartlarda inkübe edilerek hücrelerin
çoğalması sağlandı.
3.1.3. Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing)
Üremekte olan hücre pasajları %80-90 doygunluğa (confluent) ulaşınca hücreler
yeniden pasajlandı.92 Bu amaçla üremekte olan hücreler istenen çoğunluğa ulaştığında;
 Üzerlerindeki besi yeri pipetle alınarak steril fostat tampon solüsyonu (PBS)
(25 cm2 için 2 ml) ile yıkandı.
 PBS pipetle uzaklaştırıldıktan sonra hücrelerin kaldırılması için 3 ml tripsinEDTA solüsyonu ilave edilerek etüvde 10 dk. bekletildi.
 Tüm yüzeye yapışık hücrelerin kaldırılmasının ardından süspansiyon halindeki
hücre tripsin-EDTA solüsyonu 15 ml hacimli bir tüp içerisine alınarak üzerine
tripsinin inhibisyonu için tripsin hacminin 2 katı medyum eklendi.
 Tüpe alınan süspansiyon 1500 rpm de 10 dk. santrifüj edilerek tripsin-EDTA
solüsyonu uzaklaştırıldı ve hücreler taze hücre medyumu ile süspanse edilerek 3
adet 25 cm2‘lik flaska bölünerek yeniden pasajlandı.
 Yeniden pasajlanan hücreler 37 oC’ de %5 CO2 ortamında inkübe edildi.
32
3.1.4. Hücre Dondurma ve Saklanması
 Tripsin-EDTA ile yüzeyden kaldırılan hücreler santrifüj edildi ve tripsin
besi yerinden uzaklaştırıldı. Sonra hücre pelleti 1 ml besi yeri ile sulandırılarak
sayıldı.
 Tripsin, hacminin en az iki katı serumlu besi yeriyle inhibe edildi.
 Hücreler pipetleyerek tek hücre süspansiyonu haline getirilip bir falkon
tüpe aktarıldı. Üzerine 2-3 ml daha medyum ilave edildi.
 Hücre süspansiyonu santrifüjlenerek (1500 rpm’de 10 dk), süpernatant
uzaklaştırıldı.
 Pelet 900 µl hücre medyumu ile sulandırılarak sayıldı.
 Dondurma tüpleri içerisine 100 µl dimetilsülfoksit (DMSO) ve 900 µl
hücre medyumu ile süspanse edilen hücre solüsyonu eklendi.
 Tüpler dondurma kabına yerleştirilerek - 80 oC’de derin dondurucuda
gerektiğinde analizlerin tekrarı için hücre hattı saklandı.
3.1.5. Hücre Sayılarının Hesaplanması
1 ml kültür medyumunda sulandırılan hücre süspansiyonundan 10 µl alınarak
ependorf tüpe kondu ve üzerine 90 µl tripan blue boyası eklenerek karıştırıldı. Bu karışım
Neubauer lamı üzerine konularak 5 bölmedeki hücreler sayıldı, daha sonar bulunan bu
sayı sulandırma miktarı x50.000 sayısı ile çarpıldı. Sonuç olarak 1 ml medyumda kaç
milyon hücre olduğu bulundu. Böylece ekim yapılacak sayı belirlenip hücrelerin petriye
ekimleri yapıldı. 100 mm’lik kültür petrisine 5x106 hücre ve 96 kuyucuklu kültür plağının
her kuyucuğuna 5000 hücre transfer edildi.
33
3.2. Hücre Canlılığı Analizi
3.2.1. MTT Yöntemi
MTT analizi, formazon boyalarının ya da MTT azalmasına bağlı olarak enzim atik
aktivitesinin kolorimetrik ölçümüne dayanan hücre çoğalma miktarının tespit edildiği
yöntemdir. Bu yöntemle kullanılacak olan herhangi bir terapotik ajanın hücre üzerindeki
sitotoksikya da proliferatif etkileri belirlenebilmektedir.
Melatonin ve Cisplatinin, MCF-7 hücre hattı üzerindeki olası sitotoksik etkileri
MTT kiti ile üretici firmanın (Sigma Co. Germany) kullanım talimatına göre uygulandı.
Yöntem MTT ajanı ile inkübe edilen hücrelerde meydana gelen renk değişiminin
kolorometrik olarak belirlenmesi prensibine dayanmaktadır. Oluşan renk değişikliği sarı
ile renklendirilmiş formazon tuzlarının aktif hücre mitokondrilerinde tetrazolyum tuzu
azalmasıyla oluşmaktadır. Bu bileşiklerin absorbans değeri metabolik olarak
aktivitelerinin belirlenebilmesi açısından orantılıdır.
3.2.2. Yapılış Yöntemi
MTT yönteminin uygulamasından 1 gün önce 96’lik plak içerisine sayımı yapılan
5000 hücre (5000/kuyu) ile 100 µl medium hazırlanarak kuyulara ekimi yapıldı.
Mikroplak 24 saat 37°C ve %5 CO2 ayarlı inkübatörde bekletilerek hücrelerin yüzeye
yapışmaları sağlandı. Bu yolla tripsin enziminin hücre membran proteinleri ve büyüme
faktör reseptörleri üzerinde oluşturduğu zararlar ortadan kaldırılmış oldu. Bu protein ve
faktörlerin
yeniden
sentezlenebilmesi
için
24
saatlik
bir
süreye
ihtiyaç
duyulmaktadır.93Aynı zamanda bu yolla medium içerisindeki terapotik ajanların hücreyle
muamelesinden önce hücrelerin metabolik aktivite kazanması sağlanır.
24 saatlik inkübasyondan sonar seri dilusyonlar halinde hazırlanan melatonin ve
cisplatin maddeleri seriler halinde gruplara bölünen hücre hattı medyumuna ilave edildi
(100 µl olan medium ve hücre karışımı üzerine 100 µl içerisinde dilusyonu yapılan ve
34
konsantrasyonu ayarlanan melatonin ve/veya cisplatin eklendi). A serinin birinci sütunu
hücre kontrol ve A serisinin ikinci sütunu meydum kontrol olarak ayarlandı.
Melatonin ve cisplatin uygulanan hücre hatlarına 24 ve 48 saat süreli
inkübasyonlardan sonra MTT yöntemi uygulandı.
MTT analizi;
1- Doksanaltılık plak kuyucuklarında bulunan 100 µl medium ve hücre karışımı
üzerine, hazırlanmış tiazolil mavi tetrazolium bromid solüsyonundan 10 µl ilave edildi.
Bu solüsyon ilavesini takiben 96’lık plak inkübatöre alınarak 3 saat beklenildi.
2- Üç saatlik inkübasyonun ardından hücrelerin yüzeyinde bulunan medium bir
pipet ile alınarak MTT çözücü solüsyonundan 100 µl ilave edilip 20 dk. inkübatörde
bekletildi.
3-İnkübasyonu yapılan hücrelerin, mikroplak okuyucu spektrofotometre (µQuant, BioTek Instruments, Winooski, Vermont, USA) ile 570 nm absorbans değerinde
ölçümleri 3 tekrarlı olarak yapıldı.
3.3. Tunel Boyama Metodu
3.3.1. Hücrelerin lamda üretilmesi
i. Poly-L-lysine kaplı lamlar (Thermo Fisher Scientific, USA) Lamlar, 10 cm
çapındaki petri kutularına hücre ekimi yapılmadan önce yerleştirilerek class II tip
biyogüvenlik kabini içerisinde 4 saat süreyle ultraviyole ışık altında sterilize edildi.
ii. 25 cm2’lik flasklarda çoğaltılan hücrelerden, ultraviyole ışık altında steril edilen
petrilere her bir petri içerisindeki lamların üst yüzeylerine eşit miktarda (100 µL
mediumda suspense yaklaşık 5000) hücre gelecek şekilde ekim yapıldı.
iii. Lam üzerine hücrelerin yapışmasını takiben (ortalama 24 saat sonra), petriler
gruplara ayrıldı ve melatonin ve cisplatin uygulanacak olan grupların petrilerine çeşitli
35
konsantrasyonlarda melatonin ve cisplatin eklenirken, kontrol grubundakilere aynı
miktarda besi yeri medyumu konuldu.
v. İnkübasyon sürelerinin bitimini takiben (24 ve 48 saat sonra) petri içindeki
medyum pipet yardımıyla uzaklaştırıldı ve fosfat tampon solüsyonu PBS eklenerek hücre
yıkama işlemi yapıldı.
3.3.2. Fiksasyon
1.PBS ile yıkanan ve lam üzerinde yapışık bulunan hücreler petrilerden
çıkarılarak-20 oC’de soğutulmuş metanol içerisinde10 dakika tespit edildi.
2. Tespit edilen lamlar PBS ile yıkandı kurutuldu ve boyama prosedürüne
başlanıncaya kadar -20 oC’de saklandı.
3.3.3. Tunel Boyama
 Boyama işlemine alınacak lamlar derin dondurucudan çıkarılarak oda ısısına
gelinceye kadar bir süre bekletildi ve takiben PBS ile yıkandı.
 Endojen peroksitlerin bloklanması için %3’lük H2O2 solüsyonuda 10 dk
bekletildi.
 Daha sonra 5 dk süre ile 3 kez PBS solüsyonuyla yıkandı.
 Permeabilizasyon için (intrasellüler protein tespiti için oldukça önemlidir);
lamlar %0.1Triton X-100-PBS solüsyonunda 10 dk. bekletildi.
 Lamlar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra %1 BSA – PBS (bloklama)
solüsyonunda 30 dk bekletilerek non-spesifik bağlanmaların önüne geçildi.
 Daha sonra Tunel solüsyonu damlatılarak 60 dk. beklendi
 Sonra PBS solüsyonu ile her biri 5 dk. süreyle 3 kez yıkandı.
 Yıkama işleminden sonra Converted Pod solüsyonu damlatılarak 30 dk.
beklendi.
 Sonra PBS solüsyonu ile her biri 5 dk. süreyle 3 kez yıkandı.
36
 Çekirdek boyaması için Harris’in Hematoksilen solüsyonunda 2 dk.
bekletildikten sonra dereceli alkol ve ksilol serilerinden geçirilip entellan (Merck,
Germany) ile kapatıldı.
3.3.4. Tunel Pozitif Hücre Değerlendirmesi
Tunel boyama sonuçlarının gruplar arası kıyaslamalarını yapabilmek için
“Stereolojik Optic Fractionator Frame” metodu kullanıldı. Bu analizler stereoloji
workstation sistemi (BioPrecision MAC 5000controller system) ve stereoloji software
(Stereo Investigator version 9.0, Microbrightfield, Colchester, VT) ataçmanlı ışık
mikroskop (Leica DM4000 B, Tokyo, Japan) altında yapıldı.94, 95
Çalışmamızda HT-29 hücre preparatları üzerinde tunel pozitifliği “Unbiased
Counting Frame and Fractionator” metodu112, 113 kullanılarak tüm gruplara ait her bir
preparattaki pozitif hücre yoğunluğu aşağıdaki formüle göre hesaplandı (Şekil4):
PHY = PHS/(ÇA x ÇS),
PHY; µm² alana düşen pozitif hücre yoğunluğu, PHS; pozitif hücre sayısı, ÇA;
çerçeve alanı (µm²) ve ÇS; çerçeve sayısı.
Elde edilen veriler her bir grup için iki tekrarlı ölçüme dayanmakta olup, her
gruptan 4 paralel preparat boyandı.
37
Şekil 3.1. Stereolojik “Optik Fractionator Frame” metodu ile tunel pozitifliğinin
değerlendirilmesi.
3.4. Kantitatif Real Time PCR (qRT-PCR) Analizleri
3.4.1. RNA İzolasyonu
Hücre kültürü̈ ortamından total RNA izolasyonu ticari kit kullanılarak üretici
firmanın önerileri dikkate alındı (Qiagen RNA Mini Kit, USA). İzolasyon kiti spin kolon
metoduna dayalı olup özetle,
-
mRNA’nın spin kolon membranına bağlanması,
-
mRNA dışındaki kirliliklerin uzaklaştırılması ve
-
Kolon membranından RNA’nın çözülerek steril toplama tüpü̈ içerisine
elüsyonu aşamalarından oluşmaktaydı.
İzole edilen total RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik yöntemle
miktarı belirlendi. Bu amaçla DNA/RNA ölçümleri için dizayn edilmiş̧ mikro hacimde
ölçüm yapabilen Nanodrop cihazı kullanıldı (u-Biotek, USA) ve 260/280 nm değerlerine
38
göre RNA konsantrasyonu ve saflığı cihaz üzerindeki yazılımla otomatik olarak
hesaplandı ve sonuçlar ng/μl olarak belirlendi.
3.4.2. cDNA Sentezi
Total RNA’dan cDNA sentezi QuantiTect Reverse Transcription Kiti (Cat No:
205313, Qiagen, USA) kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir örnek için ters transkriptaz
(reverse transkriptase) reaksiyon karışımı Tablo 3.1’de belirtildiği gibi hazırlandı. cDNA
sentezi, 200 µl’lik steril tüplerde Thermal Cycler PCR cihazı (Applied Bioscience, USA)
kullanılarak Tablo 3.2’de belirtilen sıcaklık ve süre şartlarında gerçekleştirildi.
Tablo 3.1. cDNA sentezi reaksiyon karışımı
İçerik
Reverse-transcription master mix
Quantiscript Reverse Transcriptase
(RNase inhibitörü içerir)
Quantiscript RT Buffer
Hacim (μl)
1 μl
4 μl
1 μl
RT Primer Mix
Template RNA
14 μl
20 μl
Total hacim
Tablo 3.2. cDNA sentezi için PCR sıcaklık ve süre basamakları
Basamak 1
Sıcaklık (°C)
Süre
Basamak 2
Basamak 3
Sıcaklık (°C) 42 Sıcaklık (°C) 42 Sıcaklık (°C) 95
Süre 2 dk
Süre 15 dk
Süre 3 dk
Basamak 3
Sıcaklık (°C) 4
∞
Elde edilen cDNA’ların konsantrasyonları spektrofotometrik yöntemle (μ-Biotek
Nanodrop, USA) ölçülerek kaydedildi ve cDNA’lar qRT-PCR (Roche, German) ile
rölatif kantitasyon analizleri yapılana kadar -20 ̊C’de saklandı.
3.4.3. Real Time PCR Cihazına Yükleme Aşaması
Öncelikle karışım hazırlanacaktır. Her bir örnek için;
39
-
8 μl distile su
-
5 μl probe master mix
-
2 μl her bir primer için TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4
ve LC3 primerlerinden)
-
5 μl cDNA
Standartlar İçin Hazırlanacak Mix;
-
8 μl distile su
-
5 μl probe master mix
-
2 μl G6PD primer standartı
-
Farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış standartlardan 5 μl cDNA
Standartların Hazırlanışı;
-
Standart 1: hiç sulandırma yapılmaz. Con:10000
-
Standart 2: standart1 den alınan 5 μl cDNA üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde
edilen Con :1000
-
Standart3: standart2 den alınan 5 μl cDNA üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde
edilen Con :100
-
Standart4: standart2 den alınan 5 μl cDNA üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde
edilen Con :10
-
Real Time PCR da Costom Assay PCR programı seçilir.
Preinkibasyon
-
1 cycles Analiz modu None.
-
95 te 10dk Ramprate 4.4
Cooling
-
1 Cycles Analis Mode None
-
40 te 30 sn None Ramp Rate: 2.2
40
Absolite Quantificationda değer elde edebilmemiz için 4 adet standart kullanılır.
Hazırlanan karışımlar plak üzerindeki her bir kuyucuğa uygun şekilde total hacim 20 μl
olacak şekilde yüklenecek ardından plaktaki yükleme cihazına tanıtıp program
başlatılacaktır. Real Time PCR programı tamamladıktan sonra Absolite Quantificatinda
analiz yapılıacak ve standartları baz alarak cihazın örneklere verdiği değerler not
edilecektir.
3.4.5. RT-PCR (Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) TP53, MDM2,
CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA Ekspresyonlarının
Ölçülmesi
Her bir örneğe ait cDNA’lar kullanılarak genlerinın ekspresyonları (BECLİN1,
ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3) Roche LightCycler 480 Real-Time
PCR cihazında çalışılacaktır. Cihazın 96 kuyucuklu PCR plağı vardır. PCR işlemleri
olurken, her bir kuyucuktaki amplifkasyon miktarını kantitatif olarak eş zamanlı verme
özelliğine sahiptir. Bir plağa her bir örnek 7 kuyu kullanılacak şekilde yükleme
yapılacaktır. Çalışmada 4 gen (TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4
ve LC3) ve farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış standart G6PD kullanılacaktır. Her bir
örnek için kullanılan 5μl cDNA, 8 μl ddH2O, 5 μl Probe Master mix 2 μl TP53, 2 μl
MDM2, 2 μl CDKN1A 2 μl, CDKN1B, 2 μl BECLİN1, 2 μl ATG4 ve 2 μl LC3 primerleri
aktarılacaktır.
3.4.6. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri
mRNA Ekspresyon Tayininde Roche Lightcycler 480 Real-Time PCR Cihazı
Real Time PCR da Costom Assay PCR programı seçilir. Absolite Quantificationda
değer elde edebilmemiz için 4 adet standart kullanılır. Hazırlanan karışımlar plak
üzerindeki her bir kuyucuğa uygun şekilde total hacim 20 μl olacak şekilde yüklenecektir.
41
Ardından plaktaki yükleme cihaza tanıtıp program başlatılır. Real Time PCR programı
tamamladıktan sonra Absolite Quantificatinda analiz yapılarak standartları baz alarak
cihazın örneklere TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 verdiği
değerler not edilecektir.
3.5. İstatistiksel Analiz
MTT sonuçlarının analizi için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) sonrası
Duncan Post hoc testi kullanıldı. Önemlilik değeri (P) 0.05 olarak kabul edildi. TP53,
MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 gen ekspresyon seviyelerinin
belirlenmesinde referans (Housekeeping) gen olarak G6DP kullanıldı. TP53, MDM2,
CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 için hedef Gen/referans gen oranı
alınarak normalize edildi.
42
4. BULGULAR
4.1. MTT Sitoksisite Sonuçları
MTT analizleri sonuçlarının değerlendirmesinde, 24 saat inkübasyonu sağlanan
gruplarda cisplatin uygulamasının sitotoksik etkisinin önemli oranda fazla olduğu
belirlenirken, 48 saat inkübasyon gruplarında cisplatin ve melatonin (5µM) ile cisplatin
uygulanan gruplarda da cisplatine yakın bir sitotoksik etki görülürken, yüksek dozda
melatonin uygulamasının sitotoksik etkisinin çok az olduğu (Tablo 4.1 ve Şekil 4.1).
Tablo 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen
HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçlar
Gruplar
24h
48h
Kontrol
0.854±0.08a
0.751±0.11a
Mel-5µM
0.839±0.13a
0.696±0.23b
Mel-10µM
0.863±0.21a
0.728±0.19a
Cisplatin
0.728±0.14b
0.622±0.12b
Mel-5µM-Cis
0.847±0.17a
0.649±0.15b
Harflendirmeler gruplar arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir.
48h
24h
Kontrol
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Şekil 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen
HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçları
43
4.2. Tunel Analizi Sonuçları
Tunel pozitif hücrelerin değerlendirmesinde, Kontrol, Mel-5µM ve Mel-10µMCis uygulanan 24 saat inkübe edilen HT-29 hücreleri tünel pozitif hücre yoğunlukları
arasında önemli bir farklılığın olmadığı görülürken (P>0.05), sadece cisplatin uygulanan
HT-29 hücrelerinde önemli tünel pozitif hücre yoğunluğunda önemli oranda artışın
olduğu belirlendi (P<0.05), (Tablo 4.2).
Ayrıca, 48 saat süreli inkübasyon grubunda Cisplatin ve Mel-5µM- Cis grupları
tünel pozitif hücre yoğunluğunun diğer gruplara göre önemli oranda yüksek olduğu
görülürken (P<0.05), Mel-5µM ve Mel-10µM grupları tünel pozitif hücre yoğunluğunun
kontrol grubu ile aralarında anlamlı bir farklılığın olmadığı belirlendi (P>0.05), (Tablo
4.2).
Tablo 4.2. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen
HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait 1000 µm2 alandaki Tunel pozitif hücre
yoğunlukları
Gruplar
24h
48h
Control
0.101±0.04a
0.151±0.02a
Mel-5µM
0.115±0.02a
0.167±0.03a
Mel-105µM
0.146±0.03a
0.203±0.04a
Cisplatin
0.235±0.04b
0.426±0.07b
Mel-5µM-Cis
0.165±0.07a
0.278±0.06c
Harflendirmeler gruplar arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir.
44
Şekil 4.2. Kontrol grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait
tunel boyaması görüntüsü
Şekil 4.3. Mel-5µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait
tunel boyaması görüntüsü
45
Şekil 4.4. Mel-10µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına
ait tunel boyaması görüntüsü
Şekil 4.5. Cisplatin grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait
tunel boyaması görüntüsü
46
Şekil 4.6. Mel-10µM- Cis grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü
Şekil 4.7. Kontrol grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait
tunel boyaması görüntüsü
47
Şekil 4.8. Mel-5µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait
tunel boyaması görüntüsü
Şekil 4.9. Mel-10µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına
ait tunel boyaması görüntüsü
48
Şekil 4.10. Cisplatin grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına
ait tunel boyaması görüntüsü
Şekil 4.11. Mel-10µM- Cis grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre
hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü
49
4.3. mRNA ekspresyonu Değerleri Sonuçları
4.3.1. TP53 mRNA ekspresyonu değerleri
TP53 mRNA ekpsresyonu analizinde, 24 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri
hücrelerinde Cisplatin ve Mel-5µM gruplarının ekspresyonu seviyelerinin Kontrol
grubuna göre yüksek olduğu tespit edilirken edilen, Mel-10µM ve Mel-10µM- Cisplatin
gruplarının ekpresyonlarının Kontrol grubuna yakın olduğu belirlendi (Tablo 4.3 ve Şekil
4.12).
50
Tablo 4.3. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Control
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
TP53
Geni
26.83
27.37
28.23
27.49
25.65
27.80
26.23
25.78
25.79
26.62
G6PD
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
TP53/G6PD
0.184
0.472
0.241
0.412
0.159
0.175
0.160
0.232
0.402
0.300
Şekil 4.12. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri.
51
4.3.2. MDM2 mRNA ekspresyon değerleri
MDM2 mRNA ekspresyonu değerlendirmesinde, özellikle Mel-5µM ve Cisplatin
grupları ekspresyonunun 24 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücrelerinde yüksek
olduğu belirlenirken, Mel-10µM grubunda ekspresyonun kontrol grubuna göre yüksek
olduğu fakat Mel-5µM-Cis grubunda ise düştüğü belirlendi. Kırk sekiz saat inkübasyonlu
grupta ise en yüksek mRNA ekspresyonunun Mel-5µM-Cis grubunda olduğu görülürken,
diğer gruplardaki nRNA ekspresyonu seviyelerinin düştüğü belirlendi (Tablo 4.4 ve Şekil
4.13).
52
Tablo 4.4. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Control
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Control
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
MDM2
Geni
26.67
24.56
24.74
24.10
22.76
24.35
23.95
23.16
23.71
23.40
G6PD
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
MDM2/G6PD
1.636
3.317
2.694
4.313
1.184
1.924
0.777
1.427
1.699
2.797
Şekil 4.13. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri.
53
4.3.3. CDKN1A (P21) mRNA ekspresyonu değerleri
Yirmi dört saat süreli inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücreleri CDKN1A
mRNA ekspresyonu analizinde, en yüksek ekpresyonun Cisplatin grubunda olduğu
görülürken Mel-5µM grubunda önemli bir artış görülürken diğer gruplardaki artışın
kontrol grubu değerine yakın olduğu belirlendi. Kırk sekiz saat inkübasyon grubunda ise
en yüksek değerlerin Cisplatin ve Mel-5µM-Cis gruplarında olduğu belirlendi. Diğer
gruplardaki artışın Kontrol grubu değerine yakın olduğu görüldü (Tablo 4.5 ve Şekil
4.14).
54
Tablo 4.5. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
CDKN1A
Geni
27.08
26.70
27.50
24.77
25.19
26.80
26.96
25.93
24.29
24.58
G6PD
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
CDKN1A/
G6PD
0.154
0.748
0.398
2.720
0.220
0.350
0.096
0.210
1.139
1.234
Şekil 4.14. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri.
55
4.3.4. CDKN1B (P27) mRNA ekspresyonu değerleri
CDKN1B mRNA analizinde 24 saat süreli inkübasyonlu grupta Mel-5µM
grubunda ekspresyon seviyesinde yükseliş görülürken diğer grupların ekpresyon
değişiminin Kontrol grubuna yakın oldukları belirlendi. Kırk sekiz saat süreli
inkübasyonlu tüm grupların CDKN1B mRNA seviyelerinin Kontrol grubuna göre
azaldığı tespit edildi (Tablo 4.6 ve Şekil 4.15).
56
Tablo 4.6. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
CDKN1B
Geni
26.79
27.63
28.58
28.81
26.21
26.74
25.34
25.37
26.04
27.05
G6DP
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
CDKN1B/
G6PD
0.189
0.399
0.188
0.164
0.108
0.365
0.295
0.308
0.337
0.222
Şekil 4.15. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri.
57
4.3.5. BECLİN1 mRNA ekspresyonu değerleri
BECLİN1 mRNA ekspresyonu analizi BECLIN1/G6PD sonucuna bakıldığında,
24 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücreleri en yüksek ekspresyon değerinin Mel5µM, Mel-10µM ve Cis gruplarında olduğu görülürken, Kontrol ve Mel-5µM-Cis
gruplarında ekspresyonun azaldığı belirlendi. Diğer taraftan 48 saat inkübasyonlu HT-29
kolon kanseri hücrelerinde, Kontrol, Cisplatin ve Mel-5µM-Cis gruplarında BECLİN1
mRNA ekspresyonunun arttığı belirlenirken, Mel-5µM ve Mel-10µM gruplarının
ekspresyon değerinin kontrole göre düşük olduğu belirlendi (Tablo 4.7. ve Şekil 4.16).
58
Tablo 4.7. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Kontrol
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Kontrol
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
BECLIN1
Geni
25.90
26.85
27.04
27.11
25.19
26.37
25.34
25.12
25.28
25.93
G6PD
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
BECLIN1
/G6PD
0.349
0.678
0.548
0.537
0.220
0.473
0.295
0.368
0.570
0.483
Şekil 4.16. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri.
59
4.3.6. ATG-4 mRNA ekspresyonu değerleri
ATG-4 mRNA ekspresyonu analizinde ATG-4/G6PD seviyelerinde, 24 saat
süreli kolon kanseri hücreleri 24 saat inkübe edilen ve Cisplatin ve Mel-10µM gruplarının
ATG-4 mRNA seviyelerinin Kontrol ve diğer 24 saat inkübasyonlu gruplara göre yüksek
olduğu ve belirlenirken, en düşük değerin ise Mel-10µM-Cis grubunda olduğu belirlendi.
mRNA ekspresyonu 48 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücrelerinin ATG-4
seviyelerinde ise en yüksek ekspresyonun Cisplatin ve Mel-10µM-Cis gruplarında
olduğu görülürken, en düşük değerin Mel-5µM grubunda olduğu tespit edildi (Tablo 4.8
ve Şekil 4.17).
60
Tablo 4.8. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Control
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
ATG-4
Geni
27.78
28.59
29.18
29.06
27.32
28.12
27.36
26.90
26.77
27.25
G6PD
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
ATG4/G6PD
0.095
0.202
0.124
0.139
0.051
0.140
0.074
0.107
0.203
0.193
Şekil 4.17. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri.
61
4.3.7. LC3 mRNA ekspresyonu değerleri
LC3 mRNA ekspresyon seviyelerine bakıldığında 24 saat süreli inkübasyon
grubunda Mel-10µM ve Cisplatin gruplarında ekspresyonun önemli oranda arttığı
belirlenirken, diğer gruplardaki değerler Kontrol grubuna yakındılar. Kırk sekiz saat
inkübasyonu yapılan grupta ise Cisplatin ve Mel-5µM-Cis gruplarında önemli bir artış
belirlendi.
Mel-5µM
ve
Mel-10µM
gruplarında
ise
Kontrol
grubuna
göre
ekspresyonlarında azalış belirlendi (Tablo 4.8 ve Şekil 4.18).
62
Tablo 4.9. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri.
48 Sa
24 Sa
Süre Gruplar
Control
Mel-5µM
Mel-10µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
Control
Mel-5µM
Mel-105µM
Cisplatin
Mel-5µM-Cis
LC3 Geni
30.67
31.24
30.11
30.23
29.57
30.04
29.34
29.31
27.09
27.72
G6PD
Geni
24.38
26.29
26.17
26.21
23.00
25.29
23.59
23.68
24.48
24.88
LC3/G6PD
0.013
0.032
0.065
0.061
0.011
0.037
0.019
0.021
0.163
0.140
Şekil 4.18. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe
edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri.
63
5. TARTIŞMA
Bu tez çalışmasında in vitro şartlarda, insan kolon kanseri hücre hattında (HT-29)
melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının hücre sitotoksitesi, apoptotik hücre ölümü
ve otofaji ile ilgili gen bölgelerinin ekspresyon seviyeleri üzerine etkilerinin araştırılması
amaçlandı. Bu amaçla kolon kanser hücrelerine 5-nM ve 10-nM konsantrasyonlarında
melatonin ile 50-M konsantrasyonda cisplatin uygulayarak 24 ve 48 saat süre ile inkübe
edilerek tünel yöntemi ile apoptotik hücre yoğunluğu belirlenirken, kantitatif real-time
PCR yöntemiyle BECLİN1, ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3 genleri
ekspresyonu seviyeleri analiz edildi. Çalışmada uygulanan melatonin ve cisplatin dozları
daha önce yayınlanan çalışmalara göre belirlenmiştir.96
Kolorektal kanseri kanser türleri arasında en çok görülen dördüncü kanser türü
olup, mortalite yönünden ise akciğer kanserlerinden sonra ikinci sıradadır. Kolon kanseri
100.000 kadında 37.5 insidans ile ve 14.1 mortalite oranıyla seyrederken, erkeklerde bu
oran 100.000’de 52.2 insidans ve 20.5 mortalite ile görülmektedir.97 Kolon kanseri
tedavisinde kemoterapi süresince, hastaların tedaviye cevap vermemesi veya tedavi
sonrası kanserin tekrarlaması sıklıkla görülen bir durumdur.98 Diğer taraftan meme
kanseri tedavisinde klinikte sıkça kullanılan ilaçların direnç geliştirme özelliklerinin
olduğu, bu yolla meme kanseri tedavisinde bir takım başarısızlıkların yaşandığı
bilinmektedir. Yapılan araştırmalar, yeni terapotik yöntemlerin geliştirilmesine olan
ihtiyacı ortaya koymaktadır. Bu sebeple, kanser öncesi ve sonrası doğal antioksidan ve
anti-kanserojen maddelerin kullanımı ile hücre ölümlerinin indüklenmesi günümüzde
kanser tedavisi için sıklıkla araştırılmaktadır. Kanser hücresi apoptotik yolaklarında
bulunan, tümör mikro çevresinde rol alan, büyüme faktörlerini ve reseptörlerini kodlayan
ve hücre siklusunda rol olan bazı genlerin ekspresyon düzeylerindeki değişimlerin
64
malignant süreçte ya da dirençli hücreler üzerinde artan bölünme özelliğine katkıda
bulunduğu düşünülmektedir.
In vitro hücre kültürü çalışmaları ile üretilen hücreler kontrollü bir şekilde çeşitli
uygulamaların yapılabilmesine olanak sağlarken, direkt olarak uygulanacak madde ile
hücrenin direk teması sağlanır. Böylece uygulamaların hücreler üzerine olan etkilerinin
analizi yapılabilmektedir. Hücre kültürü̈ elde etme teknikleri, özellikle 1950 ve 1960'lı
yıllarda virüslerin memeli hücrelerinde üretilmesi ile bu yöntem gelişme göstermiştir.
Son yıllarda deneysel kanser araştırmaları ve kök hücre konusunun bilimsel olarak
öneminin ortaya çıkması da bu yöntemi popüler yapmıştır.92 Bizim çalışmamızda HT-29
kolon kanseri hücrelerine hatlarını kullanarak melatonin, cisplatin ve melatonin-cisplatin
kombine uygulamalarının apoptoz ve otofaji ile ilişkili bazı genler üzerine olan muhtemel
etkilerini araştırdık.
Çalışma MTT analizinde güçlü bir antioksidan olan melatonin ile yüksek toksik
etkiye sahip cisplatinin kombine uygulanmaları ile bu maddelerin toksik etki düzeyinin
24 saat süreli inkübasyon peryotlarında cisplatinin toksik etkisinin önemli oranda azaldığı
belirlenirken, 48 saat süreli inkübasyon kombine uygulamanın cisplatin toksisitesini
istatistiksel olarak önemsiz oranda azalttığı belirlendi. Yapılan çalışmalarda melatonin
uygulamasının nöroblastoma kanser hücrelerine uygulanan cisplatinin toksik etkisini
azalttığı rapor edilmiştir.96 Diğer taraftan yapılan birçok çalışmada cisplatinin birçok
organ üzerine toksik etkilerinin olduğu rapor edilirken,99,
100
melatoninin antioksidan
etkisi birçok çalışmada belirtilmiştir.101, 102 Bizim çalışmamızda kolon kanseri hücrelerine
uygulanan melatoninin antioksidan özellikleri ile hücrede redoks dengesini değiştirdiği
ve bazı hücre içi enzimleri aktive ederek hücrede ölüm mekanizmalarını uyarabileceği
belirlendi.
65
Melatonin birçok tür kanser üzerinde büyümeyi baskılayıcı bir etki
göstermiştir.103-105 Melatoninin bu etkisinin antioksidan etkisi ile hücrede bazı enzimlerin
aktivitesini
sağlayarak
hasarlı
hücrenin
ortadan
kaldırılması
özelliğine
dayandırılmaktadır.103 Kanser hücrelerinde ölüm mekanizmalarında meydana gelen
defektler neoplastik patogenezde çalışılmaktadır.106 Çalışmada melatonin ve cisplatin ile
kombine uygulanmıştır. Doz ve zamana bağlı olarak apoptotik aktivasyonu üzerine
etkileri araştırıldığı çalışmada melatonin uygulamasının özellikle 24 saat inkübasyon
grubunda ve cisplatin ile kombine uygulanan 24 ve 48 saat inkübasyonlu gruplarda
apoptotik aktivitenin kontrol grubuna göre yüksek olduğu belirlendi. Diğer taraftan
apoptotik aktivitede rol alan TP53 geni ekspresyonunun 24 saatlik inkübasyon grubunda
melatonin ve cisplatin uygulanan gruplarda 48 saat inkübasyonlu özellikle melatonin ve
cisplatin kombine ve cisplatin grubunda arttığı belirlendi. TP53 inhibitorü olarak bilinen
MDM2 gen seviyelerine bakıldığında ise 24 saat süreli melatonin ve cisplatin grubunda
48 saat süreli melatonin ve cisplatin kombine grupta ekspresyonun arttığı tespit edildi.
p53 geni mutasyonları birçok kanser türünde sık görülen bir durumdur.107 Bu gen,
sitotoksik ajanlara karşı tümör hücrelerinin duyarlılığının önemli bir belirteci ve DNA
hasarında hücresel cevabın oluşmasını temin etmektedir. p53 gen bölgesinin sentezlediği
p53 proteini, hücrede kısa süreli sentezlendiği için normal hücrelerde çok fazla
birikememektedir. Fakat tümör hücrelerinde mutant p53 miktarı, DNA hasarına bağlı
olarak çok miktarda sentezlenmektedir.108 Rapor edilen birçok çalışmada kanser
hücrelerinde p53 mutasyonları aracılı apoptoz mekanizmasının devre dışı kaldığını
bildirilmiştir.107 Kaabinejadian ve ark. MCF-7 hücre hattına adriamisin uygulaması ile
p53 miktarının azaldığını belirlerken,109
Singh ve ark. resveratrol ve siklofosfamit
uygulaması ile p53 ekspresyonunun arttığını rapor etmişlerdir.110 Ayrıca resveratrol
uygulaması ile meme kanseri hücrelerinde p53 ekspresyonunun arttığı ve bu yolla
66
tümöral hücrelerde apoptozisin uyarıldığı rapor edilmiştir.12 Çalışma sonucunda
melatonin ve cisplatin-melatonin kombine uygulamalarının TP53 geni mRNA
ekspresyonunu arttırdığı belirlenirken melatonin ve cisplatin uygulamasının 48 saat süreli
inkübasyonda kombine uygulamasının etkili olduğu belirlendi.
P53 geni tarafından sentezi kontrol ettiği p21 (CDKN1A) geni, hücre döngüsünü
kontrol eden CDK’ların sentezini sağlamaktadır. Bu sebeple p53 gen bölgesinde
mutasyon geçirmiş hücreler üzerinde kontrolsüz bir hücre artışı meydana gelir.111 Ayrıca
p32 geni tümör büyümesinin baskılanması ve proliferasyonun kontrolü gibi farklı
hücresel süreçlerin regülasyonu için anahtar bir proteindir.112 Bizim çalışmamızda
CDKN1A (p21) geni mRNA ekspresyonunun 24 saat süreli inkübe edilen melatonin 5nM ve cisplatin grubu ile 48 saat inkübasyonlu cisplatin ve kombine melatonin-cisplatin
gruplarında seviyenin önemli oranda attığı belirlendi. Chen ve ark., çalışmalarında
ultraviyole ile uyarılan keratonosit hücrelerinde p21 geninin seviyesinin arttığını ve p21
geni baskılanan (knockout gen) hücrelerde ise seviyenin azaldığını belirlemişlerdir.113
Han ve ark., ise çalışmalarında Camptothecin uygulamasının p53 geni üzerinden p21 geni
ekspresyonunu arttırdığını rapor etmiştir.114 Çalışma bulgularımızın literatüre ile
benzerlik gösterdiği ve 24 saat süreli inkübasyonda melatonin ve cisplatin
uygulamalarının, 48 saat süreli inkübasyonda ise cisplatin ve kombine melatonin ve
cisplatin uygulamalarının CDKN1A (p21) ekspresyon seviyesi üzerine arttırıcı bir etki
gösterdiği belirlenmiştir.
Siklinler hücrede bölünme kontrollerini sağlayan inhibitörlerdir. Siklin ailesi türü
olan CDKN1B (p27) siklusun G2/M geçişini kontrol ederken transforming growth factor
(TGF)-beta’nında baskılayıcısıdır.115 İnsan kanser türlerinde p27 seviyesinde genel bir
düşüşün olduğu rapor edilmesine rğmen, çoğ epitel dokuda (meme dokusu epiteli, akciğer
epiteli, ovaryum epiteli gibi) p27 ekpresyonunun yüksek olduğu bildirilmektedir.115
67
Ayrıca Palmqvist ve ark., p27 ekspresyonu seviyesinin gastrointestinal sistem malignant
prognoz için önemli bir marker olabileceğini rapor etmiştir.116 Bizim bulgularımızda ise
özellikle 24 saat inkübasyonlu 5nM melatonin konsantrasyon grubunun p27 seviyesini
arttırdığı görülmüştür.
Kanser hücrelerinde otofaji genetiksel yöntemlerle veya ilaç uygulamalarıyla
engellenmesi sayesinde tümör hücrelerinin öldürülebileceği ve apoptotik hücre ölümünün
başlatılabileceği bildirilmektedir. Bu çalışmada melatonin ve cisplatinin kombine ve
yalnız otofajik etkinlikleri ortaya konmaya çalışılmıştır. Melatonin ve ciplatin
uygulamalarının 24 saat süreli inkübasyonda ve 48 saat süreli uygulamalımızda ise
cisplatin uygulamasının BECLİN1 mRNA ekspresyonunu arttırdığı belirlendi. Atg-4 ve
LC-3 mRNA seviyelerine bakıldığında ise 24 saat süreli melatonin ve cisplatin grupları
ile 48 saat uygulamalı cisplatin ve melatonin-Cisplatin kombine uygulamalarının artışa
sebep olduğu tespit edildi. Bu otofajik gen bölgelerindeki artış ile uyarılan otofajik hücre
ölümü kanser gelişimini durdurduğu bir çok çalışmada rapor edilmiştir. Yapılan bir başka
çalışmada bazı anti-deprasantların (maprotiline ve fluoxetine) apoptozis-dirençli kanserli
hücrelerde otafajiyi harekete geçirerek kanser gelişimini durdurduğu bildirilmiştir.65
BECLİN1 geninin otofajik etkisi ve tümör süpresör özelliği bildirilmiştir. Diğer taraftan
BECLİN1 seviyesindeki düşüşün insanda meme, ovaryum ve prostat kanserlerine neden
olmaktadır.58-60 Sasaki ve ark., çalışmalarında Chloroquine ve 5-fluorouracil
uyguladıkları kolon kanserlerinde LC-3 protein miktarının arttığını belirlemişlerdir.117
Diğer taraftan laboratuvarımızda bortezomib uyguladığımız kolon kanserlerinde de
benzer olarak LC-3 protein miktarının arttığı tespit edildi (yayınlanmamış bilgi). Diğer
taraftan Atg-4 geni ekspresyonunun otofaji aktivitesi için gerekli olduğu rapor
edilmiştir.118 Bizim bulgularımızdan 24 saatlik melatonin ve cisplatin uygulanan gruplar
68
ile 48 saat süreli cisplatin ve kombine cisplatin-melatonin uygulanan gruplarda otofajik
etkinliğin arttığı belirlenmiştir.
Sonuç olarak, kolon kanser hücrelerinin çeşitli dozlarda ve sürelerde uygulanan
melatonin ve/veya cisplatin uygulamaları hücrede oluşan cisplatin toksititesini azalttığı
belirlenirken, apoptotik hücre ölümünü arttırdığı ve otofajik gen ekspresyonlarında artışa
sebep oluğu real time-PCR analizleri sonucunda tespit edilmiştir. Melatonin ve cisplatin
kombine uygulamalarının ve melatonin kolon kanseri tedavisinde koruyucu ve tedavi
amaçlı olarak kullanılabilecek bir ajan olabileceği sonucuna varılabilmektedir.
69
6. SONUÇ VE ÖNERİLER
Çalışma bulguları doğrultusunda 5 ve 10 nM dozlarda melatonin, 50 M dozda
cisplatin ile melatonin-Cisplatin kombine uygulamalarının HT-29 kolon kanseri üzerine
apoptotik ve otofajik etkilerin değerlendirilmesinde;
- Uygulanan maddelerden cisplatinin kolon kanseri üzerine sitotoksik olduğu
belirlenirken, melatonin uygulaması ile toksik etkinin 24 ve 48 saat uygulama
periyotlarında azaltıldığı belirlendi.
- Cisplatin 24 ve 48 saat uygulama periyotlarının her ikisinde de apoptotik ve
otofajik aktiviteleri arttırdığı tespite edildi.
- Melatonin uygulamasının tek başına özellikle 24 saatlik inkübasyon
periyodunda apoptotik ve otofajik gen bölgelerini etkileyerek aktiviteyi arttırdığı
belirlendi.
- Melatonin ile cisplatin uygulamasının hem sitotoksik etkisi az bulunurken, aynı
zamanda apoptotik ve otofajik etkiyi arttırıcı olduğu belirlendi.
70
KAYNAKLAR
1.
Kutluk T, Kars A. Kanser Konusunda Genel Bilgiler. Baskı. Türk Kanser
Araştırma ve Savaş Kurumu Yayınları, 1994.
2.
Wiencke JK, Zheng S, Lafuente A, Lafuente MJ, Grudzen L, Wrensch MR, Miike
R, Ballesta A, Trias M. Aberrant methylation of p16INK4a in anatomicand
gender-specific subtypes of sporadic colorectalcancer. Cancer Epidemiology,
Biomarkers & Prevention, 1999, 8: 501-506.
3.
Lee M, Han WS, Kim OK, Sung SH, Cho MS, Lee SN. Prognostic value of
p16INK4a and p14ARF gen hypermethylation in human colon cancer. Pathology,
Research and Practice, 2006, 202: 415-424.
4.
Şimşek F, Vatansever HS. Apoptotik ve Otofajik Ölümlerde Hücre İçi
Organizasyon. Yeni Tıp Dergisi, 2014, 31: 6-11.
5.
Çelik S. Kronik myeloid hastalarda DAP kinaz geninin metilasyon analizi.
Biyoteknoloji Enstitüsü. Ankara: Ankara Üniversitesi, 2007.
6.
Stordal B, Davey M. Understanding cisplatin resistance using cellular models.
IUBMB Life, 2007, 59: 696-699.
7.
Apostolou P, Toloudi M, Chatziioannou M, Ioannou E, Knocke DR, Nester J,
Komiotis D, Papasotiriou I. AnvirzelTM in combination with cisplatin in breast,
colon, lung, prostate, melanoma and pancreatic cancer cell lines. BMC Pharmacol
Toxicol, 2013, 14: 18.
8.
Mansour HH, Hafez HF, Fahmy NM. Silymarin modulates Cisplatin-induced
oxidative stress and hepatotoxicity in rats. Journal of biochemistry and molecular
biology, 2006, 39: 656-661.
9.
Kozuch P, Grossbard ML, Barzdins A, Araneo M, Robin A, Frager D, Homel P,
Marino J, DeGregorio P, Bruckner HW. Irinotecan combined with gemcitabine,
5-fluorouracil, leucovorin, and cisplatin (G-FLIP) is an effective and
noncrossresistant treatment for chemotherapy refractory metastatic pancreatic
cancer. Oncologist, 2001, 6: 488-495.
10.
Carlson LE, Campbell TS, Garland SN, Grossman P. Associations among salivary
cortisol, melatonin, catecholamines, sleep quality and stress in women with breast
cancer and healthy controls. J Behav Med, 2007, 30: 45-58.
11.
Sudhakar
A. History of Cancer, Ancient and Modern Treatment Methods.
Journal Cancer Sci Ther., 2009 December 1, 1: 1–4.
71
12.
Kara A. Resveratrolün meme kanseri hücre kültüründeki p53 aracılı apoptoz
aktivasyonunun ve sitotoksisitesinin polimeraz zincir reaksiyonu (pcr),
immunsitokimya ve mtt yöntemleriyle araştırılmas Sağlık bilimleri enstitüsü,
Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı. Doktora, Erzurum: Atatürk Üniversitesi,
2012.
13.
Merlo LM, Pepper JW, Reid BJ, Maley CC. Cancer as an evolutionary and
ecological process. Nature Reviews Cancer, 2006, 6: 924-935.
14.
Çevik Ö, Aydın U, Gürsoy RN. Kanser Tedavisinde Lenfatik Hedeflendirme.
Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi, 2012, 32: 67-90.
15.
Bayram S. CHEK2 Genindeki Mutasyonlar ile Hepatoselüler Kanser ve
Kolorektal Kanser Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Fen Bilimleri Enstitüsü.
Adana: Çukurova Üniversitesi, 2010.
16.
Düngül DÇ. Sporadik kolorektal kanser vakalarında genom ebadında tek nükleotit
polimorfizm profilinin belirlenmesi ile yeni genetik yatkınlık genlerinin ve
kanserin gelişmesinde etken olan genlerin belirlenmesi. Biyoteknoloji Enstitüsü.
Ankara: Ankara Üniversitesi, 2011.
17.
Gürbüzel M. Kolorektal Karsinomlarda P16 Ekspresyonu ve Prognostik
Parametrelerle Karşılaştırılması. Patoloji Bölümü. Uzmanlık, İstanbul: T.C.
Sağlık Bakanlığı Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi, 2008.
18.
Yokus B, DÜ. Ü. Kanser Biyokimyası Dicle Üniv Vet Fak Dergisi, 2012, 1: 7-18.
19.
Öner P. Kanser Biyokimyası. İçinde:Gürdöl F, Ademoğlu E (editörler).
Biyokimya, Gözden Geçirilmiş 2 Baskı. İstanbul, Nobel Tıp Kitabevleri, 2013:
653-674.
20.
http://www.kanser.gov.tr/daire-faaliyetleri/kanser-kayitciligi/108t%C3%BCrkiyede-kanser-kayitcigi.html; Sağlık istatistikleri yıllığı, 2012. Sağlık
Bakanlığı. Sağlık Araştırmaları Genel Müdürlüğü. 12.12.2014.
21.
Haggar FA, Boushey RP. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality,
survival, and risk factors. Clinics in Colon and Rectal Surgery, 2009, 22: 191-197.
22.
Rudy DR, MJ. Z. Update on colorectal cancer. AM Fam Phy, 2000, 61: 1759–
1769.
23.
Garcea G, A., Sharma RA, Dennison A, Steward WP, Gescher A, Berry DP.
Molecular biomarkers of colorectal carcinogenesis and their role in surveillance
and early intervention. European Journal of Cancer, 2003, 39(8): 1041-1052.
72
24.
Society AC. Colorectal Cancer Facts & Figures 2011-2013. 2011.
25.
O’Connell JB, Maggard MA, Liu JH, Etzioni DA. Rates of colon and rectal
cancers are increasing in young adults. The American Surgeon, 2003 69: 866–872.
26.
Howlader N, Noone AM, Krapcho M, Garshell J, Miller D, Altekruse SF, Kosary
CL, Yu M, Ruhl J, Tatalovich Z, Mariotto A, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ,
Cronin KAe. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2012. Baskı. Bethesda,
National Cancer Institute, 2008.
27.
Bethesda M, PH. G. Malignant Neoplasms of the Colon. . In: Gordon PH,
Nivatvongs S (Eds.) Principles and Practice of Surgery for the Colon, Rectum,
and Anus. rd Ed. , Informa Healthcare USA Inc, 2007, 3: 489- 643.
28.
De Jong AE, Morreau H, Nagengast FM, Mathus-Vliegen EMH, Kleibeuker JH,
Griffioen G, Cats A, Vasen HFA. Prevalence of adenomas among young
individuals at average risk for colorectal cancer. The American journal of
gastroenterology, 2005, 100(1): 139-143.
29.
Davies RJ, Miller R, Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for
molecular stool analysis. Nature Reviews Cancer, 2005, 5: 199–209.
30.
Baykan A, Zoroğlu A, Geçim E, Terzi C. Kolon ve rektum kanserleri. Türk Kolon
ve Rektum Cerrahisi Derneği, 2010: 15-30.
31.
Jackson-Thompson J, Ahmed F, German RR, Lai SM, Friedman C. Descriptive
epidemiology of colorectal cancer in the United States. Cancer Epidemiology,
Biomarkers & Prevention, 2006, 107: 1103–1111.
32.
Baker SK , Fearon ER , Nigro JM , Hamilton SR , Preisinger AC , Jessup JM , .
e. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutationsin colorectal carcinoma.
Science, 1989, 244: 217-221.
33.
FA H, RP B. Colorectal cancer epidemiology:incidence, mortality, survival, and
risk factors. Clin Colon RectalSurg, 2009, 22: 191-197.
34.
Sinha R. An epidemiologic approach to studying heterocyclic amines. Mutation
Research, 2002, 506–507: 197–204.
35.
Kabat GC, Miller AB, Jain M, Rohan TE. A cohort study of dietary iron and heme
iron intake and risk of colorectal cancer in women. British Journal of Cancer,
2007, 97: 118-122.
73
36.
Santarelli RL, Pierre F, Corpet DE. Processed meat and colorectal cancer: a
review of epidemiologic and experimental evidence. Nutrition and Cancer, 2008,
60: 131–144.
37.
Yıldız MK. Evre I-Iıı Kolon Kanserinde Prognostik Faktörlerin Araştırılması. İç
Hastalıkları Anabilim Dalı. Edirne: T.C. Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi, 2008.
38.
Zisman AL, Nickolov A, Brand RE, Gorchow A, Roy HK. Associations between
the age at diagnosis and location of colorectal cancer and the use of alcohol and
tobacco: implications for screening. Archives of Internal Medicine, 2006, 166:
629-634.
39.
Tsong WH, Koh WP, Yuan JM, Wang R, Sun CL, Yu MC. Cigarettes and alcohol
in relation to colorectal cancer: The singapore chinese health study. British
Journal of Canser, 2007, 96: 821–827
40.
Botteri E, Iodice S, Raimondi S, Maisonneuve P, Lowenfels AB. Cigarette
smoking and adenomatous polyps: a meta-analysis. Gastroenterology, 2008, 134:
388–395.
41.
Poschl G, Seitz HK. Alcohol and cancer. Alcohol and alcoholism, 2004, 39: 155–
165.
42.
Tomatır AG. Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü. Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri
Dergisi, 2003, 23: 499-508.
43.
Altunkaynak BZ, Özbek E. Programlanmış Hücre Ölümü: Apoptoz Nedir? Tıp
Araştırmaları Dergisi, 2008, 6: 93-104.
44.
Sanmartín C, Plano D, Palop JA. Selenium compounds and apoptotic modulation:
a new perspective in cancer therapy. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2008,
8: 1020-1031.
45.
Kosova F, Arı Z. Prostat kanseri ve apoptozis ilişkisi. Klinik ve Deneysel
Arastırmalar Dergisi, 2011, 2: 124-131.
46.
Zou H, Henzel W, Liu X, Lutschg A, Wang X. Apaf-1, a Human Protein
Homologous to C. elegans CED-4, Participates in Cytochrome c–Dependent
Activation of Caspase-3. Cell, 1997, 90: 405-413.
47.
Pourkarimi E, Greiss S, Gartner A. Evidence that CED-9/Bcl2 and CED-4/Apaf1 localization is not consistent with the current model for C. elegans apoptosis
induction. Cell Death and Differentiation, 2012, 19: 406-415.
74
48.
Cadabak H. Hücre Siklusu ve Kanser. ADÜ Tıp Fakültesi Dergisi, 2008, 9: 5161.
49.
Gatenby RA, Gillies RJ. Why do cancers have high aerobic glycolysis?. . Nature
Reviews Cancer, 2004, 4: 891-899.
50.
Olah E. Basic Concepts of Cancer: Genomic Determination. The Journal of The
International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2005,
16.
51.
Arslan DÖ, Korkmaz G, Gözüaçık D. Otofaji: Bir Hücresel Stres Yanıtı ve Ölüm
Mekanizması. Acıbadem Universitesi Sağlık Bilimleri Dergisi, 2011, 2: 184-194.
52.
Yang ZJ, Chee CE, Huang S, Sinicrope FA. The role of autophagy in cancer:
Therapeutic implications. . Moleculer Canser Therauticus, 2011, 10: 1533-1541.
53.
Chen S, Rehman SK, Zhang W, Wen A, Yao L, Zhang J. Autophagy is a
therapeutic target in anticancer drug resistance. Biochimica et Biophysica Acta,
2010, 1806: 220-229.
54.
Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D,
Schlattner U, Wallimann T, Carlson M, Carling D. LKB1 is the upstream kinase
in the AMP-activated protein kinase cascade. Current biology, 2003, 13: 20042008.
55.
Shaw RJ, Kosmatka M, Bardeesy N, Hurley RL, Witters LA, De Pinho RA,
Cantley LC. The tumor suppressor LKB1 kinase directly activates AMP-activated
kinase and regulates apoptosis in response to energy stress. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101: 33293335.
56.
Luo Z, Saha AK, Xiang X, Ruderman NB. AMPK, the metabolic syndrome and
cancer. Trends in Pharmacological Sciences, 2005, 26: 29-76.
57.
Anderson KA, Ribar TJ, Lin F, Noeldner PK, Green MF, Muehlbauer MJ, Witters
LA, Kemp BE, Means AR. Hypothalamic CaMKK2 contributes to the regulation
of energy balance. Cell Metabolism, 2008, 7: 377-388.
58.
Aita VM, Liang XH, Murty VV, Pincus DL, Yu W, Cayanis E, Kalachikov S,
Gilliam TC, Levine B. Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate
tumor suppressor gene on chromosome 17q21. Genomics, 1999, 59: 59-65.
59.
Levine B, Sinha S, Kroemer G. Bcl-2 family members: dual regulators of
apoptosis and autophagy. Autophagy, 2008, 4: 600-606.
75
60.
Carew JS, Kelly KR, Nawrocki ST. Autophagy as a target for cancer therapy: new
developments. Cancer Management and Research, 2012, 4: 357-365.
61.
Akar U, Chaves A, Reyez A, Barria M, Tari A, Sanguino A, Kondo Y, Kondo S,
Arun B, Lopez G, Berestein G, Ozpolat B. Silencing of Bcl-2 expression by small
interfering RNA induces autophagic cell death in MCF-7 breast cancer cells.
Autophagy, 2008, 4: 669-679.
62.
Saeki K, Yuo A, Okuma E, Yazaki Y, Susin SA, Kroemer G, Takaku F. Bcl-2
down-regulation causes autophagy in a caspase-independent manner in human
leukemic HL60 cells. Cell Death & Differentiation, 2000, 7: 1263-1269.
63.
Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ. Autophagy fights disease
through cellular self-digestion. Nature, 2008, 451: 1069-1075.
64.
Qu X, Yu J, Bhagat G, Furuya N, Hibshoosh H, Troxel A, Rosen J, Eskelinen EL,
Mizushima N, Ohsumi Y, Cattoretti G, Levine B. Promotion of tumorigenesis by
heterozygous disruption of the belcin1 autophagy gene. Journal of Clinical
Investigation, 2003, 112: 1809-1820.
65.
Cloonan SM, Williams DC. The antidepressants maprotiline and fluoxetine
induce Type II autophagic cell death in drug-resistant Burkitt's lymphoma.
International Journal of Cancer, 2010, 128: 1712-1723.
66.
Lefranc F, Facchini V, Kiss R. Proautophagic drugs: a novel means to combat
apoptosis-resistant cancers, with a special emphasis on glioblastomas. Oncologist,
2007, 12: 1395-1403.
67.
Savranlar Y. Cı̇ splatin ile Oluşturulan Nefrotoksı̇ sı̇ te Üzerı̇ ne Amı̇ fostı̇ n Etkı̇ sı̇ nin
Hı̇ stokı̇ myasal Olarak Değerlendı̇ rı̇ lmesi. Ercı̇ ye Ünı̇ versı̇ te Tip Fakültesi
Hı̇ stoloji ve Embrı̇ yoloji Anabilim Dalı. Karyseri: 2011.
68.
Takahara PM, Rosenzweig AC, Frederick CA, Lippard SJ. Crystal structure of
double-stranded DNA containing the major adduct of the anticancer drug
cisplatin. Nature, 1995, 19: 649-652.
69.
Heinemann V, Wilke H, Mergenthaler HG, Clemens M, Konig H, Illiger HJ,
Arning M, Schalhorn A, Possinger K, Fink U. Gemcitabine and cisplatin in the
treatment of advanced or metastatic pancreatic cancer. Annals of Oncology, 2000,
11: 1399-1403.
76
70.
Stordal B, Davey M. Understanding cisplatin resistance using cellular models.
International Union of Biochesmistry and Moleculer Biology Life, 2007, 59: 696699.
71.
Schmid JO, Dong M, Haubeiss S, Friedel G, Bode S, Grabner A, Ott G, Murdter
TE, Oren M, Aulitzky WE, Van der Kuip H. Cancer cells cue the p53 response of
cancer-associated fibroblasts to cisplatin. Cancer Res, 2012, 72: 5824-5832.
72.
Lamson DW, Brignall MS. Antioxidants in cancer therapy; their actions and
interactions with oncologic therapies. Alternative Medicine Review, 1999, 4: 304329.
73.
Lissoni P, Barni S, Meregalli S, Fossati V, Cazzaniga M, Esposti D, Tancini G.
Modulation of cancer endocrine therapy by melatonin: a phase II study of
tamoxifen plus melatonin in metastatic breast cancer patients progressing under
tamoxifen alone. British Journal of Cancer, 1995, 71: 854-856.
74.
Cos S, Mediavilla MD, Fernandez R, Gonzalez-Lamuno D, Sanchez-Barcelo EJ.
Does melatonin induce apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells in vitro?
Journal of Pineal Research, 2002, 32: 90-96.
75.
Brzezinski A. Melatonin in humans. The New England Journal of Medicine, 1997,
336: 186-195.
76.
Özçelik F, Erdem M, Bolu A, Gülsün M. Melatonin: Genel özellikleri ve
psikiyatrik bozukluklardaki rolü. Psikiyatride Güncel Yaklaşımlar, 2013, 5: 179203.
77.
Lerner AB. Hormones and skin color. Scientific American, 1961, 205: 98-108.
78.
Reiter RJ, Melchiorri D, Sewerynek E, Poeggeler B, Barlow-Walden L, Chuang
J, Ortiz GG, Acuna-Castroviejo D. A review of the evidence supporting
melatonin's role as an antioxidant. J Pineal Res, 1995, 18: 1-11.
79.
Pandi-Perumal SR, Srinivasan V, Maestroni GJ, Cardinali DP, Poeggeler B,
Hardeland R. Melatonin: Nature's most versatile biological signal? Federation of
European Biochemical Societies, 2006, 273: 2813-2838.
80.
Fung BK. Transducin: structure, function, and role in phototransduction.
İçinde:Osborne NN, Chader GJ (editörler). Progress in retinal research Vol. 6,
Oxford, England, Pergamon Press, 1987: 151-177.
81.
Espino J, Pariente JA, Rodriguez AB. Oxidative stress and immunosenescence:
therapeutic effects of melatonin. Oxid Med Cell Longev, 2012, 2012: 670294.
77
82.
Reiter RJ. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological
interactions. Endocrine Reviews, 1991, 12: 151-180.
83.
Reiter RJ. Neuroendocrine effects of light. International Journal of
Biometeorology, 1991, 35: 169-175.
84.
Axelrod J, Weissbach H. Enzymatic O-methylation of N-acetylserotonin to
melatonin. Science, 1960, 131: 1312.
85.
Ravindra T, Lakshmi NK, Ahuja YR. Melatonin in pathogenesis and therapy of
cancer. Indian Journal of Medical Sciences, 2006, 60: 523-535.
86.
Lissoni P, Rovelli F, Malugani F, Bucovec R, Conti A, Maestroni GJ. Antiangiogenic activity of melatonin in advanced cancer patients. Neuro
endocrinology letters, 2001, 22: 45-47.
87.
Tamarkin L, Cohen M, Roselle D, Reichert C, Lippman M, Chabner B. Melatonin
inhibition and pinealectomy enhancement of 7,12-dimethylbenz(a)anthraceneinduced mammary tumors in the rat. Cancer research, 1981, 41: 4432-4436.
88.
Lissoni P, Meregalli S, Nosetto L, Barni S, Tancini G, Fossati V, Maestroni G.
Increased survival time in brain glioblastomas by a radioneuroendocrine strategy
with radiotherapy plus melatonin compared to radiotherapy alone. Oncology,
1996, 53: 43-46.
89.
Bartsch C, Bartsch H. The anti-tumor activity of pineal melatonin and cancer
enhancing life styles in industrialized societies. Cancer Causes Control, 2006, 17:
559-571.
90.
Jung B, Ahmad N. Melatonin in cancer management: progress and promise.
Cancer research, 2006, 66: 9789-9793.
91.
Hu S, Shen G, Yin S, Xu W, Hu B. Melatonin and tryptophan circadian profiles
in patients with advanced non-small cell lung cancer. Advance in Therapy, 2009,
26: 886-892.
92.
Freshney RI. Culture of animal cells, a manual of basic technique.
93.
Huang HL, Hsing HW, Lai TC, Chen YW, Lee TR, Chan HT, Lyu PC, Wu CL,
Lu YC, Lin ST, Lin CW, Lai CH, Chang HT, Chou HC, Chan HL. Trypsininduced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal
of Biomedical Science, 2010, 17: 36.
94.
Kalkan Y, Kapakin KAT, Kara A, Atabay T, Karadeniz A, Simsek N, Karakus E,
Can I, Yildirim S, Ozkanlar S. Protective effect of Panax ginseng against serum
78
biochemical changes and apoptosis in kidney of rats treated with gentamicin
sulphate. Journal of Molecular Histology, 2012: 1-11.
95.
Akman S, Canakci V, Kara A, Tozoglu U, Arabaci T, Dagsuyu İM. Therapeutic
Effects of Alpha-lipoic Acid and Vitamin C on Alveolar Bone Resorption After
Experimental Periodontitis in Rats. A Biochemical, Histochemical and
Stereologic Study. Journal of Periodontology, 2012: 1-10.
96.
Kara A, Yücel A, Yücel N, Özcan H, Selli J, Ünal D. Evaluation of the combined
treatment with cisplatin and melatonin on neuroblastoma cell viability and
antioxidant capacity. Journal of Experimental & Clinical Medicine, 2014, 31.
97.
Menteş B, Leventoğlu S. Kolorektal Kanserlerin Klinik Özellikleri. Turkiye
Klinikleri Journal of Surgery, 2004, 9: 36-38.
98.
Özmen V. Türkiye'de Meme Kanseri: Klinik ve Histopatolojik Özellikler (13.240
Olgunun Analizi). Meme Sagligi Dergisi/Journal of Breast Health, 2014, 10.
99.
Karadeniz A, Simsek N, Karakus E, Yildirim S, Kara A, Can I, Kisa F, Emre H,
Turkeli M. Royal jelly modulates oxidative stress and apoptosis in liver and
kidneys of rats treated with cisplatin. Oxidative Medicine And Cellular Longevity,
2011, 2011.
100.
Karakus E, Karadeniz A, Simsek N, Can I, Kara A, Yildirim S, Kalkan Y, Kisa F.
Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and
apoptosis in liver of rats treated with carbon tetrachloride (CCl 4). Journal of
hazardous materials, 2011, 195: 208-213.
101.
Kara A, Akman S, Ozkanlar S, Tozoglu U, Kalkan Y, Canakci CF, Tozoglu S.
Immune modulatory and antioxidant effects of melatonin in experimental
periodontitis in rats. Free Radical Biology and Medicine, 2013, 55: 21-26.
102.
Simsek N, Kaya M, Kara A, Can I, Karadeniz A, Kalkan Y. Effects of melatonin
on islet neogenesis and beta cell apoptosis in streptozotocin-induced diabetic rats:
an immunohistochemical study. Domestic animal endocrinology, 2012, 43: 4757.
103.
Hrushesky WJ. Melatonin cancer therapy. İçinde:The Pineal Gland and Cancer,
Springer, 2001: 476-508.
104.
Hill SM, Blask DE. Effects of the pineal hormone melatonin on the proliferation
and morphological characteristics of human breast cancer cells (MCF-7) in
culture. Cancer research, 1988, 48: 6121-6126.
79
105.
Blask DE, Hill SM. Effects of melatonin on cancer: studies on MCF-7 human
breast cancer cells in culture. Journal of neural transmission. Supplementum,
1985, 21: 433-449.
106.
She Q-B, Bode AM, Ma W-Y, Chen N-Y, Dong Z. Resveratrol-induced activation
of p53 and apoptosis is mediated by extracellular-signal-regulated protein kinases
and p38 kinase. Cancer research, 2001, 61: 1604-1610.
107.
Cetin-Atalay R, Ozturk M. p53 mutations as fingerprints of environmental
carcinogens. Pure and applied chemistry, 2000, 72: 995-999.
108.
D'Autréaux B, Toledano MB. ROS as signalling molecules: mechanisms that
generate specificity in ROS homeostasis. Nature reviews Molecular cell biology,
2007, 8: 813-824.
109.
Kaabinejadian S, Sh F, Ramezani M, Azizi E. p53 expression in MCF7, T47D
and MDA-MB 468 breast cancer cell lines treated with adriamycin using RT-PCR
and immunocytochemistry. Journal of Biological Sciences, 2008.
110.
Singh N, Nigam M, Ranjan V, Zaidi D, Garg VK, Sharma S, Chaturvedi R,
Shankar R, Kumar S, Sharma R. Resveratrol as an adjunct therapy in
cyclophosphamide‐ treated MCF‐ 7 cells and breast tumor explants. Cancer
science, 2011, 102: 1059-1067.
111.
Fridman JS, Lowe SW. Control of apoptosis by p53. Oncogene, 2003, 22: 90309040.
112.
Wang C, Chen Z, Ge Q, Hu J, Li F, Hu J, Xu H, Ye Z, Li L-C. Up-regulation of
p21 WAF1/CIP1 by miRNAs and its implications in bladder cancer cells. FEBS
letters, 2014, 588: 4654-4664.
113.
Chen A, Huang X, Xue Z, Cao D, Huang K, Chen J, Pan Y, Gao Y. The Role of
p21 in Apoptosis, Proliferation, Cell Cycle Arrest, and Antioxidant Activity in
UVB-Irradiated Human HaCaT Keratinocytes. Medical science monitor basic
research, 2015, 21: 86.
114.
Han Z, Wei W, Dunaway S, Darnowski JW, Calabresi P, Sedivy J, Hendrickson
EA, Balan KV, Pantazis P, Wyche JH. Role of p21 in apoptosis and senescence
of human colon cancer cells treated with camptothecin. Journal of Biological
Chemistry, 2002, 277: 17154-17160.
115.
Slingerland J, Pagano M. Regulation of the Cdk inhibitor p 27 and its deregulation
in cancer. Journal of cellular physiology, 2000, 183: 10-17.
80
116.
Palmqvist R, Stenling R, Öberg Å, Landberg G. Prognostic significance of
p27Kip1 expression in colorectal cancer: a clinico‐ pathological characterization.
The Journal of Pathology, 1999, 188: 18-23.
117.
Sasaki K, Tsuno NH, Sunami E, Tsurita G, Kawai K, Okaji Y, Nishikawa T,
Shuno Y, Hongo K, Hiyoshi M. Chloroquine potentiates the anti-cancer effect of
5-fluorouracil on colon cancer cells. BMC cancer, 2010, 10: 370.
118.
Mariño G, Salvador-Montoliu N, Fueyo A, Knecht E, Mizushima N, López-Otín
C. Tissue-specific autophagy alterations and increased tumorigenesis in mice
deficient in Atg4C/autophagin-3. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282:
18573-18583.
81
EKLER
EK 1. ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Adı Soyadı: Süleyman POLAT
Doğum tarihi :
Doğum yeri:
05.08.1980
Erzurum
Medeni hali: Evli
Uyruğu: T.C.
Adres: Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji
Anabilim Dalı, Eruzum
Cep Tel: 90 536 520 08 49
Fax: E-mail:
doguonuralp@hotmail.com
Eğitim Bilgileri
Lise:
Lisans:
Yüksek lisans:
Doktora:
Atatürk Endüstri Meslek Lisesi
Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü
Atatürk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Histoloji ve
Embriyoloji Anabilim Dalı, 2015
-
Yabancı Dil Bilgileri
İngilizce: Orta derecede
Üye Olunan Mesleki Kuruşlar
Yok
İlgi alanları ve Hobiler
Biyokimya
82
EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU
83
84
Download