Untitled

advertisement
FARELERDE DİASETİLİN SİTOKİN SALINIM PROFİLLERİNİN
İNCELENEREK SOLUNUM SENSİTİZASYON POTANSİYELİNİN
ARAŞTIRILMASI
Aylin ELKAMA
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FARMASÖTİK TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
NİSAN 2015
27/04/2015
iv
FARELERDE DİASETİLİN SİTOKİN SALINIM PROFİLLERİNİN İNCELENEREK
SOLUNUM SENSİTİZASYON POTANSİYELİNİN ARAŞTIRILMASI
(Yüksek Lisans Tezi)
Aylin ELKAMA
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Nisan 2015
ÖZET
İşyeri ortamında sensitizan kimyasallara maruziyet solunum yoluyla ilgili çok ciddi
mesleki hastalıklara yol açmaktadır. Son yıllarda gıdalarda katkı maddesi olarak kullanılan
Diasetil maddesinin bronşiyolitis obliterans ve astım gibi hastalıklarla ilişkili olduğu ve bu
nedenle üretim yerinde çalışan işçi sağlığı için tehlike oluşturduğu düşünülmektedir. Tez
çalışmamızda bu tehlikenin boyutunu değerlendirmek üzere Diasetil’in sensitizan
karakteristiğini ortaya koymayı amaçladık. Negatif, pozitif ve çözücü kontrol gruplarıyla
birlikte Diasetil’in sensitizasyon potansiyelinin belirlenmesi için hayvan refahının
gözetildiği ve radyoaktif olmayan ex vivo Lokal Lenf Düğümü Testi (LLNA):BrdU-ELISA
yöntemi kısa süreli ve kronik maruziyet protokolleri ile yürütülmüştür. İmmün
reaksiyonlarda sitokinlerin ve antikorların başlıca rolünün olmasından ve bu zamana kadar
Diasetil’in tüm sitokin profili aydınlatılmadığından, sitokin profilleme ve fare IgE testi
çalışmaya dahil edilmiştir. Deneylerimiz sonucunda Diasetil’in %10 (ağırlık/hacim)
konsantrasyonda çözücü kontrole kıyasla lenfosit poliferasyonunu anlamlı şekilde
indüklemediği, aynı konsantrasyonda her iki maruziyet süresinde de anlamlı IgE antikoru
artışına neden olduğu gözlenmiştir. Bu çalışmanın Diasetil’in işçi sağlığına yönelik taşıdığı
riskin değerlendirilmesine ve sağlık otoritelerince gerekli düzenlemelerin yapılmasına
katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
Bilim kodu
Anahtar kelimler
Sayfa adedi
Danışman
: 1021
: Sensitizasyon, diasetil, ex vivo LLNA:BrdU-ELISA yöntemi,
hayvan refahı, sitokin profilleme, fare IgE testi, bronşiyolitis
obliterans, astım
: 112
: Prof. Dr. Ali Esat KARAKAYA
v
INVESTIGATION OF RESPIRATORY SENSITIZATION POTENCY OF DIACETYL
BY DETERMINING CYTOKINE RELEASE PROFILES IN MICE
(M.Sc. Thesis)
Aylin ELKAMA
GAZI UNIVERSITY
INSTITUTE OF HEALTH SCIENCES
January 2015
ABSTRACT
Exposure to chemical sensitizers in workplace settings leads to significant occupational
diseases related to respiratory tract. In recent years diacetyl, which is used as a food
additive, is considered to be associated with various diseases such as bronchiolitis
obliterans and asthma and therefore diacetyl is thought to be as an important hazard for
worker’s health. With this thesis study we aimed to characterize the sensitization potency
of diacetyl for the purpose of its hazard evaluation. For determining the sensitization
potency of diacetyl with negative, pozitive and vehicle control groups, animal welfare
caring and non-radioactive ex vivo Local Lymph Node Assay (LLNA):BrdU-ELISA
method with short term and chronic exposure protocols was performed. Due to significant
role of cytokines and antibodies in immune reactions and with limited knowledge about the
whole cytokine profile of diacetyl up to now, cytokine profiling and Mouse IgE test were
incorporated into research. As a consequence of our experiments, lymphocyte proliferation
induced with a concentration of 10% (w/v) of diacetyl was not found as statistically
significant in comparison with vehicle control. The same concentration of the test material
induced statistically significant IgE antibody levels in comparison with vehicle control
group in both exposure protocols. In conclusion this research supports the studies in the
field of risk assessment of diacetyl for occupational safety and contibutes to health
authorities to adopt new regulations.
Science Code
Key words
Page number
Supervisor
: 1021
: Sensitization, diacetyl, ex vivo LLNA:BrdU-ELISA method,
animal welfare, cytokine profiling, mouse IgE test, bronchiolitis
obliterans, asthma
: 112
: Prof. Dr. Ali Esat KARAKAYA
vi
TEŞEKKÜR
Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren, kıymetli
tecrübelerinden faydalandığım danışmanım Prof. Dr. Ali Esat KARAKAYA ve Ankara
Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof.
Dr. Asuman KARAKAYA’ya, deneylerim boyunca tecrübelerini paylaşan ve yardımlarını
esirgemeyen Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim
Dalı öğretim üyesi Dr. Özge CEMİLOĞLU ÜLKER’e teşekkür ederim.
Hayvan deneylerimde yardımları ve tecrübeleriyle kolaylık sağlayan Gazi Üniversitesi
Laboratuvar Hayvanları Yetiştirme ve Deneysel Araştırmalar Merkezi (GÜDAM)
Araştırma Sorumluları Vet. Hek. Dr. Elvan ANADOL ve Vet. Hek. Dr. Elif ERGÜVEN
KAYA’ya ve üretim bölümü personellerine teşekkür ederim.
Tez çalışmamın her aşamasına tanık olan, motivasyonumu her daim yüksek tutmamı
sağlayan yüksek lisans tezimin hayatıma kazandırdığı sevgili arkadaşım Ankara
Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji yüksek lisans öğrencisi Erim
TEKER’e ve tezimi yazma aşamasında mesafelere karşın beni yalnız bırakmayıp telefonun
diğer ucundan desteğini ve sohbetini esirgemeyen sevgili arkadaşım Ali Osman
SUİÇMEZ’e teşekkür ederim.
Manevi destekleri ile beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan, en umutsuz olduğum anlarda
umut ışığım olan, benimle gülüp benimle ağlayan Canım anneannem Nesrin OĞUZ,
Canım annem Güleren ELKAMA, Canım babam Aydın ELKAMA, Canım ablam Aygül
ELKAMA PAK ve Canım eniştem Oktay PAK’a tüm kalbimle teşekkür ederim. Değerli
ailem iyi ki varsınız…
vii
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET .........................................................................................................................
iv
ABSTRACT ..............................................................................................................
v
TEŞEKKÜR ..............................................................................................................
vi
İÇİNDEKİLER ..........................................................................................................
vii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ ........................................................................................
xi
ŞEKİLLERİN LİSTESİ .............................................................................................
xvi
1. GİRİŞ ..................................................................................................................
1
2. GENEL BİLGİLER ..........................................................................................
5
2.1. Aşırı Duyarlılık Reaksiyonları ........................................................................
5
2.1.1. Temas aşırı duyarlılığı ve klinik sonucu alerjik temas dermatiti .............
7
2.1.2. Solunum sensitizasyonu ........................................................................
11
2.2. Alerjik Temas Dermatiti ve Solunum Sensitizasyonunda Sitokinlerin Rolü .....
14
2.3. Kimyasalların Sensitizasyon Potansiyellerinin Ölçüm Yöntemleri ..................
18
2.3.1. Standart fare lokal lenf düğümü testi (LLNA) .......................................
21
2.3.2. Standart LLNA yöntemine alternatif in vivo BrdU yöntemi ...................
23
2.3.3. Standart LLNA yöntemine alternatif ex vivo BrdU yöntemi...................
24
2.3.4. rLLNA (reduced LLNA) .......................................................................
24
2.4. LLNA’nın Kimyasalların Solunum Sensitizasyon Potansiyellerinin Ölçümüne
Uyarlanması....................................................................................................
25
2.5. Sitokin Profillemesi ........................................................................................
26
2.6. Fare IgE Testi .................................................................................................
27
2.7. Çalışmamızda Kullanılan Radyoaktif Olmayan ex vivo LLNA Yöntemi ile
Sensitizasyon Potansiyelleri Tespit Edilecek Olan Kimyasal Maddeler ...........
29
2.7.1. 2,4-dinitroklorobenzen (DNCB) ............................................................
29
2.7.2. Trimellitik anhidrit (TMA) ....................................................................
29
viii
Sayfa
2.7.3. Diasetil..................................................................................................
30
2.8. Alternatif in vitro ve in siliko Yöntemler .........................................................
33
2.8.1. İn siliko testler .......................................................................................
34
2.8.2. İn chemico testler ..................................................................................
34
2.8.3. Hücresel testler......................................................................................
34
3. GEREÇ VE YÖNTEM ....................................................................................
37
3.1. Kimyasallar ....................................................................................................
37
3.1.1. Topik uygulanan negatif kontrol ............................................................
37
3.1.2. Topik uygulanan pozitif kontrol ............................................................
37
3.1.3. Topik uygulanan test materyali ..............................................................
37
3.1.4. Diğer kimyasallar ..................................................................................
37
3.2. Kullanılan Alet ve Malzemeler........................................................................
38
3.3. Deney Hayvanı ...............................................................................................
38
3.4. Lenfosit Proliferasyonunun Lenf Düğümü Hücrelerinde BrdU ile ex vivo
Ölçümü ...........................................................................................................
39
3.4.1. Kısa süreli maruziyet .............................................................................
39
3.4.2. Kronik maruziyet ..................................................................................
39
3.5. ELISA Yöntemi ile Sitokin ve IgE Antikoru Analizlerinin Temel Prensibi......
41
3.6. Ex vivo BrdU Katım Yöntemi Uygulanarak Elde Edilen Lenfosit
Kültürlerinde Sitokin Düzeylerinin Ölçümü ....................................................
41
3.6.1. IFN-γ ölçümü ........................................................................................
41
3.6.2. IL-2 ölçümü ..........................................................................................
42
3.6.3. IL-4 ölçümü ..........................................................................................
43
3.6.4. IL-5 ölçümü ..........................................................................................
44
3.6.5. IL-10 ölçümü ........................................................................................
45
3.6.6. IL-13 ölçümü ........................................................................................
46
3.7. Kardiyak Ponksiyon İşlemi ile Elde Edilen Kanda IgE Ölçümü.......................
47
ix
Sayfa
3.8. İstatistiksel Analizler ......................................................................................
48
4. BULGULAR ve YORUM ..............................................................................
49
4.1. Radyoaktif Olmayan ex vivo LLNA Yöntemi ile Kimyasalların Kısa Süreli
Maruziyet Sonrası Alerji Potansiyellerinin Ölçülmesi ile İlgili Deney
Sonuçları ........................................................................................................
49
4.1.1. DNCB için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması ...........................
51
4.1.2. TMA için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması .............................
51
4.1.3. Diasetil için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması ..........................
51
4.2. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kısa Süreli Maruziyet Sonrası
Kulak Arkası Lenf Düğümlerinden Elde Edilen Lenfosit Hücre Kültürlerinde
Sitokin Düzeylerinin Ölçümü ..........................................................................
52
4.2.1. IFN-γ ölçümü ........................................................................................
52
4.2.2. IL-2 ölçümü ..........................................................................................
55
4.2.3. IL-4 ölçümü ..........................................................................................
56
4.2.4. IL-5 ölçümü ..........................................................................................
59
4.2.5. IL-10 ölçümü ........................................................................................
61
4.2.6. IL-13 ölçümü ........................................................................................
62
4.3. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kısa Süreli Maruziyet Sonrası
Total Serum IgE Konsantrasyonunun Ölçümü ................................................
64
4.4. Radyoaktif Olmayan ex vivo LLNA Yöntemi ile Kimyasalların Kronik
Maruziyet Sonrası Alerji Potansiyellerinin Ölçülmesi ile İlgili Deney
Sonuçları ........................................................................................................
67
4.4.1. DNCB için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması ...........................
69
4.4.2. TMA için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması .............................
69
4.4.3. Diasetil için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması ..........................
69
4.5. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kronik Maruziyet Sonrası
Kulak Arkası Lenf Düğümlerinden Elde Edilen Lenfosit Hücre Kültürlerinde
Sitokin Düzeylerinin Ölçümü ..........................................................................
70
4.5.1. IFN-γ ölçümü ........................................................................................
70
4.5.2. IL-2 ölçümü ..........................................................................................
72
x
Sayfa
4.5.3. IL-4 ölçümü ..........................................................................................
74
4.5.4. IL-5 ölçümü ..........................................................................................
76
4.5.5. IL-10 ölçümü ........................................................................................
78
4.5.6. IL-13 ölçümü ........................................................................................
80
4.6. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kronik Maruziyet Sonrası
Total Serum IgE Konsantrasyonunun Ölçümü ................................................
82
5. TARTIŞMA .......................................................................................................
85
6. SONUÇ ve ÖNERİLER ..................................................................................
97
KAYNAKLAR ..........................................................................................................
99
EKLER ......................................................................................................................
109
EK-1. Hayvan deneyleri yerel etik kurul onayı ...........................................................
110
ÖZGEÇMİŞ ...............................................................................................................
112
xi
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.1. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen
OD450 sonuçları.......................................................................................
49
Çizelge 4.2. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen
OD450 sonuçları ......................................................................................
49
Çizelge 4.3. Diasetile kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen
OD450 sonuçları ......................................................................................
50
Çizelge 4.4. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen
OD450 sonuçları ......................................................................................
50
Çizelge 4.5. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ............
53
Çizelge 4.6. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ............
53
Çizelge 4.7. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ............
53
Çizelge 4.8. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ............
54
Çizelge 4.9. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ..............
55
Çizelge 4.10. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ............
55
Çizelge 4.11. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ............
55
Çizelge 4.12. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2
düzeyleri ..............................................................................................
56
Çizelge 4.13. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4
düzeyleri ..............................................................................................
57
Çizelge 4.14. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri ............
57
Çizelge 4.15. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri ............
57
xii
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.16. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4
düzeyleri ..............................................................................................
58
Çizelge 4.17. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5
düzeyleri ..............................................................................................
59
Çizelge 4.18. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri ............
59
Çizelge 4.19. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri ............
60
Çizelge 4.20. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5
düzeyleri ..............................................................................................
60
Çizelge 4.21. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10
düzeyleri ..............................................................................................
61
Çizelge 4.22. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri ..........
61
Çizelge 4.23. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri ..........
61
Çizelge 4.24. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10
düzeyleri ..............................................................................................
62
Çizelge 4.25. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13
düzeyleri ..............................................................................................
63
Çizelge 4.26. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri ..........
63
Çizelge 4.27. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri ..........
63
Çizelge 4.28. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13
düzeyleri ..............................................................................................
64
Çizelge 4.29. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE
düzeyleri ..............................................................................................
65
xiii
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.30. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri .............
65
Çizelge 4.31. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri .............
65
Çizelge 4.32. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf
düğümlerinden elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE
düzeyleri ..............................................................................................
66
Çizelge 4.33. DNCB’ye kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen
OD450 sonuçları.....................................................................................
67
Çizelge 4.34. TMA’ya kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları...............................................................................................
67
Çizelge 4.35. Diasetile kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları...............................................................................................
68
Çizelge 4.36. Çözücüye kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen
OD450 sonuçları.....................................................................................
68
Çizelge 4.37. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ..........
70
Çizelge 4.38. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ..........
70
Çizelge 4.39. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ..........
71
Çizelge 4.40. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri ..........
71
Çizelge 4.41. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ............
72
Çizelge 4.42. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ............
72
Çizelge 4.43. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ............
73
Çizelge 4.44. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri ............
73
Çizelge 4.45. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri ............
74
xiv
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.46. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri ............
74
Çizelge 4.47. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri ............
75
Çizelge 4.48. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri ............
75
Çizelge 4.49. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri ............
76
Çizelge 4.50. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri ............
76
Çizelge 4.51. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri ............
77
Çizelge 4.52. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri ............
77
Çizelge 4.53. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri ..........
78
Çizelge 4.54. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri ..........
78
Çizelge 4.55. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri ..........
79
Çizelge 4.56. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri ..........
79
Çizelge 4.57. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri ..........
80
Çizelge 4.58. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri ..........
80
Çizelge 4.59. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri ..........
81
Çizelge 4.60. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri ..........
81
Çizelge 4.61. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri .............
82
Çizelge 4.62. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri .............
82
xv
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.63. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri .............
82
Çizelge 4.64. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden
elde edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri .............
83
xvi
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil
Sayfa
Şekil 3.1. ELISA yöntemi ile sitokin ve antikoru ölçümü. ..........................................
41
Şekil 3.2. IFN-γ miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi ................
42
Şekil 3.3. IL-2 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi ..................
43
Şekil 3.4. IL-4 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi ..................
44
Şekil 3.5. IL-5 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi ..................
45
Şekil 3.6. IL-10 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi.................
46
Şekil 3.7. IL-13 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi.................
47
Şekil 3.8. IgE miktarının ölçülmesinde kullanılan standart doğru denklemi ................
48
Şekil 4.1. Kısa süreli maruziyet sonucu lenfosit proliferasyonu ölçümü (OD450) .......
51
Şekil 4.2. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IFN-γ
miktarı........................................................................................................
54
Şekil 4.3. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-2
miktarı........................................................................................................
56
Şekil 4.4. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-4
miktarı........................................................................................................
58
Şekil 4.5. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-5
miktarı........................................................................................................
60
Şekil 4.6. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-10
miktarı........................................................................................................
62
Şekil 4.7. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-13
miktarı........................................................................................................
64
Şekil 4.8. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IgE
miktarı........................................................................................................
66
Şekil 4.9. Kronik maruziyet sonucu lenfosit proliferasyonu ölçümü (OD450) .............
69
Şekil 4.10. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IFN-γ
miktarı .....................................................................................................
71
Şekil 4.11. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-2 miktarı.
73
Şekil 4.12. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-4 miktarı.
75
xvii
Şekil
Sayfa
Şekil 4.13. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-5 miktarı.
77
Şekil 4.14. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-10
miktarı .....................................................................................................
79
Şekil 4.15. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-13
miktarı .....................................................................................................
81
Şekil 4.16. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IgE miktarı ..
83
1
1. GİRİŞ
İşyeri ortamında alerji potansiyeli taşıyan kimyasallara maruziyet önemli bir mesleki aşırı
duyarlılık hastalığı nedenidir. Endüstriyel sektördeki çeşitli kimyasallar arasında yer alan
koku verici bileşenler, metal tuzları, halojenli aromatik bileşikler gibi düşük molekül
ağırlığına sahip kimyasalların T lenfositleri aracılı gecikmiş tip aşırı duyarlılık reaksiyonu
olan alerjik temas dermatitini indükleme kapasitesine sahip olduğu bilinmektedir (Goutet,
Pépin, Langonné, Huguet ve Ban, 2012). Yaklaşık 4000 adet kimyasalın temas
sensitizasyonu oluşturma potansiyeline sahip olduğu kabul edilir ve bu kimyasallardan
sadece 100 kadarı insan yama testlerinde verdiği pozitif yanıta göre teşhis edilmektedir.
Temas sensitizasyonu bireyin yaşam kalitesini ve çalışma performansını ciddi derecede
etkilemektedir. Son 100 yılda temas sensitizasyon problemi alerjen özellikteki
kimyasalların tüketiciye sunulması ve mesleki ürünlere sokulması ile ciddiyet kazanmıştır
(Thyssen, Giménez-Arnau, Lepoittevin, Menné, Boman ve Schnuch, 2012).
Amerika Birleşik Devletleri’nde kapalı iş yeri ortamlarında çalışan 89 milyon işçiden 60
milyonu göz, burun ve boğaz irritasyonu, baş ağrısı ve yorgunluk gibi belirtiler
göstermektedir. Hastalık ve performans kayıplarına bağlı tahmini yıllık tutar 20-70 milyar
dolar aralığındadır. Bu şikayetlerin nedeni hem biyolojik hem de kimyasal (uçucu organik
bileşikler) maruziyetine atfedilmiştir. Bu nedenle, kapalı mekanda bulunan gaz halindeki
kimyasallara maruziyetin araştırılmasına yönelik çalışmalar hız kazanmıştır (Anderson,
Wells, Fedorowicz, Butterworth, Meade ve Munson, 2007).
Bilinen çok sayıda temas sensitizanı ile kıyaslandığında, genellikle IgE aracılı Th2
solunum alerjisine yol açtığı bilinen kimyasalların listesi oldukça kısadır. Ancak
endüstriyel ülkelerde asit anhidritler ve izosiyanatlar gibi düşük molekül ağırlığındaki
kimyasallar mesleki astım vakalarının %40’ından sorumludur. Dahası, astımın zaman
geçtikçe ölümcül olabilen akciğer hasarına yol açması nedeniyle işçiler için büyük bir risk
teşkil etmektedir (Goutet ve diğerleri, 2012). Klinik araştırmalar yetişkin astım vakalarının
%20’sinin mesleki etmenlerden kaynaklandığını, bunların da %90’ının immünolojik
mekanizmaları içerdiğini göstermektedir. Ayrıca, mesleki astım gelişmiş ülkelerde en
yüksek prevalansa sahip mesleki akciğer hastalıklarının başında gelir. Bu nedenle, solunum
veya dermal alerji potansiyeli taşıyan kimyasalların tam olarak belirlenmesi ve bunların
karakterizasyonu endüstriyel toksikoloji alanında mesleki güvenlik adına önemli bir
2
araştırma konusunu oluşturmaktadır (Boverhof, Billington, Gollapudi, Hotchkiss, Krieger,
Poole, Wiescinski ve Woolhiser, 2008; Goutet ve diğerleri, 2012).
Diasetil (2,3-bütandion) gıdalara tereyağı tadı ve kokusu vermek amacıyla kullanılan hoş
koku verici kimyasal bir maddedir (Parmet ve Von Essen, 2002). Diasetilin tehlike olarak
görülmesi ilk olarak 2000 yılında ABD’deki bir mikrodalga patlamış mısır üretim tesisinde
çalışan işçilerin yüksek miktarda diasetile maruz kalması ile gerçekleşmiştir. Diasetil
inhalasyonu sonucu işçilerde geri dönüşümsüz, bronşiyollerde inflamasyon ve yaralara
neden olan akciğer hastalığı (Potera, 2012) bronşiyolitis obliterans semptomları
gözlenmiştir. Ayrıca epidemiyolojik çalışmalar diasetile maruz kalan işçilerde astımın iki
kat daha fazla görüldüğünü ortaya koymuştur (Anderson ve diğerleri, 2007).
Bunun üzerine National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) tarafından
patlamış mısırda kullanılan tereyağı tatlandırıcısı ile oluşabilecek akciğer hastalığının
araştırılması sonucu düzenleyici otoriteler tarafından işyeri ortamı havasındaki diasetilin
güvenilir seviyeleri için kısıtlama getirilmesi amaçlanmıştır (Shibamoto, 2014).
Kimyasalların sahip olduğu temas alerjisi potansiyelinin belirlenmesine yönelik valide
edilmiş Lokal Lenf Düğümü Testi (LLNA) kullanılırken, solunum sensitizasyonunu
indükleyen
kimyasalların
ileriye
dönük
belirlenmesi
için
bir
model
henüz
bulunmamaktadır (Vangosa, Braun, Cookman, Hofmann, Kimber, Loveless, Morrow,
Pauluhn, Sorensen ve Niessen, 1994). LLNA’nın dermal temasla ilgili olmasına karşın
solunum alerjenleri için uygulanabilir olduğu gösterilmiştir (Kimber, Agius, Basketter,
Corsini, Cullinan, Dearman, Gimenez-Arnau, Greenwell, Hartung, Kuper, Maestrelli,
Roggen ve Rovida, 2007; 7. Arts, De Jong, Van Triel, Schijf, De Klerk, Van Loveren ve
Kuper, 2008; Isola, Kimber, Sarlo, Lalko ve Sipes, 2008).
Diğer hayvan deneyleri ile kıyaslandığında daha az deney hayvanı ile çalışılması, hem
alerjik reaksiyonların çok şiddetli olmaması hem de uygulama süresince hayvanlara daha
az acı verilmesi, hayvan deneylerine ait mevzuatlara ve test rehberlerine (OECD Organization for Economic Cooperation and Development, ICATM - International
Cooperation on Alternative Test Methods) giren 3R yaklaşımı açısından LLNA alternatif
bir yöntem olarak kabul görmüştür. Sensitizasyon için günümüzde valide olan tek yöntem
LLNA’dır (ICCVAM, 1999; Rovida, 2011). Son zamanlarda bu metod, Avrupa
3
Birliği’ndeki yeni REACH regülasyonu ile ilk ihtiyaç duyulan sensitizasyon testi haline
gelmiştir (Anderson ve diğerleri, 2011). Ancak LLNA sonuçları immün yanıtların
tetiklenip tetiklenmediğini gösterirken, solunum veya temas alerjisine ait spesifik
mekanizmaları birbirinden ayırt edemez (Vanoirbeek et al, 2003; Boverhof et al, 2008).
Bu nedenle LLNA ile birlikte kimyasalların indüklediği sitokin profillerinin de ortaya
konması ile solunum sensitasyonunun alerjik temas dermatitinden ayırt edilmesi
sağlanmaktadır (Vandebriel ve diğerleri, 2011).
Diasetilin toksisitesine ve risk değerlendirmesine ilişkin yeterli sayıda inceleme mevcut
değildir (Shibamoto, 2014). Kimyasal alerjenlerin sitokin salım profillerine göre
sınıflandırılmasının mümkün olduğu öne sürülmektedir. Bu gerekçelerle çalışmamızda
dermal maruziyet ile solunum sensitizasyonu potansiyeline sahip olduğu düşünülen
diasetilin, kontrol gruplarını oluşturan solunum sensitizanı trimellitik anhidrit ve temas
sensitizanı 2,4-dintiroklorobenzenin eş zamanlı uygulaması sonucu indüklenen sitokin
profilleri ile karşılaştırmalı olarak (Kimber, Hilton, Basketter ve Dearman, 1996) T hücre
yanıtını ve sitokin profilini ortaya koyma ihtiyacı duyduk. Bu yaklaşımın sınırlı sayıda
sensitizanla denenmiş olmasına karşın (Goutet ve diğerleri, 2012) kimyasal solunum
alerjenlerinin karakterizasyonunu sağlayacağı gibi, bu alerjenlerin işçi sağlığına yönelik
taşıdığı riskin değerlendirilmesi adına güvenilir bir yaklaşım olduğunun göz ardı
edilmemesi ve yöntemin validasyonu için daha fazla araştırmanın yapılması gerektiğini
düşünüyoruz.
Kimyasalların sensitizasyon özelliklerinin bilinmesi, kamu ve sanayiye yönelik güvenli
ürünlerin
pazarlanmasına
imkan
tanır.
Ayrıca
ürünlerin
sınıflandırılması
ve
etiketlenmesinde bilimsel basamağı oluşturmaktadır (Thyssen ve diğerleri, 2012).
Çalışmamızda son yıllarda hem işçi sağlığı hem de tüketici sağlığı açısından oluşturduğu
riskler göz önünde bulundurulduğunda gıda katkı maddesi olarak kullanılması tartışılan
diasetilin sensitizasyon potansiyelini hayvan refahı gözetilerek modifiye edilen LLNA
yöntemi ile araştırmayı, farelerde tutarlı ve kıyaslanabilir sitokin sentezi yanıtlarının
indükleyip indüklemediğini değerlendirmeyi ve olası indüklenmiş sitokin üretiminin
diasetilin sensitizan karakterinin aydınlatılması için gerçekçi bir yaklaşım olup olmadığını
ortaya koymayı amaçladık.
4
5
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Aşırı Duyarlılık Reaksiyonları
Bağışıklık sistemi enfeksiyonlara karşı savunmada konak için gerekli iken, immün yanıtın
kendisi de doku hasarına ve hastalıklara neden olabilmektedir. Aşırı duyarlılık
reaksiyonları immün yanıtın yol açtığı bu bozukluklar arasında yer alır (Abbas ve
Lichtman, 2007).
Alerji, antijene karşı verilen immün yanıtın ardından ortaya çıkan advers durum olup, doku
hasarıyla sonuçlanan aşırı duyarlılık reaksiyonlarının bir çeşididir (Boverhof ve diğerleri,
2008). İmmünotoksikoloji açısından alerji, ilaçlara ve kimyasallara karşı gelişen spesifik
immün yanıttan kaynaklanmaktadır (Van Loveren ve Vos, 2011).
Alerjik reaksiyonlar çok çeşitli şekillerde oluşum gösterirler. Aşırı duyarlılık hastalıkları,
doku hasarı ve hastalıktan sorumlu olan temel immünolojik mekanizmalara göre
sınıflandırılırlar. Aşırı duyarlılık yanıtları Tip I, II, III ve IV olmak üzere başlıca dört sınıf
altında incelenir (Abbas ve Lichtman, 2007).
Kimyasalların yol açtığı alerjik reaksiyonlar iki aşamada gerçekleşir. Doğuştan duyarlı
bireyde uygun maruziyet yolu aracılığı ile uygun miktarda kimyasal alerjenle ilk
karşılaşmayı takiben “sensitizasyon” ile sonuçlanan edinilmiş immün yanıtlar oluşacaktır.
Bu şekilde duyarlanmış bireyin, aynı kimyasal alerjene (miktar ve maruziyet bölgesine
bağlı olarak) bir sonraki maruziyetinde, klinik açıdan alerjik reaksiyon olarak tanımlanan
inflamasyonla
sonuçlanan
daha
şiddetli
sekonder
immün
yanıtlar
tetiklenir.
Duyarlılaştırılmış bireyde alerjenle indüklenen inflamatuar reaksiyonların gelişimi “ortaya
çıkma” fazı olarak tanımlanır (Kimber, Basketter, Gerberick, Ryan ve Dearman, 2011).
Bir kimyasalın bireyleri duyarlı hale getirme kabiliyeti genellikle bu kimyasalların vücut
proteinlerine kovalent olarak bağlanması ile ilişkilidir (Van Loveren ve Vos, 2011).
Çevremizde karşılaştığımız birçok madde immün yanıtı tetikleyebilmektedir. Bu maddeler
için en önemli gereksinim proteinlerle kompleks oluşturma ihtiyacıdır (Kimber ve
Dearman, 2005). Polen, enzimler gibi çevreden veya mesleki ortamdan maruz kalınan
proteinleri içeren 1000 Dalton’dan (Da) büyük molekül ağırlığına sahip bileşikler immün
6
sistemle etkileşerek doğrudan immün yanıtı uyarabilirler. 1000 Da’dan küçük molekül
ağırlığına sahip kimyasallar ise doğrudan immün sistem tarafından tanınmak için çok
küçük yapıdadırlar ve hapten olarak etki ederler. Haptenler immün yanıt oluşturmak için
öncelikle doğrudan veya dolaylı yoldan proteinlerle etkileşmek zorundadırlar (Holsapple,
Jones, Kawabata, Kimber, Sarlo, Selgrade, Shah ve Woolhiser, 2006).
Kimyasal alerjenler için ikinci gereksinim uygun doku kompartmanına geçişleridir. Hem
temas hem de solunum alerjenleri için varsayım, hedef dokunun epitelyum olduğudur.
Temas alerjenleri için epidermis iken, solunum alerjenleri için epidermis veya solunum
epitelyumudur. Canlı epidermise erişim stratum korneumun başarılı bir şekilde geçişini
gerektirirken, solunum bölgesinin epitelyumunu koruyan böyle bir bariyer mevcut değildir
(Kimber and Dearman, 2005).
Düşük molekül ağırlığındaki kimyasal alerjenlerin immün sistem tarafından yabancı olarak
tanınıp immün yanıtı başlatmaları için protein-kimyasal kompleksi oluşturmaları
gerekmektedir (Roggen ve diğerleri, 2008). Bu kompleksler immün sistemin diğer
hücrelerine antijen sunan hücreler tarafından sunulmak üzere işlenir. Primer immün
yanıtları başlatan en etkili hücreler dendritik hücrelerdir (Viola ve diğerleri, 1999).
Antijene cevaben, spesifik B lenfositleri bölünerek spesifik IgE antikoru salgılayan plazma
hücrelerine farklılaşmak üzere stimüle edilirler. Alerjik reaksiyonlar gibi immün yanıtların
gelişimi CD4+ yardımcı T (Th) lenfositlerin ve bu hücrelerin sitokin ürünlerinin aktivitesi
ile yönetilir. İmmün yanıtta Th1 ve Th2 olarak gösterilen iki tip Th hücre fenotipi
baskındır ve salgıladıkları sitokinlerin fonksiyonlarına göre ayrılırlar (Abbas, Murphy ve
Sher, 1996). Her iki hücre popülasyonu da granülosit/makrofaj-koloni stimüle edici faktör
(GM-CSF) salgılarken, Th1 hücreleri interferon-γ (IFN-γ) ve tümör nekroz faktör-β (TNFβ) eksprese eder. Th2 hücreleri ise interlökin 4 (IL-4), IL-5, IL-10 ve IL-13 eksprese eder.
Th hücrelerinin fonksiyonel alt grupları, farklı nitelikte immün yanıtların gelişmesinde
etkilidir (Dearman, Betts, Humphreys, Flanagan, Gimour, Basketter ve Kimber, 2003a).
Th1 hücreleri hücre aracılı bağışıklığın sağlanmasından sorumlu iken, Th2 hücreleri
hümoral immün fonksiyonunda önemli olan B lenfositlerin kostimülasyonunu ve
farklılaşmasını başlatan sitokinleri üretirler (Abbas ve diğerleri, 1996). Th hücrelerinin bu
fonksiyonel ikililiği alerjik hastalıkların gelişimi ve ortaya çıkması ile bağlantılıdır
(Dearman ve diğerleri, 2003a).
7
Temas duyarlılığı veya deri alerjisi ve solunum bölgesinin alerjisi mesleki sağlıkla
yakından ilişkili kimyasal alerjilerin iki tipini oluşturmaktadır. Özellikle alerjik astım ve
alerjik temas dermatiti gibi aşırı duyarlılık reaksiyonları endüstrileşmiş ülkelerde önemli
mesleki sağlık problemleri arasındadır (Van Loveren ve Vos, 2011).
Temas alerjenleri deri sensitizasyonunu ve alerjik temas dermatitini indüklerken, solunum
alerjenleri solunum bölgesinin sensitizasyonunu stimüle ederler (Kimber ve diğerleri,
2011). Sensitizasyonun bu heterojenliği sadece maruziyet yolu farklılığına atfedilemez.
Alerjenik kimyasallar, elektrofilik ve düşük molekül ağırlığında olmaları gibi pek çok
bakımdan benzerlik gösterirlerken farklı tiplerde alerjik sensitizasyon oluşturabilirler
(Kimber and Dearman, 2002, 2005).
Deri sensitizanı kimyasalları ve solunum bölgesinin sensitizasyonuna neden olan
kimyasallara ilişkin düşünülen, CD4+ T lenfosit alt gruplarının yanıtları ile karakterize
farklı nitelikte immün yanıtları ortaya çıkardıklarıdır. Özellikle fareler üzerinde yapılan
deneylerle temas alerjenlerine tekrarlayan maruziyetin Th1 tipi immün yanıtlara neden
olduğu, solunum alerjenlerin ise Th2 tip yanıtlarla ilişkili olduğunun gösterilmesi bu
teoriyi desteklemiştir (Kimber and Dearman, 1998; Dearman, Humphreys, Skinner, ve
Kimber, 2005; Kimber, Basketter, Thyssen, Dearman ve McFadden, 2014).
2.1.1. Temas aşırı duyarlılığı ve klinik sonucu alerjik temas dermatiti
Alerjik hastalıklar günümüzde çok ciddi çevresel ve mesleki sağlık sorunu olarak göze
çarpmaktadır. Alerjik temas dermatiti en sık bildirilen mesleki rahatsızlıklarda ikinci sırada
yer alıp tüm mesleki hastalıkların %10-15’ini oluşturmaktadır. İşçi üretkenliğinde azalışa
neden olan mesleki dermal hastalıklar yılda yaklaşık 1 milyar dolar sosyoekonomik kayba
yol açmaktadır (Anderson ve diğerleri, 2011).
Temas dermatiti dış ortamdaki ajanlar tarafından indüklenen deri inflamasyonudur. Deri
insan vücudunun en dış bariyeri olmasından dolayı çevreden gelen kimyasal ve fiziksel
faktörlerle karşılaşan ilk organdır (Saint-Mezard, Rosieres, Krasteva, Berard, Dubois,
Kaiselian ve Nicolas, 2004). Bariyer fonksiyonunun yanında immünolojik açıdan aktif
doku olarak da görev yapar. Langerhans hücreleri epidermisteki hücre popülasyonunun
%2-5’ini oluşturan kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerdir ve deride başlıca antijen
8
sunan hücrelerdir. Keratinositler ise epidermiste bulunan başlıca hücre tipi olup özgül
olmayan eksojen uyaranları sitokin moleküllerinin üretimine dönüştürerek sinyal
dönüştürücüsü olarak görev yapar (Van Och, 1971).
Deri sensitizasyonu mesleki ve çevresel sağlık kapsamında kimyasalların yol açtığı en
önemli alerjik hastalıklardan biridir ve temas aşırı duyarlılığı olarak da bilinir. Temas aşırı
duyarlılığı çeşitli kimyasal ve ilaçlar, kozmetikler ve çeşitli metallere maruziyet sonucu
oluşabilmektedir (Van Och, Van Loveren, De Jong ve Vandebriel, 2002).
Temas aşırı duyarlılığı doğuştan kaynaklanmaz; fakat her zaman için önceden kutanöz bir
temas sonucu gerçekleşir. Temas aşırı duyarlılığına sahip bireylerde alerjene birkaç gün
içinde doğrudan maruziyet sonucu dermatit gelişir ve epidermisteki mononükleer
hücrelerin perivasküler inflamatuar infiltrasyonu ile karakterizedir. Sertlik ve ödem
oluşumu ile birlikte artan damar geçirgenliği ve kızarıkla sonuçlanan vazodilatasyon
inflamasyonun belirtilerindendir (Van Och ve diğerleri, 2002).
Temas aşırı duyarlılığı, deri immün sisteminin anormal yanıtının neden olduğu gecikmiş
tip IV aşırı duyarlılık reaksiyonudur ve T lenfositlerin dermis ve epidermise infiltrasyonu
ile karakterizedir. Tip IV gecikmiş aşırı duyarlılık yanıtları maruziyeti takip eden 24-72
saat içerisinde daha önceden duyarlanmış bireylerde gözlenir (Manetz ve Meade, 1999).
Temas alerjenleri genellikle oldukça düşük molekül ağırlığına sahip (>500 Da), yağda
çözünebilen ve immün sistem tarafından doğrudan tanınmayan hapten yapısındadırlar (Van
Och ve diğerleri, 2002).
Temas aşırı duyarlılığın oluşması için üç eleman gereklidir: Antijen sunan dendritik
hücreler (Langerhans hücreleri), haptene özgü T lenfositleri ve haptenin kendisi (SaintMezard ve diğerleri, 2004).
Deride uyarılmış immün cevapların gelişebilmesi için kimyasal alerjenin öncelikle
epidermise ulaşması gereklidir. Bu durum kimyasalın stratum korneumdan geçebilmesini
gerektiren fizikokimyasal özelliklerine bağlıdır. Epidermise geçiş gerçekleştikten sonra
protein-kimyasal
kompleksleri
oluşur.
Bu
epidermal
Langerhans
hücrelerinin
sorumluluğundadır. Langerhans hücrelerinin edinilmiş immün sistemdeki görevleri antijeni
tanımak, afferent lenf kanalları ile bölgesel lenf düğümlerine antijeni taşımaktır.
9
Langerhans hücrelerinin deriden hareketi ve lenf düğümleri içine lokalizasyonu epidermal
sitokinler tarafından başlatılır ve kontrol edilir (Cumberbatch, Dearman, Griffiths ve
Kimber, 2000; Kimber ve diğerleri, 2000). Langerhans hücrelerinin yer değiştirilmesinde
rol oynayan sitokinler tümör nekroz edici faktör alfa (TNF-α) ve IL-1β’dır (Cumberbatch
ve diğerleri, 2000). Ayrıca IL-10’un zıt regülasyonda rol oynadığı ve Langerhans
hücrelerinin göçünü inhibe ettiğine dair veriler bulunmaktadır (Wang, Zhuang, Fujisawa,
Shinder, Feliciani ve Shivji, 1999).
Alerjenin etkili transportu ve sensitizasyonun kazanılması için uygun epidermal
sitokinlerin indüklenmesini sağlayacak yeterli miktarda kimyasalın deriye uygulanması
gerekir. İndüklenen inflamasyonun derecesi deri sensitizasyonun etkinliği, alerjenin gücü
ve deri yüzeyine uygulanan kimyasalın miktarına bağlıdır. Bütün bu değişkenler uygun ise
immünojenik stimülasyon, Langerhans hücrelerinin lenf düğümlerine hareketi ve T
lenfositlerin cevabı ile gerçekleşir. Deri sensitizasyonun kazanılması özgül T lenfosit
cevabının uyarılması ile olur. Topik uygulanan kimyasallar tarafından indüklenen lenf
düğümlerinin proliferatif cevabının kuvveti ile sensitizasyonun geliştiği alan arasında
korelasyon vardır (Dearman ve Kimber, 1991). Böylece daha sonra bahsedileceği üzere
indüklenmiş lenf düğümü hücrelerinin proliferatif cevabının büyüklüğü ölçülerek
alerjenlerin reaktif güçlerini tespit etmek mümkündür.
Alerjik hastalıkların bütün tiplerinin genel bir özelliği olarak, temas alerjisi de iki fazda
gerçekleşir. Bunlardan ilki alerjenle ilk teması içeren ve herhangi bir klinik belirti
görülmeyen sensitizasyon fazı olup, ikincisi tekrar maruziyet sonrası insan ve farede
sırasıyla 72. ve 24. saatte pik inflamatuar reaksiyonu ile dermatitle sonuçlanan ortaya
çıkma fazıdır (Dhingra, Shemer, Da Rosa, Rozenblit, Suárez-Fariñas, Fuentes-Duculan,
Gittler, Finney, Czarnowicki, Zheng, Xu, Estrada, Cardinale, Krueger ve Guttman-Yassky,
2014):
1.faz: Sensitizasyon (indüksiyon) fazı: Derinin hapten ile ilk temasını oluşturur ve lenf
düğümlerinde haptene özgül T hücrelerinin oluşumuna ve bunların tekrar deriye göçüne
sebep olur. Deriye giren antijenik özellik kazanan haptenler, epidermisteki doku
makrofajları olan Langerhans hücreleri (antijen sunan hücreler) tarafından fagosite edilir.
Lenf damarları ile dermise ve bölgesel lenf düğümlerine göç eden bu hücreler, antijenik
molekülü, dermiste ve lenf bezlerinin parakortikal bölgesindeki naif T lenfositlere (Th0)
10
MHC (majör histocompatibilite kompleks) molekülleri aracılığı ile sunarlar (Saint-Mezard
ve diğerleri, 2004). Naif T lenfositleri yabancı antijenleri arayıp bulmak için periferik
lenfoid organlarda devamlı olarak dolaşırlar. Naif T hücreleri antijen tanımada rol oynayan
antijen
reseptörlerini
eksprese
ederler.
Ancak
naif
T
hücrelerinin
fonksiyon
gösterebilmeleri için efektör hücrelere dönüşmesi gerekir, bu süreç antijen tanınması ile
başlamaktadır. Antijenik uyarım sonucu antijene özgül T hücreleri sitokinler salgılamaya
başlar (Abbas ve Lichtman, 2007). Böylece lenfositlerde proliferasyon başlar ve deriye
giren antijene özgül T lenfositler (klonlar) oluşur. Bu duyarlanmış lenfositler dolaşıma
karışır, bir kısmı da dermise yerleşir. Bu olaylar zincirine “sensitizasyon fazı” denir.
İnsanlarda yaklaşık olarak 2 hafta, farelerde 5-7 gün kadar bir süre içinde gerçekleşir.
Haptenin sensitizasyonu indüklemesi iki farklı özelliğine dayanır: Proenflamatuar
özelliğinin yanında hapten, derinin doğal bağışıklığını aktive eder ve dendritik hücrelerin
olgunlaşmasını ve göçünü indükleyen sinyallerin oluşmasını sağlarlar (Saint-Mezard ve
diğerleri, 2004).
2.faz: Ortaya çıkma (aktivasyon) fazı: Duyarlı bireyler aynı haptenle tekrar karşılaşınca,
24-72 saat içerisinde alerjik temas dermatiti oluşur. Hapten deriye difüze olduktan sonra,
MHC sınıf I ve sınıf II molekülleri aracılığıyla hapten-peptid kompleksleri deri hücreleri
tarafından içeri alınır. Organizma, aynı antijenle ikinci defa karşılaşacak olursa, deride
duyarlı lenfositlerle antijenin birleşmesi sonucu sitokinler ortaya çıkar. Sitokinlere bağlı
olarak bölgesel doku hasarı ve inflamasyon meydana gelir. Bu sitokinlerin başlıcaları; IL-1
(Langerhans hücrelerince salınır, T lenfositlerden IL-2 salınmasına yol açar), IL-2 (T
lenfositlerden salgılanır, diğer T hücrelerini aktive eder), IFN-γ (T lenfositlerden salgılanır,
sitotoksik T hücreleri, NK hücreleri ve makrofajları aktive eder). Sonuçta; epidermiste
ödem (spongioz) ve vezikülasyon, dermiste ise inflamatuar infiltrat oluşur. Bu safhaya
“ortaya çıkma fazı” denir. 24-72 saat içerisinde gerçekleştiğinden dolayı “gecikmiş tip IV
alerjik reaksiyon” olarak adlandırılır. İnflamatuar reaksiyon birkaç gün sürer, daha sonra
baskılayıcı mekanizmalar ile azalır (Saint-Mezard ve diğerleri, 2004).
11
İNDÜKSİYON FAZI
ORTAYA ÇIKMA FAZI
Aktive edilmiş
T hücreleri
LENF DÜĞÜMLERİ
Yardımcı T hücreleri (Th)
IL-2, IL-3, IL-4,
IFN-γ
Kemotaksi
Damar geçirgenliği
Hücresel infiltrasyon
Bellek T
lenfositleri
Şekil 2.1. Temas aşırı duyarlılığın indüksiyon ve ortaya çıkma fazları (Van Och ve
diğerleri, 2002)
2.1.2. Solunum sensitizasyonu
Solunum sensitizasyonu, belirli bir antijen solunduğu zaman özellikle spesifik IgE antikoru
varlığına bağlı olarak gelişen immun durumdur. Solunum alerjisi bu durumun klinik
belirtisi olup, en önemli semptomları arasında bronşiyal astım ve yüksek ateşle seyreden
rinit bulunur. Solunum alerjisinin bu formu hem yüksek hem de düşük molekül ağırlığına
sahip kimyasallar tarafından oluşturulur. (Vangosa ve diğerleri, 1994).
Solunum bölgesinin aşırı duyarlılık reaksiyonu terimi, sensitizan ajanların maruziyetinden
kaynaklanan erken ve geç alerjik reaksiyonları, solunum yolu inflamasyonu ve solunum
yolu aşırı duyarlılığı gibi çok çeşitli yanıtları ifade etmek için kullanılır. Sensitizanın tipi,
maruziyet düzeyi ve tetiklenen yanıtın tipine bağlı olarak bu belirtilerin sadece bir kısmı
gelişir. Mevcut hayvan modelleri patofizyolojik değişikliklerin sadece bir kısmını
yansıtabilmektedir. Dolayısıyla akciğerlerdeki aşırı duyarlılık reaksiyonları çok etkenli
olup, ilişkili mekanizmalar tamamıyla anlaşılabilmiş değildir (Roggen ve diğerleri, 2008).
12
İşyerinde düşük molekül ağırlığına sahip kimyasallara maruziyet, alerjik rinit ve mesleki
astım gibi solunum bölgesi aşırı duyarlılık reaksiyonları (alerji) ile ilgili hastalıklarla
ilişkilendirilmektedir. Mesleki astım dünya genelindeki astım vakalarının % 2-15’ini
oluşturmaktadır. Mesleki astım hastane masrafları, işçi tazminatları ve çalışma saati
kayıpları ile birlikte ABD’de yılda 400 milyon dolar zarara neden olmaktadır (Dearman ve
diğerleri, 2013).
Mesleki astım gelişmiş ülkelerde en sık görülen mesleki akciğer hastalıklarındandır.
250’den fazla maddenin mesleki astıma yol açtığı ve daha fazlasının gelecekte
belirleneceği bilinmektedir. Mesleki astım işyerinde bulunan ajana maruziyetle ilişkili
olarak geri dönüşümlü solunum yolu tıkanıklığı, solunum yolları inflamasyonu ve
nonspesifik solunum yolu hiperaktivitesi ile karakterizedir (Vanoirbeek ve diğerleri, 2006).
Solunum alerjisine neden olduğu bilinen kimyasallar izosiyanatlar (toluen diizosiyanat),
asit anhidritler (trimellitik anhidrit - TMA), reaktif boyalar, platin tuzları ve glutaraldehittir
(Vanoirbeek ve diğerleri, 2006).
Solunum alerjisinin gelişimi de alerjik temas dermatitinin oluşumu gibi iki aşamadan
oluşmaktadır. Bunlardan ilki sensitizasyon evresi olup, immün durumun gelişimini kapsar.
İkincisi ise alerjinin klinik dışavurumu ile sonuçlanan ortaya çıkma evresidir. Sonuç
olarak, önceden maruz kalmamış (naif) ancak duyarlı bireyler alerjik protein veya
kimyasala ilk maruziyet anında alerjik belirtileri göstermezler. En az iki maruziyet
gerekirken bazı durumlarda haftalarca veya aylarca süren tekrarlanan maruziyeti de
gerektirebilir. Bunu duyarlanmış bireyin sonradan aynı bileşiğe tekrar maruz kalması ile
alerjinin gerçek anlamda ortaya çıkması takip eder. Alerjik reaksiyonun yapısı ve ciddiyeti,
sensitizasyon ve ortaya çıkma fazı boyunca alerjen maruziyet yolu, süresi ve dozunun yanı
sıra bireyin genetik altyapısı, alerjenin özellikleri gibi çok sayıda faktöre bağlıdır
(Boverhof ve diğerleri, 2008).
Alerjik astım ve rinit genellikle ani tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarıdır, 1 saat içinde veya
birkaç dakika süren maruziyet ile inflamatuar mediyatörlerin bölgesel salınmasından
kaynaklanır. Bu tip reaksiyonlar çoğu zaman IgE antikorundan etkilenir. Solunum
sensitizasyonunun indüksiyon fazı sırasındaki en önemli olay immun yanıt oluşumudur,
13
özellikle doku mast hücrelerine bağlanan antikorların üretimidir (Vangosa ve diğerleri,
1994).
Tip I ani aşırı duyarlılık reaksiyonlarının regülasyonunda Th1 ve Th2 yanıtları dengesi esas
faktördür. Th1 hücreleri immün yanıtı azaltırken, Th2 yanıtları artırır (Goldsby ve
diğerleri, 2002). Tip I aşırı duyarlılık olaylar sıralaması, bir antijene karşı IgE antikorunun
üretilmesi ile başlar, daha sonra bu IgE antikoru mast hücresi yüzeyindeki Fc reseptörüne
bağlanır, antijenle tekrar karşılaşıldığında IgE antikoru mast hücresinden mediyatörlerin
salınmasına neden olur. Mast hücre mediyatörleri hızlı bir şekilde damar geçirgenliğini
artırıp düz kasları kasarak bu reaksiyonlardaki klinik bulguların oluşmasına yol açar. Bu
damarsal ve düz kas reaksiyonu, duyarlı kişilerde antijenle tekrar karşılaşma sonrasında
dakikalar içerisinde gelişebilmektedir. Mast hücrelerinin diğer mediyatörleri de ilerleyen
saatlerde nötrofil ve eozinofillerin reaksiyon bölgesine toplanmasına neden olan
sitokinlerdir. Geç faz reaksiyon denilen ani aşırı duyarlılık inflamatuar bileşeni, tekrarlayan
ani aşırı duyarlılık tepkileri sonucu oluşan doku hasarından sorumludur. Alerjiye yatkın
bireylerde, bazı antijenlerle karşılaşma Th2 hücrelerinin aktivasyonuna ve IgE antikorların
üretimine neden olmaktadır. Normal bireyler ise kuvvetli bir Th2 yanıtını yabancı
antijenlerin çoğuna karşı geliştirmezler. (Abbas ve Lichtman, 2007).
Th2 hücreleri tarafından salınan IL-4 ve IL-13 sitokinleri B lenfositlerini uyararak
antijenlere özgül IgE üreten hücrelere dönüşümlerini sağlarlar. Bu nedenle atopik bireyler,
normal kişilerde IgE yanıtına neden olmayan antijenlere karşı fazla miktarlarda IgE
antikorları üretirler (Abbas ve Lichtman, 2007).
Mast hücre granüllererinden salınan vazoaktif aminler ve proteazlar, araşidonik asit
metabolizma ürünleri ve sitokinler en önemli mediyatörlerdir. Bu mediyatörlerin farklı
etkileri vardır. Histamin, en önemli amin olup, küçük çaplı kan damarlarında genişlemeye,
damar geçirgenliğinde artışa, düz kaslarda geçici kasılmalara neden olur. Proteazlar,
dokularda yerel hasara sebebiyet verir. Araşidonik asit metabolitlerinden prostaglandinler,
vasküler dilatasyona, lökotrienler ise uzun süreli düz kas kasılmalarına neden olurlar.
Sitokinler lokal inflamasyonu başlatırlar. Bu nedenle mast hücre mediyatörleri, ani aşırı
duyarlılık temel olayları olan damar ve düz kas reaksiyonlarından ve inflamasyondan
sorumludur (Abbas ve Lichtman, 2007).
14
Mast hücreleri tarafından üretilen sitokinler, geç dönem reaksiyona neden olan lökositlerin
toplanmasını uyarırlar. Bu reaksiyonda rol alan başlıca lökositler eozinofiller, nötrofiller ve
Th2 hücreleridir. Mast hücresi kaynaklı tümör nekroz faktörü (TNF) ve IL-4, nötrofilden
ve eozinofilden zengin infalamasyonu artırır. Eozinofiller ve nötrofiller proteazlarını
salarak doku hasarına neden olurken, Th2 hücreleri daha fazla sitokin üreterek reaksiyonu
artırırlar. Eozinofiller alerjik reaksiyonların en önemli bileşenleri olup, bu reaksiyonlardaki
doku hasarının sorumlularıdır. Bu hücreler, mast hücreleri ve Th2 hücrelerince üretilen IL5 sitokini tarafından aktive olurlar (Abbas ve Lichtman, 2007).
Astım solunan alerjenlerin bronşlardaki mast hücrelerini uyararak aralarında lökotrienlerin
de bulunduğu mediyatörlerin salınımına ve buna bağlı olarak bronşlardaki düz kaslarda
kasılma ve solunum yollarında tıkanıklığa yol açabilir. Kronik astımda, bronş
mukozasındaki eozinofil ve mukus salgısında artış ve bronş düz kaslarında çeşitli
uyaranlara karşı aşırı duyarlılık mevcuttur (Abbas ve Lichtman, 2007).
Astım patojenezinde hücre aracılı immün olaylarının da rolünün olduğu görüşü giderek
yaygınlık göstermektedir (Corrigan ve Kay, 1992). Astımda kronik inflamasyonun rolü
büyüktür ve bronşiyal mukozada lökositlerin akümülasyonu, mukus üretimi ve solunum
yolu hücrelerinin hasarı ile ilişkilendirilir. T lenfositler eozinofillerle birlikte bronşiyal
inflamasyonun gelişiminde merkezi role sahiptir. Hücre aracılı immün reaksiyonlar,
alerjenlere karşı gelişen geç faz solunum reaksiyonların gelişiminde ve astımın uzun süreli
ilerleyişinde önemlidir (Vangosa ve diğerleri, 1994).
Epidemiyolojik çalışmalar solunum sensitizanlarının kompleks semptomları indüklediğini
göstermektedir; bu kimyasallar alerjik astım dışında, eozinofili ve akciğerlerde solunum
yolları fonksiyon bozuklukları gibi hastalıkların gelişmesine de neden olmaktadır (Mori ve
diğerleri, 2012).
2.2. Alerjik Temas Dermatiti ve Solunum Sensitizasyonunda Sitokinlerin Rolü
Sitokinler, immün hücrelerde eksprese edilen spesifik reseptörler aracılığı ile çok küçük
konsantrasyonlarda (pikomolar) biyolojik fonksiyonlarını gösteren küçük polipeptid
moleküllerdir (Abbas ve Lichtman, 2007). Hücre büyümesi, farklılaşması ve göçü ile
immün fonksiyonları içeren hücreye özgü etkilere aracılık etmek üzere, eksojen uyaranlara
15
cevaben kısa süreli ve lokal olarak üretilirler (Van Och ve diğerleri, 2002). Sitokinler,
hedef hücrelerin yüzeyleri üzerindeki spesifik reseptörler aracılığı ile hücreden hücreye
etkileşimde görev alan çok çeşitli hücre tipi tarafından üretilmektedir (Chung ve Barnes,
1999). Epidermis içerisinde kerotinositler başlıca sitokin kaynağıdır. Sitokinler ayrıca
Langerhans hücreleri ve melanositler tarafından da üretilir (Williams ve Kupper, 1996).
Sitokinler bütün immun ve inflamatuar yanıtların indüksiyon ve efektör fazına katılır.
Bütün sitokinler kendi hedef hücrelerine sinyal iletirken plazma membranındaki spesifik
reseptörlerine bağlanır (Kelso, 2000). Farklı immunojenler farklı sitokinlerin sentezini
indükler bu da farklı immun efektör mekanizmaları aktive eder. Sitokin sentezini tetikleyen
uyaranın yapısı hücre tarafından üretilecek sitokinin belirlenmesinde önemli bir faktördür.
Bir sitokinin aynı veya farklı bir sitokinin sentezini stimüle etmesi olarak tanımlanan
sitokin kaskatı, ilk yanıtı güçlendirmek ve değiştirmek için önemli bir mekanizmadır
(Kelso, 1998).
CD4+ T hücreleri sitokin üretimlerinden dolayı neredeyse tüm immün yanıtlarda merkezi
düzenleyici role sahiptir. Olgunlaşmış periferal T hücreleri antijen tanınması ve
kostimülasyonu sonucu aktive olana kadar sitokin üretmezler, ancak birçok sitokini sentez
etme kapasitesine sahiptir (Kelso, 1998).
Özelleşme, T hücreleri in vivo immün yanıtlardan sonra (özellikle kronik yanıtlardan) veya
in vitro kültür koşulları altında klonal ekspansiyona uğradığında gerçekleşir. Bu özelleşmiş
sitokin modellerinden en iyi karakterize edilenleri Th1 ve Th2’dir. Tip 1 ve tip 2 sitokin
gurupları efektör mekanizmaların aktivasyonuna ön ayak olur, bu nedenle belirli
patojenlere karşı verilen immün reaksiyon ve yanıtların tipleriyle ilişkilendirilir (Kelso,
1998).
Sitokin yanıtının belirlenmesinde ilk ve en önemli basamak uygun indükleyici sinyalin ve
bu sinyal için fonksiyonel reseptörleri eksprese eden hücrelerin varlığıdır (Kelso, 2000).
Öncelikle, derinin temas sensitizanlarına maruz kalmasıyla epidermiste keratinosit ve
Langerhans hücreleri tarafından sitokin üretimi hızlı bir şekilde artar ve Langerhans
hücrelerinin olgunlaşması ile göçü başlatılmış olunur. Bu süreçte görev alan başlıca
sitokinler GM-CSF, IL-1 ve TNF-α’dır (Kimber ve diğerleri, 2000).
16
Antijenlere yanıt olarak, T lenfositleri, özellikle CD4 + T hücreleri hızlıca farklı etkilere
sahip farklı sitokinler salgılar. Aktivasyonu takiben 1-2 saat içinde CD4+ T lenfositlerinden
üretilen ilk sitokin IL-2’dir. Antijenle uyarılmış T hücreleri tarafından üretilen IL-2
özellikle aynı T hücresine bağlanıp etkisini gösterir. IL-2’nin temel rolü T hücre
çoğalmasını uyarmaktır, bu nedenle IL-2 T hücre büyüme faktörü olarak da adlandırılır. T
hücreleri IL-2 uyarımı ile hücre döngüsüne girer ve bölünmeye başlar, sonuçta antijene
özgül T hücreleri sayısında artış olur (Abbas ve Lichtman, 2007).
CD4+ yardımcı T hücreleri değişik sitokinleri üreterek farklı fonksiyonlara neden olan
efektör hücre alt gruplarına farklılaşabilirler. Bu alt gruplar Th1 ve Th2 hücreleri olarak
adlandırılmıştır. Antijen ile uyarılan yardımcı T hücrelerin hangi alt gruba farklılaşacağı
üretilen sitokinler tarafından belirlenir (Goldsby ve diğerleri, 2002).
Th1 ve Th2 hücrelerinin gelişimi rastlantısal bir olay değildir, naif CD4 + T hücrelerinin
antijenlerle karşılaştığı zaman aldığı uyarı tarafından düzenlenir. Makrofajlar ve dendritik
hücreler IL-12 adı verilen bir sitokin üreterek immün yanıt oluştururlar. Naif T hücresi
aynı antijen sunan hücreler tarafından sunulan bu antijenleri tanıdığı zaman, T hücreleri
aynı zamanda IL-12’ye de maruz kalırlar. IL-12, T hücrelerinin makrofajları aktive eden
IFN-γ üreten Th1 alt grubuna farklılaşmasını uyarır. Doğal immün yanıt bu durumda,
antijen sunan hücrelerden IL-12 üretimi ile kazanılmış immün yanıtın doğal gidişini etkiler
ve Th1 hücrelerine doğru yönlendirir. Eğer antijen, antijen sunan hücreler tarafından IL-12
üretimine neden olmazsa, T hücreleri bu durumda IL-4 üretir. Bu da bu hücrelerin Th2 alt
grubuna doğru farklılaşmasını indükler. Th1 ve Th2 farklılaşmasındaki denge öncelikle
belirli antijenlere karşı yanıtta dendritik hücrelerin tipleri tarafından etkilenebilir. Farklı
dendritik hücre alt grupları, antijenler tarafından aktive olduklarında farklı sitokinleri
salgılamaları ve farklı yanıt vermeleri sonucunda efektör T hücrelerini Th1 ve Th2
yönünde indükler (Abbas ve Lichtman, 2007).
Th1 hücreleri gecikmiş tip aşırı duyarlılık yanıtları ile ilişkilidir ve bu yanıtlar Th1
sitokinlerinden IFN-γ ile yönetilir. IL-2 üretimi yapan farklılaşmamış yardımcı T hücreler
ve doğal öldürücü hücreler (NK) tarafından üretilen ilk sitokin IFN-γ’dır. IFN-γ makrofaj,
nötrofil ve doğal öldürücü hücreleri aktive eder, T ve B hücre farklılaşmasını başlatarak
IL-1 ve IL-2 sentezini artırır (Van Och ve diğerleri, 2002).
17
Buna karşın, Th2 hücre aktivasyonu IgE antikor yanıtının indüksiyonu ve devamlılığı için
gerekli Th2 sitokini IL-4’ün ekspresyonu ile ani tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarını başlatır.
Th1 hücre sitokini IFN-γ ise IgE üretimini inhibe eder. Ayrıca Th2 sitokinleri, alerjik
yanıtın klinik belirtilerinin ortaya çıkmasında önemli rolü olan eozinofil ve mast
hücrelerinin gelişimi ve farklılaşması ile eozinofilerin toplanmasının stimülasyonu gibi ani
tip reaksiyonları tetiklerler (Kimber ve Dearman, 1997). IL-4, IL-10 ve IL-13 gibi Th2
hücreleri tarafından üretilen sitokinlerin bazıları makrofaj aktivasyonunu inhibe eder ve
Th1 hücre aracılı immüniteyi baskılar. Bu nedenle, bir antijene karşı hücre aracılı immün
yanıtların etkisi bu antijene yanıtta Th1 ve Th2 hücrelerinin aktivasyonu arasındaki denge
ile sağlanabilir (Abbas ve Lichtman, 2007).
Şekil 2.2. Th1 ve Th2 hücrelerini birbirinden ayıran sitokin yanıtları ve immun yanıtlardaki
farklı rolleri (Selgrade ve diğerleri, 1997)
CD4+ T lenfositlerin Th2 alt grubu, eozinofilden zengin inflamasyonu uyarır ve makrofaj
aktivasyonunun zarar verici etkilerini kontrol altına almaya çalışır. Farklılaşmış Th2
hücreleri antijeni tanıyınca, bu hücreleri IL-4 ve IL-5 (aynı zamanda birçok başka hücre
tarafından da üretilen IL-10) sitokinlerini üretirler. IL-4 IgE antikor üretimini uyarırken,
IL-5 eozinofilleri aktive eder (Foster ve diğerleri, 1997; Bousquet ve diğerleri, 2000;
Abbas ve Lichtman, 2007; Zhu ve Paul, 2008).
IL-4, IL-10 ve IL-13 gibi birçok sitokin üretiminin yanında Th2 hücreleri makrofaj
aktivasyonunu da inhibe etmektedir. Bu nedenle Th2 hücreleri, Th1 aracılı gecikmiş tip
aşırı duyarlılık reaksiyonlarını yok etmeye yardımcı olmakta ve böylece Th1 hücresel
koruyucu bağışıklıkta sıklıkla görülen doku hasarını sınırlamaktadır (Abbas ve Leichtman,
2007; Zhu ve Paul, 2008).
18
IL-4, alerjik inflamasyonun gelişimindeki temel sitokindir. Alerjik inflamasyondaki temel
biyolojik aktivitesi naif T yardımcı lenfositlerin (Th0) Th2 lenfositlerine farklılaşmasını
yürütmektir. B lenfositlerinden IgE sekresyonu ile ilişkili olup, IgE aracılı immün yanıtlar
IL-4 tarafından artırılır. IL-4 diğer inflamatuar sitokinlerin fibroblastlardan ekspresyonunu
artırıp inflamasyona ve kronik astıma katılımını sağlar. Ayrıca T lenfosit, monosit, bazofil
ve eozinofillerin göçünü yönetir. Eozinofil apoptozunu inhibe edip eozinofilik
inflamasyonu başlatır (Steinke ve Borish, 2001).
Th2 lenfosit farklılaşması inhibe edildiğinde ve Th2 hücre apoptozu indüklendiğinde, IL4’ün biyolojik aktivitelerinin inhibe edildiği ve IL-5 üretiminin azaldığı gösterilmiştir
(Steinke ve Borish, 2001). Alerjik solunum yolu hastalıklarının gelişiminde bir diğer
önemli sitokin olan IL-5 solunum yolu hiperaktivitesi, eozinofillerin büyümesi,
farklılaşması ve aktivasyonunu stimüle eder (Foster ve diğerleri, 1997).
IL-10 ise, Langerhans hücrelerinin Th1 lenfositlerine antijen sunmasını inhibe ederken,
Th2 lenfositlerin aktivasyonunu artırır (Selgrade ve diğerleri, 1997).
IL-13’ün akciğerlerde inflamasyonu, aşırı mukus sekresyonunu ve fibrozisi indüklediğinin
gösterilmesi, alerjik astımda önemli bir mediyatör olduğunu ortaya koyar (Renauld, 2001).
Ayrıca diasetilin neden olduğu akciğerlerin inflamasyonlu hastalığı bronşiyolitis obliterans
sendromunun, artan IL-13 seviyeleri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (Keane ve diğerleri,
2007).
2.3. Kimyasalların Sensitizasyon Potansiyellerinin Ölçüm Yöntemleri
Alerjik hastalıklar günümüzde ciddi bir çevresel ve mesleki sağlık sorunu oluşturmaktadır.
Alerjik temas dermatiti mesleki hastalıklar arasında en sık raporlanan olup, bütün mesleki
hastalıkların %10-15’ini oluşturmaktadır. Bu durum kamu sağılığı üzerinde ciddi bir mali
yük oluşturmaktadır; tıbbi tedavi, işçi tazminatı ve iş kaybı ile birlikte yıllık masrafı 1
milyon dolara mal olmaktadır. Bu nedenle kimyasal sensitizanlarının tehlikelerinin
belirlenmesi için hızlı ve hassas yöntemlerin geliştirilmesine ağırlık verilmiştir (Anderson
ve diğerleri, 2011). Yıllarca toksikolojideki başlıca hedef bu maddeleri belirlemek ve insan
sağlığı için oluşturduğu riskin değerlendirilmesi ve yönetilmesidir (Basketter, 2008).
19
Bu amaçla ilk olarak Kobay Maksimizasyon Testi ve Buehler Testi kullanılmıştır. İnsan
yama testinin hala bazı ülkelerde deri alerjenleri için doğrulayıcı test olarak kullanılmasına
karşın, etik kaygılar ve daha güvenilir alternatif test prosedürlerinin varlığı insan yama
testinin geçerliliğini büyük ölçüde azaltmıştır. Bu testlere alternatif olarak Lokal Lenf
Düğümü Testi’nin geliştirilmesi ve 1999, 2000 yıllarında ICCVAM ve ECVAM tarafından
valide edilmesi ile birlikte kimyasal deri sensitizanlarının belirlenmesinde Lokal Lenf
Düğümü Testi (LLNA) öncelikli yöntem olarak tercih edilmektedir (Anderson ve diğerleri,
2011).
Sensitizasyon için günümüzde valide olan tek yöntem LLNA’dır. 1990’lerin başında
Kimber ve Basketter tarafından geliştirilmiş olup, yoğun bir validasyon sürecinden
geçmiştir. 1999 yılında Birleşik Devletler’in Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından
validasyon raporu yayınlanmıştır. Bundan 3 yıl sonra Temmuz 2002 yılında OECD
tarafından kabul edilmiştir (OECD kılavuzu TG 429). 2010 yılında temel protokolde küçük
değişiklikler yapılarak revize edildi (Rovida, 2011). Son zamanlarda bu metod, Avrupa
Birliği’ndeki yeni REACH regülasyonu ile ilk ihtiyaç duyulan sensitizasyon testi haline
gelmiştir. (Anderson ve diğerleri, 2011).
Kobay maksimizasyon testi ve Buehler testi ile kıyaslandığında daha az deney hayvanı ile
çalışılması, hem alerjik reaksiyonların çok şiddetli olmaması hem de uygulama süresince
hayvanlara daha az acı verilmesi 3R (Reduction, Refinement, Replacement/ Azaltma,
iyileştirme, yerine koyma) açısından bu LLNA alternatif bir yöntem olarak kabul
görmüştür. Hala in vivo bir yöntem olmasına karşın en büyük önemi taşıyan “R” olan
yerine koyma, deney hayvanları yerine daha az gelişmiş organizma veya hücre kullanma)
hala erişilmemiştir. Bu nedenle diğer in vivo yöntemler gibi LNNA’da sadece gerekli
olduğu zaman uygulanmaktadır (Rovida, 2011).
LLNA kobay testleri ile karşılaştırıldığında çok fazla avantaja sahiptir. Kobay testleri
kayda değer güvenilirliğe sahip olsa da, yüksek oranda yanlış pozitif veya yanlış negatif
sonuç gösterir. LLNA en son verilerin subjektif bir yorumlamadan ziyade enstrümantal
ölçüme dayalı olduğu daha iyi standardize edilmiş prosedürün avantajına sahiptir. LLNA
sadece
evet/hayır
yanıtından
farklı
olarak,
test
maddesinin
etkinliği
üzerine
değerlendirmede bulunmaya imkan tanıyacak şekilde doz yanıt ilişkisi sunmaktadır. 24
gün süren kobay testlerine kıyasla test süresi daha kısadır. Ayrıca dermal aşırı duyarlılık
20
reaksiyonlarının ortaya çıkışını gerektirmeden, adjuvana ihtiyaç olmaksızın test
maddesinin deney hayvanı üzerine uygulanması gibi basit bir işlemi gerektirir. Bu nedenle
deney hayvanına verilen acı ve stres büyük ölçüde azaltılmış olur (Rovida, 2011).
Standart
LLNA’da
radyoaktif
materyalin
kullanılması
testin
uygulanabilirliğini
kısıtlamasından dolayı, radyoaktif madde kullanımını gerektirmeyen alternatifleri
geliştirilip valide edilmiştir ve OECD kılavuzuna TG 442A ve 442B olarak dahil
edilmiştir. Kısaca bu yöntemler trifosfat içeriğinin biyoluminesans yoluyla, 5-bromo-2deoksiüridinin miktarının (BrdU) ELISA test sistemi ile belirlenmesi suretiyle lenfosit
proliferasyonunun ölçülmesine dayanır (Rovida, 2011).
Test
kimyasal
alerjen
maruziyetine
yanıt
olarak
lenfositlerin
selektif
klonal
ekspansiyonunun miktar tayinine dayanır. Buna göre auriküler lenf düğümlerindeki
proliferasyonu 3 kat ya da daha fazla oranda stimüle eden madde deri sensitizanı olarak
tanımlanır (Basketter, 2014).
LLNA, sensitizan etkinliğinin kantitatif ve objektif tahmini ile tehlikenin belirlenmesi için
ilk gerçek adım olmuştur. LLNA doz yanıt verisinin basit matematiksel interpolasyonu,
eşik pozitif yanıt üretmeye yeterli test kimyasalının konsantrasyonunu kantitatif olarak
tahmin etmeye yardımcı olur. Ancak bunun doğrudan insan için kesin bir değer olmadığı
unutulmamalıdır; insanlarda eşik indüksiyonu ile doğrudan bir ilişkisi yoktur. Bir olası
sensitizanın alerjen etki gücünün bir diğeri ile kıyaslanmasına imkan tanınır (Basketter ve
diğerleri, 2000).
LLNA ile deri ve solunum sensitizasyonununu ayrımının yapılması mümkün olmamasına
karşın, bu testle birlikte sitokin yanıtları derinin solunum sensitizasyonundan ayırt
edilmesini sağlamaktadır. Ancak solunum aşırı duyarlılığı için valide edilmiş in vivo veya
in vitro bir yöntem bulunmamaktadır (Vandebriel ve diğerleri, 2011).
Gerçek temas sensitizanlarının belirlenmesinin yanı sıra, klinik alerjik temas dermatiti ile
nadiren ilişkilendirilmelerine rağmen solunum sensitizanlarının da LLNA’da pozitif yanıt
verdiği yaygın olarak kabul edilmiştir (Holsapple ve diğerleri, 2006; Vanoirbreek ve
diğerleri, 2003). Temas aşırı duyarlılık reaksiyonları hücre aracılı (Th1) olduğundan,
LLNA’nın temas sensitizanları ile B hücre aracılı IgE üretimi vasıtasıyla hümoral Th2
21
yanıtını yöneten solunum sensitizanları arasında ayrım yapabildiği düşünülmektedir
(Vanoirbreek ve diğerleri, 2003). Ancak, bazı güçlü temas sensitizanları ile karma Th1/Th2
yanıtları gözlenmiştir (Kondo ve diğerleri, 1998). Bu nedenle deri sensitizasyonununda
temas ve solunum sensitizanları arasındaki fark lenf düğümlerindeki spesifik hücre
tiplerinin aktivasyonuna dayanmaktadır. Sitokin profillemesi ve serum IgE seviyeleri
(Dearman ve diğerleri, 2003b) gibi alternatif indikatörler temas ve solunum alerjenlerinin
ayrımının yapılabilmesi için umut vaat etmektedir. Ancak IgE yanıtındaki farklılıklar ve
sitokin parmak izi kontrolünün sınırlı kapasitesi, temas ve solunum sensitizanlarının
birbirinden ayırt edilebilmesi için LLNA’nın özgüllüğünü artıracak daha sağlam verilere
gereksinim olduğunu göstermektedir (Adenuga ve diğerleri, 2012).
Genel kanı LLNA’da negatif yanıt veren kimyasal deri sensitizasyonu potansiyelinden
yoksun olduğu gibi solunum sensitizasyonu potansiyelinden de yoksun olduğudur (Roggen
ve diğerleri, 2008). Ancak LLNA’daki pozitif yanıt kesinlikle o kimyasalın temas alerjeni
olduğunu gösterse de, solunum sensitizasyonu etkinliğine sahip olduğunun kesin kanıtı
değildir (Isola ve diğerleri, 2008) Bu fikir baz alınırsa önceden bir LLNA yürütülüp
ardından sadece pozitif yanıt veren kimyasallarla sitokin profillerinin çıkarılmasının uygun
olacağı düşünülmektedir. Böylece pozitif LLNA yanıtlarını tetikleyen uygulama
konsantrasyonların bilinmesine dayanan sitokin profillemesi için uygun dozların seçimi
mümkün olacaktır (Dearman ve diğerleri, 2003a).
2.3.1. Standart fare lokal lenf düğümü testi (LLNA)
Standart Fare Lokal Lenf Düğümü Testi, temas alerjenine maruziyet bölgesindeki lenf
düğümlerinde immün yanıtın başlatılmasına dayanan deri sensitizasyonu ediniminin
belirlenmesine dayanır. Lenf düğümü aktivasyonu deriden göç eden dendritik hücreler
tarafından taşınan antijenlerin varlığı ile tetiklenir ve lenf düğümü ağırlığı ve
hücreselliğindeki artış ve T lenfosit proliferasyonunun stimülasyonu ile ilişkilidir. Daha
önceki çalışmalarda lenf düğümü aktivasyonunun çeşitli markerları değerlendirilmiştir,
ancak en hassas ve en selektif ölçünün lenf düğümü hücrelerinin miktarının [ 3H] timidin
(3H-TdR) katımının fonksiyonu olarak ölçülmesi olduğu kabul edilmiştir (Kimber ve
Weisenberger, 1989).
22
Test çok kısa bir şekilde özetlenirse: Test maddelerinin uygun çözücü içerisindeki çeşitli
konsantrasyonları ve sadece eş hacimdeki çözücü, CBA ırkı 4’er adet fare gruplarının her
iki kulak arkasına topikal olarak uygulanır. Aynı uygulama ardışık 3 gün boyunca
tekrarlanır. Maruziyet başlangıcını takip eden beş gün sonra fareler 3H-TdR kaynağı ile iv
enjeksiyona tabii tutulur. Beş saat sonra fareler sakrifiye edilir, auriküler lenf düğümleri
kesip çıkarılır, her bir deney grubu (veya her bir fare için) için lenf düğümleri bir arada
toplanır ve β-sinsilasyon sayıcı ile işlemden geçirilir. Veriler, çözücü kontrol grubunun
değerlerine göreceli olarak her bir doz grubu için stimülasyon indekslerinden (SI) elde
edilen dakika boşuna bozunma olarak kaydedilir. Deri sensitizanı, eş zamanlı çözücü
kontrol grubu ile karşılaştırmalı olarak bir veya daha fazla konsantrasyonda lenf düğümü
hücre proliferasyonunda üç katı veya daha fazla artış gösteren (SI ≥3) kimyasal olarak
tanımlanır (Kimber ve Dearman, 2002).
LLNA doz-yanıt ilişkisinin değerlendirilmesine imkan tanıdığı gibi dermal sensitizasyon
etkinliğinin kategorizasyonunda da kullanılmaktadır. Günümüzde, kimyasallar için dozyanıt ilişkisi değerlendirmesini içeren tek yöntem olarak LLNA kabul görmektedir. Avrupa
Birliği uzman grubu kimyasalların dermal sensitizasyon oluşturma potansiyellerine göre
sınıflandırılmasında LLNA kullanımını uygun görmüştür (Kimber ve diğerleri, 2003;
Basketter ve diğerleri, 2005a).
Dermal sensitizasyon risk değerlendirmesinde deneysel maruziyetin (belirli ve kontrollü
maruziyet koşulları) gerçekte var olan maruziyete (birey tarafından kontrol edilen değişken
maruziyet) ekstrapolasyonu gerekmektedir. LLNA’da doz-yanıt ilişkisinden hareketle
rölatif etkinliği belirlemede kullanılan EC3 değeri stimülasyon indeksinde 3 kat artışa
neden olan kimyasalın etkin konsantrasyonu olarak tanımlanır. Bu değerin etkinlik
ölçümünde güvenilir bir değer olduğu ve insanda deri sensitizanı kimyasalların rölatif
etkinlikleri ile korelasyon gösterdiği kanıtlanmıştır (Gerberick ve diğerleri, 2005). EC3
değeri insan yama testinde (HRIPT) sensitizasyona neden olmayan düzeyle (hiçbir etki
gözlenmeyen düzey, NOEL) uyumludur (Basketter ve diğerleri, 2005b; Gerberick ve
diğerleri, 2001). Böylece insan testine gereksinim duyulmaksızın HRIPT NOEL
değerlerinin ileriye yönelik belirlenmesi mümkün olacaktır (Van Loveren ve diğerleri,
2008).
23
Anlatılan bu kısaltılmış protokol orijinal olarak geliştirilen ve valide edilen LLNA
versiyonu olmasına karşın, bazılarında daha köklü modifikasyonların yapıldığı versiyonları
da mevcuttur (Takeyoshi ve diğerleri, 2001; Basketter, 2008; Kimber ve diğerleri, 2011).
2.3.2. Standart LLNA yöntemine alternatif in vivo BrdU yöntemi
Son 20 senedir Fare Lokal Lenf Düğümü Testinin, diğer hayvan deri sensitizasyon
modellerine alternatif olarak ilaçlar, kozmetik materyaller, pestisitler ve endüstriyel
kimyasalların
deri
sensitizan
potansiyellerini
değerlendirme
ve
tehlikelerinin
belirlenmesindeki kullanımı artmıştır. Ancak bu standart metod özel bir tesis ve kullanım
prosedürlerini içeren radyoizotop temelli bir yöntem olduğundan herhangi bir laboratuarda
yürütülmesi güçtür (Ulker ve diğerleri, 2013). Radyoaktivite kullanımından dolayı bazı
ülkelerde standart LLNA’da kısıtlamalara gidilmiştir. 1999 yılında ICCVAM alternatif
LLNA endpointlerinin geliştirilmesi ve kullanıma geçirilmesi için tavsiyede bulunmuştur.
LLNA protokolünün geliştirilmesi amacıyla çalışılan alanlardan biri radyoizotop
kullanımını gerektirmeyen bir modifikasyonu içermektedir (Suda ve diğerleri, 2002; Ulker
ve diğerleri, 2013).
LLNA: BrdU-ELISA yöntemi Takeyoshi ve arkadaşları (2001) tarafından tasarlanıp ve
laboratuarlar arası validasyon çalışması Kojima ve ark. (2008) tarafından yapıldıktan sonra
ICCVAM tarafından valide edilmiştir (2010). Umut vaat eden bu yaklaşım 3HTdR’nin
yerine radyoaktif olmayan analogu 5-bromo-2’-deoksiüridin (BrdU)’in kullanımını içerir.
BrdU 3HTdR’ye çok benzer olduğundan, 3HTdR gibi BrdU da hücre siklusunun S-fazı
sırasında lokal olarak çoğalan lenf düğümü hücrelerinin DNA’sına katılmaktadır (Williams
ve diğerleri, 2015).
Bu yöntem aynı zamanda OECD test rehberinde standart test protokolü olarak yerini
almıştır (OECD TG 442B LLNA:BrdU-ELISA). Deney protokolüne göre üç gün boyunca
test maddesinin topik uygulamasının ardından beşinci gün farelerin peritonları içerisine
BrdU enjeksiyonu yapılır. Daha sonra BrdU katılımı ELISA hücre proliferasyon kiti ile
ölçülür. Her bir doz grubunun BrdU işaretleme indeksi çözücü grubunkine oranlanır ve
stimülasyon indeks (SI) değeri hesaplanır. SI değeri 1,6’dan büyük olan kimyasallar temas
sensitizanı olarak kabul edilir (OECD TG 442B).
24
Kojima ve ark. (2010) tarafından yürütülen laboratuarlar arası validasyon çalışmasında
LLNA:BrdU-ELISA yöntemi, kobay testi ve standart LLNA ile karşılaştırılmıştır. LLNA:
BrdU-ELISA kobay maksimizasyon testi ile kıyaslandığında çok iyi tahmin edilebilirlik
sergilemiştir (%100 spesifiklik, duyarlılık ve doğruluk) ancak standart LLNA’ya kıyasla
daha düşük spesifiklik ve doğruluk göstermiştir (sırasıyla %75 ve %90) (Mehling ve
diğerleri, 2012).
2.3.3. Standart LLNA yöntemine alternatif ex vivo BrdU yöntemi
Radyoaktif atığı azaltmak ve hayvan refahını gözetmek amacıyla ICCVAM tarafından
valide edilen yöntem üzerinde modifikasyonlar yapılarak ex vivo BrdU ile işaretleme
yaklaşımı geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. OECD test rehberine
giren radyoaktif olmayan LLNA yönteminde beşinci gün BrdU’nun farelerin periton içine
enjeksiyonuna karşın, ex vivo yöntem beşinci gün farelerin sakrifikasyonundan sonra izole
edilen lenf düğümü hücrelerine BrdU ilavesini içerir (Ulker ve diğerleri, 2014).
Kimyasal maddelerin dermal alerji potansiyellerini ölçmek için uygulanan in vivo ortamda
BrdU işaretlemesi ve ex vivo ortamda BrdU işaretlemesi ile yapılan deney sonuçlarının
birbirleri ile oldukça uyumlu olduğu gözlenmiştir (Ulker ve diğerleri, 2013).
2.3.4. rLLNA (reduced LLNA)
LLNA’nın 3 doz grubu ve bir çözücü kontrol grubunun kullanıldığı ve lenfosit
proliferasyonunda çözücü kontrolden 3 kat daha fazla artış göstererek doz yanıt ilişkisi
oluşturan kimyasalın pozitif temas alerjeni olarak kabul edildiği bir yöntem olarak
tasarlandığını biliyoruz. Ancak hayvan deneylerinin azaltılmaya gidilmesine yönelik artan
talep ve baskılar, testte iyileştirmelerin yolunu açmıştır. 3 doz grubu yerine tek bir doz
grubunun uygulanması valide edilmiş olup (ICCVAM, 2011), OECD TG 429’da temas
alerjisi oluşturma potansiyeli bilinmeyen kimyasalların değerlendirilmesine yönelik rutin
tarama testi olarak yer almıştır (Thyssen ve diğerleri, 2012).
rLLNA, test maddelerinin tek konsantrasyonlarının kullanılmasını içerdiğinden deney
hayvanı sayısını standart LLNA’ya göre %40 azaltmaktadır. LLNA’da olduğu gibi her
grupta 5 adet fare ile çalışılır. Ancak bu yöntem doz-yanıt ilişkisi değerlendirmesine imkan
25
vermez. Bu nedenle doz-yanıt ilişkisinin incelenmeyeceği, sadece test maddesinin sistemik
toksisite veya lokal deri irritasyonu oluşturmayacak maksimum konsantrasyonunda
indükleyeceği immün yanıtın değerlendirileceği çalışmalarda tercih edilmelidir (OECD TG
429).
2.4. LLNA’nın Kimyasalların Solunum Sensitizasyon Potansiyellerinin Ölçümüne
Uyarlanması
Deri sensitizasyonunun aksine,
solunum
bölgesinin sensitizasyonuna
yol açma
potansiyeline sahip kimyasalların ileriye yönelik belirlenmesi için yaygın şekilde kabul
edilmiş veya valide edilmiş bir yöntem mevcut değildir. Güvenilir ve kestirimci araçların
ve
yöntemlerin
yokluğu
kimyasal
solunum
alerjenlerinin
belirlenmesi
ve
karakterizasyonunda önemli bir boşluk yaratmaktadır. Bu yöntemlerin geliştirilmesindeki
en büyük engel solunum sensitizasyonu ile ilişkili immünobiyolojik mekanizmalar
hakkındaki belirsizliklerdir. Protein alerjenlerine karşı gelişen ani tip aşırı duyarlılık
yanıtları ve astımın IgE aracılı mekanizmalara bağlı olduğunun bilinmesine karşın,
kimyasallarla gelişen solunum sensitizasyonunun IgE aracılı olup olmadığında dair fikir
birliği oluşturulamamıştır (Kimber ve Dearman, 1998, 2002; Isola ve diğerleri, 2008;
Basketter ve Kimber, 2011). Belirsizliğe karşın solunum bölgesinin sensitizasyonunun
gelişimi için uygun koşulları sağlayan Th2 tip immün yanıtların indüksiyonu ile ortaya
çıktığına dair bulgular mevcuttur (Dearman ve diğerleri, 2013).
Kimyasal alerjinin farklı biçimleri arasındaki ilişki oldukça karmaşıktır. Birçok kimyasal
solunum alerjeni, alerjik temas dermatiti ile ilişkilidir. Bu kimyasalların dermal maruziyet
ihtimaline karşın insanda alerjik temas dermatitine yol açmadığına inanılmaktadır. Ancak
kimyasal solunum alerjenleri inhalasyondan başka bir maruziyet yolu denendiğinde,
solunum bölgesinin sensitizasyonunu indükleyebilirler. Mesleki sağlık açısından
değerlendirildiğinde dermal maruziyetin bu hususta etkili olabileceği düşünülmektedir
(Kimber ve Dearman, 2005). Solunum sensitizanlarının hepsi olmasa da büyük bir kısmı
deri sensitizanlarının belirlenmesi için kullanılan LLNA gibi fare modellerinde pozitif
yanıt vermektedir (Hilton ve diğerleri, 1995; Dearman ve diğerleri, 2000; Gerberick ve
diğerleri, 2000). LLNA’da temas alerjisine yönelik testlerde pozitif yanıt oluşturmayan
kimyasalların aynı zamanda solunum sensitizan potansiyeline sahip olmadığı kabul edilir
26
(Roggen ve diğerleri, 2008). Ancak LLNA’daki pozitiflik ve temas sensitizan potansiyeli
arasındaki ilişkinin benzeri, solunum alerjenleri için resmiyet kazanmamıştır.
LLNA sonuçları sensitizanlar tarafından immün yanıtın indüklenip indüklenmediğini
gösterirken, solunum veya temas alerjisine ait spesifik mekanizmaları birbirinden ayırt
edemez (Manetz ve Meade, 1999; Vanoirbeek ve diğerleri, 2003; Gerberick ve diğerleri,
2005; Boverhof ve diğerleri, 2008; Dearman ve diğerleri, 2013).
Deri ve solunum sensitizanlarını birbirinden ayırt etmek için ilave test yöntemleri
gerekmektedir. Solunum alerjenlerinin büyük bir kısmı suda çözünür olmadığından hücre
temelli testlerde kullanılamayacağından solunum alerjenleri hala hayvan testlerini
gerektirmektdir (Manetz ve Meade, 1999). Dermal maruziyet sonrası lenf düğümü
hücrelerinde üretilen sitokinlerin solunum sensitizanlarını belirlemede kullanılabileceğine
dair veriler mevcuttur (Dearman ve diğerleri, 1996; Vandebriel ve diğerleri, 2000).
Kimyasalın tip 2 sitokin yanıtlarını indükleme yeteneğinin solunum sensitizasyon
potansiyelinin bir göstergesi kabul edildiği sitokin profillemesi gibi bir yöntemle birlike
LLNA yürütülebilir (Dearman ve diğerleri, 2013).
2.5. Sitokin Profillemesi
Sitokin profillemesi, farklı tipteki kimyasal alerjenlerin farelerde farklı sitokin salım
profilleri ile kalitatif olarak farklılık gösteren immün yanıtların tetiklenmesinin
incelenmesine dayanır (Kimber ve diğerleri, 1996).
Kimyasal solunum alerjenlerinin bazı özellikleri, deri sensitizasyonu ve alerjik temas
dermatitine yol açan diğer kimyasal alerjenlerle benzerlik göstermektedir. Kimyasal
solunum alerjenlerini temas alerjenlerinden ayıran benzersiz ve tanımlayıcı özelliği,
öncelikle kimyasal solunum alerjenlerinin Th2 immün yanıtların gelişimine neden olurken
temas alerjenleri deri sensitizasyonu ile sonuçlanan Th1 immün yanıtları indükler. Temas
ve solunum alerjenleri tarafından sırasıyla Th1 ve Th2 olmak üzere farklı nitelikte immün
yanıtların ortaya çıkarılması ile ilgili bulgular farelerde yapılan çalışmalar ile anlaşılmıştır
(Kimber and Dearman, 2005).
27
Ayrıca sitokinler antikor yanıtlarının regülasyonunda ve antikor izotiplerinden hangisinin
üretileceğini belirlemede önemli role sahiptir (Vangosa ve diğerleri, 1994). IL-4 ve IFN-γ
IgE antikor regülasyonunda önemli etkilere sahiptir. Farelerde IgE yanıtlarının başlatılması
ve sürdürülmesi IL-4 salımına bağlıdır (Dearman ve diğerleri, 2003b). İnsanlarda da IL-4
ve IgE ilişkisinin gösteridiği çalışmalar mevcuttur (Deo ve diğerleri, 2010). Tam tersi
şekilde IFN-γ farelerde IgE üretimini inhibe eder (Selgrade ve diğerleri, 1997).
Test kimyasallarının immünojenik özellikte olan ve sitokin salımı ölçümü için yeterli
şiddette
kütanöz
immün
yanıtları
stimüle
eden
konsantrasyonlarının
bilinmesi
gerekmektedir. Doz seçimi öncelikle LLNA’nın yürütülmesine dayanır. İlk olarak
LLNA’nın yürütülme nedeni test kimyasalının bütün alerjenik özelliklerinin değerlendirilip
sonrasında uygulanacak sitokin profillemesi için doz ayarlamasını yapmaktır (Dearman ve
Kimber, 2001).
Test kimyasallarının sitokin salım profilleri eşzamanlı olarak solunum sensitizasyon
potansiyelleri göz önünde bulundurulduğunda sırasıyla negatif ve pozitif kontrol olan 2,4dinitroklorobenzen (DNCB) ve trimellitik anhidrit (TMA) tarafından salınan sitokin
profilleri ile karşılaştırılır (Dearman ve Kimber, 2001).
2.6. Fare IgE Testi
Fare IgE testi, solunum bölgesinin alerjik sensitizasyonuna neden olan kimyasalların
indüklenmiş serum IgE konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak belirlenmesini
amaçlamaktadır (Kimber ve diğerleri, 1996).
Araştırmalar sonucu kimyasal solunum alerjenine topik yoldan maruz bırakılan farelerde
total IgE serum konsantrasyonlarında kayda değer bir artış gözlenmiştir (Dearman ve
Kimber, 1991; Hilton ve diğerleri, 1995; Anderson ve diğerleri, 2011). Bu yanıt solunum
bölgesi sensitizasyon potansiyelinden yoksun temas alerjenlerine maruziyet sonucu
gözlenmemiştir.
Bu
konsantrasyonundaki
gözlemler
kimyasal
değişikliklerin
solunum
fonksiyonu
desteklemektedir (Kimber ve diğerleri, 1996).
sensitizanlarını
olarak
serum
IgE
belirlenebileceğini
28
Bu yaklaşımın avantajı haptene özgül antikorun ölçümü yerine serum proteinin
ölçülmesidir. Bu fare IgE testinin temelini oluşturmaktadır (Kimber ve diğerleri, 1996).
Çalışmalarda bir dizi kimyasal alerjen, paralel olarak yürütülen LLNA’da pozitif yanıt
veren ve epikütanöz uygulamayı takiben immünojenik oldukları belirlenen tek
konsantrasyonları kullanılarak belirlenmektedir. Temel prensip önceden LLNA test
sonuçları doğrultusunda test konsantrasyonlarının seçimidir. BALB/c fareler LLNA’da
belirlenen konsantrasyonlarda test maddelerine ve çözücüye vücutlarının tıraşlanmış yan
bölgelerinden iki taraflı topik olarak maruz bırakılır. Yedi gün test maddeleri ve çözücü her
iki kulağın arkasına uygulanır. Serum IgE ELISA ile ölçülür. Analiz sonuçları sadece
solunum sensitizasyonuna ve mesleki astıma neden olduğu düşünülen kimyasalların
farelerde serum IgE seviyelerinde artışı indüklediğini teyit etmektedir (Karol, 1994;
Kimber ve diğerleri, 1996).
Serum IgE konsantrasyonundaki herhangi bir değişikliğin anlamlılığı eşzamanlı uygulanan
çözücü kontroller ile elde edilen değerler referans alınarak değerlendirilir. Her bir analizin
bütünlüğü sırasıyla pozitif ve negatif kontroller TMA ve DNCB ile sağlanır. Kimyasal
solunum alerjenleri, uygun çözücünün uygulandığı kontrol farelerde kaydedilen değerlerle
göreceli olarak bir veya daha fazla test konsantrasyonunda serum IgE konsantrasyonunda
belirgin artış oluşturan maddeler olarak tanımlanır. Bu kriterin bütün olası kimyasal
solunum alerjenlerinin belirlenmesi için uygun sensitivite ve selektivite açısından
uygulamadaki pozitifliği henüz kesinleşmemiştir (Kimber ve diğerleri, 1996).
Fare IgE testinin kimyasal solunum sensitizanlarının ileriye yönelik belirlenmesi için
kullanışlı bir yöntem olduğu ortaya konmuştur. Ancak sadece sınırlı sayıda kimyasal ile
değerlendirilmiş olup analizlerin çoğu tek bir laboratuarda yürütülmüştür. Testin
geçerliliğinin ve yararlılığının incelenmesi daha geniş aralıktaki kimyasalların ayrı
laboratuarlarda analizi ile mümkündür. Bu maksatla son dönemlerde fare IgE testinin
uluslar arası laboratuarlar arası değerlendirilmesi başlatılmıştır (Kimber ve diğerleri,
1996).
29
2.7. Çalışmamızda Kullanılan Radyoaktif Olmayan ex vivo LLNA Yöntemi ile
Sensitizasyon Potansiyelleri Tespit Edilecek Olan Kimyasal Maddeler
2.7.1. 2,4-dinitroklorobenzen (DNCB)
Dinitroklorobenzenin temas sensitizan etki gücü oldukça yüksektir ve birçok tür DNCB’ye
topik maruziyet sonrası kolayca sensitizasyon geliştirebilir. Bu nedenle hücre aracılı
immün cevap oluşturmak için deneysel temas sensitizanı olarak DNCB tercih edilmektedir
(Friedmann, 2006). Ayrıca doğada bulunmayan ve deney hayvanlarının immün sisteminin
daha önce karşılaşma ihtimali olmayacağı bir madde seçimi önemlidir. DNCB’nin
kullanılması deri teması yoluyla antijenle ilk maruziyeti ve maruziyet sonucu klinik ve
selüler immün yanıtların ateşlenmesini sağlar (Newell ve diğerleri, 2013).
DNCB Th1 sitokinleri IFN-γ ve IL-12 aracılığı ile temas aşırı duyarlılığına yol açan tipik
bir dermal sensitizan olup mesleki astım veya alerjik rinit oluşturmadığı bilinmektedir
(Vanoirbeek ve diğerleri, 2006).
2.7.2. Trimellitik anhidrit (TMA)
Düşük molekül ağırlığına sahip kimyasallardan asit anhidritlerin, mesleki astımı içeren
solunum bölgesi aşırı duyarlılık reaksiyonlarında rol oynadığı daha önceki çalışmalarda
gösterilmiştir. Asit anhidritler doğal ve kompleks biyolojik aktivitelerinden ve işyerlerinde
maruz kalan işçilerde yaygın mesleki solunum yolu hastalıkları ile ilişkilendirildiğinden
araştırmamızda temel mesleki kimyasal ajan olarak seçilmiştir (Boverhof ve diğerleri,
2008). NIOSH yaklaşık 20 bin Amerikan işçisinin çeşitli üretim alanlarında trimellitik
anhidrit maruziyeti açısından risk altında olduğunu öngörmüştür.
TMA epoksi ve diğer reçineler için kür malzemesi olarak, vinil plastikleştiricilerde, yağlı
boya ve kaplamalarda, polimer, polyester, zirai kimyasallar, boya ve pigmentlerde ve
farmasötiklerde kullanılmaktadır. TMA sensitizasyonu ilk olarak Zeiss ve arkadaşları
tarafından TMA sentezinde çalışan 14 işçinin solunum şikayetleri göstermesi ile
kaydedilmiştir. TMA’nın çok düşük konsantrasyonlarında bile işçiler immünojenik
sensitizasyon geliştirip, astım benzeri semptomlar gösterebilmektedir (Zeiss ve diğerleri,
1977).
30
TMA’e maruziyetin solunum yolu irritasyonu, rinit ve astım, ateş ve kırıklık gibi sistemik
semptomlarla ilişkili geç faz astım ve akciğerde infiltratif bozukluklar gibi çok çeşitli
klinik sendrom oluşturduğu gösterilmiştir (Zeiss ve diğerleri, 1977; Zhang ve diğerleri,
2004). TMA maruziyeti aynı zamanda çeşitli histolojik sonuçlara sahip akciğer
hastalıklarına neden olmaktadır (Tao ve diğerleri, 1991). TMA ile indüklenen alerjik rinitin
başlıca semptomları arasında kaşıntı, öksürük ve burun tıkanıklığı yer alır. TMA’nın
indüklediği alerjik rinitin patolojik özellikleri plazma sızıntısı, aşırı mukus sekresyonu ile
T ve B lenfositleri, eozinofil ve plazma hücrelerinden oluşan nazal solunum yolunda
selüler infiltrasyondur (WHO, 1999).
TMA için Occupational Safety and Health Administration (OSHA) maruziyet standartı
bulunmamaktadır. TMA’nın işyeri maruziyet seviyesini minimize etmek için solunum
sensitizanları için valide edilmiş bir yönteme gereksinim vardır (NIOSH, 1978).
TMA’nın insanlarda solunum sensitizasyonuna yol açmasının yanı sıra, hayvanlarda
solunum yolları irritasyonuna neden olduğu bilinmektedir. Yüksek doz TMA’nın deriye
uygulandıktan sonra lenf düğümü hücrelerinde IL-4, IL-10 ve IL-13 seviyelerindeki artışla
birlikte Th2 yanıtlarını ve göreceli olarak düşük seviyede Th1 sitokini IFN-γ’yı indüklediği
gösterilmiştir (Vanoirbeek ve diğerleri, 2006). Aynı zamanda TMA ve diğer asit anhidritler
ile indüklenen astımla serum IgE seviyesi arasında ilişki bulunmuştur (Sailstad ve
diğerleri, 2003; Roggen ve diğerleri, 2008). TMA, IgE antikoru aracılı mekanizma ile
mesleki astıma yol açan düşük molekül ağırlığındaki kimyasallar arasında en iyi
tanımlanandır (Dykewicz, 2009). Bu nedenle bir kimyasalın solunum sensitizasyon
potansiyelinin değerlendirildiği bir çalışmada TMA pozitif kontrol olarak tercih
edilmektedir.
2.7.3. Diasetil
Diasetil (2,3-bütandion) suda çözünen uçucu di-keton yapısında, ısıtıldığında hızla buhar
fazına geçen bir kimyasal madde olup, süt ürünleri, bira, şarap gibi birçok gıdanın
bileşiminde doğal olarak bulunur (Lockey ve diğerleri, 2009). Diasetilin aynı zamanda
çeşitli gıda ve içeceklere karakteristik tereyağı tadını vermek amacıyla katılan uçucu
kimyasallardan biri olduğu bilinmektedir (Shibamoto, 2014).
31
Diasetil GRAS (Generally Regarded as Safe) listesinde olup (FDA, 2001), kendine has
tereyağı benzeri tada sahip olduğundan gıda maddelerinin hazırlanmasında 6-9 µg/g
düzeylerinde yaygın bir şekilde kullanılır.
İlk olarak 1985 yılında diasetilin tatlandırıcı olarak kullanıldığı bir tesiste iki işçide
bronşiyolitis obliteransı akla getiren karma obstrüktif akciğer hastalığı görülmüştür.
Bronşiyolitis obliterans fibrotik veya inflamatuar prosesler sonucu gelişen bronşiyollerin
kısmi veya tam obstrüksiyonu (obliterasyon) olarak tanımlanır. Bronşiyolitis obliterans
hastalığında bronşiyoler epitelyumdaki granülasyon dokusunun proliferasyonu küçük
havayollarının tıkanıklığına yol açar. Bronşiyeolitis obliterans ve diasetil toksisitesine ait
patolojik mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır. Fibrozisin sitotoksik hasar veya
kronik
inflamasyonu
takiben
mekanizma
hasarından
kaynaklandığı
düşünülür.
Bronşiyolitis obliteransa immün aracılı mekanizmalar iştirak eder. Diasetil toksisitesine
dair analizler patolojik mekanizma olarak reaktif oksijen türevleri aracılığı ile oksidatif
stres oluşumunu göstermektedir. Bu durum metabolik fonksiyon bozukluğu, hücre sinyal
etkileri ve protein etkileşimleri aracılığı ile toksik etki kaskatını indükleyerek hücresel aşırı
duyarlılık ve fibrozise neden olmaktadır (Egilman ve Schilling, 2012).
Diasetil maruziyeti ve bronşiyolitis obliterans arasındaki ilişki, 2000 yılında ABD’nin
Missouri eyaletindeki mikrodalga patlamış mısır fabrikasında çalışan sekiz işçide görülen
pulmoner fonksiyonlarda zayıflamanın diasetil maruziyetinden kaynaklandığını gösteren
çalışma (Kreiss ve diğerleri, 2002) ile kurulmuştur.
Bunun üzerine diasetile mesleki
maruziyet birkaç gıda üretim ve tatlandırıcı tesisinde incelenmeye başlanmıştır (Parmet ve
Von Essen, 2002; Akpinar-Elci ve diğerleri, 2004; Kanwal ve diğerleri, 2006; NIOSH,
2011). Missouri’de yaşanan olaydan sonra tanısı konulan bu hastalık “patlamış mısır
hastalığı” olarak da isimlendirilmiştir (Schachter, 2002).
Diasetilin deney hayvanlarında solunum toksisitesinin incelendiği kapsamlı çalışmalar
yayımlandığından beri, tereyağı tatlandırıcısı üretim tesisleri gibi diasetil buharı ile ilişkili
tesislerdeki işçiler arasında görülen mesleki sağlık sorunları sağlık otoritelerinin de
dikkatlerini çekmeye başlamıştır. NIOSH, üretim fabrikalarında diasetil buharına maruz
kalan işçiler için diasetil maruziyet limitleri önermiştir (Shibamoto, 2014). Ancak halen
OSHA tarafından diasetil için kabul edilebilir maruziyet limitleri (PELs) belirlenmemiştir
(OSHA, 2010).
32
İlk olarak diasetilin inhalasyon toksisitesi kaydedildiğinden, birçok çalışma fabrika işçileri
arasındaki mesleki akciğer hastalığı üzerine odaklanmıştır (Shibamoto, 2014). 2012 yılında
GHS (UN Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals)
Anderson ve arkadaşlarının (2011) çalışmasına göre diasetili deri sensitizanı olarak
sınıflandırmıştır (NIOSH, 2013). Bu çalışmanın diasetilin sensitizasyon potansiyelinin
incelendiği tek çalışma olmasından dolayı diasetilin sensitizasyon ile olan ilişkisinin
immün mekanizmaları ile birlikte ortaya konmasına ihtiyaç vardır. Ayrıca diasetil yerine
önerilen diasetil gibi diketon türevi tatlandırıcıların olası immünojenik etkilerinin de ileriye
yönelik belirlenmesi sağlanabilir.
Bir gıda katkı maddesinin GRAS olarak sınıflandırılması işçiyi değil tüketiciyi koruyan bir
uygulamadır.
GRAS
sınıflandırması
tatlandırıcının
tüketici
tarafından
düşük
konsantrasyonda oral yolla maruziyeti ile ilgilidir. Bu sınıflandırma, tatlandırıcıların
üretiminin yapıldığı veya gıdaların üretiminde tatlandırıcıların kullanıldığı işyerlerinde
inhalasyon maruziyeti gibi farklı bir yolla maruziyet için güvenliliği ifade etmemektedir
(Hubbs ve diğerleri, 2002). Bu nedenle düzenleyici otoriteler tarafından işyeri ortamındaki
diasetilin işçiler için güvenli seviyelerine yönelik kısıtlama getirilmesinin, risk yönetimi
açısından önemi büyüktür.
Diasetilin LLNA yöntemi ile sensitizanyon potansiyelinin değerlendirildiği birkaç çalışma
bulunmaktadır (Roberts ve diğerleri, 1999; Anderson ve diğerleri, 2007). Roberts ve
arkadaşları diasetil için EC3 değerini, Anderson ve arakadaşları tarafından kaydedilen
değerden 10 kat daha fazla tespit etmiştir. Bunun nedenini kullandıkları fare ırklarının
farklılığına bağlamışlardır (Anderson ve diğerleri, 2007). Anderson ve Roberts’ın
yürütmüş olduğu LLNA ile diasetilin T hücre aracılı sensitizan olduğu ihtimaline
dayanarak, Dworak ve arkadaşları (2013) tarafından yürütülen QSAR çalışmasında,
diasetilin sensitizan potansiyeli değerlendirilmiştir. Bu çalışmadaki temel prensip bir
kimyasalın sensitizan olarak belirlenmesi için o kimyasalın yeterli derecede mevcut
proteinlerde
değişiklik
yapması
gerektiğidir.
Solunum
sensitizanlarının
protein
modifikasyonu eşik düzeyinin deri sensitizanlarından daha yüksek olduğu ortaya
konmuştur. Bu eşik, kimyasalların yüksek elektrofiliteye sahip olması ile elde edilebilir.
α,β-diketon yapısındaki toluen-2,4-diizosiyanatın (TDI) oldukça yüksek elektrofilik potent
deri sensitizanı olduğu bilinmektedir. Diasetilin α,β-diketon yapısından dolayı TDI ile
karşılaştırmalı olarak sensitizasyon potansiyeli incelenmiştir. Sonuç olarak diasetilin
33
TDI’dan 400 kat daha az reaktif olduğu ve zayıf sensitizan olarak değerlendirebileceği
belirtilmiştir (Dworak ve diğerleri, 2013).
Solunum alerjenleri için en yaygın maruziyet yolunun inhalasyon olduğu düşünülse de,
dermal uygulamanın da solunum bölgesinin sensitizasyonuna yol açtığın gösteren birçok
çalışma mevcuttur. TMA’ya topikal maruziyetin ratlarda sensitizasyon geliştirdiği Zhang
ve arkadaşlarının (2004) bir çalışmasında gösterilmiştir. Doğal kauçuk lateksin lateksözgül IgE üretimi artırdığı ve solunum yolu hiperaktivitesine neden olduğu Howell ve
arkadaşları (2002) tarafından gösterilmiştir (Anderson ve diğerleri, 2007). Bunlar dışında
dermal temas yoluyla klinik semptomların tetiklenebileceği deneysel olarak gösterilmiştir
(Kimber ve Dearman, 2002; Ban ve diğerleri, 2006; Dearman ve diğerleri, 2009). Bu
literatür örnekleri doğrultusunda, diasetilin dermal maruziyeti sonucu olası sensitizasyon
etkinliğini değerlendirmeyi uygun bulduk.
Bu zamana kadar diasetilin sitokin salım profilinin tamamının ortaya konduğu bir çalışma
mevcut değildir. Çalışmamızda öncelikle LLNA yöntemi ile immün yanıtın göstergesi
olarak
lenfosit
proliferasyonun indüklenip
indüklenmeyeceği,
ardından solunum
sensitizanların gösterdiği Th2 tip sitokin salım profilini yansıtıp yansıtmayacağı
araştırılacaktır.
2.8. Alternatif in vitro ve in siliko Yöntemler
Deri sensitizasyonun değerlendirmesi günümüzde hayvan testlerine dayanmaktadır.
2013’te EU Kozmetik Yönetmeliği’nde (76/768/EEC) yürürlüğe konan kozmetik
bileşenlerinin dermal sensitizasyon potansiyellerinin in vivo test edilmesine yönelik yasağı
ile birlikte EU REACH programı, kimyasalların sensitizasyon potansiyellerinin tahmini
için in vitro ve in siliko modellerin geliştirilmesi çalışmalarını hızlandırmıştır (Thyssen ve
diğerleri, 2012).
Bir kimyasalın temas sensitizanı (antijen) olarak etki gösterebilmesi için deriye penetre
olması, proteinle etkileşmesi ve immün hücreler tarafından antijenik olarak tanınması gibi
çeşitli özelliklere sahip olması gerekmektedir. Alerjideki bu üç temel belirleyici unsurun
in vitro test şemasına dahil edilmesi gerekmektedir. Mekanizma temelli in vitro yöntem
geliştirilmesine dair farklı alanlarda araştırmalar mevcuttur: 1) kimyasalların canlı
34
epidermis veya dermise deri penetrasyonu modeli; 2) bilgisayar temelli yaklaşımlar
(QSAR); 3) peptid veya proteinlerle metabolik aktivasyon ile veya aktivasyona ihtiyaç
duymadan kimyasal reaktifliğinin kantitatif ölçümü; ve 4) kimyasal alerjenlerin dendritik
hücreler ve T hücreleri tarafından tanınmasını model alan hücre temelli in vitro testler
(Ryan, 2008).
2.8.1. İn siliko testler
Kimyasalların elektrofilik özelliklerinin belirlenmesi çalışmanın temelini oluşturup,
kimyasal yapı ve sensitizasyon yanıtı arasındaki kalitatif ilişki incelenmektedir. Haptenprotein kompleksi oluşumunun deri sensitizasyonu gelişiminin ön koşulu olduğu ilk kez bu
çalışma ile ortaya konmuştur (Thyssen ve diğerleri, 2012). Yeni ve mevcut kimyasallar
için düzenleyici ve bilim komiteleri arasında fikir birliği sağlanamaması ve hangi sistemin
güvenilir olduğu netlik kazanmadığından QSAR kullanımım sınırlandırılmıştır. Kullanılan
ticari sistemler arasında Derek for Windows (UK), TopKat (ABD) ve TIMES’tır
(Bulgaristan) (Ryan, 2008).
2.8.2. İn chemico testler
İn chemico testler sensitizanın kovalent katım yapmak üzere proteinle etkileşme yeteneği
ile sensitizasyon oluşturma potansiyeli arasındaki ilişkiye dayanmaktadır. İn siliko
yöntemlerdeki hesaplamanın aksine, in chemico yöntemler deneysel ölçüm parametrelerine
dayanır (Thyssen ve diğerleri, 2012).
Direct
Peptide
Reactivity
Assay
(DPRA)
ECVAM
tarafından
pre-validasyon
değerlendirmesi aşamasında olan bu test (Thyssen ve diğerleri, 2012), kimyasalın proteine
veya peptid molekülüne bağlanma kabiliyetini değerlendiren in chemico bir yöntemdir
(Divkovic ve diğerleri, 2005).
2.8.3. Hücresel testler
Bu yöntemler izole edilmiş hücreler veya hücre dizilerinin kullanımına dayanır.
Kimyasallar tarafından çeşitli antijen sunan hücreler üzerinde indüklenen fenotipik
değişikliklerin incelenmesi temel yaklaşımlardan biridir. Antijen sunan hücrelerin deriden
35
izolasyonu güç olduğundan dendritik hücrelerin yerine ticari insan hücre dizileri
kullanılmaktadır (Casati ve diğerleri, 2005).
İn vitro yöntemlerin birinde temas alerjenlerine maruziyeti takiben THP-1 hücreleri
üzerindeki CD86 ve CD54 ekspresyonu incelenmiştir (Ashikaga et al, 2006).
U937 hücreleri dendritik hücrelerin yerine kullanılan başka bir hücre hattıdır ve Python ve
arkadaşları (2007) tarafından geliştirilmiştir. CD86 hücre yüzey ekspresyonu ile IL-1β ve
IL-18 gen ekspresyonu incelenir.
MUTZ-3
hücrelerinde
hücre
yüzey
marker’ının
ekspresyonundaki
değişiklikler
kimyasalların sensitizasyon potansiyelinin belirlenmesi amacıyla önerilen diğer bir in vitro
yöntemdir (Azam et al, 2006).
Human cell activation test (h-CLAT) ve myeloid U937 skin sensitization test (MUSST)
pre-validasyon aşamasında ECVAM tarafından incelenmektedir.
36
37
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Kimyasallar
3.1.1. Topik uygulanan negatif kontrol
2,4-dinitroklorobenzen (DNCB) (Sigma, Almanya)
Çözücü: Aseton (Riedel-de Haen, Almanya) : zeytin yağı (Sigma-Aldrich, Almanya) (4:1)
AOO (hacim/hacim)
Uygulanan konsantrasyon: %1 (ağırlık/hacim)
3.1.2. Topik uygulanan pozitif kontrol
Trimellitik anhidrit (TMA) (Merck, Almanya)
Çözücü: AOO (4:1) (v/v)
Uygulanan konsantrasyon: %10 (a/h)
3.1.3. Topik uygulanan test materyali
Diasetil (Merck, Almanya)
Çözücü: AOO (4:1) (v/v)
Uygulanan konsantrasyon: %10 (a/h)
3.1.4. Diğer kimyasallar
Fötal Bovine Serum (Biological Industries, İsrail)
Penisilin-Streptomisin (Biological Industries, İsrail)
Glutaminli RPMI 1640 (Sigma, ABD)
PBS (Fosfat Tampon Çözeltisi) (Sigma, ABD)
Fitohemaglutinin (PHA) (Biochrom, Almanya)
Tripan mavisi (Biological Industries, İsrail)
BrdU-hücre proliferasyonu kiti (Merck Millipore, Almanya)
Fare IFN-γ ELISA kiti (Bender MedSystems, ABD)
Fare IL-2 ELISA kiti (Bender MedSystems, ABD)
Fare IL-4 ELISA kiti (Bender MedSystems, ABD)
38
Fare IL-5 ELISA kiti (Bender MedSystems, ABD)
Fare IL-10 ELISA kiti (Boster Immunoleader, ABD)
Fare IL-13 ELISA kiti (Bender MedSystems, ABD)
Fare IgE ELISA kiti (USCN Life Science Inc., Cloud-Clone Corp, ABD)
3.2. Kullanılan Alet ve Malzemeler
%5 CO2’li, su ceketli inkübatör (Sanyo, Japonya)
Vorteks (Nüve NM110, Türkiye)
Otomatik otoklav (Sanyo, Japonya)
Doku homojenizatörü (Torrey Pines Scientific, ABD)
Laminar air flow (Clean Air, Biohazard EN 12469)
Mikroskop (CETİ, Belçika)
Soğutmalı santrifüj (Sigma, ABD)
Terazi (Sartorius, Almanya)
Otomatik pipet (Jencons, ABD)
Çok kanallı otomatik pipet (Ependorf, Almanya)
Membran filtre (0,2 µm, Sartorius, Almanya)
Steril tüpler (Grenier bio-one, Almanya)
Steril petri kabı (Grenier bio-one, Almanya)
Steril 24 kuyucuklu plak (Grenier bio-one, Almanya)
Steril 96 kuyucuklu plak (Grenier bio-one, Almanya)
Neubauer lamı (Marienfeld, Almanya)
Otomatik mikroplaka yıkayıcısı (Rayko, Çin)
ELISA plak okuyucusu (SpectraMAX, Molecular Devices Inc., ABD)
3.3. Deney Hayvanı
Gazi Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan onay aldıktan sonra
çalışmalara başlandı. Deney hayvanı olarak 8-12 haftalık dişi BALB/c fareler kullanıldı.
Fareler Kobay A.SŞ.’den temin edildi. Gazi Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları
Yetiştirme ve Deneysel Araştırmalar Merkezi (GÜDAM)’da 23°C’de, %55 nem oranına
sahip, 12 saat gece ve 12 saat gündüz koşullarını sağlayan bir ortamda barındırıldı.
39
3.4. Lenfosit Proliferasyonunun Lenf Düğümü Hücrelerinde BrdU ile ex vivo Ölçümü
Çalışmamızda, Vandebriel ve arkadaşları (2000) ile Dearman ve arkadaşlarının (2003,
2009) kullandığı protokollerden yola çıkarak deney protokolünü oluşturduk. Buna göre tez
çalışmamız 13 günlük kronik maruziyet protokolü ile kısa süreli maruziyet protokolünü
içermektedir.
3.4.1. Kısa süreli maruziyet
 Deney hayvanları pozitif, negatif kontrol grubu ve test materyali grubunda 5’er adet,
çözücü grubunda 10 adet olacak şekilde tartılarak gruplandırıldı.
 Maddelerin belirtilen konsantrasyonları 3 gün boyunca farelerin kulak arkalarına 25 µl
olacak şekilde topik olarak uygulandı.
 4. gün deney hayvanları dinlendirildi.
 5. gün farelerin kardiyak ponksiyon ile kanları alınıp, eppendorf tipi mikrotüplere
kondu. Her iki auriküler lenf düğümü steril koşullarda çıkartıldı ve steril petri kaplarına
aktarılarak tartıldı.
3.4.2. Kronik maruziyet
 Deney hayvanları pozitif, negatif kontrol grubu ve test materyali grubunda 5’er adet,
çözücü grubunda 10 adet olacak şekilde tartılarak gruplandırıldı.
 Maddelerin belirtilen konsantrasyonları ilk gün farelerin flank bölgelerine 50 µl olacak
şekilde topik olarak uygulandı.
 4 ardışık gün dinlendirmeden sonra ilk gün yapılan uygulama 6. gün tekrar edildi.
 4 ardışık gün daha fareler dinlendirildikten sonra, 10., 11. ve 12. günlerde kulak
arkalarına maddelerin aynı konsantrasyonu 25 µl olacak şekilde topik olarak uygulandı.
 13. gün farelerin kardiyak ponksiyon ile kanları alınıp, eppendorf tipi mikrotüplere
kondu. Her iki auriküler lenf düğümü steril koşullarda çıkartıldı ve steril petri kaplarına
aktarılarak tartıldı.
Hem kronik hem de kısa süreli maruziyet sonrası çıkarılan lenf düğümleri soğuk PBS
içeren tüplere konuldu. Homojenizatör ile düşük devirde parçalandı. Açığa çıkan hücreler
40
PBS ile iki kez yıkandı ve dipte kalan lenfosit süspansiyonu 100 µl FBS, 10 µl penisilinstreptomisin, 20 µl fitohemaglutinin (PHA) eklenip RPMI-1640 ile1 ml’ye tamamlandı.
1 ml’lik lenfosit çözeltisinden 30 µl alındı ve üzerine 30 µl tripan mavisi eklendi,
karıştırıldı. Neubauer sayım lamı üzerine alınan 30 µl lenfosit çözeltisi - tripan mavisi
karışımının üzeri lamel ile kapatıldı ve lenfositlerin canlılığını yitirmemesi için hemen
sayım yapıldı (dilüsyon faktörü 2’dir).
1
2
3
6
5
4
7
8
9
1, 3, 5, 7 ve 9 numaralı karelerdeki hücreler
sayıldı. Sayılan 5 karedeki hücrelerin
ortalaması alındı, dilüsyon faktörü ve 104
ile çarpılarak 1 ml’deki hücre sayısı
hesaplandı.
96 kuyucuklu hücre kültürü plaklarında 2x105 hücre/kuyucuk olacak şekilde hazırlanan
medium ile 100 µl’ye tamamlanarak ekim yapıldı. %5 CO2 içeren 37°C sıcaklıktaki etüve
kaldırılıp 48 saat inkübasyona bırakıldı. 48. saat sonunda hücrelerin bulunduğu
kuyucuklara BrdU eklendi ve 24 saat inkübe edildi. 24. saatin sonunda etüvden alınıp
mediumları aspire edildi. 1000 rpm’de 5 dakika santrifüj edildikten sonra her bir kuyucuğa
200 µl Fixing Solution konuldu. 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta inkübasyona
bırakıldı. İnkübasyon sonrası Fixing çözeltisi aspire edildi ve yıkama çözeltisi ile
mikroplaka yıkayıcısı ile bir kez yıkama işlemi yapıldı. Kuyucuklara 100 µl Anti-BrdU
çözeltisi eklendi, 1 saat oda sıcaklığında inkübe edildi. 1 saat sonunda yıkama çözeltisi ile
yıkama yapıldıktan sonra kuyucuklara 100 µl substrat çözeltisi eklendi. Plak oda
sıcaklığında karanlıkta 30 dakika bekletildikten sonra kuyucuklara 100µl Stop çözeltisi
eklendi ve pozitif kuyucukların renginin maviden parlak sarıya değiştiği gözlendi. Hemen
ardından 450 nm’de ELISA mikroplaka okuyucuda okutuldu ve optik dansite değerleri
(OD450) ölçüldü.
41
3.5. ELISA Yöntemi ile Sitokin ve IgE Antikoru Analizlerinin Temel Prensibi
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Şekil 3.1. ELISA yöntemi ile sitokin ve antikoru ölçümü. (1) Plaktaki kuyucuklar uygun
bir antikorla kaplanır. (2) Standart ve örnek içindeki ilgili antijen (sitokin) kaplı
antikora bağlanır. (3) Biotin konjugatlı ikincil antikor eklenir, antijene bağlanır.
(4) Streptavidin-HRP eklenir ve biotin konjugatlı ikincil antikora bağlanır. (5)
Standart ve örnek içindeki antijen miktarına göre renklenme (mavi) gözlenir.
Durdurma (stop) çözeltisi olarak asit eklenir ve reaksiyon sona erdirilir, mavi
renk sarıya döner. Sarı rengin şiddeti spektrofotometrik olarak 450 nm’de
okunur.
3.6. Ex vivo BrdU Katım Yöntemi Uygulanarak Elde Edilen Lenfosit Kültürlerinde
Sitokin Düzeylerinin Ölçümü
Sitokin ölçümü için, lenf düğümleri homojenize edildikten sonra iki kez PBS ile yıkandı.
Süpernatantları atıldı ve dipteki lenfosit hücreleri daha önceden hazırlanan RPMI-1640
kültür ortamı ile 1 ml’ye tamamlandı. Tripan mavisi ile boyandıktan sonra Neubauer lamı
ile sayım yapılarak ml’deki hücre sayısı hesaplandı.
ml’de 5x106 hücre olacak şekilde 24 kuyucuklu hücre kültürü plaklarına ekim yapıldı. %5
CO2 içeren 37°C sıcaklıktaki etüvde 72 saat inkübe edildi. 72. saatin sonunda 24
kuyucuklu plaklar 150 g’de 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatantlar 3 farklı eppendorfa
bölündü ve ELISA ile yapılacak sitokin analizlerine kadar saklanmak üzere -80°C’lik derin
dondurucuya yerleştirildi.
3.6.1. IFN-γ ölçümü
Bender MedSystems Mouse IFN-γ ELISA kiti (Katalog no: BMS606) kullanılarak ölçüm
yapıldı. Kit protokolüne göre, IFN-γ için spesifik bir antikorla kaplanmış plaklar ilk olarak
400 µl yıkama çözeltisi ile iki kez otomatik ELISA yıkayıcısında yıkandı. Yıkama
sırasında plaklar yıkama çözeltisi ile 10-15 saniye bekletildikten sonra aspire edildi.
42
Mikrokuyucukların alt yüzeylerinin aspirasyon sırasında zedelenmemesine dikkat edildi.
Yıkamanın hemen ardından 50 µl 7 farklı konsantrasyonda (1000-500-250-125-62,5-31,315,6 pg/ml) hazırlanmış standartlar ve örnekler eklendi. Dublike çalışıldı. 50 µl örnek
çözeltisi standart ve örnek bulunan kuyucuklara eklendi. Biotin konjugatı hazırlandı ve 50
µl eklendi. Yapışkanlı film ile kaplandı ve oda sıcaklığında (18-25°C) 2 saat inkübe edildi.
2 saatin sonuna doğru streptavidin-HRP hazırlandı. İnkübasyon süresi bittikten sonra
yapışkanlı film kaldırıldı ve kuyucuklar boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez otomatik ELISA
yıkayıcısında yıkandı. Ardından 100 µl streptavidin-HRP bütün kuyucuklara eklendi.
Yapışkanlı film ile kaplandı ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. 1 saatin sonunda
yapışkanlı film kaldırıldı ve kuyucuklar boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Bütün
kuyucuklara 100 µl TMB substrat çözeltisi eklendi. 10 dakika oda sıcaklığında ve
karanlıkta inkübe edildikten sonra renk değişimi gözlendi. 100 µl stop solüsyonu eklendi,
rengin maviden sarıya değişimi gözlendi ve ELISA okuyucuda 450 nm’de standartların ve
örneklerin optik dansiteleri ölçüldü (OD450). Standart eğri grafiği çizildi, doğru denklemi
bulundu ve bu denklemden hareketle örneklerin IFN-γ miktarları hesaplandı.
1,4
y = 0,0012x + 0,1122
R² = 0,9967
1,2
1
OD450
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Konsantrasyon (pg/ml)
Şekil 3.2. IFN-γ miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi
3.6.2. IL-2 ölçümü
Bender MedSytems Mouse IL-2 ELISA kiti (Katalog no:BMS601) kullanılarak ölçüm
yapıldı. Kit protokolüne göre, IL-2 için spesifik bir antikorla kaplanmış plaklar ilk olarak
400 µl yıkama çözeltisi ile iki kez otomatik ELISA yıkayıcısında yıkandı. Yıkama sonrası
plaklar
yıkama
çözeltisi
ile
10-15
saniye
bekletildikten sonra
aspire
edildi.
Mikrokuyucukların alt yüzeylerinin aspirasyon sırasında zedelenmemesine dikkat edildi.
Yıkamanın hemen ardından 50 µl 7 farklı konsantrasyonda (1000-500-250-125-62,5-31,3-
43
15,6 pg/ml) hazırlanmış standartlar ve örnekler eklendi. Dublike çalışıldı. 50 µl örnek
çözeltisi standart ve örnek bulunan kuyucuklara eklendi. Biotin konjugatı hazırlandı ve 50
µl eklendi. Yapışkanlı film ile kaplandı ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. 2 saatin
sonuna doğru streptavidin-HRP hazırlandı. İnkübasyon süresi bittikten soa yapışkanı film
kaldırıldı ve kuyucuklar boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Ardından 100 µl
streptavidin-HRP bütün kuyucuklara eklendi. Plak yapışkanlı film ile kaplandı ve oda
sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. 1 saatin sonunda yapışkanlı film kaldırıldı ve kuyucuklar
boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Bütün kuyucuklara 100 µl TMB substrat çözeltisi
eklendi. 10 dakika oda sıcakığında ve karanlıkta inkübe edildikten sonra renk değişimi
gözlendi. 100 µl stop solüsyonu eklendi, rengin maviden sarıya değişimi gözlendi ve
ELISA okuyucuda 450 nm’de standartların ve örneklerin optik dansiteleri ölçüldü.
Standart eğri grafiği çizildi, doğru denklemi bulundu ve bu denklemden hareketle
örneklerin IL-2 miktarları hesaplandı.
0,6
y = 0,0004x + 0,08
R² = 0,972
0,5
0,4
OD450
0,3
0,2
0,1
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Konsantrasyon (pg/ml)
Şekil 3.3. IL-2 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi
3.6.3. IL-4 ölçümü
Bender MedSystems Mouse IL-4 ELISA kiti (Katalog no: BMS613) kullanılarak ölçüm
yapıldı. Kit protokolüne göre, IL-4 için spesifik bir antikorla kaplanmış plaklar ilk olarak
400 µl yıkama çözeltisi ile iki kes yıkandı. Yıkama sırasında plaklar yıkama çözeltisi ile
10-15 saniye bekletildikten sonra aspire edildi. Mikrokuyucukların alt yüzeylerinin
aspirasyon sırasında zedelenmemesine dikkat edildi. Yıkamanın hemen ardından 50 µl 7
farklı konsantrasyonda (250-125-62,5-31,3-15,6-7,8-3,9 pg/ml) hazırlanmış standartlar ve
örnekler eklendi. Dublike çalışıldı. 50 µl örnek çözeltisi standart ve örnek bulunan
kuyucuklara eklendi. Biotin konjugatı hazırlandı ve 50 µl eklendi. Yapışkanlı film ile
44
kaplandı ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. 2 saat bittikten sonra yapışkanlı film
kaldırıldı ve kuyucuklar boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Ardından 100 µl
streptavidin-HRP bütün kuyucuklara eklendi. Yapışkanlı film ile kaplandı ve oda
sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. 1 saatin sonunda yapışkanlı film kaldırıldı ve kuyucuklar
boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Bütün kuyucuklara 100 µl TMB substrat çözeltisi
eklendi. 10 dakika oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildikten sonra renk değişimi
gözlendi. 100 µl stop solüsyonu eklendi, rengin maviden sarıya değişimi gözlendi ve
ELISA okuyucuda 450 nm’de standartların ve örneklerin optik dansiteleri ölçüldü.
Standart eğri grafiği çizildi, doğru denklemi bulundu ve bu denklemden hareketle
örneklerin IL-4 miktarları hesaplandı.
2
y = 0,0069x + 0,13
R² = 0,89
1,5
OD450
1
0,5
0
0
50
100
150
200
250
300
Konsantrasyon (pg/ml)
Şekil 3.4. IL-4 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi
3.6.4. IL-5 ölçümü
Bender MedSystems Mouse IL-5 ELISA kiti (Katalog no: BMS610) kullanılarak ölçüm
yapıldı. Kit protokolüne göre, IL-5 için spesifik bir antikorla kaplanmış plaklar ilk olarak
400 µl yıkama çözeltisi ile iki kes yıkandı. Yıkama sırasında plaklar yıkama çözeltisi ile
10-15 saniye bekletildikten sonra aspire edildi. Mikrokuyucukların alt yüzeylerinin
aspirasyon sırasında zedelenmemesine dikkat edildi. Yıkamanın hemen ardından 50 µl 7
farklı konsantrasyonda (500-250-125-62,5-31,3-15,6-7,8 pg/ml) hazırlanmış standartlar ve
örnekler eklendi. Dublike çalışıldı. 50 µl örnek çözeltisi standart ve örnek bulunan
kuyucuklara eklendi. Biotin konjugatı hazırlandı ve 50 µl eklendi. Yapışkanlı film ile
kaplandı ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. 2 saat bittikten sonra yapışkanlı film
kaldırıldı ve kuyucuklar boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Ardından 100 µl
45
streptavidin-HRP bütün kuyucuklara eklendi. Yapışkanlı film ile kaplandı ve oda
sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. 1 saatin sonunda yapışkanlı film kaldırıldı ve kuyucuklar
boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Bütün kuyucuklara 100 µl TMB substrat çözeltisi
eklendi. 10 dakika oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildikten sonra renk değişimi
gözlendi. 100 µl stop solüsyonu eklendi, rengin maviden sarıya değişimi gözlendi ve
ELISA okuyucuda 450 nm’de standartların ve örneklerin optik dansiteleri ölçüldü.
Standart eğri grafiği çizildi, doğru denklemi bulundu ve bu denklemden hareketle
örneklerin IL-5 miktarları hesaplandı.
1,2
y = 0,0017x + 0,124
R² = 0,9959
1
0,8
OD450
0,6
0,4
0,2
0
0
100
200
300
400
500
600
Konsantrasyon (pg/ml)
Şekil 3.5. IL-5 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi
3.6.5. IL-10 ölçümü
Boster Immunoleader Mouse IL-10 ELISA kiti (Katalog no: EK0417) kullanılarak ölçüm
yapıldı. Kit protokolüne göre, IL-10 için spesifik bir antikorla kaplanmış plaklara 100 µl 7
farklı konsantrasyonda hazırlanmış standartlar (1000-500-250-125-62,5-31,3-15,6 pg/ml)
ve örnekler kuyucuklara eklendi. Dublike çalışıldı. Yapışkanlı film ile kaplandı ve 37°C’de
90 dakika inkübe edildi. Yapışkanlı film kaldırıldı, kuyucuklar boşaltıldı. Her bir kuyucuğa
100 µl biotinlenmiş Anti – fare IL-10 antikoru çalışma çözeltisi eklendi ve 37°C’de 1 saat
inkübe edildi. Kuyucuklar 3 kez yıkama çözeltisi ile yıkandı. Yıkama sırasında plaklar
yıkama çözeltisi ile 1 dakika bekletildikten sonra aspire edildi. Mikrokuyucukların alt
yüzeylerinin aspirasyon sırasında zedelenmemesine dikkat edildi. Ardından her bir
kuyucuğa 100 µl ABC (Avidin-Biotin-Peroksidaz Kompleksi) çalışma çözeltisi eklendi ve
37°C’de 30 dakika inkübe edildi. Kuyucuklar yıkama çözeltisi ile 5 kez yıkandı. Yıkama
46
sırasında plaklar yıkama çözeltisi ile 1-2 dakika bekletildikten sonra aspire edildi.
Kuyucuklar boşaltıldıktan sonra 90 µl TMB renk geliştirici ajan her bir kuyucuğa eklendi
ve 37°C’de karanlıkta 20-25 dakika inkübe edildi. İnkübasyon sonrası 100 µl TMB stop
çözeltisi kuyucuklara eklendi. Rengin anında sarıya değiştiği gözlendi. 30 dakika içinde
ELISA okuyucuda 450 nm’de standartların ve örneklerin optik dansiteleri ölçüldü.
Standart eğri grafiği çizildi, doğru denklemi bulundu ve bu denklemden hareketle
örneklerin IL-10 miktarları hesaplandı.
y = 0,0019x + 0,24
R² = 0,9723
2,5
2
OD450
1,5
1
0,5
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Konsantrasyon (pg/ml)
Şekil 3.6. IL-10 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi
3.6.6. IL-13 ölçümü
Bender MedSystems Mouse IL-13 ELISA kiti (Katalog no: BMS6015) kullanılarak ölçüm
yapıldı. Kit protokolüne göre, IL-13 için spesifik bir antikorla kaplanmış plaklar ilk olarak
400 µl yıkama çözeltisi ile iki kes yıkandı. Yıkama sırasında plaklar yıkama çözeltisi ile
10-15 saniye bekletildikten sonra aspire edildi. Mikrokuyucukların alt yüzeylerinin
aspirasyon sırasında zedelenmemesine dikkat edildi. Yıkamanın hemen ardından 50 µl 7
farklı konsantrasyonda (500-250-125-62,5-31,3-15,6-7,8 pg/ml) hazırlanmış standartlar ve
örnekler eklendi. Dublike çalışıldı. 50 µl örnek çözeltisi standart ve örnek bulunan
kuyucuklara eklendi. Biotin konjugatı hazırlandı ve 50 µl eklendi. Yapışkanlı film ile
kaplandı ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi. 2 saat bittikten sonra yapışkanlı film
kaldırıldı ve kuyucuklar boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Ardından 100 µl
streptavidin-HRP bütün kuyucuklara eklendi. Yapışkanlı film ile kaplandı ve oda
sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. 1 saatin sonunda yapışkanlı film kaldırıldı ve kuyucuklar
boşaltıldı. Kuyucuklar 3 kez yıkandı. Bütün kuyucuklara 100 µl TMB substrat çözeltisi
47
eklendi. 10 dakika oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildikten sonra renk değişimi
gözlendi. 100 µl stop solüsyonu eklendi, rengin maviden sarıya değişimi gözlendi ve
ELISA okuyucuda 450 nm’de standartların ve örneklerin optik dansiteleri ölçüldü.
Standart eğri grafiği çizildi, doğru denklemi bulundu ve bu denklemden hareketle
örneklerin IL-13 miktarları hesaplandı.
2,5
y = 0,0035x + 0,179
R² = 0,8964
2
OD450
1,5
1
0,5
0
0
100
200
300
400
500
600
Konsantrasyon (pg/ml)
Şekil 3.7. IL-13 miktarının ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi
3.7. Kardiyak Ponksiyon İşlemi ile Elde Edilen Kanda IgE Ölçümü
Farelerin kalp boşluğundan alınan kandan IgE ölçümü için serum elde edildi. Bu amaçla
öncelikle tüpler oda sıcaklığında 1 saat kanın pıhtılaşması için bekletildi. Tüpler 1500 g’de
10 dakika santrifüj edildikten sonra hızlı bir şekilde serumları alındı ve ELISA ile
yapılacak total serum IgE miktarı ölçümü yapılana kadar saklanmak üzere -80°C’lik derin
dondurucuya yerleştirildi.
USCN Life Science Inc., Cloud-Clone Corp. Mouse IgE ELISA kiti (Katalog no:
SEA545Mu) kullanılarak ölçüm yapıldı. Kit protokolüne göre, IgE için spesifik antikorla
kaplanmış plaklarda ilk olarak 100 µl 7 farklı konsantrasyonda hazırlanmış standartlar
(900-600-300-150-75 ng/ml) ve örnekler kuyucuklara eklendi ve 37°C’de 2 saat inkübe
edildi. İnkübasyon sonrası kuyucuklar aspire edildi ve 100 µl Detection Reagant A ilave
edildi. Plaklar 37°C’de 1 saat inkübe edildikten sonra aspire edildi ve 3 kez yıkama yapıldı.
Kuyucuklara 100 µl Detecetion Reagent B eklendi ve 37°C’de yarım saat inkübe edildi.
İnkübasyondan sonra aspire edildi ve 5 kez yıkama yapıldı. Yıkamadan sonra 90 µl
substrat çözeltisi eklendi ve 37°C’de 15-25 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyondan
48
sonra 50 µl stop çözeltisi eklendikten hemen sonra ELISA okuyucuda 450 nm’de
standartların ve örneklerin optik dansiteleri ölçüldü. Standart eğri grafiği çizildi, doğru
denklemi bulundu ve bu denklemden hareketle örneklerin IgE miktarları hesaplandı.
OD450
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 0,0008x + 0,049
R² = 0,938
0
200
400
600
800
1000
Konsantrasyon (ng/ml)
Şekil 3.8. IgE miktarının ölçülmesinde kullanılan standart doğru denklemi
3.8. İstatistiksel Analizler
Sitokin düzeylerinin ortalama ve standart hata değerleri hesaplanmıştır. İstatiksel olarak
anlam bulunduğunda, sadece çözücü uygulanan kontrol grubu ile test kimyasalının
uygulandığı her bir grubun kıyaslanması Mann-Whitney test ile yapıldı.
Bu testler, “IBM SPPS Statistics 20” programı kullanılarak yapılmıştır.
49
4. BULGULAR ve YORUM
4.1. Radyoaktif Olmayan ex vivo LLNA Yöntemi ile Kimyasalların Kısa Süreli
Maruziyet Sonrası Alerji Potansiyellerinin Ölçülmesi ile İlgili Deney Sonuçları
Solunum sensitizan potansiyelleri göz önüne alındığında negatif kontrol olan 2,4dinitroklorobenzenin (DNCB) %1’lik konsantrasyondaki çözeltisinin kısa süreli maruziyet
sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.1.’de verilmiştir.
Çizelge 4.1. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Kimyasal
OD450
Ortalama
Standart hata
0,1061
0,04097163
0,1745
0,0895
%1 DNCB
(Çözücü: AOO)
0,087
0,069
0,1105
Solunum sensitizanı olduğu bilinen ve çalışmamızda pozitif kontrol olarak kullandığımız
trimellitik anhidritin (TMA) %10’luk konsantrasyondaki çözeltisinin kısa süreli maruziyet
sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.2.’de gösterilmiştir.
Çizelge 4.2. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Kimyasal
OD450
Ortalama
Standart hata
0,0776
0,01461762
0,065
0,083
%10 TMA
(Çözücü: AOO)
0,079
0,0985
0,0625
50
Test maddemiz diasetilin %10’luk konsantrasyondaki çözeltisinin kısa süreli maruziyet
sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.3.’te gösterilmiştir.
Çizelge 4.3. Diasetile kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Kimyasal
OD450
Ortalama
Standart hata
0,0773
0,01393108
0,0975
0,074
%10 Diasetil
0,0845
(Çözücü: AOO)
0,068
0,0625
Çözücü olarak kullanılan aseton:zeytin yağının (AOO, 4:1) kısa süreli maruziyet sonucu ex
vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.4.’te gösterilmiştir.
Çizelge 4.4. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Çözücü
OD450
Ortalama
Standart hata
0,07475
0,010763696
0,0645
Belirlenememiştir.
0,073
0,0615
AOO
0,0905
(4:1)
Belirlenememiştir.
0,0755
0,0905
0,0695
0,073
51
DNCB, TMA VE diasetilin 3 günlük maruziyet sonrası BrdU ELISA kiti ile lenfosit
proliferasyonu ölçümü sonrası elde edilen her bir gruba ait ortalama OD 450 değerleri Şekil
4.1.’de sütun grafiği üzerinde gösterilmiştir.
0,16
0,14
OD 450
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.1. Kısa süreli maruziyet sonucu lenfosit proliferasyonu ölçümü (OD450)
4.1.1. DNCB için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması
DNCB’nin ortalama optik dansite değeri
SI
=
=
2,29
=
1,44
=
1,43
Çözücünün (AOO) ortalama optik dansite değeri
4.1.2. TMA için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması
TMA’nın ortalama optik dansite değeri
SI
=
Çözücünün (AOO) ortalama optik dansite değeri
4.1.3. Diasetil için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması
Diasetilin ortalama optik dansite değeri
SI
=
Çözücünün (AOO) ortalama optik dansite değeri
Kimyasallarla indüklenen immün yanıt sonucunda gerçekleşen lenfosit proliferasyonunun
göstergesi olan OD450 değerlerinin rölatif olarak değerlendirilip, stimülasyon indeksleri
52
hesaplanmıştır. Her üç kimyasal (DNCB, TMA ve diasetil) için de çözücüye kıyasla OD 450
değerlerinde artış gözlenmiştir.
OECD TG 442B’de belirtildiği üzere, stimülasyon indeks (SI) değeri 1.6’dan büyük olan
kimyasallar temas sensitizanı olarak kabul edilmektedir. Bu durumda önceki çalışmalardan
da beklenildiği üzere (Adenuga ve diğerleri; Dearman ve diğerleri, 2009; Goutet ve
diğerleri, 2012) DNCB’nin %1’lik konsantrasyonda alerjik temas dermatitine yol açma
potansiyeline sahip olduğu gösterilmiştir.
Solunum sensitizanı olduğu bilinen TMA’nın %10’luk konsantrasyonu lenfosit
proliferasyonunda anlamlı bir artışa neden olmamıştır. Diasetil konsantrasyon seçimi
Anderson ve arkadaşlarının (2007) elde ettiği sonuçları esas alarak yapılmıştır. Bu
konsantrasyonda çözücü kontrolüne kıyasla lenfosit proliferasyonunda anlamlı bir sonuç
elde edilmemiştir. Bu veriler doğrultusunda TMA’nın ve diasetilin uyguladığımız
konsantrasyonlarda temas sensitizasyonu oluşturmadığı söylenebilir.
4.2. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kısa Süreli Maruziyet Sonrası
Kulak Arkası Lenf Düğümlerinden Elde Edilen Lenfosit Hücre Kültürlerinde
Sitokin Düzeylerinin Ölçümü
4.2.1. IFN-γ ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IFN-γ miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0012x + 0,1122
53
Çizelge 4.5. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
2,774
4436,315588
3,454
5569,644388
0,349
394,665088
3,285
5287,978848
3,743
6051,309128
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
4347,982608
2286,585544
Çizelge 4.6. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
Ortalama
(pg/ml)
(Konsantrasyon)
3,831
6197,975208
4
6479,640748
3,782
6116,308868
3,662
5916,309668
3,937
6374,641168
6216,975132
Standart
hata
220,6503001
Çizelge 4.7. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
Ortalama
(pg/ml)
(Konsantrasyon)
0,278
276,332228
0,179
111,332888
0,275
271,332248
0,204
152,999388
0,146
56,333108
173,665972
Standart
hata
97,6711109
54
Çizelge 4.8. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,151
64,666408
0,155
71,333048
0,13
29,666548
0,146
56,333108
0,194
136,332788
0,159
77,999688
0,178
109,666228
0,152
66,333068
0,168
92,999628
0,171
97,999608
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
80,333012
30,07386255
Kimyasalların indüklediği IFN-γ miktarları (pg/ml) Şekil 4.2.’deki gibi gösterilmiştir.
IFN-γ düzeyi
(pg/ml)
8000
**
**
6000
4000
2000
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.2. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IFN-γ miktarı
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
Temas sensitizanı DNCB’nin %1’lik konsantrasyonu kısa süreli maruziyet sonrası IFN-γ
miktarında beklediğimiz gibi istatistiksel olarak yüksek derecede anlamlı artışa neden
olmuştur. (p<0,01).
TMA da IFN-γ düzeyinde AOO grubuna göre anlamlı artış göstermiştir (p<0,01).
Diasetilin indüklediği IFN-γ ise istatistiksel anlamlılık sınırında kalmıştır (0,05≤p<0,1).
55
4.2.2. IL-2 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-2 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0004x + 0,08
Çizelge 4.9. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
0,583
0,096
0,121
0,196
0,125
Konsantrasyon
Ortalama
(pg/ml)
(Konsantrasyon)
2515
80
721
205
580
225
Standart
hata
1019,984069
Çizelge 4.10. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
0,12
0,134
0,126
0,125
0,17
Konsantrsyon
(pg/ml)
200
270
230
225
450
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
275
100,9950494
Çizelge 4.11. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,337
0,257
0,122
0,326
0,14
Konsantrasyon
Ortalama
(pg/ml)
(Konsantrasyon)
1285
885
782
210
1230
300
Standart
hata
505,9224249
56
Çizelge 4.12. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Çözücü
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
Ortalama
Standart hata
(Konsantrasyon)
0,324*
AOO (4:1)
0,129
245
0,099
95
0,095
75
0,105
125
0,096
80
0,098
90
0,146
330
0,281
166,875
105,5237786
*
0,139
295
* İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Kimyasalların indüklediği IL-2 miktarları (pg/ml) Şekil 4.3.’teki gibi gösterilmiştir.
IL-2 düzeyi
(pg/ml)
2000
*
1500
1000
500
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.3. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-2 miktarı
* 0,01≤p<0,05; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatistiksel anlamlı farklılık (Mann-Whitney test).
IL-2 düzeyi, kısa süreli maruziyet sonrası sadece diasetil için çözücü kontrol grubuna göre
istatistiksel olarak anlamlı bir artış göstermiştir.
4.2.3. IL-4 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
57
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-4 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0069x + 0,13
Çizelge 4.13. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,868
214,02
0,859
211,41
0,188
16,82
1,79
481,4
1,725
462,55
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
277,24
195,0449
Çizelge 4.14. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
2,947
816,93
4
1122,3
3,558
994,12
3,824
1071,26
3,085
856,95
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
972,312
132,4902
Çizelge 4.15. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
2,618
721,52
0,541
119,19
0,168
11,02
1,023
258,97
0,188
16,82
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
225,504
294,9606
58
Çizelge 4.16. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
0,179
14,21
0,154
6,96
0,142
3,48
0,149
5,51
0,149
5,51
0,146
4,64
0,162
9,28
0,173
12,47
0,212
23,78
0,388
74,82
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
16,066
21,52183
Kimyasalların indüklediği IL-4 miktarları (pg/ml) Şekil 4.4.’teki gibi gösterilmiştir.
**
1200
IL-4 düzeyi
(pg/ml)
1000
800
600
** *
400
200
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.4. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-4 miktarı
* 0,01≤p<0,05; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatistiksel anlamlı farklılık (Mann-Whitney test).
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
IL-4 miktarında, kısa süreli maruziyet sonrası TMA için öngördüğümüz üzere çözücü
kontrol grubuna göre yüksek istatistiksel anlamlılık elde edilmiştir (p<0,01).
Ayrıca DNCB de kısa süreli maruziyet sonrası IL-4 düzeyini anlamlı derecede artırmıştır
(p<0,01).
Diasetil, çözücü kontrol grubuna göre IL-4 sitokin artışını anlamlı düzeyde stimüle etmiştir
(p<0,05).
59
4.2.4. IL-5 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-5 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0017x + 0,124
Çizelge 4.17. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,237
132,888
0,572
526,848
0,263
163,464
0,354
270,48
0,455
389,256
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
296,5872
163,4077
Çizelge 4.18. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
2,415
2694,216
4
4558,176
3,061
3453,912
3,229
3651,48
3,099
3498,6
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
3571,277
664,9614
60
Çizelge 4.19. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,401
0,333
0,333
0,326
0,191
Konsantrasyon
(pg/ml)
325,752
245,784
245,784
237,552
78,792
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
226,7328
90,18624
Çizelge 4.20. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
0,179
14,21
0,154
6,96
0,142
3,48
0,149
5,51
0,149
5,51
0,146
4,64
0,162
9,28
0,173
12,47
0,212
23,78
0,388
74,82
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
16,066
21,52183
Kimyasalların indüklediği IL-5 miktarları (pg/ml) Şekil 4.5.’teki gibi gösterilmiştir.
IL-5 düzeyi
(pg/ml)
5000
**
4000
3000
2000
1000
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.5. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-5 miktarı
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
Sadece TMA çözücü kontrolüne göre kısa süreli maruziyet sonucu IL-5 düzeyinde anlamlı
artışa neden olmuştur (p<0,01).
61
4.2.5. IL-10 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-10 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0019x + 0,24
Çizelge 4.21. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
0,583
1,061
0,432
0,863
1,178
Konsantrasyon
(pg/ml)
360,836
863,692
201,984
655,396
986,776
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
613,7368
330,4809
Çizelge 4.22. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
2,59
3,642
2,524
2,762
2,192
Konsantrasyon
(pg/ml)
2472,2
3578,904
2402,768
2653,144
2053,504
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
2632,104
572,2358
Çizelge 4.23. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,75
0,321
0,424
0,575
0,363
Konsantrasyon
(pg/ml)
536,52
85,212
193,568
352,42
129,396
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
259,4232
185,0841
62
Çizelge 4.24. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Çözücü
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
AOO (4:1)
0,245
5,26
0,382
0,367
0,407
0,48
0,36
0,311
0,292
0,256
0,473
149,384
133,604
175,684
252,48
126,24
74,692
54,704
26,3
245,116
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
124,3464
85,28744
Kimyasalların indüklediği IL-10 miktarları (pg/ml) Şekil 4.6.’daki gibi gösterilmiştir.
IL-10 düzeyi
(pg/ml)
4000
**
3000
2000
1000
**
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.6. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-10 miktarı
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
IL-10 düzeyi, DNCB ve TMA stimülasyonu sonucu çözücü kontrol grubuna göre artış
göstermiştir (p<0,01).
4.2.6. IL-13 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
63
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-13 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0035x + 0,179
Çizelge 4.25. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
1,934
1003,86
2,774
1484,34
0,444
151,58
2,895
1553,552
2,361
1248,104
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
1088,287
566,4404
Çizelge 4.26. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
2,612
1391,676
2,515
1336,192
2,482
1317,316
2,71
1447,732
2,587
1377,376
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
1374,058
50,99694
Çizelge 4.27. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
1,864
963,82
0,998
468,468
1,159
560,56
1,484
746,46
0,338
90,948
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
566,0512
326,3599
64
Çizelge 4.28. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
0,339
91,52
0,233
30,888
0,353
99,528
0,293
65,208
0,303
70,928
0,288
62,348
0,261
46,904
0,317
78,936
0,558
216,788
1,075
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
84,78311
53,78228
*
* İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Kimyasalların indüklediği IL-13 miktarları (pg/ml) Şekil 4.7’deki gibi gösterilmiştir.
IL-13 düzeyi
(pg/ml)
2000
1500
1000
**
**
**
500
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.7. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-13 miktarı
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
Her üç kimyasal da kısa süreli maruziyet sonrası çözücü kontrol grubuna göre IL-13
düzeyinin anlamlı derecede artışına neden olmuştur (p<0,01).
4.3. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kısa Süreli Maruziyet Sonrası
Total Serum IgE Konsantrasyonunun Ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 3 günlük
maruziyeti sonrası farelerin serumlarındaki total IgE miktarı, ELISA ile örneklerin optik
dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen standart doğru denkleminden hesaplandı.
65

IgE miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0008x + 0,049
Çizelge 4.29. DNCB’ye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(ng/ml)
0,055
37,5
0,053
25
0,055
37,5
0,062
81,5
0,057
50
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
46,25
21,46946
Çizelge 4.30. TMA’ya kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(ng/ml)
0,058
56,25
0,061
75
0,061
75
0,071
137,5
0,058
56,25
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
80
33,48274
Çizelge 4.31. Diasetile kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(ng/ml)
0,108
368,75
0,068
118,75
0,088
243,75
0,065
100
0,059
62,5
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
178,75
126,1355
66
Çizelge 4.32. Çözücüye kısa süreli maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Çözücü
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(ng/ml)
0,057
50
0,057
50
0,182
Standart
hata
57,14286
21,17283
*
0,085*
AOO (4:1)
Ortalama
(Konsantrasyon)
0,054
31,25
0,059
62,5
0,055
37,5
0,062
81,25
0,072*
0,063
87,5
* İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Total serum IgE
konsantrasyonu
(ng/ml)
Kimyasalların indüklediği IgE miktarları (ng/ml) Şekil 4.8.’deki gibi gösterilmiştir.
400
300
*
200
100
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.8. Kısa süreli maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IgE miktarı
* 0,01≤p<0,05; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatistiksel anlamlı farklılık (Mann-Whitney test).
DNCB ve TMA IgE düzeyinde istatistiksel açıdan çözücü kontrol grubuna göre anlamlı bir
fark oluşturmazken, sadece diasetil total serum IgE düzeyinde çözücüye kıyasla anlamlı bir
artışa neden olmuştur (p<0,05).
67
4.4. Radyoaktif Olmayan ex vivo LLNA Yöntemi ile Kimyasalların Kronik Maruziyet
Sonrası Alerji Potansiyellerinin Ölçülmesi ile İlgili Deney Sonuçları
Solunum sensitizan potansiyelleri göz önüne alındığında negatif kontrol olan 2,4dinitroklorobenzenin (DNCB) %1’lik konsantrasyondaki çözeltisinin kronik maruziyet
sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.33.’te verilmiştir.
Çizelge 4.33. DNCB’ye kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Kimyasal
OD450-1
0D450-2
(OD450-1+OD450-2) / 2
0,376
0,077*
0,376
0,148
0,109
0,1285
0,104
0,1
0,102
0,095
0,086
0,0905
0,165
0,079
0,165
%1 DNCB
(Çözücü:
AOO)
Ortalama
Standart
hata
0,1724
0,11736561
* İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Solunum sensitizanı olduğu bilinen ve çalışmamızda pozitif kontrol olarak kullandığımız
trimellitik anhidritin (TMA) %10’luk konsantrasyondaki çözeltisinin kronik maruziyet
sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.34.’te gösterilmiştir.
Çizelge 4.34. TMA’ya kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Kimyasal
OD450
Ortalama
Standart hata
0,0955
%10 TMA
(Çözücü: AOO)
0,1
0,098
0,114
0,00731436
0,1025
0,105
* İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Test maddemiz diasetilin %10’luk konsantrasyondaki çözeltisinin kronik
maruziyet
sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.35.’te gösterilmiştir.
68
Çizelge 4.35. Diasetile kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Kimyasal
OD450
Ortalama
Standart hata
0,119
%10 Diasetil
(Çözücü: AOO)
0,246
0,06556803
0,1075
0,148
0,1195
*İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Çözücü olarak kullanılan aseton:zeytin yağının (AOO, 4:1) kısa süreli maruziyet sonucu ex
vivo yöntemle tespit edilen OD450 sonuçları Çizelge 4.4.’te gösterilmiştir.
Çizelge 4.36. Çözücüye kronik maruziyet sonucu ex vivo yöntemle tespit edilen OD450
sonuçları
Çözücü
OD450
Ortalama
Standart hata
0,100333
0,015396969
Belirlenememiştir.
Belirlenememiştir.
0,101
AOO
(4:1)
0,121
0,076
0,092
Belirlenememiştir.
0,11
0,102
Belirlenememiştir.
* İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Solunum sensitizan potansiyelleri göz önüne alındığında negatif kontrol olan %1’lik
konsantrasyonda DNCB, pozitif kontrol olan %10’luk konsantrasyonda TMA, test maddesi
olan %10’luk Diasetil ve çözücü kontrolü olan aseton:zeytin yağının (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyet sonrası BrdU ELISA kiti ile lenfosit proliferasyonu ölçümü sonrası elde edilen
her bir gruba ait ortalama OD450 değerleri Şekil 4.9.’da sütun grafiği üzerinde
gösterilmiştir.
69
0,35
0,3
OD 450
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.9. Kronik maruziyet sonucu lenfosit proliferasyonu ölçümü (OD450)
4.4.1. DNCB için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması
DNCB’nin ortalama optik dansite değeri
SI
=
=
3.41
=
1,29
=
1,47
Çözücünün (AOO) ortalama optik dansite değeri
4.4.2. TMA için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması
TMA’nın ortalama optik dansite değeri
SI
=
Çözücünün (AOO) ortalama optik dansite değeri
4.4.3. Diasetil için stimülasyon indeksinin (SI) hesaplanması
Diasetilin ortalama optik dansite değeri
SI
=
Çözücünün (AOO) ortalama optik dansite değeri
Çalışmamızda her üç kimyasal da kronik maruziyet sonrası çözücü kontrolüne kıyasla
immün yanıtın göstergesi olan lenfosit proliferasyonunu indüklemiştir. DNCB’nin
stimülasyon indeksi değerinin 1,6’dan büyük çıkması ile bu kimyasalın temas sensitizanı
potansiyeli ortaya konmuştur. Diasetil ve TMA’nın etki gücü daha önceki çalışmalarda
olduğu gibi yüksek çıkmamıştır ve anlamlı bir stimülasyon indeksi değeri elde
edilememiştir (SI<1,6).
70
4.5. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kronik Maruziyet Sonrası Kulak
Arkası Lenf Düğümlerinden Elde Edilen Lenfosit Hücre Kültürlerinde Sitokin
Düzeylerinin Ölçümü
4.5.1. IFN-γ ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IFN-γ miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0012x + 0,1122
Çizelge 4.37. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
0,197
Konsantrasyon
(pg/ml)
141,332768
0,16
79,666348
0,156
72,999708
0,158
76,333028
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
92,582963
32,61363056
Belirlenememiştir
Çizelge 4.38. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
Ortalama
(pg/ml)
(Konsantrasyon)
0,132
32,999868
0,204
152,999388
0,159
79,666348
0,147
49,666468
0,137
117,999528
86,66632
Standart
hata
49,19329873
71
Çizelge 4.39. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,167
0,214
0,159
0,147
0,137
Konsantrasyon
(pg/ml)
91,332968
169,665988
77,999688
57,999768
41,333168
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
87,666316
49,6429726
Çizelge 4.40. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IFN-γ düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans
Konsantrasyon
(OD450)
(pg/ml)
0,16
79,666348
0,114
2,999988
*
0,234
0,148
59,666428
0,17
96,332948
*
0,223
0,163
84,666328
0,148
59,666428
0,154
69,666388
Belirlenememiştir
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
64,666408
30,29166968
*İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Kimyasalların indüklediği IFN-γ miktarları (pg/ml) Şekil 4.10.’daki gibi gösterilmiştir.
IFN-γ düzeyi (pg/ml)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.10. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IFN-γ miktarı
Her üç kimyasal da istatistiksel olarak anlamlı IFN-γ artışına neden olmamıştır.
72
4.5.2. IL-2 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-2 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0004x + 0,08
Çizelge 4.41. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,26
900
0,152
360
0,109
145
0,151
355
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
440
322,6194869
Belirlenememiştir
Çizelge 4.42. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
Ortalama
(pg/ml)
(Konsantrasyon)
0,172
460
0,234
770
0,186
530
0,106
130
0,19
550
488
Standart
hata
231,3438999
73
Çizelge 4.43. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,113
0,113
0,097
0,138
0,107
Konsantrasyon
(pg/ml)
165
165
85
290
135
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
168
75,6306816
Çizelge 4.44. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-2 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans
(OD450)
0,101
Konsantrasyon
(pg/ml)
105
0,175
475
0,124
220
0,099
95
0,107
135
0,108
140
0,1
100
0,101
105
0,099
95
Belirlenememiştir
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
163,33
123,4149505
Kimyasalların indüklediği IL-2 miktarları (pg/ml) Şekil 4.11.’deki gibi gösterilmiştir.
IL-2 düzeyi (pg/ml)
900
800
*
*
700
600
500
400
300
200
100
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.11. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-2 miktarı
* 0,01≤p<0,05; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatistiksel anlamlı farklılık (Mann-Whitney test).
74
IL-2 miktarı kronik maruziyet sonrası DNCB ve TMA için çözücü kontrolüne göre artış
gösterirken, diasetilin indüklediği IL-2 miktarı AOO gurubuna göre istatistiksel
anlamlılıkta değildir.
4.5.3. IL-4 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-4 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0069x + 0,13
Çizelge 4.45. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,307
51,33
0,178
13,92
0,18
14,5
0,178
13,92
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
23,4175
18,61034
Belirlenememiştir
Çizelge 4.46. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
1,049
266,51
3,336
929,74
1,654
441,96
0,254
35,96
2,411
661İ49
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
467,132
345,895
75
Çizelge 4.47. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,13
0
0,151
6,09
0,137
2,03
0,128
-0,58
0,15
5,8
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
2,668
3,146199
Çizelge 4.48. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-4 düzeyleri
Çözücü
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
AOO (4:1)
0,148
5,22
0,15
5,8
0,176
13,34
0,142
3,48
0,16
8,7
0,17
11,6
0,141
3,19
0,146
4,64
0,176
13,34
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
7,701111
4,139772
Belirlenememiştir
Kimyasalların indüklediği IL-4 miktarları (pg/ml) Şekil 4.12.’deki gibi gösterilmiştir.
IL-4 düzeyi
(pg/ml)
1000
**
800
600
400
200
**
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.12. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-4 miktarı
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
76
Daha önceki çalışmalardan beklendiği üzere TMA yüksek istatistiksel anlamlılıkta IL-4
düzeyini çözücü kontrol grubuna göre artırmıştır. Aynı zamanda DNCB tarafından
indüklenen IL-4 seviyesi de çözücü kontrolüne göre artış göstermiştir. Ancak IL-4 seviyesi
diasetil için anlamlı bulunmamıştır.
4.5.4. IL-5 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-5 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0017x + 0,124
Çizelge 4.49. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,138
16,464
0,277
179,928
0,129
5,88
0,15
30,576
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
58,212
81,77218
Belirlenememiştir
Çizelge 4.50. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,249
147
0,183
69,384
0,207
97,608
0,193
81,144
0,168
51,744
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
89,376
36,30394
77
Çizelge 4.51. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Kimyasal
Absorbans
(OD450)
0,15
0,269
0,175
0,162
0,185
%10
Diasetil
Konsantrasyon
(pg/ml)
30,576
170,52
59,976
44,688
71,736
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
75,4992
55,34326
Çizelge 4.52. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-5 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
0,124
0
0,157
38,808
0,16
42,336
0,131
8,232
0,144
23,52
0,197
85,848
0,226
119,952
0,156
37,632
0,204
94,08
Belirlenememiştir
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
50,04533
40,93304
Kimyasalların indüklediği IL-5 miktarları (pg/ml) Şekil 4.13.’teki gibi gösterilmiştir.
IL-5 düzeyi (pg/ml)
150
100
50
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.13. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-5 miktarı
Her üç kimyasal da kronik maruziyet sonrası IL-5 seviyesinde anlamlı bir artışı
indüklememiştir.
78
4.5.5. IL-10 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-10 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0019x + 0,24
Çizelge 4.53. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,4
168,32
0,399
167,268
0,377
144,124
0,418
187,256
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
166,742
17,65564
Belirlenememiştir
Çizelge 4.54. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,464
235,648
0,66
441,84
0,45
19,988
0,36
48,392
0,404
128,344
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
239,4352
121,0522
79
Çizelge 4.55. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,374
0,664
0,259
0,286
0,362
Konsantrasyon
(pg/ml)
140,968
440,048
19,988
48,392
128,344
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
156,748
169,7017
Çizelge 4.56. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-10 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
0,341
106,252
0,347
112,564
0,449
219,868
0,464
235,648
0,414
183,048
0,634
414,488
0,406
174,632
0,333
97,836
0,29
52,6
Belirlenememiştir
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
177,4373
107,5975
Kimyasalların indüklediği IL-10 miktarları (pg/ml) Şekil 4.14.’teki gibi gösterilmiştir.
IL-10 düzeyi (pg/ml)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.14. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-10 miktarı
Her üç kimyasal da kronik maruziyet ile IL-10 düzeyinde anlamlı bir artış oluşturmamıştır.
80
4.5.6. IL-13 ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin kulak arkası lenf düğümlerinden elde edilen lenfositler
fitohemaglutininli kültür ortamında ekildikten sonra 72. saatte salınan IFN-γ sitokin
düzeyleri, ELISA ile örneklerin optik dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen
standart doğru denkleminden hesaplandı.

IL-13 miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0035x + 0,179
Çizelge 4.57. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,233
30,888
0,262
47,476
0,226
26,884
0,239
34,32
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
34,892
8,922711
Belirlenememiştir
Çizelge 4.58. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
Konsantrasyon
(pg/ml)
0,519
194,48
1,3
641,212
0,8
355,212
0,246
38,324
0,821
367,224
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
319,2904
224,5781
81
Çizelge 4.59. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Kimyasal
Absorbans
(OD450)
0,221
0,215
0,179
0,229
0,222
%10
Diasetil
Konsantrasyon
(pg/ml)
24,024
20,592
0
28,6
24,596
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
19,5624
11,29899
Çizelge 4.60. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IL-13 düzeyleri
Çözücü
AOO (4:1)
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(pg/ml)
0,231
29,744
0,241
35,464
0,247
38,896
0,285
60,632
0,277
56,056
0,266
49,764
0,274
54,34
0,245
37,752
0,218
22,308
Belirlenememiştir
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
42,77289
13,03977
Kimyasalların indüklediği IL-13 miktarları (pg/ml) Şekil 4.15.’teki gibi gösterilmiştir.
IL-13 düzeyi (pg/ml)
600
*
500
400
300
200
100
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.15. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IL-13 miktarı
* 0,01≤p<0,05; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatistiksel anlamlı farklılık (Mann-Whitney test).
Kronik maruziyet sonrası IL-13 düzeyi TMA için çözücüye kıyasla anlamlı bir artış
göstermiştir.
82
4.6. DNCB, TMA ve Diasetil Uygulanan Farelerin Kronik Maruziyet Sonrası Total
Serum IgE Konsantrasyonunun Ölçümü
%1’lik DNCB, %10’luk diasetil, %10’luk TMA ve çözücünün (AOO, 4:1) 13 günlük
maruziyeti sonrası farelerin serumlarındaki total IgE miktarı, ELISA ile örneklerin optik
dansitelerinin ölçümünden hareketle elde edilen standart doğru denkleminden hesaplandı.

IgE miktarı ölçümünde kullanılan standart doğru denklemi:
y = 0,0008x + 0,049
Çizelge 4.61. DNCB’ye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Kimyasal
%1 DNCB
Absorbans
(OD450)
0,055
0,05
0,056
0,06
0,126
Konsantrasyon
(ng/ml)
37,5
6,25
43,75
68,75
481,25
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
127,5
199,0014
Çizelge 4.62. TMA’ya kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Kimyasal
%10 TMA
Absorbans
(OD450)
0,061
0,054
0,05
0,167
0,054
Konsantrasyon
(ng/ml)
75
31,25
6,25
737,5
31,25
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
176,25
314,7233
Çizelge 4.63. Diasetile kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Kimyasal
%10
Diasetil
Absorbans
(OD450)
0,081
0,058
0,049
0,065
0,086
Konsantrasyon
(ng/ml)
200
56,25
0
100
231,25
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
117,5
96,96568
83
Çizelge 4.64. Çözücüye kronik maruziyet sonrası kulak arkası lenf düğümlerinden elde
edilen hücre kültürlerinde 72. saat sonunda IgE düzeyleri
Çözücü
Absorbans (OD450) Konsantrasyon
(ng/ml)
0,057
0,074
AOO (4:1)
Ortalama
(Konsantrasyon)
Standart
hata
35,41667
16,23798
50
*
0,05
6,25
0,053
25
0,056
43,75
0,052
18,75
0,054
31,25
0,056
43,75
0,056
43,75
0,058
56,25
*İstatistiksel hesaplamaya dahil edilmemiştir.
Kimyasalların indüklediği IgE miktarları (ng/ml) Şekil 4.16.’daki gibi gösterilmiştir.
Total serum IgE
konsantrasyonu
(ng/ml)
600
500
400
300
200
**
100
0
DNCB Diasetil TMA AOO
Şekil 4.16. Kronik maruziyet sonrası kimyasallar tarafından indüklenen IgE miktarı
** 0,001≤p<0,01; çözücü kontrol grubuna (AOO) göre istatiksel olarak yüksek anlamlı farklılık (Mann
Whitney test).
Sadece diasetilin karonik maruziyet ile indüklediği IgE düzeyi çözücü kontrol grubuna
göre istatistiksel olarak yüksek anlamlılığa sahiptir.
84
85
5. TARTIŞMA
Kimyasallar tarafından indüklenen alerjik sensitizasyon ve alerjik hastalıklar toksikolojinin
en çetrefilli ve önemli araştırma alanlarından birisidir. Alerjik temas dermatiti ile
sonuçlanan deri sensitizasyonu insanlarda immünotoksisitenin en yaygın görülen şeklidir
ve yüzlerce kimyasal deri sensitizanı olarak belirlenmiştir. Ancak daha az sayıda
kimyasalın solunum bölgesinin sensitizasyonu ve astıma yol açtığı gösterilmiştir. Buna
karşın konunun ciddiyeti daha az değildir. Solunum sensitizanlarının tehlikelerinin
belirlenmesi ve risk değerlendirmesi oldukça güç olup, özellikle iş yerlerinde solunum
alerjenlerine yüksek miktarda maruziyetin yol açtığı mesleki astım gibi aşırı duyarlılık
hastalıkları ölümcül olabilmektedir.
Sensitizasyon günümüzde en sık raporlanan mesleki hastalıklardan biri olup, işçiler için
büyük bir sağlık riski oluşturmaktadır. Kimyasalların sahip oldukları tehlikenin ve taşıdığı
riskin ortaya konması, öncelikle biyolojik, kimyasal ve toksikolojik mekanizmalarının
aydınlatılması ve gerekli test yöntemlerinin geliştirilip geçerliliğinin kanıtlanması ile
mümkün olabilir. Bu nedenle son yıllarda kimyasal sensitizanlarının tehlikelerinin
belirlenmesi için hızlı ve hassas yöntemlerin geliştirilmesine ağırlık verilmiştir. Böylece
kimyasal sensitizanların işyeri seviyeleri ve çevreye salımlarının kontrol edilmesi ile
birlikte advers yanıtların insidansında ve sonuçta oluşan ekonomik kayıplarda azalma
görülecektir.
Temas sensitizanlarının tehlikelerinin belirlenmesine yönelik valide edilmiş yöntemler
bulunmaktadır; ancak solunum sensitizanları için son yirmi yıldır yürütülen yoğun
araştırmalara rağmen valide edilmiş bir yöntem mevcut değildir.
Temas sensitizasyonu ilk olarak kobaylarda araştırılmıştır. En çok tercih edilen yöntemler
arasında Kobay Maksimizasyon Testi ve Buehler Testi olmakla birlikte birçok kobay test
yöntemi mevcuttur. Kobay modelleri kayda değer güvenilirliğe sahip olsa da, yüksek
oranda yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuç verir.
İnsan yama testlerinin hala bazı ülkelerde deri alerjenleri için doğrulayıcı test olarak
kullanılmasına karşın, etik kaygılar ve daha güvenilir alternatif test prosedürlerinin varlığı
insan yama testinin geçerliliğini büyük ölçüde azaltmıştır.
86
1989’da geliştirilen Standart Lokal Lenf Düğümü Testi (LLNA), düşük molekül ağırlığına
sahip kimyasalların temas sensitizan potansiyellerinin değerlendirmesine yönelik olarak,
kobay testlerinin yerini almıştır. Kobay testleri ile karşılaştırıldığında, daha az deney
hayvanı ile çalışılması, adjuvana ihtiyaç olmaksızın test maddesinin uygulanması, kısa
süreli test protokolüne sahip olması, doz-yanıt ilişkisi sunması ve 3R ilkesi ile uyumlu
şekilde deney hayvanına verilen acı ve stresin büyük oranda azaltılmış olması gibi birçok
yönden LLNA daha fazla avantaja sahiptir. Ayrıca bu yöntem verilerin subjektif
yorumlamadan ziyade enstrümantal ölçümüne dayalı daha iyi standardize edilmiş
prosedürün avantajına sahiptir.
Sensitizasyon değerlendirmesi için günümüzde ilk tercih edilen yöntem LLNA’dir. 1999
yılında ICCVAM ve ECVAM tarafından valide edildikten sonra, 2002 yılında OECD test
kılavuzuna girmiştir. Son zamanlarda bu metod Avrupa Birliği REACH regülasyonu ile ilk
ihtiyaç duyulan sensitizasyon testi olarak kabul edilmiştir.
Standart
LLNA’da
radyoaktif
maddenin
kullanılması
testin
uygulanabilirliğini
kısıtladığından, radyoaktif madde kullanımı gerektirmeyen alternatifleri geliştirilip valide
edilmiştir ve OECD test rehberine girmiştir.
OECD TG 442B’de yer alan bu radyoaktif olmayan LLNA’da, lokal olarak çoğalan
lenfositlerin DNA’sına katılan BrdU miktarı ELISA ile belirlenerek lenfosit proliferasyonu
ölçülür. Kimyasal sensitizanlar tarafından indüklenen lenfosit proliferasyonu immün
yanıtın bir göstergesidir. Lenfosit proliferasyonunda çözücü kontrole kıyasla 1,6 kat artışı
indükleyen kimyasallar pozitif temas sensitizanı olarak sınıflandırılır. Üç veya daha fazla
konsantrasyon kullanıldığı için doz-yanıt ilişkisine imkan tanır. Hesaplanan EC3 değerleri
temas sensitizasyonu oluşturan etkin konsantrasyon olup, EC3’ün insan yama testlerinden
elde edilen değerlerle uyumlu olduğu gösterilmiştir. Böylece bu yöntem temas
sensitizanlarının risk değerlendirmesinin yapılmasını mümkün kılar.
Solunum sensitizanları için ise daha önce bahsedildiği üzere yaygın olarak kabul edilen
veya valide edilmiş bir yöntem yoktur. Olası solunum sensitizanlarının prospektif
belirlenmesine yönelik hastalığın klinik belirtilerinin taklit edildiği çeşitli maruziyet
yollarının kullanıldığı kobay, fare ve rat modellerini içeren yöntem yaklaşımları mevcuttur.
Bunlardan biri de LLNA yöntemidir.
87
Çalışmamızda
temas
sensitizasyon
potansiyelinin
değerlendirilmesinde
uygulama
kolaylığından dolayı radyoaktif olmayan LLNA:BrdU yöntemini tercih ettik. Ancak
OECD rehberinde yer alan in vivo BrdU yöntemi yerine, hayvan refahını göz önünde
bulundurarak, modifikasyon yapılmış versiyonunu kullandık. Bu modifikasyon fareye
BrdU enjeksiyonu yapılmaksızın, fareler sakrifiye edildikten sonra izole edilen lenf
düğümü hücrelerine BrdU’nun ex vivo ilavesini içerir (Ulker ve diğerleri, 2013, 2014).
Böylece deney hayvanına invazif bir işlem yapılmaksızın daha az acı çekmesi sağlanır. Bu
modifikasyon ile benzer sonuçların elde edilebileceği ortaya konmuştur.
Çalışmamızda Dearman ve arakadaşlarının (2009) prosedürünü temel alarak solunum
sensitizanlarının kısa süreli ve kronik olmak üzere dermal maruziyet protokollerini
gerçekleştirdik. Dearman ve arkadaşlarının 13 günlük kronik maruziyet protokolünde
belirtildiği üzere negatif kontrol DNCB’nin %1’lik, pozitif kontrol TMA’nın %10’luk
konsantrasyonlarını uyguladık. Bazı yayınlarda kısa süreli maruziyet protokolünün 8 gün
olarak belirlenmiş olmasına karşın (Vandebriel ve diğerleri, 2000), Dearman ve
arkadaşlarının uyguladığı gibi 3 günlük maruziyet protokolünü kontrol gruplarının yine
aynı konsantrasyonlarında gerçekleştirdik.
Test maddesi olarak son yıllarda sensitizasyon ve solunum yoluyla ilgili diğer hastalıklara
olan etkisi yoğun olarak araştırılan diasetil maddesini seçtik. Diasetilin farelere
uygulanacak konsantrasyon seçimini, Anderson ve arkadaşlarının (2007) çalışmasının
sonuçlarına göre yaptık. En iyi sonuçların çalışmış oldukları %6-12 konsantrasyon
aralığında elde edilmesinden %10 konsantrasyonla çalışmayı uygun bulduk.
LLNA’nın aynı zamanda doz-yanıt ilişkisi sunması, sensitizanların risk değerlendirmesinin
yapılmasını mümkün kılmaktadır. Doz-yanıt ilişkisi verileri elde etmek için test ve kontrol
maddelerinin en az 3 konsantrasyonu kullanılmak zorundadır. Çalışmamızda doz-yanıt
ilişkisi verilerine
ihtiyacımız olmadığı için test
ve kontrol maddelerinin tek
konsantrasyonlarının kullanılmasına karar verdik. Böylece alternatif yöntemlerin
ilkelerinden biri olan daha az deney hayvanı kullanımını yerine getirdik.
Çalışmamızda öncelikle diasetilin solunum sensitizanı potansiyelini ortaya koymayı
amaçladık. Ancak solunum sensitizanı ve temas sensitzanlarının ayrımının yapılmasında
LLNA yönteminin yeterli olmadığını daha önceki çalışmalardan ve testin genel prosedürü
88
açısından bilmekteyiz. LLNA sadece lenfosit proliferasyonundaki anlamlı artışa dayanarak
immün cevabın test kimyasalı tarafından indüklendiğini göstermektedir. LLNA’da elde
edilen pozitif yanıt kimyasalın sadece temas sensitizanı olarak belirlenmesini sağlar.
Amacımıza yönelik olarak LLNA’ya ilave yöntemlerin yürütülmesi gerekmektedir.
LLNA solunum ve temas sensitizanlarının ayrımının yapılmasına imkan vermediğinden,
bu testle birlikte sensitizanların indüklediği farklı sitokin yanıtlarının ortaya konması
solunum sensitizanlarının temas sensitizanlarından ayırt edilmesini sağlayacaktır.
Bugüne kadar yapılan araştırmalar, sitokin fenotipinin oluşmasının kimyasal alerjenlerin
indüklediği immün yanıtın olgunlaşması süresince devam ettiğini ortaya koymaktadır.
Hem kimyasal hem de solunum alerjenlerine topikal maruziyet bölgesindeki lenf düğümü
hücrelerinin kısa süreli indüksiyonunun benzer sitokin profili gösterdiği, daha uzun süreli
maruziyetin ise selektif sitokin üretimine yol açacağı öne sürülmektedir. Temas alerjenleri
öncelikle tip 1 sitokinleri, solunum alerjenleri ise tercihen tip 2 sitokinleri ile ilişkilidir.
Kimyasal alerjenlere immün yanıt oluşumu sırasında farklı sitokin üretiminin gerçekleştiği
bu zamana kadar yapılan çalışmalarda anlaşılmıştır. Temas sensitizanlarına maruziyetten
sonra diğer sitokinlere kıyasla Th1 sitokini IFN-γ’nın arttığı gözlenirken, solunum
sensitizanlarına maruziyet selektif Th2 sitokinleri IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 seviyelerinin
ve daha düşük miktarda Th1 sitokinlerinin artışına yol açmıştır (Kimber and Dearman,
1997, 1998). Bu hipotezden yola çıkarak kendi hipotezimizi, diasetilin solunum
sensitizasyonu potansiyelinin sitokin salım profilleri üzerinden değerlendirilmesi olarak
belirledik.
Kimyasala dermal maruziyet sonucu indüklenen total serum IgE konsantrasyonundaki
artışın
solunum
sensitizasyon
potansiyelinin
belirlenmesinde
kullanılabileceği
savunulmaktadır. Bu nedenle fare IgE testini de çalışmamıza eklemeyi uygun gördük.
Ancak standart fare IgE testinden farklı olarak, 3R ilkesi gözetilerek her grup için 6 adet
fare yerine 5 adet fare ile çalıştık. Standart protokol sadece kronik maruziyetin indüklediği
IgE miktarını incelerken biz hem kronik hem de kısa süreli maruziyet sonrası total serum
IgE miktarını ölçtük.
Bu hususta elde ettiğimiz sonuçları değerlendirecek olursak, öncelikle solunum
sensitizasyonu açısından negatif kontrol olarak kullandığımız DNCB’ye farelerin kısa
89
süreli maruz bırakılması sonucu immün yanıtın göstergesi olan lenfosit proliferasyonunun
ölçülmesi ile stimülasyon indeksi (SI) 2,29 olarak bulunmuştur. Bu değer OECD test
kılavuzunda yer alan 1,6 değerinden büyük olduğu için DNCB beklediğimiz üzere anlamlı
bir cevap oluşturmuştur. Böylece çalışmamızla DNCB’nin daha önceki çalışmalarda
gösterilen temas sensitizan potansiyeli desteklenmiş oldu.
Özellikle TMA ile yapılan radyoaktif çalışmalarda TMA’nın güçlü sensitizan özellikte
yorumlanacak düzeyde lenfosit poliferasyonuna yol açtığı bulunmasına karşın (Boverhof
ve diğerleri, 2008), radyoaktif olmayan ex vivo BrdU LLNA çalışmasında böyle bir değer
bulunmamıştır (Williams ve diğerleri, 2015). Çalışmamızda ise TMA’nın lenfosit
proliferasyonu indüksiyon değerinde, uyguladığımız konsantrasyonlarda çözücü kontrole
kıyasla herhangi bir artış bulunmamıştır. Bu durum bizim uyguladığımız yöntemin
radyoaktif olmayan LLNA yöntemi olmasından kaynaklanıyor olabilir. Aynı zamanda
solunum sensitizasyonu potansiyeli bulunan daha fazla kimyasal madde ile çalışılarak,
yöntemin solunum ve temas sensitizanlarını ayrım konusundaki bu pozitif durumunun
netleştirilmesi ile radyoaktif LLNA yönteminin eleştirilen bu eksikliğinin giderilmesi
büyük önem taşıyabilir.
Test maddemiz diasetile kısa süreli maruziyet sonrası SI değeri 1,43 olarak hesaplanmıştır.
Diasetilin SI değeri OECD protokolünde yer alan 1,6 değerinden küçük olduğu için bu
konsantrasyonda
temas
sensitizasyonuna
yol
açtığı
söylenemez.
Anderson
ve
arkadaşlarının (2007) yaptığı çalışmada diasetilin temas sensitizasyon potansiyeli
araştırılmış ve diasetil güçlü temas sensitizanı olarak sınıflandırılmıştır. Ancak bir diğer
çalışmada (Robert ve diğerleri, 1999) diasetil zayıf sensitizan olarak bulunmuştur. Dworak
ve arkadaşlarının (2013) yapmış olduğu modelleme çalışmasına göre diasetilin solunum
sensitizasyon potansiyeline sahip olmadığı yorumlanmıştır. National Toxicology Program
(NTP) raporu doğrultusunda diasetilin temas sensitizasyonu potansiyelinin olmadığı
söylenebilir. Bizim bulgularımız bu araştırmalarla uyumlu olarak diasetilin temas
sensitizasyon poyansiyeli taşımadığını göstermektedir.
Solunum ve temas sensitizanları Radyoaktif LLNA ile ayrımının yapılıp yapılmayacağını
araştıran çalışmalar göstermiştir ki sadece lenfosit proliferasyonu indüksiyonunun
belirleyici bir marker olamayacağı ek son noktaların (sitokin ölçümü gibi) ölçülmesinin
gerekliliği ortaya konmuştur. Bunun üzerine sitokin ve IgE düzeyleri ölçülmüştür.
90
Farelerde kimyasal alerjenler tarafından indüklenen cevaplara ait sitokin profillemesinin,
tehlikenin belirlenmesine yönelik alternatif stratejiler için temel oluşturabileceği
düşünülmektedir.
Tez çalışmamızda deneysel temas sensitizanı olarak kullanılan solunum sensitizasyonu
potansiyeli açısından negatif kontrol olarak kullandığımız DNCB, kısa süreli dermal
maruziyet sonrası Th1 sitokini IFN-γ üretimini beklediğimiz üzere anlamlı şekilde
indüklemiştir (p < 0,01). Bu sonuç temas sensitizasyonunun Th1 hücreleri aracılı
gerçekleştiğini desteklemektedir. Ancak DNCB ile kısa süreli maruziyet sonrası IL-4, IL10 ve IL-13 düzeyleri çözücü kontrolüne kıyasla yüksek istatistiksel anlamlılıkta artış
göstermiştir (p < 0,01). Dearman ve arkadaşları (2003b) da uyguladığımız DNCB
konsantrasyonunda şiddetli IFN-γ üretimi ile birlikte tip 1 sitokin profili indüksiyonu
ancak daha düşük seviyede tip 2 sitokinleri IL-4, IL-10 ve IL-13 artışı kaydetmişlerdir.
Elde ettiğimiz verilerin Dearman’ın çalışmasını ve diğer yayınları (Selgrade ve diğerleri,
1997; Farraj ve diğerleri, 2007) desteklemesi, DNCB’ye temas sensitizasyonunun
gelişmesinde karma Th1/Th2 yanıtlarının ve bu hücrelerin sitokinlerinin etkili olduğunu
göstermektedir.
Pozitif kontrol olarak kullandığımız solunum sensitizanı olarak kabul edilen TMA,
Dearman ve arkadaşlarının (2009) çalışmasını baz alarak %10 konsantrasyonda farelere
uygulandı.. Çözücü kontrole göre lenfosit proliferasyonunun daha fazla indüklediği
konsantrasyon olan %10’luk TMA’nın sitokin profili analizi için uygun olduğuna karar
verdik.
Solunum sensitizasyonu gelişimi hem ani hem de geç faz reaksiyonlarını kapsamaktadır.
Bundan dolayı ani faz reaksiyonlarında rol oynayan Th2 sitokinleri ve özellikle IL-4 artışı
ile IgE antikor cevabı ile hücre aracılı geç faz reaksiyonda görevli Th1 sitokinlerinin
yanıtını içeren karma immün yanıtın solunum bölgesinin aşırı duyarlılık reaksiyonlarında
baskın olabileceği varsayımı yapılabilir.
Çalışmamızdaki sitokin profillemesi sonuçlarına göre bu varsayımı destekleyecek şekilde,
kısa süreli dermal maruziyet sonrası TMA, Th1 sitokini IFN-γ’yı çözücü kontrol grubuna
göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde indüklemiştir (p < 0,01). Beklediğimiz üzere TMA
tarafından indüklenen Th2 sitokinleri IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 düzeylerinin çözücü
91
kontrole göre artışı istatistiksel olarak anlamlıdır (p < 0,01). Bu veriler pozitif kontrol
olarak %10’luk TMA’nın iyi bir seçim olduğunu göstermektedir.
Moussavi ve arkadaşlarının (1998) yürüttüğü çalışmada, TMA’ya ilk maruziyetin
DNCB’ye kıyasla lenf düğümü hücrelerinde daha güçlü IFN-γ üretimi indüklediği tespit
edilirken, tam tersi bir ilişkinin kronik maruziyeti takiben geliştiği gösterilmiştir. Bu
durumu, DNCB ve TMA maruziyeti ile indüklenen sitokin ekspresyon modellerinin CD4+
T lenfositlerin (yardımcı T lenfositleri) yanı sıra CD8+ T lenfositlerin (sitotoksik T
lenfositleri) de katılımıyla şekillendiğinin kanıtı olarak kabul etmişlerdir. Selgrade ve
arkadaşları (1997) DNCB ile indüklenen şiddetli IFN-γ üretimine hem Th1 hem de
sitotoksik T 1 hücrelerinin (Tc1) katıldığını, az miktarda indüklenen IL-4 sekresyonunda
ise Th2 hücrelerin etkili olduğunu belirtmişlerdir. TMA’nın indüklediği şiddetli IL-4
salımının ise sadece Th2 hücreleri, az miktarda IFN-γ üretiminin Tc1 hücreleri aracılı
olduğu savunulur.
Bu veriler doğrultusunda solunum sensitizanlarının karma Th1/Th2 immün yanıtlarını
indüklediği ortaya konmuştur. Ayrıca CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin ekspresyon
ölçümlerini kapsayan çalışmalara dayanarak bu immün yanıt oluşumunda sitotoksik T
hücrelerinin de rolünün olabileceğini, ortaya koyduğumuz sitokin salım profillerine
bakarak söyleyebiliriz.
Test maddemiz olan diasetilin kısa süreli maruziyet sonrası sitokin salım profilini
değerlendirecek olursak, IL-2 ve IL-4 düzeyinde anlamlı bir artış (p < 0,05), IL-13
düzeyinde de yüksek istatistiksel anlamlılıkta bir artış (p < 0,01) elde edilmiştir. Hem
temas hem de solunum sensitizanları uyarımı sonucu bölgesel lenf düğümlerinde T hücre
bölünmesini indükleyen IL-2 sitokin düzeyinde her üç kimyasal için çözücü kontrolüne
göre anlamlı bir artış olmasını beklerdik.
Diasetilin neden olduğu IL-4 ve IL-13 düzeylerindeki artış, diasetilin sorumlu tutulduğu
solunum yolları ile ilgili inflamasyon ve aşırı duyarlılık reaksiyonlarına açıklık
getirmektedir.
92
Özellikle IL-13 düzeyinde tespit edilen artış, Keane ve arkadaşlarının (2007) bronşiyolitis
obliterans
sendromunda
IL-13
sitokinin
rolünü
ortaya
koydukları
çalışmayı
desteklemektedir.
Th2 sitokini IL-4’ün B lenfositleri tarafından sentezlenen IgE düzeyinin artışında başlıca
rolünün olduğu daha önceki çalışmalarda ortaya konmuştur (Dearman ve diğerleri, 1994;
Deo ve diğerleri, 2010). IgE aracılı yanıtlara neden olduğu bilinen kimyasallara dermal
maruziyet sonrası hem insan hem de farelerde total serum IgE seviyelerinin arttığı
gösterilmiştir. Bu verilere dayanarak, tercihen Th2 yolağını indükleyen solunum
sensitizanı TMA’nın ve test maddemiz diasetilin IL-4 aracılığıyla serum IgE seviyesinde
artışa neden olmalarını bekledik. Ancak sadece diasetil için serum IgE konsantrasyonu kısa
süreli maruziyet sonrası çözücü kontrol grubuna göre anlamlı artış göstermiştir (p<0,05).
Daha önce yapılan çalışmalarda farelerin DNCB’ye standart LLNA protokolünde
belirtilenden daha uzun süreli topikal maruziyetinin lenf düğümü hücrelerinin
proliferasyonunu indüklemesi ile ilişkili olarak daha immünojenik olduğu ortaya
konmuştur (Dearman ve diğerleri, 2003b). Bu nedenle standart LLNA protokolünde yer
alan 3 günlük kısa süreli maruziyet ile birlikte 13 günlük kronik maruziyet protokolünü
yürütmeye karar verdik.
Kronik maruziyeti takiben lenfosit proliferasyonunun BrdU:ELISA yöntemi ile ölçümü
sonrası DNCB’nin %1’lik konsantrasyonunun SI değeri 1,6’dan büyük olduğundan
seçtiğimiz konsantrasyonda bu kimyasalın temas sensitizanı olduğunu söyleyebiliriz. TMA
ve diasetilin seçtiğimiz konsantrasyonları dermal uygulama sonrası, radyoaktif olmayan ex
vivo LLNA:BrdU yönteminden beklediğimiz üzere lenfosit proliferasyonunu anlamlı
şekilde indüklememiştir. Buna göre %10 TMA ve %10 diasetil için temas sensitizasyon
potansiyeline sahip olmadıkları yorumu yapılabilir.
Hem kimyasal hem de solunum alerjenlerine kısa süreli maruziyetin benzer sitokin
yanıtları oluşturacağı, daha uzun süreli maruziyetin ise selektif sitokin üretimi ile
sonuçlanacağının belirtilmesine karşın (Kimber ve diğerleri, 1996), deney sonuçlarımız
bunu yansıtmamaktadır. Temas sensitizanı DNCB’nin 13 günlük dermal maruziyetinin
selektif tip 1 sitokin indüksiyonu yaptığının gösterilmesine karşın (Dearman ve diğerleri,
2003b), bulduğumuz IFN-γ düzeyi DNCB için anlamlı artış göstermemiştir. Ayrıca
93
DNCB’ye kronik maruziyet sonrası Th2 sitokini IL-4 miktarının oldukça yüksek
istatistiksel anlamlılıkta artış göstermiştir. Deney sonucunda temas sensitizasyonunda Th1
ve Th2 sitokinlerinin beraber rol oynadığını söyleyebiliriz.
T lenfositlerin olgunlaşması ve çoğalmasında rol oynayan IL-2’nin DNCB ve TMA için
anlamlı çıkması, bu kimyasalların T lenfositlerde immün cevabı indüklediklerini
göstermektedir.
Dearman ve arkadaşlarının (2009) TMA’ya 13 günlük kronik maruziyeti sonrası oldukça
yüksek seviyede IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 artışı kaydetmesi solunum sensitizanlarının
selektif Th2 yanıtlarını indüklediğini göstermektedir. Bulgularımıza göre solunum
sensitizanı TMA’nın kronik maruziyet sonrası anlamlı düzeyde IL-4 ve IL-13 artışına
neden olması bu sitokinlerin solunum aşırı duyarlılık reaksiyonlarında etkin olduğunu ve
bu tip reaksiyonlarda Th2 yolağının ağır bastığını göstermektedir. Ayrıca kısa süreli
standart prosedürün yanı sıra kronik sensitizan maruziyetinin de aşırı duyarlılık
reaksiyonlarında anlamlı sitokin cevabını indükleyeceğinin gösterilmesi 13 günlük deney
prosedürünün uygulanabilirliğini ortaya koymuştur.
Dearman ve arkadaşları (2009) kronik maruziyet sonrası TMA’nın DNCB’ye kıyasla
sergilediği yüksek Th2 sitokin profili sonuçlarına dayanarak solunum sensitizanlarının
temas sensitizanlarından ayrımının yapılabileceği görüşünü savunurlar. Bu hipoteze karşın
elde ettiğimiz DNCB tarafından indüklenen IL-4 artışından dolayı Th2 sitokinlerinin
ayırıcı bir gösterge olmadığını düşünüyoruz.
Diasetile kronik maruziyet sonrası incelediğimiz sitokinlerde çözücüye kıyasla anlamlı bir
artış gözlemlemedik. Buna istinaden diasetile kronik maruziyetin daha spesifik bir sitokin
profili ortaya koymayacağı görüşündeyiz.
IgE’nin indüklendiği alerjenlerin belirlenmesine yönelik fare total serum IgE ELISA
yönteminin kullanıldığı birçok araştırma mevcuttur. Ancak bu yöntemin güvenilirliği, IgE
aracılı yanıtları indüklemediği bilinen DNCB’ye maruz bırakılan hayvanlarda total serum
IgE seviyesinin kontrollere kıyasla yüksek çıkması nedeniyle tartışmalıdır. Ayrıca total
serum IgE seviyelerindeki tutarsızlığın nedeni olarak farklı fare ırkları kullanılması veya
fareler arasında IgE seviyelerindeki farklılıklar gösterilmiştir (Manetz ve Meade, 1999).
94
Hem kısa süreli maruziyet hem de kronik maruziyet sonrası DNCB için total serum IgE
düzeyi anlamlı bir artış gözlemlemedik. Birçok çalışmada TMA’nın IgE ile ilişkisinin
gösterilmesine karşın, yürütmüş olduğumuz her iki maruziyet protokolünde de anlamlı bir
IgE artışı kaydetmedik. Ayrıca TMA maruziyeti için IL-4 düzeyi ve IgE miktarı arasında
bir korelasyondan söz edemeyiz. TMA IL-4 seviyesini her iki maruziyet sonrasında da
anlamlı şekilde artırmış olsa da, IgE cevabı yetersiz çıkmıştır.
Diasetil hem kısa süreli hem de kronik maruziyet sonrası serum IgE konsantrasyonunu
anlamlı şekilde indüklemiştir. Diasetil maruziyeti için, IL-4 ve IgE düzeyleri arasındaki
ilişkiyi sadece kısa süreli maruziyete göre değerlendirmemiz doğru olmaz, çünkü kronik
maruziyette anlamlı IL-4 artışı gözlenmemesine karşın, IgE düzeyi oldukça yüksek
çıkmıştır.
Amaçlandığı gibi çalışmalarımız doğrultusunda, kimyasalların alerjik potansiyellerini
ölçebilen, radyoaktif olmayan ve hayvan refahını gözeten bir yöntemin kurulması
gerçekleştirilmiştir.
Tez kapsamında yapılan sitokin analizlerinin amacı,
 Kimyasalların alerjik potansiyellerinin tespitinde alternatif sonuç noktaları olarak
kullanıp kullanılmayacaklarını tespit etmek
 Solunum sensitizanları ve temas sensitizanlarının farklı sitokin profili gösterip
göstermeyeceklerini saptamak
 Diasetilin tüm sitokin profilini ortaya koymaktır.
Uyguladığımız kimyasallar ile elde ettiğimiz sitokin analizleri sonuçları doğrultusunda,
Th1 sitokini IFN-γ’nın DNCB ve TMA için benzer sonucu vermesi bu sitokinin temas ve
solunum alerjenlerinin ayrımında indikatör olarak kullanılması için uygun olmadığını
ortaya koyar. IL-2’nin temas dermatitinde Th1 cevabının gelişiminde etkili olduğunu ve
solunum ile temas sensitizanlarının ayrımında IL-2 sitokininin kullanılabileceğini savunan
hipotezin (Goutet ve diğerleri, 2012) aksine, elde ettiğimiz sonuçlar neticesinde IL-2’nin
ayırıcı indikatör olarak kullanılabileceğini düşünmüyoruz. Th2 hücrelerinden salınan IL4’ün de sadece solunum sensitizasyonunun oluşumunda özgül olmadığı, temas
sensitizasyonunda kayda değer miktarda salındığı tespit edilmiştir. Diğer Th2 sitokinlerinin
sadece solunum sensitizanları ile up-regüle olduğu ve bu nedenle bunların ayrılmasında
95
kullanılabileceği iddiasını da bulgularımız desteklememektedir. Özellikle kısa süreli
maruziyet sonrası hem Th1 hem de Th2 sitokin düzeylerindeki anlamlı artışlar, her iki tip
alerjik reaksiyonda da karma sitokin cevabının rol oynadığını göstermektedir.
Diasetilin göstermiş olduğu sitokin salım profili, bu kimyasalın yol açtığı solunum bölgesi
ile ilşkili hastalıklarda Th2 yolağının etkili olduğu iddiasını desteklememektedir. Ancak
kısa süreli maruziyet protokolünden elde edilen diasetilin indüklediği anlamlı IL-13 artışı,
solunum yolları ile ilişkili bronşiyolitis obliterans sendromunda IL-13 sitokinin etkin role
sahip olduğu iddiasına olumlu veri oluşturması açısından katkı sağlamaktadır.
Tez kapsamında yapılan serum IgE konsantrasyonunun ölçümünün amacı,
 IgE
miktarının
solunum
ve
temas
sensitizasyonlarının
ayrımında
kullanılıp
kullanılmayacağını göstermek,
 Diasetilin indüklediği immün yanıtların IgE aracılı olup olmadığını tespit etmektir.
Uyguladığımız kimyasallar ile elde ettiğimiz IgE düzeyleri sonuçları doğrultusunda, temas
ve solunum sensitizanlarının ayrımının IgE üretimine göre yapılamayacağı gösterilmiştir.
Diasetilin hem kronik hem de kısa süreli maruziyetinin indüklediği immün yanıtların IgE
aracılı olduğunu söyleyebiliriz. Diasetil için Th2 sitokinlerinin anlamlı çıkmaması, ancak
serum IgE konsantrasyonunun artış göstermesi, bu kimyasalın yol açtığı solunum bölgesi
hastalıklarında hücre aracılı gecikmiş tip aşırı duyarlılığın etkin rol oynamadığını
düşündürmektedir.
Sitokin profillemesinin ve serum IgE konsnatrasyonu ölçümünün istenilen beklentiyi
karşılamaması temas ve solunum sensitizanlarının birbirinden ayrılmasına yönelik
LLNA’nın özgüllüğünü artırmak için daha sağlam verilere ihtiyaç duyulmaktadır. Daha
önce yürütülen çalışmalarda kaydedilen veriler doğrultusunda, sitokin profillemesinin
tehlikenin belirlenmesi için alternatif bir yaklaşım olarak kabul edilebilir olmasına karşın,
elde
ettiğimiz
veriler
kimyasal
solunum
alerjenlerinin
rölatif
sensitizasyon
potansiyellerinin değerlendirilmesi için yeterli uygunluğa sahip olmadığını göstermektedir.
Bu yöntemin solunum sensitizanlarının rölatif etkinliklerinin belirlenmesine nasıl
dönüştürüleceği de net değildir. Çünkü spesifik bir sitokinin belirli ekspresyon seviyesi
için ne kadar kimyasal gerektiği bu yöntemle belirlenememektedir. Kimyasalların sitokin
96
üretimi için gerekli olan minimum konsantrasyonlarından ziyade hangi tip sitokinlerin
üretildiği tespit edilmektedir. Bu nedenle bu yöntemin kimyasalların olası temas sensitizanı
potansiyellerinin ileriye yönelik belirlenmesi ve sınıflandırılması için uygun olacağını
düşünüyoruz. Ancak solunum sensitizasyonunun toksikolojik değerlendirmesinde sitokin
profillemesinin geçerliliği için daha fazla kimyasalla yapılan çalışmalara ve verilere ihtiyaç
vardır.
Çalışmamızı kısa süreli (3 günlük) ve kronik (13 günlük) olmak üzere iki tip maruziyet
protokolü çerçevesinde yürüttük. Kronik maruziyet ile temas ve solunum sensitizanlarının
ayrımında daha iyi sonuç alındığını gösteren çalışmaların aksine, kısa süreli maruziyet ile
daha tutarlı veriler elde ettik.
97
6. SONUÇ ve ÖNERİLER
Tez
çalışmamızın
immünotoksisite
amacı,
solunum
sensitizasyonuna
yol
açtığı
bilinen
ancak
mekanizması tam olarak ortaya konmamış diasetilin solunum
sensitizasyonu potansiyelini gösterdiği sitokin salım profili ve IgE üretimi ile ilişkisi
üzerinden değerlendirmekti. Bu amaçla öncelikle diasetilin LLNA ile sensitizan olduğu
belirlenmiş konsantrasyonunda, aynı yöntemde modifikasyonlar yaparak verdiği immün
cevabı inceledik. Ardından aynı konsantrasyonda Th1 ve Th2 sitokin düzeyleri ile total
serum IgE konsantrasyonunu ölçtük.
Sonuç olarak kimyasalların sensitizasyon potansiyellerinin değerlendirildiği çalışmalarda
kullanılan deney protokolleri üzerinde, en az sayıda hayvana mümkün olan en az acıyı
verecek ufak modifikasyonlar yaparak ilk defa disetilin tüm sitokin profilini ve IgE üretimi
ile ilişkisini ortaya koyduk.
Gıda endüstrisi pek çok maruziyetin bir arada bulunduğu ve solunum sistemi
etkilenmesinin oldukça sık görüldüğü bir iş koludur. Bu iş kolunda oldukça sık kullanılan
katkı maddelerine maruziyet astım, rinit, solunum yolu rahatsızlıkları gibi aşırı duyarlılık
reaksiyonlarının ortaya çıkmasından sorumludur. Tehlikelerinin yeterince ortaya
konmadığı, olası zararlı etkileri belirlenmeyen ve kullanılırken korunma önlemleri
alınmayan diasetil gibi kimyasal tatlandırıcılar genç yaşta üretken kişileri akciğer
transplantasyonu listelerine sokacak kadar malul edici bronşiyolitis obliterans sendromuna
yol açabilir.
Bir kimyasalın oluşturduğu riskin değerlendirilmesi ve sağlık otoriteleri tarafından bu
riskin yönetilmesi için öncelikle bu kimyasalın tehlikesinin belirlenmesi ve bu tehlikeyi
oluşturan toksikolojik mekanizmaların ortaya konması gerekmektedir. Bundan dolayı,
diasetilin toksisite mekanizmasının ayrıntılı bir şekilde incelendiği bir çalışma şimdiye
kadar mevcut olmadığından diasetilin tehlikesini, gösterdiği sitokin salım profilinden ve
IgE cevabından hareketle belirlemeyi amaçladık. Diasetilin tehlikesinin belirlenmesinde
sitokinlerin sonuç nokta olarak kullanılmasında yeterli olmayacağını, ancak IL-13 ve IgE
düzeylerindeki artışın, diasetilin solunum sensitizasyonu tehlikesine işaret olabileceğini
ortaya koyduk.
98
Bu çalışma sonucu elde edilen veriler mesleki sağlık açısından düşünüldüğünde, deri ve
solunum bölgesinin alerjik sensitizasyonuna yol açan düşük molekül ağırlığına sahip
kimyasalların üretim güvenliğinin sağlanması ve prediktif toksikoloji yaklaşımının
benimsenmesine katkı sağlayacaktır.
Kimyasalların alerji potansiyellerinin belirlenmesi ve sınıflandırılmasına olanak tanıyacak
bu yöntemin geliştirilmesi ve daha fazla sayıda kimyasal madde ile kapsamlı laboratuarlar
arası çalışmaların yapılmasının regülasyonların hazırlanmasında sağlık otoritelerine
yardımcı olacağını ve solunum sensitizanlarının sınıflandırılmasında var olan boşluğu
kapatabileceğini düşünüyoruz.
99
KAYNAKLAR
Abbas, A.K., and Lichtman, A.H. (2007). Temel immünoloji. (çev. Y. Camcıoğlu, G.
Deniz). İstanbul Medikal Yayıncılık. 193-208.
Abbas, A.K., Murphy, K.M., and Sher, A. (1996). Functional diversity of helper T
lymphocytes. Nature, 383, 787-793.
Adenuga, D., Woolhiser, M.R., Gollapudi, B.B., and Boverhof, D.R. (2012). Differential
gene expression responses distinguish contact and respiratory sensitizers and
nonsensitizing irritants in the local lymph node assay. Toxicological Sciences,
126(2), 413-425.
Akpinar-Elci, M., Travis, W.D., Lynch, D.A., and Kreiss, K. (2004). Bronchiolitis
obliterans syndrome in popcorn production plant workers. European Respiratory
Journal, 24, 298-302.
Anderson, S.E., Siegel, P.D., and Meade, B.J. (2011). The LLNA: a brief review of recent
advances and limitations. Journal of Allergy, 2011, 1-10.
Anderson, S.E., Wells, J.R., Fedorowicz, A., Butterworth, L.F., Meade, B.J., and Munson,
A.E. (2007). Evaluation of the contact and respiratory sensitization potential of
volatile organic compounds generated by simulated indoor air chemistry.
Toxicological Sciences, 97(2), 355-363.
Arts, J.H., De Jong, W.H., Van Triel, J.J., Schijf, M.A., De Klerk, A., Van Loveren, H.,
and Kuper, C.F. (2008). The respiratory local lymph node assay as a tool to study
respiratory sensitizers. Toxicological Sciences, 106(2), 423-434.
Ashikaga, T., Yoshida, Y., Hirota, M., Yoneyama, K., Itagaki, H., Sakaguchi, H.,
Miyazawa, M., Ito, Y., Suzuki, H., and Toyoda, H. (2006). Development of an in
vitro skin sensitization test using human cell lines: the human cell line activation test
(h-CLAT). I. optimization of the h-CLAT protocol. Toxicology in Vitro, 20(5), 767773.
Azam, P., Peiffer, J.L., Chamousset, D., Tissier, M.H., Bonnet, P.A., Vian, L., Fabre, I.,
and Ourlin, J.C. (2006). The cytokine-dependent MUTZ-3 cell line as an in vitro
model for the screening of contact sensitizers. Toxicology and Applied
Pharmacology, 212(1), 14-23.
Ban, M., Morel, G., Langonne, I., Huguet, N., Pepin, E., and Binet, S. (2006). TDI can
induce respiratory allergy with Th2-dominated response in mice. Toxicology, 218,
39-47.
Basketter, D.A. (2008). Skin sensitisation: strategies for risk assessment and risk
management. British Journal of Dermatology, 159, 267-273.
Basketter, D.A., and Kimber, I. (2011). Assessing the potency of respiratory allergens:
uncertainties and challenges. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 61, 365372.
100
Basketter, D.A., Anderson, K.E., Liden, C., Van Loveren, H., Boman, A., Kimber, I.,
Alanko, K., and Berggren, E. (2005a). Evaluation of the skin sensitizing potency of
chemicals by using the existing methods and considerations of relevance for
elicitation. Contact Dermatitis, 52, 39-43.
Basketter, D.A., Blaikie, L., Dearman, R.J., Kimber, I., Ryan, C.A., Gerberick, G.F.,
Harvey, P., Evans, P., White, I.R., and Rycroft, R.J.G. (2000). Contact Dermatitis,
42, 344-348.
Basketter, D.A., Clapp, C., Jefferies, D., Safford, B., Ryan, C.A., Gerberick, G.F.,
Dearman, R.J., and Kimber, I. (2005b). Predictive identification of human skin
sensitisation thresholds. Contact Dermatitis, 53, 260-267.
Basketter, D.A., Gerberick, F., and Kimber, I. (2014). The local lymph node assay in 2014.
Dermatitis, 25(2), 49-50.
Bousquet, J., JeferyP.K., Busse, W.W., Johnson, M., and Vignola, A.M. (2000). Asthma
from bronchoconstriction to airways inflammation and remodeling. American
Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 161, 1720-1745.
Boverhof, D.R., Billington, R., Gollapudi, B.B., Hotchkiss, J.A., Krieger, S.M., Poole, A.,
Wiescinski, C.M., and Woolhiser, M.R. (2008). Respiratory sensitization and
allergy: current research approaches and needs. Toxicology and Applied
Pharmacology, 226(1), 1-13.
Boverhof, D.R., Gollapudi, B.B., Hotchkiss, J.A., Osterloh-Quiroz, M., and Woolhiser,
M.R. (2009). Evaluation of a toxicogenomic approach to the local lymph node assay
(LLNA). Toxicological Sciences, 107(2), 427-439.
Casati S, Aeby P, Basketter D A, Cavani A, Gennari A, Gerberick G F, Griem P, Hartung
T, Kimber I, Lepoittevin J-P, Meade B J, Pallardy M, Rougier N, Rousset F,
Rubinstenn G, Sallusto F, Verheyen G R, and Zuang V. (2005). Dendritic cells as a
tool for the predictive identification of skin sensitisation hazard. ATLA, 33, 47–62.
Chung, K.F., and Barnes, P.J. (1999). Cytokines in asthma. Thorax, 54(9), 825-857.
Corrigan, C.J., ve Kay, A.B. (1992). Asthma. Role of T-lymphocytes and lymphokines.
British Medical Bulletin, 48(1), 72-84.
Cumberbatch, M., Dearman, R.J., Griffiths, C.E.M., and Kimber, I. (2000). Langerhans
cell migration. Clinical and Experimental Dermatology, 25, 413-418.
Dearman, R.J., and Kimber, I. (1991). Differential stimulation of immune function by
respiratory and contact chemical allergens. Immunology, 72, 563-570.
Dearman, R.J., and Kimber, I. (2001). Cytokine fingerprinting and hazard assessment of
chemical respiratory allergy. Journal of Applied Toxicology, 21(2), 153-156.
Dearman, R.J., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1996). Characterization of chemical
allergens as a function of divergent cytokine secretion profiles induced in mice.
Toxicology and Applied Pharmacology, 138, 308-316.
101
Dearman, R.J., Basketter, D.A., Evans, P., and Kimber, I. (1999). Comparison of cytokine
secretion profiles provoked in mice by glutaraldehyde and formaldehyde. Clinical
and Experimental Allergy, 29, 124-132.
Dearman, R.J., Basketter, D.A.,and Kimber, I. (2013). Inter-relationships between
different classes of chemical allergens. Journal of Applied Toxicology, 33(7), 558565.
Dearman, R.J., Betts, C.J., Caddick, H.T., and Kimber, I. (2009). Cytokine profiling of
chemical allergens in mice: impact of mitogen on selectivity of response. Journal of
Applied Toxicology, 29, 233-241.
Dearman, R.J., Betts, C.J., Humphreys, N., Flanagan, B.F., Gimour, N.J., Basketter, D.A.,
and Kimber, I. (2003a). Chemical allergy: considerations for the practical
application of cytokine profiling. Toxicological Sciences, 71(2), 137-145.
Dearman, R.J., Humphreys, N., Skinner, R.A., and Kimber, I. (2005). Allergen-induced
cytokine phenotypes in mice: role of CD4 and CD8 T cell populations. Clinical &
Experimental Allergy, 35(4), 498-505.
Dearman, R.J., Ramdin, L.S.P., Basketter, D.A., and Kimber, I. (1994). Inducible
interleukin-4-secreting cells provoked in mice during chemical sensitization.
Immunology, 81, 551-57.
Dearman, R.J., Skinner, R.A., Humphreys, N.E., and Kimber, I. (2003b). Methods for the
identification of chemical respiratory allergens in rodents: comparisons of cytokine
profiling with induced changes in serum IgE. Journal of Applied Toxicology, 23,
199-207.
Dearman, R.J., Warbrick, E.V., Humphreys, I.R., and Kimber, I. (2000). Characterization
in mice of the immunological properties of five allergenic acid anhydrides. Journal
of Applied Toxicology, 20, 221-230.
Deo, S.S., Mistry, K.J., Kakade, A.M., and Niphadkar, P.V. (2010). Role played by Th2
type cytokines in IgE mediated allergy and asthma. Lung India, 27(2), 66-71.
Dhingra, N., Shemer, A., Da Rosa, J.C., Rozenblit, M., Suárez-Fariñas, M., FuentesDuculan, J., Gittler, J.K., Finney, R., Czarnowicki, T., Zheng, X., Xu, H., Estrada,
Y.D., Cardinale, I., Krueger, J.G., and Guttman-Yassky, E. (2014). Molecular
profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in
immune response. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 134(2), 362-372.
Divkovic, M., Pease, C.K., Gerberick, G.F., and Basketter, D.A. (2005). Hapten- protein
binding: from theory to practical application in the in vitro prediction of skin
sensitization. Contact Dermatitis, 53(4), 189-200.
Dworak, J.J., Roberts, D.W., Calter, M.A., Fields, C.A., and Borak, J. (2013). Is diasetyl a
respiratory sensitizer? A reconsideration using QSAR, QMM, and competition
experiments. Chemical Research in Toxicology, 26, 631-633.
Dykewicz, M.S. (2009). Occupational asthma: current concepts in pathogenesis, diagnosis,
and management. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 123, 519-528.
102
Egilman, D.S., and Schilling, J.H. (2012). Bronchiolitis obliterans and consumer exposure
to butter-flavored microwave popcorn: a case series. International Journal of
Occupational and Environmental Health, 18(1), 29-42.
Farraj, A.K., Boykin, E., Haykal-Coates, N., Gavett, S.H., Doerfler, D., and Selgrade, M.
(2007). Th2 cytokines in skin draining lymph nodes and serum IgE do not predict
airway hypersensitivity to intranasal isocyanate exposure in mice. Toxicological
Sciences, 100(1), 99-108.
Farraj, A.K., Harkema, J.R., and Kaminski, N.E. (2006). Topical application versus
intranasal instillation: a qualitative comparison of the effect of the route of
sensitization on trimellitic anhydride–induced allergic rhinitis in A/J mice.
Toxicological Sciences, 92(1), 321-328.
Foster, P.S., Hogan, S.P., Matthaei, K.I. and Young, I.G. (1997). Interleukin-4 and
interleukin-5 as targets for the inhibiton of eosinophilic inflammation and allergic
airways hyperreactivity. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 92, 55-61.
Friedmann, P.S. (2006). Contact sensitization and allergic contact
immunobiological mechanisms. Toxicology Letters, 162, 49-54.
dermatitis:
Gerberick, G.F., Robinson, M.K., Ryan, C.A., Dearman, R.J., Kimber, I., Basketter. D.A.,
Wright, Z.M., and Marks, J.G. (2001). Contact allergenic potency: correlation of
human and local lymph node assay data. American Journal of Contact Dermatitis,
12, 156–161.
Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Schlatter, H., Dearman R.J., Kimber, I.,
Patlewicz, G.Y., and Basketter D.A. (2005). Compilation of historical local lymph
node data for evaluation of skin sensitization alternative methods. Dermatitis, 16(4),
157-202.
Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kimber, I., Dearman, R.J., Lea, L.J., and Basketter D.A.
(2000). Local lymph node assay: validation assessment for regulatory purposes.
American Journal of Contact Dermatitis, 11(1), 3-18.
Goldsby, R.A., Kindt, T.J., Kuby, J., and Osborne, B.A. (2002). Kuby Immunology.
(Fourth edition). New york Freeman, 373.
Goutet, M., Pépin, E., Langonné, I., Huguet, N., and Ban, M. (2012). Identification of
contact and respiratory sensitizers according to IL-4 receptor α expression and IL-2
production. Toxicology and Applied Pharmacology, 260(2), 95-104.
Hilton, J., Dearman, R.J., Basketter, D.A, and Kimber, I. (1995). Identification of chemical
respiratory allergens: dose-response relationships in the mouse IgE test. Toxicology
Methods, 5(1), 51-60.
Holsapple, M.P., Jones, D., Kawabata, T.T., Kimber, I., Sarlo, K., Selgrade, M.K., Shah,
J., and Woolhiser, M.R. (2006). Assessing the potential to induce respiratory
hypersensitivity. Toxicological Sciences, 91(1), 4-13.
103
Howell, M.D., Weissman, D.N., and Jean Meade, B. (2002). Latex sensitization by dermal
exposure can lead to airway hyperacitivity. International Archives of Allergy and
Immunology, 128, 204-211.
Hubbs, A.F., Battelli, L.A., Goldsmith, W.T., Porter, D.W., Frazer, D., Friend, S.,
Schwegler-Berry, D., Mercer, R.R., Reynolds, J.S., Grote, A., Castranova, V.,
Kullman, G., Fedan, J.S., Dowdy, J., and Jones, W.G. (2002). Necrosis of nasal and
airway epithelium in rats inhaling vapors of artificial butter flavoring. Toxicology
and Applied Pharmacology, 185, 128-135.
Isola, D., Kimber, I., Sarlo, K., Lalko, J., and Sipes, I.G. (2008). Chemical respiratory
allergy and occupational asthma: what are the key areas of uncertainty? Journal of
Applied Toxicology, 28, 249-253.
Kanwal, R., Kullman, G., Piacitelli, C., Boylstein, R., Sahakian, N., Martin, S., Fedan, K.,
and Kreiss, K. (2006). Evaluation of flavorings-related lung disease risk at six
microwave popcorn plants. Journal of Occupational and Environmental Medicine,
48(2), 149-157.
Karol, M.H. (1994). Animal models of occupational asthma. European Respiratory
Journal, 7, 555-568.
Keane, M.P., Gomperts, B.N., Weigt, S., Xue, Y.Y., Burdick, M.D., Nakamura, H.,
Zisman, D.A., Ardehali, A., Saggar, R., Lynch III, J.P., Hogaboam, C., Kunkel, S.L.,
Lukacs, N.W., Ross, D.J., Grusby, M.J., Strieter R.M., and Belperio, J.A. (2007). IL13 is pivotal in the fibro-obliterative process of bronchiolitis obliterans syndrome.
The Journal of Immunology, 178, 511-519.
Kelso, A. (1998). Cytokines: principles and prospects. Immunology and Cell Biology, 76,
300-317.
Kelso, A. (2000). Cytokines and their receptors: an overview. Therapeutic Drug
Monitoring, 22(1), 40-43.
Kimber, I., Agius, R., Basketter, D.A., Corsini, E., Cullinan, P., Dearman, R.J., GimenezArnau, E., Greenwell, L., Hartung, T., Kuper, F., Maestrelli, P., Roggen, E., and
Rovida, C. (2007). Chemical respiratory allergy: opportunities for hazard
identification and characterisation. ATLA, 35, 243-265.
Kimber, I., and Dearman, R.J. (1997). Cell and molecular biology of chemical allergy.
Clinical Reviews in Allergy & Immunology, 15(2), 145-168.
Kimber, I., and Dearman, R.J. (1998). T-lymphocyte sub-populations and immune
responses to chemical allergens. In I. Kimber and M.J. Selgrade (Eds), T lymphocyte
Subpopulations in Immunotoxicology. Chichester, UK: John Wiley and Sons, pp:
199-231.
Kimber, I., and Dearman, R.J. (2002). Chemical respiratory allergy: role of IgE antibody
and relevance of route of exposure. Toxicology, 181-182, 311,315.
Kimber, I., and Dearman, R.J. (2005). What makes a chemical a respiratory sensitizer?
Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 5(2), 119-124.
104
Kimber, I., and Weisenberger, C. (1989). A murine local lymph npde assay fort he
identification of contact allergens. Assay development and results of an inital
validation study. Archives of Toxicology, 63, 274-282.
Kimber, I., Basketter, D.A., Butler, M., Gamer, A., Garrigue, J.L., Gerberick, G.F.,
Newsome, C., Steiling, W., Vohr, H.W. (2003) Classification of contact allergens
according to potency: proposals. Food and Chemical Toxicology, 41, 1799-1809.
Kimber, I., Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., and Dearman, R.J. (2011).
Chemical allergy: translating biology into hazard characterization. Toxicological
Sciences, 120(1), 238-268.
Kimber, I., Basketter, D.A., Thyssen, J.P., Dearman, R.J., and McFadden, J.P. (2014).
Chemical allergy in humans. Journal of Immunotoxicology, 11(3), 203-204.
Kimber, I., Cumberbatch, M., Dearman, R.J., Bhusnan, M., and Griffiths, C.E.M. (2000).
Cytokines and chemokines in the initiation and regulation of epidermal Langerhans
cell mobilization. British Journal of Dermatology, 142, 401-412.
Kimber, I., Hilton, J., Basketter, D.A., and Dearman, R.J. (1996). Predictive testing for
respiratory sensitization in the mouse. Toxicology Letters, 86(2-3), 193-198.
Kojima, H. (2008). Current status of safety evaluation and alternative to animal testings in
Japan. The Pharmaceutical Society of Japan Abstracts.
Kondo, H., Ichikawa, Y., and Imokawa, G. (1998). Percutaneous sensitization with
allergens through barrier-disrupted skin elicits a Th2-dominant cytokine response.
European Journal of Immunology, 28, 769-779.
Kreiss, K., Gomaa, A., Kullman, G., Fedan, K., Simoes, E., and Enright, P.L. (2002).
Clinical bronchiolitis obliterans in workers at a microwave-popcorn plant. The New
England Journal of Medicine, 347(5), 330-338.
Lockey, J.E., Hilbert, T.J., Levin, L.P., Ryan, P.H., White, K.L., Borton, E.K., Rice, C.H.,
McKay, R.T., and LeMasters, G.K. (2009). Airway obstruction related to diacetyl
exposure at microwave popcorn production facilities. European Respiratory
Journal, 34, 63-71.
Manetz, T.S., and Meade, B.J. (1999). Development of a flow cytometry assay for the
identification and differentiation of chemicals with the potential to elicit irritation,
IgE-mediated, or T cell-mediated hypersensitivity responses. Toxicological
Sciences, 48(2), 206-217.
Mehling, A., Eriksson, T., Eltze, T., Kolle, S., Ramirez, T., Teubner, W., Van
Ravenzwaay, B., and Landsiedel, R. (2012). Non-animal test methods for predicting
skin sensitization potentials. Archives of Toxicology, 86, 1273-1295.
Mori, T., Tanimoto, Y., Ota, M., Masakado, T., Kitamoto, S., Saito, K., Isobe, N., and
Kaneko, H. (2012). Comparison of cytokine profiles in bronchoalveolar lavage fluid
of mice exposed to respiratory and contact sensitizers. The Journal of Toxicological
Sciences, 37(2), 337-343.
105
Moussavi, A., Dearman, R.J., Kimber, I., and Kemeny, D.M. (1998). Cytokine production
by CD4+ and CD8+ T cells in mice following primary exposure to chemical
allergens: evidence for functional differentiation of T lymphocytes in vivo.
International Archives of Allergy and Immunology, 116, 116-123.
Newell, L., Polak, M.E., Perera, J., Owen, C., Boyd, P., Pickard, C., Howarth, P.H., Healy,
E., Holloway, J.W., Friedmann, P.S., and Ardern-Jones, M.R. (2013). Sensitization
via healthy skin programs Th2 responses in individuals with atopic dermatitis.
Journal of Investigative Dermatology, 133, 2372-2380.
Parmet, A.J., and Von Essen, S. (2002). Rapidly progressive, fixed airway obstructive
disease in popcorn workers: a new occupational pulmonary illness? Journal of
Occupational and Environmental Medicine, 44(3), 216-218.
Potera, C. (2012). Still searching for better butter flavoring. Environmental Health
Perspectives, 120(12), a457.
Python, F., Goebel, C. And Aeby, P. (2007). Assessment of the U937 cell line for the
detection of contact allergens. Toxicology and Applied Pharmacology, 220(2), 113124.
Renauld, J.C. (2001). New insights into the role of cytokines in asthma. Journal of Clinical
Pathology, 54, 577-589.
Roberts, D.W., York, M., and Basketter, D.A. (1999). Structure-activity relationships in
the murine local lymph node assay for skin sensitization: alpha,beta-diketones.
Contact Dermatitis, 41(1), 14-17.
Roggen E., Aufderheide, M., Cetin, Y., Dearman, R.J., Gibbs, S., Hermanns, I., Kimber, I.,
Regal, J.F., Rovida, C., Warheit, D.B., Uhlig, S., and Casati, S. (2008). The
development of novel approaches to the identification of chemical and protein
respiratory allergens. ATLA, 36, 591-598.
Rovida, C. (2011). Local lymph node assay: how testing laboratories apply OECD TG 429
for REACH purposes. ALTEX, 28(2), 117-129.
Ryan, C.A. (2008). New approaches for hazard identification: the development of in vitro
methods for predicting contact sensitization potential. Regulatory Toxicology and
Pharmacology, 50, 191-193.
Sailstad, D.M., Ward, M.D.W., Boykin, E.H.,and Selgrade, M.K. (2003). A murine model
for low molecular weight chemicals: differentiation of respiratory sensitizers (TMA)
from contact sensitizers (DNFB). Toxicology, 194, 147-161.
Saint-Mezard, P., Rosieres, A., Krasteva, M., Berard, F., Dubois, B., Kaiselian, D., and
Nicolas, J.F. (2004). Allergic contact dermatitis. European Journal of Dermatology,
14, 284-295.
Schachter, E.N. (2002). Popcorn worker’s lung. The New England Journal of Medicine,
347(5), 360-361.
106
Selgrade, M.K., Boykin, E.H., Haykal-Coates, N., Woolhiser, M.R., Wienscinski, C.,
Andrews, D.L., Farraj, A.K., Doerfler, D.L., and Gavett, S.H. (2006).
Inconsistencies between cytokine profiles, antibody responses, and respiratory
hyperresponsiveness following dermal exposure to isocyanates. Toxicological
Sciences, 94(1), 108-117.
Selgrade, M.K., Lawrence, D.A., Ullrich, S.E., Gilmour, M.I., Schuyler, M.R., and
Kimber, I. (1997). Modulation of T-helper cell populations: potential mechanisms of
respiratory hypersensitivity and immune suppression. Toxicology and Applied
Pharmacology, 145(1), 218-229.
Shibamoto, T. (2014). Diacetyl: occurence, analysis, and toxicity. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 62, 4048-4053.
Steinke, J.W., and Borish, L. (2001). Th2 cytokines and asthma interleukin-4: its role in
the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4
receptor antagonists. Respiratory Research, 2(2), 66-70.
Suda, A., Yamashita, M., Tabei, M., Taguchi, K., Vohr, H.W.,Tsutsui, N., Suzuki, R.,
Kikuchi, K., Sakaguchi, K., Mochizuki, K., and Nakamura, K. (2002). Local lymph
node assay with non-radioisotope alternative endpoints. The Journal of
Toxicological Sciences, 27(3), 205-218.
Takeyoshi, M., Yamasaki, K., Yakabe, Y., Takatsuki, M., and Kimber, I. (2001)
Development of non-radio isotopic endpoint of murine local lymph node assay
based on 5-bromo-2’-deokwyuridine (BrdU) incorporation. Toxicology Letters, 119,
203-208.
Tao, Y., Sugiura, T., Nakamura, H., Kido, M., Tanaka, I., and Kuroiwa, A. Experimental
lung injury induced b trimellitic anhydride inhalation on guinea pigs. International
Archives of Allergy and Immunology, 96(2), 119-127.
The National Institute for Occupational Safety and Health. (1978). Current intelligance
bulletin 21: trimellitic anhydride (TMA).
The National Institute for Occupational Safety and Health. (2011). Criteria for a
recommended standart occupational exposure to diacetyl and 2,3-pantadione.
The National Institute for Occupational Safety and Health. (2013). Hazard prevention and
control of exposure to diacetyl and 2,3-pentanedione.
Thyssen, J.P., Giménez-Arnau, E., Lepoittevin, J.P., Menné, T., Boman, A., and Schnuch,
A. (2012). The critical review of methodologies and approaches to assess the
inherent skin sensitization potential (skin allergies) of chemicals part I. Contact
Dermatitis, 66, 11-24.
Ulker, O.C., Ates, I., Atak, A., Karakaya, A. (2013). Evaluation of non-radioactive
endpoints of ex vivo local lymph node assay-BrdU to investigate select contact
sensitizers. Journal of Immunotoxicology, 10(1), 1-8.
107
Ulker, O.C., Kaymak, Y., and Karakaya, A., (2014). Allergenicity evaluation of fragrance
mix and its ingredients by using ex vivo local lymph node assay–BrdU endpoints.
Food and Chemical Toxicology, 65, 162-167.
Van Loveren, H., and Vos, J.G. (2011). Mechanisms of toxicity. In Jeanne Mager
Stellman (Ed). Encyclopedia of occupational health and safety. Geneva.
International Labor Organization.
Van Loveren, H., Cockshott, A., Gebel, T., Gundert-Remy, U., De Jong, W.H., Matheson,
J., McGarry, H., Musset, L., Selgrade, M.K., and Vickers, C. (2008). Skin
sensitization in chemical risk assessment: report of a WHO/IPCS international
workshop focusing on dose–response assessment. Regulatory Toxicology and
Pharmacology, 50, 155-162.
Van Och, F.M.M. (1971). Assessment of the sensitizing potency of low molecular weight
chemicals: employment of a regression method in vivo and in vitro. (Doctoral
dissertation, Universiteit Utrecht, 1971). Utecht University Repository, 2003.
Van Och, F.M.M., Van Loveren, H., De Jong, W.H., and Vandebriel, R.J. (2002).
Cytokine production induced by low-molecular-weight chemicals as a function of
the stimulation index in a modified local lymph node assay: an approach to
discriminate contact sensitizers from respiratory sensitizers. Toxicology and Applied
Pharmacology, 184, 46-56.
Vandebriel, R., Cransveld, C.C., Crommelin, D., Diamant, Z., Galzenburg, B., Joos, G.,
Kuper, F., Natsch, A., Nijkamp, F., Noteborn, H., Pieters, R., Roberts, D., Roggen,
E., Rorije, E., Seed, M., Sewald, K., Van del Huevel, R., Van Engelen, J.,
Verstraelen, S., and Van Loveren, H. (2011). Respiratory sensitization: advances in
assessing the risk of respiratory inflammation and irritation. Toxicology in Vitro, 25,
1251-1258.
Vandebriel, R.J., De Jong, W.H., Spiekstra, S.W., Van Dijk, M., Fluitman, A., Garssen, J.,
and Van Loveren, H. (2000). Assessment of preferential T-helper 1 or T-helper 2
induction by low molecular weight compounds using the local lymph node assay in
conjunction with RT-PCR and ELISA for interferon-γ and interleukin-4. Toxicology
and Applied Pharmacology, 162, 77-85.
Vangosa, G.B., Braun, C.L.J., Cookman, G., Hofmann, T., Kimber, I., Loveless, S.E.,
Morrow, T., Pauluhn, J., Sorensen, T., and Niessen, H.J. (1994). Respiratory allergy:
hazard identification and risk assessment. Fundamental and Applied Toxicology, 23,
145-158.
Vanoirbeek, J.A.J., Madervelt, C., Cunningham, A.R., Hoet, P.H.M., Xu, H., Vanhooren,
H.M., and Nemery, B. (2003). Validity of methods to predict the respiratory
sensitizing potential of chemicals: a study with a piperidinyl chlorotriazine
derivative that caused an outbreak of occupational asthma. Toxicological Sciences,
76, 338-346.
Vanoirbeek, J.A.J., Tarkowski, M., Vanhoren, H.M., De Vooght, V., Nemery, B., and
Hoet, P.H.M. (2006). Validation of a Mouse model of chemical-induced asthma
108
using trimellitic anhydride, a respiratory sensitizer, and dinitrochlorobenzene, a
dermal sensitizer. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 117(5), 1090-1097.
Viola, A., Iezzi, G., and Lanzavecchia, A. (1999). The role of dendritic cells in T cell
priming: the importance of being Professional. In M.T. Lotze and A.W. Thomson
(Eds), Dendritic Cells. San Diego: Academic Press, pp. 251-255.
Wang, B., Zhuang, L., Fujisawa, H., Shinder, G.A., Feliciani, C., and Shivji, G.M. (1999).
Enhanced epidermal Langerhans cell migration in IL-10 knockout mice. The Journal
of Immunology, 162, 277-283.
Williams, I.R., and Kupper, T.S. (1996). Immunity at the surface: homeostatic mechanisms
of the skin immune system. Life Sciences, 58(18), 1485-1507.
Williams, W.C., Copeland, C., Boykin, E., Quell, S.J., and Lehmann, D.M. (2015).
Development and utilization of an ex vivo bromodeoxyuridine local lymph node
assay protocol for assessing potential chemical sensitizers. Journal of Applied
Toxicology, 35, 29-40.
Zeiss, C.R., Patterson, R., Pruzansky, J.J., Miller, M.M., Rosenberg, M., and Levitz, D.
(1977). Trimellitic anhyride-induced airway syndromes: clinical and immunological
studies. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 60(2), 96-103.
Zhang, X.D., Fedan, J.S., Lewis, D.M., and Siegel, P.D. (2004). Asthmalike biphasic
airway responses in Brown Norway rats sensitized by dermal exposure to dry
trimellitic anhydride powder. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 113(2),
320-326.
Zhu, J., and Paul, W.E. (2008). CD4 T cells: fates, functions and faults. Blood, 112(5),
1557-1569.
109
EKLER
110
EK-1. Hayvan deneyleri yerel etik kurul onayı
111
EK-1. (devam) Hayvan deneyleri yerel etik kurul onayı
112
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Soyadı, adı
: ELKAMA, Aylin
Uyruğu
: T.C.
Doğum tarihi ve yeri
: 03/07/1989 Ankara
Medeni hali
: Bekar
Telefon
: 0 (312) 202 23 82
e-posta
: aylin.elkama@gmail.com
Eğitim Derecesi
Okul/Program
Mezuniyet yılı
Yüksek Lisans
Gazi Üniversitesi/Farmasötik Toksikoloji
Devam ediyor
Lisans
Gazi Üniversitesi/Eczacılık Fakültesi
2011
Lise
Ankara Atatürk Anadolu Lisesi
2006
İş Deneyimi, Yıl
Çalıştığı Yer
Görev
2012 – devam ediyor Gazi Üniversitesi
Yabancı Dili
İngilizce
Araştırma Görevlisi
GAZİ GELECEKTİR...
Download