Untitled - Gazi Üniversitesi Açık Arşiv

advertisement
HASTANELERDE SIKLIKLA KULLANILAN DEZENFEKTANLARA
KARŞI DUYARLILIKTA ROL OYNAYAN POLİMİKROBİYAL
BİYOFİLMLERDEKİ MİKROBİYAL ETKİLEŞİMLERİN FENOTİPİK VE
GENOTİPİK YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ
Didem KART
DOKTORA TEZİ
TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TEMMUZ 2014
ETİK BEYAN
Gazi Üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü tez yazım kuralarına uygun olarak hazırladığım
bu tez çalışmasında;
• Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dokümanları akademik ve etik kurallar
çerçevesinde elde ettiğimi,
• Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun
olarak sunduğumu,
• Tez çalışmamda yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak
gösterdiğimi,
• Kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı,
• Bu tezde sunduğum çalışmanın özgün olduğunu,
Bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan
ederim.
Didem KART
01.07.2014
iv
HASTANELERDE SIKLIKLA KULLANILAN DEZENFEKTANLARA KARŞI
DUYARLILIKTA ROL OYNAYAN POLİMİKROBİYAL BİYOFİLMLERDEKİ
MİKROBİYAL ETKİLEŞİMLERİN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE
BELİRLENMESİ
(Doktora Tezi)
Didem KART
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TEMMUZ 2014
ÖZET
Biyofilm oluşumu insan sağlığını tehdit eden önemli bir problemdir. Yapılan son
çalışmalarda persistan enfeksiyonlara yol açan klinik ile ilişkili biyofilmlerin çoğunun
polimikrobiyal kaynaklı olduğu belirtilmiştir. Sesil biyofilm hücrelerinin antimikrobiyal
ajanlara karşı yüksek direnç göstermelerinden dolayı bu enfeksiyonların tedavisi oldukça
zordur. Polimikrobiyal biyofilmlerin önemi günden güne artmasına rağmen henüz bu
biyofilmlerin özellikleri üzerine az sayıda çalışma bulunmaktadır. Çalışmamızın amacı,
tekrar edilebilirliği yüksek in vitro polimikrobiyal biyofilm modeli geliştirmek, aynı
zamanda da fenotipik ve moleküler yöntemlerle biyofilm ortamında bulunan C. albicans ve
S. aureus varlığının P. aeruginosa’nın çeşitli dezenfektanlara karşı duyarlılığı üzerindeki
etkisini anlayabilmektir. Bu çalışmada 96 çukurlu mikrotitrasyon plaklarında tekrar
edilebilirliği yüksek polimikrobiyal biyofilmler oluşturulmuştur. Piyasada bulunan 9
dezenfektanın polimikrobiyal biyofilm içinde bulunan S. aureus, C. albicans, and P.
aeruginosa’ya etkileri belirlenerek birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Seçici besiyerleri
kullanılarak plak döküm yöntemiyle hücre sayımları yapılmıştır. Hidrojen peroksit kalıntı
miktarı, ROS birikimi ve oksidatif stres ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri hem
monomikrobiyal hemde polimikrobiyal biyofilm hücrelerinden ölçülmüş ve sonuçlar
birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Sonuçlar polimikrobiyal biyofilmlerdeki mikrobiyal
etkileşimin öneminin kullanılan dezenfektana ve ortamda bulunan mikrobiyal türe bağımlı
olduğunu göstermiştir. Ayrıca literatürde sıklıkla bahsedilen monomikrobiyal biyofilmlerin
polimikrobiyaller’e göre daha duyarlı olduğu düşüncesinin her zaman geçerli olmadığı bu
çalışma sonuçlarıyla ortaya koyulmuştur.
Bilim Kodu
: 1039.3.101
Anahtar Kelimeler : Biyofilm, Polimikrobiyal, Dezenfektan, Gen ekspresyonu
Sayfa adedi
: 88
Danışman
: Prof.Dr. A. Semra Kuştimur
v
DETERMINATION OF THE MICROBIAL INTERACTIONS IN POLYMICROBIAL
BIOFILMS ACTING AS A ROLE IN SUSCEPTIBILITY AGAINST TO
DISINFECTANTS FREQUENTLY USED IN HOSPITALS WITH PHENOTYPIC AND
GENOTYPIC ANALYSIS
(Ph. D. Thesis)
Didem KART
GAZİ UNIVERSITY
INSTITUE OF HEALTH SCIENCE
JULY 2014
ABSTRACT
Biofilms are substantial problem threatening the human health. It was shown that in recent
studies, most of clinically relevant biofilms leading to persistent infections are
polymicrobial. Because of sessile cells in biofilm are highly resistant against antimicrobial
agents to treat these infections are troublesome. While increasingly being recognized as
important, there are few studies on the properties of multispecies biofilms. Our aim is set
up an in model to grow polymicrobial biofilms in a repeatable style and to find out the
impact of the presence of S. aureus or C. albicans on the susceptibility of P. aeruginosa to a
variety of disinfectants by using phenotypic and moleclar test methods. In the present
study, polimicrobial biofilms were grown in a repeatable manner in a multi-well plate. S.
aureus, C. albicans, and P. aeruginosa in polymicrobial biofilms were threated by nine
commercial different disinfectants and the effects of these disinfectant were compared. The
number of cells was quantified and counted by pour plating method on a selective growth
media. Both in polymicrobial and monomicrobial biofilms, the residual hydrogen peroxide
concentration, the accumulation of ROS and the expression level of oxidative stress related
genes were measured and the results compared with each other. Our results demonstrated
that the aspect and the importance of the effect in a polymicrobial biofilm depend on the
strain and the disinfectant used. Moreover, it is conflict with the extensive belief that
organisms in polymicrobial biofilms are always less susceptible than in monomicrobials.
Science Code
: 1039.3.101
Key Words
: Biofilm, Polymicrobial, Disinfectant, Gene expression
Page Number
: 88
Supervisior
: Prof.Dr. A. Semra Kuştimur
vi
TEŞEKKÜR
Doktora öğrenim süresince değerli desteğini, toleransını esirgemeyen ve sonsuz bilgi ve
önerilerileriyle eğitimime yol gösterici katkılarda bulunan. Sayın tez danışmanım Prof. Dr.
A.Semra KUŞTİMUR’a, eğitim sürem boyunca destek olan, sonsuz anlayış ve tolerans
gösteren, akademik çalışmalarımı destekleyen Sayın yardımcı tez danışmanım Prof. Dr.
Meral SAĞIROĞLU’na, bilimsel deneyimlerinden yararlanma fırsatı bulduğum Sayın
Prof. Dr. Tom COENYE ve Arş. Gör. Sarah TAVERNİER’e, bugüne kadar vermiş
oldukları teorik ve pratik eğitimlerden dolayı Sayın Prof. Dr. Ayşe KALKANCI başta
olmak üzere tüm Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji hocalarıma, birlikte
çalışmaktan ve aynı ortamı paylaşmaktan keyif aldığım Hacettepe Üniversitesi Eczacılık
Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı çalışanlarına ve son olarak eğitim
süresince özverilerini, maddi ve manevi desteklerini benden bir an bile esirgemeyen sevgili
eşim Burak KART’a ve saygıdeğer aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
vii
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET ………………………………………………………………………………….
iv
ABSTRACT …………………………………………………………………………..
v
TEŞEKKÜR …………………………………………………………………………..
vi
İÇİNDEKİLER ………………………………………………………………………..
vii
ÇIZELGELERİN LİSTESİ …………………………………………………………...
xi
ŞEKİLLERİN LİSTESİ ………………………………………………………………
xii
SİMGELER VE KISALTMALAR …………………………………………………...
xiii
1. GİRİŞ ……………………………………………………………………………..
1
2. GENEL BİLGİLER ……………………………………………………………
3
2.1. Biyofilmin Tarihçesi ………………………………………………………...
3
2.2. Biyofilmlerin Tanımı ………………………………………………………..
4
2.3. Biyofilm Oluşum Aşamaları…………………………………………………
4
2.3.1. Tutunma basamağı…………………………………………………….
5
2.3.2. Geri dönüşümsüz bağlanma……………………………………………
6
2.3.3. İlk ve ikinci olgunlaşma fazı…………………………………………...
7
2.3.4. Ayrılma basamağı ………………………………………………………
7
2.4. Biyofilmlerin Yapısı………………………………………………………….. 8
2.5. Polimikrobiyal Biyofilmler …………………………………………………..
9
2.6. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Yapısal Gelişimi ……………………………...
10
2.7. Polimikrobiyal Biyofilmlerdeki Etkileşimler ………………………………..
11
2.7.1 Sinerjistik etkileşimler …………………………………………………
11
2.7.2 Antagonistik Etkileşimler ……………………………………………...
13
2.8. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Hastalıklardaki Rolü …………………………
13
viii
Sayfa
2.8.1 Oral enfeksiyonlar ……………………………………………………...
13
2.8.2. Otitis media ……………………………………………………………
15
2.8.3. Diyabet kökenli yara enfeksiyonları …………………………………..
16
2.8.4. Kistik fibrozis enfeksiyonu ……………………………………………
17
2.8.5. Yabancı cisim kaynaklı enfeksiyonlar ………………………………...
18
2.9. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonların Tanısı ……………………………………..
20
2.10. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonlara Konak İmmün Cevabı,
Antibiyotik ve Dezenfektan Direnci ……………………………………….
22
2.10.1. Biyofilmlerin konak immün sistemine direnci ………………………
22
2.10.2. Biyofilmlerde antibiyotik direnci ……………………………………
22
2.10.3. Biyofilmlerde dezenfektan direnci …………………………………..
24
2.11. Polimikrobiyal Biyofilm Eradikasyonunda Alternatif Tedavi Stratejileri …
29
2.11.1. Polimikrobiyal aşılar ………………………………………………...
29
2.11.2. Sinbiyotikler …………………………………………………………
30
2.11.3. Faj tedavisi …………………………………………………………..
30
2.11.4. Diğer tedavi yaklaşımları ……………………………………………
30
2.12. Polimikrobiyal Biyofilmlerde Gen Ekspresyonunun Yeri: Kantitatif Eş
Zamanlı Reverz Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(kantitatif RT-PZR) ………………………………………………………...
31
3. GEREÇ VE YÖNTEM ……………………………………………………….
35
3.1. Çalışmada Kullanılan Suşlar ………………………………………………..
35
3.2. Çalışmada Kullanılan Dezenfektanlar ………………………………………
35
3.3. Standart Sert Su Hazırlanması ……………………………...……………….
36
3.4. Dezenfektanların Planktonik Mikroorganizmar Üzerindeki
Etkisinin Test Edilmesi ……………………………………………………...
36
3.4.1. Kantitatif süspansiyon testi …………………………………………...
37
ix
Sayfa
3.4.2. Deney koşullarının kontrolü / validasyonu …………………………....
37
3.4.3. Nötralizan toksisite kontrolü …………………………………………..
38
3.4.4. Nötralizasyon yönteminin validasyonu ……………………………….
38
3.5. Mikrobiyal Biyofilmler Üzerinde Dezenfektanların Etkinliğinin
Belirlenmesi …………………………………………………………………..
39
3.5.1. Monomikrobiyal ve polimikrobiyal inokulum hazırlanması ………….
39
3.5.2. Multi-titrasyon plaklarında monomikrobiyal ve polimikrobiyal
biyofilmlerin oluşturulması ……………………………………………
40
3.5.3 Biyofilmlerde dezenfektan etkinlik analizi ……………………………..
40
3.6. Hidrojen Peroksit Kalıntı Miktarının Titrimetrik Ölçümü …………………...
41
3.7. Sesil Hücrelerdeki Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Florimetrik ölçümü …..
41
3.8. P. aeruginosa ve S .aureus Sesil Hücrelerindeki Stres ile İlişkil
Genlerin Ekspresyonu …………………………………………………………
42
3.8.1. Biyofilmlerden total RNA ekstraksiyonu ………………………………
42
3.8.2. RNA ekstraktlarının ölçümü ve cDNA elde edilmesi ………………….
44
3.8.3. Real-Time PZR yöntemi ile cDNA’ların çoğaltılması ………………....
44
3.9. İstatiksel Analizler ……………………………………………………………
46
4. BULGULAR …………………………………………………………………….. 49
4.1. Monomikrobiyal Sesil Biyofilm Hücrelerinin Sayımı ve BSA Aracılı
Polimikrobiyal Biyofilm Oluşumunun Desteklenmesi ……………………….
49
4.2. Planktonik Mikrobiyal Kültürler Üzerine Dezenfektanların Etkisi ………….. 50
4.2. Dezenfektan Ajanlarına Karşı Polimikrobiyal Biyofilmlerde Mikroorganizmal
İletişim ve Etkileşimlerin Belirlenmesi ……………………………………… 51
4.3. Rezidual Hidrojen Peroksitin Ölçümü ……………………………………….. 54
4.4. Biyofilmlerde ROS Birikiminin Belirlenmesi ……………………………….. 55
4.5. Oksidatif Stress ile İlişkili Gen Ekspresyon Seviyelerinin Belirlenmesi ……. 55
5. TARTIŞMA …………………………………………………………… 59
x
Sayfa
6. SONUÇ ve ÖNERİLER ………………………………………………
67
KAYNAKLAR ……………………………………………………………………….
69
EKLER ………………………………………………………………………………..
83
EK-1. Etik kurul onayı ……………………………………………………….......…..
84
ÖZGEÇMİŞ …………………………………………………………………………..
86
xi
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 2.1. Biyosidlerin hücresel hedefleri ve antimikrobiyal etkileri ……….
26
Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan dezenfektanlar ……………………………..
36
Çizelge 3.2. cDNA sentezinde kullanılan ajanların hacim ve
konsantrasyonları ............................................................................
44
Çizelge 3.3. Kantitatif PZR analizinde kullanılan P.aeruginosa PAO1
suşuna ait primer dizileri ………………………………………….
45
Çizelge 3.4. Kantitatif PZR analizinde kullanılan S.aureus Mu50
suşuna ait primer dizileri ………………………………………….
46
Çizelge 4.1. Dezenfektanların planktonik kültürler üzerindeki
mikrobisidal etkisi ………………………………………………...
51
Çizelge 4.2. Dezenfektanların S.aureus-P.aeruginosa-C.albicans türlerinden oluşan
üçlü polimikrobiyal biyofilmleri öldürme oranı yüzdeleri………... 53
Çizelge 4.3. Dezenfektanların S.aureus-C.albicans ve S.aureus-P.aeruginosa ikili
polimikrobiyal biyofilmlerini öldürme oranı yüzdeleri………….... 54
xii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil
Sayfa
Şekil 2.1. Biyofilm oluşum basamakları ………………………………………
5
Şekil 2.2. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunun gösterilmesi ………………...
10
Şekil 2.3. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara direnç mekanizmaları ………
23
Şekil 2.4. P.aeruginosa’da OxyR aracılı oksidatif stres cevabı ……………….
33
Şekil 4.1. Değişen konsantrasyonlarda BSA eklenmiş polimikrobiyal
biyofilmlerde P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans sesil
hücrelerinin cfu/ml sayıları ………………………………………...
50
Şekil 4.2. Farklı türden mikrobiyal sesil hücrelerin dezenfektanlar
ajanlarına duyarlılıkları ……………………………………………..
52
Şekil 4.3. Hidrojen peroksit muamelesi sonrası olgun biyofilmlerdeki ROS
seviyelerinin ölçümü …………………………………………………
53
Şekil 4.4. S.aureus ve P.aeruginosa’nın stres ile ilişkili gen ekspresyonlarının
değişimleri …………………………………………………………..
55
xiii
SİMGELER ve KISALTMALAR
Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda
sunulmuştur.
Simgeler
Açıklama
0
C
Santigrat
µl
Mikrolitre
ml
Mililitre
cfu/ml
Koloni oluşturan ünite/mililitre
mg/ml
Miligram/mililitre
M
Molarite
∞
Sonsuz
~
Yaklaşık
Kısaltmalar
Açıklama
AHL
Açillenmiş homoserin laktonlar
AI
Autoinducer
BHI
Beyin kalp infüzyon
BSA
Bovine serum albumin
BzCl
Benzalkonyum klorür
cDNA
Komplementer DNA
CET
Setrimit
CHX
Klorhekzidin
DCF
2’,7’- Dichlorodihydrofluorescein
DCFHDA
2’,7’- dichlorofluoresein diasetat
DET
Dettol
DNA
Deoksribo nükleik asit
ECM
Ekstraselüler matriks
EPS
Ekzopolisakkarit
ETOH
Etanol
FISH
Floresan in situ hibridizasyon
HAC
Hospital antiseptic concentrate
xiv
Kısaltmalar
Açıklama
H202
Hidrojen peroksit
H2SO4
Sülfirik asit
KMnO4
Potasyum permanganat
MBK
Minimum bakterisidal konsantrasyonu
MİK
Minimum inhibisyon konsantrasyonu
MLST
Multi locus sequence typing
mRNA
Mesajcı RNA
MRSA
Metisilin dirençli Staphylococcus aureus
NaOCl
Sodyum hipoklorit
OD
Optik dansite
PCV
Protein konjuge aşılar
PVP-I
Polyvinyl prolidon-iyot
PZR
Polimeraz zincir reaksiyonu
RNA
Ribo nükleik asit
ROS
Reaktif oksijen türü
SDA
Saboraud dextrose agar
TSA
Triptik soy agar
WSH
Water Standard Hardness
1
1. GİRİŞ
Polimikrobiyal biyofilmler, kronik yara enfeksiyonları, protez, stent, implant, kateter ve
endotrakeal tüpler gibi yabancı cisim enfeksiyonları ve diğer bir çok nozokomiyal
enfeksiyonlarda rastlanan yaygın bir problem haline gelmiştir. Bu persistan biyofilm
enfeksiyonları, hastaların hastanede yatış sürelerinin uzamasına, tedavi sürecinde
maaliyetin artmasına ve yüksek ölüm oranlarına yol açmaktadır. Polimikrobiyal
biyofilmlerin klinikteki öneminin anlaşılması artarak devam etse bile yapıları ve özellikleri
üzerine çok sayıda çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Hastanelerde yaygın kullanılan
dezenfektanların polimikrobiyal biyofilmler üzerine etkinliğini anlamaya yönelik az sayıda
çalışma bulunmaktadır. Ökaryotik, polimorfik yapılı ve fırsatçı bir patojen olan Candida
albicans’ın enfeksiyonlarda genellikle Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa
türü bakterilerle ile birarada bulunarak polimikrobiyal biyofilm kaynaklı enfeksiyonlara
sebep olduğu bildirilmiştir. Çok sayıda virulans faktörüne ve antimikrobiyal ajanlara karşı
aşırı eksprese edilen direnç genlerine sahip S.aureus türü bakteriler hastanelerde
karşılaşılan önemli bir patojendir. P.aeruginosa, kistik fibrosisli veya immun kompromize
hastalarda yüksek oranda enfeksiyonlara yol açan nozokomiyal, fırsatçı bir bakteridir. Bu
çalışmada S.aureus, C.albicans ve P.aeruginosa türlerinden oluşan monomikrobiyal ve
polimikrobiyal
biyofilm
modelleri
geliştirilmiş
ve
bu
biyofilmlerin
yüzey
dekontaminasyonu aşamasında nasıl bir rol oynadıklarını belirlemek amacıyla 9 farklı
dezenfektan geliştirilen biyofilm modeleri üzerinde test edilmiştir. P.aeruginosa sesil
hücrelerinin monomikrobiyal ve üç farklı türden oluşan polimikrobiyal biyofilm içinde
iken hidrojen peroksite karşı birbirinden oldukça farklı duyarlılık cevabı sergilediği
gözlenmiş ve bu farklılığın nedeni titrimetrik, florimetrik ve moleküler yöntemlerle
araştırılmıştır. Sonuçlarımız polimikrobiyal biyofilmleri eradike etmek amacıyla kullanılan
stratejilerin, biyofilm oluşumunda varolan suş veya suşlara, kullanılan dezenfektanlara
bağlı olarak değişkenlik göstermesi gerektiğini vurgulamaktadır
2
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Biyofilmin Tarihçesi
İlk defa Antonie Van Leeuwenhoek ilkel mikroskobunu kullanarak diş yüzeyinden aldığı
mikroorganizmaları gözlemlemiş ve biyofilmleri mikrobiyal topluluklar oluşturan
‘‘animaküli’’
olarak
tanımlamıştır.
Heukelekian
ve
Heller;
sucul
ortamlarda
mikroorganizmaların tutundukları yüzeylerde biraraya gelmelerinin bakterilerin üreme ve
aktivitelerini önemli ölçüde arttırdığını belirterek bu olaya ‘‘şişe etkisi’’ adını vermişlerdir
[1].
Biyofilmlerin detaylı incelenmesi elektron mikroskobunun kullanılmasıyla başlamıştır.
Jones ve arkadaşları, tarama ve geçişli elektron mikroskoplarını kullanarak su filtreleri
üzerinde oluşan biyofilmleri incelediklerinde bu oluşumun çeşitli mikroorganizmalar
tarafından meydana geldiğini göstermişlerdir. Aynı araştırmacılar polisakkarite özgül
boyaları
kullanarak
biyofilmleri
çevreleyen
matriks
yapısının
polisakkaritlerden
oluştuğunu belirlemişlerdir [2].
1970’li yıllarda yüzeye tutunan bakterilerin kendi aralarında organize olabildikleri
anlaşılmış ve ışık mikroskobundaki teknik ilerlemeler sayesinde bakteriyel biyofilmlerin
organize topluluklardan oluşan heterojenik yapılar oldukları gösterilmiştir. Characklis
çalışmasında endüstriyel su sistemlerinde oluşan mikrobiyal slaym yapılarını incelemiş ve
bu yapıların klorin gibi dezenfektanlara oldukça dirençli olduklarını vurgulamıştır [3].
Sesil hücre topluluklarının hem diş plaklarında hem de akarsularda gözlenmesinden sonra
1978 yılında Costerton ve arkadaşları mikroorganizmaların canlı ve cansız yüzeylere
tutunarak ekolojik bir niş oluşturduklarını ve bunu takiben biyofilmlerin meydana geldiği
teorisini ortaya koymuşlardır [4]. Bu zamandan günümüze kadar yapılan endüstriyel,
ekolojik ve medikal biyofilm çalışmaları birbiriyle paralellik göstermektedir. Son 20 yıldır
biyofilmlerin sınıflandırılması üzerine gerek taramalı elektron mikroskobu gerekse standart
mikrobiyolojik kültür teknikleri kullanılarak yoğun çalışmalar gerçekleştirilmektedir.
4
2.2. Biyofilmlerin Tanımı
Biyofilmler; polisakkarit yapıdaki ekstraselüler matriks ile çevrelenmiş, birbirlerine ve
yüzeylere geri dönüşümsüz olarak bağlı hücrelerden oluşan; üreme, gen ekspresyonu ve
protein üretimi bakımından planktonik formlarına göre farklı fenotipler sergileyen sesil
mikroorganizma toplulukları olarak tanımlanabilirler [5]. Bir biyofilmin kalınlığı tek bir
hücre tabakasından, yoğun polimerik ortamla kaplı zengin hücre topluluğuna kadar
değişkenlik göstermektedir [6]. Sesil biyofilm hücreleri kompleks biyofilm yapısının
içinde oluşturulan akışkan kanallar ağı sayesinde en derin kısımlardaki besinlere
ulaşabilme imkanı bulmaktadırlar.
Biyofilm oluşumu içerisinde prokaryotik veya ökaryotik mikroorganizmalar sesil veya
planktonik formlarından yalnızca birisi olarak yaşamlarını sürdürmektedirler. Yüzeye
tutunma yoluyla oluşan sesil fenotipler genelde kendine ait karakterleri olan
polimikrobiyal biyofilmlere dönüşmektedirler. Planktonik fenotipler ise ortamda özgür
dolaşan ve çevresel ajanlara daha duyarlı mikroorganizmalardır [5].
Biyofilmler canlı dokular, medikal cihazlar, endüstriyel veya içilebilir su şebeke boruları
veya doğal sucul sistemler gibi çok çeşitli yüzeylerde oluşabilmektedirler. Su şebeke
sistemi biyofilmleri, korozyon ürünleri, çamur, su diyatomaları ve filamentöz bakterileri
kapsayan kompleks yapılardan oluşurken, medikal cihaz yüzeylerinde gelişen biyofilmler
ekstraselüler polimerik matriksle ilişkili bir yada daha fazla mikrobiyal organizmadan
oluşan basit yapılardır [1].
2.3. Biyofilm Oluşum Aşamaları
Biyofilmler, tutunma, üreme, hareket ve ektraselüler polisakkarit üretimi gibi zamanla
gelişen çeşitli dinamik işlemlerden meydana gelmektedir. Bir biyofilmin gelişim döngüsü
tutunma, bağlanma, ilk ve ikinci olgunlaşma fazı ve ayrılma olmak üzere beş farklı
aşamada gerçekleşmektedir. Tutunma aşaması çevresel sinyallerle tetiklenerek saniyeler
içinde aktif olabilen ilk basamak olup tutunulan yüzey tabakanın etkisi, yüzeyde oluşan
filmin yapısı, ortamın hidrodinamik yapısı, karakteristiği ve hücre yüzey yapısı gibi farklı
faktörler tutunmada incelenmesi gereken önemli hususlardır.
5
Şekil 2.1. Biyofilm oluşum basamakları [7]
2.3.1. Tutunma basamağı
a-) Yüzey tabakanın etkisi
Yüzeyin pürüzlü yapısı, fizikokimyasal özelliği vs. mikrobiyal tutunma aşamasında önemli
yer tutmaktadır. Araştırmaların çoğunda mikroorganizmaların cam ya da metal gibi
hidrofilik nonpolar yüzeylere oranla hidrofobik yapıdaki teflon veya diğer plastik
yüzeylere daha hızlı tutunduğu belirtilmiştir [8-10]. Tutunma aşamasındaki bu ilk
bağlanma geri dönüşümlüdür. Bakteri hücreleri bu aşamada logaritmik üreme fazı
sergilemektedir.
b-) Yüzeyde polimerik film yapısının oluşumu
Sıvı ortama maruz kalan yüzeylerin üzeri ortamda bulunan polimerlerle kaplanarak
yüzeyde mikrobiyal tutunmanın derecesini etkileyen kimyasal modifikasyonlara sebep
olmaktadır. Deniz suyuna maruz kalan yüzeylerde film tabakasının dakikalar içinde
oluştuğu ve saatler içinde artmaya devam ettiği gösterilmiştir. İnsan vucudunda bu film
yapısının çevreye oranla oldukça farklı olduğu gösterilmiştir. Diş yüzeylerinde oluşan
pelikül yapıları, kan, tükrük, idrar, solunum sekresyonları gibi biyomateryallerden oluşan
ve mikrobiyal kolonizasyonu ve tutunmayı kolaylaştıran konak kaynaklı polimerik film
tabakaları bu farklılığa örnek gösterilebilir [1, 11].
6
c-) Hidrodinamik yapı
Katı yüzeyler üzerinde hidrodinamik tabaka oluşumunda sıvı akış hızı oldukça önem
taşımaktadır. Akış hızı arttıkça yüzeydeki hidrodinamik tabaka kalınlaşmakta ve buraya
tutunan hücreler daha fazla türbülansa maruz kalarak basınç etkisiyle yüzeylerden
ayrılmaktadır [12, 13].
d-) Ortamın yapısı
Besin seviyesi, pH, iyonik denge ve sıcaklık gibi çeşitli faktörler yüzeylere mikrobiyal
tutunmada büyük önem taşımaktadır [14].
e-) Hücrelerin özellikleri
Hücre yüzey hidrofobisitesi, pili, fimbriya ve flajellanın varlığı, ekzopolisakkarit (EPS)
üretimi, hareket özelliği mikrobiyal hücrelerin yüzeylere tutunma derecesini etkileyen
çeşitli faktörlerdir. Bakterilerin çoğunluğu negatif yüklü olup yüzeylerinde çeşitli
hidrofobik yapılar içermektedir [15]. Bakteriler bu yapıları sayesinde yüzey ve
mikroorganizma arasında var olan elektrostatik itme gücünün üstesinden gelebilmekte ve
mikrobiyal aderens açısından avantaj yakalamaktadır. Bazı gram pozitif bakterilerin
mikolik asit yapısına sahip olmalarından dolayı hidrofobik materyallere diğer bakterilere
göre daha yüksek oranda tutundukları gösterilmiştir. Williams and Fletcher çalışmalarında
Pseudomonas fluorescens’in lipopolisakkarit O antijen mutantının vahşi tipe oranla
hidrofobik materyale daha fazla tutunduğunu belirtmişlerdir [1, 16].
2.3.2. Geri dönüşümsüz bağlanma
İkinci aşama geri dönüşümsüz bağlanma ile karakterize olup ilk tutunmadan dakikalar
sonra meydana gelmektedir. Epitelyal yüzeye tutunmadan sonra bakteriler, aralarında
iletişimi sağlayan kimyasal sinyalleri algılayarak çoğalmaya başlarlar. Sinyal seviyesi
belirli bir seviyeye ulaştığında EPS üretimini sağlayan genetik mekanizmalar aktive olur.
Bunun sonucunda mikroorganizmalar çoğalarak bol miktarda ekstraselüler matriks (ECM)
sentezlemeye başlarlar. Ekstraselüler matriks hem mikroorganizmaları bir kütle içinde
7
birada tutarak biyofilm ilişkili antimikrobiyal direnç gelişimine sebep olmakta, hem de bu
kütlenin canlı ya da cansız yüzeylere tutunmasını sağlamaktadır.
Ağız florası bakterilerinden Streptococcus mutans tarafından oluşturulan glukan
polisakkaritleri, Aggregatibacter actinomycetemcomitans ve Porphyromonas gingivalis’in
ürettiği fimbriyalar ve A. actinomycetemcomitans, S. mutans ve Streptococcus intermedius
tarafından üretilen hücre dışı çift zincirli DNA’lar biyofilmlerde gelişen ekstrasellüler
matriks yapılarına örnek olarak verilebilir [17-21]. Faz II aşaması sırasında hücre
agregatları oluşur ve bu agregatlar 10 mm’ den daha kalın bir tabaka halini aldıklarında
hareketleri azalır.
2.3.3. İlk ve ikinci olgunlaşma fazı
Üçüncü aşamada bulunan biyofilmler ilk olgunlaşma fazındaki hücreler olarak bilinirler.
Biyofilmler 100 mm’den daha fazla kalınlığa ulaştıklarında ikinci olgunlaşma fazı
hücreleri olarak adlandırılırlar ve biyofilm oluşumunda dördüncü aşamaya geçilmiş olur.
Bu olgunlaşmış hücre yapıları incelendiğinde, ilkel bir sirkülasyon sistemi gibi çalışarak
besinlerin ve mikroorganizmal atık ürünlerinin değişimine imkan sağlayan sıvı dolu
kanallar ve içlerinde hücre bulundurmayan sınırları belirgin yapıda ara boşluklar
gözlenmiştir. Olgun biyofilmler oksijen konsantrasyonu, pH değişimi, besin varlığı,
metabolik aktivite, üreme ve hücre yoğunluğu gibi çeşitli faktörlere göre değişen
heterojenik mikroçevreler içerirler [22].
2.3.4. Ayrılma basamağı
Biyofilm gelişimine son katkı olan beşinci aşamada; biyofilm hücreleri ana yapıdan
koparak çevreye dağılmaktadırlar. Bu aşama 4. aşamadan birkaç gün sonra başlamaktadır
[6]. Genetik olarak programlanmış yanıt veya sıvısal mekanik kuvvet sayesinde
mikrokoloniler ana biyofilm kitlesinden kopmaktadırlar [23, 24]. Kopan mikrokoloni
grupları hareket yetenekleri sayesinde veya ortamda varolan sirkülasyon sayesinde konakta
enfekte olmamış bölgelere giderek buralarda tutunur ve yeni biyofilm oluşumunu
başlatırlar. Biyofilm oluşumunun diğer aşamalarından farklı olarak hücrelerin ayrılma
basamağı çeşitli çevresel sinyalleri, sinyal transdüksiyon yolaklarını ve efektörleri içeren
karmaşık işlemlerden oluşabilmektedir [25]. Bu aşama biyofilmlerin yaşam döngülerinde
8
henüz tam anlaşılamamış olmakla birlikte çok sayıda araştırmacı bu konuya yoğun ilgi
göstermektedir [22]. Biyofilmlerde bazı yapılar ortak olsa dahi, immunolojik komponentler
ve konağa ait faktörler biyofilm oluşumunda önemli rol oynamaktadır.
2.4. Biyofilmlerin Yapısı
Biyofilmler; polisakkaritleri, nükleik asitleri, proteinleri, lipidleri ve metal iyonlarını içeren
ekzopolimer polimerik matriks içine gömülmüş, birbirlerinden su kanallarıyla ayrılan
bakteriyel mikrokolonileri içeren, ortamda bulunan organik ve inorganik moleküllerin
ekstraselüler yapıda toplanması sonucu mercan kayalıklar benzeri yapı oluşturan
heterojenik yapılardır [26]. Bu heterojenik yapılar hem monomikrobiyal hem de
polimikrobiyal biyofilmlerde gözlenmektedir. Su kanalları içinde bulunan sıvı akışı
sayesinde ortamdaki besin, oksijen ve karbon molekülleri hücre içine yayılarak biyofilm
oluşumuna yardımcı olmaktadır.
Biyofilm kalınlığı biyofilmi oluşturan mikroorganizma sayısıyla doğru orantılıdır. Reaktör
modeli uygulanarak oluşturulmuş Klebsiella pneumoniae ve P.aeruginosa biyofilmlerinde
her iki mikroorganizma tarafından oluşturulan polimikrobiyal biyofilmin ayrı ayrı oluşan
monomikrobiyal biyofilme oranla çok daha kalın yapıda olduğu gösterilmiştir [27].
Biyofilmlerin
toplam
karbonik
yapısının
%
50-90’ını
oluşturan
ekzopolimer
polisakkaritler, farklı mikrobiyal türlerden oluşan biyofilmlerde kimyasal yada fiziksel
özellik bakımından değişkenlik göstermektedir. Gram negatif bakterilerin EPS yapısı
nötral yada poli-anyonik yapıdadır. Ayrıca uronik asit varlığı (D-glukoronik, Dgalakturonik, ve mannuronik asit) veya ketal bağlı piruvat yapısı EPS’nin anyonik özellik
göstermesine neden olmaktadır [28]. Bu anyonik özellik kalsiyum veya magnezyum gibi
divalan katyonların biraraya gelmesine yardımcı olarak biyofilmlerde kuvvetli çapraz
bağların oluşmasına yol açmaktadır 38. Bazı gram pozitif bakteri EPS yapıları
incelendiğinde gram negatif bakterilerinden farklı olarak kimyasal kompozisyonlarının
katyonik yapıda olduğu belirtilmiştir [29].
EPS’lerin primer konformasyonunu belirleyen faktörler arasında polisakkaritlerin yapı ve
kompozisyonu yer almaktadır. Bazı bakteriyel EPS’ler ortamda kolay çözünürken, 1,3 ya
da 1,4 bağlı hekzos kalıntılarını içeren EPS’lerin deformasyona daha dayanıklı, sağlam
9
yapılı ve az miktarda çözünen ve/veya çözünmeyen yapılar oldukları gösterilmiştir [28].
2.5. Polimikrobiyal Biyofilmler
Mikroorganizmaların çoğunluğu sıklıkla biyotik ya da abiyotik alanlara tutulmuş, hücreler
arasında iletişimin varolduğu kompleks polimikrobiyal biyofilm formları içinde bulunarak
yaşamlarını sürdürmektedir [30]. Polimikrobiyal biyofilmler; mikrobiyal yada konak
kaynaklı polisakkaritlerden oluşan matriks içine gömülü, virüs, bakteri, mantar ve parazit
gibi çeşitli mikroorganizmalardan oluşan karmaşık hücre topluluklarıdır. Belirli bir alanda
çok sayıda farklı mikrobiyal türün birarada bulunması sonucunda zamanla türe özgül
fizyolojik
ve
kimyasal
iletişimlerin
evrimleşme
gösterdiği
gözlenmiştir.
Mikroorganizmalar aynı habitat içinde birbirlerine mutualistik, sinerjistik veya
antogonistik etki yaratabilmektedir [31]. Çok sayıda mikrobiyal ajanın bulunduğu bu
ortamda bir tür diğeri için uygun yaşam alanı hazırlayabilmektedir. Türler arasında
gerçekleşen bu tarz sinerjistik etkileşimlere mikrobiyal interferans denilmektedir.
Birden fazla mikrobiyal türün bulunduğu polimikrobiyal biyofilmlerde yoğun popülasyon
artışı tür içi ve türler arası gen transferlerinin gerçekleştiği gözlenmiştir. Bakteriyel
plazmid yada küçük kromozomal yapıların transferleri sonucunda avirulan olan bir suş
oldukça virulan bir patojen haline dönüşebilmektedir. Besin azlığı yada yoğun mikrobiyal
popülasyon içeren biyofilm ortamında bir türden diğerine aktarılan bu genler
mikroorganizmaların yaşam sürecini arttırmaya yardımcı olmaktadırlar [32].
Bugüne kadar biyofilmler hakkında edinilen bilgilerin çoğu monomikrobiyal biyofilmler
üzerine olup, doğal yada klinik ortamda çoğunlukla polimikrobiyal biyofilm formlarının
bulunduğu unutulmamalıdır. Kültür bağımlı izolasyon tekniklerinden dolayı hastalıkların
çoğu monomikrobiyal kökenli olarak tanımlanmış ancak kültürden bağımsız analiz
yöntemlerinin geliştirilmesiyle oral kavite enfeksiyonları, otitis media, diyabetik yara
enfeksiyonları, kronik kistik fibrosis gibi çeşitli hastalıkların çoğunlukla polimikrobiyal
kökenli olduğu anlaşılmıştır. Hem biyofilmlerin yapısını daha iyi anlayabilmek hem de
hastalıkların ciddiyetini ve gidişatını belirleyebilmek adına enfeksiyonlarda polimikrobiyal
popülasyonun belirlenebilmesi ve birbirleriyle etkileşimlerinin saptanabilmesi oldukça
önem taşımaktadır [30].
10
2.6. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Yapısal Gelişimi
Bakteri türleri birbirleriyle yoğun iletişim halinde olup bu iletişimler polimikrobiyal
biyofilmlerin yapısını belirleyebilmektedir. Polimikrobiyal bir topluluğun karmaşık
yapısının anlaşılması ilk olarak dental plak biyofilmlerini oluşturan popülasyonun
araştırılmasıyla ortaya çıkmıştır. Bir mikrobiyal türün diş yüzeyine veya ağız dokusuna
geçici kolonizasyonu sonrasında ortamda bulunan diğer türler kolonize olan bu türe
tutunabilmektedirler ve dolaylı yoldan yüzeylere de kolonize olabilmektedirler. Ortama
erken kolonize olan tür adeta diğer türler için iskele görevi görerek sonraki aşamalarda
tutunabilecek diğer türleri belirleyebilmektedir. Bu şekilde gerçekleşen tutunma işlemine
koagregasyon denilmektedir [33]
Şekil 2.2. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunun gösterilmesi A) Biyotik yüzey
B) Bakterilerin yüzeye erken kolonizasyonu C) Erken kolonize olan bakterilerin
ortamdaki diğer türleri kendine bağlaması D) Spesifik planktonik
mikroorganizmaların agrege olmuş hücre topluluklarının bağlanmasına yardımcı
olması
Dental plak biyofilmi oluşumunda yüzlerce oral bakterinin birbirleriyle agregat
oluşturdukları saptanmıştır. Yapılan çalışmalarda EPS yapısının koagregasyonda
yapıştırıcı görevini üstlenerek hücrelerin birbirine sıkı tutunmasına aracılık ettiği
belirtilmiştir [34, 35]. Adezin proteinleri aracılı koagregasyon polimikrobiyal biyofilm
oluşumunda temel esasdır. Yapılan bir çalışmada dental plak biyofilminden izole edilen
Streptococcus oralis DL1 suşunun diğer dental türlerle agregat oluşumunda gerekli 5 farklı
11
adezin proteinini eksprese ettiği belirtilmiştir [36-39].
Adezyon proteinleri mantarlarda da bulunan proteinler olup mantar-bakteri ilişkisine de
aracılık edebilmektedir. Grimaudo ve arkadaşları çalışmalarında oral streptokok
türlerinden Streptococcus gordonii, S.oralis ve S. sanguinis’in C.albicans’a yüksek afinite
sergilediklerini ancak C.albicans ve Candida dubliniensis’inde Fusobacterium türlerine
daha yüksek afinite sergilediğini gözlemlemişlerdir [33, 40]. Sonraki çalışmalarda
mannan’ı parçalayan mannoz enzimi ortama eklendiğinde C.albicans ve Fusobacterium
arasındaki ilişkinin inhibe olduğu gözlenmiş ve bunun sonucunda Fusobacterium’un
protein komponentinin Candida’nın karbonhidrat yapıdaki yüzey reseptörlerine bağlandığı
açığa çıkarılmıştır. Diğer bir çalışmada ise Candida yüzeyindeki protein reseptörüne
Actinomyces’in
karbonhidrat
yapıdaki
yüzey
molekülünün
bağlanarak
agregat
oluşturdukları gözlenmiştir [33].
Bakteriyel yüzey pili ve flajella yapıları ve bu organeller aracılı hareket özelliğinin
polimikrobiyal biyofilm oluşumunda gerekli olduğu belirtilmiştir. P.aeruginosa tip IV pili
ve flajellası aracılığı ile Agrobacterium tumefaciens mikrokolonileri içine yerleşmekte ve
bu ikili biyofilm oluşumunda kendisine üreme avantajı sağlamaktadır [41]. P.aeruginosa S.aureus ikili biyofilm gelişiminde tip IV pili’nin ortamdaki S.aureus eDNA’larına
bağlanarak biyofilm oluşumunu desteklediği gözlenmiştir. Escherichia coli ve Citrobacter
freundii arasındaki biyofilm oluşumunun ise E.coli’nin konjugatif pilisi (F pili) aracılığıyla
gerçekleştiği ortama F pili inhibitörü olan çinko eklendiğinde ise biyofilm oluşumunun
inhibe olduğu bildirilmiştir [42].
2.7. Polimikrobiyal Biyofilmlerdeki Etkileşimler
2.7.1. Sinerjistik etkileşimler
Polimikrobiyal bir biyofilmi oluşturan mikroorganizmaların birbirleriyle etkileşimleri ve
iletişimleri sonucunda o biyofilmin fizyolojik ve kimyasal yapıları oluşmaktadır. Sesil
biyofilm hücreleri aynı zamanda bu etkileşimler sayesinde direnç faktör eldesi, metabolik
paylaşım, olumlu yan ürün etkisi, ‘‘quarum sensing’’ sistemi ve DNA paylaşımı sağlayan
gen havuzu gibi çok sayıda avantajlara sahip olmaktadırlar [43-48].
Bazı durumlarda pasif direnç denilen durum sayesinde bir direnç faktörüne sahip olan
12
mikrobiyal tür buna sahip olmayan diğer mikrobiyal türleri antimikrobiyallere karşı
koruyabilmektedir. Beta-laktamaz enzimi üreten Haemophilus influenza’nın herhangi bir
direnç faktörü içermeyen Streptococcus pneumonia ile birlikte kültürü yapıldığında,
S.pneumoniae’nin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) / minimum bakterisidal
konsantrasyonu (MBK) değerlerinde monomikrobiyal kültüründen elde edilen değerlerine
oranla daha fazla artış gözlenmiştir [43].
Ortak metabolik beslenme polimikrobiyal biyofilmlerde görülen avantajlı bir durumdur.
A.actinomycetemcomitans ve oral streptokok türleri ile yapılan bir çalışmada konağın
doğal immunitesine karşı A.actinomycetemcomitans’ın direncinde gözlenen artış moleküler
mekanizmalar ile araştırılmıştır. Oral streptokokların nötrofil birikimine ve lokal
inflamasyona yol açan hidrojen peroksit (H2O2) ürettiği bilinmektedir. Artmış H2O2
üretimine cevap olarak A. actinomycetemcomitans hücrelerinde iki farklı gen bölgesinde
ekspresyon artışı saptanmıştır. Bu genlerden biri ‘‘katA’’ geni olup Streptokoklar ve
nötrofiller tarafından üretilen H2O2’yi, H2O ve O2’ye dönüştüren katalaz enzimini
kodlamaktadır. Bir diğer gen bölgesi ‘‘apiA’’ olup inflamasyona yol açan serum
kompleman aktivitesini inhibe eden proteini kodlamaktadır. Bu proteinin ekspresyonu
sayesinde konağın kompleman aracılı lizisinin engellendiği gösterilmiştir [49].
Biyofilmlerde ortama salınan ‘‘quarum sensing’’ sinyal molekülleri, metabolik yolaklar,
virulans faktörleri, biyosürfaktanlar, EPS üretimi ve hareket yetenekleriyle ilişkili genlerin
ekspresyonunu kontrol etmekte ve türler arası iletişimde oldukça önemli rol
oynamaktadırlar. Açillenmiş homoserin laktonlar tür ve cinsler arası iletişime aracılık
edebilen en yaygın otoindükleyici [Autoinducer (AI)] moleküllerdir [50, 51]. Küçük bir
‘‘quarum sensing’’ molekülü olan AI2 molekülü gram negatif, gram pozitif ve anerob
bakterilerin bulunduğu polimikrobiyal bir ortamda tüm türler tarafından tanınabilmektedir
[52]
Riedel ve arkadaşları çalışmalarında kistik fibrosis enfeksiyonunun etkin patojeni olan
P.aeruginosa tarafından ortama salınan AHL sinyalinin diğer etkin patojen olan
Burkholderia cepacia tarafından algılandığı ve Burkholderia cepacia virulans genlerinin
ekspresyonunda artış gözlendiği belirtilmiştir [53]. Ayrıca kistik fibrosis enfeksiyon
patojenlerinden bir diğeri olan Stenotrophomonas maltophila’nın salgıladığı sinyal
molekülünün P.aeruginosa’nın polimiksine karşı toleransında azalmaya neden olduğu da
13
gözlenmiştir [54].
Biyofilmlerde türler arası iletişimi ve etkileşimi sağlayan sinyal molekülü analoglarının
yada sinyal moleküllerini degrade eden enzimlerin ortama verilmesiyle iletişimin önemli
ölçüde baskılandığı gösterilmiş ve bu moleküllerin antibiyotiklere alternatif olabilecek
tedavi yaklaşımları arasında görülebileceği vurgulanmıştır [55].
2.7.2. Antagonistik etkileşimler
Biyofilmlerde bazı durumlarda mikroorganizmalar besin rekabeti, oksijen kısıtlılığı, toksik
maddelerin
ortama
salınımı
gibi
çeşitli
sebeplerle
ortamda
bulunan
diğer
mikroorganizmaların üremesini engellemeyi veya öldürmeyi hedeflemektedirler. Buna
örnek olarak P.aeruginosa’nın çok sayıda toksik etkili virulans faktörünü ortama salarak
C.albicans’ın üremesini inhibe ettiği yapılan çalışmalarda açıklanmıştır. Tong ve
arkadaşları, Streptococcus oligofermentans’ın L-aminoasit oksidaz enzimi sayesinde
peptondan
H 2 O2
üretimine
yol
açarak
S.mutans’ın
üremesini
inhibe
ettiğini
gözlemlediklerini belirtmişlerdir [56, 57].
2.8. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Hastalıklardaki Rolü
2.8.1 Oral enfeksiyonlar
Ağız mikrobiyolojisinde biyofilmler temel araştırma konusu olup oral hastalıklardaki
rolleri detaylı incelenmektedir. Dental biyofilm bakterileri normal zamanda konakla bir
uyum içinde yaşamlarını sürdürürler. Ancak mikrobiyal ortamda gelişen ekolojik
değişimler, dental taşıyıcılık ve periodontal hastalık gibi önemli ağız enfeksiyonlarının
gelişimine sebep olmaktadır [58].
Dental taşıyıcılık tüm yetişkin bireylerin büyük çoğunluğunda ve okul çağındaki
çocuklarda çok sık görülen ağız enfeksiyonlarından biridir [59]. Protein ve tükrük
salgılarıyla kaplanan diş yüzeylerinde pelikül denilen ince zar tabakası oluşumu sert diş
minesi yapısının bozulmasına yol açmaktadır. Bu durum, dental plak denilen ortamdaki
mikrobiyal türlerin diş yüzeyine tutunup birbirleriyle agregatlar oluşturmasına ve bunu
takiben matriks içine gömülü polimikrobiyal biyofilm topluluklarının gelişimine yol
14
açmaktadır [60]. Sağlıklı ve derin yerleşimli dental taşıyıcılığı olan bireylerden alınan
örnekler incelendiğinde diş çürüğü örneklerinin tümünde enfeksiyon etkenleri olarak
polimikrobiyal mikroorganizmalar gözlenmiştir. C.albicans’ın oral streptokoklarla birlikte
kolonize olabilmesi ve düşük pH (<4.5) ortamlarında yaşamını sürdürebilmesinden dolayı
aktif dental taşıyıcılıkta önemli rolü olduğu bilinmektedir [30].
Li ve arkadaşları çalışmalarında Fusobacterium ve Neisseria türlerini diş çürüklerine yol
açabilen
patojenler
olarak
belirlerken
Bacteroides,
Treponema,
Provetella
ve
Corynebacterium türlerini çürüklerde koruyucu rolleri olan mikroorganizmalar olarak
belirlemişlerdir [61]. Dental taşıyıcılıkta primer patojen olarak bilinen S.mutans tarafından
üretilen laktatı ve süksinatı bazı Veilonella türlerinin ortamda hızlıca degrade
edebilmesinden dolayı ağız sağlığı açısından yararlı bakteriler olarak bilinirler.
Protez stomatit diş yüzeyi ile yakın temasta bulunan yumuşak dokuların ödem ve
kızarıklığı olarak bilinir ve polimikrobiyal biyofilm aracılı oral enfeksiyonlarda detaylı
olarak çalışılmıştır. Hastalara takılan diş protezleri ağızda tükrük salgısının akışını
kısıtladığından dolayı enfeksiyon gelişimine yardımcı olmaktadır. Protez takılan hastaların
tükrük ve diş yüzeyi sürüntü örnekleri incelendiğinde C.albicans ve S.aureus türlerinin
hem sağlıklı hem de stomatitli hasta örneklerinde izole edildikleri belirtilmiştir. Ancak oral
mukozada S.aureus daha fazla saptanırken diş yüzeylerinde C.albicans’ın sayıca daha
fazla bulunduğu gözlenmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkılarak bakteriyel süperenfeksiyon ve
konak doku iltihabına yol açan S.aureus bakterisinin ortama kolonize olmasında
C.albicans’ın yardımcı rolü olduğu iddia edilmiştir [62].
C.albicans ve S.aureus’dan oluşan ikili biyofilm yapısı incelendiğinde C.albicans’ın adeta
bir iskele görevi görerek S.aureus’un yüzeye tutunmasına ve mikrokoloniler oluşturmasına
yardımcı olduğu belirtilmiştir. Aynı zamanda monomikrobiyal biyofilmlerine oranla,
C.albicans - S.aureus biyofilmlerinde sesil S.aureus hücrelerinin vankomisin direncinde
artış gözlenmiş ve bu artışın C.albicans’ın matriks yapısının S.aureus’u vankomisinin
etkisinden korumasından kaynaklandığı belirtilmiştir [63].
Periodontit, diş dokusuna destek yapıların hasarı, diş kemik dokusunun erimesi ve sonunda
diş kaybıyla sonuçlanan kronik diş eti iltihabı olarak bilinen polimikrobiyal biyofilm
kaynaklı ağız enfeksiyonudur [64].
Otuz beş yaş üstü hastalarda görülen yetişkin periodontitinde en sık karşımıza çıkan
15
mikrobiyal türler P. gingivalis, Treponema denticola ve Tannerella forsythia olup otuzbeş
yaş altı hastalarda gözlenen erken periodontitde P.gingivalis ile birlikte izole edilen A.
actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia ve Capnocytophaga sputigena türleri
sıklıkla izole edilen türler arasında yer almaktadrlar [65]. Yapılan çalışmalarda
polimikrobiyal
biyofilm
oluşumunda
Fusobacterium
nucleatus’un
P.gingivalis’in
çoğalmasını sinerjistik olarak destekleyerek total biyofilm kütlesinde artışa yol açtığı
saptanmıştır. Ayrıca F.nucleatus’un gingivit enfeksiyonunda P.gingivalis’in epitel hücresi
içine penetrasyonunu da arttırdığı gösterilmiştir [65-67].
Polimikrobiyal biyofilm kaynaklı oral enfeksiyonlara yönelik tedavi stratejilerinin
geliştirilmesinde klinik ilişkili türlerin birbirleriyle ilişkilerini ve etkileşimlerini anlamaya
yönelik yeni çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
2.8.2. Otitis Media
Çocukluk çağı hastalıklarından biri olan orta kulak iltihabı ağrı, ateş ve kulak akıntısı
semptomlarıyla baş gösteren orta kulak enfeksiyonu olarak bilinmektedir. Nadiren ölümcül
olan bu enfeksiyon kronik seyir gösterip ileri aşamada kısmi ya da tamamen duyma
kaybına yol açabilmektedir [68].
Enfeksiyondan sorumlu mikroorganizmalar sıklıkla kommensal bakteri türleri olan
S.pneumoniae, H. influenza ve genellikle üst solunum yolu virusleriyle birlikte izole edilen
Moraxella catarrhalis türleridir. Bu mikroorganizmaların çoğu enfeksiyonda tek başına rol
oynayabilecekleri gibi birlikte de çoğalarak hem hastalığın şiddetini arttıran hem de
konağın birden fazla mikroorganizmayla kolonizasyonu sağlayan polimikrobiyal
biyofilmleri oluştururlar [69].
Üst solunum yolu virüslerinin konak epitel hücrelerine bakteriyel kolonizasyonu arttırarak
hastalığın patogenezinde artışa sebep oldukları gözlenmiştir. S.pneumoniae ve S.aureus’un
Influenza A virüsü ile enfekte konağın nazofarinks’inde virüsle enfekte olmayan konağa
oranla daha fazla bulundukları belirtilmiştir [30, 70].
M.catarrhalis ve tiplendirilemeyen H.influenza tarafından gelişen polimikrobiyal
enfeksiyonda M.catarrhalis suşlarının gerek konak immün cevabına gereksede
16
antimikrobiyal tedaviye direncinde artış gözlenmiştir. Ancak H.influenza luxS defektli
mutant ile aynı çalışma tekrarlandığında M.catarrhalis’in immune cevaba ya da
antimikrobiyal tedaviye direnç göstermediği gözlenmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkarak,
quarum sensing aracılı türler arası iletişimin polimikrobiyal biofilm aracılı otitis media
enfeksiyonunu arttırdığı düşünülmektedir [71].
2.8.3. Diyabet kökenli yara enfeksiyonları
Şeker hastalığı diye bilinen diyabet vücudun insulin cevabında gözlenen hasar olup dünya
popülasyonunun yaklaşık % 6.4’ünü etkilemektedir. Tip 1 ve tip 2 diyabet en yaygın
gözlenen şeker hastalığı formlarıdır ve insülin salgılayan hücrelerin otoimmün aracılı
yıkımından ya da insülin direncine yol açan reseptör hücrelerde defektlere neden olan
metabolik bozukluklardan kaynaklanmaktadır. Vücutta düşük seviye insülin üretimi veya
insüline duyarsızlık, kan hücrelerinde yüksek glikoz artışına, ozmotik dengesizliğe, doku
dehidratasyonuna ve organ hasarına yol açmaktadır. El, ayak ekstremitelerinde gözlenen
periferal nöropati, zayıf kan dolaşımı gibi çeşitli semptomlar diyabetli bireylerde
enfeksiyon gelişimi riskine ve standart tedavilerle çözülemeyen polimikrobiyal biyofilm
kaynaklı kronik ülseratif yara enfeksiyonlarına neden olmaktadır [30].
Diyabetik yara enfeksiyonu olan bireylerden sürüntü ve aspirasyon örnekleri alınarak
yapılan çok merkezli bir çalışmada örneklerin % 48,9’unda aerobik, %1,3’ünde anaerobik,
% 43,9’unda ise aerob ve anaerob karışık bakteri popülasyonu izole edilmiştir.
Corynebacterium spp., Enterococcus spp., E.coli, S.epidermidis ve S.aureus türleri
örneklerden en sık izole edilmiş aerobik bakteriler iken, Fusobacterium spp.,
Porphyromonas spp., Prevotella spp., Bacteroides spp. ve Clostridium spp. türlerinin ise
en sık izole edilen anerobik bakteriler olduğu gözlenmiştir [72].
S.aureus diyabetik yara enfeksiyonlarında sık izole edilen bakterilerden biri olup S.aureus
biyofilm defektli mutant ile yapılan çalışmalarda yara iyileşiminin normal seyrinde devam
ettiği ancak defektin kaldırılmasıyla birlikte enfeksiyon şiddetinin arttığı ve yara iyileşme
hızının yavaşladığı gözlenmiştir [73]. E.coli, Bacteroides fragilis ve Clostridium
perfringens’in tek başlarına ikili ya da üçlü kombinasyonları kullanılarak yapılan hayvan
deneyi çalışmalarında en yüksek mortalite oranının üç bakterininde enjekte edildiği
hayvanlarda gözlendiği belirtilmiştir. Enjeksiyonun erken dönemlerinde E.coli ve
17
B.fragilis güçlü bir sinerjistik etki gösterirken ilerleyen dönemlerde antagonistik
etkileşimler sergiledikleri gösterilmiştir [74] .
2.8.4. Kistik fibrozis enfeksiyonu
Kistik fibrosis, kalın ve yapışkan mukus tabakası üretiminden dolayı hastaları sıklıkla
akciğer enfeksiyonuna yatkın kılan yaygın bir genetik hastalıktır. Kistik fibrosis
transmembran regülatör proteininde oluşan mutasyonlar, proteinlerin yanlış katlanması
sonucu hücrelerin degredasyonuna sebep olmakta ve kistik fibrosis gelişimine neden
olmaktadır [75]. Hastalarda normal mukosiliyer temizlemenin bulunmaması yoğun mukus
üretimine ve aşırı akciğer enfeksiyonuna neden olmaktadır. Sağlıklı bireylerde inhalasyon
yoluyla alınan patojen mikroorganizmalar solunum yolunda tutularak mukosiliyer tabaka
sayesinde yok edilirken, kistik fibrozisli bireylerde bu temizlenme işlemi gerçekleşmez ve
sıklıkla alt solunum yollarında polimikrobiyal biyofilm kaynaklı enfeksiyon gelişimiyle
sonuçlanır [76].
Polimikrobiyal
enfeksiyonlu
hastalardan
en
sık
izole
edilen
mikrooganizmalar
P.aeruginosa başta olmak üzere S.aureus, Streptococcus milleri grubu (SMG) patojenleri,
B.cepacia, S.maltophilia, H.influenza ve C.albicans dır.
Polimikrobiyal kaynaklı kistik fibrosis enfeksiyonlarında C.albicans ve P.aeruginosa
türleri arasında antagonistik etkileşimler saptanmıştır. Kistik fibrosisli hastalardan izole
edilmiş P.aeruginosa’nın ortama saldığı ‘‘quarum sensing’’ moleküllerinin enfeksiyonun
diğer önemli patojeni olan C.albicans’ın tomurcuklanmasını engelleyerek ortamda
çoğalmasını önlediği gözlenmiştir. Ayrıca Pseudomonas bakterisinin Candida’nın hif
hücrelerine tutunarak mantar hücresinin lizisini tetikleme yoluyla ölümüne yol açtığı
saptanmıştır [77]. C.albicans ve P.aeruginosa arasındaki bu antagonistik etkileşim tek
taraflı olmayıp C.albicans tarafından salınan farnesolün pseudomonal bir virulans faktörü
olan demir bağlayan piyosiyanin’in ekspresyonunu anlamlı ölçüde azalttığı gözlenmiştir.
Bu sonuçlar ışığında, kistik fibrozisli hastalarda Pseudomonas bakteri kolonizasyonunu
engelleyebilme stratejilerinde farnesolün etkin rol oynayabileceği ortaya çıkarılmıştır [78].
Beş yıllık bir sürveyans çalışmasında kistik fibrosis hastalarının erken dönemde S.aureus
ve H.influenza ile kolonize olduğu, sonraki dönemde bu kolonizasyonu P.aeruginosa’nın
18
takip ettiği, son dönemde ise B.cepacia kolonizasyonunun gerçekleştiği gösterilmiştir.
Kistik fibrosis balgam örneklerinden izole edilen S.aureus ve P.aeruginosa bakterilerini
içeren polimikrobiyal kültürde, P.aeruginosa tarafından ortama salınan HQNO solunum
inhibitörü bileşiğinin S.aureus üremesini ilk beş saat içinde baskıladığı gözlenmiştir. Bu iki
bakterinin birlikte üretildiği diğer bir çalışmada, HQNO bileşiklerine uzun süre maruz
kalan S.aureus bakterilerinin solunum yolu elektron transport sistemi defektlerine sahip
küçük koloni varyantlarını oluşturarak tobramisin antibiyotiğinin etkisinden korunduğu
gösterilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda bu iki bakteri türünün birbirine hem antagonistik
hem de sinerjistik etki gösterdiği saptanmıştır [79].
Kistik fibrosis hastalığında B. cepacia kompleks’in neden olduğu enfeksiyonlar çoğunlukla
yüksek ölüm oranıyla sonuçlanırlar. Enfeksiyonda B.cepacia ve P.aeruginosa’nın beraber
bulunması hastanın pulmoner fonksiyonlarında ani bozukluğa ve kötü seyirli klinik tabloya
yol
açmıştır.
Ayrıca
yapılan
çalışmalarda
ortamda
P.aeruginosa
varlığının,
Burkholderia’nın epitel hücrelere daha fazla tutunmasına ve virulans faktörü genlerinin
daha fazla eksprese olmalarına yol açtığı gözlemiştir [30].
Kistik fibrosis’li yetişkin ve pediatrik hastaların bronkoalveolar lavaj örneklerinden
Prevotella, Veilonella, Propionibacterium ve Actinomyces türü anaerob bakteriler izole
edilmiştir. Kültürden bağımsız teknikler kullanılarak yapılan çalışmalarda bu anaerobik
türlere ek olarak çok sayıda farklı türlerin de enfeksiyonda yer aldığı ve bu türlerin
hastadan hastaya değişkenlik gösterdiği vurgulanmıştır. Araştırmacılar anaerobik floranın
kistik fibrozis enfeksiyonunda etkin rol oynaması durumunda, günümüzde kullanılan çoğu
antimikrobiyal ajanın enfeksiyonu önlemede yetersiz kalacağını vurgulamaktadırlar [80].
2.8.5. Yabancı cisim kaynaklı enfeksiyonlar
a-) Santral venöz kateterler
Kan dolaşımı enfeksiyonlarının çoğunluğundan santral venöz kateterleri sorumlu olup
yaygın kullanımları uzun süre hastanede kalıma ve ciddi maliyet artışına yol açan
komplikasyon riskini de beraberinde getirmektedir [81]. Kateter ilişkili enfeksiyonlar
nozokomiyal endokarditin ana nedenleri arasında görülmekte olup kateterin takıldığı
19
anatomik bölge ve kateterizasyon süresi enfeksiyon için temel risk faktörlerini
oluşturmaktadır [82, 83].
Kateter aracılı biyofilm oluşumlarından sıklıkla S.epidermidis, S.aureus, C.albicans,
P.aeruginosa, K.pneumoniae ve E.faecalis mikroorganizmaları izole edilmekte olup
genellikle hastanın deri florası, hastane personeli mikroflorası veya kontamine materyaller
bu izolatların ana kaynağını oluşturmaktadır [84].
Çalışmaların çoğunda bu enfeksiyonların kontrolüne yönelik çeşitli antimikrobiyal tedavi
yöntemlerinin etkileri değerlendirilmiştir. Klorhekzidin ve gümüş bileşikleri, minosiklin ve
rifampin antibiyotiği, benzalkonyum klorür ve katyonik sürfaktanlar gibi çeşitli
antimikrobiyallerin farklı konsantrasyonları ile kaplanmış yada emdirilmiş kateterlerin
etkinlikleri birbirleriyle kıyaslandığında minosiklin ve rifampin ile doygunlaştırılmış
kateterlerin kısa dönem kateterizasyonda kolonizasyonu azalttığı gözlenmiştir [81].
b-) Üriner kateterler
Mikrobiyal kolonizasyon sonucu üriner kateterlerin yüzeylerinde oluşan biyofilmler
kateter ilişkili idrar yolu enfeksiyonlarının ana sebepleri arasında yer almaktadır [85]. Bu
aletlerin kontaminantı olarak karşılaşımıza en sık çıkan mikroorganizmalar S.epidermidis,
E.faecalis, E.coli, P.mirabilis, P.aeruginosa, K.pneumoniae ve diğer gram negatif bakteri
türleridir.
Yapılan bir araştırmada kısa dönem kateterizasyon sonrası hastaların %10-50’sinde
biyofilm kaynaklı üriner sistem enfeksiyonları gözlenirken uzun dönem kateterizasyon
sonrasında bu oran %100’ü bulmuştur [84]. Kateter yüzeylerine adezyonda yüzey ve
mikroorganizma arasındaki hidrofobisite oldukça önem taşımaktadır. Hem hidrofobik
hemde hidrofilik yüzeye sahip bir kateterde çok çeşitli mikroorganizma kolonizasyonu
gözlenmiştir.
Üriner kateter ilişkili biyofilmleri engellemeye yönelik; antimikrobiyal merhem
uygulaması, mesane instilasyonu ve yıkanması, idrar toplama poşetinin antimikrobiyal ajan
içermesi, sistemik antibiyotik veya gümüş oksit gibi bileşiklerin üriner katetere
emdirilmesi gibi pek çok strateji geliştirilmiştir. Gümüş emdirilmiş kateterlerin hastada
20
bakteriüri oluşumunu dört gün kadar geciktirdiği gözlenmiştir. Polimikrobiyal biyofilm ile
enfekte kateteri bulunan hastaya siprofloksasin tedavisi verildiğinde kateterin temizlendiği
ve 10 haftaya kadar da kesintisiz direnaj sağlandığı gözlenmiştir. Otuz güne kadar salım
yapan norfloksasin ile kaplanmış kateter kullanılmasının hastada E.coli, K.pneumoniae ve
P.vulgaris üremesini 10 güne kadar inhibe ettiği gözlenmiştir [86].
c-) Mekanik kalp kapakları
Mikroorganizmaların hastalarda yapay kalp kapakçıkları üzerinde veya protez etrafındaki
dokuda biyofilm oluşturarak yapay kalp endokarditine sebep oldukları gözlenmiştir.
Genellikle deri florası, yabancı cisim ya da dental invaziv işlemlerden köken alan
S.epidermidis, S.aureus, gram negatif basiller, enterokok türleri, difteroidler ve Candida
türleri bu enfeksiyonlardan sorumlu tutulmaktadır [84].
d-) Ortopedik implantlar
Oldukça ciddi hijyen protokollerinin ve antibiyotik proflaksi uygulamalarının varolmasına
rağmen hastalarda en sık diz ve kalça implantı yerleşimi sonrasında biyofilm kaynaklı
enfeksiyonlar gözlenmektedir.
Geniş spektrumlu antibiyotiklerin kemik dolgu maddelerine veya ara parçalarına absorbe
edilmesi sonucu pek çok mikroorganizma üremesine karşı etkin korunma sağlanmıştır.
Gentamisin, rifampisin, vankomisin ve tobramisin antibiyotikleri tek başlarına veya
kombinasyonları yapılarak materyallere uygulandıklarında gentamisinin fizikokimyasal ve
antimikrobiyal açıdan en etkin antibiyotik olduğu gözlenmiştir. Son yıllarda biyolojik
olarak parçalanabilen ve belirli aralıklarla salım yapabilen gentamisin yüklü materyallerin
lokal osteomiyelit tedavisinde ümit verici olduğu belirtilmektedir [87, 88].
2.9. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonların Tanısı
Akut enfeksiyonlarda sıvı, sürüntü veya enfeksiyonlu bölgenin biyopsi örneği alınarak
enfektif mikroorganizmanın kolaylıkla tanımlanabilmesine rağmen kronik enfeksiyonlarda
bu işlem çok daha problemlidir. Biyofilm ilişkili enfeksiyonların tanımlanmasında kültür
bazlı teknikler genellikle yanlış negatif sonuçlar vermektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu
21
(PZR) ve ‘‘floresan in situ hibridizasyon’’ (FISH) gibi kültüre bağımlı olmayan
analizlerden elde edilen sonuçlarla kültür temelli tekniklerden elde edilen sonuçlar
arasındaki korelasyonun çok düşük olması biyofilm enfeksiyonlarını tanımlamadaki
zorlukları ortaya koymaktadır [89]. Bu problemlere örnek olarak kronik yara
enfeksiyonlarında alınan sürüntü örneklerinde derinlerdeki mikroorganizmalardan ziyade
yalnızca yara yüzeyinde bulunan bakterilerin tanımlanabilmesi verilebilir. Yüzeylere
tutunmuş
ya
da
biyofilm
içinde
bulunan
mikroorganizmaların
kültürde
üretilememelerinden dolayı etken bakterilerin implant ya da kateter gibi yabancı cisim
kaynaklı enfeksiyonlarından soyutlanabilmelerinde problemler yaşanmaktadır [81].
Klinik uygulamalarda bu enfeksiyonların tanısını arttırabilmek amacıyla çok sayıda
alternatif tanı kriterleri yayınlanmıştır. Enfeksiyon bölgesinde yüzey ile ilişkili
mikroorganizmaların gözlenmesi veya konak dokusuna ya da mikrobiyal matrikse gömülü
mikrobiyal hücre kümelerinin gözlenmesi bu kriterlerden bir tanesidir. Diğer bir kriter ise
yüksek klinik enfeksiyon şüphesine rağmen kültürde üremenin gözlenmemesi ve
enfeksiyonun antibiyotik tedavisine direnç göstermesidir. Ayrıca konak immün sisteminin
enfeksiyonu vücuttan tamamen temizleyememesi de kriterler arasında yer almaktadır [31,
89-91].
Günümüzde mikroorganizmalar kültür, PZR ve mikroskobi gibi herbirinin kendisine göre
avantaj ve dezavantajları olan çeşitli yöntemlerle saptanabilmektedir. Kültür bazlı
tanımlamada karşılaşılan problem sıklıkla yüzeye yakın yerden örnek alınarak bakteri
kültürlerinin yapılabilmesidir. Mikroorganizma varlığının deoksribonükleik asit (DNA) ve
ribonükleik asit (RNA) temelli moleküler yöntemlerle örneklerden gösterilmesi o
mikroorganizmanın enfeksiyona tam anlamıyla katkısı olduğu anlamına gelmeyebilir,
dolayısıyla tedavi içinde bir anlam ifade etmeyebilir. Mikroskobi enfeksiyöz ajanın ve
ortam organizasyonunun görüntülenmesi açısından yararlı bir yöntemdir. Ancak
mikrobiyal etken varlığının gösterilmesi klinik örneğin tümü için şart olduğundan bu
durum birçok örneğin ayrıntılı analiz edilmesi ni gerektiren emek yoğun işlemler silsilesi
anlamına gelmektedir [81].
22
2.10. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonlara Konak İmmün Cevabı, Antibiyotik ve
Dezenfektan Direnci
2.10.1. Biyofilmlerin konak immün sistemine direnci
Gelişmekte olan ülkelerde enfeksiyon hastalıklarının çoğunu biyofilm ilişkili enfeksiyonlar
oluşturmasına rağmen konak immün cevabı üzerine yapılan çalışmalar sıklıkla konak ve
planktonik mikroorganizmalar arasındaki ilişkiyi aydınlatmaya yöneliktir. Sesil biyofilm
hücreleriyle yapılan immunolojik çalışmalarda konak immün cevabına karşı artmış
dirençten ECM yapısı sorumlu tutulmaktadır [89]. ECM konağın normal fagositik
aktivitesini engelleyerek biyofilmdeki sesil hücre popülasyonunu korumaktadır. Matriks
içine gömülü sesil hücreler, aktif nötrofillerden salınan antibakteriyel peptidler ve toksik
reaktif oksijen türlerinden (ROS) korunmaktadır. Ayrıca sesil hücrelerin immün sistem
tarafından elimine edilememesinde kemotaksi, fagosit göçü ve nötrofil kutuplaşmasını
engelleyen çok sayıda faktöründe rolleri olduğu bildirilmiştir. Konağın sesil biyofilm
hücrelerini eradike edememesi sonucunda inflamatuvar cevap tetiklenerek konakta çok
sayıda doku hasarı meydana gelmektedir [87, 92-96].
2.10.2. Biyofilmlerde antibiyotik direnci
Biyofilmlerin en önemli özelliklerinden biri antimikrobiyal ajanlara önemli ölçüde tolerans
gösterebilmeleridir.
Biyofilmlerin
nozokomiyal
enfeksiyonlardaki
etkin
rolünün
anlaşılmasından sonra araştırmacıların büyük bir kısmı biyofilmlere etkili olabilecek
antimikrobiyal ajanların belirlenmesini amaçlayan çalışmalara yönelmişlerdir [97].
Mikroorganizmaların yüzeylere geri dönüşümlü olarak tutundukları ilk basamakta
antibiyotiklerin organizmalar üzerinde hala etkili olduğu gösterilmiştir. Ancak sonrasında
gerçekleşen geri dönüşümsüz bağlanma, mikrokoloni üremesi ve olgun biyofilmlerin
oluşumuyla sonuçlanan süreçte sesil hücrelerin antibiyotiklere maksimum toleransını
göstermiştir. Antibiyotiklerin biyofilm hücrelerine karşı MİK ve MBK değerleri aynı
hücrelerin planktonik formlarına göre 100-1000 kat daha yüksek bulunmuştur [7, 98].
23
Şekil 2.3. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara direnç mekanizmaları [99]
Biyofilm kaynaklı kistik fibrosis hastalarında kromozomal kodlanan beta-laktamaz
enzimlerinin bakterilerden sentezlenmesi antibiyotik tedavisine yanıttaki başarısızlığın ana
nedenleri arasındadır. Beta laktam antibiyotiği ortama eklendiğinde beta laktamaz
enzimleri sentezlenerek efluks pompalarla beraber veya pompadan bağımsız olarak
antibiyotik direncine neden olmaktadırlar. Ayrıca biyofilmlerin matriks yapısında biriken
beta-laktamaz enzimlerin varlığı antibiyotiklerin henüz daha sesil hücrelere ulaşmadan
hidrolize olmalarına yol açmaktadır. Biyofilmlerin en karakteristik yapılarından biri olan
EPS matriks adeta bir difüzyon bariyeri görevi görerek antibiyotiklerin matrikse gömülü
hücrelere girişini engellemektedir. Biyofilm’in matriks yapıları antimikrobiyal bileşiklerle
reaksiyon vererek ve/veya bileşikleri adsorbe etme yoluyla antimikrobiyal ajanın içeri
girişini kısıtlamaktadırlar. Biyofilmlerin aminoglikozid antibiyotiklerine karşı toleransının,
bu pozitif yüklü antibiyotiklerin negatif yüklü matrikse bağlanarak biyofilm içine sınırlı
penetre olabilmelerinin sonucu olduğu düşünülmektedir [7, 98, 100-102].
Biyofilm yapısı incelendiğinde yüzeylerde oksijen konsantrasyonu, protein sentezi,
metabolik aktivite ve üreme hızı oldukça fazla iken biyofilmin merkezine ve derinlerine
inildiğinde bu faktörlerin neredeyse yok denecek kadar az olduğu saptanmıştır. Bu durum
antibiyotiklere karşı azalmış duyarlılığın sebeplerinden biri olarak açıklanmaktadır [7].
Bakteri toplulukları belirli bir besine karşı açlık çekmeye başladığında üreme hızlarını
yavaşlatarak logaritmik üreme fazından yavaş veya ürememe fazına geçmektedir. Olgun
biyofilm formlarında sık karşılaşılan bu durum genellikle antibiyotiklere karşı direnç
gelişimi ile sonlanmaktadır [99].
24
Biyofilmlerde mikrobiyal heterojenitenin varlığı antimikrobiyal ajanlara karşı oldukça
farklı yanıtların verilmesine neden olmaktadır. Olgun bir biyofilmde besinler, atık ürünler
ve çeşitli sinyal faktörleri ortamda homojen dağılmayıp gradiyentli olarak bulunmaktadır.
Bu durum aynı biyofilm içinde yaşayan sesil hücrelerin farklı çevrelere maruz kalarak
farklı üreme oranlarına sahip olmalarına dolayısıyla farklı antimikrobiyal cevap
geliştirmelerine yol açmaktadır [99].
Horizontal gen transferleri biyofilmlerde yüksek oranda görülen mutasyonların ana
sebebidir. Bu fizyolojik koşullar sesil hücrelerin nasıl kolayca çok ilaca dirençli fenotiplere
dönüşebildiğini, düşük afiniteli antibiyotik hedeflerine, antibiyotikleri parçalayan
enzimlere ve efluks pompalarına sahip olduklarını açıklamaktadır. Kistik fibrosisli hasta
izolatlarından vahşi tip P.aeruginosa bakterilerinin, DNA tamir sistemi için gerekli
genlerinde oluşan mutasyonlar sonucunda, çoklu ilaca dirençli efluks pompası eksprese
eden dirençli suşlara dönüştükleri gözlenmiştir [103, 104]. Ayrıca biyofilmlerde endojen
kaynaklı ROS artışı ve hücrelerde bu zararlı bileşikleri etkisiz hale getirecek antioksidan
mekanizmasında defektler görülmesi, oksidatif stress oluşumuna yol açarak biyofilmlerin
mutasyonlara daha açık hale gelmelerine neden olmaktadır. Biyofilm oluşumundaki
oksidatif stresin antibiyotik direncini tetiklediği ancak antioksidan bileşiklerin ortama
eklenmesiyle direncin azaldığı gözlenmiştir [105].
Mikroorganizmalar biyofilmleri oluşturmak adına belirli bir konsantrasyona ulaştıklarında
‘‘quarum sensing’’ sistemi vasıtasıyla birbirlerini algılayarak virulans faktörlerini
sentezleyen bazı genlerini aktif hale getirirler. P.aeruginosa’nın quarum sensing gen
mutantları ile yapılan çalışmalarda antimikrobiyal tedaviye duyarlılıkta artış gözlenmiştir
[99].
2.10.3. Biyofilmlerde dezenfektan direnci
Dezenfektanlar antibiyotiklerden farklı olarak tüm patojenik mikroorganizmaları inaktive
etmek amacıyla birden fazla hedefe karşı nonspesifik etki gösteren ve cansız yüzeyler
üzerine uygulanan kimyasal ajanlardır. Dezenfeksiyon işlemi yüzeylerdeki biyolojik
kontaminasyonun kontrolü amacıyla medikal, endüstriyel alanda ve evlerimizde yaygın
olarak
kullanılmaktadır.
Ancak
bazı
durumlarda
biyosidlerin
mikrobiyal
kontaminasyonları gidermede etkisiz olabildiği, bunu takiben yüzeyde hala var olan
25
mikroorganizmaların gerek medikal ve gıda alanında gerekse de evsel hijyen açısından
sağlığı tehdit eden önemli problemlere yol açabildikleri belirtilmiştir [106].
Planktonik mikroorgnanizmalara karşı dezenfektan etkinliğinin test edilmesine yönelik çok
sayıda standart rehber yayınlanmış olmasına rağmen biyofilmler için bu standart metotlar
yok denecek kadar azdır. Planktonik hücreler için uygulanan test protokollerinin modifiye
edilmesi ya da son yıllarda ‘‘Avrupa Standartları Test Yöntemi (ASTM no. E2799-11)’’
olarak onay almış minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon yöntemi (MBEK) gibi
özel dizayn edilmiş sistemlerin kullanılmasıyla biyofilmlere karşı antimikrobiyal ajanların
etkinliği test edilebilmektedir [107]. Çizelge 2.1’de en sık kullanılan biyosidler ve bu
biyosidlerin
antimikrobiyal
belirtilmektedir [108].
etkileri,
etki
mekanizmaları,
ve
hücresel
hedefleri
26
Çizelge 2.1. Biyosidlerin hücresel hedefleri ve antimikrobiyal etkileri
Biyosidler
Hücresel Hedef
Izotiyazolin
Organik civa
bileşikleri
Ağır metal tuzları
Hipoklorit
Gluteraldehit
Formaldehit
Kloroasetamid
Sitoplazmik ve membran
bağımlı tiyol içeren enzimler
Hipoklorit
Klorin salan
ajanlar
Hidrojen perosit
Perasetik asit
EDTA
Oksin
Proteinlerin amino grupları
Aminoakridinler
DNA bazları arasında
interkalasyon
Sitoplazmik membrane
bütünlüğü
Membran bağımlı enzim
çevresi ve fonksiyonu
Amino, imino, amid,
karboksil ve tiyol grubu
içeren biyomoleküller
Etki
Mekanizması
Tiyol
gruplarının
oksidasyonu
Hücresel
Alkilasyon
metabolizma ve
reaksiyonu
replikasyonun
inhibisyonu
Olası hücre duvar
hasarı
Metabolik
Halojenizasyon
inhibisyon
Metabolik
inhibisyon
Hücre içeriğinin
salınması
Stres’e aşırı
duyarlılık
Metabolik
inhibisyon
Replikasyon
hasarı
Solunum
inhibisyonu
Hücreiçi
koagülasyon
Serbest radikal
oksidasyon
Metal iyon
şelasyonu
Transmembran pH gradienti
Membran bütünlüğü
Transport,
solunum ve
enerji işleminin
parçalanması
Alifatik alkoller
Membran bütünlüğü
Sızıntı
Anyonik
sürfaktanlar
Sitoplazmik membrane
bütünlüğü
Membran bağımlı enzim
çevresi ve fonksiyonu
Sızıntı
Fosfolipid
tabaka içine
penetrasyon
Fosfolipidlerin
olası
yerdeğişimi
Fosfolipid
solüsyonu
Membranprotein
çözünürlüğü
Kuaterner
amonyum
bileşikleri
Klorheksidin
Polihekzametilen
Biguanidler
Fenol bileşikleri
Zayıf asitler
Paraben
Fenoksietanol
2-Fenil etanol
Enzim ve protein tiyol
grupları
Dış membran bütünlüğü,
Gram negatif hücre duvarı
hedef bölgesi
Metal iyon gerektiren enzim
işlemi
Antimikrobiyal
Etkinlik
Metabolik
inhibisyon
İnterkalasyon
Fosfolipdlerle
elektrostatik
ilişki
Dezenfeksiyona dirençli mikroorganizmalar sıklıkla yüzeylerde oluşan biyofilmlerden
kaynaklanmakta olup bu direnç gelişimi genellikle intrinsik, genetik olarak kazanılmış ya
27
da fenotipik olabilmektedir [109-111]. Biyofilm içindeki ortam koşullarından dolayı sesil
bakteriler ortama fizyolojik adaptasyonlar göstermekte ve bu adaptasyonlar antimikrobiyal
ajanlara gerçek bir direnç oluşumundan ziyade daha az tolerans göstermeyi
tetiklemektedir. Biyofilm modundan planktonik forma geri dönüş sonrasında ise bu
toleransta tekrar artışlar gözlenmektedir [106].
Biyosid aktivitesi mikroorganizmalarda türden türe değişkenlik gösterebileceği gibi bazen
aynı türün farklı suşları arasında dahi farklılıklar gözlenmektedir. Bu değişkenlikler
bakterinin intrinsik direnci denilen ve bakteri hücresini biyosidin etkisinden koruyan
kromozom kontrolündeki özelliğinden kaynaklanmaktadır. Bakteri hücre formları arasında
bakteri endosporları dezenfektanlara en dirençli mikroorganizmlar olup bunu sırasıyla
mikobakteriler, gram negatif bakteriler ve gram pozitif bakteriler takip etmektedir.
Kompleks EPS yapısı biyosidlerin biyofilm içine difüzyonunu ve penetrasyonunu
engelleyerek antimikrobiyal etkinliklerinin azalmasına yol açmaktadır. Biyosidler yüksek
kimyasal reaktif ajanlar olup aktiviteleri ortamda protein, nükleik asit veya karbonhidrat
gibi organik materyaller varlığında olumsuz yönde etkilenmektedir [112]. Ayrıca biyofilm
hücrelerine biyosidlerin penetrastonunu engelleyen diğer faktörler arasında biyosidin
pozitif yüklü olması ve hidrofobik özellik içermesi de sayılabilmektedir. Kuarterner
amonyum bileşiklerinden benzalkonyum klorür (BZK) ile yapılan bir çalışmada, daha uzun
karbon zincirine sahip BZK’nın hidrofobik özelliğinin arttığı ve hidrofilik yapıdaki
biyofilm matriksi içine penetrasyonunun kısıtlandığı belirtilmiştir [113].
Sınırlı penetrasyon durumunda az miktarda antimikrobiyal ajanın biyofilmin derinliklerine
ulaşabilmesi bir süre sonra biyofilmlerin bu ajanların sub-letal konsantrasyonlarına karşı
kazanılmış bağışıklık geliştirmelerine neden olmaktadır. İlk olarak Salmonella
biyofilmlerinde dezenfektanlara karşı kazanılmış bağışıklık durumu bildirilmiştir [114].
Besin, oksijen, üreme oranı vs. gibi çeşitli faktörlerin aynı ortam içinde farklılık göstermesi
sesil hücre topluluklarının ortama farklı fenotipik adaptasyonlar sergilemelerine neden
olmaktadır. Bu durum biyosidlere karşı değişken duyarlılık profili sergileyen hücrelerin
gelişmesiyle sonuçlanmaktadır. Biyosid direnci gözlenen popülasyonda membran
kompozisyonunda değişiklikler ve çeşitli korunma mekanizmaları ile ilişkili genlerin
ekspresyonlarında artışlar gözlenmiştir. Ayrıca popülasyonda korunumlu persister
28
hücrelerin varlığı da fenotipik adaptasyonların bir sonucudur. Bu hücreler genotipik
mutantlar olmayıp antimikrobiyal korunmaya yardım eden fenotipik varyantlardır [115,
116].
Biyofilmlerin yaşam döngülerinde stres cevabı gelişimi önemli bir yer tutmaktadır.
Oksitleyici ajanlara maruz kalmış sesil hücrelerde ajanların zararlı etkilerinden korunmak
için oksidatif stres ile ilişkili genlerin ekspresyonlarının artması buna örnek verilebilir.
Oksidatif stres cevabının düzenlenmesine yönelik araştırmaların çoğunda, biyosidlere karşı
katalaz
ve
süperoksit
dismutaz
gibi
koruyucu
enzimleri
kodlayan
genlerin
ekspresyonlarında artış gözlendiği ve bu genlerin çoğunlukla ‘‘quarum sensing’’
konrolünde olduğu bildirilmiştir [117-122].
Mutasyonlar, kromozomal gen çoğalımı veya plasmid ve transpozon gibi ekstrakromozomal gen determinantlarının edinilmesi sonucunda hücrelerde biyosid toleransında
artışlar gözlenmektedir. Biyofilmlerde bulunan yoğun hücre popülasyonu, matriks varlığı,
ortama çok miktarda DNA salımı gibi faktörler transformasyona veya konjugasyona uygun
ortam hazırlamaktadır. Biyofilmlerde gözlenen farklı genotipik varyantlar stres koşullarına
ve antimikrobiyal ajanlara daha dayanıklı alt popülasyonların oluşmasına neden
olmaktadır. Biyofilm hücrelerinin mutasyona uğrama oranları planktonik formlarına göre
çok daha yüksek bulunmuştur [123-126].
Dezenfektanlarla muamele sonrasında değişken duyarlılık sonuçları elde edilmesinin
sebeplerinden biri biyofilmlerin doğada farklı mikrobiyal türlerin karışımından oluşmaları
ve birbirlerine sinerjistik ya da antagonistik etkileşimler sergilemeleridir. Çalışmaların
çoğunda polimikrobiyal biyofilmlerin dezenfeksiyona karşı monomikrobiyal biyofilmlere
oranla daha dirençli olduğu belirtilmiştir. Bu duruma ilişkin mekanizmalar hala tam
aydınlatılamamışdır. Ancak biyofilmdeki herbir türün sentezlediği polimerler sonucunda
daha vizkoz bir matriks yapısı oluştuğu ve bu yapının biyosidlerin penetrasyonunu azalttığı
önerilen korunma mekanizmalarından bir tanesidir [127, 128].
29
2.11. Polimikrobiyal Biyofilm Eradikasyonunda Alternatif Tedavi Stratejileri
2.11.1. Polimikrobiyal aşılar
Günümüzde geliştirilen aşıların çoğunluğu Koch pastülasını esas alarak monomikrobiyal
enfeksiyonları hedef almaktadır ancak bu aşıların polimikrobiyal enfeksiyonları
önlemedeki etkisinin yetersiz olduğu bilinmektedir. Bir hastalığın polimikrobiyal doğası
aşı geliştirilme sürecinde mutlaka irdelenmesi gereken konular arasındadır. Polimikrobiyal
kökenli bir hastalık söz konusu olduğunda tüm etken türlerin antijenlerinden oluşan
multivalan bir aşı geliştirilmesi o hastalığın önlenmesinde daha garanti olabilir [30].
Polimikrobiyal kaynaklı enfeksiyondan izole edilmiş her bir türün virulan olduğu bilinse
bile ortamda iki ya da daha fazla mikroorganizma biraraya geldiğinde türler arasında
sinerjistik ya da antagonistik etkileşimler gözlenebilmektedir. Periyodontal hastalıklar
polimikrobiyal enfeksiyonların en fazla çalışılmış grubudur. Hastalığın ana etkenlerinden
P.gingivalis türünün diğer türlerle etkileşimleri ve bu etkileşimlerin hastalığın nasıl daha
da ilerlemesine sebep olduğu bilinmektedir. Hayvan deneyi çalışmaları sonucunda
günümüzde P.gingivalis’in dış membran proteinlerini hedef alan rekombinant bir DNA
aşısının var olmasına karşın hala kronik periyodontit enfeksiyonunu önlemeye yönelik
başarılı bir aşının lisansı bulunmamaktadır [129].
Bir patojenin virulans faktörü başarılı bir aşılamayla hedef alınsa bile ortamda bulunan
diğer türler tarafından üretilen virulans faktörlerinin ortak kullanımı sayesinde aşının etkisi
yetersiz kalabilmektedir. Bu sebeple yeni geliştirilecek aşılarda, ortamda varolan ve
sekonder enfeksiyona yol açabilecek tüm türlerin kullanabileceği ortak mikrobiyal
antijenler hedef olarak seçilmeli ve bu şekilde optimizasyon sağlanmalıdır [30].
Otitis media enfeksiyonunu sınırlamak amacıyla kullanılan protein konjuge aşılar (PCV)
ilk olarak 2000 yılında lisans almış olup S.pneumoniae’ya özgül kapsül polisakkaritlerini
içermektedir. Ancak klinik çalışmalar sonucunda bu enfeksiyonun S.pneumoniae,
H.influenza, M.catarrhalis, solunum sinsityal virüs’ü gibi birden fazla mikroorganizma
tarafından geliştirildiği gözlenmiş ve yalnızca S.pneumoniae’ya etkin olan PCV aşılarının
enfeksiyonu önlemedeki etkinliğinin yetersiz olduğu anlaşılmıştır [130]
30
2.11.2. Sinbiyotikler
Sinbiyotikler, insanlar tarafından sindirilebilen ve aynı zamanda yararlı barsak bakterileri
tarafından fermente edilebilen oligosakkaritlerden oluşmuş prebiyotik ve probiyotiklerin
kombinasyonu
olarak
bilinmektedir.
Sinbiyotikler
Lactobacillus
acidophilus,
Bifidobacterium bifidum, Biidobacterium lactis ve sinerji1 prebiyotiklerini içermekte olup
önceki çalışmalarda ülseratif kolit ve Crohn hastalığının tedavisinde kullanılmışlardır.
Günümüzde ise bakteriyel biyofilm oluşumu öncesi ve sonrası sinbiyotiklerle muamele
edildiğinde biyofilm oluşumlarının engellendiğini ya da oluşan biyofilm bakteri sayılarının
azaldığı gösterilmiştir [30, 54, 131, 132].
2.11.3. Faj tedavisi
Fajlar belirli bakteri türlerini enfekte ederek kendilerini çoğaltabilen ve sonrasında enfekte
bakteri hücrelerini lizise uğratarak ortamdaki bakteri popülasyonunu azaltan viruslerdir.
Biyofilm EPS’lerine kolayca yayılabilmeleri, matriksi parçalayabilen depolimeraz enzimi
sentezleyebilmeleri, bakteriye özgül virulans enzimleri sentezleyerek biyofilm yapılarını
parçalayabilmeleri ve polimikrobiyal bir toplulukta yalnızca tek bir mikroorganizmaya
özgül olmalarından dolayı, biyofilm oluşumlarını engellemeye yönelik alternatif tedavi
stratejileri arasında yer almaktadırlar .
Çoklu bakteriyel bir topluluğa bakterisidal etki göstermek amacıyla birden fazla
mikroorganizmaya tropizm gösterebilen faj karışımlarının kulanımı piyasada mevcuttur.
Faj karışımı içeren hidrojel kaplı kateterlerin kullanımı sonucunda kateter yüzeyinde
oluşan Pseudomonas biyofilm hücrelerinin sayısında azalma gözlenmiş ve medikal alet
ilişkili enfeksiyonları azaltmada bu uygulamanın kullanılabileceği vurgulanmıştır. Hayvan
deneyi çalışmalarında yanık enfeksiyonlarında da faj muamelesinin etkili olduğu
gösterilmiştir. Ayrıca fajların antibiyotiklerle kombine kullanımları sonucunda sinerjistik
etkileşimler gözlenmiştir [133-135].
2.11.4. Diğer tedavi yaklaşımları
Endüstriyel ve medikal çevrede gelişen mikrobiyal biyofilmler polimikrobiyal kökenli
olduğundan
dolayı
biyofilmlerin
matriks
yapısında
biyokimyasal
heterojenite
31
gözlenmektedir. Biyofilm matriks’inin kompozisyonuna bağlı olarak proteaz, selülaz,
polisakkarit depolimeraz, aljinat liyaz dispersin B veya DNaz gibi çeşitli enzimler ve
biyosürfaktan ve D-aminoasit gibi küçük moleküller kullanılarak hem yüzeylerden
biyofilmlerin
kaldırılması
hem
de
biyofilm
hücre
kümelerinin
parçalanması
sağlanmaktadır. Piyasada enzim karışımlarını içeren ticari preparatlar bulunmaktadır [106,
136].
Antimikrobiyal etkili aktif maddeleri sayesinde doğada bulunan çok sayıda bitkiden tıbbi
amaçlı faydalanmaktayız. Son zamanlarda birçok aktif bileşiğin antimikrobiyal etkisi
biyofilmler üzerinde denenmiş ve ümit verici sonuçlar elde edilmiştir. Oregano’dan
ekstrakte edilmiş Carvacrol adında doğal bir terpen bileşiği, Brezilya doğal bitkisinden
ekstrakte edilmiş casbane diterpene bileşiği, Nigella sativa tohumundan izole edilen
timokinon bileşiği, ökaliptus yağı, çay ağacı yağı kullanılarak yapılan çalışmalar bu
duruma örnek verilebilir [137-140].
2.12. Polimikrobiyal Biyofilmlerde Gen Ekspresyonunun Yeri: Kantitatif Eş zamanlı
Reverz Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (kantitatif RT-PZR).
Yüzeylere tutunan ve biyofilm oluşturan mikroorganizmalardaki fenotipik değişimlerin
biyofilm oluşumu sırasında değişen gen ekspresyonlarından kaynaklandığı öne
sürülmüştür. Yapılan genetik analizler sonucunda biyofilm oluşumunda birbirinden farklı
çok sayıda genetik faktörün rol oynadığı belirtilmiştir. Bakteriyel bir biyofilmde bazı
genlerin farklı eksprese olduğunu gösteren ilk kanıtlar gen-füzyon çalışmaları sırasında
gösterilmiş ve E.coli bakterilerinin planktonik ve biyofilm formu arasında, genomun
yaklaşık %38’inde farklı ekspresyon profilleri olduğu belirtilmiştir [97, 141-143].
Geçmişten günümüze kadar geçen sürede gen ekspresyonlarını hedef alan kalitatif ya da
kantitatif PZR yöntemleri kullanılarak adezyon, ‘‘quarum sensing’’, metabolizma, stres
cevabı, hücre duvar yapımı vs ile ilişkili pek çok genin biyofilm oluşumu ile ilişkili olduğu
saptanmıştır. Ayrıca nozokomiyal enfeksiyonlar başta olmak üzere pek çok enfeksiyondan
sorumlu tutulan monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilmlerin birbirleriyle tür içi ve
türler arası ilişkileri, bu ilişkilerin mikrobiyal virulans ve enfeksiyon üzerindeki
yansımaları, antibiyotik yada dezenfektanlar gibi antimikrobiyal ajanlara yanıtta etkin rol
oynayan genlerin belirlenmesi gibi farklı amaçlara yönelik çok sayıda ekspresyon saptama
32
temelli moleküler yöntemler uygulanmaktadır.
ROS molekülleri kaynaklı oksidatif stress durumu mikroorganizmaların yaşamında hayati
bir yer kapladığından birçok araştırmacı bu strese karşı mikroorganizmalarda gelişen
cevabı ekspresyon çalışmalarıyla anlamaya çalışmıştır. Hücrelerde oluşan ROS molekülleri
sıklıkla aerobik metabolizma, redoks potansiyeline sahip ilaçlar, iyonize radyasyon ya da
enfeksiyon sırasında insan fagositik hücreleri tarafından ROS bileşiklerinin stimüle olması
gibi durumlarla meydana gelmektedir. Oluşan bu ROS bileşikleri mikroorganizmaların
DNA, RNA, lipid ve protein gibi biyomoleküllerinde hasar oluşturmaktadır. Mikrobiyal
hücreler bu toksik bileşiklerin zaralı etkileinden korunmak amacıyla kendilerince
antioksidan korunma mekanizmaları geliştirmektedirler. İlk olarak E.coli bakterilerinde bu
korunma mekanizmaları detaylı çalışılmış olup sonrasında Pseudomonas başta olmak üzere
pek çok patojende araştırmalar yapılmıştır [144].
P.aeruginosa suşlarının antioksidan sistemleriyle planktonik yaşam formlarında iken veya
insanlarda geliştirdikleri enfeksiyon sırasında gelişen endojen veya ekzojen kaynaklı ROS
bileşiklerinden korundukları bildirilmiştir. Stres cevabı üzerine yapılan çalışmalarda H202
aracılı detoksifikasyon sırasında korunmada rol oynayan bir çok genin transkripsiyonel
OxyR gen regülatörünün kontrolü altında olduğu bildirilmiştir. Bu regülatorün
P.aeruginosa genomunda bulunan katA, katB, ahpB ve ahpC gibi çok sayıda genin
transkripsiyonunu aktive ederek H202 bileşiğine karşı antioksidan aracılı koruma sağladığı.
ayrıca siderofor piyoverdin molekülü aracılı demir alımına ve bir phenazin bileşiği olan
piyosiyaninin üretimine de katkıda bulunduğu gösterilmiştir.
33
Şekil 2.4. P.aeruginosa’da OxyR aracılı oksidatif stres cevabı [144]
Kantitatif eş zamanlı RT-PZR mesajcı RNA (mRNA) ’ların ve gen ekspresyon
seviyelerinin saptanmasında ve sayımında yaygın olarak kullanılan duyarlılığı ve
tekrarlanabilirliği yüksek güvenilir bir yöntemdir. Başarılı bir kantitatif eş zamanlı RTPZR yöntemi için en önemli iki faktör; DNA içermeyen saf mRNA veya intakt total
RNA’nın hücrelerden ekstrakte edilmesi ve bu RNA’lardan reverz transkripsiyon yoluyla
özgül ve hassas tek zincirli komplementer DNA (cDNA) elde edilmesidir [145].
Kantitatif eş zamanlı RT-PCR yöntemi az sayıda mRNA varlığında ya da ilgilenilen RNA
geni düşük seviyelerde eksprese edildiğinde dahi güvenle kullanılabilen bir yöntem olup
polimorfizm ve mutasyonları saptama gibi farklı amaca yönelik çalışmalarda da modifiye
edilerek kullanılmaktadır. Literatürde kantitatif eş zamanlı RT-PCR çeşitleri ile yapılmış
çok sayıda çalışmalar bulunmakta olup bir çalışmadan diğerine göre teknik detaylar
farklılık göstermektedir. Ancak temel mekanizma her yöntem için aynıdır. İlk aşama
RNA’nın
tek
zincirli
kalıp
cDNA’ya
enzimatik
olarak
dönüştürülmesidir.
Oligodeoksinükleotit primer mRNA ile hibridize olarak bağlanır ve RNA bağımlı DNA
polimeraz enzimi yardımıyla uzatılarak PZR yöntemi ile çoğaltılabilen cDNA kopyaları
oluşturulur. İkinci aşamada ise eş zamanlı PZR yöntemi aracılığıyla cDNA dizisine özgül
olarak bağlanan primerler kullanılarak cDNA kopyaları çoğaltılmakta ve ortama eklenmiş
hibridizasyon probları, moleküler boncuklar veya ‘‘Syber Green I’’ gibi DNA boyaları
yardımıyla çoğalan ürünlerin sayıları belirlenmektedir [146].
34
Eksprese olan gen seviyeleri kesin yada göreceli kantitatif eş zamanlı RT-PZR metoduyla
ölçülmektedir.
Kesin
sayım
için;
standart
bir
DNA
molekülünün
bilinen
konsantrasyonlarını baz alan standart kalibrasyon eğrisi kullanılarak ortamdaki net kopya
sayısının verdiği sinyal ölçülmektedir. Ancak ekspresyon çalışmalarında sıklıkla kullanılan
göreceli sayımda, referans (housekeeping) genine karşı hedef genin mRNA ekspresyon
seviyesindeki değişiklik göreceli olarak ölçülmektedir.
35
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Çalışmada Kullanılan Suşlar
Çalışmada Gent Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Laboratuvarı stok standart suşları olan Staphylococcus aureus Mu50 (Metisilin dirençli
S.aureus [MRSA]), Pseudomonas aeruginosa PAO-1 bakteri suşları ve Candida albicans
SC5314
mantar
suşu
kullanılmıştır.
Uygulanacak
yöntemler
öncesinde
her
mikroorganizma için 590 nm dalga boyunda spektrofotometrik ölçümler yapılmış ve
Staphylococcus aureus Mu50 için optik dansite (OD) 0,2, Pseudomonas aeruginosa PAO1 için OD 0,1 ve Candida albicans SC5314 için OD 0,5 olarak ayarlanmıştır. Gerekli
durumlarda mikroorganizmaların belirtilen OD değerlerini içeren süspansiyonları beyinkalp infüzyon sıvı besiyeri ile seyreltilerek son konsantrasyonları ayarlanmıştır.
3.2. Çalışmada Kullanılan Dezenfektanlar
Sodyum hipoklorit (Forever, Courcelles, Belgium), Benzalkonyum klorür (Sigma-Aldrich
Life Science), Dettol (Chloroxylenol, Reckitt Benckiser, Belgium), Etanol (absolute
alcohol, ≥ %99,8, Certa), %30’luk Hidrojen peroksit (Acros, Geel, Belgium), Klorhekzidin
(Fagron, Waregem, Belgium), Setrimit (Certa, Braine-l’Alleud, Belgium), %0,5 Setrimid
ve %0.05 Klorhekzidindiglukan içeren Hastane antiseptik konsantrasyonu [Hospital
Antiseptic Concentrate (HAC; Regent Medical, Manchester, UK)], İzo-betadin (PVP-I,
polyvidoniodine %7,5, Meda Pharma) olmak üzere toplam 9 dezenfektanın etkinliği
çizelge 3.1.’de belirtilen konsantrasyonları ve temas süreleri kullanılarak planktonik ve
biyofilm formları üzerinde uygulanmıştır. Dezenfektanların belirtilen konsantrasyon ve
temas süreleri öncesinde gerçekleştirilen çalışmalar baz alınarak çalışmaya dahil edilmiştir.
Dezenfektanların etkisini nötralize etmek amacıyla sıvı nötralizan besiyeri kullanılmıştır.
Tüm dezenfektan solüsyonları standart sert su [Water Standard Hardness (WSH)]
kullanılarak çalışma öncesinde taze olarak hazırlanmış ve kullanım öncesinde filtre ile
sterilize edilmiştir.
36
Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan dezenfektanlar
Dezenfektanlar
Konsantrasyon (%)
Sodyum hipoklorit (NaOCl)
0,05
Temas süreleri
(Dakika)
5
Benzalkonyum klorit (BzCl)
0,2
15
Dettol (kloroksenol) (DET)
5
5
Etanol (ETOH)
70
2
Hidrojen Peroksit (H2O2)
1,5
30
Klorhekzidin (CHX)
0,4
15
Setrimit (CET)
Hastane Antiseptik
Konsantrasyonu (H.A.C.)
İzobetadin (PVP-I)
0,15
15
1
15
7,5
15
3.3. Standart Sert Su Hazırlanması
Solüsyon A hazırlanması
31,74 gram anhidröz MgCl2
73,99 gram anhidröz CaCl2 bileşikleri distile su içerisinde çözülerek 1 litre’ye tamamlanır.
Otoklavda 20 dakika 1210C’de sterilize edilir.
Solüsyon B hazırlanması
56,03 gram NaHCO3 bileşiği distile su içerisinde çözülerek 1 litre’ye tamamlanır. Filtre ile
sterilize edilir. Solüsyon A’dan 3 ml alınır ve 600 ml steril distile su içine eklenir. Bu
solüsyon’a 4 ml solüsyon B’den eklenir ve total hacim 1 litreye tamamlanır. Solüsyon
filtreden geçirilerek sterilize edilir ve +4 0C’de maksimum 1 ay saklanır.
3.4. Dezenfektanların Planktonik Mikroorganizmalar Üzerindeki Etkisinin Test
Edilmesi
Dezenfektanların planktonik mikroorganizmalar üzerindeki mikrobisidal etkisi Avrupa
standartları (EN 1040) kantitatif süspansiyon testi yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Bu
yöntemde, test mikroorganizmalarımızın yukarıda belirtilen OD değerleri ayarlanıp hem
tek başlarına hem de birbirleriyle ikili ve üçlü kombinasyonları yapılarak tekli ve
polimikrobiyal sıvı kültürleri hazırlanmış ve sonuç olarak yalnızca S.aureus Mu50,
37
P.aeruginosa PAO1 ve C.albicans SC5314’ı içeren monomikrobiyal sıvı hücre
süspansiyonları; S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1, S.aureus Mu50 & C.albicans
SC5314 ve P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC5314 suş kombinasyonlarını içeren ikili
hücre süspansiyonları ve S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC5314’den
oluşan üçlü polimikrobiyal hücre süspansiyonları elde edilmiştir.
3.4.1. Kantitatif süspansiyon testi
Hazırlanan kültürlerden 1’er ml alınan sıvı mikroorganizma süspansiyonları içlerine 1’er
ml steril su yerleştirilmiş olan tüplere aktarılmış ve tüpler hızlıca vortekslenerek
karıştırılmıştır. Tüpler önceden ayarlanmış su banyosunda 20 0C’de 2 dakika boyunca
bekletilmiştir. Süre sonunda bu süspansiyon tüplerine test edilecek tüm dezenfektan
solüsyonlarının 8’er ml’si ayrı ayrı eklenmiş ve vortekslenerek her dezenfektan için
belirlenen temas süreleri boyunca 20 0C’ye ayarlı su banyosu içerisinde bekletilmiştir. Süre
sonunda dezenfektan-mikroorganizma karışımını içeren solüsyonların 1’er ml’si, içerisinde
1’er ml su ve dezenfektan etkisini nötralize edecek olan 8 ml hacimdeki sıvı nötralizan
besiyeri bulunan tüplere aktarılmış ve vortekslenerek 5 dakika boyunca 20
0
C’de
bekletilmiştir. Nötralizasyon süresinin sonunda tüplerden 1’er ml alınarak uygun
dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml
açısından belirlenmiştir.
3.4.2. Deney koşullarının kontrolü / validasyonu
Bu yöntem deney koşullarının validasyonu ve/veya ortamda herhangi bir lethal etkinin
yokluğunu doğrulamak amacıyla uygulanmıştır. Yöntem kantitatif süspansiyon testi ile
hemen hemen aynı koşulları ve basamakları içermekte olup yalnızca test tüplerine 8’er ml
dezenfektan yerine su eklenmiş ve her dezenfektan için belirlenen temas süreleri boyunca
20 0C’ye ayarlı su banyosu içerisinde bekletilmiştir. Süre sonunda nötralizasyon basamağı
uygulanmayıp su-mikroorganizma karışımını içeren solüsyonlardan 1’er ml alınarak uygun
dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml
açısından belirlenmiştir.
38
3.4.3. Nötralizan toksisite kontrolü
Çalışmada kullanılan nötralizanın toksik olup olmadığını göstermek amacıyla nötralizan
kontrol testi uygulanmıştır. Sekiz mililitre nötralizan süspansiyonu ve 1 ml su aynı tüp
içerisinde birleştirilmiş ve üzerine 1 ml mikroorganizma süspansiyonu aktarıldıktan sonra
tüpler vortekslenerek karıştırılmıştır. Bu işlem tüm dezenfektanlar ve mikroorganizmalar
için ayrı ayrı yapılmıştır. Tüpler önceden ayarlanmış su banyosunda 20 0C’de 5 dakika
boyunca bekletilmiştir. Süre dolmadan hemen önce tekrar vortekslenmiş ve süre sonunda
tüplerden 1’er ml alınarak uygun dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle
mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml açısından belirlenmiştir.
3.4.4. Nötralizasyon Yönteminin Validasyonu
Birer mililitre su steril tüpler içine eklenmiş ve üzerine 1’er ml dilüent solüsyonu (BHI)
aktarılmış ve son olarak aynı tüplere 8’er ml test edilecek dezenfektan solüsyonlarından
eklenmiştir. Tüpler su banyosunda 20 0C’de dezenfektanların temas süreleri boyunca
bekletilerek süre dolmadan hemen önce tekrar vortekslenmiş ve süre sonunda tüplerden
1’er ml alınarak içerisinde 8’er ml nötralizan solüsyonu ve 1’er ml su bulunan yeni tüplere
aktarılmıştır. Su banyosunda 20 0C’de 5 dakika bekletilen tüplere süre sonunda 1’er ml
mikroorganizma süspansiyonları eklenmiş ve su banyosunda 20 0C’de 30 dakika boyunca
tekrar bekletilmişlerdir. Süre sonunda tüplerden 1’er ml alınarak uygun dilüsyonlar
yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml açısından
belirlenmiştir.
Planktonik
mikroorganizmalar
üzerine
yukarıda
belirtilen
tüm
test
yöntemleri
uygulandıktan sonra sayım için yapılan plak ekim yöntemlerinde mikroorganizmaların saf
üretilebilmesi için uygun seçici besiyerleri kullanılmıştır. Bu amaçla monomikrobiyal
planktonik hücre süspansiyonlarından C.albicans üretimi için Saboraud dekstroz agar
(SDA), S.aureus ve P.aeruginosa üretimleri için ise triptik soy agar (TSA) besiyeri
kullanılmıştır. Hazırlanan ikili polimikrobiyal planktonik hücre süspansiyonlarından;
C.albicans & S.aureus ikili süspansiyonunda C.albicans ve S.aureus’ un saf kültürleri ve
sayımları amacıyla sırasıyla nitrofurantoin eklenmiş SDA ve amfoterisin eklenmiş TSA
kullanılmıştır. Bir diğer ikili polimikrobiyal planktonik hücre süspansiyonu olan
P.aeruginosa & S.aureus süspansiyonunda P.aeruginosa ve S.aureus’un saf kültürleri ve
39
sayımları amacıyla sırasıyla Setrimid agar ve %7,5 NaCl eklenmiş TSA kullanılmıştır. Son
olarak, S.aureus & C.albicans & P.aeruginosa üçlü planktonik hücre süspansiyonundan
ayrı ayrı C.albicans, S.aureus ve P.aeruginosa saf kültür eldesi içinde sırasıyla
nitrofurantin ve tobramisin eklenmiş SDA, %7,5 NaCl ve amfoterisin eklenmiş TSA ve
Setrimid agar kullanılmıştır. Tüm testler farklı zamanlarda 6 kez tekrar edilerek
uygulanmıştır.
3.5. Mikrobiyal Biyofilmler Üzerinde Dezenfektanların Etkinliğinin Belirlenmesi
3.5.1. Monomikrobiyal ve polimikrobiyal inokulum hazırlanması
Çalışmada kullanılan S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans suşları BHI sıvı besiyerine
ekilip 18-24 saat boyunca 37 0C’de etüvde bekletilerek gün aşırı üremeleri sağlanmıştır.
Ertesi gün üreyen kültürler 5 dakika boyunca 5000 rpm’de santrifüj edilmiştir. Süpernatan
dökülüp üzerine tekrar BHI eklenmiş ve S.aureus için OD 0,2’ye (108 cfu/ml),
P.aeruginosa için OD 0,1’ye (108 cfu/ml), C.albicans için OD 0,5’e (5x106 cfu/m)
ayarlanmıştır. Bakteri süspansiyonları sonrasında monomikrobiyal ve polimikrobiyal
biyofilm modelinde kullanılmak üzere sırasıyla 1/100 ve 1/50 oranında, mantar
süspansiyonu ise 1/50 ve 1/25 oranında dilüe edilmiştir. Böylece çukur içinde bulunan son
inokulüm miktarları Candida albicans SC5314 için 105 cfu/çukur, Staphylococcus aureus
Mu50, Pseudomonas aeruginosa PAO-1 bakterileri için ise 106cfu/çukur olarak
hazırlanmıştır. Sonuç olarak S.aureus Mu50, P.aeruginosa PAO1 ve C.albicans
SC5314’ün tek başlarına oluşturdukları monomikrobiyal biyofilm plakları; S.aureus Mu50
& P.aeruginosa PAO1, S.aureus Mu50 & C.albicans SC5314 ve P.aeruginosa
PAO1&C.albicans SC5314 suş kombinasyonlarından oluşan ikili biyofilm plakları ve
S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC5314’den oluşan üçlü
polimikrobiyal biyofilm plakları hazırlanmıştır. Polimikrobiyal biyofilmde S.aureus ve
C.albicans’ın P.aeruginosa tarafından öldürülmelerini engellemek amacıyla %0, 1, 2, 3 ve
5 oranlarını içeren farklı konsantranlarda sığır serum albümin’i [Bovine serum albumin
(BSA)] besiyeri ortamına eklenmiştir. En uygun bulunan BSA konsantrasyonu
polimikrobiyal biyofilm oluşumu modellerinde S.aureus ve C.albicans üremelerini
arttırmak amacıyla kullanılmıştır [147, 148].
40
3.5.2. Multi-titrasyon plaklarında monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilmlerin
oluşturulması
Mikrotitrasyon plak çukurlarına hazırlanan monomikrobiyal ve polimikrobiyal bakteri ve
mantar süspansiyonlarının 100’er µl’si aktarılmıştır. Test edilecek her dezenfektanın hem
kontrol hem de test örneği için ayrı ayrı toplamda 12 çukur kullanılmıştır. Plaklar 4 saat
boyunca 37 0C’de inkübatör içinde bırakılarak mikroorganizmaların çukur yüzeylerine
tutunmaları sağlanmıştır. Süre sonunda çukurlar serum fizyolojik ile iki kere yıkanmış ve
çukurlara tekrar 100 µl steril BHI broth eklenerek 20 saat daha inkübasyona bırakılarak
biyofilm oluşumları elde edilmiştir.
3.5.3. Biyofilmlerde Dezenfektan Etkinlik Analizi
Mikroorganizma süpernatanları 24 saat sonunda pipet yardımıyla çukurlardan nazikçe
kaldırılmıştır. Tüm çukurlara 100’ er µl fizyolojik su eklenerek iki defa yıkama işlemi
gerçekleştirilmiş, bu sayede yüzeylere tutunmayan mikroorganizmalar ortamdan
uzaklaştırılırken tutunup biyofilm oluşturanların yüzeylerde kalması sağlanmıştır.
Sonrasında tüm çukurlara 120 µl dezenfektan solüsyonlarından eklenmiş ve 2, 5, 15 veya
30 dakika olmak üzere uygun görülen temas süresi boyunca beklenmiştir. Kontrol örneği
için dezenfektan yerine standart sert su çukurlara eklenmiştir.
Nötralizasyon işleminde kullanılan dezenfektana göre farklılık gösteren iki farklı prosedür
uygulanmıştır. CET, CHX, HAC, H2O2 ve NaOCl solüsyonları için dezenfektanla temas
süresi sonunda çukurlara 80’er µl 2,5 kat konsantre DENB nötralizan solüsyonu eklenerek
5 dakika beklenmiştir. DET, ETOH, BzCl ve PVP-I solüsyonları için ise 200’er µl 2,5 kat
konsantre DENB nötralizan solüsyonu eklenerek 5 dakika beklenmiştir. Çukurlarda
bulunan nötralizan işlem sonrası kuyucuklardan kaldırılarak serum fizyolojik ile 2 defa
yıkanmış ve plaklar sonikatörde 5 dakika bekletilerek biyofilm hücelerinin yüzeyden
ayrılması sağlanmıştır. Kuyucuklardaki biyofilm hücre süpernatanları steril tüplere
aktarılarak uygun dilüsyonları yapılmış ve plak döküm yöntemi kullanılarak secilmiş
besiyerlerine ekimleri yapılarak sayılmıştır.
41
Bölüm 3.4.4.’de planktonik mikroorganizmaların saf kültürü ve sayımı için kullanılan
besiyerleri ayrıntılı olarak belirtilmiş olup
monomikrobiyal biyofilm hücrelerinin ve
kombinasyon yapılmış ikili ve üçlü polimikrobiyal biyofilm hücrelerinin ayrı ayrı saf
kültürlerinin eldesi ve sayımı için de aynı besiyerleri kullanılmıştır.
3.6. Kalıntı H2O2 Miktarının Titrimetrik Ölçümü
Yukarıda belirtildiği şekilde oluşturulan 24 saatlik monomikrobiyal Pseudomonas biyofilm
oluşumu ve Pseudomonas, Stafilokok ve Candida’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm
oluşumu, yarım saat boyunca %1,5 H2O2 ile muamele edilmiş ve süre sonunda biyofilm
süpernatanları çukurlardan pipet yardımıyla flakon içine toplanarak filtreden geçirilmiştir.
Steril süpernatanların 1 ml’si alınarak içinde 2ml H2SO4 ve 20 ml distile su bulunan
solüsyonlar içine aktarılmıştır. Solüsyonlarda bulunan H2SO4 hem sesil hücrelerde bulunan
katalaz enzimini inhibe ederek reaksiyonun durdurulmasını hem de ürüne dönüşmeden
kalan H2O2’in stabilitesini sağlamaktadır. Bu yöntemde sesil hücrelerde bulunan kalıntı
H2O2 miktarı titrimetrik olarak ölçülmüştür. Hayli yüksek bir oksitleyici ajan olan H2O2,
redükte bir madde olan permanganat (MnO42-) iyonu ile redoks tepkimesine girer ve
reaksiyonun dengesi 5 mol H2O2 ‘ye 2 mol permanganat olacak şekilde sonuçlanır.
Titrasyon’da 0.002 M permanganat çözeltisi iyon kaynağı olarak kullanılmıştır. Koyu
bordo renkli bu çözelti büret içine hun yardımıyla aktarılmış ve toplam hacmi 23 ml olan
süpernatan-H2SO4 solüsyonu steril bir erlen içine boşaltılarak büret musluğunun altına
yerleştirilmiştir. Permanganat çözeltisi musluğun hafifçe açılmasıyla erlen içine aktarılmış
ve ortam açık pembe renk olana kadar damlatma işlemine devam edilmiştir. Sabit açık
pembe renk elde edildiğinde titrasyon sonlandırılmış ve harcanan permanganat miktarları
belirlenerek hücrelerdeki kalıntı H2O2 miktarı hesap edilmiştir [149].
3.7. Sesil Hücrelerdeki Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Florimetrik Ölçümü
Multititrasyon plaklarında oluşturulan P. aeruginosa’nın olgun monomikrobiyal biyofilm
oluşumları ve P. aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm
oluşumları serum fizyolojik ile yıkama işlemi sonrasında yarım saat boyunca %1,5 H2O2
ile muamele edilmiştir. Kontrol örnekleri için %1,5 H2O2 yerine aynı koşullarda standart
sert su kullanılmıştır. Sesil hücrelerdeki hücre içi ROS birikimi ışığa hassas 2’,7’-
42
dichlorofluoresein diasetat (DCFHDA) boyası (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
kullanılarak florimetrik bir yöntemle ölçülmüştür. Uygulanan bu yöntemde temel
mekanizma; hücre içi geçirgen yapıdaki floresan vermeyen DCFH-DA boyasının hücre
içine difüz etmesi ve burada hücresel esteraz enzimleri aracılığıyla floresan vermeyen 2’,
7’-dichlorodihydrofluorescin (DCFH) bileşiğine dönüşmesi şeklindedir. Sonrasında bu
bileşik ortamda bulunan ROS bileşikleri vasıtasıyla hızlıca oksitlenerek oldukça yüksek
miktarda floresan veren 2’, 7’-dichlorofluorescein (DCF) bileşiğine dönüşmektedir [150].
Dezenfektan eklenmiş biyofilm çukurlarına aynı zamanda deney öncesi taze hazırlanan 10
µM DCFHDA boyası da eklenerek plaklar yarım saat süre ile inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyon sonunda hücrelerdeki floresan miktarı 485 nm (eksitasyon) ve 535 nm
(emisyon) dalga boylarında ölçülmüştür. Elde edilen veriler kontrol biyofimlerinden elde
edilen verilerle karşılaştırlmıştır. Bu boyanın dönüşümü biyofilmlerdeki metabolik açıdan
aktif hücre sayısıyla orantılı olduğundan sonuçlar monomikrobiyal biyofilmdeki
P.aeruginosa’nın ve polimikrobiyal biyofilmdeki P. aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’ın
kültüre edilebilir total hücre sayısına göre normalize edilmiştir. Hücre içi ROS
seviyelerinin ölçümü 3 kez tekrar edilmiştir.
3.8. P. aeruginosa ve S .aureus Sesil Hücrelerindeki Stres ile İlişkili Genlerin
Ekspresyonu
3.8.1. Biyofilmlerden total RNA ekstraksiyonu
Yarım saat süresince %1.5 H2O2 dezenfektan solüsyonuna ve sonrasında nötralizasyon
işlemine
maruz
bırakılmış
P.aeruginosa,
S.aureus
ve
C.albicans’dan
oluşan
polimikrobiyal biyofilm hücreleri ve yalnızca P. aeruginosa ve S.aureus’dan oluşan
monomikrobiyal biyofilm hücreleri mRNA ekstraksiyon işlemi için bölüm 3.5.2.’de
anlatıldığı gibi plak çukurlarından gibi steril falkon tüpleri içine alınmıştır. Kontrol örneği
olarak dezenfektan yerine standart sert su eklenmiş biyofilmler kullanılmıştır. Hücrelerden
total RNA ekstraksiyonu ‘‘SV Total RNA Isolation System’’ (Promega, Fitchburg, WI,
USA) kit’i kullanılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda aşağıda belirtilen protokole
göre uygulanmıştır.
43
‘‘SV Total RNA Isolation System’’ total RNA ekstraksiyon protokolü
a. Santrifüjlenerek çöktürülen biyofilm hücrelerinden 1 ml örnek alınmış ve 1.5 ml
mikrosantrifüj tüpüne aktarılarak 2 dakika 14000 g’de santrifüj edilmiştir.
b. Süpernatanı dikkatlice kaldırılıp kurutulan peletin üzerine final konsantrayonu gram
negatifler için 0.4 mg/ml, gram pozitifler için 3 mg/ml olan 100 µl taze hazırlanmiş lizozim
eklenerek inkübe edilmiştir.
c. Peletin üzerine 75 µl RNA lizis tamponu eklenerek hücreler parçalanmıştır.
d. Üzerine 350 µl RNA seyreltme tamponu eklenerek ependorf alt-üst olacak şekilde
hafifçe çalkalanmış ve yeni mikrosantrifüj tüpü içine aktarılmıştır.
e. Üzerine % 95’ lik etanolden 200 ml eklenmiş sonrasında spin sisteminin içine
aktarılarak 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiştir.
f. Toplama tüpündeki sıvı döküldükten sonra ortama 600 µl RNA yıkama solüsyonunu
eklenmiş ve 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiştir.
g. Toplama tüpündeki sıvı döküldükten sonra her örnek için hazırlanan DNaz inkübasyon
miksinden 50 µl eklenmiştir. DNAaz inkübasyon miksi 40 µl ‘‘Yellow Core’’ tamponu, 5
µl 009M MnCl2, 5 µl DNAaz1 enziminden oluşmaktadır. Onbeş dakikalık bir inkübasyon
işleminden sonra spin sisteme 200 ml DNaz inhibisyon solüsyonu eklenerek 14000 g‘de 1
dakika santrifüjlenmiştir
h. 600 µl yıkama solüsyonu eklenerek tekrar 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiş ve
toplama tüpündeki sıvı döküldükten sonra ortama 250 µl RNA yıkama solüsyonu
eklenerek yüksek hızda 2 dakika santrifüjlenmiştir.
ı. Toplama tüpünde bulunan spin filtre 1,5 ml’ lik elüsyon tüpü içine aktarılmış ve 100 µl
nükleaz içermeyen su membran filtre üzerine aktarılarak 14000 g‘de 1 dakika
santrifüjlenmiş ve filtre sistemden çıkartılarak tüp -80 0C’ ye ayarlı dondurucu içine
yerleştirilmiştir.
44
3.8.2. RNA ekstraktlarının ölçümü ve cDNA elde edilmesi
Ekstrakte edilen total RNA miktarları BioDrop mLITE (BioDrop, Cambridge, UK) cihazı
kullanılarak ölçülmüştür. Ölçülen RNA miktarları biyofilm izolatları için her örnek başına
100 ng/µl olacak şekilde hesaplanmış ve ‘‘qScript cDNA SuperMix’’ (Quanta Biosciences,
Gaithersburg, MD, USA) kit’i kullanılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda
RNA’ların tek zincirli komplementer DNA (cDNA)’ya dönüştürülmeleri sağlanmıştır.
cDNA eldesi için kit’in içerisinde bulunan ve aşağıdaki çizelge 3.2.’ de belirtilen ajanlar
buz üzerinde çözülmüş ve 0,2 ml’lik PCR tüplerine toplam son hacim 20 µl olacak şekilde
uygun hacim ve konsantrasyonda eklenmiştir.
Çizelge 3.2. cDNA sentezinde kullanılan ajanların hacim ve konsantrasyonları
Kit içeriği
qScript cDNA Super Mix (5x)
qScript Reverz Transcriptaz (50X)
Hacim/Reaksiyon
4 µl
1 µl
Son konsantrasyon
1X
2,5X
RNaz/DNaz içermeyen su
Kalıp RNA
Toplam hacim
değişken
değişken
20 µl
1µg-10 pg total RNA
-
Hazırlanan reaksiyon mixleri hafifçe vorteklenip santrifüj edildikten sonra aşağıda
belirtilen programa ayarlanmış termal döngü cihazına yerleştirilmiştir.
§
25 0C
5 dakika
§
42 0C
30 dakika
§
85 0C
5 dakika
§
+4 0C
∞
3.8.3. Real-Time PZR yöntemi ile cDNA’ların çoğaltılması
Real-time PZR reaksiyonu ‘‘PerfeCTa SYBR Green FastMix’’ (Quanta, Biosciences) kit’i
kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Reaksiyonda kullanılan primerlerden oxyR, fpvaI, ahpC,
pvdS ve sodM’e ait olan diziler P.aeruginosa gen bölgeleri için literatürden elde edilmiştir
[144, 151, 152]. KatA ve katB primerlerine ait diziler gen bankasında P.aeruginosa PAO1
45
sekans verileri kullanılarak primer-BLAST aracılığıyla dizayn edilmiştir. Çizelge 3.3.’de
çalışmada kullanılan primerlere ait diziler belirtilmiştir.
Çizelge 3.3. Kantitatif PZR analizinde kullanılan P.aeruginosa PAO1 suşuna ait
primer dizileri
Hedef
Gen
oxyR
katA
katB
sodM
ahpC
pvdS
fpvAI
fabD*
oprM*
Forward primer
Primer sekansı (5’-3’)
Reverz primer
CTCACCGAACTGCGCTACA
GTGCGATCAAGGGCAAACC
GTTGATGTGCGAGGTTTCC
CCTTGCCTTACGCCTACGATG
GCAAGTTCATCGAGGTGACC
GCGTTCTTCAGGCTCCAGTC
CTGCAGCAGTGCGATCAAGGGCAA
GCATCCCTCGCATTCGTCT
CCATGAGCCGCCAACTGTC
CGAGTCGGCCAGCACTT
TTCTTCAGGCTCCAGTCTC
TGTGCGAGGTTTCCACCG
TGCCGCAGCAGACTTTCCA
CTTTCTGGAACTCGCCGTAG
AGTTGATGTGCGAGGTTTCC
GTGGACGTCGCAGGTTCCAGTAGTC
GGCGCTCTTCAGGACCATT
CCTGGAACGCCGTCTGGAT
* house-keeping genleri
Reaksiyon sonrası elde edilen ekspresyon verileri literatürden elde edilen fabD ve oprM
referans genlerine göre normalize edilmiştir [153]. Tüm primerlerin özgüllüğü erime eğrisi
analizi ile değerlendirilmiştir.
S.aureus Mu50 gen bölgeleri için dps, katA, ldhA ve sodA’ya ait olan primer diziler
literatürden elde edilmiştir [154]. AphF ve trxB primerlerine ait diziler gen bankasında
S.aureus Mu50 sekans verileri kullanılarak primer-BLAST aracılığıyla dizayn edilmiştir.
Ekspresyon seviyeleri multi locus sequence typing (MLST) veritabanından seçilen yqi ve
tpi referans genlerine göre normalize edilmiştir. Çizelge 3.4.’de çalışmada kullanılan
primerlere ait diziler belirtilmiştir.
46
Çizelge 3.4. Kantitatif PZR analizinde kullanılan S.aureus Mu50 suşuna ait primer dizileri
Forward primer
ahpF
dps
katA
ldhA
sodA
tpi*
trxB
yqi*
Primer sekansı (5’-3’)
Reverz primer
AATTGCTGCTTCAACCCAG
CACAAAGCTACACAATTTCCACTG
ATGCGCAAAGATATCGATTAGGA
GCAACATGGAAATTCTCTGG
CTGCTGTACGTAATAATGGCGG
TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA
GCTGCAGTATACGCATCACG
CAGCATACAGGACACCTATTGGC
AAAGGTGTTGCATTCTGCCC
ATACATCATCGCCAGCATTACC
TGGTGGCTTTTTATATTCAGGTTG
CAGTCAATACGGCATCTTCAT
ATGTAGTCAGGGCGTTTGTTTTG
TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC
ATTAGCCATTTGACCGCCTG
CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC
* house-keeping genleri
Son hacim 20 µl olacak şekilde kantitatif PZR reaksiyon karışımı aşağıda belirtildiği
şekilde hazırlanmıştır.
§
Forward primer (Sigma)
2 µl
§
Reverz primer (Sigma)
2 µl
§
DEPC
4 µl
§
Syber Green (BR)
10 µl
§
Kalıp cDNA
2 µl
§
Toplam hacim
20 µl
Yukarıda belirtilen reaktifler 0.2 ml hacimli 96 çukurlu steril plaklara aktarılarak reaksiyon
için uygun program girilmiş olan termal döngü cihazına (CFX96 Real Time System; BioRad, Hercules, CA,USA) yerleştirilmiştir. Reaksiyon sonrası elde edilen ekspresyon
verileri literatürden elde edilen fabD ve oprM referans genlerine göre standardize
edilmiştir [153]. Tüm deneyler 3 farklı zamanda tekrar edilmiştir.
3.9. İstatiksel Analizler
İstatiksel veri analizleri SPSS software, versiyon 21 (SPSS, Chicago, IL, USA) programı
kullanılarak yapılmıştır. Verilerin normal dağılımı Shapiro-Wilk testi kullanılarak
doğrulanmıştır. Normal dağılım verileri bağımsız t-testi kullanılarak analiz edilmiştir. Nonnormal dağılım verileri Mann-Whitney test yöntemi ile belirlenmiştir. P değeri <0.05
olarak saptanan farklılıklar istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Gen ekspresyon
47
seviyesi için, p-değeri ≤ 0.01 olarak saptanan, regülasyon oranındaki farklılıkları 2 kat’dan
fazla veya daha az olan sonuçlar anlamlı kabul edilmiştir.
48
49
4. BULGULAR
4.1. Canlı Monomikrobiyal Biyofilm Hücrelerinin Sayımı ve Sığır Serum Albumin ile
Polimikrobiyal Biyofilm Oluşumunun Desteklenmesi
Son inokulüm miktarları C. albicans SC5314 için 105 cfu/çukur, S. aureus Mu50 ve P.
aeruginosa PAO-1 bakterileri için ise 106 cfu/çukur olarak hazırlanan monomikrobiyal ve
polimikrobiyal hücre süspansiyonlar mikrotitrasyon plağı çukurlarına aktarılmış ve olgun
biyofilm oluşumları sağlanmıştır. Olgun monomikrobiyal sesil hücre sayılarına
bakıldığında C.albicans için ~106 cfu/çukur, S.aureus için ~107 cfu/çukur, P. aeruginosa
için ise 107cfu/çukur olacak şekilde yaklaşık 1 log’luk artış gözlenmiştir.
Olgun polimikrobiyal biyofilmin kontrol grubunda yer alan her bir mikroorganizmanın
plak sayım sonuçlarına bakıldığında C.albicans için ~101 cfu/çukur, S.aureus için ~102
cfu/çukur, P. aeruginosa için ise ~106 cfu/ml üreme sayıları elde edilmiştir. S.aureus ve
C.albicans için elde edilen düşük koloni sayıları, bu mikroorganizmaların üremelerinin
ve/veya biyofilm oluşumlarının P.aeruginosa tarafından inhibe edildiğini göstermektedir.
Polimikrobiyal biyofilmlerdeki mikrobiyal hücre sayılarının herhangi bir dezenfektan ajanı
ile temas etmeyen kontrol grubunda dahi ~101 veya 102 cfu/çukur gibi az miktarda
bulunmaları, test gruplarının nitel olarak değerlendirilmeleri açısından problem teşkil
etmektedir. Olgun biyofilm test grubunda bulunan başlangıç mikroorganizma sayısının
dezenfektanla temas öncesinde bu kadar düşük olması dezenfektanların polimikrobiyal
biyofilmler üzerindeki etkinliğinin güvenilir düzeyde belirlenmesi açısından problem
oluşturmaktadır. Ayrıca mikroorganizmaların polimikrobiyal bir ortamda birlikte iken
birbirlerine avantaj sağladıklarını veya tam tersi bir durum olan mikrobiyal birlikteliğin
birbirlerine antagonistik bir etki oluşturduğunu belirleyebilmek için de yine başlangıç
mikroorganizma sayısının düşük olmaması gerekmektedir. Çünkü mikrobiyal birliktelikten
doğan tüm bu olumlu yada olumsuz etkiler dezenfektan ile temas sonrasında her bir
mikroorganizma sayısındaki artış yada azalışa göre belirlenecektir. Bu sebeple ortamdaki
mikrobiyal üreme inhibisyonunu engelleyebilmek ve P.aeruginosa varlığında S.aureus ve
C.albicans’ın üremesini arttırabilmek amacıyla besiyeri içeriğine %0-5 aralığını içeren
BSA ayrı ayrı farklı konsantrasyonlarda eklenmiştir. Şekil 4.1.’de %0, 1, 2, 3 ve 5 BSA
50
ortama eklendiğinde polimikrobiyal biyofilmde birarada bulunan P.aeruginosa, S.aureus
ve C.albicans sesil hücrelerinin cfu/ml sayıları görülmektedir.
Şekil 4.1. Değişen konsantrasyonlarda BSA eklenmiş polimikrobiyal biyofilmlerde
P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans sesil hücrelerinin cfu/ml sayıları
Besiyeri ortamına %5’ lik konsantrasyonda BSA eklenmesi olgun polimikrobiyal biyofilmi
oluşturan tüm mikrobiyal türler için en uygun, ortak konsantrasyon olarak belirlenmiştir.
4.2. Planktonik Mikrobiyal Kültürler Üzerine Dezenfektanların Etkisi
Çalışmamızda kullanılan 9 farklı dezenfektanın P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans
planktonik mikroorganizmalar üzerindeki mikrobisidal etkisi Avrupa standartları (EN
1040) modifiye kantitatif süspansiyon test yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. NaOCl
(%0,05) ve H2O2 (%1,5) solüsyonları haricinde çalışmada kullanılan bütün dezenfektanlar
hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal planktonik hücre kültürlerinin tümü için
etkili bulunmuştur. Dezenfektanların planktonik hücreler üzerindeki % ölüm oranları
çizelge 4.1.’de belirtilmektedir. Sonuçlar ‘‘ölüm oranı yüzdesi’’ olarak hesaplanmış ve
veriler ortalama ± SEM değerleri olarak belirtilmiştir.
51
Çizelge 4.1. Dezenfektanların planktonik kültürler üzerindeki mikrobisidal etkisi
Biyosid
NaOCl
H2O2
BzCl
DET
ETOH
CHX
CET
HAC
PVP-I
S.aureus
Mu50
Mono
Poli
99,99±23
99,99±36
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
P.aeruginosa
PAO1
Mono
Poli
99,98±14 99,84±16
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
C.albicans
SC5314
Mono
Poli
99,96±32
99,99±3,4
100±0
87,50±6,3
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
100±0
Planktonik kültürler üzerine uygulanan modifiye kantitatif süspansiyon testinde deney
koşullarının validasyonu, kullanılan nötralizanın validasyonu ve toksisite kontrolü ayrı ayrı
test edilmiş ve sonuçlar deney koşulları için uygun bulunmuştur.
4.2. Dezenfektan Ajanlarına Karşı Polimikrobiyal Biyofilmlerde Mikroorganizmal
İletişim ve Etkileşimlerin Belirlenmesi
Titrasyon plağı çukurlarında oluşturulan olgun monomikrobiyal ve polimikrobiyal sesil
bakteri ve mantar hücreleri 9 farklı dezenfektan ile test edilmişdir. Dezenfektan ile temas
sonrası biyofilmlerde yaşayan sesil hücreler plak sayım yöntemi ile sayılarak
belirlenmişlerdir.
Çalışmamızda
mantar
ve
bakterilerden
oluşan
ikili
ve
üçlü
polimikrobiyal biyofilmlerdeki mikrobiyal birlikteliğin türlerin yaşamına avantaj sağlaması
ya da dezavantajlı olması veya nötr etki göstermesi durumu araştırılmıştır. Bu amaçla
dezenfektan ajanlarıyla temas sonrası hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal
biyofilmlerde yaşayan hücre sayıları her biyofilm modelinin kendi kontrol grubundaki
canlı hücre sayıları ile karşılaştırılmış ve hücre sayısındaki artış, azalış veya değişmeme
durumu belirtilmiştir. Çalışma sonuçlarımız biyofilm oluşumunda bulunan mikrobiyal sesil
hücrelerin antimikrobiyal ajanlara duyarlılık profillerinin tek bir faktöre bağlı olmadığını;
kullanılan dezenfektana, test edilen mikrobiyal türe ve ortamda başka mikrobiyal
tür/türlerin varlığına bağlı olarak değişkenlik gösterebileceğini vurgulamaktadır.
Şekil 4.2. a’da C.albicans’ın sesil hücreleri gerek S.aureus ve/veya P.aeruginosa ile ikili
gerekse de S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans türleri ile üçlü polimikrobiyal biyofilm
52
oluşumu içindeyken dettol ajanına karşı anlamlı azalmış duyarlılık gösterdiği
görülmektedir. Şekil 4.2. b ve 4.2. c’de, ortamda bulunan mikrobiyal türlere bağlı olarak
sırasıyla CHX ve NaOCl’e karşı P.aeruginosa ve S.aureus monomikrobiyal hücrelerin
duyarlıklarındaki
istatistiksel
anlamlı
artış
görülmektedir.
Şekil
4.2.
d’de
ise
P.aeruginosa’nın ETOH’e karşı sergilediği duyarlılık profilinde, C.albicans ile
oluşturduğu ikili biyofilm modeli haricindeki diğer polimikrobiyal biyofilm modellerinin
hiçbirinde istatiksel anlamlı bir değişim gözlenmediği görülmektedir.
a)
c)
b)
d)
Şekil 4.2. Farklı türden mikrobiyal sesil hücrelerin dezenfektan ajanlarına duyarlılıkları
Çizelge 4.2. ’de hem monomikrobiyal hem de S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans türleri
tarafından oluşturulan üçlü polimikrobiyal biyofilm modelinde dezenfektanların öldürme
oranlarının yüzdesi belirtilmektedir. Monomikrobiyal biyofilm içerisindeki S.aureus sesil
hücreleri CHX, CET ve HAC ajanlarına karşı üçlü polimikrobiyal biyofilm yapısı
içerisinde bulunan S.aureus hücrelerine oranla istatiksel anlamlı olarak daha duyarlı bir
profil sergilemişlerdir. DET ajanına karşı ise tam tersi sonuç alınmıştır (Çizelge 4.2.).
Sonuçlar ‘‘ölüm oranı yüzdesi’’ olarak hesaplanmış ve veriler ortalama ± SEM değerleri
olarak belirtilmiştir.
53
Çizelge 4.2. Dezenfektanların S.aureus-P.aeruginosa-C.albicans türlerinden oluşan
üçlü polimikrobiyal biyofilmleri öldürme oranı yüzdeleri
S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC 5314
Mono S.a
NaOCl
BzCl
DET
ETOH
H2O2
CHX
CET
HAC
PVP-I
90,98±14
99,50±16
99,93±3.1+
6,66±17
71,43±8,9
95,50±3,2
46,35±17
75,01±7,1
99,99±9,7
Poli S.a
96,02±9,7
99,95±16
96,46±4,2
66,07±17a
88,22±9,8
100,00±0 a
95,94±17a
96,14±13 a
100,00±0
Mono P.a
0.00±4.6
72,94±9.1
85,49±8.2
99,04±9.5
0.00±9.3
99,99±2.9
0,00±16
0,00±7.5
100,00±0
Poli P.a
a
98,84±15
75,23±10
99,92±4,7 a
98,92±5,5
96,94±9,1 a
100,00±0 a
49,25±20 a
45,47±13 a
99,72±8,3
Mono C.a
Poli C.a
92,76±2,2
89,51±7,3
99,99±5,6+
54,83±15,2
47,81±6,9
99,91±2,6
0,00±17,8
14,29±3,1
98,83±7,5
95,50±3,0 a
99,31±9,9 a
99,25±3,4
88,04±18,5
82,57±8,3 a
100,00±0 a
53,38±12 a
43,04±10 a
100,00±0 a
a
Polimikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü monomikrobiyal’e oranla
daha fazla saptanmıştır (p < 0.05)
+
Monomikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü polimikrobiyal’e oranla
daha fazla saptanmıştır (p < 0.05)
NaOCl, DET, H2O2, CHX, CET ve HAC ajanlarına karşı P.aureginosa sesil hücreleri
monomikrobiyal biyofilmlere oranla üçlü polimikrobiyal biyofilm yapısı içerisinde iken
istatiksel anlamlı olarak daha duyarlı bir profil sergilemişlerdir (Çizelge 4.2.).
C.albicans’ın sesil hücrelerinin polimikrobiyal biyofilm içinde iken NaOCl, BzCl, H2O2,
CHX, CET, HAC ve PVP-I ajanlarına monomikrobiyal biyofilmdeki hücrelere göre daha
duyarlı bir profil sergilerken, DET ajanına karşı daha az duyarlı bulunmuşlardır (Çizelge
4.2.).
Çalışmamızda bakteri ve mantar suşları tarafından oluşturulan ikili polimikrobiyal
biyofilm modelleri de geliştirilmiş olup dezenfektanların biyofilmler üzerindeki öldürme
yüzdeleri belirlenmiştir. Buna ilaveten mikroorganizmaların bu ikili biyofilm oluşumları
içerisindeki birlikteliklerinin dezenfektanlardan korunmada rol oynayıp oynamadığı
belirlenmeye çalışılmıştır (Çizelge 4.3).
S.aureus sesil hücreleri tek başlarına oluşturdukları biyofilm oluşumuna oranla S.aureus ve
C.albicans ikili biyofilmi içerisinde iken NaOCl, CHX, ETOH ve HAC ajanlarına daha
duyarlı bulunmuştur. C.albicans ise NaOCl, BzCl ve PVP-I ‘ye karşı ikili biyofilm içinde
iken anlamlı oranda daha duyarlı ancak DET ve ETOH’a daha az duyarlı olarak
saptanmıştır. Sonuçlar istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur (Çizelge 4.3).
54
Çizelge 4.3. Dezenfektanların S.aureus-C.albicans ve S.aureus-P.aeruginosa ikili
polimikrobiyal biyofilmlerini öldürme oranı yüzdeleri
NaOCl
BzCl
DET
ETOH
H 2O 2
CHX
CET
HAC
PVP-I
S.a
Mu50
Mono
C.a
SC5314
Mono
P.a
PAO1
Mono
S.aureus &
C.albicans
Poli S.a
Poli C.a
S.aureus &
P.aeruginosa
Poli S.a
Poli P.a
90,98
99,50
99,93
6,66
71,43
95,50
46,35
75,01
99,99
92,76
72,94
99.99
99,04
47,81
99,91
0,00
47,81
98,83
0,00
89,51
85,49
54,83
0.00
99,99
0,00
0,00
100,00
99,97*
99.78
78,66
96,85*
67,14
99,59*
80,26
94,46*
100,00
92,75
99.97
98,20*
43,26
85,13
100,00*
90,17
97,35*
100,00
99,10*
92.72*
91,93+
98,83+
61,14
99,99
37,52
90,94
99,97*
98,35*
91.16*
99,96*
98,37
98,64*
100,00*
95,31*
96,92*
99,99
*
Polimikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü monomikrobiyal’e oranla
daha fazla saptanmıştır (p < 0.05)
+
Monomikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü polimikrobiyal’e oranla
daha fazla saptanmıştır (p < 0.05)
S.aureus ve P.aeruginosa ikili biyofilm yapısı içerisinde bulunan P.aeruginosa sesil
hücreleri NaOCl, BzCl, H2O2, DET, CHX, CET ve HAC ajanlarına, P.aeruginosa
monomikrobiyal biyofilm hücrelerinden daha duyarlı bulunmuştur. S.aureus’un ise CHX
ve HAC’a karşı ikili biyofilm içinde iken daha duyarlı iken DET’e karşı daha az duyarlı
olduğu saptanmıştır. Sonuçlar istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur (Çizelge 4.3).
4.3. Rezidual Hidrojen Peroksit’in Ölçümü
Yalnızca P.aeruginosa suşlarından oluşan biyofilm hücreleri ve S.aureus, P.aeruginosa ve
C.albicans’ın oluşturduğu polimikrobiyal biyofilm hücreleri %1,5’luk H2O2 ajanı ile yarım
saat muamele edilmiş ve sonrasında biyofilm süpernatanlarında bulunan kalıntı H2O2
miktarı titrimetrik olarak belirlenmiştir. Kalıntı H2O2 miktarı; P.aeruginosa biyofilminde
0,015 ± %0,007 (ortalama ± SEM), S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans’dan oluşan
polimikrobiyal biyofilmde ise 0,035 ± %0,027 (ortalama ± SEM) olarak belirlenmiştir.
Elde edilen bu sonuçlar neticesinde her iki biyofilm modeli arasında kalıntı H2O2 miktarı
açısından istatistiki olarak anlamlı fark bulunmamıştır.
55
4.4. Biyofilmlerde ROS Birikiminin Belirlenmesi
Yarım saat boyunca %1,5’ lik H2O2 ile muamele edilen P.aeruginosa’nın monomikrobiyal
ve S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans’ın oluşturduğu polimikrobiyal biyofilm
hücrelerindeki ROS miktarları DCFHDA boyası kullanılarak florimerik ölçülmüştür.
Kontrol grupları ile kıyaslandıklarında test grubu örneklerinden hem P.aeruginosa
monomikrobiyal hücrelerde hem de üçlü polimikrobiyal sesil hücrelerde ROS birikiminin
istatiksel anlamlı olarak artmış olduğu gözlenmiştir (p ≤ 0.05). Test gruplarının
monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilm hücrelerinde ROS birikimi bakımından
farklılık gözlenmiş ancak bu fark istatiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.05).
Kontrol gruplarında ise monomikrobiyal biyofilmdeki bazal ROS seviyesi polimikrobiyale
oranla daha yüksek olarak ölçülmüş ve bu fark istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p ≤
0,05) (Şekil 4.3).
Şekil 4.3. H2O2 ile muamele sonrası olgun biyofilmlerdeki ROS seviyelerinin ölçümü.
Veriler en az 24 çukurda oluşturulmuş biyofilm örneklerinin 3 bağımsız
tekrarını içeren ortalama ve SEM değerlerini belirtmektedir.
Veriler 1000 canlı hücredeki floresan miktarına göre standardize edilmiştir..
4.5. Oksidatif Stres ile İlişkili Gen Ekspresyon Seviyelerinin Belirlenmesi
Pseudomonas aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm
hücreleri ve yalnızca P. aeruginosa ve S.aureus’dan oluşan monomikrobiyal biyofilm
56
hücreleri peroksit ajanı ile muamele edilmiş ve sonrasında uygulanan nötralizasyon
basamağıyla da antimikrobiyal ajanın aktivitesi nötralize edilmiştir. Hem yalnızca S.aureus
ve P.aeruginosa’dan oluşan ayrı ayrı monomikrobiyal hücre örneklerindeki hem de bu iki
bakteri türününde içinde bulunduğu üçlü polimikrobiyal biyofilm hücre örneklerindeki
oksidatif stress ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri kantitatif eş zamanlı RT-PZR
yöntemiyle belirlenmiştir. Kontrol grubu olarak %1,5’ lik H2O2 yerine standart sert su ile
muamele edilen biyofilm örnekleri test edilmiştir.
Şekil 4.4. S.aureus ve P.aeruginosa’nın stres ile ilişkili gen ekspresyonlarının değişimleri
Pseudomonas aeruginosa için oksidatif stress ile ilişkili genler olarak oxyR,
katA, katB, ahpC, pvdS, fpvaI ve sodM bölgelerinin ekspresyon seviyeleri her iki biyofilm
modeli (monomikrobiyal P.aeruginosa hücreleri ve polimikrobiyal biyofilm hücreleri) için
belirlenip birbirlerine göre karşılaştırılmıştır. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda yer alan
P.aeruginosa sesil hücrelerinin katalaz enzimini kodlayan katA, katB genleri, bir siderofor
reseptörünü kodlayan fpvaI geni ve oksidatif stress’e karşı korunma mekanizması genlerini
regüle eden oxyR geni monomikrobiyal sesil hücrelere göre daha fazla eksprese olmalarına
rağmen bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.). Sırasıyla
alkil-hidroksi peroksidaz enzimini ve hücreye demir alımı ve salınımını sağlayan
sideroforlardan piyoverdin’i kodlayan ahpC ve pvdS genlerinin regülasyonlarında
monomikrobiyale oranla polimikrobiyal sesil P.aeruginosa hücrelerinde istatistiksel olarak
anlamlı olmayan azalışlar saptanmıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.).
Staphylococcus aureus için oksidatif stress ile ilişkili dps, katA, soda, ldhA, trxB ve ahpF
genlerinin ekspresyon seviyeleri S.aureus monomikrobiyal hücreleri ve polimikrobiyal
57
oluşumdaki sesil S.aureus hücreleri için belirlenip birbirleriyle karşılaştırılmıştır.
Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda yer alan S. aureus hücrelerinin ldhA ve trxB genleri
monomikrobiyal sesil hücrelere göre daha fazla eksprese olmalarına rağmen bu artış
istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.). Süperoksit dismutaz ve
katalaz gibi enzimleri kodlayan soda, katA ve dps genlerinin ekspresyonlarında ise
monomikrobiyal’e oranla polimikrobiyal sesil S.aureus hücrelerinde istatistiksel olarak
anlamlı olmayan azalışlar saptanmıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.).
58
59
5. TARTIŞMA
Biyofilmlerin insan vücudunda gelişen mikrobiyal enfeksiyonların çoğunluğundan sorumlu
olduğu bilinmektedir. Hastalara takılan medikal cihazların uzun sureli ve yoğun kullanımı
biyofilm oluşumu için uygun koşulları sağlamaktadır. Biyofilmlerin insan vücudundaki
enfeksiyonların %80’ini oluşturduğu tahmin edilmektedir. Günümüzde tanımlanan
biyofilm enfeksiyonlarının çoğunun polimikrobiyal olduğu çeşitli kronik enfeksiyonlardan
ve yabancı cisim enfeksiyonlarından sıklıkla izole edilmeleri sonucunda anlaşılmıştır.
Candida albicans kan dolaşımı enfeksiyonlarında dördüncü en sık izole edilen patojen
olup en yüksek ölüm oranı ile ilişkili bulunmaktadır. Kandida kökenli nozokomiyal kan
dolaşımı enfeksiyonlarının %27’ sinin S.aureus ile birliktelik içinde bulunan
polimikrobiyal kaynaklı enfeksiyonlar olduğu bildirilmiştir. C.albicans biyomateryaller
üzerine sıkıca tutunarak kolaylıkla biyofilm oluşturabilmekte ve ortamda bulunan S.aureus
türü bakterileri genellikle C.albicans’ın hiflerine tutunarak polimikrobiyal biyofilm
yapısını oluşturmaktadır. Ayrıca pek çok enfeksiyondan C.albicans ve P.aeruginosa’nın
aynı anda izole edilmesi hastalıklarda bu iki mikroorganizmanın birlikte rol oynadığını
göstermiştir [155].
Çalışmamızda
C.albicans,
S.aureus
ve
P.aeruginosa
standart
suşları
ile
hem
monomikrobiyal hemde ikili ve üçlü polimikrobiyal biyofilm modelleri 96 çukurlu mikrotitrasyon plaklarında başarıyla geliştirilmiştir. Üçlü biyofilm modeli oluşturulurken
başlangıçta S.aureus ve C.albicans üremesinin P.aeruginosa tarafından baskılandığı
gözlenmiş ancak sonrasında ortama %5 BSA eklenmesiyle bu problem ortadan
kaldırılmıştır (Şekil 4.1.) [156].
Bir serum proteini olan albumin’in serbest hidroksil ve sülfidril gupları sayesinde ortamda
varolan toksik ROS bileşiklerini yakalayarak hücrelerin ROS tarafından apoptozisini
engellediği bilinmektedir. Antioksidan rolü olduğu bilinen BSA ile yapılan bir başka
çalışmada ise yüksek demir konsantrasyonu varlığında tetiklenen hücre membranı lipid
peroksidasyonunun ortama BSA eklenmesiyle inhibe olduğu gözlenmiştir. Yapılan
çalışmalarda ayrıca BSA’nın ortamda fazla miktarda bulunan demir şelatlarına
elektrostatik olarak bağlanıp hücre membranından uzak kalmalarını sağlayarak demir
aracılı membran lipid peroksidasyonunu engelledikleri de gösterilmiştir [157, 158].
60
Piyosiyanin, P.aeruginosa tarafından üretilen bir fenazin olup oksijen molekülünü zararlı
oksijen derivatiflerine (O2-) ve H2O2’e indirgemektedir. Ayrıca piyosiyanin varlığının
hücrede ferrik demir birikiminden sorumlu spesifik genlerin regülasyonunu arttırdığı da
bildirilmiştir [159].
Çalışmamızda başlangıçta S.aureus ve C.albicans üremelerinin P.aeruginosa tarafından
inhibe edildiği gözlenmiş ancak ortama %5 BSA eklenmesiyle bakterilerin yeniden ürediği
görülmüştür. BSA’nın yukarıda belirtilen ROS aracılı hücre apoptozisini engellemesi veya
demir aracılı lipid peroksidasyonunu inhibe etmesi gibi çeşitli koruma mekanizmaları
sayesinde P.aeruginosa tarafından üretilen piyosiyaninin zararlı toksik etkilerini ortadan
kaldırmış olabileceği düşünülmektedir Bu sebeple de ortama BSA eklenmesiyle
başlangıçta Pseudomonas kaynaklı piyosiyanin bileşiği tarafından engellenen bakteriyel ve
fungal üremelerin yeniden aktive olduğu varsayılmaktadır [156].
Polimikrobiyal biyofilmlerin eradike edilmeleri monomikrobiyal biyofilmlere oranla çok
daha karmaşık ve zor olduğundan klinik uygulamalarda polimikrobiyal biyofilm kaynaklı
enfeksiyonların tedavisi için gerekli antimikrobiyal ajan seçimi de zor olmaktadır. Bu
sebeple polimikrobiyal biyofilmler için uygulanabilecek yeni tedavi stratejilerini içeren
açıklama raporlarına acil ihtiyaç duyulmaktadır [160].
Nozokomiyal
enfeksiyonların
genellikle
endojen
veya
ekzojen
kaynaklı
mikroorganizmalar tarafından geliştiği ve kan, tükrük, idrar ve diğer vücut salgılarının
çevreye olası yayılmaları sonucunda mikroorganizmaların etrafı kontamine ederek bu
enfeksiyonların gelişimine yardımcı oldukları bilinmektedir. Bu sebeple hastalıkların
önlenmesinde dezenfeksiyon ve sterilizasyon prosedürleri oldukça önemli olup özellikle
medikal alet kaynaklı biyofilm enfeksiyonlarının önlenmesinde olmazsa olmaz işlemler
arasında yer almaktadır. Dezenfeksiyon işlemi hasta ve yüzeyler arasında direkt veya
indirekt temasdan kaynaklanan çapraz kontaminasyonların önlenmesi açısından da oldukça
önem taşımaktadır. Sağlık bakım merkezlerinde yüzey kontaminasyonlarının kaynağının
genellikle
yüzeylerde
oluşan
biyofilmler
olduğu
bilinmektedir.
Biyofilmlerdeki
mikroorganizmaların öldürülmesi için kullanılan dezenfektan ajanların temas sürelerinin
mikroorganizmaların planktonik formlarından on, yüz ve bazen bin katı oranında daha
fazla olduğu literatürdeki çalışmalarda yer almaktadır [161].
61
Çalışmamızda S.aureus ve P.aeruginosa suşlarının ve C.albicans suşunun planktonik ve
biyofilm formları 9 farklı dezenfektana karşı duyarlılık profillerini belirlemek amacıyla
test edilmiştir. Sonuçlarımız test edilen dezenfektanların hemen hemen hepsinin,
planktonik mikrobiyal hücre sayılarında % 99,999’dan daha fazla azalma sağlayarak
oldukça etkin bir mikrobisidal aktivite sergilediklerini göstermiştir. Ancak bu
dezenfektanlar mono veya polimikrobiyal biyofilmlere uygulandıklarında çok azının
planktonik formlar üzerinde olduğu gibi güçlü mikrobisidal aktiviteye sahip olduğu
gözlenmiştir (Çizelge 4.1.).
Literatürdeki çalışmalara bakıldığında polimikrobiyal biyofilmlerin monomikrobiyallere
göre antimikrobiyal ajanlara karşı sıklıkla daha azalan bir duyarlılık gösterdikleri
belirtilmiştir [63, 79]. S.aureus ve C.albicans ile yapılan ikili biyofilm çalışmasında
S.aureus’un tek başına iken serum ortamında zayıf bir biyofilm oluşturduğu ve
vankomisine karşı daha duyarlı olduğu gözlenmiş, ancak C.albicans ile birlikte iken çok
daha sağlam bir biyofilm oluşumu ve vankomisine artmış direnç bildirilmiştir. Ayrıca aynı
çalışmada biyofilmlerin matriks boyası ile boyanması sonucunda S.aureus hücrelerinin
etrafında antimikrobiyal dirence yol açtığı düşünülen, C.albicans tarafından üretilmiş
matriks ile kaplı bir halo yapısı gözlenmiştir. S.epidermidis ve C.albicans ile yapılan başka
bir çalışmada da vankomisine karşı aynı sonuç alınmıştır [63, 162].
Simoes ve arkadaşları çalışmalarında 6 farklı bakteri türü tarafından oluşturulan mono ve
polimikrobiyal biyofilmlerin sodyum hipoklorite karşı duyarlılıklarını belirlemişlerdir.
Sonuçlarda Acinetobacter calcoaceticus’unda içinde bulunduğu 6 farklı türün oluşturduğu
polimikrobiyal biyofilmin sodyum hipoklorit ajanına en yüksek direnci gösterdiği, ancak
A.calcoaceticus’u içermeyen polimikrobiyal biyofilmin bu ajana monomikrobiyal
biyofilmlerden bile daha duyarlı bulunduğu belirtilmiştir. Bu çalışmayla A.calcoaceticus’
un aynı biyofilm ortamında iken diğer türlerin antimikrobiyal ajanlardan korunmasına
yardımcı olduğu sonucuna varılmıştır [163].
Hastalara uygulanan kateterlerin sterilizasyonunda kateter lümeni içine antimikrobiyal sıvı
solüsyonların aktarılması günümüzde antimikrobiyal kapama terapisi olarak bilinmektedir.
Kateter lümen yüzeyinin sterilize edilmesini veya biyofilm oluşumunun engellenmesini
amaçlayan bu uygulama in vitro da monomikrobiyal biyofilmler üzerinde uygulanmış
ancak polimikrobiyal biyofilmler üzerindeki etkilerini gösteren çok az sayıda çalışma
62
bulunmaktadır. Peter ve arkadaşları etanolün olası kateter kapama solüsyonu olarak
kullanılabileceğini göstermeyi amaçladıkları çalışmalarında C.albicans ve S.aureus
türlerinden oluşan polimikrobiyal ve monomikrobiyal biyofilmlerde etanole ajanına
duyarlılıkta, her iki biyofilm modelindeki sesil hücreler arasında anlamlı bir fark olmadığı
gözlenmiştir. Ayrıca biyofimde C.albicans’ın üremesinin engellenmesi ve etkin olarak
öldürülmesi için %30’luk etanol ile 4 saatlik inkübasyon yapılması gerekirken S.aureus
için %50’lik ethanol solüsyonunun kullanılması gerektiği bildirilmiştir. [164].
Çalışmamızdan elde edilen sonuçlar bazı literatür çalışmalarında öne sürülen,
monomikrobiyal biyofilmlerin polimikrobiyallere göre antimikrobiyal ajanlara karşı daha
duyarlı olduğu hipotezini desteklememektedir. Sonuçlarımızda antimikrobiyal ajanlara
karşı duyarlılığın kullanılan dezenfektana ve test edilen mikroorganizmaya ve ortamda
bulunan mikrobiyal tür/türlerin çeşidine bağlı olarak değişebileceğini göstermiş
bulunmaktayız (Şekil 4.2.). Nitekim, polimikrobiyal biyofilm oluşumunda bulunan
S.aureus sesil hücrelerinin hastane antiseptik konsantrasyonu, setrimid ve klorhekzidin
dezenfektanlarına daha duyarlı iken, dettol ajanına daha az duyarlı bulunması veya
uygulanan diğer dezenfektanlara karşı monomikrobiyal sesil hücrelerle aynı duyarlılık
yanıtını sergilemesi bu duruma örnek olarak verilebilir (Çizelge 4.2.) [156].
Literatür bulgularında P.aeruginosa ile aynı mikrobiyal ortamı paylaşan S.aureus
bakterilerinin çeşitli antimikrobiyal ajanlara P.aeruginosa tarafından üretilen HQNO
bileşikleri sayesinde daha yüksek düzeyde direnç geliştirdikleri gözlenmiştir [79]. Harriot
ve Nover tarafından 2009 yılında gerçekleştirilen çalışmada, C.albicans suşlarının
S.aureus hücrelerini çevreleyen matriks yapılarını üreterek S.aureus bakterileri üzerinde
koruyucu bir role sahip oldukları belirtilmiştir [63]. Çalışmamızda S.aureus sesil hücreleri
polimikrobiyal biyofilm içinde iken bazı dezenfektanlara karşı daha duyarlı profil
sergilemişlerdir. Ancak S.aureus’un antimikrobiyal ajanlara daha duyarlı bir profil
sergilemesine neden olan mekanizma/mekanizmalar henüz bilinmeyip bu mekanizmaların
aydınlatılması uygun hijyen prosedürleri ve başarılı tedavinin gerçekleştirilmesi açısından
oldukça önem taşımaktadır.
Candida albicans sesil hücrelerinin tek başlarına bulundukları monomikrobiyal
biyofilmlere oranla üçlü polimikrobiyal biyofilm oluşumu içindeyken etanol ve dettol
ajanları haricindeki tüm dezenfektanlara daha duyarlı bulunmuşlardır (Çizelge 4.2.).
63
Polimikrobiyal biyofilm modelinin kontrol grubunda, yalnızca C.albicans suşundan oluşan
monomikrobiyal biyofilm kontrol grubuna oranla C.albicans hücre sayısında 1 log’ luk
azalma gözlenmiştir. Bu azalmanın sebepleri arasında P.aeruginosa tarafından üretilen
fenazin toksininin ortamda reaktif oksijen türlerinin artışına yol açarak mantar hücrelerinin
ölümüne neden olması düşünülebilir [139]. Ancak bu toksinin, C.albicans sesil
hücrelerinin polimikrobiyal biyofilm oluşumunda iken dezenfektanlarla temas sonrası bu
ajanlara daha duyarlı profil sergilemelerine yol açıp açmadığı henüz bilinmemektedir.
Pseudomonas aeruginosa sesil biyofilm hücreleri NaOCl, DET, H2O2, CHX, CET ve HAC
ajanlarına karşı üçlü polimikrobiyal biyofilm oluşumu içindeyken daha duyarlı
bulunmuşlardır. P.aeruginosa hücrelerinin monomikrobiyal biyofilm içindeyken H2O2
ajanından hiç etkilenmemesi (%0) ancak polimikrobiyal yapı içindeyken % 96.94 oranında
bir hücre ölümü gözlenmesi çalışmamızın çarpıcı sonuçlarından birisidir (Çizelge 4.2.).
Polimikrobiyal biyofilm yapısı içerisindeyken H2O2 ajanına karşı edinilen mikrobiyal
korunma mekanizmalarından bir tanesinin difüzyon etkileşimi olduğu düşünülmektedir
[156].
H2O2 bileşiğinin henüz biyofilm içine penetre olamadan biyofilm yüzeyinde bulunan
katalaz enzimleri vasıtasıyla hızlıca nötralize edildiği bilinmektedir [165]. Çalışmamızda
polimikrobiyal biyofilm yapısındaki Pseudomonas sesil hücrelerinin H2O2 ajanına karşı
azalmış duyarlılıklarından sorumlu mekanizma/mekanizmaları, hücrelerde bulunan kalıntı
hidrojen peroksit miktarının ve hücrelerde biriken ROS seviyelerinin ölçülmesiyle ve
oksidatif stres ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerinin belirlenmesiyle açıklanmaya
çalışılmıştır.
Monomikrobiyal Pseudomonas biyofilm süpernatanından ölçülen kalıntı hidrojen peroksit
miktarı, ne polimikrobiyal biyofilm süpernatanında ne de kontrol grubu süpernatanında
ölçülen miktardan istatiksel olarak farklı bulunmamıştır. Bu sonuçlar test edilen tüm H2O2
miktarının her iki biyofilm modelinde de enzimler aracılığıyla tamamen parçalandığını
göstermektedir.
Pseudomonas aeruginosa aerobik solunum yoluyla metabolik enerjilerini sağlamaktadırlar.
Membran aracılı bu solunum işlemi sırasında kontrolsüz elektron aktarımlarından dolayı
hücre içinde hidrojen peroksit, super oksit anyonları ve hidroksi radikalleri gibi çeşitli
64
toksik reaktif oksijen bileşikleri oluşmaktadır. Ayrıca ortamda bulunan demir iyonlarınında
(Fe+2 ve Fe+3) zararlı hidroksil radikallerinin oluşumunu stimule ettiği bildirilmiştir [151].
Çalışmamızda H2O2 ile biyofilm hücreleri endojen olarak muamele edilmişlerdir.
Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda Pseudomonas sesil hücrelerinde hidrojen peroksite
karşı duyarlılığın sebebinin hücrede biriken toksik etkili ROS bileşikleri olabileceği
düşüncesiyle monomikrobiyal Pseudomonas sesil hücrelerinden ve polimikrobiyal
hücrelerden ROS ölçümü yapılmıştır. Hidrojen peroksit ile muamele edildikten sonra
biyofilm hücrelerinde ölçülen ROS miktarı açısından her iki biyofilm modelinde de
anlamlı fark bulunmamıştır. Bu sonuçlar biyofilmde birden fazla mikrobiyal türün birarada
bulunmasının ROS üretimine ayrıca bir katkı sağlamadığını göstermektedir. Ayrıca
Pseudomonas sesil hücrelerinin peroksit ajanına karşı saptanmış olan duyarlılıklarında
ROS üretiminin muhtemel bir rolü olmadığı da görülmektedir. Kontrol gruplarına
bakıldığında ise monomikrobiyal biyofilmdeki bazal ROS seviyesinin polimikrobiyale
oranla daha yüksek bulunduğu ve bu yüksek miktarın istatistiksel olarak anlamlı olduğu
bulunmuştur (Şekil 4.3.).
Son olarak oksidatif etkili hidrojen peroksite artmış duyarlılıkta genotipik faktörlerin rol
oynayabileceği düşünülmüştür. Bu sebeple oksidatif stres ile ilişkili genlerdeki ekspresyon
seviyeleri hem P.aeruginosa’nın hem de S.aureus’un mono ve polimikrobiyal biyofilm
hücrelerinden ayrı ayrı ölçülmüştür (Şekil 4.4.). Toksik bir oksijen derivatifi olan H2O2 ve
benzeri ajanlara karşı bakterilerin çeşitli korunma mekanizmaları geliştirdikleri
bilinmektedir. İlk aşamada bakterilerin sodA ve sodB genleri tarafından kodlanan
süperoksit dismutaz enzimleri aracılığıyla toksik süperoksit anyonları H2O2 bileşiklerine
dönüştürülmektedir. Sonrasında bu peroksit bileşiğine karşı katA ve katB gibi genlerden
kodlanan katalaz enzimleri vasıtasıyla hücrelerin peroksit bileşiklerinden korunması
sağlanmaktadır. Son aşamada ise ahpA, ahpB ve ahpCF gen bölgelerinden kodlanan alkil
hidrojen peroksidaz enzimleriyle H2O2 ‘in detoksifikasyonu gerçekleşmektedir. Bir çok
bakteride bu oksidatif stres cevabı genlerinin oxyR regülatörü tarafından kontrol edildiği
bilinmektedir [144, 151].
Panmanee ve Hassett çalışmalarında, biyofilmlerin peroksit karşı duyarlılıklarında oxyR
aracılı katB, ahpCF ve ahpB genlerinden kodlanan antioksidan enzimlerin rolünü
araştırmışlar ve ahpCF tarafından kodlanan alkil hidroksiperoksidaz enzimlerinin biyofilm
65
hücrelerinin yaşamında önemli bir yer tutarken, katB tarafından kodlanan katalaz
enziminin planktonik yaşam formlarında daha önemli bir yeri olduğunu bildirmişlerdir.
Ayrıca oxyR mutantlarından oluşturulan biyofilmlerin vahşi tiplere oranla H2O2’ nin çok
düşük konsantrasyonlarına dahi oldukça duyarlı olduklarını belirtmişlerdir [166].
Vinckx ve arkadaşları; P.aeruginosa oxyR mutant suşlarında bir siderofor bileşiği olan
piyoverdinin hücre içine alımında ya da piyoverdin reseptörünün üretiminde vahşi tipe
oranla bir değişiklik olmadığını, ancak siderofor içinde biriken demirin geri alınmasının
mutant suşlarda gerçekleşmediğini belirtmişlerdir. Ayrıca oxyR mutant suşlarının katB,
ahpC ve ahpB gen ekspresyon seviyelerinin üretildikleri besiyeri ortamının içeriğine göre
değişiklik gösterdiğini belirterek bu genlerin transkripsiyonlarının tamamıyla oxyR genine
bağımlı olmadığını belirtmişlerdir [159].
Çalışmamızda, Pseudomonas hücreleri polimikrobiyal ortamda iken peroksit ajanına
monomikrobiyal ortamdakinden daha duyarlı bulunmalarından dolayı stress ile ilişkili
genlerin ekspresyonlarında da duyarlılık sonucuyla paralel olarak anlamlı bir azalma
görülmesi beklenmiştir. Ancak P.aeruginosa ve S.aureus’un her iki biyofilm modelinde de
gerek oksidatif stress ile ilişkili genlerde gerekse de demir alımı ile ilişkili genlerde anlamlı
bir
fark
gözlenmemiştir
(Şekil
4.4.).
Altta
yatan
genetik
mekanizmaların
posttranskripsiyonel regülasyonu hedef alan daha ileri düzey genetik çalışmalarla
aydınlatılması gerekmektedir [156].
66
67
6. SONUÇ ve ÖNERİLER
Bu çalışma da 96 çukurlu mikrotitrasyon plakları kullanılarak stabilitesi ve
tekrarlanabilirliği yüksek polimikrobiyal biyofilm modelleri başarıyla geliştirilmiş ve
hastanelerde yaygın kullanılan 9 farklı dezenfektanın biyofilmleri eradike edici etkisi bu
modeller üzerinde araştırılmıştır.
Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda S.aureus ve C.albicans üremesinin P.aeruginosa
tarafından baskılandığı gözlenmiş ancak ortama %5 BSA eklenmesiyle mikrobiyal üreme
sorunu çözülebilmiştir.
Dezenfektanların çoğu, çalışılan mikrobiyal türlerin planktonik formlarında etkili bulurken
biyofilm formları üzerinde aynı etki gözlenememiştir.
Bazı literatür bulgularında polimikrobiyal biyofilmlerin çeşitli antimikrobiyal ajanlara
karşı duyarlılıklarında monomikrobiyallere oranla azalma saptandığı belirtilmektedir.
Ancak bizim sonuçlarımız bu durumun her zaman geçerli olmadığını ve büyük oranda
mikrobiyal türlere, ortamda bulunan diğer mikroorganizmaların varlığına ve kullanılan
dezenfektanın türüne göre değişebildiğini göstermektedir.
C.albicans SC5314 ve P.aeruginosa PAO1 suşları üçlü polimikrobiyal biyofilm modelinde
çeşitli dezenfektanlara karşı tek başlarına üretildikleri monomikrobiyal kültürlerine oranla
daha duyarlı bulunmuşlardır. S.aureus Mu50 suşunun monomikrobiyal ve üçlü
polimikrobiyal biyofilm modelindeki sonuçlarına bakıldığında ise test edilen dezenfektana
bağlı olarak duyarlılıkta azalış, artış veya değişiklik gözlenmemesi gibi farklı sonuçlar elde
edilmiştir. Bu değişik duyarlılık yanıtlarından sorumlu mekanizmaların yapılacak ileri
çalışmalar sayesinde aydınlatılması gerekmektedir.
Pseudomonas sesil hücrelerindeki kalıntı hidrojen peroksit miktarı, hücrelerde biriken
reaktif oksijen türleri ve oksidatif stres ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri
belirlenerek, polimikrobiyal biyofilm yapısındaki Pseudomonas sesil hücrelerinin hidrojen
peroksit ajanına karşı azalmış duyarlılıklarından sorumlu mekanizma/mekanizmalar
aydınlatılmaya çalışılmıştır. Sonuçlarda test edilen tüm hidrojen peroksit miktarı açısından
hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal Pseudomonas hücrelerinde anlamlı fark
68
bulunmadığı, peroksit ajanının her iki modelde de enzimler aracılığıyla parçalandığı
gözlenmiştir. Ayrıca Pseudomonas sesil hücrelerinin peroksit ajanına karşı azalmış olan
duyarlılıklarında ROS üretiminin muhtemel bir rolü olmadığıda belirtilmiştir.
Yapılan gen ekspresyon çalışmaları sonucunda polimikrobiyal biyofilmde yer alan
pseudomonas hücrelerinde peroksit ajanına karşı gözlenen azalmış duyarlılık profil
gösterme sebebinin posttranskripsiyonel regülasyonu hedef alan daha ileri düzey genetik
çalışmalarla aydınlatılması gerektiği bildirilmiştir.
69
KAYNAKLAR
1.
Donlan R. M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious
Diseases, 8 (9), 881-890.
2.
Jones H., Roth I.and Sanders W. (1969). Electron microscopic study of a slime
layer. Journal of Bacteriology, 99 (1), 316-325.
3.
Characklis W. G. (1973). Attached microbial growths—II. Frictional resistance due
to microbial slimes. Water Research, 7 (9), 1249-1258.
4.
Costerton J., Geesey G.and Cheng K. (1978). How bacteria stick. Scientific
American, 238 (1), 86-95.
5.
Donlan R. M.and Costerton J. W. (2002). Biofilms: survival mechanisms of
clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15 (2), 167193.
6.
Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R.and Lappin-Scott
H. M. (1995). Microbial biofilms. Annual Reviews in Microbiology, 711-745.
7.
Hoiby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S.and Ciofu O. (2010). Antibiotic
resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35
(4), 322-332.
8.
Fletcher M.and Loeb G. (1979). Influence of substratum characteristics on the
attachment of a marine pseudomonad to solid surfaces. Applied and Environmental
Microbiology, 37 (1), 67-72.
9.
Pringle J. H.and Fletcher M. (1983). Influence of substratum wettability on
attachment of freshwater bacteria to solid surfaces. Applied and Environmental
Microbiology, 45 (3), 811-817.
10.
Bendinger B., Rijnaarts H. H., Altendorf K.and Zehnder A. J. (1993).
Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria
related to the presence and chain length of mycolic acids. Applied and
Environmental Microbiology, 59 (11), 3973-3977.
11.
Lappin Scott H. M.and Costerton J. W. (2003). Microbial biofilms. (First ed.).
Cambridge: Cambridge University Press, 130-145.
12.
Rijnaarts H. H., Norde W., Bouwer E. J., Lyklema J.and Zehnder A. J. (1993).
Bacterial adhesion under static and dynamic conditions. Applied and
Environmental Microbiology, 59 (10), 3255-3265.
13.
Zheng D., Taylor G. T.and Gyananath G. (1994). Influence of laminar flow
velocity and nutrient concentration on attachment of marine bacterioplankton.
Biofouling, 8 (2), 107-120.
70
14.
Cowan M. M., Warren T. M.and Fletcher M. (1991). Mixed‐species colonization of
solid surfaces in laboratory biofilms. Biofouling, 3 (1), 23-34.
15.
Rosenberg, M and Kjelleberg, S. (editors). (1986). Advances in Microbial Ecology,
NewYork: Plenum Press, 353-393.
16.
Williams V.and Fletcher M. (1996). Pseudomonas fluorescens adhesion and
transport through porous media are affected by lipopolysaccharide composition.
Applied and Environmental Microbiology, 62 (1), 100-104.
17.
Kachlany S. C., Planet P. J., DeSalle R., Fine D. H., Figurski D. H.and Kaplan J. B.
(2001). flp‐1, the first representative of a new pilin gene subfamily, is required for
non‐specific adherence of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Molecular
Microbiology, 40 (3), 542-554.
18.
Lamont R. J., El-Sabaeny A., Park Y., Cook G. S., Costerton J. W.and Demuth D.
R. (2002). Role of the Streptococcus gordonii SspB protein in the development of
Porphyromonas gingivalis biofilms on streptococcal substrates. Microbiology, 148
(6), 1627-1636.
19.
Inoue T., Shingaki R., Sogawa N., Sogawa C. A., Asaumi J. i., Kokeguchi S.and
Fukui K. (2003). Biofilm Formation by a Fimbriae‐Deficient Mutant of
Actinobacillus actinomycetemcomitans. Microbiology and Immunology, 47 (11),
877-881.
20.
Petersen F. C., Pecharki D.and Scheie A. A. (2004). Biofilm mode of growth of
Streptococcus intermedius favored by a competence-stimulating signaling peptide.
Journal of Bacteriology, 186 (18), 6327-6331.
21.
Petersen F. C., Tao L.and Scheie A. A. (2005). DNA binding-uptake system: a link
between cell-to-cell communication and biofilm formation. Journal of
Bacteriology, 187 (13), 4392-4400.
22.
Kaplan J. B. (2010). Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and
potential therapeutic uses. Journal of Dental Research, 89 (3), 205-218.
23.
Boyd A.and Chakrabarty A. á. (1994). Role of alginate lyase in cell detachment of
Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology, 60 (7), 23552359.
24.
Archer N. K., Mazaitis M. J., Costerton J. W., Leid J. G., Powers M. E.and Shirtliff
M. E. (2011). Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in
human disease. Virulence 2011, 2 (5), 445-459.
25.
Karatan E.and Watnick P. (2009). Signals, regulatory networks, and materials that
build and break bacterial biofilms. Microbiology and Molecular Biology Reviews,
73 (2), 310-347.
26.
Evans L. V. (2003). Biofilms: recent advances in their study and control.
(Amsterdam: CRC press, 1-471.
71
27.
James G., Beaudette L.and Costerton J. (1995). Interspecies bacterial interactions in
biofilms. Journal of Industrial Microbiology, 15 (4), 257-262.
28.
Sutherland I. W. (2001). Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky
framework. Microbiology, 147 (1), 3-9.
29.
Hussain M., Wilcox M.and White P. (1993). The slime of coagulase‐negative
staphylococci: Biochemistry and relation to adherence. FEMS Microbiology
Letters, 104 (3‐4), 191-208.
30.
Peters B. M., Jabra-Rizk M. A., O'May G. A., Costerton J. W.and Shirtliff M. E.
(2012). Polymicrobial interactions: impact on pathogenesis and human disease.
Clinical Microbiology Reviews, 25 (1), 193-213.
31.
Peleg A. Y., Hogan D. A.and Mylonakis E. (2010). Medically important bacterial–
fungal interactions. Nature Reviews Microbiology, 8 (5), 340-349.
32.
Armstrong D. G., Lavery L. A.and Boulton A. J. (2007). Negative pressure wound
therapy via vacuum‐assisted closure following partial foot amputation: what is the
role of wound chronicity? International wound journal, 4 (1), 79-86.
33.
Hansen S. K., Haagensen J. A., Gjermansen M., Jørgensen T. M., Tolker-Nielsen
T.and Molin S. (2007). Characterization of a Pseudomonas putida rough variant
evolved in a mixed-species biofilm with Acinetobacter sp. strain C6. Journal of
Bacteriology, 189 (13), 4932-4943.
34.
Kolenbrander P. E. (2000). Oral microbial communities: biofilms, interactions, and
genetic systems 1. Annual Reviews in Microbiology, 413-437.
35.
Rickard A. H., Gilbert P., High N. J., Kolenbrander P. E.and Handley P. S. (2003).
Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species
biofilms. Trends in Microbiology, 11 (2), 94-100.
36.
Clemans D. L., Kolenbrander P. E., Debabov D. V., Zhang Q., Lunsford R. D.,
Sakone H., Whittaker C. J., Heaton M. P.and Neuhaus F. C. (1999). Insertional
Inactivation of Genes Responsible for the d-Alanylation of Lipoteichoic Acid in
Streptococcus gordonii DL1 (Challis) Affects Intrageneric Coaggregations.
Infection and Immunity, 67 (5), 2464-2474.
37.
McNab R., Forbes H., Handley P. S., Loach D. M., Tannock G. W.and Jenkinson
H. F. (1999). Cell wall-anchored CshA polypeptide (259 kilodaltons) in
Streptococcus gordonii forms surface fibrils that confer hydrophobic and adhesive
properties. Journal of Bacteriology, 181 (10), 3087-3095.
38.
Egland P. G., Dû L. D.and Kolenbrander P. E. (2001). Identification of
Independent Streptococcus gordonii SspA and SspB Functions in Coaggregation
with Actinomyces naeslundii. Infection and Immunity, 69 (12), 7512-7516.
72
39.
Takahashi Y., Konishi K., Cisar J. O.and Yoshikawa M. (2002). Identification and
characterization of hsa, the gene encoding the sialic acid-binding adhesin of
Streptococcus gordonii DL1. Infection and Immunity, 70 (3), 1209-1218.
40.
Bjarnsholt T., Jensen P. Ø., Fiandaca M. J., Pedersen J., Hansen C. R., Andersen C.
B., Pressler T., Givskov M.and Høiby N. (2009). Pseudomonas aeruginosa biofilms
in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology, 44 (6),
547-558.
41.
An D., Danhorn T., Fuqua C.and Parsek M. R. (2006). Quorum sensing and
motility mediate interactions between Pseudomonas aeruginosa and Agrobacterium
tumefaciens in biofilm cocultures. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA, 103 (10), 3828-3833.
42.
Pereira A. L., Silva T. N., Gomes A. C., Araújo A. C.and Giugliano L. G. (2010).
Diarrhea-associated biofilm formed by enteroaggregative Escherichia coli and
aggregative Citrobacter freundii: a consortium mediated by putative F pili. BMC
Microbiology, 10 (1), 57.
43.
Carlsson J. (1997). Bacterial metabolism in dental biofilms. Advances in Dental
Research, 11 (1), 75-80.
44.
Fischbach M. A.and Sonnenburg J. L. (2011). Eating for two: how metabolism
establishes interspecies interactions in the gut. Cell host & microbe, 10 (4), 336347.
45.
Weimer K. E., Juneau R. A., Murrah K. A., Pang B., Armbruster C. E., Richardson
S. H.and Swords W. E. (2011). Divergent mechanisms for passive pneumococcal
resistance to β-lactam antibiotics in the presence of Haemophilus influenzae.
Journal of Infectious Diseases, 203 (4), 549-555.
46.
Elias S.and Banin E. (2012). Multi‐species biofilms: living with friendly neighbors.
FEMS Microbiology Reviews, 36 (5), 990-1004.
47.
Madsen J. S., Burmølle M., Hansen L. H.and Sørensen S. J. (2012). The
interconnection between biofilm formation and horizontal gene transfer. FEMS
Immunology and Medical Microbiology, 65 (2), 183-195.
48.
Wolcott R., Costerton J., Raoult D.and Cutler S. (2013). The polymicrobial nature
of biofilm infection. Clinical Microbiology and Infection, 19 (2), 107-112.
49.
Ramsey M. M.and Whiteley M. (2009). Polymicrobial interactions stimulate
resistance to host innate immunity through metabolite perception. Proceedings of
the National Academy of Sciences, 106 (5), 1578-1583.
50.
Bassler B. L. (2002). Small talk: cell-to-cell communication in bacteria. Cell, 109
(4), 421-424.
51.
Federle M. J.and Bassler B. L. (2003). Interspecies communication in bacteria.
Journal of Clinical Investigation, 112 (9), 1291-1299.
73
52.
Zhu P.and Li M. (2012). Recent progresses on AI-2 bacterial quorum sensing
inhibitors. Current Medicinal Chemistry, 19 (2), 174-186.
53.
Riedel K., Hentzer M., Geisenberger O., Huber B., Steidle A., Wu H., Høiby N.,
Givskov M., Molin S.and Eberl L. (2001). N-acylhomoserine-lactone-mediated
communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in
mixed biofilms. Microbiology, 147 (12), 3249-3262.
54.
Ryan R. P., Fouhy Y., Garcia B. F., Watt S. A., Niehaus K., Yang L.,
Tolker‐Nielsen T.and Dow J. M. (2008). Interspecies signalling via the
Stenotrophomonas maltophilia diffusible signal factor influences biofilm formation
and polymyxin tolerance in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology, 68
(1), 75-86.
55.
Yang L., Liu Y., Wu H., Hoiby N., Molin S.and Song Z. J. (2011). Current
understanding of multi-species biofilms. Int J Oral Sci, 3 (2), 74-81.
56.
Tong H., Chen W., Shi W., Qi F.and Dong X. (2008). SO-LAAO, a novel L-amino
acid oxidase that enables Streptococcus oligofermentans to outcompete
Streptococcus mutans by generating H2O2 from peptone. Journal of Bacteriology,
190 (13), 4716-4721.
57.
Bandara H., Yau J., Watt R., Jin L.and Samaranayake L. (2010). Pseudomonas
aeruginosa inhibits in-vitro Candida biofilm development. BMC Microbiology, 10
(1), 125.
58.
Burmolle M., Thomsen T. R., Fazli M., Dige I., Christensen L., Homoe P., Tvede
M., Nyvad B., Tolker-Nielsen T., Givskov M., Moser C., Kirketerp-Moller K.,
Johansen H. K., Hoiby N., Jensen P. O., Sorensen S. J.and Bjarnsholt T. (2010).
Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in
multispecies infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 59 (3),
324-336.
59.
Petersen P. E., Bourgeois D., Ogawa H., Estupinan-Day S.and Ndiaye C. (2005).
The global burden of oral diseases and risks to oral health. Bulletin of the World
Health Organization, 83 (9), 661-669.
60.
Paster B. J., Boches S. K., Galvin J. L., Ericson R. E., Lau C. N., Levanos V. A.,
Sahasrabudhe A.and Dewhirst F. E. (2001). Bacterial diversity in human
subgingival plaque. Journal of Bacteriology, 183 (12), 3770-3783.
61.
Li Y., Ge Y., Saxena D.and Caufield P. (2007). Genetic profiling of the oral
microbiota associated with severe early-childhood caries. Journal of Clinical
Microbiology, 45 (1), 81-87.
62.
Baena-Monroy T., Moreno-Maldonado V., Franco-Martinez F., Aldape-Barrios B.,
Quindos G.and Sanchez-Vargas L. (2004). Candida albicans, Staphylococcus
aureus and Streptococcus mutans colonization in patients wearing dental prosthesis.
Medicina Oral, Patología Oral y Cirugía Bucal, 10, 27-39.
74
63.
Harriott M. M.and Noverr M. C. (2009). Candida albicans and Staphylococcus
aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53 (9), 3914-3922.
64.
Schaudinn C., Gorur A., Keller D., Sedghizadeh P. P.and Costerton J. W. (2009).
Periodontitis An archetypical biofilm disease. The Journal of the American Dental
Association, 140 (8), 978-986.
65.
Armitage G. C.and Cullinan M. P. (2010). Comparison of the clinical features of
chronic and aggressive periodontitis. Periodontology 2000, 53 (1), 12-27.
66.
Saito A., Inagaki S., Kimizuka R., Okuda K., Hosaka Y., Nakagawa T.and Ishihara
K. (2008). Fusobacterium nucleatum enhances invasion of human gingival
epithelial and aortic endothelial cells by Porphyromonas gingivalis. FEMS
Immunology and Medical Microbiology, 54 (3), 349-355.
67.
Saito Y., Fujii R., Nakagawa K. I., Kuramitsu H., Okuda K.and Ishihara K. (2008).
Stimulation of Fusobacterium nucleatum biofilm formation by Porphyromonas
gingivalis. Oral Microbiology and Immunology, 23 (1), 1-6.
68.
Segal N., Leibovitz E., Dagan R.and Leiberman A. (2005). Acute otitis mediadiagnosis and treatment in the era of antibiotic resistant organisms: updated clinical
practice guidelines. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 69
(10), 1311-1319.
69.
Laufer A. S., Metlay J. P., Gent J. F., Fennie K. P., Kong Y.and Pettigrew M. M.
(2011). Microbial communities of the upper respiratory tract and otitis media in
children. MBio, 2 (1), 245-210.
70.
Patel J. A., Nair S., Revai K., Grady J.and Chonmaitree T. (2009). Nasopharyngeal
acute phase cytokines in viral upper respiratory infection: impact on acute otitis
media in children. The Pediatric infectious disease journal, 28 (11), 1002.
71.
Armbruster C. E., Hong W., Pang B., Weimer K. E., Juneau R. A., Turner J.and
Swords W. E. (2010). Indirect pathogenicity of Haemophilus influenzae and
Moraxella catarrhalis in polymicrobial otitis media occurs via interspecies quorum
signaling. MBio, 1 (3), 102-110.
72.
Citron D. M., Goldstein E. J., Merriam C. V., Lipsky B. A.and Abramson M. A.
(2007). Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro
activity of antimicrobial agents. Journal of Clinical Microbiology, 45 (9), 28192828.
73.
Bowling F. L., Jude E. B.and Boulton A. J. (2009). MRSA and diabetic foot
wounds: contaminating or infecting organisms? Current diabetes reports, 9 (6),
440-444.
74.
Mastropaolo M. D., Evans N. P., Byrnes M. K., Stevens A. M., Robertson J. L.and
Melville S. B. (2005). Synergy in polymicrobial infections in a mouse model of
type 2 diabetes. Infection and Immunity, 73 (9), 6055-6063.
75
75.
Lopes S. P., Ceri H., Azevedo N. F.and Pereira M. O. (2012). Antibiotic resistance
of mixed biofilms in cystic fibrosis: impact of emerging microorganisms on
treatment of infection. International Journal of Antimicrobial Agents, 40 (3), 260263.
76.
Sibley C. D., Rabin H.and Surette M. G. (2006). Cystic fibrosis: a polymicrobial
infectious disease. Future Microbiology, 1 (1), 53-61.
77.
Hogan D. A.and Kolter R. (2002). Pseudomonas-Candida interactions: an
ecological role for virulence factors. Science, 296 (5576), 2229-2232.
78.
Cugini C., Calfee M., Farrow J. M., Morales D. K., Pesci E. C.and Hogan D. A.
(2007). Farnesol, a common sesquiterpene, inhibits PQS production in
Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology, 65 (4), 896-906.
79.
Hoffman L. R., Déziel E., D'Argenio D. A., Lépine F., Emerson J., McNamara S.,
Gibson R. L., Ramsey B. W.and Miller S. I. (2006). Selection for Staphylococcus
aureus small-colony variants due to growth in the presence of Pseudomonas
aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103 (52), 1989019895.
80.
Tunney M., Klem E., Fodor A., Gilpin D., Moriarty T., McGrath S., Muhlebach
M., Boucher R., Cardwell C.and Doering G. (2011). Use of culture and molecular
analysis to determine the effect of antibiotic treatment on microbial community
diversity and abundance during exacerbation in patients with cystic fibrosis.
Thorax, 66 (7), 579-584.
81.
Francolini I.and Donelli G. (2010). Prevention and control of biofilm‐based
medical‐device‐related infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology,
59 (3), 227-238.
82.
Corey G. R.and Lalani T. (2008). Risk of intravascular cardiac device infections in
patients with bacteraemia: impact on device removal. International Journal of
Antimicrobial Agents, 32, 26-29.
83.
Falcone M., Barzaghi N., Carosi G., Grossi P., Minoli L., Ravasio V., Rizzi M.,
Suter F., Utili R.and Viscoli C. (2009). Candida infective endocarditis: report of 15
cases from a prospective multicenter study. Medicine, 88 (3), 160-168.
84.
Donlan R. M. (2001). Biofilms and device-associated infections. Emerging
Infectious Diseases, 7 (2), 277.
85.
Stickler D. J. (2008). Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary
catheters. Nature Clinical Practice Urology, 5 (11), 598-608.
86.
Park J. H., Cho Y. W., Cho Y.-H., Choi J. M., Shin H. J., Bae Y. H., Chung H.,
Jeong S. Y.and Kwon I. C. (2003). Norfloxacin-releasing urethral catheter for longterm catheterization. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 14 (9),
951-962.
76
87.
Belt H. v. d., Neut D., Schenk W., Horn J. R. v., Mei H. C. v. d.and Busscher H. J.
(2001). Infection of orthopedic implants and the use of antibiotic-loaded bone
cements: a review. Acta Orthopaedica, 72 (6), 557-571.
88.
Neut D., Kluin O. S., Crielaard B. J., van der Mei H. C., Busscher H. J.and Grijpma
D. W. (2009). A biodegradable antibiotic delivery system based on poly(trimethylene carbonate) for the treatment of osteomyelitis. Acta Orthopaedica, 80
(5), 514-519.
89.
Hall‐Stoodley L.and Stoodley P. (2009). Evolving concepts in biofilm infections.
Cellular Microbiology, 11 (7), 1034-1043.
90.
Parsek M. R.and Singh P. K. (2003). Bacterial biofilms: an emerging link to
disease pathogenesis. Annual Reviews in Microbiology, 57 (1), 677-701.
91.
Lynch A. S.and Robertson G. T. (2008). Bacterial and fungal biofilm infections.
Annual Review of Medicine, 59 415-428.
92.
Simpson J. A., Smith S. E.and Dean R. T. (1989). Scavenging by alginate of free
radicals released by macrophages. Free Radical Biology and Medicine, 6 (4), 347353.
93.
Høiby N., Krogh Johansen H., Moser C., Song Z., Ciofu O.and Kharazmi A.
(2001). Pseudomonas aeruginosa and the in vitro and in vivo biofilm mode of
growth. Microbes and Infection, 3 (1), 23-35.
94.
Jesaitis A. J., Franklin M. J., Berglund D., Sasaki M., Lord C. I., Bleazard J. B.,
Duffy J. E., Beyenal H.and Lewandowski Z. (2003). Compromised host defense on
Pseudomonas aeruginosa biofilms: characterization of neutrophil and biofilm
interactions. The journal of Immunology, 171 (8), 4329-4339.
95.
Bylund J., Burgess L.-A., Cescutti P., Ernst R. K.and Speert D. P. (2006).
Exopolysaccharides from Burkholderia cenocepacia inhibit neutrophil chemotaxis
and scavenge reactive oxygen species. Journal of Biological Chemistry, 281 (5),
2526-2532.
96.
Bryers J. D. (2008). Medical biofilms. Biotechnology and Bioengineering, 100 (1),
1-18.
97.
Fux C., Costerton J., Stewart P.and Stoodley P. (2005). Survival strategies of
infectious biofilms. Trends in Microbiology, 13 (1), 34-40.
98.
Webb J. S., Thompson L. S., James S., Charlton T., Tolker-Nielsen T., Koch B.,
Givskov M.and Kjelleberg S. (2003). Cell death in Pseudomonas aeruginosa
biofilm development. Journal of Bacteriology, 185 (15), 4585-4592.
99.
Mah T.-F. C.and O'Toole G. A. (2001). Mechanisms of biofilm resistance to
antimicrobial agents. Trends in Microbiology, 9 (1), 34-39.
77
100.
Anwar H., Strap J.and Costerton J. (1992). Establishment of aging biofilms:
possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 36 (7), 1347.
101.
Hunt B., Weber A., Berger A., Ramsey B.and Smith A. (1995). Macromolecular
mechanisms of sputum inhibition of tobramycin activity. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 39 (1), 34-39.
102.
Bagge N., Ciofu O., Hentzer M., Campbell J. I., Givskov M.and Høiby N. (2002).
Constitutive high expression of chromosomal β-lactamase in Pseudomonas
aeruginosa caused by a new insertion sequence (IS1669) located in ampD.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46 (11), 3406-3411.
103.
Oliver A., Sánchez J. M.and Blázquez J. (2002). Characterization of the GO system
of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Letters, 217 (1), 31-35.
104.
Mandsberg L. F., Ciofu O., Kirkby N., Christiansen L. E., Poulsen H. E.and Høiby
N. (2009). Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa strains with increased
mutation frequency due to inactivation of the DNA oxidative repair system.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53 (6), 2483-2491.
105.
Boles B. R.and Singh P. K. (2008). Endogenous oxidative stress produces diversity
and adaptability in biofilm communities. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 105 (34), 12503-12508.
106.
Bridier A., Briandet R., Thomas V.and Dubois-Brissonnet F. (2011). Resistance of
bacterial biofilms to disinfectants: a review. Biofouling, 27 (9), 1017-1032.
107.
Ceri H., Olson M., Stremick C., Read R., Morck D.and Buret A. (1999). The
Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic
susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology, 37 (6),
1771-1776.
108.
Araújo, P, et al. (editors). (2011). Science Against Microbial Pathogens:
Communicating Current Research and Technological Advances, Spain: Formatex
Research Center, 826-834.
109.
Langsrud S., Sidhu M. S., Heir E.and Holck A. L. (2003). Bacterial disinfectant
resistance—a challenge for the food industry. International biodeterioration &
biodegradation, 51 (4), 283-290.
110.
Bressler D., Balzer M., Dannehl A., Flemming H.-C.and Wingender J. (2009).
Persistence of Pseudomonas aeruginosa in drinking-water biofilms on elastomeric
material. Water Science & Technology: Water Supply, 9 (1), 81-87.
111.
Vestby L. K., Møretrø T., Langsrud S., Heir E.and Nesse L. L. (2009). Biofilm
forming abilities of Salmonella are correlated with persistence in fish meal-and
feed factories. BMC Veterinary Research, 5 (1), 20.
78
112.
Lambert R.and Johnston M. (2001). The effect of interfering substances on the
disinfection process: a mathematical model. Journal of Applied Microbiology, 91
(3), 548-555.
113.
Sandt C., Barbeau J., Gagnon M.-A.and Lafleur M. (2007). Role of the ammonium
group in the diffusion of quaternary ammonium compounds in Streptococcus
mutans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60 (6), 1281-1287.
114.
Mangalappalli-Illathu A. K., Vidović S.and Korber D. R. (2008). Differential
adaptive response and survival of Salmonella enterica serovar enteritidis planktonic
and biofilm cells exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 52 (10), 3669-3680.
115.
Harrison J. J., Ceri H., Roper N. J., Badry E. A., Sproule K. M.and Turner R. J.
(2005). Persister cells mediate tolerance to metal oxyanions in Escherichia coli.
Microbiology, 151 (10), 3181-3195.
116.
Lewis K. (2005). Persister cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry
(Moscow), 70 (2), 267-274.
117.
Beloin C.and Ghigo J. M. (2005). Finding gene-expression patterns in bacterial
biofilms. Trends in Microbiology, 13 (1), 16-19.
118.
Lumjiaktase P., Diggle S. P., Loprasert S., Tungpradabkul S., Daykin M., Camara
M., Williams P.and Kunakorn M. (2006). Quorum sensing regulates dpsA and the
oxidative stress response in Burkholderia pseudomallei. Microbiology, 152 (12),
3651-3659.
119.
Joelsson A., Kan B.and Zhu J. (2007). Quorum sensing enhances the stress
response in Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology, 73 (11),
3742-3746.
120.
Pontes M. H., Babst M., Lochhead R., Oakeson K., Smith K.and Dale C. (2008).
Quorum sensing primes the oxidative stress response in the insect endosymbiont,
Sodalis glossinidius. PloS One, 3 (10), 3541.
121.
Coenye T. (2010). Response of sessile cells to stress: from changes in gene
expression to phenotypic adaptation. FEMS Immunology and Medical
Microbiology, 59 (3), 239-252.
122.
Pham T. K., Roy S., Noirel J., Douglas I., Wright P. C.and Stafford G. P. (2010). A
quantitative proteomic analysis of biofilm adaptation by the periodontal pathogen
Tannerella forsythia. Proteomics, 10 (17), 3130-3141.
123.
Allegrucci M.and Sauer K. (2007). Characterization of colony morphology variants
isolated from Streptococcus pneumoniae biofilms. Journal of Bacteriology, 189
(5), 2030-2038.
79
124.
Driffield K., Miller K., Bostock J., O'neill A.and Chopra I. (2008). Increased
mutability of Pseudomonas aeruginosa in biofilms. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 61 (5), 1053-1056.
125.
Ando T., Itakura S., Uchii K., Sobue R.and Maeda S. (2009). Horizontal transfer of
non-conjugative plasmid in colony biofilm of Escherichia coli on food-based
media. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25 (10), 1865-1869.
126.
Nguyen K. T., Piastro K., Gray T. A.and Derbyshire K. M. (2010). Mycobacterial
biofilms facilitate horizontal DNA transfer between strains of Mycobacterium
smegmatis. Journal of Bacteriology, 192 (19), 5134-5142.
127.
Burmolle M., Webb J. S., Rao D., Hansen L. H., Sorensen S. J.and Kjelleberg S.
(2006). Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial
agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies
biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 72 (6), 3916-3923.
128.
Van der Veen S.and Abee T. (2011). Mixed species biofilms of Listeria
monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to
benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food
Microbiology, 144 (3), 421-431.
129.
Zhang T., Hashizume T., Kurita-Ochiai T.and Yamamoto M. (2009). Sublingual
vaccination with outer membrane protein of Porphyromonas gingivalis and Flt3
ligand elicits protective immunity in the oral cavity. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 390 (3), 937-941.
130.
Pletz M. W., Maus U., Krug N., Welte T.and Lode H. (2008). Pneumococcal
vaccines: mechanism of action, impact on epidemiology and adaption of the
species. International Journal of Antimicrobial Agents, 32 (3), 199-206.
131.
Furrie E., Macfarlane S., Kennedy A., Cummings J., Walsh S., O’neil D.and
Macfarlane G. (2005). Synbiotic therapy (Bifidobacterium longum/Synergy 1)
initiates resolution of inflammation in patients with active ulcerative colitis: a
randomised controlled pilot trial. Gut, 54 (2), 242-249.
132.
Steed H., Macfarlane G. T., Blackett K. L., Bahrami B., Reynolds N., Walsh S. V.,
Cummings J. H.and Macfarlane S. (2010). Clinical trial: the microbiological and
immunological effects of synbiotic consumption–a randomized double‐blind
placebo‐controlled study in active Crohn’s disease. Alimentary Pharmacology and
Therapeutics, 32 (7), 872-883.
133.
McVay C. S., Velásquez M.and Fralick J. A. (2007). Phage therapy of
Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 51 (6), 1934-1938.
134.
Donlan R. M. (2009). Preventing biofilms of clinically relevant organisms using
bacteriophage. Trends in Microbiology, 17 (2), 66-72.
80
135.
Fu W., Forster T., Mayer O., Curtin J. J., Lehman S. M.and Donlan R. M. (2010).
Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas
aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 54 (1), 397-404.
136.
Jabbouri S.and Sadovskaya I. (2010). Characteristics of the biofilm matrix and its
role as a possible target for the detection and eradication of Staphylococcus
epidermidis associated with medical implant infections. FEMS Immunology and
Medical Microbiology, 59 (3), 280-291.
137.
Knowles J., Roller S., Murray D.and Naidu A. (2005). Antimicrobial action of
carvacrol at different stages of dual-species biofilm development by
Staphylococcus aureus and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Applied and
Environmental Microbiology, 71 (2), 797-803.
138.
Carneiro V. A., Santos H. S. d., Arruda F. V. S., Bandeira P. N., Albuquerque M.
R. J. R., Pereira M. O., Henriques M., Cavada B. S.and Teixeira E. H. (2010).
Casbane diterpene as a promising natural antimicrobial agent against biofilmassociated infections. Molecules, 16 (1), 190-201.
139.
Morales D. K.and Hogan D. A. (2010). Candida albicans interactions with bacteria
in the context of human health and disease. PLoS Pathogens, 6 (4), 1000886.
140.
Budzyńska A., Wieckowska-Szakiel M., Sadowska B., Kalemba D.and Rózalska B.
(2011). Antibiofilm activity of selected plant essential oils and their major
components. Polish Journal of Microbiology, 60 (1), 35-41.
141.
Prigent-Combaret C., Vidal O., Dorel C.and Lejeune P. (1999). Abiotic surface
sensing and biofilm-dependent regulation of gene expression in Escherichia coli.
Journal of Bacteriology, 181 (19), 5993-6002.
142.
O'Toole G., Kaplan H. B.and Kolter R. (2000). Biofilm formation as microbial
development. Annual Reviews in Microbiology, 54 (1), 49-79.
143.
O'Toole G. A. (2003). To build a biofilm. Journal of Bacteriology, 185 (9), 26872689.
144.
Wei Q., Minh P. N., Dotsch A., Hildebrand F., Panmanee W., Elfarash A., Schulz
S., Plaisance S., Charlier D., Hassett D., Haussler S.and Cornelis P. (2012). Global
regulation of gene expression by OxyR in an important human opportunistic
pathogen. Nucleic Acids Research, 40 (10), 4320-4333.
145.
Pfaffl, MW. (editors). (2004). AZ of quantitative PCR, La Jolla, USA: International
University Line (IUL), 89-113.
146.
Sambrook J., Fritsch E. F.and Maniatis T. (1989). Molecular cloning. (Third ed.).
New York: Cold spring harbor laboratory press New York, 110-130.
81
147.
Voggu L., Schlag S., Biswas R., Rosenstein R., Rausch C.and Götz F. (2006).
Microevolution of cytochrome bd oxidase in staphylococci and its implication in
resistance to respiratory toxins released by Pseudomonas. Journal of Bacteriology,
188 (23), 8079-8086.
148.
Morales D. K., Jacobs N. J., Rajamani S., Krishnamurthy M., Cubillos‐Ruiz J.
R.and Hogan D. A. (2010). Antifungal mechanisms by which a novel Pseudomonas
aeruginosa phenazine toxin kills Candida albicans in biofilms. Molecular
Microbiology, 78 (6), 1379-1392.
149.
De Bruecker K. (2009). Bactericide effect van H2O2 op B.cepacia complex
biofilms, Master of science Ghent University, Ghent.
150.
Aranda A., Sequedo L., Tolosa L., Quintas G., Burello E., Castell J.and Gombau L.
(2013). Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative
method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in
Vitro, 27 (2), 954-963.
151.
Vinckx T., Matthijs S.and Cornelis P. (2008). Loss of the oxidative stress regulator
OxyR in Pseudomonas aeruginosa PAO1 impairs growth under iron-limited
conditions. FEMS Microbiology Letters, 288 (2), 258-265.
152.
Liu X., Li J., Wang Y., Li T., Zhao J.and Zhang C. (2013). Green tea polyphenols
function as prooxidants to inhibit Pseudomonas aeruginosa and induce the
expression of oxidative stress-related genes. Folia Microbiologica, 58 (3), 211-217.
153.
Savli H., Karadenizli A., Kolayli F., Gundes S., Ozbek U.and Vahaboglu H.
(2003). Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance
gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative
RT-PCR. Journal of Medical Microbiology, 52 (5), 403-408.
154.
Nobre L. S.and Saraiva L. M. (2013). Effect of combined oxidative and nitrosative
stresses on Staphylococcus aureus transcriptome. Applied Microbiology and
Biotechnology, 97 (6), 2563-2573.
155.
Klotz S. A., Chasin B. S., Powell B., Gaur N. K.and Lipke P. N. (2007).
Polymicrobial bloodstream infections involving Candida species: analysis of
patients and review of the literature. Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease, 59 (4), 401-406.
156.
Kart D., Tavernier S., Van Acker H., Nelis H. J.and Coenye T. (2014). Activity of
disinfectants against multispecies biofilms formed by Staphylococcus aureus,
Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa. Biofouling, 30 (3), 377-383.
157.
Iglesias J., Abernethy V. E., Wang Z., Lieberthal W., Koh J. S.and Levine J. S.
(1999). Albumin is a major serum survival factor for renal tubular cells and
macrophages through scavenging of ROS. American Journal of Physiology-Renal
Physiology, 277 (5), 711-722.
82
158.
Fukuzawa K., Saitoh Y., Akai K., Kogure K., Ueno S., Tokumura A., Otagiri
M.and Shibata A. (2005). Antioxidant effect of bovine serum albumin on
membrane lipid peroxidation induced by iron chelate and superoxide. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1668 (1), 145-155.
159.
Vinckx T., Wei Q., Matthijs S.and Cornelis P. (2010). The Pseudomonas
aeruginosa oxidative stress regulator OxyR influences production of pyocyanin and
rhamnolipids: protective role of pyocyanin. Microbiology, 156 (Pt 3), 678-686.
160.
Li H., Zhang C., Liu P., Liu W., Gao Y.and Sun S. (in press). In vitro interactions
between fluconazole and minocycline against mixed cultures of Candida albicans
and Staphylococcus aureus. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 17.
161.
Vieira C. D., de Macêdo Farias L., Diniz C. G., Alvarez-Leite M. E., da Silva
Camargo E. R.and de Carvalho M. A. R. (2005). New methods in the evaluation of
chemical disinfectants used in Health Care Services. American Journal of Infection
Control, 33 (3), 162-169.
162.
Adam B., Baillie G. S.and Douglas L. J. (2002). Mixed species biofilms of Candida
albicans and Staphylococcus epidermidis. Journal of Medical Microbiology, 51 (4),
344-349.
163.
Simões L. C., Simões M.and Vieira M. J. (2010). Influence of the diversity of
bacterial isolates from drinking water on resistance of biofilms to disinfection.
Applied and Environmental Microbiology, 76 (19), 6673-6679.
164.
Peters B. M., Ward R. M., Rane H. S., Lee S. A.and Noverr M. C. (2013). Efficacy
of ethanol against Candida albicans and Staphylococcus aureus polymicrobial
biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57 (1), 74-82.
165.
Stewart P. S., Roe F., Rayner J., Elkins J. G., Lewandowski Z., Ochsner U. A.and
Hassett D. J. (2000). Effect of catalase on hydrogen peroxide penetration into
Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 66
(2), 836-838.
166.
Panmanee W.and Hassett D. J. (2009). Differential roles of OxyR‐controlled
antioxidant enzymes alkyl hydroperoxide reductase (AhpCF) and catalase (KatB)
in the protection of Pseudomonas aeruginosa against hydrogen peroxide in biofilm
vs. planktonic culture. FEMS Microbiology Letters, 295 (2), 238-244.
83
EKLER
84
EK-1. Etik kurul onayı
Şekil 1.1. Etik kurul onayı
85
EK-1 (Devam). Etik kurul onayı
Şekil 1.1. Etik kurul onayı
86
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Soyadı, adı
:
KART, Didem
Uyruğu
:
T.C.
Doğum tarihi ve yeri
:
09/03/1983 Ankara
Medeni hali
:
Evli
Telefon
:
0(312) 305 14 99
e-posta
:
dturk@hacettepe.edu.tr
Eğitim Derecesi
Okul/Program
Mezuniyet yılı
Yüksek Lisans
Hacettepe Üniv./Mikrobiyoloji AbD
2008
Lisans
Hacettepe Üniv./Biyoloji Bölümü
2005
Lise
Seyranbağları Süper Lisesi
2000
İş Deneyimi,Yıl
Çalıştığı Yer
Görev
2006 - devam ediyor
Hacettepe Üniversitesi
Araş.Gör.
Yabancı Dil
İngilizce
Yayınlar
1. Atac AS., Bulut OE., Özalp M., Celik H., Tatar I., Ozturk D., Ekizoğlu M. (2009). The
effect of Hydrogen Peroxide Colloidal Silver Ions on Elimination of Biofilm in Dental
Unit Waterlines ADO Journal of Clinical Sciences. 3.
87
2. Ekizoğlu M., Gündüz MG., Kart D., Şimşek R., Şafak C. (2011).Antimicrobial
Screening of 2-Methyl-3-Acyl-4-Aryl-2,6,6 and / or 2,7,7-Trimethyl-1,4,5,6,7,8Hexahydroquinoline Derivatives Hacettepe University Journal of the Faculty of Pharmacy.
31 (1).
3. Kahraman Ç., Ekizoglu M., Kart D., Akdemir ZŞ., Tatlı İİ. (2011). Antimicrobial
Activity of Some Verbascum Species Growing in Turkey FABAD Journal of
Pharmaceutical Sciences. 36 (1).
4. Turker S., Ozer YA., Kutlu B., Nohutcu R., Bilgili H., Ozturk D., Ozalp M., Sungur A.
(2011). Gamma Irradiation Studies I. Bone Grafts, Journal of Medical Devices. 5 (3)
5. Özalp M., Bulut ÖE., Ataç AS., Ekizoğlu M, Kart D, Çelik HH., Tatar I. (2013).The
effect of the hydrogen peroxide colloidal silver on reducing the colonization and growth of
heterotrophic bacteria in dental unit waterlines Turkish Journal of Biology. 37.
6. Yuksek H., Akyıldırım O., Yola ML., Gursoy K., Celebier M., Kart D. (2013).
Synthesis, In Vitro Antimicrobial and Antioxidant Activities of Some New 4,5-Dihydro1H-1,2,4-triazol-5-one Derivatives Archive der Pharmazie. 346.
7. Kart D., Tavernier S., Van Acker H., Nelis HJ., Coenye T. (2014). Activity of
disinfectants against multispecies biofilms formed by Staphylococcus aureus, Candida
albicans and Pseudomonas aeruginosa. Biofouling. 30 (3).
88
GAZİ GELECEKTİR…
Download