Untitled - Gazi Üniversitesi Açık Arşiv
advertisement
HASTANELERDE SIKLIKLA KULLANILAN DEZENFEKTANLARA KARŞI DUYARLILIKTA ROL OYNAYAN POLİMİKROBİYAL BİYOFİLMLERDEKİ MİKROBİYAL ETKİLEŞİMLERİN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ Didem KART DOKTORA TEZİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEMMUZ 2014 ETİK BEYAN Gazi Üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü tez yazım kuralarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; • Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dokümanları akademik ve etik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, • Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, • Tez çalışmamda yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak gösterdiğimi, • Kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı, • Bu tezde sunduğum çalışmanın özgün olduğunu, Bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan ederim. Didem KART 01.07.2014 iv HASTANELERDE SIKLIKLA KULLANILAN DEZENFEKTANLARA KARŞI DUYARLILIKTA ROL OYNAYAN POLİMİKROBİYAL BİYOFİLMLERDEKİ MİKROBİYAL ETKİLEŞİMLERİN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ (Doktora Tezi) Didem KART GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEMMUZ 2014 ÖZET Biyofilm oluşumu insan sağlığını tehdit eden önemli bir problemdir. Yapılan son çalışmalarda persistan enfeksiyonlara yol açan klinik ile ilişkili biyofilmlerin çoğunun polimikrobiyal kaynaklı olduğu belirtilmiştir. Sesil biyofilm hücrelerinin antimikrobiyal ajanlara karşı yüksek direnç göstermelerinden dolayı bu enfeksiyonların tedavisi oldukça zordur. Polimikrobiyal biyofilmlerin önemi günden güne artmasına rağmen henüz bu biyofilmlerin özellikleri üzerine az sayıda çalışma bulunmaktadır. Çalışmamızın amacı, tekrar edilebilirliği yüksek in vitro polimikrobiyal biyofilm modeli geliştirmek, aynı zamanda da fenotipik ve moleküler yöntemlerle biyofilm ortamında bulunan C. albicans ve S. aureus varlığının P. aeruginosa’nın çeşitli dezenfektanlara karşı duyarlılığı üzerindeki etkisini anlayabilmektir. Bu çalışmada 96 çukurlu mikrotitrasyon plaklarında tekrar edilebilirliği yüksek polimikrobiyal biyofilmler oluşturulmuştur. Piyasada bulunan 9 dezenfektanın polimikrobiyal biyofilm içinde bulunan S. aureus, C. albicans, and P. aeruginosa’ya etkileri belirlenerek birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Seçici besiyerleri kullanılarak plak döküm yöntemiyle hücre sayımları yapılmıştır. Hidrojen peroksit kalıntı miktarı, ROS birikimi ve oksidatif stres ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri hem monomikrobiyal hemde polimikrobiyal biyofilm hücrelerinden ölçülmüş ve sonuçlar birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Sonuçlar polimikrobiyal biyofilmlerdeki mikrobiyal etkileşimin öneminin kullanılan dezenfektana ve ortamda bulunan mikrobiyal türe bağımlı olduğunu göstermiştir. Ayrıca literatürde sıklıkla bahsedilen monomikrobiyal biyofilmlerin polimikrobiyaller’e göre daha duyarlı olduğu düşüncesinin her zaman geçerli olmadığı bu çalışma sonuçlarıyla ortaya koyulmuştur. Bilim Kodu : 1039.3.101 Anahtar Kelimeler : Biyofilm, Polimikrobiyal, Dezenfektan, Gen ekspresyonu Sayfa adedi : 88 Danışman : Prof.Dr. A. Semra Kuştimur v DETERMINATION OF THE MICROBIAL INTERACTIONS IN POLYMICROBIAL BIOFILMS ACTING AS A ROLE IN SUSCEPTIBILITY AGAINST TO DISINFECTANTS FREQUENTLY USED IN HOSPITALS WITH PHENOTYPIC AND GENOTYPIC ANALYSIS (Ph. D. Thesis) Didem KART GAZİ UNIVERSITY INSTITUE OF HEALTH SCIENCE JULY 2014 ABSTRACT Biofilms are substantial problem threatening the human health. It was shown that in recent studies, most of clinically relevant biofilms leading to persistent infections are polymicrobial. Because of sessile cells in biofilm are highly resistant against antimicrobial agents to treat these infections are troublesome. While increasingly being recognized as important, there are few studies on the properties of multispecies biofilms. Our aim is set up an in model to grow polymicrobial biofilms in a repeatable style and to find out the impact of the presence of S. aureus or C. albicans on the susceptibility of P. aeruginosa to a variety of disinfectants by using phenotypic and moleclar test methods. In the present study, polimicrobial biofilms were grown in a repeatable manner in a multi-well plate. S. aureus, C. albicans, and P. aeruginosa in polymicrobial biofilms were threated by nine commercial different disinfectants and the effects of these disinfectant were compared. The number of cells was quantified and counted by pour plating method on a selective growth media. Both in polymicrobial and monomicrobial biofilms, the residual hydrogen peroxide concentration, the accumulation of ROS and the expression level of oxidative stress related genes were measured and the results compared with each other. Our results demonstrated that the aspect and the importance of the effect in a polymicrobial biofilm depend on the strain and the disinfectant used. Moreover, it is conflict with the extensive belief that organisms in polymicrobial biofilms are always less susceptible than in monomicrobials. Science Code : 1039.3.101 Key Words : Biofilm, Polymicrobial, Disinfectant, Gene expression Page Number : 88 Supervisior : Prof.Dr. A. Semra Kuştimur vi TEŞEKKÜR Doktora öğrenim süresince değerli desteğini, toleransını esirgemeyen ve sonsuz bilgi ve önerilerileriyle eğitimime yol gösterici katkılarda bulunan. Sayın tez danışmanım Prof. Dr. A.Semra KUŞTİMUR’a, eğitim sürem boyunca destek olan, sonsuz anlayış ve tolerans gösteren, akademik çalışmalarımı destekleyen Sayın yardımcı tez danışmanım Prof. Dr. Meral SAĞIROĞLU’na, bilimsel deneyimlerinden yararlanma fırsatı bulduğum Sayın Prof. Dr. Tom COENYE ve Arş. Gör. Sarah TAVERNİER’e, bugüne kadar vermiş oldukları teorik ve pratik eğitimlerden dolayı Sayın Prof. Dr. Ayşe KALKANCI başta olmak üzere tüm Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji hocalarıma, birlikte çalışmaktan ve aynı ortamı paylaşmaktan keyif aldığım Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı çalışanlarına ve son olarak eğitim süresince özverilerini, maddi ve manevi desteklerini benden bir an bile esirgemeyen sevgili eşim Burak KART’a ve saygıdeğer aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET …………………………………………………………………………………. iv ABSTRACT ………………………………………………………………………….. v TEŞEKKÜR ………………………………………………………………………….. vi İÇİNDEKİLER ……………………………………………………………………….. vii ÇIZELGELERİN LİSTESİ …………………………………………………………... xi ŞEKİLLERİN LİSTESİ ……………………………………………………………… xii SİMGELER VE KISALTMALAR …………………………………………………... xiii 1. GİRİŞ …………………………………………………………………………….. 1 2. GENEL BİLGİLER …………………………………………………………… 3 2.1. Biyofilmin Tarihçesi ………………………………………………………... 3 2.2. Biyofilmlerin Tanımı ……………………………………………………….. 4 2.3. Biyofilm Oluşum Aşamaları………………………………………………… 4 2.3.1. Tutunma basamağı……………………………………………………. 5 2.3.2. Geri dönüşümsüz bağlanma…………………………………………… 6 2.3.3. İlk ve ikinci olgunlaşma fazı…………………………………………... 7 2.3.4. Ayrılma basamağı ……………………………………………………… 7 2.4. Biyofilmlerin Yapısı………………………………………………………….. 8 2.5. Polimikrobiyal Biyofilmler ………………………………………………….. 9 2.6. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Yapısal Gelişimi ……………………………... 10 2.7. Polimikrobiyal Biyofilmlerdeki Etkileşimler ……………………………….. 11 2.7.1 Sinerjistik etkileşimler ………………………………………………… 11 2.7.2 Antagonistik Etkileşimler ……………………………………………... 13 2.8. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Hastalıklardaki Rolü ………………………… 13 viii Sayfa 2.8.1 Oral enfeksiyonlar ……………………………………………………... 13 2.8.2. Otitis media …………………………………………………………… 15 2.8.3. Diyabet kökenli yara enfeksiyonları ………………………………….. 16 2.8.4. Kistik fibrozis enfeksiyonu …………………………………………… 17 2.8.5. Yabancı cisim kaynaklı enfeksiyonlar ………………………………... 18 2.9. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonların Tanısı …………………………………….. 20 2.10. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonlara Konak İmmün Cevabı, Antibiyotik ve Dezenfektan Direnci ………………………………………. 22 2.10.1. Biyofilmlerin konak immün sistemine direnci ……………………… 22 2.10.2. Biyofilmlerde antibiyotik direnci …………………………………… 22 2.10.3. Biyofilmlerde dezenfektan direnci ………………………………….. 24 2.11. Polimikrobiyal Biyofilm Eradikasyonunda Alternatif Tedavi Stratejileri … 29 2.11.1. Polimikrobiyal aşılar ………………………………………………... 29 2.11.2. Sinbiyotikler ………………………………………………………… 30 2.11.3. Faj tedavisi ………………………………………………………….. 30 2.11.4. Diğer tedavi yaklaşımları …………………………………………… 30 2.12. Polimikrobiyal Biyofilmlerde Gen Ekspresyonunun Yeri: Kantitatif Eş Zamanlı Reverz Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (kantitatif RT-PZR) ………………………………………………………... 31 3. GEREÇ VE YÖNTEM ………………………………………………………. 35 3.1. Çalışmada Kullanılan Suşlar ……………………………………………….. 35 3.2. Çalışmada Kullanılan Dezenfektanlar ……………………………………… 35 3.3. Standart Sert Su Hazırlanması ……………………………...………………. 36 3.4. Dezenfektanların Planktonik Mikroorganizmar Üzerindeki Etkisinin Test Edilmesi ……………………………………………………... 36 3.4.1. Kantitatif süspansiyon testi …………………………………………... 37 ix Sayfa 3.4.2. Deney koşullarının kontrolü / validasyonu ………………………….... 37 3.4.3. Nötralizan toksisite kontrolü ………………………………………….. 38 3.4.4. Nötralizasyon yönteminin validasyonu ………………………………. 38 3.5. Mikrobiyal Biyofilmler Üzerinde Dezenfektanların Etkinliğinin Belirlenmesi ………………………………………………………………….. 39 3.5.1. Monomikrobiyal ve polimikrobiyal inokulum hazırlanması …………. 39 3.5.2. Multi-titrasyon plaklarında monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilmlerin oluşturulması …………………………………………… 40 3.5.3 Biyofilmlerde dezenfektan etkinlik analizi …………………………….. 40 3.6. Hidrojen Peroksit Kalıntı Miktarının Titrimetrik Ölçümü …………………... 41 3.7. Sesil Hücrelerdeki Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Florimetrik ölçümü ….. 41 3.8. P. aeruginosa ve S .aureus Sesil Hücrelerindeki Stres ile İlişkil Genlerin Ekspresyonu ………………………………………………………… 42 3.8.1. Biyofilmlerden total RNA ekstraksiyonu ……………………………… 42 3.8.2. RNA ekstraktlarının ölçümü ve cDNA elde edilmesi …………………. 44 3.8.3. Real-Time PZR yöntemi ile cDNA’ların çoğaltılması ……………….... 44 3.9. İstatiksel Analizler …………………………………………………………… 46 4. BULGULAR …………………………………………………………………….. 49 4.1. Monomikrobiyal Sesil Biyofilm Hücrelerinin Sayımı ve BSA Aracılı Polimikrobiyal Biyofilm Oluşumunun Desteklenmesi ………………………. 49 4.2. Planktonik Mikrobiyal Kültürler Üzerine Dezenfektanların Etkisi ………….. 50 4.2. Dezenfektan Ajanlarına Karşı Polimikrobiyal Biyofilmlerde Mikroorganizmal İletişim ve Etkileşimlerin Belirlenmesi ……………………………………… 51 4.3. Rezidual Hidrojen Peroksitin Ölçümü ……………………………………….. 54 4.4. Biyofilmlerde ROS Birikiminin Belirlenmesi ……………………………….. 55 4.5. Oksidatif Stress ile İlişkili Gen Ekspresyon Seviyelerinin Belirlenmesi ……. 55 5. TARTIŞMA …………………………………………………………… 59 x Sayfa 6. SONUÇ ve ÖNERİLER ……………………………………………… 67 KAYNAKLAR ………………………………………………………………………. 69 EKLER ……………………………………………………………………………….. 83 EK-1. Etik kurul onayı ……………………………………………………….......….. 84 ÖZGEÇMİŞ ………………………………………………………………………….. 86 xi ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Biyosidlerin hücresel hedefleri ve antimikrobiyal etkileri ………. 26 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan dezenfektanlar …………………………….. 36 Çizelge 3.2. cDNA sentezinde kullanılan ajanların hacim ve konsantrasyonları ............................................................................ 44 Çizelge 3.3. Kantitatif PZR analizinde kullanılan P.aeruginosa PAO1 suşuna ait primer dizileri …………………………………………. 45 Çizelge 3.4. Kantitatif PZR analizinde kullanılan S.aureus Mu50 suşuna ait primer dizileri …………………………………………. 46 Çizelge 4.1. Dezenfektanların planktonik kültürler üzerindeki mikrobisidal etkisi ………………………………………………... 51 Çizelge 4.2. Dezenfektanların S.aureus-P.aeruginosa-C.albicans türlerinden oluşan üçlü polimikrobiyal biyofilmleri öldürme oranı yüzdeleri………... 53 Çizelge 4.3. Dezenfektanların S.aureus-C.albicans ve S.aureus-P.aeruginosa ikili polimikrobiyal biyofilmlerini öldürme oranı yüzdeleri………….... 54 xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Biyofilm oluşum basamakları ……………………………………… 5 Şekil 2.2. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunun gösterilmesi ………………... 10 Şekil 2.3. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara direnç mekanizmaları ……… 23 Şekil 2.4. P.aeruginosa’da OxyR aracılı oksidatif stres cevabı ………………. 33 Şekil 4.1. Değişen konsantrasyonlarda BSA eklenmiş polimikrobiyal biyofilmlerde P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans sesil hücrelerinin cfu/ml sayıları ………………………………………... 50 Şekil 4.2. Farklı türden mikrobiyal sesil hücrelerin dezenfektanlar ajanlarına duyarlılıkları …………………………………………….. 52 Şekil 4.3. Hidrojen peroksit muamelesi sonrası olgun biyofilmlerdeki ROS seviyelerinin ölçümü ………………………………………………… 53 Şekil 4.4. S.aureus ve P.aeruginosa’nın stres ile ilişkili gen ekspresyonlarının değişimleri ………………………………………………………….. 55 xiii SİMGELER ve KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama 0 C Santigrat µl Mikrolitre ml Mililitre cfu/ml Koloni oluşturan ünite/mililitre mg/ml Miligram/mililitre M Molarite ∞ Sonsuz ~ Yaklaşık Kısaltmalar Açıklama AHL Açillenmiş homoserin laktonlar AI Autoinducer BHI Beyin kalp infüzyon BSA Bovine serum albumin BzCl Benzalkonyum klorür cDNA Komplementer DNA CET Setrimit CHX Klorhekzidin DCF 2’,7’- Dichlorodihydrofluorescein DCFHDA 2’,7’- dichlorofluoresein diasetat DET Dettol DNA Deoksribo nükleik asit ECM Ekstraselüler matriks EPS Ekzopolisakkarit ETOH Etanol FISH Floresan in situ hibridizasyon HAC Hospital antiseptic concentrate xiv Kısaltmalar Açıklama H202 Hidrojen peroksit H2SO4 Sülfirik asit KMnO4 Potasyum permanganat MBK Minimum bakterisidal konsantrasyonu MİK Minimum inhibisyon konsantrasyonu MLST Multi locus sequence typing mRNA Mesajcı RNA MRSA Metisilin dirençli Staphylococcus aureus NaOCl Sodyum hipoklorit OD Optik dansite PCV Protein konjuge aşılar PVP-I Polyvinyl prolidon-iyot PZR Polimeraz zincir reaksiyonu RNA Ribo nükleik asit ROS Reaktif oksijen türü SDA Saboraud dextrose agar TSA Triptik soy agar WSH Water Standard Hardness 1 1. GİRİŞ Polimikrobiyal biyofilmler, kronik yara enfeksiyonları, protez, stent, implant, kateter ve endotrakeal tüpler gibi yabancı cisim enfeksiyonları ve diğer bir çok nozokomiyal enfeksiyonlarda rastlanan yaygın bir problem haline gelmiştir. Bu persistan biyofilm enfeksiyonları, hastaların hastanede yatış sürelerinin uzamasına, tedavi sürecinde maaliyetin artmasına ve yüksek ölüm oranlarına yol açmaktadır. Polimikrobiyal biyofilmlerin klinikteki öneminin anlaşılması artarak devam etse bile yapıları ve özellikleri üzerine çok sayıda çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Hastanelerde yaygın kullanılan dezenfektanların polimikrobiyal biyofilmler üzerine etkinliğini anlamaya yönelik az sayıda çalışma bulunmaktadır. Ökaryotik, polimorfik yapılı ve fırsatçı bir patojen olan Candida albicans’ın enfeksiyonlarda genellikle Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa türü bakterilerle ile birarada bulunarak polimikrobiyal biyofilm kaynaklı enfeksiyonlara sebep olduğu bildirilmiştir. Çok sayıda virulans faktörüne ve antimikrobiyal ajanlara karşı aşırı eksprese edilen direnç genlerine sahip S.aureus türü bakteriler hastanelerde karşılaşılan önemli bir patojendir. P.aeruginosa, kistik fibrosisli veya immun kompromize hastalarda yüksek oranda enfeksiyonlara yol açan nozokomiyal, fırsatçı bir bakteridir. Bu çalışmada S.aureus, C.albicans ve P.aeruginosa türlerinden oluşan monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilm modelleri geliştirilmiş ve bu biyofilmlerin yüzey dekontaminasyonu aşamasında nasıl bir rol oynadıklarını belirlemek amacıyla 9 farklı dezenfektan geliştirilen biyofilm modeleri üzerinde test edilmiştir. P.aeruginosa sesil hücrelerinin monomikrobiyal ve üç farklı türden oluşan polimikrobiyal biyofilm içinde iken hidrojen peroksite karşı birbirinden oldukça farklı duyarlılık cevabı sergilediği gözlenmiş ve bu farklılığın nedeni titrimetrik, florimetrik ve moleküler yöntemlerle araştırılmıştır. Sonuçlarımız polimikrobiyal biyofilmleri eradike etmek amacıyla kullanılan stratejilerin, biyofilm oluşumunda varolan suş veya suşlara, kullanılan dezenfektanlara bağlı olarak değişkenlik göstermesi gerektiğini vurgulamaktadır 2 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Biyofilmin Tarihçesi İlk defa Antonie Van Leeuwenhoek ilkel mikroskobunu kullanarak diş yüzeyinden aldığı mikroorganizmaları gözlemlemiş ve biyofilmleri mikrobiyal topluluklar oluşturan ‘‘animaküli’’ olarak tanımlamıştır. Heukelekian ve Heller; sucul ortamlarda mikroorganizmaların tutundukları yüzeylerde biraraya gelmelerinin bakterilerin üreme ve aktivitelerini önemli ölçüde arttırdığını belirterek bu olaya ‘‘şişe etkisi’’ adını vermişlerdir [1]. Biyofilmlerin detaylı incelenmesi elektron mikroskobunun kullanılmasıyla başlamıştır. Jones ve arkadaşları, tarama ve geçişli elektron mikroskoplarını kullanarak su filtreleri üzerinde oluşan biyofilmleri incelediklerinde bu oluşumun çeşitli mikroorganizmalar tarafından meydana geldiğini göstermişlerdir. Aynı araştırmacılar polisakkarite özgül boyaları kullanarak biyofilmleri çevreleyen matriks yapısının polisakkaritlerden oluştuğunu belirlemişlerdir [2]. 1970’li yıllarda yüzeye tutunan bakterilerin kendi aralarında organize olabildikleri anlaşılmış ve ışık mikroskobundaki teknik ilerlemeler sayesinde bakteriyel biyofilmlerin organize topluluklardan oluşan heterojenik yapılar oldukları gösterilmiştir. Characklis çalışmasında endüstriyel su sistemlerinde oluşan mikrobiyal slaym yapılarını incelemiş ve bu yapıların klorin gibi dezenfektanlara oldukça dirençli olduklarını vurgulamıştır [3]. Sesil hücre topluluklarının hem diş plaklarında hem de akarsularda gözlenmesinden sonra 1978 yılında Costerton ve arkadaşları mikroorganizmaların canlı ve cansız yüzeylere tutunarak ekolojik bir niş oluşturduklarını ve bunu takiben biyofilmlerin meydana geldiği teorisini ortaya koymuşlardır [4]. Bu zamandan günümüze kadar yapılan endüstriyel, ekolojik ve medikal biyofilm çalışmaları birbiriyle paralellik göstermektedir. Son 20 yıldır biyofilmlerin sınıflandırılması üzerine gerek taramalı elektron mikroskobu gerekse standart mikrobiyolojik kültür teknikleri kullanılarak yoğun çalışmalar gerçekleştirilmektedir. 4 2.2. Biyofilmlerin Tanımı Biyofilmler; polisakkarit yapıdaki ekstraselüler matriks ile çevrelenmiş, birbirlerine ve yüzeylere geri dönüşümsüz olarak bağlı hücrelerden oluşan; üreme, gen ekspresyonu ve protein üretimi bakımından planktonik formlarına göre farklı fenotipler sergileyen sesil mikroorganizma toplulukları olarak tanımlanabilirler [5]. Bir biyofilmin kalınlığı tek bir hücre tabakasından, yoğun polimerik ortamla kaplı zengin hücre topluluğuna kadar değişkenlik göstermektedir [6]. Sesil biyofilm hücreleri kompleks biyofilm yapısının içinde oluşturulan akışkan kanallar ağı sayesinde en derin kısımlardaki besinlere ulaşabilme imkanı bulmaktadırlar. Biyofilm oluşumu içerisinde prokaryotik veya ökaryotik mikroorganizmalar sesil veya planktonik formlarından yalnızca birisi olarak yaşamlarını sürdürmektedirler. Yüzeye tutunma yoluyla oluşan sesil fenotipler genelde kendine ait karakterleri olan polimikrobiyal biyofilmlere dönüşmektedirler. Planktonik fenotipler ise ortamda özgür dolaşan ve çevresel ajanlara daha duyarlı mikroorganizmalardır [5]. Biyofilmler canlı dokular, medikal cihazlar, endüstriyel veya içilebilir su şebeke boruları veya doğal sucul sistemler gibi çok çeşitli yüzeylerde oluşabilmektedirler. Su şebeke sistemi biyofilmleri, korozyon ürünleri, çamur, su diyatomaları ve filamentöz bakterileri kapsayan kompleks yapılardan oluşurken, medikal cihaz yüzeylerinde gelişen biyofilmler ekstraselüler polimerik matriksle ilişkili bir yada daha fazla mikrobiyal organizmadan oluşan basit yapılardır [1]. 2.3. Biyofilm Oluşum Aşamaları Biyofilmler, tutunma, üreme, hareket ve ektraselüler polisakkarit üretimi gibi zamanla gelişen çeşitli dinamik işlemlerden meydana gelmektedir. Bir biyofilmin gelişim döngüsü tutunma, bağlanma, ilk ve ikinci olgunlaşma fazı ve ayrılma olmak üzere beş farklı aşamada gerçekleşmektedir. Tutunma aşaması çevresel sinyallerle tetiklenerek saniyeler içinde aktif olabilen ilk basamak olup tutunulan yüzey tabakanın etkisi, yüzeyde oluşan filmin yapısı, ortamın hidrodinamik yapısı, karakteristiği ve hücre yüzey yapısı gibi farklı faktörler tutunmada incelenmesi gereken önemli hususlardır. 5 Şekil 2.1. Biyofilm oluşum basamakları [7] 2.3.1. Tutunma basamağı a-) Yüzey tabakanın etkisi Yüzeyin pürüzlü yapısı, fizikokimyasal özelliği vs. mikrobiyal tutunma aşamasında önemli yer tutmaktadır. Araştırmaların çoğunda mikroorganizmaların cam ya da metal gibi hidrofilik nonpolar yüzeylere oranla hidrofobik yapıdaki teflon veya diğer plastik yüzeylere daha hızlı tutunduğu belirtilmiştir [8-10]. Tutunma aşamasındaki bu ilk bağlanma geri dönüşümlüdür. Bakteri hücreleri bu aşamada logaritmik üreme fazı sergilemektedir. b-) Yüzeyde polimerik film yapısının oluşumu Sıvı ortama maruz kalan yüzeylerin üzeri ortamda bulunan polimerlerle kaplanarak yüzeyde mikrobiyal tutunmanın derecesini etkileyen kimyasal modifikasyonlara sebep olmaktadır. Deniz suyuna maruz kalan yüzeylerde film tabakasının dakikalar içinde oluştuğu ve saatler içinde artmaya devam ettiği gösterilmiştir. İnsan vucudunda bu film yapısının çevreye oranla oldukça farklı olduğu gösterilmiştir. Diş yüzeylerinde oluşan pelikül yapıları, kan, tükrük, idrar, solunum sekresyonları gibi biyomateryallerden oluşan ve mikrobiyal kolonizasyonu ve tutunmayı kolaylaştıran konak kaynaklı polimerik film tabakaları bu farklılığa örnek gösterilebilir [1, 11]. 6 c-) Hidrodinamik yapı Katı yüzeyler üzerinde hidrodinamik tabaka oluşumunda sıvı akış hızı oldukça önem taşımaktadır. Akış hızı arttıkça yüzeydeki hidrodinamik tabaka kalınlaşmakta ve buraya tutunan hücreler daha fazla türbülansa maruz kalarak basınç etkisiyle yüzeylerden ayrılmaktadır [12, 13]. d-) Ortamın yapısı Besin seviyesi, pH, iyonik denge ve sıcaklık gibi çeşitli faktörler yüzeylere mikrobiyal tutunmada büyük önem taşımaktadır [14]. e-) Hücrelerin özellikleri Hücre yüzey hidrofobisitesi, pili, fimbriya ve flajellanın varlığı, ekzopolisakkarit (EPS) üretimi, hareket özelliği mikrobiyal hücrelerin yüzeylere tutunma derecesini etkileyen çeşitli faktörlerdir. Bakterilerin çoğunluğu negatif yüklü olup yüzeylerinde çeşitli hidrofobik yapılar içermektedir [15]. Bakteriler bu yapıları sayesinde yüzey ve mikroorganizma arasında var olan elektrostatik itme gücünün üstesinden gelebilmekte ve mikrobiyal aderens açısından avantaj yakalamaktadır. Bazı gram pozitif bakterilerin mikolik asit yapısına sahip olmalarından dolayı hidrofobik materyallere diğer bakterilere göre daha yüksek oranda tutundukları gösterilmiştir. Williams and Fletcher çalışmalarında Pseudomonas fluorescens’in lipopolisakkarit O antijen mutantının vahşi tipe oranla hidrofobik materyale daha fazla tutunduğunu belirtmişlerdir [1, 16]. 2.3.2. Geri dönüşümsüz bağlanma İkinci aşama geri dönüşümsüz bağlanma ile karakterize olup ilk tutunmadan dakikalar sonra meydana gelmektedir. Epitelyal yüzeye tutunmadan sonra bakteriler, aralarında iletişimi sağlayan kimyasal sinyalleri algılayarak çoğalmaya başlarlar. Sinyal seviyesi belirli bir seviyeye ulaştığında EPS üretimini sağlayan genetik mekanizmalar aktive olur. Bunun sonucunda mikroorganizmalar çoğalarak bol miktarda ekstraselüler matriks (ECM) sentezlemeye başlarlar. Ekstraselüler matriks hem mikroorganizmaları bir kütle içinde 7 birada tutarak biyofilm ilişkili antimikrobiyal direnç gelişimine sebep olmakta, hem de bu kütlenin canlı ya da cansız yüzeylere tutunmasını sağlamaktadır. Ağız florası bakterilerinden Streptococcus mutans tarafından oluşturulan glukan polisakkaritleri, Aggregatibacter actinomycetemcomitans ve Porphyromonas gingivalis’in ürettiği fimbriyalar ve A. actinomycetemcomitans, S. mutans ve Streptococcus intermedius tarafından üretilen hücre dışı çift zincirli DNA’lar biyofilmlerde gelişen ekstrasellüler matriks yapılarına örnek olarak verilebilir [17-21]. Faz II aşaması sırasında hücre agregatları oluşur ve bu agregatlar 10 mm’ den daha kalın bir tabaka halini aldıklarında hareketleri azalır. 2.3.3. İlk ve ikinci olgunlaşma fazı Üçüncü aşamada bulunan biyofilmler ilk olgunlaşma fazındaki hücreler olarak bilinirler. Biyofilmler 100 mm’den daha fazla kalınlığa ulaştıklarında ikinci olgunlaşma fazı hücreleri olarak adlandırılırlar ve biyofilm oluşumunda dördüncü aşamaya geçilmiş olur. Bu olgunlaşmış hücre yapıları incelendiğinde, ilkel bir sirkülasyon sistemi gibi çalışarak besinlerin ve mikroorganizmal atık ürünlerinin değişimine imkan sağlayan sıvı dolu kanallar ve içlerinde hücre bulundurmayan sınırları belirgin yapıda ara boşluklar gözlenmiştir. Olgun biyofilmler oksijen konsantrasyonu, pH değişimi, besin varlığı, metabolik aktivite, üreme ve hücre yoğunluğu gibi çeşitli faktörlere göre değişen heterojenik mikroçevreler içerirler [22]. 2.3.4. Ayrılma basamağı Biyofilm gelişimine son katkı olan beşinci aşamada; biyofilm hücreleri ana yapıdan koparak çevreye dağılmaktadırlar. Bu aşama 4. aşamadan birkaç gün sonra başlamaktadır [6]. Genetik olarak programlanmış yanıt veya sıvısal mekanik kuvvet sayesinde mikrokoloniler ana biyofilm kitlesinden kopmaktadırlar [23, 24]. Kopan mikrokoloni grupları hareket yetenekleri sayesinde veya ortamda varolan sirkülasyon sayesinde konakta enfekte olmamış bölgelere giderek buralarda tutunur ve yeni biyofilm oluşumunu başlatırlar. Biyofilm oluşumunun diğer aşamalarından farklı olarak hücrelerin ayrılma basamağı çeşitli çevresel sinyalleri, sinyal transdüksiyon yolaklarını ve efektörleri içeren karmaşık işlemlerden oluşabilmektedir [25]. Bu aşama biyofilmlerin yaşam döngülerinde 8 henüz tam anlaşılamamış olmakla birlikte çok sayıda araştırmacı bu konuya yoğun ilgi göstermektedir [22]. Biyofilmlerde bazı yapılar ortak olsa dahi, immunolojik komponentler ve konağa ait faktörler biyofilm oluşumunda önemli rol oynamaktadır. 2.4. Biyofilmlerin Yapısı Biyofilmler; polisakkaritleri, nükleik asitleri, proteinleri, lipidleri ve metal iyonlarını içeren ekzopolimer polimerik matriks içine gömülmüş, birbirlerinden su kanallarıyla ayrılan bakteriyel mikrokolonileri içeren, ortamda bulunan organik ve inorganik moleküllerin ekstraselüler yapıda toplanması sonucu mercan kayalıklar benzeri yapı oluşturan heterojenik yapılardır [26]. Bu heterojenik yapılar hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal biyofilmlerde gözlenmektedir. Su kanalları içinde bulunan sıvı akışı sayesinde ortamdaki besin, oksijen ve karbon molekülleri hücre içine yayılarak biyofilm oluşumuna yardımcı olmaktadır. Biyofilm kalınlığı biyofilmi oluşturan mikroorganizma sayısıyla doğru orantılıdır. Reaktör modeli uygulanarak oluşturulmuş Klebsiella pneumoniae ve P.aeruginosa biyofilmlerinde her iki mikroorganizma tarafından oluşturulan polimikrobiyal biyofilmin ayrı ayrı oluşan monomikrobiyal biyofilme oranla çok daha kalın yapıda olduğu gösterilmiştir [27]. Biyofilmlerin toplam karbonik yapısının % 50-90’ını oluşturan ekzopolimer polisakkaritler, farklı mikrobiyal türlerden oluşan biyofilmlerde kimyasal yada fiziksel özellik bakımından değişkenlik göstermektedir. Gram negatif bakterilerin EPS yapısı nötral yada poli-anyonik yapıdadır. Ayrıca uronik asit varlığı (D-glukoronik, Dgalakturonik, ve mannuronik asit) veya ketal bağlı piruvat yapısı EPS’nin anyonik özellik göstermesine neden olmaktadır [28]. Bu anyonik özellik kalsiyum veya magnezyum gibi divalan katyonların biraraya gelmesine yardımcı olarak biyofilmlerde kuvvetli çapraz bağların oluşmasına yol açmaktadır 38. Bazı gram pozitif bakteri EPS yapıları incelendiğinde gram negatif bakterilerinden farklı olarak kimyasal kompozisyonlarının katyonik yapıda olduğu belirtilmiştir [29]. EPS’lerin primer konformasyonunu belirleyen faktörler arasında polisakkaritlerin yapı ve kompozisyonu yer almaktadır. Bazı bakteriyel EPS’ler ortamda kolay çözünürken, 1,3 ya da 1,4 bağlı hekzos kalıntılarını içeren EPS’lerin deformasyona daha dayanıklı, sağlam 9 yapılı ve az miktarda çözünen ve/veya çözünmeyen yapılar oldukları gösterilmiştir [28]. 2.5. Polimikrobiyal Biyofilmler Mikroorganizmaların çoğunluğu sıklıkla biyotik ya da abiyotik alanlara tutulmuş, hücreler arasında iletişimin varolduğu kompleks polimikrobiyal biyofilm formları içinde bulunarak yaşamlarını sürdürmektedir [30]. Polimikrobiyal biyofilmler; mikrobiyal yada konak kaynaklı polisakkaritlerden oluşan matriks içine gömülü, virüs, bakteri, mantar ve parazit gibi çeşitli mikroorganizmalardan oluşan karmaşık hücre topluluklarıdır. Belirli bir alanda çok sayıda farklı mikrobiyal türün birarada bulunması sonucunda zamanla türe özgül fizyolojik ve kimyasal iletişimlerin evrimleşme gösterdiği gözlenmiştir. Mikroorganizmalar aynı habitat içinde birbirlerine mutualistik, sinerjistik veya antogonistik etki yaratabilmektedir [31]. Çok sayıda mikrobiyal ajanın bulunduğu bu ortamda bir tür diğeri için uygun yaşam alanı hazırlayabilmektedir. Türler arasında gerçekleşen bu tarz sinerjistik etkileşimlere mikrobiyal interferans denilmektedir. Birden fazla mikrobiyal türün bulunduğu polimikrobiyal biyofilmlerde yoğun popülasyon artışı tür içi ve türler arası gen transferlerinin gerçekleştiği gözlenmiştir. Bakteriyel plazmid yada küçük kromozomal yapıların transferleri sonucunda avirulan olan bir suş oldukça virulan bir patojen haline dönüşebilmektedir. Besin azlığı yada yoğun mikrobiyal popülasyon içeren biyofilm ortamında bir türden diğerine aktarılan bu genler mikroorganizmaların yaşam sürecini arttırmaya yardımcı olmaktadırlar [32]. Bugüne kadar biyofilmler hakkında edinilen bilgilerin çoğu monomikrobiyal biyofilmler üzerine olup, doğal yada klinik ortamda çoğunlukla polimikrobiyal biyofilm formlarının bulunduğu unutulmamalıdır. Kültür bağımlı izolasyon tekniklerinden dolayı hastalıkların çoğu monomikrobiyal kökenli olarak tanımlanmış ancak kültürden bağımsız analiz yöntemlerinin geliştirilmesiyle oral kavite enfeksiyonları, otitis media, diyabetik yara enfeksiyonları, kronik kistik fibrosis gibi çeşitli hastalıkların çoğunlukla polimikrobiyal kökenli olduğu anlaşılmıştır. Hem biyofilmlerin yapısını daha iyi anlayabilmek hem de hastalıkların ciddiyetini ve gidişatını belirleyebilmek adına enfeksiyonlarda polimikrobiyal popülasyonun belirlenebilmesi ve birbirleriyle etkileşimlerinin saptanabilmesi oldukça önem taşımaktadır [30]. 10 2.6. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Yapısal Gelişimi Bakteri türleri birbirleriyle yoğun iletişim halinde olup bu iletişimler polimikrobiyal biyofilmlerin yapısını belirleyebilmektedir. Polimikrobiyal bir topluluğun karmaşık yapısının anlaşılması ilk olarak dental plak biyofilmlerini oluşturan popülasyonun araştırılmasıyla ortaya çıkmıştır. Bir mikrobiyal türün diş yüzeyine veya ağız dokusuna geçici kolonizasyonu sonrasında ortamda bulunan diğer türler kolonize olan bu türe tutunabilmektedirler ve dolaylı yoldan yüzeylere de kolonize olabilmektedirler. Ortama erken kolonize olan tür adeta diğer türler için iskele görevi görerek sonraki aşamalarda tutunabilecek diğer türleri belirleyebilmektedir. Bu şekilde gerçekleşen tutunma işlemine koagregasyon denilmektedir [33] Şekil 2.2. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunun gösterilmesi A) Biyotik yüzey B) Bakterilerin yüzeye erken kolonizasyonu C) Erken kolonize olan bakterilerin ortamdaki diğer türleri kendine bağlaması D) Spesifik planktonik mikroorganizmaların agrege olmuş hücre topluluklarının bağlanmasına yardımcı olması Dental plak biyofilmi oluşumunda yüzlerce oral bakterinin birbirleriyle agregat oluşturdukları saptanmıştır. Yapılan çalışmalarda EPS yapısının koagregasyonda yapıştırıcı görevini üstlenerek hücrelerin birbirine sıkı tutunmasına aracılık ettiği belirtilmiştir [34, 35]. Adezin proteinleri aracılı koagregasyon polimikrobiyal biyofilm oluşumunda temel esasdır. Yapılan bir çalışmada dental plak biyofilminden izole edilen Streptococcus oralis DL1 suşunun diğer dental türlerle agregat oluşumunda gerekli 5 farklı 11 adezin proteinini eksprese ettiği belirtilmiştir [36-39]. Adezyon proteinleri mantarlarda da bulunan proteinler olup mantar-bakteri ilişkisine de aracılık edebilmektedir. Grimaudo ve arkadaşları çalışmalarında oral streptokok türlerinden Streptococcus gordonii, S.oralis ve S. sanguinis’in C.albicans’a yüksek afinite sergilediklerini ancak C.albicans ve Candida dubliniensis’inde Fusobacterium türlerine daha yüksek afinite sergilediğini gözlemlemişlerdir [33, 40]. Sonraki çalışmalarda mannan’ı parçalayan mannoz enzimi ortama eklendiğinde C.albicans ve Fusobacterium arasındaki ilişkinin inhibe olduğu gözlenmiş ve bunun sonucunda Fusobacterium’un protein komponentinin Candida’nın karbonhidrat yapıdaki yüzey reseptörlerine bağlandığı açığa çıkarılmıştır. Diğer bir çalışmada ise Candida yüzeyindeki protein reseptörüne Actinomyces’in karbonhidrat yapıdaki yüzey molekülünün bağlanarak agregat oluşturdukları gözlenmiştir [33]. Bakteriyel yüzey pili ve flajella yapıları ve bu organeller aracılı hareket özelliğinin polimikrobiyal biyofilm oluşumunda gerekli olduğu belirtilmiştir. P.aeruginosa tip IV pili ve flajellası aracılığı ile Agrobacterium tumefaciens mikrokolonileri içine yerleşmekte ve bu ikili biyofilm oluşumunda kendisine üreme avantajı sağlamaktadır [41]. P.aeruginosa S.aureus ikili biyofilm gelişiminde tip IV pili’nin ortamdaki S.aureus eDNA’larına bağlanarak biyofilm oluşumunu desteklediği gözlenmiştir. Escherichia coli ve Citrobacter freundii arasındaki biyofilm oluşumunun ise E.coli’nin konjugatif pilisi (F pili) aracılığıyla gerçekleştiği ortama F pili inhibitörü olan çinko eklendiğinde ise biyofilm oluşumunun inhibe olduğu bildirilmiştir [42]. 2.7. Polimikrobiyal Biyofilmlerdeki Etkileşimler 2.7.1. Sinerjistik etkileşimler Polimikrobiyal bir biyofilmi oluşturan mikroorganizmaların birbirleriyle etkileşimleri ve iletişimleri sonucunda o biyofilmin fizyolojik ve kimyasal yapıları oluşmaktadır. Sesil biyofilm hücreleri aynı zamanda bu etkileşimler sayesinde direnç faktör eldesi, metabolik paylaşım, olumlu yan ürün etkisi, ‘‘quarum sensing’’ sistemi ve DNA paylaşımı sağlayan gen havuzu gibi çok sayıda avantajlara sahip olmaktadırlar [43-48]. Bazı durumlarda pasif direnç denilen durum sayesinde bir direnç faktörüne sahip olan 12 mikrobiyal tür buna sahip olmayan diğer mikrobiyal türleri antimikrobiyallere karşı koruyabilmektedir. Beta-laktamaz enzimi üreten Haemophilus influenza’nın herhangi bir direnç faktörü içermeyen Streptococcus pneumonia ile birlikte kültürü yapıldığında, S.pneumoniae’nin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) / minimum bakterisidal konsantrasyonu (MBK) değerlerinde monomikrobiyal kültüründen elde edilen değerlerine oranla daha fazla artış gözlenmiştir [43]. Ortak metabolik beslenme polimikrobiyal biyofilmlerde görülen avantajlı bir durumdur. A.actinomycetemcomitans ve oral streptokok türleri ile yapılan bir çalışmada konağın doğal immunitesine karşı A.actinomycetemcomitans’ın direncinde gözlenen artış moleküler mekanizmalar ile araştırılmıştır. Oral streptokokların nötrofil birikimine ve lokal inflamasyona yol açan hidrojen peroksit (H2O2) ürettiği bilinmektedir. Artmış H2O2 üretimine cevap olarak A. actinomycetemcomitans hücrelerinde iki farklı gen bölgesinde ekspresyon artışı saptanmıştır. Bu genlerden biri ‘‘katA’’ geni olup Streptokoklar ve nötrofiller tarafından üretilen H2O2’yi, H2O ve O2’ye dönüştüren katalaz enzimini kodlamaktadır. Bir diğer gen bölgesi ‘‘apiA’’ olup inflamasyona yol açan serum kompleman aktivitesini inhibe eden proteini kodlamaktadır. Bu proteinin ekspresyonu sayesinde konağın kompleman aracılı lizisinin engellendiği gösterilmiştir [49]. Biyofilmlerde ortama salınan ‘‘quarum sensing’’ sinyal molekülleri, metabolik yolaklar, virulans faktörleri, biyosürfaktanlar, EPS üretimi ve hareket yetenekleriyle ilişkili genlerin ekspresyonunu kontrol etmekte ve türler arası iletişimde oldukça önemli rol oynamaktadırlar. Açillenmiş homoserin laktonlar tür ve cinsler arası iletişime aracılık edebilen en yaygın otoindükleyici [Autoinducer (AI)] moleküllerdir [50, 51]. Küçük bir ‘‘quarum sensing’’ molekülü olan AI2 molekülü gram negatif, gram pozitif ve anerob bakterilerin bulunduğu polimikrobiyal bir ortamda tüm türler tarafından tanınabilmektedir [52] Riedel ve arkadaşları çalışmalarında kistik fibrosis enfeksiyonunun etkin patojeni olan P.aeruginosa tarafından ortama salınan AHL sinyalinin diğer etkin patojen olan Burkholderia cepacia tarafından algılandığı ve Burkholderia cepacia virulans genlerinin ekspresyonunda artış gözlendiği belirtilmiştir [53]. Ayrıca kistik fibrosis enfeksiyon patojenlerinden bir diğeri olan Stenotrophomonas maltophila’nın salgıladığı sinyal molekülünün P.aeruginosa’nın polimiksine karşı toleransında azalmaya neden olduğu da 13 gözlenmiştir [54]. Biyofilmlerde türler arası iletişimi ve etkileşimi sağlayan sinyal molekülü analoglarının yada sinyal moleküllerini degrade eden enzimlerin ortama verilmesiyle iletişimin önemli ölçüde baskılandığı gösterilmiş ve bu moleküllerin antibiyotiklere alternatif olabilecek tedavi yaklaşımları arasında görülebileceği vurgulanmıştır [55]. 2.7.2. Antagonistik etkileşimler Biyofilmlerde bazı durumlarda mikroorganizmalar besin rekabeti, oksijen kısıtlılığı, toksik maddelerin ortama salınımı gibi çeşitli sebeplerle ortamda bulunan diğer mikroorganizmaların üremesini engellemeyi veya öldürmeyi hedeflemektedirler. Buna örnek olarak P.aeruginosa’nın çok sayıda toksik etkili virulans faktörünü ortama salarak C.albicans’ın üremesini inhibe ettiği yapılan çalışmalarda açıklanmıştır. Tong ve arkadaşları, Streptococcus oligofermentans’ın L-aminoasit oksidaz enzimi sayesinde peptondan H 2 O2 üretimine yol açarak S.mutans’ın üremesini inhibe ettiğini gözlemlediklerini belirtmişlerdir [56, 57]. 2.8. Polimikrobiyal Biyofilmlerin Hastalıklardaki Rolü 2.8.1 Oral enfeksiyonlar Ağız mikrobiyolojisinde biyofilmler temel araştırma konusu olup oral hastalıklardaki rolleri detaylı incelenmektedir. Dental biyofilm bakterileri normal zamanda konakla bir uyum içinde yaşamlarını sürdürürler. Ancak mikrobiyal ortamda gelişen ekolojik değişimler, dental taşıyıcılık ve periodontal hastalık gibi önemli ağız enfeksiyonlarının gelişimine sebep olmaktadır [58]. Dental taşıyıcılık tüm yetişkin bireylerin büyük çoğunluğunda ve okul çağındaki çocuklarda çok sık görülen ağız enfeksiyonlarından biridir [59]. Protein ve tükrük salgılarıyla kaplanan diş yüzeylerinde pelikül denilen ince zar tabakası oluşumu sert diş minesi yapısının bozulmasına yol açmaktadır. Bu durum, dental plak denilen ortamdaki mikrobiyal türlerin diş yüzeyine tutunup birbirleriyle agregatlar oluşturmasına ve bunu takiben matriks içine gömülü polimikrobiyal biyofilm topluluklarının gelişimine yol 14 açmaktadır [60]. Sağlıklı ve derin yerleşimli dental taşıyıcılığı olan bireylerden alınan örnekler incelendiğinde diş çürüğü örneklerinin tümünde enfeksiyon etkenleri olarak polimikrobiyal mikroorganizmalar gözlenmiştir. C.albicans’ın oral streptokoklarla birlikte kolonize olabilmesi ve düşük pH (<4.5) ortamlarında yaşamını sürdürebilmesinden dolayı aktif dental taşıyıcılıkta önemli rolü olduğu bilinmektedir [30]. Li ve arkadaşları çalışmalarında Fusobacterium ve Neisseria türlerini diş çürüklerine yol açabilen patojenler olarak belirlerken Bacteroides, Treponema, Provetella ve Corynebacterium türlerini çürüklerde koruyucu rolleri olan mikroorganizmalar olarak belirlemişlerdir [61]. Dental taşıyıcılıkta primer patojen olarak bilinen S.mutans tarafından üretilen laktatı ve süksinatı bazı Veilonella türlerinin ortamda hızlıca degrade edebilmesinden dolayı ağız sağlığı açısından yararlı bakteriler olarak bilinirler. Protez stomatit diş yüzeyi ile yakın temasta bulunan yumuşak dokuların ödem ve kızarıklığı olarak bilinir ve polimikrobiyal biyofilm aracılı oral enfeksiyonlarda detaylı olarak çalışılmıştır. Hastalara takılan diş protezleri ağızda tükrük salgısının akışını kısıtladığından dolayı enfeksiyon gelişimine yardımcı olmaktadır. Protez takılan hastaların tükrük ve diş yüzeyi sürüntü örnekleri incelendiğinde C.albicans ve S.aureus türlerinin hem sağlıklı hem de stomatitli hasta örneklerinde izole edildikleri belirtilmiştir. Ancak oral mukozada S.aureus daha fazla saptanırken diş yüzeylerinde C.albicans’ın sayıca daha fazla bulunduğu gözlenmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkılarak bakteriyel süperenfeksiyon ve konak doku iltihabına yol açan S.aureus bakterisinin ortama kolonize olmasında C.albicans’ın yardımcı rolü olduğu iddia edilmiştir [62]. C.albicans ve S.aureus’dan oluşan ikili biyofilm yapısı incelendiğinde C.albicans’ın adeta bir iskele görevi görerek S.aureus’un yüzeye tutunmasına ve mikrokoloniler oluşturmasına yardımcı olduğu belirtilmiştir. Aynı zamanda monomikrobiyal biyofilmlerine oranla, C.albicans - S.aureus biyofilmlerinde sesil S.aureus hücrelerinin vankomisin direncinde artış gözlenmiş ve bu artışın C.albicans’ın matriks yapısının S.aureus’u vankomisinin etkisinden korumasından kaynaklandığı belirtilmiştir [63]. Periodontit, diş dokusuna destek yapıların hasarı, diş kemik dokusunun erimesi ve sonunda diş kaybıyla sonuçlanan kronik diş eti iltihabı olarak bilinen polimikrobiyal biyofilm kaynaklı ağız enfeksiyonudur [64]. Otuz beş yaş üstü hastalarda görülen yetişkin periodontitinde en sık karşımıza çıkan 15 mikrobiyal türler P. gingivalis, Treponema denticola ve Tannerella forsythia olup otuzbeş yaş altı hastalarda gözlenen erken periodontitde P.gingivalis ile birlikte izole edilen A. actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia ve Capnocytophaga sputigena türleri sıklıkla izole edilen türler arasında yer almaktadrlar [65]. Yapılan çalışmalarda polimikrobiyal biyofilm oluşumunda Fusobacterium nucleatus’un P.gingivalis’in çoğalmasını sinerjistik olarak destekleyerek total biyofilm kütlesinde artışa yol açtığı saptanmıştır. Ayrıca F.nucleatus’un gingivit enfeksiyonunda P.gingivalis’in epitel hücresi içine penetrasyonunu da arttırdığı gösterilmiştir [65-67]. Polimikrobiyal biyofilm kaynaklı oral enfeksiyonlara yönelik tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde klinik ilişkili türlerin birbirleriyle ilişkilerini ve etkileşimlerini anlamaya yönelik yeni çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. 2.8.2. Otitis Media Çocukluk çağı hastalıklarından biri olan orta kulak iltihabı ağrı, ateş ve kulak akıntısı semptomlarıyla baş gösteren orta kulak enfeksiyonu olarak bilinmektedir. Nadiren ölümcül olan bu enfeksiyon kronik seyir gösterip ileri aşamada kısmi ya da tamamen duyma kaybına yol açabilmektedir [68]. Enfeksiyondan sorumlu mikroorganizmalar sıklıkla kommensal bakteri türleri olan S.pneumoniae, H. influenza ve genellikle üst solunum yolu virusleriyle birlikte izole edilen Moraxella catarrhalis türleridir. Bu mikroorganizmaların çoğu enfeksiyonda tek başına rol oynayabilecekleri gibi birlikte de çoğalarak hem hastalığın şiddetini arttıran hem de konağın birden fazla mikroorganizmayla kolonizasyonu sağlayan polimikrobiyal biyofilmleri oluştururlar [69]. Üst solunum yolu virüslerinin konak epitel hücrelerine bakteriyel kolonizasyonu arttırarak hastalığın patogenezinde artışa sebep oldukları gözlenmiştir. S.pneumoniae ve S.aureus’un Influenza A virüsü ile enfekte konağın nazofarinks’inde virüsle enfekte olmayan konağa oranla daha fazla bulundukları belirtilmiştir [30, 70]. M.catarrhalis ve tiplendirilemeyen H.influenza tarafından gelişen polimikrobiyal enfeksiyonda M.catarrhalis suşlarının gerek konak immün cevabına gereksede 16 antimikrobiyal tedaviye direncinde artış gözlenmiştir. Ancak H.influenza luxS defektli mutant ile aynı çalışma tekrarlandığında M.catarrhalis’in immune cevaba ya da antimikrobiyal tedaviye direnç göstermediği gözlenmiştir. Bu sonuçlardan yola çıkarak, quarum sensing aracılı türler arası iletişimin polimikrobiyal biofilm aracılı otitis media enfeksiyonunu arttırdığı düşünülmektedir [71]. 2.8.3. Diyabet kökenli yara enfeksiyonları Şeker hastalığı diye bilinen diyabet vücudun insulin cevabında gözlenen hasar olup dünya popülasyonunun yaklaşık % 6.4’ünü etkilemektedir. Tip 1 ve tip 2 diyabet en yaygın gözlenen şeker hastalığı formlarıdır ve insülin salgılayan hücrelerin otoimmün aracılı yıkımından ya da insülin direncine yol açan reseptör hücrelerde defektlere neden olan metabolik bozukluklardan kaynaklanmaktadır. Vücutta düşük seviye insülin üretimi veya insüline duyarsızlık, kan hücrelerinde yüksek glikoz artışına, ozmotik dengesizliğe, doku dehidratasyonuna ve organ hasarına yol açmaktadır. El, ayak ekstremitelerinde gözlenen periferal nöropati, zayıf kan dolaşımı gibi çeşitli semptomlar diyabetli bireylerde enfeksiyon gelişimi riskine ve standart tedavilerle çözülemeyen polimikrobiyal biyofilm kaynaklı kronik ülseratif yara enfeksiyonlarına neden olmaktadır [30]. Diyabetik yara enfeksiyonu olan bireylerden sürüntü ve aspirasyon örnekleri alınarak yapılan çok merkezli bir çalışmada örneklerin % 48,9’unda aerobik, %1,3’ünde anaerobik, % 43,9’unda ise aerob ve anaerob karışık bakteri popülasyonu izole edilmiştir. Corynebacterium spp., Enterococcus spp., E.coli, S.epidermidis ve S.aureus türleri örneklerden en sık izole edilmiş aerobik bakteriler iken, Fusobacterium spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp., Bacteroides spp. ve Clostridium spp. türlerinin ise en sık izole edilen anerobik bakteriler olduğu gözlenmiştir [72]. S.aureus diyabetik yara enfeksiyonlarında sık izole edilen bakterilerden biri olup S.aureus biyofilm defektli mutant ile yapılan çalışmalarda yara iyileşiminin normal seyrinde devam ettiği ancak defektin kaldırılmasıyla birlikte enfeksiyon şiddetinin arttığı ve yara iyileşme hızının yavaşladığı gözlenmiştir [73]. E.coli, Bacteroides fragilis ve Clostridium perfringens’in tek başlarına ikili ya da üçlü kombinasyonları kullanılarak yapılan hayvan deneyi çalışmalarında en yüksek mortalite oranının üç bakterininde enjekte edildiği hayvanlarda gözlendiği belirtilmiştir. Enjeksiyonun erken dönemlerinde E.coli ve 17 B.fragilis güçlü bir sinerjistik etki gösterirken ilerleyen dönemlerde antagonistik etkileşimler sergiledikleri gösterilmiştir [74] . 2.8.4. Kistik fibrozis enfeksiyonu Kistik fibrosis, kalın ve yapışkan mukus tabakası üretiminden dolayı hastaları sıklıkla akciğer enfeksiyonuna yatkın kılan yaygın bir genetik hastalıktır. Kistik fibrosis transmembran regülatör proteininde oluşan mutasyonlar, proteinlerin yanlış katlanması sonucu hücrelerin degredasyonuna sebep olmakta ve kistik fibrosis gelişimine neden olmaktadır [75]. Hastalarda normal mukosiliyer temizlemenin bulunmaması yoğun mukus üretimine ve aşırı akciğer enfeksiyonuna neden olmaktadır. Sağlıklı bireylerde inhalasyon yoluyla alınan patojen mikroorganizmalar solunum yolunda tutularak mukosiliyer tabaka sayesinde yok edilirken, kistik fibrozisli bireylerde bu temizlenme işlemi gerçekleşmez ve sıklıkla alt solunum yollarında polimikrobiyal biyofilm kaynaklı enfeksiyon gelişimiyle sonuçlanır [76]. Polimikrobiyal enfeksiyonlu hastalardan en sık izole edilen mikrooganizmalar P.aeruginosa başta olmak üzere S.aureus, Streptococcus milleri grubu (SMG) patojenleri, B.cepacia, S.maltophilia, H.influenza ve C.albicans dır. Polimikrobiyal kaynaklı kistik fibrosis enfeksiyonlarında C.albicans ve P.aeruginosa türleri arasında antagonistik etkileşimler saptanmıştır. Kistik fibrosisli hastalardan izole edilmiş P.aeruginosa’nın ortama saldığı ‘‘quarum sensing’’ moleküllerinin enfeksiyonun diğer önemli patojeni olan C.albicans’ın tomurcuklanmasını engelleyerek ortamda çoğalmasını önlediği gözlenmiştir. Ayrıca Pseudomonas bakterisinin Candida’nın hif hücrelerine tutunarak mantar hücresinin lizisini tetikleme yoluyla ölümüne yol açtığı saptanmıştır [77]. C.albicans ve P.aeruginosa arasındaki bu antagonistik etkileşim tek taraflı olmayıp C.albicans tarafından salınan farnesolün pseudomonal bir virulans faktörü olan demir bağlayan piyosiyanin’in ekspresyonunu anlamlı ölçüde azalttığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar ışığında, kistik fibrozisli hastalarda Pseudomonas bakteri kolonizasyonunu engelleyebilme stratejilerinde farnesolün etkin rol oynayabileceği ortaya çıkarılmıştır [78]. Beş yıllık bir sürveyans çalışmasında kistik fibrosis hastalarının erken dönemde S.aureus ve H.influenza ile kolonize olduğu, sonraki dönemde bu kolonizasyonu P.aeruginosa’nın 18 takip ettiği, son dönemde ise B.cepacia kolonizasyonunun gerçekleştiği gösterilmiştir. Kistik fibrosis balgam örneklerinden izole edilen S.aureus ve P.aeruginosa bakterilerini içeren polimikrobiyal kültürde, P.aeruginosa tarafından ortama salınan HQNO solunum inhibitörü bileşiğinin S.aureus üremesini ilk beş saat içinde baskıladığı gözlenmiştir. Bu iki bakterinin birlikte üretildiği diğer bir çalışmada, HQNO bileşiklerine uzun süre maruz kalan S.aureus bakterilerinin solunum yolu elektron transport sistemi defektlerine sahip küçük koloni varyantlarını oluşturarak tobramisin antibiyotiğinin etkisinden korunduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda bu iki bakteri türünün birbirine hem antagonistik hem de sinerjistik etki gösterdiği saptanmıştır [79]. Kistik fibrosis hastalığında B. cepacia kompleks’in neden olduğu enfeksiyonlar çoğunlukla yüksek ölüm oranıyla sonuçlanırlar. Enfeksiyonda B.cepacia ve P.aeruginosa’nın beraber bulunması hastanın pulmoner fonksiyonlarında ani bozukluğa ve kötü seyirli klinik tabloya yol açmıştır. Ayrıca yapılan çalışmalarda ortamda P.aeruginosa varlığının, Burkholderia’nın epitel hücrelere daha fazla tutunmasına ve virulans faktörü genlerinin daha fazla eksprese olmalarına yol açtığı gözlemiştir [30]. Kistik fibrosis’li yetişkin ve pediatrik hastaların bronkoalveolar lavaj örneklerinden Prevotella, Veilonella, Propionibacterium ve Actinomyces türü anaerob bakteriler izole edilmiştir. Kültürden bağımsız teknikler kullanılarak yapılan çalışmalarda bu anaerobik türlere ek olarak çok sayıda farklı türlerin de enfeksiyonda yer aldığı ve bu türlerin hastadan hastaya değişkenlik gösterdiği vurgulanmıştır. Araştırmacılar anaerobik floranın kistik fibrozis enfeksiyonunda etkin rol oynaması durumunda, günümüzde kullanılan çoğu antimikrobiyal ajanın enfeksiyonu önlemede yetersiz kalacağını vurgulamaktadırlar [80]. 2.8.5. Yabancı cisim kaynaklı enfeksiyonlar a-) Santral venöz kateterler Kan dolaşımı enfeksiyonlarının çoğunluğundan santral venöz kateterleri sorumlu olup yaygın kullanımları uzun süre hastanede kalıma ve ciddi maliyet artışına yol açan komplikasyon riskini de beraberinde getirmektedir [81]. Kateter ilişkili enfeksiyonlar nozokomiyal endokarditin ana nedenleri arasında görülmekte olup kateterin takıldığı 19 anatomik bölge ve kateterizasyon süresi enfeksiyon için temel risk faktörlerini oluşturmaktadır [82, 83]. Kateter aracılı biyofilm oluşumlarından sıklıkla S.epidermidis, S.aureus, C.albicans, P.aeruginosa, K.pneumoniae ve E.faecalis mikroorganizmaları izole edilmekte olup genellikle hastanın deri florası, hastane personeli mikroflorası veya kontamine materyaller bu izolatların ana kaynağını oluşturmaktadır [84]. Çalışmaların çoğunda bu enfeksiyonların kontrolüne yönelik çeşitli antimikrobiyal tedavi yöntemlerinin etkileri değerlendirilmiştir. Klorhekzidin ve gümüş bileşikleri, minosiklin ve rifampin antibiyotiği, benzalkonyum klorür ve katyonik sürfaktanlar gibi çeşitli antimikrobiyallerin farklı konsantrasyonları ile kaplanmış yada emdirilmiş kateterlerin etkinlikleri birbirleriyle kıyaslandığında minosiklin ve rifampin ile doygunlaştırılmış kateterlerin kısa dönem kateterizasyonda kolonizasyonu azalttığı gözlenmiştir [81]. b-) Üriner kateterler Mikrobiyal kolonizasyon sonucu üriner kateterlerin yüzeylerinde oluşan biyofilmler kateter ilişkili idrar yolu enfeksiyonlarının ana sebepleri arasında yer almaktadır [85]. Bu aletlerin kontaminantı olarak karşılaşımıza en sık çıkan mikroorganizmalar S.epidermidis, E.faecalis, E.coli, P.mirabilis, P.aeruginosa, K.pneumoniae ve diğer gram negatif bakteri türleridir. Yapılan bir araştırmada kısa dönem kateterizasyon sonrası hastaların %10-50’sinde biyofilm kaynaklı üriner sistem enfeksiyonları gözlenirken uzun dönem kateterizasyon sonrasında bu oran %100’ü bulmuştur [84]. Kateter yüzeylerine adezyonda yüzey ve mikroorganizma arasındaki hidrofobisite oldukça önem taşımaktadır. Hem hidrofobik hemde hidrofilik yüzeye sahip bir kateterde çok çeşitli mikroorganizma kolonizasyonu gözlenmiştir. Üriner kateter ilişkili biyofilmleri engellemeye yönelik; antimikrobiyal merhem uygulaması, mesane instilasyonu ve yıkanması, idrar toplama poşetinin antimikrobiyal ajan içermesi, sistemik antibiyotik veya gümüş oksit gibi bileşiklerin üriner katetere emdirilmesi gibi pek çok strateji geliştirilmiştir. Gümüş emdirilmiş kateterlerin hastada 20 bakteriüri oluşumunu dört gün kadar geciktirdiği gözlenmiştir. Polimikrobiyal biyofilm ile enfekte kateteri bulunan hastaya siprofloksasin tedavisi verildiğinde kateterin temizlendiği ve 10 haftaya kadar da kesintisiz direnaj sağlandığı gözlenmiştir. Otuz güne kadar salım yapan norfloksasin ile kaplanmış kateter kullanılmasının hastada E.coli, K.pneumoniae ve P.vulgaris üremesini 10 güne kadar inhibe ettiği gözlenmiştir [86]. c-) Mekanik kalp kapakları Mikroorganizmaların hastalarda yapay kalp kapakçıkları üzerinde veya protez etrafındaki dokuda biyofilm oluşturarak yapay kalp endokarditine sebep oldukları gözlenmiştir. Genellikle deri florası, yabancı cisim ya da dental invaziv işlemlerden köken alan S.epidermidis, S.aureus, gram negatif basiller, enterokok türleri, difteroidler ve Candida türleri bu enfeksiyonlardan sorumlu tutulmaktadır [84]. d-) Ortopedik implantlar Oldukça ciddi hijyen protokollerinin ve antibiyotik proflaksi uygulamalarının varolmasına rağmen hastalarda en sık diz ve kalça implantı yerleşimi sonrasında biyofilm kaynaklı enfeksiyonlar gözlenmektedir. Geniş spektrumlu antibiyotiklerin kemik dolgu maddelerine veya ara parçalarına absorbe edilmesi sonucu pek çok mikroorganizma üremesine karşı etkin korunma sağlanmıştır. Gentamisin, rifampisin, vankomisin ve tobramisin antibiyotikleri tek başlarına veya kombinasyonları yapılarak materyallere uygulandıklarında gentamisinin fizikokimyasal ve antimikrobiyal açıdan en etkin antibiyotik olduğu gözlenmiştir. Son yıllarda biyolojik olarak parçalanabilen ve belirli aralıklarla salım yapabilen gentamisin yüklü materyallerin lokal osteomiyelit tedavisinde ümit verici olduğu belirtilmektedir [87, 88]. 2.9. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonların Tanısı Akut enfeksiyonlarda sıvı, sürüntü veya enfeksiyonlu bölgenin biyopsi örneği alınarak enfektif mikroorganizmanın kolaylıkla tanımlanabilmesine rağmen kronik enfeksiyonlarda bu işlem çok daha problemlidir. Biyofilm ilişkili enfeksiyonların tanımlanmasında kültür bazlı teknikler genellikle yanlış negatif sonuçlar vermektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu 21 (PZR) ve ‘‘floresan in situ hibridizasyon’’ (FISH) gibi kültüre bağımlı olmayan analizlerden elde edilen sonuçlarla kültür temelli tekniklerden elde edilen sonuçlar arasındaki korelasyonun çok düşük olması biyofilm enfeksiyonlarını tanımlamadaki zorlukları ortaya koymaktadır [89]. Bu problemlere örnek olarak kronik yara enfeksiyonlarında alınan sürüntü örneklerinde derinlerdeki mikroorganizmalardan ziyade yalnızca yara yüzeyinde bulunan bakterilerin tanımlanabilmesi verilebilir. Yüzeylere tutunmuş ya da biyofilm içinde bulunan mikroorganizmaların kültürde üretilememelerinden dolayı etken bakterilerin implant ya da kateter gibi yabancı cisim kaynaklı enfeksiyonlarından soyutlanabilmelerinde problemler yaşanmaktadır [81]. Klinik uygulamalarda bu enfeksiyonların tanısını arttırabilmek amacıyla çok sayıda alternatif tanı kriterleri yayınlanmıştır. Enfeksiyon bölgesinde yüzey ile ilişkili mikroorganizmaların gözlenmesi veya konak dokusuna ya da mikrobiyal matrikse gömülü mikrobiyal hücre kümelerinin gözlenmesi bu kriterlerden bir tanesidir. Diğer bir kriter ise yüksek klinik enfeksiyon şüphesine rağmen kültürde üremenin gözlenmemesi ve enfeksiyonun antibiyotik tedavisine direnç göstermesidir. Ayrıca konak immün sisteminin enfeksiyonu vücuttan tamamen temizleyememesi de kriterler arasında yer almaktadır [31, 89-91]. Günümüzde mikroorganizmalar kültür, PZR ve mikroskobi gibi herbirinin kendisine göre avantaj ve dezavantajları olan çeşitli yöntemlerle saptanabilmektedir. Kültür bazlı tanımlamada karşılaşılan problem sıklıkla yüzeye yakın yerden örnek alınarak bakteri kültürlerinin yapılabilmesidir. Mikroorganizma varlığının deoksribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) temelli moleküler yöntemlerle örneklerden gösterilmesi o mikroorganizmanın enfeksiyona tam anlamıyla katkısı olduğu anlamına gelmeyebilir, dolayısıyla tedavi içinde bir anlam ifade etmeyebilir. Mikroskobi enfeksiyöz ajanın ve ortam organizasyonunun görüntülenmesi açısından yararlı bir yöntemdir. Ancak mikrobiyal etken varlığının gösterilmesi klinik örneğin tümü için şart olduğundan bu durum birçok örneğin ayrıntılı analiz edilmesi ni gerektiren emek yoğun işlemler silsilesi anlamına gelmektedir [81]. 22 2.10. Biyofilm İlişkili Enfeksiyonlara Konak İmmün Cevabı, Antibiyotik ve Dezenfektan Direnci 2.10.1. Biyofilmlerin konak immün sistemine direnci Gelişmekte olan ülkelerde enfeksiyon hastalıklarının çoğunu biyofilm ilişkili enfeksiyonlar oluşturmasına rağmen konak immün cevabı üzerine yapılan çalışmalar sıklıkla konak ve planktonik mikroorganizmalar arasındaki ilişkiyi aydınlatmaya yöneliktir. Sesil biyofilm hücreleriyle yapılan immunolojik çalışmalarda konak immün cevabına karşı artmış dirençten ECM yapısı sorumlu tutulmaktadır [89]. ECM konağın normal fagositik aktivitesini engelleyerek biyofilmdeki sesil hücre popülasyonunu korumaktadır. Matriks içine gömülü sesil hücreler, aktif nötrofillerden salınan antibakteriyel peptidler ve toksik reaktif oksijen türlerinden (ROS) korunmaktadır. Ayrıca sesil hücrelerin immün sistem tarafından elimine edilememesinde kemotaksi, fagosit göçü ve nötrofil kutuplaşmasını engelleyen çok sayıda faktöründe rolleri olduğu bildirilmiştir. Konağın sesil biyofilm hücrelerini eradike edememesi sonucunda inflamatuvar cevap tetiklenerek konakta çok sayıda doku hasarı meydana gelmektedir [87, 92-96]. 2.10.2. Biyofilmlerde antibiyotik direnci Biyofilmlerin en önemli özelliklerinden biri antimikrobiyal ajanlara önemli ölçüde tolerans gösterebilmeleridir. Biyofilmlerin nozokomiyal enfeksiyonlardaki etkin rolünün anlaşılmasından sonra araştırmacıların büyük bir kısmı biyofilmlere etkili olabilecek antimikrobiyal ajanların belirlenmesini amaçlayan çalışmalara yönelmişlerdir [97]. Mikroorganizmaların yüzeylere geri dönüşümlü olarak tutundukları ilk basamakta antibiyotiklerin organizmalar üzerinde hala etkili olduğu gösterilmiştir. Ancak sonrasında gerçekleşen geri dönüşümsüz bağlanma, mikrokoloni üremesi ve olgun biyofilmlerin oluşumuyla sonuçlanan süreçte sesil hücrelerin antibiyotiklere maksimum toleransını göstermiştir. Antibiyotiklerin biyofilm hücrelerine karşı MİK ve MBK değerleri aynı hücrelerin planktonik formlarına göre 100-1000 kat daha yüksek bulunmuştur [7, 98]. 23 Şekil 2.3. Biyofilmlerin antimikrobiyal ajanlara direnç mekanizmaları [99] Biyofilm kaynaklı kistik fibrosis hastalarında kromozomal kodlanan beta-laktamaz enzimlerinin bakterilerden sentezlenmesi antibiyotik tedavisine yanıttaki başarısızlığın ana nedenleri arasındadır. Beta laktam antibiyotiği ortama eklendiğinde beta laktamaz enzimleri sentezlenerek efluks pompalarla beraber veya pompadan bağımsız olarak antibiyotik direncine neden olmaktadırlar. Ayrıca biyofilmlerin matriks yapısında biriken beta-laktamaz enzimlerin varlığı antibiyotiklerin henüz daha sesil hücrelere ulaşmadan hidrolize olmalarına yol açmaktadır. Biyofilmlerin en karakteristik yapılarından biri olan EPS matriks adeta bir difüzyon bariyeri görevi görerek antibiyotiklerin matrikse gömülü hücrelere girişini engellemektedir. Biyofilm’in matriks yapıları antimikrobiyal bileşiklerle reaksiyon vererek ve/veya bileşikleri adsorbe etme yoluyla antimikrobiyal ajanın içeri girişini kısıtlamaktadırlar. Biyofilmlerin aminoglikozid antibiyotiklerine karşı toleransının, bu pozitif yüklü antibiyotiklerin negatif yüklü matrikse bağlanarak biyofilm içine sınırlı penetre olabilmelerinin sonucu olduğu düşünülmektedir [7, 98, 100-102]. Biyofilm yapısı incelendiğinde yüzeylerde oksijen konsantrasyonu, protein sentezi, metabolik aktivite ve üreme hızı oldukça fazla iken biyofilmin merkezine ve derinlerine inildiğinde bu faktörlerin neredeyse yok denecek kadar az olduğu saptanmıştır. Bu durum antibiyotiklere karşı azalmış duyarlılığın sebeplerinden biri olarak açıklanmaktadır [7]. Bakteri toplulukları belirli bir besine karşı açlık çekmeye başladığında üreme hızlarını yavaşlatarak logaritmik üreme fazından yavaş veya ürememe fazına geçmektedir. Olgun biyofilm formlarında sık karşılaşılan bu durum genellikle antibiyotiklere karşı direnç gelişimi ile sonlanmaktadır [99]. 24 Biyofilmlerde mikrobiyal heterojenitenin varlığı antimikrobiyal ajanlara karşı oldukça farklı yanıtların verilmesine neden olmaktadır. Olgun bir biyofilmde besinler, atık ürünler ve çeşitli sinyal faktörleri ortamda homojen dağılmayıp gradiyentli olarak bulunmaktadır. Bu durum aynı biyofilm içinde yaşayan sesil hücrelerin farklı çevrelere maruz kalarak farklı üreme oranlarına sahip olmalarına dolayısıyla farklı antimikrobiyal cevap geliştirmelerine yol açmaktadır [99]. Horizontal gen transferleri biyofilmlerde yüksek oranda görülen mutasyonların ana sebebidir. Bu fizyolojik koşullar sesil hücrelerin nasıl kolayca çok ilaca dirençli fenotiplere dönüşebildiğini, düşük afiniteli antibiyotik hedeflerine, antibiyotikleri parçalayan enzimlere ve efluks pompalarına sahip olduklarını açıklamaktadır. Kistik fibrosisli hasta izolatlarından vahşi tip P.aeruginosa bakterilerinin, DNA tamir sistemi için gerekli genlerinde oluşan mutasyonlar sonucunda, çoklu ilaca dirençli efluks pompası eksprese eden dirençli suşlara dönüştükleri gözlenmiştir [103, 104]. Ayrıca biyofilmlerde endojen kaynaklı ROS artışı ve hücrelerde bu zararlı bileşikleri etkisiz hale getirecek antioksidan mekanizmasında defektler görülmesi, oksidatif stress oluşumuna yol açarak biyofilmlerin mutasyonlara daha açık hale gelmelerine neden olmaktadır. Biyofilm oluşumundaki oksidatif stresin antibiyotik direncini tetiklediği ancak antioksidan bileşiklerin ortama eklenmesiyle direncin azaldığı gözlenmiştir [105]. Mikroorganizmalar biyofilmleri oluşturmak adına belirli bir konsantrasyona ulaştıklarında ‘‘quarum sensing’’ sistemi vasıtasıyla birbirlerini algılayarak virulans faktörlerini sentezleyen bazı genlerini aktif hale getirirler. P.aeruginosa’nın quarum sensing gen mutantları ile yapılan çalışmalarda antimikrobiyal tedaviye duyarlılıkta artış gözlenmiştir [99]. 2.10.3. Biyofilmlerde dezenfektan direnci Dezenfektanlar antibiyotiklerden farklı olarak tüm patojenik mikroorganizmaları inaktive etmek amacıyla birden fazla hedefe karşı nonspesifik etki gösteren ve cansız yüzeyler üzerine uygulanan kimyasal ajanlardır. Dezenfeksiyon işlemi yüzeylerdeki biyolojik kontaminasyonun kontrolü amacıyla medikal, endüstriyel alanda ve evlerimizde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bazı durumlarda biyosidlerin mikrobiyal kontaminasyonları gidermede etkisiz olabildiği, bunu takiben yüzeyde hala var olan 25 mikroorganizmaların gerek medikal ve gıda alanında gerekse de evsel hijyen açısından sağlığı tehdit eden önemli problemlere yol açabildikleri belirtilmiştir [106]. Planktonik mikroorgnanizmalara karşı dezenfektan etkinliğinin test edilmesine yönelik çok sayıda standart rehber yayınlanmış olmasına rağmen biyofilmler için bu standart metotlar yok denecek kadar azdır. Planktonik hücreler için uygulanan test protokollerinin modifiye edilmesi ya da son yıllarda ‘‘Avrupa Standartları Test Yöntemi (ASTM no. E2799-11)’’ olarak onay almış minimum biyofilm eradike edici konsantrasyon yöntemi (MBEK) gibi özel dizayn edilmiş sistemlerin kullanılmasıyla biyofilmlere karşı antimikrobiyal ajanların etkinliği test edilebilmektedir [107]. Çizelge 2.1’de en sık kullanılan biyosidler ve bu biyosidlerin antimikrobiyal belirtilmektedir [108]. etkileri, etki mekanizmaları, ve hücresel hedefleri 26 Çizelge 2.1. Biyosidlerin hücresel hedefleri ve antimikrobiyal etkileri Biyosidler Hücresel Hedef Izotiyazolin Organik civa bileşikleri Ağır metal tuzları Hipoklorit Gluteraldehit Formaldehit Kloroasetamid Sitoplazmik ve membran bağımlı tiyol içeren enzimler Hipoklorit Klorin salan ajanlar Hidrojen perosit Perasetik asit EDTA Oksin Proteinlerin amino grupları Aminoakridinler DNA bazları arasında interkalasyon Sitoplazmik membrane bütünlüğü Membran bağımlı enzim çevresi ve fonksiyonu Amino, imino, amid, karboksil ve tiyol grubu içeren biyomoleküller Etki Mekanizması Tiyol gruplarının oksidasyonu Hücresel Alkilasyon metabolizma ve reaksiyonu replikasyonun inhibisyonu Olası hücre duvar hasarı Metabolik Halojenizasyon inhibisyon Metabolik inhibisyon Hücre içeriğinin salınması Stres’e aşırı duyarlılık Metabolik inhibisyon Replikasyon hasarı Solunum inhibisyonu Hücreiçi koagülasyon Serbest radikal oksidasyon Metal iyon şelasyonu Transmembran pH gradienti Membran bütünlüğü Transport, solunum ve enerji işleminin parçalanması Alifatik alkoller Membran bütünlüğü Sızıntı Anyonik sürfaktanlar Sitoplazmik membrane bütünlüğü Membran bağımlı enzim çevresi ve fonksiyonu Sızıntı Fosfolipid tabaka içine penetrasyon Fosfolipidlerin olası yerdeğişimi Fosfolipid solüsyonu Membranprotein çözünürlüğü Kuaterner amonyum bileşikleri Klorheksidin Polihekzametilen Biguanidler Fenol bileşikleri Zayıf asitler Paraben Fenoksietanol 2-Fenil etanol Enzim ve protein tiyol grupları Dış membran bütünlüğü, Gram negatif hücre duvarı hedef bölgesi Metal iyon gerektiren enzim işlemi Antimikrobiyal Etkinlik Metabolik inhibisyon İnterkalasyon Fosfolipdlerle elektrostatik ilişki Dezenfeksiyona dirençli mikroorganizmalar sıklıkla yüzeylerde oluşan biyofilmlerden kaynaklanmakta olup bu direnç gelişimi genellikle intrinsik, genetik olarak kazanılmış ya 27 da fenotipik olabilmektedir [109-111]. Biyofilm içindeki ortam koşullarından dolayı sesil bakteriler ortama fizyolojik adaptasyonlar göstermekte ve bu adaptasyonlar antimikrobiyal ajanlara gerçek bir direnç oluşumundan ziyade daha az tolerans göstermeyi tetiklemektedir. Biyofilm modundan planktonik forma geri dönüş sonrasında ise bu toleransta tekrar artışlar gözlenmektedir [106]. Biyosid aktivitesi mikroorganizmalarda türden türe değişkenlik gösterebileceği gibi bazen aynı türün farklı suşları arasında dahi farklılıklar gözlenmektedir. Bu değişkenlikler bakterinin intrinsik direnci denilen ve bakteri hücresini biyosidin etkisinden koruyan kromozom kontrolündeki özelliğinden kaynaklanmaktadır. Bakteri hücre formları arasında bakteri endosporları dezenfektanlara en dirençli mikroorganizmlar olup bunu sırasıyla mikobakteriler, gram negatif bakteriler ve gram pozitif bakteriler takip etmektedir. Kompleks EPS yapısı biyosidlerin biyofilm içine difüzyonunu ve penetrasyonunu engelleyerek antimikrobiyal etkinliklerinin azalmasına yol açmaktadır. Biyosidler yüksek kimyasal reaktif ajanlar olup aktiviteleri ortamda protein, nükleik asit veya karbonhidrat gibi organik materyaller varlığında olumsuz yönde etkilenmektedir [112]. Ayrıca biyofilm hücrelerine biyosidlerin penetrastonunu engelleyen diğer faktörler arasında biyosidin pozitif yüklü olması ve hidrofobik özellik içermesi de sayılabilmektedir. Kuarterner amonyum bileşiklerinden benzalkonyum klorür (BZK) ile yapılan bir çalışmada, daha uzun karbon zincirine sahip BZK’nın hidrofobik özelliğinin arttığı ve hidrofilik yapıdaki biyofilm matriksi içine penetrasyonunun kısıtlandığı belirtilmiştir [113]. Sınırlı penetrasyon durumunda az miktarda antimikrobiyal ajanın biyofilmin derinliklerine ulaşabilmesi bir süre sonra biyofilmlerin bu ajanların sub-letal konsantrasyonlarına karşı kazanılmış bağışıklık geliştirmelerine neden olmaktadır. İlk olarak Salmonella biyofilmlerinde dezenfektanlara karşı kazanılmış bağışıklık durumu bildirilmiştir [114]. Besin, oksijen, üreme oranı vs. gibi çeşitli faktörlerin aynı ortam içinde farklılık göstermesi sesil hücre topluluklarının ortama farklı fenotipik adaptasyonlar sergilemelerine neden olmaktadır. Bu durum biyosidlere karşı değişken duyarlılık profili sergileyen hücrelerin gelişmesiyle sonuçlanmaktadır. Biyosid direnci gözlenen popülasyonda membran kompozisyonunda değişiklikler ve çeşitli korunma mekanizmaları ile ilişkili genlerin ekspresyonlarında artışlar gözlenmiştir. Ayrıca popülasyonda korunumlu persister 28 hücrelerin varlığı da fenotipik adaptasyonların bir sonucudur. Bu hücreler genotipik mutantlar olmayıp antimikrobiyal korunmaya yardım eden fenotipik varyantlardır [115, 116]. Biyofilmlerin yaşam döngülerinde stres cevabı gelişimi önemli bir yer tutmaktadır. Oksitleyici ajanlara maruz kalmış sesil hücrelerde ajanların zararlı etkilerinden korunmak için oksidatif stres ile ilişkili genlerin ekspresyonlarının artması buna örnek verilebilir. Oksidatif stres cevabının düzenlenmesine yönelik araştırmaların çoğunda, biyosidlere karşı katalaz ve süperoksit dismutaz gibi koruyucu enzimleri kodlayan genlerin ekspresyonlarında artış gözlendiği ve bu genlerin çoğunlukla ‘‘quarum sensing’’ konrolünde olduğu bildirilmiştir [117-122]. Mutasyonlar, kromozomal gen çoğalımı veya plasmid ve transpozon gibi ekstrakromozomal gen determinantlarının edinilmesi sonucunda hücrelerde biyosid toleransında artışlar gözlenmektedir. Biyofilmlerde bulunan yoğun hücre popülasyonu, matriks varlığı, ortama çok miktarda DNA salımı gibi faktörler transformasyona veya konjugasyona uygun ortam hazırlamaktadır. Biyofilmlerde gözlenen farklı genotipik varyantlar stres koşullarına ve antimikrobiyal ajanlara daha dayanıklı alt popülasyonların oluşmasına neden olmaktadır. Biyofilm hücrelerinin mutasyona uğrama oranları planktonik formlarına göre çok daha yüksek bulunmuştur [123-126]. Dezenfektanlarla muamele sonrasında değişken duyarlılık sonuçları elde edilmesinin sebeplerinden biri biyofilmlerin doğada farklı mikrobiyal türlerin karışımından oluşmaları ve birbirlerine sinerjistik ya da antagonistik etkileşimler sergilemeleridir. Çalışmaların çoğunda polimikrobiyal biyofilmlerin dezenfeksiyona karşı monomikrobiyal biyofilmlere oranla daha dirençli olduğu belirtilmiştir. Bu duruma ilişkin mekanizmalar hala tam aydınlatılamamışdır. Ancak biyofilmdeki herbir türün sentezlediği polimerler sonucunda daha vizkoz bir matriks yapısı oluştuğu ve bu yapının biyosidlerin penetrasyonunu azalttığı önerilen korunma mekanizmalarından bir tanesidir [127, 128]. 29 2.11. Polimikrobiyal Biyofilm Eradikasyonunda Alternatif Tedavi Stratejileri 2.11.1. Polimikrobiyal aşılar Günümüzde geliştirilen aşıların çoğunluğu Koch pastülasını esas alarak monomikrobiyal enfeksiyonları hedef almaktadır ancak bu aşıların polimikrobiyal enfeksiyonları önlemedeki etkisinin yetersiz olduğu bilinmektedir. Bir hastalığın polimikrobiyal doğası aşı geliştirilme sürecinde mutlaka irdelenmesi gereken konular arasındadır. Polimikrobiyal kökenli bir hastalık söz konusu olduğunda tüm etken türlerin antijenlerinden oluşan multivalan bir aşı geliştirilmesi o hastalığın önlenmesinde daha garanti olabilir [30]. Polimikrobiyal kaynaklı enfeksiyondan izole edilmiş her bir türün virulan olduğu bilinse bile ortamda iki ya da daha fazla mikroorganizma biraraya geldiğinde türler arasında sinerjistik ya da antagonistik etkileşimler gözlenebilmektedir. Periyodontal hastalıklar polimikrobiyal enfeksiyonların en fazla çalışılmış grubudur. Hastalığın ana etkenlerinden P.gingivalis türünün diğer türlerle etkileşimleri ve bu etkileşimlerin hastalığın nasıl daha da ilerlemesine sebep olduğu bilinmektedir. Hayvan deneyi çalışmaları sonucunda günümüzde P.gingivalis’in dış membran proteinlerini hedef alan rekombinant bir DNA aşısının var olmasına karşın hala kronik periyodontit enfeksiyonunu önlemeye yönelik başarılı bir aşının lisansı bulunmamaktadır [129]. Bir patojenin virulans faktörü başarılı bir aşılamayla hedef alınsa bile ortamda bulunan diğer türler tarafından üretilen virulans faktörlerinin ortak kullanımı sayesinde aşının etkisi yetersiz kalabilmektedir. Bu sebeple yeni geliştirilecek aşılarda, ortamda varolan ve sekonder enfeksiyona yol açabilecek tüm türlerin kullanabileceği ortak mikrobiyal antijenler hedef olarak seçilmeli ve bu şekilde optimizasyon sağlanmalıdır [30]. Otitis media enfeksiyonunu sınırlamak amacıyla kullanılan protein konjuge aşılar (PCV) ilk olarak 2000 yılında lisans almış olup S.pneumoniae’ya özgül kapsül polisakkaritlerini içermektedir. Ancak klinik çalışmalar sonucunda bu enfeksiyonun S.pneumoniae, H.influenza, M.catarrhalis, solunum sinsityal virüs’ü gibi birden fazla mikroorganizma tarafından geliştirildiği gözlenmiş ve yalnızca S.pneumoniae’ya etkin olan PCV aşılarının enfeksiyonu önlemedeki etkinliğinin yetersiz olduğu anlaşılmıştır [130] 30 2.11.2. Sinbiyotikler Sinbiyotikler, insanlar tarafından sindirilebilen ve aynı zamanda yararlı barsak bakterileri tarafından fermente edilebilen oligosakkaritlerden oluşmuş prebiyotik ve probiyotiklerin kombinasyonu olarak bilinmektedir. Sinbiyotikler Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Biidobacterium lactis ve sinerji1 prebiyotiklerini içermekte olup önceki çalışmalarda ülseratif kolit ve Crohn hastalığının tedavisinde kullanılmışlardır. Günümüzde ise bakteriyel biyofilm oluşumu öncesi ve sonrası sinbiyotiklerle muamele edildiğinde biyofilm oluşumlarının engellendiğini ya da oluşan biyofilm bakteri sayılarının azaldığı gösterilmiştir [30, 54, 131, 132]. 2.11.3. Faj tedavisi Fajlar belirli bakteri türlerini enfekte ederek kendilerini çoğaltabilen ve sonrasında enfekte bakteri hücrelerini lizise uğratarak ortamdaki bakteri popülasyonunu azaltan viruslerdir. Biyofilm EPS’lerine kolayca yayılabilmeleri, matriksi parçalayabilen depolimeraz enzimi sentezleyebilmeleri, bakteriye özgül virulans enzimleri sentezleyerek biyofilm yapılarını parçalayabilmeleri ve polimikrobiyal bir toplulukta yalnızca tek bir mikroorganizmaya özgül olmalarından dolayı, biyofilm oluşumlarını engellemeye yönelik alternatif tedavi stratejileri arasında yer almaktadırlar . Çoklu bakteriyel bir topluluğa bakterisidal etki göstermek amacıyla birden fazla mikroorganizmaya tropizm gösterebilen faj karışımlarının kulanımı piyasada mevcuttur. Faj karışımı içeren hidrojel kaplı kateterlerin kullanımı sonucunda kateter yüzeyinde oluşan Pseudomonas biyofilm hücrelerinin sayısında azalma gözlenmiş ve medikal alet ilişkili enfeksiyonları azaltmada bu uygulamanın kullanılabileceği vurgulanmıştır. Hayvan deneyi çalışmalarında yanık enfeksiyonlarında da faj muamelesinin etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca fajların antibiyotiklerle kombine kullanımları sonucunda sinerjistik etkileşimler gözlenmiştir [133-135]. 2.11.4. Diğer tedavi yaklaşımları Endüstriyel ve medikal çevrede gelişen mikrobiyal biyofilmler polimikrobiyal kökenli olduğundan dolayı biyofilmlerin matriks yapısında biyokimyasal heterojenite 31 gözlenmektedir. Biyofilm matriks’inin kompozisyonuna bağlı olarak proteaz, selülaz, polisakkarit depolimeraz, aljinat liyaz dispersin B veya DNaz gibi çeşitli enzimler ve biyosürfaktan ve D-aminoasit gibi küçük moleküller kullanılarak hem yüzeylerden biyofilmlerin kaldırılması hem de biyofilm hücre kümelerinin parçalanması sağlanmaktadır. Piyasada enzim karışımlarını içeren ticari preparatlar bulunmaktadır [106, 136]. Antimikrobiyal etkili aktif maddeleri sayesinde doğada bulunan çok sayıda bitkiden tıbbi amaçlı faydalanmaktayız. Son zamanlarda birçok aktif bileşiğin antimikrobiyal etkisi biyofilmler üzerinde denenmiş ve ümit verici sonuçlar elde edilmiştir. Oregano’dan ekstrakte edilmiş Carvacrol adında doğal bir terpen bileşiği, Brezilya doğal bitkisinden ekstrakte edilmiş casbane diterpene bileşiği, Nigella sativa tohumundan izole edilen timokinon bileşiği, ökaliptus yağı, çay ağacı yağı kullanılarak yapılan çalışmalar bu duruma örnek verilebilir [137-140]. 2.12. Polimikrobiyal Biyofilmlerde Gen Ekspresyonunun Yeri: Kantitatif Eş zamanlı Reverz Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (kantitatif RT-PZR). Yüzeylere tutunan ve biyofilm oluşturan mikroorganizmalardaki fenotipik değişimlerin biyofilm oluşumu sırasında değişen gen ekspresyonlarından kaynaklandığı öne sürülmüştür. Yapılan genetik analizler sonucunda biyofilm oluşumunda birbirinden farklı çok sayıda genetik faktörün rol oynadığı belirtilmiştir. Bakteriyel bir biyofilmde bazı genlerin farklı eksprese olduğunu gösteren ilk kanıtlar gen-füzyon çalışmaları sırasında gösterilmiş ve E.coli bakterilerinin planktonik ve biyofilm formu arasında, genomun yaklaşık %38’inde farklı ekspresyon profilleri olduğu belirtilmiştir [97, 141-143]. Geçmişten günümüze kadar geçen sürede gen ekspresyonlarını hedef alan kalitatif ya da kantitatif PZR yöntemleri kullanılarak adezyon, ‘‘quarum sensing’’, metabolizma, stres cevabı, hücre duvar yapımı vs ile ilişkili pek çok genin biyofilm oluşumu ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Ayrıca nozokomiyal enfeksiyonlar başta olmak üzere pek çok enfeksiyondan sorumlu tutulan monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilmlerin birbirleriyle tür içi ve türler arası ilişkileri, bu ilişkilerin mikrobiyal virulans ve enfeksiyon üzerindeki yansımaları, antibiyotik yada dezenfektanlar gibi antimikrobiyal ajanlara yanıtta etkin rol oynayan genlerin belirlenmesi gibi farklı amaçlara yönelik çok sayıda ekspresyon saptama 32 temelli moleküler yöntemler uygulanmaktadır. ROS molekülleri kaynaklı oksidatif stress durumu mikroorganizmaların yaşamında hayati bir yer kapladığından birçok araştırmacı bu strese karşı mikroorganizmalarda gelişen cevabı ekspresyon çalışmalarıyla anlamaya çalışmıştır. Hücrelerde oluşan ROS molekülleri sıklıkla aerobik metabolizma, redoks potansiyeline sahip ilaçlar, iyonize radyasyon ya da enfeksiyon sırasında insan fagositik hücreleri tarafından ROS bileşiklerinin stimüle olması gibi durumlarla meydana gelmektedir. Oluşan bu ROS bileşikleri mikroorganizmaların DNA, RNA, lipid ve protein gibi biyomoleküllerinde hasar oluşturmaktadır. Mikrobiyal hücreler bu toksik bileşiklerin zaralı etkileinden korunmak amacıyla kendilerince antioksidan korunma mekanizmaları geliştirmektedirler. İlk olarak E.coli bakterilerinde bu korunma mekanizmaları detaylı çalışılmış olup sonrasında Pseudomonas başta olmak üzere pek çok patojende araştırmalar yapılmıştır [144]. P.aeruginosa suşlarının antioksidan sistemleriyle planktonik yaşam formlarında iken veya insanlarda geliştirdikleri enfeksiyon sırasında gelişen endojen veya ekzojen kaynaklı ROS bileşiklerinden korundukları bildirilmiştir. Stres cevabı üzerine yapılan çalışmalarda H202 aracılı detoksifikasyon sırasında korunmada rol oynayan bir çok genin transkripsiyonel OxyR gen regülatörünün kontrolü altında olduğu bildirilmiştir. Bu regülatorün P.aeruginosa genomunda bulunan katA, katB, ahpB ve ahpC gibi çok sayıda genin transkripsiyonunu aktive ederek H202 bileşiğine karşı antioksidan aracılı koruma sağladığı. ayrıca siderofor piyoverdin molekülü aracılı demir alımına ve bir phenazin bileşiği olan piyosiyaninin üretimine de katkıda bulunduğu gösterilmiştir. 33 Şekil 2.4. P.aeruginosa’da OxyR aracılı oksidatif stres cevabı [144] Kantitatif eş zamanlı RT-PZR mesajcı RNA (mRNA) ’ların ve gen ekspresyon seviyelerinin saptanmasında ve sayımında yaygın olarak kullanılan duyarlılığı ve tekrarlanabilirliği yüksek güvenilir bir yöntemdir. Başarılı bir kantitatif eş zamanlı RTPZR yöntemi için en önemli iki faktör; DNA içermeyen saf mRNA veya intakt total RNA’nın hücrelerden ekstrakte edilmesi ve bu RNA’lardan reverz transkripsiyon yoluyla özgül ve hassas tek zincirli komplementer DNA (cDNA) elde edilmesidir [145]. Kantitatif eş zamanlı RT-PCR yöntemi az sayıda mRNA varlığında ya da ilgilenilen RNA geni düşük seviyelerde eksprese edildiğinde dahi güvenle kullanılabilen bir yöntem olup polimorfizm ve mutasyonları saptama gibi farklı amaca yönelik çalışmalarda da modifiye edilerek kullanılmaktadır. Literatürde kantitatif eş zamanlı RT-PCR çeşitleri ile yapılmış çok sayıda çalışmalar bulunmakta olup bir çalışmadan diğerine göre teknik detaylar farklılık göstermektedir. Ancak temel mekanizma her yöntem için aynıdır. İlk aşama RNA’nın tek zincirli kalıp cDNA’ya enzimatik olarak dönüştürülmesidir. Oligodeoksinükleotit primer mRNA ile hibridize olarak bağlanır ve RNA bağımlı DNA polimeraz enzimi yardımıyla uzatılarak PZR yöntemi ile çoğaltılabilen cDNA kopyaları oluşturulur. İkinci aşamada ise eş zamanlı PZR yöntemi aracılığıyla cDNA dizisine özgül olarak bağlanan primerler kullanılarak cDNA kopyaları çoğaltılmakta ve ortama eklenmiş hibridizasyon probları, moleküler boncuklar veya ‘‘Syber Green I’’ gibi DNA boyaları yardımıyla çoğalan ürünlerin sayıları belirlenmektedir [146]. 34 Eksprese olan gen seviyeleri kesin yada göreceli kantitatif eş zamanlı RT-PZR metoduyla ölçülmektedir. Kesin sayım için; standart bir DNA molekülünün bilinen konsantrasyonlarını baz alan standart kalibrasyon eğrisi kullanılarak ortamdaki net kopya sayısının verdiği sinyal ölçülmektedir. Ancak ekspresyon çalışmalarında sıklıkla kullanılan göreceli sayımda, referans (housekeeping) genine karşı hedef genin mRNA ekspresyon seviyesindeki değişiklik göreceli olarak ölçülmektedir. 35 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Çalışmada Kullanılan Suşlar Çalışmada Gent Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı stok standart suşları olan Staphylococcus aureus Mu50 (Metisilin dirençli S.aureus [MRSA]), Pseudomonas aeruginosa PAO-1 bakteri suşları ve Candida albicans SC5314 mantar suşu kullanılmıştır. Uygulanacak yöntemler öncesinde her mikroorganizma için 590 nm dalga boyunda spektrofotometrik ölçümler yapılmış ve Staphylococcus aureus Mu50 için optik dansite (OD) 0,2, Pseudomonas aeruginosa PAO1 için OD 0,1 ve Candida albicans SC5314 için OD 0,5 olarak ayarlanmıştır. Gerekli durumlarda mikroorganizmaların belirtilen OD değerlerini içeren süspansiyonları beyinkalp infüzyon sıvı besiyeri ile seyreltilerek son konsantrasyonları ayarlanmıştır. 3.2. Çalışmada Kullanılan Dezenfektanlar Sodyum hipoklorit (Forever, Courcelles, Belgium), Benzalkonyum klorür (Sigma-Aldrich Life Science), Dettol (Chloroxylenol, Reckitt Benckiser, Belgium), Etanol (absolute alcohol, ≥ %99,8, Certa), %30’luk Hidrojen peroksit (Acros, Geel, Belgium), Klorhekzidin (Fagron, Waregem, Belgium), Setrimit (Certa, Braine-l’Alleud, Belgium), %0,5 Setrimid ve %0.05 Klorhekzidindiglukan içeren Hastane antiseptik konsantrasyonu [Hospital Antiseptic Concentrate (HAC; Regent Medical, Manchester, UK)], İzo-betadin (PVP-I, polyvidoniodine %7,5, Meda Pharma) olmak üzere toplam 9 dezenfektanın etkinliği çizelge 3.1.’de belirtilen konsantrasyonları ve temas süreleri kullanılarak planktonik ve biyofilm formları üzerinde uygulanmıştır. Dezenfektanların belirtilen konsantrasyon ve temas süreleri öncesinde gerçekleştirilen çalışmalar baz alınarak çalışmaya dahil edilmiştir. Dezenfektanların etkisini nötralize etmek amacıyla sıvı nötralizan besiyeri kullanılmıştır. Tüm dezenfektan solüsyonları standart sert su [Water Standard Hardness (WSH)] kullanılarak çalışma öncesinde taze olarak hazırlanmış ve kullanım öncesinde filtre ile sterilize edilmiştir. 36 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan dezenfektanlar Dezenfektanlar Konsantrasyon (%) Sodyum hipoklorit (NaOCl) 0,05 Temas süreleri (Dakika) 5 Benzalkonyum klorit (BzCl) 0,2 15 Dettol (kloroksenol) (DET) 5 5 Etanol (ETOH) 70 2 Hidrojen Peroksit (H2O2) 1,5 30 Klorhekzidin (CHX) 0,4 15 Setrimit (CET) Hastane Antiseptik Konsantrasyonu (H.A.C.) İzobetadin (PVP-I) 0,15 15 1 15 7,5 15 3.3. Standart Sert Su Hazırlanması Solüsyon A hazırlanması 31,74 gram anhidröz MgCl2 73,99 gram anhidröz CaCl2 bileşikleri distile su içerisinde çözülerek 1 litre’ye tamamlanır. Otoklavda 20 dakika 1210C’de sterilize edilir. Solüsyon B hazırlanması 56,03 gram NaHCO3 bileşiği distile su içerisinde çözülerek 1 litre’ye tamamlanır. Filtre ile sterilize edilir. Solüsyon A’dan 3 ml alınır ve 600 ml steril distile su içine eklenir. Bu solüsyon’a 4 ml solüsyon B’den eklenir ve total hacim 1 litreye tamamlanır. Solüsyon filtreden geçirilerek sterilize edilir ve +4 0C’de maksimum 1 ay saklanır. 3.4. Dezenfektanların Planktonik Mikroorganizmalar Üzerindeki Etkisinin Test Edilmesi Dezenfektanların planktonik mikroorganizmalar üzerindeki mikrobisidal etkisi Avrupa standartları (EN 1040) kantitatif süspansiyon testi yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Bu yöntemde, test mikroorganizmalarımızın yukarıda belirtilen OD değerleri ayarlanıp hem tek başlarına hem de birbirleriyle ikili ve üçlü kombinasyonları yapılarak tekli ve polimikrobiyal sıvı kültürleri hazırlanmış ve sonuç olarak yalnızca S.aureus Mu50, 37 P.aeruginosa PAO1 ve C.albicans SC5314’ı içeren monomikrobiyal sıvı hücre süspansiyonları; S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1, S.aureus Mu50 & C.albicans SC5314 ve P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC5314 suş kombinasyonlarını içeren ikili hücre süspansiyonları ve S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC5314’den oluşan üçlü polimikrobiyal hücre süspansiyonları elde edilmiştir. 3.4.1. Kantitatif süspansiyon testi Hazırlanan kültürlerden 1’er ml alınan sıvı mikroorganizma süspansiyonları içlerine 1’er ml steril su yerleştirilmiş olan tüplere aktarılmış ve tüpler hızlıca vortekslenerek karıştırılmıştır. Tüpler önceden ayarlanmış su banyosunda 20 0C’de 2 dakika boyunca bekletilmiştir. Süre sonunda bu süspansiyon tüplerine test edilecek tüm dezenfektan solüsyonlarının 8’er ml’si ayrı ayrı eklenmiş ve vortekslenerek her dezenfektan için belirlenen temas süreleri boyunca 20 0C’ye ayarlı su banyosu içerisinde bekletilmiştir. Süre sonunda dezenfektan-mikroorganizma karışımını içeren solüsyonların 1’er ml’si, içerisinde 1’er ml su ve dezenfektan etkisini nötralize edecek olan 8 ml hacimdeki sıvı nötralizan besiyeri bulunan tüplere aktarılmış ve vortekslenerek 5 dakika boyunca 20 0 C’de bekletilmiştir. Nötralizasyon süresinin sonunda tüplerden 1’er ml alınarak uygun dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml açısından belirlenmiştir. 3.4.2. Deney koşullarının kontrolü / validasyonu Bu yöntem deney koşullarının validasyonu ve/veya ortamda herhangi bir lethal etkinin yokluğunu doğrulamak amacıyla uygulanmıştır. Yöntem kantitatif süspansiyon testi ile hemen hemen aynı koşulları ve basamakları içermekte olup yalnızca test tüplerine 8’er ml dezenfektan yerine su eklenmiş ve her dezenfektan için belirlenen temas süreleri boyunca 20 0C’ye ayarlı su banyosu içerisinde bekletilmiştir. Süre sonunda nötralizasyon basamağı uygulanmayıp su-mikroorganizma karışımını içeren solüsyonlardan 1’er ml alınarak uygun dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml açısından belirlenmiştir. 38 3.4.3. Nötralizan toksisite kontrolü Çalışmada kullanılan nötralizanın toksik olup olmadığını göstermek amacıyla nötralizan kontrol testi uygulanmıştır. Sekiz mililitre nötralizan süspansiyonu ve 1 ml su aynı tüp içerisinde birleştirilmiş ve üzerine 1 ml mikroorganizma süspansiyonu aktarıldıktan sonra tüpler vortekslenerek karıştırılmıştır. Bu işlem tüm dezenfektanlar ve mikroorganizmalar için ayrı ayrı yapılmıştır. Tüpler önceden ayarlanmış su banyosunda 20 0C’de 5 dakika boyunca bekletilmiştir. Süre dolmadan hemen önce tekrar vortekslenmiş ve süre sonunda tüplerden 1’er ml alınarak uygun dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml açısından belirlenmiştir. 3.4.4. Nötralizasyon Yönteminin Validasyonu Birer mililitre su steril tüpler içine eklenmiş ve üzerine 1’er ml dilüent solüsyonu (BHI) aktarılmış ve son olarak aynı tüplere 8’er ml test edilecek dezenfektan solüsyonlarından eklenmiştir. Tüpler su banyosunda 20 0C’de dezenfektanların temas süreleri boyunca bekletilerek süre dolmadan hemen önce tekrar vortekslenmiş ve süre sonunda tüplerden 1’er ml alınarak içerisinde 8’er ml nötralizan solüsyonu ve 1’er ml su bulunan yeni tüplere aktarılmıştır. Su banyosunda 20 0C’de 5 dakika bekletilen tüplere süre sonunda 1’er ml mikroorganizma süspansiyonları eklenmiş ve su banyosunda 20 0C’de 30 dakika boyunca tekrar bekletilmişlerdir. Süre sonunda tüplerden 1’er ml alınarak uygun dilüsyonlar yapılmış ve plak döküm yöntemiyle mikroorganizma koloni sayıları cfu/ml açısından belirlenmiştir. Planktonik mikroorganizmalar üzerine yukarıda belirtilen tüm test yöntemleri uygulandıktan sonra sayım için yapılan plak ekim yöntemlerinde mikroorganizmaların saf üretilebilmesi için uygun seçici besiyerleri kullanılmıştır. Bu amaçla monomikrobiyal planktonik hücre süspansiyonlarından C.albicans üretimi için Saboraud dekstroz agar (SDA), S.aureus ve P.aeruginosa üretimleri için ise triptik soy agar (TSA) besiyeri kullanılmıştır. Hazırlanan ikili polimikrobiyal planktonik hücre süspansiyonlarından; C.albicans & S.aureus ikili süspansiyonunda C.albicans ve S.aureus’ un saf kültürleri ve sayımları amacıyla sırasıyla nitrofurantoin eklenmiş SDA ve amfoterisin eklenmiş TSA kullanılmıştır. Bir diğer ikili polimikrobiyal planktonik hücre süspansiyonu olan P.aeruginosa & S.aureus süspansiyonunda P.aeruginosa ve S.aureus’un saf kültürleri ve 39 sayımları amacıyla sırasıyla Setrimid agar ve %7,5 NaCl eklenmiş TSA kullanılmıştır. Son olarak, S.aureus & C.albicans & P.aeruginosa üçlü planktonik hücre süspansiyonundan ayrı ayrı C.albicans, S.aureus ve P.aeruginosa saf kültür eldesi içinde sırasıyla nitrofurantin ve tobramisin eklenmiş SDA, %7,5 NaCl ve amfoterisin eklenmiş TSA ve Setrimid agar kullanılmıştır. Tüm testler farklı zamanlarda 6 kez tekrar edilerek uygulanmıştır. 3.5. Mikrobiyal Biyofilmler Üzerinde Dezenfektanların Etkinliğinin Belirlenmesi 3.5.1. Monomikrobiyal ve polimikrobiyal inokulum hazırlanması Çalışmada kullanılan S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans suşları BHI sıvı besiyerine ekilip 18-24 saat boyunca 37 0C’de etüvde bekletilerek gün aşırı üremeleri sağlanmıştır. Ertesi gün üreyen kültürler 5 dakika boyunca 5000 rpm’de santrifüj edilmiştir. Süpernatan dökülüp üzerine tekrar BHI eklenmiş ve S.aureus için OD 0,2’ye (108 cfu/ml), P.aeruginosa için OD 0,1’ye (108 cfu/ml), C.albicans için OD 0,5’e (5x106 cfu/m) ayarlanmıştır. Bakteri süspansiyonları sonrasında monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilm modelinde kullanılmak üzere sırasıyla 1/100 ve 1/50 oranında, mantar süspansiyonu ise 1/50 ve 1/25 oranında dilüe edilmiştir. Böylece çukur içinde bulunan son inokulüm miktarları Candida albicans SC5314 için 105 cfu/çukur, Staphylococcus aureus Mu50, Pseudomonas aeruginosa PAO-1 bakterileri için ise 106cfu/çukur olarak hazırlanmıştır. Sonuç olarak S.aureus Mu50, P.aeruginosa PAO1 ve C.albicans SC5314’ün tek başlarına oluşturdukları monomikrobiyal biyofilm plakları; S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1, S.aureus Mu50 & C.albicans SC5314 ve P.aeruginosa PAO1&C.albicans SC5314 suş kombinasyonlarından oluşan ikili biyofilm plakları ve S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC5314’den oluşan üçlü polimikrobiyal biyofilm plakları hazırlanmıştır. Polimikrobiyal biyofilmde S.aureus ve C.albicans’ın P.aeruginosa tarafından öldürülmelerini engellemek amacıyla %0, 1, 2, 3 ve 5 oranlarını içeren farklı konsantranlarda sığır serum albümin’i [Bovine serum albumin (BSA)] besiyeri ortamına eklenmiştir. En uygun bulunan BSA konsantrasyonu polimikrobiyal biyofilm oluşumu modellerinde S.aureus ve C.albicans üremelerini arttırmak amacıyla kullanılmıştır [147, 148]. 40 3.5.2. Multi-titrasyon plaklarında monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilmlerin oluşturulması Mikrotitrasyon plak çukurlarına hazırlanan monomikrobiyal ve polimikrobiyal bakteri ve mantar süspansiyonlarının 100’er µl’si aktarılmıştır. Test edilecek her dezenfektanın hem kontrol hem de test örneği için ayrı ayrı toplamda 12 çukur kullanılmıştır. Plaklar 4 saat boyunca 37 0C’de inkübatör içinde bırakılarak mikroorganizmaların çukur yüzeylerine tutunmaları sağlanmıştır. Süre sonunda çukurlar serum fizyolojik ile iki kere yıkanmış ve çukurlara tekrar 100 µl steril BHI broth eklenerek 20 saat daha inkübasyona bırakılarak biyofilm oluşumları elde edilmiştir. 3.5.3. Biyofilmlerde Dezenfektan Etkinlik Analizi Mikroorganizma süpernatanları 24 saat sonunda pipet yardımıyla çukurlardan nazikçe kaldırılmıştır. Tüm çukurlara 100’ er µl fizyolojik su eklenerek iki defa yıkama işlemi gerçekleştirilmiş, bu sayede yüzeylere tutunmayan mikroorganizmalar ortamdan uzaklaştırılırken tutunup biyofilm oluşturanların yüzeylerde kalması sağlanmıştır. Sonrasında tüm çukurlara 120 µl dezenfektan solüsyonlarından eklenmiş ve 2, 5, 15 veya 30 dakika olmak üzere uygun görülen temas süresi boyunca beklenmiştir. Kontrol örneği için dezenfektan yerine standart sert su çukurlara eklenmiştir. Nötralizasyon işleminde kullanılan dezenfektana göre farklılık gösteren iki farklı prosedür uygulanmıştır. CET, CHX, HAC, H2O2 ve NaOCl solüsyonları için dezenfektanla temas süresi sonunda çukurlara 80’er µl 2,5 kat konsantre DENB nötralizan solüsyonu eklenerek 5 dakika beklenmiştir. DET, ETOH, BzCl ve PVP-I solüsyonları için ise 200’er µl 2,5 kat konsantre DENB nötralizan solüsyonu eklenerek 5 dakika beklenmiştir. Çukurlarda bulunan nötralizan işlem sonrası kuyucuklardan kaldırılarak serum fizyolojik ile 2 defa yıkanmış ve plaklar sonikatörde 5 dakika bekletilerek biyofilm hücelerinin yüzeyden ayrılması sağlanmıştır. Kuyucuklardaki biyofilm hücre süpernatanları steril tüplere aktarılarak uygun dilüsyonları yapılmış ve plak döküm yöntemi kullanılarak secilmiş besiyerlerine ekimleri yapılarak sayılmıştır. 41 Bölüm 3.4.4.’de planktonik mikroorganizmaların saf kültürü ve sayımı için kullanılan besiyerleri ayrıntılı olarak belirtilmiş olup monomikrobiyal biyofilm hücrelerinin ve kombinasyon yapılmış ikili ve üçlü polimikrobiyal biyofilm hücrelerinin ayrı ayrı saf kültürlerinin eldesi ve sayımı için de aynı besiyerleri kullanılmıştır. 3.6. Kalıntı H2O2 Miktarının Titrimetrik Ölçümü Yukarıda belirtildiği şekilde oluşturulan 24 saatlik monomikrobiyal Pseudomonas biyofilm oluşumu ve Pseudomonas, Stafilokok ve Candida’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm oluşumu, yarım saat boyunca %1,5 H2O2 ile muamele edilmiş ve süre sonunda biyofilm süpernatanları çukurlardan pipet yardımıyla flakon içine toplanarak filtreden geçirilmiştir. Steril süpernatanların 1 ml’si alınarak içinde 2ml H2SO4 ve 20 ml distile su bulunan solüsyonlar içine aktarılmıştır. Solüsyonlarda bulunan H2SO4 hem sesil hücrelerde bulunan katalaz enzimini inhibe ederek reaksiyonun durdurulmasını hem de ürüne dönüşmeden kalan H2O2’in stabilitesini sağlamaktadır. Bu yöntemde sesil hücrelerde bulunan kalıntı H2O2 miktarı titrimetrik olarak ölçülmüştür. Hayli yüksek bir oksitleyici ajan olan H2O2, redükte bir madde olan permanganat (MnO42-) iyonu ile redoks tepkimesine girer ve reaksiyonun dengesi 5 mol H2O2 ‘ye 2 mol permanganat olacak şekilde sonuçlanır. Titrasyon’da 0.002 M permanganat çözeltisi iyon kaynağı olarak kullanılmıştır. Koyu bordo renkli bu çözelti büret içine hun yardımıyla aktarılmış ve toplam hacmi 23 ml olan süpernatan-H2SO4 solüsyonu steril bir erlen içine boşaltılarak büret musluğunun altına yerleştirilmiştir. Permanganat çözeltisi musluğun hafifçe açılmasıyla erlen içine aktarılmış ve ortam açık pembe renk olana kadar damlatma işlemine devam edilmiştir. Sabit açık pembe renk elde edildiğinde titrasyon sonlandırılmış ve harcanan permanganat miktarları belirlenerek hücrelerdeki kalıntı H2O2 miktarı hesap edilmiştir [149]. 3.7. Sesil Hücrelerdeki Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS) Florimetrik Ölçümü Multititrasyon plaklarında oluşturulan P. aeruginosa’nın olgun monomikrobiyal biyofilm oluşumları ve P. aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm oluşumları serum fizyolojik ile yıkama işlemi sonrasında yarım saat boyunca %1,5 H2O2 ile muamele edilmiştir. Kontrol örnekleri için %1,5 H2O2 yerine aynı koşullarda standart sert su kullanılmıştır. Sesil hücrelerdeki hücre içi ROS birikimi ışığa hassas 2’,7’- 42 dichlorofluoresein diasetat (DCFHDA) boyası (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kullanılarak florimetrik bir yöntemle ölçülmüştür. Uygulanan bu yöntemde temel mekanizma; hücre içi geçirgen yapıdaki floresan vermeyen DCFH-DA boyasının hücre içine difüz etmesi ve burada hücresel esteraz enzimleri aracılığıyla floresan vermeyen 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescin (DCFH) bileşiğine dönüşmesi şeklindedir. Sonrasında bu bileşik ortamda bulunan ROS bileşikleri vasıtasıyla hızlıca oksitlenerek oldukça yüksek miktarda floresan veren 2’, 7’-dichlorofluorescein (DCF) bileşiğine dönüşmektedir [150]. Dezenfektan eklenmiş biyofilm çukurlarına aynı zamanda deney öncesi taze hazırlanan 10 µM DCFHDA boyası da eklenerek plaklar yarım saat süre ile inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda hücrelerdeki floresan miktarı 485 nm (eksitasyon) ve 535 nm (emisyon) dalga boylarında ölçülmüştür. Elde edilen veriler kontrol biyofimlerinden elde edilen verilerle karşılaştırlmıştır. Bu boyanın dönüşümü biyofilmlerdeki metabolik açıdan aktif hücre sayısıyla orantılı olduğundan sonuçlar monomikrobiyal biyofilmdeki P.aeruginosa’nın ve polimikrobiyal biyofilmdeki P. aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’ın kültüre edilebilir total hücre sayısına göre normalize edilmiştir. Hücre içi ROS seviyelerinin ölçümü 3 kez tekrar edilmiştir. 3.8. P. aeruginosa ve S .aureus Sesil Hücrelerindeki Stres ile İlişkili Genlerin Ekspresyonu 3.8.1. Biyofilmlerden total RNA ekstraksiyonu Yarım saat süresince %1.5 H2O2 dezenfektan solüsyonuna ve sonrasında nötralizasyon işlemine maruz bırakılmış P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm hücreleri ve yalnızca P. aeruginosa ve S.aureus’dan oluşan monomikrobiyal biyofilm hücreleri mRNA ekstraksiyon işlemi için bölüm 3.5.2.’de anlatıldığı gibi plak çukurlarından gibi steril falkon tüpleri içine alınmıştır. Kontrol örneği olarak dezenfektan yerine standart sert su eklenmiş biyofilmler kullanılmıştır. Hücrelerden total RNA ekstraksiyonu ‘‘SV Total RNA Isolation System’’ (Promega, Fitchburg, WI, USA) kit’i kullanılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda aşağıda belirtilen protokole göre uygulanmıştır. 43 ‘‘SV Total RNA Isolation System’’ total RNA ekstraksiyon protokolü a. Santrifüjlenerek çöktürülen biyofilm hücrelerinden 1 ml örnek alınmış ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılarak 2 dakika 14000 g’de santrifüj edilmiştir. b. Süpernatanı dikkatlice kaldırılıp kurutulan peletin üzerine final konsantrayonu gram negatifler için 0.4 mg/ml, gram pozitifler için 3 mg/ml olan 100 µl taze hazırlanmiş lizozim eklenerek inkübe edilmiştir. c. Peletin üzerine 75 µl RNA lizis tamponu eklenerek hücreler parçalanmıştır. d. Üzerine 350 µl RNA seyreltme tamponu eklenerek ependorf alt-üst olacak şekilde hafifçe çalkalanmış ve yeni mikrosantrifüj tüpü içine aktarılmıştır. e. Üzerine % 95’ lik etanolden 200 ml eklenmiş sonrasında spin sisteminin içine aktarılarak 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiştir. f. Toplama tüpündeki sıvı döküldükten sonra ortama 600 µl RNA yıkama solüsyonunu eklenmiş ve 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiştir. g. Toplama tüpündeki sıvı döküldükten sonra her örnek için hazırlanan DNaz inkübasyon miksinden 50 µl eklenmiştir. DNAaz inkübasyon miksi 40 µl ‘‘Yellow Core’’ tamponu, 5 µl 009M MnCl2, 5 µl DNAaz1 enziminden oluşmaktadır. Onbeş dakikalık bir inkübasyon işleminden sonra spin sisteme 200 ml DNaz inhibisyon solüsyonu eklenerek 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiştir h. 600 µl yıkama solüsyonu eklenerek tekrar 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiş ve toplama tüpündeki sıvı döküldükten sonra ortama 250 µl RNA yıkama solüsyonu eklenerek yüksek hızda 2 dakika santrifüjlenmiştir. ı. Toplama tüpünde bulunan spin filtre 1,5 ml’ lik elüsyon tüpü içine aktarılmış ve 100 µl nükleaz içermeyen su membran filtre üzerine aktarılarak 14000 g‘de 1 dakika santrifüjlenmiş ve filtre sistemden çıkartılarak tüp -80 0C’ ye ayarlı dondurucu içine yerleştirilmiştir. 44 3.8.2. RNA ekstraktlarının ölçümü ve cDNA elde edilmesi Ekstrakte edilen total RNA miktarları BioDrop mLITE (BioDrop, Cambridge, UK) cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Ölçülen RNA miktarları biyofilm izolatları için her örnek başına 100 ng/µl olacak şekilde hesaplanmış ve ‘‘qScript cDNA SuperMix’’ (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) kit’i kullanılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda RNA’ların tek zincirli komplementer DNA (cDNA)’ya dönüştürülmeleri sağlanmıştır. cDNA eldesi için kit’in içerisinde bulunan ve aşağıdaki çizelge 3.2.’ de belirtilen ajanlar buz üzerinde çözülmüş ve 0,2 ml’lik PCR tüplerine toplam son hacim 20 µl olacak şekilde uygun hacim ve konsantrasyonda eklenmiştir. Çizelge 3.2. cDNA sentezinde kullanılan ajanların hacim ve konsantrasyonları Kit içeriği qScript cDNA Super Mix (5x) qScript Reverz Transcriptaz (50X) Hacim/Reaksiyon 4 µl 1 µl Son konsantrasyon 1X 2,5X RNaz/DNaz içermeyen su Kalıp RNA Toplam hacim değişken değişken 20 µl 1µg-10 pg total RNA - Hazırlanan reaksiyon mixleri hafifçe vorteklenip santrifüj edildikten sonra aşağıda belirtilen programa ayarlanmış termal döngü cihazına yerleştirilmiştir. § 25 0C 5 dakika § 42 0C 30 dakika § 85 0C 5 dakika § +4 0C ∞ 3.8.3. Real-Time PZR yöntemi ile cDNA’ların çoğaltılması Real-time PZR reaksiyonu ‘‘PerfeCTa SYBR Green FastMix’’ (Quanta, Biosciences) kit’i kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Reaksiyonda kullanılan primerlerden oxyR, fpvaI, ahpC, pvdS ve sodM’e ait olan diziler P.aeruginosa gen bölgeleri için literatürden elde edilmiştir [144, 151, 152]. KatA ve katB primerlerine ait diziler gen bankasında P.aeruginosa PAO1 45 sekans verileri kullanılarak primer-BLAST aracılığıyla dizayn edilmiştir. Çizelge 3.3.’de çalışmada kullanılan primerlere ait diziler belirtilmiştir. Çizelge 3.3. Kantitatif PZR analizinde kullanılan P.aeruginosa PAO1 suşuna ait primer dizileri Hedef Gen oxyR katA katB sodM ahpC pvdS fpvAI fabD* oprM* Forward primer Primer sekansı (5’-3’) Reverz primer CTCACCGAACTGCGCTACA GTGCGATCAAGGGCAAACC GTTGATGTGCGAGGTTTCC CCTTGCCTTACGCCTACGATG GCAAGTTCATCGAGGTGACC GCGTTCTTCAGGCTCCAGTC CTGCAGCAGTGCGATCAAGGGCAA GCATCCCTCGCATTCGTCT CCATGAGCCGCCAACTGTC CGAGTCGGCCAGCACTT TTCTTCAGGCTCCAGTCTC TGTGCGAGGTTTCCACCG TGCCGCAGCAGACTTTCCA CTTTCTGGAACTCGCCGTAG AGTTGATGTGCGAGGTTTCC GTGGACGTCGCAGGTTCCAGTAGTC GGCGCTCTTCAGGACCATT CCTGGAACGCCGTCTGGAT * house-keeping genleri Reaksiyon sonrası elde edilen ekspresyon verileri literatürden elde edilen fabD ve oprM referans genlerine göre normalize edilmiştir [153]. Tüm primerlerin özgüllüğü erime eğrisi analizi ile değerlendirilmiştir. S.aureus Mu50 gen bölgeleri için dps, katA, ldhA ve sodA’ya ait olan primer diziler literatürden elde edilmiştir [154]. AphF ve trxB primerlerine ait diziler gen bankasında S.aureus Mu50 sekans verileri kullanılarak primer-BLAST aracılığıyla dizayn edilmiştir. Ekspresyon seviyeleri multi locus sequence typing (MLST) veritabanından seçilen yqi ve tpi referans genlerine göre normalize edilmiştir. Çizelge 3.4.’de çalışmada kullanılan primerlere ait diziler belirtilmiştir. 46 Çizelge 3.4. Kantitatif PZR analizinde kullanılan S.aureus Mu50 suşuna ait primer dizileri Forward primer ahpF dps katA ldhA sodA tpi* trxB yqi* Primer sekansı (5’-3’) Reverz primer AATTGCTGCTTCAACCCAG CACAAAGCTACACAATTTCCACTG ATGCGCAAAGATATCGATTAGGA GCAACATGGAAATTCTCTGG CTGCTGTACGTAATAATGGCGG TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA GCTGCAGTATACGCATCACG CAGCATACAGGACACCTATTGGC AAAGGTGTTGCATTCTGCCC ATACATCATCGCCAGCATTACC TGGTGGCTTTTTATATTCAGGTTG CAGTCAATACGGCATCTTCAT ATGTAGTCAGGGCGTTTGTTTTG TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC ATTAGCCATTTGACCGCCTG CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC * house-keeping genleri Son hacim 20 µl olacak şekilde kantitatif PZR reaksiyon karışımı aşağıda belirtildiği şekilde hazırlanmıştır. § Forward primer (Sigma) 2 µl § Reverz primer (Sigma) 2 µl § DEPC 4 µl § Syber Green (BR) 10 µl § Kalıp cDNA 2 µl § Toplam hacim 20 µl Yukarıda belirtilen reaktifler 0.2 ml hacimli 96 çukurlu steril plaklara aktarılarak reaksiyon için uygun program girilmiş olan termal döngü cihazına (CFX96 Real Time System; BioRad, Hercules, CA,USA) yerleştirilmiştir. Reaksiyon sonrası elde edilen ekspresyon verileri literatürden elde edilen fabD ve oprM referans genlerine göre standardize edilmiştir [153]. Tüm deneyler 3 farklı zamanda tekrar edilmiştir. 3.9. İstatiksel Analizler İstatiksel veri analizleri SPSS software, versiyon 21 (SPSS, Chicago, IL, USA) programı kullanılarak yapılmıştır. Verilerin normal dağılımı Shapiro-Wilk testi kullanılarak doğrulanmıştır. Normal dağılım verileri bağımsız t-testi kullanılarak analiz edilmiştir. Nonnormal dağılım verileri Mann-Whitney test yöntemi ile belirlenmiştir. P değeri <0.05 olarak saptanan farklılıklar istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Gen ekspresyon 47 seviyesi için, p-değeri ≤ 0.01 olarak saptanan, regülasyon oranındaki farklılıkları 2 kat’dan fazla veya daha az olan sonuçlar anlamlı kabul edilmiştir. 48 49 4. BULGULAR 4.1. Canlı Monomikrobiyal Biyofilm Hücrelerinin Sayımı ve Sığır Serum Albumin ile Polimikrobiyal Biyofilm Oluşumunun Desteklenmesi Son inokulüm miktarları C. albicans SC5314 için 105 cfu/çukur, S. aureus Mu50 ve P. aeruginosa PAO-1 bakterileri için ise 106 cfu/çukur olarak hazırlanan monomikrobiyal ve polimikrobiyal hücre süspansiyonlar mikrotitrasyon plağı çukurlarına aktarılmış ve olgun biyofilm oluşumları sağlanmıştır. Olgun monomikrobiyal sesil hücre sayılarına bakıldığında C.albicans için ~106 cfu/çukur, S.aureus için ~107 cfu/çukur, P. aeruginosa için ise 107cfu/çukur olacak şekilde yaklaşık 1 log’luk artış gözlenmiştir. Olgun polimikrobiyal biyofilmin kontrol grubunda yer alan her bir mikroorganizmanın plak sayım sonuçlarına bakıldığında C.albicans için ~101 cfu/çukur, S.aureus için ~102 cfu/çukur, P. aeruginosa için ise ~106 cfu/ml üreme sayıları elde edilmiştir. S.aureus ve C.albicans için elde edilen düşük koloni sayıları, bu mikroorganizmaların üremelerinin ve/veya biyofilm oluşumlarının P.aeruginosa tarafından inhibe edildiğini göstermektedir. Polimikrobiyal biyofilmlerdeki mikrobiyal hücre sayılarının herhangi bir dezenfektan ajanı ile temas etmeyen kontrol grubunda dahi ~101 veya 102 cfu/çukur gibi az miktarda bulunmaları, test gruplarının nitel olarak değerlendirilmeleri açısından problem teşkil etmektedir. Olgun biyofilm test grubunda bulunan başlangıç mikroorganizma sayısının dezenfektanla temas öncesinde bu kadar düşük olması dezenfektanların polimikrobiyal biyofilmler üzerindeki etkinliğinin güvenilir düzeyde belirlenmesi açısından problem oluşturmaktadır. Ayrıca mikroorganizmaların polimikrobiyal bir ortamda birlikte iken birbirlerine avantaj sağladıklarını veya tam tersi bir durum olan mikrobiyal birlikteliğin birbirlerine antagonistik bir etki oluşturduğunu belirleyebilmek için de yine başlangıç mikroorganizma sayısının düşük olmaması gerekmektedir. Çünkü mikrobiyal birliktelikten doğan tüm bu olumlu yada olumsuz etkiler dezenfektan ile temas sonrasında her bir mikroorganizma sayısındaki artış yada azalışa göre belirlenecektir. Bu sebeple ortamdaki mikrobiyal üreme inhibisyonunu engelleyebilmek ve P.aeruginosa varlığında S.aureus ve C.albicans’ın üremesini arttırabilmek amacıyla besiyeri içeriğine %0-5 aralığını içeren BSA ayrı ayrı farklı konsantrasyonlarda eklenmiştir. Şekil 4.1.’de %0, 1, 2, 3 ve 5 BSA 50 ortama eklendiğinde polimikrobiyal biyofilmde birarada bulunan P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans sesil hücrelerinin cfu/ml sayıları görülmektedir. Şekil 4.1. Değişen konsantrasyonlarda BSA eklenmiş polimikrobiyal biyofilmlerde P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans sesil hücrelerinin cfu/ml sayıları Besiyeri ortamına %5’ lik konsantrasyonda BSA eklenmesi olgun polimikrobiyal biyofilmi oluşturan tüm mikrobiyal türler için en uygun, ortak konsantrasyon olarak belirlenmiştir. 4.2. Planktonik Mikrobiyal Kültürler Üzerine Dezenfektanların Etkisi Çalışmamızda kullanılan 9 farklı dezenfektanın P.aeruginosa, S.aureus ve C.albicans planktonik mikroorganizmalar üzerindeki mikrobisidal etkisi Avrupa standartları (EN 1040) modifiye kantitatif süspansiyon test yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. NaOCl (%0,05) ve H2O2 (%1,5) solüsyonları haricinde çalışmada kullanılan bütün dezenfektanlar hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal planktonik hücre kültürlerinin tümü için etkili bulunmuştur. Dezenfektanların planktonik hücreler üzerindeki % ölüm oranları çizelge 4.1.’de belirtilmektedir. Sonuçlar ‘‘ölüm oranı yüzdesi’’ olarak hesaplanmış ve veriler ortalama ± SEM değerleri olarak belirtilmiştir. 51 Çizelge 4.1. Dezenfektanların planktonik kültürler üzerindeki mikrobisidal etkisi Biyosid NaOCl H2O2 BzCl DET ETOH CHX CET HAC PVP-I S.aureus Mu50 Mono Poli 99,99±23 99,99±36 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 P.aeruginosa PAO1 Mono Poli 99,98±14 99,84±16 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 C.albicans SC5314 Mono Poli 99,96±32 99,99±3,4 100±0 87,50±6,3 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 Planktonik kültürler üzerine uygulanan modifiye kantitatif süspansiyon testinde deney koşullarının validasyonu, kullanılan nötralizanın validasyonu ve toksisite kontrolü ayrı ayrı test edilmiş ve sonuçlar deney koşulları için uygun bulunmuştur. 4.2. Dezenfektan Ajanlarına Karşı Polimikrobiyal Biyofilmlerde Mikroorganizmal İletişim ve Etkileşimlerin Belirlenmesi Titrasyon plağı çukurlarında oluşturulan olgun monomikrobiyal ve polimikrobiyal sesil bakteri ve mantar hücreleri 9 farklı dezenfektan ile test edilmişdir. Dezenfektan ile temas sonrası biyofilmlerde yaşayan sesil hücreler plak sayım yöntemi ile sayılarak belirlenmişlerdir. Çalışmamızda mantar ve bakterilerden oluşan ikili ve üçlü polimikrobiyal biyofilmlerdeki mikrobiyal birlikteliğin türlerin yaşamına avantaj sağlaması ya da dezavantajlı olması veya nötr etki göstermesi durumu araştırılmıştır. Bu amaçla dezenfektan ajanlarıyla temas sonrası hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal biyofilmlerde yaşayan hücre sayıları her biyofilm modelinin kendi kontrol grubundaki canlı hücre sayıları ile karşılaştırılmış ve hücre sayısındaki artış, azalış veya değişmeme durumu belirtilmiştir. Çalışma sonuçlarımız biyofilm oluşumunda bulunan mikrobiyal sesil hücrelerin antimikrobiyal ajanlara duyarlılık profillerinin tek bir faktöre bağlı olmadığını; kullanılan dezenfektana, test edilen mikrobiyal türe ve ortamda başka mikrobiyal tür/türlerin varlığına bağlı olarak değişkenlik gösterebileceğini vurgulamaktadır. Şekil 4.2. a’da C.albicans’ın sesil hücreleri gerek S.aureus ve/veya P.aeruginosa ile ikili gerekse de S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans türleri ile üçlü polimikrobiyal biyofilm 52 oluşumu içindeyken dettol ajanına karşı anlamlı azalmış duyarlılık gösterdiği görülmektedir. Şekil 4.2. b ve 4.2. c’de, ortamda bulunan mikrobiyal türlere bağlı olarak sırasıyla CHX ve NaOCl’e karşı P.aeruginosa ve S.aureus monomikrobiyal hücrelerin duyarlıklarındaki istatistiksel anlamlı artış görülmektedir. Şekil 4.2. d’de ise P.aeruginosa’nın ETOH’e karşı sergilediği duyarlılık profilinde, C.albicans ile oluşturduğu ikili biyofilm modeli haricindeki diğer polimikrobiyal biyofilm modellerinin hiçbirinde istatiksel anlamlı bir değişim gözlenmediği görülmektedir. a) c) b) d) Şekil 4.2. Farklı türden mikrobiyal sesil hücrelerin dezenfektan ajanlarına duyarlılıkları Çizelge 4.2. ’de hem monomikrobiyal hem de S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans türleri tarafından oluşturulan üçlü polimikrobiyal biyofilm modelinde dezenfektanların öldürme oranlarının yüzdesi belirtilmektedir. Monomikrobiyal biyofilm içerisindeki S.aureus sesil hücreleri CHX, CET ve HAC ajanlarına karşı üçlü polimikrobiyal biyofilm yapısı içerisinde bulunan S.aureus hücrelerine oranla istatiksel anlamlı olarak daha duyarlı bir profil sergilemişlerdir. DET ajanına karşı ise tam tersi sonuç alınmıştır (Çizelge 4.2.). Sonuçlar ‘‘ölüm oranı yüzdesi’’ olarak hesaplanmış ve veriler ortalama ± SEM değerleri olarak belirtilmiştir. 53 Çizelge 4.2. Dezenfektanların S.aureus-P.aeruginosa-C.albicans türlerinden oluşan üçlü polimikrobiyal biyofilmleri öldürme oranı yüzdeleri S.aureus Mu50 & P.aeruginosa PAO1 & C.albicans SC 5314 Mono S.a NaOCl BzCl DET ETOH H2O2 CHX CET HAC PVP-I 90,98±14 99,50±16 99,93±3.1+ 6,66±17 71,43±8,9 95,50±3,2 46,35±17 75,01±7,1 99,99±9,7 Poli S.a 96,02±9,7 99,95±16 96,46±4,2 66,07±17a 88,22±9,8 100,00±0 a 95,94±17a 96,14±13 a 100,00±0 Mono P.a 0.00±4.6 72,94±9.1 85,49±8.2 99,04±9.5 0.00±9.3 99,99±2.9 0,00±16 0,00±7.5 100,00±0 Poli P.a a 98,84±15 75,23±10 99,92±4,7 a 98,92±5,5 96,94±9,1 a 100,00±0 a 49,25±20 a 45,47±13 a 99,72±8,3 Mono C.a Poli C.a 92,76±2,2 89,51±7,3 99,99±5,6+ 54,83±15,2 47,81±6,9 99,91±2,6 0,00±17,8 14,29±3,1 98,83±7,5 95,50±3,0 a 99,31±9,9 a 99,25±3,4 88,04±18,5 82,57±8,3 a 100,00±0 a 53,38±12 a 43,04±10 a 100,00±0 a a Polimikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü monomikrobiyal’e oranla daha fazla saptanmıştır (p < 0.05) + Monomikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü polimikrobiyal’e oranla daha fazla saptanmıştır (p < 0.05) NaOCl, DET, H2O2, CHX, CET ve HAC ajanlarına karşı P.aureginosa sesil hücreleri monomikrobiyal biyofilmlere oranla üçlü polimikrobiyal biyofilm yapısı içerisinde iken istatiksel anlamlı olarak daha duyarlı bir profil sergilemişlerdir (Çizelge 4.2.). C.albicans’ın sesil hücrelerinin polimikrobiyal biyofilm içinde iken NaOCl, BzCl, H2O2, CHX, CET, HAC ve PVP-I ajanlarına monomikrobiyal biyofilmdeki hücrelere göre daha duyarlı bir profil sergilerken, DET ajanına karşı daha az duyarlı bulunmuşlardır (Çizelge 4.2.). Çalışmamızda bakteri ve mantar suşları tarafından oluşturulan ikili polimikrobiyal biyofilm modelleri de geliştirilmiş olup dezenfektanların biyofilmler üzerindeki öldürme yüzdeleri belirlenmiştir. Buna ilaveten mikroorganizmaların bu ikili biyofilm oluşumları içerisindeki birlikteliklerinin dezenfektanlardan korunmada rol oynayıp oynamadığı belirlenmeye çalışılmıştır (Çizelge 4.3). S.aureus sesil hücreleri tek başlarına oluşturdukları biyofilm oluşumuna oranla S.aureus ve C.albicans ikili biyofilmi içerisinde iken NaOCl, CHX, ETOH ve HAC ajanlarına daha duyarlı bulunmuştur. C.albicans ise NaOCl, BzCl ve PVP-I ‘ye karşı ikili biyofilm içinde iken anlamlı oranda daha duyarlı ancak DET ve ETOH’a daha az duyarlı olarak saptanmıştır. Sonuçlar istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur (Çizelge 4.3). 54 Çizelge 4.3. Dezenfektanların S.aureus-C.albicans ve S.aureus-P.aeruginosa ikili polimikrobiyal biyofilmlerini öldürme oranı yüzdeleri NaOCl BzCl DET ETOH H 2O 2 CHX CET HAC PVP-I S.a Mu50 Mono C.a SC5314 Mono P.a PAO1 Mono S.aureus & C.albicans Poli S.a Poli C.a S.aureus & P.aeruginosa Poli S.a Poli P.a 90,98 99,50 99,93 6,66 71,43 95,50 46,35 75,01 99,99 92,76 72,94 99.99 99,04 47,81 99,91 0,00 47,81 98,83 0,00 89,51 85,49 54,83 0.00 99,99 0,00 0,00 100,00 99,97* 99.78 78,66 96,85* 67,14 99,59* 80,26 94,46* 100,00 92,75 99.97 98,20* 43,26 85,13 100,00* 90,17 97,35* 100,00 99,10* 92.72* 91,93+ 98,83+ 61,14 99,99 37,52 90,94 99,97* 98,35* 91.16* 99,96* 98,37 98,64* 100,00* 95,31* 96,92* 99,99 * Polimikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü monomikrobiyal’e oranla daha fazla saptanmıştır (p < 0.05) + Monomikrobiyal biyofilmde istatistiksel anlamlı hücre ölümü polimikrobiyal’e oranla daha fazla saptanmıştır (p < 0.05) S.aureus ve P.aeruginosa ikili biyofilm yapısı içerisinde bulunan P.aeruginosa sesil hücreleri NaOCl, BzCl, H2O2, DET, CHX, CET ve HAC ajanlarına, P.aeruginosa monomikrobiyal biyofilm hücrelerinden daha duyarlı bulunmuştur. S.aureus’un ise CHX ve HAC’a karşı ikili biyofilm içinde iken daha duyarlı iken DET’e karşı daha az duyarlı olduğu saptanmıştır. Sonuçlar istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur (Çizelge 4.3). 4.3. Rezidual Hidrojen Peroksit’in Ölçümü Yalnızca P.aeruginosa suşlarından oluşan biyofilm hücreleri ve S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans’ın oluşturduğu polimikrobiyal biyofilm hücreleri %1,5’luk H2O2 ajanı ile yarım saat muamele edilmiş ve sonrasında biyofilm süpernatanlarında bulunan kalıntı H2O2 miktarı titrimetrik olarak belirlenmiştir. Kalıntı H2O2 miktarı; P.aeruginosa biyofilminde 0,015 ± %0,007 (ortalama ± SEM), S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans’dan oluşan polimikrobiyal biyofilmde ise 0,035 ± %0,027 (ortalama ± SEM) olarak belirlenmiştir. Elde edilen bu sonuçlar neticesinde her iki biyofilm modeli arasında kalıntı H2O2 miktarı açısından istatistiki olarak anlamlı fark bulunmamıştır. 55 4.4. Biyofilmlerde ROS Birikiminin Belirlenmesi Yarım saat boyunca %1,5’ lik H2O2 ile muamele edilen P.aeruginosa’nın monomikrobiyal ve S.aureus, P.aeruginosa ve C.albicans’ın oluşturduğu polimikrobiyal biyofilm hücrelerindeki ROS miktarları DCFHDA boyası kullanılarak florimerik ölçülmüştür. Kontrol grupları ile kıyaslandıklarında test grubu örneklerinden hem P.aeruginosa monomikrobiyal hücrelerde hem de üçlü polimikrobiyal sesil hücrelerde ROS birikiminin istatiksel anlamlı olarak artmış olduğu gözlenmiştir (p ≤ 0.05). Test gruplarının monomikrobiyal ve polimikrobiyal biyofilm hücrelerinde ROS birikimi bakımından farklılık gözlenmiş ancak bu fark istatiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.05). Kontrol gruplarında ise monomikrobiyal biyofilmdeki bazal ROS seviyesi polimikrobiyale oranla daha yüksek olarak ölçülmüş ve bu fark istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p ≤ 0,05) (Şekil 4.3). Şekil 4.3. H2O2 ile muamele sonrası olgun biyofilmlerdeki ROS seviyelerinin ölçümü. Veriler en az 24 çukurda oluşturulmuş biyofilm örneklerinin 3 bağımsız tekrarını içeren ortalama ve SEM değerlerini belirtmektedir. Veriler 1000 canlı hücredeki floresan miktarına göre standardize edilmiştir.. 4.5. Oksidatif Stres ile İlişkili Gen Ekspresyon Seviyelerinin Belirlenmesi Pseudomonas aeruginosa, S.aureus ve C.albicans’dan oluşan polimikrobiyal biyofilm hücreleri ve yalnızca P. aeruginosa ve S.aureus’dan oluşan monomikrobiyal biyofilm 56 hücreleri peroksit ajanı ile muamele edilmiş ve sonrasında uygulanan nötralizasyon basamağıyla da antimikrobiyal ajanın aktivitesi nötralize edilmiştir. Hem yalnızca S.aureus ve P.aeruginosa’dan oluşan ayrı ayrı monomikrobiyal hücre örneklerindeki hem de bu iki bakteri türününde içinde bulunduğu üçlü polimikrobiyal biyofilm hücre örneklerindeki oksidatif stress ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri kantitatif eş zamanlı RT-PZR yöntemiyle belirlenmiştir. Kontrol grubu olarak %1,5’ lik H2O2 yerine standart sert su ile muamele edilen biyofilm örnekleri test edilmiştir. Şekil 4.4. S.aureus ve P.aeruginosa’nın stres ile ilişkili gen ekspresyonlarının değişimleri Pseudomonas aeruginosa için oksidatif stress ile ilişkili genler olarak oxyR, katA, katB, ahpC, pvdS, fpvaI ve sodM bölgelerinin ekspresyon seviyeleri her iki biyofilm modeli (monomikrobiyal P.aeruginosa hücreleri ve polimikrobiyal biyofilm hücreleri) için belirlenip birbirlerine göre karşılaştırılmıştır. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda yer alan P.aeruginosa sesil hücrelerinin katalaz enzimini kodlayan katA, katB genleri, bir siderofor reseptörünü kodlayan fpvaI geni ve oksidatif stress’e karşı korunma mekanizması genlerini regüle eden oxyR geni monomikrobiyal sesil hücrelere göre daha fazla eksprese olmalarına rağmen bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.). Sırasıyla alkil-hidroksi peroksidaz enzimini ve hücreye demir alımı ve salınımını sağlayan sideroforlardan piyoverdin’i kodlayan ahpC ve pvdS genlerinin regülasyonlarında monomikrobiyale oranla polimikrobiyal sesil P.aeruginosa hücrelerinde istatistiksel olarak anlamlı olmayan azalışlar saptanmıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.). Staphylococcus aureus için oksidatif stress ile ilişkili dps, katA, soda, ldhA, trxB ve ahpF genlerinin ekspresyon seviyeleri S.aureus monomikrobiyal hücreleri ve polimikrobiyal 57 oluşumdaki sesil S.aureus hücreleri için belirlenip birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda yer alan S. aureus hücrelerinin ldhA ve trxB genleri monomikrobiyal sesil hücrelere göre daha fazla eksprese olmalarına rağmen bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.). Süperoksit dismutaz ve katalaz gibi enzimleri kodlayan soda, katA ve dps genlerinin ekspresyonlarında ise monomikrobiyal’e oranla polimikrobiyal sesil S.aureus hücrelerinde istatistiksel olarak anlamlı olmayan azalışlar saptanmıştır (p > 0.01) (Şekil 4.4.). 58 59 5. TARTIŞMA Biyofilmlerin insan vücudunda gelişen mikrobiyal enfeksiyonların çoğunluğundan sorumlu olduğu bilinmektedir. Hastalara takılan medikal cihazların uzun sureli ve yoğun kullanımı biyofilm oluşumu için uygun koşulları sağlamaktadır. Biyofilmlerin insan vücudundaki enfeksiyonların %80’ini oluşturduğu tahmin edilmektedir. Günümüzde tanımlanan biyofilm enfeksiyonlarının çoğunun polimikrobiyal olduğu çeşitli kronik enfeksiyonlardan ve yabancı cisim enfeksiyonlarından sıklıkla izole edilmeleri sonucunda anlaşılmıştır. Candida albicans kan dolaşımı enfeksiyonlarında dördüncü en sık izole edilen patojen olup en yüksek ölüm oranı ile ilişkili bulunmaktadır. Kandida kökenli nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonlarının %27’ sinin S.aureus ile birliktelik içinde bulunan polimikrobiyal kaynaklı enfeksiyonlar olduğu bildirilmiştir. C.albicans biyomateryaller üzerine sıkıca tutunarak kolaylıkla biyofilm oluşturabilmekte ve ortamda bulunan S.aureus türü bakterileri genellikle C.albicans’ın hiflerine tutunarak polimikrobiyal biyofilm yapısını oluşturmaktadır. Ayrıca pek çok enfeksiyondan C.albicans ve P.aeruginosa’nın aynı anda izole edilmesi hastalıklarda bu iki mikroorganizmanın birlikte rol oynadığını göstermiştir [155]. Çalışmamızda C.albicans, S.aureus ve P.aeruginosa standart suşları ile hem monomikrobiyal hemde ikili ve üçlü polimikrobiyal biyofilm modelleri 96 çukurlu mikrotitrasyon plaklarında başarıyla geliştirilmiştir. Üçlü biyofilm modeli oluşturulurken başlangıçta S.aureus ve C.albicans üremesinin P.aeruginosa tarafından baskılandığı gözlenmiş ancak sonrasında ortama %5 BSA eklenmesiyle bu problem ortadan kaldırılmıştır (Şekil 4.1.) [156]. Bir serum proteini olan albumin’in serbest hidroksil ve sülfidril gupları sayesinde ortamda varolan toksik ROS bileşiklerini yakalayarak hücrelerin ROS tarafından apoptozisini engellediği bilinmektedir. Antioksidan rolü olduğu bilinen BSA ile yapılan bir başka çalışmada ise yüksek demir konsantrasyonu varlığında tetiklenen hücre membranı lipid peroksidasyonunun ortama BSA eklenmesiyle inhibe olduğu gözlenmiştir. Yapılan çalışmalarda ayrıca BSA’nın ortamda fazla miktarda bulunan demir şelatlarına elektrostatik olarak bağlanıp hücre membranından uzak kalmalarını sağlayarak demir aracılı membran lipid peroksidasyonunu engelledikleri de gösterilmiştir [157, 158]. 60 Piyosiyanin, P.aeruginosa tarafından üretilen bir fenazin olup oksijen molekülünü zararlı oksijen derivatiflerine (O2-) ve H2O2’e indirgemektedir. Ayrıca piyosiyanin varlığının hücrede ferrik demir birikiminden sorumlu spesifik genlerin regülasyonunu arttırdığı da bildirilmiştir [159]. Çalışmamızda başlangıçta S.aureus ve C.albicans üremelerinin P.aeruginosa tarafından inhibe edildiği gözlenmiş ancak ortama %5 BSA eklenmesiyle bakterilerin yeniden ürediği görülmüştür. BSA’nın yukarıda belirtilen ROS aracılı hücre apoptozisini engellemesi veya demir aracılı lipid peroksidasyonunu inhibe etmesi gibi çeşitli koruma mekanizmaları sayesinde P.aeruginosa tarafından üretilen piyosiyaninin zararlı toksik etkilerini ortadan kaldırmış olabileceği düşünülmektedir Bu sebeple de ortama BSA eklenmesiyle başlangıçta Pseudomonas kaynaklı piyosiyanin bileşiği tarafından engellenen bakteriyel ve fungal üremelerin yeniden aktive olduğu varsayılmaktadır [156]. Polimikrobiyal biyofilmlerin eradike edilmeleri monomikrobiyal biyofilmlere oranla çok daha karmaşık ve zor olduğundan klinik uygulamalarda polimikrobiyal biyofilm kaynaklı enfeksiyonların tedavisi için gerekli antimikrobiyal ajan seçimi de zor olmaktadır. Bu sebeple polimikrobiyal biyofilmler için uygulanabilecek yeni tedavi stratejilerini içeren açıklama raporlarına acil ihtiyaç duyulmaktadır [160]. Nozokomiyal enfeksiyonların genellikle endojen veya ekzojen kaynaklı mikroorganizmalar tarafından geliştiği ve kan, tükrük, idrar ve diğer vücut salgılarının çevreye olası yayılmaları sonucunda mikroorganizmaların etrafı kontamine ederek bu enfeksiyonların gelişimine yardımcı oldukları bilinmektedir. Bu sebeple hastalıkların önlenmesinde dezenfeksiyon ve sterilizasyon prosedürleri oldukça önemli olup özellikle medikal alet kaynaklı biyofilm enfeksiyonlarının önlenmesinde olmazsa olmaz işlemler arasında yer almaktadır. Dezenfeksiyon işlemi hasta ve yüzeyler arasında direkt veya indirekt temasdan kaynaklanan çapraz kontaminasyonların önlenmesi açısından da oldukça önem taşımaktadır. Sağlık bakım merkezlerinde yüzey kontaminasyonlarının kaynağının genellikle yüzeylerde oluşan biyofilmler olduğu bilinmektedir. Biyofilmlerdeki mikroorganizmaların öldürülmesi için kullanılan dezenfektan ajanların temas sürelerinin mikroorganizmaların planktonik formlarından on, yüz ve bazen bin katı oranında daha fazla olduğu literatürdeki çalışmalarda yer almaktadır [161]. 61 Çalışmamızda S.aureus ve P.aeruginosa suşlarının ve C.albicans suşunun planktonik ve biyofilm formları 9 farklı dezenfektana karşı duyarlılık profillerini belirlemek amacıyla test edilmiştir. Sonuçlarımız test edilen dezenfektanların hemen hemen hepsinin, planktonik mikrobiyal hücre sayılarında % 99,999’dan daha fazla azalma sağlayarak oldukça etkin bir mikrobisidal aktivite sergilediklerini göstermiştir. Ancak bu dezenfektanlar mono veya polimikrobiyal biyofilmlere uygulandıklarında çok azının planktonik formlar üzerinde olduğu gibi güçlü mikrobisidal aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir (Çizelge 4.1.). Literatürdeki çalışmalara bakıldığında polimikrobiyal biyofilmlerin monomikrobiyallere göre antimikrobiyal ajanlara karşı sıklıkla daha azalan bir duyarlılık gösterdikleri belirtilmiştir [63, 79]. S.aureus ve C.albicans ile yapılan ikili biyofilm çalışmasında S.aureus’un tek başına iken serum ortamında zayıf bir biyofilm oluşturduğu ve vankomisine karşı daha duyarlı olduğu gözlenmiş, ancak C.albicans ile birlikte iken çok daha sağlam bir biyofilm oluşumu ve vankomisine artmış direnç bildirilmiştir. Ayrıca aynı çalışmada biyofilmlerin matriks boyası ile boyanması sonucunda S.aureus hücrelerinin etrafında antimikrobiyal dirence yol açtığı düşünülen, C.albicans tarafından üretilmiş matriks ile kaplı bir halo yapısı gözlenmiştir. S.epidermidis ve C.albicans ile yapılan başka bir çalışmada da vankomisine karşı aynı sonuç alınmıştır [63, 162]. Simoes ve arkadaşları çalışmalarında 6 farklı bakteri türü tarafından oluşturulan mono ve polimikrobiyal biyofilmlerin sodyum hipoklorite karşı duyarlılıklarını belirlemişlerdir. Sonuçlarda Acinetobacter calcoaceticus’unda içinde bulunduğu 6 farklı türün oluşturduğu polimikrobiyal biyofilmin sodyum hipoklorit ajanına en yüksek direnci gösterdiği, ancak A.calcoaceticus’u içermeyen polimikrobiyal biyofilmin bu ajana monomikrobiyal biyofilmlerden bile daha duyarlı bulunduğu belirtilmiştir. Bu çalışmayla A.calcoaceticus’ un aynı biyofilm ortamında iken diğer türlerin antimikrobiyal ajanlardan korunmasına yardımcı olduğu sonucuna varılmıştır [163]. Hastalara uygulanan kateterlerin sterilizasyonunda kateter lümeni içine antimikrobiyal sıvı solüsyonların aktarılması günümüzde antimikrobiyal kapama terapisi olarak bilinmektedir. Kateter lümen yüzeyinin sterilize edilmesini veya biyofilm oluşumunun engellenmesini amaçlayan bu uygulama in vitro da monomikrobiyal biyofilmler üzerinde uygulanmış ancak polimikrobiyal biyofilmler üzerindeki etkilerini gösteren çok az sayıda çalışma 62 bulunmaktadır. Peter ve arkadaşları etanolün olası kateter kapama solüsyonu olarak kullanılabileceğini göstermeyi amaçladıkları çalışmalarında C.albicans ve S.aureus türlerinden oluşan polimikrobiyal ve monomikrobiyal biyofilmlerde etanole ajanına duyarlılıkta, her iki biyofilm modelindeki sesil hücreler arasında anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir. Ayrıca biyofimde C.albicans’ın üremesinin engellenmesi ve etkin olarak öldürülmesi için %30’luk etanol ile 4 saatlik inkübasyon yapılması gerekirken S.aureus için %50’lik ethanol solüsyonunun kullanılması gerektiği bildirilmiştir. [164]. Çalışmamızdan elde edilen sonuçlar bazı literatür çalışmalarında öne sürülen, monomikrobiyal biyofilmlerin polimikrobiyallere göre antimikrobiyal ajanlara karşı daha duyarlı olduğu hipotezini desteklememektedir. Sonuçlarımızda antimikrobiyal ajanlara karşı duyarlılığın kullanılan dezenfektana ve test edilen mikroorganizmaya ve ortamda bulunan mikrobiyal tür/türlerin çeşidine bağlı olarak değişebileceğini göstermiş bulunmaktayız (Şekil 4.2.). Nitekim, polimikrobiyal biyofilm oluşumunda bulunan S.aureus sesil hücrelerinin hastane antiseptik konsantrasyonu, setrimid ve klorhekzidin dezenfektanlarına daha duyarlı iken, dettol ajanına daha az duyarlı bulunması veya uygulanan diğer dezenfektanlara karşı monomikrobiyal sesil hücrelerle aynı duyarlılık yanıtını sergilemesi bu duruma örnek olarak verilebilir (Çizelge 4.2.) [156]. Literatür bulgularında P.aeruginosa ile aynı mikrobiyal ortamı paylaşan S.aureus bakterilerinin çeşitli antimikrobiyal ajanlara P.aeruginosa tarafından üretilen HQNO bileşikleri sayesinde daha yüksek düzeyde direnç geliştirdikleri gözlenmiştir [79]. Harriot ve Nover tarafından 2009 yılında gerçekleştirilen çalışmada, C.albicans suşlarının S.aureus hücrelerini çevreleyen matriks yapılarını üreterek S.aureus bakterileri üzerinde koruyucu bir role sahip oldukları belirtilmiştir [63]. Çalışmamızda S.aureus sesil hücreleri polimikrobiyal biyofilm içinde iken bazı dezenfektanlara karşı daha duyarlı profil sergilemişlerdir. Ancak S.aureus’un antimikrobiyal ajanlara daha duyarlı bir profil sergilemesine neden olan mekanizma/mekanizmalar henüz bilinmeyip bu mekanizmaların aydınlatılması uygun hijyen prosedürleri ve başarılı tedavinin gerçekleştirilmesi açısından oldukça önem taşımaktadır. Candida albicans sesil hücrelerinin tek başlarına bulundukları monomikrobiyal biyofilmlere oranla üçlü polimikrobiyal biyofilm oluşumu içindeyken etanol ve dettol ajanları haricindeki tüm dezenfektanlara daha duyarlı bulunmuşlardır (Çizelge 4.2.). 63 Polimikrobiyal biyofilm modelinin kontrol grubunda, yalnızca C.albicans suşundan oluşan monomikrobiyal biyofilm kontrol grubuna oranla C.albicans hücre sayısında 1 log’ luk azalma gözlenmiştir. Bu azalmanın sebepleri arasında P.aeruginosa tarafından üretilen fenazin toksininin ortamda reaktif oksijen türlerinin artışına yol açarak mantar hücrelerinin ölümüne neden olması düşünülebilir [139]. Ancak bu toksinin, C.albicans sesil hücrelerinin polimikrobiyal biyofilm oluşumunda iken dezenfektanlarla temas sonrası bu ajanlara daha duyarlı profil sergilemelerine yol açıp açmadığı henüz bilinmemektedir. Pseudomonas aeruginosa sesil biyofilm hücreleri NaOCl, DET, H2O2, CHX, CET ve HAC ajanlarına karşı üçlü polimikrobiyal biyofilm oluşumu içindeyken daha duyarlı bulunmuşlardır. P.aeruginosa hücrelerinin monomikrobiyal biyofilm içindeyken H2O2 ajanından hiç etkilenmemesi (%0) ancak polimikrobiyal yapı içindeyken % 96.94 oranında bir hücre ölümü gözlenmesi çalışmamızın çarpıcı sonuçlarından birisidir (Çizelge 4.2.). Polimikrobiyal biyofilm yapısı içerisindeyken H2O2 ajanına karşı edinilen mikrobiyal korunma mekanizmalarından bir tanesinin difüzyon etkileşimi olduğu düşünülmektedir [156]. H2O2 bileşiğinin henüz biyofilm içine penetre olamadan biyofilm yüzeyinde bulunan katalaz enzimleri vasıtasıyla hızlıca nötralize edildiği bilinmektedir [165]. Çalışmamızda polimikrobiyal biyofilm yapısındaki Pseudomonas sesil hücrelerinin H2O2 ajanına karşı azalmış duyarlılıklarından sorumlu mekanizma/mekanizmaları, hücrelerde bulunan kalıntı hidrojen peroksit miktarının ve hücrelerde biriken ROS seviyelerinin ölçülmesiyle ve oksidatif stres ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerinin belirlenmesiyle açıklanmaya çalışılmıştır. Monomikrobiyal Pseudomonas biyofilm süpernatanından ölçülen kalıntı hidrojen peroksit miktarı, ne polimikrobiyal biyofilm süpernatanında ne de kontrol grubu süpernatanında ölçülen miktardan istatiksel olarak farklı bulunmamıştır. Bu sonuçlar test edilen tüm H2O2 miktarının her iki biyofilm modelinde de enzimler aracılığıyla tamamen parçalandığını göstermektedir. Pseudomonas aeruginosa aerobik solunum yoluyla metabolik enerjilerini sağlamaktadırlar. Membran aracılı bu solunum işlemi sırasında kontrolsüz elektron aktarımlarından dolayı hücre içinde hidrojen peroksit, super oksit anyonları ve hidroksi radikalleri gibi çeşitli 64 toksik reaktif oksijen bileşikleri oluşmaktadır. Ayrıca ortamda bulunan demir iyonlarınında (Fe+2 ve Fe+3) zararlı hidroksil radikallerinin oluşumunu stimule ettiği bildirilmiştir [151]. Çalışmamızda H2O2 ile biyofilm hücreleri endojen olarak muamele edilmişlerdir. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda Pseudomonas sesil hücrelerinde hidrojen peroksite karşı duyarlılığın sebebinin hücrede biriken toksik etkili ROS bileşikleri olabileceği düşüncesiyle monomikrobiyal Pseudomonas sesil hücrelerinden ve polimikrobiyal hücrelerden ROS ölçümü yapılmıştır. Hidrojen peroksit ile muamele edildikten sonra biyofilm hücrelerinde ölçülen ROS miktarı açısından her iki biyofilm modelinde de anlamlı fark bulunmamıştır. Bu sonuçlar biyofilmde birden fazla mikrobiyal türün birarada bulunmasının ROS üretimine ayrıca bir katkı sağlamadığını göstermektedir. Ayrıca Pseudomonas sesil hücrelerinin peroksit ajanına karşı saptanmış olan duyarlılıklarında ROS üretiminin muhtemel bir rolü olmadığı da görülmektedir. Kontrol gruplarına bakıldığında ise monomikrobiyal biyofilmdeki bazal ROS seviyesinin polimikrobiyale oranla daha yüksek bulunduğu ve bu yüksek miktarın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (Şekil 4.3.). Son olarak oksidatif etkili hidrojen peroksite artmış duyarlılıkta genotipik faktörlerin rol oynayabileceği düşünülmüştür. Bu sebeple oksidatif stres ile ilişkili genlerdeki ekspresyon seviyeleri hem P.aeruginosa’nın hem de S.aureus’un mono ve polimikrobiyal biyofilm hücrelerinden ayrı ayrı ölçülmüştür (Şekil 4.4.). Toksik bir oksijen derivatifi olan H2O2 ve benzeri ajanlara karşı bakterilerin çeşitli korunma mekanizmaları geliştirdikleri bilinmektedir. İlk aşamada bakterilerin sodA ve sodB genleri tarafından kodlanan süperoksit dismutaz enzimleri aracılığıyla toksik süperoksit anyonları H2O2 bileşiklerine dönüştürülmektedir. Sonrasında bu peroksit bileşiğine karşı katA ve katB gibi genlerden kodlanan katalaz enzimleri vasıtasıyla hücrelerin peroksit bileşiklerinden korunması sağlanmaktadır. Son aşamada ise ahpA, ahpB ve ahpCF gen bölgelerinden kodlanan alkil hidrojen peroksidaz enzimleriyle H2O2 ‘in detoksifikasyonu gerçekleşmektedir. Bir çok bakteride bu oksidatif stres cevabı genlerinin oxyR regülatörü tarafından kontrol edildiği bilinmektedir [144, 151]. Panmanee ve Hassett çalışmalarında, biyofilmlerin peroksit karşı duyarlılıklarında oxyR aracılı katB, ahpCF ve ahpB genlerinden kodlanan antioksidan enzimlerin rolünü araştırmışlar ve ahpCF tarafından kodlanan alkil hidroksiperoksidaz enzimlerinin biyofilm 65 hücrelerinin yaşamında önemli bir yer tutarken, katB tarafından kodlanan katalaz enziminin planktonik yaşam formlarında daha önemli bir yeri olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca oxyR mutantlarından oluşturulan biyofilmlerin vahşi tiplere oranla H2O2’ nin çok düşük konsantrasyonlarına dahi oldukça duyarlı olduklarını belirtmişlerdir [166]. Vinckx ve arkadaşları; P.aeruginosa oxyR mutant suşlarında bir siderofor bileşiği olan piyoverdinin hücre içine alımında ya da piyoverdin reseptörünün üretiminde vahşi tipe oranla bir değişiklik olmadığını, ancak siderofor içinde biriken demirin geri alınmasının mutant suşlarda gerçekleşmediğini belirtmişlerdir. Ayrıca oxyR mutant suşlarının katB, ahpC ve ahpB gen ekspresyon seviyelerinin üretildikleri besiyeri ortamının içeriğine göre değişiklik gösterdiğini belirterek bu genlerin transkripsiyonlarının tamamıyla oxyR genine bağımlı olmadığını belirtmişlerdir [159]. Çalışmamızda, Pseudomonas hücreleri polimikrobiyal ortamda iken peroksit ajanına monomikrobiyal ortamdakinden daha duyarlı bulunmalarından dolayı stress ile ilişkili genlerin ekspresyonlarında da duyarlılık sonucuyla paralel olarak anlamlı bir azalma görülmesi beklenmiştir. Ancak P.aeruginosa ve S.aureus’un her iki biyofilm modelinde de gerek oksidatif stress ile ilişkili genlerde gerekse de demir alımı ile ilişkili genlerde anlamlı bir fark gözlenmemiştir (Şekil 4.4.). Altta yatan genetik mekanizmaların posttranskripsiyonel regülasyonu hedef alan daha ileri düzey genetik çalışmalarla aydınlatılması gerekmektedir [156]. 66 67 6. SONUÇ ve ÖNERİLER Bu çalışma da 96 çukurlu mikrotitrasyon plakları kullanılarak stabilitesi ve tekrarlanabilirliği yüksek polimikrobiyal biyofilm modelleri başarıyla geliştirilmiş ve hastanelerde yaygın kullanılan 9 farklı dezenfektanın biyofilmleri eradike edici etkisi bu modeller üzerinde araştırılmıştır. Polimikrobiyal biyofilm oluşumunda S.aureus ve C.albicans üremesinin P.aeruginosa tarafından baskılandığı gözlenmiş ancak ortama %5 BSA eklenmesiyle mikrobiyal üreme sorunu çözülebilmiştir. Dezenfektanların çoğu, çalışılan mikrobiyal türlerin planktonik formlarında etkili bulurken biyofilm formları üzerinde aynı etki gözlenememiştir. Bazı literatür bulgularında polimikrobiyal biyofilmlerin çeşitli antimikrobiyal ajanlara karşı duyarlılıklarında monomikrobiyallere oranla azalma saptandığı belirtilmektedir. Ancak bizim sonuçlarımız bu durumun her zaman geçerli olmadığını ve büyük oranda mikrobiyal türlere, ortamda bulunan diğer mikroorganizmaların varlığına ve kullanılan dezenfektanın türüne göre değişebildiğini göstermektedir. C.albicans SC5314 ve P.aeruginosa PAO1 suşları üçlü polimikrobiyal biyofilm modelinde çeşitli dezenfektanlara karşı tek başlarına üretildikleri monomikrobiyal kültürlerine oranla daha duyarlı bulunmuşlardır. S.aureus Mu50 suşunun monomikrobiyal ve üçlü polimikrobiyal biyofilm modelindeki sonuçlarına bakıldığında ise test edilen dezenfektana bağlı olarak duyarlılıkta azalış, artış veya değişiklik gözlenmemesi gibi farklı sonuçlar elde edilmiştir. Bu değişik duyarlılık yanıtlarından sorumlu mekanizmaların yapılacak ileri çalışmalar sayesinde aydınlatılması gerekmektedir. Pseudomonas sesil hücrelerindeki kalıntı hidrojen peroksit miktarı, hücrelerde biriken reaktif oksijen türleri ve oksidatif stres ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyeleri belirlenerek, polimikrobiyal biyofilm yapısındaki Pseudomonas sesil hücrelerinin hidrojen peroksit ajanına karşı azalmış duyarlılıklarından sorumlu mekanizma/mekanizmalar aydınlatılmaya çalışılmıştır. Sonuçlarda test edilen tüm hidrojen peroksit miktarı açısından hem monomikrobiyal hem de polimikrobiyal Pseudomonas hücrelerinde anlamlı fark 68 bulunmadığı, peroksit ajanının her iki modelde de enzimler aracılığıyla parçalandığı gözlenmiştir. Ayrıca Pseudomonas sesil hücrelerinin peroksit ajanına karşı azalmış olan duyarlılıklarında ROS üretiminin muhtemel bir rolü olmadığıda belirtilmiştir. Yapılan gen ekspresyon çalışmaları sonucunda polimikrobiyal biyofilmde yer alan pseudomonas hücrelerinde peroksit ajanına karşı gözlenen azalmış duyarlılık profil gösterme sebebinin posttranskripsiyonel regülasyonu hedef alan daha ileri düzey genetik çalışmalarla aydınlatılması gerektiği bildirilmiştir. 69 KAYNAKLAR 1. Donlan R. M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases, 8 (9), 881-890. 2. Jones H., Roth I.and Sanders W. (1969). Electron microscopic study of a slime layer. Journal of Bacteriology, 99 (1), 316-325. 3. Characklis W. G. (1973). Attached microbial growths—II. Frictional resistance due to microbial slimes. Water Research, 7 (9), 1249-1258. 4. Costerton J., Geesey G.and Cheng K. (1978). How bacteria stick. Scientific American, 238 (1), 86-95. 5. Donlan R. M.and Costerton J. W. (2002). Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15 (2), 167193. 6. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R.and Lappin-Scott H. M. (1995). Microbial biofilms. Annual Reviews in Microbiology, 711-745. 7. Hoiby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S.and Ciofu O. (2010). Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35 (4), 322-332. 8. Fletcher M.and Loeb G. (1979). Influence of substratum characteristics on the attachment of a marine pseudomonad to solid surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 37 (1), 67-72. 9. Pringle J. H.and Fletcher M. (1983). Influence of substratum wettability on attachment of freshwater bacteria to solid surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 45 (3), 811-817. 10. Bendinger B., Rijnaarts H. H., Altendorf K.and Zehnder A. J. (1993). Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids. Applied and Environmental Microbiology, 59 (11), 3973-3977. 11. Lappin Scott H. M.and Costerton J. W. (2003). Microbial biofilms. (First ed.). Cambridge: Cambridge University Press, 130-145. 12. Rijnaarts H. H., Norde W., Bouwer E. J., Lyklema J.and Zehnder A. J. (1993). Bacterial adhesion under static and dynamic conditions. Applied and Environmental Microbiology, 59 (10), 3255-3265. 13. Zheng D., Taylor G. T.and Gyananath G. (1994). Influence of laminar flow velocity and nutrient concentration on attachment of marine bacterioplankton. Biofouling, 8 (2), 107-120. 70 14. Cowan M. M., Warren T. M.and Fletcher M. (1991). Mixed‐species colonization of solid surfaces in laboratory biofilms. Biofouling, 3 (1), 23-34. 15. Rosenberg, M and Kjelleberg, S. (editors). (1986). Advances in Microbial Ecology, NewYork: Plenum Press, 353-393. 16. Williams V.and Fletcher M. (1996). Pseudomonas fluorescens adhesion and transport through porous media are affected by lipopolysaccharide composition. Applied and Environmental Microbiology, 62 (1), 100-104. 17. Kachlany S. C., Planet P. J., DeSalle R., Fine D. H., Figurski D. H.and Kaplan J. B. (2001). flp‐1, the first representative of a new pilin gene subfamily, is required for non‐specific adherence of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Molecular Microbiology, 40 (3), 542-554. 18. Lamont R. J., El-Sabaeny A., Park Y., Cook G. S., Costerton J. W.and Demuth D. R. (2002). Role of the Streptococcus gordonii SspB protein in the development of Porphyromonas gingivalis biofilms on streptococcal substrates. Microbiology, 148 (6), 1627-1636. 19. Inoue T., Shingaki R., Sogawa N., Sogawa C. A., Asaumi J. i., Kokeguchi S.and Fukui K. (2003). Biofilm Formation by a Fimbriae‐Deficient Mutant of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Microbiology and Immunology, 47 (11), 877-881. 20. Petersen F. C., Pecharki D.and Scheie A. A. (2004). Biofilm mode of growth of Streptococcus intermedius favored by a competence-stimulating signaling peptide. Journal of Bacteriology, 186 (18), 6327-6331. 21. Petersen F. C., Tao L.and Scheie A. A. (2005). DNA binding-uptake system: a link between cell-to-cell communication and biofilm formation. Journal of Bacteriology, 187 (13), 4392-4400. 22. Kaplan J. B. (2010). Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research, 89 (3), 205-218. 23. Boyd A.and Chakrabarty A. á. (1994). Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology, 60 (7), 23552359. 24. Archer N. K., Mazaitis M. J., Costerton J. W., Leid J. G., Powers M. E.and Shirtliff M. E. (2011). Staphylococcus aureus biofilms: properties, regulation, and roles in human disease. Virulence 2011, 2 (5), 445-459. 25. Karatan E.and Watnick P. (2009). Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 73 (2), 310-347. 26. Evans L. V. (2003). Biofilms: recent advances in their study and control. (Amsterdam: CRC press, 1-471. 71 27. James G., Beaudette L.and Costerton J. (1995). Interspecies bacterial interactions in biofilms. Journal of Industrial Microbiology, 15 (4), 257-262. 28. Sutherland I. W. (2001). Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology, 147 (1), 3-9. 29. Hussain M., Wilcox M.and White P. (1993). The slime of coagulase‐negative staphylococci: Biochemistry and relation to adherence. FEMS Microbiology Letters, 104 (3‐4), 191-208. 30. Peters B. M., Jabra-Rizk M. A., O'May G. A., Costerton J. W.and Shirtliff M. E. (2012). Polymicrobial interactions: impact on pathogenesis and human disease. Clinical Microbiology Reviews, 25 (1), 193-213. 31. Peleg A. Y., Hogan D. A.and Mylonakis E. (2010). Medically important bacterial– fungal interactions. Nature Reviews Microbiology, 8 (5), 340-349. 32. Armstrong D. G., Lavery L. A.and Boulton A. J. (2007). Negative pressure wound therapy via vacuum‐assisted closure following partial foot amputation: what is the role of wound chronicity? International wound journal, 4 (1), 79-86. 33. Hansen S. K., Haagensen J. A., Gjermansen M., Jørgensen T. M., Tolker-Nielsen T.and Molin S. (2007). Characterization of a Pseudomonas putida rough variant evolved in a mixed-species biofilm with Acinetobacter sp. strain C6. Journal of Bacteriology, 189 (13), 4932-4943. 34. Kolenbrander P. E. (2000). Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems 1. Annual Reviews in Microbiology, 413-437. 35. Rickard A. H., Gilbert P., High N. J., Kolenbrander P. E.and Handley P. S. (2003). Bacterial coaggregation: an integral process in the development of multi-species biofilms. Trends in Microbiology, 11 (2), 94-100. 36. Clemans D. L., Kolenbrander P. E., Debabov D. V., Zhang Q., Lunsford R. D., Sakone H., Whittaker C. J., Heaton M. P.and Neuhaus F. C. (1999). Insertional Inactivation of Genes Responsible for the d-Alanylation of Lipoteichoic Acid in Streptococcus gordonii DL1 (Challis) Affects Intrageneric Coaggregations. Infection and Immunity, 67 (5), 2464-2474. 37. McNab R., Forbes H., Handley P. S., Loach D. M., Tannock G. W.and Jenkinson H. F. (1999). Cell wall-anchored CshA polypeptide (259 kilodaltons) in Streptococcus gordonii forms surface fibrils that confer hydrophobic and adhesive properties. Journal of Bacteriology, 181 (10), 3087-3095. 38. Egland P. G., Dû L. D.and Kolenbrander P. E. (2001). Identification of Independent Streptococcus gordonii SspA and SspB Functions in Coaggregation with Actinomyces naeslundii. Infection and Immunity, 69 (12), 7512-7516. 72 39. Takahashi Y., Konishi K., Cisar J. O.and Yoshikawa M. (2002). Identification and characterization of hsa, the gene encoding the sialic acid-binding adhesin of Streptococcus gordonii DL1. Infection and Immunity, 70 (3), 1209-1218. 40. Bjarnsholt T., Jensen P. Ø., Fiandaca M. J., Pedersen J., Hansen C. R., Andersen C. B., Pressler T., Givskov M.and Høiby N. (2009). Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology, 44 (6), 547-558. 41. An D., Danhorn T., Fuqua C.and Parsek M. R. (2006). Quorum sensing and motility mediate interactions between Pseudomonas aeruginosa and Agrobacterium tumefaciens in biofilm cocultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 103 (10), 3828-3833. 42. Pereira A. L., Silva T. N., Gomes A. C., Araújo A. C.and Giugliano L. G. (2010). Diarrhea-associated biofilm formed by enteroaggregative Escherichia coli and aggregative Citrobacter freundii: a consortium mediated by putative F pili. BMC Microbiology, 10 (1), 57. 43. Carlsson J. (1997). Bacterial metabolism in dental biofilms. Advances in Dental Research, 11 (1), 75-80. 44. Fischbach M. A.and Sonnenburg J. L. (2011). Eating for two: how metabolism establishes interspecies interactions in the gut. Cell host & microbe, 10 (4), 336347. 45. Weimer K. E., Juneau R. A., Murrah K. A., Pang B., Armbruster C. E., Richardson S. H.and Swords W. E. (2011). Divergent mechanisms for passive pneumococcal resistance to β-lactam antibiotics in the presence of Haemophilus influenzae. Journal of Infectious Diseases, 203 (4), 549-555. 46. Elias S.and Banin E. (2012). Multi‐species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiology Reviews, 36 (5), 990-1004. 47. Madsen J. S., Burmølle M., Hansen L. H.and Sørensen S. J. (2012). The interconnection between biofilm formation and horizontal gene transfer. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 65 (2), 183-195. 48. Wolcott R., Costerton J., Raoult D.and Cutler S. (2013). The polymicrobial nature of biofilm infection. Clinical Microbiology and Infection, 19 (2), 107-112. 49. Ramsey M. M.and Whiteley M. (2009). Polymicrobial interactions stimulate resistance to host innate immunity through metabolite perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (5), 1578-1583. 50. Bassler B. L. (2002). Small talk: cell-to-cell communication in bacteria. Cell, 109 (4), 421-424. 51. Federle M. J.and Bassler B. L. (2003). Interspecies communication in bacteria. Journal of Clinical Investigation, 112 (9), 1291-1299. 73 52. Zhu P.and Li M. (2012). Recent progresses on AI-2 bacterial quorum sensing inhibitors. Current Medicinal Chemistry, 19 (2), 174-186. 53. Riedel K., Hentzer M., Geisenberger O., Huber B., Steidle A., Wu H., Høiby N., Givskov M., Molin S.and Eberl L. (2001). N-acylhomoserine-lactone-mediated communication between Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia in mixed biofilms. Microbiology, 147 (12), 3249-3262. 54. Ryan R. P., Fouhy Y., Garcia B. F., Watt S. A., Niehaus K., Yang L., Tolker‐Nielsen T.and Dow J. M. (2008). Interspecies signalling via the Stenotrophomonas maltophilia diffusible signal factor influences biofilm formation and polymyxin tolerance in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology, 68 (1), 75-86. 55. Yang L., Liu Y., Wu H., Hoiby N., Molin S.and Song Z. J. (2011). Current understanding of multi-species biofilms. Int J Oral Sci, 3 (2), 74-81. 56. Tong H., Chen W., Shi W., Qi F.and Dong X. (2008). SO-LAAO, a novel L-amino acid oxidase that enables Streptococcus oligofermentans to outcompete Streptococcus mutans by generating H2O2 from peptone. Journal of Bacteriology, 190 (13), 4716-4721. 57. Bandara H., Yau J., Watt R., Jin L.and Samaranayake L. (2010). Pseudomonas aeruginosa inhibits in-vitro Candida biofilm development. BMC Microbiology, 10 (1), 125. 58. Burmolle M., Thomsen T. R., Fazli M., Dige I., Christensen L., Homoe P., Tvede M., Nyvad B., Tolker-Nielsen T., Givskov M., Moser C., Kirketerp-Moller K., Johansen H. K., Hoiby N., Jensen P. O., Sorensen S. J.and Bjarnsholt T. (2010). Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 59 (3), 324-336. 59. Petersen P. E., Bourgeois D., Ogawa H., Estupinan-Day S.and Ndiaye C. (2005). The global burden of oral diseases and risks to oral health. Bulletin of the World Health Organization, 83 (9), 661-669. 60. Paster B. J., Boches S. K., Galvin J. L., Ericson R. E., Lau C. N., Levanos V. A., Sahasrabudhe A.and Dewhirst F. E. (2001). Bacterial diversity in human subgingival plaque. Journal of Bacteriology, 183 (12), 3770-3783. 61. Li Y., Ge Y., Saxena D.and Caufield P. (2007). Genetic profiling of the oral microbiota associated with severe early-childhood caries. Journal of Clinical Microbiology, 45 (1), 81-87. 62. Baena-Monroy T., Moreno-Maldonado V., Franco-Martinez F., Aldape-Barrios B., Quindos G.and Sanchez-Vargas L. (2004). Candida albicans, Staphylococcus aureus and Streptococcus mutans colonization in patients wearing dental prosthesis. Medicina Oral, Patología Oral y Cirugía Bucal, 10, 27-39. 74 63. Harriott M. M.and Noverr M. C. (2009). Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53 (9), 3914-3922. 64. Schaudinn C., Gorur A., Keller D., Sedghizadeh P. P.and Costerton J. W. (2009). Periodontitis An archetypical biofilm disease. The Journal of the American Dental Association, 140 (8), 978-986. 65. Armitage G. C.and Cullinan M. P. (2010). Comparison of the clinical features of chronic and aggressive periodontitis. Periodontology 2000, 53 (1), 12-27. 66. Saito A., Inagaki S., Kimizuka R., Okuda K., Hosaka Y., Nakagawa T.and Ishihara K. (2008). Fusobacterium nucleatum enhances invasion of human gingival epithelial and aortic endothelial cells by Porphyromonas gingivalis. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 54 (3), 349-355. 67. Saito Y., Fujii R., Nakagawa K. I., Kuramitsu H., Okuda K.and Ishihara K. (2008). Stimulation of Fusobacterium nucleatum biofilm formation by Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiology and Immunology, 23 (1), 1-6. 68. Segal N., Leibovitz E., Dagan R.and Leiberman A. (2005). Acute otitis mediadiagnosis and treatment in the era of antibiotic resistant organisms: updated clinical practice guidelines. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 69 (10), 1311-1319. 69. Laufer A. S., Metlay J. P., Gent J. F., Fennie K. P., Kong Y.and Pettigrew M. M. (2011). Microbial communities of the upper respiratory tract and otitis media in children. MBio, 2 (1), 245-210. 70. Patel J. A., Nair S., Revai K., Grady J.and Chonmaitree T. (2009). Nasopharyngeal acute phase cytokines in viral upper respiratory infection: impact on acute otitis media in children. The Pediatric infectious disease journal, 28 (11), 1002. 71. Armbruster C. E., Hong W., Pang B., Weimer K. E., Juneau R. A., Turner J.and Swords W. E. (2010). Indirect pathogenicity of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis in polymicrobial otitis media occurs via interspecies quorum signaling. MBio, 1 (3), 102-110. 72. Citron D. M., Goldstein E. J., Merriam C. V., Lipsky B. A.and Abramson M. A. (2007). Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro activity of antimicrobial agents. Journal of Clinical Microbiology, 45 (9), 28192828. 73. Bowling F. L., Jude E. B.and Boulton A. J. (2009). MRSA and diabetic foot wounds: contaminating or infecting organisms? Current diabetes reports, 9 (6), 440-444. 74. Mastropaolo M. D., Evans N. P., Byrnes M. K., Stevens A. M., Robertson J. L.and Melville S. B. (2005). Synergy in polymicrobial infections in a mouse model of type 2 diabetes. Infection and Immunity, 73 (9), 6055-6063. 75 75. Lopes S. P., Ceri H., Azevedo N. F.and Pereira M. O. (2012). Antibiotic resistance of mixed biofilms in cystic fibrosis: impact of emerging microorganisms on treatment of infection. International Journal of Antimicrobial Agents, 40 (3), 260263. 76. Sibley C. D., Rabin H.and Surette M. G. (2006). Cystic fibrosis: a polymicrobial infectious disease. Future Microbiology, 1 (1), 53-61. 77. Hogan D. A.and Kolter R. (2002). Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science, 296 (5576), 2229-2232. 78. Cugini C., Calfee M., Farrow J. M., Morales D. K., Pesci E. C.and Hogan D. A. (2007). Farnesol, a common sesquiterpene, inhibits PQS production in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology, 65 (4), 896-906. 79. Hoffman L. R., Déziel E., D'Argenio D. A., Lépine F., Emerson J., McNamara S., Gibson R. L., Ramsey B. W.and Miller S. I. (2006). Selection for Staphylococcus aureus small-colony variants due to growth in the presence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103 (52), 1989019895. 80. Tunney M., Klem E., Fodor A., Gilpin D., Moriarty T., McGrath S., Muhlebach M., Boucher R., Cardwell C.and Doering G. (2011). Use of culture and molecular analysis to determine the effect of antibiotic treatment on microbial community diversity and abundance during exacerbation in patients with cystic fibrosis. Thorax, 66 (7), 579-584. 81. Francolini I.and Donelli G. (2010). Prevention and control of biofilm‐based medical‐device‐related infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 59 (3), 227-238. 82. Corey G. R.and Lalani T. (2008). Risk of intravascular cardiac device infections in patients with bacteraemia: impact on device removal. International Journal of Antimicrobial Agents, 32, 26-29. 83. Falcone M., Barzaghi N., Carosi G., Grossi P., Minoli L., Ravasio V., Rizzi M., Suter F., Utili R.and Viscoli C. (2009). Candida infective endocarditis: report of 15 cases from a prospective multicenter study. Medicine, 88 (3), 160-168. 84. Donlan R. M. (2001). Biofilms and device-associated infections. Emerging Infectious Diseases, 7 (2), 277. 85. Stickler D. J. (2008). Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nature Clinical Practice Urology, 5 (11), 598-608. 86. Park J. H., Cho Y. W., Cho Y.-H., Choi J. M., Shin H. J., Bae Y. H., Chung H., Jeong S. Y.and Kwon I. C. (2003). Norfloxacin-releasing urethral catheter for longterm catheterization. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 14 (9), 951-962. 76 87. Belt H. v. d., Neut D., Schenk W., Horn J. R. v., Mei H. C. v. d.and Busscher H. J. (2001). Infection of orthopedic implants and the use of antibiotic-loaded bone cements: a review. Acta Orthopaedica, 72 (6), 557-571. 88. Neut D., Kluin O. S., Crielaard B. J., van der Mei H. C., Busscher H. J.and Grijpma D. W. (2009). A biodegradable antibiotic delivery system based on poly(trimethylene carbonate) for the treatment of osteomyelitis. Acta Orthopaedica, 80 (5), 514-519. 89. Hall‐Stoodley L.and Stoodley P. (2009). Evolving concepts in biofilm infections. Cellular Microbiology, 11 (7), 1034-1043. 90. Parsek M. R.and Singh P. K. (2003). Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annual Reviews in Microbiology, 57 (1), 677-701. 91. Lynch A. S.and Robertson G. T. (2008). Bacterial and fungal biofilm infections. Annual Review of Medicine, 59 415-428. 92. Simpson J. A., Smith S. E.and Dean R. T. (1989). Scavenging by alginate of free radicals released by macrophages. Free Radical Biology and Medicine, 6 (4), 347353. 93. Høiby N., Krogh Johansen H., Moser C., Song Z., Ciofu O.and Kharazmi A. (2001). Pseudomonas aeruginosa and the in vitro and in vivo biofilm mode of growth. Microbes and Infection, 3 (1), 23-35. 94. Jesaitis A. J., Franklin M. J., Berglund D., Sasaki M., Lord C. I., Bleazard J. B., Duffy J. E., Beyenal H.and Lewandowski Z. (2003). Compromised host defense on Pseudomonas aeruginosa biofilms: characterization of neutrophil and biofilm interactions. The journal of Immunology, 171 (8), 4329-4339. 95. Bylund J., Burgess L.-A., Cescutti P., Ernst R. K.and Speert D. P. (2006). Exopolysaccharides from Burkholderia cenocepacia inhibit neutrophil chemotaxis and scavenge reactive oxygen species. Journal of Biological Chemistry, 281 (5), 2526-2532. 96. Bryers J. D. (2008). Medical biofilms. Biotechnology and Bioengineering, 100 (1), 1-18. 97. Fux C., Costerton J., Stewart P.and Stoodley P. (2005). Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology, 13 (1), 34-40. 98. Webb J. S., Thompson L. S., James S., Charlton T., Tolker-Nielsen T., Koch B., Givskov M.and Kjelleberg S. (2003). Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology, 185 (15), 4585-4592. 99. Mah T.-F. C.and O'Toole G. A. (2001). Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology, 9 (1), 34-39. 77 100. Anwar H., Strap J.and Costerton J. (1992). Establishment of aging biofilms: possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36 (7), 1347. 101. Hunt B., Weber A., Berger A., Ramsey B.and Smith A. (1995). Macromolecular mechanisms of sputum inhibition of tobramycin activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 39 (1), 34-39. 102. Bagge N., Ciofu O., Hentzer M., Campbell J. I., Givskov M.and Høiby N. (2002). Constitutive high expression of chromosomal β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa caused by a new insertion sequence (IS1669) located in ampD. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46 (11), 3406-3411. 103. Oliver A., Sánchez J. M.and Blázquez J. (2002). Characterization of the GO system of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Letters, 217 (1), 31-35. 104. Mandsberg L. F., Ciofu O., Kirkby N., Christiansen L. E., Poulsen H. E.and Høiby N. (2009). Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa strains with increased mutation frequency due to inactivation of the DNA oxidative repair system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53 (6), 2483-2491. 105. Boles B. R.and Singh P. K. (2008). Endogenous oxidative stress produces diversity and adaptability in biofilm communities. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105 (34), 12503-12508. 106. Bridier A., Briandet R., Thomas V.and Dubois-Brissonnet F. (2011). Resistance of bacterial biofilms to disinfectants: a review. Biofouling, 27 (9), 1017-1032. 107. Ceri H., Olson M., Stremick C., Read R., Morck D.and Buret A. (1999). The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology, 37 (6), 1771-1776. 108. Araújo, P, et al. (editors). (2011). Science Against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances, Spain: Formatex Research Center, 826-834. 109. Langsrud S., Sidhu M. S., Heir E.and Holck A. L. (2003). Bacterial disinfectant resistance—a challenge for the food industry. International biodeterioration & biodegradation, 51 (4), 283-290. 110. Bressler D., Balzer M., Dannehl A., Flemming H.-C.and Wingender J. (2009). Persistence of Pseudomonas aeruginosa in drinking-water biofilms on elastomeric material. Water Science & Technology: Water Supply, 9 (1), 81-87. 111. Vestby L. K., Møretrø T., Langsrud S., Heir E.and Nesse L. L. (2009). Biofilm forming abilities of Salmonella are correlated with persistence in fish meal-and feed factories. BMC Veterinary Research, 5 (1), 20. 78 112. Lambert R.and Johnston M. (2001). The effect of interfering substances on the disinfection process: a mathematical model. Journal of Applied Microbiology, 91 (3), 548-555. 113. Sandt C., Barbeau J., Gagnon M.-A.and Lafleur M. (2007). Role of the ammonium group in the diffusion of quaternary ammonium compounds in Streptococcus mutans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60 (6), 1281-1287. 114. Mangalappalli-Illathu A. K., Vidović S.and Korber D. R. (2008). Differential adaptive response and survival of Salmonella enterica serovar enteritidis planktonic and biofilm cells exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52 (10), 3669-3680. 115. Harrison J. J., Ceri H., Roper N. J., Badry E. A., Sproule K. M.and Turner R. J. (2005). Persister cells mediate tolerance to metal oxyanions in Escherichia coli. Microbiology, 151 (10), 3181-3195. 116. Lewis K. (2005). Persister cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry (Moscow), 70 (2), 267-274. 117. Beloin C.and Ghigo J. M. (2005). Finding gene-expression patterns in bacterial biofilms. Trends in Microbiology, 13 (1), 16-19. 118. Lumjiaktase P., Diggle S. P., Loprasert S., Tungpradabkul S., Daykin M., Camara M., Williams P.and Kunakorn M. (2006). Quorum sensing regulates dpsA and the oxidative stress response in Burkholderia pseudomallei. Microbiology, 152 (12), 3651-3659. 119. Joelsson A., Kan B.and Zhu J. (2007). Quorum sensing enhances the stress response in Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology, 73 (11), 3742-3746. 120. Pontes M. H., Babst M., Lochhead R., Oakeson K., Smith K.and Dale C. (2008). Quorum sensing primes the oxidative stress response in the insect endosymbiont, Sodalis glossinidius. PloS One, 3 (10), 3541. 121. Coenye T. (2010). Response of sessile cells to stress: from changes in gene expression to phenotypic adaptation. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 59 (3), 239-252. 122. Pham T. K., Roy S., Noirel J., Douglas I., Wright P. C.and Stafford G. P. (2010). A quantitative proteomic analysis of biofilm adaptation by the periodontal pathogen Tannerella forsythia. Proteomics, 10 (17), 3130-3141. 123. Allegrucci M.and Sauer K. (2007). Characterization of colony morphology variants isolated from Streptococcus pneumoniae biofilms. Journal of Bacteriology, 189 (5), 2030-2038. 79 124. Driffield K., Miller K., Bostock J., O'neill A.and Chopra I. (2008). Increased mutability of Pseudomonas aeruginosa in biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 61 (5), 1053-1056. 125. Ando T., Itakura S., Uchii K., Sobue R.and Maeda S. (2009). Horizontal transfer of non-conjugative plasmid in colony biofilm of Escherichia coli on food-based media. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25 (10), 1865-1869. 126. Nguyen K. T., Piastro K., Gray T. A.and Derbyshire K. M. (2010). Mycobacterial biofilms facilitate horizontal DNA transfer between strains of Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology, 192 (19), 5134-5142. 127. Burmolle M., Webb J. S., Rao D., Hansen L. H., Sorensen S. J.and Kjelleberg S. (2006). Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 72 (6), 3916-3923. 128. Van der Veen S.and Abee T. (2011). Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology, 144 (3), 421-431. 129. Zhang T., Hashizume T., Kurita-Ochiai T.and Yamamoto M. (2009). Sublingual vaccination with outer membrane protein of Porphyromonas gingivalis and Flt3 ligand elicits protective immunity in the oral cavity. Biochemical and Biophysical Research Communications, 390 (3), 937-941. 130. Pletz M. W., Maus U., Krug N., Welte T.and Lode H. (2008). Pneumococcal vaccines: mechanism of action, impact on epidemiology and adaption of the species. International Journal of Antimicrobial Agents, 32 (3), 199-206. 131. Furrie E., Macfarlane S., Kennedy A., Cummings J., Walsh S., O’neil D.and Macfarlane G. (2005). Synbiotic therapy (Bifidobacterium longum/Synergy 1) initiates resolution of inflammation in patients with active ulcerative colitis: a randomised controlled pilot trial. Gut, 54 (2), 242-249. 132. Steed H., Macfarlane G. T., Blackett K. L., Bahrami B., Reynolds N., Walsh S. V., Cummings J. H.and Macfarlane S. (2010). Clinical trial: the microbiological and immunological effects of synbiotic consumption–a randomized double‐blind placebo‐controlled study in active Crohn’s disease. Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 32 (7), 872-883. 133. McVay C. S., Velásquez M.and Fralick J. A. (2007). Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51 (6), 1934-1938. 134. Donlan R. M. (2009). Preventing biofilms of clinically relevant organisms using bacteriophage. Trends in Microbiology, 17 (2), 66-72. 80 135. Fu W., Forster T., Mayer O., Curtin J. J., Lehman S. M.and Donlan R. M. (2010). Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 54 (1), 397-404. 136. Jabbouri S.and Sadovskaya I. (2010). Characteristics of the biofilm matrix and its role as a possible target for the detection and eradication of Staphylococcus epidermidis associated with medical implant infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 59 (3), 280-291. 137. Knowles J., Roller S., Murray D.and Naidu A. (2005). Antimicrobial action of carvacrol at different stages of dual-species biofilm development by Staphylococcus aureus and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology, 71 (2), 797-803. 138. Carneiro V. A., Santos H. S. d., Arruda F. V. S., Bandeira P. N., Albuquerque M. R. J. R., Pereira M. O., Henriques M., Cavada B. S.and Teixeira E. H. (2010). Casbane diterpene as a promising natural antimicrobial agent against biofilmassociated infections. Molecules, 16 (1), 190-201. 139. Morales D. K.and Hogan D. A. (2010). Candida albicans interactions with bacteria in the context of human health and disease. PLoS Pathogens, 6 (4), 1000886. 140. Budzyńska A., Wieckowska-Szakiel M., Sadowska B., Kalemba D.and Rózalska B. (2011). Antibiofilm activity of selected plant essential oils and their major components. Polish Journal of Microbiology, 60 (1), 35-41. 141. Prigent-Combaret C., Vidal O., Dorel C.and Lejeune P. (1999). Abiotic surface sensing and biofilm-dependent regulation of gene expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 181 (19), 5993-6002. 142. O'Toole G., Kaplan H. B.and Kolter R. (2000). Biofilm formation as microbial development. Annual Reviews in Microbiology, 54 (1), 49-79. 143. O'Toole G. A. (2003). To build a biofilm. Journal of Bacteriology, 185 (9), 26872689. 144. Wei Q., Minh P. N., Dotsch A., Hildebrand F., Panmanee W., Elfarash A., Schulz S., Plaisance S., Charlier D., Hassett D., Haussler S.and Cornelis P. (2012). Global regulation of gene expression by OxyR in an important human opportunistic pathogen. Nucleic Acids Research, 40 (10), 4320-4333. 145. Pfaffl, MW. (editors). (2004). AZ of quantitative PCR, La Jolla, USA: International University Line (IUL), 89-113. 146. Sambrook J., Fritsch E. F.and Maniatis T. (1989). Molecular cloning. (Third ed.). New York: Cold spring harbor laboratory press New York, 110-130. 81 147. Voggu L., Schlag S., Biswas R., Rosenstein R., Rausch C.and Götz F. (2006). Microevolution of cytochrome bd oxidase in staphylococci and its implication in resistance to respiratory toxins released by Pseudomonas. Journal of Bacteriology, 188 (23), 8079-8086. 148. Morales D. K., Jacobs N. J., Rajamani S., Krishnamurthy M., Cubillos‐Ruiz J. R.and Hogan D. A. (2010). Antifungal mechanisms by which a novel Pseudomonas aeruginosa phenazine toxin kills Candida albicans in biofilms. Molecular Microbiology, 78 (6), 1379-1392. 149. De Bruecker K. (2009). Bactericide effect van H2O2 op B.cepacia complex biofilms, Master of science Ghent University, Ghent. 150. Aranda A., Sequedo L., Tolosa L., Quintas G., Burello E., Castell J.and Gombau L. (2013). Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro, 27 (2), 954-963. 151. Vinckx T., Matthijs S.and Cornelis P. (2008). Loss of the oxidative stress regulator OxyR in Pseudomonas aeruginosa PAO1 impairs growth under iron-limited conditions. FEMS Microbiology Letters, 288 (2), 258-265. 152. Liu X., Li J., Wang Y., Li T., Zhao J.and Zhang C. (2013). Green tea polyphenols function as prooxidants to inhibit Pseudomonas aeruginosa and induce the expression of oxidative stress-related genes. Folia Microbiologica, 58 (3), 211-217. 153. Savli H., Karadenizli A., Kolayli F., Gundes S., Ozbek U.and Vahaboglu H. (2003). Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology, 52 (5), 403-408. 154. Nobre L. S.and Saraiva L. M. (2013). Effect of combined oxidative and nitrosative stresses on Staphylococcus aureus transcriptome. Applied Microbiology and Biotechnology, 97 (6), 2563-2573. 155. Klotz S. A., Chasin B. S., Powell B., Gaur N. K.and Lipke P. N. (2007). Polymicrobial bloodstream infections involving Candida species: analysis of patients and review of the literature. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 59 (4), 401-406. 156. Kart D., Tavernier S., Van Acker H., Nelis H. J.and Coenye T. (2014). Activity of disinfectants against multispecies biofilms formed by Staphylococcus aureus, Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa. Biofouling, 30 (3), 377-383. 157. Iglesias J., Abernethy V. E., Wang Z., Lieberthal W., Koh J. S.and Levine J. S. (1999). Albumin is a major serum survival factor for renal tubular cells and macrophages through scavenging of ROS. American Journal of Physiology-Renal Physiology, 277 (5), 711-722. 82 158. Fukuzawa K., Saitoh Y., Akai K., Kogure K., Ueno S., Tokumura A., Otagiri M.and Shibata A. (2005). Antioxidant effect of bovine serum albumin on membrane lipid peroxidation induced by iron chelate and superoxide. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1668 (1), 145-155. 159. Vinckx T., Wei Q., Matthijs S.and Cornelis P. (2010). The Pseudomonas aeruginosa oxidative stress regulator OxyR influences production of pyocyanin and rhamnolipids: protective role of pyocyanin. Microbiology, 156 (Pt 3), 678-686. 160. Li H., Zhang C., Liu P., Liu W., Gao Y.and Sun S. (in press). In vitro interactions between fluconazole and minocycline against mixed cultures of Candida albicans and Staphylococcus aureus. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 17. 161. Vieira C. D., de Macêdo Farias L., Diniz C. G., Alvarez-Leite M. E., da Silva Camargo E. R.and de Carvalho M. A. R. (2005). New methods in the evaluation of chemical disinfectants used in Health Care Services. American Journal of Infection Control, 33 (3), 162-169. 162. Adam B., Baillie G. S.and Douglas L. J. (2002). Mixed species biofilms of Candida albicans and Staphylococcus epidermidis. Journal of Medical Microbiology, 51 (4), 344-349. 163. Simões L. C., Simões M.and Vieira M. J. (2010). Influence of the diversity of bacterial isolates from drinking water on resistance of biofilms to disinfection. Applied and Environmental Microbiology, 76 (19), 6673-6679. 164. Peters B. M., Ward R. M., Rane H. S., Lee S. A.and Noverr M. C. (2013). Efficacy of ethanol against Candida albicans and Staphylococcus aureus polymicrobial biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57 (1), 74-82. 165. Stewart P. S., Roe F., Rayner J., Elkins J. G., Lewandowski Z., Ochsner U. A.and Hassett D. J. (2000). Effect of catalase on hydrogen peroxide penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 66 (2), 836-838. 166. Panmanee W.and Hassett D. J. (2009). Differential roles of OxyR‐controlled antioxidant enzymes alkyl hydroperoxide reductase (AhpCF) and catalase (KatB) in the protection of Pseudomonas aeruginosa against hydrogen peroxide in biofilm vs. planktonic culture. FEMS Microbiology Letters, 295 (2), 238-244. 83 EKLER 84 EK-1. Etik kurul onayı Şekil 1.1. Etik kurul onayı 85 EK-1 (Devam). Etik kurul onayı Şekil 1.1. Etik kurul onayı 86 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : KART, Didem Uyruğu : T.C. Doğum tarihi ve yeri : 09/03/1983 Ankara Medeni hali : Evli Telefon : 0(312) 305 14 99 e-posta : dturk@hacettepe.edu.tr Eğitim Derecesi Okul/Program Mezuniyet yılı Yüksek Lisans Hacettepe Üniv./Mikrobiyoloji AbD 2008 Lisans Hacettepe Üniv./Biyoloji Bölümü 2005 Lise Seyranbağları Süper Lisesi 2000 İş Deneyimi,Yıl Çalıştığı Yer Görev 2006 - devam ediyor Hacettepe Üniversitesi Araş.Gör. Yabancı Dil İngilizce Yayınlar 1. Atac AS., Bulut OE., Özalp M., Celik H., Tatar I., Ozturk D., Ekizoğlu M. (2009). The effect of Hydrogen Peroxide Colloidal Silver Ions on Elimination of Biofilm in Dental Unit Waterlines ADO Journal of Clinical Sciences. 3. 87 2. Ekizoğlu M., Gündüz MG., Kart D., Şimşek R., Şafak C. (2011).Antimicrobial Screening of 2-Methyl-3-Acyl-4-Aryl-2,6,6 and / or 2,7,7-Trimethyl-1,4,5,6,7,8Hexahydroquinoline Derivatives Hacettepe University Journal of the Faculty of Pharmacy. 31 (1). 3. Kahraman Ç., Ekizoglu M., Kart D., Akdemir ZŞ., Tatlı İİ. (2011). Antimicrobial Activity of Some Verbascum Species Growing in Turkey FABAD Journal of Pharmaceutical Sciences. 36 (1). 4. Turker S., Ozer YA., Kutlu B., Nohutcu R., Bilgili H., Ozturk D., Ozalp M., Sungur A. (2011). Gamma Irradiation Studies I. Bone Grafts, Journal of Medical Devices. 5 (3) 5. Özalp M., Bulut ÖE., Ataç AS., Ekizoğlu M, Kart D, Çelik HH., Tatar I. (2013).The effect of the hydrogen peroxide colloidal silver on reducing the colonization and growth of heterotrophic bacteria in dental unit waterlines Turkish Journal of Biology. 37. 6. Yuksek H., Akyıldırım O., Yola ML., Gursoy K., Celebier M., Kart D. (2013). Synthesis, In Vitro Antimicrobial and Antioxidant Activities of Some New 4,5-Dihydro1H-1,2,4-triazol-5-one Derivatives Archive der Pharmazie. 346. 7. Kart D., Tavernier S., Van Acker H., Nelis HJ., Coenye T. (2014). Activity of disinfectants against multispecies biofilms formed by Staphylococcus aureus, Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa. Biofouling. 30 (3). 88 GAZİ GELECEKTİR…
