tc ege ünġversġtesġ sağlık bġlġmlerġ enstġtüsü

advertisement
T.C.
EGE ÜNĠVERSĠTESĠ
SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
ĠN VĠTRO STRES MODELĠNDE NĠKOTĠNĠN GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE
AKTĠVE OLAN GENLERĠN EKSPRESYONUNA OLAN ETKĠSĠNĠN
ARAġTIRILMASI
Sinirbilim Anabilim Dalı Programı
Yüksek Lisans Tezi
Hasibe ġAHĠN
ĠZMĠR
2015
T.C.
EGE ÜNĠVERSĠTESĠ
SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
ĠN VĠTRO STRES MODELĠNDE NĠKOTĠNĠN GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE
AKTĠVE OLAN GENLERĠN EKSPRESYONUNA OLAN ETKĠSĠNĠN
ARAġTIRILMASI
Sinirbilim Anabilim Dalı Programı
Yüksek Lisans Tezi
Hasibe ġAHĠN
DANIġMAN
Prof. Dr. Ersin Oğuz KOYLU
ĠZMĠR
2015
i
DEĞERLENDĠRME KURULU ÜYELERĠ
Adı Soyadı
Ġmza
BaĢkan : Prof.Dr.Ersin Oğuz KOYLU
……………….
(DanıĢman)
Üye : Prof.Dr. Nuran EKERBĠÇER
............................
Üye : Doç.Dr. Oğuz GÖZEN
............................
Yedek Üye : Prof.Dr. Lütfiye KANIT
...........................
Yedek Üye : Prof.Dr. Burcu BALKAN
............................
Yüksek Lisans Tezinin kabul edildiği tarih:
ii
ÖNSÖZ
Yüksek lisans öğrenimim süresince her türlü yardımı sağlayan, bilgi, tecrübe ve güler
yüzü ile çalıĢmama ıĢık tutan danıĢmanım Sayın Prof. Dr. Ersin KOYLU‟ya,
Tez çalıĢmam süresince laboratuvar çalıĢmalarımda tüm bilgi birikimini benimle
paylaĢan sayesinde pek çok konuda bilgi edindiğim, deneylerin yürütülmesi,
analizlerin yapılması ve değerlendirilmesi konularında beni yönlendiren, tez
süresince değerli vaktinin çoğunu bize ayıran, sadece teknik konularda değil hayata
karĢı farklı bakıĢ açıları kazanmamı sağlayan Sayın Doç. Dr. Oğuz GÖZEN‟e,
Bölüme kaydolduğum andan itibaren her türlü konuda yardımını esirgemeyen,
bilimsel desteği ve sağladığı olanaklar için hocam Sayın Prof. Dr. Lütfiye KANIT‟a,
Tez çalıĢmamda kullandığım hücreleri temin etmemize yardımcı olan Ġstanbul
Teknik Üniversitesi‟nden Prof. Dr. Arzu KARABAY KORKMAZ ve doktora
öğrencisi Ece SELÇUK ġAHĠN‟e,
Tezimin yazım aĢamalarında fikirleri ve yardımlarıyla yanımda olan arkadaĢlarım
Ar. Gör. Alper ERDOĞAN ve Ar. Gör. Meltem KARATAġ‟a,
Yüksek lisans öğrenimim süresince her zaman yanımda olan arkadaĢım Müzeyyen
UĞUR‟a, tezimin hazırlanması sırasında beni cesaretlendiren ve manevi destek
sağlayan değerli arkadaĢlarım Elif ENGĠN, Tuğçe AKGÜL, Fatma TUNCER‟e
Ġzmir‟deki ailem Fizyoloji Anabilim Dalı ailesine ve aileme
TeĢekkürlerimi sunarım.
ĠZMĠR, Haziran 2015
Hasibe ġahin
iii
ÖZET
Nikotin, merkezi sinir sistemi üzerindeki etkileri ile HPA (HipotalamoHipofizer-Adrenal)
eksenini
stimüle
ederek
hipofiz
bezinden
ACTH
(Adrenokortikotropik hormon) salgılanmasına sebep olmaktadır. ACTH, adrenal
korteksten
bir
glukokortikoid
olan
kortizol
salınmasını
sağlamaktadır.
Glukokortikoidler, hücrede etkilerini intrasellüler glukokortikoid reseptörlerine (GR)
bağlanarak göstermektedir. Kortizol bağlanmasından sonra dimerize olan GR
nükleusa geçmekte ve DNA üzerinde bulanan “Glukokortikoid yanıt elementi
(GRE)” bölgelerine bağlanarak gen transkripsiyonunda değiĢikliklere neden
olmaktadır. GR‟de bulunan bazı serin grupları fosforile olabilmekte ve fosforilasyon
durumu GR‟ünün nükleusa geçiĢini ve dolayısıyla gen anlatımını etkilemektedir. GR
fosforilasyonunda JNK (c-Jun N-terminal kinaz) ve CDK5 (siklin bağımlı kinaz 5)
görev almaktadır. Bu çalıĢmanın amacı, in vitro stres modelinde, nikotinin
glukokortikoid reseptörü fosforilasyonuna olan etkisinin ve varsa bu etkinin nikotinik
asetilkolin reseptörleri üzerinden olup olmadığının araĢtırılmasıdır. Proje kapsamında
ayrıca nikotinin, eğer mevcutsa, GR fosforilasyonu üzerine olan etkisinin JNK ve
CDK5 üzerinden olup olmadığı araĢtırılmıĢtır. Stres modeli oluĢtumak için kullanılan
deksametazonun
konsantrasyonu
arttıkça
incelenen
genlerde
gen
anlatım
seviyelerinde artıĢ görülmüĢtür. Nikotinin düĢük konsantrasyonda uygulanmasında
tüm genlerde anlamlı artıĢ gözlenmiĢtir. SGK1 ve KLF11 genlerinde deksametazon
ve nikotinin birlikte uygulamasında gen anlatımlarında anlamlı artıĢ gözlenmiĢtir. Bu
artıĢ CDK5 inhibitörü kenpaullone eklenmesiyle SGK1 gen anlatımındaki artıĢ
ortadan kalkmazdan JNK inhibitörü SP600125‟in eklenmesiyle SGK1 gen
anlatımındaki artıĢ ortadan kalkmıĢtır.
Anahtar Kelimeler: Stres; nikotin; glukokortikoid; glukokortikoid reseptörü;
nikotinik asetilkolin reseptörü; gerçek zamanlı PCR
iv
ABSTRACT
Nicotine stimulates HPA (Hypothalamo-Pituitary-Adrenal) axis through its
central nervous system effects and causes ACTH (Adrenocorticotropic hormone)
release from pituitary gland. ACTH induces the release of cortisol, a glucocorticoid,
from adrenal cortex. Glucocorticoids show their effects on cells by binding to
intracellular glucocorticoid receptors (GR). After cortisol binding, dimerized GRs
enter the nucleus and bind “Glucocorticoid Response Element (GRE)” regions on
DNA and cause changes in gene transcription. Certain serine groups on GR can be
phosphorylated and their phosphorylation state can affect GR entry into nucleus and
thus gene transcription. JNK (c-Jun N-terminal kinase) and CDK5 (Cyclin
Dependant Kinase 5) phosphorylate GR. The aim of this study is to demonstrate the
possible effect of nicotine on glucocorticoid receptor phosphorylation and to show
whether this effect is via nicotinic acetylcholine receptors in an in vitro stress model.
Within the scope of this project, we further investigated the role of JNK and CDK5
on the possible nicotine-induced changes in GR phosphorylation. Dexamethasone is
used for the stress model and with its increased concentrations there was an inrease
in transcription of studied genes. Nicotine administration in low doses resulted in
significant increase in transcription of all genes analysed. Transcription of SGK1 and
KLF11 genes increased significantly with concurrent use of dexamethasone and
nicotine. This increase in SGK1 gene transcription was not prevented by the addition
of CDK5 inhibitor kenpaullone, whereas the administration of JNK inhibitor
SP600125 prevented an increase in SGK1 transcription.
Keywords: Stress; nicotine; glucocorticoid; glucocorticoid receptor; nicotinic
acetylcholine receptor; real-time PCR
v
Ġçindekiler
ÖNSÖZ ....................................................................................................................... iii
ÖZET........................................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................................. v
ġEKĠLLER LĠSTESĠ ................................................................................................. vii
TABLO LĠSTESĠ ........................................................................................................ ix
KISALTMALAR ......................................................................................................... x
1.GĠRĠġ VE AMAÇ ..................................................................................................... 1
2. GENEL BĠLGĠLER ................................................................................................. 2
2.1. STRES ................................................................................................................... 2
2.1.1. STRES YANITI ................................................................................................. 2
2.1.1.1. KORTĠZOL SENTEZĠ ................................................................................... 4
2.1.2. GLUKOKORTĠKOĠDLER ................................................................................ 6
2.1.2.1.GLUKORTĠKOĠDLER ĠLE ĠLĠġKĠLĠ BAZI HEDEF GENLER ................... 9
2.1.3. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRLERĠ.......................................................... 9
2.1.3.1.GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRÜ TRANSKRĠPSĠYONEL
AKTĠVASYONU ....................................................................................................... 11
2.1.3.2. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRÜ TRANSKRĠPSĠYONEL
REPRESYON ............................................................................................................ 11
2.1.4. CDK5 ............................................................................................................... 12
2.1.5. JNK .................................................................................................................. 15
2.1.6. GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE ĠLĠġKĠLĠ GENLER ............................................. 16
2.1.6.1. BCL2L .......................................................................................................... 16
2.1.6.2.SGK1 .............................................................................................................. 17
2.1.6.3. GILZ .............................................................................................................. 18
2.1.6.4.KLF11 ............................................................................................................ 19
2.1.6.5.NFKB1 ........................................................................................................... 19
2.1.6.6. G6PD ............................................................................................................. 20
2.1.7. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN FĠZYOLOJĠK ETKĠLERĠ ............................... 20
2.1.8. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN GERĠ BĠLDĠRĠM ETKĠLERĠ ......................... 22
2.2. NĠKOTĠN ............................................................................................................ 22
2.2.1. NĠKOTĠNĠN YAPISI ....................................................................................... 22
2.2.2. NĠKOTĠNĠN ETKĠ MEKANĠZMASI ............................................................. 25
2.2.3. NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRLERĠ ............................................ 25
2.2.4.NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRÜ KODLAYAN GENLER .......... 27
2.2.4.1. CHRNA3 ....................................................................................................... 28
iv
2.2.4.2. CHRNA5 ....................................................................................................... 29
2.2.4.3. CHRNA7 ....................................................................................................... 29
2.2.4.4.CHRNB2 ........................................................................................................ 30
2.2.4.5.CHRNB4 ........................................................................................................ 30
2.2.5. NĠKOTĠNĠN ETKĠLERĠ .................................................................................. 30
2.3. STRES VE NĠKOTĠN ......................................................................................... 30
2.4. SH-SY5Y HÜCRE HATTI ................................................................................. 32
2.4.1.RETĠNOĠK ASĠT .............................................................................................. 34
2.5. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU ............................................................ 36
2.5.1.GERÇEK ZAMANLI (REAL-TİME) PCR ....................................................... 37
2.5.1.1.DNA‟YA ÖZGÜL OLMADAN BAĞLANAN BOYALARLA GENEL
BELĠRLEME ............................................................................................................. 40
2.5.1.2.DNA‟YA ÖZGÜL OLARAK BAĞLANAN PROBLARLA BELĠRLEME 41
3. GEREÇ VE YÖNTEM .......................................................................................... 44
3.1. KOLLAJEN KAPLAMA.................................................................................... 45
3.2. HÜCRE KÜLTÜRÜ ........................................................................................... 45
3.2.1. HÜCRELERĠN AÇILMASI ............................................................................ 46
3.2.2. HÜCRELERĠN SAYILMASI.......................................................................... 46
3.2.3. HÜCRELERĠN PASAJLAMASI .................................................................... 47
3.2.4. HÜCRELERDEN STOK ALINMASI ............................................................ 47
3.2.5. HÜCRELERĠN FARKLILAġTIRILMASI ..................................................... 48
3.3. ĠLAÇ UYGULAMASI ....................................................................................... 48
3.3.1. ALL-TRANS RETĠNOĠK ASĠT ...................................................................... 48
3.3.2. DEKSAMETAZON ......................................................................................... 49
3.3.3.NĠKOTĠN .......................................................................................................... 49
3.3.4.MEKAMĠLAMĠN ............................................................................................. 49
3.3.5. KENPAULLONE (CDK5 ĠNHĠBĠTÖRÜ) ...................................................... 49
3.3.6. SP600125 (JNK ĠNHĠBĠTÖRÜ) ...................................................................... 49
3.4. DENEY GRUPLARI .......................................................................................... 49
3.5. RNA ĠZOLASYONU.......................................................................................... 50
3.6. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ .......................................................... 51
3.7. cDNA SENTEZĠ ................................................................................................. 52
3.8. PRĠMER TASARIMI.......................................................................................... 52
3.9. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU ............................................................ 54
3.9.1. SYBR Green I .................................................................................................. 54
3.9.2. TaqMan Probları .............................................................................................. 56
3.10. ĠSTATĠSTĠK ..................................................................................................... 56
v
4. BULGULAR .......................................................................................................... 57
4.1. FARKLILAġTIRMA .......................................................................................... 57
4.2. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ .......................................................... 57
4.3. PCR ..................................................................................................................... 58
4.3.1. SYBR GREEN I............................................................................................... 58
4.3.2. Deney Gruplarına Göre Genlerde Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları ............... 61
4.3.3. Seçilen Genlere Göre Deney Gruplarında Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları .. 70
4.3.3.1. BCL2L .......................................................................................................... 70
4.3.3.2. GILZ .............................................................................................................. 73
4.3.3.3.KLF11 ............................................................................................................ 75
4.3.3.4.NFKB1 ........................................................................................................... 78
4.3.3.5.SGK1 .............................................................................................................. 80
5. TARTIġMA ........................................................................................................... 83
6. SONUÇ VE ÖNERĠLER ....................................................................................... 87
8. KAYNAKLAR ...................................................................................................... 88
8.ÖZGEÇMĠġ ............................................................................................................ 92
vi
ġEKĠLLER LĠSTESĠ
ġekil 1: Hipotalamus-Hipofiz-Adrenokortikal Eksen (HPA) ...................................... 3
ġekil 2: Adrenal bez[4] ................................................................................................ 5
ġekil 3: Kortizol sentezi ............................................................................................... 6
ġekil 4: GR proteini 3 domaini .................................................................................. 10
ġekil 5: Kenpaullone .................................................................................................. 14
ġekil 6: SP600125 kimyasal yapısı ............................................................................ 16
ġekil 7: Nikotinin kimyasal yapısı ............................................................................. 23
ġekil 8: Asetilkolinin kimyasal yapısı........................................................................ 24
ġekil 9: Mekamilaminin kimyasal yapısı ................................................................... 24
ġekil 10: Nikotinik reseptör yapısı (A) Pentamerik yapı; kas tipi, nöronal hetomerik
a4b2 ve a3b3b4a5 tipleri ve homomerik a7,a8 ve a9 nikotinik reseptörler bağlanma
bölgesi sayısı ve alt birim stokiyometrisi. (B) Nikotinik reseptör sekansında
hidrofilik ektraselüler ACh bağlanma bölgesini içeren domain, 4 transmembran
segmenti, M1±M4, intraselüler hidrofobik domain ve küçük C terminal domaini.
Kutu içinde belirtilen M2 transmembran segmenti iyon kanalı hattıdır. ................... 26
ġekil 11: Ġnsan karyotipi. Nikotinik asetilkolin reseptörler kodlayan genler ve
lokasyonları tipik insan karyoripinde gösterilmiĢtir. ................................................. 28
ġekil 12: : Gerçek zamanlı PCR döngüsündeki fazlar ............................................... 37
ġekil 13: A: SYBR Green, B: Taqman, C: Molecular Beacons; D: LightCycler ...... 40
ġekil 14: SYBR Green yöntemi[55] .......................................................................... 41
ġekil 15: Taqman yöntemi[55]................................................................................... 43
ġekil 16: SH-SY5Y hücreleri görüntüsü A:10X retinoik asit, B: 20X retinoik asit, C:
40X retinoik asit, D: 10X kontrol, E: 20X kontrol. ................................................... 57
ġekil 17: RNA jel elektroforez görüntüsü .................................................................. 58
ġekil 18: Sybr green PCR optimizasyonu erime eğrileri ........................................... 59
ġekil 19: SH-SY5Y hücrelreinde farklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücre
kültürlerinde nikotinik asetilkolin reseptör gen anlatımları ....................................... 60
ġekil 20: FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücrelerde bazal ektresyon sonuçları
.................................................................................................................................... 60
ġekil 21: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine deksametazon uygulaması . 61
ġekil 22: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine nikotin uygulaması ........... 62
ġekil 23: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda
deksametazon + nikotin uygulaması .......................................................................... 64
ġekil 24: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda
deksametazon + nikotin + mekamilamin uygulaması ................................................ 66
ġekil 25: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda
deksametazon + nikotin + SP600125 uygulaması ..................................................... 68
ġekil 26: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda
deksametazon + nikotin + kenpaullone uygulaması .................................................. 69
ġekil 27: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre BCL2L gen
ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 72
ġekil 28: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre GILZ gen
ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 74
vii
ġekil 29: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre KLF11 gen
ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 77
ġekil 30: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre NFKB1 gen
ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 79
ġekil 31: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre SGK1 gen
ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 82
viii
TABLO LĠSTESĠ
Tablo 1: PCR yönteminde kullanılan primerler ....................................................... 533
Tablo 2: SYBR Green PCR KoĢulları ...................................................................... 555
Tablo 3: Taqman PCR için gerekli olan bileĢikler ve miktarları ............................. 566
Tablo 4: Taqman PCR koĢulları............................................................................... 566
ix
KISALTMALAR
6-OHDA
6- hidroksi dopamin
µM
Mikromolar
ACh
Asetilkolin
AChBP
Asetilkolin bağlanma proteini
AChRs
Asetilkolin reseptörü
ACTH
Adrenokortikotropik hormon
ADH
Antidiüretik Hormon
AF
Aktivasyon fonksiyon domaini
AP1
Aktivatör protein
AVP
Arjinin-vazopresin
BCL2L
BCL2-like 1
BDNF
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör
cAMP
Siklik adenozin monofosfat
CAT
Kolin asetil transferaz
CDI
Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri
CDK
Siklin bağımlı kinaz
cDNA
Tamamlayıcı DNA
ChAT
Kolin asetil transferaz
CHRNA3
Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa 3
CHRNA5
Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa 5
CHRNA7
Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa 7
CHRNB2
Nikotinik kolinerjik reseptör, beta 2
CHRNB4
Nikotinik kolinerjik reseptör, beta 4
CO2
Karbondioksit
CRH
Kortikotropin salgılatıcı hormon
D2R ve D3R Dopamin reseptör 2 ve 3 alt tiplari
DAT
Dopamin taĢıyıcı
DBD
DNA bağlanma bölgesi
DEPC
Dietilpirokarbonat
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's medium
DMSO
Dimetil sülfoksit
DNA
Deoksiribonükleik asit
x
dNTP
Deoksinükleotitfosfatlar
DTT
Ditiyotretol
EDTA
Etilendiamin tetraasetik asit
EtBr
Etidyum bromür
FKBP
Ġmmunofilin
FRET
Floresans rezonans enerji transferleri
g
g kuvveti veya relatif santrifüj kuvveti
G6PD
Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz
GC
Glukokortikoid
GILZ
Glukokortikoid ile uyarılmıĢ lösin fermuarı
GM-CSF
Granulositmakrofaj koloni uyarıcı faktör
GR
Glukokortikoid reseptörü
GRE
Glukokortikoid yanıt elementi
GSK-3β
Glikojen sentaz kinaz-3 beta
HAT
Histon asetilaz
HDAC
Histon deasetilaz
HPA
Hipotalamus-Hipofiz-Adrenokortikal Eksen
hsp
Isı Ģoku proteinleri
JNK
c-Jun N-terminal kinaz
KLF11
Kruppel-like faktor 11
LBD
Ligand bağlanma bölgesi
LDL
Lipoprotein
mAChR
Muskarinik asetilkolin reseptörü
MAP2
Mikrotubul iliĢkili protein 2
MAPK
Mitojen-aktive edici protein kinaz
MC
Mineralokortikoid
MEM NEAA Minimum essential medium nonessential amino acid
Mg+2
Magnezyum
MgCl2
Magnezyum klorür
MKK
Mitojen aktive edici kinaz kinaz
MKP
MAP kinaz fosfataz
MPP+
1-metil-4-fenil piridinyum iyonu
MPTP
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin
MR
Mineralokortikoid reseptörleri
xi
nAChR
Nikotinik asetilkolin reseptörü
NeuN
Nöronal spesifik nuklear protein.
NFKB1
Nükleer faktör Kapa B
NF-κb
Nükleer faktör kapa B
NGF
Nöron büyüme faktörü
nM
Nanomolar
NSE
Nöron spesifik enolaz
NTD
N terminal bölge
PCNA
Proliferasyon hücre nuklear antijeni
PCR
Polimeraz zincir reaksiyonu
PEPCK
Fosfoenolpirüvat karboksikinaz
pH
Hidrojenin gücü
PLA2
Sitoplazmik fosfolipaz A2
POMC
Proopiomelanokortin
PVN
Paraventriküler nükleus
RA
Retinoik asit
RNA
Ribonükleik asit
SAP-97
Sinaptik bağlantılı protein 97
SAPK
Stres aktiviteli protein kinaz
SGK1
Serum/glukokortikoid düzenleyici kinaz
SH-SY5Y
Nöroblastoma hücre hattı
SLPI
Serum lökoprotaz inhibitör
TAE
Tris asetat EDTA
TH
Tirozin hidroksilaz
Tm
Erime sıcaklığı
TPA
12-O-tetradekanoyilforbol 13-asetat
U
Enzim birimi
UV
Ultraviyole
VDAC
DıĢ mitokondrial membran kanalı
VMAT
Veziküler monoamin transporter
α-BGT
α-bungarotoksin
xii
1.GĠRĠġ VE AMAÇ
Stres, yaĢamımızın kaçınılmaz bir parçasıdır. Stres pozitif etkilere sahip
olabildiği gibi negatif etkilere de sahip olabilmektedir. Yüksek düzeyde olmayan ve
kontrol edilebilen stres kiĢinin yaĢamına heyecan katarak baĢarılı olmasını sağlarken,
yoğun düzeydeki stres hastalıklara yatkınlığı artırabilmektedir.
Sigara kullanımı ile stres arasındaki iliĢki uzun zamandır tartıĢma konusu
olmuĢtur. Bilimsel sonuçlar sigara bağımlılığın stresi arttırdığını göstermesine
rağmen, sigara içenler sigaranın streslerini azalttığını söylemektedir. Tütün
kullanımına bağlı olarak ortaya çıkan hastalıkların neden olduğu ölümler, dünyada
önlenebilir ölüm nedenleri arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Tütün ürünlerinin
kullanımının yaygınlığının arkasında yatan en önemli neden, bu ürünlerin içinde
yüksek derecede bağımlılık yapıcı etkileri ile bilinen nikotinin bulunmasıdır. Nikotin,
dopamin adlı norötransmitterin salgılanmasına neden olur. Dopamin içiciye haz
verir, konsantrasyonunu artırır, enerji düzeyini yükseltir. Bu nörotransmiterlerin
salınması mutluluk hissine neden olur. Uzun süre nikotin kullananımında beyin
normal fonksiyonlarını yerine getirebilmek için nikotine ihtiyaç duyar ve böylece
kiĢi bu etkileri yaĢayabilmek için daha fazla sigara tüketmeye baĢlar.
Nikotin, merkezi sinir sistemi üzerindeki etkilerinin yanı sıra HPA
(Hipotalamo-Hipofizer-Adrenal) eksenini stimüle ederek hipofiz bezinden ACTH
(Adrenokortikotropik hormon) salgılanmasına sebep olmaktadır. ACTH, adrenal
korteksten bir glukokortikoid olan kortizol salınmasına neden olmaktadır.
Glukokortikoidler, hücrede etkilerini intrasellüler glukokortikoid reseptörlerine (GR)
bağlanarak göstermektedir. Kortizol bağlanmasından sonra dimerize olan GR
nükleusa geçmekte ve DNA üzerinde bulanan “Glukokortikoid yanıt elementi
(GRE)” bölgelerine bağlanarak gen transkripsiyonunda değiĢikliklere neden
olmaktadır. GR‟de bulunan bazı serin grupları fosforile olabilmekte ve fosforilasyon
durumu GR‟ünün nükleusa giriĢini etkilemektedir.
Bu çalıĢmanın amacı, in vitro stres modelinde nikotinin, glukokortikoid ile
aktive olan genlerin ekspresyonuna olan etkisinin ve varsa bu etkinin nikotinik
asetilkolin reseptörleri üzerinden ya da GR fosforilasyonu üzerinde etkisi olan JNK
(c-Jun N-terminal kinaz) ve CDK5 (Siklin bağımlı kinaz) üzerinden olup
olmadığının araĢtırılmasıdır.
2. GENEL BĠLGĠLER
2.1. STRES
Stres fizyolojisi, canlıların yaĢamda kendisini tehdit eden durumlarla
karĢılaĢtığında,
homeostatik
dengesini
korumak
için
geliĢtirdiği
fizyolojik
mekanizmaları inceler. Claude Bernard (1813–1878), canlıların dıĢ çevreden
bağımsız yaĢamak üzere evrimleĢtiklerini ve fizyolojik sistemlerin iç ve dıĢ çevre
kaynaklı değiĢkenlere karĢı bir tampon oluĢturmayı amaçladığını vurgulamıĢtır.
Walter Cannon (1871– 1945), homeostaz için stres ile stres yanıtının oluĢturduğu
adaptif doğaya dikkat çekmiĢ, bunu takiben ”kaç ya da savaĢ” kavramını
tanımlanmıĢtır. Aç aslanın yaralı zebrayı yakalamaya çalıĢtığı senaryodaki iki
hayvanın da organizmasında benzer fizyolojik yanıtlar olduğundan yola çıkan Hans
Selye (1907–1982), çalıĢmalarıyla stres yanıtının daha ziyade adrenokortikal
kısmıyla ilgilenmiĢtir. Daha sonraki dönemde stres yanıtının patolojik özelliklerine
dikkat çekilmiĢtir. Stres konusundaki araĢtırmalar bu temel bulgu ve çalıĢmalar
ıĢığında gerçek bir bilimsel disiplin haline gelmiĢtir.
Strese yol açan etmenlere stresör denir. Stresörler homeostatik dengeyi bozan
fiziksel veya psikolojik etmenlerdir. Stresörlere yaralanma, açlık, hemoraji,
hastalıklar ya da her çeĢit duygudurum değiĢikliği gibi örnekler verilebilir[1].
2.1.1. STRES YANITI
Stresörlere ait bilgi korteks, limbik sistem ve beyin sapından gelen yollar ve
duysal afferent lifler (spinohipotalamik yollar->lateral hipotalamus –>paraventriküler
nükleus (PVN)) aracılığıyla hipotalamusa iletilmektedir. Bu bilgi hipotalamustaki
PVN‟dan kortikotropin salgılatıcı hormon (CRH) ve arjinin-vazopresin (AVP)
salımına yol açar. CRH ve AVP‟nin güçlendirici etkisiyle hipofizin ön lobundan
adrenokortikotropik hormon (ACTH) salımı sağlanır. ACTH ise adrenal korteksten
kortikosteroid üretimini artırmaktadır. PVN‟daki CRH nöronlarının bir kısmı, beyin
sapındaki (ventral lateral medulla) ve medulla spinalisteki (intermediolateral kolon)
2
sempatik sisteme ait çekirdeklere aksonal projeksiyonlar vermektedir. Aynı zamanda
bu sempatik çekirdekler AVP ve arkuat çekirdekte proopiomelanokortin (POMC)
sentezleyen nöronlardan da uyarıcı projeksiyonlar almaktadır. Sempatik sistem
çekirdekleri uyarıldığında adrenal bez medullasından adrenalin salımı artmaktadır.
Stres
ortaya
çıktığında
sempatik
katekolaminlerin
salınmasıyla,
kardiyovasküler ve pulmoner tonus artıĢı gibi metabolik etkiler görülür. UzamıĢ
streste ise anabolizan fonksiyonlar, inflamatuar yanıtlar, ağrı algısı, sindirim, üreme,
parasempatik sinir sistemi ve büyüme hormonu salgısı baskılanır. Organizma,
hayatta kalabilmek için, bir mantık içersinde stresle savaĢır: Glukoz ve oksijen, alarm
durumundaki organizma için sadece enerji gereksinimi olan bölgelere ulaĢtırılır, ağrı
algısı baskılanır, biliĢ ise daha iyi mücadele edebilmek için keskinleĢir. Daha yıkıcı
stresörlerin zararlı etkileri, sempatik sinirsistemi ile düzenlenir.
Stres yanıtında glukokortikoidler, β-endorfin, prolaktin, vazopresin ve
pankreastan da glukagon salımı artar. Glukoz, serbest yağ asitleri, aminoasitler, ve
gliserol depo organlardan taĢınır, bu maddelerin karaciğer ve yağ dokusuna
alınmaları önlenirken bu organlarda da trigliserid, protein ve glikojen sentezi
baskılanır. Böylece aktivitesi artan kaslara enerji yönlendirmek için kanda glukoz,
serbest yağ asitleri ve gliserol seviyeleri yüksek tutulur [1].
ġekil 1: Hipotalamus-Hipofiz-Adrenokortikal Eksen (HPA)
Stres yanıtı, çevreye olan beyin ve vücut yanıtlarını yönetir. Ġnsanlarda kortizol
kemirgenlerde ise kortikosteron hormonu stres yanıtındaki önemli düzenleyicilerdir.
3
Kortizol ve kortikosteronlar hücre içindeki pek çok farklı mekanizma üzerinde
etkilidir. Bunlar arasında membran aracılığı ile ortaya çıkan değiĢiklikler ve değiĢen
gen transkripsiyonu sayılabilir[2].
Psikolojik, enfeksiyöz ve travmatik her türlü stres CRH nöronlarını aktive eder.
HPA ekseninin son ürünü olan glukokortikoid (GC) hormonlar, stres mücadelesinde
homeostatik ve adaptif süreçlerde hayati rol oynar (ġekil 1). Bu süreçler metabolik,
immün, nöral ve davranıĢsal mekanizmalardır.
GC düzeyleri, birkaç saat orta stres derecesine ulaĢtığı zaman (günlük yaĢam
için bu „stimülasyon‟ olarak adlandırılabilir) hipokampustaki sinaptik plastisite
hızlandırılarak biliĢ kuvvetlenir. Ancak stresörlere uzun süreli maruz kalındığı
durumlarda stres yanıtı da artarak GC miktarları yüksek düzeylere ulaĢır ve bu
durumda hipokampus nöronlarına doğrudan toksik etki eder. UzamıĢ stres ile stres
yanıtı, katabolik doğası gereği homeostazisi dengelemek yerine kendisi zararlı hale
gelebilir. Stres yanıtının kronik olarak çok fazla aktive olması miyopati, steroid
diyabeti, hipertansiyon, peptikülser, üremede bozukluk, psikojenik cücelik,
immünosupresyon gibi stres iliĢkili hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur. Akut
strese uygun stres yanıtını verilememesi gibi, kronik strese yanıtın çok fazla
verilmesi de yıkıcı olur. Bu iki uçlu stres fizyolojisi ile yaĢlanma arasında etkileĢim
görülmektedir. YaĢlanma stres yanıtı kapasitesinde bozulma dönemi olarak
tanımlanabilir. UzamıĢ stres, yaĢlılığın dejeneratif süreçlerini hızlandırmaktadır[3].
2.1.1.1. KORTĠZOL SENTEZĠ
Adrenal
bez
böbreğin
hemen
üzerinde,
posteromedial
yüzeyinde
retroperitoneal yerleĢimli, korteks ve medulladan oluĢan bir bezdir. Ağırlığının %
90‟ ını oluĢturan adrenal korteks, dıĢtan içe doğru, zona glomerulosa, zona fasikülata
ve zona retikülaris olmak üzere 3 tabakadan oluĢur (ġekil2).
4
ġekil 2: Adrenal bez[4]
Zona glomerulosa aldosteron yapımından sorumlu iken, zona fasikülata ve
zona retikülaris kortizol ve androjen üretir.
Aldosteron üreten zona glomerulosa renin –anjiotensin sistemi ve potasyum
seviyesi ile düzenlenirken, zona retikülaris temel olarak androjenlerin üretimi ile
iliĢkilidir. Ġnsan zona retikülaris tabakasında kortizol üretimi ile iliĢkili 17-alfa
hidroksilaz enzimi bulunmakla birlikte, kortizol üretiminden sorumlu asıl bölge zona
fasikülata tabakasıdır. Her iki zonda, ACTH eksikliğinde atrofi, fazlalığında ise
hiperplazi ve hipertrofi ortaya çıkar. Akut olarak ACTH uyarısına cevapta kortizol
artıĢından sorumlu olan zona fasikülata hücreleri iken, zona retikülaris hücreleri uzun
süreli ACTH etkisi altında bazal glukokortikoid salınımından sorumludur.
Tüm adrenal steroidlerin sentezi kolesterol ile baĢlar. Adrenal kolesterolün
temel kaynağı plazma lipoproteinleri olup, asetattan da adrenal kortekste de novo
kolesterol sentezi yapılabilir. Adrenal beze ulaĢan kolesterolün %80‟i düĢük dansiteli
lipoprotein (LDL)‟den sağlanır.
Adrenal bezde küçük bir serbest kolesterol havuzu mevcut olup, uyarı
oluĢtuğunda, depo kolesteril esterlerinin serbest kolesterole hidrolizi, plazmadan
lipoprotein alımı ve kolesterol sentezi artar. Kolesterolün sitokrom-P450 enzimleri
aracılığıyla pregnenolona dönüĢmek üzere iç mitokondrial zara transferi, adrenal
steroidogenezin hormon bağımlı hız kısıtlayıcı basamağıdır. Pregnenolon, daha sonra
ileri steroid sentezinin gerçekleĢtiği mitokondri dıĢına geçer ve birçok enzimatik
reaksiyon sonucunda kortizol sentezlenir (ġekil 3). Bazal koĢullarda günlük kortizol
sekresyonu 8-25 mg/ gündür.
5
ġekil 3: Kortizol sentezi
Kortizol sentezi nöroendokrin olarak kontrol edilir ve adrenal bezde kortizol
depolanmaz. Kortizol sentezi hipofiz bezinden salgılanan ACTH ile düzenlenirken,
ACTH‟nın kendisi de primer olarak hipotalamustan pulsatil tarzda salınan
kortikotropin salgılayıcı hormon ile düzenlenir. Nöroendokrin kontrolde üç
mekanizma mevcuttur: sirkadyan ritm, hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin (HPA)
stres yanıtı ve ACTH salınımının kortizol ile geri inhibisyonu[5].
2.1.2. GLUKOKORTĠKOĠDLER
Glukokortikoidler (GC) vücut stres altındayken homoestatik dengeyi sağlamak
için doğal olarak salınan hormonlardır. HPA eksende glukokordikoid üretimi ile ilgili
olarak,
beyindeki
GC-bağlayan
mineralokortikoidler
(MC),mineralokortikoid
reseptörleri (MR) ve glukokortikoid reseptörleri (GR) bulunmaktadır. GR beyinde
yaygın olarak bulunurken; MR, hipokampusta sınırlıdır. GR, GC düzeylerindeki
yükselmelerde negatif geri bildirimi düzenler. MR, HPA eksen aktivitesindeki limbik
etkinin tonik inhibisyonunda görevlidir. Hipokampal MR endojen GC‟lerle sürekli
iliĢki içersindeyken; GR, stres ya da sirkadyan ritim ile iliĢkili olarak glukokortikoid
düzenlenmesine katılırlar.
Kolesterolden
kortikosteron
sentezi
adrenal
bezin
zona
retikülaris,
zonafasikulata ve zona glomerüloza bölgelerinin üçünde de gerçekleĢmektedir.
Kortizol ise sadece zona fasikulata ve zona retikülariste sentezlenmektedir. Ġnsanda
en çok sentezlenip salınan glukokortikoid, kortizoldür. Kortikosteron ise çok daha az
6
miktarda sentezlenip salınmaktadır. Sıçanda ise hemen hemen sadece kortikosteron
sentezlenmektedir.
DolaĢımda kortizol büyük oranda bir α globulin olan transkortine ve çok daha
az oranda albumine bağlı olarak bulunmaktadır. Proteinlere bağlı olarak bulunan
steroidler fizyolojik açıdan inaktiftir. ACTH, glukukortikoidlerin bazal sekresyonunu
ve strese bağlı sekresyon artıĢını sağlamaktadır. ACTH‟nın tekrarlayan dozlarıyla
adrenal bezde ACTH reseptörleri anlatımı artmaktadır (up-regule olmaktadır). GC
düzeylerinin yükselmesi ACTH salgısını uzun süreli olarak inhibe etmektedir.
Glukokotikoidlerin yüksek düzeyde salgılanmaları kısa vadede yaĢamsal değere
sahiptir ancak uzun vadede kesinlikle zararlı ve yıkıcıdır. Patolojik anlamda ve uzun
süreli yükselen GC seviyeleri aĢırı katabolizma sonucu protein depolarını tüketir;
hiperglisemi, hipertansiyon ve osteoporoz geliĢmesine neden olur; vücutta yangı
süreci ve bağıĢıklık sistemi baskılanır[6].
Sentetik glukokortikoidler çok sayıda inflamatuar hastalıklarda ve kanser
tedavisinde
terapötik
olarak
kullanılmaktadır.
Glukokortikoidlerin
etkileri
kendilerine ait reseptöre (GR) bağlanması sonucunda ortaya çıkar. GR; MAPK
(Mitojenle aktive olan protein kinaz), CDK ve GSK-3β (glikojen sentez kinaz-3 beta)
gibi kinazlar tarafından fosforillenir ve fosforillenen dimerize GR nukleusa geçerek
hedef genlerde transkripsiyonel aktivite değiĢikliklerine neden olur[7].
Kortizol, glukokortikoid aktivitesini düzenleyen en önemli faktörlerden biridir.
Hensch, romatoid artrit tedavisinde kortizol kullanarak 1950 yılında Nobel tıp
ödülünü kazanmıĢtır. Bu yıllarda astım tedavisinde de kortizol kullanılmaya
baĢlanmıĢtır. Son yıllarda klinik uygulamalarda glukokortikoid moleküllerinin
genellikle sentetik pek çok tipi kullanılmaktadır. Bu moleküllerin kimyasal yapısının
temeli doğal kortikosteroidlere dayanır.
Glukokortikoidler; mekanik, kimyasal, enfeksiyöz ve immunolojik uyarıların
neden olduğu inflamasyonu engelleyen ve baskılayan en güçlü ve etkili ilaçlardır.
Glukokortikoidlerin temel
antiinflamatuar etkileri
proinflamatuar
proteinleri
kodlayan çok sayıda genin transkripsiyonunun inhibisyonu sonucuortaya çıkar. Bu
genler arasında sitokin içeren interlökin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11 ve 13, tümör nekroz faktör
α, granulositmakrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), kemokinler (interlökin 8,
aktivasyonu düzenleyen, normal T-hücre- ekspese eden ve kemokin salgılayan,
makrofaj inflamatuar protein 1α, monosit kemotaksik protein 1, 2, 3 ve 4 eotaksin),
adhezyon molekülleri (intraselüler adhezyon molekülü 1, vasküler hücre adhezyon
7
molekülü 1, E-selektin) ve sentezi düzenlemeye aracılık eden enzimler (nitrik oksit
sentaz, siklooksigenaz 2, sitoplazmik fosfolipaz A2 [PLA2] ) sayılabilir.
Glukokortikoidler ek olarak immun yanıtta hücre düzeyinde önemli etkilere
sahiptir. Glukokortikoidler eozonofillerin ömrünü kısaltabilir ve dendritik hücre
etkilerinin sayısını (antijen sunan) azaltır, alerjilerde antiinflamatuar etkiden de
kısmen sorumlu olduğu gözlenmiĢtir.[8]
Glukokortikoidlerin birçok antiinflamatuar etkisi transkripsiyon faktörlerinin
inhibisyonuyla (transrepresyon) olur. Oysaki endokrin ve metabolik etkilerde
DNA‟ya GRE‟lerin bağlanması (transaktivasyon) aracılık eder. Glukokortikoidler,
hücre nukleusunda DNA üzerindeki GRE‟ye bağlanırken aktif homomerik formda
bulunmalıdır. Diğer yandan, AP1 (aktivatör protein) ve NF-κB ( nuklear faktör kapa
B) gibi transkripsiyon faktörleriyle etkileĢiminde monomerik formda bulunur. Bu
etkilerin ayrımı hücrelerde GR mutasyonu yapılarak ve sonra viral bir vektörle
infekte edilerek gösterilmiĢtir. RU248585, RU486 ve ZK98299 gibi bazı
glukokortikoid
molekülleri
hücrelerde
transaktivasyondan
daha
büyük
transrepresyon gösterirler. Son zamanlarda glukokortikoidlerin yeni bir sınıfı
tanımlanmıĢtır. Bu glukokortikoidlerin de güçlü transrepresyon aktivitesi vardır
ancak, transaktivasyon minimaldir. [8]
Glukokortikoid antagonisti olarak RU248585, RU486 ve ZK98299 molekülleri
kullanılırken, GC agonisti olarak antiinflamatuar ve immun baskılayıcı etkilere sahip
olan deksametazon kullanılır. Deksametazon, romatolojik problemler ile bazı
alerjiler, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve serebral ödem gibi daha birçok
alanda yaygın olarak kullanılmaktadır.
Glukokortikoidlere direnç geliĢimini açıklayan bazı mekanizmalar vardır.
Hastalardan izole edilen monosit ve T lenfositlerin in vitro koĢullarda
glukokortikoidlere yanıtının azaldığı gösterilmiĢtir. Bu hücrelerden bazılarında
glukokortikoidlerin GR için afinitesi azalmıĢtır. T hücrelerinin interlökin 2 ve
interlökin 4 ile inkubasyonuyla, glukokortikoid etkilerinin fonksiyonel inhibisyona
yol açtığı gösterilmiĢtir.[8]
Glukokortikoidlerin
antiinflamatuar
etkisi,
antiinflamatuar
proteinlerin
(lipokortin 1, serum lökoprotazinhibitör (SLPI), interlökin 10 ve interlökin 1 reseptör
antagonisti gibi) anlatımının artması ile meydana gelir. Bu etki GRE‟lerde promotor
bölgedeki genler tarafından düzenlenir. Glukokortikoid reseptörleri de, koaktivatör
faktörlerinin bağlanmasıyla transkripsiyonu artırabilir.
8
2.1.2.1.GLUKORTĠKOĠDLER ĠLE ĠLĠġKĠLĠ BAZI HEDEF GENLER
Ġnflamatuar enzimler: Glukokortikoidler astım inflamasyonu siklogenaz 2 ve
sitosolik PLA2 gibi proinflamatuar sitokinlerin ürünü olan nitrik oksit sentaz
sentezini inhibe eder.
Adhezyon molekülleri: Adhezyon molekülleri inflamasyon bölgesine hücre göçünde
önemli rol oynar. Pek çok inflamatuar sitokinler endoteliyal hücrelerin yüzeyinde
adhezyon molekülünün ekspresyonununa neden olur ve glukokortikoidler bu
ekspresyonu ya dolaylı olarak inflamatuar sitokinlerin azaltılarak düzenlenmesiyle
(downregulasyon) ya da doğrudan bu molekülleri (intraselüler adhezyon molekülü, E
selektin ya da vasküler hücre adhezyon molekülü 1 gibi)
kodlayan genlerin
ekspresyonunu düzenleyerek etkileyebilir.
Apoptoz: Glukokortikoidlerin eozinofil gibi bazı inflamatuar hücrelerinde yarı ömrü
kısalır. Bu hücrelerin hayatta kalması, interlökin 5 ve GM-CSF gibi sitokinlerin
bulunmasına bağlıdır. Glukokortikoidler bu sitokinlerin sentezini bloklar ve onların
ölümünü tetikler (apoptoz) ancak bu etkinin moleküler mekanizması henüz
açıklanmamıĢtır. Glukokortikoidler nötrofillerde apoptozu inhibe ederek bu
hücrelerin hayatta kalma süresini uzatır.
β adrenareseptör: Glukokortikoidler β adrenareseptörlerin ekspresyonunu artırırlar.
Bu etki hem in vivo hem de in vitro olarak gösterilmiĢtir.[8]
Tüm insan genomunda GR bağlanması kromatin immünopresipitasyonu
kullanarak ve sonrasında son-jenerasyon DNA sekanslaması yöntemi ile belirlenmiĢ
ve glukokortikoid dekzametazona yanıtla ilgili ortaya çıkan gen ekspresyonu
değiĢiklikleri mRNA sekanslaması ile gösterilmiĢtir. GR'nin yer aldığı 4392 genomik
pozisyonda deksametazona yanıt olarak ekspresyonunu anlamlı biçimde değiĢtiren
234 gen tanımlanmıĢtır. Bu genetik sayım GR'nin gen aktivasyonu ve baskılaması
arasında belirgin farklılıklar olduğunu göstermiĢtir.[9]
2.1.3. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRLERĠ
Glukokortikoidler etkilerini belirli intraselüler glukokortikoid reseptörlerine
bağlanarak gösterirler. GR genetik kodu kromozom 5‟in uzun kolunda tespit
9
edilmiĢtir (bölge 5q31-32). Bu genomik yapıda 9 ekson ve 3 farklı gen promotorü
tanımlanmıĢtır. Farklı hücre tiplerinde farklı promotorlerin bulunması, hücre tipine
bağlı olarak farklı reseptörlerin bulunabileceğini düĢündürmektedir.[8, 10]
Glukokortikoidler ve reseptörlerinin yaĢam için gerekli olduğu bazı
çalıĢmalarla gösterilmiĢtir. Glukokortikoid reseptörü eksik olan farelerde bazı
anomaliler görülmüĢtür ve doğumdan kısa süre sonra ölmüĢlerdir.
Ġnsan GR‟nin iki izoformu vardır; GRα ve GRβ ve bu izoformlar tek genin
alternatif kırpılmalarından oluĢmuĢlardır. Her iki izoform da insan dokularında
bulunur. GRα, 777 aminoasit içerir, hormona bağlanır ve glukokortikoid yanıt
genlerini aktive eder, predominant izoformdur. Tersine GRβ sadece 742 rezidü
uzunluğundadır, C-terminus bölgesi GRα‟dan farklıdır, bu zamana kadar bilinen hiç
bir glukokortikoide bağlanmaz. GRβ‟nın fonksiyonu net değildir. GRα aracılı
transaktivasyonu dominant negatif düzenleyici etkisi olabildiği ve inflamatuar
yanıtlarda glukokortikoid aracılı direnç sağlayabildiği düĢünülmektedir. GRα,
memelilerde her hücre tipinde ekprese edilir[8, 10].
GRα proteini, N terminal (NTD), DNA bağlanma bölgesi (DBD) ve ligand
bağlanma bölgesi (LBD) olmak üzere üç domain içerir (Ģekil 4). N terminal, AF1/tau1/enh2 transaktivasyon bölgesi içerir, AF-1 (transaktivasyon domaini)
transkripsiyonun artırılması, reseptör ve bazal transkripsiyon faktörlerinin birleĢmesi
için gereklidir[10, 11]. Merkezde DNA bağlanma domaini bulunur, nüklear
reseptörler boyunca iyi korunmuĢtur. Reseptör dimerizasyonunda ve hedefe
bağlanmada kritik olan iki tane “zinc finger” bölgesi içerir. C-terminal bölgesi
hormon bağlanan yerdir, ısı Ģoku proteinlerinin bağlanma bölgesinde de görev alır.
Bu hormon bağlanma domainleri, ligand bağlı aktivasyon fonksiyon domaini (AF-2)
gibi nuklear lokalizasyon sinyallerini içerir.
ġekil 4: GR proteini 3 domaini
10
Glukokortikoidler lipofilik özellikleri sayesinde plazma membranından difüze
olabilirler ve intraselüler GRα‟ya bağlanırlar. GRα sitoplazmada inaktif kompleks
halinde bulunur. Isı Ģoku proteinleri 90 (hsp90), hsp70, hsp56, hsp40, düĢük molekül
ağırlıklı protein (p23) ve bazı immunofilinlerden (hsp56) oluĢur.
Ġmmunofilinlerin strese yanıtta kortizol-HPA ekseni ve kronik beyin
hastalıklarıyla iliĢkili olduğu öngörülmüĢtür. Kortizole maruz bırakılan nöronal hücre
kültürlerinde FK506 bağlama proteinlerinin (immunofilinlerin) (FKBP) -52 ve -51
yanıtı ve glukokortikoid reseptörleri translokasyonuna etkisindeki moleküler olaylar
araĢtırılmıĢtır. GR-immunofilin etkileĢiminde (FK506 kullanılan) nöronal nukleusta
GR formasyonu ve stabilitesi etkileri görülmüĢtür. FK506‟nın, GR nuklear
lokalizasyonunu değiĢtirdiği ve GR yanıt genlerinin ekspresyonunu inhibe ettiği
farkedilmiĢtir.[12]
Glukokortikoid bağlanmasıyla GRα multimerik kompleks proteinlerden
(özellikle hsp90) ayrılarak transkipsiyonel faktörlerin aktivasyonunu baĢlatır.
Böylece nükleer lokalizasyon sinyallerine maruz kalır ve hızla nükleusa transloke
olur. Burada ligand reseptör kompleksi inflamatuar genlerin transkripsiyonel yanıtını
uyarma veya baskılama Ģeklinde module eder[10].
2.1.3.1.GLUKOKORTĠKOĠD
RESEPTÖRÜ
TRANSKRĠPSĠYONEL
AKTĠVASYONU
GRα, DNA üzerindeki glukokortikoid yanıt elementlerine homodimer olarak
bağlanarak transkiripsiyonu aktive eder. Bu bağlanmanın gerçekleĢtiği GRE sekansı
15 baz çiftlik palindromik bir dizidir ve diziliĢi AGAACAnnnTGTTCT (n herhangi
bir nukleotit olabilir) Ģeklindedir. GRE sekansındaki bağlanma sonucunda GRα‟da
konformasyonel değiĢim olur, bazı koaktivatörlerin de desteğiyle GR-DNA
kompleksi oluĢur.
2.1.3.2.
GLUKOKORTĠKOĠD
RESEPTÖRÜ
TRANSKRĠPSĠYONEL
REPRESYON
GRα, doğrudan negatif GRE‟ye (nGRE) bağlanarak genleri baskılayabilir.
nGRE sekansları çok çeĢitlidir. Glukokortikoidlerin en etkili anti-inflamatar etkisi
11
GRα ve diğer transkripsiyon faktörlerinde (özellikle NF-κB ve AP-1) protein –
protein etkileĢimleri sonucunda görülür. Bu mekanizma inflamatuar hastalıklarla
iliĢkili sitokin ürün sayısının kısıtlanmasına yol açar. [12]
Steroid madde hücreye girdikten sonra reseptöre bağlanır ve sadece birkaç
dakika nükleusa ulaĢır. Nükleusta baĢlangıç değiĢimi olarak transkripsiyon birkaç
dakika sürer ve yeterli haberci RNA (mRNA) birikir. Post-transkripsiyonel süreç için
gereken zaman gen boyutuna bağlı olarak değiĢkenlik gösterir. Böylece steroid
alımından sonraki 15 dakika içinde hızlı gen yanıtlarıyla mRNA artıĢı belirlenmiĢ
olur ancak temel düzenleme için daha uzun saatler gereklidir[13].
GR, N terminal bölgesindeki (S203, S211 ve S226) çoklu fosforilasyon bölgesi
bulunmaktadır. Fosforilasyonun, reseptör aktivitesine etkisini araĢtırmak için yapılan
çalıĢmalar sonucunda S226‟nın alanin ile yer değiĢtirmesinin GR transkripsiyonel
yanıtı arttırdığı bulunmuĢtur. S211 fosforilasyonu hormon bağımlıdır. Buradaki
fosforilasyonun azaltılması; nuklear retansiyonun ve transkripsiyonel aktivasyonun
azalması ile iliĢkilendirilmiĢtir. S211 ve S226 fosforilasyonu sonucu GR
transkripsiyonel yanıt kofaktör etkileĢimleri ile belirlenmiĢtir[13]. Memeli kültür
hücrelerinden ya da mayadan ektopik olarak eksprese edilen hücrelerden elde edilen
GR‟de izole edilmiĢ çoklu fosforilasyon bölgeleri bulunmuĢtur. Ġnsanda N terminal
transkripsiyon düzenleyici domainde serin 203 (S203), serin 211 (S211) ve serin 226
(S226) içeren 3 bölge bulunmuĢtur[13]. Birçok transkripsiyon faktörünün gen
ekspresyonunu düzenlediğine dair kanıtlar artmaktadır. Ligand bağlanması, nükleer
translokasyon, reseptör dimerizasyonu ve genel transkripsiyon faktörleriyle
etkileĢimde fosforilasyon iliĢkilidir. GR bir fosfoproteindir ve aktivitesi fosforilasyon
ile düzenlenir. GR glukokortikoid yokluğunda kısmen fosforillenir, GR‟ye agonisti
bağlandığında
ise fosforilasyon artar
ancak
antagonisti
bağlandığında
bu
gerçekleĢmez. Bazı çalıĢmalarda fosforilasyonun GR stabilitesini etkilediği
gösterilmiĢtir. Ġnsan glukokortikoid reseptöründe AF1 fosforilasyon rezidüleri S203,
S211 ve S226‟dır. Bunlardan en az ikisinin (S211 ve S226) GR transkripsiyonel
aktivitesinde önemli olduğu düĢünülür[11].
2.1.4. CDK5
Siklin bağımlı kinazlar (CDKs), diğer proteinleri fosforile ederek onları akive
ya da inaktive eden protein kinaz enzimleridir. Hücre siklusu siklinler (cyc=cln ),
12
siklin bağımlı kinazlar (CDK) ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CDI) tarafından
kontrol edilir. Bu proteinlerin düzeyleri hücre siklusunun farklı fazlarında farklılıklar
gösterir. Siklin bağımlı kinazlar ökaryot hücre siklusu fazlarından interfaz ve mitoza
geçisi kontrol eder. CDK'lar protein fosforilasyonu yapan enzimlerdir. CDK
aktivitesi DNA sarmalının açılması için de gereklidir[14].
Aktif CDK, bir katalitik alt birim (CDK1-CDK9) ve bir düzenleyici alt birim
(siklin A, siklin J ve siklin T) içerir. CDK‟ların aktiviteleri siklin ekspresyonu,
fosforilasyon, defosforilasyon ve negatif düzenleyici proteinlerin (örneğin p16INK4,
p21Cip ve p27KIP bağlanmasını içeren çeĢitli mekanizmlar tarafından düzenlenir ve
hücre içi organellerin ya da proteinlerin doğru yerleĢimi için gereklidir[15].
CDK5, CDK ailesininkendine özgü bir üyesidir. YaklaĢık 20 yıl önce sığır
beyin ekstratında keĢfedilmiĢtir. Fonksiyon ve düzenlenmesi diğer CDK‟larla
kıyaslandığında kendine özgü özellikler gösterir. CDK5, serin/treonin kinaz
yapısındadır ve merkezi sinir sistemi geliĢimi, fonksiyonu ve hastalıklarında rol
oynar. p25 bağlanmasına bağlı olarak CDK‟nın yanlıĢ düzenlenmesi sonucunda
nöronal hücre ölümü görülebileceği gibi, madde bağımlılığı, ile Alzheimer,
Parkinson, Amiyotrofik Lateral Skleroz gibi bazı nörodejeneratif hastalıkların
mekanizmalarında rol oynayabilir. CDK5‟in nöronlarda ölümü indüklemesinin yanı
sıra hayatta kalımı etkilediği de kapsamlı çalıĢmalarla gösterilmiĢtir. Diğer yandan
CDK5/p35 nöronların stres altında hayatta kalmaları için gereklidir ve DNA
hasarıyla indüklenen nöronal ölüme karĢı koruyucu niteliktedir. [16, 17]
CDK5 prolin yönlendirilmiĢ serin/treonin kinaz ailesine 1992 yılında atipik üye
olarak dahil edilmiĢtir. Kendi aktivatörünü kullanır ve çoklu hücre fonksiyonlarında
önemli düzenleyici rol oynar.
CDK ailesi üyelerinden sadece birkaçı hücre siklusu haricinde görev alır.
Bunlardan bir tanesi olan CDK5, CDK1 ile %60 homoloji gösterir. Memelilerde
CDK5 mRNA ve proteini böbrek, testis ve ovaryumda da eksprese edilmekle
birlikte, en yüksek seviyede yetiĢkin sinir sistemi ve geliĢen post mitotik nöronlarda
eksprese edilir. Bununla birlikte CDK5diğer dokularda da bulunur özellikle beyin
ekstratlarında aktivitesi saptanmıĢtır.[18]
CDK5‟inaktif formu izole edildiğinde yeni sekansın düzenleyici alt biriminde
p25 bağı açığa çıkarılmıĢ ve moleküler klonlamada bu alt birimin uzun prekürsörü
p35 açığa çıkarılmıĢtır.[19]
13
CDK5, hücre morfolojisini ve hareketini değiĢtirme, nöronal geliĢim ve
nöronal hayatta kalım ya da ölümle iliĢkili çeĢitli proteinleri doğrudan fosforiller.
Nöronlardaki p35 ya da p39 proteini CDK5 kinaz aktivitesinde anahtar belirteçtir.
Nöronal farklılaĢma sırasında, nöronal büyüme faktörleri ya da ekstraselüler matriks
proteinleri CDK5 aktivitesinin artmasıyla artması sonucunda p35 sentez uyarımına
katılır. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör, glial kaynaklı nörotrofik faktör, nöron
büyüme faktörü (NGF), retinoik asit, laminin ve nörogilinin CDK5 aktivitesini
artırdığı rapor edilmiĢtir. Diğer yandan proteazom tarafından p35 ya da p39
degradasyonu sonucu CDK5 aktivitesi azalır.[17]
CDK5 aktivitesi nöronların geliĢimi ve olgunlaĢmasını içeren çeĢitli nöronal
fonksiyonlarda gereklidir. CDK5, mitojen-aktiveli protein kinaz- reseptör protein
kinazlar, c-Jun N-terminal kinaz 3, fosfotidilinositol-3-kinaz/ protein kinaz ve
glikojen sentez kinaz 3β sinyal yolakları gibi çeĢitli düzenleyici yolaklarda rol alır.
CDK5 çeĢitli küçük GTPaz ailesinden Rho ve Ras gibi “downsteam” aĢağı akım
substratlarını ya da mikrotübül bağlanma proteinlerini (ör. Tau, MAP2, MAP1b)
fosfatlar ve nörit büyümesinde ve/ ya da uzantı morfogenezinde aktin dinamiklerini
module eder.[17]
CDK
fonksiyonlarını
araĢtırmak
için
CDK‟lara
özgü
inhbitörler
kullanılmaktadır. Kenpaullone bazı CDK‟lar için ATP yarıĢmalı inhibitördür.
Tercihen CDK‟ları inhibe eden özgün bir kemotip bileĢimidir. Açık formülü“9Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one” Ģeklinde olup, “NSC
664704” adıyla da bilinir [15]. (ġekil 5)
ġekil 5: Kenpaullone
14
2.1.5. JNK
Mitojen aktive edici protein kinaz, serin-treonin kinaz üst ailesidir. Sitokinler,
büyüme faktörleri, nörotransmiter, hormonların yanı sıra hücre tutunması ve hücresel
stres koĢulları altında aktive olur.
Hücre büyümesi, farklılaĢması, sitoskeletal
fonksiyonlar ve gen ekspresyonunda anahtar rol oynar[20].
JNK sinyal yolağında negatif düzenleyici bileĢenler tanımlanmıĢtır. Bunlar ikili
özellik içeren MAP kinaz fosfataz MKP7 (özellikle JNK ve bazı p38 MAP kinaz
izoformlarını inaktive eder) yapısındadır. Isı Ģoku proteini Hsp72‟nin, JNK‟yı inhibe
ettiği ve böylelikle stresle indüklenen JNK aktivitesini ve apoptozu düzenleyebildiği
rapor edilmiĢtir.[21]
Üç tane JNK geni bulunmaktadır: JNK1, JNK2, JNK3 [21-23]. JNK3; beyin,
kalp ve testislerde sınırlı kalırken JNK1 ve JNK2 vücudun pek çok yerinde ekprese
edilir. Farklı kırpılma ve ekson kullanımı sonucu JNK1,2 ve 3 genlerinin çoklu
izoformları ortaya çıkmaktadır. Her bir JNK kısa form (46kDa) ve uzun formunu
(54kDa) ekprese eder. JNK1, 2 ve 3‟ün alternatif formları; farklı substrat
proteinlerine bağlanma ve bunları fosfatlamanın yanı sıra farklı JNK izoformları
farklı yollarla aktive olabilmektedirler.[22]
JNK sinyal yolağı analiz edildiğinde, çeĢitli patolojik Ģartlar, kanser, kalp
hastalıkları ve çeĢitli inflamatuar hastalıklar ile iliĢkili olabileceği görülmektedir.
JNK sinyal yolağını inhibe eden ilaçlar tedavi edici Ģekilde yararlı olabilir. Buna ek
olarak bazı ilaçlar (inhibitör SP600125 rapor edilmiĢtir) JNK fonksiyonu
araĢtırmalarını kolaylaĢtırır. Bu inhibitör kültür hücrelerinde JNK aktivitesini inhibe
eder ayrıca in vivo çalıĢmalarda inflamatuar yanıtları azaltır. SP600125, JNK sinyal
yolağı çalıĢmaları için kullanıĢlı bir araçtır [21].
SP600125, MAPK ailesinin bir üyesi olan JNK‟ya inhibitör olarak geliĢtirilmiĢ
bir bileĢiktir (ġekil 6). Protein kinaz testlerine yönelik 20 kat seçicilik gösterdiği
raporlanmıĢtır. Ayrıca bazı hücre temelli denemelerde bu inhibitör tarafından anti
inflamatuvar gen ekspresyonlarının engellendiği, AP1 aktivasyonu, yumurtalık
kanser hücrelerinde tipIV kollajenaz ekspresyonu ve insan primer CD4 hücre
kültürlerinde farklılaĢma ve aktivasyonu raporlanmıĢtır. Bu nedenlerle SP600125
15
kronik inflamatuar hastalıklar, apopototik hücre ölümü ve kanser uygulamalarında
hedef olarak önerilmiĢtir[24].
ġekil 6: SP600125 kimyasal yapısı
2.1.6. GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE ĠLĠġKĠLĠ GENLER
Glukokortikoidler tarafından doğrudan regüle edilen 10 ila 100 gen olduğu
düĢünülmektedir. Glukokortikoid-GR kompleksinin anti-inflamatuar proteinler ya da
daha önemlisi transrepresyon mekanizmalarında indirek gen regülasyon etkilerinin
olduğu gösterilmiĢtir. Bu mekanizmalar nüklear faktör- κB (NF-κB) ya da aktivatör
protein 1 (AP1) gibi proinflamatuar transkripsiyonel faktörlerin, mitojen- aktive edici
protein kinazlar (MAPKs) gibi enzimlerin destabilizasyonu, gen ekspresyonunu
kapsayan süreçlerdir ve inflamatuar yanıtta hücre çoğalmasının doğrudan
inhibisyonu ile iliĢkilidir. Alternatif olarak glukokortikoid-GR kompleksinin histon
asetiltransferaz (HAT) ve histon deasetilaz (HDAC) aktivasyonuna katıldığı da
tartıĢılmıĢtır. Bunların her ikisi de kromotin konformasyonundan sorumlu
enzimlerdir.[4]
Glukokortikoid ile aktive olduğu bilinen genlerden araĢtırma için seçilenleri
aĢağıda açıklanmıĢtır.
2.1.6.1. BCL2L
Bilinen diğer isimleri: BCLX; BCL2L; BCLXL; BCLXS; Bcl-X; bcl-xL; bclxS; PPP1R52; BCL-XL/S.
Ġnsan 20.kromozomda bulunur (20q11.21) ve 8 eksonu vardır. Proteini, BCL-2
protein ailesine ait olan gen tarafından kodlanır. BCL-2 ailesi üyeleri hetero ya da
homomer yapıdadır. GeniĢ çapta hücresel aktiviteleri içeren anti- ya da pro-apoptotik
16
düzenleyici görevi vardır. Proteini ise, dıĢ mitokondrial membranda bulunan gen
tarafından kodlanır. DıĢ mitokondrial membran kanalının (VDAC) açılmasını
düzenler. Böylece mitokondrial membran potansiyeli düzenlenir; reaktif oksijen türü
ürünler kontrol edilir ve mitokondriden sitokrom C salınır. Bunların her ikisi de
hücre apoptozunun güçlü uyarıcılarıdır. Ġki alternatif kırpılma transkript varyantı
sayesinde farklı izoformları kodlar. Uzun izoformlar apoptotik inhibitörlerdir ve kısa
izoformlar apoptotik aktivatörlerdir [25].
Ġmmunofilinlerin strese yanıtta kortizol- HPA ekseni ve kronik beyin
hastalıklarıyla iliĢkili olduğu öngörülmüĢ ve bu amaçla nöronal hücre hattı SH-SY5Y
kullanılmıĢtır. Kortizole maruz bırakılan nöronal hücre kültürlerinde FK506 bağlama
proteinlerinin
(FKBP)
-52
ve
-51
yanıtı
ve
glukokortikoid
reseptörleri
translokasyonuna etkisindeki moleküler olaylar araĢtırılmıĢtır. Kontrol grubu için
BCL2L gen ekspresyonuna bakılmıĢtır. 100nM kortizol 24 saatlik uygulamasında
BCL2L gen ekspresyon seviyesinde artıĢ görülmüĢtür.
FKBP5 ve BCL2L1‟in kortizol tarafından indüklendiği ve GR gen
transkripsiyonunu düzenlediği önceki çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. FKBP5 geni
FKBP51 proteinini kodlar, GR‟ye doğrudan bağlanan glukokortikoid yanıt
elementlerini içerir, duygudurumu bozuklukları ile iliĢkili polimorfizmleri vardır.
BCL2L1 geni; Bcl-xL proteinini kodlar ve BCL2 ailesinin mitokondrial bir üyesidir.
Mitokondrial fonksiyon, metabolizma ve sinaptik iletim ile iliĢkili olduğu düĢünülür.
30 dakika kotizol uygulanması sonrasında FKBP5 ve BCL2L1 genleri mRNA
seviyelerinde %30 artıĢ olduğu gösterilmiĢtir.[12].
2.1.6.2.SGK1
Ġnsanda 6. kromozomda (6q23) bulunur ve 17 eksonu vardır. Serin/treonin
protein kinaz kodlar ve hücresel stres yanıtında önemli rol oynar. Bu kinaz bazı
potasyum, sodyum ve klor kanallarını aktive eder, hücrenin hayatta kalması, nöronal
uyarılabilirlik ve renal sodyum salgılama süreçlerini düzenlemesiyle iliĢkili olduğu
belirtilmiĢtir. Bu genin yüksek seviyedeki ifadesi hipertansiyon ve diyabetik
nefropatiye neden olabilir. Bu genin bazı alternatif kırpılma transkript varyasyonları
sayesinde farklı izoformları kodladığı gösterilmiĢtir [26].
Ġyon kanalı geçirgenliği, hücre hacmi, hücre döngüsü süreci ve apoptozu içeren
düzenlenmeleri kapsayan hücresel stres yolakları SGK1 gen anlatımının arttığını
17
gösterir. Son zamanlarda MPTP ile indüklenen Parkinson hastalığının (PD) erken
patogenezinde SGK1 gen anlatımı ve farklı nörodejenaratif hastalıklarda hayvan
modellerinin kullanılması yararlı sonuçlar elde edilmesini sağlamıĢtır.
Farklı geliĢim aĢamalarında ve hipertansiyon, diyabetik nöropati, iskemi,
travma, nörodejenaratif hastalıklar gibi patalojik Ģartlarda SGK1 geni iliĢkisi
çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. SGK1‟in hücre döngüsü sürecinde ve hücre sağ kalım
yolaklarında fizyolojik rolü gözlemlenmiĢtir. Örneğin, aktif SGK1; voltaj kapılı K+
kanallarını düzenleyerek nöronal uyarılabilirlikte rol oynadığı ve proapoptotik enzim
glikojen sentaz kinaz 3 (GSK3) aktivitesini azalttığı düĢünülmektedir. SGK1 geninin
nöroprokretif süreçlerdeki önemi kanıtlanmıĢtır. MPTP uygulamasından önce bir
glukokortikoid olan deksametazon kullanılarak SGK1 gen anlatımının uyarılması
incelenmiĢ ve SGK1 gen anlatımının arttığı gösterilmiĢtir [27].
S”GK mRNA‟sı en çok insan hücre hattı ve sıçanlarda timus, ovaryum ve
akciğerlerde bulunur. SGK mRNA‟sı glukokortikoidler ve serum tarafından 30
dakikada uyarılır ve “de novo” protein sentezinde bağımsız görev alır.
Deksametazona bağlı yolakta kloramfenikol asetiltransferaz raportör gen aktivitesi
transkripsiyonu uyarabilir. Ġmmünoblot ile özellikle SGK ĢifrelenmiĢ protein
antikorları
belirlenmiĢtir.
Bu
proteinler
mRNA
birikimine
paralel
olarak
glukokortikoid uygulamasında artıĢ göstermiĢtir[28].
2.1.6.3. GILZ
Ġnsan X kromozomunda bulunur (Xq22.3) ve 9 eksonu bulunmaktadır. Bu gen
tarafından kodlanan protein sirke sineğindeki bir protein olan shs (shortsighted) ve
bir tür kemirgen olan murin TSC-22 proteini ile benzer sekansları paylaĢır. Her
ikisinde de fonksiyonel olarak transkripsiyonel düzenleyiciler ve lösin zincir protein
bulunur.
Bu genin ifadesi glukokortikoidler ve intelökin 10 tarafından uyarılır.
Steroid ve kemokinlerin anti-inflamatuvar ve immunsupresif etkilerinde anahtar rol
oynadığı görülmüĢtür. Bu gen için tanımlanmıĢ transkript varyantları tarafından
kodlanan farklı izoformlar vardır[29].
Deksametazon uygulaması sonrasında mutant S226A içeren ve yabani tip
U2OS hücrelerinde GR hedef genleri incelenmiĢ yapılan çalıĢmalar sonucunda tüm
genlerde artıĢ olduğu bulunmuĢtur. Yabani tipe göre mutant hücrelerde GILZ
geninde 2 katın üstünde artıĢ görülmüĢ. Bu S226 fosforilasyonunun endojen GR
18
hedeflerinin inhibe edildiğini doğrulamıĢtır. Önceki bulgularla tutarlı olarak GR
S226 fosforilasyonu hormon yokluğu koĢulları altında, düĢük S211 ve yüksek S226
fosforilasyon seviyelerinde JNK özgü reseptör tarafından olur. S226 fosforilasyonu
GR transkripsiyonel aktivitesini azalttığı sonucu bulunmuĢtur[13].
2.1.6.4.KLF11
Ġnsan 2. kromozomunda bulunur (2p25) ve 7 eksonu vardır. Bu gen tarafından
kodlanan protein çinko parmak transkripsiyon faktörüdür ve epsilon ve gama globin
gen promoterlerinde SP-1 gibi sekanslara bağlanır. Bu bağlanma hücre büyümesini
inhibe eder ve apoptozise neden olur. Bu gen kusurları insüline bağımlı olmayan
eriĢkin tip diyabete neden olur. Bu gene ait 3 transkript varyantının iki farklı
izoformu kodladığı bulunmuĢtur[30].
Depresyon da dahil olmak üzere pek çok psikiyatrik hastalıkta kronik stres risk
faktörüdür ve stresin varlığı kanda glukokortikoidlerin ya da beyin monoamin
oksidaz A artıĢıyla belirlenir. Transkripsiyon faktörü KLF11 (TIEG2 olarak da
bilinir) ile hücre büyümesini inhibe eden stres arasındaki iliĢki incelenmiĢ, nöron
kültür hücrelerinde bir glukokortikoid olan deksametazonun KLF11 mRNA ve
protein seviyesini arttırdığı bulunmuĢtur[31].
2.1.6.5.NFKB1
Ġnsanın 4. kromozomda yer alır (4q24) ve 25 eksonu bulunmaktadır. 50 kD
protein ürünü olan 26S protezom tarafından kotrasnkripsiyonel süreçte 105 kD‟luk
bir protein kodlar. Bu 105 kD protein bir Rel protein özel transkripsiyon
inhibitörüdür ve 50 kD protein NF-kappa-B (NFKB) protein kompleksinin DNA
bağlanma alt birim proteinidir. NFKB transkripsiyon düzenleyicidir ve çeĢitli iç ve
dıĢ hücresel uyarılarla (sitokinler, serbest oksijen radikalleri, ultraviyole ıĢın ve
bakteri ya da viral ürünler gibi) aktive olur. Aktive olan NFKB nukleusa girer ve çok
çeĢitli biyolojik fonksiyonları içeren genlerin ekspresyonunu uyarır. Genin iki
transkript varyantının farklı izoformları kodladığı bulunmuĢtur[32].
NFKBIA geni GC tarafından düzenlenen anti inflamatuvar yanıtta önemli bir
bileĢendir.
GC
yanıtında
kullanılan
A549
hücrelerinde
GR
bölgeleri
tanımlanmıĢtır[9].
19
2.1.6.6. G6PD
G6PD1 olarak da adlandırılan G6PD geni (Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz)
insan X kromozomunda bulunur (Xq28) ve 14 eksonu vardır. Glukoz-6-fosfat
dehidrogenaz kodlar. Bu protein ana fonksiyonu NADPH üretmektir. G6PD genetik
çeĢitlilik için dikkate değerdir. Pek çok mutantı, özellikle missense mutasyonuyla
oluĢan,
enzim
aktivite
seviyeleri
tanımlanmıĢ
ve
klinik
semptomlarda
iliĢkilendirilmiĢtir. G6PD eksikliği yenidoğan sarılığı, akut hemoliz ya da bazı kronik
sferositik olmayan hemolitik anemilere neden olmaktadır. Ġki transkript varyantının
kodladığı farklı izoformlar bulunmaktadır[33].
2.1.7. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN FĠZYOLOJĠK ETKĠLERĠ
Glukokortikoidler yaĢamsal önem taĢır. Glukokortikoidler etkilerini glukoz
üretimi (glukoneojenez), damarlarda katekolaminlere artmıĢ yanıt, yangı ve
bağıĢıklık sisteminin baskılanması ve merkezi sinir sisteminin düzenlenmesi
biçiminde gösterir.
Glukokortikoid hormonlar baĢta karbonhidrat metabolizması olmak üzere
organizmanın birçok aktivitesini etkiler. Bu hormonların en temel iĢlevi organizmayı
her türlü strese karĢı güçlü kılmaktır. Bu amaçla glukoz ve glikojen sentezi
hızlandırılarak enerji depoları güçlendirilir, vasküler tonus düzenlenir.
1.Karbonhidrat metabolizmasına etkisi:
Glukokortikoidler temel etki olarak,
glukoneogenezisi hızlandırmak suretiyle glukoz sentezini artırırlar. Bu amaçla
proteinler yıkılır, aminoasitler oluĢur. Aminoasitlerden de glukoneogenez yoluyla
glukoz üretimi sağlanır.
A) Glikojen Sentezi: Glukokortikoidler glikojen sentazı aktive etmek suretiyle
glikogenezi hızlandırırlar.
B) Glukoneogenez: Glukokortikoid hormonların en önemli etkisi bu metabolik yol
üzerinedir. Glukokortikoidlerin etkisi ile karaciğerde glukoneogenezin anahtar
hormonu olan fosfoenolpirüvat karboksikinaz (PEPCK) ın sentezi artar, ayrıca
pirüvatkarboksilaz,
fruktoz-1,6-difosfataz
ve
glukoz-6-fosfataz
da
(enzim
indüksiyonu yoluyla) aktifleĢir. Öte yandan periferik dokularda artan proteoliz
20
nedeniyle serbestleĢen aminoasitler, glukoneogenezin artıĢı için gerekli substrat
yükünü oluĢtururlar.
C) Periferik dokularda glukoz kullanımı: Glukokortikoidler periferik dokulara glukoz
giriĢini ve bu dokularda glukoz kullanımını azaltırlar.
D) Yol verici etki (permissive effect):Karbonhidrat metabolizmasında görevli
glukagon ve epinefrin gibi hormonlar ancak glukokortikoid hormonların varlığında
görev yapabilirler.
2.Yağ metabolizmasına etkisi: Glukokortikoidler lipolizi hızlandırır. Bu nedenle
plazmada serbest yağ asitleri artar ve organizmaya enerji desteği sağlanır.
3. Protein metabolizmasına etkisi: Ekstra hepatik dokularda katabolik etki,
karaciğerde anabolik etki görülür. Protein yıkımı sonucu ortaya çıkan glikojenik
aminoasitler
karaciğerde
glukoneogeneze
girerler.
Fizyolojik
dozlardaki
glukokortikoidlerin RNA sentezini artırmak suretiyle protein metabolizmasında
anabolik etkileri gözlenir.
4.
Ġmmün
fonksiyon
üzerine
etkisi:
Tedavi
edici
dozlarda
kullanılan
glukokortikoidler immün fonksiyonu baskılar. Periferik kandaki lenfositlerin sayısı
(özellikle T lenfositler) hem lizis, hem de dalak ve kemik iliği gibi organlara göç
nedeniyle düĢerek lenfopeni tablosu ortaya çıkar. Organizmanın enflamasyona
gösterdiği cevap azalır. Enflamasyon çevresindeki granülositlerin periferik kana
geçmeleri, fibroblastik aktivitedeki azalma, lökotrien ve prostaglandin gibi
antiflammatuar etkenlerin sentezindeki yavaĢlamalar bu zemini hazırlar.
5. Mineral metabolizmasına etkisi: Glukokortikoid hormonlar aynı zamanda
mineralokortikoid aktivitede gösterir. Bu hormonlar böbrekten sodyum geri
emilimini, potasyum çıkıĢını artırırlar. D vitamininin barsaktaki etkisi azaldığı için
kalsiyum emilimi azalır, ayrıca kalsiyumun böbrek yoluyla itrahı artar ve sonuçta
hipokalsemi görülür.
6. Kemik ve bağ dokusuna etkisi: GC etkisiyle yeni kemik oluĢumu engellenir,
kemik dansitesi azalır. Bağdokusundaki rejenerasyon gücü yavaĢlar, yara iyileĢmesi
gecikir, mikrobik yayılım daha kolay olur.
7. Kan basıncına etkisi: Glukokortikoidler antidiüretik hormon ADH ve
anjiyotensinojen salgısını artırır ve dolayısıyla kan basıncını yükseltir.
21
2.1.8. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN GERĠ BĠLDĠRĠM ETKĠLERĠ
Adrenal korteks tarafından üretilen kortizol kan beyin bariyerini serbestçe
geçer. Sistemik dolaĢıma katılan kortizolün negatif geri bildirim düzeneği ile kendi
salımını durdurucu bir etkisi vardır. Kortizol HPA eksenini; hipofizin ACTH üreten
kortikotrop hücreleri, hipotalamus ve hipokampus düzeylerinde inhibe eder [34].
Glukokortikoidler hipokampus, PVN ve ön hipofize etki ederek ön hipofizden
ACTH ve PVN‟den CRH salımını inhibe ederler. Ayrıca stres yanıtında adaptasyon
evresinin oluĢmasından ve stres yanıtının sonlandırılmasından GC sorumludur.
Glukokortikoidlerin negatif geri bildirim etkisi iki evrelidir. Birinci evre saniyeler
içinde baĢlar ve baĢlangıçtan itibaren 20 dakika sürer. Hızlı geri bildirim evresi adını
alır. Bu evre hız duyarlıdır; HPA ekseninin ne kadar inhibe edileceği
glukokortikoidlerin dolaĢımdaki miktarı değil, artıĢ hızı belirler. Bu evrede
glukokortikoidler HPA eksen hormonlarının sadece salımını inhibe eder. Ġkinci evre
olan gecikmiĢ geri bildirim evresi ise stresörün uygulanıĢından 40 dakika sonra
baĢlar. Bu evre glukokortikoid miktarına duyarlıdır ve dolaĢımdaki konsantrasyon
geri bildirimin gücünü belirler. Bu evrenin baĢlangıcında (ilk 2-10 saat) sadece
hormon sekresyonu baskılanırken daha sonraları hormon sentezi de baskılanır ve
hormon sentezine yol açan reseptörlerde gerileme [down-regulation] geliĢir [1].
2.2. NĠKOTĠN
2.2.1. NĠKOTĠNĠN YAPISI
Nikotin bazı bitkilerde sentezlenen doğal bir alkaloiddir. Solanaceae
(patlıcangiller) ailesininden olan bu bitkilere örnek olarak papates, patlıcan, yeĢil
biber ve tütün bitkisi verilebilir. Nikotinin birincil ticari kaynağı kurutulmuĢ tütün
bitkisi (nicotinia tabacum venicotinia rustica) yapraklarıdır. Tütün bitkisi yüzyıllar
önce Güney Amerika yerlileri tarafından yetiĢtirilmiĢ, daha sonra Kuzey Amerika‟da
Ģifalı bitki olarak kullanılmıĢtır. Daha sonra da sinir sistemini uyaran bir ajan olarak
soluma yolu ile kullanılmaya baĢlanmıĢtır.
Nikotin ilk kez 1828 yılında Posselt ve Reiman tarafından tütün yaprağından izole
edilmiĢtir. Asetilkoline benzer sıvı alkoloid yapıdadır, merkezi ve periferik sinir
sistemindeki nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR) ile etkileĢime girer. Nikotin
22
ve diğer nikotinik ajanlar Langely ve arkadaĢları tarafından 1890‟larda ve yirminci
yüzyılın baĢlarında kullanılarak sinir sistemindeki etkileri araĢtırılmıĢtır [35].
Nikotin, sigarada bulunan polonyum, radon, metanol, toluen, kadmiyum,
bütan, DDT, hidrojen siyanür, aseton, naftalin, arsenik, amonyak, karbon monoksit
gibi 3.885 toksik maddeden biridir.[36].
Nikotin bitkisinin (Nicotiana) yaklaĢık 60 türü bulunmaktadır. Ancak
bunlardan sadece iki türü (N. rustica veN. Tabacumare) ticari olarak kullanılır. En
çok bilinen türü N. Tabacum dünyanın çeĢitli yerlerinde yetiĢtirilir ve basitçe tütün
olarak adlandırılır.
Haziran-Ağustos ayları arasında pembemsi renkli çiçekler açan, 0,75-1,5 m
boylarında, bir yıllık kültür bitkisidir. Gövdeleri dik, silindir Ģeklinde, tüylü ve
yapıĢkanlıdır. Yapraklar sapsız veya kısa saplı, büyük oval, tüylü ve yapıĢkan, özel
kokulu ve acı lezzetlidir. Çiçekler tepede salkım durumunda bulunurlar. Tüp
Ģeklinde, pembemsi-kırmızı renkli, tüylü ve beĢ sivri diĢli çiçeklere sahiptir.
Meyveleri uzunca ve oval Ģekilli küçük tohumludur.
Nikotin, tütün bitkisinin kuru ağırlığının % 0,6-3‟ünü oluĢturur. 1893‟te
nikotinin kimyasal yapısı Pinner ve Wolfenstein tarafından belirlenmiĢtir (ġekil 7).
Kimyasal formülü C10H14N2ve molekül ağırlığı 162,23‟dür. Elementlerin bileĢikteki
yüzde oranları: C%74.03, H %8.70, N %17.27‟dir. Kimyasal yapısı adlandırmada 3(1-Metil-2-pirrolidinil) piridin‟dir. 1904 yılında Pictet, Crepieux ve Ritoschy
tarafından sentez edilmiĢtir. Biyolojik aktif formunda tütün bitkisinden seçime bağlı
olarak sentezlenen iki steroizomeri (L-nikotin ya da S- nikotin) vardır.
ġekil 7: Nikotinin kimyasal yapısı
Asetilkolin (ACh), nikotinin bağlandığı reseptörün doğal agonistidir (ġekil 8).
ACh vücutta kolin ve asetilCoA‟dan kolin asetilaz (kolin asetil transferaz, CAT) ile
yapılır[37].
23
ġekil 8: Asetilkolinin kimyasal yapısı
Mekamilamin, nikotinik asetilkolin reseptörünün yarıĢmasız ve seçici olmayan
antagonistidir. 1950‟lerde kan basıncını düĢüren ilaç olarak tanımlanmıĢtır.
Mekamilamin kan- beyin bariyerinden kolaylıkla geçebilir. Kilinik çalıĢmalar
mekamilaminin, nikotinin merkezi ve periferik etkilerini engellemekte etkili
olduğunu göstermektedir[38].
Farmakolojik
sınıflandırmada
“ganglion
blokeri”
olarak
adlandırılan
mekamilamin, sigara bırakma amaçlı kullanılan ajanlardan biridir. Kimyasal yapısı
(MEC;
N,2,3,3-tetrametil-bisiklo[2.2.1]
heptan-2-amin
hidroklorid)
olarak
bilinmektedir (ġekil 9).
ġekil 9: Mekamilaminin kimyasal yapısı
Mekamilamin, beyinde endojen nörotransmiter olarak asetilkolin tarafından
uyarılan nikotinik asetilkolin reseptörünü antagonize eder ve bu da orta beyinde
dopaminerjik nöronların bazal ateĢleme oranında azalmaya neden olur.
Duygudurum bozuklukları, nikotin bağımlılığı, kokain bağımlılığı, Ģizofreni,
otizm, epilepsi, Tourette‟s sendromu, alzheimer hastalığı gibi nöropsikyatrik
hastalıkların yanında kan basıncını düĢermek için de mekamilamin kullanılır.
Mekamilamin nikotinin nAChR‟e bağlanması azaltır. Sigara bırakma amaçlı
kullanılmasının nedeni, mekamilamin nikotinin ödül etkisini baskılaması ve böylece
sigara içme isteğini azaltmasıdır [38].
24
2.2.2. NĠKOTĠNĠN ETKĠ MEKANĠZMASI
DıĢardan alınan etken maddeler, vücuttaki etkilerini doğal olarak vücutta
bulunan bazı maddeleri taklit ederek ya da devam eden bazı iĢlemleri engelleyerek
gösterirler. Nikotinin etkisine aracılık eden spesifik bir reseptör 1905 yılında fizyolog
John
Newport
Langley
tarafından
bulunmuĢtur.
Nikotin
etkisini
vücutta
nörotransmiter olarak bulunan bir madde olanasetilkolini (ACh) taklit ederek
gerçekleĢtirir. Nikotin, ACh gibi hücre yüzeyinde bulunan asetilkolin reseptörlerine
(AChRs) tutunarak etkisini gösterir.
Sir Henry Dale (1914), vücutta temel olarak kendilerine bağlanan maddelerle
anılan muskarinik asetilkolin reseptörü (mAChRs)ve nikotinik asetilkolin reseptörü
(nAChRs) olarak iki büyük grup asetilkolin reseptör varlığını belirtmiĢtir.
Muskarinik reseptörler parasempatik son organlarda, nikotinik reseptörler ise
otonomik ganglion ve nöromüsküler kavĢakta yer alır.
Santral sinir sistemindeki kolinerjik etkiler hem nikotinik hemde muskarinik
mekanizmaları aracılığıyla ortaya çıkar. Böylece nikotinin vücuttaki etki yerlerinin
sinir-kas kavĢağı, otonomik ganglionlar ve merkezi kolinerjik sinapslar olduğu
görülmektedir[39].
2.2.3. NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRLERĠ
Asetilkolin
reseptörleri
ligandla
aktive
edilen
türde
nörottransmitter
reseptörlerindendir. BaĢlıca iki altbirimden oluĢur: metabotropik muskarinik
reseptörler (mAchR) ve iyonotropik nikotinik reseptörler (nAchR). Her ikisi de
endojen nörotransmiter asetilkolin ile aktive olur ve hem nöronal, hem de nöronal
olmayan hücrelerde eksprese edilirler. Metabotropik reseptörler yedi geçiĢli
transmembran proteinler olup, G-protein iliĢkilidir. Amanita muscaria mantar toksini
olan muskarin ile aktifleĢir ve itüzümü(nightshade) ailesi üyesi olan Atropa
belladonna toksini atropin ile inhibe edilir[40].
Asetilkolin reseptörlerinin diğer sınıfı iyonotropik katyonik kanalları oluĢturan
nikotinik reseptörlerdir. nAchR hakkındaki bilgilere bakıldığında iki doğal
kombinasyonu
bulunduğu
görülür.
Ġlk
bulgu Torpedo
balığındadır,
avını
sersemletmek için elektiriksel organın elektirik akımı üretmesi sonucu yapılan
analizlerde nAChR'lerinin anlatımı olduğu görülmüĢtür. Torpedo balığındaki bu
25
organ nAchR proteinlerinin yaklaĢık %40'ını içerdiğinden dolayı reseptörün
saflaĢtırılmasında iyi bir kaynak oluĢturmaktadır. Ġkinci keĢif yılan zehri olarak
bilinen α-bungarotoksin (α-BGT)ile iliĢkilidir, kas tipi nAChR‟e bağlanırve iĢlevini
baskılayarak sinir-kas kavsağında paralize neden olur.
Genetik, immunolojik, mikroskobik ve fonksiyonel analizler birleĢtirildiğinde
kas tipi nAChR‟lerin birbirleriyle iliĢkili dört adet heteropentamer yapısından
oluĢtuğu anlaĢılmaktadır. Genetik ve immunolojik çalıĢmalar, membrandaki merkez
por çevresindeki alt ünitelerin organizasyonunun iki α alt ünite ve birer tane β,δ ve γ
stokiyometrisi ile iliĢkili olduğunu göstermiĢtir (ġekil 10).
ġekil 10: Nikotinik reseptör yapısı (A) Pentamerik yapı; kas tipi, nöronal hetomerik a4b2 ve a3b3b4a5
tipleri ve homomerik a7,a8 ve a9 nikotinik reseptörler bağlanma bölgesi sayısı ve alt birim stokiyometrisi.
(B) Nikotinik reseptör sekansında hidrofilik ektraselüler ACh bağlanma bölgesini içeren domain, 4
transmembran segmenti, M1±M4, intraselüler hidrofobik domain ve küçük C terminal domaini. Kutu
içinde belirtilen M2 transmembran segmenti iyon kanalı hattıdır.
26
Nikotinik asetilkolin reseptörlerineACh gibi endojen agonistin bağlanmasıyla
reseptörde yapısal bir değiĢiklik olur, iyon kanalı açılarak iyon akımı gerçekleĢir ve
hücresel yanıt indüklenir ve bunun sonucunda da biyolojik fonksiyonlar düzenlenir.
1914 yılında Henry H. Dale ve Otto Loewi (1936 yılında Nobel Tıp ve Fizyoloji
ödülünü paylaĢmıĢlardır) tarafından kalp hızını azalttığı gösterilen ACh, endojen
sinyal bileĢiği olarak tanımlanmıĢtır. Claude Bernard bir alkaloid ekstresi olan
kürarın ACh reseptörünü inhibe ederek kurbağa iskelet kasındaki kasılmayı
engelleyebileceğini göstermiĢtir[40].
Biyokimyasal araĢtırmalar Torpedo reseptörü ve nöronal reseptörlerin her
ikisinde de periferik ve nöranal nAchR varlığını göstermiĢtir. Bunlar membran
üzerinde beĢ alt ünite içeren hetero-oligomerler ve merkezinde iyon kanalı olan bir
fıçı yapısındadır. Tavuk, sıçan, ve insanda moleküler klonlama çalıĢmalarında alt
üniteler için kodlanan çeĢitli genler tanımlanmıĢtır. Sinir-kas kavĢağında bulunan
periferik nAChR‟de α1, β1, γ ve δ ya da ε altbirimleri bulunur[36, 40].
Memeli genomunda ve insanda nAchR altünitelerinin 16 farklı gen tarafından
kodladığı gösterilmiĢtir. Bu genlerin ortak bir atadan gelip gen duplikasyonları ve
mutasyonlarla gittikçe farklılaĢtığı varsayılmaktadır. Bu açıdan nAchR evrimsel
açıdan en basit yaĢam formundan (yumuĢakçalar, solucanlar ve derisidikenliler) bu
yana korunmuĢtur. Ġnsan iyonotropik nAChR ile yüksek derecede yapısal homoloji
gösteren iyon kanalları bakterilerde de bulunur ve bu da kanıt niteliğindedir. Bakteri
ve omurgasız kanalları arasındaki yapısal homoloji nematodlarda (Caenorhabditis
elegans) glutamat duyarlı klorid kanalları kristalizasyonu ile gösterilmiĢtir[36].
ACh molekülleri iki komĢu altbirimin arasına yerleĢir ve α altbirim bağlanma
bölgesinin ilk bileĢenini oluĢtururken komĢu alt birimler yapının tamamlanmasını
sağlar. Ach bağlanma domaini ile ilgili daha detaylı bilgi Ach bağlanma proteininin
(AChBP) kristal yapı çalıĢmalarından sağlanmıĢtır. YumuĢakçalar tarafından ekprese
edilen su geçirgen protein sinapsta Ach salımını gösterir. Doğal nAchR‟lerdeki
ölçümler ligand bağlanma domaini ve nAchR agonist ve antagonist dizaynını
anlamamızı sağlamıĢtır.
2.2.4.NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRÜ KODLAYAN GENLER
Pek çok çalıĢmada nAchR‟nin beĢ özdeĢ alt birimden oluĢan homopentamerya
da farklı alt birimlerin kombinasyonu sonucu oluĢan heteropentamer yapıda
27
olabileceği gösterilmiĢtir. Alt birimler α ve β alt gruplarından oluĢur, bu da protein
sekansına ve Torpedo‟da ligand bağlanma bölgesi α alt birimdeki N terminal
domainde birbirine komĢu iki sistein pozisyonu 192 ve 193 varlığına göre belirlenir.
α alt birimi kodlayan genler CHRNA (1-10) ve β alt birimi kodlayan genler
CHRNB(1-4) olarak belirlenmiĢtir. Bunlara ek olarak kas reseptörleri için 3 alt birim
daha tanımlanmıĢtır bunlar; CHRNG geniyle kodlanan γ, CHRND geniyle kodlanan
δ ve CHRNE geniyle kodlanan ε‟dur. Kas ve nöronal nikotinik asetilkolin
reseptörlerinin kodlandığı farklı genlerin kromozomal lokasyonları Ģekil 11‟te
gösterilmiĢtir.[36]
ġekil 11: Ġnsan karyotipi. Nikotinik asetilkolin reseptörler kodlayan genler ve lokasyonları tipik insan
karyoripinde gösterilmiĢtir.
2.2.4.1. CHRNA3
Bilinen diğer adları; LNCR2, PAOD2, NACHRA3. Ġnsan 15.kromozomunda
bulunur (15q24) ve 9 eksonu vardır. Nikotinik asetilkolin reseptör ailesi tarafından
kodlanır. Bu aile üyelerinin proteinleri alfa ve beta alt ünitelerin her ikisinden de
oluĢan pentamerik kompleks yapıdadır. Alfa tip alt ünitelerin kodladıkları
28
karakteristik bitiĢik sistein rezidüleri içerir. Kodlanan proetin ligand kapılı iyon
kanalıdır ve nörotransmisyonda rol oynar. Bu genin polimorfizmleri sigaraya
baĢlamada artıĢ ve akciğer kanserine hassasiyette artıĢ ile iliĢkilendirilmiĢtir.
Alternatif kırpılmalarla çeĢitli transkriptleri tanımlanmıĢtır[41].
2.2.4.2. CHRNA5
Bir diğer adıyla LNCR2‟dir. Ġnsan 15. kromozomda bulunur (15q24) ve 6
eksonu vardır. Protein, sinapslarda hızlı sinyal aktarımını sağlayan ligand kapılı iyon
kanalları üst ailesi üyesi nikotinik asetilkolin reseptör altbirimi geni tarafından
kodlanır. Bu reseptörler heteropentamerden oluĢur ama benzer alt üniteleri içerir. Bu
gen kusuru akciğer kanser tipi 2 (LNCR2) ile iliĢkilendirilmiĢtir[42].
2.2.4.3. CHRNA7
NACHRA7 ya da CHRNA7-2 olarak da bilinir. 10 eksonu vardır ve insan 15.
kromozomda bulunur (15q14). Nikotinik asetilkolin reseptörleri, sinapslarda hızlı
sinyal iletimini düzenleyen ligand kapılı iyon kanalları süperailesinin üyesidirler.
nAChR homolog altbirimlerin oluĢturduğu bir heteropentamer yapısında olduğu
düĢünülür. Yapının her bir alt birimi N-terminal ekstraselüler domaini takiben üçlü
transmembran domain ile korunmuĢtur; bir değiĢken sitoplazmik ilmek, bir tane
dörtlü korunmuĢ transmembran domaini ve bir kısa C-terminal ekstraselüler bölgesi.
Protein, homo-oligomerik kanal formunda gen tarafından kodlanır. Kalsiyum
iyonlarına geçirgenlik gösterir ve beyin nikotinik reseptörlerinin önemli bir
bileĢenidir. Alfa-bungaratoksine yüksek duyarlılık gösterir ve alfa-bungaratoksin
beyin nikotinik reseptörlerini bloke eder. Bu reseptör asetilkolini bağlar,
konformasyonunda değiĢim olur, bundan tüm alt üniteler etkilenir ve iyon geçiren
kanalların plazma membranı boyunca açılmasına yol açar. Bu gen juvenil
miyoklonik epilepsi için önemli duyarlılıkta bölge olarak tanımlanmıĢtır ve
Ģizofreninin genetik iletiminde kromozomal lokasyonu içerir. Alternatif kırpılmalar
sonucu çoklu transkript varyantları bulunmaktadır[43].
29
2.2.4.4.CHRNB2
Bilinen diğer adları: EFNL3, nAChRB2‟dir. Ġnsan 1. kromozomunda bulunur
(1q21.3) ve 6 eksonu bulunmaktadır. Nöronal asetilkolin reseptörleri homo ya da
heteropentamerik kompleksleri homolog alfa ya da beta altünitelerden oluĢur.
Asetilkolin ve nikotin gibi ligand yanıtlarında plazma membranından sodyum ve
potasyum geçiĢine izin veren ligand kapılı iyon kanalları süperailesi üyesidir. Bu gen
bazı beta altüniteleri kodlar. Bu gendeki mutasyon otozomal dominant noktürnal
frontal lob epilepsisi ile iliĢkilendirilmiĢtir[44].
2.2.4.5.CHRNB4
Ġnsanın 15. kromozomunda bulunur ( 15q24) ve 6 eksonu vardır[45].
2.2.5. NĠKOTĠNĠN ETKĠLERĠ
Sigarada bulunan temel psikoaktif madde olan nikotin, bağımlılığa yol açan
pekiĢtirici özellikten sorumludur. Nikotin, kolinerjik bir ajan olarak merkezi sinir
sisteminde spesifik bir uyanıklık etkisi oluĢturmakta ve biliĢsel fonksiyonları
geliĢtirmektedir[46].
Nikotin, mezokortikolimbik sistemden dopamin salımını uyararak nikotinin
ödül etkilerini sağlamaktadır. Nikotin, nikotinik asetilkolin reseptörleri aracılığıyla
ventral tegmental alanda dopaminerjik nöronları uyarır ve nukleus akumbenste
dopamin salımı artar[38].
2.3. STRES VE NĠKOTĠN
Sigara içme, kortizol ve nikotin arasında en az üç nedensellik iliĢkisi
bulunmaktadır. Birincisi HPA ekseni bağımlılık süreçlerini kapsar. Ġkincisi
artmıĢkortizol seviyeleri; lipid profilleri, immun fonksiyonlar, merkezi adipozite,
kemik mineral yoğunluğu ve üreme fonksiyonlarını içeren uzun süreli sağlıkla iliĢkili
biyolojik süreçlerde olumsuz etki gösterir. Üçüncüsü ise, psikolojik stresin yüksek
kortizol seviyelerine duyarlı olmasıdır. Çoğu sigara içicisi için sigarayı bırakmak
stresli bir durumdur. Kortizol doğrudanbu sürecin içinde yer alır ve sigarayı
bırakanlarda erken dönem kötü etkilerden sorumludur [47].
30
Nikotinin stres yanıt hormonları, ACTH ve prolaktin salgılanmasında kuvvetli
bir uyarıcı olduğu gösterilmiĢtir. HPA ekseni ve nikotinin ACTH salgılanması
üzerindeki etkisine değilinen çalıĢmalarda; nikotin etkisi sonucu merkezi bir
mekanizma aracılığı ile anterior hipofiz kortikotroptan ACTH salınımının dolaylı
olarak uyarıldığı gösterilmiĢtir. Nikotinin ACTH düzenlenmesi açısından CRH
bölgesi nöronları ve hipotalamik PVN‟de doğrudan önemli etkileri olduğu
anlaĢılmaktadır. Diğer yandan, beyin sapındaki katekolaminarjik nöronlardan,
özellikle noradrenarjik/adrenerjik nukleus traktus solitaryus (NTS) nöronları PVN‟
ye projekte olur ve nikotine doza bağımlı duyarlılık gösterir. Bu katekolaminlerin
(nörotoksik lezyon, sentetik enzim inhibitörleri ya da adrenarjik reseptör
antagonistleri gibi nedenlerle) azalması, nikotinle uyarılan ACTH sekresyonunun
inhibisyonu ile sonuçlanır. Buna ek olarak beyin sapında, mekamilamin gibi
antagonistler kullanılarak nikotinik kolinerjik reseptör (NAchRs) blokajı, PVN
terminalinden norepinefrin (NE) salımında doz bağımlı azalma ve beraberinde
plazma ACTH düzeylerinin azalması ile sonuçlanır. Heterojen olarak farklı
altbirimleri içeren nikotinik asetilkolin reseptörleri, nikotinik agonistlere karĢı da
farklı duyarlılıklar gösterirler. Kronik nikotin uygulamasında nöroendokrin yanıtın
duyarsızlaĢması sonrasında nikotin metabolizması değiĢimi yerine nAChR‟lerde
değiĢim olur[48].
Mezokortikolimbik sistem dopamin nöronlarındaki nAChR‟lerinin nikotinle
duyarsızlaĢtırılması antidepresan benzeri etkiler oluĢturmaktadır. Aynı zamanda
nikotinin
postgangliyonik
sempatik
sinir
sonlanmalarından
noradrenalin
salgılanmasına neden olduğuve sempatomimetik etkilere yol açtığı bilinmektedir.
Nikotinin sempatomimetik etkileriyle stres yanıtlarını artırması beklenirken sigara
içenler genellikle sigaranın stresi azalttığını ifade etmektedirler. Nikotinin uyanıklık
ile azalmıĢ stresi birlikte oluĢturması Nesbitt paradoksu olarak adlandırılmaktadır
[49]. Nikotinle ilgili moleküler mekanizmaların açığa kavuĢturulması bağımlılıkla
mücadele edebilmek için önem taĢımaktadır.
Yapılan epidemiolojik çalĢmalarda nikotin ile depresyon arasında bağlantı
olduğu saptanmıĢtır. Bu çalıĢmalara göre Ģu sonuçlar bildirilmiĢtir: (1) Sigara
içicileri depresif bulgular göstermektedir. (2) Depresyona girmiĢ olan kiĢilerde daha
sık sigara içiciliği ile karĢılaĢılmaktadır. (3) Depresyon öyküsü olan sigara içicileri
sigarayı bırakmada çok daha fazla zorlukla karĢılaĢmaktadır. (4) Sigarayı bırakma
programlarından sonra genellikle bu kiĢilerde depresyon görülmektedir.
31
File ve arkadaĢları, orta dereceli stres karĢısında endiĢe, hoĢnutsuzluk ve
saldırganlığın anlamlı olarak arttığını ve nikotinin kadınlarda strese karĢı yatıĢtırıcı
etkisi olduğu halde erkeklerde stres yanıtını artırcı etkisi olduğunu bildirmiĢlerdir[1].
Tüm bu bulgular; nikotin, stres ve glukokortikoidler arasında önemli bir iliĢki
olduğunu göstermekle birlikte, bu iliĢkinin altında yatan mekanizmaların
öğrenilebilmesi için yeni araĢtırmaların yapılması kaçınılmazdır.
2.4. SH-SY5Y HÜCRE HATTI
SH-SY5Y, nöronal hücre araĢtırmalarında yaygın olarak kullanılan bir hücre
hattıdır. Kovalevich ve Langford‟un detaylı tanımlamasına göre; insan SH-SY5Y
(ATCC ® CRL-2266™) hücre hattı, parental metastatik kemik biyopsi hücre hattı
olan SK-N-SH (ATCC ® HTB-11™) alt kültüründen 1970‟li yıllardaJune Biedler
tarafından elde edilmiĢtir.
SH-SY5Y hücreleri farklılaĢmadan sürekli çoğalabilir, morfolojileri nöroblast
gibidir
ve
olgunlaĢmamıĢ
nöronal
iĢaretleyicileri
eksprese
edebilirler.
FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre morfolojileri primer nöronlara benzer, çoğalma
hızında, hücre siklusundan çıkıĢta ve G0 giriĢte azalma gösterirken, nöron spesifik
marker ekspresyonunda artıĢ gösterirler. Hücrelerin farklılaĢmasını indüklemek için
kullanılan bazı ajanlar retinoik asit, forbol esterleri ve dibütiril cAMP (Siklik
adenozin monofosfat)‟dir[50]. Bunların yanı sıra BDNF (Beyin kaynaklı nörotrofik
faktör), NGF (Nöron büyüme faktörü) gibi büyüme faktörleriyle nörogulinler de
kullanılmaktadır. Daha az kullanılan farklılaĢtırma faktörleri vitamin D metaboliti ve
kolesteroldur[51].
FarklılaĢtırma için iĢaretleyiciler βIII tübulin, sinaptofizin, mikrotubul iliĢkili
protein 2 (MAP2), nöron spesifik enolaz, sinaptik bağlantılı protein 97 (SAP-97) ve
nöronal spesifik nuklear protein NeuN olarak sıralanabilir.
Embriyonik merkezi sinir sistemi dokularından köken alan primer memeli
nöronlarının olgun nörona farklılaĢması sınırlıdır. Ġn vitro transforme nöron tipi
hücre hattı kullanımı bu sınırlandırmayı ortadan kaldırır.
SH-SY5Y hücre hattının in vitro çalıĢmalarda kullanılmasında üç önemli
karakteristik özelliği sayılabilir. Ġlk olarak, bu hüvre hattı yüzeye bağımlı ve
süspanseolmak üzere her iki tip hücreyi de içerir. Bazı çalıĢmalarda süspansehücre
32
fenotipine karĢı yüzeye bağımlı hücre tipinin biyolojik olarak önemine olmakla
birlikte,
birçok
çalıĢmada
ortam
değiĢimi
sırasında
süspansehücrelerin
uzaklaĢtırılmasıyla yüzey bağımlı hücreler kullanılmıĢtır. Ġkinci olarak, Biedler‟in
grubu tarafından parental farklılaĢtırılmıĢ SK - N - SH hücre hattının morfolojik
olarak nöroblast hücreler ve epitelyal hücreler olmak üzere iki farklı fenotip içerdiği
belirtilmiĢtir. Daha sonraki çalıĢmalarda SH-SY5Y hücrelerindeki bu iki fenotip
Encinas ve arkadaĢları tarafından “N” ve “S” tipi olarak adlandırılmıĢtır. Üçüncüsü,
SH-SY5Y hücreleri nöronal markerlar tarafından karakterize edilen olgun nöron
fenotipine farklılaĢabilir.
SH-SY5Yhücrelerinin ikilenme zamanı tam olarak belirtilmemesine rağmen
parental nöroblast benzeri populasyonda ikilenme zamanı yaklaĢık 27 saattir ve alt
kültürleri benzer ikilenme zamanı göstermiĢtir.
SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin farklılaĢabilmesi sinirbilim araĢtımaları için
avantajlıdır. Primer nöron kültürlerine göre daha düĢük maliyet sağlar. Hücre hattı
olmasından dolayı primer insan nöronal kültür çalıĢmalarında olduğu gibi etik
kaygıları içermez. Bunlara ek olarak insan kaynaklı hücreler olmasından dolayı insan
özel proteinleri ve protein izoformlarını eksprese ederler.
FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ SH-SY5Y hücreleri nöron benzeri hücre
kullanımının gerekli olduğu in vitro deneylerde kullanılmaktadır. Bu tür hücrelere;
nöronal farklılaĢmayla nöritlerin uzaması ve formasyonu, plazma membranında artan
elektriksel uyarı, fonksiyonel sinapslarda sinaptofizinpozitif formasyonu, nörona özel
enzimler,
nörotransmiterler
ve
nörotransmiter
reseptörleriile
iliĢkili
özel
araĢtırmalarda ihtiyaç duyulur.
SH-SY5Y hücrelerinin farklılaĢtırılmamıĢ formunun morfolojisi nöroblast
benzeri ve non-polarize hücre gövdesi Ģeklinde karakterize edilir. Bu hücreler
kümeler halinde büyüme eğilimindedir ve hücre kümeleri baĢka bir hücre kütlesinin
merkezinde üste doğru büyüme izlenimi verir. Kültürler süspanse ve yüzeye bağımlı
hücreleri içerir ve bazı çalıĢmalarda retinoik asit uygulamasıyla farklılaĢtırma
sırasında süspanse hücrelerin yüzeye bağımlı hücrelere göre “N” tipi hücrelere
dönüĢmesinin daha muhtemel olduğu gösterilmiĢtir. FarklılaĢmamıĢ SH-SY5Y
hücreleri immatür nöronal markerları eksprese ederler ve sürekli çoğalabilirler.
FarklılaĢan hücrelerde çoğalama hızı yavaĢlar ve nöron spesifik enolaz (NSE),
nöronal ve nöroendokrin dokularda bulunan baskın enolaz-izoenzimaktivitesi artar.
SH-SY5Y hücreleri medium Ģartlarına bağlı olarak kolinerjik, adrenarjik ya da
33
dopaminerjik çeĢitli nöronal fenotiplere yönelebilir. SH-SY5Y hücrelerinin
farklılaĢtırılması için en yaygın olarak kullanılan ajan retinoik asittir (RA).
FarklılaĢmamıĢ SH-SY5Y hücreleri olgunlaĢmamıĢ katekolaminerjik nöronlara
benzerler. Proliferasyon hücre nuklear antijeni (PCNA)
gibi hücre çoğalmasını
gösteren belirteçlerin yanı sıra, nestin gibi olgunlaĢmamıĢ nöronal belirteçler ile
karakterize edilir. SH-SY5Y hücreleri farklılaĢmayı takiben, βIII tubulin, mikrotubul
bağlantılı protein 2 (MAP2), sinaptozin, NeuN, sinaptik bağlantılı protein 97 (SAP97) ve NSE gibi bazı olgun nöron markerlarını eksprese eder.
SH-SY5Y hücreleri; hem farklılaĢmıĢ hem de farklıĢmamıĢ durumda
dopaminerjik nöron markerlarını eksprese eder. RA ya da 12-O-tetradekanoyilforbol
13-asetat (TPA) ile farklılaĢmayla adrenarjik fenotipe dönüĢürler. Muskarinik ve
nikotinik asetilkolin reseptörlerinin ikisi de bu hücrelerde eksprese edilir. G proteini
ile eĢleĢtirilmiĢ muskarinik reseptörler farklılaĢmıĢ ve farklılaĢmamıĢ hücelerin
membranında bulunurlar. TPA ve RA uygulanmıĢ hücreler farklılaĢmamıĢ hücrelerle
kıyaslandığında asetilkolinesteraz aktivitesinde belirgin artıĢ görülür. Buna rağman
sadece RA uygulandığında kolin asetiltransferaz aktivitesinde artıĢ görülür. Ligand
kapılı iyon kanalı oluĢturan nikotinik asetilkolin reseptörleri de SH-SY5Y
hücrelerinde bulunur ve insandakiganliyon tipi nAChR analoğu kabul edilri. SHSY5Y hücrelerindeki nACh reseptörlerinikotine yanıtta desensitizasyon gösterir. SHSY5Y hücrelerinde bulunan nAchR, nikotine desensitize yanıt gösterir ancak primer
nöronlardaki reseptör aktivasyonuna benzer Ģekilde, yıkamayı takiben yeniden
sensitizeolur [50].
2.4.1.RETĠNOĠK ASĠT
All-trans retinoik asit, retinolun doğal bir metabolitidir ve A vitamininin
biyolojik özelliklerini taĢır. Normal büyüme hücre farklılaĢması ve bağıĢıklık
fonksiyonlarında gereklidir. Retinoik asit biyolojik fonksiyonlarını RA reseptörü
(RAR) ve retinoid X reseptörü (RXR) olarak adlandırılan nükleer retinoid
reseptörleri aracılığıyla düzenler. Bu reseptörler retinoid yanıt genlerinde
transkripsiyonel
aktivasyonu sağlar.
Böylece retinoidler hücre
büyümesini
düzenlerken, çeĢitli hücre kültürlerinde ve hayvan modellerinde hücre farklılaĢmasını
sağlar[52].
34
SH-SY5Y hücrelerinin farklılaĢtırılmasında en yaygın kullanılan ve en iyi
tanımlanan metod, kültür ortamına retinoik asit eklenmesidir. Retinoik asit güçlü
büyüme inhibe edici ve hücresel farklılaĢmayı teĢvik edici özelliktedir. Genel olarak
En az 3-5gün süreyle 10 µM konsantrasyonda RA uygulaması ile hem serumsuz hem
de düĢük serumlu ortamlarda farklılaĢma indüklenir.
SH-SY5Y hücrelerinde retinoik asit uygulmasının fosfotidilinozitol 3
kinaz/Akt sinyal yolağını aktive ettiği ve antiapoptotik Bcl-2 proteini artırdığı
gösterilmiĢtir. Buna ek olarak bazı çalıĢmalardaRA-farklılaĢtırılmıĢ hücrelerin,6hidroksi dopamin (6-OHDA), 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ya da
metabolitleri ve1-metil-4-fenil piridinyum iyonu (MPP+) içeren ajanlar tarafından
indüklenen toksin aracılı hücre ölümünde farklılaĢmamıĢ hücrelere göre daha
dayanıklı olduğu gösterilmiĢtir.
RA uygulaması SH-SY5Y hücrelerindeöncelikle kolinerjik nöron fenotipini
farklılaĢtırır ve bu farklılaĢma kolin asetil transferaz (ChAT) aktivitesi ve veziküler
monoamin transporter (VMAT) ekspresyonu artıĢı ile gösterilebilir. Hücreler RA
uygulamasıyla olgun dopaminerjik fenotipe de dönüĢebilirler ancak, bu durum forbol
esterleri gibi ek ajanların birlikte uygulanmasını gerektirir. FarklılaĢmamıĢ SH-SY5Y
hücrelerinde bulunan dopaminerjik markerlar retinoik asit ile indüklenen
farklılaĢtırma sonrasında önemli derecede artar. ÇalıĢmalar forbol esterleri
uygulamasını takiben RA uygulamasıyla tirozin hidroksilaz (TH), dopamin reseptör
2 ve 3 alt tiplari (D2R ve D3R) ve dopamin transporter (DAT) ekspresyonuyla bu
artıĢı göstermiĢtir. Ġlginç bir Ģekilde Encinas ve arkadaĢları RA-farklılaĢtırılmıĢ SHSY5Y hücrelerindekarbakol stimulasyonuna artmıĢnoradrenalin salgılanmasıyla
yanıt oluĢtuğunu 2000 yılında rapor etmiĢlerdir[50].
Retinoik asitin SH-SY5Y hücre kültüründe büyüme ve farklılaĢmasını
incelemek için retinoik asit içermeyen besi ortamı ve 1µM RA içeren besiortamı
olacak Ģekilde 2 deney grubu oluĢturulmuĢ, RNA izolasyonu sonrasında mikroarray
hibridizasyonu, seçilen genler ile qPCR, protein izolasyonu sonrası western blot
yöntemleriyle analizler yapılmıĢ ve sonuç olarak RA uygulamasıyla ile gen
anlatımının
değiĢtiği,
hücresel
farklılaĢma
ve
çoğalmanın
düzenlendiği
bulunmuĢtur[53].
35
2.5. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), laboratuvar ortamında spesifik DNA
dizilerinin; primer olarak adlandırılan sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla
çoğaltılması iĢlemidir. PCR metodu ilk kez Kary Mullis tarafından (1987)
tanımlanmıĢ olup, Mullis bu buluĢundan dolayı 1993 yılı Nobel Kimya Ödülüne hak
kazanmıĢtır. PCR, bir çeĢit "in vitro klonlama" olarak kabul edilebilir. Tipik bir PCR
üç temel basamakta gerçekleĢir:
1. Denatürasyon: Ġlk aĢamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı
yardımıyla birbirinden ayrılır (denatürasyon) .Çoğunlukla 94°C- 97°C arasında 1560 saniye süresince uygulanır. Ġlk denatürasyon tek döngü olarak 5-15 dakika olarak
uygulanır.
2. Bağlanma (annealing): Denatürasyonu takiben daha düĢük ısılarda oligonükleotid
primerler, ayrılmıĢ olan tek zincirli DNA üzerinde kendilerine özgül bölgelere
bağlanırlar. Bu olay çoğunlukla 47°C- 60°C arasında 30-60 saniyede gerçekleĢir.
3. Uzama (elongasyon): Uzama aĢamasında ısı 72°C‟ye kadar arttırılarak DNA
polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır. Uzama
basamağının süresi kullanılan polimerazın cinsine ve amplifiye edilecek DNA„nın
uzunluğuna göre değiĢir.
PCR‟ın bu üç basamağının her tekrarında DNA miktarı teorik olarak iki katına
çıkar. OluĢan ürün; ilk koyulan DNA miktarı ve döngü sayısına bağlıdır.Bu teknikle;
bir DNA hedefini 106-1012 kat arasında çoğaltmak mümkündür.
Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu
bölgedekibazdizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz
uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak
sentezlenmesine dayanır.
PCR Teknolojisi için:
1) DNA örneği (genelde genomik DNA),2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve
soldan çevreleyen bir çift sentetik primer,3) dNTP'ler (A,T,C,G),4) Isıya dayanıklı
DNA-Polimeraz enzimi, ve 5) Uygun pH ve iyon koĢullarını (Mg+2) sağlayan
tampon karıĢımı gereklidir.
PCR'nin orijinal protokolünde E.Coli DNA polimeraz I'in Klenowparçası,
birleĢen oligonükleotidlerin polimerizasyonunda kullanılmıĢtır. Ancak DNA'yı
denatüre etmek için gerekli olan ısıya ulaĢıldığında; enzim inaktive olur. Her ne
36
kadar bu yöntem 200 bp altındaki reaksiyonlar için iyi çalıĢsa da; uzunsegmentlerde
baĢarılı olmamıĢtır. Uzun segmentlerde PCR ürünü çok iyi olmayıp; primerin yanlıĢ
bölgeye yapıĢmasına (mispriming)bağlı olarak farklı büyüklüklerde PCR ürünü elde
edilmektedir. Bu tip problemler ısıya dayanıklı Taq Polimerazlarin bulunması ile
önlenmiĢtir.
2.5.1.GERÇEK ZAMANLI (REAL-TİME) PCR
PCR ürünü kantitasyonunun özgün, hassas ve diğer metodlara göre daha kolay
tespit edilebildiği bir yöntemdir. Gerçek zamanlı PCR sisteminin temelini floresan
taĢıyıcı moleküllerin ıĢınımlarının tespiti ve miktarının belirlenmesi oluĢturur. Sinyal
artıĢı PCR ürün artıĢıyla direkt orantılıdır. DNA amplifikasyonunu belirlemek için
değiĢik floresan sistemler kullanılır.
Bu geliĢim sayesinde gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlere
dönüĢtürerek ölçmek, devam eden PCR reaksiyonunu ekranda izleyerek gerçek
zamanlı (real-time) olarak reaksiyonun gidiĢine müdahale etmek ve PCR
döngülerinin sayısıyla oynayabilmek de mümkündür. Birçok adlandırmayla anılan bu
teknolojiye floresan okuma yapması nedeniyle Floresan Kantitatif RT-PCR,
Kantitatif-kinetik PCR gibi çeĢitli isimler verilebilmektedir [54].
ġekil 12: : Gerçek zamanlı PCR döngüsündeki fazlar
Gerçek zamanlı PCR döngüsündeki fazlar:
1.Üssel Faz (Exponential Faz)

PCR ürün miktarı her siklusta tam olarak iki kat artar,
37

Reaksiyon spesifik ve tamdır,

Reaksiyonun etkinliği %100‟dür,

Reaksiyonun tüm bileĢenleri tazedir.
2.Linear Faz (yüksek farklılık)

Reaksiyonun bileĢenleri tükenmeye baĢlar,

Reaksiyon yavaĢlar,

OluĢan PCR ürünleri degrade olmaya baĢlar,
3.Plato Fazı (Plateu Phase -End-point)

Reaksiyon sonlanmakta,

Yeni PCR ürünü oluĢmamakta,

PCR ürünleri degrade olması artmaktadır.
Gerçek zamanlı PCR yöntemi çeĢitli amaçlarla nükleik asitlaerin kalitatif veya
kantitatif olarak saptanabilmesi amacıyla kullanılabilmektedir. Gerçek zamanlı PCR
yöntemini, daha önceden geliĢtirilmiĢ olan standart PCR yönteminden ayıran iki
önemli özellik vardır: Birincisi, real-time-PCR yönteminde termal döngü cihazıyla
birleĢtirilmiĢ bir optik okuma sisteminin kullanılmasıdır. Ġkincisi ise, PCR iĢlemi
sırasında amplifikasyonu bilgisayar ekranına yansıtacak bir probun veya probların
bulunması gereğidir. Bu nedenle özellikle uygun prob seçimi, gerçek zamanlı PCR
iĢleminin verimliliğini etkileyen en önemli basamaklardan biridir. Probun iĢlevi,
cihaz içerisinde gerçekleĢtirilmiĢ olan çoğaltma iĢleminin, gözle görülür hale
getirilmesidir. Prob kullanılmadan da, PCR tüpü içerisinde uygun primerlerin,
dNTP‟lerin ve enzimin kullanımıyla PCR iĢlemi gerçekleĢecektir. Ancak prob
kullanılmadan sonucun gerçek zamanlı PCR cihazının bilgisayarında görüntülenmesi
mümkün olmayacaktır.
Problar, florofor denen ve belirli dalga boyundaki ıĢıkla uyarıldığında floresan
ıĢıma yayabilme özelliğine sahip sentetik oligonükleotidlerdir. Genel olarak
bakıldığında prob dizileri, PCR tüpü içerisinde çoğaltma iĢlemi gerçekleĢirken,
çoğaltılmıĢ olan hedef DNA zincirlerine bağlanarak floresan ıĢıma oluĢmasına neden
olurlar. Bu iĢlemin gerçekleĢebilmesi için problar, hedef DNA‟nın belirli bir dizisine
tamamlayıcı olacak Ģekilde tasarlanmalıdır.
Prob, tek zincirli hedef DNA üzerinde tamamlayıcı olduğu bölgeye
bağlandıktan sonra, gerçek zamanlı PCR cihazının ıĢık kaynağı, PCR tüpü içine
38
uyarıcı kısa dalga boylu ıĢık gönderir. Kısa dalga boylu ıĢığın absorpsiyonu
sonrasında, uzun dalga boylu ıĢık salınımı oluĢur. Böylece gerçekleĢen floresan
ıĢıma, cihaz tarafından algılanır. PCR tüpü içerisinde ne kadar çok hedef DNA varsa
o kadar çok prob bağlanacak ve floresan ıĢıma miktarı da o derecede fazla olacaktır.
Gerçek zamanlı PCR iĢlemi ile çoğaltılmıĢ olan hedef dizilerin görüntülenebilmesi
amacıyla kullanılan çeĢitli problar mevcuttur. Buradaki temel amaç, çoğaltımlı olan
PCR ürünleriyle, kullanılan probun etkileĢime girmesinin sağlanmasıdır. Bunun
sonucunda hedef DNA‟ya floresan veren boyaların bağlanmasıyla DNA kantitasyonu
mümkün olabilmektedir.
Gerçek zamanlı PCR yönteminde floresan kimyası, iki sınıf altında
incelenebilir: Genel yöntemler ve zincire özgül yöntemler. Genel yöntemlerde
DNA‟ya özgül olmadan bağlanan problar kullanılır. Bir baĢka deyiĢle bu yöntemde
kullanılan problar PCR tüpü içerisindeki her çift zincirli DNA‟ya bağlanarak floresan
oluĢmasına neden olurlar. Zincire özgül yöntemlerde kullanılan problar ise, primer
bağlanma bölgeleri arasındaki hedef DNA‟nın komplementer bir bölgesine
bağlanarak floresan ıĢımaya neden olurlar. Bu yöntemlerin avantajı, primer-dimer
bağlanması
gibi
özgül
olmayan
çoğaltma
ürünlerinin
floresan
ıĢımayla
sonuçlanmamasıdır. Bu nedenle özgüllükleri daha yüksektir ve daha iyi sinyal
oluĢumu sağlarlar.
Gerçek Zamanlı PCR’da kullanılan prob sistemleri ve boyalar:
A. Özgül Floresan ĠĢaretli Problar
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Taqman
Molecular Beacons
Scorpion Primerleri
Hibridizasyon Probları
B. Özgül Olmayan Floresan ĠĢaretli Problar
Sybr Green I
Etidyum Bromid
39
ġekil 13: A: SYBR Green, B: Taqman, C: Molecular Beacons; D: LightCycler
2.5.1.1.DNA’YA ÖZGÜL OLMADAN BAĞLANAN BOYALARLA GENEL
BELĠRLEME
Bu yöntemde, çift zincirli DNA‟ya özgül olmadan bağlanan özel boyalar prob
görevi görürler. Bu amaçla en sık kullanılan boya molekülleri “SYBR Green I” ve
“SYBR Gold”dur. Bu boyaların çift zincirli DNA arasına girerek bağlanması
sonucunda 20-100 katlık bir floresan ıĢıma artıĢı olur ve bu ıĢıma gerçek zamanlı
PCR cihazı tarafından okunur.
Primerlerin bağlanmasını takiben gerçekleĢtirilen uzama aĢamasında hedef
DNA‟nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA‟ya bağlanan “SYBR green” miktarı artar
ve buna bağlı olarak yayılan floresan miktarında artıĢ gözlenir. “SYBR green”,
yalnızca çift zincirli DNA‟ya bağlandığında floresan veren bir boyadır. Ancak
floresan artıĢı her zaman özgül amplifikasyonu göstermeyebilir. Çünkü ortamda
hedef DNA bulunmadığı durumlarda “SYBR green”, primerlerin kendi aralarında
gerçekleĢebilecek bağlanmalar (primer dimerleri) sonucunda bu yapılara katılarak
floresan oluĢumuna neden olabilmektedir. Böyle durumlarda elde edilen floresan
ıĢımanın istenen hedef bölgenin amplifikasyonuyla mı gerçekleĢtiği, yoksa primer
dimer oluĢumu ile ortaya çıkmıĢ özgül olmayan bir ürün mü olduğunu anlayabilmek
için erime eğrisi (“melting curve”)analizi yapılır. Her çift sarmal DNA kendine özgü
erime sıcaklığı (“melting temperature” Tm) (çift sarmal DNA‟nın %50‟sinin tek
sarmal hale geçmesi için gerekli sıcaklık) değerine sahiptir. PCR amplifikasyonu
40
sonrasında sıcaklık yavaĢ yavaĢ yükseltilerek, belirli aralıklarla tüpteki floresan
miktarı kaydedilir. Çift sarmal DNA zincirleri birbirlerinden ayrılmaya baĢlayınca
“SYBR green” boyası serbest kalır ve floresan miktarı azalmaya baĢlar. Erime
eğrisinden yararlanılarak Tm derecesi hesaplanır. Test edilecek örneğe ait Tm
derecesi, aynı koĢullarda iĢleme alınan pozitif kontrolün Tm derecesiyle
karĢılaĢtırılarak PCR sonucu elde edilen ürünün özgül ürün olup olmadığına karar
verilir.
Tm
dereceleri
aynı
ise,
aranan
hedef
bölgenin
amplifikasyonu
gerçekleĢtirilmiĢ demektir. Farklı Tm dereceleri saptanması durumunda, elde edilen
amplifikasyonun özgül olmayan bir ürüne ait olduğu sonucuna varılır.
ġekil 14: SYBR Green yöntemi[55]
2.5.1.2.DNA’YA
ÖZGÜL
OLARAK
BAĞLANAN
PROBLARLA
BELĠRLEME
Bu tür yöntemlerde prob, çoğaltılmıĢ olan ürünün tamamına değil, ürün
içindeki özgül bir bölgeye bağlanır. Bir baĢka deyiĢle, floresan ıĢıma oluĢması
aslında tam olarak hedef bölgenin değil, hedef bölge içindeki proba komplementer
dizinin varlığını göstermektedir. Böylece hedef bölgenin varlığı dolaylı yoldan
gösterilmiĢ olmaktadır. Bu yöntemde probların verimliliği çok önemlidir. Kullanılan
41
problar, çoğaltma iĢleminin baĢlangıç aĢamasındaki az sayıdaki hedef bölge varlığını
da saptayabilmelidir. Farklı Ģekilde iĢlev gören değiĢik problar mevcuttur.
Özgül problar kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile amplifikasyonun
saptanması (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer): Özgül problardan
biri 3‟ ucundan floresan boya ile iĢaretli (donör boya), diğeri 5‟ ucundan alıcı boya
(acceptor dye) ile iĢaretlidir. Bu tür problara dual hibridizasyon probları adı verilir ve
uzunlukları 30 nükleotide kadar olabilir. Lineer hibridizasyon probları kullanılarak
gerçek zamanlı PCR ile amplifikasyonun saptanması, direkt hibridizasyon esasına
dayanır. Bağlanma sonrasında ikinci probun 5‟ ucundan sentez olmaması için bu uca
bir fosfat bağlanmıĢtır. Problar hedef bölge üzerinde birbirine yakın yere (1-5
nükleotid uzaklıkta) bağlanır ve iĢaretli uçlar yanyana gelmiĢ olur. Ġki boyanın
yanyana gelmesiyle açığa çıkan enerji, ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek
floresan oluĢumuna neden olur. OluĢan floresan miktarı, ortamdaki hibridizasyonun
derecesine (PCR ile oluĢan ürün miktarına) bağlı olarak artar. Her PCR döngüsünün
düĢük sıcaklık basamaklarında prob hedef DNA‟yabağlanarak ıĢıma sağlar, yüksek
sıcaklık basamaklarında hedeften ayrılır. Her döngüde, probların bağlanabileceği
hedef DNA miktarı arttığı için, sinyal miktarıda artar.
TaqMan probları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile amplifikasyonun
saptanması (5‟ekzonükleaz aktivitesi): Bu sistemde 5‟ ve 3‟ uçlarından florokrom
maddelerle iĢaretli TaqMan probları kullanılır (“dual labelled probe”). Probun 5‟
ucunda raportör florokrom, 3‟ ucunda ise baskılayıcı florokrom bulunur. Prob, tek
sarmal halegetirilen hedef bölge üzerinde, primerlerin bağlanma bölgesinin
arasındakalan yere bağlanır. Prob ile hedef bölge arasındaki hibridizasyon devam
ettiği sürece raportör florokrom maddenin sinyal oluĢturması, 3‟ ucundaki baskılayıcı
florokrom madde tarafından engellenir. Primerlerin hedef nükleik asite bağlanmasını
takiben baĢlatılan primer uzaması probun bağlandığı noktaya geldiğinde, sentezin
devam edebilmesi için TaqDNA polimeraz enzimi 5‟-3‟ekzonükleaz aktivitesini
kullanarak probu 5‟ ucundan itibaren yıkmaya baĢlar. Böylece raportör florokrom
serbest hale geçer ve sinyal oluĢturur. Her döngüde üretilen ürün arttıkça, floresan
miktarında artma gözlenir. Bu yöntemde dikkat edilmesi gereken nokta, ıĢımanın
probun DNA‟ya bağlanmasıyla oluĢmadığı, probun kırılarak ayrılmasını sağlayan 5‟3‟ ekzonükleaz aktivitesi ile oluĢtuğudur. Bu nedenle bu tür problara hidroliz
probları adı verilir.
42
ġekil 15: Taqman yöntemi[55]
Gerek hibridizasyon probları kullanıldığında, gerekse hidroliz probları
kullanıldığında, her PCR döngüsünde oluĢan floresan ıĢıma miktarı artar. Ancak
floresan sinyali oluĢumu, hibridizasyon problarında hedef DNA‟ya bağlanma
sonucunda oluĢurken, hidroliz problarında hedef DNA‟dan ayrılma sonucunda
oluĢur. Hibridizasyon probları özellikle mutasyonların saptanmasına yönelik erime
eğrisi analizi için uygunken, hidroliz probları erime eğrisi analizinde kullanılamazlar.
“Molecular beacon” ve diğer konformasyonel problar kullanılarak real-timePCR ile
amplifikasyonun saptanması: Konformasyonel problarla PCR ürününün saptanması,
DNA‟ya bağlandıktan sonra meydana gelen yapısal değiĢiklik sonucunda ıĢıma
oluĢması esasına dayanır. “Molecular beacon” yapıları, TaqMan problarından
geliĢtirilmiĢtir. Bu nedenle kimyasal yapısı, 5‟ ve 3‟ uçlarında raportör ve baskılayıcı
florokrom bulunması nedeniyle 5‟ nükleaz aktivitesinde kullanılan problara
benzerdir. Ancak saptama aĢaması, probun kırılmasıyla ıĢımanın oluĢması esasına
dayanmaz. Bu yapılar 5‟ ve 3‟ uçları bir firketenin iki ucunu oluĢturacak Ģekilde,
bükülmüĢ bir yapıda tasarlanmıĢlardır. Raportör vebaskılayıcı moleküllerin
komĢuluğunda birbirine tamamlayıcı diziler vardır.“Molecular beacon” yapısının
komplementer olduğu hedef DNA‟ya tam olarak bağlanabilmesi için, bu yapının
doğrusal olarak açılması ve bu Ģekilde bağlanması gereklidir. Bu açılarak bağlanma
43
sonucunda iki florokrom birbirinden uzaklaĢır ve baskılayıcı etki ortadan kalktığı
için ıĢıma oluĢur.
Kantitasyon için kullanılacak probların tasarımı sırasında dikkat edilecek
noktalar Ģunlardır:
1- Probların bağlanacakları bölgenin primerlerden uzakta olması tercih edilmelidir.
Primer bölgesinden amplifikasyon baĢladığı sırada probun bağlanacağı hedef bölgesi
kapatılabilir.
2- Probların Tm değerleri primerlerin Tm değerlerinden 5-10oC yüksek olmalıdır.
Eğer problarla primerlerin bağlanma değerleri aynı olursa primerler problardan daha
hızlı bir bağlanma gösterirler.
3- Probların Tm değerleri “annealing” değerinden yüksek olmak zorundadır. Sinyal
“annealing” sırasında okunduğundan daha önce probun bağlanması gereklidir.
4- Probların Tm değerleri primerlerden baĢlayan yeni DNA sentezi(amplifikasyon)
sıcaklığını aĢmamalıdır. Bağlı kalan problar sentezi engelleyebilir.
3. GEREÇ VE YÖNTEM
Agarose ( 15510-027 Ġnvitrogen)
All-trans retinoik asit (R2625 sigma aldrich),
Asetik asit (27225 sigma aldrich)
SH-SY5Y hücre hattı (ATCC® CRL-2266™),
Rat-tail collagen (11 179179 001 Roche),
DMEM (41965-039 gibco),
Ham‟s F12 (BE12-615F lonza),
Glutmax (35050-038 gibco),
MEM NEAA (11140-050 gibco),
FBS (F9665 sigma aldrich),
Penicilin streptomycin (15140-122 gibco),
Dexamethasone (D4902 sigma aldrich),
Tripsin-EDTA (T4049 sigma aldrich),
DMSO (D2650 sigma aldrich),
Nikotin (N5260 sigma aldrich),
Mekamilamin (M9020 sigma aldrich),
SP600125 (S5567 sigma aldrich),
44
Kenpaulon (K3888 sigma aldrich),
Tripure (11667165001 Roche),
Kloroform ( 24216 sigma aldrich),
Ġzopropanol (19516 sigma aldrich),
DEPC (Diethylpyrocarbonate) ( 750023 Ġnvitrogen),
Etanol (32221 sigma aldrich),
1 Kb Plus DNA Ladder (10787-018 invitrogen)
Transcriptor high fidelity cDNA synthesis kit (05081963001 Roche),
LightCycler DNA Master SYBR Green I (12158817001 Roche),
LightCycler 480 Probes Master (04707494001 Roche)
RealTime Ready Custom Single Assays (05532957001 Roche)
3.1. KOLLAJEN KAPLAMA
Kollajeni çözmek için gerekli olan %20 asetik asit hazırlandı. Filtreden
geçirildi. Laminar flow altında hazırlanan %20 asetik asitin 50 µl‟si liyofilizatın
üzerine damla damla eklendi ve 5 ml otoklavlanmıĢ su eklendi . Bir gece liyofilizatın
çözünmesi beklendi. 2 mg/ml stok kollajen hazırlandı. Bu Ģekilde +4 ̊C‟de saklandı.
Kollajen kaplama iĢlemi için önerilen miktar 5 µg/cm2 „dir. Stoktan dilüsyon
yapılarak hazırlanan 50 µg/ml kollajen solüsyonu cm2 basına 100 µl kullanılarak
plate veya flakslar kollajen ile kaplandı ve gece boyunca laminar flow altında
kuruması sağlanarak kaplama iĢlemi tamamlandı
. Alüminyum folyoya sarılarak
+4 ̊C‟de en çok bir ay süre ile saklandı.
3.2. HÜCRE KÜLTÜRÜ
Ġstanbul Teknik Üniversitesi‟den temin edilen SH-SY5Y hücre hattı
DMEM/F12 (1:1), %10 FBS, %1 Glutamax, %1 MEM NEAA ve %1 Penisilin +
Streptomisin içeren besiyeri kullanılarak kollajen kaplı plate ya da flasklarda 37 ̊C‟de
ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiĢ ortamda üretildi. SH-SY5Y hücre hattının in vitro
devamlılığının sağlanması için besiyeri her 2 – 3 günde bir değiĢtirildi. Hücre
yoğunluğu ıĢık mikroskobu analizleri ile kontrol edilerek, % 80 doluluk oranında
pasaj iĢlemi gerçekleĢtirildi.
45
3.2.1. HÜCRELERĠN AÇILMASI

Hücreler için DMEM/F12 (1:1), %10 FBS, %1 Glutamax, %1 MEM NEAA
ve %1 Penisilin + Streptomisin içeren besiyeri hazırlandı ve su banyosunda
37˚C‟ye ısıtıldı.

Hücreler sıvı azot tankından veya -80˚C‟den çıkarılır çıkarılmaz 37˚C‟lik su
banyosunda hızla çözüldü (Hücrelerin bulunduğu tüpün tamamen suya
batırılmamasına dikkat edildi).

Çözülen hücreler 15 mL‟lik santrifuj tüpüne aktarılıp üzerine 10 ml ortam
yavaĢça eklendi.

500g‟de 5 dakika santrifüj edildi.

Pellete değmemeye özen göstererek süpernatan uzaklaĢtırıldı.

Hücre pelleti üzerine 2ml yeni medium eklendi ve hücreler iyice süspanse
edildi.

Hücreler istenilen plate/flaska ekildi.

Mikroskop altında incelendi.

37˚C‟ de %5 CO2‟li inkübatöre yerleĢtirildi.

Hücre hattının in vitro devamlılığının sağlanması için besiyeri her 2 günde
bir değiĢtirildi.

Hücreler yaklaĢık % 80 doluluk oranına ulaĢtığında pasajlandı.
3.2.2. HÜCRELERĠN SAYILMASI

Hücre sayımı, hücre süspansiyonunun yoğunluğunun belirlenmesi için
yapıldı.

Sayım için hücre süspansiyonundan 100 µl alınıp tripan mavisiyle 1000 µl‟ye
tamamlandı.

KarıĢım pipetle homojenize edildi. YaklaĢık 10 saniye vortekslendi.

Thoma lamı üzerine lamel koyuldu ve sayılacak hücre süspansiyonu bu ikisi
arasına 15-20 µl pipetle kenardan vererek yayıldı.

Ġki tarafta da bulunan bir büyük karedeki hücreler sayıldı ve ortalaması alındı.

Mililitredeki hücre sayısını (hücre sayısı/ml) belirlemek için:
Hücre sayısı / ml =
Sayılan ortalama hücre miktarı (canlı) × Dilüsyon oranı × 104
46
Canlı hücre sayısı/ toplam hücre sayısı= % canlılık oranını verir (%75‟in altında
olmamalıdır.)
Formülleri uygulandı
3.2.3. HÜCRELERĠN PASAJLAMASI
Pasajlama iĢlemi yapılırken T25 flasklar için;

Medium çekildikten sonra 1,2 ml tripsin (37 ̊C‟ye ısıtılmıĢ) eklendi,

3 dakika inkübatörde tutuldu.

Üzerine 1,2 ml serum ve yaklaĢık 5 ml medium eklendi, falkona alındı.

500g„de 5 dakika santrifüj edildi.

Üst sıvı pellete değmeden atıldı.

2 ml medium eklenerek pastör pipeti yardımıyla pellet çözüldü.

100 µl alınıp 900 µl tripan mavisi eklenerek 1 ml‟ye tamamlanıp karıĢtırıldı
ve Thoma lamı ile hücre sayımı yapıldı.

Hücreler gerekli oranlarda medium ile karıĢtırılarak kollajen ile kaplanmıĢ
olan plate/flasklara ekim yapıldı.

T25 için 2 milyon, 12 well plate her well için 275000 hücre ekimi yapıldı.
3.2.4. HÜCRELERDEN STOK ALINMASI
Kullanılan hücreler, yapılan çalıĢmada duyulan ihtiyaçtan daha fazla sayıda
çoğalıyor veya yapılan çalıĢma bitmiĢ ya da ara verilecek ise uygun koĢullarda
dondurularak
saklanabilir.
Hücrelerin
dondurulması,
hücrelerin
yeniden
çözüldüğünde canlılıklarının iyi olması için çok dikkat edilmesi gereken bir iĢlemdir.
Pasajlama iĢlemine benzer Ģekilde yapıldı.

Medium, tripsin-EDTA (%0.05) ve serum su banyosunda 37°C‟ye ısıtıldı.

Ġnkübatörden alınan hücrelerin durumu, mikroskop altında incelendi.

Flask dik konuma getirilerek, hücre tabakasının olduğu yüzeye steril cam
pastör pipetleri kullanarak vakum yardımıyla ortam uzaklaĢtırıldı.

T25 flask için yaklaĢık 1,2 ml tripsin solüsyonu ilave edildi ve 37°C‟ de %5
CO2‟li inkübatörde 3 dakika hücreler yüzeyden kalkana kadar bekletildi.

Ġnkübatörden alınan flaskın tabanındaki tüm hücrelerin kalkması sağlandı.

Mikroskopta hücrelerin serbest olup olmadığı kontrol edildi.
47

Tripsinin aktivitesinin azalması için yaklaĢık 1.2 ml serum eklendi ve
hücreler falkona aktarılıp medium ile yaklaĢık 10 ml „ye tamamlandı.

500 g, 5 dakika santrifüj edildi. Supernatan atıldı.

Peleti çözmek için 1,5 ml serum eklendi. Önce pipet yardımıyla ardından
pastör pipeti ile peletin dağılması sağlandı.

Uygun oranda DMSO eklendi (toplam %10 DMSO+ %90 serum) (örnek: 1.5
ml medium için 165 µl DMSO eklendi).

Hücreler 2 ml hacimde kriyotüplere aktarıldı. Tüpün üzerine gerekli bilgiler
yazıldı (hücre hattı/pasaj no/ tarih/ DMSO oranı/ yapan kiĢi adı gibi.).

Kriyotüp kademeli soğutucu bloğa yerleĢtirildi ve
-80 ̊C dondurucuya
kaldırıldı.

Ertesi gün sıvı azot tankına transfer edildi.
3.2.5. HÜCRELERĠN FARKLILAġTIRILMASI
SH-SY5Y hücre hattı ekildikten bir gün sonra düĢük serumlu medium
[DMEM/F12 (1:1), %2 FBS, %1 Glutamax, %1 MEM NEAA ve %1 Penisilin +
Streptomisin] ile birlikte 10 uM all-trans retinoik asit içeren besiyeri kullanılarak 37
̊C‟de ve %5 CO2 ile nemlendirilmiĢ ortamda üretildi. Retinoik asit ıĢığa duyarlı
olduğu için iĢlemler karanlıklta gerçekleĢtirildi. Her iki günde medium değiĢikliği
yapılarak farklılaĢma için önerilen 5 gün boyunca uygulama yapıldı. Kontrol grubuna
%1 DMSO içeren düĢük serumlu medium uygulandı (retinoik asit DMSO da
çözüldüğü için).
3.3. ĠLAÇ UYGULAMASI
3.3.1. ALL-TRANS RETĠNOĠK ASĠT
Moleküler ağırlığı 300,44 g/mol olan all -trans retinoik asitin 50 mg‟ı 3,33ml
DMSO içinde çözülerek
50mM stok hazırlandı . 10 µl stoklar halinde
-20 ̊C‟de
ıĢıktan korunarak saklandı.
48
3.3.2. DEKSAMETAZON
Moleküler ağırlığı 392,46 g/mol olan deksametazon 7,2 mg‟ı tartıldı ve 917 µl
DMSO içinde çözülerek 20 mM stok hazırlandı. Bu stoktan 20 µl alınıp DMEM ile 8
ml‟ye tamamlandı , 50 µM stok elde edildi . 50 µM stok solusyon 100 µl ve 200 µl
Ģeklinde -20 ̊C‟de stoklandı.
3.3.3.NĠKOTĠN
Moleküler ağırlığı 462,41 g/mol olan toz haldeki nikotinden 924 mg tartılıp 15
ml otoklavlanmıĢ distile su içinde çözüldü. Önce 4N NaOH sonra 1N NaOH, pH 7,4
olacak Ģekilde eklendi. OtoklavlanmıĢ distile su ile 20 ml‟ye tamamlandı.
HazırlanmıĢ olan 100 mM nikotin 45 mm filtreden geçirildi . 30 µl ve 500 µl stoklar
halinde -20 ̊C‟de saklandı.
3.3.4.MEKAMĠLAMĠN
Moleküler ağırlığı 203,75 g/mol olan mekamilaminin 5 mg‟ı 491 µl
otoklavlanmıĢ distile su içinde çözülerek 50mM stok hazırlandı. 10 µl stoklar halinde
-20 ̊C‟de saklandı.
3.3.5. KENPAULLONE (CDK5 ĠNHĠBĠTÖRÜ)
Moleküler ağırlığı 327,18 g/mol olan CDK 5 inhibitörü 1 mg‟ı 306 µl DMSO
içinde çözülerek 10 mM stok hazırlandı. 5 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de depolandı.
3.3.6. SP600125 (JNK ĠNHĠBĠTÖRÜ)
Moleküler ağırlığı 220,23 g/mol olan JNK inhibitörünün 2 mg‟ı tartıldı ve 454
µl DMSO içinde çözülerek 20mM stok hazırlandı . 10 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de
depolandı.
3.4. DENEY GRUPLARI
SH-SY5Y hücreleri 12 well platelere her kuyucukta 275000 hücre olacak
Ģekilde ekildikten bir gün sonra farklılaĢtırma yöntemi uygulandı. 5 gün sonunda
aĢağıdaki gruplarda belirtildiği konsantrasyonda 24 saat süreli uygulama yapıldı.
49
1. Kontrol
2. Deksametazon 10nM
3. Deksametazon 100nM
4. Nikotin 50nM
5. Nikotin 300nM
6. Deksametazon 10nM + Nikotin 50 nM
7. Deksametazon 10nM + Nikotin 300 nM
8. Deksametazon 100nM + Nikotin 50 nM
9. Deksametazon 100nM + Nikotin 300 nM
10. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM
11. Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM
12. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM
13. Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM
14. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM
15. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM
16. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM
17. Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM
18. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM
19. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM
20. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM
21. Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM
3.5. RNA ĠZOLASYONU
Roche Tripure izolasyon yöntemi takip edilerek RNA izolasyonu yapıldı.
 12 well platelere ekilen hücreler uygulama sonrasında RNA toplamak için her
kuyucuğa 1 ml trizol eklenerek RNase-free ependorflara toplandı.
 Üzerine 200 µl kloroform eklendi ve 15 saniye hızlı bir Ģekilde çalkalandı.
 Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi.
 Ġnkübasyonun ardından santrifüj edildi (12000g, +4˚C, 15 dakika).
 Santrifüj sonucunda üst sıvıda bulunan RNA baĢka temiz ve etiketlenmiĢ
RNase-free ependorflara alındı. (Bu aĢamadan sonraki çalıĢmalar buz
üzerinde gerçekleĢtirildi.)
50
 RNA örneklerinin bulunduğu ependorflara 0,5 ml izopropanol eklendi. Birkaç
kez ters-düz edilerek karıĢması sağlandı.
 10 dakika oda sıcaklığında inkübasyonun ardından santrifüj edildi (12000g ,
+4 ˚C, 10 dakika).
 Santrifüj sonrasında pellete değmeden örneklerin üst sıvısı atıldı.
 %75‟lik etanolden her ependorfa 1 ml eklendi. (Bu aĢamada +2˚C ile +8˚C
arasında 1 hafta ya da -15˚C ile -25˚C arasındaki sıcaklıkta 1 yıl saklanabilir)
 Pelletin kalkması sağlandı ve kısaca (1-2 saniye) vortekslendi.
 7500g‟de, +4 ˚C‟de 5 dakika santrifüj edildi.
 Pipet yardımıyla üst sıvı atıldı.
 Etanolun uçmasını sağlamak için ependorfların kapağı açık kalacak Ģekilde
kuru ısı bloğuna (55˚C) yerleĢtirildi.
 Etanolü yeterince uçan RNA örneklerinin üzerine birkaç kez al-ver yapılarak
30 µl DEPC (ya da PCR için kullanılan su) eklendi.
 5 dakika kapakları kapatılıp ısı bloğuna bekletildi.
 Nanodrop cihazında nukleik asit ve RNA özellikleri seçilerek izolasyonu
tamamlanan RNA örneklerinin konsantrasyonu ölçüldü.
 RNA „yı çözdüğümüz DEPC (ya da PCR için kullanılan su) ile 2 kez blank
alındı ve 1,5 µl ile ölçüm yapıldı.
 Ölçüm sonuçlarının güvenilirliği için en az 2 tekrar yapıldı.
 Konsantrasyon ve 260/280 değerleri kaydedildi.
 Örnekler -80˚C‟ye kaldırıldı.
3.6. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ
FarklılaĢtırma prosedürü uygulanan hücrelerden izole edilen RNA‟nın kalitatif
analizi için agaroz jel elektroforezi yapıldı.
 Yürütme tamponu, %10 sukroz (gliserolde kullanılabilir), %90 deiyonize
formamid ve %0,05 bromofenol mavisi içerecek Ģekilde hazırlandı.
 %1 agaroz jel için, 0,5g agaroz tartıldı, 50 ml %1 TAE (Tris-acetate-EDTA)
ile erlende karıĢtırılıp mikrodalga fırında agarozun erimesi sağlanarak
hazırlandı. Tank-kaset hazırlandı. Jelin biraz soğuması beklenip kasete
döküldü, donması beklenildi. Tank %1 TAE ile dolduruldu.
51

RNA örnekleri jele yüklenirken %50 yürütme tamponu, %50 RNA olacak
Ģekilde 500 µl‟lik ependorfa hazırlandı (toplam 15-20 µl).

10 dakika 60 ̊C de (kuru ısı bloğunda) ısıtıldı.

Her kuyucuğa 15µl olacak sekilde yükleme yapıldı.

Marker hazırlanırken 1,5 µl DNA (100 bp–12 kb) ile 7,5µl yürütme tamponu
karıĢtırıldı. 6 µl‟si jele yüklendi.

Jel 70 voltta yaklaĢık 2 saat yürütüldü.

Jeli görüntülemek için 100 ml distile su içerisine %1‟lik 20 µl EtBr (Etidyum
bromür) eklendi, EtBr her yere dağılması sağlandı ve jel bu karıĢıma alındı.

KarıĢtırıcıda 10 dakika boyanması sağlandı, ardından yıkama yapmak için
distile su ile karıĢıtırıcıda 5 dakika bekletildi.

Ultraviyole (UV) ıĢık altında görüntü alındı.
3.7. cDNA SENTEZĠ
“Transcriptor high fidelity cDNA synthesis kit”i kullanılarak kantitatif RTPCR standart prosedürü uygulandı.

Kitte belirtildiği Ģekilde toplam hacim 20 µl olacak Ģekilde 60 µM random
hexamer primer, 1000 ng cDNA için gereken miktarda RNA ve toplamı 11,4
µl olacak Ģekilde su eklendi.

Techne TC-512 Thermal Cycler cihazında 10 dakika 65˚C inkübasyonun
ardından hemen buz üstüne alındı.

Tampon (son konsantrasyon 8 mM MgCl2), RNase inhibitörü (son
konsantrasyon 20U), dNTP (her birinden son konsantrasyon 1 mM), DTT
(son konsantrasyon 5 mM) ve revers transkriptaz enzimi (son konsantrasyon
10U) içeren karıĢımdan 8,6 µl eklenerek toplam 20 µl yapıldı.

Thermal Cycler cihazında 10 dakika 29˚C, 60 dakika 48˚C, 5 dakika 85˚C
programı uygulandı.

Sentezlenen cDNA -20 ˚C‟de saklandı.
3.8. PRĠMER TASARIMI
Ġnsan nikotinik asetilkolin reseptör genleri için CHRNA3 (NM_000743),
CHRNA5 (NM_000745), CHRNA7 (NM_000746), CHRNB2 (NM_000748),
52
CHRNB4 (NM_000750) ve housekeeping gen olarak 18S ribosomal RNA (X03205)
seçildi. Glukokortikoid çalıĢmalarında kullanılan yüzlerce genden bazıları hedef geni
olarak olarak seçildi. Bunlar: BCL2L1 (NM_138578), SGK1 (NM_001143677),
NFKB1 (NM_001165412), GILZ (NM_001015881), KLF11 (NM_001177716)‟dir
ve bu genlere özgü primer dizaynları çevrimiçi araçlar kullanılarak yapıldı. Primer
tasarımı yapılırken; oligonükleotidin tek bir dizilime özgül olmasına, saç tokası
oluĢturmaması için oligonükleotid kendi içinde karĢılıklı eĢlenik baz dizileri
içermemesine, oligonükleotid çiftleri dimer oluĢumuna neden olacak Ģekilde
birbirleri ile eĢlenik olmamasına, oligonükleotid uzunluğunun 18-24 baz arasında
olmasına, oligonükleotid çiftlerinin Tm‟lerinin birbirine denk veya yakın olmasına,
oligonükleotid dizilimleri için 3‟ten fazla tekrar eden baz olmamasına dikkat edildi
(Tablo1).
gen
CHRNA3
NM_000743
CHRNA5
NM_000745
SYBR
GREEN
CHRNA7
NM_000746
CHRNB2
NM_000748
CHRNB4
NM_000750
18sRNA
X03205
BCL2L1
NM_138578
SGK1
NM_001143677
TaqMan
NFKB1
NM_001165412
GILZ
NM_001015881
KLF11
NM_001177716
primerler
sense
antisense
ürün
sense
antisense
ürün
sense
antisense
ürün
sense
antisense
ürün
sense
antisense
ürün
sense
antisense
ürün
sense
prob
antisense
ürün
sense
prob
antisense
ürün
sense
prob
antisense
ürün
sense
prob
antisense
ürün
sense
prob
antisense
ürün
sekans (5'-3')
GGCTCAAGCAAATCTGGAATG
GGTAATCAAACGGGAAGTAGGT
TTGGTGGATGTGGATGAGAAA
TTTGTAGTTTGCCGGTGGA
GAACTACAATCCCTTGGAGAGG
CGCTCATCAGCACTGTTATAGA
CTGGTGACAGTACAGCTTATGG
TGCCGTCAGCATTGTTGTA
CCAGCTTATCAGCGTGAATGA
CCGGACTATCAAGTTGGTGTAG
CCCAACTTCTTAGAGGGACAAG
GTACAAAGGGCAGGGACTTAAT
CCTAAGGCGGATTTGAATCTCT
CTCCCTTCAGAATCTTATCTTGGCTTTGGA
TGAGTCTCGTCTCTGGTTAGT
CCTCTCCAGCTGAAACCAAATA
AAATTCCGCAAGACACCTCCTGGA
ACTCTTAATCTCCATGAAGTCATCC
GCTACTCTGGCGCAGAAATTA
AATAATGCCTTCCGGCTGAGTCCT
CAGAGACCTCATAGTTGTCCATAAG
GGCCATGGATCTGGTGAAG
TGCTGTGAGAGAGGAGGTGGAGAT
AGGGTGTTCTCACGCTCTA
CGACTCTGTGCATAACTCCTC
AGCCATCGACAAGGACACCTGTTT
GCTGTACATGCTTTGGAATCTG
başlangıç
uzunluk
Tm
%GC oranı amplikon
bölgesi
758
21 61,833
47,619
1012
22 61,933
45,455
255
447
21 61,851
42,857
701
19 61,916
47,368
255
217
22 61.792
50
474
22 61.906
45.455
258
427
22 62,206
50
640
19 62,218
47,368
214
301
21 62,442
47,619
520
22 61,934
50
220
1435
22 61,975
50
1696
22 62,274
45,455
262
219
22 62,054
45,455
245
30 67,632
43,333
310
21 61,867
47,619
92
1071
22 62,228
45,455
1097
24 67,944
50
1187
25 62,161
40
117
2964
21 62,421
47,619
3000
24 67,657
50
3063
25 62,095
44
100
213
19 62,188
57,895
246
24 67,988
54,167
332
19 62,245
52,632
120
322
21 61,872
52,381
364
24 68,082
50
421
22 61,797
45,455
100
Tablo 1: PCR yönteminde kullanılan primerler
53
3.9. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU
3.9.1. SYBR Green I
Seçilen CHRNA3 (NM_000743), CHRNA5 (NM_000745), CHRNA7
(NM_000746), CHRNB2 (NM_000748), CHRNB4 (NM_000750) ve housekeeping
gen olarak 18S ribosomal RNA (X03205) genleri LightCycler DNA Master SYBR
Green I kiti ile Roche LightCycler 1,5 cihazında kapiller sistemde çalıĢıldı. Tablo
2„de her gen için ayrı ayrı belirtilen miktarlarda primerler, MgCl2, cDNA ve Taq
DNA polimeraz, reaksiyon tamponu, dNTP karıĢımı, SYBR Green boyası ve 10mM
MgCl2 içeren 10X konsantrasyondaki SYBR Green Masterdan eklendi ve toplam
hacim 20 µl olacak Ģekilde PCR grade su ile tamamlandı. Hazırlanan kapiller
4000g‟de 15 saniye santrifüj edildi ve cihaza yerleĢtirildi. Floresan kanalı 530nm
olarak seçildi, örnek isimleri girildi, cihaz tipi seçildi, tablo 2‟de belirtilen Ģekilde
PCR koĢulları yazıldı. ĠĢlem bitiminde analizler yapıldı.
54
primer
konsantrasyonu
CHRNA3
NM_000745
CHRNA5
NM_000745
CHRNA7
NM_000746
CHRNB2
NM_000748
CHRNB4
NM_000750
18sRNA
X03205
Tablo
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Antisense
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.4 µM
0.2 µM
0.2 µM
2:
Mg+2
miktarı
cDNA
miktarı denatürasyon
PCR kosulları
amplifikasyon (45 döngü)
denatürasyon bağlanma uzama
erime eğrisi
denatürasyon bağlanma
erime
soğuma
3.5mM
50ng
95 ˚C 30 sn
95 ˚C 0 sn
60 ˚C 5 sn
72 ˚C 11 sn
95 ˚C 0 sn
65 ˚C 15 sn
95˚C 0 sn
40˚C 30 sn
2mM
50ng
95 ˚C 30 sn
95 ˚C 0 sn
56 ˚C 5 sn
72 ˚C 11 sn
95 ˚C 0 sn
65 ˚C 15 sn
95˚C 0 sn
40˚C 30 sn
3.5mM
100ng
95 ˚C 30 sn
95 ˚C 0 sn
60 ˚C 5 sn
72 ˚C 11 sn
95 ˚C 0 sn
65 ˚C 15 sn
95˚C 0 sn
40˚C 30 sn
1.75mM
50ng
95 ˚C 30 sn
95 ˚C 0 sn
60 ˚C 5 sn
72 ˚C 11 sn
95 ˚C 0 sn
65 ˚C 15 sn
95˚C 0 sn
40˚C 30 sn
2mM
50ng
95 ˚C 30 sn
95 ˚C 0 sn
60 ˚C 5 sn
72 ˚C 11 sn
95 ˚C 0 sn
65 ˚C 15 sn
95˚C 0 sn
40˚C 30 sn
2mM
25ng
95 ˚C 30 sn
95 ˚C 0 sn
60 ˚C 5 sn
72 ˚C 11 sn
95 ˚C 0 sn
65 ˚C 15 sn
95˚C 0 sn
40˚C 30 sn
SYBR
Green
PCR
Koşulları
3.9.2. TaqMan Probları
BCL2L1 (NM_138578), SGK1 (NM_001143677), NFKB1 (NM_001165412),
GILZ (NM_001015881), KLF11 (NM_001177716) genleri ve referans olarak Roche
housekeeping gen G6PD (Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz) (Catalog Assay
05532957001-assay ID 102098) “LightCycler 480 Probes Master kiti” ile Light
Cycler 480 cihazında çalıĢıldı.
Tablo 3„de belirtildiği gibi toplam hacim 17 µl olacak Ģekilde hazırlanıp Tablo
4„de belirtilen Ģekilde PCR programı uygulandı.
Referans gen olarak 4 µl G6PD kullanılarak total hacim 17 µl‟ye tamamlandı.
Stok konsantrasyon
Sense
8 µM
Antisense 8 µM
Prob
2 µM
master
mix
2x
cDNA
Su
Total
Son konsantrasyon
0.4 µM
0.4 µM
0.1 µM
2x
Miktar
1 µl
1 µl
1 µl
8.5 µl
4 µl
1.5 µl
17 µl
50 ng
Tablo 3: Taqman PCR için gerekli olan bileşikler ve miktarları
Program
döngü
sıcaklık (˚C)
süre
belirleme
inkübasyon
1
amplifikasyon
45
soğutma
1
95
95
59
72
40
07 dk
10 sn
30 sn
01 sn
10 sn
yok
yok
yok
tek
yok
artış oranı
(˚C/s)
4.4
4.4
2.2
4.4
4.4
Tablo 4: Taqman PCR koşulları
3.10. ĠSTATĠSTĠK
Bulgular SPSS 16 istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. Retinoik asit
uygulamasıyla faklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücre kültürlerinde nikotinik
asetilkolin reseptörler genlerinin ekspresyon analizleri için Bağımsız T-Testi
uygulandı. Deney grupların ortalamaları arasındaki farkın istatiksel olarak
56
anlamlılığını değerlendirmek için Tek örneklem T-Testi kullanıldı. Deney grupları
her gen için tek tek incelenirken bağımsız değiĢkende çok sayıda grup olduğu için
ANOVA yapıldı. Tüm istatiksel analizlerde anlamlılık değeri p<0,05 olarak alındı.
4. BULGULAR
4.1. FARKLILAġTIRMA
SH-SY5Y hücre hattının farklılaĢtırılması için yaygın olarak kullanılan retinoik
asit uygulandı. Hücreler 96 kuyucuklu hücre kültür kabına 2x104 hücre/kuyucuk
ekildikten 5 gün sonra 10 µM retinoik asit uygulandı ve retinoik asit uygulamasından
sonra üçüncü günde fotoğrafları çekildi. Retinoik asit uygulamasında üçüncü gün
itibariyle hücrelerde nöroblast benzeri hücreler gözlendi. Aksonal uzamanın olduğu
ıĢık mikroskobu ile fark edilebilir düzeydedir. Kontrol grubunda ise hücrelerin
kümeler halinde bulunduğu gözlendi.
ġekil 16: SH-SY5Y hücreleri görüntüsü A:10X retinoik asit, B: 20X retinoik asit, C: 40X retinoik asit, D:
10X kontrol, E: 20X kontrol.
4.2. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ
FarklılaĢtırma yöntemi uygulanan ve kontrol amaçlı olarak yöntem
uygulanmayan hücrelerden izole edilen RNA agoroz jel ektroforezi yapılarak
kalitatif olarak analiz edildi. UV (ultraviyole) ıĢık altında görüntü alındı. %1‟lik
57
agoroz jel TAE tamponu içinde 70 voltta 2 saat yürütüldü. RNA izolasyonu sırasında
herhangi bir sorun olmadığı alınan jel görüntüsünde bantların oluĢumu ile
doğrulanmıĢtır.
ġekil 17: RNA jel elektroforez görüntüsü
4.3. PCR
4.3.1. SYBR GREEN I
Nikotinik asetilkolin reseptörünü kodlayan genlerden seçilmiĢ olanlara
(CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB2, CHRNB4 ve housekeeping gen olarak
18S ribosomal RNA), retinoik asit uygulaması ile farklılaĢtırılmıĢ ve kontrol için
farklılaĢtırılmamıĢ olan hücre kültürlerindeki ekspresyon düzeyine bakmak amacıyla
sybr green boyası kullanılarak real time PCR yöntemi uygulanmıĢtır. ġekil 18‟de α3,
α7 ve β2 genleri için PCR optimizasyonuna dair erime eğrileri görülmektedir.
58
ġekil 18: Sybr green PCR optimizasyonu erime eğrileri
SH-SY5Y hücre hattına retinoik asit uygulaması yapılarak hücreler nöron
hücrelerine farklılaĢtırılmıĢlardır. Bu farklılaĢtırılan ve farklılaĢtırılmayan (kontrol)
hücrelerde nikotinik asetilkolin reseptör genlerin ekspresyon farklarına bakmak için
sybr-green boyası kullanılarak real-time PCR uygulaması yapılmıĢtır(ġekil
19).FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücrelerde bazal ektresyon sonuçları Ģekil
20‟de gösterilmiĢtir. α3, α5 ve β2 genleri için istatistiksel olarak anlamlı azalma
görülmüĢtür
α3 (M=3.825; SD=2.683; SEM=1.014; t(13)= -1.266; p=0.048); α5 (M=3.462;
SD=2.303; SEM=0.87; t(13)= -0.336; p=0.031); β2 (M=4.854; SD=2.753;
SEM=1.04; t(13)= -3.266; p=0.006).
59
ġekil 19: SH-SY5Y hücrelreinde farklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücre kültürlerinde nikotinik
asetilkolin reseptör gen anlatımları
ġekil 20: FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücrelerde bazal ektresyon sonuçları
60
4.3.2. Deney Gruplarına Göre Genlerde Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları
Glukortikoid ile aktive olduğu bilinen genler (BCL2L1, SGK1, NFKB1, GILZ,
KLF11) üzerinde deney grupları tasarlanmıĢ ve ilaçlar uygulanmıĢtır.
ġekil 21: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine deksametazon uygulaması
Yapılan PCR sonucunda beĢ gen için de deksametazonun yüksek dozunda
(100nM) anlamlı artıĢ görülmektedir. 24 saatlik 100nM deksametozun uygulaması
BCL2L geninde anlamlı göstermiĢtir (M=1.2900E2; SD=13.41; SEM=5.07; t(6)=
5.719; p=0.001). SGK1 geninde yine anlamlı bir artıĢ görülmektedir (M=1.3443E2;
SD=13.68; SEM=5.17; t(6)= 6.656; p=0.001). KLF11 geni için (M=1.1500E2;
SD=14.22; SEM=5.37; t(6)= 2.790; p=0.032), NFKB1 geni için (M=1.8112E2;
SD=29.76; SEM=11.24; t(6)= 7.21; p=0.000). Bu uygulama GILZ geninde
deksametazonun iki dozu için de anlamlı artıĢa neden olmustur. Deksametazon 10nM
(M=1.1733E2; SD=10.51; SEM=4.29; t(5)= 4.036; p=0.010), deksametazon 100nM
(M=1.6471E2; SD=24.28; SEM=9.17; t(6)= 7.051; p=0.000).
61
ġekil 22: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine nikotin uygulaması
Nikotin uygulamasında SGK1 geni hariç diğer genlerde düĢük doz
uygulamasında daha çok artıĢ varken yüksek doz nikotin uygulamasında daha az artıĢ
görülmüĢtür. SGK1 geninde ise doz uygulaması arttıkça gen anlatımı artmıĢtır. 50
nM dozunda tüm genlerde anlamlı artıĢ görüldü. BCL2L (M=1.2446E2; SD=14.60;
SEM=5.518; t(6)= 4.433; p=0.004), GILZ (M=1.3432E2; SD=34.16; SEM=12.91;
t(6)= 2.658; p=0.038), SGK1 (M=1.2573E2; SD=27.56; SEM=10.41; t(6)= 2.470;
p=0.048), KLF11 (M=1.2326E2; SD=19.36; SEM=7.31; t(6)= 3.178; p=0.019),
NFKB1 (M=1.7568E2; SD=52.87; SEM=19.98; t(6)= 3.787; p=0.009). Nikotin
300nM dozunda BCL2L (M=1.1587E2; SD=13.60; SEM=5.55; t(5)= 2.857;
p=0.036) ve SGK (M=1.5823E2; SD=25.24; SEM=10.30; t(5)= 5.651; p=0.002)
genleri hariç artıĢ görülmedi.
24 saatlik deksametazon ve nikotinin her iki dozunun kombinasyonları Ģeklindeki
uygulamada GILZ geni hariç diğer genlerde artıĢlar görülmektedir.
BCL2L için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.0832E2; SD: 5.42;
SEM: 1.45; t(13)= 5.738; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM dozunda
62
istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.080). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.1147E2; SD: 9.62; SEM: 3.636; t(6)= 3.155; p=0.020).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.0739E2; SD: 4.85; SEM: 1.98; t(5)=
3.731; p=0.014). SGK1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.6318E2; SD:
13.47; SEM: 5.09; t(6)= 12.407; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M:
1.4979E2; SD: 33.74; SEM: 12.75; t(6)= 3.904; p=0.008). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.6835E2; SD: 13.87; SEM: 5.24; t(6)= 13.030; p=0.000).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.5338E2; SD: 35.75; SEM: 14.59; t(5)=
3.657; p=0.015).
KLF11 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M:1.2022E2; SD:11.85;
SEM:4.47; t(6)= 4.513; p=0.004). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M:
1.2404E2; SD: 14.91; SEM: 5.63; t(6)= 4.265; p=0.005). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.2283E2; SD: 12.69; SEM: 4.79; t(6)= 4.757; p=0.003).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.2509E2; SD: 20.28; SEM: 8.28; t(5)=
3.029; p=0.029).
NFKB1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.2772E2; SD: 20.71;
SEM: 7.83; t(6)= 3.540; p=0.012). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M:
1.2871E2; SD: 18.97; SEM: 7.17; t(6)= 4.003; p=0.007). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.2896E2; SD: 26.30; SEM: 9.94; t(6)= 2.913; p=0.027).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM bu yüksek dozlarda uygulamada NKFB1 için
anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.084).
63
ġekil 23: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin
uygulaması
24 saatlik deksametazon ve nikotinin her iki dozunun kombinasyonları
Ģeklindeki uygulamada GILZ geni hariç diğerlerinde artıĢlar görülmektedir.
BCL2L için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.0832E2; SD: 5.42;
SEM: 1.45; t(13)= 5.738; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM dozunda
istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.080). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.1147E2; SD: 9.62; SEM: 3.636; t(6)= 3.155; p=0.020).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.0739E2; SD: 4.85; SEM: 1.98; t(5)=
3.731; p=0.014).
SGK1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.6318E2; SD: 13.47;
SEM: 5.09; t(6)= 12.407; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M:
1.4979E2; SD: 33.74; SEM: 12.75; t(6)= 3.904; p=0.008). Deksametazon
64
100nM+nikotin 50nM (M: 1.6835E2; SD: 13.87; SEM: 5.24; t(6)= 13.030; p=0.000).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.5338E2; SD: 35.75; SEM: 14.59; t(5)=
3.657; p=0.015).
KLF11 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M:1.2022E2; SD:11.85;
SEM:4.47; t(6)= 4.513; p=0.004). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M:
1.2404E2; SD: 14.91; SEM: 5.63; t(6)= 4.265; p=0.005). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.2283E2; SD: 12.69; SEM: 4.79; t(6)= 4.757; p=0.003).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.2509E2; SD: 20.28; SEM: 8.28; t(5)=
3.029; p=0.029).
NFKB1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.2772E2; SD: 20.71;
SEM: 7.83; t(6)= 3.540; p=0.012). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M:
1.2871E2; SD: 18.97; SEM: 7.17; t(6)= 4.003; p=0.007). Deksametazon
100nM+nikotin 50nM (M: 1.2896E2; SD: 26.30; SEM: 9.94; t(6)= 2.913; p=0.027).
Deksametazon 100nM+nikotin 300nM bu yüksek dozlarda uygulamada NKFB1 için
anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.084)
65
ġekil 24: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin
+ mekamilamin uygulaması
Nikotin antagonisti mekamilaminin deksametazon+nikotin içeren hücre
kültürlerine 24 saatlik uygulama sonucu tüm genlerde kontrol grubuna göre artıĢ
gözlenmektedir.
BCL2L için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.0864E2; SD: 7.38; SEM: 2.04; t(12)= 4.215; p=0.001). Deksametazon 10nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.1043E2; SD: 6.57; SEM: 2.48; t(6)=
4.197; p=0.006). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.3277E2; SD: 13.92; SEM: 5.26; t(6)= 6.228; p=0.001). Deksametazon 100nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2591E2; SD: 5.64; SEM: 2.13; t(6)=
12.144; p=0.00).
GILZ için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.2919E2; SD: 17.007; SEM: 6.94; t(5)= 4.204; p=0.008). Deksametazon 10nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM ygulamasında anlamlı bir artıĢ gözrülmedi
(p= 0.062). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
66
1.3731E2; SD: 17.62; SEM: 6.66; t(6)= 5.602; p=0.001). Deksametazon 100nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2620E2; SD: 19.99; SEM: 7.55; t(6)=
3.466; p=0.013).
SGK1 için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.8025E2; SD: 31.98; SEM: 13.05; t(5)= 6.145; p=0.002). Deksametazon 10nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.6371E2; SD: 18.94; SEM: 7.15; t(6)=
8.898; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.3627E2; SD: 7.82; SEM: 2.95; t(6)= 12.263; p=0.00). Deksametazon 100nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2369E2; SD: 24.18; SEM: 9.14; t(6)=
2.592; p=0.041).
KLF11 için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.4202E2; SD: 21.68; SEM: 8.85; t(5)= 4.747; p=0.005). Deksametazon 10nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.3079E2; SD: 22.77; SEM: 8.60; t(6)=
3.577; p=0.012). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.4916E2; SD: 20.13; SEM: 7.61; t(6)= 6.460; p=0.01). Deksametazon 100nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.4711E2; SD: 17.99; SEM: 6.80; t(6)=
6.927; p=0.00).
NFKB1 için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.5368E2; SD: 33.29; SEM: 13.59; t(5)= 3.950; p=0.011). Deksametazon 10nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.5854E2; SD: 25.71; SEM: 9.71; t(6)=
6.025; p=0.001). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M:
1.8421E2; SD: 35.75; SEM: 13.51; t(6)= 6.231; p=0.01). Deksametazon 100nM +
nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.7155E2; SD: 23.21; SEM: 8.77; t(6)=
8.153; p=0.00).
67
ġekil 25: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin
+ SP600125 uygulaması
MAPK ailesinin bir üyesi JNK‟ya inhibitör olarak geliĢtirilmiĢ bir bileĢik olan
SP600125, 24 saat farklı dozlarda deksametazon + nikotin içeren farklılaĢtırılmıĢ
SH-SY5Y hücre kültürlerine uygulandı ve glukokortikoid ile aktive olduğu bilinen
genler üzeirndeki etkisi incelendi.
BCL2L geninde bu uygulamada farklı dozların tümünde artıĢ görülmüĢtür.
deksametazon 10nM + nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 1.1307E2; SD: 7.88;
SEM: 2.10; t(13)= 6.199; p=0.000). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM +
SP600125 10 µM (M: 1.2444E2; SD: 13.42; SEM: 5.07; t(6)= 4.819; p=0.003).
Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 1.0796E2; SD: 7.04;
SEM: 2.66; t(6)= 2.989; p=0.024). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM +
SP600125 10 µM (M: 1.1756E2; SD: 7.61; SEM: 2.87; t(6)= 6.098; p=0.001).
SGK1 geni için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M:
65.38;
SD:
30.68;
SEM:
11.59;
t(6)=
-2.985;
p=0.024).
Deksametazon
68
100nM+nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 70.87; SD: 9.69; SEM: 3.66; t(6)= 7.948; p=0.000). Bu gruplarda azalma görülmüĢtür.
ġekil 26: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin
+ kenpaullone uygulaması
Kenpaullone bazı CDK‟larda ATP yarıĢmalı inhibitördür. Glukokortioid
reseptörü fosforillenmesinde görev alan CDK5 inhibirötü olarak kenpaullone,
deksametazon + nikotin içeren SH-SY5Y hücre kültürüne 24 saat uygulanmıĢtır.
Dekzametazon, nikotin ve kenpauollone birlikte uygulanması sonucunda SGK1
geninde farklı dozları içeren gruplarda artıĢ, KLF11 geninde tüm dozlarda azalma
gözlenirken diğer genlerde herhangi anlamlı bir değiĢim olmamıĢtır.
SGK1; deksametazon 10nM + nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M:
1.6228E2; SD: 24.79; SEM: 9.37; t(6)= 6.646; p=0.001). Deksametazon 10nM +
nikotin 300nM + kenpaullone 2µM (M: 1.4194E2; SD: 13.31; SEM: 5.03; t(6)=
69
8.335; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M:
1.3195E2; SD: 19.05; SEM: 7.20; t(6)= 4.435; p=0.004).
KLF11; deksametazon 10nM + nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M: 69.42;
SD: 20.43; SEM: 7.72; t(6)= -3.959; p=0.007). Deksametazon 10nM + nikotin
300nM + kenpaullone 2µM (M: 70.42; SD: 5.66; SEM: 2.14; t(6)= -13.821;
p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M: 75.13; SD:
9.96; SEM: 3.76; t(6)= -6.600; p=0.001). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM +
kenpaullone 2µM (M: 71.40; SD: 11.86; SEM: 4.48; t(6)= -6.378; p=0.001).
4.3.3. Seçilen Genlere Göre Deney Gruplarında Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları
4.3.3.1. BCL2L
Bağımsız değiĢkende çok sayıda grup olduğu için istatistik değerlendirmesi için
Anova yapıldı: t(20)= 6.745; p=0.000.
Bcl2l geninde deksametazon 100nM (p=0.000) ve nikotin 50nM (p=0.000) kontrol
grubuna göre anlamlı artıĢ gösterdi. Stres ile aktive olduğu bilinen bu genin
deksametazon 100nM ile aktive olduğu görülmüĢ nikotinin her iki dozunda da artıĢ
göstermesi nikotinin aynı yolak üzerinden etki edebileceğini gösterdi. Deksametazon
100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) ve Deksametazon 100nM
+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) uygulamalarında kontrol
grubuna göre anlamlı artıĢ görüldü. Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti
mekamilaminin nikotin ile birlikte uygulanması nikotin etkisini bloklamıĢ ve
deksametazon 100nM etkisini göstererek istatistiksel anlamlı artıĢ görüldü.
Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.024), deksametazon
10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000), deksametazon 100nM +
Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.029) gruplarında kontrol grubuna göre
istatistiksel anlamlı artıĢ görüldü.
Deksametazon 100nM + Nikotin 50 nM grubuna göre deksametazon 100nM +
Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubunda (p=0.018) anlamlı artıĢ görüldü.
Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grunbuna göre
deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000) ve
70
deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.002) gruplarında
anlamlı artıĢ görüldü.
Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM grubuna göre
Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.050) grubunda
anlamlı artıĢ görüldü.
71
ġekil
27:
FarklılaĢtırılmıĢ
SH-SY5Y
hücrelerinde
deney
gruplarına
göre
BCL2L
gen
ekspresyon
Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh
10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh
2uM
Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 300 nM
Dex 100nM+Nic 50 nM
Dex 10nM+Nic 300 nM
Dex 10nM+Nic 50 Nm
nic 300nM
nic 50nM
dex100nM
dex 10nM
kontrol
BCL2L
160
140
120
100
80
60
40
20
0
seviyeleri
72
4.3.3.2. GILZ
Anova yapıldı: t(20)= 4.011; p=0.000.
Gilz geninde deksametazon 100nM uygulamasında kontrol grubuna göre gen
düzeyinde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.000).
Deksametazonun 10 nM ile Deksametazon 100nM‟a bakıldığında artan dozunun
uygulanmasında gen düzeyinde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.032).
Deksametazon 100nM uygulanan grup deksametazona ilaveten nikotin de
uygulandığında nikotin uygulanan gruplarda sadece deksametazon uygulanan gruba
göre gilz geninde anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM
(p=0.000), deksametazon 10nM+ nikotin 300nM (p=0.014). Benzer Ģekilde
deksametazon 100nM grubuna nikotin ile birlikte kenpaullone eklenmesiyle gilz
geninde anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM +
Kenpaullone 2µM (p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM +
Kenpaullone 2µM (p=0.000). Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125
10µM (p=0.002) grubunda deksametazon 100nM grubuna göre anlamlı azalma
vardır.
73
ġekil
28:
FarklılaĢtırılmıĢ
SH-SY5Y
hücrelerinde
deney
gruplarına
göre
GILZ
gen
ekspresyon
Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 300 nM
Dex 100nM+Nic 50 nM
Dex 10nM+Nic 300 nM
Dex 10nM+Nic 50 Nm
nic 300nM
nic 50nM
dex100nM
dex 10nM
kontrol
GILZ
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
seviyeleri
74
4.3.3.3.KLF11
Anova yapıldı: t(20)= 13.823; p=0.000.
Klf11 geninde Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM
(p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.024),
Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) ve
Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000)
gruplarında anlamlı artıĢ görülmüĢtür. Sadece nikotin ya da sadece deksametazon
uygulamasında
anlamlı
artıĢ
görülmezken
bu
deksametazon,
nikotin
ve
mekamilaminin birlikte uygulanmasında artıĢ görülmesi mekamilaminin bu gende
artıĢı etkileyebileceğini düĢündürdü.
Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.026) ve
Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.039) gruplarında
kontrol grubuna göre anlamlı azalma görüldü.
Deksametazon 10nM grubu deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + mekamilamin
10µM ile kıyaslandığında nikotin ve mekamilamin eklenen grupta artıĢ görüldü
(p=0.002). Benzer Ģekilde deksametazon 100nM grubu deksametazon 100nM +
Nikotin 50nM + mekamilamin 10µM grubu ile kıyaslandığında nikotin ve
mekamilamin eklenmesinde Bcl2l geninde anlamlı artıĢ oldu (p=0.044).
Nikotin
ve
Kenpaullene
eklenmesi
deksametozon
100nM
grubuna
göre
karĢılastırıldığında Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM
(p=0.005) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM
(p=0.001) istatistiksel anlamlı azalma görüldü.
Nikotin 50nM tek baĢına uygulanması ve deksametazon, nikotin, kenpaullone
birlikte uygulandığı gruplara bakıldığında tek baĢına nikotin uygulamasına göre
anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM
(p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000).
Benzer etki nikotin 300nM dozunda da görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin
300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.018), Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM +
Kenpaullone 2µM (p=0.025).
75
Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM grubuna kenpaullone eklendiğinde anlamlı
azalma görüldü (p=0.000). Benzer etki Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM
(p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM (p=0.000) ve Deksametazon
100nM + Nikotin 300nM (p=0.000) gruplarında da görüldü.
Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubu kenpaullone ya
da SP600125 eklenen gruplar ile karĢılaĢtırıldığında anlamlı azalma görüldü.
Deksametazon
10nM
+
Nikotin
50nM
+
Kenpaullone
2µM
(p=0.000),
Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.001). Benzer Ģekilde
Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM ve Deksametazon
100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM grubunda da kenpaullone ya da
SP600125 eklenen gruplar ile karĢılaĢtırıldığında anlamlı azalma görüldü.
Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000),
Deksametazon
100nM
+
Nikotin
50nM
+
SP600125
10µM
(p=0.000).
Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000),
Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000).
Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM grubu kenpaullone
eklenen grup ile karĢılaĢtırıldığında anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM +
Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000).
Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM grubu ile Deksametazon
10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM grupları karĢılaĢtırıldığında SP600125
içeren grupta anlamlı artıĢ görüldü (p=0.002).
76
ġekil
29:
FarklılaĢtırılmıĢ
SH-SY5Y
hücrelerinde
deney
gruplarına
göre
KLF11
gen
ekspresyon
Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 300 nM
Dex 100nM+Nic 50 nM
Dex 10nM+Nic 300 nM
Dex 10nM+Nic 50 Nm
nic 300nM
nic 50nM
dex100nM
dex 10nM
kontrol
KLF11
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
seviyeleri
77
4.3.3.4.NFKB1
Anova yapıldı: t(20)= 6.760; p=0.000.
NFKB1 geninde deksametazon 100nM (p=0.000) ve nikotin 50nM (p=0.000) kontrol
grubuna göre anlamlı artıĢ gösterdi. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM +
Mekamilamin 10µM (p=0.026) ve Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM +
Mekamilamin 10µM (p=0.003) uygulamalarında kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ
görüldü. Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) ve
Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000).
Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti mekamilaminin nikotin ile birlikte
uygulanması nikotin etkisini bloklar, deksametzonun 10nM dozu uygulamasında
kontrol gubuna göre artıĢ görülmezken mekamilamin nikotinini bloklamasına
rağmen deksametazon ve nikotin birlikte uygulamasında kontrol grubunda
istatistiksel anlamlı artıĢ görüldü.
Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubu ile
Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM kıyaslandığında
p=0.000 anlamlı azalma olduğu görüldü. Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM +
Mekamilamin 10µM ile Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM
kıyaslandığında p=0.010 azalma görüldü.
Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM ile Deksametazon
100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubu karĢılaĢtırıldığında p=0.000
artıĢ görüldü.
78
ġekil
30:
FarklılaĢtırılmıĢ
SH-SY5Y
hücrelerinde
deney
gruplarına
göre
NFKB1
gen
ekspresyon
Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 300 nM
Dex 100nM+Nic 50 nM
Dex 10nM+Nic 300 nM
Dex 10nM+Nic 50 Nm
nic 300nM
nic 50nM
dex100nM
dex 10nM
kontrol
NFKB1
250
200
150
100
50
0
seviyeleri
79
4.3.3.5.SGK1
Anova yapıldı: t(20)= 13.212; p=0.000.
Sgk1 geninde deksametazon 100nM uygulamasında gen düzeyinde anlamlı artıĢ
görüldü (p=0.24). Nikotin 300nM uygulamasında artıĢ görüldü (p=0.000).
deksametazon ve nikotinin birlikte uygulandığı tüm gruplarda artıĢ görüldü.
Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin
300nM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM (p=0.000), Deksametazon
100nM+ Nikotin 300nM (p=0.000). Deksametazon nikotin ve mekamilamin içeren
gruplarda deksametazon ve nikotinin yüksek dozunu içeren grup haricinde diğer
gruolarda Sgk1 geninde kontrol grubuna göre artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM+
Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin
300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM +
Mekamilamin 10µM (p=0.020). Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM +
Kenpaullone 2µM (p=0.001) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM +
Kenpaullone 2µM (p=0.023) gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ görüldü.
Deksametazon 10 nM içeren gruba göre Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM içeren
grupta Sgk1 geninde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.004). Deksametazon 10 nM içeren
gruba göre Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000),
Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.004)gruplarında
artıĢ görüldü.
Deksametazon 10 nM içeren gruba göre Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM +
SP600125 10µM (p=0.000) grubunda Sgk1 gen düzeyinde azalma görüldü.
Nikotin 50 nM grubuna göre Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin
10µM (p=0.020)grubunda anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin
50nM + SP600125 10µM (p=0.001) grubunda azalma görüldü, nikotin dozunun
artırılmasıyla bu azalmanın ortadan kalktığı görüldü; deksametazon dozunun
artırılmasıyla yine anlamlı bir azalma görüldü. Deksametazon 10onM+ Nikotin
50nM + SP600125 10µM (p=0.007).
80
Nikotin 300 nM grubuna göre deksametazon ve SP600125 eklenmesiyle Sgk1
geninde azalma görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM
(p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.001).
Deney gruplarına SP600125 eklenmesiyle Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM
içeren gruba göre anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM +
SP600125 10µM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + SP600125
10µM (p=0.000). Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + SP600125 10µM
(p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000).
Benzer sonuçlar deksametazon ve nikotin farklı konsantrasyonlarını içeren diğer
gruplar ile karĢılaĢtırıldığında da görüldü.
Genel olarak deksametazon, nikotin ve SP600125 içeren grup; deksametazon, nikotin
ve mekamilamin içeren deney grubu ile karĢılaĢtırıldığında azalma olduğu görüldü
(deksametazon ve nikotin yüksek dozunu içeren grup hariç).
Genel olarak deksametazon, nikotin ve SP600125 içeren grup; deksametazon, nikotin
ve kenpaullone içeren deney grubu ile karĢılaĢtırıldığında azalma olduğu görüldü
(deksametazon
ve
nikotin
yüksek
dozunu
içeren
grup
hariç)
81
ġekil
31:
FarklılaĢtırılmıĢ
SH-SY5Y
hücrelerinde
deney
gruplarına
göre
SGK1
gen
ekspresyon
Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM
Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM
Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM
Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM
Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM
Dex 100nM+Nic 300 nM
Dex 100nM+Nic 50 nM
Dex 10nM+Nic 300 nM
Dex 10nM+Nic 50 Nm
nic 300nM
nic 50nM
dex100nM
dex 10nM
kontrol
SGK1
250
200
150
100
50
0
seviyeleri
82
5. TARTIġMA
Bu tez çalıĢmasında SH-SY5Y hücre hattı kullanılarak in vitro stres modelinde
nikotinin glukokortikoid ile aktive olan genlerin ekspresyonuna olan etkisi
araĢtırılmıĢtır.
SH-SY5Y, nöronal hücre araĢtırmalarında yaygın olarak kullanılan hücre
hattıdır. Nöroblastoma hücrelerinin farklılaĢabilmesi sinirbilim araĢtırmaları için bir
avantaj oluĢturmaktadır. Bu farklılaĢmayı indüklemek için kullanılan ajanlar arasında
retinoik asit, forbol esterleri ve dibütiril cAMP bulunur. Bunların yanı sıra BDNF,
NGFgibi büyüme faktörleriyle nörogulinler de kullanılmaktadır. Bu tez çalıĢmasında
SH-SY5Y hücrelerini nörona farklılaĢtırmak için yaygın olarak kullanılan ajan
retinoik asit uygulanmıĢtır. FarklılaĢtırılmayan hücreler (kontrol grubu) non-polarize
hücre gövdesine sahip ve kümeler halinde büyüme eğilimi göstermiĢtir. Retinoik asit
uygulamasıyla farklılaĢtırılan hücrelerde dendritik uzuntılar görülmüĢ, çoğalma
hızlarının
yavaĢladığı
ve
kümeler
halinde
çoğalmadıkları
belirlenmiĢtir.
FarklılaĢtırma daha önceki çalıĢmalarda da gösterildiği gibi nöritlerin uzaması ve
formasyonu, nörotransmiter reseptörlerindeki değiĢim Ģeklinde gösterilmiĢtir.
Ligand kapılı iyon kanalı oluĢturan nikotinik asetilkolin reseptörleri SH-SY5Y
hücrelerinde bulunmakta ve insan ganglion tipi nAChR analoğu kabul edilmektedir.
SH-SY5Y hücrelerinin ve α3, α5, α7, β2 ve β4 nAchR genlerini eksprese ettiği daha
önceki çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. α (α2- α8) ve β (β2- β4) altbirimleri farklı
kombinasyonda bir araya gelerek bulunabilirler. SH-SY5Y hücrelerinde bulunan
nAchR alt birim kombinasyonları tam olarak bilinmemekle birlikte α3β2, α3β4,
α3β4α5, α3β2α5, ve α3β2β4α5olası kombinasyonlardır[56].FarklılaĢtırılan ve
farklılaĢtırılmayan hücre kültürlerinde bu nikotinik asetilkolin reseptör gen
ekspresyonlarına sybr green boyası kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapılmıĢ ve α3,
α5 ve β2 genleri için istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmüĢtür.SH-SY5Y
hücrelerinde bulunan nAchR, nikotine desensitize yanıt gösterir fakat primer
nöronlardaki reseptör aktivasyonuna benzer Ģekilde yıkamayı takiben yeniden
sensitize hale gelir[50].
Sıçanlarda yapılan kronik kısıtlama stresi deneyinde glukokoritikoid agonisti
RU28,362 ya da kortikosteron 7 gün uygulanmıĢ, nAchRα7 mRNA ve protein
hipokampal eksresyon seviyesi
125
I α-Bungarotoksin otoradyografi ile ölçülmüĢtür.
83
Kronik stres sonucunda nAchRα7 protein seviyesi düĢerken, aynı çalıĢmada mRNA
seviyesinin CA1, CA3 vedentat girus bölgelerinde arttığı bulunmuĢtur. Kronik stres
ürünlerinde hipokampal formasyondaki reseptörlere bağlanma azalırken nAchRα7
mRNA‟sında önemli artıĢ gösterilmiĢtir. Bunun sonuçallostatik aĢırı yüklenme ya da
strese karĢı hipokampal adaptasyonlarda nAchRα7‟nin önemli rol oynayabileceğini
göstermektedir.
Stres,
nAchRα7proteininintrafiğini
ve
posttranslasyonel
modifikasyonunu değiĢtirebilir. Diğer yandan stres sırasında reseptörlerin uyarı
düzeyiyle bağlantılı olarak mRNA düzeylerinin doğrudan artabildiği (up-regulation)
gösterilmiĢtir. [57]
Stres
yanıtı,
karĢılaĢtığında,
canlıların
homeostatik
yaĢamda
dengesini
kendisini
korumak
tehdit
için
eden
geliĢtirdiği
durumlarla
bir
dizi
mekanizmadan oluĢmaktadır. Psikolojik, enfeksiyöz ve travmatik her türlü stres CRH
nöronlarını aktive eder. HPA ekseninin son ürünü olan glukokortikoid hormonlar,
stres karĢısında geliĢtirilen adaptif süreçlerde hayati rol oynar. Bu süreçler metabolik,
immün, nöral ve davranıĢsal mekanizmalardır. HPA ekseni boyunca GC sentezlenir.
Glukokortikoidler mekanik, kimyasal, enfeksiyöz ve immunolojik uyarıların neden
olduğu inflamasyonu engelleyen ve baskılayan en güçlü ve etkili ajanlardır.
Fizyolojik Ģartlarda endokrin ve metabolik süreçlere GRE‟lerin DNA‟ya bağlanması
(transaktivasyon) aracılık eder. Glukokoritkoidlerin birçok antiinflamatuar etkisi ise
transkripsiyon faktörlerinin inhibisyonuyla (transrepresyon) olur. Glukokortikoidler
lipofilik özellikleri sayesinde plazma membranından difüze olabilirler ve intraselüler
GRα‟ya bağlanırlar.
Glukokortikoidler tarafından doğrudan regüle edilen 10 ila 100 gen olduğu
düĢünülmektedir. Glukokortikoid-GR kompleksinin antiinflamatuar proteinler ya da
daha önemlisi transrepresyon mekanizmalarında indirek gen düzenleme etkilerinin
olduğu gösterilmiĢtir. Bu mekanizmalar nüklear faktör- κB ya da aktivatör protein 1
gibi proinflamatuar transkripsiyonel faktörlerin, MAPK‟lar gibi enzimlerin
destabilizasyonu ve inflamatuar süreçte hücre çoğalması inhibisyonunu içerir.
Glukokortikoidler, etkilerini glukokortikoid resptörlerine bağlanıp bu reseptörü
aktive ederek gösterirler. Glukokortikoid reseptörleri MAPK, CDK ve GSK-3β gibi
kinazlar tarafından fosforillenir ve fosforillenen dimerize GR nukleusa geçerek hedef
genlerde transkripsiyonel aktivite değiĢikliklerine neden olur [7]. CDK5,
glukokortikoid reseptörünün S211 bölgesinin fosforillenmesinden sorumludur ve bu
etki GR aktivitesini artırır; JNK, glukokortikoid reseptörünün S226 bölgesinin
84
fosforillenmesinden sorumludur ve bu etki de GR aktivitesini azaltma yönündedir.
Bu fosforillenmeler sonucu transkripsiyonel aktivitede değiĢiklikler ortaya çıkar.
Tütün (nikotin) kullanımı ve kortizol arasındaki iliĢki üç boyutta ortaya çıkar. Ġlk
olarak HPA ekseni bağımlılık süreçleri ile doğrudan iliĢkilidir. Ġkincisi, artmıĢ
kortizol seviyeleri; lipid profilleri, immun fonksiyonlar, merkezi adipozite, kemik
mineral yogunluğu ve üreme fonksiyonlarını içeren sağlıkla iliĢkili pek çok biyolojik
süreçlerde uzun süreli olumsuz etkiler gösterir. Son olarak, psikolojik stres yüksek
kortizol düzeyleri ile iliĢkilidir. Çoğu sigara içicisi için sigarayı bırakmak stresli bir
durumdur.
Kortizol
doğrudanbu
süreçile
iliĢkilidirve
sigarabırakmanınerken
dönemindeki kötü deneyimlerin baĢıca sorumlusu kortizol olarak kabul edilir [47].
Bu tez kapsamında nikotin uygulaması sonucunda glukokortikoid ile aktive
olan ve nöronlarda bulunduğu bilinen BCL2L1, SGK1, NFKB1, GILZ,
KLF11genleri ve referans gen olarak G6PDgen ekspresyon düzeyleri Taqman probu
kullanılarak gerçek zamanlı PCR yöntemi kullanılarak incelenmiĢtir.
FarklılaĢtırılan
SH-SY5Y
hücrelerine
deksametazonun
iki
farklı
konsrantrasyonu (10nM ve 100nM) 24 saatlik uygulanarak glukokortikoid ile aktive
olduğu bilinen ve seçilen bu genlerin ekpresyon düzeyine bakılmıĢtır. Yüksek doz
deksametazon uygulamasında her gende istatistiksel olarak anlamlı artıĢ görülmüĢtür.
Kullanılan doz aralığı ve uygulama süresi daha önce yapılan deneyler baz alınarak
uygulanmıĢtır [58-63].
U2OS ve A549 gibi hücrelerde deksametazon uygulamasıyla GR serin
bölgerindeki (S203, S211 ve S226) fosforillenme daha önceki çalıĢmalarda
incelenmiĢtir. Bu çalıĢmalarda GR bağımlı gen ekspresyonu üzerindeki fosforilasyon
etkilerini daha iyi anlamak için belirli GR hedef genlerden mRNA toplanmıĢ ve
U2OS hücrelerinde GILZ, ladinin 1 (LAD1), IGF-bağlanma proteini 1 (IGFBP1) ve
interferon düzenleyici faktör 8 (IRF8) gibi genler incelenmiĢtir. Bu amaçla belirlenen
dozlarda 2 saat deksametazoın uygulanmıĢ, qPCR için total RNA izole edilmiĢ
vedüĢük konsantrasyonda deksametazon uygulanması sonucu (<10nM) GILZ
aktivasyonunun bozulduğu gösterilmiĢtir [13].
Sunulan tez çalıĢmasında farklılaĢtırılan SH-SY5Y hücrelerine nikotinin iki
farklı konsrantrasyonunun (50nM ve 300nM) 24 saatlik uygulanmasıyla seçilen gen
eksresyonlarında
nikotin
dozu
arttıkça
bifazik
etki
görülmüĢtür.
DüĢük
konsantrasyonda nikotin uygulaması tüm genlerde anlamlı artıĢ gösterirken yüksek
dozda düĢük doza göre daha az anlamlı artıĢ olmuĢ ya da olmamıĢtır. Nikotin dozu
85
arttıkça SH-SY5Y hücrelerinde nikotinin toksik etki gösterdiği daha önceki
çalĢmalarda gösterilmiĢtir[64].
Deksametazon ile nikotin farklı doz kombinasyonlarda birlikte uygulandığında
SGK1 ve KLF11 genlerinde tüm gruplarda kontrol grubuna oranla anlamlı artıĢ
gözlenmiĢtir.
Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti mekamilamin, deksametazon ve
nikotin ile birlikte uygulanıldığında deney gruplarının büyük bölümündeseçilen
genlerde
ekspresyon
artıĢı
görülmüĢtür.
Bu
durum,
nikotinin
antagonisti
mekamilamin tarafından bloke edildiğini ve sonuçta deksametzonun bu genlerin
ifadesini
kontrol
gruplarına
göre
artırmasından
kaynaklı
olabileceğini
düĢündürmektedir.
Glukokortikoid reseptör fosforilasyonunda görev alan ve GR aktivitesini
arttırdığı bilinen özel bir siklin bağımlı kinaz olan CDK5‟in inhibitörü kenpaullone,
nikotin ve deksametazonun farklı doz kombinasyonlarını içeren hücre kültürlerine 24
saat uygulanmıĢtır. SGK1 geninde tüm gruplarda kontrol grubuna göre istatistiksel
anlamlı artıĢ görülmekteyken KLF11 geninde tüm gruplarda kontrol grubuna göre
anlamlı azalma görülmüĢtür.
Glukokortikoid reseptör fosforilasyonunda görev alan ve GR aktivitesini
azaltmaktan sorumlu olan JNK‟nın inhibitörü olan SP600125, nikotin ve
deksametazon farklı doz kombinasyonlarını içeren hücre kültürlerine 24 saat
uygulanmıĢtır. SGK1 geninde kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı
düzeyde azalan gruplar görülmekteyken BCL2L geninde tüm gruplarda kontrol
grubuna göre anlamlı artıĢ görülmüĢtür.
SGK1 geni deksametazon ve nikotin birlikte uygulandığında artıĢ gösterirken
CDK5 inhibitörü uygulaması ile bu artıĢ ortadan kalkmazken JNK inhibitörü
uygulaması ile gen ekpresyonunda azalma görülür.
KLF11 geni deksametazon ve nikotin birlikte uygulandığında artıĢ gösterirken
JNK inhibitörü uygulaması ile bu artıĢ ortadan kalkar. CDK5 inhibitörü uygulaması
ile gen ifadesinde tüm gruplarda azalma görülür.
BCL2L geni deksametazon ve nikotin birlikte uygulandığında artıĢ gösterirken
JNK inhibitörü uygulaması ile bu artıĢ ortadan kalkmazken CDK5 inhibitörü
uygulaması ile gen ifadesindeki artıĢ ortadan kalkar.
86
6. SONUÇ VE ÖNERĠLER
Stres etmenlerinin vücutta meydana getirdiği değiĢiklikler ve glukokortikoid
etkileri uzun zamandır araĢtırma konusu olmuĢtur. Stres yanıtının moleküler
mekanizmaları incelenmiĢ ve zararlı etkilerine karĢı tedavi yöntemleri geliĢtirilmeye
çalıĢılmıĢtır. Benzer Ģekilde, nikotinin sinir sistemi ve tüm organizmaya olan etkileri
de pek çok araĢtırmaya konu olmuĢtur. Mezokortikolimbik sistem dopamin
nöronlarındaki nAChR‟lerinin nikotinle duyarsızlaĢtırılması antidepresan benzeri
etkiler oluĢturmaktadır. Aynı zamanda nikotinin postgangliyonik sempatik sinir
sonlanmalarından noradrenalin salgılanmasına neden olduğu ve sempatomimetik
etkilere yol açtığı bilinmektedir. Nikotinin sempatomimetik etkileriyle stres
yanıtlarını artırması beklenirken sigara içenler genellikle sigaranın stresi azalttığını
ifade etmektedirler. Nikotinin uyanıklık ile azalmıĢ stresi birlikte oluĢturması Nesbitt
paradoksu olarak adlandırılmaktadır [49]. Sigaranın içinde bulunan ve temel
bağımlılık yapıcı ajan olarak kabul edilen nikotinin moleküler düzeydeki etkilerinin
bilinmesi sigara bağımlılığı ve bunun stres ile iliĢkisinin altında yatan mekanizmaları
anlama açısından önemli kazanımlar sağlayacaktır. Bu çalıĢmada, stres ve nikotin
iliĢkisinde seçilen genlerde, bu genlerin anlatımındaki farklıklar mRNA düzeyinde
gösterilmiĢtir. AraĢtırılan genlerin fonksiyonel etkilerinin ortaya çıkarılmasıiçin
translasyon sonrası protein etkilerinin incelenmesi gereklidir. Glukokortikoidlerin
etkilediği bilenen yüzlerce gen vardır bunlarda nikotin uygulamasıyla protein
düzeyinde etkileri moleküler yolaklar ıĢığında araĢtırılarak stres ve nikotin iliĢkisi
aydınlatılabilir ve bir paradoks olan nikotin stres iliĢkisine ıĢık tutulabilir.
87
8. KAYNAKLAR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Keser, A., STRES VE NİKOTİNİN NÖRONAL NİTRİK OKSİT SENTAZ
EKSPRESYONUNA VE BEYİN NİTRİT/NİTRAT SEVİYELERİNE ETKİSİ, in
FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI2007, EGE ÜNĠVERSĠTESĠ TIP
FAKÜLTESĠ.
De Kloet, E.R., Hormones and the stressed brain. Ann N Y Acad Sci, 2004.
1018: p. 1-15.
Stein-Behrens, B.A. and R.M. Sapolsky, Stress, glucocorticoids, and aging.
Aging (Milano), 1992. 4(3): p. 197-210.
University,
G.R.
adrenal
gland.
2015;
Available
from:
http://www.gru.edu/mcg/phy/raineylab/objective.php.
Brandt, D., The Adrenal Cortex in Steroid Biosynthesis and Regulation of
Cortisol Production
Kim E. Barrett, S.M.B., Scott Boitano, Heddwen L. Brooks, Ganong’s
Review of Medical Physiology2010.
Galliher-Beckley, A.J. and J.A. Cidlowski, Emerging roles of glucocorticoid
receptor phosphorylation in modulating glucocorticoid hormone action in
health and disease. IUBMB Life, 2009. 61(10): p. 979-86.
Cosio, B.G., A. Torrego, and I.M. Adcock, [Molecular mechanisms of
glucocorticoids]. Arch Bronconeumol, 2005. 41(1): p. 34-41.
Reddy, T.E., et al., Genomic determination of the glucocorticoid response
reveals unexpected mechanisms of gene regulation. Genome Res, 2009.
19(12): p. 2163-71.
Smoak, K.A. and J.A. Cidlowski, Mechanisms of glucocorticoid receptor
signaling during inflammation. Mech Ageing Dev, 2004. 125(10-11): p. 697706.
Kumar, R. and E.B. Thompson, Gene regulation by the glucocorticoid
receptor: structure:function relationship. J Steroid Biochem Mol Biol, 2005.
94(5): p. 383-94.
Tatro, E.T., et al., Modulation of glucocorticoid receptor nuclear
translocation in neurons by immunophilins FKBP51 and FKBP52:
implications for major depressive disorder. Brain Res, 2009. 1286: p. 1-12.
Chen, W., et al., Glucocorticoid receptor phosphorylation differentially
affects target gene expression. Mol Endocrinol, 2008. 22(8): p. 1754-66.
Cabadak, H., HÜCRE SIKLUSU VE KANSER. ADÜ Tıp Fakültesi Dergisi,
2008.
Zaharevitz, D.W., et al., Discovery and initial characterization of the
paullones, a novel class of small-molecule inhibitors of cyclin-dependent
kinases. Cancer Res, 1999. 59(11): p. 2566-9.
Liebl, J., et al., Twice switched at birth: cell cycle-independent roles of the
"neuron-specific" cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) in non-neuronal cells.
Cell Signal, 2011. 23(11): p. 1698-707.
Zhu, J., W. Li, and Z. Mao, Cdk5: mediator of neuronal development, death
and the response to DNA damage. Mech Ageing Dev, 2011. 132(8-9): p. 38994.
Smith, D.S., P.L. Greer, and L.H. Tsai, Cdk5 on the brain. Cell Growth
Differ, 2001. 12(6): p. 277-83.
Lew, J., CDK5: A new lead to survival. Cell Cycle, 2013. 12(13): p. 1981-2.
88
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
Qiu, J., et al., Rapid activation of ERK1/2 mitogen-activated protein kinase
by corticosterone in PC12 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001.
287(4): p. 1017-24.
Weston, C.R. and R.J. Davis, The JNK signal transduction pathway. Curr
Opin Genet Dev, 2002. 12(1): p. 14-21.
Johnson, G.L. and K. Nakamura, The c-jun kinase/stress-activated pathway:
regulation, function and role in human disease. Biochim Biophys Acta, 2007.
1773(8): p. 1341-8.
Chen, F., JNK-induced apoptosis, compensatory growth, and cancer stem
cells. Cancer Res, 2012. 72(2): p. 379-86.
Bain, J., et al., The specificities of protein kinase inhibitors: an update.
Biochem J, 2003. 371(Pt 1): p. 199-204.
BCL2L1.
Jul
2008
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_138578.
SGK1.
Jan
2009
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001143677.
Schoenebeck, B., et al., Sgk1, a cell survival response in neurodegenerative
diseases. Mol Cell Neurosci, 2005. 30(2): p. 249-64.
Webster, M.K., et al., Characterization of sgk, a novel member of the
serine/threonine protein kinase gene family which is transcriptionally
induced by glucocorticoids and serum. Mol Cell Biol, 1993. 13(4): p. 203140.
GILZ.
Jul
2008
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001015881.
KLF11.
Apr
2010
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001177716.
Grunewald, M., et al., Mechanistic role for a novel glucocorticoid-KLF11
(TIEG2) protein pathway in stress-induced monoamine oxidase A expression.
J Biol Chem, 2012. 287(29): p. 24195-206.
NFKB1.
Sep
2009
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001165412.
G6PD.
Jul
2008
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2539.
TÜRKÇAPAR, D.D.M.H., HPA (hipotalamik-pituiter [hipofiz]-adrenal)
Ekseni. DUYGUDURUM DĠZĠSĠ 2001. 6:257-263.
Hofmann, F.B., Nicotine Psychopharmacology, in Handbook of Experimental
Pharmacology, J.E.H.E.D. London and S. Pogun, Editors. 2009: SpringerVerlag Berlin Heidelberg.
Hurst, R., H. Rollema, and D. Bertrand, Nicotinic acetylcholine receptors:
from basic science to therapeutics. Pharmacol Ther, 2013. 137(1): p. 22-54.
DOĞAN, Y.H., NİKOTİNİN BEYİNDEKİ ÖDÜL SİSTEMLERİ
ÜZERİNDEKİ ETKİSİNDE CİNSİYET FARKLILIĞI, in fizyolji
anabilimdalı2006, ege üniversitesi.
Bacher, I., et al., Mecamylamine - a nicotinic acetylcholine receptor
antagonist with potential for the treatment of neuropsychiatric disorders.
Expert Opin Pharmacother, 2009. 10(16): p. 2709-21.
Nesil, T., Sıçanlarda Nikotin Tercihinin Olusturulması ve Arastırılması, in
Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoteknoloji Anabilim Dalı2007,
Ege Üniversitesi.
89
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
Albuquerque, E.X., et al., Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from
structure to function. Physiol Rev, 2009. 89(1): p. 73-120.
CHRNA3.
Nov
2009
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_000743.
CHRNA5
Jun
2010
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1138.
CHRNA7
Feb
2012
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1139.
CHRNB2
Jul
2008
18-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1141.
CHRNB4
17-Mar-2015;
Available
from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_000750.
Levin, E.D., et al., The effects of smoking-related sensory cues on
psychological stress. Pharmacol Biochem Behav, 1991. 39(2): p. 265-8.
Steptoe, A. and M. Ussher, Smoking, cortisol and nicotine. Int J
Psychophysiol, 2006. 59(3): p. 228-35.
Matta, S.G., et al., Response of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis to
nicotine. Psychoneuroendocrinology, 1998. 23(2): p. 103-13.
Parrott, A.C., Nesbitt's Paradox resolved? Stress and arousal modulation
during cigarette smoking. Addiction, 1998. 93(1): p. 27-39.
Shohreh Amini, M.K.W., Neuronal Cell Culture, ed. J.M. Walker2013.
Agholme, L., et al., An in vitro model for neuroscience: differentiation of SHSY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of
mature neurons. J Alzheimers Dis, 2010. 20(4): p. 1069-82.
Chen, Q. and A.C. Ross, Retinoic acid regulates cell cycle progression and
cell differentiation in human monocytic THP-1 cells. Exp Cell Res, 2004.
297(1): p. 68-81.
Korecka, J.A., et al., Phenotypic characterization of retinoic acid
differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS One, 2013.
8(5): p. e63862.
PCR.
2000
Available
from:
http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/RTPCR/RT_PCR.html.
Tuba, G., Gen Anlatımının Kantitatif Analizi “Real-Time PCR”.
Warpman, U., et al., Regulation of nicotinic receptor subtypes following
chronic nicotinic agonist exposure in M10 and SH-SY5Y neuroblastoma cells.
J Neurochem, 1998. 70(5): p. 2028-37.
Hunter, R.G., et al., Regulation of the nicotinic receptor alpha7 subunit by
chronic stress and corticosteroids. Brain Res, 2010. 1325: p. 141-6.
Ke, L. and R.J. Lukas, Effects of steroid exposure on ligand binding and
functional activities of diverse nicotinic acetylcholine receptor subtypes. J
Neurochem, 1996. 67(3): p. 1100-12.
Cote-Velez, A., et al., Dexamethasone represses cAMP rapid upregulation of
TRH gene transcription: identification of a composite glucocorticoid
response element and a cAMP response element in TRH promoter. J Mol
Endocrinol, 2005. 34(1): p. 177-97.
Thomas, A., et al., Expression of a complete and functional complement
system by human neuronal cells in vitro. Int Immunol, 2000. 12(7): p. 101523.
Yaniv, S.P., et al., Dexamethasone enhances the norepinephrine-induced
ERK/MAPK intracellular pathway possibly via dysregulation of the alpha290
62.
63.
64.
adrenergic receptor: implications for antidepressant drug mechanism of
action. Eur J Cell Biol, 2010. 89(9): p. 712-22.
Lucki, A., et al., Dexamethasone in the presence of desipramine enhances
MAPK/ERK1/2 signaling possibly via its interference with beta-arrestin. J
Neural Transm, 2014. 121(3): p. 289-98.
Casulari, L.A., et al., Dexamethasone blocks the migration of the human
neuroblastoma cell line SK-N-SH. Braz J Med Biol Res, 2006. 39(9): p.
1233-40.
Ramlochansingh, C., R.E. Taylor, and Y. Tizabi, Toxic effects of low alcohol
and nicotine combinations in SH-SY5Y cells are apoptotically mediated.
Neurotox Res, 2011. 20(3): p. 263-9.
91
8.ÖZGEÇMĠġ
HASĠBE ġAHĠN
KocamustafapaĢa Mahallesi Berber ġefik Sokak Karadeniz
Apartmanı No:47 Daire:13
KocamustafapaĢa - Fatih/ĠSTANBUL
0505 3971126
hasibeshn@gmail.com
EĞĠTĠM
2014 – devam etmekte
2012 – devam etmekte
2009 – 2014
2008 – 2012
2003 – 2007
Yüksek Lisans, Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri
Enstitüsü, FizyolojiAnabilim Dalı
Yüksek Lisans, Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri
Enstitüsü, Sinirbilim Anabilim Dalı
Lisans, Anadolu Üniversitesi, Açık Öğretim Fakültesi,
İşletme
Lisans, İstanbul Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler
Biyoloji ve Genetik
Uşak Anadolu Öğretmen Lisesi
DENEYĠM
Eylül 2014 – devam etmekte
CRM-CRO Sözleşmeli Araştırma Kuruluşu, Klinik
Araştırma Koordinatörü
Mart 2013- Ağustos 2014
EÜBAM Oral Nikotin Tercih Eden ve Etmeyen Sıçan
SoylarınınOluşturulması
Temmuz 2011
Yeditepe Üniversitesi Mühendislik ve Mimarlık Fakültesi
Genetik veBiyomühendislik Bölümü, İstanbul
ġubat 2011
İstanbul Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü,
İstanbul
Ağustos 2010 — Eylül 2010
Ege Üniversitesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Moleküler
Laboratuarı, İzmir
Temmuz 2010
İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü Moleküler
Tıp AnabilimDalı, İstanbul
Temmuz 2009 — Ağustos 2009 Özel Ceyline Hastanesi Mikrobiyoloji ve Biyokimya Laboratuarı,
Usak
EĞĠTĠM VE SERTĠFĠKALAR







Ege Üniversitesi 11. Ulusal Sinirbilim Kongresi (28.04.2013-01.05.2013)
İstanbul Üniversitesi Yaşam Bilimlerinde Multidisipliner Ar-Ge ve İnovasyon
Sempozyumu (15-17 Haziran 2012)
İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 9.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik
Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası(24-26 Şubat 2012)
İTÜ Girişimcilik Kulübü ‘GO:Beden Dili Eğitimi’ Semineri Katılım Belgesi (25 Ekim
2011)
İstanbul Üniversitesi Kariyer Geliştirme Merkezi (KAGEM) Kariyer Günleri’ne Katılım
Sertifikası (15-16 Mart 2011)
İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 8.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik
Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası (4-6 Mart 2011)
İSMEK (İstanbul Büyükşehir Belediyesi Sanat ve Meslek Eğitimi Kursları) Web
92










Tasarımcısı Kurs Bitirme Belgesi (22.11.2010-15.02.2011)
Ege Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 4.Moleküler Biyoloji ve Genetik Araştırma ile
Uygulama Platformu Katılım Belgesi (27-30 Ağustos 2010)
İstanbul Üniversitesi Disiplinlerarası Fen Öğrenci Kongresi Teşekkür Belgesi (13-15
Mayıs 2010)
Boğaziçi Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Hafta Sonu 5 Katılım Sertifikası
(10-11 Nisan 2010)
Marmara Üniversitesi I.Kök Hücre Sempozyumu Katılım Sertifikası (5 Mart 2010)
İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 7.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik
Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası(19-21 Şubat 2010)
İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 6.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik
Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası(6-8 Mart 2009)
İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetikte Kariyer 2009 Katılım Sertifikası
(12.06.2009)
Boğaziçi Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Hafta Sonu 4 Katılım sertifikası
(18-19 Nisan 2009)
1.Ulusal Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar Sempozyumu (UGDOS) Katılım
Sertifikası (20.12.2008)
Bilgisayar Operatörlüğü-İşletmenliği Kursu(Uşak Halk Eğitim Merkezi)(01.07.200813.08.2008)
AKTĠVĠTELER








İSMEK Bendir Kursu(2014-2015)
Ege Üniversitesi Türk Halk Dansları Topluluğu (TÜHAD) (2013 - 2014)
İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi İÜGEN Kulübü Yönetim Kurulu Üyesi (2010 - 2012)
Genç TEMA üyesi (2009 - 2012)
İSMEK Ney Kursu (2009 - 2010)
İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi İÜGEN Kulübü Üyesi (2009 - 2012)
İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi Çevre Koruma Kulübü Üyesi (2009 - 2012)
Uşak Anadolu Öğretmen Lisesi -Voleybol Takımı (2003 - 2007)
YABANCI DĠLLER
İngilizce: İyi
Almanca: Başlangıç
KĠġĠSEL BĠLGĠLER
Doğum Tarihi
Doğum Yeri
Sürücü Ehliyeti
: 03.10.1989
: Uşak
: B (2008)
93
Download