türkiye cumhuriyeti - Ankara Üniversitesi Açık Erişim Sistemi

TÜRKİYE CUMHURİYETİ
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
MEME KANSERİNDE GASC1 GEN EKSPRESYONU
Dr. Bahri ÇAKABAY
GENEL CERRAHİ ANABİLİM DALI CERRAHİ ONKOLOJİ BİLİM DALI
YAN DAL UZMANLIK TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Sancar BAYAR
ANKARA
2012
i
KABUL VE ONAY
i
TEŞEKKÜR
Cerrahi onkoloji yan-dal uzmanlık tezimin oluşumunda desteği ve zor
anlarda insani sıcaklığı için başta tez danışmanı hocam Prof. Dr. Sancar Bayar’a,
cerrahi onkolojinin ülkemizde bir yan-dal uzmanlığı olarak kurumsallaşmasındaki
çabaları ve eğitim sürecimde bilimsel katkılarından dolayı hocam Prof. Dr. Hikmet
Akgül’e, meslek yaşamımda bir dönüm noktası olan onkolojik cerrahinin karizmatik
otoritesi ve ilkeli yaşam öğreticisi hocam Prof. Dr. Salim Demirci’ye, cerrahi
onkolojinin spesifik alanlarındaki katkıları için hocam Prof. Dr. Ekrem Ünal’a
Tezin genetik altyapısının oluşumunda görüş ve önerileri için AÜTF Genetik
A.D. Öğretim Üyesi Prof. Dr. Ajlan Tükün’e, genetik çalışmaların yürütülmesindeki
emeği ve “materyal ve metod” yazımında katkıları için Doç. Dr. Güvem Gümüş
Akay’a,
Projenin patoloji ayağındaki emeği için A.Ü.T.F. Patoji A.D.’den değerli
meslektaşım Uzm. Dr. Saba Kiremitçi’ye, istatistiksel değerlendirmede katkıları için
A.Ü.T.F. İstatik A.D.’den Uzm. Beyza Doğanay’a ve yeniden asistanlık sürecini
birlikte geçirdiğim arkadaşım Op. Dr. Bülent Aksel’e teşekkürlerimi sunuyorum.
Çalışma, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) /(Proje
kodu:11B3330009) tarafından desteklenmiştir. BAP koordinasyon kuruluna sağladığı
finansal destek nedeniyle ayrıca teşekkür ediyorum.
Son olarak; uzakta da olsa şefkatli bakışlarını hep üzerimde hissetiğim yaşlı
anneme, eğitim sürecinde yokluğuma katlanan ve tüm sıkıntılarımı paylaşan eşime
ve yükümüzle birlikte neşeli sıçrayışlar yapmayı mümkün kılan kızım Dılba Ceren’e
sevgilerimi sunuyorum.
Bahri ÇAKABAY
ii
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
KABUL VE ONAY .................................................................................................... i
TEŞEKKÜR ............................................................................................................... ii
İÇİNDEKİLER ......................................................................................................... iii
ŞEKİLLER DİZİNİ.................................................................................................... v
TABLOLAR DİZİNİ ................................................................................................ vi
GRAFİKLER DİZİNİ .............................................................................................. vii
1. GİRİŞ VE AMAÇ .................................................................................................. 1
2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................. 12
2.1. KANSERİN MOLEKÜLER BİYOLOJİSİ ................................................. 12
2.2. KANSER GENLERİ, KANSER GEN MUTASYONLARI VE
KANSER GENLERİNİN BELİRLENMESİ .............................................. 20
2.3. KANSER GENOM ANALİZİYLE SOMATİK DÖNÜŞÜMLERİN
BELİRLENMESİ VE YENİ TÜMÖR TAKSONOMİSİ ............................ 21
2.4. KANSER EPİGENETİĞİ, EPİGENİTİK SÜREÇ VE EPİGENETİK
TEDAVİ ...................................................................................................... 22
2.5. MEME KANSERİ ....................................................................................... 24
2.5.1. Kalıtımsal Meme Kanseri ................................................................ 25
2.5.1.1. Meme Kanser Gelişimine Yatkınlık Yaratan Nadir
Görülen, Etkinliği Yüksek Genler ..................................... 27
2.5.1.2. Meme
Kanser
Gelişimine
Yatkınlık
Yaratan
Etkinliği Orta düzeyde, Az-sıklıkta Görülen Genler ......... 28
2.5.1.3. Meme
Kanser
Gelişimine
Yatkınlık
Yaratan
Etkinliği Düşük, Sık Görülen Gen ve Lokuslar ................. 28
2.5.2. Meme Kanserinde Somatik Değişiklikler ........................................ 28
2.5.3. Meme Kanserinde Gen Ekspresyon Paterni .................................... 29
2.5.4. Meme Kanserinde GASC1 ............................................................... 33
2.5.5. Meme Kanserinde Tnm Evrelemesi (Amerıcan Joınt
Commıttee on Cancer – AJCC 2003) .............................................. 33
3. GEREÇ ve YÖNTEM .......................................................................................... 39
iii
4. BULGULAR ........................................................................................................ 44
5. TARTIŞMA ......................................................................................................... 50
6. ÖZET.................................................................................................................... 53
7. SUMMARY ......................................................................................................... 56
8. KAYNAKLAR .................................................................................................... 59
iv
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa No
Şekil 1.
ABD’de 2009 yılında öngörülen kanserler ve ölüm oranları ................ 3
Şekil 2.
Çift sarmal oluşturan DNA'nın şematik resmi...................................... 13
Şekil 3.
DNA replikasyonu. ............................................................................... 14
Şekil 4.
Genetik bilginin DNA'dan proteine ve hücre fonksiyonlarına
dönüşümü. ............................................................................................ 15
Şekil 5.
Ökaryotik gen ekspresyonunun kontrolündeki dört önemli
basamak. ............................................................................................... 16
Şekil 6.
Hücre döngüsü ve kontrol sistemi. ....................................................... 17
Şekil 7.
Apoptozis yollarının basitleştirilmiş şeması. ........................................ 18
Şekil 8.
Hücre yüzeyindeki ve hücre içi reseptör basamakları. ......................... 19
Şekil 9.
Meme kanserinde genetik yatkınlık...................................................... 29
Şekil 10.
Meme dokusunda toplam 85 deneysel örneğin gen ekspresyon
paterni ................................................................................................... 31
Şekil 11.
Meme kanserinde prognoz göstergesi olan gen ekspresyon
paterni ................................................................................................... 32
Şekil 12.
cDNA sentez basamakları .................................................................... 40
v
TABLOLAR DİZİNİ
Sayfa No:
Tablo 1.
ABD’de 2009 yılında tahmin edilen yeni kanser olguları ve
cinsiyete göre tahmin edilen toplam ölüm sayıları. ................................. 2
Tablo 2.
ABD’de 2006 yılında gelişen ölümlerin ilk onbeş nedeni. ..................... 5
Tablo 3.
ABD’de 2006 yılında, 1-14 yaş arası çocuklarda ilk 10 ölüm
nedeni.. ..................................................................................................... 6
Tablo 4.
Meme Kanserine Yatkınlık Yaratan Gen ve Lokuslar .......................... 26
Tablo 5.
Meme Kanserinin TNM Sınıflamasına Göre Evrelendirilmesi ............. 38
Tablo 6.
Master karışım hazırlama prosedürü ..................................................... 40
Tablo 7.
Primer ve prob dizileri ........................................................................... 41
Tablo 8.
Reaksiyon karışımı hazırlama prosedürü............................................... 49
Tablo 9.
Kantitatif gerçek zamanlı PCR reaksiyon koşulları............................... 49
Tablo 10. Olguların histopatolojik sonuçları ......................................................... 51
Tablo 11. Normal ve tümörlü dokuda GASC1 ekspresyonu ölçülebilen
olguların dağılımı................................................................................... 51
vi
GRAFİKLER DİZİNİ
Sayfa No:
Grafik 1.
ABD’de erkeklerde, 1930-2005 yılları arasında seçilmiş kanserler
için yaş-uyumlu ölüm oranları. (Jemal A. Cancer statistics, 2009.
CA: a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249 ) ......................... 4
Grafik 2.
ABD’de kadınlarda, 1930-2005 yılları arasında seçilmiş kanserler
için yaş-uyumlu ölüm oranları Jemal A. Cancerstatistics, 2009.
CA: a cancerjournalforclinicians 2009; 59: 225-249 ) ............................ 5
Grafik 3.
Türkiye yaşa standardize insidans ve mortalite hızları (Türkiye’de
Kanser Kontrolü Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş
Dairesi Başkanlığı, 2007: 17-45) ............................................................. 7
Grafik 4.
Türkiye’de cinsiyete göre 2000-2002 yılları kanser insidans hızları
(yüzbinde) (Yardım N. Türkiye’de Kanser Kontrolü Ankara: T.C.
Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı, 2009: 51-65) ........ 8
Grafik 5.
Türkiye’de kansere bağlı beklenen ölüm hızları (Yardım N.
Türkiye’de Kanser Kontrolü Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı
Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı, 2009: 51-65) ................................... 8
Grafik 6.
Normal dokuda GASC1 eksprosyon ölçümü yapılmış 41 olgu ile
tümörlü dokuda GASC1 ekspresyon ölçümü yapılmış 42 olgunun
karşılaştırılması. ..................................................................................... 46
Grafik 7.
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen
ekspresyonuna
oranının
G3
ve
G2
olgularda
karşılaştırılması. ..................................................................................... 46
Grafik 8.
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun tümörsüz
dokuda ölçülen ekspresyona oranının tümör çapı (T) ile
karşılaştırılması. ..................................................................................... 47
vii
Grafik 9.
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının lenf nodu tutulumu (pN) ile
karşılaştırılması. ..................................................................................... 47
Grafik 10. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının ER durumu ile karşılaştırılması. ............ 48
Grafik 11. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının PR durumu ile karşılaştırılması. ............. 48
Grafik 12. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının c-erb durumu ile karşılaştırılması. ......... 49
Grafik 13. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen
ekspresyona
oranının
triple-negatif
olgular
ile
karşılaştırılması. ..................................................................................... 49
viii
1. GİRİŞ VE AMAÇ
Kanser, tüm dünyada en önemli sağlık problemi olmayı sürdürmektedir ve
halen Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) her dört ölümden biri kanserlere bağlı
gelişmektedir (1). Tablo 1’de ABD’de 2009 yılında erkek ve kadınlar arasında
tahmin edilen yeni kanser olguları gösterilmektedir. Her ne kadar in situ karsinom
olgularını içermese de, yaklaşık 1,5 milyon yeni kanser olgusu öngörüsünde
bulunulmaktadır. Şekil 1’de ise, 2009 yılında erkek ve kadınlarda gelişeceği
öngörülen kanserler’in yüzdeleri ve öngörülen ölüm oranları belirtilmiştir.
Bu göstergeler; ABD’de 2009 yılında her iki cinste 562,340 Amerikalı’nın
kanser nedeniyle hayatını kaybedeceğini ve bu sayının günde 1500 ölümden fazla bir
sayıya karşılık geldiğini göstermektedir (1).
Mortalite oranları; dört major kanser türü için, kadınlardaki akciğer kanseri
dışında düşme eğilimi göstermektedir (Grafik 1, 2). Bu düşüş; meme kanserlerinde
postmenopozal dönemde kullanılan menopozal hormon kullanımının azalmasına,
kolorektal kanserlerde prekanseröz poliplerin taramalar sırasında erken tanı ve
eksizyonuna, prostat kanseri için ise prostat spesifik antijen (PSA) testi kullanımının
rutin hale gelmesine bağlanabilir. Ancak tüm bu verilere rağmen ABD’de kanser
nedeniyle ölümler halen ikinci sıradadır (Tablo 2).
1
Tablo 1. ABD’de 2009 yılında tahmin edilen yeni kanser olguları ve cinsiyete göre
tahmin edilen toplam ölüm sayıları
(Jemal A. Cancer statistics, 2009. CA: a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249 )
2
(Jemal A. Cancer statistics, 2009. CA: a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249)
Şekil 1. ABD’de 2009 yılında en sık görülmesi öngörülen kanserler ve ölüm
oranları
3
(Jemal A. Cancer statistics, 2009. CA: a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249 )
Grafik 1. ABD’de erkeklerde, 1930-2005 yılları arasında seçilmiş kanserler için
yaş-uyumlu ölüm oranları
4
(Jemal A. Cancerstatistics, 2009. CA: a cancerjournalforclinicians 2009; 59: 225-249 )
Grafik 2. ABD’de kadınlarda, 1930-2005 yılları arasında seçilmiş kanserler için
yaş-uyumlu ölüm oranları
Tablo 2.ABD’de 2006 yılında gelişen ölümlerin ilk onbeş nedeni
(Jemal A. Cancer statistics, 2009. CA: a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249 )
5
Öyle ki; ABD’de 1-14 yaş arasındaki çocuklarda dahi kanser, en sık ikinci
ölüm nedenidir (Tablo 3).
Tablo 3. ABD’de 2006 yılında, 1-14 yaş arası çocuklarda ilk 10 ölüm nedeni
(Jemal A. Cancer statistics, 2009. CA: a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249 ).
Ülkemizde ise GLOBOCAN (Dünya Sağlık Örgütüne bağlı bir birim olan
‘Uluslararası kanser araştırma organı’nın yayınladığı küresel kanser istatistikleri)
2002’de yer alan Türkiye kanser insidans tahminleri şöyledir: Erkeklerde deri
dışındaki tüm kanserler için kaba insidans hızı (Bir yıl içerisindeki olgu sayısının, yıl
ortası nüfusa oranıdır) 110/100.000, yaşa standardize hız (YSH: Belli bir sürede bir
toplumda belli bir yaş grubunda oluşan ölümlerin, aynı toplumda ve aynı süre
içerisinde, söz konusu olan yaş grubundaki toplam kişi sayısına bölünmesi ile
hesaplanır) 137,3/100.000’dir (2). Erkeklerde en sık görülen kanserler akciğer, mide,
mesane, kolorektal, larinks, prostat (sırasıyla YSH 47.7; 12.2; 11.0; 9.1; 8.0; 8.0)
kanserleri olarak tahmin edilmiştir. Kadınlarda deri dışındaki tüm kanserler için;
kaba hız 82/100.000, YSH 91,2/100.000’dir. İlk altı sırada ise meme, kolorektal,
mide, over, akciğer kanserleri ve lösemiler (sırasıyla YSH 22.0; 8.5; 6.4; 5.4; 5.3;
4.7) yer almaktadır. Erkeklerde deri dışındaki tüm kanserler için; kaba mortalite hızı
(Belli bir sürede olan ölüm sayısının, aynı süredeki ortalama toplum nüfusuna
bölünmesi ile hesaplanır) 85.7/100.000, YSH 107.8/100.000; kadınlarda deri dışında
6
tüm kanserler için; kaba mortalite hızı 82/100.000, YSH 91.2/100.000 olarak tahmin
edilmiştir (Grafik 3) (3).
(Türkiye’de Kanser Kontrolü Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı,
2007: 17-45)
Grafik 3. Türkiye yaşa standardize insidans ve mortalite hızları
Ülkemizde yine 2009 yılında yayınlanan verilere göre öngörülen kanser
insidans ve beklenen ölüm hızlarında artış olduğu gözlenmektedir (Grafik 4, 5) (4).
7
(Yardım N. Türkiye’de Kanser Kontrolü Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi
Başkanlığı, 2009: 51-65)
Grafik 4.
Türkiye’de cinsiyete göre 2000-2002 yılları kanser insidans hızları
(yüzbinde)
(Yardım N. Türkiye’de Kanser Kontrolü Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi
Başkanlığı, 2009: 51-65)
Grafik 5. Türkiye’de kansere bağlı beklenen ölüm hızları
8
Var olan verilerin değerlendirilmesinde dikkat edilmesi gereken durum; tüm
bu insidans ve mortalite hızlarının, günümüzde oldukça gelişmiş olan tanı ve tedavi
çabalarına rağmen artarak devam ediyor olmasıdır. Yakın zamana kadar tüm tanı ve
tedavi çabalarına rağmen yaşam oranlarında çok az olumlu gelişme sağlanabilmiştir.
Bu insidans ve mortalite verileri, var olan paradigmanın kanseri anlama ve kanserle
savaşımda yetersiz kaldığını ve paradigmatik bir değişimin zorunlu olduğunu
hissetirmektedir. Moleküler genetik çalışmalar yeni paradigma arayışının sonucudur.
İnsan genom dizisinin elde edilmesi ve DNA teknolojisindeki ilerlemeler
sayesinde kanserle ilgili bilgimizde son 5 yılda dramatik gelişmeler sağlanmıştır. Bu
yeni bilgiler onkoloji alanına birçok düzeyde tercüme edilmiş ve paradigmatik
değişimin hazırlayıcıları olmuştur. Bu paradigmatik dönüşümü özetlemek gerekirse;
● Genomik harita tümör taksonometrisini histolojik bazdan genetik baza
doğru kaydırarak yeniden düzenledi.
● Tümörogeneze neden olan moleküler değişikliği hedefleyen kanser
ilaçlarının başarısı, somatik genetik dönüşümün tedavinin hedefi olması
gerektiğini kanıtladı.
● Tümörün
genotiplendirilmesi,
bireyselleşmiş/kişiye
özgü
tedavi
yaklaşımlarının geliştirilmesini olanaklı kıldı.
● Tümöre özgü DNA değişiklilerin göstergesi olan duyarlılığı yüksek
biyobelirteçler,
hastalığın
bulgulanması
ve
monitorizasyonunda
kullanılmaya başlandı.
● Halen devam etmekte olan kanser genom analizi çalışmaları, farklı
moleküler
hedeflerin
tanımlanmasına
yol
açarak
yeni
tedavi
yaklaşımlarının geliştirilmesi için yol gösterici olacaktır.
Moleküler tıpta devam eden devrimsel gelişme, kanseri moleküler düzeyde
anlama çalışmalarını öne çıkarmıştır. Genin keşfi ile başlayan bu süreç, daha
önceden bilinmeyen genlerin ve gen dizimlerinin ortaya çıkartılmasıyla devam etmiş,
9
DNA’nın ikili sarmal (double helix) yapısının keşfinden 50 yıl kadar sonra ‘İnsan
Genom Projesi’nin tamamlanmasıyla büyük bir başarıya ulaşmıştır.
‘Genomik bilgi aşaması’ denilen ikinci aşamada; yüksek çıktılı genetik
yöntemlerin kullanılması ile genomik ve transkriptomik seviyelerde gerçekleştirilen
çalışmalardan elde edilen veriler doğrultusunda genler ve mRNA ürünleri hakkında
bilgi edinilmektedir.
Onkoloji alanında farklı tümör örneklerinin normal doku
örnekleri ve birbirleri ile genomik ve transkriptomik seviyede karşılaştırılmaları
sonucunda tümörogenezde rol oynayan genlerin tanımlanması mümkün olmaktadır.
Bu tip çalışmalardan elde edilen veriler; tümörlerin altgruplara ayrılmasını ve
kişiselleştirilmiş tedavi seçeneklerini olanaklı hale getirecektir.
Üçüncü aşama olan‘Proteomik bilgi aşaması’nda, tümörogenezde önemli
rol oynayan genlerin fonksiyonel ürünleri olan proteinlerin ve bu proteinlerin
posttranslayonel modifikasyonlarının, yine yüksek çıktılı moleküler yöntemlerle
araştırılmasına devam edilmektedir.
Genomik ve proteomik araştırmalar kanserin moleküler temeli hakkında
yeni fonksiyonel bilgi düzeyleri sağlayacaktır. Bu araştırmaların, moleküler kanser
uygulamaları için yeni bilgi alanları ve spesifik tedavi olanakları sağlayacağı umut
edilmektedir. Genomik devrim öncesine kadar, tümör iki kritere göre sınıflandırılırdı;
lokalizasyon(tümörün ortaya çıktığı alan) ve tümörün görünümü (histolojik yapısı).
Bu iki kriter prognozun belirlenmesinde ve en iyi tedavi şeklinin oluşturulmasında
günümüzde de hala kullanılmaktadır. Oysa, histolojik olarak benzer tümörlerin klinik
olarak farklı sonuçlar doğurduğu uzun yıllardan beri bilinmektedir. Genetik lezyon
varlığının major kriter olduğu yeni tümör taksonomisi, genom temelli bilgi sayesinde
daha iyi teşhis olanağı sağlayacak ve kişiye özgü tedavi planlamasını mümkün
kılacaktır. Gen ekspresyon profillerinin analizi teşhis ve tedavide sağladığı fayda
nedeniyle pratik uygulamaya geçecektir. Bu prediktif işaretler klinisyenlere
hastalarıyla tedavi planlamasında ve rekürensleri tahmin etmede eşsiz yardımlar
sağlayacaktır.
Bu çalışmamızda amaç; yeni keşfedilmiş bir onkogen olan ve daha çok
özefagus kanserinde araştırılmış GASC1 (gene amplified in squamous cell
10
carcinoma1) genini meme kanseri olgularında çalışmaktır. Sınırlı sayıda çalışma
meme kanseri olgularında GASC1 artan ekspresyonunu (overexpression) rapor
etmiştir. Çalışmamızda elde edilecek sonuçların meme kanseri olgularında, tümörün
genomik sınıflandırmasına katkı sunması amaçlanmaktadır.
11
2. GENEL BİLGİLER
2.1. KANSERİN MOLEKÜLER BİYOLOJİSİ
Kanser temelde genetik bir hastalıktır ve kansere yol açan DNA
değişimlerinin ortaya konması ile en iyi şekilde anlaşılabilir. Karsinogenezin tam
anlaşılabilmesi; büyüme, invazyon ve metastaza yol açan hücresel programdaki
dönüşüme
yol
açan
genetik
değişikliklerin
nasıl
gerçekleştiğini
bilmekle
mümkündür. Çoğu somatik hücre genomunda biriken çok sayıdaki moleküler
değişiklik kanser gelişimine yol açmaktadır (5).
DNA, hücrenin çekirdeği içerisinde kromozomlar şeklinde paketlenmiş
genetik materyalidir. Moleküler yapısı ilk olarak J.D. Watson ve F. Crick tarafından
aydınlatılan DNA molekülü, sağa dönüşümlü, çift sarmallı bir yapıda bulunmaktadır.
Çift sarmalı oluşturan her bir DNA zinciri birbirlerine 3’-5’ fosfodiester bağları ile
bağlanmış
çok
sayıda
nükleotid
(azotlu
baz-şeker-fosfat)
molekülünden
oluşmaktadır. Bu nedenle her bir zincire polinükleotid zinciri adı da verilmektedir.
Çift sarmallı yapıda her iki polinükleotid zinciri birbirine antiparaleldir. Yani bir
zincir 5’3’ yönünde bulunurken, bu zincire komplamenter olan ikinci zincir 3’5’
yönünde bulunmaktadır. DNA molekülünü oluşturan nükleotid birimleri temel olarak
5 karbonlu bir deoksiriboz şekeri ve buna 5’ C atamundan bağlı bir fosfat ve 1’ C
atomundan bağlı bir azotlu bazdan oluşmaktadır. DNA molekülünde temel olarak 4
farklı azotlu baz bulunmaktadır. Bunlar Adenin (A), Timin (T), Sitozin (C) ve
Guanin (G)’dir. Birbirine antiparalel iki polinükleotid zincirinin karşılıklı gelerek çift
sarmal yapıyı oluşturmalarında bazların komplamenterlik özelliği son derece
önemlidir. DNA molekülünde A’nın karşısında T; C’nin karşısında ise T bulunur. İki
polinükleotid zinciri bazlar arasında meydana gelen hidrojen bağları ile bir arada
tutulurlar. A il T arasında 2; C ile G arasında 3 hidrojen bağı bulunur (Şekil 2).
DNA’nın kendini eşlemesi (replikasyon) yarı korunumlu (semi conservative) olarak
gerçekleşir. Replikasyon sırasında DNA’nın iki zinciri birbirinden ayrılır ve her bir
zincirin karşısına bazların komplamenterlik esasına dayalı olarak yeni zincirler
sentezlenir (Şekil 3).
12
DNA bir hücrenin tüm fonksiyonları için önemli olan bilgiyi kodlar. DNA’da
kodlu olan bu bilgi hücre içerisinde protein bilgisine dönüştürlür. Gen ekspresyonu
olarak ifade edilen bu süreçte ilk olarak DNA’daki bilgi transkripsiyon adını
verdiğimiz bir işlemle mRNA bilgisi şeklinde yazılır. Daha sonra oluşan bu mRNA
molekülü belli işlemlerden geçirilip olgunlaştırıldıktan sonra sitoplazmaya aktarılır
ve ribozom adını veridiğimiz organellerde tRNA (transfer RNA) molekülerinin de
yardımıyla mRNA’daki bu bilgi protein bilgisine tercüme edilir. Bu işleme
translasyon adı verilmektedir (Şekil 4). Bu basamakların her biri, genlerin her
hücrede spesifik yer ve zamanda doğru şekilde ifade edilmesini sağlamak üzere
(ekspresyon) dikkatli bir şekilde kontrol edilir (Şekil 5). Hata saptama (proofreading)
mekanizmaları ile tüm basamaklar kontrol edilir.
Şekil 2. Çift sarmal oluşturan DNA'nın şematik resmi
DNA dört nükleotid tipinden oluşur; her bir polinükleotid zincirinde bunlar
birbirlerine kovalent bağlarla (fosfodiester bağı) bağlıdır. Çift sarmal yapıda bulunan
13
DNA molekülü, birbirine bazlar arasındaki hidrojen bağları ile bağlanmış iki
polinükleotid zincirinden oluşur. DNA zincirlerinin sonlarında bulunan oklar iki
zincirin
kutupsallıklarını
göstermektedir.
Şeklin
sol
alt
tarafındaki
resim
düzleştirilmiş DNA molekülünü gösterir. Gerçekte DNA molekülü çift sarmal şeklini
alacak şekilde bükülür ve her dönüş sağda gösterildiği gibi 10.4 baz çiftinden oluşur
(Schwartz’s Principles of Surgery, Ninth Edition The McGraw-Hill Companies, Inc.
Book ISBN 978-0-07-1547703).
Şekil 3. DNA replikasyonu
Nükleotid A sadece T ile ve G nükleotidi C İle eşleştiğinden, DNA'nın her bir
zinciri komplementer zincirindeki nükleotid dizisini belirleyebilir. Bu yolla çift
sarmallı DNA özdeş şekilde kopyalanabilir (Schwartz’s Principles of Surgery, Ninth
Edition The McGraw-Hill Companies, Inc. Book ISBN 978-0-07-1547703).
14
Şekil 4.Genetik bilginin DNA'dan proteine ve hücre fonksiyonlarına dönüşümü
Genetik bilginin DNA'dan RNA'ya aktarılması işlemine transkripsiyon ve
RNA'nın proteine aktarılma işlemine translasyon adı verilir. Proteinler hücre yapısı,
hücreler arası sinyal iletimi ve metabolizmanın önemli kontrol bileşenleridir.
Genomiks ve proteomiks canlı bir organizmanın sırasıyla DNA ve protein
düzeyindeki genetik bileşimini inceleyen bilim dallarıdır. Genler ile onların
hücrelerdeki fonksiyonları arasındaki İlişkiyi inceleyen bilim dalına fonksiyonel
genomiks adı verilir (Schwartz’s Principles of Surgery, Ninth Edition The McGrawHill Companies, Inc. Book ISBN 978-0-07-1547703).
15
Şekil 5. Ökaryotik gen ekspresyonunun kontrolündeki dört önemli basamak
Transkripsiyonel ve transkripsyon sonrası kontrol bir proteinin üretilmesi için
var olan mRNA düzeyini belirler; translasyonel ve translasyon sonrası kontrol ise
fonksiyonel proteinlerin nihai akıbetini belirler. Transkripsiyon sonrası ve
translasyon sonrası kontrollerin birçok basamak içerdiğine dikkat ediniz. (Schwartz’s
Principles of Surgery, Ninth Edition The McGraw-Hill Companies, Inc. Book ISBN
978-0-07-1547703).
Gen Ekspresyonunun Düzenlenmesi: Canlı hücre enzimatik yollarla
DNA’dan RNA’yı yazdırmak (transkripsyon) ve mRNA’yı proteine dönüştürmek
(translasyon) için gerekli mekanizmaya sahiptir. Gen ekspresyonu bu iki
mekanizmayla oluşur. Gen ekspresyonunun düzenlenmesi, gelişimin ya da hayat
döngüsünün herhangi bir aşamasında bir hücrede ifade edilen gen ürünlerinin miktar
ve ifade zamanlarının geri döndürülebilen mekanizmalarla kontrolüdür.
İnsan Genomu; Genom bir organizmanın sahip olduğu kalıtsal bilginin
tümünü ifade etmek amacıyla kullanılan bir terimdir. Genom, hem genleri hem de
kodlamayan DNA dizilerini içerir. İnsan genomu 23 kromozom çifti tarafından
taşınan yaklaşık 3 milyar baz çifti uzunluğundaki DNA dizisinden oluşmaktadır.
İnsan genomunda 25.000-30.000 gen olduğu tahmin edilmekte ve tüm insanlarda bu
yapının %99,9’unun özdeş olduğuna inanılmaktadır. DNA’da tek baz farklılıklarının
16
olduğu yaklaşık 3 milyon bölge tanımlanmıştır; bunlara tek nükleotid polimorfizmleri
(SNP) adı verilir. SNP’ler hastalık eğilimi bakımından insanlar arasındaki
farklılıkların ve çevresel faktörlere yanıtların kritik belirleyicileri olabilmektedir.
Hücre Döngüsü: Hücre döngüsünün basamakları Şekil 6’da gösterilmiştir.
Öncelikle, hücrenin proliferasyon için karar vermesi ve gerekli moleküleri
sentezlemeye hazırlanması gerekir. Büyüme faktörlerinin sentezlenmesi ve yeni
sentezlenen ya da yeni açığa çıkan her büyüme faktörünün kendisine özgü büyüme
faktörü reseptörlerine bağlanması gerekir. Bu reseptörlerden proliferasyon sinyalinin
sinyal iletici moleküller aracılığıyla nukleusa taşınması ve nukleusta DNA eşleşmesi
gerekmektedir. G0 fazında (istirahat fazı), hücreler genellikle spesifik bir işlevi
görmek üzere proğramlanırlar.G1 fazında (ara faz, interfaz), spesifik hücre
fonksiyonları için gereken proteinler ve RNA sentezlenir. Geç G1 fazında bol
miktarda RNA sentezlenir. Ayrıca, DNA sentezi için gereken birçok enzim üretilir.
S fazında (DNA sentezi fazı) hücre içindeki DNA’nın miktarı ikiye katlanır. G2
fazında DNA sentezi durur, protein ve RNA sentezi devam eder, mitotik
“spindle”ların mikrotübuler prekürsörleri üretilir. M fazında (mitozis) protein ve
RNA sentez hızı aniden yavaşlar, genetik materyal oluşan iki yeni hücreye dağılır.
Mitozisi takiben oluşan yeni hücreler ya G0 ya da G1 fazına girerler.
Şekil 6. Hücre döngüsü ve kontrol sistemi
17
M çekirdek ve sitoplazmanın bölündüğü mitoz fazıdır; S DNA'nın sentez
fazıdır; Gl M ile S arasındaki fazdır, G2 S ile M arasındaki fazdır. Siklin ve sikline
bağımlı kinaz (CDK) kompleksleri her fazdaki spesifik olayları kontrol eder. Hücre
döngüsündeki farklı siklin/CDK kompleksleri gösterilmektedir. A B, D ve E sırasıyla
siklin A siklin B, siklin D ve siklin E'yi simgeler(Schwartz’s Principles of Surgery,
Ninth Edition The McGraw-Hill Companies, Inc. Book ISBN 978-0-07-1547703).
Apoptozis:
Hücre
döngüsü
kontrolüne
ek
olarak,
genetik
olarak
programlanmış mekanizmalar içeren kontrollü bir hücre ölüm mekanizması vardır.
Apopitozis veya kontrollü hücre ölümü adı verilen bu hücresel süreç, doku
dengesinin korunması için şarttır. Apopitozis, pek çok fizyolojik uyaran ile aktive
olabilir; bunlar ölüm reseptör sinyalleri (Fas veya sitokrinTNF gibi), büyüme faktör
eksikliği, DNA hasarı ve stres sinyalleridir(Şekil 7). Karmaşık apopitozis
mekanizması sıkı şekilde kontrol edilmelidir. Süreçteki bozukluklar neoplastik
transformasyonlara neden olur. Bcl-2 ailesi proteinleri apoptozisin düzenleyicileridir.
Bazı üyeleri apoptozisi indüklerken bazıları inhibe eder. Bcl-2 doğrudan hücresel
proliferasyonu artırmak yerine apoptozisi inhibe ederek etkisini gösteren tek
onkogendir.
Şekil 7. Apoptozis yollarının basitleştirilmiş şeması
18
Hücre dışı ölüm reseptörü yolları Fas ve TNF reseptörlerinin aktivasyonunu
ve buna bağlı olarak kaspaz yolunun aktivasyonunu içerir. Hücre içi ölüm yolu,
mitokondriden sitokrom C'nin açığa çıkmasını gösterir. Apoptozis sırasında
hücrelerde DNA fragmantasyonu olur, çekirdek ve hücre membranı parçalanır ve
sonunda diğer hücreler tarafından yok edilir (Schwartz’s Principles of Surgery, Ninth
Edition The McGraw-Hill Companies, Inc. Book ISBN 978-0-07-1547703)
Sinyal İleti Yolları: Bir genomdaki gen ekspresyonu, kısmen sinyal yoluyla
kontrol edilir. Sinyal yolu genellikle hücre yüzeyinde başlar ve çekirdekte sonlanır,
DNA ve transkripyon aparatına etkide bulunur (Şekil 8). Proteinler, kısa pepidler,
nükleotidler, aminoasitler, steroidler, yağasitleri, çözünmüş gazlar v.b. hücrenin yanıt
verdiği biyoaktif maddelerdir. Hücrelerin sinyal istemindeki anormal değişiklikler
kansere neden olabilir. Sinyal ağlarının anlaşılmasındaki ilerlemelerle ve sağlanan
bilgi, geleneksel yaklaşımları aşan yeni araştırma yöntemleri gerektirmektedir (tıbbi
matematik ve fizik, tıbbi enformatik, bilgisayarlı biyoloji v.b. içeren multidisipliner
araştırma ve işbirliği).
Şekil 8. Hücre yüzeyindeki ve hücre içi reseptör basamakları
19
Büyüme faktörlerinin çoğu ve diğer hidrofilik sinyal molekülleri hücredeki
aşağı doğru sinyalleri aktive eder. Hormonlar veya diğer yayılabilen moleküler
hücreye girer ve sitoplazma veya çekirdekteki hücre içi reseptöre bağlanır. Gen
ekspresyonunu kontrol etmek üzere hücre dışı veya hücre içi sinyaller çekirdeğe
ulaşır (Schwartz’s Principles of Surgery, Ninth Edition The McGraw-Hill
Companies, Inc. Book ISBN 978-0-07-1547703).
Kanser Genomunun Destabilizasyonu: Kansere neden olan genetik
dönüşümler; kendi kendine büyeme, var olan hücre siklusundan kaçma, apoptozise
resistans, hücresel ölümsüzleşme ve sonunda; anjiogenesis, invazyon ve metastaz
yapmayı kolaylaştıran özelikler sağlar. Örneğin Li-Fraumeni sendromu ve Ailevi
Meme Kanserinde “Checkpoint defekti”, HNPCC/Lynch sendromunda “Mismatch
repair” birçok kanserin gelişmesine neden olmaktadır. Genomik instabiliteye neden
olan çok geniş ve çok farklı mekanizmalar mevcuttur. Genomik destabilzasyon
kanserogenezisi başlatır fakat spesifik tümörün sağlamlılığını da tehlikeye atar. Bu
konuda ilerleyen çalışmalar kişiye göre planlanmış daha iyi tedavi olanakları sunacak
noktadadır.
2.2. KANSER GENLERİ, KANSER GEN MUTASYONLARI VE KANSER
GENLERİNİN BELİRLENMESİ
Kanser genleri, onkogenler ve tümör supresör genler olarak iki sınıfa ayrılır.
Klasik analojiye göre, onkogenler bir otomobilin akseleratörleri gibidir; onkogendeki
mutasyon bir akselaratörün devamlı basıncı gibi işlev görür. Buna karşın, tümör
supressör genler, “frenler” gibi davranır, eğer mutasyona uğramazlarsa fonksiyonları
tümörogenezisi durdurmak yönündedir(6). Onkogendeki mutasyon, tipik olarak
spesifik bölgelerde oluşur, sıklıkla aynı kodonu etkiler. Genelikle tek bir allelin
etkilenmesi etkinin ortaya çıkması için yeterlidir. Buna karşın, tümör supresör
genlerde etkinin ortaya çıkması için her iki alelin de fonksiyonunu kaybetmesi
gereklidir. Malign tümörlerde bulunan major somatik mutasyonlar; nukleotid yer
değişimleri (substitutions), küçük insersiyon ve delesyonlar, kromozomal yeniden
düzenleme ve kopya sayısındaki dönüşümlerdir.
20
İnsan genom projesinin tamamlanması biyomedikal bilimler için yeni bir alan
oluşturmuş durumdadır. Genom dizilimi ve organizasyonuyla ilgili bilgilenmeler,
tümörlerin orjininin ve evriminin altında yatan genetik dönüşümlerin sistematik
analizine imkan sağladı. İnsan genomu aydınlatılmadan önce birçok kanser geni
(KRAS,TP53 ve APC gibi),onkovirus analizleri, bağlantı çalışmaları, heterozigot
kaybı ve sitogenetik temelli yaklaşımlarla başarılı olarak keşfedildi. 2004 yılında
İnsan Genom Projesi’nin tamamlanması kanserdeki somatik mutasyonlara ait
bilginin sanal ortamda kataloglanmasına imkan sağladı(7,8). Bu proje günümüzde
insan kanseriyle ilgili tüm genetik değişikliklerin belirlenmesinde eşsiz bir fırsattır.
2.3. KANSER
GENOM
ANALİZİYLE
SOMATİK
DÖNÜŞÜMLERİN
BELİRLENMESİ VE YENİ TÜMÖR TAKSONOMİSİ
Kanser genomundaki tüm genomik dizinin ortaya konması malign tümörlerde
somatik mutasyonların tüm major tiplerini görmeyi sağlar. Nukleotid yer değişimleri,
küçük insersiyon ve delesyonlar, kromozomal yeniden düzenleme ve kopya
sayısındaki dönüşümler genomik anormaliklerin geniş repertuarını oluşturur.
Nukleotid yer değişimler malign tümörlerde en sık karşılaşılan somatik
mutasyondur. Aynı hastanın normal ve tümörlü dokusundan alınan örneklerde
somatik nukleotid yer değişimleri etkili bir şekilde belirleyen birçok genetik ve
biyoinformatik araç geliştirilmiştir. Kanser örneklerinde belirlenen mutasyonla ilgili
fonksiyonel değişiklikleri hesaplamada kullanılan birçok yöntem buna paralel olarak
geliştirilmiştir(9).
Kanser örneklerinde ortaya konan tüm genomik dizinle keşfedilen somatik
mutasyonların ikinci kategorisini küçük insersiyon ve delesyonlar temsil eder. Bu
mutasyonlar nukleotid yer değişimlerden on kat daha az görülmesine karşın kanser
progresyonunda oldukça etkilidir.
Kanser genomunda kromozomal yeniden düzenlemelerinin sistematik olarak
ortaya konması, yeni nesil dizin metodolojilerinin en önemli uygulamalarından
biridir. Bununla ilgili önceki stratejiler hematopoetik tümörlerdeki reküren
translokasyonları sitogenetik yöntemlerle ortaya koymaya dayanıyordu. Son
21
gelişmelerle, biyoinformatik ve fonksiyonel yöntemlerin kombine kullanımının
devreye girmesi sağlanarak, solid epitelyal tümörlerde reküren translokasyonları
tesbit etme imkanı sağlanmıştır(10).
Genom ve transkriptom’ların (transcriptom) yeni dizin analizlerinin
kullanımı, kanser spesmeninde oluşan kromozom içi ve kromozomlar arası yeniden
düzenlenmenin sistematik araştırmasını mümkün kılacaktır. Buda bazı tümörlerde
ve kanser hücre serilerinde, kanserdeki yeni gen füzyonlarının tesbit edilmesini ve
tüm major yapısal yeniden-düzenlemelerin sanal ortamda kataloglanmasını
sağlayacaktır (11).
Gelecekte, yeni metodolojiler microarray temeli çalışmalara göre daha fazla
avantaj sağlayacak, hasarlı alanların daha iyi tanımlanması, saturasyon yokluğu,
malign hücrenin genomik bölgelerindeki değişiklikleri daha doğru tahmin etmeyi
kolaylaştıracaktır (12).
Kanser genomunun tanımlanması klinik pratiği birçok düzeyde devamlı
olarak etkilemektedir. Bir tarafta yeni kanser genleri tanımlanırken, diğer taraftan
tümör taksonomisi yeniden düzenlenmektedir. Genomik devrim öncesine kadar,
tümör iki kritere göre sınıflandırılırdı; lokalizasyon (tümörün ortaya çıktığı alan) ve
tümörün görünümü (histolojik yapısı). Bu iki kriter prognozun belirlenmesinde ve en
iyi tedavi şeklinin oluşturulmasında günümüzde de hala kullanılmaktadır. Oysa,
histolojik olarak benzer tümörlerin klinik olarak farklı sonuçlar doğurduğu uzun
yıllardır bilinmektedir. Daha da ötesi, histolojik analizle farklılıkları ortaya
konamamış tümörler tedavilere çok farklı cevaplar verebilmektedir(13). Genetik
lezyon varlığının major kriter olduğu yeni tümör taksonomisi; genom bazlı bilgi
sayesinde daha iyi teşhis olanağı sağlayacak ve kişiye özgü tedavi planlamasını
mümkün kılacaktır.
2.4. KANSER EPİGENETİĞİ, EPİGENİTİK SÜREÇ VE EPİGENETİK
TEDAVİ
Epigenetik, genlerin ekspresyonlarında meydana gelen, kalıtılabilir ancak
DNA dizisinden bağımsız değişimlerdir. DNA dizinde meydana gelen çok sayıda
22
mutasyona ilave olarak, tüm insan kanserleri esaslı epigenetik değişiklikler içerir.
Epigenetik değişiklikler kanserogenezise neden olan gen mutasyonlarının erken
döneminde ortaya çıkar ve bu nedenle erken teşhis için olanak sağlar.
Epimutasyonlar ilaç tedavileriyle geri döndürülebilir bu da epigenetik tedavileri
olanaklı kılar.
İnsan genomunda bulunan yaklaşık 25.000-30.000 gen, belirli hücrelerde ve
belirli zamanlarda ifade edilmelidir. Hücreler gen ifadesindeki bu kontrolü
sağlayabilmek için yukarıda sözü edilen mekanizmaları kullanmanın yanı sıra
nükleozom yapılanmalarını da değiştirerek gen ekspresyonlarını düzenleyebilirler.
Nükleus içerisinde DNA, histon ve non-histom proteinleri ile kademeli olarak
paketlenerek kromatin şeklinde organize edilir. Kromatin yapısındaki değişiklikler
gen ifadesini kontrol eder: genel olarak kromatin yapı sıkılaşıp yoğunlaştığında
(heterokromatin) genler inaktive olur (sessizleşme, susturulma), kromatin yapısı
gevşeyerek açıldığında (ökromatin) ise genler aktive olarak ifade edilir. Kromatin
yapısındaki bu dinamik durum ise,
temel olarak geri dönüştürülebilir DNA
metilasyonu ya da histon modifikasyonları ile sağlanan epigenetik mekanizmalar ile
gerçekleştirilir. Epigenetik mekanizmalar şu şekilde sınıflandırılabilir:
●
DNA metilasyonu
●
Histon modifikasyonları
●
Kromatin yeniden modellendirilmesi (remodeling)
●
Kodlamayan RNA’lar aracılığı ile epigenetik düzenlenme
Bu işlemlerde görevli alan enzimler arasında, DNA metiltransferazlar
(DNMT), histon deasetilazlar (HDAC), histon asetiltransferazlar (HAT), histon
metiltransferazlar (HMT), histon demetilazlar ve metil CpGbağlanma proteini
MECP2 sayılabilir. Normal epigenetik paternlerden bir sapma olduğunda ortaya
çıkan gen ifadesindeki anormallikler çeşitli klinik sonuçlara yol açabilir.
Kanser, genetik ve epigenetik hataların birikimiyle ortaya çıkan ve normal
hücrenin metastatik tümör hücresine dönüşmesiyle sonuçlanan çok basamaklı bir
olaydır. DNA metilasyonundaki değişiklikler kanserle ilişkili genlerin ifadesinde
değişikliklere neden olur. DNA hipometilasyonu onkogenleri aktive eder ve
23
kromozom yapısının kararlılığını yitirmesine neden olurken, DNA hipermetilasyonu
tümör baskılayıcı genlerin susturulmasına yol açar.
Kanser
hücrelerinde,
histonlardaki
lizinlerin
asetilasyonunda
ve
metilasyonunda artış ve azalmalar olmaktadır. Kanser hücrelerinde H4-K16
asetilasyonunun
ve
H4-K20’deki
trimetilasyonun
ortadan
kaybolduğu
ve
heterokromatin yapısında bozulmaya yol açtığı saptanmıştır. Farklı kanser tiplerinde,
hatta aynı kanser tipinin değişik evrelerindeki histon modifikasyon paternleri özdeş
değildir. Tümör tiplerini farklı epigenetik paternlere göre sınıflandırmak, farklı tipleri
birbirinden ayırmada yardımcı olabilir, hatta gelecekte histon modifikasyon
paternlerini incelemek kanserin erken tanısına yardımcı olabilir.
Genomun epigenetik durumundaki değişikliklerin ters çevrilebilir olması
kanser tedavisinde yeni bir umut ışığı yakmaktadır. DNA metiltransferazlar ile histon
deasetilazlar gibi enzimleri inhibe ederek, tümör-supresör genlerinin epigenetik
olarak susturulmasını engelleyebilecek ya da bu genlerin yeniden aktivasyonunu
sağlayabilecek yeni kanser ilaçlarının geliştirilmesi üzerine yoğun çalışmalar
başlamıştır. Günümüzde, epigenetik inhibisyon için geliştirilmekte olan ilaçların ana
hedefleri DNA metil transferazlar ve histon deasetilazlardır. Epigenetik gen
susturulmasında rol alan karmaşık etkileşimler ağı, klinik olarak etkin bir tedavi için
çeşitli ilaçların beraber kullanılmasının daha doğru olacağını göstermektedir.
Gerçekten de, DNA metiltransferazlar ile histon deasetilazların inhibitörlerinin
birlikle kullanımının epigenetik olarak susturulmuş genlerin yeniden aktivasyonunda
başarılı sonuçlar verdiği görülmüştür. Bu yaklaşım klinik olarak test edilmeye
başlamak üzeredir.
2.5. MEME KANSERİ
Meme kanseri heterojen bir hastalık olup nokta mutasyonları, kromozomal
amplifikasyonlar,
delesyonlar,
yeniden
düzenlenmeler,
translokasyonlar
ve
duplikasyonları da içeren genetik anormaliklerin progresif birikimi sonucu oluşur
(14,15). Meme karsinogenezisinin tam anlaşılabilmesi için büyüme, invazyon ve
24
metastazla sonuçlanan hücresel program dönüşümüne neden olan genetik
değişikliklerin bilinmesi gerekir. DNA’dan RNA’ya ve RNA’dan proteine aktarılan
genetik bilgi akışında, herhangi bir adımdaki bozukluk meme karsinogenezisine
katkı sunar.
Germline mutasyonlar tüm meme kanserlerinin sadece %10’luk kısmını
oluştururken, meme kanserlerinin çoğu sporadiktir ve somatik genetik değişikliklerle
oluşur (Şekill 9) (16).
Şekil 9.Meme kanserinde genetik yatkınlık
Ailevi meme kanseri tüm meme kanserlerinin yaklaşık %20-%30’unu oluşturmaktadır. BRCA1 ve
BRCA2 mutasyonları kalıtımsal meme kanserinin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır. CHEK2, TP53,
PTEN ve STK11 diğer şüphelenilen genlerdir. Yeni keşfedilen genler, ailevi meme kanserinin %5’in
altında bir oranı oluşturmaktadır. Ailevi meme kanserinin yaklaşık yarısı hala açıklanamamıştır
(Olopade OI, Grushko TA, Nanda R, Huo D. Advances in breast cancer: pathways to personalized
medicine. Clin Cancer Res. 2008 Dec 15;14(24):7988-99)
2.5.1. Kalıtımsal Meme Kanseri
Aile öyküsü meme kanseri için en önemli risk faktörlerinden biridir. Ailevi
form meme kanserinin yaklaşık %20’lik bir kısmını oluştur. Ailevi kansere neden
olan birçok gen yakın zamanda ortaya konmuştur. Meme kanseri gelişiminde duyarlı
genler
sağladıkları
risk
düzeyi
ve
sıklıklarına
göre
üç
kategoride
sınıflandırılmaktadır: Nadir görülen ama etkinliği yüksek genler, nadir ama orta
düzeyde etkin genler ve düşük etkinlikli genler (Tablo 4) (17).
25
Tablo 4. Meme Kanserine Yatkınlık Yaratan Gen ve Lokuslar
Gen/Lokus
İlişkili Sendrom/Klinik Özellikler
Meme Kanseri
Riski
Mutasyon /
Minor Allel
Sıklığı
ETKİNLİĞİ YÜKSEK GENLER
BRCA1 (17q21)
Kalıtımsal meme/over kanser: billeteral/multifokal
meme tümörü, prostat, kolon, karaciğer, kemik
kanserleri
%60–% 85
(yaşamboyu)
1/400
BRCA2 (13q12.3)
Kalıtımsal meme/over kanser: erkek meme kanseri,
pankreas, safra kesesi, farenks, mide, melenom,
prostat kanseri.
%60–% 85
(yaşamboyu)
1/400
TP53 (17p13.1)
Li-Fraumeni sendromu: meme kanseri, yumuşak
doku sarkomları, santral sinir sistemi tümörleri,
adenokortikal, prostat kanseri, lösemi.
%50–%89
(50 yaş ile)
<1/10,000
PTEN (10q23.3)
Cowden sendromu: meme kanseri, hamartom, troid,
oral mukoza, endometrial, beyin tümörleri.
%25–% 50
(yaşamboyu)
<1/10,000
CDH1 (16q22.1)
Ailevi diffüz mide kanseri: lobuler meme kanseri,
mide kanseri
göreceli risk 6.6 <1/10,000
STK11/LKB1
(19p13.3)
Peutz-Jeghers sendromu: meme, over, testis,
pankreas, serviks, uterus, kolon kansereri,melonositik
makuller,GIS hamartomatoz polileri.
%30–% 50
(70 yaş ile)
<1/10,000
ETKİNLİĞİ ORTA DÜZEYDE GENLER
CHEK2(22q12.1)
Li-Fraumeni 2 sendromu (?): meme, prostat,
kolorektal, beyin tümörleri, sarkomlar.
genel risk 2.6
1/100–200
BRIP1 (17q22)
Meme kanseri: ayrıca FA-J Fanconi anemisi (bialelik
mutasyon)
göreceli
risk.2.0
<1/1000
ATM (11q22.3)
Ataxia-telangiectasia: meme, overian
tümörler,lösemi, lenfoma ; muhtemel mide, pankreas
ve mesane kanserleri;immun yetmezlik.
göreceli
risk2.37
1/33–333
PALB2 (16p12)
Meme, pankreas, prostat kanserleri: ayrıca FA-N
Fanconi anemisi
göreceli risk.2.3 <1/1000
DÜŞÜK ETKİNLİĞİ OLAN GEN VE LOKUSLAR
FGFR2 (10q26)
Meme kanseri
genel risk 1.26
0.38
TOX3 (16q12.1)
Meme kanseri
genel risk 1.14
0.46
LSP1 (11p15.5)
Meme kanseri
genel risk 1.06
0.3
TGFB1 (19q13.1)
Meme kanseri
genel risk 1.07
0.68
MAP3K1 (5q11.2)
Meme kanseri
genel risk 1.13
0.28
CASP8 (2q33-34)
Meme kanseri (koruyucu)
genel risk 0.89
0.13
6q22.33
Meme kanseri
genel risk 1.41
0.21
2q35
Meme kanseri
genel risk 1.11
0.11–0.52
8q24
Meme kanseri
genel risk 1.06
0.4
5p12
Meme kanseri
genel risk 1.19
0.2–0.31
26
2.5.1.1. Meme Kanser Gelişimine Yatkınlık Yaratan Nadir Görülen,
Etkinliği Yüksek Genler
Dominant geçişli ailevi meme kanser olgularının yarısına yakınınında BRCA1
ve BRCA2 mutasyonları gözlenmektedir. Bu mutasyon genel kadın populasyonunda
meme kanser gelişme riskini 10-30 kat artırmakta, yaşam boyu meme kanser
gelişimini yaklaşık %85 oranına çıkarmaktadır (18). BRCA1 ve BRCA2’ye bağlı
binden fazla germline mutasyon belirlenmiştir. Patolojik mutasyonu en sık daha kısa
bir protein üretilmesine, ya da protein fonksiyonunun değişmesiyle sonuçlanır
(17,18).
BRCA1-ilişkili meme kanseri BRCA2-ilişkili ve sporadik meme kanserinden
farklılık gösterir. BRCA1-ilişkili meme kanser daha agresif karekterlidir, daha genç
hastalarda görülülür, yüksek histolojik grade, yüksek proliferasyon oranı, anöploidi,
ve ER(-), PR(-), HER2(-) (“triple-negatif”) karekteri daha yüksektir. BRCA1-ilişkili
“triple-negatif” fenotip “basal-like” gen expresyon paterni gösterir (19). BRCA1 ve
BRCA2 tümör supresör genler olup fonksiyonları genomik stabilitenin devamını
sağlamaktır. Yaban tip BRCA1 ve BRCA2 mutasyonuna bağlı olarak heterozigotluk
kaybı (LOH) yaşandığında DNA onarımında defekt oluşur ve kanser gelişimine
zemin hazırlanır (19,20). BRCA1 ve BRCA2’nin DNA onarımındaki rolü BRCAilişkili meme kanserinde terapötik hedefler için imkan sağlar. Platinyum ajanlarla
DNA replikasyonu bloke edilebilir ya da PARP1 selüler enzim inhibitörleri
kullanılarak DNA onarımı için alternatif yollar sağlanabilir (21).
Bu sınafa giren
diğer genler TP53 PTEN,STK11/LKB1 ve CDH1 genleridir. Bu genler meme kanser
gelişme riskini 8-10 kat artırmaktadır. Hepsi de otozomal dominant geçiş gösteren,
tümör supresör fonksiyonu olan genledir (22).
27
2.5.1.2. Meme Kanser Gelişimine Yatkınlık Yaratan Etkinliği Orta
düzeyde, Az-sıklıkta Görülen Genler
Meme kanser gelişiminde orta derecede risk yaratan dört adet gen
belirlenmiştir. CHEK2, TM, BRIP1 ve PALB2. Bu genlerin her biri mutasyona
uğramış bireylerde meme kanser gelişimini 2-3 kat artırmaktadır (18). Bu genler
kalıtımsal meme kanser olgularının %2,3’ünü oluşturmaktadır. Genel populasyonda
mutasyon sıklıkları düşük (%0,1-%1) olduğundan ilgili çalışmalarda belirlenmeleri
oldukça zordur.
2.5.1.3. Meme Kanser Gelişimine Yatkınlık Yaratan Etkinliği Düşük,
Sık Görülen Gen ve Lokuslar
Meme kanseri olan kadınlarda %15-%40 oranında düşük risk paneline sahip
yaklaşık on farklı allel ve lokus belirlenmiştir (18). Çok sık görülmelerine karşın, bu
genlere bağlı meme kanser gelişme riski oldukça düşüktür (17). Buna karşın, bu allel
ve lokuslar muhtemelen diğer orta ve yüksek risk yaratan genlerle etkileşerek klinik
olarak önemli hale gelmektedir. BRCA ailesi içinde EFGFR2, MAP3K1 tek nükleotid
polimorfizmleri (SNPs) BRCA2 mutasyon varlığında risk artırıcı rol oynamaktadır.
2.5.2. Meme Kanserinde Somatik Değişiklikler
Meme kanserlerinin büyük çoğunluğu sporadiktir ve çok sayıda somatik
genetik değişikliğin birikimi sonucu gelişir (14). Son bilgilere ışığında meme
kanserli bireyde herhangi bir yerde ve zamanda yerleşmiş 50 -80 farklı somatik
mutasyon tarif edilmiştir (15). Bu mutasyonların çoğu DNA’nın hatalı replikasyonu
sonucu oluşurken, bir kısmı da muhtemelen endojen ya da eksojen mutagenlerle
oluşmaktadır. “Genom boyu ilişkilendirme çalışmaları /Genom-wide association
studies” (GWAS) yüzlerce somatik meme kanser aday geni tariflemiştir (23).
Günümüzde, tüm somatik mutasyonların açığa çıkarılması ve genetik değişiklerin
kataloglanması için yoğun çalışmalar ve uluslarası çabalar sürdürülmektedir.
28
Meme kanserinde ortaya konan her mutasyonun rolünü belirlemede hala
birçok zorluk bulunmaktadır. Tümörlerdeki somatik DNA mutasyonlarının çoğu
zararsız ve onkogenezise katkısı olmayan doğal biyolojik değişiklikler olan
“passenger” mutasyonlardır (14,15). Buna karşın,”driver” mutasyonlar hücrede
büyüme avantajları yaratan ve kanser gelişimine etki eden mutasyonlardır. Bu
mutasyonlar “aday kanser genleri/ candidate cancer genes” (CAN)’lerde bulunur
(24).
Somatik mutasyonların kataloglanması ve CAN genler hala tamamlanmamış
olsa da, yeterli sayıda ve çeşitlilik arzeden yapısal özellikler ortaya konulmuştur.
Meme kanserinde DNA mutasyonları oldukça heterojen karektere sahiptir; bu da
meme kanserindeki geniş fenotip varyasyonu, değişken tümör davranışı ve tedaviye
cevap vermedeki farklılıkarı açıklar mahiyetedir.
2.5.3. Meme Kanserinde Gen Ekspresyon Paterni
DNA tarafından kodlanmış ve hücresel programı yönlendiren genetik bilgi
akışı,
canlı
hücrenin
enzimatik
yollarla
DNA’dan
RNA’yı
yazdırması
(transkripsiyon) ve mRNA’yı proteine dönüştürmesi (translasyon) için gerekli
mekanizmaları çalıştırmasıyla sağlanır. DNA yapısındaki değişiklikler onunla ilişkili
mRNA ifadesinin (ekspresyon) düşüklüğü ya da yüksekliğine (overexpression) yol
açabilir. Anormal gen ekspresyon paterni meme kanserinin yaygın bulgusudur. Gen
ekspresyon profili yaklaşık 10 yıldır klinik uygulama alanına girmiş olup, çeşitli
tümörlerden alınan örneklerle gen ekspresyon profillerinin değerlendirilmesi hücresel
program dönüşümlerine ve tümör davranışını etkileyen gen değişikliklerinin
belirlenmesine olanak sağlamıştır. Elde edilen moleküler bulgular, tanı koymayı
geliştirme, rekürensleri tahmin etme ve kişiye-özgü tedavi planlamasında eşsiz
katkılar sağlamaktadır ve sağlayacaktır.
Meme kanserinin gen ekspresyon paternine göre sınıflandırılması Perou ve
ark. ile Sorlie ve ark. tarafından gerçekleştirilmiştir (Şekil 10.) (25,26). Yazarlar bu
sınıflamaları için meme kanserinin ”moleküler portreleri” tanımını kullandılar. Bu
29
kategori içinde ER(+) ya da PR(+) luminalA ve luminalB tömür tipi, HER2 genamplifiye tümör, ve bazal kreatinin ekspresyonu gösteren “basal-like” tümör
sınıflandırması yapıldı. Basal tümör tipik olarak ER(-), PR(-), HER2(-) olduğundan
sıklıkla “triple negatif” olarak adlandırılırsa da tüm basal-like tümörler triple-negatif
değildir.
Aynı zamanda van’t Veer ve ark. ve van de Vijyer ve ark. muhtemel metastaz
yapma oranı yüksek meme kanser hastalarını gen ekspresyon analiziyle saptayarak
tümörleri altgruplara ayırdılar (Şekil.11) (27,28).
Goldhirsch ve ark. prognostik değeri yüksek 70-gen profili işaretlediler
(29).Yüksek riskli nod-negatif hastaları belirlemede 76-genin işaretlendiği (76-gene
Rotterdam signature) prognostik gen ekspresyon paneli ve orta histolojik grade olan
hastalarda Genomic Grade Index(GGI) ile iyi ve kötü prognostik grupların ayrımını
sağlayan gen ekspresyon işaretlenmeleri geliştirildi (30).
Gen ekspresyon profilinin analiziyle tedavide sağlanacak faydanın daha iyi
belirlenmesi pratik uygulamaya geçmiştir. Bu prediktif işaretler klinisyenlere
hastalarıyla tedavi planlaması yaparken eşsiz yardımlar sağlar. Oncotype DX testi,
formalin fikse parafin bloklardan alınan örneklerin RT-PCR yöntemiyle gen analizi
yapılması ve bu sonuçlara göre antiöstrojen tedavinin planlanması esasına dayanır.
Bu test için, literatürdeki 250 aday genin genomik datasından, 16 kanser-ilişkili gen
ve 5 referans gen kullanılarak, teşhisten sonraki 10 yıl içinde gelişebilecek rekürensi
tahmin etmede, 0 ile 100 arasında değişen rekürens skoru hesaplayan algoritmalar
geliştirilmiştir (31).
Meme Kanseri Gen Ekspresyon Oranı (The Breast Cancer Gen Expression
Ratio) ER(+) meme kanserinin bir başka belirleyicisi olup, tedavi edilmemiş ER
(49/node(-) hastalarda rekürens riskini belirlemede kullanılmaktadır (32).
30
(Sørlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish
tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Sep 11;98(19):1086974).
Şekil 10. Meme dokusunda toplam 85 deneysel örneğin (78 kanser, 3 benign, ve 4
normal doku) gen ekspresyon paterni
31
(van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a predictor of survival
in breast cancer. N Engl J Med. 2002 Dec 19;347(25):1999-2009).
Şekil 11. Meme kanserinde prognoz göstergesi olan gen ekspresyon paterni
32
2.5.4. Meme Kanserinde GASC1
GASC1 (gene amplified in squamous cell carcinoma1,aynı zamanda
JMJD2C/KDM4C olarak ta bilinir) histon demetilazı kodlayan 9p23-24 bölgesine
yerleşik bir onkogendir. Sınırlı sayıda çalışma meme kanseri olgularında GASC1’in
artan ekspresyonunu (overexpression) rapor etmiştir(33).
Kanserin sadece genetik dönüşümlerle değil aynı zamanda histon
modifikasyonu ve DNA metilasyonunu içeren epigenetik değişikliklere bağlı
olarakta geliştiği bilinmektedir. Genetik ve epigenetik dönüşümler kanser
hücresindeki direkt ve indirekt olarak etkileşim içendedir. Özelikle, epigenetik
dönüşümler anormal kromatin düzenlemeye neden olan
genetik dönüşümler
doğurabilir. Özgün olarak, bir ‘epigenetik enzimi’ kodlayan gendeki dönüşüm,
tümörogenezisle sonuçlanacak olan bir histon kod değişimi yapabilir(34).
Kromozom 9p’deki genetik dönüşümlere akciğer, meme, mesane, özefagus
ve diğer birçok insan kanserinde rastlanmaktadır (35-39). 9p21-24 dönüşümleri
özelikle triple-negative (ER-, PR- ve HER-2-) meme kanserinde tanımlanmıştır(40).
Ayrıca BRCA2 mutasyon taşıyıcıları olan meme kanser hastalarında birlikte 9p23-24
amplifikasyonu saptanmıştır(35).
2.5.5. Meme Kanserinde Tnm Evrelemesi (Amerıcan Joınt Commıttee
on Cancer – AJCC 2003)
Primer Tümör (T)
TX
Primer tümör saptanamamaktadır
T0
Primer tümör yok
Tis
Karsinoma in situ
Tis(DCIS) Duktal karsinoma in situ
Tis(LCIS) Lobuler karsinoma in situ
Tis (Paget) Meme başının kitlesiz Paget hastalığı (Tümör olan Paget
hastalarında sınıflama tümörün boyutuna göre yapılır)
33
T1
Tümörün en büyük boyutu 2 cm veya daha az
T1mic
En büyük boyutu 0.1 cm veya daha az olan mikroinvazyon
T1a
En büyük boyutu 0.1 cm.den büyük olan ancak 0.5 cm.yi geçmeyen
tümör
En büyük boyutu 0.5 cm.den büyük olan ancak 1 cm.yi geçmeyen
T1b
tümör
En büyük boyutu 1 cm.den büyük olan ancak 2 cm.yi geçmeyen
T1c
tümör
En büyük boyutu 2 cm.den büyük olan ancak 5 cm.yi geçmeyen
T2
tümör
T3
En büyük boyutu 5 cm.den büyük olan tümör
T4
Herhangi bir boyutta ancak (a) göğüs duvarına veya (b) cilde direkt
yayılım
Göğüs duvarına yayılım, pektoral kası içermeden
T4a
Meme cildinde ödem (peau d’orange da dahil) veya ülserasyon, veya
T4b
aynı memede satellit deri nodülleri
T4c
T4a ve T4b birlikte
T4d
İnflamatuvar karsinoma
Bölgesel Lenf Nodülleri (N)
Klinik Sınıflama
NX
Bölgesel lenf nodları saptanamamaktadır (örn. daha önce çıkartılmış)
N0
Bölgesel lenf nodu metastazı yok
N1
İpsilateral lenf nod(lar)ında metastaz (fikse değil)
N2
Fikse veya gruplaşmış ipsilateral aksiller lenf nodlarında metastaz
veya klinik olarak belirgin* aksiller lenf nodu metastazı olmadığı durumlarda klinik
olarak belirgin ipsilateral internal mammaryal nodlarında metastaz
34
N2a
Birbirlerine veya çevre dokulara fikse ipsilateral aksiller lenf
nodlarında metastaz
N2b
Sadece klinik olarak aksiller lenf nodu metastazı olmadığında klinik
olarak belirgin* ipsilateral internal mammaryal nodlarda metastaz olduğunda
N3
Aksiller lenf nodu tutulumu olsun ya da olmasın ipsilateral
infraklavikular lenf nod(ları) metastazı veya klinik olarak belirgin* ipsilateral
internal mammaryal lenf nod(ları) metastazı ile birlikte klinik olarak belirgin
aksiller lenf nodu metastazı; veya aksiller ya da internal mammaryal lenf nodu
metastazı olsun ya da olmasın ipsilateral supraklavikular lenf nod(ları) metastazı
N3a
ipsilateral infraklavikular lenf nod(lar)ında metastaz
N3b
ipsilateral internal mammaryal lenf nod(lar)ında veya aksiller lenf
nod(ları)nda metastaz
N3c
ipsilateral supraklaviküler lenf nod(ları)nda metastaz
* Görüntüleme metodları (lenfosintigrafi hariç) veya klinik muayene ile veya
patolojik olarak açıkça görülerek saptanma durumunda ‘klinik olarak belirgin’ terimi
kullanılır.
Patolojik Sınıflama (pN)a
pNX Bölgesel lenf nodları saptanamamakta (örn. patolojik inceleme için daha
önce çıkartılmış veya çıkartılmamış)
pN0 Histolojik olarak bölgesel lenf nodu metastazı olmayan, izole tümör
hücreleri (ITH) için ek inceleme yok
Not:
H&E
boyası
ile
verifiye
edilebilen
ancak
sıklıkla
sadece
immünohistokimyasal(IHK) veya moleküler metodlarla saptanan, 0.2 mm.den daha
geniş olmayan tek tümör hücreleri veya küçük hücre kümeleri ‘izole tümör
hücreleri (ITH)’ olarak tanımlanır. ITH, proliferasyon veya stromal reaksiyon gibi
malign aktivite kanıtlarını genellikle göstermez.
35
pN0(i-) Histolojik bölgesel lenf nodu metastazı yok, negatif IHK
pN0(i+) Histolojik bölgesel lenf nodu metastazı yok, pozitif IHK, 0.2
mm.den geniş IHK kümesi yok.
pN0(mol -) Histolojik bölgesel lenf nodu metastazı yok, negatif moleküler
bulgular. pN0(mol+) Histolojik bölgesel lenf nodu metastazı yok, pozitif moleküler
bulgular. aSınıflama sentinel lenf nodu diseksiyonu uygulanan veya uygulanmayan
aksiller lenf nodu diseksiyonuna göre yapılır. Ardından aksiller lenf nodu
diseksiyonu uygulanmayan sentinel lenf nodu diseksiyonuna dayalı yapılan
sınıflama, sentinel nod için (sn) ile belirtilir, örn ; pN0(i+)(sn).
pN1 1-3 arası aksiller lenf nodlarında, ve/veya internal mamaryal nodlarda
sentinel lenf nodu diseksiyonu ile saptanan mikroskopik hastalıkla birlikte metastaz,
fakat klinik olarak belirgin değil**
pN1mi Mikrometastaz ( 0.2 mm.den geniş, 2.0 mm.den geniş değil)
pN1a 1-3 adet aksiller lenf nodunda metastaz
pN1b Sentinel lenf nodu diseksiyonu ile internal mammaryal nodlarda
mikroskopik hastalık olarak saptanan metastaz, fakat klinik olarak belirgin değil**
pN1c 1-3 adet aksiller lenf nodunda ve internal mammaryal nodlarda sentinel
lenf nodu diseksiyonu ile mikroskopik olarak saptanan metastaz, fakat klinik olarak
belirgin değil**. (3 aksiller lenf nodundan fazla pozitif nod varsa, artmış tümör
yükünü göstermek için internal mammaryal lenf nodları pN3b olarak sınıflandırılır).
(pN1a + pN1b)
pN2 4-9 aksiller lenf nodunda metastaz, veya aksiller lenf nodu metastazı
olmadığında internal mammaryal lenf nodlarında klinik olarak belirgin* metastaz
pN2a 4-9 aksiller lenf nodunda metastaz (2.0 mm.den büyük en az bir tümör
odağı)
36
pN2b Aksiller lenf nodu metastazı yokken, internal mammaryal lenf
nodlarında klinik olarak belirgin* metastaz
pN3 10 veya daha fazla aksiller lenf nodunda, veya infraklaviküler lenf
nodlarında, veya 1 ya da daha fazla aksiller lenf nodu pozitif olduğunda klinik olarak
belirgin* ipsilateral internal mammaryal lenf nodlarında metastaz; veya internal
mammaryal lenf nodlarında klinik olarak negatif mikroskopik metastazla birlikte
3’ten daha fazla aksiller lenf nodunda metastaz; veya ipsilateral supraklaviküler lenf
nodlarında metastaz
pN3a 10 veya daha fazla aksiller lenf nodunda metastaz (2.0 mm.den büyük
en az bir tümör odağı), veya infraklaviküler lenf nodlarına metastaz
pN3b 1 veya daha fazla pozitif aksiller lenf nodu varlığında klinik olarak
belirgin* ipsilateral internal mammaryal lenf nodu metastazı; veya sentinel lenf nodu
diseksiyonuyla saptanan fakat klinik olarak belirgin olmayan** mikroskopik
hastalıkla birlikte 3 veya daha fazla aksiller lenf nodunda veya internal mammaryal
lenf nodlarında metastaz.
pN3c ipsilateral supraklaviküler lenf nodlarında metastaz
* Görüntüleme metodları (lenfosintigrafi hariç) veya klinik muayene ile
saptanan metastazlarda ‘klinik olarak belirgin’ terimi kullanılır.
** Görüntüleme metodları (lenfosintigrafi hariç) veya klinik muayene ile
saptanamayan metastazlarda ‘klinik olarak belirgin olmayan’ terimi kullanılır.
Uzak Metastaz (M)
MX Uzak metastaz bulunamıyor
M0 Uzak metastaz yok
M1 Uzak metastaz var (Tümörün olduğu tarafta supraklaviküler lenf nodları
ve karşı memenin bölgesel lenf nodlarına metastazlar dahil)
37
Histopatolojik Grade (G):
Gx: Değerlendirilemiyor
G3: Kötü Diferansiye
G1: iyi diferansiye
G4: indiferansiye
Tablo 5. Meme Kanserinin TNM Sınıflamasına Göre Evrelendirilmesi
Evre 0
Tis
N0
M0
Evre I
T1a
N0
M0
Evre IIA
T0
N1
M0
T1a
N1
M0
T2
N0
M0
T2
N1
M0
T3
N0
M0
T0
N2
M0
T1a
N2
M0
T2
N2
M0
T3
N1
M0
T3
N2
M0
T4
N0
M0
T4
N1
M0
T4
N2
M0
Evre IIIC
Herhangi T
N3
M0
Evre IV
Herhangi T
HerhangiN
M1
Evre IIB
Evre IIIA
Evre IIIB
a
T1,T1mic’i de içerir
38
3. GEREÇ ve YÖNTEM
Çalışma,
Ankara
Üniversitesi
Tıp
Fakültesi
Klinik
Araştırmalar
Değerlendirme Kurulu tarafından 13 Aralık 2010 tarih ve 20-405 karar numarası ile
başlatıldı. Meme kanserinde GASC1 gen ekspresyonunu araştırmak amacıyla,
Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji ABD'nda patolojik incelemesi yapılan 44
kadın meme kanseri olgusuna ait materyaller kullanıldı. Eksizyonel biyopsi,
kadranektomi, lumpektomi ve/veya mastektomi materyalleri incelenen vakalarda
patoloji rapor nüshalarından tümör uzun çapı, tümör tipi, tümör grade'i, aksiller lenf
nodülü tutulumu, ER, PR ve c-erb bilgilerine ulaşıldı. Moleküler incelemede
kullanılmak üzere her bir vaka için tümörü temsil eden bir parafin blok ile
nontümöral meme dokusunu içeren ikinci bir parafin blok belirlendi. Bloklardan her
seferinde temiz mikrotom bıçağı kullanılarak 8 mikron kalınlığında 4-5 kesit alındı
ve steril ependorf tüplerine konularak moleküler inceleme için teslim edildi.
RNA İzolasyonu: Formalin ile fikse edilmiş parafine gömülü dokudan RNA
eldesi Roche High Pure FFPE RNA Micro Kit (Roche, Almanya; Kat. No:
04823125001) kullanılarak üretici firmanın önerdiği protokol doğrultusunda
gerçekleştirildi.
cDNA Sentezi: RNA örneklerinden cDNA sentezi, High Fidelity
Transcriptor cDNA sentez kiti (Roche Almanya; Kat. No: 0508995001) kullanılarak
üretici firmanın önerdiği ve aşağıda özetlenen protokol doğrultusunda gerçekleştirildi
(Şekil 12).
39
(Melike Dinççelik. Mide Kanserinde Glipikan 5 ve Glipikan 6’nın Ekspresyon Seviyelerinin Tanısal ve
Prognostik Önemi. Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, 2011).
Şekil 12. cDNA sentez basamakları. Master Karışım* çalışılan örnek sayısına göre
hesaplanarak Tablo 6’da verildiği gibi hazırlandı
Tablo 6. Master karışım hazırlama prosedürü
Master Karışım*
1X
Transcriptase Reaction Buffer
4 μL
Protector RNase Inhibitor
0.5 μL
dNTP
2 μL
DTT
1 μL
Reverse Transcriptase
1.1 μL
TOPLAM HACİM
8.6 μL
40
Elde edilen cDNA’lar kantitatif gerçek zamanlı PCR yapılana kadar -20⁰C’de
saklandı.
Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (Real-Time PCR): Kantitatif gerçek
zamanlı PCR, Roche LightCycler 2.0 cihazında TaqMan prob yöntemi ile
gerçekleştirildi. Bu amaçla Roche LightCycler TaqMan Master (Roche, Almanya;
Kat No: 04735536001) kullanıldı.
GASC1 (Gene Amplified in Squamous Cell Carcinoma 1) ve GAPDH
(Gliseraldehit 3-Fosfat Dehidrojenaz) genlerinin ekspresyon analizi için kullanılan
primer ve prob dizileri Tablo 7’de verilmiştir.
Tablo 7. Primer ve prob dizileri
Lokus
Dizi
GAPDH
EKZON 8
GAPDH-F
5’- ATCATCCCTGCCTCTACTGG -3’
GAPDH-R
5’- GTCAGGTCCACCACTGACAC -3’
GAPDH-P
5’-(FAM) ACCTTGCCCACAGCCTTGGC (TAMRA)-3’
GASC1
EKZON 15
GASC1-F
5’- AAGTCGTTACATCGGAGGGA -3’
GASC1-R
5’- CAGCACTTTGCACAGGAAAT -3’
GASC1-P
5’-(FAM) TCTCCACCCAATGCCTTCCTTGA (TAMRA)-3’
41
Araştırılacak her bölge için reaksiyon karışımı için Roche Taqman Master
Miks kullanılarak aşağıda belirtildiği şekilde hazırlandı (Tablo 8).
Tablo 8. Reaksiyon karışımı hazırlama prosedürü
REAKSİYON KARIŞIMI
1X
Master mix
4 μL
Primer F
2 μL
Primer R
2 μL
Prob
2 μL
dH2O
5 μL
TOPLAM HACİM
15 μL
Araştırılacak her bir gen için ayrı ayrı reaksiyon karışımı hazırlandı. Her bir
örnek için kapillere 15μl reaksiyon karışımı ve 5μl cDNA örneği ilave edildi.
Reaksiyon koşulları aşağıdaki tablodaki gibi oluşturuldu.
Tablo 9. Kantitatif gerçek zamanlı PCR reaksiyon koşulları
Sıcaklık
Süre
95 °C
10 dk
1
Denatürasyon
95 °C
10 sn
50
“Annealing”
54 °C
30 sn
Uzama/Sentez
72 °C
3 sn
40 °C
30 sn
Pre-Inkübasyon
Döngü sayısı
Amplifikasyon
Soğutma
1
İstatistiksel Değerlendirme
GASC1 geninin ekspresyon seviyesi için ΔΔCt (Delta delta Ct) yöntemi ile
rölatif gen ekspresyon analizi yapılmıştır. Bir dokuda GASC1ekspresyon seviyesi, o
42
dokuda GASC1 için elde edilen Ct değerinin, aynı dokuda GAPDH (housekeeping)
için elde edilen Ct değerine oranlanmasıyla hesaplanmıştır.
Normal ve tümörlü dokularda ekspresyon karşılaştırılmasında Wilcoxon testi
kullanılırken,
tümörlü doku ekspresyonunun normal doku ekspresyonuna oranı
bakımından gruplar arası (G, T, N, ER, PR ve c-erb) karşılaştırmalarda Mann
Whitney U testi ve Kruskal Wallis testi kullanıldı. Tanımlayıcı istatistik olarak
ortanca(minimum-maksimum) verildi. Yaş ile normal ve tümörlü doku ekspresyonu
arasındaki ilişki ise Spearman rho korelasyon katsayısı ile incelendi. Analizler SPSS
15.0 for Windows paket programı ile gerçekleştirildi. P<0.05 istatistiksel olarak
anlamlı kabul edildi. Grafikler ortanca (minimum-maksimum) değerleri kullanılarak
çizildi.
43
4. BULGULAR
Histopatalojik tanısı “invaziv duktal karsinoma” olan meme kanserli toplam
44 hastanın histopatolojik özelikleri Tablo 10’da özetlendi. Tüm hastalar, kadın
hastalardan oluşmuş olup, yaş ortalaması: 55.11(Min: 30, Maks: 79) bulundu.
Olguların % 29.54’ünün T1, % 63.63’ünün T2, % 6.81’inin T3 tümör olduğu
görüldü. Bölgesel (aksiler) lenf nodu tutulumu değerlendirilmiş 33 hastanın %
27.27’sinin pN0, % 27.27’sinin pN1, % 22.72’sinin pN2, % 6.81’inin pN3 olduğu
tespit edildi. Hastaların 11’inde patoloji raporlarında bölgesel lenf durmuna ait
bilgiye rastlanmadı (%25’i pNx ). Hastalar grade’ine göre değerlendirildiğinde ; %50
G2, %50 G3 olarak bulundu.
Tablo 10. Olguların histopatolojik sonuçları
Özelikler
Sayı(n=44)
%
T1
13
29.54
T2
28
63.63
T3
3
6.81
G2
22
50.00
G3
22
50.00
pNx
11
25.00
pN0
12
27.27
pN1
8
27.27
pN2
10
22.72
pN3
3
6.81
GASC1 ekspresyon ölçümü için çalışmaya alınan 44 olgunun 3’ünde normal
dokuda ve 2’sinde tümörlü dokuda bilinmeyen teknik nedenlerden ötürü ekspresyon
ölçümü yapılamadı. Toplam 39 olguda hem normal dokuda hemde tümörlü dokuda
ekspresyon ölçümü gerçekleştirildi (Tablo 11).
44
Tablo 11. Normal ve tümörlü dokuda GASC1 ekspresyonu ölçülebilen olguların
dağılımı
Özelikler
GASC1 ekspresyonu
ölçülebilen
GASC1 ekspresyonu
ölçülemeyen
GASC1 ekspresyonu
ölçümü “0” olan
Normal
doku
(N=44)
Tümör
dokusu
(N=44)
Normal+Tümörlü doku
(N=88)
41
42
83
3
2
5
4
1
5
Normal ve tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyon sonuçlarının yaş ile
ilişkisi bulunamadı (normal dokuda: r=0,215 p=0,071, tümörlü dokuda: r=0,180
p=0,254).
Normal dokuda GASC1 eksprosyon ölçümü yapılmış 41 olgu, tümörlü
dokuda GASC1 ekspresyon ölçümü yapılmış 42 olgu ile ekspresyon değerlerine göre
karşılaştırıldığında, tümörlü dokuda GASC1ekspresyonu istatistiksel olarak anlamlı
derecede yüksek bulundu (Grafik 6) .
Normal dokularda da bazal seviyede GASC1ekspresyonu tespit edildiği için,
hem normal dokudan hem tümörlü dokudan ekspresyon ölçümü yapılabilen 39
olgunun tümörlü dokusunda ölçülen GASC1 ekspresyon değerleri normal dokusunda
ölçülen ekspresyon değerine oranlandı, elde edilen oranlar olguların grade (G), tümör
büyüklüğü (T), patolojik lenf nodu tutulumu (pN) ve ER, PR, c-erb durumları ile
karşılaştırıldı:
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda ölçülen
ekspresyonuna oranı G3 olgularda da daha yüksek bulunmasına karşın bu yükseklik
istatistiksel olarak anlamlı değildi (Grafik 7) .
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda ölçülen
ekspresyona oranı; tümör çapı (T) ve lenf nodu tutulumu (pN) ile ayrı ayrı
karşılaştırıldığında her ikisinde de fark bulunamadı (Grafik 8) (Grafik 9.).
45
Ekspresyon
p=0.022
Grafik 6. Normal dokuda GASC1 eksprosyon ölçümü yapılmış 41 olgu ile tümörlü
dokuda GASC1 ekspresyon ölçümü yapılmış 42 olgunun karşılaştırılması
1,4000
p=0.322
Tümör/Normal
1,2000
1,0000
,8000
,6000
,4000
,2000
,0000
0
0,5
1
G2
1,5
2
2,5
G3
Grafik 7. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda ölçülen
ekspresyonuna oranının G3 ve G2 olgularda karşılaştırılması
46
1,4000
p=0.462
1,2000
Tümör/Normal
1,0000
,8000
,6000
,4000
,2000
,0000
0
0,5
T1
1
1,5
T2
2
3T3
2,5
3,5
Grafik 8. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun tümörsüz dokuda
ölçülen ekspresyona oranının tümör çapı (T) ile karşılaştırılması
1,4000
p=0.103
1,2000
Tümör/Normal
1,0000
,8000
,6000
,4000
,2000
,0000
0
1PN0
2 PN1
3 PN2
4
PN3
5
Grafik 9. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda ölçülen
ekspresyona oranının lenf nodu tutulumu (pN) ile karşılaştırılması
47
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda ölçülen
ekspresyona oranı; reseptör durumu (ER, PR) ve c-erb ekspresyonu ile ayrı ayrı
karşılaştırıldığında fark bulunamadı (Grafik 10) (Grafik 11) (Grafik 12).
Tümör/Normal
p=0.544
Er-
Er+
Grafik 10. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının ER durumu ile karşılaştırılması
Tümör/Normal
p=0.697
Pr-
Pr+
Grafik 11. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının PR durumu ile karşılaştırılması
48
Tümör/Normal
p=0.175
c-erb-
c-erb+
Grafik 12. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının c-erb durumu ile karşılaştırılması
Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda ölçülen
ekspresyona oranı; triple-negatif olgular ile karşılaştırıldığında fark bulunamadı.
Tümör/Normal
p=0.294
Triple(-)
Diğer
Grafik 13. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun normal dokuda
ölçülen ekspresyona oranının triple-negatif olgular ile karşılaştırılması
49
5. TARTIŞMA
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir. Dünyada yılda yaklaşık 1
milyon yeni meme kanseri olgusu teşhis edilmekte ve yılda yaklaşık 400.000 hasta
bu hastalık nedeniyle ölmektedir (1). Birçok onkogen, tümör supressör gen, seks
steroid
hormonu
ve onların
reseptörleri
meme kanserin
gelişiminde rol
oynamaktadır. Meme kanseri farklı biyolojik davranışı, klinikopatolojik özelikleri ve
moleküler karekteristikleri olan alt gruplara sahip heterojen bir kanserdir. Farklı alt
grupların tedaviye cevapları ve prognozları önemli oranda farklılık göstermektedir.
Gen ekspresyon analizinde sağlanan ilerlemeler meme kanserinin biyolojik
karekterinin belirlenmesine ve son dönemde tedavi kararının verilmesine uyarlanmış
durumdadır. Anormal gen ekspresyon paternine en çok meme kanserinde
rastlanması, meme kanserinde gen ekspresyon çalışmalarnın önemini artırmaktadır.
Meme kanserinin moleküler biyolojisini ve gen ekspresyon paternini daha iyi
anlamamız, bu kanseri önleme, bulgulama ve tedavi stratejilerini geliştirmemize
eşsiz katkılar sunacaktır. Sağlanan genomik ilerlemeler ışığında, meme kanserinde
yeni yaklaşım tümörün moleküler karekteristiğine göre sınıflandırılması tedavi
planlamasının ona göre yapılması şeklinde olacaktır.
GASC1 histon demetilazı kodlayan 9p23-24 bölgesine yerleşik bir
onkogendir. Daha önce yapılmış kromozom analizleri 9p23-24 amplikasyonunun
birçok tümör tipinde rastlandığını göstermiştir (35-39). İlk olarak 2000 yılında Yang
ve ark. özefagus kanser hücre serilerinde 9p23-24 amplikasyonunda GASC1 gen
klonlanmasını gösterdiler (38). Takip eden çalışmalarda meme kanserinde de 9p2324 artışı (gain) gösterildi(33,40). BRCA2 mutasyon taşıyıcıları olan meme kanser
hastalarında, birlikte 9p23-24 amplifikasyonunun saptanması dikkatleri bu alana
çevirdi (35). Hücre serilerinde yapılan bir çalışma ile GASC1’in meme kanserinde
9p23-24 amplikasyonu için hedef genlerden biri olduğu gösterildi (33). Hücre serileri
kullanılarak gerçekleştirilen bu çalışmada, GASC1 amplikasyonunun ya da
overekspresyonunun meme kanser onkogenleri olarak bilinen diğer genlere benzer
şekilde, transformasyon oluşturan gen gibi davrandığı rapor edildi (33). Bu bulgular
50
meme kanserinin gelişiminde ve progresyonunda GASC1’in artan öneminin
göstergeleri olarak kabul edilmelidir.
Doku
örneklerinde
gerçekleştirilen
çalışmamız
sonucunda
GASC1
ekpresyonunun meme kanserli hastanın kanserli dokusunda normal dokuya oranla
daha yüksek bulunması, GASC1 geninin meme kanseri gelişiminde etkili bir onkogen
olduğunu göstermektedir. Çalışmamızda GASC1 ekspresyonunun istatistiksel olarak
anlamlı olmasada yüksek grade’li olgularda daha yüksek olması ise GASC1 genin
meme
kanserinde
prognostik
bir
gösterge
olarak
kullanılabileceğini
düşündürtmektedir. Çalışmamızda tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun
normal dokuda ölçülen GASC1 ekspresyona oranı, tümör çapı ve bölgesel (aksiller)
lenf nodu tutulumu ile karşılaştırıldığında her ikisinde de fark bulunamamasına
karşın, olgu sayısı daha yüksek çalışmalarla bu sonuçlar değişebilir gibi
görünmektedir. Bazı çalışmalar, ER(-) meme kanserinde 9p22-24 artışının (gain)
daha sık görüldüğünü rapor etmiştir(41). Çalışmamızda GASC1 ekspresyon düzeyi
ile olguların ER, PR ve c-erb durumları ayrı ayrı karşılaştırıldığında anlamlı fark
bulunamadı. Daha önce yapılmış çalışmalar GASC1 ekspresyonunun özellikle triplenegatif meme kanserinde artış gösterdiğini rapor etmiştir(40). Değişime uğramamış
(nontransformed) insan meme epitel hücrelerinde GASC1 ekspresyon artışının,
büyüme faktöründen bağımsız proliferasyon içeren neoplastik değişime neden
olduğu belirtilmiştir(33). Triple-negatif meme kanserinin agresif doğası gözönüne
alındığında GASC1 ekspresyon artışının meme kanseri için kötü prognoz göstergesi
olduğu görülmektedir. Çalışmamızda triple-negatif olgularda GASC1 ekspresyon
düzeyinde normal dokuya göre fark bulunmamakla birlikte, hasta serimizde triplenegatif olgu sayısının sadece 5 olgu ile sınırlı olması göz önüne alındığında,
güvenilir sonuç elde etmek için daha yüksek sayılı triple-negatif olguyla yapılacak
çalışmalara ihtiyaç olduğu görülmektedir. İstatistiksel olarak anlamlı olmasa da,
bizim çalışmamızda G3 hastalarda GASC1 ekspresyonunun G2 hastalara göre daha
yüksek bulunması GASC1 ekspresyon artışının meme kanserinde kötü prognoz
göstergesi olarak yorumlanabileceğini göstermektedir.
Epigenetik çalışmalarda DNA metilasyonundaki değişikliklerin kanserle
ilişkili genlerin ifadesinde değişikliklere neden olduğunu gösterilmesi; GASC1’in
51
histon demetilazı kodlayan bir onkogen olarak meme kanserindeki önemini
artırmaktadır.
Epigenetik
değişikliklerin
kanserogenezise
neden
olan
gen
mutasyonlarının erken döneminde ortaya çıktığı ve bu nedenle erken teşhis için
olanak sağladığı bilinmektedir. Oluşan epimutasyonların ilaç tedavileriyle geri
döndürülebilir
olması
epigenetik
tedavileri
olanaklı
kılmaktadır.
DNA
metiltransferazlar ile histon deasetilazlar gibi enzimleri inhibe ederek, tümörsupresör genlerinin epigenetik olarak susturulmasını engelleyebilecek ya da bu
genlerin yeniden aktivasyonunu sağlayabilecek yaklaşımların geliştirilmiş olması
meme kanserinde GASC1 çalışmalarının önemini artırmaktadır.
Sonuç olarak, çalışmamızda elde edilen veriler ışığında; GASC1 geninin
meme kanseri olgularında, tümörün genomik sınıflandırmasında ve hedefe yönelik
tedavi çalışmalarında hesaba katılması gereken bir onkogen olduğu görülmektedir.
Olgu sayısının arttırılması ile birlikte yapılacak olan ileri çalışmalarla, GASC1
geninin meme kanseriyle ilişkisi daha iyi aydınlatılabilecektir.
52
6. ÖZET
Giriş ve Amaç: Meme kanseri kadınlar arasında dünyada en sık görülen ve
en çok ölüme neden olan kanserdir. Birçok onkogen, tümör supressör gen, seks
steroid hormonu ve onların reseptörleri meme kanserinin gelişiminde rol
oynamaktadır. Moleküler biyolojideki ilerlemeler sayesinde, meme kanseri
gelişimine neden olan çok sayıda gen izole edilmiş ve meme kanserindeki
anormallikler gösterilmiştir. DNA değişiklikleri ve onunla ilişkili mRNA’nın
ekspresyon artışı ya da azalışı; sonuç olarak anormal gen ekspresyon paterni meme
kanserinde yaygın bulgudur. Gen ekspresyon profili yaklaşık 10 yıldır klinik
uygulama alanına girmiş olup, çeşitli tümörlerden alınan örneklerle gen ekspresyon
değerlendirmesi
DNA
değişkliklerinin
neden
olduğu
hücresel
program
dönüşümlerini ve tümör davranışını belirleme imkanı sağlar. Elde edilen moleküler
bulgular, tanı koymayı geliştirme, rekürensleri tahmin etme ve kişiye-özgü tedavi
planlamasında eşsiz katkılar sağlar. Kanserin sadece genetik dönüşümlerle değil
aynı zamanda histon modifikasyonu ve DNA metilasyonunu içeren epigenetik
değişikliklere bağlı olarakta geliştiği artan oranda görünürlük kazanmıştır. Genetik
ve epigenetik dönüşümler kanser hücresinde direkt ve indirekt olarak etkileşim
içendedir. Özelikle, epigenetik dönüşümler anormal kromatin düzenlemeye neden
olan genetik dönüşümler doğurabilir. Özgün olarak, bir ‘epigenetik enzimi’ kodlayan
gendeki dönüşüm, tümörogenezisle sonuçlanacak olan bir histon kod değişimi
yapabilir. GASC1
(gene amplified in squamous cell carcinoma 1) ‘in histon
demetilazı kodlayan 9p23-24 bölgesine yerleşik yeni bir onkogen olduğu
düşünülmektedir. Son çalıışmalar 9p23-24 daki DNA amplifikasyonunun özefagus
ve meme kanserinide içeren birçok kanserde oluştuğunu göstermiştir. Bazı
yeniçalışmalar 9p21-24 artışının basal-like, triple-negative meme kanseriyle(ER-,
PR- and HER-2-) daha çok ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu çalışma da; yeni
keşfedilmiş bir onkogen olan ve daha çok özefagus kanserinde araştırılmış GASC1
genini meme kanseri olgularında çalışmak, elde edilecek sonuçların meme kanseri
olgularında, tümörün genomik sınıflandırmasına ve hedefe yönelik tedavi
çalışmalarına katkı sunması amaçlanmaktadır.
53
Gereç ve Yöntem: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji ABD'nda
patolojik incelemesi yapılan 44 kadın meme kanseri olgusuna ait materyaller
kullanıldı. Moleküler incelemede kullanılmak üzere her bir olgu için tümörü temsil
eden bir parafin blok ile nontümöral meme dokusunu içeren ikinci bir parafin blok
belirlendi. Bloklardan 8 mikron kalınlığında 4-5 kesit alınarak moleküler inceleme
için A.Ü.T.F. Genetik ABD’na gönderildii. Formalin ile fikse edilmiş parafine
gömülü dokulardan RNA eldesi, RNA’nın kantitasyonu, cDNA sentezi ve kantitatif
gerçek zamanlı PCR işlemleri gerçekleştirildi.GASC1 geninin ekspresyon seviyesi
için ΔΔCt (Delta delta Ct) yöntemi ile rölatif gen ekspresyon analizi yapıldı. Tümör
ve normal doku örneklerinde GASC1 ekspresyonları arasında fark olup olmadığı
Wilcoxon Signed Ranks test ile değerlendirildi. GASC1 ekspresyon seviyesinin,
tümör boyutu, lenf nodu tutulumu ve histolojik grade ile ilişkisi Mann Whitney U
test ile, GASC1 ekspresyon seviyesinin yaş ile ilişkisi Nonparametrik Correlations ile
değerlendirildi.
Bulgular: Hastaların yaş ortalaması:55.11 (Min: 30, Maks: 79) bulundu.
Klinikopatolojik olarak % 29.54’ünün T1, % 63.63’ünün T2, % 6.81’inin T3, tümör
olduğu görüldü. Hastaların % 27.27’sinin pN0, % 27.27’sinin pN1, % 22.72’sinin
pN2, % 6.81’inin pN3 ,%25’inin pNx olduğu görüldü. Hastalar grade’ine göre
değerlendirildiğinde ise %50 G2, %50 G3 olarak bulundu. GASC1 ekspresyon
ölçümü için çalışmaya alınan 44 olgunun 3’ünde normal dokuda ve 2’sinde tümörlü
dokuda ekspresyon ölçümü yapılamadı. GASC1 ekspresyonunun yaş ile ilişkisi
bulunamadı (normal dokuda: r=0,215 p=0,071, tümörlü dokuda:r=0,180 p=0,254).
Normal dokuda GASC1 eksprosyon ölçümü yapılmış 41 olgu, tümörlü dokuda
GASC1 ekspresyon ölçümü yapılmış 42 olgu ile ekspresyon değerlerine göre
karşılaştırıldığında, tümörlü dokuda GASC1 ekspresyonu istatistiksel olarak anlamlı
derecede yüksek bulundu. Tümörlü dokuda ölçülen GASC1 ekspresyonunun
tümörsüz dokuda ölçülen ekspresyonuna oranı G3 olgularda da daha yüksek
bulunmasına karşın bu yükseklik istatistiksel olarak anlamlı değildi. Tümörlü dokuda
ölçülen GASC1 ekspresyonunun tümörsüz dokuda ölçülen ekspresyona oranı; tümör
çapı (T) ve lenf nodu tutulumu (pN) ve ER, PR, c-erb durumları ile ayrı ayrı
karşılaştırıldığında fark bulunamadı.
54
Tartışma ve Sonuç: Bu çalışmada GASC1 geninin meme kanser olgularında
ekspresyonunu çalışıldı. Doku örneklerinde gerçekleştirilen çalışmamız sonucunda
GASC1 ekpresyonunun meme kanserli hastanın kanserli dokusunda normal dokuya
oranla daha yüksek bulunması, GASC1 genin meme kanseri gelişiminde etkili bir gen
olduğunu göstermektedir. GASC1 ekspresyonunun istatistiksel olarak anlamlı
olmasada yüksek grade’li olgularda daha yüksek olması ise GASC1 genin meme
kanserinde prognostik bir gösterge olarak kullanılabileceği anlamına gelmektedir.
Hasta sayısı artırılarak gerçekleştirilecek daha ileri çalışmalarla, meme kanseri ile
GASC1 ilişkisi için önemli sonuçlar elde edilebilir.
55
7. SUMMARY
Introduction and Purpose: Breast cancer is the most common malignancy
and the most deadly cancer among women worldwide. Multiple oncogenes, tumor
suppressor genes, and sex steroid hormones and their receptors are involved in the
genesis and development of breast cancer. With the progress of molecular biological
analysis, a number of genes involved in the development and progression of breast
cancer have been isolated and shown to have abnormalities in breast cancers. DNA
alterations lead to either under- or overexpression of their associated mRNAs;
consequently abnormal gene expression patterns are a common finding in breast
tumors. Gene expression profiling has been introduced into the clinical literature
during the past decade as research suggests that assessing the expression of multiple
genes in a tumor sample may reflect programs turned on by DNA alternations and
predict tumor behavior. So-called molecular signatures hold promise for improving
diagnosis, prediction of recurrence, and selection of therapies for individual patients.
It is increasingly apparent that cancer development not only depends on genetic
alterations but also on epigenetic changes involving histone modifications and DNA
methylation. Genetic and epigenetic alterations in cancer cells interact directly and
indirectly. In particular, epigenetic alterations can result from genetic alterations that
dictate abnormal chromatin regulation. Specifically, a genetic alteration in the gene
encoding an ‘epigenetic enzyme’ can lead to changes within the histone code, which
is involved in tumorigenesis in multiple tumor types. GASC1 (gene amplified in
squamous cell carcinoma 1) is considered to be one of the novel oncogenes in the
9p23-24 region, which is encodes a histone demethylase. Recent studies have
revealed that amplification of DNA at 9p23-24 frequently occurs in several human
tumors, including esophageal and breast cancers. Some new studies demonstrated
that gain of 9p21-24 is more prevalent in the basal-like, triple-negative breast
cancers, (ER-, PR- and HER-2-).
In this study, a newly discovered oncogene and
more researched esophageal cancer gene GASCI has been working in breast cancer;
results to be obtained of this study aims to contribute to breast cancer cases, genomic
tumor classification and studies of targeted therapy
56
Materials and Method: In this study we used materials of 44 women breast
cancer patients whose materials are previously examined in Ankara University
Faculty of Medicine, Department of Pathology. For each case we determined two
parafin blocks to use in molecular examination, one of them included tumoral tissue
and the other one included nontumoral breast tissue. 8 micron thick, 4- 5 sections
taken from blocks and sent to Ankara University Faculty of Medicine, Department of
Genetics for molecular examination. Obtaining of RNA, quantitation of RNA and
cDNA synthesis and quantitative real-time PCR procedures was performed by using
these paraffined and formalin fixed tissues. Relative gene expression analysis was
performed by using ΔΔCt (delta delta Ct) method for detecting of the level of GASC1
gene expression. Wilcoxon Signed Ranks test used for investigate if there is a
difference between GASC1 expression of tumor and normal tissue samples. The
relation between level of GASC1 expression and tumor size, lymph node
involvement, histogical grade and status of ER, PR, c-erb evaluated with Mann
Whitney U test; relationship between GASC1 expression levels and age was
evaluated with nonparametric correlations.
Findings: The patients mean age was 55.11( Min: 30, Maks:79). On clinic
and pathologic examination 29.53% was T1, 63.63% was T2, 6.81% was T3 of all
tumors. Lymph node ratios are: 27.27% pN0, 27.27% pN1, 22.72% pN2,6.81% pN3
and 25% was pNx. Patients for the grade of the disease and 50% G2, 50% G3 was
found. 44 case included for GASC1 expression measurement and 3 of the normal
tissue samples and 2 of the tumor tissues could not evaluated for GASC1 expression.
There was no correlation of age and GASC1 expression ( normal tissue r = 0,215 p =
0,071, tumoral tissue r= 0,180 p = 0,254 ). Measurement of GASC1 expression in the
normal tissue in 41 cases and measurement of GASC1 expression in the tumor tissue
in 42 cases were compared according to expression values. GASC1 expression in
tumor tissue was found significantly higher. Although GASC1 expression measured
in tumor tissue was higher than GASC1 expression measured in non-tumor tissue in
G3 cases, this elevation was not stastically significant. GASC1 expression
measurement tumor tissue and non-tumor tissue ratio was compared with tumor size,
lymph node involvement and status of ER, PR, c-erb but there was no difference.
57
Discussion and Conclusion: In this study, GASC1 gene expression in breast
cancer cases were studied.GASC1 expression measurement in breast cancer tissue of
cancer patients is higher than normal tissue, it shows that GASC1 gene is a gene that
is effective in the development of breast cancer. GASC1 expression is higher in highgrade cases although not statistically significant. This means that GASC1 expression
can be used as a prognostic indicator in breast cancer. In further studies that can be
made by increasing the patient number, significant results can be obtained in the
relationship between GASC1 and breast cancer.
58
8. KAYNAKLAR
1.
Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. Cancer statistics, 2009. CA:
a cancer journal for clinicians 2009; 59: 225-249
2.
Bray F, Pisani P, Parkin DM, GLOBOCAN 2002, Cancer Incidence, Mortality
and
Prevalence
Worldwide,
Descriptive
Epidemiology
Group,
IARC
CancerBase No. 5, version 2.0, IARCPress, Lyon, 2004
3.
Eser SY. Türkiye’de kanser insidansi. In: Tuncer AM, ed. Türkiye‟de Kanser
Kontrolü Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı,
2007: 17-45
4.
Yardım N, Mollahaliloğlu S. Türkiye’de kanser durumu ve uluslar arası
göstergeler ile uyumunun değerlendirmesi. Türkiye’de Kanser Kontrolü
Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı, 2009: 51-65
5.
Vogelstein B, Kinzler KW. Cancer genes and the pathways they control.Nat
Med. 2004 Aug;10(8):789-99.
6.
Kinzler KW, Vogelstein B. Lessons from hereditary colorectal cancer.Cell.
1996 Oct 18;87(2):159-70. Review.
7.
International
Human
euchromatic
sequence
Genome
of
the
Sequencing
human
Consortium.
genome.
Finishing
Nature.
2004
the
Oct
21;431(7011):931-45.
8.
Pleasance ED, Cheetham RK, Stephens PJ, et al. A comprehensive catalogue of
somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 2010 Jan
14;463(7278):191-6. Epub 2009 Dec 16.
9.
Meyerson M,Gabriel S,Getz G.Advences in understnding cancer genomes
through second generation sequencing. Nat Rev Genet 2010;11(10);685
10. Tomlins SA, Rhodes DR, Yu J, et al. The role of SPINK1 in ETS
rearrangement-negative prostate cancers.Cancer Cell. 2008 Jun;13(6):519-28
59
11. Stephens PJ, Greenman CD, Fu B, et al. Massive genomic rearrangement
acquired in a single catastrophic event during cancer development.Cell. 2011
Jan 7;144(1):27-40.
12. Meyerson M, Gabriel S, Getz G. Advances in understanding cancer genomes
through second-generation sequencing.Nat Rev Genet. 2010 Oct;11(10):685-96.
13. Bleeker FE, Bardelli A. Genomic landscapes of cancers: prospects for targeted
therapies. Pharmacogenomics. 2007 Dec;8(12):1629-33
14. Bell DW. Our changing view of the genomic landscape of cancer. J Pathol.
2010 Jan;220(2):231-43.
15. Wood LD, Parsons DW, Jones S,et al. The genomic landscapes of human breast
and colorectal cancers.Science. 2007 Nov 16;318(5853):1108-13. Epub 2007
Oct 11
16. Olopade OI, Grushko TA, Nanda R, Huo D. Advances in breast cancer:
pathways
to
personalized
medicine.
Clin
Cancer
Res.
2008
Dec
15;14(24):7988-99
17. Turnbull C, Rahman N. Genetic predisposition to breast cancer: past, present,
and future. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2008;9:321-45.
18. Foulkes WD. Inherited susceptibility to common cancers.N Engl J Med. 2008
Nov 13;359(20):2143-53.
19. Turner NC, Reis-Filho JS. Basal-like breast cancer and the BRCA1
phenotype.Oncogene. 2006 Sep 25;25(43):5846-53.
20. Venkitaraman AR. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and
BRCA2.Cell. 2002 Jan 25;108(2):171-82.
21. Fong PC, Boss DS, Yap TA, et al. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase
in tumors from BRCA mutation carriers.N Engl J Med. 2009 Jul 9;361(2):12334. Epub 2009 Jun 24
60
22. Stratton MR, Rahman N. The emerging landscape of breast cancer
susceptibility.Nat Genet. 2008 Jan;40(1):17-22
23. Forbes SA, Bhamra G, Bamford S,et al. The Catalogue of Somatic Mutations in
Cancer (COSMIC). Curr Protoc Hum Genet. 2008 Apr;Chapter 10:Unit 10.11.
24. Stratton MR, Campbell PJ, Futreal PA. The cancer genome.Nature. 2009 Apr
9;458(7239):719-24.
25. Perou CM, Sørlie T, Eisen MB, et al.. Molecular portraits of human breast
tumours.Nature. 2000 Aug 17;406(6797):747-52
26. Sørlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al. Gene expression patterns of breast
carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2001 Sep 11;98(19):10869-74
27. van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ,et al. Gene expression profiling
predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 2002 Jan 31;415(6871):5306.
28. van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a
predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med. 2002 Dec
19;347(25):1999-2009
29. Goldhirsch A, Wood WC, Gelber RD, Coates AS, Thürlimann B, Senn HJ.
Meeting highlights: updated international expert consensus on the primary
therapy of early breast cancer.J Clin Oncol. 2003 Sep 1;21(17):3357-65. Epub
2003 Jul 7.
30. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al. Gene expression profiling in breast cancer:
understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis.J
Natl Cancer Inst. 2006 Feb 15;98(4):
262-72
31. Paik S, Shak S, Tang G,et al. A multigene assay to predict recurrence of
tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Engl J Med. 2004 Dec
30;351(27):2817-26. Epub 2004 Dec 10
61
32. Ma XJ, Hilsenbeck SG, Wang W, et al.Erlander MG The HOXB13:IL17BR
expression index is a prognostic factor in early-stage breast cancer. J Clin
Oncol. 2006 Oct 1;24(28):4611-9.
33. Liu G, Bollig-Fischer A, Kreike B, van de Vijver MJ, Abrams J, Ethier SP,
Yang ZQ. Genomic amplification and oncogenic properties of the GASC1
histone
demethylase
gene
in
breast
cancer.Oncogene.
2009
Dec
17;28(50):4491-500. Epub 2009 Sep 28.
34. Esteller M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification
maps. Nat Rev Genet 2007;8:286–98.
35. Savelyeva L, Claas A, Matzner I, Schlag P, Hofmann W, Scherneck S, et al.
Constitutional
genomic
instability
with
inversions,
duplications,
and
amplifications in 9p23-24 in BRCA2 mutation carriers. Cancer Res
2001;61:5179–85.
36. Sharpless NE. INK4a/ARF: a multifunctional tumor suppressor locus. Mutat
Res 2005;576:22–38.
37. Vinatzer U, Gollinger M, Mullauer L, Raderer M, Chott A, Streubel B. Mucosaassociated lymphoid tissue lymphoma: novel translocations including
rearrangements
of
ODZ2,
JMJD2C,
and
CNN3.
Clin
Cancer
Res
2008;14:6426–31.
38. Yang ZQ, Imoto I, Fukuda Y, Pimkhaokham A, Shimada Y, Imamura M, et al.
Identification of a novel gene, GASC1, within an amplicon at 9p23–24
frequently detected in esophageal cancer cell lines. Cancer Res 2000;60:4735–
9.
39. Yang ZQ, Imoto I, Pimkhaokham A, Shimada Y, Sasaki K, Oka M, et al. A
novel amplicon at 9p23 – 24 in squamous cell carcinoma of the esophagus that
lies proximal to GASC1 and harbors NFIB. Jpn JCancer Res 2001;92:423–8.
62
40. Han W, Jung EM, Cho J, Lee JW, Hwang KT, Yang SJ, et al. DNA copy
number alterations and expression of relevant genes in triple-negative breast
cancer. Genes Chromosomes Cancer 2008;47:490–9.
41. Vincent-Salomon A, Lucchesi C, Gruel N, Raynal V, Pierron G, Goudefroye R,
et al.: breast cancer study group of the Institut Curie. Integrated genomic and
transcriptomic analysis of ductal carcinoma in situ of the breast.Clin Cancer
Res. 2008 Apr 1;14(7):1956-65
63