ankara üniversitesi fen bilimleri enstitüsü yüksek lisans tezi hücre
advertisement
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ HÜCRE DIŞI DNA’NIN SALMONELLA BİYOFİLMLERİNDEKİ ROLÜ Caner ÖZDEMİR BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI ANKARA 2015 Her hakkı saklıdır ETİK Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez içindeki bütün bilgilerin doğru ve tam olduğunu, bilgilerin üretilmesi aşamasında bilimsel etiğe uygun davrandığımı, yararlandığım bütün kaynakları atıf yaparak belirttiğimi beyan ederim. 24/07/2015 Caner ÖZDEMİR i ÖZET Yüksek Lisans Tezi HÜCRE DIŞI DNA’NIN SALMONELLA BİYOFİLMLERİNDEKİ ROLÜ Caner ÖZDEMİR Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Bölümü Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK Bu çalışmada 17 faklı Salmonella serovarında, eDNA’nın Salmonella biyofilmlerindeki rolü değerlendirilmiştir. DNaz I enzimi (50µg/mL) kullanılarak eDNA’nın Salmonella biyofilmine olan fonksiyonel ve yapısal etkilerini göstermek amaçlanmıştır. Mikrobiyal adezyonun başlangıç aşamasında eDNA’nın rolü, bazı Group C1, Kentucky, Infantis, Nchanga, Roughform, Virchow ve S. Typhimurium SL1344 gibi Salmonella serotiplerinde, biyofilm oluşumunun erken aşamasında 28°C (24 h) DNaz I varlığında daha fazla biyomas oluşturmaktadır. eDNA’nın bu serovaryeteler üzerinde önemli ölçüde olumsuz bir etkisi olduğu gözlemlenmiştir. Tüm olgun biyofilm örnekleri yüksek DNaz konsantrasyonunda (50 µg/mL) ortalama % 45,8 oranında eradike edilmiştir. Böylece olgun Salmonella biyofilmlerinde eDNA’nın önemli bir rolü olduğu gösterilmiştir. Bizim gözlemlerimiz daha önce yapılan çalışmaların aksine, eDNA’nın biyofilm oluşumunda önemli ve pozitif rol oynadığı yönündedir. eDNA biyofilm oluşumunun erken aşamasında Salmonella serovarları arasında negatif etki göstermektedir, birçoğu da eDNA yokluğunda biyofilm üretme yeteneğindedir. Buna ek olarak, biyofilm yapısında eDNA bulunmaması olgun Salmonella biyofilm örneklerinde destabilizasyona yol açmaktadır. Ekstrakte edilen eDNA profili diğer Enterobacteriaceae üyelerine benzer olarak 28 kb molekül büyüklüğüne sahiptir. Özet olarak, Salmonella biyofilmlerindeki eDNA’nın rolü serotiplere bağlı olarak farklılık göstermektedir. Temmuz 2015, 109 sayfa Anahtar kelimeler: Salmonella, biyofilm, hücre dışı DNA; mikrobiyal adezyon ii ABSTRACT Master Thesis ROLES OF EXTRACELLULAR DNA ON SALMONELLA BIOFILMS Caner ÖZDEMİR Ankara University Institute of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK In the present study, 17 different Salmonella serovars were monitored to evaluate the roles of eDNA in Salmonella biofilms. It was aimed to illuminate the effects of eDNA on functionality and structurality of Salmonella biofilms by using DNase I enzyme (50µg/mL). The assays for evaluating the roles of eDNA on the initial microbial adhesion showed some of Salmonella serotypes, such as Group C1, Kentucky, Infantis, Nchanga, Roughform, Virchow, and S. Typhimurium SL1344, formed significantly more biomass in the presence of DNase I during early stages of biofilm formation at 28 °C (24 h). It was observed that eDNA had a notable negative effect on the initial attachment of these serovars. All preestablished biofilm samples of serovars were eradicated by 45,8 % on the average at high concentrations of DNase I (50 µg/mL). Hereby, the remarkable role of eDNA in the structurality of mature Salmonella biofilms was demonstrated. Our observation stands in contrast to previous studies which show that eDNA plays an important and a positive role on biofilm formation. We concluded that eDNA has a notable negative effect among some Salmonella serovars during the early stages of biofilm formation, so many of them are more capable of producing biofilm in the absence of eDNA. Additionally, the absence of eDNA leads to destabilizing of the mature biofilm samples of Salmonella. The extracted eDNA has a 28 kb molecular weight similar to other Enterobacteriaceae members’ eDNA profile. In summary, the functional role of eDNA in Salmonella biofilms is dependent on the serovars. July 2015, 109 pages Key Words: Salmonella, biofilm, extracellular DNA, microbial adhesion iii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince, çalışmalarımı yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında bilgi ve önerileri ile bilimsel gelişmeme başından sonuna kadar katkıda bulunan; hayata yaklaşımıyla bizlere örnek olan, bilgi ve deneyimlerini her zaman bizimle paylaşan Hocam Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK’e (Ankara Üniversitesi, Biyoloji Bölümü), Çalışmalarım süresinde yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Nefise AKÇELİK’e (Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü), Çalışmalarımın deneysel aşamalarına olan katkılarının yanı sıra arkadaşlıklarıyla da bana destek olan başta Arş. Gör. Başar KARACA (Ankara Üniversitesi, Biyoloji Bölümü) olmak üzere; Prokaryot Genetiği Laboratuvarındaki arkadaşlarım Arş. Gör. Neslihan KARATUĞ (Ankara Üniversitesi, Biyoloji Bölümü) ve Fatma Neslihan Yüksel’ e, Desteklerini benden esirgemeyen annem, babam ve kardeşime, Teşekkürlerimi sunarım. Caner ÖZDEMİR Ankara, Temmuz 2015 iv İÇİNDEKİLER TEZ ONAY SAYFASI ETİK……………………………………………………………………………………i ÖZET…………………………………………………………………………………...ii ABSTRACT…………………………………………………………………………...iii TEŞEKKÜR…………………………………………………………………………...iv ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………………………...ix ÇİZELGELER DİZİNİ……………………………………………………….………xi 1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ............................................................................................... 3 2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri ..................................................................... 3 2.2 Biyofilm Tanımı ......................................................................................................... 6 2.3 Biyofilm Oluşum Aşamaları ..................................................................................... 6 2.4 Biyofilm Matriksi ...................................................................................................... 9 2.5 Salmonella Biyofilmleri ........................................................................................... 13 2.6 Salmonella Biyofilmlerinin Yapısal Bileşenleri…………………..……………..19 2.7 Hücre Dışı DNA ....................................................................................................... 26 3. MATERYAL VE YÖNTEM .................................................................................... 31 3.1 Materyal ................................................................................................................... 31 3.1.1 Bakteriler .............................................................................................................. 31 3.1.2 Besiyerleri ............................................................................................................. 32 3.2 Yöntem ..................................................................................................................... 36 3.2.1 Kongo kırmızısı içeren LB agar besiyerlerinde Salmonella suşlarının biyofilm morfotiplerinin belirlenmesi ................................................................ 36 3.2.2 Polistiren yüzeylerde biyofilm üreticisi Salmonella suşlarının belirlenmesi .. 36 3.2.3 Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi.................................................................................................. 38 3.2.4 Hücre dışı DNA’nın Salmonella’nın olgun biyofilmleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi ............................................................................... 39 3.2.5 Farklı orijinlerden gelen DNA'nın Salmonella'nın biyofilm oluşum sürecine olan etkilerinin değerlendirilmesi …………………………………...38 v 3.2.6 DNaz I enziminin Salmonella hücrelerinin canlılığı üzerindeki olası etkilerinin araştırılması ....................................................................................... 40 3.2.7 Genomik DNA izolasyonu ................................................................................... 40 3.2.8 Hücre dışı DNA izolasyonu ................................................................................. 41 3.2.9 Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu (RAPDPZR) analizleri ..................................................................................................... 42 3.2.10 İstatistik analizleri……………….…………………………………………….41 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA ...................................................... 44 4.1 Kongo Kırmızısı İçeren NaCl’siz LB Agar Besiyerlerinde Salmonella Suşlarının Biyofilm Morfotiplerinin Belirlenmesi ............................................ 44 4.2 Polistiren Yüzeylerde Biyofilm Üreticisi Salmonella Suşlarının Belirlenmesi .. 48 4.3 Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi.................................................................................................. 59 4.4 Hücre Dışı DNA’nın Salmonella’nın Olgun Biyofilmleri Üzerindeki Etkilerinin Değerlendirilmesi ............................................................................. 74 4.5 Farklı Orijinlerden Gelen DNA'nın (ekzojen) Salmonella'nınBiyofilm Üretimi Sürecine Olan Etkilerinin Değerlendirilmesi …………………….....84 4.6 DNaz I Enziminin Salmonella Hücrelerinin Canlılığı Üzerindeki Olası Etkilerinin Araştırılması ..................................................................................... 88 4.7 Hücre Dışı DNA’ nın Elektroforetik Tekniklerle Gösterilmesi .......................... 89 4.8 Hücre Dışı DNA ve Genomik DNA Orijinlerinin RAPD-PZR Tekniği Esas Alınarak Karşılaştırılması ............................................................................................ 90 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 93 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………….……109 vi SİMGELER DİZİNİ % µg µL µM ∞ AdrA AgfD ATM BapA bcs bdar bp C c-di-GMP CF CR csg CTAB Da dH2O DNA E. eDNA EDTA ENP Envz EPS g GTP HCl IHF kb KCl KH2PO4 kob LB LPS mL mm mM Na2HPO4 NaCl NarL ng nm yüzde mikrogram mikrolitre mikromolar sonsuz AgfD regulated A ince agregatif fimbriya adhesion test medium big adhesion protein A bacterial cellulose synthesis (brown, dry and rough) kahverengi, kuru ve pürüzlü baz çifti Celcius siklik-di-guanozin monofosfat kalkoflor Kongo kırmızılı agar curli synthesis gene setil trimetilamonyum bromid dalton distile su deoksiribonükleik asit Esherichia hücre dışı DNA etilendiamin tetraasetik asit hücre dışı nükleasyon presipitasyon yolağı membran bağlı sensör kinaz hücre dışı polimerik bileşen gram guanozin trifosfat hidroklorik asit bütünleşmiş ana faktör kilo baz çifti potasyum klorür potasyum mono fosfat koloni oluşturan birim Luria Bertani lipopolisakkarit mililitre milimetre milimolar di Sodyum Hidrojen Fosfat sodyum klorür nitrate reductase L nanogram nanometre vii OD OmpR P. pdar PDEs pGpG pH PVC PZR RAPD rdar rpm RpoS S. saw SDS SF STMH TE U UV V β optik dansite dış membran protein R Pseudomanas pembe, kuru ve pürüzlü fosfodiestereraz fosfoguanil guanozin power of hydrogen (hidrojenin gücü) poli vinil klorür polimeraz zincir reaksiyonu rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA red, dry and rough (kırmızı, kuru ve pürüzlü) (revolutions per minute) dakikadaki devir sayısı RNA polymerase sigma S Salmonella smooth and white (düz ve beyaz) sodyum dodezil sülfat serum fizyolojik serinhidroksimetilaz tris EDTA unit ultra viyole volt beta viii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Salmonella Typhimurium’un renklendirilmiş elekron mikrograf görüntüsü (Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH).......................................................................................... 3 Şekil 2.2 Biyofilm oluşumunun beş basamaklı aşamaları ve bu aşamaları gösteren mikrograflar............... 7 Şekil 2.3 Salmonella biyofilmlerindeki hücre dışı matiks bileşenlerinin regülasyonu (Kristina vd. 2007). .................................................................................................................... 16 Şekil 4.2 Salmonella suşlarının farklı inkübasyon sıcaklıklarındaki morfotip dağılımları ......................... 47 Şekil 4.4 Salmonella suşları arasındaki biyofilm üretim davranışlarının dağılımı (24 saatlik inkübasyon süresi). ..................................................................................................................... 58 Şekil 4.5 Salmonella suşları arasındaki biyofilm üretim davranışlarının dağılımı (48 saatlik inkübasyon süresi). ..................................................................................................................... 59 Şekil 4.6 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (20ºC/24 saat) ................................................................................... 60 Şekil 4.7 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (28ºC/24 saat)................................................................................... 61 Şekil 4.8 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (28ºC/48 saat)................................................................................... 61 Şekil 4.9 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (37ºC/24 saat)................................................................................... 62 Şekil 4.10 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (37ºC/48 saat).................................................................................. 62 Şekil 4.11a Salmonella Enteritidis (DMC3), DNaz I enzim uygulamasının (50 µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 63 Şekil 4.11b Salmonella Typhimurium (DMC4), DNaz I enzim uygulamasının (50 µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................... 63 Şekil 4.11c Salmonella Virchow (DMC5), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................................. 64 Şekil 4.11d Salmonella Infantis (DMC12), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................................. 64 Şekil 4.11e Salmonella Roughform (DMC13), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 65 Şekil 4.11h Salmonella Corvallis (DMC36), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 66 Şekil 4.11i Salmonella Thompson (DMC44), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................................. 67 Şekil 4.11j Salmonella Group C1 (DMC50), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 67 ix Şekil 4.11k Salmonella Senftenberg (DMC55), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................ 68 Şekil 4.11l Salmonella Agona (DMC59), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 68 Şekil 4.11m Salmonella Telaviv (DMC66), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................................. 69 Şekil 4.11n Salmonella Bispebjerg (DMC78), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................................. 69 Şekil 4.11o Salmonella Montevideo (DMC88), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 70 Şekil 4.11p Salmonella Montevideo (DMC90), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................................. 70 Şekil 4.11r Salmonella Salford (DMC93), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi ................................................................................................................. 71 Şekil 4.11s Salmonella Typhimurium SL1344 (M43), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi .................................................................................................. 71 Şekil 4.12a DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC3 S. Enteritidis’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ....................................................................................................................................... 75 Şekil 4.12b DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC4 S. Typhimurium'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................... 75 Şekil 4.12c DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC5 S. Virchow'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 76 Şekil 4.12d DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC12 S. Infantis’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 76 Şekil 4.12e DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC13 S. Roughform'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri .......................................................................................................................... 77 Şekil 4.12f DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC15 S. Nchanga’nın 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................................ 77 Şekil 4.12g DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC34 S. Kentucky’nin 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................... 78 Şekil 4.12h DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC36 S. Corvallis’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................................ 78 Şekil 4.12i DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC44 S. Thompson'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ....................................................................................................................................... 79 Şekil 4.12j DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC50 S. Group C1’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ....................................................................................................................................... 79 Şekil 4.12k DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC55 S. Senftenberg’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................... 80 Şekil 4.12l DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC59 S. Agona’nın 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 80 Şekil 4.12m DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC66 S. Telaviv’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................................ 81 x Şekil 4.12n DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC78 S. Bispebjerg’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................................ 81 Şekil 4.12o DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC88 S. Montevideo'nun 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................... 82 Şekil 4.12p DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC90 S. Anatum‘un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ........................................................................................................................................ 82 Şekil 4.12r DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC93 S. Salford'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri . 83 Şekil 4.12s DNaz I enziminin (50 µg/mL) S. Typhimurium SL1344’ün 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri ............................................................................................................................ 83 Şekil 4.16 P1254 primeri ile elde edilen RAPD-PZR profilleri (G; genomik DNA, E; hücre dışı DNA, rakamlar da suş kodlarını yansıtmaktadır). ..................................................................... 90 Şekil 4.17 P1283 primeri ile elde edilen RAPD-PZR profilleri (G; genomik DNA, E; hücre dışı DNA, rakamlar da suş kodlarını yansıtmaktadır) ...................................................................... 91 xi ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Bakteriyal biyofilmlerdeki hücre dışı polimerik bileşenlerin fonksiyonları……………………………………………………………………………...….11 Çizelge 2.2 Salmonella’nın biyofilm oluşumunda kritik rolü olan bazı yapısal matriks bileşenleri……………………………………………………………………………….……20 Çizelge 3.1 Çalışma dahilinde kullanılan Salmonella suşları …………………………………….………31 Çizelge 3.2 Biyofilm üretim kapasitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan “cut off” (sınır değer) dönüşümleri ............................................................................................................................ 37 Çizelge 3.3 RAPD-PZR çalışmaları için optimize edilmiş reaksiyon bileşenleri ...................................... 42 Çizelge 3.4 RAPD-PZR çalışmaları için tercih edilen primerler ve dizileri .............................................. 42 Çizelge 3.5 RAPD-PZR reaksiyon koşulları .............................................................................................. 42 Çizelge 4.1 Çalışma dahilindeki farklı Salmonella serovaryetelerinin üç farklı sıcaklıkta içerdiği biyofilm morfotipleri .............................................................................................................. 44 Çizelge 4.3a S. Enteritidis’in (DMC3) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 49 Çizelge 4.3b S. Typhimurium’un (DMC4) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 49 Çizelge 4.3c S. Virchow’un (DMC5) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 50 Çizelge 4.3d S. Infantis’in (DMC12) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 50 Çizelge 4.3e S. Roughform’un (DMC13) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri .................................................................................................................... 51 Çizelge 4.3f S. Nchanga’nın (DMC15) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 51 Çizelge 4.3g S. Kentucky’nin (DMC34) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 52 Çizelge 4.3h S. Corvallis’in (DMC36) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 52 Çizelge 4.3i S. Thompson’un (DMC44) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 53 Çizelge 4.3j S. Group C1’in (DMC50) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri .................................................................................................................... 53 Çizelge 4.3k S. Senftenberg’in (DMC55) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri .................................................................................................................... 54 Çizelge 4.3l S. Agona’nın (DMC59) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 54 xii Çizelge 4.3m S. Telaviv’in (DMC66) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri .................................................................................................................... 55 Çizelge 4.3o S. Montevideo’nun (DMC88) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri .................................................................................................................... 56 Çizelge 4.3p S. Anatum’un (DMC90) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ................................................................................................................... 56 Çizelge 4.3r S. Salford’un (DMC93) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri .................................................................................................................... 57 Çizelge 4.3s S. Typhimurium SL1344’ün (M43) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri ..................................................................................................... 57 Çizelge 4.4 Salmonella serovaryetelerinin DNaz I enzimi varlığında (50 µg/mL) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim profilleri. ........................................ 72 Çizelge 4.5 Olgun biyofilm örneklerinin (24 saatlik) DNaz I enzimi ile muamelesi sonucu 24 saat sonunda kontrol grubuna nispeten (DNaz I ile muamele edilmeyen) biyomasta meydana gelen azalma(%)…………………………………………………………...…...….83 Çizelge 4.6 DNaz I enziminin Salmonella’nın canlılığı üzerindeki etkileri.. ........................................... ..89 xiii 1. GİRİŞ Bakteriyel biyofilmler; bir nesneye, ara yüzeye ya da birbirine yapışık halde bulunan bakteri toplulukları olarak tanımlanmaktadır. Biyofilm içerisinde bulunan hücreler, kendi ürettikleri ve dış çevreye karşı kimyasal ve mekanik koruma sağlayan bir matriks içerisine gömülü olarak bulunmakta ve üzerlerinde çok çeşitili bileşiklerin birikmesine neden oldukları için hem endüstriyel hem de tıp alanında büyük sorunların ortaya çıkmasına neden olmaktadırlar (Møretrø vd. 2009). Biyofilm içerisindeki bakterilerin dezenfektanlara ve kurumaya karşı oldukça dirençli oldukları bilinmektedir (Matthysse vd. 1981, Zogaj vd. 2001). Salmonella enfeksiyonları çapraz kontaminasyonlar nedeniyle hızlı bir yayılma özelliği göstermektedir. Özellikle endüstriyel sanitasyon uygulamalarında, biyofilm oluşturma yeteneklerinden kaynaklanan dirençlilik sayesinde Salmonella suşları, canlılıklarını konakçı dışındaki çevrelerde de sürdürebilmektedirler. Bu da Salmonella kontaminasyonlarının hızlı bir şekilde yayılmasına neden olmaktadır. Biyofilmler içerisinde bulunan mikroorganizmalar, kendi ürettikleri sulu hücre dışı polimerik bileşenler (EPS) içerisine gömülü vaziyette, kendi ideal dış çevrelerini yaratarak yaşarlar. EPS, genellikle polisakkaritlerden, proteinlerden, nükleik asitlerden ve lipitlerden oluşmaktadır. Bu yapısal bileşenler, biyofilmlere mekanik bir stabilite sağlar, yüzey adezyonunu kolaylaştırır ve kohezif bir sistem oluşturur. Güncel araştırmalar birçok mikroorganizmanın üretebildiği ve bir hücre dışı polimerik bileşen olan hücre dışı DNA’nın, matriks bileşenlerinin birbirine bağlanmalarında ve in vitro biyofilm yapılarındaki stabilizasyonun sağlanmasında önemli fonksiyonları olduğunu göstermektedir (Allesen-Holm vd. 2006). Gram-negatif ve Gram-pozitif birçok bakterinin polimerik bir matriks bileşeni olarak hücre dışı DNA ürettiği bilinmektedir. Günümüze dek bu bağlamda yürütülen birçok çalışma, hücre dışı DNA’nın biyofilm sistemlerinin kararlılığında ve fonksiyonelliğinde müspet katkıları olduğunu vurgular niteliktedir. Ancak Salmonella cinsinde hücre dışı DNA’nın fonksiyonelliğine ve orijinine ilişkin henüz netleşmemiş bulgular, Enterobacteriaceae familyasında biyofilm yaşam biçiminin açıklığa kavuşturulmasında ciddi bir sorun yaratmaktadır. Zira hücre dışı DNA başlıca matriks bileşenlerinden bir tanesidir. Dolayısıyla biyofilm yaşam biçiminin başlangıç aşamasını teşkil eden mikrobiyal adezyonda, diğer majör matriks bileşenleriyle olan olası etkileşimlerinde ve biyofilmin üç boyutlu yapısallığının 1 tesisinde hücre dışı DNA’nın ne düzeyde bir rolünün olduğunun belirlenmesi kritik bir öneme haizdir. Tez çalışmasında, 17 farklı Salmonella serovarına dahil suşların biyofilmlerinde hücre dışı DNA varlığının araştırılması, hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilmlerindeki yapısal ve fonksiyonel etkilerinin saptanması ve son olarak da Salmonella biyofilmleriyle mücadelede hücre dışı DNA’yı hedef alan muhtemel stratejilerin geliştirilmesi için başlangıç niteliğindeki araştırmaların yapılması amaçlanmıştır. Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilmlerindeki rolü henüz netlik kazanmış değildir. Bu matriks bileşeninin varlığı S. Typhimurium ve S. Typhi gibi iki önemli serovarda saptanmıştır ancak; diğer bazı önemli serovarların biyofilmlerinde bu bileşenin varlığı henüz saptanmamıştır. Ayrıca hücre dışı DNA’ nın bahsi geçen Salmonella serovarlarının biyofilmlerinde biyofilm oluşumunun başlangıcında elzem bir aşama olan mikrobiyal adezyona katkı sağlamak yerine, adezyonu engellediğini gösteren bulgular mevcuttur. Hücre dışı DNA’nın adezyon aşamasından sonra Salmonella biyofilmlerinin olgunlaşmasında ve kararlılığında ne düzeyde etkinlik gösterdiği henüz netlik kazanmamıştır. Bu bağlamda çalışmada kullanılacak olan Salmonella suşlarının zengin bir serovar çeşitliliği göstermesi ve bu farklı serovarlarda hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilmlerinin oluşumundaki ve olgunlaşmasındaki muhtemel etkilerinin saptanması bu konudaki belirsizliği giderebilecek mahiyette olacaktır. 2 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri Salmonella ilk olarak 1880 yılında Eberth tarafından tanımlanmıştır ve 1884 yılında Gaffky tarafından kültüre alınmıştır (Burrows 1959). Salmonella cinsi Enterobacteriaceae familyasına dahil olup, Salmonella enterica ve Salmonella bongori olmak üzere iki tür içermektedir. Salmonella enterica alttür enterica’nın altı alt türü vardır ve memeli hayvanlarda en çok hastalığa neden olan serovarları kapsamaktadır. Diğer Salmonella enterica alt türleri salamae, arizonae, diarizonae, houtenae ve indica’dır. Bu alt türün üyelerinin birçoğu insanlar için sıklıkla patojenik niteliktedir ve genellikle sıcakkanlı (polikiotermik) hayvanların bağırsak kanalında bulunmaktadırlar (Popoff vd. 2005, Threfall vd. 2005). Salmonella fakültatif anaerobik, gram negatif, düz, çubuk şeklinde (0,7-1,5 x 2,0-5,0 µm), hareketini genellikle peritriş flagella ile sağlar. Salmonella Pullorum ve Salmonella Gallinarum haricinde hepsi peritriş flagellaya sahiptir (Anonymous 1990, Halkman vd. 1994) (Şekil 2.1). Şekil 2.1 Salmonella Typhimurium’un renklendirilmiş elekron mikrograf görüntüsü (Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH). 3 Bazı ekstrem durumlar haricinde Salmonella 7-48 °C sıcaklık aralığında gelişme gösterir. Bu bakteriler asidik stres, düşük su aktivitesi ve yüksek sıcaklık gibi koşullara adapte olarak çeşitli yüzeylerde canlı kalabilmektedirler (Kaufman 1998, White vd. 2006). Salmonella türleri enfeksiyon yoluyla hastalığa sebep olmaktadır. Organizma konakçı vücudunda gelişir, çoğalır ve konakçının hücreleri veya dokuları üzerine yerleşir. Salmonella bağırsakta çoğalır, koloni oluşturur ve sonuç olarak tüm bağırsak dokularını istila eder, ateş reaksiyonuna ve diyareye sebep olur (D’Aoust 1997). Salmonella konakçının doğal bağışıklık sistemine karşı kendini koruyabilmekte, kan doku ve lenfatik sisteme yerleşerek birçok ciddi semptomun gelişmesine neden olabilmektedir. S. Typhi insanlarda tifoid ateşin etkenidir. S. Typhimurium ise insan gastroenteritine neden olan en yaygın serovarlardan biridir. Hayvan konakçılarda S. Typhimurium tercihen bağırsak epitelindeki Peyer plaklarını istila etmektedir. Bakteriler, epitel dokuyu, makrofajların içine girerek geçerler. Salmonella suşları, makrofajlar içerisinde kalarak replike olurlar ve mezenterik lenf nodüllerine, dalağa ve karaciğere yayılabilirler (Zhang vd. 2000). Salmonella esas olarak insan ve hayvanların bağırsak sisteminde bulunan bir patojendir. Bazı Salmonella üyeleri konağa adapte olmuş ya da konak spesifiktir. Bunun en tipik örneği insanları enfekte edebilen S. Typhi’ dir. Konak spesifik diğer serovaryeteler: Paratyphi ve Sendai (insan), Pullorum ve Gallinarum (kanatlılar), Dublin (sığırlar), Choleraesuis (domuzlar, ancak insanları da enfekte edebilmektedir), Typhimurium ve Enteritidis (insan, sığır, kanatlılar, koyun, domuz, at ve yabani kemirgenlerde) ana hastalık etmenleridir. (Singleton ve Sainsbury 1996, Wain vd. 2005). İnsan salmonellozuna genellikle hayvansal orijinli kontamine gıdalar sebep olmaktadır (RIVM 2011, EFSA 2011). Son yıllarda yapılan çalışmalar; kontamine meyve ve sebzelerin de Salmonella’ya bağlı, gıda kaynaklı hastalıkların epidemiyolojisinde etkili olduğunu göstermektedir (Berger vd. 2010, EFSA 2011). İnsan salmonellozunun yaklaşık olarak % 95’i et, kümes hayvanları, yumurtalar, süt, deniz ürünleri ve hazır gıdalar gibi kontamine ürünlerin tüketimiyle ilişkili bulunmaktadır. Salmonella; abdominal ağrı, bulantı, kusma, diyare ve baş ağrısı ile karakterize edilen gastroenterit ve tifoidal ateşi kapsayan birçok farklı hastalık 4 semptomlarına neden olabilmektedir. Enfeksiyonun tedavisinde genellikle antibiyotik terapi uygulanmaktadır (Foley vd. 2007). Salmonella bulaşısı genellikle fekal-oral yolla gerçekleşmekte ve insanlarda en yaygın gıda kaynaklı hastalık olan ‘‘salmonelloz’’ un ortaya çıkmasına neden olmaktadır (Veldman vd. 1995, Anonymous 2008). Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) verileri değerlendirildiğinde, dünyada her yıl binlercesi ölümle sonuçlanan salmonelloz vakasının ortaya çıktığı görülmektedir. Salmonella cinsi üyeleri ile kontamine olmuş gıdalar; hayvanlarda, Salmonella enfeksiyonlarının ortaya çıkmasının yanı sıra, bu hayvanlarla beslenen insanlarda da hastalık oluşumuna neden olduğu için büyük risk oluşturmaktadır. Özellikle endüstride uygulanan sanitasyon çalışmaları ile bakteri kontaminasyonunu en aza indirmek için çalışmalar yapılsa da, bazı Salmonella cinsi üyeleri, biyofilm üretme özellikleri sayesinde, dezenfeksiyon uygulamaları sonucunda dahi canlılıklarını sürdürebilmektedir (Ronner vd. 1993, Møretrø vd. 2003). Gıdalarda ve gıda katkı maddelerindeki Salmonella kontaminasyonu dünya genelinde büyük bir sorun teşkil etmekte ve bu durum hayvanlarda ve hayvansal gıdaları tüketen bireylerde Salmonella enfeksiyon riskini arttırmaktadır (Crump vd. 2002). Salmonelloz vakalarının bir kısmının, kanatlı hayvan etlerinin yanı sıra, marul, kavun, pastörize edilmemiş portakal suyu, domates gibi çeşitli meyve ve sebzelerin tüketilmesi sonucu ortaya çıktığı bilinmektedir (Cook vd. 1998, Brunett ve Beutchat 2000). Gıda üretiminin gerçekleştiği fabrikalarda, Salmonella kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için büyük yatırımlar yapılmasına karşın, bazı klonların fabrika koşullarında yıllarca varlığını sürdürebildiği belirlenmiştir. Ayrıca bu klonların biyofilm oluşturma yeteneklerinden dolayı dezenfektanlar aracılığı ile de üretim yapılan yüzeylerden uzaklaştırılamadığı saptanmıştır (Ronner vd. 1993, Moretro vd. 2003). Tifoid Salmonella enfeksiyonu etkeni S. Typhi, insan konakçılarda safra taşlarının üzerinde biyofilm oluşturmak suretiyle asemptomatik olarak hayatta kalmaya devam etmektedir. Bu nedenle asemptomatik konakçılarda antibiyotik uygulamasıyla patojenin 5 yok edilmesi çoğu kez yetersiz bir uygulama olmaktadır. Tifo etkeni olmayan Salmonella serovaryeteleri de aynı zamanda laboratuvar koşullarında safra taşı üzerinde kolonize olabilmektedir ve HEp-2 hücreleri üzerinde biyofilm oluşturabilmektedirler (Prouty vd. 2002). 2.2 Biyofilm Tanımı Biyofilm en genel ifade ile birbirlerine, abiyotik-biyotik yüzeylere ya da ara yüzeylere bir matriks aracılığı ile tutunan bakteriyel popülasyonlar olarak tanımlanabilir. Daha özgül bir ifade dahilinde ise biyofilmler, bakteriyel popülasyonların ara yüzeylere, birbirlerine ya da bir substrata geri dönüşümlü olarak tutunmaları ve ürettikleri hücre dışı polimerik matriksin içine gömülmeleri sonucu gelişme oranı ve genetik ifade ile ilişkili biçimde değişen bir fenotip sergileyen yapılar, olarak adlandırılabilir (Costerton ve Donlan 2002). Biyofilmler bakteriyal üremenin ve yayılmanın baskın formudur. Bu durumu en iyi açıklayan veri, enfeksiyon hastalıklarının %80’inin biyofilm kaynaklı olduğunun belirlenmesi sonucu elde edilmiştir (Davies 2003, Hall-Stoodley ve Stoodley 2009). Biyofilmler, cansız (inert) ya da canlı yüzeylere kendi ürettikleri polimerik matriks ile tutunan ve bu matrikse gömülü vaziyette bulunan bakteri hücrelerinin yapısal komüniteleri olarak adlandırılmaktadır (Costerton vd. 1999, Donlan ve Costerton 2002, Hall-Stoodley vd. 2006, Hoiby vd. 2010). Biyofilmler içerisindeki bakteriler, genellikle çevresel streslere, antibiyotiklere, dezenfektanlara ve konakçı immün yanıtına karşı iyi bir şekilde korunmuş olup, eradikasyonları oldukça zordur (Hoiby vd. 2010, Jensen vd. 2010). 2.3 Biyofilm Oluşum Aşamaları Biyofilm oluşumunun ilk aşaması, bakterilerin uygun bir yüzeye tutunmalarıdır. Doğal tip suşlar, çeşitli çevresel koşullarda hayatta kalabilmek ve kendini koruyabilmek için biyofilm oluştururlar. Herhangi bir yüzeyle etkileşime girecek olan bakteriyal hücreler, tutunmadan önce yüzeyi keşfedebilmek için yüzey boyunca hareket ederler. Yüzeyle 6 etkileşimden sonra bakteriler bir araya gelerek mikrokoloniler oluşturabilmek için, tek tabakalı hücre hatları meydana getirirler. Biyofilmler, aynı türden bakterilerin bir araya gelmeleriyle oluşabileceği gibi farklı türlerin bir araya gelmesiyle oluşan kompleks bir yapıda da olabilirler. Tutunma süreci aktif bir süreç olup, bu süreç bakterinin yüzeye ve diğer bakterilere geri dönüşümlü bir biçimde bağlanabilmesi için hücre dışı polimerik matriksin sentezini gerektirmektedir. Bakterilerin geri dönüşümlü bir biçimde bağlanmalarının ardından bakteriyal hücreler çoğalır ve ekzopolisakkarit üretirler (Costerton 1999). Biyofilmler beş temel aşamada oluşturulurlar. Bunlar: bakterilerin yüzeyle temasa geçmeleri, bakterilerin geri dönüşümlü olacak şekilde sıkıca tutunabilmeleri için hücre dışı polimerik matriks üretmeleri, biyofilm yapısının erken gelişimi, biyofilm olgunlaşması, olgun biyofilm hücrelerin koparak ayrılmasıdır (Stoodley vd. 2002) (Şekil 2.2). EPS Mikroorganizmalar Şekil 2.2 Biyofilm oluşumunun beş basamaklı aşamaları ve bu aşamaları gösteren mikrograflar Bakteriyal türlere bağlı olarak biyofilmlerin takriben %10-25’i bakteri hücrelerinden, %75-90’ı da ekzopolisakkarit matriksten oluşur. Olgun biyofilmlerin üç boyutlu yapılarında bakteriyal kümeler arasında su dolu kanallar bulunmaktadır, bu su dolu kanallar primitif bir dolaşım sistemine analog olacak şekilde metabolik süreçlerde üretilen toksik maddelerin atılmasında ve besinsel öğelerin alınmasında görevlidir. Biyofilmlerin ilerleyen safhalarında biyofilmden kopmalar görülebilir. Biyofilm hücre 7 topluluğundan köken alan yavru hücreler hayatta kalabilmek ve yeniden kolonize olabilmek için biyofilmden ayrılabilirler (Costerton 1999). Uzun süreli yapısal ve fonksiyonel araştırmalar sonucunda, mikroorganizmaların zorlu çevre koşullarında neden biyofilm sistemleri halinde organize oldukları daha iyi anlaşılmıştır. Bu koşullar daha çok doğal, endüstriyel ve medikal çevrelerdeki koşullar olup, mikroorganizmalar bazı durumlarda bu çevrelerdeki biyotik ya da abiyotik yüzeylerde kolonize olarak komünite davranışı sergilemeye yönelebilirler. Biyofilm yapılarında en dikkat çekici özelliklerden biri, polimerik matriks içerisine gömülü vaziyette bulunan bakterilerin planktonik yaşam tarzlarından farklı olarak. fenotipik ve morfolojik farklılıklar sergilemesidir (David 1999). Biyofilm yapısındaki bakteriler ve planktonik bakteriler arasında yaklaşık olarak % 1-10 düzeyinde gen ifadesi farkı vardır. Gen ifade düzeyleri ve metabolizma, aynı şekilde biyofilm oluşumunun farklı safhalarında çeşitlilik gösterir (Schembri vd. 2003, Webb vd. 2003, Beloin ve Ghigo 2005). Gram negatif bakterilerde çeşitli çevresel koşullarda (örneğin: besin arzı, konakçı metabolitleri, kolonize olunan yüzeylerin fiziksel ve kimyasal nitelikleri, sıcaklık, oksijen gerilimi, tuz konsantrasyonu ve ozmolarite) ve bakterinin kendi ürettiği sinyaller (örneğin: indol, siklik-diguanilat, asetil fosfat ve N-asilhomoserin laktonlar) biyofilm oluşumunda, olgunlaşmasında ve dağılmasında rol oynar (Prouty vd. 2002, Shirtliff vd. 2002, Hammer ve Bassler 2003, Martino vd. 2003, Wolfe vd. 2003, Tischler ve Camilli 2004). Biyofilm oluşumu en az üç mekanizma ile açıklanan bir süreçtir. Bunlardan bir tanesi yüzey hareketi neticesinde tutunmuş hücrelerin yeniden dağılmasıdır. İkinci bir oluşum mekanizması, tutunmuş bakteri hücrelerinin ikiye bölünmesiyle ilgilidir (Heydorn vd. 2000). Hücre bölünmesiyle birlikte yavru hücreler tutundukları yüzeyden biyofilm dışına ve yukarı istikamette yayılırlar ve kolonizasyonla yeni hücre kümeleri oluştururlar. Üçüncü mekanizma ise sıvı fazda planktonik halde bulunan bakterilerin gelişmekte olan biyofilm üzerine birikmesi ile ilgilidir. Bu mekanizmaların görece katkıları mevcut bakterilerin türüne, kolonize olunan yüzeyin doğasına ve çevrenin fizikokimyasal koşullarına bağlıdır. Biyofilmlerin fiziksel boyutlarının ölçülmesi ve görsel karşılaştırmalarının mikroskobik yöntemlerle yapılması sonucunda ortalama on 8 gün gibi uzun bir süreçte oluştukları anlaşılmıştır. Bu nedenle biyofilm oluşum başlangıcında rol alan tek tek genlerin susturulmasıyla elde edilecek fenotiplerin biyofilm oluşumuna sağlayacağı veriler, süreci açıklamakta yetersiz kalmaktadır (Costerton 1999). Olgun biyofilmler; biyofilmin lokasyonuna, içerisindeki mikroorganizmaların türüne ve ortamdaki besinsel niteliğe göre çeşitlilik gösterir. Bu çeşitliliğe, dental plaklardaki ya da üriner kataterlerdeki kalın ve düz yapılı biyofilmler veya oligotrofik sular üzerindeki ince tabakalı biyofilmler örnek teşkil edebilir. Biyofilm organizasyonu için en ideal modeli oluşturan P. aeruginosa suşlarında biyofilm bir substrata tutunmuş vaziyettedir ve biyofilm üzerinde besinlerin sürekli akış halinde olduğu sulu bir faz vardır. Bu yapıda tutunmuş hücreler, mikro kolonilerin teşkili için ekzopolisakkarit üretir ve biyofilmin yayılabilmesi için mikroorganizmalar yüzey boyunca yavaşça göç ederler. Mikro koloniler mantar şeklini andıran sütun formunda yapılar inşa ederler. Primitif dolaşım sistemine paralellik gösteren su dolu kanallar mikro koloniler arasında oluşturularak besinsel gereksinimlerinin sağlanmasına ve toksik atıkların uzaklaştırılmasına olanak sağlar. Bu kompleks ve organize yaşamsal yapının nasıl düzenlenebileceğine ilişkin sorular hala güncelliğini koruyan çalışmalara kaynak teşkil etmektedir (De Beer vd. 1994). 2.4 Biyofilm Matriksi Biyofilm oluşumu kompleks bir süreçtir ve bu süreçte hücre dışı matriks oluşumu bir çok çevresel faktörden etkilenir. Matriks hücre desikasyonunun önlenmesine, kimyasal dezenfeksiyon ajanları gibi çeşitli çevresel streslere karşı biyofilm içerisindeki hücrelerin korunmasına olanak sağlar (Zogaj vd. 2001, Anriany vd. 2006, White vd. 2006, Gibson vd. 2006, Steenackers vd 2012). Biyofilmler içerisinde bulunan mikorganizmalar, kendi ürettikleri sulu hücre dışı polimerik bileşenler (EPS) içerisine gömülü vaziyette kendi ideal dış çevrelerini yaratarak yaşarlar. EPS genellikle, polisakkaritlerden, proteinlerden, nükleik asitlerden ve lipitlerden oluşmaktadır. Bu yapısal bileşenler, biyofilmlere mekanik bir stabilite 9 sağlar, yüzey adezyonunu kolaylaştırır ve kohezif bir sistem oluştururlar. Bu üç boyutlu polimerik ağ, biyofilm içerisinde hücrelerin etkileşimini sağlar ve immobilize eder. İlave olarak, biyofilm matriksi, eksternal bir sindirim sistemi gibi de fonksiyon gösterir. Hücrelerin yakınında bulunan hücre dışı enzimler, çözülmüş, kolloid yapıda ve katı biyopolimerlerin metabolize edilmesine yardımcı olmaktadır. Matriksin tesis ettiği bu karmaşık organizasyon düzeyi, mikroorganizmaların dünya üzerindeki en başarılı yaşam formlarından birisi olmasını sağlamaktadır (Donlan ve Costerton 2002). Mikrobiyal agregatlar, genellikle sıvı-hava ya da katı-sıvı ara yüzlerde sulu EPS matriks yapılarına gömülü vaziyette akümüle olan yapılardır. Bu ifade doğrultusunda biyofilm tanımından farklı olarak, flok (yüzen biyofilm yapıları) ve silaj yapıları da paylaştıkları bazı karakteristikler bağlamında biyofilm örnekleri olarak gösterilebilirler. Çok hücreli biyofilmler stabil bir mikrokonsorsiyum oluşturabilirler. Bu oluşum içerisinde, fizikokimyasal gradiyentler oluşmakta, yatay gen transferleri meydana gelmekte ve hücre-hücre iletişimi gerçekleşmektedir. Bu konsorsiyum aynı zamanda yüksek rekabetçi bir çevre meydana getirmektedir (Flemming ve Windenger 2010). Mikroorganizmalar doğada ayrı ayrı hücrelerin saf kültürleri halinde bulunmazlar. Çoğunlukla, yüzeylerde ya da ara yüzeylerde akümüle olarak film, mat, flok, silaj ya da biyofilm gibi polimikrobiyal agregatlar oluştururlar (Neue ve Flemming 1999). Biyofilm içerisinde mikroorganizmalar %10’dan daha az bir kütleye karşılık gelirken, matriks bileşenleri bu yapının yaklaşık % 90’ını oluşturur. Hücrelerin gömülü olduğu hücre dışı matriks materyalleri çoğunlukla biyofilmi oluşturan hücreler tarafından üretilir. Matriks hücre dışı polimerik bileşenler olarak bilinen farklı tipteki biyopolimerlerin birikimiyle oluşmaktadır. Bu birikim üç boyutlu yapının iskeletini oluşturur. Bu iskelet, yüzey adezyonundan ve kohezyondan sorumludur. Biyofilm oluşumu, bütünüyle planktonik fazdan farklı bir yaşam biçimi oluşturmaktadır (Karatan ve Signals 2009). EPS’nin çeşitli fonksiyonları biyofilm yaşam biçimine geniş ölçekte katkı sağlamaktadır. EPS biyofilm hücrelerini immobilize eder ve bu hücreler birbirlerine olabildiğince yakın durur. Fiziksel yakınlık hücre-hücre iletişimini ve sinerjistik mikrokonsorsuyum gibi etkileşimleri beraberinde getirir. Hücre dışı enzimlerin immobilize edilmesi çok yönlü bir dış sindirim sistemi meydana getirir ve bu 10 sistem çözünmüş ve partikül yapıdaki bileşenlerin sulu fazdan alınması ve besin-enerji kaynakları olarak kullanılmasına imkan tanır. Matriks aynı zamanda lize edilen hücrelerin bileşenlerini tuttuğu için geri dönüşüm merkezi olarak da işlev görür. Bu bileşenleri başında yatay gen transferleri için kaynak teşkil eden DNA gelmektedir. Bazı bileşenleri çok güç metabolize olmasına karşın EPS aynı zamanda besinsel bir kaynak olarak da işlev görür. Matriks bileşenlerinin bütünüyle metabolize edilebilmesi için çok çeşitli bir enzim sistemi gerekmektedir. Matriks organizmaları kurumaya, oksidasyona ya da yüklü biyositlere, bazı antibiyotiklere ve metalik katyonlara, UV radyasyona, birçok protozoon saldırısına ve konakçının immün savunmasına karşı korur. Ekolojik olarak, EPS’deki boşluklara hapsolmuş rekabet ve korporasyon populasyonların stabil adaptasyonuna olanak sağlar. Biyofilmin, biyofilm yapısındaki tüm hücrelere ekolojik bir avantaj sağlayıp sağlamadığı belirsizdir. Biyofilmin içerisindeki rekabetin simülasyonunda polimer üreticileri için üretici olmayanların giderlerinin karşılanmasında güçlü evrimsel bir fayda açığa çıkmaktadır. Muhtemelen polimerlerden ötürü, polimer üretici yavru hücreler oksijence zengin bölgelere itilirler (Xavier ve Foster 2007). EPS, çok çeşitli biyopolimerlerden oluştuğu ve analizlerinin güç olmasından kaynaklı olarak biyofimlerin karanlık maddesi olarak adlandırılmaktadır (Flemming vd. 2007). EPS biyofilm sistemleri içerisinde mikroorganizmaların tipine, mevcut akış kuvvetlerine, sıcaklığa ve besinsel bileşenlerin varlığına göre çok geniş bir çeşitlilik sergilemektedir. EPS başlangıçta “hücre dışı polisakkaritler” olarak adlandırılırken; proteinlerin, nükleik asitlerin, lipitlerin ve diğer biyopolimerlerin varlıklarının keşfedilmesinden ötürü yeniden adlandırılmıştır (Allison vd. 1998, Neue ve Flemming 1999). Flagella, pilus ve fimbriya gibi hücre dışı bakteriyal yapılar matriksin stabilizasyonuna yardımcı olur (Zogaj vd. 2001). Gram negatif bakterilerin dış membranlarından köken alan membran vezikülleri çeşitli enzimleri ve DNA’yı ihtiva etmektedir. Bu bileşenler bazı durumlarda, yok edici veziküllerin rekabetçi biyofilm organizmalarını hedeflemesi gibi, matriksin niteliklerini değiştirebilmektedir (Schooling ve Beveridge 2006). Bakteriyal biyofilmlerdeki hücre dışı polimerik bileşenlerin fonksiyonları çizelge 2.1’de özetlenmiştir. 11 Çizelge 2.1 Bakteriyal biyofilmlerdeki hücre dışı polimerik bileşenlerin fonksiyonları Fonksiyon Adezyon Biyofilmle olan ilişkisi Başlangıç aşamasında biyotik ve abiyotik kolonizasyona imkan tanır ve biyofilmlerin uzun süre yüzeylere tutunmalarını sağlar. İçerdiği EPS bileşenleri Polisakkaritler, proteinler, DNA ve amfilik moleküller Hücre agregasyonu Hücreler arasında köprü kurulmasını, geçici immobilizasyonu, yüksek hücresel yoğunluğun sağlanması ve hücre-hücre tanınmasını sağlar. Polisakkaritler, proteinler ve DNA Kohezyon Mekanik stabiliteyi düzenleyen sulu bir polimer ağı oluşturur ve biyofilmin mimarisini belirler. Nötral ve yüklü moleküller, proteinler (amilodler ve lektinler gibi) ve DNA Suyun hapsedilmesi Yüksek oranda sulu mikroçevreleri oluşturur ve kurumaya karşı koruma sağlar. Hidrofilik polisakkaritler ve bazı muhtemel proteinler Koruyucu bariyer İnfeksiyon süresince spesifik ve non-spesifik konakçı savunmalarına karşı direnci sağlar ve çeşitli antimikrobiyal ajanlara karşı toleransı artırır. Oksidasyon ve avcı stresinden korur. Polisakkaritler ve proteinler Organik bileşenlerin emilimi İnorganik bileşenlerin emilimi Çevreden besinlerin akümülasyonunu sağlar ve zenobiyotiklerin emilimini kolaylaştırır (çevresel detoksifikasyon) Polisakkaritlerin jelleşmesini ve iyon değişimini sağlar, mineralleşmeye imkan tanır ve toksik molekülleri akümüle eder (çevresel detoksifikasyon) Besinsel ihtiyaçların giderilmesi için ekzojen makromoleküllerin sindirimi ve yapısal EPS bileşenlerinin sindirimi (biyofilmden hücrelerin ayrılmasına imkan tanır). Yüklü ya da hidrofobik polisakkaritler ve proteinler Besin kaynağı Biyofilm komünitesindeki hücreler için karbon, azot ve fosfor kaynağı teşkil eder. Potansiyel olarak tüm EPS bileşenleri Genetik bilginin değişimi Biyofilm hücreleri arasındaki yatay gen transferini kolaylaştırır. DNA Elektron vericisi ya da alıcısı Biyofilm matriksi içerisinde redoks reaksiyonlarının gerçekleşmesini sağlar. Proteinler (pilus ve nanotüpler) ve muhtemel nemli bileşenler Hücre bileşenlerinin taşınması Metabolik değişimlerin sonucu olarak hücre bileşenlerinin açığa çıkarılması. Nükleik asit, lipopolisakkarit, fosfolipit ve enzimleri içeren membran vezikülleri Fazla enerjinin depolanması Dengesiz karbon ve nitrojen oranlarında fazla karbon kaynaklarının depolanması. Polisakkaritler Enzimlerin bağlanması Polisakkaritlerle olan etkileşimlerinin sonucunda enzimlerin akümüle olması, depolanması ve stabilize edilmesi. Polisakkaritler ve enzimler Enzimatik aktivite 12 Fosfat ve sülfat bileşenleri içeren yüklü polisakkaritler ve proteinler Proteinler Yapısal çok hücreli mikrobiyal komünitelerin oluşumunda ve sürdürülmesinde EPS’nin üretimi ve miktarı önemlidir (Sutherland 2001). Konsantrasyon, kohezyon, yük, emilim kapasitesi, özgüllük ve matriksin üç boyutlu yapısıyla birlikte (yoğun bölgeler, porlar ve kanallar) tek tek EPS bileşenlerinin doğası belirli bir biyofilmin içerisindeki yaşam biçimini belirler. Biyofilm morfolojisinin sonucunda, pürüzsüz ve düz, pürüzlü, kabarık ya da filamentli morfometrik özellikler görülebilir ve biyofilmler aynı zamanda porozitenin derecesine, su dolu kanallarla çevrili mantar benzeri makrokolonilerle karakterize edilebilir. 2.5 Salmonella Biyofilmleri Salmonella’nın yüzey ilişkili kompleks komüniteleri olarak adlandırılan biyofilmleri, Salmonella’ya konakçı ve konakçı dışı sistemlerde dirençlilik ve süreklilik sağlar. Söz konusu biyofilmler özellikle gıda çevreleri için son derece önemlidir (Steenackers vd. 2012). Gerçekleştirilen çok yönlü birçok çalışmada; Salmonella’nın polimer, çelik ve cam gibi yüzeylerin yanı sıra maydanoz gibi organik yüzeylerde de biyofilm oluşturma yeteneğinde olduğu belirlenmiştir (Moretro vd. 2009). Çeşitli biyolojik yüzeylerde laboratuvar koşullarında biyofilm oluşturma yeteneklerinin yanı sıra Salmonella, bitkiler gibi biyotik; plastik ve metal gibi abiyotik yüzeylerde de biyofilm oluşturabilmektedir (Hood ve Zottola 1997, Momba ve Kaleni 2002, Brandl 2006). Salmonella türlerinin doğal mikroflora ile birlikte içme suyu borularında ölçülebilir düzeyde biyofilm oluşturduğu saptanmıştır (Schmeisser vd. 2003). Salmonella’nın hayvan konakçıların dışındaki biyofilmler içerisinde hayatta kalabilmesi ve çoğalabilmesi, Salmonella ile ilgili gıda ve su kaynaklı gastroenteritin sürekliliğini açıklar niteliktedir (Brandl 2006, Teplitski 2006). Birçok çalışmada, konakçı haricinde plastik (Joseph vd. 2001, Mireles vd. 2001, Stepanovic vd. 2004, Hurrell vd. 2009, Vestby vd. 2009), lastik (Arnold ve Yates 2009), 13 çimento (Joseph vd. 2001), cam (Solano vd. 2002, Prouty ve Gunn 2003) ve paslanmaz çelik (Joseph vd. 2001, Ramesh vd. 2002, Giaouris ve Nychas 2006, Moretro vd. 2009) gibi mezbaha, gıda işleme üniteleri, mutfak, tuvalet ve banyo gibi yerlerde kullanılan abiyotik yüzeylerde Salmonella’nın biyofilm oluşturabildiği kanıtlanmıştır. Salmonella biyofilmleri desikasyon ve birçok çevresel stres faktörlerine karşı daha fazla dirençlidir. Salmonella’nın bu tip abiyotik yüzeylerde biyofilm üretebilmesi konakçı dışında da hayatta kalabilmesine kolaylaştırmaktadır. Bu imkan tanımakta hipotezi ve desteklemek yeni adına konakçılara yem olan geçisini ve balık ürünleri fabrikalarından izole edilen 111 adet Salmonella suşunun biyofilm üretim kapasiteleri ile fabrika çevrelerinde hayatta kalmaları arasında pozitif bir korelasyon saptanmıştır (Vestby vd. 2009). Salmonella’nın konakçı dışında uzun süre hayatta kalabildiğine yönelik bir diğer çarpıcı örnek; özellikle banyo ve tuvaletlerde kalıcılık kazanan Salmonella biyofilmlerinin saptandığı evlerde, aile bireylerinin tekrarlayan salmonelloz atakları geçirmesidir Tekrarlayan salmonelloz ataklarında Salmonella’nın biyofilm materyali içerisinde inkorpore olduğu, diyare semptomunun sonlanmasından dört hafta sonrasında dahi temizlik ürünlerinin kullanılmasına karşın hayatta kalabildiğini saptanmıştır (Barker ve Bloomfield 2000). Bitkiler genellikle insan konakçısı olan patojenler için ideal substratlar değildir. Ancak, bazı Salmonella salgınlarının kontamine bitkiler ile ilişkili olduğu gelişmiş ülkelerin raporlarında mevcuttur. Endüstrileşmiş ülkelerde Salmonella salgınları kontamine filiz tohumları (örneğin; alfa alfa (Mahon vd. 1997, Taormina vd. 1999, Van Beneden vd. 1999), taze sebze ve meyveler (örneğin; kantalop (kavun) (Bowen vd. 2006) ve kişniş (Campbell vd. 2001, Brandi ve Mandrell 2002) gibi bitkilerin tüketimi ile ilişkilendirimiştir. Kontamine bitkilerde Salmonella’nın altı aya kadar hayatta kalabildiği belirlenmiştir (Teplitski vd. 2009). Salmonella’nın ve diğer enterik patojenlerin epifit olarak bitkilerin dış yüzeylerinde bulunabilmesi, bu bakterilerin söz konusu yeni ekolojik nişlerine kolaylıkla adapte olabilmelerine bağlıdır (Beuchat 2002). Bitki yüzeylerindeki biyofilmler yalnızca epifitik olmayıp endofitik de olabilmektedir (Gandhi vd. 2001, Dong vd. 2003, Lang vd. 2004, Klerks vd. 2007). Endofitik bakteriler bitkilerin iç dokularına girmeden de dokular arası boşlukları kolonize edebilmektedir. Iniguez ve ark. (2005) yaptığı bir çalışmada özellikle endofitik Salmonella’nın yüzeyi 14 sterilize edilmiş 10 g alfaalfa filizinin tüketilmesinin salmonelloza neden olabileceği saptanmıştır. Kutter ve ark. (2006), S. Typhimurium LT2 ve DT104h suşları ile yaptıkları bir çalışmada kök kolonizasyonundan sonra bu suşların sistemik bir şekilde bitkide yayıldığını saptamışlardır. Salmonella aynı zamanda epitel hücreleri üzerinde tutunarak olgun biyofilmler, mikro koloniler, bakteriler koloniler oluşturabilmektedir. Bu durum konakçılarda mukozal enfeksiyonların oluşmasına ve bu enfeksiyonların uzun süre devam etmesine neden olmaktadır. Söz konusu biyofilmlerin aynı zamanda hayvanlarda bağırsak yolu ile sürekli taşınması da sürekli bir riskin etkenidir (Althouse vd. 2003, Ricke 2003, Morgan vd. 2004). Safra taşları Salmonella’nın biyofilm oluşturabildiği iyi bilinen bir diğer biyotik örnektir. S. Typhi bağırsak epitelyum hücre hattını geçtikten sonra patojeni karaciğer ve safra kanalına taşıyan makrofajları istila edebilmektedir (Tsolis vd. 2008). S. Typhi insan tifo ateşinin etyolojik etkenidir ve dünya genelinde yılda yaklaşık yirmi milyon insanı etkilemektedir. Bu patojen safra taşı üzerindeyken hem aktif (kolesistitis) hem de kronik (taşıyıcılık) enfeksiyonlara neden olabilmektedir. S. Typhi ile enfekte olan insanların yaklaşık %5’i asemptomatik kronik safra kesesi taşıyıcısı olmaktadır. Asemptomatik Salmonella taşıyıcıları özellikle gelişmekte olan ülkelerde gıda ve su desteklerini kontamine edebilmekte ve bu durum sürekli tekrar eden Salmonella enfeksiyonlarının nedeni olmaktadır. Söz konusu taşıyıcı aşamanın antibiyotikler ile tedavi edilmesi son derece güçtür ve sıklıkla Salmonella’nın tutunabildiği safra taşı gibi safra kesesi anormallikleri ile karşılaşılmaktadır (Levine vd. 1982, Lai vd. 1992, Dutta vd. 2000). Çoğunlukla safra kesesinin alınması ile sonuçlanan safra kesesi cerrahisi, hastaları bu gibi kronik enfeksiyonlardan kurtarmanın tek yoludur. Salmonella cinsi ve diğer Entereobacteriaceae ailesi üyeleri, doğal yaşam döngülerinde biyotik ve abiyotik yüzeylerde biyofilm oluşturma kabiliyetindedir (Prouty ve Gunn 2003, Ledeboer ve Jones 2005). Birçok Salmonella serovaryetesi hücre dışı matriks bileşenleri olan; selüloz ve kıvrımlı fimbriyalarla karakterize edilmiş çok hücreli bir davranış durumu sergilemektedir (Römling, 2005). Çok hücreli davranış biçimi, CsgD 15 (kıvrımlı fimbriya alt ünite geni) tarafından pozitif şekilde regüle edilir. Salmonella’da biyofilm bileşeni olarak önemli bir rol sergileyen selüloz, bakteriyal selüloz sentez operonu olan bcsABZC ve selüloz biyosentezinin aktivatörü olan adrA operonunun ifadeleriyle düzenlenir. CsgD, selüloz biyosentezini dolaylı bir şekilde adrA aracılığıyla yapar. c-di-GMP’nin üretiminin uyarılması adrA tarafından gerçekleştirilir ve c-di-GMP bcsB alt ünitesine bağlanıp, selüloz üretimini başlatır. Selüloz kompleksi bcsA ve bcsB tarafından oluşturulurken bcsZ selülaz vazifesi görür. CsgD kıvrımlı fimbiryanın sentezine de katılır ve promotora bağlanarak csgBAC operonunun transkripsiyonunu başlatır (Solano vd. 2002, Römling 2005). Salmonella’nın hücre dışı matiksinde protein yapısında major bileşen olan kıvrımlı fimbriya üretilmektedir (Barnhart ve Chapman 2006). Kıvrımlı fimbriya; yüzeye tutunma, hücre agregasyonu, çevresel etkenlere karşı direnç ve biyofilm oluşumunu içine alan amiloid fiber yapısıdır (Austin vd. 1998, Römling vd. 1998). Salmonella enterica’nın ikinci önemli matriks bileşeni ise selülozdur (Zogaj vd. 2001, Solano vd. 2002). Kıvrımlı fimbriya ve selüloz sentezi kompleks bir regülasyon ağı içerisinde kilit rol oynayan CsgD tarafından düzenlenmektedir (Römling vd. 2000) (Şekil 2.3). Kıvrımlı fimbriya BapA Selüloz Şekil 2.3 Salmonella biyofilmlerindeki hücre dışı matiks bileşenlerinin regülasyonu (Kristina vd. 2007). 16 Hücre dışı polimerik matriksin oluşumu birçok çevresel faktörden etkilenir. Salmonella’da hücre dışı matriks; çeşitli proteinlerden, ekzopolisakkaritlerden, lipopolisakkaritlerden, hücre dışı DNA’dan ve yağ asitlerinden oluşmaktadır. Bu matriks biyofilm olgunlaşması, hücrelerin desikasyonunu önleme ve kimyasal dezenfeksiyon uygulamaları gibi çesitli çevresel streslere karşı koruma sağlamaktadır (Zogaj vd. 2001, Anriany vd. 2006, White vd. 2006, Gibson et vd. 2006, Steenackers vd. 2012). Salmonella biyofimlerinin hücre dışı matriks yapısı üzerine yapılan çalışmalar çoğunlukla kıvrımlı fimbriya ve selüloz üzerinedir. Bu yapılar Salmonella’ nın çok hücreli davranış biçimi sergilemesinde ve “rdar”(red, dry and rough; kırmızı, kuru ve pürüzlü) morfotipini oluşturumasında çok önemli bileşenlerdir (Römling vd. 1998, Gerstel ve Römling 2003, Römling 2005). Kıvrımlı fimbriya ve selüloz Salmonella ssp., Escherichia coli, Shigella ssp., Enterobacter ssp., Citrobacter ssp. gibi Enterobacteriaceae familyasına dahil birçok mikroorganizmada ifade edilmektedir (Gerstel ve Römling 2003, Bokranz vd. 2005, Solomon vd. 2005). Kıvrımlı fimbriya; epitel hücreleri ve bitki yüzeyleri gibi biyotik yüzeylerde ve abiyotik yüzeylerde biyofilm oluşumuna aracılık eden ve yüksek adezif özelliğe sahip hücre dışı bir proteindir (Zogaj vd. 2001, Ledeboer vd. 2006, Berger vd. 2010, Hermans vd. 2011). Kıvrımlı fimbriya birçok biyokimyasal özelliği ile ökaryotik amiloid fiber yapılarına benzemektedir. CsgD, Salmonella biyofilmlerinin matriksindeki özgül bileşenlerin sentezlenmesinde fonksiyonel esas regülatördür (Gerstel ve Römling 2003). CsgD transkripsiyonel regülatörü, alıcı bir N-terminal bölge ihtiva etmektedir. Bu bölgede korunmuş bir aspartat (D59) rezidüsü bulunmaktadır. C-terminal kısmında ise LuxR benzeri sarmaldönüş-sarmal (helix-turn-helix) motifi bulumaktadır. Bu motif FixJ/NarL protein ailesine dâhil bir DNA bağlanma proteindir. csg operonu, csgBAC ve csgDEFG operonlarını içeren divergent bir sistemdir. csgD mutant suşları, bütünüyle çok hücreli 17 davranış tarzından yoksun olabilmektedir. Bu mutantlar Kongo Kırmızılı (CR) agar ortamlarıda “saw” (smooth and white; düz ve beyaz) fenotipi sergilemektedir (Römling vd. 2000). csgD promotor bölgesinde meydana gelebilecek nokta mutasyonları (csgB ve csgD genleri arasındaki 521 bp’lik bölgede) korunmuş promotor bölgesini yüksek düzeyde regüle olan biçimden yarı korunumlu bir biçime çevirebilmektedir (Römling vd. 1998). csgD geni üzerinde gerçekleştirilen insersiyonal mutasyon çalışmalarında bu genin susturulması sonucunda suşlar Luria Bertani (LB) sıvı besi ortamlarında pelikül yapısı oluşturamazken, ATM (Adhesion Test Medium; adezyon test besi ortamı) besi ortamlarında biyofilm oluşturabilmektedirler (Solano vd. 2002). csbB-csgD ara bölgesinde gerçekleştirilen bir insersiyonal mutasyonda alfaalfa (kaba yonca bitkisi) bitkisiyle yapılan bir çalışmada, bu suşların bitki yüzeylerinde ilk tutunmayı gerçekleştiremediği saptanmıştır (Barak vd. 2005). Cam yüzeylerde yürütülen biyofilm deneylerinde CsgD’nin biyofilm üretimi için elzem olduğu saptanmıştır (Grantcharova vd. 2010). S. Typhimurium ve E. coli kıvrımlı fimbriya operonları arasındaki nükleotid ve protein düzeyindeki yüksek benzerlik ve korunmuşluk; bu genlerin; bu mikroorganizmaların ortak atasında da bulunabileceğini akla getirmektedir (Römling vd. 1998). csgB-csgD ara bölgesi esas alınarak yapılan karşılaştırmalı genetik analizler, S. bongori izolatları dışında hemen hemen tüm Salmonella suşlarında yüksek düzeyde benzerlik ve korunmuşluk sergilemektedir. Bu ara bölgede görülebilen değişimler ise genetik sürüklenmenin neticesinde gerçekleşen nötral mutasyonların sonucudur. Bu mutasyonlar laboratuvar koşullarına uyarlanmış suşlarda daha sık gözlenmekte ve muhtemel mutasyonel etkilerin sonucunda “rdar” (red, dry and rough; kırmızı, kuru ve pürüzlü) morfotipi kaybolmaktadır. Doğal tip suşlarda ise bu mutasyonel değişimler daha az sıklıkta gözlenmektedir. Bu değişim, Salmonella suşlarının zengin besi ortamlarında ve laboratuvar koşullarında uzun nesiller süresince pasajlanması sonucunda görülebilmekte ve “rdar” morfotipi kaybolabilmektedir (Davidson vd. 2008). CsgD’nin Salmonella biyofilmlerinde kıvrımlı fimbriya biyosentezinde pozitif bir transkripsiyonel regülatör olduğu uzun süredir bilinmektedir (Römling vd. 1998). In vitro koşullarda yürütülen bazı çalışmalarda asetil fosfat ile yönlendirilen fosforilasyon 18 sonucunda fosforillenen CsgD’nin promotor bölgesine olan afinitesini azaldığı ve Nterminal bölgedeki korunmuş aspartat (D59) rezidüsünün in vivo ve in vitro koşullarda CsgD’nin fonksiyonelliği için son derece önemli olduğu belirlenmiştir. Salmonella’da kıvrımlı fimbriya sentezi ve hücre dışı ortama taşınması, hücre dışı nükleasyon presipitasyon yolağı (ENP) aracılığıyla olmaktadır (Hammar vd. 1996). Selüloz, β,1-4 glikozid bağı içeren bir polisakkarit yapısıdır. Kıvrımlı fimbriyada olduğu gibi selüloz da çeşitli biyotik ve abiyotik yüzeylerde biyofilm oluşumu için gerekmektedir (Zogaj vd. 2001, Ledeboer vd. 2006, Barak vd. 2007). Selüloz biyosentezi için gerekli temel bileşenler, bcsABZC ve bcsEFG operonları tarafından kodlanmaktadır. Bakteriyal membranın iç yüzeyinde meydana gelen selüloz biyosentezi CsgD’nin doğrudan adrA’ ya (AgfD tarafından regüle edilen gen) bağlanmasıyla pozitif yönde regüle edilmektedir (Zogaj vd. 2001, Zakikhany vd 2010). Fosforile olmamış CsgD, adrA promotoruna özgül bir biçimde bağlanmaktadır (Zakikhany vd. 2010). Bu bağlanma paterni CsgD’nin kıvrımlı fimbriya operonuna bağlanmasından biraz daha farklıdır. Bu matriks bileşenlerinin farklı transkripsiyonel regülasyonlarının, bu genlerin promotor dizilerindeki farklılıklardan kaynaklı olduğu düşünülmektedir. AdrA; bcsABZC operonunu regüle ederek selüloz biyosentezini başlatmaktadır (Zogaj vd. 2001, Simm vd. 2004). AdrA, post-transkripsiyonel düzeyde hücresel c-di-GMP düzeyini değiştirmektedir (Zogaj vd. 2001, Robbe-Saule vd. 2006). AdrA, membran bağlı GGDEF bölgesini kodlamaktadır. Bu protein guanilat siklaz aktivitesi gösterir ve hücresel c-di-GMP düzeyinin ayarlanmasıyla ilişkilidir. Salmonella’da bcsABZC operonunun hemen yakınında selüloz biyosenteziyle ilişkili bcsEFG operonu bulunmaktadır (Solano vd. 2002). Her iki operonda meydana gelebilecek mutasyonlar LB ve ATM besi ortamlarında pelikül ve biyofilm oluşumlarını etkilemektedir. Selüloz üretimi açısından mutant suşlar besi ortamlarında kalkoflor (CF) bağlayamamaktadır (Zogaj vd. 2001, Solano vd. 2002, Römling vd. 2003). Selüloz biyosentezinin bazı koşullarda CsgD’den bağımsız olabileceği düşünülmektedir. Gastroenterit etkeni olarak izole edilmiş bazı S. Enteritidis suşlarında 19 CsgD ile ilişkili olmayan selüloz biyosentezi gözlenmiştir (Römling vd. 2003). Bu suşların bazılarında, adrA, rpoS, csgD ve ompR mutasyonlarına karşın ATM koşullarında biyofilm oluşumu belirlenmiştir (Solano vd. 2002, Garcia vd. 2004). Ancak bu suşlardaki selüloz üretimi belirtilen mutasyonel koşullarda dahi diguanilat siklaz aktivitesinden bağımsız değildir. LPS (lipopolisakkarit) üretimi bakımından mutant suşlarda görülen aşırı selüloz üretimi de CsgD’den bağımsız biyofilm üretimine başka bir alternatif sunmaktadır (Anriany vd. 2006). Bu alternatiflerin CsgD’den bağımsız olduğu ancak RpoS, YedQ global regülasyon (GGDEF bölgesini içeren membrana bağlı bir protein) ve c-di-GMP düzeyinden bağımsız olmadığı kesindir. 2.6 Salmonella Biyofilmlerinin Yapısal Bileşenleri Salmonella’nın biyofilmlerindeki matriks bileşenlerinin ifadesi ve varlığı biyofilmin bulunduğu substratın fizikokimysal özelliklerine ve biyofilmin bulunduğu çevrenin koşullarına önemli ölçüde bağlıdır (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2 Salmonella’nın biyofilm oluşumunda kritik rolü olan bazı yapısal matriks bileşenleri Yüzey Agar plakalar (rdar morfotipi) Epitel hücreleri İlgili substrat üzerinde regüle edilen önemli yapısal bileşenler 1) Kıvrımlı fimbriya (csgDEFG-csgBAC) 2) BapA (bapABCD) 3) Selüloz (bcsABZC-bcsEFG) 4) O-Ag-kapsülü (yihU-yshA ve yihW) 5) Diğer kapsüler polisakkaritler 6) LPS 1) Tip I fimbriya (fim) 2) Plazmid kodlu fimbriya (pef) 3) Kıvrımlı fimbriya (csg genleri) 4) Uzun polar fimbriya (lpf) 5) Bovin kolonizasyon faktörü (bcf) 6) Sth fimbriya (sth) 7) Kolanik asit (wca genleri ve wza, wzb ve wzc) 8) Selüloz (bcsABZC-bcsEFG) 20 Referans 1) (Römling vd. 1998) 2) (Latasa vd. 2005) 3) (Zogaj vd. 2001) 4) (Gibson vd. 2006) 5) (deRezende vd. 2005) 6) (White vd. 2003, deRezende vd. 2005, Gibson vd. 2006, Anriany vd. 2006) 1) (Boddicker vd. 2002, Ledeboer ve Jones 2005, Ledeboer vd. 2006) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) (Prouty vd. 2002, Prouty ve Gunn 2003, Crawford vd. 2008, Crawford vd. 2010) Çizelge 2.2 Salmonella’nın biyofilm oluşumunda kritik rolü olan bazı yapısal matriks bileşenleri (devam) Safra taşları 1) Flagella 2) O-Ag-kapsülü (yihU-yshA ve yihW) 3) Tip I fimbriya (fim) Cam 1) Selüloz (bcsABZC-bcsEFG) 2) LPS 3) Tip III salgı aparatı 4) Flagella Bitki Yüzeyleri 1) Kıvrımlı fimbriya (csg genleri) 2) Selüloz (bcsABZC-bcsEFG) 3) O-Ag-kapsülü 1, 2, 3) (Prouty vd. 2002, Prouty ve Gunn 2003, Crawford vd. 2008, Crawford vd. 2010) 1, 2, 3, 4) (Prouty ve Gunn, 2003, Crawford vd. 2008) 1, 2, 3) (Barak vd. 2005, Barak vd. 2007) “Rdar” biyofilm morfotipi Salmonella’nın çok hücreli davranış desenlerini kavramak üzere en çok tercih edilen biyofilm morfotiplerinden biridir. “Rdar” morfotipinin protein ve ekzopolisakkarit olmak üzere iki major bileşeni bulunmaktadır. Protein fraksiyonu adhezif nitelikte kıvrımlı fimbriyadan [(eski adlandırılması; ince agreagatif fimbriya (Tafi)] ve BapA proteininden oluşmaktadır (Latasa vd. 2005). Ekzopolisakkarit fraksiyon ise geniş ölçüde selülozdan oluşmaktadır (Zogaj vd. 2001). Selülozun yanı sıra O-antijenik kapsülü, diğer ilave ekzopolisakkaritler ve lipopolisakkaritler bulunmaktadır (Collinson vd. 2003, deRezende vd. 2005, Anriany vd. 2006, Gibson vd. 2006). Fimbriyalar (tip 1 (fim), plazmid kodlu fimbriya (pef), kıvrımlı fimbriya (csg), uzun polar fimbriya (lpf), bovin kolonizasyon faktörü (bcf), kolanik asit ve selüloz Salmonella’nın epitelyum hücreleri üzerinde biyofilm oluşturabilmesi için zaruridir (Boddicker vd. 2002, Ledeboer ve Jones, 2005, Ledeboer vd. 2006). Flagellanın alt üniteleri ve O-Ag-kapsülü de hidrofobik karakteristikteki safra taşları üzerindeki biyofilm oluşumları için son derece önemlidir (Prouty vd. 2002, Prouty ve Gunn, 2003, Crawford vd. 2008, Crawford vd. 2010). Selüloz, LPS, tip III salgı sistemi (TTSS) ve flagellar hareket ise cam gibi hidrofilik karakteristikteki substralar üzerindeki biyofilm oluşumları için kritiktir (Prouty ve Gunn 2003, Crawford vd. 2008). Bitki yüzeylerine tutunma ve etkin bir biyofilm üretimi ise kıvrımlı fimbriya, selüloz ve O-Ag-kapsülünün ifadesine bağlıdır (Barak vd. 2005, Barak vd. 2007). Flagella da benzer şekilde Salmonella-bitki interaksiyonlarında bazı serovarlar için önemli bir role sahiptir (Berger vd. 2009). 21 Kıvrımlı fimbriya (csgBAC-csgDEFG) yüksek agregatif özellikte, dallanmayan, amiloid benzeri bir hücre yüzey protein olup, konakçı kolonizasyonunda, persistansta, harekette ve invazyonda son derece kritik rollere sahiptir (Barnhart ve Chapman, 2006). Salmonella’daki kıvrımlı fimbriya hücre-hücre etkileşimlerini ve yüzey adezyonunu teşvik ettiği için biyofilm üretiminde oldukça önemli bir etkiye sahiptir. Kıvrımlı fimbriyanın β-zincir yapısı içeren CsgA ve CsgB alt üniteleri hidrofobik bir boya Kongo kırmızısı ile etkileşime girerek katı besiyerlerinde tipik “rdar” biyofilm morfotipini belirlemektedir. Kongo kırmızılı katı besiyerlerinde kıvrımlı fimbriya ifadesi olmayan mutant suşların içerdiği morfotip “pdar” (pembe, kuru ve pürüzlü) morfotipidir (Römling vd. 1998). Kıvrımlı fimbriyaya ilave olarak S. Typhimurium genomunda biyofilm üretimi için kritik öneme haiz ilave 12 fimbriyal operon daha bulunmaktadır (McClelland vd. 2001). Örneğin; HeP-2 epitel hücrelerinin ve tavuk bağırsak epitel hücrelerinin model alındığı biyofilm çalışmalarında Tip 1 fimbriyanın epitel hücrelerine tutunmada ve biyofilm oluşumunda fonksiyonel olduğu anlaşılmıştır (Boddicker vd. 2002, Ledeboer ve Jones 2002). Epitel hücreleri üzerindeki biyofilm oluşumu fimH geninin farklı allellerini ifade eden S. Typhimurium suşlarında farklılık göstermekle birlikte, ilgili genin fonksiyonundan yoksun mutantlarda biyofilm üretimi epitel hücreleri üzerinde gerçekleşmemektedir. Söz konusu genetik determinant FimH adhezinini ifade ederek mannoz rezidülerine olan adezyona imkan tanımaktadır. Plazmid kodlu fimbriya (pef) ve kıvrımlı fimbriya (csg) biyosentezinden yoksun mutantlar plastik, HEp-2 ve tavuk bağırsak epiteli gibi abiyotik ve biyotik substratlar üzerinde biyofilm üretememektedir. Kıvrımlı fimbriya mutantları aynı zamanda murin epitelyum hücre hatlarına tutunmada da yetersizdir (Sukulpolvi vd. 1997). Uzun polar fimbriya (lpf) üretiminden yoksun mutantlarda ise HEp-2 hücre hatları ve plastik üzerinde biyofilm üretim kapasitesi açısından orta düzeyde bir azalma saptanırken, tavuk bağırsak epitel hücrelerinde biyofilm üretiminde çok ciddi bir azalma görülmektedir. Diğer yandan sth mutantlarında ise biyofilm üretimi açısından kayda değer bir eksiklik görülmezken, bcf mutantlarında plastik yüzeylerde, HEp-2 hücre hatları ve tavuk bağırsak epitelyum hücrelerinde biyofilm üretiminde kayda değer bir artış saptanmıştır. Biyofilm üretiminde rol alan genetik determinantların etkinliklerinin saptanmasına ilişkin yapılan in vitro çalışmalar sonucunda; tip 1 fimbriya, plazmid kodlu fimbriya, kıvrımlı fimbriya, uzun polar fimbriya ve Bcf gibi bileşenlerin in vivo 22 koşullardaki biyofilm üretimine ilişkin benzer rollere sahip olduğu anlaşılmıştır (Ledeboer vd. 2006). Tip 1 fimbriya domuzlarda in vivo kolonizasyonda da önemlidir (Althouse vd. 2003). Tüm bu sonuçlar fimbriyaların biyofilm üretiminde her birinin kendisine özgü fonksiyonları olduğunu ve biyofilmin abiyotik ve biyotik substralar üzerinde olgunlaşmasında tamamlayıcı rolleri olduğunu kanıtlamaktadır. Fimbriyanın biyofilm oluşumu ile ilgili en mühim tarafı, fimbriyanın biyosentezinin biyofilmin dahil olduğu sistemin koşullarına doğrudan bağlı olmasıdır. Fimbriyal operonlardaki (fim, csg, lpf ve pef) mutasyonlar, safra taşları üzerindeki biyofilm üretimini doğrudan etkilemezken, tip 1 fimbriyanın fazlaca ifade edilmesi (fimW insersiyonal aktivasyonu aracılığıyla) kolesterol ve safra taşları üzerinde biyofilm olşumunu ve olgunlaşmasını olumsuz yönde etkilemektedir. Ancak aynı durum, cam ve plastik gibi abiyotik substratlar üzerinde görülmemektedir (Prouty vd. 2002, Crawford vd. 2010). S. Enteritidis’te kodlanan, büyük (386 kDa), prolin-treonin amino asitlerince zengin, çok bölgeli BapA proteini Staphylococcus aureus’taki Bap (biyofilm ilişkili protein) yüzey proteini ile homoloji göstermekte ve benzer bir fonksiyon içermektedir. BapA proteini, “rdar” morfotipinin kıvrımlı fimbriyadan sonraki ikinci önemli protein fraksiyonudur. BapA proteini özellikle LB koşullarında bakteriyal agregasyonda ve sıvı-hava ara fazında pelikül oluşumunda son derece kritik bir role sahiptir. bapABCD operonundan kodlanan ve BapBCD tip 1 protein salgı sistemi aracılığı ile salgılanan BapA proteini, bakteri yüzeyine gevşek bir şekilde tutunmaktadır. BapA proteini yüksek düzeyde ifade edildiğinde pelikül oluşumu ve biyofilm üretimi de artmaktadır. BapA ile yüksek düzeyde homoloji gösteren STM4261 proteini (siiE) Salmonella genomundan ifade olan en büyük iki proteinden bir diğeridir ve S. Enteritidis’te BapA’da olduğu gibi biyofilm üretimi ile doğrudan bir ilişkisi yoktur. Kısaca söz konusu iki protein dizileri arasında yüksek homoloji olmasına karşın, ikisinin fonksiyonelliği birbirinden oldukça farklıdır. BapA proteinin biyofilm matriksinde her ne kadar ikinci önemli protein fraksiyonu olsa da tek başına kıvrımlı fimbriyanın ya da selülozun noksanlığını biyofilm üretimi açısından giderebilecek potansiyelde bir bileşen değildir (Latasa vd. 2005). Selüloz β-1-4-D-glikoz polimeri olup, Salmonella’da bcsABZC-bcsEFG operonundan kodlanmaktadır. Selüloz Salmonella biyofilm matriksindeki en önemli polisakkarit bileşenidir. Selülozun biyofilm sistemindeki etkisi, hücre-hücre interaksiyonlarını tesis 23 ederek yapışkan ve kompozit bir matriks ağı oluşturmaktır (Römling vd. 2000, Zogaj vd. 2001, Solano vd. 2002). Matrikste selüloz noksanlığı olması halinde Kongo kırmızlı agar besiyerlerinde gözlenen morfotip “bdar” morfotipidir, matrikste major bileşen olarak sadece selüloz ihtiva eden biyofilmlerin aynı besiyerlerinde gözlenen morfotipi ise “pdar” morfotipidir. Selüloz biyofilm oluşumunun erken safhalarında ilk tutunmada kritik bir role sahip olmasının yanı sıra biyofilmin olgunlaşmasında da elzemdir. Zira bcsB mutantlarının kullanıldığı çalışmalarda Salmonella’da biyofilm üretiminin ciddi düzeyde azaldığı saptanmıştır (Ledeboer vd. 2006). Benzer bir çalışmada abiyotik substratların yanı sıra biyotik substralarda (Hep-2 hücreleri ve tavuk bağırsak hücreleri) üzerinde de bcsB mutantlarının biyofilm üretim kapasitesinin düştüğü gözlenmiştir (Ledeboer and Jones 2005). Selülozun abiyotik substratlara tutunma üzerine olan fonksiyonunun saptanmasına yönelik başka bir çalışmada ise, bcsA mutantlarının (S. Enteritidis ve S. Newport) alfaalfa gibi bitkilerin yüzeylerine daha az tutunabildiği ve daha az miktarda biyofilm üretebildiği saptanmıştır (Barak vd. 2007). Bitki yüzeylerinde bulunana ve matriksinde hem selüloz hem de kıvrımlı fimbriya ihtiva eden Salmonella biyofilmleri kontamine suların sulamada kullanılması durumunda biyofilm yapıları içerisinde bu suyu muhafaza ederek uzun vadeli sürekli kontaminasyonlara da olanak sağlamaktadır (Lapidot ve Yaron 2009). Bitkilerle simbiyotik ilişkide bulunan ve bitkiler için patojenik olan birçok bakterinin matriks bileşeni olarak ürettiği selüloz bitki yüzeylerindeki adezyonda son derece kritik bir öneme sahiptir. Zira bitki yüzeyinde bulunan bakteriyal orijinli selüloz yapışkan tabiatından ötürü biyofilm üreticisi olmayan patojenlerin de bu lokasayonlara selüloz aracılığı ile tutunarak bitkilerde hastalalık etmeni olabileceği bilinen bir diğer durumdur (Rodrigues vd. 2007). Selülozun söz konusu fonksiyonelliklerinden ve yüzey adezyonundaki rollerinden farklı olarak, selüloz Salmonella’nın safra taşlarının yüzeyine tutunmasında öncelikli bir role sahip değildir (Prouty ve Gunn 2003). Salmonella’da selülozun fonksiyonlarına benzer bir şekilde kolanik asit de biyotik susbstratlar üzerinde biyofilm üretimi için gerekmektedir (Danese vd. 2000). Ancak kolanik asit Salmonella’nın abiyotik yüzeyler, safra taşı (wcaA mutantı) ve bitki yüzeylerinde (wcaJ mutantı) biyofilm üretebilmesi için zorunlu değildir. Bu sonuçlar ilgili bileşen için Salmonella’nın hayvan ve bitki epitel hücreleri üzerinde farklı bir 24 biyofilm davranış modeli sergilediğini kanıtlar niteliktedir (Prouty ve Gunn 2003, Ledeboer ve Jones 2005, Barak vd. 2007). Kolanik asitten sonraki bir diğer önemli polisakkarit bileşeni anyonik O-Ag-kapsülüdür. O-Ag-kapsülü lipitlere kovalent modifikasyonlar aracılığı ile bağlanmaktadır (White vd. 2003, Gibson vd. 2006). O-Ag-kapsülü 2300 adet tekrar eden tetrasakkarit birimlerinden oluşmakta ve lipid bir çapa aracılığı ile membrana bağlanmaktadır (Snyder vd. 2006). O-Ag kapsülü (yihU-yshA ve yihVW aracılığı ile kodlanan) S. Enteritidis’teki LPS O-Ag-kapsülü ile tekrar eden şeker dizileri itibariyle benzerlik göstermektedir, ancak ilgili yapı toplam yük karakteristiği, lipitlere bağlanma motifleri ve immün reaksiyonları açısından LPS O-Ag kapsülünden farklılık göstermektedir (White vd. 2003, Gibson vd. 2006, Synder vd. 2006). O-Ag-kapsülü bakteriyi desikasyona karşı olan toleransını artırmakta, ancak çok hücreli davranış motifinin ifadesinde ve katı besiyerleri üzerinde hücre dışı polimerik matriks bileşenlerinin tesisinde önemli bir rol üstlenmemektedir. Bunun yanında, biyofilm sistemlerinden bağımsız olarak O-Ag-kapsülü Salmonella’nın dış çevrede hayatta kalmasına katkı sağlayan bir bileşendir (Gibson vd. 2006). O-Ag-kapsülü S. Typhimurium ve S. Typhi’de safra taşları üzerindeki biyofilm üretiminde kritik bir fonksiyona sahipken, cam ya da plastik gibi abiyotik yüzeyler üzerindeki biyofilm oluşumu için kritik değildir (Crawford vd. 2008). O-Ag-kapsülünün alfaalfa gibi bitkilerin yüzeylerine tutunmada ve biyofilm oluşumunda önemli katkıları vardır, ancak benzer katkının epitelyum hücrelerine olan tutunmada olup olumadığı henüz netlik kazanmamıştır (Barak vd. 2007). Farklı yağ asitlerinin (doymuş ve doymamış yağ asitlerini içeren yaygın LPS komponentleri S. Enteritidis suşlarının “rdar” morfotipi ifade eden suşlarında EPS fraksiyonu olarak bulunabileceği saptanmıştır (Gibson vd. 2006). LPS ve yaygın enterobakteriyal antijen ya da onların biyosentetik üretim sürecine dahil olan bazı komponentleri Salmonella’da LB koşullarında biyofilm üretimi için gerekmekte iken, ATM koşullarında gerekmemektedir (Solano vd. 2002). LPS üretimi açısından mutant S. Typhimurium LT2 suşları doğal tip suşlara nispeten PVC gibi abiyotik yüzeyler üzerinde daha fazla biyofilm üretmektedir (Mireles vd. 2001). galE ve rfaD mutantları 25 ile yapılan çalışmalarda LPS O-Ag sentezi açısından yetersiz suşlarının hidrofobik karakteristikteki safra taşları üzerindeki biyofilm üretiminde önemli bir değişim saptanmazken, hidroflik karakteristikteki cam gibi yüzeylerdeki biyofilm üretiminde azalma saptanmıştır (Prouty ve Gunn 2003). galE şeker metabolizmasında merkezi bir rolü olan ve galaktoz ve nükleozid öncüllerinin biyosentezinde rol alan uridin difosfogalaktoz-4-epimeraz enzimini kodlamaktadır. Galaktoz yalnızca LPS üretimi ile ilişkili olmayıp (dış kor kısmı ve O-antijen sentezi) kolanik asit ve O-Ag-kapsül biyosentez süreçleri ile de ilgilidir. Bu nedenle ilgili enzimi kodlayan gen (galE) üzerinde meydana gelebilecek anlamlı tek bir mutasyon dahi yüzey yapılarının regülasyonunda ve biyofilm oluşumunda birçok etkiye neden olacaktır. LPS ifadesinin regülasyonu ile ilişkili determinantlardan biri olan rfbA geninde meydana gelecek bir mutasyon eksik bir LPS profilinin eksik ifadesine neden olmakta, bu durum “rdar” biyofilm morfotipinin eksik bir şekilde ifadesine, yetersiz pelikül oluşumuna ve PVC gibi abiyotik yüzeyler üzerinde zayıf bir biyofilm oluşumunun görülmesine yol açmaktadır (Danese vd. 2000, Gibson vd. 2006). 2.7 Hücre Dışı DNA Biyofilm içerisinde gelişen bakteriler kimyasal ve mekanik strese karşı kendilerini korumaktadır. Biyofilm yapısının büyük bir kısmı hücre dışı polimerik bileşenlerden oluşmaktadır. Hücre dışı matriks farklı kimyasal içerikli proteinlerden, polisakkaritlerden ve hücre dışı DNA’dan oluşmaktadır (Peterson vd. 2013). Kimyasal ve mekanik strese karşı biyofilmler tarafından korunan organizmalar hücre dışı polimerik matriks içerisine gömülüdür. Kimyasal ve mekanik stres, biyofilmler üzerinde deformasyona sebep olmak ile birlikte biyofilm oluşumunu teşvik edecek nitelikte de olabilir. Bakteriler neredeyse tüm doğal ve yapay yüzeylere tutunabilmektedir. Bakteriler yüzeye tutunduklarında biyofilm içerisinde kimyasal ve mekanik stresten korunmak için hızlıca gelişmektedir (Peterson vd. 2013). Matriks bileşenleri adezyon, kohezyon, su tutma, kimyasal değişimlere karşı koruma, iyon ve bileşikleri içinde tutma gibi özelliklere sahiptir (Flemming ve Wingender 2010). 26 Ekzopolisakkaritler hayvan ve bitki dokularında hücre dışı matriksin ana bileşeni olmakla birlikte mikrobiyal biyofilmlelerin de ana kurucu unsurlarıdır (Sutherland 2001). Son yıllarda hücre dışı DNA’nın biyofilm sistemlerindeki yapısal ve fonksiyonel rollerini kavramaya yönelik yapılan çalışmalar, hücre dışı DNA’nın da bahsi geçen diğer matriks bileşenleri kadar elzem olduğu kanıtlanmıştır. Farklı birçok biyofilm örneğinde hücre dışı DNA’ya (eDNA) rastlanmaktadır. eDNA’ya atık su sistemlerindeki biyofilm örneklerinde de büyük miktarlarda rastlanmaktadır (Frolund vd. 1996). Hücre dışı DNA birçok bakteri türünün biyofilminde bulunmakta ve biyofilm yapılarında önemli bir yapısal eleman olarak fonksiyon göstermektedir. Hücre dışı DNA, çoğu durumda biyofilm komponetlerinin hücre hücre bağlantısı işlevini yerine getiren rastgele kromozomal DNA’dan köken almaktadır (Allesen-Holm 2006). Hücreler, biyofilm mikrokolonileri içerisinde otolizise maruz kalmaktadır. Ancak hücre dışı DNA’nın ve biyofilm gelişiminin otolizise bir katkısı olup olmadığı henüz netlik kazanmamıştır (Webb vd. 2003). Hücre dışı DNA’nın biyofilm matriksi içerisindeki varlığı katyon gradiyentine, genomik DNA’nın serbest kalmasına ve antibiyotik direncine bağlı olabilmektedir (Mulcahy vd. 2008). Hücre dışı DNA biyofilm sistemlerinde çoğunlukla lize olan hücrelerden gelen kalıntı DNA parçalarından oluşmaktadır ve ilk tutunmadan biyofilmin olgunlaşmasına dek olan tüm süreçlerde önemli bir bileşen olarak rol almaktadır. Nükleik asitlerin mikrobiyal agregasyondaki rolü özellikle diğer major matriks bileşenleri arasındaki bağlantıların oluşturulması ile ilişkilidir. Örneğin Rhodovulum cinsi bakterilerin biyofilmlerine nükleolitik enzimler uygulandığında biyofilmler çok hızlı bir şekilde dağılabilirken, aynı cinsin biyofilmlerine proteinleri ve karbohidratları degrade eden enzimler uygulandığında biyofilm dağılmamaktadır (Watanabe vd. 1998). Hücre dışı DNA benzer şekilde P. aeruginosa biyofilmlerinde de hücre-hücre etkileşimlerinin sağlanmasında önemli rollere sahiptir (Yang vd. 2007). Hücre dışı DNA biyofilm sistemlerindeki yapısal ve fonksiyonel katkılarının saptanması için yapılan çalışmalarda; DNaz I enzim uygulaması sonucunda P. aeruginosa ve B. cereus’un biyofilm oluşumlarının başlangıç safhalarında mikrobiyal adezyonu engellendiği görülmüştür. Elde edilen bulgular DNA’nın ilk tutunmada bir adezin gibi rol üstlendiğini kanıtlar mahiyettedir (Whitchurch vd. 2002, Vllain vd. 2009). Hücre dışı DNA yapısal ve fonksiyonel etkilerinin yanı sıra, antimikrobiyal bir ajan gibi de davranabilmektedir. Hücre dışı 27 DNA, katyonları şelatlayarak lipopolisakkaritlerin ve dış membranın stabilizasyonuna katkı sağlamaktadır (Mulcahy vd. 2008). Hücre dışı DNA’nın biyofilmlerdeki lokalizasyonu çeşitlilik göstermektedir örneğin; P. aeruginosa’da örgü benzeri yapılar oluşturup organize olurken, başka bir bakteri de filamentöz yapılar halinde organize olabilmektedir (Allesen-Holm vd. 2006, Böckelman vd. 2006). Haemophilus influenza biyofilmlerindeki hücre dışı DNA su kanallarını destekleyen sıkı bir ağ yapısı halinde organize olmaktadır (Jurcisek ve Bakaletz 2007). Hücre dışı DNA esasen zamana bağlı olarak biyofilm sistemleri içerisinde farklı yerlere lokalize olmaktadır. P. aeruginosa biyofilmlerinde hücre dışı DNA, olgunlaşma safhasında karakteristik mantar benzeri yapının tesisine sap ve baş kısımları arasındaki bağlantıyı güçlendirerek katkı sağlamaktadır (Allesen-Holm vd. 2006). Sap kısmında lokalize olan yapılanmayı güçlendiren hücre dışı DNA aynı zamanda dış çevreden gelen ya da biyofilmin iç yapılarından göç eden bakterilerin buralara tutunmasını sağlayarak güçlü ve olgun biyofilmlerin oluşmasına olanak sağlamaktadır. Erken biyofilm oluşum aşamasında hücre dışı DNA’nın rolü hakkında bilinenler yetersizdir (Doern vd. 2009). Hücre dışı DNA’nın biyofilm oluşumunun başlangıcında, konakçı-bakteri etkileşiminin erken evresinde ve enfeksiyon sürecinin başlamasında payı bulunmaktadır (Brady vd. 2008, Dongari- Bagtzoglou 2008). Olgun biyofilmlerin yeni yüzeylere kolonize olması için biyofilmlerden kopmalar meydana gelmesi gerekmektedir (Klausen vd. 2006, Kirkov vd. 2007). Hücre dışı DNA’nın intrinsik ya da dışsal etkilerle yıkımı olgun biyofilmeden kopmalara, yeni nişlerin istilasına ve konakçı organizmada sürekliliği sağlamaya sebep olmaktadır (Costerton vd. 1999, Furukawa vd. 2006, Thomas vd. 2006). Hücre dışı DNA’nın biyofilmlerle ilişkisine bakıldığında nükleik asitlerin sesil hücrelerin besin ve enerji gereksinimlerinin bir kısmını da temin ettiği görülmektedir (Finkel ve Kolter 2001, Mulcahy vd. 2010). Hücre dışı DNA’nın besinsel krize yönelik gereksinimin bir kısmını sağlamasının yanı sıra yatay gen aktarım süreçlerini de teşvik ettiği bilinmektedir (Spoering ve Gilmore 2006, Conover vd. 2011). Hücre dışı DNA hemen hemen tüm bakterilerde biyofilm oluşumunun başlangıcı olan ilk tutunmada çok 28 önemlidir. Zira çok düşük miktardaki hücre dışı DNA’nın bulunması dahi güçlü bir biyofilm oluşumu için yeterlidir. Çalışmalar hücre dışı DNA’nın karakterizasyonu ve biyofilm gelişiminin potansiyel işlevi üzerinde yoğunlaşmaktadır. Ancak ilgili çalışmalarda hücre dışı DNA’nın ekstraksiyonu süresince lize olan hücrelerden gelen olası genomik DNA bulaşısı çoğu kez bu tip analizlerin yapılmasını güçleştirmektedir. Hücre dışı DNA’nın orijinine yönelik genel kanı biyofilm içersindeki hücrelerin lizisi sonucu açığa çıkan genomik DNA parçaları olduğu şeklindedir (Steinmoen vd. 2002, Hamilton vd. 2005, Patton vd. 2005, Rice vd. 2005, Yang vd. 2005). Örneğin; S. epidermidis’te hücre dışı DNA’nın alt popülasyonlardaki bakterilerin lize olmasıyla oluştuğu görülmektedir. Alt popülasyonların lizisi çift fonksiyonlu bir otolizin (AtlE) aracılığıyla gerçekleşmektedir. Lize olan alt popülasyonlardan açığa çıkan hücre dışı DNA kalan popülasyonların biyofilm üretim kapasitesini artırmakta ve teşvik etmektedir. Bu fenomen hücre dışı DNA’nın bazı biyofilm sistemlerinde son derece önemli bir yapısal bileşen olduğunu gözler önüne sermektedir (Molin ve Tolker-Nielsen 2003). Bunun dışında bazı bakteri türlerinde eDNA’nın özel bazı hücre dışı salgılama mekanizmaları tarafından biyofilm ortamına salındığı yönündedir (Renelli vd. 2004, Hamilton vd. 2005, Draghi ve Turner 2006, Abajy vd. 2007). Bu yöndeki araştırmalarda hücre dışı DNA’nın biyofilm matriksi oluşumuna katkı sağlayacak şekilde aktif taşıma sistemleri aracılığı ile salgılandığına işaret edilmektedir (Witchurch vd. 2002). Hücre dışı DNA’nın orijinini kavramaya yönelik olarak “Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RAPD-PZR) ve restriksiyon endonükleaz analizleri kolaylıkla kullanılabilmekte ve eDNA-genomik DNA farklılıkları gösterilebilmektedir (Bockelmann vd. 2006). Hücre dışı DNA’yı ekstraksiyon işlemi boyunca açığa çıkan genomik DNA’dan ve hücre dışı polimerik matriksin diğer bileşenlerinden ayırmak yüksek saflıkta hücre dışı DNA elde edilmesi açısından önem arz etmektedir. Biyofilm örneklerinden hücre dışı 29 DNA izole etmek için yüksek hızda santrifüj ve membran filtrasyonu gibi yöntemler birçok çalışmada kullanılmaktadır (Steinberger ve Holden 2005, Allesen-Holm vd. 2006, Bockelmann vd. 2006). Hücre dışı DNA, hücre dışı polimerik matrikste çeşitli fiziksel veya kimyasal etkileşimler tesis ederek hücre dışı proteinler, polisakkaritler ve diğer polimerler ile ilişkili olabilir. Hücre dışı polimerik matriksin protein ve polisakkaritlerden oluşan yapısal bileşenlerinin hücre dışı DNA ile olan sıkı etkileşimleri, hücre dışı DNA’nın EPS matriksten kolaylıkla ayrılmasına engel olmaktadır (Jianfeng ve Chuanwu 2009). Hücre dışı DNA’nın nükleik asit kompozisyonuna ve modifikasyonlarına bakıldığında, özellikle bazı bakteri türlerinde, genomik DNA’dan son derece farklı olabildiği görülmektedir. Örneğin; Bacillus subtilis biyofilmlerinde hücre dışı DNA’da genomik DNA’dan farklı olarak yüksek düzeyde metillenmemiş CpG’lere rastlanmaktadır (Olishevsky vd. 2004). Hücre dışı DNA salınımı erken eksponansiyel büyüme fazında başlamakta ve durağan fazda en yüksek konsantrasyona ulaşmaktadır. Örneğin; Pseudomonas aeruginosa biyofilm üretiminin başlangıcında gerekli olan aljinat biyosentezi süresince yüksek miktarda hücre dışı DNA sentezlemektedir (Steinberger vd. 2002, Whitchurch vd. 2002). Enterobacteriaceae familyasına üye bakterilerin biyofilm yapılarındaki hücre dışı DNA’nın hemen hemen tüm üyelerde ortak olmak üzere yaklaşık 30 kb’lik bir büyüklüğe sahip olduğu bilinmektedir. Hücre dışı DNA’nın biyofilm oluşum aşamalarında elzem bir rol oynadığı DNaz I enziminin varlığındaki biyofilm oluşumuna ilişkin çalışmalarda; biyofilm kütlesinde, biyofilm devamlılığında ve biyofilmin antibiyotik toleransında ciddi azalmaların saptanmasıyla anlaşılmıştır. Biyofilm oluşumunda hücre dışı DNA’nın DNazI enzimi tarafından yıkımı mikrobiyal topluluğun başkalaşmasına yani çevresel faktörlere karşı toleransının azalmasına yol açabilmektedir (Tetz vd. 2009, Victor ve George 2010). 30 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal 3.1.1 Bakteriler Tez çalışmasında kullanılan farklı serovaryetelere dahil tüm Salmonella suşları (n=18; 17 adet DMC kodlu, 1 adet Salmonella Typhimurium SL1344 suşu) Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Prokaryot Genetiği Laboratuvarı bünyesinde oluşturulan kültür koleksiyonundan sağlandı. Stok kültürler -80ºC’ de % 60 gliserol ilave edilen Luria-Bertani (LB) sıvı besiyerinde saklandı. Biyofilm çalışması süresince denenecek kültürler, NaCl içermeyen LB sıvı besiyerinde [bacto-tryptone 10 g/L (Merck, Almanya), maya ekstraktı 5 g/L (Merck, Almanya)], 37°C’de bir gece geliştirildikten sonra denemeye alındı (Römling vd. 1998). Kültür koleksiyonundan her bir serovarı temsil eden ve biyofilm üretim kabiliyeti olan suşların listesi çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1 Çalışma dahilinde kullanılan Salmonella suşları Suş kodu Suş adı DMC3 Enteritidis DMC4 Typhimurium DMC5 Virchow DMC12 Infantis DMC13 Roughform DMC15 Nchanga DMC34 Kentucky DMC36 Corvallis DMC44 Thompson DMC50 Group C1 DMC55 Senftenberg DMC59 Agona 31 Çizelge 3.1 Çalışma dahilinde kullanılan Salmonella suşları (devam) DMC66 Telaviv DMC78 Bisbepjerg DMC88 Montevideo DMC90 Anatum DMC93 Salford M43* Typhimurium SL1344 * M43 Salmonella Typhimurium SL1344 (referans suş) 3.1.2 Besiyerleri Luria Bertani (LB) Broth ve Agar (Merck, Germany) İçerik g/L Tripton 10 g Maya ekstraktı 5g Sodyum klorid 10 g Agar 15 g Distile su ile 1000 mL’ ye tamamlanır. Sterilizasyondan önce pH 7.0 ± 0.2’ ye ayarlanır. Broth besiyeri cam tüplere dağıtıldıktan, katı besiyeri ise agar ilavesinden sonra otoklavda (121°C/15 dakika) sterilize edilir. Katı besiyerleri 55C’ ye kadar soğutulduktan sonra petrilere dökülür. Luria Bertani (LB) Broth ve Agar (NaCl’siz) İçerik Tripton g/L 10 g Maya ekstraktı 5g Agar 15 g 32 Distile su ile 1000 mL’ ye tamamlanır. Sterilizasyondan önce pH 7.0 ± 0.2’ye ayarlanır. Broth besiyeri cam tüplere dağıtıldıktan, katı besiyeri ise agar ilavesinden sonra otoklavda (121°C/15 dakika) sterilize edilir. Katı besiyerleri 55C’ye kadar soğutulduktan sonra petrilere dökülür. Kongo Kırmızısı İçeren (40 µg/mL) Luria Bertani (LB) Agar (NaCl’siz) İçerik g/L Tripton 10 g Maya ekstraktı 5g Kongo kırmızısı 0,04 g Agar 15 g Distile su ile 1000 mL’ye tamamlanır. Sterilizasyondan önce pH 7.0 ± 0.2’ye ayarlanır. Çözülen içeriğe 0,04 gram Kongo kırmızısı ilave edilir. pH ayarı yapılıp 15 gram agar ilavesinden sonra besiyeri 121C’ de 15 dakika sterilize edilir. Katı besiyerleri 55C’ ye kadar soğutulduktan sonra petrilere dökülür. PBS (Fosfat Salin Tamponu) NaCl g/L 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,24 g Distile su ile 1000 mL’ye tamamlanır. Sterilizasyon işlemi 121°C’ de 15 dakika süre ile yapılır. 33 SF (Serum Fizyolojik) NaCl g/L 8,5 g dH2O 1000 mL Alkol/Aseton Çözeltisi 100 mL Saf etanol 70 mL Aseton 30 mL 100 mL Glasiyel asetik asit çözeltisi % 33‘lük Glasiyel asetik asit 100 mL CTAB/NaCl g/100mL NaCl 4,1 g CTAB 10 g dH2O 100 mL NaCl 80 mL distile su içerisinde çözülür. 10 g CTAB yavaş yavaş eklenir. CTAB’ın çözünmesi için çözelti aralıklarla 65°C’ye kadar ısıtılır. Son aşamada toplam hacim distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Tris/HCl (0.5 M EDTA pH:8) g/L Tris 1,21 g EDTA 0,37 g Distile su ile 1000 mL’ye tamamlanır. pH 7.0 ± 0.02 (Sterilizasyondan önce) ayarlanır. Sterilizasyon işlemi 121°C’ de 15 dakika süre ile yapılır. 34 % 10’luk SDS Çözeltisi g/100mL SDS 10 g dH2O 100 mL DNA Jel Yükleme Tampon Çözeltisi Bromfenol mavisi g/100mL 0.25 mL Sakkaroz 40 g dH2O 100 mL Fenol/Kloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi Fenol Kloroform 25 mL 24 mL İzoamil alkol 1 mL Kloroform/ İzoamil Alkol Çözeltisi Kloroform 24 mL İzoamil Alkol 1 mL 3.1.3 Primerler P1254 5’-CCG CAG CCA A-3’ P1283 5’-GCG ATC CCC A-3’ 35 3.2 Yöntem 3.2.1 Kongo kırmızısı içeren LB agar besiyerlerinde Salmonella suşlarının biyofilm morfotiplerinin belirlenmesi Salmonella suşları (n=18; 17 adet DMC kodlu, 1 adet Salmonella Typhimurium SL1344 suşu) -20°C stoğundan alınarak 5’er mL’lik LB sıvı besiyerlerine % 1 inokülasyon oranıyla aktarıldı ve bir gece (18 saat) çalkalamalı koşullarda (200 devir/dakika) 37°C’de inkübasyona bırakıldı. Bir gecelik inkübasyondan sonra aktif kültürlerden % 1 oranında alınan inokülumlar 5’er mL’lik NaCl’siz LB sıvı besiyerlerine [bacto-tryptone 10 g/L (Merck, Germany), maya ekstraktı 5 g/L (Merck, Germany)] aktarıldı ve suşlar 37°C’de bir gece inkübasyona bırakıldı (Römling vd. 1998). İnkübasyondan sonra daha önceden hazırlanmış, biyofilm matriksinin bileşenleri için indikatör özellik gösteren Kongo kırmızısını (40 µg/mL) (Sigma, USA) içeren NaCl’siz LB agar besiyerlerine aktif kültürlerden 20’şer µL damlatıldı. Petriler daha sonra Salmonella’nın biyofilm üretiminde ve gelişiminde kritik olan üç farklı sıcaklıkta (20-28-37°C) en az 8 gün süreyle inkübasyona bırakıldı (Römling ve Rohde 1999). Tüm petriler stereo mikroskobunda (Leica, Germany) inkübasyon süresince her gün görsel olarak incelendi. Çalışma iki paralel ve iki tekrarlı olarak gerçekleştirildi. Suşların içerdiği morfotipler: biyofilmin matriksinde kıvrımlı fimbriya ve selüloz bulunduran “rdar” (kırmızı, kuru ve pürüzlü), yalnızca kıvrımlı fimbriya bulunduran “bdar” (kahverengi, kuru ve pürüzlü), yalnızca selüloz bulunduran “pdar” (pembe, kuru ve pürüzlü) ve her ikisini de bulundurmayan “saw” (düz ve beyaz) olmak üzere kategorize edildi. Çalışma iki tekrarlı olacak şekilde gerçekleştirildi. 3.2.2 Polistiren yüzeylerde biyofilm üreticisi Salmonella suşlarının belirlenmesi Salmonella suşlarının polistiren üzerinde biyofilm oluşturma özelliklerinin incelenmesi için Vestby vd. (2009) ve Stepanovic vd. (2000) tarafından önerilen yöntemler modifiye edildi. Bu amaçla, NaCl içermeyen 5 mL’lik LB sıvı besiyerlerinde 37°C’de, çalkalamalı koşullarda (200 rpm/saat) bir gece boyunca (18 saat) geliştirilen aktif kültürlerden, 15’er µL alınarak 115 µL NaCl’siz LB besiyeri ihtiva eden kuyulara inoküle edildi. Bakteri süspansiyonlarını içeren mikrotitre plakalar, 24-48 saat süresince 36 ve 20-28 ve 37°C’de statik koşullarda inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon süresi bitiminde, kuyular 2 defa steril fizyolojik serum (%0,85 NaCl) (Merck, Almanya) ile yıkandıktan ve plakalar oda sıcaklığında kurutulduktan sonra % 95’lik metanol ile 10 dakika süresince fikse edildi.130 µL % 0,1’lik kristal viyole kuyulara aktarıldı. Boya inkübasyonu için plakalar oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. Daha sonra plakalar, steril distile su ile 2 kez yıkandı. Biyofilm tabakasına bağlanan boyaların çözünmesi için kuyulara 130 µL % 33’lük glasiyel asetik asit aktarıldı ve plakalar 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. İnkübasyon bitiminde çözünen kristal viyole boyası, OD595nm’ de Elisa okuyucusunda (Biorad, USA) ölçüldü. Bu deneme, tüm suşlar için sekiz paralel ve iki tekrar olacak şekilde gerçekleştirildi. Biyofilm ölçümlerinin sonucu her sekiz paralelden alınan OD değerlerinin ortalamasından, kontrol (yalnızca NaCl’siz LB sıvı besiyeri içeren kuyular) kuyularının OD değerlerinin ortalamasının çıkarılmasıyla hesaplandı. Suşlar aynı zamanda “cut off” (sınır) değerlerinin dönüşümleri de esas alınmak suretiyle, biyofilm üretimleri açısından “üretici olmayan”, “zayıf”, “orta” ve “güçlü” olmak üzere değerlendirmeye tabi tutuldu. Sınır değerleri, mikrotitre plaka ölçüm esasına dayalı yöntemlerde negatif test gruplarından gelen ölçüm sonuçlarının istatistiki sapma değerlerini ifade eden bir değerdir. Biyofilm üreticisi suşların biyofilm üretim kapasiteleri aşağıda ifade edilen sınır değerlerin dönüşümleriyle ifade edilmektedir (Çizelge 3.2). Çizelge 3.2 Biyofilm üretim kapasitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan “cut off” (sınır değer) dönüşümleri OD ≤ ODc üretici değil ODc < OD ≤ 2xODc zayıf üretici 2xODc < OD ≤ 4xODc orta düzey üretici 4xODc < OD güçlü üretici 37 3.2.3 Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi Bu yöntem Stephanovic vd. (2000) yöntemi esas alınarak gerçekleştirilmiştir. Yöntem uygulanırken bazı modifikasyonlar gerçekleştirilmiştir. Bu bağlamada çalışılacak Salmonella suşları bir gece boyunca (18 saat) çalkalamalı koşullarda (200 rpm/dakika) NaCl’siz LB sıvı besiyerlerinde geliştirildi. Bir gecelik aktif kültürlerden 15’er µL alınıp içerisindeki son konsantrasyonları 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56 ve 0.78 µg/mL olan ve DNaz I enzimi (Sigma, USA) içeren NaCl’siz LB sıvı besiyeri ihtiva eden kuyulara (115 µL) transfer edildi. İnokülasyondan sonra mikrotitre plakalar 20-2837°C’de 24 ve 48 saat sürelerince inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sürelerinin sonunda mikrotitre plaka kuyuları aseptik koşullarda aspire edildi ve kuyular iki kez serum fizyolojik (150 µL) ile yıkandı. Yıkama işleminden sonra kurutulan mikrotitre plakalar 10 dakika süresince steril kabinde kurumaya bırakıldı. Kurutulan mikrotitre plakalar %95’lik metanol ile 10 dakika süresince fikse edildi. Bu işlemden sonra kuyulara 140 µL % 0,1’lik kristal viyole çözeltisi aktarıldı ve plakalar 30 dakika süresince inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon bitiminde tutunamayan boyaların uzaklaştırılması için kuyular distile su ile yıkandı. Yıkanan plakalar oda koşullarında kurutulduktan sonra tutunan boyaların çözünmesi için kuyulara 140 µL % 33’lük glasiyal asetik asit çözeltisi transfer edildi. Çözünen boya ELISA okuyucusunda 595 nm dalga boyunda ölçüldü. Test kuyuları belirtilen konsantrasyonlarda DNaz I enzimi içerirken, kontrol kuyuları enzim içermemektedir. Enzim aktivitesine bağlı olarak biyofilm üretim miktarında meydana gelebilecek olası değişimler [(C-B)-(T-B)]/(C-B) formülü esas alınarak hesaplandı (C; pozitif kontrol, yalnızca inokülüm ihtiva eden kuyulardan elde edilen optik dansite değerleri. T; uygun konsantrasyonlarda enzim ihtiva eden kuyulardan elde edilen optik dansite değerleri. B; yalnızca besiyeri ihtiva eden kuyulardan elde edilen optik dansite değerleri). Her bir serovaryete için birer kontrol ve test grubu oluşturulmuştur. Deney deseni üç paralel üç tekrar olacak şekilde düzenlenmiştir. 38 3.2.4 Hücre dışı DNA’nın Salmonella’nın olgun biyofilmleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi Bu çalışmada 28°C’de mikrotitre plakalarda geliştirilen Salmonella biyofilmleri kullanıldı. Biyofilm örneklemesinde, yukarıda biyofilm üretim miktarlarının tercih edilen yöntem esas alındı. İnkübasyon bitiminde aseptik koşullarda mikrotitre plaka kuyularından planktonik fazdaki bakteri hücreleri uzaklaştırıldı ve kurutularak hazır hale getirilen biyofilm örnekleri üzerine 50 µg/mL konsantrasyonda 130 µL’lik DNaz I enzim solüsyonları uygulandı ve biyofilm örneklerini içeren plakalar 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 ve 24 saatlik sürelerde inkübasyona bırakıldı. Kontrol örneklerini (yalnızca biyofilm örneği) içeren kuyulara yalnızca belirtilen hacimlerde fizyolojik serum transfer edildi. İnkübasyon bitiminde kuyular steril distile su ile yıkandıktan sonra tekrar kurumaya bırakıldı ve kurutma işleminden sonra biyofilm miktarlarının saptanmasında yine yukarıda özetlendiği üzere kristal viyole bağlanma süreci esas alındı. Enzim aktivitesine bağlı olarak biyomas miktarında meydana gelecek olası değişimler [(C-B)-(T-B)]/(C-B) formülü esas alınarak hesaplandı. Yöntem üç paralel ve üç tekrar olacak şekilde gerçekleştirildi. 3.2.5 Farklı orijinlerden gelen DNA’nın Salmonella’nın biyofilm oluşum sürecine olan etkilerinin değerlendirilmesi Bu çalışmada farklı orijinden gelen yabancı DNA’nın biyofilm ortamına ilavesi sonucu Salmonella’nın biyofilm yanıtında meydana gelecek olası değişimlerin saptanması amaçlandı. Bu bağlamda hücre dışı DNA’nın biyofilm oluşumunun başlangıç safhasında farklı etkileşimler yarattığı (inhibe edici ve stimüle edici) DMC4 kodlu S. Typhimurium ve DMC12 kodlu S. Infantis suşları çalışma için tercih edildi. Yabancı DNA örneklerinin biyofilm üretim sürecine olan etkilerinin değerlendirilmesinde biyofilm üretim miktarlarının belirlenmesinde tercih edilen ve yukarıda özetlenen mikrotitre plaka yöntemi esas alındı ve modifiye edildi. Yabancı DNA kaynağı olarak biyofilmlerin geliştirildiği besi ortamlarına farklı canlı gruplarını yansıtacak şekilde S. Infantis hücre dışı DNA’sı, S. Typhimurium hücre dışı DNA’sı, Staphylococcus aureus genomik DNA’sı, Enterococcus faecalis genomik DNA’sı, Candida albicans genomik DNA’sı, bitki DNA’sı (Dianthus) ve makrofungus (Coprinus comatus) DNA’sı ilave 39 edilmiştir. Yukarıda özetlenen yöntem dahilinde farklı olarak mikrotitre plaka test kuyularına yabancı DNA örnekleri son konsantrasyonları 50, 25, 12.5, 6.25 µg/mL olacak şekilde ilave edildi. Pozitif kontrol kuyularına yalnızca ilgili suşlar inoküle edildi. Mikrotitre plakalar 24 saat süresince 28°C’de inkübasyona kaldırıldı. İnkübasyon bitiminde yine aynı şekilde yıkama ve boyama işlemi yukarıda anlatıldığı üzere gerçekleştirildi. Yöntem üç paralel ve üç tekrar olacak şekilde gerçekleştirildi. 3.2.6 DNaz I enziminin Salmonella hücrelerinin canlılığı üzerindeki olası etkilerinin araştırılması Bu aşamada, “Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi” yönteminin uygulandığı süreçte biyofilm üretim miktarlarının saptanması aşamasından önce en yüksek konsantrasyonda DNaz I enzimi (100 µg/mL) içeren test kuyularının ve kontrol kuyularının (DNaz I enzimi içermeyip yalnızca inokülüm içeren) planktonik hücre formlarını içeren süspansiyonlarından 100’er µL alındı ve bir seri dilüsyon yapıldı. Dilüsyon işleminden sonra hazırlanan bakteri süspansiyonlarından kültürel sayım gerçekleştirildi. Sayım sonucunda kontrol ve test gruplarının sayım sonuçları karşılaştırıldı (Harmsenn vd. 2010). 3.2.7 Genomik DNA izolasyonu Çalışılan bakteri 5 mL LB broth ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve 37°C’ de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat süre ile geliştirildi. Bu süre bitiminde 1,5 mL kültür mikrofüj tüplerine alındı ve 12000 rpm’ de 2 dakika santrifüj edilerek bakteri hücreleri çöktürüldü. Üst sıvı ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra hücre çökeltisi 567 µL TrisEDTA tampon içerisinde çözüldü. Üzerine 30 µL % 10 SDS ve 3 µL proteinaz K (20 mg/mL, Sigma Chem Co. USA) aktarılıp karıştırıldı ve 37 °C’ de 1 saat tutuldu. Ortama 100 µL 5 M NaCl ilave edilerek karıştırıldı. 80 µL CTAB/NaCl çözeltisinin ilavesinin ardından kesik mikropipet uçları kullanılarak beyaz partikül yapısı oluşuncaya kadar iyice karıştırılan tüpler, 65°C’ de 10 dk tutuldu. Bu ortam üzerine 0,75 mL kloroform/izoamil alkol (24/1 hacim/hacim) aktarılıp karıştırıldı. 12000 rpm’ de 5 dk santrifüj edilen ortamın üst fazı yeni mikrofüj tüplerine alındı. Alınan faz üzerine 0,75 40 mL fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1 hacim/hacim) ilave edildi ve 12000 rpm’ de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Santrifüj işleminin sonunda tüplerdeki üst sıvı yeni mikrofüj tüplerine aktarıldı ve bu sıvının üzerine hacmin 0,6’sı (~350 µL) oranında izopropanol ilave edildi. Tüpler öne arkaya hareket ettirilerek karıştırıldı ve -20°C’ de 20 dakika bekletildi. Daha sonra 12000 rpm’de 5 dakika santrifüj işlemi uygulandı. Üst sıvı döküldükten sonra çökelti üzerine 350 µL % 70 etanol eklenerek tekrar 12000 rpm’de 5 dakika santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst sıvı dikkatli bir şekilde ortamdan uzaklaştırıldı ve genomik DNA örneği oda sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA çökeltisi 100 µL TE tampon içerisinde yaklaşık 1 saat muamele edilerek çözüldü (Wilson 2001). 3.2.8 Hücre dışı DNA izolasyonu Biyofilm matriksi içerisinde bulunma olasılığı olan hücre dışı DNA’ nın izolasyonu için genomik DNA izolasyonunda kullanılan prosedürün bazı aşamalarından yararlanıldı. NaCl’siz LB agar ortamlarında 1 gün boyunca 28°C’de geliştirilen biyofilmler inkübasyon sonunda steril kürdanlarla agar yüzeyinden kazınarak 3 mL serum fizyolojik ve 5 adet steril cam boncuk (r:3 mm) içeren cam tüplere aktarıldı. Daha sonra cam tüpler en yüksek devirde 2 dakika süresince karıştırıldı (IKA Genius Vortex 3, Germany). Karıştırma aşamasından sonra elde edilen biyofilm homojenatları 5 mL’lik santrifüj tüplerine aktarıldı ve 12000 rpm’de 2 dakika boyunca 1 kez santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst faz, santrifüjden sonra geriye kalan olası bakteri hücresi kalıntılarını uzaklaştırmak üzere 0,22 µm por çaplı membran filtrelerden (Sartorius, Germany) geçirildi. Filtre edilen üst fazlarda genomik DNA izolasyonunda belirtildiği üzere kloroform/izoamil alkol ve fenol/kloroform/izoamil alkol çöktürmeleri yapıldı, izopropanol ilave edilen tüpler beyaz çökelti oluşuncaya kadar karıştırıldı, 20 dakika süresince -20°C’de bekletildi ve 12000 rpm’de 5 dk santrifüj işlemi yapıldı. Üst sıvı döküldükten sonra çökelti üzerine 350 µL % 70’lik etanol eklenerek tekrar 12000 rpm’de 5 dakika santrifüj işlemine tabi tutuldu. Üst sıvı dikkatli bir şekilde ortamdan uzaklaştırıldı ve hücre dışı DNA olması muhtemel örnekler oda sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA çökeltisi 100 µL distile su içerisinde muamele edilerek çözüldü (Wilson 2001). 41 3.2.9 Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu (RAPDPZR) analizleri RAPD-PZR analizleri için Lin vd. (1996) tarafından önerilen yöntem kullanıldı. Bu çalışma dahilinde öncelikle reaksiyon bileşenlerinin optimizasyonu gerçekleştirildi. Optimize reaksiyon bileşenleri, reaksiyon koşulları ve reaksiyonlarda tercih edilen primer dizileri çizelge 3.3- 3.5’te verilmiştir (Lin vd. 1996). Çizelge 3.3 RAPD-PZR çalışmaları için optimize edilmiş reaksiyon bileşenleri Steril dH2O (Nuclease free water, Bioshop) 10X PCR Tampon –MgCl2 +KCl (Fermantas) Primer (10µM, Sentegen) dNTP (10 mM her biri için, Fermantas) MgCl2 (25 mM Fermantas) Taq DNA Polimeraz (5 U/mL Fermantas) DNA (40ng) 17,5 µL 5 µL 10 µL 2 µL 10 µL 0,5 µL 2 µL TOPLAM 50 µL Çizelge 3.4 RAPD-PZR çalışmaları için tercih edilen primerler ve dizileri 5’-CCG CAG CCA A-3’ 5’-GCG ATC CCC A-3’ P1254 P1283 Çizelge 3.5 RAPD-PZR reaksiyon koşulları 94 oC ……4 dakika 35 oC ……4 dakika 4 döngü 72 oC ……4 dakika 94 oC …...30 saniye 35 oC .…..60 saniye 30 döngü o 72 C …... 2 dakika 72 oC …....5 dakika 4 oC …... 42 RAPD-PZR reaksiyonları esas alınarak elde edilen genomik ve hücre dışı DNA’ların bant profillerinin karşılaştırılmasında, hücre dışı DNA’nın orijinine yönelik tahminlerde bulunulması amaçlanmıştır. Bu işlem sonrasında; 10 µL PZR ürünü, 2 µL 6X yükleme boyası karıştırıldı, kuyulara transfer edildi ve % 2 oranında agaroz içeren jel sistemlerinde 80 V elektrik akımı uygulanarak 1,5 saat yürütüldü. Elektroforez işlemi sonrasında agaroz jeller, 0,2 μg/mL etidyum bromit (Sigma Chem. Co., USA) çözeltisinde 20 dakika süre ile boyandıktan sonra 366 nm dalga boyunda UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları çekildi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System). 3.2.10 İstatistik analizleri Sonuçların değerlerilmesinde tercih edilecek istatistiki testler SPSS 22.0 (IBM, USA) paket yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. 43 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1 Kongo Kırmızısı İçeren NaCl’siz LB Agar Besiyerlerinde Salmonella Suşlarının Biyofilm Morfotiplerinin Belirlenmesi Çalışma kapsamında değerlendirmeye alınan ve farklı serovarlara dahil Salmonella suşlarının üç farklı sıcaklıkta içerdiği biyofilm morfotipleri çizelge 4.1’de ve şekil 4.1’de verilmiştir. Çizelge 4.1 Çalışma dahilindeki farklı Salmonella serovaryetelerinin üç farklı sıcaklıkta içerdiği biyofilm morfotipleri Suş Kodu Suş adı Enteritidis DMC3 DMC4 Typhimurium DMC5 Virchow DMC12 Infantis DMC13 Roughform DMC15 Nchanga DMC34 Kentucky DMC36 Corvallis DMC44 Thompson DMC50 Group C1 DMC55 Senftenberg DMC59 Agona DMC66 Telaviv DMC78 Bisbepjerg DMC88 Montevideo DMC90 Anatum DMC93 Salford Typhimurium M43 SL1344 İçerdiği morfotip İçerdiği morfotip (20°C) (28°C) İçerdiği morfotip (37°C) rdar rdar saw rdar rdar bdar pdar rdar rdar rdar rdar rdar rdar bdar bdar rdar bdar rdar rdar rdar bdar bdar pdar rdar rdar rdar rdar rdar rdar bdar bdar rdar bdar rdar rdar saw saw saw saw saw bdar bdar bdar saw saw saw saw saw saw saw saw rdar rdar saw 44 Bu yöntem ile Enterobacteriaceae ailesine dahil olan ve genellikle Salmonella ve E. coli gibi enterik mikroorganizmaların içerdikleri biyofilm morfotiplerinin taranması mümkündür. Tüm biyofilm çalışmalarında besiyeri olarak NaCl içermeyen LB sıvı besiyeri kullanılmıştır. Suşların bu ortamda geliştirilmesinin nedeni, artan ozmolariteyle Salmonella’nın biyofilmin matriksinde önemli bir yapısal ve fonksiyonel görevi olan kıvrımlı fimbriya (curli) genlerinin transkripsiyonel düzeyde ifadelerinin engellenmesidir (Olsén vd. 1993). Çalışmada morfotip analizi için tercih edilen NaCl’siz LB agar besiyerinde aynı zamanda Coomassie brillant blue (20 µg/mL) ve kıvrımlı fimbriyanın bağlanabildiği ve biyofilm morfotipi için indikatör bir boya özelliği gösteren Kongo kırmızısı (40 µg/mL) bulunmaktadır. NaCl’siz LB broth ortamlarında 37°C’de çalkalamalı koşullarda bir gece boyunca üretilen suşlar, Kongo kırmızısı içeren NaCl’siz LB agar ortamlarına inoküle edilmiştir. İnokülasyondan sonra suşlar biyofilm oluşturmaları için üç kritik sıcaklıkta yani 20, 28 ve 37°C’de 8 gün boyunca inkübasyona bırakılmıştır (Römling 2005, Vestby vd. 2009). 8 günlük inkübasyon sonunda suşlar içerdikleri morfotiplere göre değerlendirilmiştir. Kongo kırmızılı agar ortamlarında Salmonella’nın farklı biyofilm morfotipleri oluşturabildiği saptanmıştır. Bunlar: rdar (kırmızı, kuru ve pürüzlü) morfotipi; hücre dışı matriks bileşenleri olarak selüloz ve kıvrımlı fimbriya üreten, bdar (kahverengi, kuru ve pürüzlü) morfotipi, hücre dışı matriks bileşenleri olarak kıvrımlı fimbriya üreten, pdar (pembe, kuru ve pürüzlü) morfotipi, hücre dışı matriks bileşeni olarak selüloz üreten morfotiplerdir (Şekil 4.1). Bu morfotiplere ilave olarak biyofilm üreticisi olamayan ve hücre dışı matriksinde selüloz ve kıvrımlı fimbriya bileşenlerini bulundurmayan saw (düz ve beyaz) morfotipi de tanımlanmıştır (Römling vd. 1998, Solano vd. 2002). 45 Şekil 4.1 Salmonella suşlarında çalışma dahilinde saptanan üç farklı morfotip. a) rdar b) bdar c) pdar “Bdar” ve “rdar” morfotiplerinin matriksinde bulunan kıvrımlı fimbirya (curli), Enterobacteriaceae familyasına dahil bakterilerin dış yüzeylerinde bulunmaktadır (Olsén vd. 1989, Barnhart ve Chapman 2006). Kıvrımlı fimbriya, Eschericha ve Salmonella türlerinde yüksek agregasyon özelliği gösteren esnek fiber yapılar oluşturmaktadır. Kıvrımlı fimbriya, hücre-hücre ve hücre yüzey etkileşimini sağlayarak memeli ve bitki hücrelerindekinin yanı sıra cam, plastik ve paslanmaz çelik gibi inert yüzeylerde bakteriyal adezyonu gerçekleştirir (Barnhart ve Chapman 2006, Cegelski vd. 2009). Selüloz üretimi olmayan mutantlarla yapılan çalışmalarda, selüloz üretiminin Salmonella’nın patojenitesiyle ilişkisi olmadığı saptanmıştır. Ancak selüloz üretimi bakımından mutant suşların klor gibi bazı dezenfektanların etkilerine karşı çok daha duyarlı olduğu bilinmektedir. Selülozun biyofilm içerisindeki varlığı, Salmonella’nın çevresel yüzeylerde hayatta kalabilmesi için önemli bir faktördür (Solano vd. 2002). “Bdar ve “rdar” morfotiplerinin uzun süre hayatta kalabilme kabiliyetleri farklıdır. “Rdar” morfotipindeki bakterilerin “bdar” morfotipine kıyasla olumsuz çevresel koşullarda daha uzun süre hayatta kalabildiği ve birçok kimyasal ajana karşı daha dirençli olduğu bilinmektedir (Vestby vd. 2009). Morfotip analizine tabi tutulan farklı serovarlara dahil Salmonella suşlarının morfotip içeriklerinin saptanması, serovarlar arasında hücre dışı DNA’nın biyofilm üretiminde ve yapısallığındaki farklılıkların belirlenmesinin yanı sıra çeşitli morfotip içeriklerinin de söz konusu süreçlerdeki 46 rollerinin ve hücre dışı DNA ile ilişkilerinin anlaşılması için gerekli bulgulardır. Zira farklı biyofilm morfotiplerinin ihtiva ettiği farklı matriks bileşenlerinin özellikle olgun biyofilmlerde hücre dışı DNA ile olan etkileşimlerinin belirlenmesi bu bağlamda kritik bir önem arz etmektedir. Morfotip içeriklerinin dağılımı göz önünde bulundurulduğunda 20°C ve 28°C’de baskın morfotipin “rdar”, 37°C’de ise baskın morfotipin biyofilm üreticisi olmayan suşların içerdiği bir morfotip olan “saw” morfotipi olduğu Salmonella suşları (n=18) görülmektedir (Şekil 4.2). saw pdar bdar rdar 20°C 0 1 4 13 28°C 0 1 6 11 37°C 15 0 3 0 Farklı inkübasyon sıcaklıklarındaki biyofilm morfotip dağılımları Şekil 4.2 Salmonella suşlarının farklı inkübasyon sıcaklıklarındaki morfotip dağılımları Bu noktada kültür ortamında DNaz I enziminin bulunması halinde seçilecek bazı serovarların morfotip içeriklerindeki muhtemel farklanmaların saptanacak olması bilinenin dışında yeni morfotip içeriklerinin tanımlanabilmesi gibi sonuçları beraberinde getirebilir. Zira hücre dışı DNA’nın varlığına ya da yokluğuna göre Salmonella suşlarının biyofilm üretim durumlarındaki farklılıklar, kıvrımlı fimbriya ve selüloz gibi majör matriks komponentlerinin dışındaki diğer minör matriks bileşenlerinin varlıklarının hücre dışı DNA ile doğrudan ya da dolaylı yollardan ilişkisi olabileceği ihtimalini düşündürmektedir. 47 4.2 Polistiren Yüzeylerde Biyofilm Üreticisi Salmonella Suşlarının Belirlenmesi İlerideki çalışmalarda tercih edilecek suşların seçilmesi açısından öncelikli olarak her bir serovarı temsil eden suşların ideal birer biyofilm üreticisi olmaları elzemdir. İdeal üretici suşların tespitinin yanı sıra bu suşların Salmonella için kritik önem arz eden inkübasyon sıcaklıklarında (20-28 ve 37°C) biyofilm üretim kapasitelerinin araştırılması da hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilmlerinin yapısallığındaki ve fonksiyonelliğindeki rollerinin değerlendirilmesi açısından gereklidir. Zira biyofilm çalışmalarındaki inkübasyon sıcaklıkları DNaz I enziminin aktivitesiyle de doğrudan ilintilidir. DNaz I enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 37°C’dir. Biyofilm örneklemelerinin yapıldığı kültür ortamlarında enzimin optimum aktivite göstermesi, hücre dışı DNA’nın olası etkilerinin değerlendirilmesini doğrudan etkileyecek bir faktördür. Bu bağlamda üç farklı sıcaklıkta biyofilm örneklemelerinin yapıldığı inkübasyon koşullarında DNaz I enzimin varlığına bağlı olarak değişecek biyofilm üretim kapasitelerinin karşılaştırılacak olması, hücre dışı DNA’nın değişen inkübasyon sıcaklıklarına bağlı olarak farklanabilecek davranışlarının anlaşılmasına imkan tanıyacak mahiyette olacaktır. Çalışılacak suşların seçimi için laboratuvarımızda tez öncesi denemelerde kültür koleksiyonumuzdaki tüm Salmonella suşlarının biyofilm üretim kapasitelerinin belirlenmesi için yapılan analizlerin sonuçları her bir farklı serovarı temsil edecek şekilde baz alınmıştır. Sonuçlar Çizelge 4.3a-4.3s’te verilmiştir. Sonuçlar üç farklı inkübasyon sıcaklığını ve iki farklı inkübasyon süresini (24 saat ve 48 saat) yansıtacak mahiyettedir. 48 Çizelge 4.3a S. Enteritidis’in (DMC3) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi 0,118 ± 0,051 0,069 Zayıf Enteritidis 0,336 ± 0,053 0,044 Güçlü DMC3 Enteritidis 1,142 ± 0,058 0,066 Güçlü DMC3 Enteritidis 1,401 ± 0,105 0,074 Güçlü DMC3 Enteritidis 0,000 ± 0.000 0,153 Üretici değil DMC3 Enteritidis 0,025 ± 0,011 0,120 Üretici değil Suş adı Biyofilm üretim miktarı DMC3 Enteritidis DMC3 Suş kodu S. Enteritidis suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’ de, hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise söz konusu inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3b S. Typhimurium’un (DMC4) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC4 Typhimurium 0,403 ± 0,047 0,069 Güçlü DMC4 Typhimurium 1,920 ± 0,299 0,044 Güçlü DMC4 Typhimurium 0,325 ± 0,036 0,066 Güçlü DMC4 Typhimurium 0,822 ± 0,071 0,074 Güçlü DMC4 Typhimurium 0,000 ± 0,000 0,153 Üretici değil DMC4 Typhimurium 0,000 ± 0,000 0,120 Üretici değil 49 20°C ve 28°C’de S. Typhimurium suşu güçlü bir biyofilm üretim davranışı gösterirken, 37°C’de biyofilm üretimi söz konusu olmamıştır. Çizelge 4.3c S. Virchow’un (DMC5) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC5 Virchow 0,151 ±0,016 0,069 Orta DMC5 Virchow 0,265 ±0,077 0,044 Güçlü DMC5 Virchow 0,379 ±0,078 0,066 Güçlü DMC5 Virchow 0,863 ±0,094 0,074 Güçlü DMC5 Virchow 0,000 ±0,000 0,000 Üretici değil DMC5 Virchow 0,000 ±0,000 0,120 Üretici değil S. Virchow suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’de, hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise söz konusu inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3d S. Infantis’in (DMC12) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC12 Infantis 0,674 ± 0,062 0,069 Güçlü DMC12 Infantis 1,563 ± 0,165 0,044 Güçlü DMC12 Infantis 1,128 ± 0,353 0,066 Güçlü DMC12 Infantis 1,355 ± 0,087 0,074 Güçlü DMC12 Infantis 0,102 ± 0,013 0,153 Üretici değil DMC12 Infantis 0,147 ± 0,041 0,120 Üretici değil 50 S. Infantis suşu 20°C ve 28°C’de her iki inkübasyon süresi bitiminde güçlü bir biyofilm üretimi davranışı göstermiştir. 37°C’de biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3e S. Roughform’un (DMC13) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20 °C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC13 Roughform 0,158 ± 0,030 0,069 Orta DMC13 Roughform 0,081 ± 0,019 0,044 Zayıf DMC13 Roughform 0,834 ± 0,066 0,066 Güçlü DMC13 Roughform 1,845 ± 0,077 0,074 Güçlü DMC13 Roughform 0,004 ± 0,004 0,153 Üretici değil DMC13 Roughform 0,015 ± 0,007 0,120 Üretici değil S. Roughform’un güçlü bir biyofilm üretebilmesi için ideal inkübasyon sıcaklığının 28°C olduğu saptanmıştır. Çizelge 4.3f S. Nchanga’nın (DMC15) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC15 Nchanga 0,323 ± 0,061 0,069 Güçlü DMC15 Nchanga 0,356 ± 0,083 0,044 Güçlü DMC15 Nchanga 0,763 ± 0,077 0,066 Güçlü DMC15 Nchanga 2,372 ±0,067 0,074 Güçlü DMC15 Nchanga 0,000 ± 0,000 0,153 Üretici değil DMC15 Nchanga 0,007 ± 0,006 0,120 Üretici değil S. Nchanga, hem 20°C ve hem de 28°C’de güçlü bir biyofilm üreticisidir. 51 Çizelge 4.3g S. Kentucky’nin (DMC34) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı DMC34 Kentucky 0,168 ± 0,026 0,121 Zayıf DMC34 Kentucky 0,824 ±0,132 0,091 Güçlü DMC34 Kentucky 0,296 ±0,026 0,083 Güçlü DMC34 Kentucky 1,832 ±0,128 0,061 Güçlü DMC34 Kentucky 0,000 ±0,000 0,168 Üretici değil DMC34 Kentucky 0,000 ±0,000 0,112 Üretici değil S. Kentucky suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’de hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3h S. Corvallis’in (DMC36) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC36 Corvallis 0,396 ± 0,111 0,121 Orta DMC36 Corvallis 1,695 ± 0,136 0,091 Güçlü DMC36 Corvallis 2,525 ± 0,111 0,083 Güçlü DMC36 Corvallis 2,965 ± 0,007 0,061 Güçlü DMC36 Corvallis 0,439 ± 0,027 0,168 Zayıf DMC36 Corvallis 0,227 ± 0,039 0,112 Zayıf S. Corvallis suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’de hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon 52 sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3i S. Thompson’un (DMC44) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC44 Thompson 0,233 ±0,087 0,121 Zayıf DMC44 Thompson 1,650 ±0,034 0,091 Güçlü DMC44 Thompson 0,423 ±0,087 0,083 Orta DMC44 Thompson 1,395 ±0,039 0,061 Güçlü DMC44 Thompson 0,000 ± 0,000 0,168 Üretici değil DMC44 Thompson 0,000 ± 0,000 0,112 Üretici değil S. Thompson suşunda güçlü biyofilm üretiminin ideal koşullarının 20°C ve 28°C için 48 saatlik inkübasyon süresi olduğu saptanmıştır. Çizelge 4.3j S. Group C1’in (DMC50) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC50 Group C1 0,130 ± 0,047 0,121 Zayıf DMC50 Group C1 0,926 ± 0,335 0,091 Güçlü DMC50 Group C1 0,405 ± 0,047 0,083 Güçlü DMC50 Group C1 1,351 ± 0,060 0,061 Güçlü DMC50 Group C1 0,000 ± 0,000 0,168 Üretici değil DMC50 Group C1 0,000 ± 0,000 0,112 Üretici değil S. Group C1 suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’de hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon 53 sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3k S. Senftenberg’in (DMC55) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır ) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC55 Senftenberg 0,044 ± 0,010 0,121 Üretici değil DMC55 Senftenberg 1,284 ± 0,166 0,091 Güçlü DMC55 Senftenberg 0,270 ± 0,110 0,083 Orta DMC55 Senftenberg 1,467 ± 0,088 0,061 Güçlü DMC55 Senftenberg 0,000 ± 0,000 0,168 Üretici değil DMC55 Senftenberg 0,004 ± 0,013 0,112 Üretici değil S. Senftenberg suşunda güçlü biyofilm üretiminin ideal koşullarının 20°C ve 28°C için 48 saatlik inkübasyon süresi olduğu saptanmıştır. Çizelge 4.3l S. Agona’nın (DMC59) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC59 Agona 0,089 ± 0,016 0,121 Üretici değil DMC59 Agona 0,833 ± 0,053 0,091 Güçlü DMC59 Agona 1,565 ± 0,016 0,083 Güçlü DMC59 Agona 1,498 ± 0,050 0,061 Güçlü DMC59 Agona 0,000 ± 0,000 0,168 Üretici değil DMC59 Agona 0,005 ± 0,015 0,112 Üretici değil S. Agona suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’de hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon 54 sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise söz konusu inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3m S. Telaviv’in (DMC66) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC66 Telaviv 0,062 ±0,007 0,060 Zayıf DMC66 Telaviv 0,514 ±0,028 0,207 Orta DMC66 Telaviv 1,278 ±0,007 0,212 Güçlü DMC66 Telaviv 2,627 ±0,074 0,087 Güçlü DMC66 Telaviv 0,000 ± 0,000 0,163 Üretici değil DMC66 Telaviv 0,037 ±0,028 0,071 Üretici değil S. Telaviv suşunda 37°C’de biyofilm üretimi saptanmazken, güçlü biyofilm üretimi davranışı yalnızca 28°C’de hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon sürelerinin bitiminde saptanmıştır. Çizelge 4.3n S. Bispebjerg’in (DMC78) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi 20°C/24 saat DMC78 Bispebjerg 0,198 ± 0,017 0,060 Orta 20°C/48 saat DMC78 Bispebjerg 0,722 ± 0,098 0,207 Orta DMC78 Bispebjerg 1,478 ± 0,017 0,212 Güçlü DMC78 Bispebjerg 1,798 ± 0,093 0,087 Güçlü 37°C/24 saat DMC78 Bispebjerg 0,000 ± 0,000 0,163 Üretici değil 37°C/48 saat DMC78 Bispebjerg 0,003 ± 0,007 0,071 Üretici değil 28°C/24 saat 28°C/48 saat 55 S. Bispebjerg suşunda güçlü biyofilm üretim eğilimi yalnızca 28°C’de 24 ve 48 saatlik inkübasyon sürelerinin her ikisinde de saptanmıştır. Çizelge 4.3o S. Montevideo’nun (DMC88) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC88 Montevideo 0,293 ± 0,009 0,060 Güçlü DMC88 Montevideo 1,080 ± 0,127 0,207 Güçlü DMC88 Montevideo 1,947 ± 0,009 0,212 Güçlü DMC88 Montevideo 2,820 ± 0,005 0,087 Üretici değil DMC88 Montevideo 0,007 ± 0,000 0,163 Üretici değil DMC88 Montevideo 0,072 ± 0,084 0,071 Zayıf S. Montevideo suşunda 28°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda biyofilm üretiminde görülen düşüş dikkat çekicidir. Ayrıca 48 saatin sonunda 37°C’de zayıf da olsa bir biyofilm üretimi görülmektedir. Çizelge 4.3p S. Anatum’un (DMC90) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi DMC90 Anatum 0,262 ± 0,049 0,060 Güçlü DMC90 Anatum 1,106 ± 0,086 0,207 Güçlü DMC90 Anatum 0,860 ± 0,049 0,212 Güçlü DMC90 Anatum 2,143 ± 0,129 0,087 Güçlü DMC90 Anatum 0,017 ± 0,003 0,163 Üretici değil DMC90 Anatum 0,059 ± 0,011 0,071 Üretici değil S. Anatum, hem 20°C ve hem de 28°C’de güçlü bir biyofilm üreticisidir. 56 Çizelge 4.3r S. Salford’un (DMC93) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi Suş kodu Suş adı Biyofilm üretim miktarı DMC93 Salford 0,038 ± 0,001 0,067 Üretici değil DMC93 Salford 0,457 ± 0,031 0,065 Güçlü DMC93 Salford 0,512 ± 0,001 0,061 Güçlü DMC93 Salford 1,209 ± 0,051 0,071 Güçlü DMC93 Salford 0,040 ± 0,019 0,055 Üretici değil DMC93 Salford 0,055 ± 0,097 0,102 Üretici değil S. Salford suşunda 20°C’de 48 saatlik inkübasyon süresinin sonunda güçlü bir biyofilm üretimi görülmüş olup, 28°C’ de hem 24 saatlik hem de 48 saatlik inkübasyon sürelerinin sonunda güçlü biyofilm üretimi saptanmıştır. 37°C’de ise söz konusu inkübasyon sürelerinin bitiminde biyofilm üretimi saptanmamıştır. Çizelge 4.3s S. Typhimurium SL1344’ün (M43) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasiteleri Suş kodu 20°C/24 saat 20°C/48 saat 28°C/24 saat 28°C/48 saat 37°C/24 saat 37°C/48 saat M43 M43 M43 M43 M43 M43 Suş adı Typhimurium SL1344 Typhimurium SL1344 Typhimurium SL1344 Typhimurium SL1344 Typhimurium SL1344 Typhimurium SL1344 Biyofilm üretim miktarı STD “Cut off”(sınır) değeri Biyofilm üretim kapasitesi 0,857 ± 0,065 0,067 Güçlü 0,531 ± 0,016 0,065 Güçlü 0,497 ± 0,065 0,061 Güçlü 0,520 ± 0,018 0,071 Zayıf 0,052 ± 0,014 0,055 Üretici değil 0,000 ± 0,000 0,102 Üretici değil 57 Referans bir Salmonella suşu olmasından ötürü çalışma kapsamına dahil edilen S. Typhimurium SL1344 suşunda güçlü biyofilm üretim eğilimi 20°C’lik inkübasyon sıcaklığında görülmüştür. Tüm suşların belirtilen inkübasyon sıcaklıklarında ve sürelerindeki biyofilm üretim kapasitelerinin genel eğilimlerine baktığımızda kısa süreli inkübasyon sürecinde ideal biyofilm üretim sıcaklığının 28°C olduğu tespit edilirken, uzun süreli inkübasyon sürecinde (48 saat) 20°C ve 28°C inkübasyon sıcaklıklarında tüm suşlarda, biyofilm üretim profillerinin artış eğiliminde olduğu belirlenmiştir (Şekil SALMONELLA SUŞLARı (N=18) 4.4 ve 4.5). Güçlü Orta Zayıf Üretici olmayan 20°C 7 4 4 3 28°C 15 2 1 0 37°C 0 0 2 16 SALMONELLA SUŞLARI ARASINDAKI BİYOFİLM ÜRETİM DAVRANIŞLARININ DAĞILIMI (24 SAATLİK İNKÜBASYON SÜRESİ) Şekil 4.4 Salmonella suşları arasındaki biyofilm üretim davranışlarının dağılımı (24 saatlik inkübasyon süresi). 58 SALMONELLA SUŞLARI (N=18) Güçlü Orta Zayıf Üretici olmayan 20°C 15 2 1 0 28°C 15 0 1 2 37°C 0 0 2 16 SALMONELLA SUŞLARI ARASINDAKİ BİYOFİLM ÜRETİM DAVRANIŞLARININ DAĞILIMI (48 SAATLİK İNKÜBASYON SÜRESİ) Şekil 4.5 Salmonella suşları arasındaki biyofilm üretim davranışlarının dağılımı (48 saatlik inkübasyon süresi) Çalışmada kullanılan ve daha önceki çalışmalarda Türkiye’de açıkta satışa sunulan tavuk ve kırmızı et örneklerinden izole edilmiş ve serotiplendirilmiş suşların biyofilm üretim kapasiteleri değerlendirildiğinde, literatürdeki diğer çalışmalar ile benzer bulgulara ulaşılmıştır. Örneğin; hayvan, insan ve gıda kaynaklarından izole edilen S. Typhimurium ve S. Enteritidis serovarlarının kullanıldığı bir çalışmada, ideal gelişim sıcaklığının altındaki inkübasyon sıcaklıklarında (22°C ve 30°C) Salmonella suşlarınının 37°C inkübasyon sıcaklığına kıyasla daha fazla biyofilm ürettiği saptanmıştır (Stepanovic vd. 2003). Yine benzer şekilde balık yemi üretimi yapılan fabrika çevrelerinden izole edilen Salmonella suşlarında (serovar Agona, Montevideo, Senftenberg, Typhimurium) oda sıcaklığı koşullarında yüksek bir biyofilm üretim eğilimi görüldüğü saptanmıştır (Vestby vd. 2009). 4.3 Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilm oluşumu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi Çalışmanın başlangıcında Salmonella suşlarının biyofilm oluşturma kabiliyetleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi 59 açısından etkin bir DNaz I enzim konsantrasyonunun saptanması amaçlandı. Bu bağlamda en yüksek enzim konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde 100-50-25-12,5-6,25-3,12-1,56-0.78 µg/mL konsantrasyon gradiyenti, biyofilm oluşumu üzerinde enzimin etkinliğinin belirlenebilmesi için değerlendirmeye tabi tutuldu. Ön deneme çalışması, iyi bir biyofilm üreticisi olan ve tez öncesinde öne sürülen hipotezlerin sınanması için yapılan deneme çalışmalarında kesin olarak hücre dışı DNA ürettiği saptanan tek bir suş üzerinde yapıldı (DMC12, S. Infantis). Enzimin biyofilm oluşumu üzerindeki etkinliklerinin saptanmasında 20-28 ve 37°C olmak üzere üç farklı inkübasyon sıcaklığı ve 24-48 saat olmak üzere iki farklı inkübasyon süresi tercih edildi. 20°C inkübasyon sıcaklığında gerçekleştirilen denemede enzim etkinliğinin oldukça düşük olduğu saptandı (Şekil 4.6) (Tek yönlü varyans analizi, p=0.034). 20°C’de 48 saatlik inkibasyon süresinin bitiminde DNaz I enzim aktivitesi itibariyle biyofilm üretim profillerine bakıldığında, farklı konsantrasyonlarda enzim ihtiva eden kuyulardaki biyofilm miktarları ile kontrol kuyularındaki (enzim ihtiva etmeyen) biyofilm miktarları arasında anlamlı bir fark kalmadığı saptanmıştır. OD595nm dalga boyundaki byofilm üretim miktarı DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri 20ºC/24 saat 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Sütun1 kontrol (DNazI 0,78 µg/mL 1,56 µg/mL 3,12 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL 25 µg/mL enzimi içermeyen) 0,530 0,533 0,556 0,583 0,642 0,667 0,686 50 µg/mL 100 µg/mL 0,692 0,761 Şekil 4.6 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (20ºC/24 saat) 60 28ºC ve 37ºC’lik inkübasyon sıcaklıklarında ise 24 ve 48 saatlik inkübasyon süreleri sonunda enzimin daha yüksek düzeyde aktivite gösterdiği saptandı (Şekil 4.7-4.8-4.9- OD595nm dalga boyundaki byofilm üretim miktarı 4.10). DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri 28ºC/24 saat 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Sütun1 kontrol (DNazI 0,78 µg/mL 1,56 µg/mL 3,12 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL enzimi içermeyen) 0,934 0,723 0,725 0,708 0,889 0,797 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 0,929 1,152 1,221 OD595nm dalga boyundaki byofilm üretim miktarı Şekil 4.7 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (28ºC/24 saat) DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri 28ºC/48 saat 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Sütun1 kontrol (DNazI 0,78 µg/mL 1,56 µg/mL 3,12 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL enzimi içermeyen) 1,839 1,862 1,889 1,926 1,966 2,018 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 2,252 2,394 2,486 Şekil 4.8 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (28ºC/48 saat) 61 OD595nm dalga boyundaki byofilm üretim miktarı DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNazI enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri 37ºC/24 saat 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Sütun1 kontrol (DNazI enzimi içermeyen) 0,78 µg/mL 1,56 µg/mL 3,12 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL 25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 0,148 0,131 0,148 0,168 0,229 0,345 0,527 0,571 0,592 Şekil 4.9 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (37ºC/24 saat) OD595nm dalga boyundaki byofilm üretim miktarı DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNazI enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri 37ºC/48 saat 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Sütun1 kontrol (DNazI enzimi içermeyen) 0,78 µg/mL 1,56 µg/mL 3,12 µg/mL 6,25 µg/mL 12,5 µg/mL 25 µg/mL 0,169 0,133 0,110 0,115 0,127 0,224 0,360 50 µg/mL 100 µg/mL 0,408 0,456 Şekil 4.10 DMC12 S. Infantis suşunda farklı DNaz I enzim konsantrasyonlarının biyofilm üretimi üzerindeki etkileri (37ºC/48 saat) Bu sonuçlar dahilinde 37ºC gibi bir inkübasyon sıcaklığında biyofilm üreticisi olmayan bir suşun artan DNaz I enzimi konsantrasyonuna bağlı olarak bu inkübasyon sıcaklığında biyofilm üretim eğilimi göstermesi dikkate değer bir bulgudur. Bundan sonraki aşamada diğer tüm Salmonella suşları için yapılan denemelerde 28-37ºC 62 inkübasyon sıcaklıkları ve 50 µg/mL DNaz I enzim konsantrasyonu tercih edilmiştir (Tek yönlü varyans analizi, 24 saat ve 28°C için p=0.00; 48 saat ve 28ºC için p=0.00; 24 saat ve 37°C için; p=0.012; 48 saat ve 37°C için p=0.007). Söz konusu denemelerin sonuçları şekil 4.11a-4.11s’te verilmiştir. OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Enteritidis, DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,546 0,197 28ºC/48 saat 1,907 0,647 37ºC/24 saat 0,165 0,143 37ºC/48 saat 0,124 0,082 Şekil 4.11a Salmonella Enteritidis (DMC3), DNaz I enzim uygulamasının (50 µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Typhimurium (DMC4), DNaz I enzim uygulamasının (50 µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,525 0,312 28ºC/48 saat 0,911 0,490 37ºC/24 saat 0,045 0,024 37ºC/48 saat 0,007 0,042 Şekil 4.11b Salmonella Typhimurium (DMC4), DNaz I enzim uygulamasının (50 µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 63 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Virchow (DMC5), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,203 0,432 28ºC/48 saat 0,911 0,490 37ºC/24 saat 0,000 0,048 37ºC/48 saat 0,027 0,040 Şekil 4.11c Salmonella Virchow (DMC5), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Infantis (DMC12), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 1,016 1,296 28ºC/48 saat 1,303 1,500 37ºC/24 saat 0,237 0,592 37ºC/48 saat 0,155 0,389 Şekil 4.11d Salmonella Infantis (DMC12), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 64 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Roughform (DMC13), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,700 1,003 28ºC/48 saat 1,992 2,029 37 ºC/24 saat 0,123 0,229 37 ºC/48 saat 0,375 0,408 Şekil 4.11e Salmonella Roughform (DMC13), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Nchanga (DMC15), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,669 0,860 28ºC/48 saat 2,459 1,593 37ºC/24 saat 0,079 0,204 37ºC/48 saat 0,317 0,189 Şekil 4.11f Salmonella Nchanga (DMC15), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 65 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Kentucky (DMC34), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,272 0,403 28ºC/48 saat 1,799 0,920 37ºC/24 saat 0,007 0,010 37ºC / 48 saat 0,036 0,027 Şekil 4.11g Salmonella Kentucky (DMC34), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Corvallis (DMC36), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 2,649 1,510 28ºC/48 saat 3,036 1,141 37ºC/24 saat 0,111 0,044 37ºC/48 saat 0,522 0,098 Şekil 4.11h Salmonella Corvallis (DMC36), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 66 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Thompson (DMC44), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,479 0,430 28ºC/48 saat 1,587 0,974 37ºC/24 saat 0,205 0,207 37ºC/48 saat 0,411 0,179 Şekil 4.11i Salmonella Thompson (DMC44), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Group C1 (DMC50), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,519 0,564 28ºC/48 saat 1,281 0,886 37ºC/24 saat 0,141 0,214 37 ºC / 48 saat 0,296 0,213 Şekil 4.11j Salmonella Group C1 (DMC50), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 67 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Senftenberg (DMC55), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,198 0,130 28ºC/48 saat 1,575 0,651 37ºC/24 saat 0,003 0,053 37 ºC / 48 saat 0,000 0,050 Şekil 4.11k Salmonella Senftenberg (DMC55), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Agona (DMC59), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 1,655 0,801 28ºC/48 saat 1,537 1,355 37ºC/24 saat 0,274 0,076 37ºC/48 saat 0,554 0,178 Şekil 4.11l Salmonella Agona (DMC59), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 68 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Telaviv (DMC66), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 1,387 0,396 28ºC/48 saat 2,734 1,048 37ºC/24 saat 0,212 0,035 37 ºC / 48 saat 0,351 0,026 Şekil 4.11m Salmonella Telaviv (DMC66), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Bispebjerg (DMC78), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 1,501 1,080 28ºC/48 saat 1,964 1,869 37ºC/24 saat 0,029 0,040 37 ºC / 48 saat 0,196 0,131 Şekil 4.11n Salmonella Bispebjerg (DMC78), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 69 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Montevideo (DMC88), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 2,000 0,614 28ºC/48 saat 2,959 1,924 37ºC/24 saat 0,189 0,179 37 ºC / 48 saat 0,405 0,227 Şekil 4.11o Salmonella Montevideo (DMC88), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Anatum (DMC90), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,965 0,704 28ºC/48 saat 2,304 2,018 37ºC/24 saat 0,973 0,712 37 ºC / 48 saat 0,507 0,160 Şekil 4.11p Salmonella Montevideo (DMC90), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 70 OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Salford (DMC93), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/24 saat 0,510 0,802 28ºC/48 saat 1,268 1,171 37ºC/24 saat 0,518 0,610 37ºC/48 saat 0,693 0,418 Şekil 4.11r Salmonella Salford (DMC93), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi OD595nm'de biyofilm üretimi Salmonella Typhimurium SL1344, DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol (DNaz I içermeyen) DNaz I (50 µg/mL) 28ºC/2 4 saat 0,500 1,290 28ºC/4 8 saat 0,584 1,043 37ºC/2 4 saat 0,016 0,098 37ºC/4 8 saat 0,022 0,037 Şekil 4.11s Salmonella Typhimurium SL1344 (M43), DNaz I enzim uygulamasının (50µg/mL) biyofilm üretimi üzerine etkisi Bazı kontrol grupları ile (yalnızca inokülüm ihtiva eden) test gruplarının (DNaz I enzimi ve inokülüm içeren) biyofilm üretim miktarları arasındaki farklanmalarına bakıldığında; özellikle biyofilm üretiminin söz konusu olmadığı 37°C’lik inkübasyon sıcaklığında biyofilm üretimindeki bariz artış önem arzetmektedir. 37°C’de biyofilm üretim miktarlarındaki söz konusu artışlara özellikle Infantis, Roughform, Nchanga ve Group 71 C1 serovaryetelerinde rastlanmıştır. 28°C inkübasyon sıcaklığında gerçekleştirilen denemelerde birçok serovarda görülen eğilim biyofilm üretim miktarlarında görülen azalmadır. Ancak Virchow, Roughform ve Kentucky gibi serovaryetelerde ilk 24 saat içerisinde kontrol gruplarına kıyasla biyofilm üretimlerinde görülen artış dikkate değer bir diğer bulgudur. Çizelge 4.4 Salmonella serovaryetelerinin DNaz I enzimi varlığında (50 µg/mL) farklı inkübasyon sıcaklıkları ve sürelerindeki biyofilm üretim profilleri. Çizelgede verilen değerler her bir denemede kontrol ve test grupları arasındaki biyofilm üretim miktarlarının yüzde (%) farklanmalarını yansıtmaktadır (*Kontrol grubuna (DNaz I enzimi ihtiva etmeyen) kıyasla test grubunun biyofilm üretimindeki artış, — test ve kontrol gruplarının biyofilm üretimleri arasında fark yok, T test; p<0.05). 28ºC/24 saat 28ºC/48 saat 37ºC/24 saat 37ºC/24 saat DMC3 (Enteritidis) %63.92 % 66.07 %13.35 %33.87 DMC4 (Typhimurium) %40.57 %46.21 — — DMC5 (Virchow) *%112.8 %46.21 — — DMC12 (Infantis) *27.56 *15.12 *149.79 *150.97 DMC13 (Roughform) *43.43 *1.86 *86.18 *8.8 DMC15 (Nchanga) *28.55 35.22 *158.23 40.38 DMC34 (Kentucky) *48.16 48.86 — — DMC36 (Corvallis) 42.98 62.42 60.36 81.23 DMC44 (Thompson) 10.23 38.63 — 56.45 DMC50 (Group C1) *%8.67 *%30.83 *%51.77 %28.04 DMC55 (Senftenberg) *34.34 %58.66 — — DMC59 (Agona) %51.60 %18.20 %19.80 %67.87 DMC66 (Telaviv) %71.45 %61.67 %83.49 %92.60 DMC78 (Bispebjerg) %28.05 %4.84 — %33.16 DMC88 (Montevideo) %69.3 %34.98 %5.29 %17.80 DMC90 (Anatum) %27.05 %12.41 %26.82 %68.44 DMC93 (Salford) *%57.26 %7.65 *%17.76 %39.68 *%158 *%78.60 — — SalmonellaTyphimurium SL1344 Güncel araştırmalar birçok mikroorganizmanın üretebildiği polimerik bileşen olan hücre dışı DNA’nın, matriks bileşenlerinin birbirine bağlanmalarında ve in vitro biyofilm yapılarındaki stabilizasyonun sağlanmasında önemli fonksiyonları olduğuna işaret 72 etmektedir (Allesen-Holm vd. 2006). Gram-negatif ve Gram-pozitif birçok bakterinin polimerik bir matriks bileşeni olarak hücre dışı DNA ürettiği bilinmektedir. Günümüze dek bu bağlamda yürütülen birçok çalışma, hücre dışı DNA’nın biyofilm sistemlerinin kararlılığında ve fonksiyonelliğinde müspet katkıları olduğunu vurgular niteliktedir. Hücre dışı DNA’nın Salmonella biyofilmlerindeki rolü henüz netlik kazanmış değildir. Bu matriks bileşeninin varlığı S. Typhimurium ve S. Typhi gibi iki önemli serovarda saptanmıştır ancak; diğer bazı önemli serovarların biyofilmlerinde bu bileşenin varlığı henüz saptanmamıştır. Wang vd. (2014) yaptığı çalışma Typhimurium ve Typhi gibi serovarlarda hücre dışı DNA’nın biyofilm oluşumunun başlangıç aşaması olan ilk tutunmayı engellediğini gösterir mahiyettedir. Söz konusu çalışmada biyofilm üretim aşamasında tercih edilen inkübasyon sıcaklığı 30°C’dir. Bizim çalışmamızda kullanılan S. Typhimurium suşlarının biyofilm oluşturmalarında (28°C) hücre dışı DNA’nın etkisi, bu çalışmadaki bulgularla bazı noktalarda uyuşacak mahiyette bir eğilim göstermiştir. Çalışmamızda kullanılan Infantis, Roughform, Nchanga, Kentucky, Group C1, ve S. Typhimurium SL1344 suşları söz konusu olduğunda, bu suşlarda özellikle ilk 24 saat içerisinde biyofilm üretim miktarlarındaki artış hücre dışı DNA’nın biyofilmin başlangıç safhalarındaki ilk tutunmayı engeller nitelikte bir etkiye sahip olduğunu kanıtlamaktadır (Çizelge 4.4). Özellikle Wang. vd. (2014) bu yöndeki çalışmasında S. Typhimurium serovarında ilk 24 saat içerisinde bizim çalışmamızdakine benzer eğilimde mikrobiyal adezyonda bir azalma eğilimi görülmektedir. Ancak hem literatürdeki hem de çalışmamızda elde edilen bulgular; hücre dışı DNA’nın matriks içerisinde bulunup bulunmamasına bağlı olarak değişen adezyon paternlerinin serovar düzeyinden de öte suş düzeyinde dahi farklanmalara yol açtığına işaret etmektedir. Çalışmamız dahilindeki S. Typhimurium DMC4 suşunda hücre dışı DNA’nın giderimi neticesinde literatürdeki bulgulardan farklı olarak biyofim üretiminde önemli oranda bir azalma olduğu saptanmıştır (Şekil 4.3a, Çizelge 4.4). Bir diğer önemli bulgu, 37°C inkübasyon sıcaklığında Infantis ve Nchanga gibi serovarlar sırasıyla zayıf üretici ya da üretici olmayan biyofilm üretim profilleri sergilerken, hücre dışı DNA’nın kültür ortamından eliminasyonuna bağlı olarak biyofilm üretimlerinde artış görülmesi ve bunun sonucunda biyofilm üretici bir profile dönüşmeleridir (T test; p<0.05). Hücre dışı DNA, bazı serovarlarda biyofilm oluşumlarının başlagıcında önemli bir aşama olan mikrobiyal adezyona katkı sağlamak yerine mikrobiyal adezyonu engellemektedir. 73 Diğer birçok bakteriden farklı olarak Salmonella’da hücre dışı DNA, bazı serovarlarda mikrobiyal adezyonu engeller nitelikte bir etki gösterirken, tüm serovarların olgun biyofilmlerinde yapısallığa net bir katkı sağladığı kesindir. Bazı serovarlarda hücre dışı DNA’nın giderimine bağlı olarak biyofilm üretiminde görülen artış, Salmonella biyofilm matriksinde ana bileşenler olan kıvrımlı fimbriya ve selüloz gibi bileşenlerin dışında diğer minör matriks bileşenlerinin hücre dışı DNA ile serovar ya da suş düzeyinde bir farklılığı yansıtacak şekilde, çeşitli etkileşim desenleri oluşturabileceği ihtimalini akla getirmektedir. Bazı Salmonella serovarlarının biyofilmlerinde bulunan hücre dışı DNA’nın ilk tutunma aşamasında fonksiyonel olabilecek, ana bileşenler haricinde, matriks bileşenlerinin adhezif özelliklerini baskılayacak etkileşimlerde bulunması yine muhtemeldir. Ancak ilgili görüşlerin kanıtı için daha ileri analizlerin yapılması zorunludur. Ayrıca bu denemeler sonucunda elde edilen bulgular, çalışılan 18 farklı serovarın hücre dışı DNA ürettiğini dolaylı yoldan kanıtlar mahiyettedir. Zira biyofilm kültür ortamlarındaki DNaz I enziminin varlığı bu serovarların biyofilm üretimlerinde artış ya da azalış düzeyinde anlamlı farklanmaların meydana gelmesine neden olmuştur. 4.4 Hücre Dışı DNA’nın Salmonella’nın Olgun Biyofilmleri Üzerindeki Etkilerinin Değerlendirilmesi Bu çalışma kapsamında tüm Salmonella serovarlarının 24 saatlik biyofilmlerine 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 ve 24 saat sürelerince DNaz I enzim (50 µg/mL) uygulaması yapıldı. Geliştirilen biyofilm örnekleri yukarıdaki yöntemde belirtildiği üzere hazırlandı. Hazırlanan biyofilm örneklerine DNaz I enzimi belirtilen sürelerde ve 37°C’de uygulandı. Enzim uygulamalarından sonra biyofilm (biyomas) miktarlarındaki değişim, kontrol (enzim muamelesi yapılmayan) gruplarından elde edilen biyofilm (biyomas) miktarlarıyla karşılaştırıldı (Şekil 4.12a-4.12s). 74 2 1,5 1,052 0,390 0,350 0,480 0,450 0,451 0,480 0,5 0,460 1 0,520 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC3 S. Enteritidis'in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12a DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC3 S. Enteritidis’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2 0,170 0,233 0,231 0,244 0,251 0,321 0,5 0,346 1 0,375 1,5 0,649 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC4 S. Typhimurium'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12b DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC4 S. Typhimurium'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 75 2 1,5 0,165 0,160 0,183 0,200 0,255 0,254 0,258 0,5 0,311 1 0,410 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC5 S. Virchow'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12c DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC5 S. Virchow'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 1,101 1,043 0,975 1 1,225 1,153 1,185 1,5 1,339 2 1,490 2,5 2,000 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC12 S. Infantis'in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12d DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC12 S. Infantis’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 76 1,50 0,998 2,00 1,200 0,314 0,235 0,405 0,414 0,346 0,50 0,350 1,00 0,403 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC13 S. Roughform'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,00 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12e DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC13 S. Roughform'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2 1,5 0,476 0,461 0,359 0,320 0,348 0,362 0,372 0,5 0,405 1 0,560 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC15 S. Nchanga'nın 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12f DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC15 S. Nchanga’nın 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 77 2,00 1,50 0,152 0,175 0,177 0,196 0,192 0,283 0,272 0,50 0,290 1,00 0,401 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC34 S. Kentucky'nin 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,00 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12g DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC34 S. Kentucky’nin 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2,5 0,85 0,81 0,84 1,01 0,94 0,97 1 1,05 1,5 1,36 2 1,82 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC36 S. Corvallis'in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12h DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC36 S. Corvallis’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 78 2,000 1,500 0,260 0,257 0,181 0,212 0,184 0,197 0,232 0,500 0,231 1,000 0,380 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC44 S. Thompson'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,000 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12i DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC44 S. Thompson'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2 1,5 0,263 0,289 0,292 0,357 0,359 0,366 0,361 0,5 0,475 1 0,534 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC50 S. Group C1'in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12j DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC50 S. Group C1’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 79 2 1,5 0,120 0,126 0,123 0,116 0,123 0,130 0,125 0,5 0,152 1 0,220 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC55 S. Senftenberg' in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12k DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC55 S. Senftenberg’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2 0,70 0,72 0,70 0,68 0,68 0,96 0,91 1 1,01 1,5 1,08 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC59 S. Agona'nın 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12l DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC59 S. Agona’nın 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 80 1 1,097 1,024 0,875 1,154 1,347 1,451 1,5 1,470 1,580 2 1,530 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC66 S. Telaviv'in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12m DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC66 S. Telaviv’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2 0,579 0,570 0,614 0,676 0,806 0,825 0,842 1 0,871 1,5 1,010 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC78 S. Bispebjerg'in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12n DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC78 S. Bispebjerg’in 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 81 1,460 1,463 1,463 1,447 1,454 1,5 1,453 1,504 1,515 2 1,660 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC88 S. Montevideo'nun 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 1 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12o DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC88 S. Montevideo'nun 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 1,211 1,133 1,169 1,134 1,5 1,202 1,503 1,658 1,710 2 1,820 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC90 S. Anatum'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 1 0,5 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12p DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC90 S. Anatum‘un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 82 2 0,370 0,279 0,322 0,308 0,310 0,5 0,327 0,362 1 0,383 1,5 0,670 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC93 S. Salford'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12r DNaz I enziminin (50 µg/mL) DMC93 S. Salford'un 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 2 1,5 0,180 0,162 0,160 0,171 0,150 0,162 0,214 0,5 0,195 1 0,440 OD595nm'deki biyofilm miktarları DNaz I enziminin (50 µg/mL) S. Typhimurium SL1344'ün 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 0 Kontrol 1. saat 2. saat 3. saat 4. saat 6. saat 8. saat 12. saat 24. saat Enzim uygulama süreleri Şekil 4.12s DNaz I enziminin (50 µg/mL) S. Typhimurium SL1344’ün 24 saatlik biyofilmleri üzerine etkileri 83 Bu bulgulara göre DNaz I enzim uygulaması, özellikle enzim muamele süresinin artışına bağlı olarak, hemen hemen tüm Salmonella serovaryetelerinin olgun biyofilm miktarlarında azalmaya neden olmuştur. Ancak 24 saatlik enzim inkübasyonu süresinin bitiminde yalnızca DNaz I enziminin etkisi ile tam bir biyomas giderimi sağlanamamıştır. Elde edilen bulgular tüm Salmonella serovarlarının olgun biyofilmlerinde hücre dışı DNA’nın dikkate değer yapısal bir bileşen olduğuna işaret etmektedir (Çizelge 4.5). DNaz I enziminin olgun biyofilmler üzerindeki etkinliğinin değerlendirilmesinde bazı biyofilm karakteristiklerinin göz önünde bulundurulması (biyofilm miktarı, yoğunluğu, kalınlığı, morfotip farklılığı), önemli bir noktadır. Olgun biyofilm örneklerinin DNaz I enzimi ile muamele edilmesine bağlı olarak biyomasta saptanan azalma miktarlarına bakıldığında, biyofilm örneklerinde meydana gelen parçalanmaların morfotip içeriklerinden bağımsız olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 4.5). Salmonella’da “rdar” biyofilm morfotipinin “bdar” biyofilm morfotipinden farklı olarak daha kompozit ve rijit bir biyofilm ağını tesis ettiği bilinen bir durumdur (Römling ve Rohde 2005). Biyofilm yapısallıklarında saptanan çözülüş, hücre dışı DNA’nın Salmonella’nın abiyotik yüzeylere olan tutunmasındaki değişken rolünden farklı olarak olgun biyofilm sistemlerinin sürekliliğinde ve tesisinde önemli katkıları olduğunu net bir şekilde kanıtlamaktadır. Çalışma kapsamındaki bir diğer ilginç durum, enzim inkübasyon süresince zamana bağlı olarak biyofilm örneklerinde meydana gelen istikrarsız ve büyük kopmaların görülmesidir. Söz konusu durum hücre dışı DNA’nın diğer matriks komponentlerinin birbirleri ile olan interaksiyonlarında oldukça önemli bir ara eleman gibi rol üstlendiğine işaret etmektedir. Enzim muamelesi sonucunda biyomas giderimindeki en yüksek düzey, matriksinde major komponent olarak yalnızca selüloz ihtiva eden (pdar morfotipi) S. Roughform DMC13 suşunda saptanmıştır (%74.17). Selüloz Salmonella biyofilm matriksindeki en önemli polisakkarit bileşenidir. Selülozun biyofilm sistemindeki etkisi, hücre-hücre interaksiyonlarını tesis ederek yapışkan ve kompozit bir matriks ağı oluşturmaktır (Römling vd. 2000, Zogaj vd. 2001, Solano vd. 2002). Selüloz biyofilm oluşumunun erken safhalarında ilk tutunmada kritik bir role sahip olmasının yanı sıra, biyofilmin olgunlaşmasında da elzemdir. Bitkilerle simbiyotik ilişkide bulunan ve bitkiler için patojenik olan birçok bakterinin matriks bileşeni olarak ürettiği selüloz, bitki yüzeyleri gibi biyotik yüzeylerdeki adezyonda son derece kritik bir öneme sahiptir. Zira bitki yüzeyinde bulunan bakteriyal orijinli selüloz 84 yapışkan tabiatından ötürü Salmonella’nın da dahil olduğu patojenlerin bitki yüzeylerine selüloz aracılığı ile tutunmasına, bitkilerde hastalık etmeni olmasına ve bu bitkilerin tüketilmesine bağlı olarak enfeksiyon hastalıklarının sirayetine imkan tanımaktadır (Rodrigues vd. 2007). Ayrıca selülozun yem fabrikası çevrelerinden izole edilen S. Agona ve S. Typhimurium serovarları için biyofilm yapısı içerisinde major bir bileşen olmadığı ancak; az miktarda bulunan selülozun matriksin organizasyonuna ve yapısallığına yüksek düzeyde bir katkı sağladığı bilinmektedir (Vestby vd. 2009). Çalışmamız kapsamında elde edilen bulgu, matriksinde major bileşen olarak yalnızca selüloz ihtiva eden Salmonella suşlarının biyofilm sistemlerinin tesisi için selülozun inşa ettiği ağın devamlılığında hücre dışı DNA’nın selüloz ile önemli interaksiyonlar kurabileceği ihtimalini düşündürmektedir. Çizelge 4.5 Olgun biyofilm örneklerinin (24 saatlik) DNaz I enzimi ile muamelesi sonucu 24 saat sonunda kontrol grubuna nispeten (DNaz I ile muamele edilmeyen) biyomasta meydana gelen azalma (%) Suş kodu/Serovar DMC3/Enteritidis DMC4/Typhimurium DMC5/Virchow DMC12/Infantis DMC13/Roughform DMC15/Nchanga DMC34/Kentucky DMC36/Corvallis DMC44/Thompson DMC50/Group C1 DMC55/ Senftenberg DMC59/Agona DMC66/Telaviv DMC78/Bispebjerg DMC88/Montevideo DMC90/Anatum DMC93/Salford SL1344/Typhimurium Morfotip içeriği (28°C) rdar rdar bdar bdar pdar rdar rdar rdar rdar rdar rdar bdar bdar rdar bdar rdar rdar rdar 85 Biyomastaki azalma yüzdeleri %62.86 %73.85 %58.54 %45.00 %74.17 %14.29 %62.10 %53.30 %31.58 %50.75 %45.45 %35.19 %28.23 %42.25 %12.05 %33.52 %42.84 %59.09 Güncel araştırmalar birçok mikroorganizmanın ürettiği hücre dışı DNA’nın matriks bileşenlerinin birbirine bağlanmalarında ve in vitro/in vivo biyofilm yapılarının stabilizasyonunda önemli fonksiyonları olduğunu göstermektedir. Hücre dışı DNA’yı uzaklaştırmak için DNaz’ların kullanılması günümüzde özellikle konakçı sistemleri içerisindeki biyofilmler ve onların neden olduğu enfeksiyonlar ile mücadelede etkin bir antibiyofilm stratejisi olarak düşünülmektedir (Allesen-Holm vd. 2006). DNaz’lar özellikle kompakt biyofilm yapılarının gevşetilmesinde ve diğer biyofilmlerle mücadele ajanlarının etkinliklerinin artırılmasında kombine ajan olarak tercih edilmektedir (Ramsey vd. 1993). Çalışmamızda elde edilen bulgular, benzer şekilde Salmonella biyofilmleri ile mücadelede etkin bir stratejinin geliştirilmesi için DNaz I’in tek başına olmasa da diğer kombine ajanlarla birlikte efektif bir şekilde kullanılabileceğine işaret etmektedir. Özellikle hücre dışı DNA’nın Salmonella’da antimikrobiyal dirençliliği indüklediği göz önünde bulundurulursa (Johnson vd. 2013) DNaz’ların Salmonella biyofilmleri ile mücadelede tercih edilecek olmasının isabetli olacağı ortadadır. 4.5 Farklı Orijinlerden Gelen DNA’nın (ekzojen) Salmonella’nın Biyofilm Üretimi Sürecine Olan Etkilerinin Değerlendirilmesi Çalışma kapsamında hücre dışı DNA’nın varlığına bağlı olarak polistiren yüzeylerde iki farklı tutunma paterni sergileyen DMC4 (Typhimurium) ve DMC12 (Infantis) suşları kullanıldı. Belirtilen suşların biyofilmlerinin geliştirildiği besi ortamlarına ayrı ayrı yedi farklı yabancı orijinli DNA örnekleri dört farklı konsantrasyonda (6.25, 12.5, 25 ve 50 µg/mL) ilave edildi. Çalışmadan elde edilen bulgular Şekil 13 ve Şekil 14’te verilmiştir. 86 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Kontrol 50 µg/mL 25 µg/mL 12.5 µg/mL 6.25 µg/mL Şekil 4.13 Farklı DNA kaynaklarının S. Typhimurium’un biyofilm üretim sürecine olan etkilerinin değerlendirilmesi 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Kontrol 50 µg/mL 25 µg/mL 12.5 µg/mL 6.25 µg/mL Şekil 4.14 Farklı DNA kaynaklarının S. Infantis’in biyofilm üretim sürecine olan etkilerinin değerlendirilmesi 87 Bu çalışmada elde edilen bulgular hücre dışı DNA’nın biyofilm üretim sürecine olan etkilerinin araştırılması için yürütülen çalışmadan elde edilen bulgularla paralellik göstermektedir (Wang vd. 2014) Zira biyofilmin geliştirildiği ortamlara ilave edilen Infantis ve Typhimurium hücre dışı DNA’ları, Typhimurium serovarının biyofilm üretimine katkı sağlarken, Infantis’in biyofilm üretimini zayıflatmıştır. Biyofilm üretim miktarlarındaki anlamlı düzeydeki değişimler yalnızca aynı türe dahil Infantis ve Typhimurium serovarlarının hücre dışı DNA’larının ilavesi ile mümkün olmuştur (Mann Whitney U Testi, p<0.05). Diğer yabancı orijinli DNA’ların ise, Salmonella’nın biyofilm üretiminde kayda değer bir etkisinin olmadığı saptanmıştır (Şekil 13 ve Şekil 14). Infantis ve Typhimurium hücre dışı DNA’larının biyofilm üretimine bu denli bir etki göstermesinin ardındaki nedenlerin daha ileri analizlerle kanıtlanması zorunludur. Zira bu etki Salmonella’daki hücre dışı DNA’da matriks komponentleri ile özel etkileşimleri tesis eden spesfik nükleik asit serileri olabileceği ihtimalini de düşündürmektedir. Mikroorganizmaların biyofilmlerindeki hücre dışı DNA’nın orijini üzerine iki temel görüş bulunmaktadır. Bunlardan ilki hücre dışı DNA’nın biyofilm sistemi içerisinde lize olan hücrelerinin genomik DNA kalıntılarından oluştuğu (Watnick ve Kolter 2002), ikincisi ise hücre lizisinden bağımsız olacak şekilde özel membran vezikülleri ile hücre dışı DNA’nın matriks ortamına salgılandığıdır (Liao vd. 2014). Çalışmamızda elde edilen verilerin ileri analizlere tabi tutulması halinde, bu öngörülerin hangisinin gerçek sistem olduğu kanıtlanabilecektir. 4.6 DNaz I Enziminin Salmonella Hücrelerinin Canlılığı Üzerindeki Olası Etkilerinin Araştırılması Bu çalışma kapsamında biyofilm örneklerinin bulunduğu kültür ortamlarından planktonik fazdaki hücreleri ihtiva eden süspansiyon örnekleri alındı. Süspansiyon örnekleri en yüksek konsantrasyonda DNaz I enzimi (100 µg/mL) içeren kuyulardan ve kontrol kuyularından (enzim içermeyen) hazırlandı. Hazırlanan süspansiyonlardan bir seri dilüsyon yapıldı ve kültürel sayım işlemi gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda DNaz I enziminin üç farklı inkübasyon sıcaklığında (20-28 ve 37°C) tek başına Salmonella hücrelerinin canlılığı üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığı saptandı (Çizelge 4.6). 88 Çizelge 4.6 DNaz I enziminin Salmonella’nın canlılığı üzerindeki etkileri 24 saat 48 saat DNaz I enzimi içermeyen DNaz I enzimi içeren (100 µg/mL) DNaz I enzimi içermeyen DNaz I enzimi içeren (100 µg/mL) 20°C 1,6 x 109 kob/mL 1,45 x 109 kob/mL 2,2 x 109 kob/mL 2,35 x 109 kob/mL 28°C 2,7 x 109 kob/mL 2,5 x 109 kob/mL 1,9 x 109 kob/mL 1,55 x 109 kob/mL 37 ° C 1,0 x 109 kob/mL 1,85 x 109 kob/mL 3,05 x 108 kob/mL 3,0 x 108 kob/mL 4.7 Hücre Dışı DNA’ nın Elektroforetik Tekniklerle Gösterilmesi İzole edilen genomik ve hücre dışı DNA örnekleri %1’lik agaroz jellerde 80 V uygulanarak koşturuldu. Bant büyüklerinin hesaplanmasında 1 kb’lik markör referans alındı. Elde edilen bant profilleri analiz edildiğinde hücre dışı DNA’nın jelde genomik DNA bantlarının yukarısında bir bant profili verdiği görüldü. Markör referans alınarak hücre dışı DNA örneklerinin moleküler büyüklüklerinin hesaplanması sonucunda, hücre dışı DNA’nın ortalama tüm serovarlarda genomik DNA’nın biraz altında, 28 kb’lik bir büyüklükte olduğu saptandı (Şekil 4.15). Ulaşılan bu veri, literatür verileriyle de bağdaşmaktadır. Zira başta E. Coli olmak üzere Enterobacteriaceae familyasına dahil üyelerin hücre dışı DNA’ları yaklaşık 30 kb büyüklüğündedir (Tetz ve Tetz 2009). Şekil 4.15 Salmonella serovarlarında ortak saptanan hücre dışı DNA. (1 kuyu; Markör, 2. kuyu; genomik DNA, 3. kuyu hücre dışı DNA 89 4.8 Hücre Dışı DNA ve Genomik DNA Orijinlerinin RAPD-PZR Tekniği Esas Alınarak Karşılaştırılması Genomik ve hücre dışı DNA’ların RAPD profilleri Şekil 3.16a-3.16b ve 3.17a-3.17b’de verilmiştir. Her bir serovaryetenin genomik ve hücre dışı DNA örneklerinden elde edilen RAPD-PZR reaksiyon ürünleri karşılaştırma yapabilmek adına yan yana yürütüldü. RAPD-PZR reaksiyonlarında P1254 ve P1283 primerleri kullanıldı. Bulgular Şekil 4.16-4.17’de verilmiştir. Şekil 4.16 P1254 primeri ile elde edilen RAPD-PZR profilleri (G; genomik DNA, E; hücre dışı DNA, rakamlar da suş kodlarını yansıtmaktadır). 90 Şekil 4.17 P1283 primeri ile elde edilen RAPD-PZR profilleri (G; genomik DNA, E; hücre dışı DNA, rakamlar da suş kodlarını yansıtmaktadır) Typhimurium (DMC4), Infantis (DMC12) ve Telaviv (DMC66) serovarlarının dışında diğer tüm serovarlarda her iki primer ile yürütülen RAPD-PZR reaksiyonları neticesinde elde edilen genomik ve hücre dışı DNA’ların farklı bir profil sergilediği saptanmıştır. Bu bulgular söz konusu suşlarda hücre dışı DNA’nın genomik DNA esaslı olmadığına işaret etmektedir. RAPD-PZR ile elde edilen parmak izlerinin kıyaslanması hücre dışı DNA’nın kökeninin araştırılmasında sıklıkla tercih edilen yöntemlerden bir tanesidir (Böckelman vd. 2005, Wu ve Xi 2009). Bant profillerinde saptanan farklanmalar genomik DNA ile hücre dışı DNA’nın farklı kaynaklardan kökenlendiğini dolaylı yoldan kanıtlayacak niteliktedir. Ancak bu yöntem kendi içindeki bazı sınırlayıcı faktörleri beraberinde getirmektedir. Örneğin; biyofilm matriksinden etkin bir şekilde hücre dışı DNA izolasyonu ve olası genomik DNA bulaşısını asgari düzeye indirgemek için enzimatik izolasyon yöntemleri gibi daha etkin yöntemler tercih edilmelidir (Wu ve Xi 2009). Enzimatik izolasyon protokollerinin esas alınmadığı, kimyasal ve mekanik 91 süreçlerin dahil olduğu geleneksel izolasyon yöntemlerinde hücre dışı DNA’nın genomik DNA ile kontaminasyonu ya da izolasyon süresince DNA’da meydana gelebilecek kırılmalar son derece olasıdır. Söz konusu olasıklar, RAPD-PZR ile elde edilecek genomik DNA ve hücre dışı DNA parmak izlerinin farklı olmasına neden olabilecek niteliktedir. Bu nedenle çalışmamızda elde edilen bulguların kesinlik kazanabilmesi için daha hassas izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. 92 KAYNAKLAR Abajy, M.Y., Kopec, J., Schiwon K., Burzynski M., Doring, M., Bohn, C. and Grohmann, E. 2007. A type IV-secretion-like system is required for conjugative DNA transport of broad-host-range plasmid pIP501 in gram-positive bacteria. Journal of Bacteriology, 189, 2487-2496. Allesen-Holm, M., Barken, K.B., Yang L., Klausen, M., Webb, J.S., Kjelleberg, S., Molin, S., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. 2006. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Mol. Microbiol, 59, 1114-1128. Allison, D.G., Sutherland, I.W. and Neu, T.R. 1998. In Biofilm Communities: Order from Chaos? (eds McBain, A. et al.) BioLine, 381-387. Althouse, C., Patterson, S., Fedorka-Cray, P., and Isaacson, R.E. 2003. Type 1 fimbriae of Salmonella enterica serovar Typhimurium bind to enterocytes and contribute to colonization of swine in vivo. Infection and Immunity, 71(11), 6446-6452. Anonymous. 2008. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards on request from the Health and Consumer Protection, Directory General, Europan Commission on Microbiological Risk Assesment in feeding stuffs for food producing animals. EFSA J., 720, 1-84. Anonymous. 1990. The Oxoid Manual. 6th Edition. Unipath Limited, Wade Road, An international outbreak of Salmonella infections caused by alfalfa sprouts grown from contaminated seeds. The Journal of Infectious Diseases, 175(4), 876-882. Anriany, Y., Sahu, S.N., Wessels, K.R., McCann, L.M., Joseph, S.W. 2006. Alteration of the rugose phenotype in waaG and ddhC mutants of Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 is associated with inverse production of curli and cellulose. Appl. Environ. Microbiol., 72(7), 5002-5012. Arnold, J.W., and Yates, I.E. 2009. Interventions for control of Salmonella: Clearance of microbial growth from rubber picker fingers. Poultry Science, 88(6), 12921298. Austin, J.W., Sanders, G., Kay, W.W., Collinson, S.K. 1998. Thin aggregative fimbriae enhance Salmonella Enteritidis biofilm formation. FEMS Microbiol. Lett, 162(2), 295-301. 93 Barak, J.D., Gorski, L., Naraghi-Arani, P., and Charkowski, A.O. 2005. Salmonella enterica virulence genes are required for bacterial attachment to plant tissue. Applied and Environmental Microbiology, 71(10), 5685-5691. Barak, J.D., Jahn, C.E., Gibson, D.L., and Charkowski, A.O. 2007. The role of cellulose and O-antigen capsule in the colonization of plants by Salmonella enterica. Molecular Plant–Microbe Interactions, 20(9), 1083-1091. Barker, J., and Bloomfield, S.F. 2000. Survival of Salmonella in bathrooms and toilets in domestic homes following salmonellosis. Journal of Applied Microbiology, 89(1), 137-144. Barnhart M.M., Chapman M.R. 2006. Curli biogenesis and function. Annu. Rev. Microbiol, 60, 131-147. Beloin, C. and Ghigo, J.M. 2005. Finding gene-expression patterns in bacterial biofilms. Trends Microbiol, 13, 16-19. Berger C.N., Sodha S.V., Shaw R.K., Griffin P.M., Pink D., Hand P., Frankel G. 2010. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol, 12(9), 2385-2397. Berger, C.N., Shaw, R.K., Brown, D.J., Mather, H., Clare, S., Dougan, G., et al. 2009. Interaction of Salmonella enterica with basil and other salad leaves. The ISME Journal, 3(2), 261-265. Beuchat, L.R. 2002. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruits and vegetables. Microbes and Infection, 4(4), 413-423. Bockelmann, U., Janke, A., Kuhn, R., Neu, T.R., Wecke, J., Lawrence, J.R., and Szewzyk U. 2006. Bacterial extracellular DNA forming a defined network- like structure. FEMS Microbiol. Lett, 262, 31-38. Boddicker, J.D., Ledeboer, N.A., Jagnow, J., Jones, B.D., and Clegg, S. 2002. Differential binding to and biofilm formation on, HEp-2 cells by Salmonella enterica serovar Typhimurium is dependent upon allelic variation in the fimH gene of the fim gene cluster. Molecular Microbiology, 45(5), 1255-1265. Bokranz, W., Wang, X., Tschape, H., Römling, U. 2005. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J. Med. Microbiol, 54(12), 1171-1182. 94 Bowen, A., Fry, A., Richards, G., and Beuchat, L. 2006. Infections associated with cantaloupe consumption: A public health concern. Epidemiology and Infection, 134(4), 675-685. Brady, R.A., Leid, J.G., Calhoun, J.H., and Shirtliff, M.E. 2008. Osteomyelitis and the role of biofilms in chronic infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol, 52, 13-22. Brandl, M.T., and Mandrell, R.E. 2002. Fitness of Salmonella enterica serovar Thompson in the cilantro phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology, 68(7), 3614-3621. Brandl, M.T., 2006. Fitness of human enteric pathogens on plants and implications for food safety. Annu. Rev. Phytopathol, 44, 367-392. Burnett, S.L. and Beuchat, L.R. 2000. Human patogens associated with raw produce and unpasteurized juices, and diffuculties in decontamination. J. Ind. Microbiol. Biotech, 25, 281-287. Campbell, J.V., Mohle-Boetani, J., Reporter, R., Abbott, S., Farrar, J., Brandl, M., et al. 2001. An outbreak of Salmonella serotype Thompson associated with fresh cilantro. The Journal of Infectious Diseases, 183(6), 984-987. Cegelski, L., Pinkner J.S., Hammer, N.D., Cusumano, C.K., Hung, C.S., Chorell, E., Aberg, V., Walker, J.N., Seed, P.C., Almqvist, F., Chapman, M.R., Hultgren, S.J. 2009. Small-molecule inhibitors target Escherichia coli amyloid biogenesis and biofilm formation. Nat. Chem. Biol, 5, 913-919. Collinson, S.K., Clouthier, S.C., Doran, J.L., Banser, P.A. and Kay, W.W. 1996. Salmonella enteritidis agfBAC operon encoding thin, aggregative fimbriae. Journal of Bacteriology, 178(3), 662-667. Conover, M.S., Mishra, M., Deora, R. 2011. Extracellular DNA is essential for maintaining Bordetella biofilm integrity on abiotic surfaces and in the upper respiratory tract of mice. PLoS ONE, 6, 16861. Cook, K.A., Dobbs, T.E., Hlady, W.G., Barret, T.J., Puhr, N.D., Lancette, G.A., Bodager, D.W., Toth, B.L., Genese, C.A., Highsmith, A.K., Pilot, K.E., Finelli, L. and Swerdlow, D. 1998. Outbreak of Salmonella serotype Hartford infections asociated with unpasteurized orange juice. Jama, 280, 1504-1509. Costerton, J.W., Stewart, P.S., Greenberg, E.P. 1999. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 284, 1318-1322. 95 Crawford, R.W., Gibson, D.L., Kay, W.W. and Gunn, J.S. 2008. Identification of a bile induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infection and Immunity, 76(11), 5341-5349. Crawford, R.W., Reeve, K.E. and Gunn, J.S. 2010. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. Journal of Bacteriology, 192(12), 2981-2990. Crawford, R.W., Rosales-Reyes, R., Ramirez-Aguilar Mde, L., Chapa-Azuela, O., Alpuche- Aranda, C. and Gunn, J.S. 2010. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(9), 43534358. Crump, J.A., Griffin, P.M. and Angulo, F.J. 2002. Bacterial contamination of animal feed and its relationship to human foodborne illness. Clin. Infect. Dis, 35, 859865. Danese, P.N., Pratt, L.A. and Kolter, R. 2000. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture. Journal of Bacteriology, 182(12), 3593-3596. D'Aoust, J.Y. 1997 Salmonella species In Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers. (Eds M. P. Doyle, L. R. Beuchat and T. J. Montville). ASMPress, 129, 158. Washington. Davidson, C.J., White, A.P. and Surette, M.G. 2008. Evolutionary loss of the rdar morphotype in Salmonella as a result of high mutation rates during laboratory passage. The ISME Journal, 2(3), 293-307. Davies, D. 2003. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nature Reviews. Drug Discovery, 2(2), 114-122. De Beer, D., Stoodley, P., Roe, F. and Lewandowski, Z. 1994. Effects of biofilm structures on oxygen distribution and mass transport. Biotechnology and Bioengineering, 43(11), 1131-1138. de Rezende, C.E., Anriany, Y., Carr, L.E., Joseph, S.W. and Weiner, R.M. 2005. Capsular polysaccharide surrounds smooth and rugose types of Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104. Applied and Environmental Microbiology, 71(11), 7345-7351. 96 Doern, C.D., Roberts, A.L., Hong, W., Nelson, J., Lukomski, S., Swords, W.E. and Reid, S.D. 2009. Biofilm formation by group A Streptococcus: a role for the streptococcal regulator of virulence (Srv) and streptococcal cysteine protease (SpeB). Microbiology, 155, 46-52. Dong, Y., Iniguez, A.L., Ahmer, B.M. and Triplett, E.W. 2003. Kinetics and strain specificity of rhizosphere and endophytic colonization by enteric bacteria on seedlings of Medicago sativa and Medicago truncatula. Applied and Environmental Microbiology, 69(3), 1783-1790. Dongari-Bagtzoglou, A. 2008. Pathogenesis of mucosal biofilm infections: challenges and progress. Expert Rev. Antiinfect. Ther, 6, 201-208. Donlan, R.M. and Costerdon J.W. 2002. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev, 15, 167-193. Draghi, J.A. and P.E. Turner. 2006. DNA secretion and gene-level selection in bacteria. Microbiology, 152, 2683-2688. Dutta, U., Garg, P.K., Kumar, R. and Tandon, R.K. 2000. Typhoid carriers among patients with gallstones are at increased risk for carcinoma of the gallbladder. The American Journal of Gastroenterology, 95(3), 784-787. Finkel, S.E., Kolter, R. 2001. DNA as a nutrient: novel role for bacterial competence gene homologs. J. Bacteriol, 183, 6288-6293. Flemming, H.C., Neu, T.R. and Wozniak, D.J. 2007. The EPS matrix: the “house of biofilm cells”. J. Bacteriol, 189, 7945-7947. Flemming, H.C. and Wingender, J. 2010. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiol, 8, 623-633. Foley, S.L., Lynne, A.M., Nayak, R. 2008. Salmonella challenges: prevalence in swine and poultry and potential pathogenicity of such isolates. J. Anim. Sci, 86, 149162. Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K. and Nielsen, P.H. 1996. Extraction of exopolymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Research, 30, 1749-1758. Furukawa, S.S., Kuchma, L. and O’Toole, G.A. 2006. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol, 188, 1211-1217. 97 Gandhi, M., Golding, S., Yaron, S. and Matthews, K.R. 2001. Use of green fluorescent protein expressing Salmonella Stanley to investigate survival, spatial location, and control on alfalfa sprouts. Journal of Food Protection, 64(12), 1891-1898. Garcia, B., Latasa, C., Solano, C., Garcia-del Portillo, F., Gamazo, C. and Lasa, I. 2004. Role of the GGDEF protein family in Salmonella cellulose biosynthesis and biofilm formation. Molecular Microbiology, 54(1), 264-277. Gerstel, U., Römling, U. 2003. The csgD promoter, a control unit for biofilm formation in Salmonella Typhimurium. Res. Microbiol, 154(10), 659-667. Giaouris, E.D. and Nychas, G.J. 2006. The adherence of Salmonella Enteritidis PT4 to stainless steel: The importance of the air–liquid interface and nutrient availability. Food Microbiology, 23(8), 747-752. Gibson, D.L., White, A.P., Snyder, S.D., Martin, S., Heiss, C., Azadi, P., Surette, M., Kay, W.W. 2006. Salmonella produces an O-antigen capsule regulated by AgfD and important for environmental persistence. J. Bacteriol, 188(22), 7722-7730. Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K. and Römling, U. 2010. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology, 192(2), 456-466. Halkman, K.A., Doğan, B.H., Rahati Noveir, M. 1994. Gıda maddelerinde Salmonella ile E.coli arama ve sayılma yöntemlerinin karşılaştırılması, Gıda Tek. Der, 21, 93. Hall-Stoodley, L. and Stoodley, P. 2009. Evolving concepts in biofilm infections. Cellular Microbiology, 11(7), 1034-1043. Hall-Stoodley, L., Hu, F.Z., Gieseke, A., Nistico, L., Nguyen, D., Hayes, J., et al. 2006. Direct detection of bacterial biofilms on the middle-ear mucosa of children with chronic otitis media. Jama, 296(2), 202-211. Hamilton, H.L., N.M. Dominguez, K.J. Schwartz, K.T. Hackett, and J.P. Dillard. 2005. Neisseria gonorrhoeae secretes chromosomal DNA via a novel type IV secretion system. Mol. Microbiol, 55, 1704-1721. Hammar, M., Bian, Z. and Normark, S. 1996. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(13), 65626566. 98 Hammer, B.K. and Bassler, B.L. 2003. Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol, 50, 101-114. Harmsenn, M., Lappann, M., Knochel, S. and Molin, S. 2010. Role of Extracellular DNA during Biofilm Formation by Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol, 76(7), 2271-2279. Hermans, K., Nguyen, T.L., Roberfroid, S., Schoofs, G., Verhoeven, T., De Coster, D., Vanderleyden, J., De Keersmaecker, S.C. 2011. Gene expression analysis of monospecies Salmonella Typhimurium biofilms using differential fluorescence induction. J. Microbiol. Methods, 84(3), 467-478. Heydorn, A., Ersboll, B.K., Hentzer, M., Parsek, M.R., Givskov, M., Molin, S. 2000. Experimental reproducibility Antibiotic resistance in biofilms 111 in flowchamber biofilms. Microbiology, 146, 2409-2415. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., and Ciofu, O. 2010. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents, 35(4), 322-332. Hood, S.K. and Zottola, E.A. 1997. Adherence to stainless stain by foodborne microorganisms during growth in modl food systems. Int. J. Food Microbiol, 37, 145-153. Hurrell, E., Kucerova, E., Loughlin, M., Caubilla-Barron, J. and Forsythe, S. J. 2009. Biofilm formation on enteral feeding tubes by Cronobacter sakazakii, Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae. International Journal of Food Microbiology, 136(2), 227-231. Iniguez, A.L., Dong, Y., Carter, H.D., Ahmer, B.M., Stone, J.M. and Triplett, E.W. 2005. Regulation of enteric endophytic bacterial colonization by plant defenses. Molecular Plant–Microbe Interactions, 18(2), 169-178. Jensen, P.O., Givskov, M., Bjarnsholt, T. and Moser, C. 2010. The immune system vs. Pseudomonas aeruginosa biofilms. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 59(3), 292-305. Johnson, R.P., Wilson, J.B., Michel, P., Rahn, K., Renwick, S. A., Gyles, C. L. and Spika, J.S. 1999. Human infection with verocytotoxigenic Escherichia coli associated with exposure to farms and rural environments. In Escherichia coli 99 O157:H7 in farm animals. Edited by Stewart, C.S. and Flint, H.J. CABI Publishing, 147, 168. New York. Joseph, B., Otta, S.K., Karunasagar, I. and Karunasagar, I. 2001. Biofilm formation by Salmonella spp. on food contact surfaces and their sensitivity to sanitizers. International Journal of Food Microbiology, 64(3), 367-372. Jurcisek, J.A. and Bakaletz, L.O. 2007. Biofilms formed by nontypeable Haemophilus influenzae in vivo contain both double-stranded DNA and type IV pilin protein. J. Bacteriol, 189, 3868-3875. Karatan, E. and Watnik, P. 2009.Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 73, 310-347. Kaufman, M.E. 1998. Pulsed-field gel electrophoresis, Moleculer Bacteriology, 33, 50. Totowa Kirov, S.M., Webb, J.S. and O’May, C.Y. 2007. Biofilm differentiation and dispersal in mucoid Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis. Microbiology 153, 3264-3274. Klausen, M., Gjermansen, M., Kreft, J.U. and Tolker-Nielsen, T. 2006. Dynamics of development and dispersal in sessile microbial communities: examples from Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida model biofilms. FEMS Microbiol. Lett, 261, 1-11. Klerks, M.M., Franz, E., van Gent-Pelzer, M., Zijlstra, C. and van Bruggen, A.H. 2007. Differential interaction of Salmonella enterica serovars with lettuce cultivars and plant–microbe factors influencing the colonization efficiency. The ISME Journal, 1(7), 620-631. Kutter, S., Hartmann, A. and Schmid, M. 2006. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. FEMS Microbiology Ecology, 56(2), 262−271. Lai, C.W., Chan, R.C., Cheng, A.F., Sung, J.Y. and Leung, J.W. 1992. Common bile duct stones: A cause of chronic salmonellosis. The American Journal of Gastroenterology, 87(9), 1198-1199. Lang, M.M., Harris, L.J. and Beuchat, L.R. 2004. Survival and recovery of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Listeria monocytogenes on lettuce and parsley as 100 affected by method of inoculation, time between inoculation and analysis, and treatment with chlorinated water. Journal of Food Protection, 67(6), 1092-1103. Lapidot, A. and Yaron, S. 2009. Transfer of Salmonella enterica serovar Typhimurium from contaminated irrigation water to parsley is dependent on curli and cellulose, the biofilm matrix components. Journal of Food Protection, 72(3), 618-623. Latasa, C., Roux, A., Toledo-Arana, A., Ghigo, J.M., Gamazo, C., Penades, J.R., et al. 2005. BapA, a large secreted protein required for biofilm formation and host colonization of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Molecular Microbiology, 58(5), 1322-1339. Ledeboer, N.A. and Jones, B.D. 2005. Exopolysaccharide sugars contribute to biofilm formation by Salmonella enterica serovar Typhimurium on HEp-2 cells and chicken intestinal epithelium. J. Bacteriol, 187(9), 3214-3226. Ledeboer, N.A., Frye, J.G., McClelland M., Jones, B.D. 2006. Salmonella enterica serovar Typhimurium requires the Lpf, Pef, and Tafi fimbriae for biofilm formation on HEp-2 tissue culture cells and chicken intestinal epithelium. Infect Immun 74(6), 3156-3169. Levine, M.M., Black, R.E. and Lanata, C. 1982. Precise estimation of the numbers of chronic carriers of Salmonella Typhi in Santiago, Chile, an endemic area. The Journal of Infectious Diseases, 146(6), 724-726. Lin, A.W., Usera, M.A., Barrett, T.J. and Goldsby, R.A. 1996. Application of random amplified polymorphic DNA analysis to differentiate strains of Salmonella Enteritidis. J. Clinical Microbiol, 34(4), 870-876. Mahon, B.E., Ponka, A., Hall, W.N., Komatsu, K., Dietrich, S.E., Siitonen, A., et al. 1997. An International Outbreak of Salmonella Infections Caused by Alfalfa Sprouts Grown from Contaminated Seeds. J. Infect. Dis, 175 (4), 876-882. doi: 10.1086/513985. Martino, P.D., Fursy, R., Bret, L., Sundararaju, B., and Phillips, R.S. 2003. Indole can act as an extracellular signal to regulate biofilm formation of Escherichia coli and other indole-producing bacteria. Can. J. Microbiol, 49, 443-449. Matthysse, A.G., Holmes, K.V. and Gurlitz, R.H. 1981. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumefaciens during attachment to carrot cells. J. Bacteriol, 145, 583-595. 101 McClelland, M., Sanderson, K.E., Spieth, J., Clifton, S.W., Latreille, P., Courtney, L., et al. 2001. Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature, 413(6858), 852-856. Mireles, J.R., Toguchi, A. and Harshey, R.M. 2001. Salmonella enterica serovar Typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: Surfactin inhibits biofilm formation. Journal of Bacteriology, 183(20), 5848-5854. Molin, S., and Tolker-Nielsen, T. 2003.Gene transfer occurs with enhanced efficiency in biofilms and induces enhanced stabilisation of the biofilm structure. Curr. Opin. Biotechnol, 14, 255-261. Momba, M.N.B. and Kaleni, P. 2002. Regrowth of survival indicator microorganisms on the surface of household container used for storage of drinking water in rural communities of South Africa. Water Res, 36, 3023-3028. Møretrø, T., Midtgaard, E.S., Nesse, L.L. and Langsrud, S. 2003. Susceptibliy of Salmonella isolated from fish feed factories to disinfectans and air-drying at surfaces. Vet. Microbiol, 94, 207-217. Møretrø, T., Vestby, L.K., Nesse, L.L., Hannevik, S., Kotlarz, K, and Langsrud, S. 2009. Evaluation of efficiency of disinfectans aganist Salmonella from the feed industry. J. Appl. Microbiol, 106, 1005-1012. Morgan, E., Campbell, J.D., Rowe, S.C., Bispham, J., Stevens, M.P., Bowen, A.J., et al. 2004. Identification of host-specific colonization factors of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Molecular Microbiology, 54(4), 994-1010. Mulcahy, H, Charron-Mazenod, L., Lewenza, S. 2010. Pseudomonas aeruginosa produces an extracellular deoxyribonuclease that is required for utilization of DNA as a nutrient source. Environ. Microbiol, 12, 1621–1629. Mulcahy, H., Charron-Mazenod, L., Lewenza, S. 2008. Extracellular DNA chelates cations and induces antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. PLoS Pathogs, 4: e1000213. doi:10.1371/journal.ppat.1000213. Olishevsky, S., Kozak V., Yanish Y., Potebnya G., Lisovenko G., Olexienko I., Mazur, O., Rybalko, S. and Shlyakhovenko, V. 2004. Characteristics of extracellular DNA containing unmethylated CpG motifs isolated from Bacillus subtilis culture medium filtrate. Exp. Oncol, 26, 265-270. 102 Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. 1989. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature, 338, 652-655. Olsen, A., Arnqvist, A., Hammar, M., Sukupolvi, S., Normark, S. 1993. The RpoS sigma factor relieves H-NS mediated transcriptional repression of csgA, the subunit gene of fibronectin-binding curli in Escherichia coli. Mol. Microbiol, 7, 523-536. Patton, T.G., Rice, K.C., Foster, M.K. and Bayles, K.W. 2005. The Staphylococcus aureus cidC gene encodes a pyruvate oxidase that affects acetate metabolism and cell death in stationary phase. Mol. Microbiol, 56, 1664-1674. Peterson, B.W., van der Mei, H.C., Sjollema, J., Busscher, H.J., Sharma, P.K. 2013. A distinguishable role of eDNA in the viscoelastic relaxation of biofilms. mBio, 4(5);e00497 13.doi:10.1128/mBio.00497-13. Popoff, M.Y. and Le Minor, L.E. 2005. Genus XXXIII Salmonella. Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2, 764-787. Prouty, A.M. and Gunn J.S. 2003. Comparative analysis of Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm formation on gallstones and on glass. Infect. Immun, 71(12), 7154-7158. Prouty, A.M., Schwesinger, W.H., and Gunn, J.S. 2002. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infection and Immunity, 70(5), 2640-2649. Ramesh, N., Joseph, S.W., Carr, L.E., Douglass, L.W. and Wheaton, F.W. 2002. Evaluation of chemical disinfectants for the elimination of Salmonella biofilms from poultry transport containers. Poultry Science, 81(6), 904-910. Renelli, M., Matias, V., Lo, R.Y. and Beveridge, T.J. 2004. DNA-containing membrane vesicles of Pseudomonas aeruginosa PAO1 and their genetic transformation potential. Microbiology, 150, 2161-2169. Rice, K.C., Nelson, J.B., Patton, T.G., Yang S.J. and Bayles, K.W. 2005. Acetic acid induces expression of the Staphylococcus aureus cidABC and lrgAB murein hydrolase regulator operons. J. Bacteriol, 187, 813-821. Ricke, S.C. 2003. The gastrointestinal tract ecology of Salmonella Enteritidis colonization in molting hens. Poultry Science, 82(6), 1003-1007. 103 Robbe-Saule, V., Jaumouille, V., Prevost, M.C., Guadagnini, S., Talhouarne, C., Mathout, H., et al. 2006. Crl activates transcription initiation of RpoS-regulated genes involved in the multicellular behavior of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology, 188(11), 3983-3994. Rodriguez-Navarro, D.N., Dardanelli, M.S. and Ruiz-Sainz, J.E. 2007. Attachment of bacteria to the roots of higher plants. FEMS Microbiology Letters, 272(2), 127136. Ronner, A.B. and Wong, A.C.L. 1993. Biyofilm devolepment and sanitizer inactivation of Listeria monosytogenes and Salmonella Typhimurium on stainless-steel and Buna-N Rubber J. Food Prot, 56, 750-758. Römling, U., Rohde, M., Olsen, A., Normark, S., Reinkoster J. 2000. AgfD, the checkpoint of multicellular and aggregative behaviour in Salmonella Typhimurium regulates at least two independent pathways. Mol. Microbiol, 36(1), 10-23. Römling, U., Sierralta, W.D, Eriksson, K., Normark, S. 1998. Multicellular and aggregative behaviour of Salmonella Typhimurium strains is controlled by mutations in the agfD promoter. Mol. Microbiol, 28(2), 249-264. Römling, U. 2005. Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae. Cell Mol. Life. Sci, 62(11), 1234-1246. Römling, U., Bokranz, W., Rabsch, W., Zogaj, X., Nimtz, M. and Tschape, H. 2003. Occurrence and regulation of the multicellular morphotype in Salmonella serovars important in human disease. International Journal of Medical Microbiology, 293(4), 273-285. Römling, U. and Rohde, M. 1999. Flagella modulate the multicellular behavior of Salmonella Typhimurium on the community level. FEMS Microbiol. Lett, 180, 91-102. Schembri, M.A., Kjaergaard, K. and Klemm, P. 2003. Global gene expression in Escherichia coli biofilms. Mol. Microbiol, 48, 253-267. Schmeisser, C., Stockigt, C., Raasch, C., Wingender, J., Timmis, K.N., Wenderoth, D. F., Flemming, H.C., Liesegang, H., Schmitz, R.A., Jaeger, K.E. and Streit, R. 2003. Metagenome survey of biofilms in drinking-water networks. American Soc. for Microbiol, 69, 7298-7309. 104 Schooling, S.R. and Beveridge, T.J. 2006. Membrane vesicles: an overlooked component of the matrices of biofilms. J. Bacteriol, 188, 5945-5957. Shirtliff, M.E., Mader, J.T. and Camper, A.K. 2002. Molecular interactions in biofilms Chem. Biol, 9, 859-871. Simm, R., Morr, M., Kader, A., Nimtz, M. and Römling, U. 2004. GGDEF and EAL domains inversely regulate cyclic di-GMP levels and transition from sessility to motility. Molecular Microbiology, 53(4), 1123-1134. Snyder, D.S., Gibson, D., Heiss, C., Kay, W. and Azadi, P. 2006. Structure of a capsular polysaccharide isolated from Salmonella Enteritidis. Carbohydrate Research, 341(14), 2388-2397. Solano, C., Garcia, B., Valle, J., Berasain, C., Ghigo, J.M., Gamazo, C., Lasa, I. 2002. Genetic analysis of Salmonella Enteritidis biofilm formation: critical role of cellulose. Mol. Microbiol, 43(3), 793-808. Solomon, E.B., Niemira, B.A., Sapers, G.M., Annous, B.A. 2005. Biofilm formation, cellulose production, and curli biosynthesis by Salmonella originating from produce, animal, and clinical sources. J. Food Protect, 68, 906-912. Spoering, A.L., Gilmore, M.S. 2006. Quorum sensing and DNA release in bacterial biofilms. Curr. Opin. Microbiol, 9, 133-137. Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J., de Keersmaecker, S.C.J. 2012. Salmonella biofilms: An overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Res. Int., 45(2), 502-531. Steinberger, R.E., Allen, A.R., Hansma, H.G., and Holden, P.A. 2002. Elongation correlates with nutrient deprivation in Pseudomonas aeruginosa unsaturated biofilms. Microbiol. Ecol, 43, 416-423. Steinberger, R.E. and Holden, P.A. 2005. Extracellular DNA in single and multiplespecies unsaturated biofilms. Appl. Environ. Microbiol, 71, 5404-5410. Steinmoen, H., Knutsen, E. and Havarstein L.S. 2002. Induction of natural competence in Streptococcus pneumoniae triggers lysis and DNA release from a subfraction of the cell population. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 7681-7686. Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic I., Savic, B. and Svabic-Vlahovic, M. 2000. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods, 40, 175-179. 105 Stepanovic, S., Cirkovic, I., Ranin, L. and Svabic-Vlahovic, M. 2004. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology, 38(5), 428-432. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D.G., Costerton, J.W. 2002. Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol, 56, 187-209. Sukupolvi, S., Lorenz, R.G., Gordon, J.I., Bian, Z., Pfeifer, J.D., Normark, S.J., et al. 1997. Expression of thin aggregative fimbriae promotes interaction of Salmonella Typhimurium SR-11 with mouse small intestinal epithelial cells. Infection and Immunity, 65(12), 5320-5325. Sutherland, I.W. 2001.The biofilm matrix an immobilized but dynamic microbial environment. Trends Microbiol, 9, 222-227. Taormina, P.J., Beuchat, L.R. and Slutsker, L. 1999. Infections associated with eating seed sprouts: An international concern. Emerging Infectious Diseases, 5(5), 626634. Teplitski, M., Al-Agely, A. and Ahmer, B.M. 2006. Contribution of the SirA regulon to biofilm formation in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Microbiology, 152(11), 3411-3424. Teplitski, M., Barak, J.D. and Schneider, K.R. 2009. Human enteric pathogens in produce: Un-answered ecological questions with direct implications for food safety. Current Opinion in Biotechnology, 20(2),166-171. Tetz, V.V. and Tetz, G.V. 2010. Effect of Extracellular DNA Destruction by DNase I on Characteristics of Forming Biofilms. DNA and Cell Biology. 29(8), 399-405 doi:10.1089=dna.2009.1011. Tetz, G.V., Artemenko, N.K. and Tetz, V.V. 2009. Effect of DNase and antibiotics on biofilm characteristics. Antimicrob. Agents Chemother, 53, 1204-1209. Thomas, M.S., John, G. and Nakaishi, L.A. 2006. Managing the complexity of a dynamic biofilm. Am. Dent. Assoc, 137, 10-15. Threlfall, E.J. 2005. Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Bacteriology, 1398-1434. Tischler, A.D. and Camilli, A. 2004. Cyclic diguanylate (c-di-GMP) regulates Vibrio cholerae biofilm formation. Mol. Microbiol, 53, 857-869. 106 Tsolis, R.M., Young, G.M., Solnick, J.V. and Baumler, A.J. 2008. From bench to bedside: Stealth of enteroinvasive pathogens. Nature Reviews. Microbiology, 6(12), 883-892. Van Beneden, C.A., Keene, W.E., Strang, R.A., Werker, D.H., King, A.S., Mahon, B., et al. 1999. Multinational outbreak of Salmonella enterica serotype Newport infections due to contaminated alfalfa sprouts. Jama, 281(2), 158-162. Veldman, A., Vahl, H.A., Borggreve, G.J. and Fuller, D.C. 1995. A survey of the incidence of Salmonella species and Enterobacteriaceae in poultry feeds and feed components. Vet. Rec, 136, 169-172. Vestby, L.K., Møretrø, T., Langsrud, S., Heir, E., Nesse, L.L. 2009. Biofilm forming abilities of Salmonella are correlated with persistence in fish meal and feed factories. BMC Vet. Res, 5, 20. Wain, J., House, D., Zafar, A., Baker, S., Nair, S., et al. 2005. Vi antigen expression in Salmonella enterica serovar Typhi clinical isolates from Pakistan. J. Clin. Microbiol, 43, 1158-1165. Wang, H., Huang, Y., Wu, S., Li, Y., Ye, Y., et al. 2014. Extracellular DNA inhibits Salmonella enterica Serovar Typhimurium and S. enterica Serovar Typhi biofilm development on abiotic surfaces. Curr. Microbiol, 68, 262-268. Watanabe, M., Suzuki, Y., Sasaki, K., Nakashimada, Y., Nishio, N. 1999. Flocculating property of extracellular polymeric substance derived from a marine photosynthetic bacterium, Rhodovulum sp. J. Biosci. Bioeng, 87, 625-629. Watnick, P. and Kolter, R. 2002. Biofilm, city of microbes. J. Bacteriol, 182, 26752679. Webb, J.S., Thompson, L.S., James, S., Charlton, T., Tolker-Nielsen, T., et al. 2003. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. J. Bacteriol, 185, 4585-4592. Whitchurch, C.B., Tolker-Nielsen, T., Ragas. P.C. and Mattick, J.S. 2002. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science, 295, 1487. White, A.P. and Surette, M.G. 2006. Comparative genetics of the rdar morphotype in Salmonella. Journal of Bacteriology, 188(24), 8395-8406. White, A.P., Gibson, D.L., Collinson, S.K., Banser, P.A. and Kay, W.W. 2003. Extracellular polysaccharides associated with thin aggregative fimbriae of 107 Salmonella enterica serovar Enteritidis. Journal of Bacteriology, 185(18), 53985407. Wilson, K. 2001. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 2:Unit 2-4. Wolfe, A.J., Chang, D.E., Walker, J.D. and 7 other authors. 2003. Evidence that acetyl phosphate functions as a global signal during biofilm development. Mol. Microbiol, 48, 977-988. Wu, J. and Xi, C. 2009. Evaluation of Different Methods for Extracting Extracellular DNA from the Biofilm Matrix. Applied And Environmental Microbiology, 75(16), 5390-5395. Xavier, J.B. and Foster, K.R. 2007.Cooperation and conflict in microbial biofilms. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 876–881. Yang, L. et al. 2007. Effects of iron on DNA release and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. Microbiology, 153, 1318-1328. Yang, S.J., Rice, K.C.,. Brown, R.J., Patton, T.G., Liou, L.E., Park, Y.H. and Bayles, K.W. 2005. A LysR-type regulator, CidR, is required for induction of the Staphylococcus aureus cidABC operon. J. Bacteriol, 187, 5893-5900. Zakikhany, K., Harrington, C.R., Nimtz, M., Hinton, J.C. and Römling, U. 2010. Unphosphorylated CsgD controls biofilm formation in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Molecular Microbiology, 77(3), 771-786. Zhang, X.L. and Yip, C.M. 2000. Salmonella enterica serovar Typhi uses type IV B pili to enter human intestinal ephitelial cells. Infections and Immunity, 68, 3067-3073. Zogaj, X., Nimtz, M., Rohde, M., Bokranz, W. and Römling, U. 2001. The multicellular morphotypes of Salmonella Typhimurium and Escherichia coli produce cellulose as the second component of the extracellular matrix. Molecular Microbiology, 39(6), 1452-1463. 108 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Caner ÖZDEMİR Doğum Yeri : ANKARA Doğum Tarihi : 17.02.1984 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Dikmen Yabancı Dil Ağırlıklı Lisesi (2002) Lisans : Selçuk Üniversitesi, Fen Fakültesi Biyoloji (2009) Yüksek Lisans :Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitisü, Biyoloji Ana Bilim Dalı (02/2013-) Uluslararası Kongre Sunum The Role of Extracellular DNA in Salmonella Biofilms: is It in Intimate Relationship with Matrix or Initial Adhesion? ECCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases), Copenhagen, Denmark. (28 April 2015). 109
