Slayt 1

advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİ
Dr. ismail Bezirganoglu
RNA YAPISI
RNA genden proteine bilginin akışında sadece bir
aracı
 RNA, DNA replikasyonundan protein sentezine
kadar temel hücre işlemlerinin geniş bir alanıyla
ilgilidir.
 RNA yı çok amaçlı molekül yapan nedir.
 DNA ile karşılaştırıldığında RNA nın daha
büyük yapısal bir değişkenliğe sahip olduğudur.
 RNA zincirleri küresel proteinlere benzer şekilde
işlev gören üç boyutlu özgün yapılara katlanırlar.

RNA, birçok hücresel süreçte görev alır.
DNA replikasyonu.
 mRNA işlenmesi,
 protein sentezi
 proteinin hedefe yönelmesi
 gen ekspresyonu


NÜKLEOTİD= BAZ+ŞEKER+FOSFORİK ASİT
RNA TıPLERı






Ribozomal RNA: Ribozomun temel bileşeni
Elçi RNA (mRNA): Bir gene ürününü kodlayan ve
sitoplazmada ribozomlara bağlanan genomik DNA dizisinin
bir kopyası
Taşıyıcı RNA: özgün bir amino asit ile yüklü küçük bir
RNA. tRNA antikodonu ile mRNA’ nın kodonu eşleşerek
uygun aminoasit ribozoma iletilir.
Küçük çekirdek RNA’ sı (sn RNA): mRNA yı
translasyona hazırlayan pre-mRNA’ dan intronların
çıkarılması işleminde görev alır.
Küçük çekirdekçik RNA’ sı (sno mRNA): rRNA
işlenmesinde rol oynar.
Mikro RNA (miRNA): transkripsiyon sonrası gen
düzenlemesinde görev alır.
Protein Coding Gene
…
Transcription
Polyadenylation
intron
exon
primary transcript / pre-mRNA
mRNA
Splicing
Export
Translation
Protein
Folding, Modification,
Transport, Complex
Assembly
Protein Complex
Degradation
AAAAAAAAA
Degradation
rna- protein etkileşimi





RNA bir iskele olarak hizmet edebilir. Sinyal tanıyıcı
partikülde olduğu gibi proteinler bunların üzerinde düzenli
bir biçimde yapılanabilirler. Proteinler, RNA’ nın primer
nükleotid dizisini ve sekonder ve tersiyer yapı motiflerini
tanırlar.
RNA-protein
etkileşimleri
proteinlerin
katalitik
aktivitelerini etkileyebilir.
RNA katalitik olabilir. Ribozim olarak adlandırılan RNA
molekülleri, canlı hücrelerde meydana gelen pek çok
kimyasal reaksiyonu katalizleyebilir.
Kısa RNA lar direk olarak gen ekspresyonunu kontrol
edebilirler.
RNA kalıtsal bir materyal olabilir.
rna’ nın yapısal
motifleri

RNA,
nükleotitlerin
birbirine,
fosfodiester
bağlarıyla
eklenmesiyle
oluşan bir zincir benzeri
moleküldür.
Rna’ nın sekonder ikincil yapısı
Termodinamik verilere
 karşılaştırılmalı dizi analizi
 Çözülmüş kristal yapı verileri
 Bilgisayar analizi yöntemiyle oldukça güvenilir
doğrulukta tahmin edilebilir.

RNA sekonder yapısı
Pseudoknot
Stem
Interior Loop
Single-Stranded
Bulge Loop
Junction (Multiloop)
Hairpin loop
RNA sarmal oluşumu tek zincir içinde oluşur.
 DNA’ da olduğu gibi RNA sarmalı da baz çiftleri
arasında oluşan hidrojen bağlarıyla ve baz
istifleşmeleri
arasında
oluşan
hidrofibik
etkileşimlerle kararlı hale getirilir.
 X ışını kristalizasyon çalışmaları RNA öncelikle
her dönüşde 11 baz çifti bulunan, sağa doğru
dönen A tipi çift zincir RNA sarmalları oluşturur.
 RNA daki riboz şekerinin 2’ – hidroksil grubu, Btipi sarmal yapısının oluşumunu engeller.

Watson Crick baz çiftli normal A- tipi RNA
sarmalları özgün ligant etkileşimler için olmayan,
derin, dar büyük oluklara sahiptir.
 Küçük oluklar büyük oluklara nazaran daha az baz
dizisine sahiptir.
 RNA çift sarmalındaki küçük oluklar 2’ OH grubu
içerirler ki bu grublar iyi hidrojen bağı
yapıcıdırlar.
 Küçük oluklar sığ ve geniştirler buda onları
ligantlar için erişilebiliryaparlar.
 Bu sebepden küçük olukdan RNA ya bağlanan
proteinler tarafından tanınması RNA için
yaygındır.

O
H
N H
N
N
N
H N
H N
N
N
H
O

Watson-Crick baz çifti

Watson-Crick baz çiftine uymayan G/U (Wobble)
O
N
N H
O
H N H
N
N
N
N
tRNA yapısı
RNA zincirleri, globular proteinlere benzer
şekilde faaliyet gösteren üç boyutlu özgün
yapılara katlanır.
 tRNA kısa nükleotit zincirinden oluşur.
 X ışını kristograf çalışmaları tRNA nın hücredeki
fonksiyonel şeklinin açık bir yonca yaprağı
olmadığı L- şekilli üç boyutlu yapıya katlanır.

MODıFıYE BAZLAR
Genelde taşıyıcı RNA lar 50’ den fazla modifiye
edilmiş baz içerir.
 Modifikasyonlar
basit metilasyondan pürin
halkasının yeniden yapılandırılmasına kadar
değişebilir.
 Inozin(I), tRNA’ da tanımlanan ilk modifiye
nükleotittir.
 Inozin 6. karbonda bir amino grubu yerine, bir
oksijenin olması ile adenozinden farklılaşır.
 Nükleozit modifikasyonları yalnızca tRNA lara
has değildir.

 Ribozomal
RNA
ların
olgunlaşması
esnasında birçok baz modifikasyonları
meydana gelir.
 Herhangi bir RNA da tanımlanan ilk
modifiye
nükleozit
sık
rastlanan
pseudouridin’ dir.
 pseudo
üridinin
yan
ürünüdür
ve
halkasının 5. karbonunun yerinde azot
vardır.
Her tRNA halkasının ayrı fonksiyonu
Her transfer RNA’ nın amino asit eklenen 3’ ucu
ACC nükleotit dizisine sahiptir.
 T halkasının tRNA ların ribozomlar tarafından
tanınmasında rol oynar.
 Antikodon halkası mRNA daki kodonlarla baz
çiftleşmesi yapar.
 D halkası tRNA ya uygun amino asiti yükleyen ,
aminoaçil
tRNA
sentetazların
tRNA
yı
tanımasında görev alır.

tRNA yapısı
Koaksiyal raflama ile oluşan sarmal kollar
Amino asit
bağlama bölgesi
D HALKASI
T HALKASI
Değişen halka
Antikodon halkası
tRNA da bulunan modifiye bazların yapısı
Baz çiftleşmesi yapmış kolların genellikle koaksial
istifleşmelerle diğer kollarla uzun mesafeli
ilişkiler kurmasıdır.
 Koaksial istifleşme yada sarmal istifleşme , iki
farklı
baz
çiftleşmesi
yapmış
koldaki
nükleotidlerin üst üste yığılması ve sürekli bir
sarmal oluşturacak şekilde hizalanmalarıdır.
 iki sarmalın gerçekde birbirine bağlı olmaması
sadece birbirine bir çizgi üzerinde sıradan
istifleşmelerinden
dolayı,
bunlar
pseudocontinous (sürekli) olarak ifade edilir.
 yapı iki sarmal arasındaki baz istifleşmelri ile
kararlı hale getirilir.

Rna da yaygın tersiyer yapı motifleri






RNA katlanmaları, DNA ve RNA’nın çift sarmal yapılarında
ilk kez görünen iki temel aygıtı kullanır.
Hidrojen bağları, baz istifleşmeleri
RNA nın önceden oluşmuş ikincil yapı domainleri,
etkileşerek tersiyer yapıyı oluştururlar.
Halka ve kabarcıklardaki baz çiftleşmesi yapmamış olduğu
tahmin edilen bazlar, kural dışı baz eşleşmeleri oluşturarak
uzun menzilli çeşitli etkileşimlerin oluşumunda yer alırlar.
üç boyutlu yapı 2’ OH grupları arasındaki etkileşim ve uzak
nükleotidler arasındaki etkileşimlerle korunur. Bu uzun
menzilli etkileşimler, standart watson- crick baz
çiftlerinden daha az kararlıdırlar ve hafif denatüre edici
şartlar altında kırılabilirler.
RNA negatif yüklü olduğundan dolayı tersiyer yapı oluşumu
divalent ve monovalent metal iyonlarının bağlanmasıyla veya
bazik proteinlerin bağlanmasıyla yük nötralizasyonu
gerektiren bir süreçtir.
yaygın rna katlanma motifleri
Pseudoknot motifi: tek zincirli bir halka bu
halkanın dışındaki komplementer bir dizi ile baz
çiftleşmesi yaptığında ve koaksial istifleşme ile
üç boyutlu bir yapıya katlandığında bu motif
oluşur.
 Minor motif: büyük RNA moleküllerinin en uzun
menzillietkileşimlerinde en çok bulunan motiftir.
Katalitik RNA molekülünde rRNA da bulunmuştur.
Bu katlanma biçiminde tekzincirli adenozinler,
Van der Waals etkileşimlerive hidrojen bağları
aracılığıyla RNA çift sarmalının küçük olukları ile
tersiyer temaslar kurarlar.




Tetrahalka motifi: gövde halka yapısının kararlılığını artırır.
UUUU tetrahalka dizili bir stem-loop, halkadaki özel bir
baz istifleşmelerinden dolayı özellikle kararlıdır.tetra
halkalar sıklıkla guanin bazının 1- azot pozisyonundan,
iskelet fosfatına kararlı bir hidrojen bağı olan G dönüşleri
içerir.
Riboz fermuar motifi: küçük oluklar arasındaki sarmal
sarmal etkileşimleri kararlı hale getirir. Etkileşimler: bir
sarmalın bir ribozunun 2’-OH ile ya bir pirimidin bazının 2oksijeni yada diğer sarmalın bir pürin bazının 3- azotu
arasındaki hidrojen bağlarını içerir.
Kink-turn (bükülme-dönüş) motifi: Bir RNA çift sarmalına
gömülü bir asimetrik internal halkadır. en göz alıcı özelliği
bu yapıyla ilişkili üç nükleotitlik kabarcığın fosfodiester
omurgasında keskin bir dönüştür.

Öpüşen firkete halkası: komplementer dizili iki
firkete halkasının tek zincirli bölgeleri arasında
iki firkete halkası oluşturur.
RNA YAYGIN TERSİYER MOTİFİ
rna nın katlanma kinetikleri




Büyük RNA molekülleri için RNA zincirinin oluşturabileceği birçok
alternatif yapı mevcuttur. Örneğin yanlış baz eşleşmeleri
sebebiyle yanlış katlanma, hem sekonder hemde tersiyer yapılar
için problemdir. Bu problem yalnızca moleküler biyologlar için
değildir. Sadece tek veya birkaç muhtemel yapı fonksiyon
sağladığından, in vivo da alternatif fonksiyonel olmayan yanlış
katlanmalara karşı RNA nın kendisi korunmalıdır.
Özgün RNA bağlanma proteinleri hedef RNA lar ile sıkı
kompleksler oluştururlar ve RNA katlanmasına yardım
edenşaperonlar
olarak
davranırlar.
Heterojen
nükleer
ribonükleoprotein (hnRNP) proteinleri ailesi bunlara bir örnektir.
20 den fazla farklı proteini içeren bu grup, pre mRNA’ nın
agregasyonunu ve yanlış katlanmasını önlemeye yardımcı olur.
rRNA : rRNA’lar sadece ribosomal proteinler ile bir düzen içinde
katlanarak, uygunsuz katlanıp kinetik katlanma tuzaklarına
düşmekten ve buralarda kaybolmaktan kurtulurlar.
rna katalizinin keşfi



Thomas CECH 1982 de Tetrahymena thermophila rRNA genlerinin
transkripsiyonu üzerine araştırmalardan sonra tetrahymena
thermophila rRNA sına ait tek intronunun hücre dışındada kendi
splays etme aktivitesi gösterdiğini ortaya koydular.
Sidney Altman Bir yıl sonra E coli ye ait ribonükleaz P (Rnaz P)’ ye
ait RNA bileşeninin hücre dışında, protein alt birimi olmadan pretRNA yı işleyebildiğini gösterdiler.
1989 da araştırıcılar kimya dalında Nobel Ödülü aldılar. Bu keşif
ve kimyasal evrimle ilgili yapılan diğer çalışmalar prebiyotik
dünyanın RNA dünyası olduğu hipotezine götürdü. RNA dünyasının
RNA larla dolu olduğunu, RNA nın hem genetik bilgiyi taşıdığı
hemde
proteinlerin
katalitik
fonksiyonlarını
yaptıklarını
öngörmekteydi.



Klonlanmış bir ribozomal RNA geninden öncül bir rRNA
sentezlenmesi. Başka hiçbir protein kullanılmadan, in vitro
rRNA ürettiler. GTP ve Mg+2 varlığında çıplak rRNA
kesilebiliyordu bu durum kesinlikle RNA’nın kendini
splaysinge uğrattığını gösteriyordu.
daha sonra tetrahymena pre 26S rRNA’sı in vitro da
transkribe edildi, fakat bu defa RNA radyoaktif olarak
işaretlendi. Sonra GTP li GTP siz ortam gibi farklı koşullar
altında pre-RNA dan intronların splaysingini araştırdılar.
Örnekler poliakrilamid jel elektroforeziyle ayrıldı ve
otoradyografi olarak görüntülendi. Eğer splaysing olmuşsa
kesilmiş intronların ve birbirine yapışmış eksonları içeren
birçok bandın görülmesi beklendi. Sonuçlar intron
splaysingi için GTP’ nin gerekli olduğunu intron sadece
reaksiyon karışımının içinde GTP
olduğu zaman, 26S
rRNA dan kesilip çıkartılabildi.
sonuçda RNA nın katalitik aktivitesiyle kendi kendini
kesmesi enzim tanımına uymaz. Bu yüzden katalitik
aktiviteye sahip olan RNA moeküllerini enzimlerden
ayırmak için ribozim olarak tanımlandı.
RNAAZ BıR RıBOZıMDıR



1971 de sidney altman E colide pre-tRNA’nın 5’ lider dizisinin
işlenmesine katılan ribonükleaz P (RNAP) enzimini saflaştırmaya
çalıştılar. örneklerde kontaminasyon edici RNA yı uzaklaştırmak
için birçok teşebbüsden 12 yıl sonra aslında RNA nın biyolojik
katalizleme özelliğine sahip olduğunu gösterdiler.
RNazP RNAsı başka bir RNA molekülü üzerinde işlem yapabilen
ve reaksiyon sonunda hiçbir şekilde değişmeyen gerçek bir RNA
enzimidir.
Ecoli RNAaz P, M1 RNA, katalitik RNA ve C5 proteininden
oluşmuştur. In vitro ortamda M1 RNA, yüksek monovalent ve
divalent katyon konsantrasyonunda tek başına öncül tRNA yı
işleyebilir. In vivo ortamda ise C5 proteini M1 RNA sının katalitik
aktivitesini artırmak için gereklidir.
RİBOZİMLER
BİRÇOK
REAKSİYONU KATALİZLER
KİMYASAL
Ribozomdaki 23S rRNA, bu büyük ribozim hiçbir
değişikliğe uğramadan peptid bağı oluşumunu
katalizler.
 Ribozimler proteinlerle aynı şekilde reaksiyonları
katalizlerler. Ribozimler substrata bağlanma
bölgeleri
oluştururlar
ve
reaksiyonların
aktivasyon enerjisini düşürerek hızlandırırlar.
 birçok ribozim metalloenzimdir, aktif bölgeye
divalent katyonların bağlanması, enzimin aktif
formuna katlanması için kritik öneme sahiptir.

Büyük ve küçük ribozimler
RNA az P’ nin RNA bileşenleri grup I ve grup II
intron aileleri büyük ribozim grubundadır.
 Birkaç yüz nükleotidden 3000 nükleotide kadar
farklılık gösterir.
 Anahtar özelliğinden dolayı küçük ribozimden
ayrılırlar.
 Büyük ribozimler 3’-OH ucu üretirken küçük
ribozimler 2’ ve 3’ siklik fosfat ve 5’- OH uçlu
ürünleri üretirler.
 küçük ribozimler hepatit delta virüsü, varkud
satellit RNA sını ve glmS riboswitch ribozimini
içerir
 40-154 nükleotit.

rna da oluşan genomlar
RNA da oluşan genomlar: ortalama büyüklükleri
10.000 nükleotid kadardır. DNA dan oluşan
genomlara göre 1000 kat daha fazla mutasyona
uğrarlar. Bu durumun iki temel sebebi vardır.
 RNA zincirlerinden RNA replikasyonu yapan
protein enzimin bilindiği gibi hatay yatkın olması
ve replikasyon sırasında hataları düzeltmek için
herhangi bir mekanizma yoktur.
 Ökaryotik RNA virüsleri: çok geniş bir gruptur.
Bitkileri, hayvanları içeren birçok farklı konak
hücreyi enfekte eder. Çok farklı büyüklükte ve
şekilde türleri vardır.

Zarflı zarfsız kapsidlidirler. Kapsid virüsün dış
protein örtüsüdür. Zarf ise kapsülü çevreleyen
lipid ve proteinden oluşmuş bir tabakadır. tipik
RNA virüsleri, DNA ara ürünü oluşturmadan
replike olurlar, bu özellik onları retrovirülerden
ayırır.
 RNA genomunun tipine bağlı olarak, üç ana RNA
virüsü kategorisi vardır: plus(+) zincir RNA
virüsleri, minus(-) virüsleri ve çift zincirli RNA
virüsleri





Retrovirüsler: tek zincirli RNA genomludur. Genomları reverse
transkripsiyon ile DNA ara ürünü üreterek replike olur. Hayvan
hücresini enfekte ettikden sonra retrovirüsler, tek zincirli RNA larını
çift zincirli DNA ya çevirirler. Retrovirüs DNA ları konak hücre DNA
sına entegre olur ve konak genomda kalıcı olur.
Viroidler: yüksek yapılı bitkilerde enfeksiyona sebep olan subviral
patojenlerdir. Viral RNA ların aksine hiçbir protein kodlamaz ve bir
protein kılıfı ile korunmazlar. Viroid genomu tek, çok küçük ve 250400 nükleotitten oluşan sirküler bir RNA molekülünden oluşmaktadır.
konağın kodladığı RNA polimerazı kullanarak replike olur
Diğer subviral patojenler, satellit RNA lar ve virusoidler: satellit
RNA lar sadece ona uygun RNA bağımlı RNA polimeraz sağlayan
yardımcı bir virüsün varlığında çoğalır. büyük satellit RNA ları protein
kodlayabilirler.
virusoid: hiçbir proteini kodlama yeteneği olmayan çoğalmak ve kapsid
oluşturmak için kesinlikle yardımcı bir virüse bağımlı olan bir RNA
moekülüdür.
Download