Kan bir sıvı dokudur. Su içeriği fazla olan plazma, yedi tip hücre ve

KANDAN DNA İZOLASYONU
KAN
Kan bir sıvı dokudur. Su içeriği fazla olan plazma, yedi tip hücre ve hücre fragmentlerinden
meydana gelir.

Kırmızı kan hücreleri (alyuvar) veya eritrositler (red blood cells (RBCs) veya
erythrocytes)

Beş tip beyaz kan hücreleri (akyuvar) ve lökositler (white blood cells (WBCs) veya
leukocytes)

Üç tip gronülosit (granulocytes)
 Nötrofiller (neutrophils)
 Eozinofiller (eosinophils)
 Bazofiller (basophils)

Sitoplâzmalarında granülosit içermeyen lökositlerin iki tipi
 Lenfositler (lymphocytes)
 Monositler (monocytes)
Eğer bir kan örneği, pıhtılaşmayı önleyici kimyasallarla (EDTA gibi) muamele edilip santrifüj
edilirse; Alyuvarlar tüpün dip kısmına, akyuvarlar ise kanın en üstte toplanan plazma kısmı ile
alyuvarlar arasına yerleşir.
Figür 1. Kanın santrifüj sonu meydana getirdiği gradient.
DNA İZOLASYONU
İnsan genomik DNA’sı 3x 109 nukleotid uzunluğundadır. Genomik DNA bütün nükleusu
bulunan hücrelerde bulunur ve bu hücreler genomik DNA analizleri için kullanılabilir. Örneğin;
prenatal tanı için amniyotik sıvıdaki fetal hücrelerden veya koryonik hücrelerde genomik DNA
elde edilebilir. Erişkinlerde periferal kandaki lökositler en kolay ulaşılabilen DNA kaynağıdır.
EDTA’lı tüplere alınan 10 ml kan yaklaşık olarak 108 beyaz kan hücresi içerir ve bu miktar
hücreden elde edilecek genomik DNA pek çok genetik test için yeterlidir. DNA izolasyonu için
pek çok metod vardır. Geleneksel izolasyon yöntemlerinin yanında pek çok firma tarafından
üretilen DNA izolasyon kitleri DNA izolasyonunda kullanılmaktadır. Ayrıca mRNA kullanarak
sentezlenen cDNA’da bir diğer DNA kaynağıdır. DNA degredasyona karşı dayanıklı bir
polimerdir ve uygun saklama şartlarında uzun yıllar korunup tekrar tekrar analizlerde
kullanılabilir.
1. Homojenizasyon: 1 ml total kan örneği alınarak 10000 rpm’de 5 dk santrifüj edildikten
sonra supernatant uzaklaştırılır ve kan hücreleri vorteks ile 1-3 dk parçalanır.
2. Doku lizisi: Tüpe alınan örneğin üzerine 400 µl Buffer AP1 eklenir
3. Tüpler su banyosunda 65 C’de 10 dk inkübe edilir. İnkübasyon sırasında birkaç defa
tersyüz edilir.
4. 130 µl Buffer P3 eklenir. Karıştırılır. 5 dakika buz üzerinde inkübe edilir.
5. Santrifügasyon : Tüpler 14.000-16.000 g’de 5 dakika santrifüj edilir.( Çözünmeyen ve
parçalanmayan materyallerin çöktürülmesi için yapılır.)
6. Lizat (supernatant) 2ml’lik 1. kolonu içeren tüpe alınır.
7. 2 dakika 20.000 g de santrifüj yapılır.
8. Alt sıvı yeni tüpe alınır ve 1,5 katı kadar AW1 buffer eklenir. Pipet ile karıştırılır.
9. Kolona yükleme: Örnek ( max 650 ml) kitten çıkan 2.kolona aktarılır. 6.000 g’de 1
dakika santrifüj edilir. Kolonun altında toplanan sıvı atılır. Bu işlem örnek bitene kadar
tekrar edilir.
10. Kolonun yıkanması: 500 ml Wash Buffer kolona eklenir ve 6.000 g’de 1 dakika
santrifüj edilir. Kolonun altında toplanan sıvı atılır
11. Kolonun kurumaya bırakılması: kolon 10.000 g’de 1 dakika santrifüj edilir.
12. DNA elüsyonu: Kolon temiz bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. 100 ml Elution Buffer
direk kolon membranına eklenir ve 5 dakika beklenir. 6.000 g’de 1 dakika santrifüj
edilir.
13. İzole edilen DNA örneği 4 C’de veya -20 C’de saklanır.