POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR)

advertisement
BİYOFİZİK 2015
1
Amaç
Bu pratiğin amacı öğrencilerin polimeraz zincir
reaksiyonu ve kullanım alanları hakkında bilgi sahibi
olmalarını sağlamak
2
Hedefler
Bu pratiğin sonunda öğrenciler,
polimeraz zincir reaksiyonunun moleküler
çalışmalardaki önemini kavrayabilmeli,
kullanım alanlarını ve çeşitleri hakkında bilgi sahibi
olabilmeli.
3
 İlk kez 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan
beri polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem
araştırmada hem de klinik laboratuarlarda tanıda
yeni bir çığır açmıştır.
 ABD'de Cetus şirketinde çalışan Henry A. Erlich,
Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından
geliştirilmiştir. Bu buluşundan dolayı K. Mullis,
1993 yılı Nobel Kimya Ödülünü kazanmıştır.
4
PCR NEDİR?
 Metod basitçe, nükleik asitlerin uygun koşullarda
tüpte çoğaltılması şeklindedir.
 Spesifik bir DNA parçasının kopyalarının
primerler tarafından yönlendirilerek enzimatik
olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in
vitro(canlı dışında,tüpte) bir yöntemdir.
5
 Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki
ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerini
tamamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer
kullanılarak, bu iki primerle sınırlandırılan genin
enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.
6
7
KULLANIM ALANLARI
 Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın






tanısı,
Prenatal tanıda,
Klinik örneklerde patojen organizmaların
saptanması,
Adli tıpta,
Onkogenesisin araştırılmasında,
Klonlamada,gen tanısı araştırmalarında,
Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde,
8
KULLANIM ALANLARI
 DNA




dizi analizinde,büyük miktarda DNA
örneklerinin oluşturulmasında,
Bilinmeyen dizi tayininde,
Evrimin aydınlatılmasında,
İn vitro fertilization yapılan tek hücrede,
implantasyon
öncesi
genetik
testlerin
yapılmasında,
DNA-protein interaksiyonunun araştırılmasında,
9
 PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile
çalışmaya olanak sağlamaktadır.
 PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok
büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok
durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz
hale getirmiştir.
10
OLUŞUM MEKANİZMASI
 Polimeraz zincir reaksiyonunda üç temel basamak
vardır ve çoğaltılmış ürünün miktarı,teorik olarak, bu
üç adımın tekrarlanma sayısına bağlıdır:
 Denatürasyon
 Annealing (Hibridizasyon)
 Extension (Polimerizasyon)
11
DENATÜRASYON
 DNA’nın
iki zincirinin
birbirinden ayrılmasıdır.
yüksek
sıcaklıkta
ANNEALING
 Sentetik
olgonükleotidlerin
hedef
bağlanmasıdır (primer bağlanması).
DNA’ya
EXTENSION
 Zincirin uzaması ya
primerleri uzatmasıdır.
da
DNA
polimerazın
12
 Her adım farklı sıcaklıklarda gerçekleşir:
Denatürasyon, 940C-980C
Annealing, 370C-650C
Extension, 720C
13
14
 Ardarda tekrarlanan denatürasyon, primerlerin
bağlanması, primerlerin uzaması evreleriyle
DNA parçaları üssel olarak artar.
 Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu
sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer
primerler için kalıp görevi yapmasıdır.
 Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü
üzerinde istenilen bölgenin iki katına
çıkmasıyla sonuçlanır.
15
16
 PCR boyunca biriken ürünlerin boyu, iki primerin boyu
ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin toplamı
kadardır.
 Matematiksel olarak amplifikasyon;
(2n-2n)X
ile ifade edilir.
n= döngü sayısı
2n= birinci ve ikinci döngü sonucunda oluşan boyları bilinmeyen
ürünler.
X= orijinal kalıbın kopya sayısı
Her döngü %100 verimle çalışsa 20 döngü sonunda 220 kat
ürün oluşur.
17
PCR’nin işleyişi

Verimli bir PCR için;
1.
2.
3.
4.
5.
Denatürasyon
Primerlerin bağlanması
Primerlerin uzaması
Döngü sayısı
PCR makinesinin sıcaklık iniş ve çıkış süreleri önemlidir.
18
PCR’nin Verimi
 PCR’nin verimini etkileyen önemli bir faktör, DNA
polimeraz enzimidir. Normalde enzim miktarı, 25-30
PCR döngüsü sonucunda hedef dizi artışı ve termal
denatürasyon nedeniyle sınırlayıcı bir etken haline
gelir.
 Verimliliği azaltan bir diğer faktör de konsantrasyonu
artan hedef dizilerin primer ile bağlanma yarışıdır.
19
PCR’nin Temel Bileşenleri
 Kalıp olarak kullanılan DNA molekülü
 DNA polimeraz enzimi
 Primerler
 dNTP karışımı
 Tampon ve MgCl2
20
Kalıp DNA
 PCR’de; genomik DNA’lar, plazmid ve faj DNA’ları
çeşitli genler ve hatta herhangi bir DNA parçası
kalıp olarak kullanılabilir.
 PCR’de kalıp olarak DNA’nın yanı sıra RNA’da
kullanılabilir.
21
Polimerazlar
 DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı
bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal
kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit
deoksiribonükleozid
trifosfattan
uzun
polinükleotid zincirin sentezini kataliz eder.
 Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp
moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa
DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar.
22
 Sentezin yönü, 5’ uçtan 3’ uca doğru olup, primerin
serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki dNTP’lerin
nükleofilik
etki
yapmalarıyla,
fosfodiester
bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin
polimerizasyonu sağlanır.
23
Primerler
 Gen çoğaltılması dahil PCR’nin birçok uygulaması
için kalıp DNA’ya tamamen tamamlayıcı olan
primerlere ihtiyaç vardır.
 Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda
bağlanma sağlamak üzere primerler 20-30
nükleotid uzunluğundadır.
24
dNTP Karışımı


Deoksirübonükleozid trifosfatlar
(dATP,dGTP,dTTP,dCTP) yüksek saflıkta ya tek
tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak
sağlanır.
Optimal dNTP konsantrasyonu;
1.
2.
3.
4.
5.
MgCl2 konsantrasyonuna
Reaksiyon koşullarına
Primer konsantrasyonuna
Çoğaltılmış ürünün boyuna
PCR döngü sayısına bağlıdır.
Yapılacak PCR için en uygun dNTP konsantrasyonu
deneysel olarak belirlenmelidir.
25
Tamponlar ve MgCl2
 PCR’de en çok kullanılan tampon Taq/Amplitaq
enzimlerine özgü olan tampondur. Diğer enzimler
için de benzeri tamponlar bulunur.
 MgCl2’nin
reaksiyon
karışımındaki
final
konsantrasyonu değişebilmekle birlikte genellikle
0,5-5,0 mM’lık değerler arasında çalışılır.
26

Mg+2 iyonları;
1.
2.
3.
4.
dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar.
Polimeraz aktivitesini stimüle(uyarmak) ederler
Çift iplikli DNA’nın Tm değerini arttırırlar
Primer/kalıp etkileşimini sağlarlar
Bu yüzden MgCl2’ün PCR’nin özgüllüğü ve ürün
verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır.
Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu olarak
1,0-1,5 mM’lık değerler tercih edilir.düşük Mg+2
konsantrasyonu; ürün oluşumunda azalmaya, yüksek
Mg+2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün
birikimine yol açar.
MgCl2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl2
kullanımına gerek yoktur.
27
PCR ürünlerinin belirlenmesi ve analizi


PCR
ürünleri
(amplikonlar)
boyları
primerlerle sınırlandırılmış DNA parçası ya
da parçalarıdır.
PCR ürünlerinin analizi ile genellikle üç çeşit
bilgi edinilebilir:
1.
2.
3.
Hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı
varyasyonun belirlenmesi
Başlangıç materyali olarak kullanılan DNA
veya RNA’nın kabaca ya da kesin miktarının
belirlenmesi için çoğaltılmış PCR ürününün
miktarının ölçülmesi
Dizi analizi
28
 Çoğaltılmış ürünün saptanması ve doğrulanması için
çeşitli yöntemler kullanılabilir.
 En basit ve en genel olanı elektroforezdir. (Agaroz ya
da jel elektroforezi)
29
PCR ÇEŞİTLERİ
1. Yuvalanmış (nested) PCR:
Özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engelleyen, yüksek
özgünlükte bir PCR yöntemi.
İki primer çifti
İle çoğaltım
İki primerin bağlanma bölgesinin
arasındaki ikinci primer çiftinin bağlanma
yerleri
Yeniden çoğaltım
30
 Bu yönteme göre ardarda 2 PCR yapılır.
 İlk PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumuyla
sonuçlanır.
 2. PCR ise ilk PCR sonucu çoğaltılmış DNA’nın iç
kısımlarına ait dizileri içeren ‘NESTED’ primerleri ile
yapılır.
 İlk PCR ürünleri 2. PCR için kalıp olarak kullanılır ve
istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde
edilir.
31
2.Demirlenmiş (anchored)PCR:
DNA kesilir ve vektöre
bağlanır
(i) DNA’ya ait primer ve
(ii) Vektöre ait primer
kullanımıyla PCR
(i)
(ii)
32
 Çoğaltılacak olan DNA nın sadece bir bölgesinin
bilindiği durumda uygulanır.
 Bilinen bölgeden yaralanılarak ilgilenilen DNA
parçasının çoğaltılmasıdır.
 Çoğaltılacak DNA bilinen bir diziye bağlanır ve bu
bilinen dizi 2. primer bölgesi olarak kullanılır.
33
3. Geri (revers) Transkripsiyon PCR’si
RNA PCR olarak da adlandırılan RT-PCR, iki
aşamalı olup
 RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri
transkripsiyon) ve
 tamamlayıcı DNA’nın da standart PCR yoluyla
çoğaltılması aşamalarını kapsar.
34
4. Asimetrik PCR:
Asimetrik PCR yöntemi, fazla miktarda çoğaltılan
tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılır.
Bu PCR çeşitinde, kullanılan iki primerden biri
miktarca diğerinden çok daha fazladır. Bu nedenle
asimetrik PCR sonucu ipliklerden biri diğerinden çok
daha fazla miktarda artar.
Asimetrik PCR herhangi bir kalıp ipliğe
uygulanabilir ancak tek iplikli ürünün fazla miktarda
üretilememesi gibi bir sorunla karşılaşılabilir.Bu
nedenle çoğunlukla klasik PCR ile önce çift iplikli
hedef DNA çoğaltılır, ardından asimetrik PCR
uygulamasıyla kalıp yeniden çoğaltılarak tek iplikli
ürün yeterli miktarda üretilir.
35
5. Ters (ınvers) PCR (IPCR):
Bilinen bir DNA dizisinden
yararlanılarak bu DNA’nın her iki ucundaki bilinmeyen bölgelerin
çoğaltılması için kullanılır.
Bilinen dizi
DNA’nın kesimi
Kendiliğinden ligasyon
Bilinen dizinin enzim kesimi
Her iki ucunda Bilinen diziler
taşıyan Ve PCR için uygun
hedef dizi
36
 Bilinen diziyi içeren DNA önce restriksiyon enzim
kesimi ile doğrusal ve sonra bilinen DNA’yı içerecek
şekilde halkasal hale getirilir.
 Ardından bilinen DNA dizilerine ikinci bir restriksiyon
kesimi uygulanmasıyla tekrar doğrusal olarak elde edilen
DNA molekülü bilinen dizilere uygun olarak tasarlanan
primerler yardımıyla çoğaltılır.
 Böylece dizisi bilinmeyen DNA parçası çoğaltılmış olur.
37
6. In Situ PCR:
 Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku parçaları
içindeki kalıp DNA’nın PCR ile çoğaltılması
işlemidir.
 Bu yöntem viral DNA’nın ve tek kopyalı genlerin
saptanmasında veya RT-PCR ile birlikte viral RNA
ve transkriptlerin belirlenmesinde kullanılır.
 İn situ PCR, hücre içine PCR bileşenlerinin girişine
izin vermek üzere hücre membranları yarı geçirgen
hale getirildikten sonra fikse edilmiş hücre veya
dokularda kullanılır.
38
7.Çoklu (Multipleks) PCR
 Bir PCR ile birden fazla hedef dizinin birlikte
çoğaltılmasıdır.
 Çoklu PCR, birden fazla bölgeye bağlanan
multipleks primerler ile gerçekleştirilir.
 Bu PCR gen delesyonlarının haritalanması,
küçük delesyonların, çerçeve kayması ve nokta
mutasyonların analizinde kullanılan bir
yöntem olduğundan kistik fibrozis gibi genetik
hastalıkların tanısında kullanılabilir.
39
8.Rastgele çoğaltılmış poliformik DNA
(RAPD)
 Bu metot, dizisi bilinmeyen DNA parçalarının
çoğaltılmasını kapsar.
 Reaksiyonun
ürünleri,
oligonükleotidlerin
dizisine, uzunluğuna ve reaksiyon şartlarına
bağlıdır.
 RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü çok sayıda
marker sağlamasıdır.
40
9. Immuno PCR
 PCR ile antijen saptama sistemidir.
 Özgül
olarak
antijen-antikor
kompleksine
bağlanmış bir işaret DNA parçasının çoğaltılması
için kullanılır.
epitop
x
antikor
antijen
Uygun primerlerle
PCR
PCR ürünlerinin
analizi
41
Real Time PCR
Son yıllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri
sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas
ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, gerçek zamanlı(real-time)
PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden
olmuştur.
“Real-time” PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında
yapılmaktadır.
42
 Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının
mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin
uygulanmasına gerek kalmamaktadır.
 “Real-time” PCR ürünlerinin niteliksel ve sayısal
analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan
boyalardan ya da diziye özgün problardan
yararlanılmaktadır.
43
44
(www)
Real-Time PCR
Tüp içinde oluşan fluorescence
saptanır
Amplifikasyon sırasında saptama
yapılır
45
BioRad
iCycler
46
47
48
49
50
51
Download