ARKEOLOJİK TOPLUMLARDA AKRABALIK İLİŞKİLERİ: BİR

T. C.
İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ
ADLİ TIP ENSTİTÜSÜ
FEN BİLİMLERİ ANA BİLİM DALI
ARKEOLOJİK TOPLUMLARDA
AKRABALIK İLİŞKİLERİ:
BİR MOLEKÜLER ANTROPOLOJİK YAKLAŞIM
DOKTORA TEZİ
Şeyda Şebnem Özcan
İstanbul - 2010
Babaannemin anısına…
ii
TEŞEKKÜR
Tez çalışmamızın ortaya çıkışından itibaren beni destekleyen, sorumluluğunda olan
iskelet koleksiyonundan örnekleri kullanmamı sağlayan Danışmanım Prof. Dr. M. Yaşar
İşcan’a; bana zaman ayırarak teorik ve pratik bilgisiyle beni aydınlattığı, değerli yorum ve
önerileri ile teze katkıda bulunduğu, tezin düzenlenmesine yardım ettiği için minnettarım.
Yüksek lisans ve doktora eğitimim boyunca beni Adli Bilimler ve Adli Genetik
konularında en iyi şekilde eğiten, akademik hayata başlamamı ve bu yolda ilerlememi
sağlayan Prof. Dr. Ersi A. Kalfoğlu’na; çalışma boyunca bilgi ve deneyimleri ile bana yol
gösterdiği, maddi-manevi her türlü desteği sağladığı için sonsuz teşekkür ederim.
Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi laboratuvarının kapılarını çalışmam için açan
Prof. Dr. Sevil Atasoy’a, yararlanmamı sağladığı imkânlar için teşekkürü bir borç bilirim.
Çalışmam boyunca bana umut ve dayanma gücü veren Yard. Doç. Dr. E. Hülya
Yükseloğlu’na, zaman ayırarak tezimin son kontrollerini yaptığı için müteşekkirim.
Aynı yolda yürürken her zorluğu beraber yaşadığımız Araş. Gör. Gavril Petridis’e,
çalışmamın laboratuvar aşamalarında gösterdiği yardım ve harcadığı emek için; başımın
sıkıştığı her anda arkeoloji bilgisine başvurduğum Arkeolog Bahar Mergen’e, benden
esirgemediği yardımı ve anlayışı için teşekkür ederim.
TÜBİTAK Bursu kapsamında üç ay birlikte çalıştığım İngiltere Manchester
Üniversitesi’ne bağlı Manchester Disiplinler Arası Araştırma Merkezi’nden Prof. Terry
Brown ve Dr. Abigail Bouwman’a, bana güvenerek laboratuvarlarında çalışmama fırsat
verip konuyla ilgili öğrettikleri her şey ve halen süren destekleri için teşekkür borçluyum.
A.B.D. Washington D.C.’de bulunan Smithsonian Institution’dan Alain Touwaide
ve Emanuela Appetiti’ye, bana kazandırdıkları multidisipliner bakış açısı, sağladıkları tüm
olanaklar, devam eden yardımları ve geleceğimle ilgili açtıkları yeni ufuklar için teşekkür
borçluyum.
Hayatım boyunca her konuda bana güvenen, destek olan, emek harcayan, hayatımı
kolaylaştıran annemin hakkını ödeyemem. Ayrıca tez çalışmam boyunca bana ilgi ve
anlayış gösteren babama, tezin basımındaki maddi yardımı ve manevi desteği için
minnettarım.
iii
Bu tez çalışması, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri
Yürütücü Sekreterliği tarafından desteklenmiştir (Proje Numarası: 2571).
iv
ÖZET
Yazar: Ş. Şebnem Özcan, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Kampüsü,
İstanbul
Tezin Başlığı ve Tarihi: Arkeolojik Toplumlarda Akrabalık İlişkileri: Bir Moleküler
Antropolojik Yaklaşım, 2010
Eski ve modern insan toplumları arasındaki evrimsel bağlantıları belirlemek için
yapılan genetik analizlerle popülasyonların birbirleri ile olan yakınlığı araştırılmaya
başlanmıştır. Bu genetik ilişkiler; arkeolojik kazılarda elde edilen iskelet kalıntılarında
moleküler incelemelerle belirlenir ve tarih öncesi toplumların sosyal yapısı, aile düzeni ve
akrabalık ilişkileri ile ilgili bilgiler sağlar. İskelet kalıntılarından DNA elde edilmesi, adli
bilimlerde de önem kazanmıştır. Çünkü kemik ve dişler uzun zaman boyunca korunduğu
için analiz etmeye uygun tek kaynaktır. Ancak çevreden kaynaklanan inhibitörlerin varlığı
kadar, çevresel, bakteriyel ve post-mortem DNA hasarlarından dolayı, eski kalıntılardan
DNA eldesi zordur. Dolayısıyla laboratuvar çalışması; zaman alan ve özen isteyen bir
süreç haline dönüşür. Bu çalışmanın amacı; Van-Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö.
1200–750/700) bölgesindeki arkeolojik kazıların iki farklı oda mezarından çıkarılmış
kemiklerle bunların her birinin başka bir aileye ait olduğunu genetik analizlerle belirlemek
ve sosyokültürel yapılarına bir ışık tutmaktır. Çalışmada materyal olarak Van-Yoncatepe
kazı alanında bulunan oda mezarlardan M2'deki 20, M6’daki 17 insan femur kemiği
kullanılmıştır. Kemik parçalarından alınan örneklerden DNA izole edilerek, mitokondriyal
DNA HVRI bölgesinde 16147–16294 baz çifti arası bölge PCR ile çoğaltılmıştır. Daha
sonra, Türkiye’de arkeoloji ve adli bilimlerde henüz uygulanmayan klonlama yapılmış ve
hedef bölge dizinlenmiştir. Analiz sonunda, bireylerin taşıdığı genetik profil çıkarılarak
v
aralarındaki olası akrabalık ilişkileri değerlendirilmiştir. Akrabalık analizlerinin daha yakın
kesinlik ve güvenilirlikle yapılabilmesi için daha fazla sayıda genetik özellik incelenmesi
gerekmektedir. Bu sebeple bir ön çalışma niteliğinde olan bu proje, uygun yöntem ve
çalışma planını ülkemize uyarlayarak ileriki araştırmalar için temel oluşturacaktır.
Moleküler antropoloji araştırmalarında kullanılabilecek bu yöntemin, adli bilimlerde de
kemikten DNA elde etme yöntemlerini geliştirmekte faydalı olacağı düşünülmektedir.
vi
SUMMARY
Author: Ş. Şebnem Özcan, Institute of Forensic Sciences, Istanbul University, Cerrahpasa
Campus, Istanbul
Title and Date: Determination of the Genetic Relationships in Van-Yoncatepe
Archaeological Population: A Molecular Anthropological Approach, 2010
Ancient and modern populations have been compared using genetical analysis
carried out in order to determine the evolutional relationships between them. This analysis
provides information regarding social structure, family systems and kinship relationships
of prehistoric populations and is conducted with the skeletal samples obtained in
archaeological excavations. DNA extraction from ancient and modern skeletal remains is
also significant in forensic sciences as bones and teeth are the only samples to obtain and
analyze DNA. Ideally DNA is best preserved in bones and teeth. However there has been
numerous difficulties to carry out this procedure probably because the current technique is
not properly applied. Some of the difficulties arise from bacterial damages, taphonomic
factors and diagenesis. Thus the laboratory procedure to carry out to persue such an
investigation takes a considerable time. The purpose of this study is to investigate genetic
relationships in the ancient Urartu population who lived in Van-Yoncatepe (1200–750/700
BCE) and to assess the family composition in each burial chamber using 20 femura
(Chamber M2) and 17 femura (Chamber M6) in order to shed light to the family structure
and kinship pattern in the society. Mitochondrial DNA was extracted, 16147–16294 bp
region in HVRI was amplified and cloned prior to the sequencing, a technique that has not
been applied in Turkey to archaeologic and forensic cases. Genetic profiles of the
individuals were evaluated for determining the probable kinships within and between the
vii
two burial chambers. In general, the more polymorphic characteristics are analyzed, the
closer one comes to the true genetic (thus kinship) relationship. This preliminary analysis
of skeletal remains obtained from a well-preserved burial chamber should result in better
research for both forensic and archaeological populations.
viii
İÇİNDEKİLER
Teşekkür
iii
Proje Desteği
iv
Özet
v
Summary
vii
İçindekiler
ix
Şekiller ve Tablolar Listesi
xii
BÖLÜM I: GİRİŞ VE AMAÇ
1
BÖLÜM II: GENEL BİLGİLER
3
Fiziksel ve Adli Antropoloji
3
Sosyokültürel Antropoloji
5
Akrabalık
6
Aile
8
Evlilik
9
Moleküler Antropoloji
11
Biyoarkeolojik Örnekler ve Genetik Materyal
14
Kemik
17
Diş
22
Yumuşak dokular
23
Diğer biyoarkeolojik örnekler
24
Geçmişe ait DNA’nın biyokimyasal özellikleri
28
Kromozomal DNA çalışmaları
35
Mitokondriyal DNA çalışmaları
41
ix
DNA tipleme sistemleriyle akrabalık analizi
44
Akrabalık tayinlerinde istatistiksel hesaplar
48
Biyoarkeolojik Örneklerde DNA Çalışmaları
50
Birey düzeyinde aDNA Çalışmaları
51
Aile düzeyinde aDNA Çalışmaları
54
Toplum düzeyinde aDNA Çalışmaları
57
Tarihsel çevrenin rekonstrüksiyonu için aDNA
62
Tıbbi amaçlı çalışmalarda aDNA
63
İnsan evrimi çalışmalarında aDNA
65
Geçmişe ait DNA çalışma yöntemleri
66
DNA izolasyonu
67
DNA’nın çoğaltılması
69
DNA analizi
75
Biyoteknolojiden yararlanma
78
Geçmişe ait DNA'nın güvenilirliği
81
Geçmişe ait DNA çalışmalarında etik ve yasal konular
89
Eski DNA çalışmalarının adli bilimlere katkısı
92
Anadolu’da Demir Çağı
94
Van Coğrafyası
95
Yoncatepe ve Urartu Medeniyeti
95
Yoncatepe Nekropolü
97
BÖLÜM III: GEREÇ VE YÖNTEM
100
Kemiklerin hazırlanması
100
x
DNA izolasyonu
101
DNA’nın çoğaltılması
103
Jelden DNA izolasyonu
105
DNA’nın klonlanması
106
Klonlama sonrası çoğaltma
109
PCR ürünlerinin saflaştırılması
111
Dizinleme
111
Dizinlerin değerlendirilmesi
112
BÖLÜM IV: BULGULAR
113
BÖLÜM V: TARTIŞMA
124
Yoncatepe materyali
125
Kemiklerin hazırlanması
128
DNA izolasyon yöntemi
132
Amplifikasyonda karşılaşılan sorunlar
134
Klonlamanın faydası
136
Klonlama sonrası çoğaltma
137
Dizin bulgularının genel değerlendirmesi
138
Mutasyon bulgularının değerlendirmesi
139
Mutasyonların haplogrup düzeyinde değerlendirmesi
143
BÖLÜM VI: SONUÇ
145
BÖLÜM VII: KAYNAKLAR
147
EKLER
193
ÖZGEÇMİŞ
197
xi
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1. Sudan akrabalık sınıflama sistemi
7
Şekil 2. Post-mortem DNA değişimlerinde hidrolitik hasar ile iplik
kopmalarının meydana gelmesi
30
Şekil 3. Post-mortem DNA değişimlerinde oksidatif ve hidrolitik baz
modifikasyonları
31
Şekil 4. Post-mortem DNA değişimlerinde çapraz bağların oluşması
33
Şekil 5. Königsfeld Kont’larının geleneksel aile mezarlığında arkeolojik
ve tarihi kayıtlara göre çıkarılan soyağacı ile genetik soyağacının
karşılaştırılması
48
Şekil 6. Yoncatepe’nin genel görünümü
96
Şekil 7. Yoncatepe arkeolojik kazı alanı
96
Şekil 8. Mezar 2’nin genel görünümü
97
Şekil 9. Mezar 2’deki buluntular
98
Şekil 10. Mezar 6’nın genel görünümü
98
Şekil 11. Mezar 6’daki buluntular
99
Şekil 12. Agaroz jelden DNA bantının kesilmesi
105
Şekil 13. DNA izolasyonu sırasında örneklerin üst fazında görülen renk
farklılıkları
113
Şekil 14. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü
114
Şekil 15. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü
114
Şekil 16. Amplifikasyonun başarısız olduğu, sadece primer-dimer oluşumunu
gösteren bir jel görüntüsü
115
Şekil 17. Amplifikasyon sırasında kontaminasyonun olduğunu gösteren bir
jel görüntüsü
116
Şekil 18. Amplifikasyonun doğru gerçekleştiği bir jel görüntüsü
116
xii
Şekil 19. Amplifikasyon ürünlerinden klonlama yapılmadan önce
M6-FD7 örneğinin saflaştırma sonrası dizinlenmesi
117
Şekil 20. Klonlamadan sonra gerçekleştirilen amplifikasyonda vektöre
doğru bağlanan ve bağlanmayan ürünlerin tespit edildiği jel görüntüsü
118
Şekil 21. Klonlama yapılmış M6-FD6 amplifikasyon ürününün elde
edilen kolonilerinden birinin dizinlenmesi
119
Şekil 22. M6-FD6 örneğine ait bir koloni dizininin Chromas programı
ile işlenmesi
119
Şekil 23. M2FD3 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen
dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge
diziniyle karşılaştırılması
120
Şekil 24. M2FD7 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen
dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge
diziniyle karşılaştırılması
121
Şekil 25. M6FD5 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen
dizinlerin, BioEdit programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge
diziniyle karşılaştırılması
121
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 1. Biyoarkeoloji uygulamaları, antropolojiye katkısı ve moleküler
analiz yöntemleri
14
Tablo 2. İncelenen kemik örneklerine göre izolasyon ve amplifikasyon
başarısı, dizinlenen koloni sayısı ve dizin sonuçlarında görülen farklılıklar
122
xiii
BÖLÜM 1
GİRİŞ VE AMAÇ
Arkeolojik ve modern insan toplumları arasındaki evrimsel bağlantıları belirlemek
için yapılan genetik analizler, moleküler antropolojinin gelişmesini sağlamış, böylece
popülasyonların birbiri ile olan yakınlığı araştırılmaya başlanmıştır. Antropologlar için bu
durum, toplumların nasıl oluşup zaman içinde nasıl geliştiğini anlamak, göç ve yerleşme
şekillerini ortaya çıkarmak açısından önemlidir (Lalueza-Fox, 1997; Kaestle and
Horsburgh, 2002; Cunha et al., 2006). Tarih öncesi toplumların ekonomik, sosyal, hatta
genetik özellikleri; arkeolojik kazılarda elde edilen iskelet kalıntıları incelenerek
belirlenebilir. Antropolojik yöntemlerle kemiklerin ait olduğu bireylerin yaş, cinsiyet ve
boyları tespit edilir, aralarındaki biyolojik yakınlık hakkında bilgi sağlanır (Krogman and
İşcan, 1986; İşcan, 1988; Mergen and İşcan, 2007). Teknolojik imkânlardan faydalanarak,
ileri analizler yapılabilmesi ve araştırmaların kesin ve güvenilir olarak tamamlanabilmesi
ise ancak moleküler genetik analizlerle mümkündür (Pääbo et al., 2004). Arkeolojik
kazılarla elde edilen tarih öncesi farklı toplumlara ait kemik örneklerinin genetik
profillerinin kıyaslanması sonucu, eski toplumların birbiriyle veya modern toplumlarla
aralarındaki ilgi saptanabilir (Jones, 2003; Cooper et al., 2004). Arkeolog ve
antropologların kurdukları hipotezler de moleküler araştırmalarla doğrulanır veya
reddedilir.
Toplumların tarihinin daha iyi anlaşılması için eski biyolojik örneklerde DNA
çalışmalarının bireysel genetik bilgilerin tespitinin ötesine geçerek kişiler arasındaki
akrabalık bağlarının belirlenmesi gerekmektedir (Dudar et al., 2003). Eski kemik
1
örneklerindeki DNA, aynı mezarda grup halinde gömülenlerin akraba olup olmadıklarını
göstererek bu değişimi açığa çıkaracak bir potansiyele sahiptir. Bu sebeple söz konusu
örneklerin DNA analizi ile biyolojik ilişkilerinin belirlenmesi önem taşımaktadır. Defin
alanlarında bulunan kemiklerin ait olduğu bireyler arasındaki akrabalık ilişkileri; tarih
öncesi toplumların kültürü, sosyal yapısı ve aile düzeni ile ilgili veri sağlar (Gross, 1992;
Haimes, 2006). Toplumların tarihlerinde güçlü etkilere sahip olan göç ve aynı soydan
yapılan evlilikler hakkında bilgi verir (Finkler, 2005).
İskelet kalıntılarından DNA elde edilmesi, adli bilimlerde de önem kazanmıştır.
Çünkü kemik ve dişler uzun zaman boyunca korunduğu için analiz etmeye uygun tek
kaynaktır. Yıllarca çeşitli çevre şartlarına maruz kalan kemik örneklerinden DNA
verilerinin elde edilebilmesi, kaybolan veya bilinmeyen bireylerin idantifikasyonunda
değerli ve önemli bir araçtır (İşcan and Altunçul, 2002). Ancak çevresel, bakteriyel ve
post-mortem DNA hasarlarından dolayı, eski kalıntılardan DNA eldesi zordur (Prado et al.,
1997; Capelli et al., 2003; Loreille et al., 2007). Geçmişe ait DNA örneklerinin degrade
yapısından dolayı, tarih öncesi materyalleri genetik olarak tiplemede tercih edilen molekül,
çoğunlukla yüksek kopya sayısından dolayı mitokondriyal DNA (mtDNA) olmaktadır
(O'Rourke et al., 2000).
Bu çalışmanın amacı; Demir Çağı’na ait Van-Yoncatepe bölgesindeki arkeolojik
kazılarda iki farklı oda mezardan çıkarılmış kemiklerin ait olduğu bireylerin olası akrabalık
ilişkilerini genetik analizlerle belirlemek ve bu arkeolojik toplumun sosyokültürel yapısına
bir ışık tutmaktır. Bu amaca yönelik olarak, öncelikle arkeolojik iskeletlerden DNA eldesi
için kullanılan yöntemlerin yerel şartlarda denenmesi, gerekli değişikliklerin yapılarak
protokollerin Türkiye'ye uyarlanması hedeflenmiştir.
2
BÖLÜM 2
GENEL BİLGİLER
Yunanca ‘anthropos’ (άνθρωποϛ, insan) ve ‘logos’ (λόγος, bilim) kelimelerinden
oluşan antropoloji; insanın biyolojik ve kültürel çeşitliliğini inceler, zaman ve mekân
içindeki benzerlik ve farklılıkları açıklamaya çalışır. Geçmiş ve şimdiki zamana, biyoloji,
toplum, kültür ve dile ilgi; antropolojiyi sosyoloji, siyaset bilimi, iktisat, psikoloji ve tarih
gibi birçok başka alana bağlar (Hunter and Whitten, 1993).
Genel antropolojinin dört alt disiplini, sosyo-kültürel, arkeolojik, biyolojik ve
linguistik antropolojidir. Kültürel antropoloji, geçmişteki ve günümüzdeki kültürel
çeşitlilikle ilgilenir. Arkeolojik antropoloji ya da arkeoloji, geçmişe ait kalıntılar elde
ederek tarih öncesi toplulukların sosyal, iktisadi, dinsel ve siyasal yapılarını yeniden
oluşturmaya yardımcı olur. Biyolojik ya da fiziksel antropoloji; zaman ve mekân içindeki
biyolojik çeşitliliği çevredeki farklılaşmalarla ilişkilendirir, fosilleri, genetiği, büyüme ve
gelişmeyi, bedensel tepkileri ve primatları inceler. Linguistik antropoloji ise, çağdaş
dillerin çeşitliliğini belgeler, konuşmanın farklı toplumsal koşullarda ve zaman içinde nasıl
değiştiğini araştırır (Hunter and Whitten, 1993; Kottak, 2001).
FİZİKSEL VE ADLİ ANTROPOLOJİ
Fiziksel antropoloji; fosil kayıtlarının ortaya çıkardığı hominid evrimi
(paleoantropoloji), insan genetiği, insan büyümesi ve gelişimi, insanın biyolojik esnekliği
ve insan dışı hominidlerin biyoloji, davranış ve toplumsal yaşamı olmak üzere farklı ilgi
alanlarına sahiptir. Bunlar, fiziksel antropolojiyi; biyoloji, zooloji, jeoloji, anatomi,
3
fizyoloji, tıp ve halk sağlığı gibi diğer alanlara bağlar (Hunter and Whitten, 1993; Kottak,
2001; Katzenberg and Saunders, 2008). Adli antropoloji ise, fiziksel antropolojinin adli
amaçlı kullanımı olarak tanımlanır ve osteolojiden insan fizyonomisine kadar uzanan bir
dizi konu ile ilgi kurar. Bu bilim dalı her geçen gün daha fazla disiplinler arası hale
geldiğinden diğer uzmanlarla iş birliğinin önemli olduğu unutulmamalıdır (İşcan, 1988;
İşcan and Loth, 1997; İşcan, 2001; Cattaneo, 2007).
Adli antropoloji kavramını ilk ortaya atanlardan biri olan Thomas Dwight’tır. Bu
dönemden sonraki gelişmeler 1970’lere kadar sürmüş; bu süreç içinde yapılan araştırma ve
incelemelerle bazı standartlar ve osteometri teknikleri geliştirilmeye çalışılmış, bu
çalışmalar için materyalin büyük bir bölümünde, bütünlüğünü koruyan insan
iskeletlerinden oluşan koleksiyonlar (örneğin, Terry ve Hamann-Todd koleksiyonu)
kullanılmıştır. Bu tür iskelet koleksiyonları üzerinde yapılan antropolojik incelemelerle,
ölüm sırasındaki yaş, boy, fizikî yapı, cinsiyet, ırk, meslek, alışkanlıklar, ölüm nedeni,
ölüm zamanı, kemik travmaları, kemiklerin kaç iskelete ait olduğu, dişlerle ilgili veriler,
vb. çok sayıdaki sorunun yanıtlanabilmesi için formüller, skalalar, mikro ve
makromorfolojik yöntemlerle radyolojik kriterler geliştirilmiştir. Arkeolojinin bu
aşamadaki katkısı; yanma, alevin geliş yönü, iklim, fiziksel kalıntılar, makro ve
mikroorganizmaların etkisi, arazi yapısı gibi çevre koşullarının tespitinde önem
kazanmaktadır (Krogman and İşcan, 1986; Çöloğlu and İşcan, 1998).
Adli antropoloji sadece bireysel olgularla ilgilenmez, aynı zamanda savaş
kurbanları ve kitlesel felaketlerde de kullanılabilir (Mundorff and Bartelink, 2007).
Antropologlar sıklıkla olmamakla birlikte insan kalıntılarının aranmasında ve elde
edilmesinde görev alabilirler. Özellikle adli antropologlar gömülmüş kalıntıların doğru bir
4
şekilde aranmasını sağlayacak teknikler konusunda bilgi sahibi olmalıdır. Yıllar geçmişse
ve alan ağaçlıksa, bir gömü bölgesini belirlemenin zorluğu açıktır. Alanda yürüme,
fotoğraflama ve diğer arkeolojik yöntemler bilinmeli, bunun yanında ceset arama
köpeklerinin, radarların veya derin olmayan mezarlarda gömülü insan kalıntılarının tespiti
için kimyasal sensörler yoluyla dekompoze koku analizi yapan taşınabilir analitik aletlerin
kullanımı ile ilgili yeni gelişmeler de takip edilmelidir (Stewart, 1979; Cattaneo, 2007).
Fiziksel antropologlar, kısmen/tamamen iskeletleşmiş kalıntılarda, ileri derecede
kömürleşmiş ve gömülmüş bedenlerin yer aldığı olgularda en önemli personeldir. Bu tip
olgularda gözlem yapmak, kaydetmek ve materyali toplamak osteoloji bilgisini gerektirir
(Çöloğlu and İşcan, 1998; Cattaneo, 2007). Adli osteoloji, insana ait olan veya olduğu
sanılan az ya da çok iskeletleşmiş kalıntıları inceleyerek, adli veya sosyal amaçlara yönelik
kimlik tespiti yapan bilim dalıdır (Çöloğlu and İşcan, 1998).
Ölümden sonra geçen süre, aslında adli antropologlar tarafından cevaplandırılacak
en zor sorulardan biridir. Bazen bir olgunun geçmiş toplumlardan mı, yoksa adli bir olgu
mu olduğunu söylemek imkânsızdır. Eğer kuru bir kemik söz konusu ise, bir antropolog
sadece kemiğin arkeolojik, eski veya yeni göründüğü ilgili bir fikir beyan edebilir, kesin
bir şey söyleyemez. Burada sorun, ölüm zamanını ölçmek için kesin bir yöntem
olmayışıdır. Ancak on beş yıl ile elli yıl farkını belirlemek özellikle hukuksal süreçte
önemli olabilir (Krogman and İşcan, 1986; Cattaneo, 2007).
SOSYOKÜLTÜREL ANTROPOLOJİ
İnsan toplulukları, sadece alışılagelmiş toplumsal etkinlikler ve ilişkiler
çerçevesinde değil, aynı zamanda ortak bir kültürel geleneğe açık olma yoluyla örgütlenir.
5
Öğrenme yoluyla aktarılarak paylaşılan kültür, toplumsal yaşama uyum sağlamanın temel
nedenidir. Tylor’a göre kültür, bir toplumun üyesi olarak insanın kazandığı bilgi, inanç,
gelenek, sanatsal faaliyet, hukuk, ahlaki değerler ve diğer yetenek ve alışkanlıkları içeren
karmaşık bir bütündür (Kottak, 2001).
Kültüre temel oluşturan yetenekler; öğrenebilme, simgesel düşünebilme, dili
yönlendirebilme, yaşamlarını örgütlemek ve çevreye uyum sağlayabilmek için gereken alet
ve diğer kültürel ürünleri kullanabilme gibi kabiliyetlerdir. Her çağdaş insan topluluğu,
simgeleştirme ve böylece kendine özgü bir kültür yaratıp onu sürdürebilme yeteneğine
sahiptir. Kültürel özellikler, bir gruptan diğerine yayılabilir. İki ayrı kültür; ödünç alma ve
yayılma yoluyla kültürel deneyimlerini ve uyarlanma araçlarını paylaşabilir. Kültürel
ödünç alma, bütün insanlık tarihi boyunca sürmüştür. Yayılma, göçler ve çok uluslu
toplumlar aracılığıyla pek çok kültürel özellik, uluslar arası boyut kazanır. Aynı toplumun
ya da ulusun insanları, bir kültürel geleneği paylaşsalar da, tüm kültürlerde çeşitlilik
mevcuttur. Geçmişteki ve günümüzdeki bu kültürel çeşitlilik de kültürel antropolojinin
konusudur. (Gross, 1992; Kottak, 2001).
Akrabalık
İnsanlık tarihinin büyük bir kısmında insan yaşamını düzenleyip örgütleyen
akrabalık ve soydanlık sistemleri, antropolojinin önemli bir parçasıdır. Akrabalar, çoğu kez
aynı yörede yaşar, birlikte çalışır, dua eder, kutlama yaparlar (Kottak, 2001).
Türk kültüründe ‘akraba’ kelimesi Arapça ‘karîb’ (yakın) kelimesinin çoğul hali
olan ‘akrîba’dan gelmektedir. Etimoloji sözlüğünde “kan ve evlilik yoluyla birbirine bağlı
kimseler, hısım” olarak tanımlanır. ‘Hısımlık’ da Arapça’dan Türkçe’ye giren bir kelimedir
6
ve “yakınlık, evlilik bağıyla yakınlık” anlamındadır. Anadolu’nun bazı bölgelerinde akraba
ve hısım aynı anlamda kullanılsa da, aralarında kan bağı olanlara ‘akraba’, olmayanların
evlilikleriyle oluşan yakınlıklara ‘hısım’ dendiği bilinmektedir. İngilizce’de ise ‘akraba’,
halk birliği, aile anlamına gelen ‘kin’ sözcüğü ile karşılanır (Ayan et al., 2002).
Farklı kültürlerdeki insanlar, akrabalarını belirtmek için değişik bir terminoloji
kullanırlar. Bu terimler, akrabalığın toplumsal yapılanmasını yansıtır. Belirli bir toplumda
yaşayan insanlar tarafından kuşaklar boyunca geliştirilen yerel bir taksonomi vardır ve
sınıflayıcı bir sistem olan bu terminoloji, insanların benzerlikleri ve farklılıkları nasıl
algıladığına dayanır. En basit sınıflandırma, günümüzde Amerika’da kullanılan Eskimo
sistemi olup, akrabalık ilişkilerinde erkek ve kadınlar eşit derecede (ikiyanlı) izlenir. Türk
toplumunda kullanılan Sudan sınıflandırma sistemi ise daha karmaşıktır, her nesil ve her
birey için ayrı bir terim mevcuttur (Şekil 1). Örneğin; Eskimo sisteminde annenin ve
babanın erkek kardeşi ‘uncle’, kız kardeşi ‘aunt’ olarak isimlendirir. Bu terimler aynı
zamanda ebeveynlerin kardeşlerinin eşleri için de kullanılır. Sudan sisteminde ise bu
bireyler sırasıyla dayı, amca, teyze, hala, enişte ve yenge olarak adlandırılır (Kottak, 2001).
3
5
1
=
2
4
6
Ego
Şekil 1. Sudan akrabalık sınıflama sistemi, 1: Anne (Mother), 2: Baba (Father), 3–4: DayıAmca (Uncle), 5–6: Teyze-Hala (Aunt) (Kottak, 2001).
7
Bazı antropologlar, akrabalık terimlerinin eğilim ve davranışlar için bir ipucu
olduğuna inanırlar. Bazıları bu adlandırmaların kişinin toplumda taşıdığı hakları ve
zorunlulukları yansıttığını düşünürken, üçüncü grup bunun eğilimden ziyade sınıflandırma
yapmayı sağladığını ifade etmektedir (Gross, 1992).
Akrabalık; takımlarda, kabilelerde ve şefliklerde yaşamsal önem taşır. Böyle
kültürlerde akrabalık ve soydanlık, kişiler arası ilişkilerin ve siyasal örgütlenmenin
düzenlenmesinde temel rol oynar (Kottak, 2001).
Aile
Aile, toplumdaki en küçük akrabalık birimi olarak tanımlanabilir ve toplumları
karşılaştırmada kullanılır. Ancak kişiler herhangi bir biyolojik bağ olmadan da ailelere ait
olabilir. Örneğin evlat edinilmiş bir çocuk veya evlilikle bir aileye girmiş kişi gibi.
Dolayısıyla aile, kan bağına veya evlilik ilişkisine dayanan sosyal birimdir. Ailenin en iyi
bilinen şekli; bir veya iki ebeveyn ve onların çocuklarından oluşan çekirdek ailedir. Birçok
toplumda aileler, çevrelerindeki şartlar değiştiğinde yapısal ve fonksiyonel olarak
farklılaşır ve ortama uyum sağlar (Gross, 1992).
Aile ve diğer akrabalık bağları bireye sosyal bir kimlik verir, saygınlık kazandırır.
Ailelerin sosyal durumu, bireylerin eğilimlerini ve birbiriyle ilişkilerini şekillendirir.
Akrabalık bağları bireylerin sahip olacağı olanakları belirlemede önemlidir. Neredeyse her
toplumda var olan miras kuralları; malların ve değerli eşyaların akrabalar arasında geçişini
belirler. Hatta sadece mallar değil, rütbeler, gruplar içindeki üyelikler, siyasal liderlikler
veya özel roller de miras gibi aktarılabilir (Gross, 1992).
Akrabalık sistemlerinin modern toplumlardaki yeri ve önemi üzerine yapılmış
8
sosyolojik çalışmalarla, ailenin topluma değil, toplumun aileye ve akrabalık sistemlerine
biçim verdiği söylenebilir (Ayan et al., 2002).
Aile ve akrabalığın genetik açıdan tanımlanması ise, bireylerin aralarındaki
kalıtımsal benzerliklerle belirlenen biyolojik bağlara dayanır (Finkler, 2005). Tarihi
mezarlarda soy ağacı oluşturmak için yapılan akrabalık analizleri, antropolojide her zaman
eksikliği duyulan bir konudur. Bireylerin veya popülasyonların ilişkilerini belirlemek için
genetiği yansıtan morfolojik özellikler kullanılan birçok girişim mevcuttur. Ancak
benzerlikleri göstermek fenotipik özelliklerin doğası gereğidir. İnsan genom projesine
rağmen birçok fenotipik özelliğin genetik alt yapısı halen bilinmemektedir. Bu sebeple
birey idantifikasyonu ile akrabalığın ortaya çıkarılmasını sağlayan, kodlama yapmayan ve
yüksek polimorfizm gösteren moleküler analizler, tarihî antropolojide büyük bir adımdır
(Hummel, 2003).
Evlilik
Yeni bir çekirdek ailenin temeli olan evlilik, genel olarak erkek ve kadın arasında
kurulan birlik olarak tanımlanabilir. Ancak hiçbir evlilik tanımı, tüm toplumlara kolayca
uygulanabilecek kapsamda değildir. Örneğin; eşcinsel evlilikleri kabul eden bazı uluslar
olduğu gibi, çoğul evlilikleri yasal olarak gören toplumlar da vardır (Kottak, 2001). Birçok
topluma uyan bir tanım, evliliğin ‘çocuğun sosyal kimliğini ve hukuksal durumunu
oluşturan yazılı veya sözlü bir anlaşma’ olduğudur. Bu anlaşma, cinsel birliktelik hakkını
verebilir ve malların paylaşımında düzenlemeleri de içerebilir (Gross, 1992).
Evlilik kültürel olarak evrenseldir ve cinsellik, üreme-çoğalma, ekonomi ve eğitim
olmak üzere dört önemli sosyal işlevi yerine getirir (Kottak, 2001). Evlilik; para, eşya,
9
emek gücü, çocuk hakkı ve sosyal gruplara katılım gibi değerleri içerir. Bazı toplumlarda
damat tarafından gelinin ailesine para ödenmesi yaygındır. Bazılarında da gelinin ailesi, bir
miktar para sağlamak zorundadır (Gross, 1992).
Eşler ve onların akrabaları arasında sosyal olarak anlamlı bir “hısımlık ilişkisi”
kuran evlilik, gruplar arasında anlaşmalarla toplumsal örgütlenmeyi dışarıya yöneltir (Dış
evlilik). İç evlilik ise kişiyi ait olduğu grup içinde evlenmeye zorlar. Bu, kimi zaman aynı
aile içinde bile gerçekleşebilir (Kottak, 2001). Örneğin, çapraz (dayı oğlu- hala kızı, hala
oğlu- dayı kızı) veya paralel (amca kızı- amca oğlu, teyze kızı- teyze oğlu) yeğen
evlilikleri (parallel-cousin or cross-cousin marriage) görülebilir (Ayan et al., 2002). Ayrıca
baldız evliliği (bir adamın, ölmüş karısının kız kardeşiyle evlenmesi) ve/veya kayınbirader
evliliği (bir kadının, ölmüş kocasının erkek kardeşiyle evlenmesi) de mevcuttur (Kottak,
2001). Akraba evlilikleri (consanguineous marriage) tıp alanındaki çalışmalarla bir sorun
olarak kendini gösterse de, kökleri tarihin erken dönemlerine dayanır ve akraba
evliliklerinin ; geleneksel, töresel ve örfî nitelikli kültürel boyutları vardır (Ayan et al.,
2002).
Türk kültüründe İslam öncesi dönemin akraba evliliği açısından farklı
coğrafyalarda ve farklı kültür ortamları ile etkileşimde nasıl bir durum gösterdiğinin
ayrıntılı olarak tespit edilmesi başlı başına bir konudur. Ancak genel olarak Arap kültür
çevresinden farklılıklar gösterdiği, İslamiyet’in kabulü ile bu iki kültür çevresinin önemli
düzeyde etkileşime girdiği bazı kaynaklarda belirtilmektedir. Güncel araştırma verileri,
özellikle Anadolu’da dikkate değer oranda akraba evliliğine işaret etmektedir. İlk bakışta
bu oranın yüksekliği, kentleşme, eğitim ve refah düzeyinin düşük olması ile açıklanabilse
de, daha çok kültürel nedenli olduğu izlenimi doğmaktadır (Ayan et al., 2002).
10
Akraba evliliklerinin oranı, endüstrileşmiş Batı toplumlarında çok düşük olmasına
rağmen; Türkiye bazı Asya ve İslam ülkeleri gibi akraba evliliğinin yüksek olduğu ülkeler
arasındadır. Gerek etnik köken, gerekse bireylerin yetiştiği yörelere göre akraba evliliği
oranlarında önemli farklılıklar bulunması, bu tip evliliklerin nedenleri arasında yöresel ve
kültürel geleneklerin önemli bir yer tuttuğuna işaret etmektedir (Ayan et al., 2002).
Ensestin yasaklanması ve dış evlilik kuralları, insanları eş seçmek için aile dışına
yönlendirir. Bu durum, yeni hanelerin oluşumuna sebep olur. Her toplumda yeni hane
oluşturmak için kurallar veya tercihler vardır. Evlilik sonrası yerleşme kuralları, evlenen
çiftlerin nerede yaşayacakları hakkındaki tercihlerini veya zorunluluklarını belirler.
Patrilokal (erkek tarafında) yaşam, damadın ailesi ile beraber veya onun ailesine yakın
oturmaktır. Bu, geleneksel Çin toplumunda tercih edilen bir kuraldır. Matrilokal (kadın
tarafında) yaşam ise, gelinin ailesiyle birlikte veya onun ailesine yakın oturmaktır.
Arizona’da yaşayan Batılı Apaçi Kızılderilileri, matrilokaldir. Günümüzde neolokal (yeni
bir yerde) yaşam da görülmektedir; çiftler hem gelin hem de damadın ailelerinden uzakta,
bağımsız bir yerde oturmayı tercih ederler (Gross, 1992).
Arkeolojik gruplar, özellikle avcı-toplayıcı toplumlar, düşük düzeyde çeşitliliğe
sahiptir; çünkü az nüfusları, kendi aralarında çiftleşmeye ve yüksek genetik kaymaya sebep
olur (Kaestle and Horsburgh, 2002). Bunun yanında akraba evlilikleri, alel frekanslarının
Hardy-Weinberg dengesinden sapmaya neden olabilir (Gerstenberger et al., 1999).
MOLEKÜLER ANTROPOLOJİ
Organizmalardaki büyük moleküllerin yapı ve fonksiyonlarını inceleyen moleküler
biyoloji, elde ettiği bilgilerle birçok bilimsel alana katkı sağlar veya yeni bilim dalları
11
oluşturur. Örneğin moleküler psikiyatri, beyindeki moleküllerin işlev bozukluğunu
inceleyerek mental hastalıkları teşhis ve tedavi için girişimlerde bulunmayı hedefler.
Moleküler analizler, eski ve modern toplumlar arasındaki evrimsel bağlantıları veya
toplum içindeki yakınlık ilişkilerini belirlemeye yarayarak, antropolojiye de yardımcı
olmaktadır. Genetik yapıdaki benzerlik veya farklılıklar, insan gruplarının coğrafik
kökenleri hakkında bilgi verir. Böylece antropolojinin ilgi alanı olan göç ve yerleşme
özelliklerinin zaman içinde gelişimi takip edilir; toplumların yaşayış düzeni, beslenme
alışkanlıkları ve ölü gömme gelenekleri ile ilgili veri sağlanır (Brown, 2006). Zaman ve
kültür açısından farklı olan ölü gömme, birçok sosyal, fiziksel, dini ve ekonomik faktörden
etkilenir. Askeri mezarlıklar, kimsesizler mezarlığı, kilise mezarlıkları, köy mezarlıkları,
aile mezarlıkları, anıtmezarlar, vb. uzun bir liste insanların kendilerini kimliklendirdikleri
veya organize ettikleri çeşitli yolları (akraba grupları, din, sosyal sınıf veya meslek)
yansıtır (Stodder, 2008).
Sosyal bilimlerle modern biyolojinin kesişim noktası olan moleküler antropoloji,
son yıllarda ortaya çıkmış bir bilimsel alandır. Protein ve nükleik asitler gibi büyük
moleküller kullanıldığı için ‘moleküler’, toplumların tarih öncesindeki yapılarıyla ilgili
bilgiler elde etmeye yaradığı için ‘antropoloji’ kelimeleri ile ifade edilir. Moleküler
antropoloji, ilk kez 1962’deki bir antropoloji konferansında biyokimyager Emile
Zuckerkandl tarafından “biyomoleküllerin yapısındaki farklılıklardan yararlanarak insan
evrimini incelemek” tanımı ile kullanılmıştır. Buradaki çelişki, alanın bir çeşit antropoloji
bilimi gibi durmasına karşılık, aslında antropolojik sorulara uygulanan biyokimya
teknolojisi olmasıdır. Marks’a (2002) göre; moleküler antropoloji, sadece moleküler
teknikleri antropolojiye uyarlamaktan çok, antropolojik bilgiyi moleküler verilerle
12
birleştirdiğinde geçerli ve kalıcı olur.
Paleontoloji ve arkeolojiye dayanan geleneksel antropoloji, artık günümüzde
moleküler biyolojiden de yarar sağlamaktadır. Moleküllerle ilgili bilgiler, paleontoloji ve
arkeolojinin önemini değiştirmez, daha fazla veri sağlayarak bu bilim dallarıyla beraber
antropolojiye katkıda bulunur (Marks, 2002; Cunha et al., 2006). Bazı olgularda sadece
genetik analiz yapılması yeterli olmaz, çünkü moleküler araştırmalar, antropolojik verilere
ihtiyaç duyar. Yaş veya boy gibi önemli biyolojik bilgileri sağlamak genetik analizlerle
mümkün değildir. Antropolojik kimliklendirme, DNA laboratuvarları tarafından analiz
edilecek örneklerin sayısını azaltır. Bu sebeple pozitif idantifikasyon yapılabilmesi için
antropoloji ve genetik, arkeolojik verilerle birlikte kullanılmalıdır (Imaizumi et al., 2002;
Capelli et al., 2003; Cunha et al., 2006; Christensen et al., 2007).
Her türlü arkeolojik kalıntının moleküler tekniklerle analiz edildiği bu alan, çeşitli
araştırmacılar tarafından “moleküler veya biyomoleküler arkeoloji”, “biyoarkeoloji” ya da
“arkeogenetik” olarak da adlandırılmaktadır. Özellikle nesli tükenmiş canlıların
fosillerinden elde edilen genetik özelliklerin modern örneklerle kıyaslanması için yeni bir
yoldur. Biyomoleküler arkeoloji; fizik, kimya, jeoloji ve moleküler biyoloji ile disiplinler
arası çalışmalar yaparak evrim, göç, beslenme, evcilleştirme gibi konularda önemli bilgiler
sağlarken, paleopatoloji (hastalıkların tarihinin belirlenmesi) ile de ilgilenir (Capelli et al.,
2003; Renfrew, 2003; Stone, 2008).
Antropoloji ve arkeoloji bilimleri, çeşitli amaçlarla gerçekleştirilen moleküler
düzeyde analizlerle daha ayrıntılı ve kesin bilgiler elde etmeyi sağlar. Örneğin; modern
insanın evrimi ve göç yollarının araştırılması, tarih öncesi toplumların sosyal yapıları,
kültürel özellikleri, ekonomik düzenleri, beslenme alışkanlıkları, sağlık sorunları, yaşayış
13
tarzları, geleneklerinin anlaşılması, hayvanların evrimi ve birbiriyle filogenetik
yakınlıkları, evcilleştirilme zamanları, beslenme alışkanlıkları, bitkilerin evrimi ve
birbiriyle filogenetik yakınlıkları, Neandertaller ve modern insanları da içeren nesli
tükenmiş ve yaşayan canlıların filogenetik ilişkileri; moleküler tekniklerle araştırılır.
Bunlardan her biri kendi alanında özel ve önemli veriler sağlayarak genel anlamda
antropoloji ve arkeolojiye destek verir (Tablo 1) (Marks, 2002; Stone, 2008).
Tablo 1. Biyoarkeoloji uygulamaları, antropolojiye katkısı ve moleküler analiz yöntemleri.
Uygulama
Genetik cinsiyetlendirme
İnsana ait olmayan aDNA
Anne/baba tarafından
akrabalık
Katkı
Evlilik ve ölü gömme
gelenekleri, cinsiyetlere
göre ölüm, hastalık,
beslenme ve statü oranları
Avcılık, beslenme
davranışları, bitki ve hayvan
evcilleşmesi, çevresel
rekonstrüksiyon
Sosyal yapı, statü, evlilik,
ölü gömme gelenekleri, göç
Moleküler İşaret
Cinsiyet kromozomları
Mitokondriyal DNA,
kloroplast DNA’sı,
otozomal DNA
Mitokondriyal DNA,
otozomal DNA, cinsiyet
kromozomları
Popülasyon devamlılığı ve Tarih öncesi toplumların
Mitokondriyal DNA,
yer değiştirme
göçü, gruplar arası ata-torun otozomal DNA, cinsiyet
ilişkileri, benzer veya farklı kromozomları
morfolojik ve kültürel
kalıntılardan eski gruplar
arası ilişkiler
Filogenetik
Tür evrimi, insanın kökeni
Mitokondriyal DNA,
rekonstrüksiyon
otozomal DNA, cinsiyet
kromozomları
(Kaestle and Horsburgh, 2002)
BİYOARKEOLOJİK ÖRNEKLER VE GENETİK MATERYAL
Arkeolojik kazılarla elde edilmiş kalıntılara veya müzelerde korunan nesli tükenmiş
canlılara ait her türlü biyolojik örnekte genetik materyalin halen var olduğu ilk kez 1984’te
14
tespit edilmiştir (Higuchi et al., 1984). Ardından çeşitli araştırmacılar birçok farklı tarihsel
örnekle çalışmalar yaparak, hem yeni bir bilim dalının oluşumuna katkı sağlamış, hem de
disiplinler arası işbirliğinin önemini ortaya çıkarmışlardır.
Uzun yıllar öncesine ait biyolojik örneklerdeki DNA, ‘geçmişten kalan, geçmişe
ait’ anlamında ‘ancient’ olarak ifade edilmekte ve aDNA kısaltmasıyla kullanılmaktadır
(Herrmann and Hummel, 1994). Bazı Türkçe kaynaklarda aDNA için, ‘eski’ anlamı
taşıyan ‘antik DNA’ kelimesi kullanılmıştır (Akkaya, 2003; Gökçümen, 2004; Güral,
2007). Ancak kelime, Orta Çağ öncesi tüm zaman anlamına gelen Antik Çağ’ı ifade
ettiğinden, Türkçe’de ‘antik DNA’ teriminden bahsedilmesi, Antik Çağ’a ait DNA’nın
anlaşılmasına neden olabilecektir. Bu sebeple kullanılması tercih edilmemiştir. Çalışmanın
devamında biyoarkeolojik örneklerdeki DNA’yı ifade etmek amacıyla, ‘geçmişe ait DNA’,
‘eski DNA’ terimleri veya ‘aDNA’ kısaltması kullanılmıştır.
Tarih boyunca çeşitli çevre şartlarına maruz kalmış biyolojik örneklerdeki nükleik
asitler, post-mortem hasarlar sebebiyle bozulmuş ve parçalanmıştır. Ancak bu engelleri
ortadan kaldırarak daha verimli ve güvenilir DNA analizleri yapabilmek için bilim
dünyasında geliştirilen yeni tekniklerle araştırmalar devam etmektedir (Kaestle and
Horsburgh, 2002). Günümüzde diş, kemik, korunmuş yumuşak dokular başta olmak üzere
arkeolojik kazı alanında bulunabilen veya müzelerde korunmuş olan canlılara ait deri ve kıl
gibi müze örnekleri (Cooper, 1994; Wisely et al., 2004; Stuart et al., 2006), taşlaşmış gübre
(Poinar et al., 1998; Reinheird et al., 2007), geçmişe ait bitkiler (Gugerli et al., 2005),
polenler (Parducci et al., 2005), bitki tohumları (Poinar et al., 1993; Rollo et al., 1994a) ve
fosillerden (Golenberg, 1994; Taylor and Swann, 1994) başarıyla DNA elde edilebilmesi
mümkündür. aDNA çalışmaları göz önüne alınırsa, her hücredeki yüksek mitokondriyal
15
ve/veya kloroplast DNA kopya sayısı, bozulmamış ve parçalanmamış DNA kısımlarının
eldesinde çekirdek DNA’sına oranla daha fazla başarı sağlar. Bu sebeple bugüne kadar
çoğu aDNA çalışması da mitokondriyal DNA üzerinde yoğunlaşmıştır. Ancak geliştirilmiş
tekniklerle bazı araştırıcılar eski çekirdek DNA’sı dizininde de başarı sağlamışlardır
(Clisson et al., 2002; Wisely et al., 2004; Stuart et al., 2006). Bu, aDNA ile test
edilebilecek potansiyel hipotezleri önemli ölçüde genişletir (Kaestle and Horsburgh, 2002).
Tarihsel biyolojik materyal, diyagenezin etkisiyle zaman içinde kendine özgü
kimyasal ve/veya yapısal özelliklerini kaybeder. Diyagenez, gömüldükten sonra biyolojik
materyalde başlayan fiziksel, kimyasal veya biyolojik her türlü değişimi ifade eder.
Yüksek sıcaklık ve yeryüzündekinden düşük, oldukça sabit nem koşulları, diyagenezi
hızlandırır (Bollongino et al., 2008). Bunun dışında radyasyon (esasen UV), pH ve
oksidatif ajanlar da diyagenez altındaki aDNA’yı etkiler. Değişik dokular, farklı hücreler
ve hücre içeriklerinden dolayı, diyagenezden farklı derecelerde etkilenir (Herrmann and
Hummel, 1994). En erken dekompoze olan dokular sırasıyla sindirim sistemi organları;
ardından kalp ve diğer dolaşım sistemi organları; sonra akciğerler, karaciğer ve safra; bunu
takiben beyin ve sinir sistemi; kas sistemi ve en son iskelet sisteminin kolajen içeren bağ
dokusudur (Stodder, 2008). Özellikle kemikte bu değişimi açığa çıkaracak belirli
parametreler söz konusudur. Kemiğin kolajen içeriği, histolojik bütünlüğü, porozitesi (su
alabilme kapasitesi) ve kristalliğinin araştırılması bu açıdan yarar sağlar. Kolajen içeriği ve
histolojik yapı diyagenezin etkisi olarak bilinirken, porozite ve muhtemelen kristallik
kemiğin çevresine cevabını değiştiren faktörlerdir (Hedges, 2002).
Çevrenin, materyalin fiziksel ve kimyasal korunmasına etkisinin tespit edilmesi
amacıyla yürütülen çalışmalar biyomoleküler araştırmalarda önemli bilgiler sağlar ve
16
degradasyon mekanizmalarının anlaşılması, toprak özelliklerinin bilindiği durumlarda
kemiğin muhtemel korunmasının tahmin edilmesi için kullanılabilir. Ortamın pH’ı kemik
diyagenezinde büyük rol oynar. Aşındırıcı (korozif) topraklardan elde edilen kemiklerde
hem makroskobik hem de biyomoleküler seviyede büyük hasar görülür. Kuzey İsveç,
Finlandiya ve İskoçya’nın bazı bölgelerindeki bu tip topraklarda hemen kazı yapılarak
örneğin alınması önerilir (Nielsen-Marsh et al., 2007). Arkeolojik kazılarda görev alanlara
göre, kumlu birikintilerden ve/veya sulu düzlüklerden elde edilen kemikler genellikle daha
poröz ve kolay ufalanır durumdadır. Çok düşük sıcaklıklar ve kuru bir ortam ise
mikrobiyal hasarı engeller (Hedges, 2002). Soğuk, kuru ortamlardan elde edilen örneklerde
DNA hasarının az olduğu, birçok araştırmacı tarafından belirtilmektedir (Höss et al., 1996;
Wayne et al., 1999; Ricaut et al., 2005; Bollongino et al., 2008). Biyoarkeolojik
örneklerde DNA’nın korunması esas olarak örneğin yaşından çok, çevresel faktörler ile
ilgilidir (Burger et al., 1999; Ricaut et al., 2005; Gamba et al., 2008). Pääbo ve
meslektaşları (1989), örneğin yaşı ile DNA hasarı arasında bir ilgi bulamamıştır. Tuross
(1994) ise örneğin yaşı ve DNA eldesi arasında ters bir ilişki bulunduğunu belirtmiştir.
Kemik
Genellikle en uygun aDNA kaynağı olarak bilinir. İzolasyon ve amplifikasyon
başarısı doku tipinden bağımsız olmakla birlikte (Höss et al., 1996; O’Rourke et al., 1996);
deneysel çalışmalar, kemikten elde edilen DNA'nın yumuşak dokulardakinden fazla
olduğu düşüncesini desteklemektedir (Tuross, 1994).
Vücutta kafatası, kaburga gibi yassı kemikler ve kol-bacak kemikleri gibi uzun
kemikler bulunur. Uzun kemiklerde epifizlerde süngerimsi (trabeküler), diyafizde ise sıkı
17
(kompakt, kortikal) doku yer alır. Lee ve meslektaşlarına göre (1991), kaburgalar gibi
süngerimsi kemikler, sıkı kemikten 10–20 kat daha fazla DNA eldesi sağlar, ancak
kontaminasyona açık olması sebebiyle özgün olmadığı da tartışılmaktadır (Parsons and
Weedn, 1996; Parr et al., 1996; O’Rourke et al., 1996). Bu sebeple geçmişten kalan
kemiklerde daha yoğun, sert, kortikal tabaka varlığı önemlidir (Cooper, 1994).
Hagelberg ve meslektaşları (1991) kemik örneklerinin mikroskobik olarak
korunmuş olmasıyla DNA eldesinin arasında bir ilgi olduğunu; ancak örneğin yaşıyla bir
bağlantısının bulunmadığını gözlemlemişlerdir. Amplifikasyon başarısı ile kemiğin yaşı
arasında bir ilgi kurulmamıştır (von Wurmb-Schwark et al., 2003).
İskelet dokularından birçok şekilde örnek alınabilir. Küçük parçalar kullanılabilir
veya uzun kemiklerde delik açılarak ya da orta kısımdaki sıkı dokudan kesit alınarak
incelenebilir (Motoc et al., 2009). Bu sırada lezyonlu iskelet örnekleri kontaminasyona yol
açacağı için lezyonsuz olanlar seçilmelidir. O’Rourke ve meslektaşları (2000), küçük
kaburga parçaları seçilmesini tavsiye etmektedir, çünkü bunlar her birey için çok sayıdadır,
en az morfolojik ve paleopatolojik öneme sahiptir ve sıklıkla müze veya arkeolojik
koleksiyonlarda kullanılmaz.
Kemikler çok çeşitli şartlara maruz kalır ve bunlardan birçoğu kemiğin yapısını ve
bileşimini önemli derecede değiştirir (Stout, 1978). Kemik degradasyonu iki olayla
gerçekleşir: biri mikroorganizmalar tarafından hızlı gerçekleştirilir, diğeri ise daha yavaş
olan kimyasal degradasyondur (Smith et al., 2003).
Hidroksiapatit (HA) ve kolajen, kemiğin kendine özgü yapısında bulunan iki
moleküldür ve DNA çalışmalarında etkili olduğu bilinmektedir. Bu sebeple kemiklerdeki
DNA’nın varlığı, hidroksiapatit ve kolajenin tespitiyle belirlenebilir (Götherström et al.,
18
2002). DNA’nın hidroksiapatite bağlanarak bozunmadan kaldığı belirlenmiştir, moleküler
biyolojide nükleik asitlerin bağlanması için kullanılır (Sambrook and Russel, 2001).
Hidroksiapatit veya hidroksilapatit [Ca10(PO4)6(OH)2], bir inorganik mineral olarak
kemiğin %70’ini oluşturur. Ayrıca dişte de bulunur. %39.8 kalsiyum ve %18.5 fosfor içerir
(Burton, 2008). Geçmişe ait kemiklerde DNA’nın varlığı; hidroksiapatitteki kristallik
(degradasyon) artışı ile ters ilişkili, kolajen korunması ile doğru orantılıdır (Götherström et
al., 2002). Kemiğin asidik ortamlarda makroskobik ve mikroskobik hasara daha fazla
uğramasının sebebi, var olan mikrobiyal aktivitenin hidroksiapatitin bruşite
parçalanmasına sebep olmasıdır. Hidroksiapatit ayrıca kendisi için gerekli olan 7-7.5 pH,
6-7’ye indiğinde oktakalsiyum fosfata dönüşür (Jackes et al., 2001). Hidroksiapatitin en
stabil hali pH 7.8’de görülür. Ortamdaki su, apatiti parçalamada en büyük etkendir. Asidik
topraklar da kemiğin yapısındaki kalsiyum fosfatı çözerek, apatiti parçalar. Kireçtaşı gibi
alkali çevre ise asitin degradatif etkilerini tamponlar ve kemik apatitini korur. Diğer
yandan alkali ortamlarda ve karbondioksit varlığında apatitin parçalanmasını arttıran
bikarbonat oluşur. Aynı ortamdan alınan kemik örneklerinde farklı korunma durumları da
görülebilir. Örneğin kemiğin yanında bulunan bir kireçtaşı veya çömleklerin varlığı,
kemikteki apatiti korumuş olabilir, mağaralarda kenarlara yakın duran örnekler
duvarlardaki sızıntılardan dolayı daha fazla bozulabilir ya da bakır içeren metal nesneler
bakteriyel büyümeyi engellediği için, bu tip nesnelerle birlikte gömülmüş kemiklerde iyi
korunma özellikleri görülebilir (Bollongino et al., 2008).
Kolajen tip I, kemiğin organik fazını oluşturan ana proteindir. Bu fibriler proteinin,
kemiğin hidroksiapatitine yüksek bir afinitesi vardır. Kanda çözünmüş halde bulunan
hidroksiapatit minerali, organik matriks sentezlendiğinde katlanan kolajen molekülleri
19
arasındaki boşluklara yerleşir (Schweitzer et al., 2008). Bu sebeple kolajenin korunması,
hidroksiapatitin korunması ile ilgilidir (Götherström et al., 2002). Kolajenin yapısal
özelliği olarak aminoasit bileşimi sınırlı tutulur ve her üç aminoasitten sonra glisin yer alır.
Kolajen belirteci olarak aminoasit analizleri bu sebeple %30 glisin oranı verir. Üçlü helikal
peptid zincirlerinden meydana gelen molekül, belirli aralıklarla birbiri üzerine katlanarak
proteine suda çözünmeme özelliği veren moleküler çapraz bağlar oluşturur. Bu yapı,
elektron mikroskobunda bantlar olarak gözlenir, ancak degradasyonda inter moleküler
çapraz bağlar kırıldığı için aynı görüntü alınamaz (Schweitzer et al., 2008). Kolajen çapraz
bağlarla güçlü bağlandığında, hidrolitik kayba karşı stabilize olabilir (Hedges, 2002).
Arkeolojik kemik örneklerinde DNA’nın varlığı ile kolajen miktarı arasında benzer
bir ilgi bulunmuştur (Götherström et al., 2002). Kemikte yüksek miktardaki kolajen kaybı,
mikrobiyal zararlarla ilişkilidir (Hedges, 2002). Kemiğin mikro yapısının ölüm sonrasında
bozulması, mantarların geçitler açması değil, bakteriyel hasardır. En çok bilinen
Clostridium histolyticum, kolajeni parçalayan bir enzim olan kolajenaz üretir ve kemikteki
kolajenin yıkımına sebep olarak histolojik yapıyı bozar (Jackes et al., 2001). Mikro
organizmalarla ciddi anlamda bulaşmış bir kemikte en az %80 kolajen kaybı görülür. Çok
sıcak iklimlerden elde edilen çok eski kemiklerde ise, ısıya duyarlı kolajen kaybı
mekanizmaları kaçınılmazdır, çünkü sıcaklık kolajenin maksimum miktarda kalmasında
büyük bir faktördür. Bunlar, kemiğin histolojik yapısını da önemli ölçüde etkiler. Kolajen
içeriği az olan kemiklerde zayıf, doğal değerlere yakın kolajen miktarına sahip kemiklerde
ise iyi bir histolojik korunma gözlenir (Hedges, 2002). Ancak yapısal olarak çok iyi
korunmuş bir kemikte kolajen kaybının hızlı olduğu örnekler de söz konusudur (Smith et
al., 2002). Kemikteki ağırlık kaybı (~%20) ve porozite artışının (~%50) çoğu, kolajen
20
kaybına bağlanır (Hedges, 2002). Arkeolojik kemiklerde porozite arttıkça yoğunluk azalır,
bu canlı kemik dokusundakinin tersidir, yoğunluk arttıkça porozite artar, çünkü poröz
kemiğin dış yüzeyinde kalsiyum karbonat birikir (Jackes et al., 2001). Porların
boyutlarında meydana gelen değişme olan porozite, diagenezle ilgili bir belirteçtir
(Nielsen-Marsh and Hedges, 1999) ve DNA eldesinde başarı için yardımcıdır (Gilbert et
al., 2005). Kemikteki bir başka mineral bağlayan protein olan osteokalsin de uzun süreli
stabilitesinden dolayı aDNA çalışmalarında analiz edilen bir moleküldür (Nielsen-Marsh et
al., 2005; Buckley et al., 2008).
Arkeolojik kemiğin histolojisinin, diğer analizlerle birlikte değerli bir yöntem
olduğu söylenebilir (Jans et al., 2002). İskelet kalıntılarında histolojik korunmanın
amplifiye edilebilir DNA’nın en iyi belirteci olduğu çeşitli araştırmacılar tarafından
bildirilmiştir (Colson et al., 1997; Al-enizi et al., 2008).
Bir çalışmada Yakın Doğu (Kıbrıs, Gürcistan, İsrail, Suriye, Türkiye) örneklerinin
Avrupa’ya göre daha poröz ve yumuşak yapıda olduğu, DNA elde edilen bazı örneklerin
amplifikasyonunun zor olduğu belirlenmiş, Avrupa için amplifikasyon başarısıyla toprak
tipi arasında bir ilgi tespit edilmiştir. Kireçli topraklardaki örneklerden başarıyla DNA
çoğaltılabilmiş, düşük pH’lı topraklarda DNA eldesi zorlaşmıştır (Bollongino et al., 2008).
Kemikte en fazla bulunan elementler olan kalsiyum ve fosfor dışında, eser element
analizleri yapılırsa paleodiet hakkında bilgi edinilir. Stronsiyum, baryum, kurşun, çinko;
kolaylıkla kalsiyumun yerine geçebilir ve kemikte birikir. Analizler, antropologlara tarih
öncesi canlıların herbivor veya karnivor oldukları ile ilgili bilgi verir (Burton, 2008).
Paleodiet araştırmalarında stabil azot izotopları da kullanılabilir. Kemik ve dişlerin mineral
kısmından karbon, oksijen izotoplarının analizi de mümkündür (Katzenberg, 2008).
21
Diş
Diş örnekleri, kemiğe göre kontaminasyona daha az eğilimlidir veya kontamine
olmuşsa dekontamine edilmesi daha kolaydır (Gilbert et al., 2005; 2006). Dişten nükleer
DNA’nın amplifikasyon başarısı, kemiğe göre daha yüksek olarak tespit edilmiştir (Ricaut
et al., 2005; Zierdt et al., 1996; Meyer et al., 2000). Nelson ve Melton (2007), yüz on altı
iskelet örneğinde femurdan sonra diş örneklerinden başarıyla (%90) DNA profili elde
etmiştir. Alakoç (2007) tarih öncesi Van-Yoncatepe toplumunun arkeolojik diş
örneklerinden DNA analiz etmiş ve sonuçları odontometrik verilerle karşılaştırmıştır.
Dişin taç ve kök olmak üzere iki temel kısmı; mine, dentin, sement ve pulpadan
oluşan dört ana doku tipi vardır. Taçın görülen kısmı sert mine tabakası ile kaplıdır.
Minenin %97’si inorganiktir, hidroksiapatit içerir. Bunun altında yarı sert doku olan dentin
bulunur. Dentinde kemikten daha fazla kalsiyum fosfat (%75), daha az kolajen (%18)
vardır. Sement ise, kök yüzeyini örten ince tabakadır. Dişin özünde kan damarları ile
sinirlerden oluşan yumuşak doku, pulpa bulunur ve genetik materyal açısından dişin en
önemli kısmıdır (Scott, 2008).
aDNA kaynağı olarak dişi kullanmanın, her birey için çok sayıda ve bağımsız
örnek olmasından dolayı avantajı vardır. O’Rourke ve meslektaşlarının (2000) belirttiğine
göre, dişteki çürük DNA kontaminasyonuna izin verdiği için sağlam dişler seçilmelidir.
Çıkmamış dişleri kullanmak riski arttırır.
Dişten DNA izolasyonunda; dişi toz haline getirme, kesme veya diş kanalı yoluyla
pulpaya girme gibi farklı hazırlama yöntemleri kullanılabilir (O’Rourke et al., 2000). Diş
tozunun rengindeki farklılık amplifikasyon başarısıyla ilgili değildir (Drancourt et al.,
1998). Tüm dişi toz haline getirmek; pulpa yuvasına giriş için kesilen dişe göre daha fazla
22
DNA eldesi sağlar, ancak daha fazla degrade DNA elde edilir (Smith et al., 1993). Dişi
kesmek, pulpayı aldıktan sonra dişi yapıştırarak birleştirmeyi mümkün kılar, dolayısıyla
daha az tahrip edicidir (Drancourt et al., 1998; Merriwether et al., 1994). Diş kanalı
yoluyla pulpaya girmek ise, iç dokunun etkin bir şekilde alınmasının zor olmasından
dolayı, Smith ve araştırıcıları (1993) tarafından önerilmemektedir.
Sıcaklık (4–37° C), nem (%20–%98), pH (3.0–10.0), deniz suyuna maruz kalma,
bahçede, toprakta veya kumda gömülme gibi çevresel faktörlerin, diş örneklerinden elde
edilen DNA miktarını önemli derecede etkilemediği bildirilmiştir (Schwartz et al., 1991).
Yumuşak Dokular
Tarihsel biyolojik örneklerden gerçekleştirilen ilk DNA çalışmalarında yumuşak
dokular tercih edilmiştir (Higuchi et al., 1984; Pääbo, 1985). Sert dokulardan tipleme
yapmanın zor olduğu durumlarda, varsa yumuşak dokular kullanılarak DNA analizi
gerçekleştirmek mümkün olabilir. Bir çalışmada nemli bir ortamda bulunan kafataslarından
DNA elde edilememiş, kafatası içinde çürümeye başlamış beyin dokularından DNA analiz
edilebilmiştir (Graw et al., 2000).
Kaynak olarak yumuşak doku kullanılırsa, kontaminasyonu azaltmak amacıyla
yüzey altı dokusu tercih edilmelidir. Dondurma, tek başına veya süblimasyon (kurutma) ile
birlikte yumuşak dokuların korunması için idealdir (Nielsen et al., 1994). Kurutma işlemi
DNA'yı hidrolitik hasarlardan koruyabildiği için (oksidatif hasarlara hala açık olduğu
halde) kurutulmuş yumuşak doku, daha iyi bir aDNA kaynağıdır. Genellikle kurutulmuş
dokulardan elde edilen aDNA, kemiklerden elde edilenden daha düşüktür ve inhibitörlerin
de izolasyonu fazladır (O’Rourke et al., 2000). Kuru örneklerin avantajı, suyun
23
yokluğudur. Çünkü su bir reaktant/ortam olarak DNA’ya zarar verir. Suyun yokluğunda
mikrobiyolojik fonksiyonlar, enzim degradasyonu, hidroliz ve diğer kimyasal zararlar çok
yavaşlar (Sensabaugh, 1994).
Grönland’de Qilakitsoq yerleşmesinde bulunan mumyalaşmış beden; kazı ve örnek
alınması sırasında hiç korunmamış, ayrıca DNA çalışmaları başlatılmadan önce on yıldan
fazla oda sıcaklığında kalmıştır. Buna rağmen uygun protokollerle deriden DNA elde
edilebilmiştir (Nielsen et al., 1994).
Diğer Biyoarkeolojik Örnekler
Dökülen saçlar, DNA içeren kökü değil, sadece gövdeyi içerdiği halde, adli
olgularda kullanılmaktadır (Wilson et al., 1995). Modern adli örneklerde saçın
gövdesindeki DNA miktarının birkaç haftada 1 ng'ın -PCR tespit sınırının- altına indiği
düşünüldüğünde; eski saç örneklerinden aDNA elde etme olasılığının da azaldığı söylenir
(O’Rourke et al., 2000). Ancak saçlar ya da kıllar, kemiğe ve dişe göre kontaminasyona
daha az yatkın olduğundan geçmişe ait DNA çalışmalarında daha güvenilir bir materyal
olabilir (Willerslev and Cooper, 2005).
Koprolit (fosilleşmiş dışkı), nükleik asit izolasyonu için potansiyel taşımaktadır
(Chobe et al., 1997). Koprolitlerden elde edilen DNA dizinleri, tür veya birey
idantifikasyonu sağladığı gibi, beslenme konusunda da bilgi verir. DNA’nın feçeste aşırı
miktardaki şekere bağlanması, DNA’yı stabilize ederek degradasyonu önler, ancak bu
durum aynı zamanda PCR’ı da inhibe eder (Poinar et al., 1998). Nesli tükenmiş ya da
günümüze kadar gelmiş hayvanlardan ikisini de bulmak veya onlardan doku örnekleri
almak sıklıkla zordur. Ancak tüm hayvanlar yabani hayatta arkalarında kolaylıkla
24
toplanabilecek fekal kalıntılar bırakır ve bunlar çoğunlukla fosil kayıtlarda belirlenir.
Hayvanların boşaltım maddeleri, hem kendilerine, hem de sindirdikleri diğer hayvan ve
bitkilere ait DNA içerir. Dolayısıyla yabani hayvanlardan noninvazif yöntemlerle rutin
örnek almak için feçes kullanılabilir. Arkeolojik kazılarda bulunan koprolitlerden de
benzer şekilde DNA analizleri yapılabilir. Moleküler koproskopi ile beslenme
alışkanlıkları ve son buzul döneminden önce, dönem boyunca ve sonrasındaki çevre
çalışılabilir. Araştırmalar insan koprolitlerine kadar genişletilebilir, böylece sadece
sindirilen bitkiler değil, hayvanlar da belirlenebilir (Pääbo et al., 2004).
Jeolojik kayıtlar, yaşamda var olmuş ancak şu anda bulunmayan her türlü bilgi için
tek delildir. Hayvanlara ve bitkilere ait fosillerden moleküler veriler elde edilebilir.
Fosillerdeki moleküllerin, hücrelerin ve dokuların kimyasal özellikleri; korunma kadar
diyagenez ve degradasyonun kimyasal ve moleküler süreci ile ilgili bilgi sağlar.
Paleontoloji kapsamında organizmaların kalıntıları, kısımları ve ürünlerini inceleyen
tafonomi de yerini almıştır (Schweitzer et al., 2008). Tafonomi, ölümden sonra
organizmayı değiştiren, insan, hayvan veya doğal etkenlerin sebep olduğu fiziksel ve
kimyasal olaydır ve örneklerin alınmasıyla laboratuvar analizi arasında kritik bir bağ
oluşturur (Stodder, 2008). Diyagenez ile ilgili faktörler tafonomi içinde incelenir
(Schweitzer et al., 2008). Herbaryum örnekleri, kimyasal koruyucularla veya yüksek
sıcaklık ile muamele edilmeyip, havada kurumaya bırakıldığında, daha fazla DNA içerme
olasılığına sahiptir (Taylor and Swann, 1994).
Bitki tohumları özel yapılardır, ana bitkinin ölümünden sonra bile uzun süre
embriyolarının genetik materyalini korur. Bu sebeple bir bitki tohumunun hücreleri en kötü
çevre şartlarına bile adapte olur. Eğer tohum kuru çevrede saklanırsa, dış görünüşte kayda
25
değer bir farklılık olmadan kendiliğinden mumyalaşır. Yüzyıllar sonra koyu kırmızımsı
kahverengi halini alır, ancak yapısını hala korumaktadır (Rollo et al., 1994a). Tohumların
arkeolojik bulguları, eski uygarlıklar hakkında özellikle ekinlerin yetiştirilmesi,
tüketilmesi, ticaretinin yapılması ve yerleşim içindeki depo alanlarının belirlenmesi ile
ilgili bilgiler verir (Çilingir, 2009).
Moleküler genetik arkeolojide bir ileri adım da, kutuplarda tiyal tabakasında
(devamlı don altında kalan toprak alt tabakası) bulunan sedimentlerin incelenmesidir.
Yeryüzünün %20-25’inde (Rusya ve Kanada’nın %50’si, Alaska’nın %82’si, Çin’in
%20’si ve Antarktika’nın çoğunluğu) görülen tiyal tabakası, evrimsel ve filogenetik
çalışmalar için önemli bir kaynaktır (Mitchell et al., 2005). Çünkü sedimentler PCR ile
çoğaltılabilen DNA içerir. Tarihi 300.000 – 400.000 yıl geriye giden sedimentten bitkinin
kloroplast DNA’sı ve yarım milyon yıl öncesine ait sedimentten bakteri DNA dizinleri
elde edilmiştir (Pääbo et al., 2004). Sedimentlerdeki DNA zaman içindeki fauna ve flora
hakkında bilgi verir (Willerslev and Cooper, 2005). Ancak bu sedimentlerin farklı DNA
dizinleri içermesi, koprolitlerin ve sedimentlerin analizinde tahmin edilemez bir
karmaşıklık da yaratmıştır. Tabakalar arasında suyun süzülmesiyle ne tür bir parçacık veya
molekül hareketi olduğunu bilmek imkânsızdır. Bu sebeple herhangi bir dizinin
tarihlendirilmesi, sediment düzeyi tarihlendirilse bile belirsizdir. Ayrıca sedimentlerdeki
DNA dizinlerinin koprolite nasıl geçtiği de bilinmemektedir. Bu yüzden, kemik ve dişlerin
ilgili hayvanın sadece bir mtDNA dizinini verebilme avantajı olduğu halde, çok sayıda
farklı mtDNA dizini veren koprolitler ve sedimental örnekler yorum hatası yaratır.
Koprolit ve sedimentlerden DNA dizinlerine ait bir başka sınırlama da, uzun DNA
dizinlerinin kısa çakışan segmentlerin amplifikasyonu ile belirlenememesidir. Çünkü
26
segmentler çok sayıda bireyden veya diğer türlerden gelmiş olabilir (Pääbo et al., 2004).
Hemen hemen şeffaf, rengi açık sarıdan yakut kırmızısına kadar değişen, kolay
kırılabilir, fosilleşmiş veya yarı fosilleşmiş bir reçine olan kehribara gömülü böceklerde ve
bitkilerde de DNA dizinleri çalışılmıştır (Poinar et al., 1994). Miyosen bitkilerinden ve
kehribara gömülü örneklerden sonuç elde edilemeyen olgular da bildirilmiştir. Miyosen
bitkilerindeki lignin ve kehribara gömülü böceklerdeki kitin gibi diğer moleküllerin
korunmamış olması da, bu fosillerdeki DNA’nın varlığını tartışmada kullanılmıştır (Pääbo
et al., 2004).
Reese ve araştırıcıları (1996) tarafından yapılan bir çalışmada, geçmişteki Teksas
piktograflarında (resimyazı) pigment bağlayıcı olarak kullanılan yağın, hayvansal
(çifttoynaklılar) kökenli olduğu ortaya çıkarılmıştır.
Marota ve meslektaşları (2002), eski çağlarda yazma materyali olarak kullanılan
papirüslerle (Cyperus papyrus) DNA bozulma oranını incelemiştir. 0–100 yaşındaki
modern ve 1300–3200 yıllık tarihi Mısır papirüslerinin kloroplast DNA’ları ile yapılan bu
çalışmaya göre, materyaldeki DNA’nın yarı ömrünün 19–24 yıl olduğu; son DNA
parçalarının papirüsün üretilmesinden en fazla 532–672 yıl sonra ortadan kaybolacağı ifade
edilmektedir. Kağıtın bulunmasından önce dört yüz yıl kullanılmış bir diğer yazma
materyali olan parşömen, hayvan derisinden hazırlandığı için değerli bulunmaktadır.
Ancak kırılması, parçalanması, dağılması sıklıkla söz konusudur. Tarihsel ve paleografik
incelemeler için yazıların yorumlanmasından önce parçaların birbiriyle birleştirilmesi
gereklidir. Bazen parçalar çok sayıdadır ve ait olduğu sayfaları belirlemek mümkün
olamayabilir. Hayvan kaynaklı bu materyallerin degrade DNA’sı ile moleküler analizler
durumu açıklığa kavuşturur (Hummel, 2003; Poulakakis et al., 2007).
27
Arkeolojik kazılarda kronoloji, toplumun kültürü ve üretim stratejileri gibi önemli
bilgiler elde etmeyi sağlayan, çeşitli malzemelerden yapılmış gereçler ortaya çıkarılır. Bu
aletlerde eser miktarda biyolojik deliller bulunabilir. Yapılacak analizler, aletleri kullanan
kişileri gösterebileceği gibi, aletlerin kullanılma amaçları hakkında da fikir verebilir.
Etiyopya’da rutin olarak taş aletler kullanan modern bir grup tarafından üretilmiş taşların
etno-deneysel arkeolojik çalışmasında, üreticilerden değişik aşamalarda taş aletler
toplanmış, başarıyla DNA çoğaltılabilmiştir. Ancak araştırmacılar şuna dikkat çekerler;
hem aletin üreticisi hem de kullanıldığı türlerden DNA çoğaltılabilmiş, ancak aletin
kullanımıyla ilgili olmayan DNA’nın varlığı da belirlenmiştir (Kimura et al., 2001).
Wyoming (ABD) eyaletindeki bir arkeolojik alanda elde edilen 24 taş alet, üzerinde
bulunabilecek DNA için analiz edilmiş ve kazıda çıkarılmış kemiklerle karşılaştırılmıştır.
Dokuz alette DNA’ya rastlanmıştır. Hatta aletlerden birinde üç türe (köpek, geyik ve evcil
kedi) ait DNA tespit edilmiştir. Evcil kedi bulunması ilginçtir, çünkü alana özgü bir tür
değildir, dolayısıyla kazı yapanlardan birinden bulaşma ihtimalini düşündürmektedir.
Köpek DNA’sı da benzer şekilde yorumlanabilirken, geyik için durum farklıdır. Diğer
verilerle birlikte ahşap ve deriden yapılmış bu aletin geyiklerin postunu ayırmada
kullanılmış olabileceği veya saklandığı geyik derisi kınından bulaştığı akla uygun
gelmektedir (Shanks et al., 2005).
Geçmişe ait DNA’nın Biyokimyasal Özellikleri
Uzun yıllar farklı çevre şartlarına maruz kalan biyoarkeolojik örneklerde DNA,
ölümden sonra endojen nükleazlar tarafından parçalanmaya başlar. Hızlı kurutma, düşük
sıcaklıklar veya yüksek tuz derişimleri gibi durumlarda, nükleik asitlerin tamamı
28
parçalanmadan önce nükleazlar bozulur veya inaktif hale gelir. Bu durumda bile, yavaş da
olsa devam eden diğer olaylar DNA’yı etkiler (Hofreiter et al., 2001). DNA iplikleri kırılır,
bazsız, yanlış veya çapraz bağlanan bölgeler oluşur, deaminasyon ürünleri meydana gelir
(Willerslev and Cooper, 2005). Bu moleküler degradasyon, DNA miktarını çoğaltmayı
engeller. Aynı zamanda organik PCR inhibitörleri de çoğaltma sırasında DNA ile yarışır
(O’Rourke et al., 2000).
Arkeolojik kalıntılardan izole edilen DNA’da en belirgin hasar tipi, genellikle 100–
500 baz çifti arasında kısa parçalara degradasyondur. Boyuttaki azalma, hem ölümden kısa
bir süre sonra başlayan enzimatik olay, hem de tek ipliği oluşturan fosfat-şeker iskeletinde
fosfodiester bağlarının hidrolitik parçalanması sebebiyle meydana gelir. Azot bazları ile
şeker arasındaki N-glikozil bağları da hidrolitik parçalanmaya maruz kalır ve bazsız
bölgelerle sonuçlanır (Şekil 2). Bir nükleotid yok olduğunda, DNA yeni bir kimyasal
düzenlemeye girer ve baz kaybından neredeyse daha yavaş veya onunla aynı oranda iplik
kırılması meydana gelir (Pääbo et al., 2004). Hidroliz oranı suyun varlığında sıcaklık ve
pH bağımlı olduğu halde, Guanin ve Adenin (depurinasyon), Timin ve Sitozine
(deprimidasyon) göre yirmi kat daha dayanıklıdır. Depurinasyon, hidrate DNA’nın en
önemli bozunma yoludur. Ancak DNA’nın hidroksiapatite adsorpsiyonu, depurinasyon
oranında iki kat azalma ile sonuçlanır, böylece eski kemiklerden incelenebilir DNA elde
etme şansı artar (Lindahl, 1993). Hidrolitik depurinasyon oranını etkileyen temel faktörler,
pH, su miktarı ve sıcaklıktır. İlk ikisi kemikte daha az önemlidir, çünkü hem kemik pH=4–
9 arasında tamponlama etkisi gösterir, hem de porların dağılımı su geçişini sağlar. Derine
gömmek, sıcaklık farklılıklarını yıllık bir ortalamada dengelediği için sıcaklık DNA
korunmasında temel rol oynar (Smith et al., 2001; 2003).
29
Hidroliz
az örnek molekül / kısa parçalar
kontaminasyon / kısa PCR ürünleri
Şekil 2. Post-mortem DNA değişimlerinde hidrolitik hasar ile iplik kopmalarının meydana
gelmesi. (A) Fosfodiester iskeletinin doğrudan ayrılması. (B) Bazsız bölgelerde
depurinasyon. (C) Şeker iskeletinin ayrılması (Willerslev and Cooper, 2005).
DNA polimerazlarının uzamasını engelleyen bazı DNA modifikasyonlarında
moleküllerin amplifikasyonu mümkündür, ancak PCR sırasında yanlış bazların dahil
edilmesi söz konusu olabilir. Bunun en fazla görülen şekli, sırasıyla hipoksantin, urasil,
timin ve ksantin oluşturan adenin, sitozin, 5-metilsitozin ve guanin bazlarından amino
gruplarının hidrolitik kaybıdır. Adenin (hipoksantin), sitozin (urasil), 5-metil sitozin
(timin) için deaminasyon ürünleri; DNA polimeraz tarafından sentezlenen yeni DNA
ipliklerinde yanlış bazların yerleştirilmesine (G yerine A, T yerine C) sebep olduğundan,
aDNA amplifikasyonlarıyla yakından ilgilidir (Şekil 3) (Willerslev and Cooper, 2005).
30
Oksidasyon / Hidroliz
Bloklama
5-Hidroksi 5-Metil
hidantoin
5-Hidroksi hidantoin
Yanlış kodlama
Adenin
Sitozin
Hipoksantin
Urasil
yanlış baz bağlanmaları
kimerik dizinler
dizin hataları
Şekil 3. Post-mortem DNA değişimlerinde oksidatif ve hidrolitik baz modifikasyonları (i)
bloke edenler (ii) yanlış kodlamaya sebep olanlar (Willerslev and Cooper, 2005).
DNA dizinlerinin uzunluğu, sadece iplik kopmalarıyla değil, aynı zamanda Taq
polimeraz tarafından DNA ipliklerinin uzamasını bloke eden lezyonlarla da belirlenir. Bu
tip birçok zarar, radyasyondan kaynaklanan peroksit (-O2), hidrojen peroksit (H2O2) ve
hidroksil (-OH) gibi serbest radikaller tarafından uyarılır (Pääbo et al., 2004). Oksidasyon
adı verilen bu olay, sudan gelen hidroksilin veya süperoksit radikallerinin bazları
değiştirmesi veya heliks yapıyı bozması olarak tanımlanır (O’Rourke et al., 2000). Güneş
ışığı (UV), oksidasyona sebep olan serbest radikalleri arttırır (Bollongino et al., 2008).
Mitokondriler oksijen metabolizmasının merkezi olduğu için, oksidasyon nükleere göre
mitokondriyal DNA'yı daha çok etkiler (O’Rourke et al., 2000). Oksidatif hasarın belli
başlı bölgeleri, şeker-fosfat iskeleti ve azotlu bazlar, özellikle halka parçalanmasına doğru
31
giden pirimidin ve pürinler arasındaki çift bağlardır (Hofreiter et al., 2001; Pääbo et al.,
2004). Pirimidinler, özellikle Timin, oksidatif hasara pürinlerden daha duyarlıdır.
Pirimidinlerin %10’u oksidatif hasar sonucu değişmektedir (Pääbo, 1989). Oksidize
pirimidinler olan hidantoinler, DNA polimerazları bloke ederek PCR sırasında uzamayı
engeller (Hofreiter et al., 2001). Bu sebeple hidantoinlerin varlığı, izolasyon ve
amplifikasyon başarısı ile ters orantılıdır (Höss et al., 1996).
Bir diğer hasar tipi de, DNA polimerazı bloke eden ve aDNA preparatlarında
elektron mikroskobu ile doğrudan gözlemlenebilen çapraz bağlardır (Pääbo et al., 2004).
Bunlar, protein veya nükleik asitlerdeki birincil amino grupları ile şekerler arasında
yoğunlaşma reaksiyonları ile meydana gelen Maillard ürünlerinin oluşumuna sebep olur
(Şekil 4). Nükleik asitleri bağlayan Maillard ürünleri, diğer inhibitörler (humik asit, fulvik
asit) gibi, çoğunlukla DNA izolatlarının kahverengi olmasına sebep olur. Bu bileşikler,
agaroz jelde UV ışık altında mavi floresans verir (Pääbo, 1989; Tuross, 1994; Hanni et al.,
1995; Kalmar et al., 2000; Kolman and Tuross, 2000). Bunlar sülfid içerdiğinden, 600 baz
çiftinden küçük DNA parçaları ile karşılaştırılabilir hızda agaroz jelde yürür (Golenberg,
1994). Maillard ürünlerini parçalayan bir ajan, örneğin N-fenilaçiltiazolyum bromid (PTB)
ile muamele; amplifikasyona başka türlü cevap vermeyen bazı örneklerden DNA
dizinlerini çoğaltmayı sağlar (Pääbo et al., 2004). Donmuş sedimentlerden elde edilen eski
DNA dizinlerinde çapraz bağların, iplik kopmalarından daha etkili olduğu belirlenmiştir
(Hansen et al., 2006). Pääbo (1989) eski DNA’da yüksek miktarda oksidatif hasar ve
çapraz bağlar olduğunu göstermiştir.
32
Alkilasyon / Maillard Reaksiyonu
İplikler arası çapraz bağlar
Moleküller arası çapraz bağlar
Amplifikasyon olmaz
Kontaminasyon
Şekil 4. Post-mortem DNA değişimlerinde çapraz bağların oluşması. (i) Alkilasyon ile
iplikler arasında çapraz bağlar oluşması. (ii) Maillard reaksiyonu ile moleküler çapraz
bağların oluşması (Willerslev and Cooper, 2005).
Degradasyon olayları hücrelerin içinde sürekli olarak devam eder, ancak
çekirdekteki DNA tamir mekanizmaları ile kontrol altındadır. Ölüm sonrasında bu ve diğer
degradatif olaylar birikmeye başlar. Eski DNA'nın eldesi ve amplifikasyonu, mümkün
olduğunda, 300–500 baz çiftinden az uzunlukta ve birkaç bin yıllık veya daha az yaşta olan
örneklerle sınırlıdır (O’Rourke et al., 2000). Pääbo (1989) ise, 140 baz çiftinden daha uzun
parçalarda amplifikasyonun başarısız olduğunu belirtmiştir. Ancak arkeolojik materyalin
korunması için degradasyon mekanizmaları ile ilgili bilgiler arttırılmalıdır (Jans et al.,
2002).
Araştırıcılar, uzun süreli çevresel sıcaklıkla DNA izolasyonu ve amplifikasyon
başarısı arasında ters bir ilgi kurmuşlardır (Höss et al., 1996; Pääbo, 1989; Poinar et al.,
1996). Sıcaklıktaki 20° C'lik düşüş, baz degradasyonunu 10-25 kat azaltır (Höss et al.,
1996). Tuross (1993, 1994) bozulmanın ölüm sonrası hemen başladığını, ancak en azından
kemik örneklerinde hidroksiapatite bağlanan DNA'nın stabilizasyonundan dolayı,
33
hidrolitik depurinasyon oranının iki kat yavaşladığını öne sürmektedir. Lindahl’e (1993)
göre, DNA’nın tümüyle hidrolitik hasara uğraması fizyolojik tuz konsantrasyonları, nötral
pH ve 15º C sıcaklıkta 100.000 yıl alacaktır.
PCR inhibitörlerinin büyük çoğunluğu taninler, humik asit, fulvik asit ve diğer tüm
bilinen toprak kaynaklı degradasyon ürünleridir (Hummel et al., 1992; Tuross, 1994,
O’Rourke et al., 2000). Bunlar fenol türevli oldukları için, fenol-kloroform ekstraksiyonu
ile uzaklaştırılabilirler. Tuross (1994), 260–280 nm’de absorbans ölçtüğü örneklerde fulvik
asitin, DNA’ya göre daha fazla emici olduğunu belirlemiştir, dolayısıyla DNA izolatlarının
240, 260 veya 280 nm’de absorbansı ölçüldüğünde fulvik asitlerin varlığı kolaylıkla
görülebilir. Tuross’un (1994) belirttiğine göre; 100 ng fulvik asit, Taq polimerazın hedef
aldığı kontrol Lambda DNA’nın amplifikasyonunu tamamen inhibe eder.
Eski DNA'nın elde edilmesi yıkıcı bir süreç olduğu için eski DNA izolasyonu ve
amplifikasyonu girişimlerinde uygun belirteçleri incelemek çok önemlidir. Nükleik asit
degradasyonu birçok şekilde tespit edilebilir (O’Rourke et al., 2000). Genel olarak
proteinlerin korunmuş olması, örnekte benzer düzeyde korunmuş DNA beklenebileceğini
gösterir (Kolman and Tuross, 2000). Aminoasit rasemizasyonu bir başka yöntemdir. Canlı
organizmalardaki tüm proteinler sadece L-aminoasitlerden oluşur, ancak L-formundan Dformuna post-mortem dönüşüm (rasemizasyon) denge oluşuncaya kadar (D/L=1) devam
eder. Fosil örneklerinde ve kemiklerde proteinlerin zaman içinde degradasyonu ile hem Dhem de L- aminoasitlerin varlığı gösterilmiştir (Schwartz et al., 1991, Poinar et al., 1996).
Aspartik asit (Asp) rasemizasyonu neredeyse DNA depurinasyonuna yakındır ve bu
sebeple DNA'nın korunmuş olduğunun iyi bir belirtecidir. Aminoasit rasemizasyonu,
DNA'nın depurinasyonu gibi, sıcaklık ve suyun varlığından etkilenir. Yüksek oranlarda
34
rasemizasyon tespit edilen örnekler, kısa DNA parçaları vermeye eğilimlidir. Bir çalışmada
Asp D-formunun Asp-L formunu %8'den fazla aştığı örneklerde DNA elde edilememiş ve
çoğaltılamamıştır (Poinar et al., 1996).
Smith ve meslektaşları (2001), geçmişe ait örneklerde termal yaş kavramından
bahseder. Sıcaklık 10ºC’de sabit tutulduğunda DNA degradasyonunun olması için geçen
süre olarak tanımlanan termal yaş, çözeltide tahmin edilen DNA depurinasyonunun bilinen
sıcaklık bağlılığını kullanarak farklı bölgelerin kronolojik yaşını bireysel termal geçmişine
göre ayarlar. Termal yaşın kullanımı iki varsayıma dayanır: DNA depurinasyonu DNA
degradasyonu için anahtar yoldur, depurinasyon için aktivasyon enerjisi sıcaklık bağımlıdır
(Smith et al., 2003). DNA korunması için sınırın, 10º C’de yaklaşık 19.000 yıl olduğu
tahmin edilmektedir (Chilvers et al., 2008).
Hansen ve meslektaşlarına (2006) göre, aminoasit rasemizasyonu ve termal yaş gibi
yöntemlerle DNA’nın uzun süreli korunmasını belirlemek imkânsız olduğundan, bakteriyel
DNA’nın durumu, örneğin saklanma koşulları gibi daha gerçekçi şartlar için hasar
oranlarının araştırılması gerekir. Ayrıca gaz kromatografisi / kütle spektrometrisi, önemli
miktarlarda değişmiş DNA bazlarını belirlemek için kullanılabilir (Höss et al., 1996).
Yüksek performanslı likit kromatografisi analizleriyle pirimidin kayıpları belirlenebilir
(Mitchell et al., 2005).
Kromozomal DNA Çalışmaları
Nükleer DNA (nuDNA) analizlerinde 1985 yılına kadar kullanılan parçacık
uzunluk polimorfizmi (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) ile sınırlı
özellikte (sadece taze ve çok miktarda) örnekten DNA çalışılabilmiştir. Kary Mullis
35
tarafından tanımlanan Polimeraz Zincir Tepkimesi (Polymerase Chain Reaction, PCR), çok
az miktarda olan örneklerden DNA çalışılmasını mümkün hale getirmiştir (Mullis et al.,
1986; Mullis and Faloona, 1987). PCR, bir biyolojik örnekteki belirli DNA bölgesinin
miktarını arttırmak için genel bir teknik olup, zaman içinde ilerleyen teknolojiyle birlikte,
temeli PCR’a dayanan birçok sistem geliştirilmiştir. PCR temelli tüm sistemler, özellikle
eski, sınırlı miktarda veya degrade örneklerden DNA analizinde başarıya ulaşılmasını
sağlamıştır (Rudin and Inman, 2002).
Alec Jeffreys tarafından 1985’te genomda varlığı keşfedilen tekrar bölgelerinin
sayılarının kişileri arasında farklı olduğu ortaya çıkarılmış ve ilk kez iki cinsel saldırı
cinayetinin çözülmesinde kullanılmıştır (Jeffreys et al., 1985; Saferstein, 2004). Genomda
farklı çeşitlerdeki tekrar bölgelerinden biri olan basit dizin tekrarları, ‘minisatellit’
(değişken sayıda ardışık tekrarlar, Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) ve
‘mikrosatellit’ (kısa ardışık tekrarlar, Short Tandem Repeats, STR) olarak bilinir.
Dinükleotid tekrarlarının, aDNA tiplemesinde güvenilir nükleer DNA dizinleri olmadığı
gösterilmiştir (Ramos et al., 1995). Hummel ve meslektaşları (1999), tarihsel örneklerde
aynı anda dört STR lokusundan fazlasının başarıyla çoğaltılamadığını, ancak kendi
çalışmalarıyla dokuz STR lokusunu aynı anda analiz edebildiklerini bildirmiştir. Eski
örneklerde degradasyondan dolayı, büyük boyutlu STR’lerin çoğaltılmasında genellikle
başarı sağlanamamıştır. Ancak kromozomal DNA için 300 veya daha fazla baz çifti
uzunluğunda parçaların korunabildiği de gösterilmiştir (Hummel et al., 1999). Von
Wurmb-Schwark ve meslektaşlarına (2004) göre STR analizi için 100 pg eski DNA
gereklidir. Degrade örneklerden STR çalışmalarında PCR döngülerine bağlı olarak örnek
ve enzim konsantrasyonlarının ayarlanması, ayrıca profillerin yorumlanmasında düşük
36
düzeyde sinyaller alındığında örneğin yeniden analiz edilmesi için stratejiler içeren
kılavuzların oluşturulması ve kişilerin dikkatli yorumlaması ile birlikte bilgisayar
yazılımları da kullanması önerilmektedir (Schneider et al., 2004).
Son yıllarda geleneksel otozomal STR primerlerinin tekrar dizinine daha yakın
bölgelerden bağlanması sağlanarak boyutları küçültülmüş ve daha kısa tekrar bölgeleri elde
edilerek bunlara “mini-STR” adı verilmiştir. Günümüzde standardize edilerek kullanıma
sunulmuş ticari kitlerle farklı sayılarda mini-STR lokusunun aynı anda analiz edilebilmesi
mümkündür. Mini-STR’ler, çok kısa olmalarından dolayı, özellikle degrade örneklerin
analizinde tercih edilmektedir. Bu sebeple, mini-STR’ler özellikle kemik ve saç
örneklerinden DNA analizinde sıklıkla kullanılmaktadır (Butler et al., 2003; Coble et al.,
2006; Opel et al., 2006; Pizzamiglio et al., 2006; Asamura et al., 2007a, Fondevila et al.,
2008). Yeni mini-STR’lerin oluşturulması çalışmaları halen devam etmektedir (Coble et
al., 2006). Hatta degrade örneklerden Y-STR bölgelerinin analizi için mini Y-STR
sistemleri de geliştirilmiştir (Asamura et al., 2007b). EDNAP (Avrupa DNA Profilleme
Grubu) ve ENFSI (Avrupa Adli Bilimler Enstitüleri Ağı), aDNA analizlerinde başarı için
STR’lerin giderek küçülmesi gerektiğini önermektedir (Dixon et al., 2006).
Genomun belirli noktalarında bireyler arasındaki baz farklılıkları, tek nükleotid
polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) olarak adlandırılır. Bir bireyde hem
çekirdek DNA’sında, hem de mitokondriyal DNA’da milyonlarca bulunabilen SNP’ler,
adli bilimler açısından kişilerin birbirinden ayırt edilmesini sağlar. SNP analizi için birçok
teknik vardır, ancak günümüzde halen aynı anda çok sayıda SNP’nin aynı anda
belirlenmesi için sistemler geliştirilmeye devam edilmektedir (Butler, 2005).
SNP kullanımının adli bilimlerdeki temel amacı, güçlü PCR inhibitörlerinden veya
37
degrade örneklerden küçük PCR ürünleri oluşturmaktır. Analiz edilecek hedef bölge
STR’lerdeki gibi 20–60 nükleotid değil, sadece bir tek nükleotid içerdiğinden, PCR
ürünleri de küçük – kısa olur ve analizde başarı sağlanır (Butler, 2005). İskelet kalıntıları
gibi degrade örneklerde diğer yöntemlerle birlikte SNP analizleri de kullanarak
idantifikasyon yapılan olgular bulunmaktadır (Larcombe et al., 2005; Fondevilla et al.,
2008).
Cinsiyet Kromozomları
Cinsiyetin antropolojik yöntemlerle belirlenmesi, tam bir iskeletin varlığında zor
değildir, ancak çoğunlukla iskelet parçalarının bulunması söz konusudur. Örneğin uçak
kazalarında kemikler birçok parçaya ayrılır ve sadece çok küçük bir parça bulunabilir
(İşcan, 2001). Bebek ve çocuk iskeletlerinde antropolojik çalışmalarla cinsiyet tayini çok
zordur, tek çözüm DNA analizleridir (Colson et al., 1997; Mergen and İşcan, 2007; Arslan
et al., 2008).
Cinsiyetin moleküler düzeyde tayini; adli örneklerde, idantifikasyon için toplumun
%50’sinin dışlanmasını sağlarken, arkeolojik örneklerde antropolojik ölçümlerle elde
edilen bilgilerin teyit edilmesine imkân verir. Bu amaçla önceleri Y kromozomuna özgü
dizinlerin amplifikasyonu kullanılmıştır. Bu, cinsiyet tayininde ilk moleküler genetik
yöntemdir (Hummel and Herrmann, 1991; 1994). Günümüzde ise insanlarda var olan
cinsiyet kromozomlarının (X ve Y) her ikisinde de farklı uzunluklarda yer alan, dolayısıyla
cinsiyetler arasında ayırım yapmayı sağlayan Amelogenin lokusu kullanılır. Lokus, sadece
X kromozomunda 6 baz çiftlik bir delesyon gösterdiğinden, analiz sonunda kadınlarda
(XX) sadece bir ürün (X), erkeklerde (XY) ise biri diğerinden altı baz daha kısa iki ürün (X
38
ve Y) görülür (Rudin and Inman, 2002). Colson ve meslektaşları (1997), tek kopya
sayısından dolayı amelogenin sisteminin başarı sağlamadığını, bu sebeple sekiz yeni
doğmuş, bir genç yetişkin bireyde genetik cinsiyeti belirlemek için Y kromozomundan
yararlandıklarını belirtmiştir. Matheson ve Toy (2001), Amelogenin ile birlikte X ve Y
kromozomlarındaki alfoid tekrarlarını kullanarak genetik cinsiyet tayini gerçekleştirmiş,
Amelogenin’in çoğaltılamadığı altı olgudan beşinde alfoid tekrarlarının sonuç verdiğini
belirtmiştir. Amelogenin’deki Y kopyasının delesyonu sebebiyle kadın olarak tespit
edilebilecek erkeklerin, doğru cinsiyetlendirilmesi için Y kromozomunda cinsiyet
belirleyici bölge (Sex-determining Region of Y-chromosome, SRY) çalışılabilir. Drobnic
(2006) tarafından SRY bölgesi analizleri için yeni primerler önerilmiştir. Cinsiyet
kromozomları, cinsiyet tayini dışında taşıdıkları, gonozomal STR ve SNP bölgeleriyle
idantifikasyona da yarar. Ayrıca göç yolları çalışmalarına katkı sağlar (Butler, 2005).
Otozomal DNA incelemeleri, her bireyin genlerinin yarısını annesinden, diğer
yarısı babasından aldığı esasına göre gerçekleştirilir. Ancak Y kromozomu ve
mitokondriyal DNA çalışmaları yapıldığında, bireyin bir önceki neslin özelliklerini aynen
taşıdığı, dolayısıyla önceki kuşağı temsil ettiği göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca bu
analizlerde genotipten değil, haplotipten bahsedilir, çünkü her birey için tek bir alel vardır
(Butler, 2005). Bir bireydeki dizin çeşidi ‘haplotip’, birbiriyle bağlantılı haplotiplerin
oluşturduğu gruplar ise ‘haplogrup’ olarak adlandırılır.
Y kromozomu ve mitokondriyal DNA çalışmalarında incelenen özellikler, kuşaklar
arasında -mutasyonlar dışında- değişmeden aktarılır. Böylece annenin soyunu
mitokondriyal DNA, babanın soyunu ise Y kromozomu ile takip etmek mümkün olur. Her
ne kadar bu tip analizlerle bireylerin etkili bir şekilde birbirlerinden ayırt edilmesi mümkün
39
olamasa da, hem Y kromozomunda bulunan Y-STR ve Y-SNP’ler, hem de mtDNA’da yer
alan SNP’ler adli bilimlerde çok önemli bir yer tutar (Butler, 2005). Y kromozomu ve
mitokondriyal DNA, modern insanların evrimsel kökeni ve dünyaya yayılmaya
başladıklarında izledikleri rotaları belirlemek amacıyla arkeogenetikte geniş ölçüde
kullanılır (Cavalli-Sforza and Feldman, 2003).
Y kromozomu: Aynı soydan gelen tüm erkek bireylerde aynı özellikleri taşır. Adli
bilimlerde özellikle failin çoğunlukla erkek olduğu cinsel suçlarda toplanan biyolojik
delillerde, sadece erkeğe ait DNA’nın incelenmesi ve farklı erkeklerin birbirinden ayırt
edilebilmesi gerekir. Bu durumda Y kromozomu üzerinde yer alan STR’ler veya SNP’ler
çok önemli bilgiler sunar. Babanın hayatta olmadığı ve erkek çocukların söz konusu
olduğu babalık olgularında, kayıp bireylerin araştırılmasında, kitlesel felaketlerde kişi
idantifikasyonlarında; ailede yaşayan diğer erkek bireylerin Y kromozomlarının analizi ile
sonuca gidilmesi mümkündür (Butler, 2005).
Y kromozomu üzerinde incelenen işaretler, evrim sürecindeki göç yollarının
anlaşılması açısından da çok önemlidir. Özellikle Y-SNP’ler bu araştırmalarda
haplogruplar arasındaki farklılıkları tanımlamada daha idealdir. Y-STR’ler ise
haplogruplar içerisinde yakın ilişkili verilerin ayrımında kullanılmaktadır. Y kromozomu
işaretleri bölgesel bir sınırlama eğilimi göstermiş, diğer bir deyişle popülasyona özgü
kalmıştır. Böylece Y kromozomu haplogruplarının belirlenmesi ile filogenetik ağaçlar
oluşturulmuştur (Underhill et al., 1997, Cinnioglu et al., 2004). Özellikle modern insanın
evrimi ve göç yollarının anlaşılması açısından birçok toplumun tek nükleotid polimorfizmi
çalışmaları halen sürmektedir.
40
Mitokondriyal DNA Çalışmaları
İnsan mitokondriyal DNA’sı (mtDNA), 16569 nükleotid çiftinden oluşan kapalı
halkasal bir molekül olup ağır (Heavy, H) ve hafif (Light, L) olarak adlandırılan iki DNA
iplikçiğinden meydana gelir. Bir küçük (12S) ve bir büyük (16S) rRNA, 22 tRNA ve
mitokondriyal enerji oluşturma yolu olan oksidatif fosforilasyonun alt üniteleri olan on üç
polipeptid kodlar (Wallace, 1994). Kodlama yapmayan 1100 baz çiftlik bölümü ise ileri
değişken kontrol bölgesi (Hyper Variable Control Region, HVR) veya D-Loop
(Displacement Loop) olarak adlandırılır ve iki kısım içerir: HVRI (16024–16365) ve
HVRII (73–340) (Anderson et al., 1981). Bu çeşitlilik popülasyona özgüdür, hatta belirli
mitokondriyal işaretlerdeki yüksek mutasyon oranları ile aile düzeyine kadar inebilir.
HVR’ler bireyler arasında %3 farklılık gösterir, bir başka deyişle rastgele seçilmiş akraba
olmayan iki kişide, her yüz nükleotidden üçü farklıdır (Stoneking, 2000). Karşılaştırılabilir
yüksek polimorfizm düzeylerinden dolayı, HVR’ler aDNA analizleri için genellikle çok
uygundur (Hummel, 2003). Ancak bu uzun bölge, aDNA çalışmalarında tek bir
amplifikasyon ile başarılamayacağı için, HVR’leri çoğaltmada üst üste çakışan parçalar
oluşturmak sıklıkla tercih edilen bir yöntemdir (Krings et al., 1997; Hummel, 2003;
Imaizumi et al., 2005; Bouwman et al., 2006, 2008; Dissing et al., 2007; Gao et al., 2007).
Bu parçaların amplifikasyonu ve dizinlenmesi ile teorik olarak büyük boyutta bir dizin
yapılandırılabilir (Yao and Zhang, 2003).
İnsan mitokondriyal genomunun tüm dizisi 1981'de tespit edilmiştir (Anderson et
al., 1981). Bu ilk mtDNA dizisi, Anderson dizisi veya Cambridge Referans Dizisi
(Cambridge Reference Sequence, CRS) olarak bilinir (Ek 1). Moleküldeki her nükleotid
numaralandırılarak diğer mtDNA dizileriyle karşılaştırmada kolaylıkla kullanılması
41
sağlanmıştır. Daha sonra 1999 yılında Andrews ve meslektaşları (1999) tarafından bu
dizinin yenilenmiş hali (revised Cambridge Reference Sequence, rCRS) yayınlanmıştır.
Bunun orijinal Cambridge dizisinden farkı, mtDNA dizininde düzeltilmiş ve doğrulanmış
on sekiz nükleotid içermesidir (Andrews et al., 1999).
Oosit sitoplazması yoluyla iletildiği için, anne kalıtımlı olan mtDNA dizininin
değişebilmesi için tek yol, yayılan annesel soylar boyunca mutasyonların dizinsel
birikimidir. Özellikle mitokondriyal DNA'nın I ve II değişken bölgeleri, temelde
mitokondrilerdeki DNA tamir mekanizmalarının eksikliğinden dolayı, değişiklikleri belli
bir oranda biriktirir. Mutasyonlar rastlantısal olduğundan mtDNA’nın kodlayan /
kodlamayan herhangi bir bölgesindeki baz değişebilir. Hatta vücuttaki her hücre yüzlerce
mitokondri ve binlerce mtDNA içerdiği için mitokondriyal mutasyonlar, bütün dokularda
vücut ve üreme hücrelerinde meydana gelebilir. Farklı tip DNA mutasyonlarının ve
bunların hücre ve dokulardaki dağılımının anlamları çok farklı olabilir. Somatik dokularda
artan mutasyonlar, hücresel enerji üretimini bozar ama bireysel olarak da yok edilir. Dişi
üreme hücrelerinde artan mutasyonlar, yeni mitokondriyal DNA polimorfizmleri veya
mtDNA bozukluğu olarak yeni nesillere aktarılır. Somatik mutasyonlar, mitokondriyal
hasarın süresini belirlerken, kalıtımsal mtDNA mutasyonları klinik belirtilerin şiddetini ve
yapısını etkiler (Wallace, 1994).
Bir mtDNA mutasyonu arttığında “heteroplazmi” denilen mutant ve normal
moleküllerden oluşan intrasellüler bir karışım meydana gelir. Bunu takiben mutant ve
normal mtDNA’lar mitoz ve mayoz replikasyon sırasında yavru hücrelere rastgele
dağıldığı için mutant ve normal moleküllerin yüzdesi ya saf mutant ya da saf normale
doğru hücre içinde sürüklenir ki; bu da “homoplazmi” olarak adlandırılır (Wallace, 1994).
42
Heteroplazmi üç düzeyde olabilir: Bir hücre sadece homoplazmik mtDNA taşır; bir hücre
farklı mtDNA haplotipleri taşır, ancak her bir mitokondri homoplazmiktir; her mitokondri
farklı mtDNA tiplerini içerir (Lutz et al., 1999). Heteroplazminin insanlarda varlığı, sıklığı
ve dağılımı, günümüzde kesin olarak bilinmemektedir. Dolayısıyla heteroplazmi, mtDNA
tipleme sistemleriyle her zaman belirlenemese de, bütün bireylerin bir dereceye kadar
heteroplazmik olduğu düşünülmektedir. Farklı dokularda (kanda en düşük, saçta en yüksek
sıklıkta), hatta aynı bireyin aynı dokularında bile farklı derecelerde heteroplazmi görülür
(Rudin and Inman, 2002; Bini and Pappalardo, 2005). Salas ve meslektaşları (2001) tek bir
saçın farklı bölümlerinde farklı düzeylerde heteroplazmi bildirmişlerdir. İnsanlarda
heteroplazmi hakkındaki birçok araştırma, hastalıklarla bağlantılı mtDNA mutasyonları ile
ilgilidir, çünkü homoplazmi patojenik mutantların çoğu için öldürücüdür (Lutz et al.,
1999).
Yüksek mtDNA dizin çeşitliliği, coğrafik olarak ayrılmış popülasyonlar arasında
belirgin olarak görülür. Bu varyasyon, ilk kez Avrupa, Asya ve Afrika’dan toplanan
örneklerden HpaI sınırlandırılmış parça uzunluk polimorfizmlerinin (Restriction Fragment
Length Polimorphism, RFLP) analiz edilmesi sonucu örneklerin etnik ve coğrafik kökeni
ile bir korelasyon oluşturmak için gösterilmiştir. Bütün dünyadaki 62 popülasyondan 3065
mtDNA’daki AvaII, BamHI, HaeII, HpaI, HhaI ve MspI gibi yüksek polimorfik enzimlerle
restriksiyon bölgesi farklılıklarının analizi, insan mtDNA’sının çeşitliliğinin evrimi
hakkında birkaç temel ilkeyi açığa çıkarmıştır: (1) MtDNA mutasyonları yayılan maternal
yollar boyunca dizinsel olarak birikir. (2) MtDNA varyasyonu bireyin etnik ve coğrafik
kökeni ile yüksek korelasyon gösterir. (3) Bağımsız restriksiyon bölgelerindeki varyantlar
ya her zaman birbirleriyle ilişkilidir ya da hiç ilişkili değildir; bu da mtDNA'ların çok az
43
rekombine olduğunu veya asla rekombinasyonun gerçekleşmediğini gösterir. (4) Homo
sapiens için tek orijin vardır, insanlar için mtDNA ağacı tek koldan kıtalara yayılır. (5)
Bireysel popülasyonlar içinde mtDNA dizin çeşitliliği, Afrika popülasyonlarında en
yüksek, Asya ve Avrupa popülasyonlarında yüksek, Amerika yerlilerinde en düşüktür.
MtDNA mutasyonlarının ve dolayısıyla dizin çeşitliliğinin oldukça sabit oranda biriktiği
farz edilirse, bu H. sapiens’in Afrika’dan köken aldığı, Asya ve Avrupa’ya göç ettiği ve
nihayet Amerika’ya ulaştığı anlamına gelir (Wallace, 1994).
MtDNA haplogruplarının filogenetik gruplandırmasının coğrafik özelliklerle
uyumlu olduğu bulunmuş; haplogrupların adlandırma ve frekansları 1993 ve 1994
yıllarında Chen, Torroni, Wallace tarafından Afrikalılara (L), Asyalılara (B), Avrupa/Batı
Avrasyalılara (H, I, J, K) ve Amerikan yerlilerine (A, B, C, D) özgü olarak tespit
edilmiştir. Farklı araştırmacılar etnik toplumlarda popülasyon incelemelerini
sürdürmektedirler (Mitomap, 2009).
DNA Tipleme Sistemleriyle Akrabalık Analizi
DNA, bireylerin idantifikasyonu kadar, iki ya da daha fazla bireyin aynı aileden
olup olmadıklarını belirlemek için de kullanılabilir. Bu çalışmalar, akrabalık analizi olarak
adlandırılır ve günümüzde adli bilimlerde en temel uygulaması babalık testleridir. Kısmen
anneden, kısmen babadan kalıtılan DNA profilinde belirli bir STR bölgesinin alelleri aile
ağacına yerleştirildiğinde, aile içindeki ilişkiler ortaya çıkar (Bujdoso et al., 2003; Brown,
2006). Popülasyonda sık rastlanmayan bir alelin istatistiksel olasılığı aile içinde yüksek
olsa da, çalışılan bireylerin bir lokusta dahil edildiği bilgisi, akrabalığı göstermek için
yeterli değildir. Kesinliği arttırmak için daha fazla STR lokusu çalışılmalıdır, ancak analiz
44
sonsuz da olmamalı, görülen ilişkilerin kabul edilebilir bir olasılık verebildiği sayıda bölge
incelenmelidir (Wenk, 2004). Bir popülasyonda düşük frekanslı alellerin varlığı arttıkça,
popülasyon içindeki yakınlık olasılığı da artar (Boljuncic, 2007).
Mitokondriyal DNA, bireyler arasında ilişkileri ortaya çıkarmak için kullanılan
polimorfizmlere sahiptir, ancak çeşitlilik STR’lerdeki kadar fazla değildir. Ancak mtDNA
sadece anneden kalıtıldığı için büyük önem taşır. Babaya ait mtDNA döllenme sırasında
kaybolduğundan çocuğun DNA içeriğiyle karışmaz ve çocuklarda her zaman anne ile aynı
mtDNA görülür. Bireyler uzaktan ilişkili bile olsa, bu annesel kalıtım modeli anne
tarafından akrabalıkları ortaya çıkarmayı kolaylaştırır (Rudin and Inman, 2002).
Genetik danışmanlıkta, ikiz çalışmalarında, bebeklerin hastanede karıştığı
durumlarda, infertilite tedavisinde gamet ve embriyo birleştirilmesinde akrabalık analizleri
yararlı olmaktadır. Bu tıbbi yaklaşımların ötesinde, kan akrabalığı çalışmaları adli
bilimlerde, varolmayan veya sonlandırılmış resmi veya gayriresmi ilişkilerden doğan
çocukların sosyal bakımlarının üstlenilmesinde, mal ve sosyal güvenlik hukukunda ve
göçmenlik kararlarında çok değerlidir. Hatta insan dışı düşünüldüğünde, yabani hayatta
bitki ve hayvanların soy içi çiftleştirilmesinde de akrabalık analizi önemlidir (Wenk,
2004).
Günümüzde var olan teknoloji ile soy bağı araştırması mümkün olduğu gibi, bunun
kökleri tarihe dayandırılarak ataların tespiti, ait olunan kökenin belirlenmesi de söz
konusudur. Birçok laboratuvar, belirli ücretler karşılığında bireylerin genetik ataları
hakkında ayrıntılı bilgi sağladıklarını iddia etmektedir. Bu kuruluşlar, yeryüzünde var olan
belirli popülasyonlarla ilişkilendirilen haplogrupları belirleyecek DNA dizinleme
tekniklerini kullanır. Bazıları bireyin etnik geçmişinin yüzde değerlerini verir (%35
45
Avrupalı, %50 Asyalı, %15 Afrikalı gibi). Ancak bu hizmetlerin güvenilirliği tartışmalıdır
(Walker, 2008).
DNA tiplemesinin akrabalık analizinde kullanıldığı ilginç bir örnek, 1990’larda
Rus hükümdar ailesinin son bireyleri, Romanov’ların kemiklerinde gerçekleştirilen
çalışmadır (Gill et al., 1994): Çar Nicholas II, Rusya Devrimi’nde tahttan indirilmişti. Eşi
Çariçe Alexandra ve beş çocuğu ile birlikte hapse atılmış, 1918’de doktor ve hizmetçileri
de dahil hepsi öldürülmüştü. 1991’de komünizmin düşmesinden sonra, cesetler
mezarlarından çıkarıldı ve incelenmeye başlandı. Mezarlardan elde edilen çocuk ve
yetişkin kemikleri birbirine karıştığı gibi, doktor ve hizmetçilere ait kemikler de ayırt
edilemiyordu. Ancak çocuk kemiklerinin sadece Çar ve Çariçe’ye ait olduğu
düşünülüyordu. Dolayısıyla hangi yetişkinlerin çocukların ailesi olduğundan yola çıkılarak
Çar ve Çariçe’nin kemikleri belirlenebilirdi.
Her bireye ait kemikten DNA çekitlendi ve beş STR lokusu PCR ile tiplendi.
Sadece ikisi çocukların ebeveynleri hakkında yeterli bilgi sağlayabildi. Ancak bunlar
gerçekten Romanov’ların kemikleri miydi yoksa herhangi bir ailenin iskelet kalıntıları
mıydı? Bunu belirleyebilmek için kemiklerdeki DNA, Romanov’ların yaşayan
akrabalarının DNA’ları ile karşılaştırıldı. Romanov’ların mtDNA çalışmaları, sonunda
kemiklerin Çar Nicholas, Çariçe Alexandra ve üç kız çocuklarının olduğunu gösterdi.
Romanov’ların mezarında sadece üç çocuk bulunmuştu. Tek oğlan Alexei ve dört
kızdan biri kayıptı. 20.yüzyılın ortalarında birçok kadın, Romanov prensesi olduğunu iddia
etmiştir, çünkü kemikler elde edilmeden önce bile, kızlardan birinin (Anastasia)
Bolşeviklerden batıya kaçtığı söylentisi vardır. DNA analizi, bu iddialarda bulunanların
hiçbirinin Çar ve Çariçe’nin kızı olmadığını göstermiştir. İki çocuğun yokluğu, kemiklerin
46
farklı bir yere gömülmüş olduklarını düşündürmüştür (Gill et al., 1994). Ancak son yıllarda
bir erkek ve bir kız çocuğunun iskeletlerin bulunduğu, bununla birlikte Alexei’nin giydiği
kıyafetlerle Maria’nın kullandığı takılara benzer kalıntılarının da bu iskeletlerin yanında
bulunduğu bildirilmiştir (Brown, 2006).
Arkeolojik kapsamda aile bağlarının açıklanması için bir örnek de, Almanya
Bavaria’da St. Margareth’s Kilisesi kazısında görülür (Gerstenberger et al., 1999).
Kilisedeki mezar taşları ve açıklamalar, Königsfeld Kontu ailesinin yedi neslinden sekiz
erkek bireyin 1546–1749 arasında gömüldüğünü gösterir. Sekiz bireyde genetik testler,
tarihi kaynaklarda yazılan şecere ile farklılık gösterir (Şekil 5). Bunlardan ikisi genetik
olarak kadındır ve Kont değildir. Otozomal ve Y kromozomal mikrosatellitler daha ileri
anomaliler olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu işaretler, iki en büyük Kont’un iskeletlerinin
(55 ve 33) muhtemelen kazı sırasında karıştığını ve son erkeğin (11) önceki Kont’un (54)
biyolojik oğlu olmadığını göstermiştir. Bu sebeple bu birey, ya Königsfeld ailesinin bireyi
değildir, ya da babalık dışı bir olgudur. Önceden Karl Albrecht olarak bilinen kadın birey
(32) otozomal haplotipi, Karl Albrecht’in kız kardeşi ve Georg Josef’in (11) kızıdır. Diğer
kadın birey (1) ise bu kadının (32) annesi olarak tanımlanır (Georg Josef’in karısı).
Königsfeld’lerden Georg Josef ve tüm aile grubunun varlığı, Georg’un aslında bir babalık
dışı olgunun ürünü olduğunu gösterir ki; Königsfeld soyu dışında bir kişi ve onun ailesinin
bu mezarda yattığı ortaya çıkar. Diğer tarihî bilgi ve belgelerle kurulan aile ilişkilerinin ise
genetik analizlerle uyumlu olduğu da gösterilmiştir (Gerstenberger et al., 1999).
47
Arkeolojik ve tarihsel
yapılandırma
Genetik yapılandırma
Karl Albrect’in kız kardeşi
Belirlenemeyen kadın
birey (30 yaşlarında)
Şekil 5. Königsfeld Kont’larının geleneksel aile mezarlığında (1546–1749) arkeolojik
ve tarihi kayıtlara göre çıkarılan soyağacı ile genetik soyağacının karşılaştırılması.
Otozomal STR’lerle 33 ve 55 yer değiştirmiş, hem otozomal hem de Y-STR’lerle 11’in
54’ün biyolojik oğlu olduğu dışlanmış, ancak otozomal STR’lerle 32’nin babası olduğu
belirlenmiştir. 32’nin bir kadın, muhtemelen Karl Albrecht’in kızkardeşlerinden biri
olduğu belirlenmiştir. O güne kadar idantifiye edilememiş yetişkin bir kadın olan 1, 32’nin
annesidir; böylece Königsfeld ailesinin bir üyesi olan Maria Anna olarak tespit edilir
(Hummel, 2003).
Akrabalık Tayinlerinde İstatistiksel Hesaplar
İncelenen bir biyolojik örneğin idantifikasyonundan sonra, kişiye ait olup
olmadığının tespiti için yapılan karşılaştırma sonunda örnek dışlanabilir veya dahil
edilebilir. Bu dahil etmede rastgele uyuşma olasılığı önemlidir ve istatistiksel hesabın
yapılabilmesi için, incelenen özelliklerin toplumda görülme sıklığının bilinmesi gerekir
(Rudin and Inman, 2002). Adli bilimlerde olasılık, kaç kişide bir aynı DNA profilinin
görülebileceğini bildiren bir indeks ve bu indeksten yararlanılarak elde edilen EssenMöller oranı (W) ile hesaplanır (Essen-Möller, 1938). Ebeveynlik testlerinin dışında,
kitlesel felaketlerde karışmış, parçalanmış bireylerde veya kayıp kişilerde ters ebeveynlik
48
testleri de yapılabilir. Ancak akrabalar gibi birbiriyle genetik olarak ilişkili bireylerin DNA
örnekleri arasında birçok alel paylaşıldığından, farklı istatistiksel eşitlikler uygulanmalıdır
(Fung et al., 2003; Butler, 2005; Brenner, 2009). Hatta bazı olgularda, özellikle göçmenlik
uygulamalarında yanlış babanın akraba olma olasılığı yüksektir. Örneğin; incelenen birey
gerçek babanın erkek kardeşi olabilir (Fung et al., 2002). Aile ilişkilerinin etkisini
hesaplamak için uyuşma olasılık formülleri geliştirilmiştir. Bu olasılıklar, lokusların her
alelinde farklı oranlarda olmak üzere akrabalık derecesi yakınlaştıkça artar (Evett and
Weir, 1998).
Günümüzde araştırmacılar, babalık veya kardeşlik analizlerinde kullanılacak
yazılımlar geliştirmekte veya var olanları deneyerek bilim dünyasına sunmaktadır (Blouin,
2003; Fung, 2003; Riancho and Zarrabeitia, 2003; Fung et al., 2006; Fischer, 2009; Alt et
al., 2009). Genetik verileri incelemek için uygun bilgisayar programları olduğu gibi,
istatistiksel hesaplar yapabilen yazılımlar da piyasada mevcuttur. Örneğin; “BioEdit” gibi
programlar dizin verilerini işlemek için kullanılır ve örnekler arasında karşılaştırmalarda
kolaylık sağlar (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). “Popgene” gibi çok sayıda
örnekle çalışabilen istatistik programları ile alel frekanslarından, popülasyonlar arası
genetik uzaklığa kadar birçok bilgi elde edilebilir (http://www.ualberta.ca/~fyeh/).
“Powerstats” gibi programlar ise örneklerin rastgele uyuşma olasılıkları, sistemlerin
dışlama gücü gibi hesapları yapar (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/).
Bireylerin akraba olduğu durumlarda yapılacak analizlere özgü istatistiksel hesaplamalar
yapan programlar da geliştirilmiştir. Örneğin, “Familias” programı DNA profilleri bilinen,
ancak aile ilişkileri sorgulanan olgularda olasılıkların belirlenmesi için kullanılır (Egeland
49
et al., 2000). “GenoProof” yazılımı standart babalık testlerine ek olarak, X ve Y-STR
analizleriyle akrabalık, kardeşlik ilişkilerini analiz eder (http://qualitype.de/genoproof/).
BİYOARKEOLOJİK ÖRNEKLERDE DNA ÇALIŞMALARI
Eski örneklerden DNA eldesi ilk kez 1984'te Higuchi ve meslektaşları tarafından
gösterilmiştir. Atgillerin nesli tükenmiş bir üyesi olan Equus quagga’nın müze örneğinde
(deri kalıntıları) nükleik asitlerin varlığını ortaya koymuşlar ve bunun modern zebra ile
filogenetik yakınlığını belirlemişlerdir (Higuchi et al., 1984). Bir yıl sonra Pääbo (1985)
Mısır Hanedanlığı’na ait 2400 yıllık mumyalaşmış bir çocuktan DNA dizisi elde etmiştir.
Bu sonuç, sadece moleküler analizin mümkün olduğunun gösterilmesi açısından değil,
aynı zamanda büyük bir DNA parçasının (> 3 kb) dizinlenebildiğini ortaya çıkarması
açısından da önemlidir (Pääbo, 1985). Johnson ve meslektaşları (1985) mamut
kalıntılarında, Rogers ve Bendich (1985) ise herbaryum örneklerinde DNA’nın varlığını
ispatlamışlardır. Bu ilk çabalar eski DNA parçalarını elde etmek, bir vektöre kopyalamak
ve klonlanan parçaların dizinlenmesi aşamalarını içermekteydi. Ancak bu teknik izole
edilmiş çok fazla aDNA gerektiriyordu. Daha sonra PCR'ın keşfi ile birlikte (Mullis and
Faloona, 1987) yapılan ilk aDNA çalışması, Hagelberg ve meslektaşlarının (1989)
arkeolojik kemikten başarıyla DNA çoğaltmasıdır. Ardından çok sayıda araştırmacı farklı
coğrafik bölgelerdeki çeşitli örneklerden eski DNA elde etme çalışmalarına başlamıştır.
Fiziksel antropolojide eski DNA analizi çalışmaları, bireysel veya toplumsal
yapılabilir. Geçmişten kalan iskelet veya doku örnekleri bulunmuş bir bireyden
gerçekleştirilen DNA analizi ile cinsiyet tayin edilebilir, idantifikasyon yapılabilir.
Arkeolojik kökenli iskelet koleksiyonlarının DNA incelemeleriyle tarih öncesi toplumların
50
genetik özellikleri ve göç şekilleriyle ilgili bilgi edinmek de mümkündür. Tüm bu verilerle
bireyler arasındaki akrabalık ilişkileri belirlenebilir, arkeolojik ve modern toplumlar
arasında çeşitli karşılaştırmalar gerçekleştirilebilir (O’Rourke et al., 2000).
Birey Düzeyinde aDNA Çalışmaları
Cinsiyet Tayini: aDNA, en basit düzeyde, X ve Y kromozomları üzerindeki
işaretleri kullanarak bireyin cinsiyetini belirlemeye yarar. Genetik cinsiyetlendirme,
standart morfolojik yöntemlerle cinsiyetinin belirlenmesi çok zor olan çocuklar ve ergin
olmayan bireylerde veya parçalanmış kalıntılarda özellikle yararlıdır ve gereklidir (Stone et
al., 1996; Kaestle and Horsburgh, 2002; Imaizumi et al., 2005; Arslan et al., 2008).
Pompei arkeolojik alanından elde edilen kalıntıların cinsiyetleri moleküler düzeyde
tayin edilmiş, antropometrik değerlendirmelerle karşılaştırılarak sunulmuştur. On üç
iskelet örneğinden üçünde cinsiyetin tahmin edilenden farklı olduğu belirlenmiştir
(Cipollaro et al., 1998). Meyer ve meslektaşları (2000), on iki bireye ait otuz altı diş ve
kemik örneğinde Amelogenin analizi gerçekleştirmiş, bazı erkek bireylerde amplifikasyon
olmamış, bazen de alel düşmesi ile cinsiyet tayini zorlaşmış ve bağımsız başka PCR’lar
yapmak gerektiği belirtilmiştir. Diyarbakır, Çayönü tepesinde bulunan 9.400 yıllık on
insan kafatası örneğinde X ve Y kromozomlarındaki alfoid tekrarları ve amelogenin
kullanılarak genetik cinsiyet tayini gerçekleştirilmiş, dokuzunda morfolojik cinsiyet
genetik cinsiyet ile doğrulanmıştır (Matheson and Toy, 2001). Hatay’ın Reyhanlı ilçesinde
Amik Ovası'nın ortasındaki Kalkolitik yerleşim yeri olan Tell Kurdu’dan elde edilen kemik
örneklerinde moleküler cinsiyet %64 başarıyla belirlenmiştir (Mekel-Bobrov and Lahn,
2004).
51
Rönesans döneminin en büyük bilginlerinden biri sayılan, 1304–1374 yılları
arasında yaşamış İtalyan hümanist ve şair Francesco Petrarca’nın 2003’te açılan
mezarından çıkarılan kemiklerin analizinde; cinsiyet moleküler düzeyde çalışılmış,
kaburga kemiklerinin erkeğe, ancak diş örneklerinin kadına ait olduğu belirlenmiştir.
Bulgular morfolojik analizlerle tutarlıdır. Ayrıca kafatasının kaburga kemiklerinden iki yüz
yıl daha eski olduğu açığa çıkarılmıştır. Petrarca’nın iskelet kalıntılarının bir kısmının
çalındığı bilinmektedir. Ancak bu bulgulardan sonra, bir kadına ait ve daha eski olan
kafatasının, çalınan kemiklerin yerine konulduğu düşünülmüştür (Caramelli et al., 2007;
Pilli et al., 2008).
İdantifikasyon: aDNA, adli bilimcilerin kullandıklarına benzer yöntemlerle
bireyleri idantifiye eder. Bu yolla, karışmış örnekler en az birey sayısına ayrılır ve
gömülme sırasında veya kazıdan sonra kırılmışsa birleştirilebilir. Eğer morfolojik katkılar,
bireyin genetik veya salgın bir hastalıktan etkilendiğini gösteriyorsa, aDNA hastalığın
varlığını doğrulayabilir. Yaşayan ataları bilinen bireyler, aDNA yoluyla birbiriyle
kıyaslanarak idantifiye edilebilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Arkeolojik kazılarda
bulunan hayvan kemikleri genellikle deneyimli bir arkeozoolog tarafından kolaylıkla
belirlenir. Ancak tür idantifikasyonu sadece diyafiz parçaları kalmışsa zorlaşabilir.
Özellikle iki yakın tür olan koyun ile keçiyi, köpek ile kurdu ayırmak zordur. Bu türlere ait
kemik örneklerinden moleküler genetik analizlerle idantifikasyon yapılarak kesin sonuca
ulaşılır (Hummel, 2003).
Japonya’da iki bölgeden elde edilen, bazıları birlikte gömülmüş iki grup insan
kalıntısı (yirmi altı ve yirmi dokuz iskelet) VNTR kullanılarak idantifiye edilmiş,
birbirleriyle karşılaştırılmış, ancak eski toplumlarda alel frekansları hakkında veri olmadığı
52
için akrabalık olasılığını tahmin etmenin güç olduğu vurgulanmıştır (Kurosaki et al.,
1993). Kayıp bir kişinin İzmir’de bulunan iskeleti DNA analiziyle idantifiye edilmiş ve
aile bağlarının tahmini yapılmıştır (Altunçul et al., 1999).
Mart 1995’te Bolivya Hükümeti tarafından Che Guevara’nın 1960’larda ülkede bir
yerlere gömülmüş gerillalarının kalıntılarını bulmak için komisyon oluşturulmuştur. Grup
daha sonra uluslar arası boyut kazanmış ve Arjantin, Küba ve Bolivya’dan adli bilimciler
de katılmıştır. Birkaç ay sonra iki gömü yerinde bazı iskeletler bulunmuş, STR ve mtDNA
analizleriyle idantifikasyon yapılmıştır. Bireylerin çocuk ve eşleriyle karşılaştırılmaları
sonucunda kimlikleri tespit edilmiş, biri dışlanmış, diğeri sadece kardeşi hayatta olduğu
için kesin olarak belirlenememiştir. Çalışma hem tarihsel, hem de insani sebeplerle
Bolivya’daki savaşta grubun ölen üyelerinin bulunup belirlenmesi için devam eden çabalar
açısından önemlidir (Lleonart et al., 2000).
Almanya, Lower Saxony’de Harz dağlarının güneybatısında bulunan Lichtenstein
Mağarası’nda 1972’de varlığı tespit edilen gömüler Geç Tunç Çağı’na (1000–700 BC)
tarihlendirilmiştir. Hem insan, hem hayvan orijinli iskelet materyali, 6–8º C’lik sabit düşük
ısı ve alçıtaşı, kireç ve silisli tortu tabakası ile kaplanmış olması sebebiyle çok iyi
korunmuştur. Sağ ve sol femur ve tibialar ile birlikte iki kalça kemiğinden STR, mtDNA
ve Y kromozomu analizleri yapılmış, femurlar, tibialar ve bir kalça kemiğinin aynı bireye,
ikinci kalça kemiğinin başka bir bireye ait olduğu belirlenmiştir (Schweitzer et al., 2008).
Kayıp insanlar için kurulmuş olan uluslar arası komisyon (International
Commission on Missing Persons, ICMP), Yugoslavya’daki kitle mezarlarından elde edilen
degrade iskelet kalıntılarında on bir binin üzerinde bireyin, kayıp kişilerin aile bireylerinin
profillerinden oluşan geniş bir veri tabanı ile kıyaslanması yoluyla idantifiye edildiğini, bu
53
amaçla mini-STR’leri kullandıklarını bildirmiştir (Parsons et al., 2007). Fondevila ve
meslektaşları (2008), büyük bir orman yangınından elde edilen parçalanmış bir kemiği
tipleyerek kızı olduğunu iddia eden kişinin profiliyle kıyaslanması için STR, SNP, miniSTR analizleri ve mtDNA dizinlemesini gerçekleştirmiştir.
Aile Düzeyinde aDNA Çalışmaları (Akrabalık Tayini)
Soy ağaçlarının kullanılmasının antropoloji içinde uzun bir tarihi vardır ve aDNA
analizleri bu uygulamaları geçmişe doğru genişletmeyi sağlamıştır. Basit bir şekilde,
sadece annelik ve babalık değil, annesel (maternal) ve babasal (paternal) yollar mtDNA ve
Y kromozomu ile idantifiye edilebilir. Yüksek çeşitlilikte uzun DNA bölgeleri incelenirse,
aynı arkeolojik bölgeden aynı mutasyonları paylaşan insanların yakın ilişkili olduğu
belirlenir. Çünkü meydana gelen bir mutasyon yeterli nesiller boyunca ayrılmamıştır.
Ancak bu yöntem yüksek güvenilirlikle annelik / babalık tayini sağlamaz. Bir birey, sadece
annesiyle değil, kardeşleri, anneannesi, anne tarafından akrabaları (teyze, dayı, kuzen) ile
de aynı mtDNA mutasyonlarına sahiptir. Benzer şekilde erkekler de sadece babalarıyla
değil, erkek kardeşleri, baba tarafındaki akrabaları (dede, amca, erkek kuzen) ile aynı Y
kromozomu mutasyonlarını paylaşır. Bireyler arasında annelik ve babalığı gerçekten
belirlemek için, çok sayıda yüksek değişken otozomal işaretlerde çeşitlilik incelenmelidir.
Çocuklar her ebeveynin her kromozomundan bir kopya aldığı için, otozomal
mutasyonlarının yarısının her bir ebeveynle uyuşması gerekir. Aynı işaretleri kullanmak,
diğer ailesel bağları da (kardeşlik gibi) ortaya çıkarır (Kaestle and Horsburgh, 2002).
Arkeolojik kayıtlar çerçevesinde, annesel ve babasal yolların veya daha belirgin
aile bağlarının tespiti; tarih öncesi toplumların sosyal yapı, evlilik ve gömme gelenekleri
54
ile ilgili hipotezleri test etmede büyük bir atılımdır. Akrabalık bağları, gömü modelleri ve
morfolojik benzerlikler temel alınarak hipotezlenebilse de, DNA kullanmadan doğrudan
belirlenemez (Kaestle and Horsburgh, 2002).
Fily ve meslektaşları (1998), Fransa'nın güneyindeki Bask bölgesinden dört Tunç
çağı (3700 yıl önce) iskeletinde HVRI ve HVRII dizin farklılığını bildirmişlerdir. Sonuçlar
dikkat çekicidir, çünkü anne tarafından bağlantı tespit edilebilmiştir. Sonuçlar sadece
HVRII dizin bilgisine dayansa da, dördünün aynı aile üyeleri olması olasıdır. Elde edilen
HVRI dizinlerinin ise insan kaynaklı olmadığı, sıçangillere ait olduğu gösterilmiştir. Bu
durum, özellikle pozitif kontrol örnekleri olarak insan yaşıyla karşılaştırılabilir nitelikte
olan bir insan dışı materyal kullanılacaksa, aDNA araştırmalarında primer tasarımının
spesifikliğinin garanti edilmesi gerektiğini gösterir.
Doğu Kazakistan’da bir köyün yakınlarında taş bir tümülüs altındaki donmuş
mezarda iyi korunmuş durumda bulunan iki iskelete ait kemik, beyin ve kas dokusundan
elde edilen DNA’da STR ve mtDNA analiz edilmiş, diğer dokulardaki yüksek PCR
inhibisyonundan dolayı, sadece kemikte başarılı sonuçlara ulaştıkları belirtilmiştir.
Örneklerden biri kadına, diğeri erkeğe aittir. İlk çalışılan sistemlerle her lokusta bir alelin
ortak olması, bireylerin anne-oğul, baba-kız veya kız kardeş-erkek kardeş gibi yakın
akrabalığına işaret etmektedir. Lokus sayısı arttırılarak analiz yapıldığında eklenen
lokuslarda farklılıklar görülmüştür, böylece anne-oğul veya baba-kız ihtimalleri
dışlanmıştır. MtDNA analizleri ile tespit edilen üç mutasyon sebebiyle, bireylerin kardeş
veya anne tarafından akraba olma ihtimalleri de indirgenmiştir. Böylece bu kişilerin yakın
akraba olmadığı, evli bir çift olabileceği sonucuna varılmıştır. Dolayısıyla hem STR hem
55
de mtDNA gibi analiz yöntemlerini birlikte kullanarak akrabalık konusunda yorum
yapmak daha güvenilir sonuçlar sağlayacaktır (Clisson et al., 2002).
Kuzey Moğolistan’daki bir nekropolden elde edilmiş elli altı iskelet kalıntısında
mikrosatellit çalışılmış, kırk yedisinde (%84) başarı sağlanarak bazı örneklerin birbirleriyle
genetik yakınlıklarını ortaya çıkarılmıştır (Keyser-Tracqui et al., 2003). Japonya,
Hokkaido’da gömü bölgesindeki bir mezarda iki iskeletin anne tarafından akraba olduğu
belirlenmiş, tahmin edilen yaşlara göre bunların kardeş (birinci derece akraba), dayı/teyze,
erkek/kız yeğen (ikinci derece akraba) ya da anne tarafından kuzen (üçüncü derece akraba)
olabilecekleri bildirilmiştir (Adachi et al., 2003).
Hindistan’ın şehir ve köylerindeki tarihi mezarlıklarda STR ile aile ilişkileri
belirlenmeye çalışılmış ve veriler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Şehir
mezarlarında daha fazla aile bağı tespit edilmiş, köy mezarları ise daha az genetik yakınlık
göstermiştir (Sivilich, 2005). Başka bir araştırmada ise aynı gömü bölgesinde bir
mezardaki iki yetişkin kadının arasında herhangi bir yakınlık olmadığı belirtilmiştir
(Adachi et al., 2006).
İspanya’nın bazı arkeolojik bölgelerinden elde edilen otuz dokuz kemik ve diş
örneğinde mtDNA analiz edilmiş ve bireyler arasında düşük çeşitlilik gözlemlenmiştir.
Bireylerin çoğu ortak Avrupa motifini göstermektedir. Bu durumda aynı mtDNA profilini
taşımak, anne tarafından akrabalığı göstermeyebileceği için, ileri analizler yapılmalıdır
(Fernandez et al., 2006). Danimarka kralları ve kraliçelerinin birlikte gömülü olduğu
katedralde 1074’te ölen son Viking Kralı Sven Estridsen’in ve tarihçiler tarafından kimliği
tartışmalı bulunan annesi Estrid’in kemiklerinden mtDNA analizi gerçekleştirilmiştir. İki
birey arasında iki noktada dizin farklılığının gözlenmesi, kadının Sven’in annesi
56
olamayacağını, hatta fiziksel incelemeler bu bireyin daha genç olduğunu, Sven’in, adı
Estrid olan ve Kraliçe ünvanı alan iki gelininden biri olabileceğini ortaya çıkarmıştır
(Dissing et al., 2007).
Çin’in kuzeybatısındaki Lajia bölgesinde seli takip eden bir depremle ölmüş tarih
öncesi toplumdan elde edilen on altı bireye ait diş örnekleriyle anne tarafından akrabalığı
belirlemek için mtDNA analizleri yapılmıştır. Çünkü antropometrik analizler ve iskelet
pozisyonları, araştırmacılara ölenlerin yakın akraba olduklarını, hatta bazı bireylerin anneçocuk olduğunu düşündürmüştür. Analiz sonunda on dört birey başarıyla tiplenmiş,
birbirleri arasındaki kardeşlik, anne-oğul ilişkileri ortaya çıkarılmıştır (Gao et al., 2007).
Kuzey Hırvatistan’daki Erken Orta Çağ gömü bölgesindeki dört bireyden DNA
analiz edilmiş ve akrabalık olasılıkları hesaplanmıştır (Boljuncic, 2007). Yunanistan’da
Miken Uygarlığı’na ait bir mezarda bulunan ve DNA analizi gerçekleştirilen iskeletlerden
iki bireyin birbirinin kardeşi olduğu belirlenmiştir. Bunlardan kadın bireyin, erkeklerin çok
olduğu bu mezarda herhangi bir evlilik bağı sebebiyle değil, doğum hakkına sahip bir
pozisyonda olması sebebiyle bulunduğu gösterilmiştir (Bouwman et al., 2008).
Toplum Düzeyinde aDNA Çalışmaları
Bazı arkeologlar, yeni popülasyonların son 10.000 yıl içinde Avrupa’ya göç etmiş
olabileceğini düşünmektedir. Kıtaya tarımı bu insanlar getirmiştir. Avcılıktan ziraate geçiş,
Güneybatı Asya’da 10.000 yıl önce Erken Neolitik köylüleri buğday ve arpa gibi tohumları
ekmeye başladıklarında gerçekleşmiştir. Düzen kurulduktan sonra, tarım Asya, Avrupa ve
Kuzey Afrika’ya yayılmıştır. Kültür bitkilerinin kalıntıları için arkeolojik alanların
araştırılması ile Avrupa’ya tarımı getiren iki rotanın izi bulunmuştur. Bunlardan biri
57
Akdeniz sahilinden İspanya’ya, İngiltere’ye; diğeri ise Tuna ve Rhine vadileri boyunca
Kuzey Avrupa’ya doğrudur. Tarımın yayılması, çiftçilerin bir yerden başka bir yere göç
ederken buluşlarını, hayvanlarını ve tohumlarını da yanlarına alarak, o zamanlar
Avrupa’daki tarım öncesi toplulukları yerlerinden etmeleriyle gerçekleşmiştir.
Arkeogenetikçiler, 1990’larda Avrupa’daki popülasyonlarda 95 nükleer gen bölgesi ile
yapılan geniş filogenetik çalışmalarla örtüşen bu modeli desteklemektedirler. Bu da,
güneybatı Asya’dan kuzeydoğu Avrupa’ya veya tam tersi yönünde bir göçün olduğunu
gösterir. Çünkü ilk göçler, arkeolojik kayıtlara göre tarımın yayılmasıyla aynı zamana
rastlamaktadır (Brown, 2006).
Avrupa popülasyonlarıyla ikinci çalışma mtDNA ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar,
Avrupalı toplumların son 20.000 yıldır sabit kaldığını göstermiştir. Bu durumda tarım
Avrupa’ya ne zaman yayılmıştır? Modern Avrupa toplumlarında daha ileri mitokondriyal
DNA varyasyon çalışmaları, tarımın yayılmasında başka bir modelin olduğunu işaret
etmektedir. Modern Avrupalılar arasında mitokondriyal genomun 11 büyük sınıfa
(haplogrup) ayrılabileceği belirlenmiştir. En eski haplogrup, Avrupa’da 50.000 yıl önce
görülmüştür. Bu, arkeolojik kayıtlara göre, ilk modern insanın kıtaya gelişi ile
çakışmaktadır. Tarımın başlangıcı ile ilişkili olabilecek en yeni haplogruplar, J ve T1,
modern Avrupa popülasyonlarının %8.3’ü ile ifade edilir. Günümüzde tarımın Avrupa’ya
önceden oraya yaşayan toplulukları yok etmeden onlarla birlikte yaşayıp üreyen küçük
öncü gruplar tarafından getirildiği düşünülmektedir (Brown, 2006).
Tarih öncesi popülasyonların hareketi, devamlılığı veya yer değiştirme konuları,
özellikle test etmek için çok sayıda eski birey varsa, aDNA kullanılarak incelenebilir.
Pompei arkeolojik alanının bu konuda bilimsel önemi çok fazladır, çünkü bilinen bir
58
tarihte aynı felaketle ölen bir insan popülasyonunun rastgele örneklemesini sunar
(Cipollaro et al., 1998).
Popülasyon Genetiği: Güney Almanya’da Orta Çağ’a ait bir mezarlıktaki otuz
sekiz iskelet kalıntısının genetik analizlerle popülasyonlar arası ilişkileri araştırılmıştır
(Scholz et al., 2001). Kuzeydoğu Sibirya’da yaşayan etnik bir grup olan Yakut
toplumundan elde edilen iskelet örneklerinde STR ve mtDNA analizleriyle genetik
ilişkileri incelenmiş, eski Yakut popülasyonu ile modern Sakalar arasındaki ilişkiler ortaya
çıkarılmıştır (Ricaut et al., 2004, 2006). Gamba ve meslektaşları (2008), Doğu İspanya’da
on yedi arkeolojik bölgeden elde edilmiş otuz altı farklı bireye ait yirmi bir kemik, on beş
diş örneğinde mtDNA analizi gerçekleştirmiş ve İber yarımadasının doğusunda prehistorik
Afrika genetik alt yapısının varlığını göstermiştir. Gao ve meslektaşları’nın (2007) Lajia
bölgesinde yaptıkları çalışmada Lajia popülasyonunun genetik yapısı hakkında bilgi
edinilmiştir. Komünite, matrilineal klan değildir, baba tarafından ilişkili çok sayıda ailenin
birleşmesiyle oluşmuş geniş bir toplumdur. Modern Çin popülasyonu ile karşılaştırma
yapıldığında, Kuzeybatı Çin’de yaşamış bu halkın etnik tarihi ile uyumlu olarak, modern
toplumun maternal gen havuzuna katkıda bulunmuş olabileceği söylenir. Bu arkeolojik
bölge, seli takip eden bir deprem gibi büyük bir felaketle yok olmuş tarih öncesi topluma
ait veriler sunduğundan, aynı zamanda arkeologlar tarafından “Doğu Pompei” olarak da
adlandırılmaktadır (Zhang et al., 2004).
Bazı örnekler nadir de olsa iyi korunduğu için DNA’daki hasar oranları göz ardı
edilebilir. Ancak özellikle popülasyon genetiği çalışmalarında DNA hasarı önemli bir
faktördür ve mutlaka göz önüne alınmalı veya elimine edilmeye çalışılmalıdır (Axelsson et
al., 2008). Genetik varyasyon grupların atalarından kalıtıldığı için, farklı frekanslı eski ve
59
modern grupların yakın ilişkili olmaması beklenirken, modern grupların atalarıyla benzer
frekansları olması beklenir. Ayrıca belirli genetik işaretlerin sınırlı dağılımları vardır ve
ilişkilerin belirteçleri olarak kullanılır. Bu yolla, birçok ölçüde ata-torun bağları ile ilgili
sorular cevaplanabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Büyük gruplar (≥ 25 birey)
örneklemede hatalı sonuçları önler. Ayrıca arkeolojik alan içindeki bireylerin ilişkilerini
araştırmaya yarar. Bir toplumda nadir görülen bir genetik polimorfizmi veya aleli paylaşan
iki birey, sık görülen bir polimorfizmi paylaşanlardan daha yakın ilişkilidir (Stone, 2008).
aDNA verileri, belirli bir bölgedeki popülasyonun devamlılığı hipotezlerini test etmek için
de kullanılabilir. Daha geniş açıdan bakılırsa, büyük popülasyon hareketleri ile ilgili
hipotezlerde de aDNA’dan yararlanır. Örneğin linguistik ve arkeolojik deliller, şu anda
aDNA çalışmalarıyla keşfedilen, Amerika’daki birçok tarih öncesi toplum hareketini
desteklemektedir (Kaestle and Horsburgh, 2002).
Göç Yolları: Handt ve araştırıcıları (1994a), Tyrolean Alpleri’nde bulunan 5000
yıllık donmuş bir mumyayı incelenmiştir. Buzul dönemindeki bu geç Neolitik birey,
Tyrolean Buz Adamı veya Ötzi olarak adlandırılmıştır. Soğuğa rağmen DNA degrade
olmuş ve nükleer amplifikasyon, hatta moleküler düzeyde cinsiyet tayini yapılamamıştır.
MtDNA analizleri ise sonuç vermiş ve klonlardan HVRI dizinlenmiştir. Gözlenen
dizinlerin heterojenliği, modern kontaminantlarının varlığını göstermiştir, ancak çok sayıda
klon dizisinin doğrulanmasıyla örneğin eski mtDNA'sı da belirlenebilmiştir. Bu bireyde
gözlenen dizin varyantları, Kuzey Alpler’de yaşayan modern toplumlarda sık görülenlerle
tutarlıdır. Rollo ve meslektaşları (1994b) ise Buz Adam’ın kıyafetlerini incelemiştir. Buna
göre Buz Adam’ın bir paltosu ve bitki kalıntıları taşıyan ayakkabıları vardır. Hem bu
çimenlerden, hem de mikroorganizmalardan elde edilen DNA analizleri, çimenlerin
60
ekildiği zaman hakkında bilgi vermektedir.
Hollanda'daki kazılarda elde edilen yedi iskelet örneğinde (1100–1850 yıl önce)
gözlenen heterojen HVRI dizini, Kuzey Avrupa'nın birçok büyük mtDNA haplogruplarını
göstermektedir (Colson et al., 1997).
Stone ve Stoneking (1993, 1998, 1999) Amerika, Batı İllionis'in Oneota arkeolojik
bölgesindeki iskeletlerden DNA elde etmişler, örneklerin ait olduğu mtDNA
haplogruplarını (A, B, C ve D) tespit etmişlerdir. Amerika’da Utah'ın Kuzey Fremont (Parr
et al., 1996, O’Rourke et al., 1996) bölgesindeki kırk üç örnek ve güneybatıdaki Anasazi
(Carlyle et al., 2000) bölgesinde kırk örnekte mtDNA varyasyonu incelenmiştir. Coğrafik
olarak yakın bu iki bölgedeki örneklerin haplogrup profilleri benzerdir. Ayrıca bunlar
modern güneybatı popülasyonları ile benzer mtDNA haplogrup profillerini paylaşır
(O’Rourke et al., 2000).
Japonya'da (Horai et al., 1989, 1991) Jomon (3000–6000 yıl önce) ve ilk modern
Ainu örneklerinin (200–300 yıl önce) HVRI verileri, modern Japonlarla dizin benzerliği
olduğunu ve Japonların anavatanı kabul edilen Güneydoğu Asya'daki modern nesillerle
aralarında da bazı benzerliklerin bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu çıkarım ön çalışma
olarak kabul edilmelidir, çünkü çalışılan eski örnek sayısı sadece altıdır ve yaş aralığı çok
geniştir (O’Rourke et al., 2000). Son zamanlara kadar Çin'deki genetik çeşitliliğin tarih
öncesi modellerinin sistematik araştırması yapılmamıştır. Oota ve meslektaşları (1995,
1999), Çin'deki Shandong bölgesinde Yixi alanından çıkartılan elli sekiz diş ve kemik
örneğinde 2000 yıllık mtDNA HVRI ve HVRII için dizin bilgisi elde etmişlerdir. Modern
Asya dizin çeşitleriyle kıyaslandığında, analizler eski Yixi örnekleriyle modern Tayvan
arasında büyük benzerlikler olduğunu gösterir. Horai ve meslektaşları (1989, 1991)
61
tarafından incelenen Jomon örnekleri genetik olarak eski Yixi örneklerine, Güneydoğu
Asya ve Okyanusya'daki mtDNA neslinden daha çok benzemektedir (Oota et al., 1999).
Tarihsel Çevrenin Rekonstrüksiyonu için aDNA
Arkeologlar, eski toplumların yaşadığı çevrenin yeniden canlandırılmasına sıklıkla
ilgi duymaktadırlar. Tarih öncesi insanların var olduğu ekosistemin bilinmesi, besin elde
etme davranışı gibi çevrenin gerektirdiği kültürel adaptasyonlar ve mevsimsel göçler
hakkında bilgi sağlar. Ayrıca evcilleşme olayını anlamaya yarar. Çevresel rekonstrüksiyon,
tipik olarak bir alandaki floral ve faunal kalıntıları belirlemek ve türlerin tercihli
habitatlarından yerel çevreyi göstermekle gerçekleştirilir. Yakın ilişkili türler, geniş
çeşitlilikte habitatları tercih ederler ve tür tayininde zorluklar ortaya çıkar. Bu sebeple
türlerin kesin idantifikasyonu, yerel çevrenin yeniden canlandırılmasında kritik olabilir. Bu
çerçevede aDNA teknikleri arkeolojik alanlarda bulunan türlerin kesin idantifikasyonunda
kullanılabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002).
Çevrede var olan bitkilerin tespit edilmesi, buğday veya mısır kültürlerinin
yetiştirilmesi, sığırların evcilleştirilmesi, kullanılan boyaların veya parşömenlerin
kökeninin belirlenmesi aDNA analizleriyle mümkündür. Koprolitlerde sindirilmiş
hayvansal veya bitkisel besinlerin idantifikasyonu, canlıların beslenme şekilleri hakkında
fikir verir (Stone, 2008). Kloroplastlarında, mitokondrilerinde ve poliploid nükleer
genomlarında büyük miktarlarda DNA taşıyan bitkilerin fosil kayıtları incelendiğinde;
örneğin 5000 yıllık buğday (Brown et al., 1994), mısır (Goloubinoff et al., 1993), arpa ve
turp tohumu (O’Donoghue et al., 1996) örneklerinden elde edilen bilgilerle paleoekolojik
çalışmaların devamı gelmektedir.
62
İnsan dışı çeşitli türlerin coğrafik dağılımı ile ilgili bilgi edinmek için yapılan
ekolojik araştırmalar genetik analizlerle ilerlemektedir. Arndt ve meslektaşları (2003),
Burdur Ağlasun ilçesinin 7 km kuzeyindeki antik kent olan Sagalassos'taki kazılarda
günümüzde bölgede var olmayan bir balık türünün eski kalıntılarını tespit etmiş ve
başarıyla DNA izole edip çoğaltarak dizinlemişlerdir. Çatalhöyük’te bulunan eski buğday
örneklerinin varlığı, Türkiye’de Bilgiç ve Akkaya tarafından ilk kez moleküler düzeyde
gösterilmiş ve modern örneklerle DNA düzeyinde genetik ilişki analizi ile
değerlendirilmiştir (Bilgiç and Akkaya, 2000; Akkaya and Bilgiç, 2002; Bilgiç, 2002;
Somel 2003).
Tıbbi amaçlı çalışmalarda aDNA
Tarih öncesi hastalıklarla ilgili sorular aDNA teknikleri ile yanıtlanabilir. Eski
örneklerde hastalıklı bireylerde patojenlerin genomları da çok sayıda bulunur ve
paleopatolojik çalışmalar açısından önem taşır (Mitchell et al., 2005). Hastalıkların
varlığını göstermek için kullanılan geleneksel paleopatolojik yöntemler, tanısal iskelet
lezyonlarına dayanır. Çeşitli bulaşıcı hastalıklar, insan kalıntılarında benzer iskelet
patolojileri bırakabilir, bazı rahatsızlıklar ise iskelette ya iz bırakmaz ya da tanısal iz
bırakmaz. Enfeksiyöz ajanların genomunu incelemek, bu zorluğu ortadan kaldırır
(O’Rourke et al., 2000; Kaestle and Horsburgh, 2002). Bu amaçla kemik, diş, yumuşak
doku gibi eski biyolojik örneklerde veya mumyalarda Mycobacterium tuberculosis,
Yersinia pestis, Clostiridium'un birkaç türü ve Trypanosoma cruzi gibi bakterilerin DNA’sı
elde edilerek analiz edilmiş ve çeşitli hastalıkların varlığı tespit edilmiştir (Mitchell et al.,
2005; Zink et al., 2007). Tüberküloz sebebi patojen olan Mycobacterium tuberculosis;
63
1000 yıllık Peru mumyasından başarıyla çoğaltılabilmiştir (Salo et al., 1994). Taunberger
ve meslektaşları (1997) 1918’de dünyada yirmi milyon kişiyi öldüren grip salgını boyunca
toplanan patolojik örnekleri incelemiş, virüs RNA’sını izole etmiş, çoğaltmış, dokuz gen
parçasını dizinlemiştir. 1918 gribinin çok öldürücü olduğu belirlenmiş, bir kuş gribi
olduğuna dair önceki spekülasyonların tersine, dizinlenen genler bunun domuz gribi ile
ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. 14.yüzyıl Ortaçağ Kara Ölüm salgını boyunca 17–28
milyon kişinin ölüm sebebi olarak antraks, tifüs, tüberküloz gibi çeşitli patojenler
gösterilmişti. Ancak 14.yüzyıl Fransız mezarındaki çoklu gömüde bulunan yetişkin kadın,
yetişkin erkek ve çocuk olmak üzere üç bireye ait dişler analiz edildi. Çocuğa ait dişlerden
birinde ve bir yetişkin dişinde, veba patojeni olan Yersinia pestis’in Pla genini çoğaltmaya
yarayacak DNA elde edildi. Adı geçen diğer patojenlere özgü primerler ise örneklerden
aDNA çoğaltamadı (Raoult et al., 2000).
Bu teknikler İskoçya, Orkney’deki Norse mezarlığından insan kalıntılarında
leprozun idantifikasyonunu doğrulamada kullanılmıştır. İki bireyin kalıntıları incelenmiş,
biri leprozla uyumlu iskelet patolojisi göstermiş, diğerinde hiçbir patolojik durum
görülmemiştir. Amplifikasyon, leprozun patolojik belirteci olarak iskelette leproza sebep
olan bakteri Mycobacterium laprae’nin varlığını doğrulamıştır. Ancak patolojik bulgu
olmayan iskelette ise çoğaltma sonuç vermemiştir. İki iskeletten hiçbirinde tüberküloz
patojeni M. tuberculosis’e özgü primerler amplifiye olmamıştır (Taylor et al., 2000).
İnsan bağışıklık sistemi, bireyleri çevrede bulunan enfeksiyöz ajanlara maruz
kalmaktan korumak için sitokin polimorfizmleri göstererek evrimleşmiştir. Geçmişe ait diş
örneklerinde, otoimmun hastalıklara yatkınlıkla ilgisi kurulan sitokin genlerindeki
SNP’lerin analizi, toplum sağlığını anlamak için önemlidir (Larcombe et al., 2005).
64
Örnekler az olsa da, bu çalışmalar eski tarihte çok sayıda bildirilen salgınlardan
sorumlu ajanları belirlemek, iskeletlerdeki paleopatolojik lezyonların belirlenen tanılarını
doğrulamak ve eski ya da modern mikrobiyal dizileri karşılaştırma yoluyla moleküler
düzeyde enfeksiyöz hastalıkların evrimleşmesi hakkında bilgi sağlamak için önemlidir
(O’Rourke et al., 2000). Ancak sıklıkla kontaminasyon var olabilir. Örneğin topraktaki
bakteriler M. tuberculosis’e benzer DNA dizinleri taşıyabilir. Bu sebeple, teknik konuları
içeren ve güvenilirlik kriterini kuran bir dizi, iyi kontrol edilmiş ciddi çalışma gereklidir
(Pääbo et al., 2004).
İnsan Evrimi Çalışmalarında aDNA
Neandertallerle ilgili en fazla bilinen ve önemli olan çalışma, Almanya, Düsseldorf
yakınlarındaki Feldhofer Mağarası'nda bulunan iskelet örneğinden moleküler analizdir
(Krings et al., 1997, 1999). Amplifiye edilen HVRI klonlanmış ve dizinlenmiştir. Buna
göre, bu Neandertal örneği modern insandan, hatta modern Avrupa, Afrika ve Asya
dizilerinden de farklıdır (Krings et al., 1999).
Ovchinnikov ve meslektaşları (2000), Kuzey Kafkasya'da Mezmaiskaya
bölgesinden çıkarılmış 29.000 yıl öncesine tarihlendirdikleri bir Neandertal bebeğinden
DNA analiz etmiştir. HVRI'deki 345 baz dizisi; modern insanla arasındaki farkın,
Feldhofer Neandertali ile arasında olan farktan iki katı daha fazla olduğunu göstermiştir.
Bu iki Neandertal örneği arasında gözlenen farkın büyüklüğü, modern insan
popülasyonları arasında görülen farka eşittir. Ancak iki Neandertal HVRI dizisi,
Cambridge dizisinden farklı on dokuz nükleotid substitüsyonunu da paylaşır. Dolayısıyla
filogenetik olarak, iki Neandertal dizisi modern insan HVRI dizisinden uzak olan ayrı bir
65
kol oluşturmaktadır. Hatta her iki Neandertal dizisi de tüm modern insan gruplarından
farklıdır. Bu sonuçlar, Krings ve meslektaşlarının (1997) Neandertal'lerin doğrudan
modern insanların atası olmasının mümkün olmadığını, dolayısıyla insanın kökeninin
Afrika'dan çıkış modelini desteklediğini belirten ilk değerlendirmelerini doğrulamıştır
(O’Rourke et al., 2000). Pääbo ve meslektaşları (2004), bazı Neandertallerin insanlara
benzer mtDNA dizinleri taşıdığının belirlenmesi durumunda, bunun modern DNA
kontaminasyonu olarak düşünüleceğini de belirtmiştir.
GEÇMİŞE AİT DNA ÇALIŞMA YÖNTEMLERİ
İzolasyondan önce, örneklerin potansiyel yüzey kontaminasyonu giderilmelidir,
çünkü kontamine DNA örneğin yüzeyinde iç taraftakine göre daha fazladır (Bouwman et
al., 2006). Yüzey tabakası bistüri ile kazınabilir, örnek UV radyasyonuna, aside veya
yüksek derişimde etanole maruz bırakılabilir, sodyumhipoklorit (NaOCl - çamaşır suyu)
içinde tutulabilir ya da bu yöntemlerin bir kombinasyonu şeklinde uygulanabilir (Watt,
2003).
Örneğin indirgenmesi; izolasyon enzimleri ve malzemelerinin yüzey alanıyla
yeterince etki etmesini sağlamak için mekanik yollarla (bir öğütücü, değirmen veya havan
yardımıyla) gerçekleştirilir. İskelet örneklerini toz haline getirmek, örneklerin el ile
işlenmesi demektir ve kontaminasyona açık olduğundan özenle uygulanmalıdır (O’Rourke
et al., 2000). Örnek, kimyasal olarak da indirgenir, sıvı azotta dondurma bu olaya yardımcı
olabilir, ancak azota daldırmadan önce, sıvı azotun DNA kontaminasyon kaynağı olabilme
ihtimalinden dolayı örneğin bir naylon poşete konulmuş olması gerekir (Fountain et al.,
1997).
66
DNA İzolasyonu
aDNA izolasyon yöntemleri, çoğunlukla adli protokollerden alınmıştır (Parsons and
Weedn, 1996) ve iki yaklaşımdan biri kullanılır: proteinaz K/fenol-kloroform
ekstraksiyonu veya silika temelli izolasyon. İzolasyon çözeltileri, yağları emülsiye eden
ve/veya proteinlerin parçalanmasına yardımcı olan birçok farklı deterjan veya yüzey aktif
maddeleri (surfaktant) içerir (Sambrook and Russel, 2001). Az bir miktar (0.5–1.0 g)
örneğe 1.0–2.0 ml izolasyon çözeltisi eklenmesi, uygun sıcaklıklarda (50–60° C) birkaç
saat çalkalamayla proteinlerin parçalanması için yeterlidir (O’Rourke et al., 2000).
Kantitasyon çalışmaları 0.5–1 g kemik tozunun 0–5 ng DNA verdiğini göstermiştir (von
Wurmb-Schwark et al., 2004). Fenol-kloroform yönteminde örnek kaybına veya PCR
inhibisyonuna yol açacağı için, organik çözücülerin izolasyon ve amplifikasyon
basamaklarına taşınması önlenmelidir. Son sıvı faz, 30.000 moleküler ağırlıktan küçük
moleküllerin yok edilmesi için yoğunlaştırılmalıdır. Ancak bu aynı zamanda DNA ile izole
edilen PCR inhibitörlerini de konsantre eder. Konsantre edilmiş örnek, etanol veya
izopropanol ile çöktürülerek peletin TE çözeltisinde yeniden çözülmesini gerektirir
(O’Rourke et al., 2000). Hanni ve araştırıcıları (1995) etanol yerine izopropanol
önermektedir, çünkü izopropanolün DNA için seçiciliği daha yüksektir (Sambrook and
Russel, 2001). Ayrıca Maillard ürünleri olduğundan şüphe edilen kahverengi PCR
inhibitörlerini uzaklaştırmada izopropanolün daha etkili olduğu bildirilmiştir (Poinar et al.,
1998). Altunçul (2001), kemikten DNA elde etme yöntemlerini karşılaştırmalı incelemiş
ve fenol-kloroform ekstraksiyonunun başarısını vurgulamıştır. Yöntem, biyolojide
standarttır ve yüksek DNA eldesiyle sonuçlanır. Ancak aDNA çalışmalarında bu metodu
kullanmanın bir sorunu, inhibitörlerin de ekstrakte edilmesidir ki; bu da çoğaltma ve
67
analizi zorlaştırır (O’Rourke et al., 2000; Stone, 2008).
Silika yöntemi, DNA'yı yüksek konsantrasyonda guanidinyum tiyosiyanat
(GuSCN) içinde izole eder (Höss and Pääbo, 1993). GuSCN, proteinaz K gibi, proteinleri
parçalama yeteneğine sahiptir ve DNA'nın silika partiküllerine bağlanmasını sağlayan
kaotropik bir ajan görevi yapar (Boom et al., 1990). Bu protokolün avantajı, yüksek toksik
özellikteki fenol ve kloroformu kullanmadığı için kabin gerekliliğini kaldırmasıdır. Ayrıca
PCR inhibitörlerini izole etme durumu da daha az rastlanır, ancak silikanın kendisi güçlü
bir PCR inhibitörüdür ve yıkama esnasında tüm silikanın uzaklaştırılması gerekir. Bunun
yanında, DNA'ya yüksek afinitesinden dolayı GuSCN, modern nükleik asit ile kolaylıkla
kontamine olabilir. Bunu önlemek için tampon çözeltiler steril tüplerde hazırlanmalı,
birkaç saat silika ile inkübe edilmeli, santrifüjden sonra üst faz alınıp kullanılmalıdır (Höss
and Pääbo, 1993). Silika yönteminin tekrarlanması, PCR inhibitörlerinden korunmak için
de uygulanabilir (Kemp et al., 2006). aDNA izolasyonunda avantajlarından dolayı silika
temelli DNA izolasyon kitleri daha fazla kullanılmaktadır (Poinar et al., 1993; Tuross,
1994; Zierdt et al., 1996; Krings et al., 1997; Yang et al., 1998; Bouwman et al., 2006).
Silika jel spin kolonları, fenol-kloroform ekstraksiyonundan sonra geriye kalan
pigmentasyonu uzaklaştırarak bir konsantre edici gibi davranır, ancak bir kerede içine
konulan çözelti miktarı sınırlıdır. Bu durum DNA çözeltisinin el ile muamele edilmesinin
artmasından dolayı kontaminasyon veya örnek kaybı açısından sorun yaratabilir. Proteinaz
K temelli izolasyon yöntemleriyle daha fazla DNA eldesi sağlanmasına rağmen, silika
guanidinyum protokolleri daha yüksek oranlarda amplifikasyon başarısı ve daha az PCR
inhibitörleri ile sonuçlanır (Cattaneo et al., 1997). Standart proteinaz K prosedüründe
küçük değişikliklerle zor iskelet kalıntılarından elde edilen DNA miktarı arttırılabilir.
68
EDTA proteinaz aktivitesini inhibe eder ve kalsiyum bunu arttırır. Bu sebeple proteinaz K
eklenmesinden önce dekalsifikasyon aşamasından kalan tüm EDTA uzaklaştırılmalıdır
(O’Rourke et al., 1996). Bunun yanında EDTA’nın ve fenolün enzim inhibitörü olduğu da
göz önünde bulundurulmalıdır (Sambrook and Russel, 2001). Jackes ve araştırıcıları
(2001) ise zayıf asit çözeltileri ile bile dekalsifikasyonun Mezolitik kemik mineralinde
büyük zarara sebep olduğunu, histolojik yapıyı bozduğunu belirtmiştir.
Kemikten DNA izolasyonunda bazı araştırmacılar (Tuross, 1994; Krings et al.,
1997; Yang et al., 1998) hidroksiapatiti parçalayarak, bazıları (Götherström and Liden,
1996) apatitle yarışacak iyonlar ekleyerek DNA’yı açığa çıkarmayı tercih etmektedir.
İzolasyon sırasında apatitle ilgilenmeyen araştırmacılar da (Höss and Pääbo, 1993)
bulunmaktadır. Kemikten tamamen demineralizasyonla DNA eldesi sağlayan etkili bir
protokol önerilmiştir. Kemik tozunun tamamıyla fiziksel olarak çözülmesine dayanır.
Böylece degrade iskelet örneklerinden DNA eldesi ve tipleme başarısı artar (Loreille et al.,
2007).
DNA’nın Çoğaltılması
Hedef DNA dizisinin amplifikasyonu, günümüzde rutin bir laboratuvar tekniğidir
(Ehrlich, 1989; Innis et al., 1990). Modern örneklerle kullanım için geliştirilen birçok
teknik eski örneklerle çalışmasa da, yöntemler nispeten standardize edilmektedir. aDNA'yı
çoğaltmak için çeşitli protokoller önerilmiştir (Pääbo, 1989, 1990; Hagelberg et al., 1991;
Herrmann and Hummel, 1994; Römpler et al., 2006; Meissner et al., 2007).
Pääbo (1989), 1 µg eski DNA izolatından gerçekleştirilen 84 ve 121 baz çiftlik
amplifikasyonların, 1 ng modern DNA’nın verdiği miktarlarda ürün oluşturduğunu
69
gözlemiştir. O’Rourke ve meslektaşları (1996) ise eski örneklerin modern dokulardan
beklenenin %1-5’i kadar DNA verdiğini belirtmektedir.
aDNA'nın PCR reaksiyonlarındaki aşırı primer konsantrasyonu, primerlerin hedef
dışı moleküllere yanlış bağlanmasını kolaylaştırarak, basamaklaşma (laddering) etkisi ve
elektroforezde aşırı primer-dimer oluşumu ile sonuçlanır (Ariffin et al., 2007; Dissing et
al., 2007). aDNA olgularında sıklıkla olduğu gibi, hedef örneğin miktarı düşük olduğu
zaman, özellikle yüksek primer konsantrasyonlarında basamaklaşma etkisi fark edilir hale
gelir. Primer konsantrasyonlarını önerilen standart protokollerin altına düşürmek, primerdimer oluşumunu azaltır ve hedef dışı moleküllerin yanlışlıkla çoğalmasından dolayı jel
bantlarının basamak halini almasını etkili biçimde elimine eder. Bu sonuç, sıkı PCR
koşulları sağlayarak kolaylaştırılır (Hummel et al., 1992). Geçmişe ait DNA çalışmalarında
kullanılacak primerler pirimidin bakımından zengin olmalıdır. Bu tip primerler, pürince
zengin eski DNA dizinlerine tamamlayıcı olacaktır (O’Rourke et al., 1996). PCR sırasında
kontaminasyon tespiti amacıyla kullanılan negatif kontrollerde, bulaşma olmadığı durumda
sadece primer-dimer oluşumu gözlenir. Eğer aynı PCR ürünü ile yeniden PCR yapılacak
olursa, primer-dimerler meydana gelmez (Ariffin et al., 2007). Degrade DNA’nın
amplifikasyonunda, farklı polimerazlar incelenmiş, 0.5–1.2 ng örnek olduğunda etkinlik
açısından anlamlı bir farklılık bulunmamıştır (Purzycka et al., 2006). Bir polimeraz enzimi
teknik anlamda düzenlenerek degrade DNA analizlerinde kullanılabilir hale getirilebilir
(Shapiro, 2008). Enzim ve primerler çalışma alanındaki kontaminantlardan etkilenebilir,
ancak bunların UV radyasyonu primerleri inaktive edecek ve PCR'ı yok edecektir
(O’Rourke et al., 2000).
aDNA PCR reaksiyonundan elde edilen ürünü arttırmanın en kolay ve ucuz yolu
70
'hot-start' prosedürdür. Hot-start PCR, primerlerin ve/veya enzimlerin örneğin ilk döngüde
denatürasyon sıcaklığına ulaşmasından önce DNA örneğine bağlanmasını engeller. Bu
prosedür, yanlış bağlanma ve primer oligomerlerinin oluşum oranlarını azaltarak
amplifikasyon ürününü, dizinin doğruluğunu ve kesinliğini arttırır (Chou et al., 1992).
Hedef dışı ürünler, sadece PCR malzemelerinin etkinliği azaltmaz, aynı zamanda hedef
dizinin çoğalmasını da doğrudan engeller. Hot-start PCR; reaksiyon karışımının önceden
ısıtılmış ısı döngü cihazına konulana kadar buz üstünde tutulması veya denatürasyon
sıcaklığına gelene kadar inaktif kalan, yeni geliştirilmiş polimerazlar kullanılması ile
sağlanmaktadır.
STR çalışmalarında degradasyondan dolayı alel düşmesi görülebilir. Bu alel kaybı
boyut bağlantılıdır ve herhangi bir lokusa özgü değildir (Gerstenberger et al., 1999; Meyer
et al., 2000; Ricaut et al., 2004; Buckleton and Triggs, 2006; Opel et al., 2006). Degrade
örnekler için standart amplifikasyon ve elektroforez koşulları, büyük STR’lerde alel
düşmesinden ötürü genotiplemede %100 başarı sağlamamış, kapiler elektroforezdeki
enjeksiyon süresi beş saniyeden on saniyeye çıkarılarak alellerin görüntülenmesinde %80–
88 başarı oranı elde edilmiştir. Ancak bunun kekeme (‘stutter’) veya ölçek dışı (‘offladder’) bantlar gibi artefaktlar oluşturduğu da belirtilmiştir (Swango et al., 2006). PCR
sırasında enzim kayması sebebiyle kekeme bantların oluştuğunu Gerstenberger ve
meslektaşları (1999) da ifade etmiştir. Analiz edilen örnek miktarının arttırılması ise
tiplemede bir farklılık yaratmamıştır (Swango et al., 2006).
Jel elektroforezinde uygun boyutta bantın olmamasından dolayı aDNA örneği için
amplifikasyonun başarısız olduğunu varsaymak, genellikle sık rastlanır bir durumdur.
Ancak konsantrasyonu düşük veya önemli enzim inhibitörleri içeren örnekler; yetersiz
71
çoğalarak jelde görüntülenemeyecek kadar az ürün oluşturabilir. Bu tip durumlarda,
amplifikasyonun arttırılması 'touchdown PCR' (Don et al., 1991) ya da 'booster PCR’
(Ruano et al., 1989) ile sağlanabilir. Touchdown PCR, yüksek bağlanma sıcaklıkları ile
başlar ve standart sıcaklığa ulaşılana kadar ilk döngüler boyunca azaltılır. Kalan
döngülerde amplifikasyon için kullanılır. İlk döngülerde düşük hatta belki de etkisiz primer
bağlanması olabilir, ancak her döngüde yüksek kalitede hedef dizi oranının artmasıyla
yanlış bağlanma da en az indirgenir. Yöntem, aslında uzun modern moleküllerin
amplifikasyonu için geliştirilmiştir, ancak küçük boyutlarına rağmen bazı aDNA
örneklerinde de etkili olabilmektedir. Booster PCR ise, sadece birkaç döngüde hedef diziyi
arttırılmış sıkı koşullarda ve azaltılmış primer konsantrasyonlarında çoğaltır. Bu şekilde
oluşturulan ürünler, her zamanki PCR reaksiyonunda örnek olarak kullanılır. Booster PCR
ile ilgili temel endişe, ilk döngünün ürünlerinin ikinci PCR'da örnek olarak kullanılması
sebebiyle, örneklerin modern kontaminantlarla karşılaşma olasılığının artmasıdır.
Örneklere, enzim inhibitörlerine bağlanarak enzim konsantrasyonunu arttırması için
Bovine Serum Albumin (BSA) eklenmesi, PCR etkinliğini ve elde edilen ürünü arttırabilir.
aDNA analizlerinin özelliği olan uzun PCR döngülerinde (40 döngü) ileri uygunlukta
polimeraz aktivitesinin kullanılması da gereklidir. Pääbo (1989), yüksek enzim
konsantrasyonunun kontrol izolatlarında bazen nonspesifik amplifikasyon ürünlerine sebep
olduğunu belirtmiştir. PCR döngü sayısının yükseltilmesiyle DNA izolatında var olan az
sayıda molekülün çoğalma şansı arttırılır (Dixon et al., 2006). Ancak PCR döngülerinin
arttırılması, kontamine olan az miktardaki DNA’nın da artmasına sebep olabilir (Ariffin et
al., 2007).
Başlangıçtaki örnek moleküllerin belirlenmesi hangi PCR’ın yapılacağını
72
belirlemede yararlıdır ve kompetitif PCR (Handt et al., 1996; Nielsen and Thuelsen, 1998),
son zamanlarda ise Real-Time Kantitatif PCR (Swango et al., 2006) ile başarılabilir. Ancak
özgün aDNA olduğunu kesin olarak göstermeyeceği için başlangıçtaki örnek miktarını
ölçmeyen araştırmacılar da vardır (Chilvers et al., 2008). DNA içeriği ve degradasyon
durumunu tahmin etmek için kan, adli kemik ve arkeolojik kemiklerde mtDNA Real-Time
PCR ile analiz edilmiş; tüm örneklerde başarı sağlanmıştır. Bunun yanında amplikon
uzunluğu ile amplifikasyon verimi arasında ters bir ilişki gözlenmiştir (Alonso et al.,
2004). Eğer PCR’a bin veya daha fazla molekülle başlanıyorsa, nükleotidlerin yanlış
bağlanmasını teyit etmek için deneyin tekrarlanması gereksizdir. Daha az molekül söz
konusu ise birkaç tekrara ihtiyaç olabilir. Ayrıca PCR ürününün klonlanması da sorunları
belirlemek adına önemlidir (Handt et al., 1996).
Analiz edilecek örneklerde kontamine DNA olduğu durumlarda, tercihli
amplifikasyon (preferential amplification) görülebilir ve bu hasarsız DNA, örneğe ait
parçalanmış DNA’ya göre daha iyi çoğalabilir (Pääbo, 1989).
DNA dizinleri hasar gördüğünde, PCR’da primerlerle tamamlayıcı ipliği oluşturan
Taq polimeraz örneğin hasarlı bölgesine Adenozin ekleyebilir, diğer örneğe atlayabilir ve
uzama devam eder (O’Rourke et al., 1996). Pääbo (1990) bu etkiye atlama PCR (‘jumping
PCR’) adını vermiştir. Booster PCR, atlamayı önlemektedir (Pääbo, 1990).
Aynı örneğin tekrarlanan analizlerinden farklı genotiplerin oluşması için öne
sürülen hipotezlerden biri, amplifikasyon sırasında primerlerin mikrosatellit lokuslarına ait
dizinlere bağlanması ile kısmen parçalanmış tekrar dizinlerinin çapraz bağlanmasının
beraber gerçekleşebilmesidir. Tekrar dizinlerinin içinden kopan DNA parçaları,
mikrosatellit lokuslarının çoğaltılması sırasında kimerik alellerin oluşumunun en sık
73
sebebidir. Bu yanlış aleller PCR’ın ilk döngülerinde meydana gelir ve Taq polimeraz için
uygun bölgeler oluşturacak şekilde birbirine bağlanır. Bu önlemek amacıyla DNA
parçalarının 3’ uçlarına çoklu A kuyruğu ekleyecek bir yöntem geliştirilmiştir. Buna göre,
1µg aDNA’nın yaklaşık 6–12 pmol 3’ ucu içerdiği tahmin edilerek, uygun miktarlarda
terminal transferaz, dATP, tampon ve BSA ile reaksiyona girmesi sağlanmaktadır. Böylece
örnekteki 3’ uçlara çoklu Adenin kuyruğu eklenerek, 3’ uçlar kapatılır ve di- veya
trinükleotid içeren tekrar dizinlerinin daha güvenilir tiplenmesi mümkün olur. Bu yöntem
atlama PCR’ı da önlemektedir (Culjkovic et al., 2003).
Aynı anda hem mtDNA hem de STR analizleri yapmayı sağlayan ikili PCR
tekniğinin inhibitör deneylerinde ve PCR etkinliğini kontrol etmede yararlı olabileceği
bildirilmiştir. Formaline gömülü, adli ve biyoarkeolojik örneklerde karşılaştırmalı olarak
ikili PCR çalışmaları ile gerçekleştirilmiş, özellikle eski DNA’da başarılı sonuçlar alındığı
belirtilmiştir (von Wurmb-Schwark et al., 2003, 2004).
‘Nested-PCR’ adı verilen yöntemle yanlış DNA bölgesinin çoğalma ihtimali en aza
indirgenir. Bu amaçla her bir lokus için iki çift primer kullanılır. İlk çift (‘dış primer’)
standart PCR temelinde lokusu çoğaltırken, ikinci set primerler (‘nested-primerler veya iç
primerler’) ilk PCR ürünlerine bağlanır ve ikinci PCR ürünü ilkinden daha kısa olur.
Nested-PCR bazı araştırmacılar tarafından aDNA çalışmalarında kullanılmıştır (Yang et
al., 1997; Fernandez et al., 2006; Millar et al., 2008).
Römpler ve araştırıcıları (2006) basit tekli PCR yerine, iki basamaklı çoklu PCR
önermiştir. Meissner ve meslektaşlarının (2007) geliştirdiği kısa beşli PCR yaklaşımı,
DNA tiplemesinin ticari kitlerle başarısız olduğu olgularda, özellikle degrade örneklerde
mükemmel sonuçlar elde etmeyi sağlar.
74
DNA Analizi
PCR ürünlerinin analizi için gerekli temel teknoloji, elektroforezdir (Sambrook and
Russel, 2001). DNA parçalarını boyutlarına göre ayıran elektroforez, plaka jellerde veya
kapiler aracılığıyla yapılabilir. Plaka jel kullanılacaksa, iki farklı taşıyıcı ortam söz
konusudur: agaroz veya poliakrilamid. Seçilen elektroforez yöntemi, bilimsel sorunun
çözümüne veya beklenen cevaba dayanan analiz çeşidine bağlıdır. En kolay yol, PCR’ın
olup olmadığının tespitidir. Bu durumda agaroz jel elektroforezi genellikle yeterlidir.
Agaroz jel elektroforezi, amplifikasyon ürünlerinin yeterli uzunluk polimorfizmi
gösterdikleri durumlarda veya RFLP analizinde de uygundur. Ancak çoklu dizin veya kısa
parça polimorfizmleri inceleniyorsa, amplifikasyon ürünlerinin yüksek çözünürlükteki
elektroforez ünitelerinde analiz edilmesi gereklidir. Parçaları ayırt etmede yeterli
çözünürlük elde etmek için, ayırıcı ortam olarak poliakrilamid kullanılır. Hem parça, hem
de dizin analizleri uygun yazılım programlarıyla desteklenen otomatik aletler kullanılarak
tamamlanabilir, böylece sonuçların yorumlanması daha hızlı ve kolay gerçekleşir
(Hummel, 2003).
Parça uzunluk analizi veya DNA moleküllerinin boyutlarına göre ayrılması, tüm
elektroforez tekniklerinde temel yaklaşımdır, elektrik alanda tutulan yüklü moleküller
boyutlarına göre katoddan anoda doğru taşıyıcı bir ortam üzerinde göç eder. Kullanılan
ayırıcı ortama bağlı olarak sonuçlar çözünürlüklerine göre değişir. Agaroz jel
elektroforezinde düşük yüzdeli jeller 50–500 baz çifti arası küçük moleküllerin benzer
oranda hareketine sebep olur, böylece aDNA elektroforezinde parça ayrımı yetersiz kalır,
sadece 500 baz çifti üzerindeki parçalar düşük konsantrasyonlu agaroz jellerde başarıyla
ayrılır. Parça ayrımında moleküllerin aldığı yol ve jel kalınlığı da önemlidir. Uzun
75
mesafeler ve ince jeller kısa parçaları ayırmada başarılı olur. Jeli kaplayan tampon çözelti
de kaliteyi etkileyen bir faktördür (Sambrook and Russel, 2001). Eğer aDNA agaroz jel
elektroforezi ile ayrılırsa, degrade DNA’da var olan çapraz bağlar, yüksek moleküler
ağırlıklı DNA ile uyumlu bir hızda göç eder (Cooper, 1994).
Dizin analizi veya dizinleme (sekanslama), çoğaltılmış DNA parçası içinde bazların
birbirini takip etmesinin analizidir. Nükleotid değişimleri, insersiyonlar veya baz
delesyonları gibi her türlü polimorfizmi ortaya çıkarabilir. Polimorfizmin yapısına bağlı
olarak alternatif teknikler de kullanılabilir. Örneğin, dizinin belirli bir bölgesinde 2-6
bazlık bir insersiyon veya delesyon bekleniyorsa ve bu baz eklenmesi veya yok olması elde
edilecek tek bilgi ise, parça analizi bir çözüm yolu olabilir. Ancak çok sayıda bilinmeyen
farklı polimorfizmlerin söz konusu olduğu analizlerde dizinleme yerine kullanılacak bir
başka teknik yoktur (Hummel, 2003).
Dizinleme farklı yollarla yapılabilir. Günümüzde otomatik dizinleme teknolojisinde
Sanger-Coulson dizinlemesi kullanılır, zincir sonlandırma tepkimesi veya Taq-döngü
dizinlemesi de denilir. İlkini takiben ikinci bir PCR’a gerek duyulur. İlkinin tersine, ikinci
PCR asimetriktir, sadece bir primer kullanılır, böylece ürünün tek ipliğinin linear
amplifikasyonu sağlanır. İkinci PCR’ın en önemli noktası, dizini meydana getiren bütün
bazların çeşidine göre belirli renklerle işaretlenmesidir. Bu, sadece dinükleozittrifosfat
(dNTP) eklemekle değil, dörtlü floresan dideoksinükleosittrifosfat da (ddNTP) eklemekle
sağlanır. ddNTP’ler -OH grubu içermediği için, fosfodiester bağının oluşumu engellenir ve
yeni nükleotidler yapıya katılmaz, zincir uzaması sonlanır. dNTP ve ddNTP’lerin uygun
oranlarda bulunmasıyla zincir sonlanmaları rastgele gerçekleşir. Sonuçta tek iplikli işaretli
dizinler elektroforeze tabi tutulur, parçalar uzunluklarına göre ayrılır ve araştırılan dizini
76
oluşturan bazlar farklı renklerle birbiri ardına dizilir (Sanger et al., 1977).
Bazı araştırmacılar, çoğalttıkları DNA parçalarını doğrudan dizinlemiştir (Anzai et
al., 1999; Ariffin et al., 2007). Oysa Hummel’in (2003) belirttiğine göre, adli veya
arkeolojik örneklerde PCR sonrası doğrudan dizinleme, kontaminasyon sebebiyle güvenilir
ve geçerli bir sonuç veremeyecektir. Bu durumda birden fazla bireye ait olma (kontamine
olma) ihtimali yüksek olan PCR ürünlerini belirlemek için biyoteknolojiden yararlanarak
dizinleme öncesi klonlama yapmak tek uygun çözümdür. Kontaminasyonun belirlenmesi
için klonlama yapılması önerilmektedir (Hebsgaard et al., 2005). PCR sonrası doğrudan
dizinleme, primerler tarafından amplifiye edilen her şeyin bir özetidir ve modern DNA
çalışmalarında standarttır. Oysa geçmişten kalan materyalden gerçekleştirilen PCR, özgün,
hasarlı ve kontamine olan her türlü DNA’yı içeren çok sayıda dizini çoğaltır. Bu sebeple
dizinler sıklıkla klonlama yapılarak belirlenir (Stone, 2008).
aDNA hasarı hakkında birçok istatistiksel araştırma, her örnekte mutasyon dağılımı
oluşturmak için klonlamaya dayanır (Ho et al., 2007). Tek bir PCR’dan bağımsız çok
sayıda klonlamanın, amplifikasyonun ilk döngülerinde düzensiz etkiler yüzünden bir
haplotipte rastgele bir artış olan PCR sürüklenmesi (‘PCR drift’) sebebiyle yeterli bir delil
olamayacağı da belirtilmelidir (Axelsson et al., 2008). Ho ve meslektaşları (2007), yanlış
bağlanma lezyonlarını kesin olarak tahmin etmek için simülasyon kullanarak bilinen
miktarda hasarlı dizinler oluşturmuş ve hazırlanan modelin hata kapasitesini belirlemiştir.
Daha sonra bu model aDNA setlerinde yanlış bağlanma lezyonlarının sayısını tahmin
etmek için kullanılmıştır. Dizinler arasında istatistiksel yöntemlerle analiz konusunda ileri
çalışmalar yapılması önerilmektedir (Axelsson et al., 2008).
77
Biyoteknolojiden Yararlanma
Genetik mühendisliği veya rekombinant DNA teknolojisi ya da son yıllardaki
adıyla biyoteknoloji, 1970’li yılların başında gelişmeye başlamış ve hızlı bir ilerleme
kaydetmiştir. Genetikte yeni bir dönem yaratarak, temelinde gen klonlaması içeren
yöntemlerle birçok bilim dalına fayda sağlamıştır (Brown, 2006). Rekombinant DNA
teknolojisi, PCR gibi herhangi bir DNA parçasının çoğaltılmasını sağlar (Tefferi, 2006).
Bini ve Pappalardo (2005), anne tarafından akraba olanların farklı dokularında
heteroplazmik mtDNA profillerini klonlama ile tespit etmiş ve farklı dizin varyantlarının
dağılımını belirlemede bu yöntemin yüksek kesinlik ve duyarlılık gösterdiğini bildirmiştir.
İnsan veya insan dışı tüm eski örneklerden genetik analiz için rekombinant DNA
tekniklerinden yararlanmak; kontaminasyon ihtimali çok fazla olan bu örneklerden doğru
analiz yapmak için tercih edilen ve giderek daha sık kullanılan bir yöntemdir (Pääbo, 1985,
1989; Hummel et al., 1992; Poinar et al., 1998; Gilbert et al., 2005; Brown, 2006;
Bouwman et al., 2006; Hatsch et al., 2006; Caramelli et al., 2007; Dissing et al., 2007).
Konuyla ilgili yapılan ilk çalışmalarda da 2400 yıllık Mısır mumyasından DNA dizisi elde
edilirken, hedef bölgenin bir vektöre kopyalaması ve klonlanan parçaların dizinlenmesi
aşamaları gerçekleştirilmiştir (Pääbo, 1985).
Gen klonlaması
Gen klonlaması deneylerinde temel aşamalar şunlardır: 1. Klonlanacak geni içeren
DNA parçası, “vektör” olarak adlandırılan dairesel DNA molekülünün içine yerleştirilir ve
“rekombinant DNA molekülü” elde edilir. 2. Vektör, bu geni çoğunlukla bir bakteri olan
konak hücreye aktarır. 3. Vektör, konak hücrede çoğalır ve sadece kendisinin değil, taşıdığı
78
genin de çok sayıda kopyasını üretir. 4. Konak hücre bölündüğünde, rekombinant DNA
molekül kopyaları yeni nesillere geçer ve vektör replikasyonu devam eder. 5. Çok sayıda
hücre bölünmesinden sonra, aynı konak hücrenin koloni veya klonları üretilmiş olur. Her
klon, rekombinant DNA molekülünün bir veya daha fazla sayıda kopyasını taşır. Böylece
rekombinant molekül tarafından taşınan gen artık klonlanmış olur (Brown, 2006). Bir
başka deyişle klonlama, iki farklı organizmadan elde edilen DNA parçalarının birbirine
katılımı sonucu oluşan molekülün, bakteriler tarafından alınıp çoğaltılması yoluyla çok
sayıda kopyasının elde edilmesidir.
Klonlama, iki temel amaca hizmet eder. Birincisi, az sayıda başlangıç
materyalinden çok sayıda rekombinant DNA üretmeyi sağlar. Sadece birkaç nanogram
yeterlidir, her bakteri bir plazmid alıp bir koloni oluşturmak üzere defalarca bölüneceği
için, her hücre molekülün çok sayıda kopyasını içerir. Başlangıç miktarını arttıracak
şekilde birkaç mikrogram rekombinant DNA genellikle tek bir bakteri kolonisinden elde
edilebilir. İkincisi; purifikasyonu sağlamasıdır. Çünkü ligasyon karışımında istenen
rekombinant molekül dışında; bağlanmamış vektör molekülleri, bağlanmamış DNA
molekülleri, kendine bağlanmış vektörler ve yanlış DNA parçası içeren rekombinant
DNA’lar da bulunur. Bağlanmamış vektörler, nadiren bir sorun yaratır, çünkü bakteri
hücreleri tarafından alınmış olsalar da, sadece bazı istisnai şartlar dışında çoğalmazlar.
Bakteri içindeki enzimler, bu DNA parçalarını degrade eder. Kendine bağlanmış vektörler
ve yanlış rekombinant plazmidler, istenen molekül kadar verimli çoğalır. Ancak yine de
istenen molekülün saflaştırması klonlamayla sağlanabilir, çünkü bir hücrenin birden fazla
DNA molekülü alması mümkün değildir (Brown, 2006).
79
Klonlama sırasında her hücre bir koloni oluşturacağından kolonideki her klon aynı
molekülü içerecektir. Farklı koloniler; kimi istenen rekombinant DNA molekülü, kimi
farklı rekombinant DNA molekülü, kimisi de kendine bağlanmış vektörler olmak üzere
farklı moleküller içerir. Bu sebeple doğru rekombinant plazmidleri içeren kolonilerin
doğru tespit edilebilmesi önemlidir (Brown, 2006).
Klonlama Vektörleri: Bir DNA molekülünün, gen klonlamasında vektör olarak
görev yapabilmesi için birçok özelliğe sahip olması gerekir. En önemlisi, konak hücrede
çoğalabilmelidir. Böylece rekombinant DNA molekülünün çok sayıda kopyası üretilir ve
yavru hücrelere aktarılır. Bir klonlama vektörü ideal olarak 10kb’dan küçük olmalıdır,
çünkü büyük moleküller saflaştırma sırasında kopmaya eğilimlidir ve manipüle edilmesi
daha zordur. Bakteri hücrelerinde bu kriterleri sağlayan DNA molekülleri, temel olarak
plazmidler ve bakteriyofaj kromozomlarıdır (Brown, 2006).
Plazmidler, bakteri hücrelerinde bağımsız bir varlık gösteren, dairesel DNA
molekülleridir. Plazmidler çoğunlukla bir veya iki gen taşırlar ve bu genler sıklıkla konak
bakteri için yararlı bir özellikten sorumludur. Örneğin; ampisilin gibi antibiyotiklerin
toksik konsantrasyonlarından korunma yeteneği, sıklıkla antibiyotik dirençli genleri
taşıyan plazmidin bakteri hücresinde var olmasından ileri gelir. Birçok plazmid, ana
bakteriyel kromozomdan bağımsız olarak çoğalabilir. Tek bir hücrede birbirlerine
uyumlarına göre çok sayıda farklı plazmid de bulunabilir (Brown, 2006).
Bakteriyofajlar, özellikle bakterileri enfekte eden virüslerdir. Bütün virüsler gibi
fajlar da, protein moleküllerinden oluşmuş koruyucu bir kılıf ile kaplanmış ve bazıları faj
replikasyonu için genler taşıyan bir DNA -nadiren RNA- molekülü içeren oldukça basit
80
yapıdadır. Bakteriyofajların birçok farklı çeşidi vardır, ancak bunlardan lambda (λ) ve
M13, klonlama vektörü olarak önemlidir (Brown, 2006).
Yirmi kilobazdan küçük DNA parçalarının klonlanmasında kullanılan plazmidler
ve bakteriyofajlar dışında; 300-1000kb boyutlarında büyük DNA’lar için de kozmidler
(büyük plazmidler), bakteriyel yapay kromozomlar (Bacterial Artificial Chromosomes,
BAC) veya maya yapay kromozomları (Yeast Artificial Chromosomes, YAC) da vektör
olarak kullanılabilir (Tefferi, 2006).
Geçmişe ait DNA'nın Güvenilirliği
Kontaminasyon: aDNA'nın güvenilirliği veya gerçek/özgün olma özelliği; önemli
bir konudur ve araştırma sonuçlarının modern kontaminantlardan ziyade, kendi hedef
dizilerini yansıttığını varsaymak dikkat ister (Handt et al., 1994b; Richards et al., 1995).
Geçmişe ait örneklerden özgün DNA elde etmenin kesin bir teknik garantisi yoktur, bu
kontamine DNA’yı özgün eski DNA’dan ayırmanın zorluğudur (Yao and Zhang, 2003).
Hatta tüm kriterler karşılansa bile, özgünlük kesin olmayabilir (Cooper et al., 2004).
Klonlama sonrası dizinleme özgün DNA varlığı ile ilgili fikir verir. Eğer tüm klonlar ya da
çoğu birbiriyle uyumluysa, DNA’nın kontamine olmadığı kabul edilir (Stone, 2008).
Yayınlanan ilk özgünlük kriteri üç noktayla sınırlıdır: 1. İzolasyon sırasında
çözeltilerden gelebilecek kontaminasyonları belirlemek için örneklerle birlikte kontrol
izolatlarını test etmek, 2. Her örnekten birden fazla izolasyon hazırlamak, 3.Amplifikasyon
etkinliği ve amplifikasyon ürününün boyutu arasında, eski DNA örneğinde degradasyon ve
hasarı gösteren bir ters ilgi beklemek. Bu kriterler, kontaminasyon ve yanlış bağlanmalar
hakkında yeni bakış açıları belirgin hale geldikçe genişletilmiştir (Pääbo et al., 2004).
81
Handt ve meslektaşları (1994b), aDNA sonuçlarının güvenilirliğini değerlendirmek
için altı kriter belirlemişlerdir: 1. PCR'dan önce ve sonraki aktiviteler, laboratuvarın farklı
kısımlarında veya ayrı laboratuvarlarda yapılmalıdır. 2. Modern DNA bulaşmasından
korunmak için sıkı laboratuvar koşulları uygulanmalıdır. 3. Kontaminasyonun tespit
edilebilmesi için kontrol örnekler kullanılmalıdır. 4. Sonuçları doğrulamak için örnekler
tekrar çalışılmalıdır. 5. Gözlenen aDNA dizisi, filogenetik ilişki göstermelidir. 6. Parça
boyutu ile PCR etkinliği arasında ters ilişki gözlenmelidir.
Pääbo ve meslektaşlarına (2004) göre neredeyse tam bir kriter listesi vardır:
1. Amplifikasyon ürünleri rutin olarak klonlanmalı ve çok sayıda klon
dizinlenmelidir.
2. Kör izolasyon kontrolleri hazırlanmalıdır. Benzer şekilde, negatif PCR kontrolleri
kullanılmalıdır. Her deneyde örnek eklenmemiş çok sayıda kontrolün
amplifikasyonu yapılmalıdır.
3. Aynı örneğin aynı veya farklı izolatlarından tekrarlanmış amplifikasyonlar
gereklidir. Çalışılan örneğin DNA içermediğine karar verilmeden önce, üç
izolasyon yapılması makul bir çabadır.
4. Bir izolatta var olan çoğaltılabilir DNA moleküllerinin kantitasyonu, tutarlı
değişimlerin meydana gelebileceği PCR’a ne kadar molekül ile başlanacağı
hakkında bir fikir verir.
5. Amplifikasyon verimliliği ve amplikon uzunluğu arasındaki ters orantı, aDNA
örneğinde var olan engelleyici lezyonların ve degradasyonun ilerlemesinin en basit
belirtecidir.
82
6. Genel durumlarına göre DNA içerebilecek örnekleri belirleyecek hızlı tarama
yöntemleri kullanılabilir. Aminoasit varlığının analizi, kemik histolojisinin
değerlendirilmesi, DNA hasarının belirlenmesi, kemikteki porozite ve yoğunluğun
ölçülmesi ve elekron mikroskopu ile değerlendirme; alternatif yöntemlerdir.
7. Hücrelerde mitokondri gibi organellerin DNA’ları da bulunur. mtDNA birçok
aDNA çalışmasında temel olduğunda, çakışan dizinleri çoğaltmada farklı primer
setleri kullanılabilir.
8. Önemli sonuçlar ikinci bir laboratuarda doğrulanmalıdır. Bu, bir laboratuvar
kontaminasyonunu belirlemede yararlıdır.
Yang ve Watt (2005) tarafından hedef DNA molekülüne benzer herhangi bir
molekül ile bulaşma olarak tanımlanan kontaminasyon, araştırma konusuna bağlıdır.
Örneğin; modern insan DNA’sı, geçmişe ait insan kalıntıları çalışmalarında bir
kontaminant iken, hayvan kalıntıları ile yapılan araştırmalarda insana ait bir bulaşma
önemli değildir (Watt, 2003).
Kontaminasyon, laboratuvar kaynaklı olabilir. Laboratuvarda meydana gelen bir
bulaşma, PCR ürününün taşınmasıdır. PCR ürünleri, kolaylıkla herhangi bir maddeye
kendilerini yapıştırabilir ve giysi, ayakkabı veya havalandırma sistemleri yoluyla
taşınabilir. Dolayısıyla laboratuvar personelinin giysileri, kullanılan kimyasallar, araçgereçler veya aletler; havada bulunan görülmeyen tanecikleri, serbest hücre ve DNA
moleküllerini içerebilir, PCR tüplerine girerek ya da sıvılar transfer edilirken ortama
karışabilir (Watt, 2003). PCR malzemelerinden kaynaklanan özellikle hayvan kaynaklı
kontaminasyonlar bildirilmiştir (Leonard et al., 2007). Bunlarla birlikte müze örneklerini
83
birleştirmede yapıştırıcı kullanıldığı için, insan dizinleri; hatta yapıştırıcı hayvan kaynaklı
bir madde ise hayvana ait dizinler de tespit edilebilir (Cooper, 1994; Nicholson et al.,
2002).
İnsan DNA’sı ile kontaminasyon, bulaşmış laboratuvar malzemelerinin
kullanılması ile meydana gelir. Örneğin; malzemeler Avrupa kökenli bir üretici firmada
Avrupa tipi dizinlerle kontamine olabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002). Analiz öncesinde
(örneğin, kazı aşamasında) veya analiz sırasında örnekle temasta bulunan kişilerden de
insan DNA’sı kontaminasyonu gerçekleşebilir (Watt, 2003). Çok yaygın olan bu durum,
aynı zamanda kontaminasyonun örnek kaynaklı olması ile de açıklanabilir (Hebsgaard et
al., 2005). Örnek kaynaklı kontaminasyonun bir diğer şekli de birbirine çok yakın olarak
saklanan veya sergilenen örnekler arasında çapraz bulaşmadır. Bu, PCR öncesi hazırlık
aşamasında herhangi bir adımda da meydana gelebilir (Watt, 2003).
Kontaminasyonu önleyecek veya en aza indirgeyecek çeşitli protokoller
önerilmiştir. Laboratuvar kaynaklı kontaminasyonun önlenmesi için her çalışma ayrı bir
alanda yapılmalıdır. Örneğin; izolasyon, PCR'a hazırlık ve amplifikasyon aşamaları
birbirinden ayrılmış farklı kısımlarda gerçekleştirilmelidir. Günümüzde izolasyon için
diğer laboratuvarlardan ayrı, HEPA-filtreli, pozitif basınçlı özel alanlar düzenlenmekte;
PCR hazırlığı için ise steril, HEPA-filtreli, pozitif basınçlı bir hava düzeneği ve UV ışık
sistemi olan farklı bir laboratuvar kullanılmaktadır. Alanda ayrıca tüpleri, otomatik
pipetleri ve bazı malzemeleri steril etmek için rutin olarak kullanılan bir UV kabini de
bulunur. Çalışma alanından, aletlerden veya malzemelerden kaynaklanan kontaminasyon
riskinin azaltılması için, sodyumhipoklorit veya DNAz ile rutin temizlik yapılmalı veya
UV radyasyonuna tabi tutulmalıdır (O’Rourke et al., 2000). Dekontaminasyon amacıyla en
84
sık kullanılan kimyasal hipoklorittir ve oksidatif hasarla dakikalar içinde DNA’yı parçalar.
Bu sebeple örneklere uygulandığında endojen DNA’yı da parçalamaması için kontrollü
olarak kullanılmalıdır (Kemp and Smith, 2005; Dissing et al., 2008). Taşınma sebebiyle
kontaminasyonun en aza indirilmesi için, ısı döngü cihazının ısı bloğuna da her
amplifikasyondan 20–30 dakika önce UV verilmesi önerilmektedir. Tüm aDNA işlemleri
eldiven (tercihen iki kat eldiven), maske ve uzun kollu özel giysiler giyen araştırmacılar
tarafından yapılmalıdır (O’Rourke et al., 2000). Bunun yanında, laboratuvar personelinin
aDNA çalışma alanından modern DNA laboratuvarına, PCR öncesi alandan PCR sonrası
alana doğru hareket etmesi PCR ürünlerinin taşınmasının önlenmesini sağlayacaktır (Watt,
2003). Bunun yanında bir aDNA laboratuvarında modern örneklerle ilgili araştırmaların
yapılmaması, en temel kontaminasyon etkeninden korunmayı sağlar (Pääbo et al., 2004).
Anderung ve araştırıcılarına göre (2008), kontaminasyonun temel kaynağı
laboratuvar değil, kazı ve saklama koşullarıdır. Kazı sırasında bir kontaminasyondan
korunmak için, maske, eldiven, temiz bir poşet ve temiz aletler kullanılması etkilidir (Yang
and Watt, 2005). Kemiklerin kazı sonrasında yıkanması ve temizlenmesi, kontaminasyon
için kritik aşamalardır (Fortea et al., 2008). Örnekler arasında çapraz bulaşma riskinin
azaltılması için örneklerin ayrı ayrı ele alınması, eldivenlerin örneklerle birlikte
değiştirilmesi, aletlerin ve araç-gereçlerin temizlenmesi, filtreli pipet uçlarının kullanılması
gereklidir (Watt, 2003).
Bireysel çalışmalardaki kontaminasyonun belirlenmesi için çok sayıda kör
izolasyon kontrolü ve negatif PCR kontrolü kullanılmalıdır. Kör izolasyon kontrolü,
izolasyon sırasında lizis çözeltisine kemik tozu eklenmeden; negatif PCR kontrolü ise PCR
karışımının içine DNA izolatı eklenmeden, tüm aşamalardan geçirilen kontrollerdir (Watt,
85
2003). Bunlarda herhangi bir ürünün varlığı, kontaminasyonun kesin kanıtıdır ve deney
tekrar edilmelidir. Hatta PCR hazırlığı sırasında açık ve kapalı iki kontrolün de
kullanılması önerilir. Açık kontroller; DNA'nın eklenmediği, ancak PCR'ın başlatılma
aşamasına kadar kapakları açık kalan, tüm diğer örnek tüpleri kapatıldıktan sonra kapakları
kapatılan tüplerdir. Kapalı tüpler ise örnek dışında tüm PCR malzemelerini içerir ve PCR
hazırlama aşamasında kapakları kapalı tutulur. Bu iki kontrol çeşidi, PCR hazırlık
aşamasından kaynaklanan (taşınma yoluyla) veya kontamine malzemelerden kaynaklanan
bulaşma durumlarını etkin olarak ayırt etmeye yarar (O’Rourke et al., 2000). aDNA
çalışmalarında pozitif kontrol kullanılması, kontaminasyon olasılığından dolayı tavsiye
edilmemektedir (Willerslev and Cooper, 2005).
İlk sonuçların tekrarlanması bir zorunluluktur. Hatta ideali, bu tekrarın başka bir
laboratuvar tarafından yapılmasıdır (Krings et al., 1997; Hebsgaard et al., 2005). Ancak
sıklıkla bu, maliyetinden ötürü mümkün olamamaktadır. Aynı laboratuvarda tekrar, farklı
izolasyonlar yapılarak başlamalıdır. Mümkünse diş gibi farklı iskelet elemanları
kullanılmalıdır. Tekrarlar birkaç hafta veya ay aralıkla gerçekleştirilmelidir. Bu tekrarlar
olmadan aDNA sonuçları geçici olarak kalacaktır (O’Rourke et al., 2000). İki farklı
laboratuvar tarafından yapılacak bağımsız analizlerin sadece laboratuvar
kontaminasyonunu yok edeceği, örnek iki laboratuvara da ulaşmadan önce kontamine
olmuşsa, iki analizde de aynı olan ancak özgün olmayan sonuçlar elde edileceği göz
önünde tutulmalıdır (Yang et al., 1997).
aDNA sonuçları, filogenetik bir ilişki göstermelidir (Handt et al., 1994b). İnsana ait
örneklerde, eski örnekle onun soyundan gelen toplumların genetik benzerliği bir anlam
ifade etmelidir. Tüm laboratuvar personelinin DNA örnekleri, modern, laboratuvar
86
kaynaklı kontaminantları belirlemek amacıyla, incelenen özellikler için dizinlenmeli ve
tiplenmelidir. Örnekleri topraktan çıkartan arkeolog veya müze personeli gibi, örnekleri
tutan kişiler de bulunabiliyorsa, tiplenmelidir. Sonuç olarak, ilk kopya örnek düşük (<100)
ise, PCR hataları birikebilir ve son PCR ürününün miktarına etki edebilir (Handt et al.,
1996). Bu çoğaltılmış diziler, dizi heterojenitesi olarak bilinir ve ancak kontaminasyonu da
ortaya çıkaracak olan çok sayıda klonlanmış PCR ürününün dizinlenmesi ile belirlenir
(Handt et al., 1996; Krings et al., 1997; Kolman and Tuross, 2000).
Genellikle tüm bu kriterleri göz önüne almak olağanüstü bir önem taşır. Ancak her
olguda her bir kritere bağlı kalmak gerekli değildir, çünkü tüm çalışmalarda tüm hata
kaynakları meydana gelmez. İzolasyon ve PCR kontrolleri her zaman kullanılmalıysa da,
bir ve aynı izolattan çok sayıda amplifikasyon, binlerce örnek molekülden başlayacağı
kantitasyonla belirlenmişse tutarlı değişikliklerin olması beklenmediğinden gereksizdir.
Örneklerin iyi korunmuş olduğu gözlemleniyorsa, korunmanın biyokimyasal analizine de
ihtiyaç yoktur. Ancak biyolojik açıdan önem aDNA’nın belirli bir dizininin özgünlüğüne
dayanıyorsa, ikinci laboratuarda tekrarlanması dahil kriterlerin çoğu ya da hepsi
sağlanmalıdır (Pääbo et al., 2004; Hebsgaard et al., 2005). Schweitzer ve meslektaşları
(2008) ancak fosillerin morfolojik, mikroyapısal ve kimyasal analizleri, biyomoleküler
parçaların olası varlığını gösterirse, moleküler analizlere başlanması gerektiğini
savunmaktadır.
Örneğin Yapısı: Tek bir eski örneğin analizi, örneğin kaldığı zamandan ziyade
yapısından dolayı sorunludur. Birçok örneğin bir popülasyon olarak analizi ise daha
zordur. Çoğu eski toplum örneği, belirli bir bölgede değişen zaman aralıklarıyla ayrılan
birçok bireyden oluşur. Bu sebeple popülasyonun standart tanımını sağlamaz ve bunun
87
geleneksel anlamda doğru bir popülasyon olmadığı bilinmelidir. Bu tip bir örnek
dağılımında, standart popülasyon ve genetik analiz varsayımları üzerinde uzlaşma
sağlanmalıdır. Bu, örneklerde güvenilir zaman kaynağının önemli olduğu anlamına gelir.
Örnekleri tarihlendirme, aDNA analizlerinin maliyetini azaltır. Sadece aDNA analizi için
kullanılan kalıntılar ile ilişkili olan arkeolojik alanların veya tabakaların tarihi, örneğin yaşı
için güvenilir belirteçler olmayabilir veya en azından örneklerin kaynakları hakkında açık
bir soru bırakırlar (Santure et al., 1990).
aDNA araştırmalarında bir başka sorun da, tüm örneklerde genetik işaretler elde
etme başarısının aynı olmamasıdır. Örneğin; Amerika yerlilerinin haplogruplarını tespit
etmek için kullanılan farklı işaretlerde, bütün primer setleri her örnekte başarılı sonuç
vermez. Bu durum, haplogrup frekanslarını hesaplamada karışıklık yaratır ve birbiriyle
çelişkili haplogrup ve genetik işaret frekanslarına sebep olur. Degrade nükleik asitlerle
çalışıldığında durum daha kötü bir hal alır ve modern-eski örnek karşılaştırması zorlaşır.
Farklı bir genetik işaretten ziyade dizinlemeye güvenmek, durumu kurtarır (O’Rourke et
al., 2000).
Bahsedilen tüm önlemlere rağmen, herhangi bir aDNA laboratuvarında
kontaminasyon kaçınılmazdır. Dekontaminasyon yöntemleri %100 etkili değildir ve aDNA
çalışmalarında kontaminasyon hala ciddi bir sorundur (Gilbert et al., 2005). Değişmez bir
tehlike ve beklenen bir sonuç olan bulaşma, çoğunlukla enzim inhibitörlerinden
kaynaklanan PCR başarısızlıkları yüzündendir ve temiz örneklerle tekrarlar veya
değişiklikler yapılarak üstesinden gelinebilir (O’Rourke et al., 2000; Hebsgaard et al.,
2005). Başlangıç materyalinin az olması, PCR inhibitörlerinin varlığı, endojen DNA hasarı
gibi sorunları çözmek için uygulanan ilk stratejiler, Taq-polimeraz’ın miktarını arttırmak
88
veya DNA izolatını seyreltmektir. PCR inhibitörleri de seyreltilmiş olur (Hummel et al.,
1992; Eilert and Foran, 2007). Bu noktada bifazik amplifikasyon kullanılabilir, seyreltilmiş
örnekle 20–30 döngü PCR yapılır ve ürünün %5-10’u aynı amplifikasyon parametrelerinde
yeniden çoğaltılmaya tabi tutulur (Hummel et al., 1992). Daha sonra izolasyon ve
saflaştırma prosedürlerini geliştirmek temel alınmıştır (Anderung et al., 2008).
Saflaştırmanın DNA kaybına sebep olduğu konusunda, Boom ve meslektaşları (1990)
sadece çok küçük (40–60 baz çiftinden az) DNA parçalarının kaybolduğunu belirtmiştir.
aDNA izolatları için çok sayıda bağımsız PCR veya sonuçların istatistiksel yöntemle
analizi DNA hasarının etkilerini elimine etmek için uygulanan diğer yöntemlerdir
(Axelsson et al., 2008). Bunlardan bazıları diğerlerinden daha etkili olsa da, hiçbiri genel
kabul görmüş değildir (Anderung et al., 2008). Bu gerçekler, sonuç elde etme ve raporlama
başarısını düşürmektedir, çünkü tek bir PCR'ın başarısızlığı, doğru bir veri sağlamaz.
Ancak bu zorluklar; çoğaltılabilir DNA veren örnekler dışında, bireysel araştırmalardaki
veya çalışma gruplarındaki başarı veya başarısızlık oranlarını doğrulukla belirlemek için
standart prosedürlerin olmadığı anlamına gelir. Yakın gelecekte de bir standardizasyon söz
konusu görünmemektedir. Yine de birçok aDNA çalışması başarıyla sürdürülmekte ve
fiziksel antropoloji, toplum tarihi, demografi ve evrimdeki çeşitli sorunları çözmektedir
(O’Rourke et al., 2000; Hebsgaard et al., 2005).
GEÇMİŞE AİT DNA ÇALIŞMALARINDA ETİK VE YASAL KONULAR
Antropolojik materyalin her açıdan doğru yönetimi zorunludur. Örneğin; uzun
kemiklerden en az hasarla örnek almak (Gibbon et al., 2009) veya dentin izolasyonundan
sonra dişi yapıştırmak mümkün olduğu halde, aDNA yöntemleri genellikle tahrip edicidir.
89
Bu kaynaklar yerine geri konulamaz olduğundan, tahrip edici analizler sadece sonuçlar
önemli tartışmalarda bilgilendirici olacaksa, ilginç hipotezleri test etmede veri
sağlayacaksa veya tahribat diğer araştırma alanlarını etkilemeyecekse gerçekleştirilmelidir.
Çalışma öncesinde araştırmacılar, bazı sorularla durumu değerlendirerek aDNA
analizlerine başlamalıdır. Örneğin; yöntem uygulaması antropolojik bir soruya yönelik mi?
Sonuç almak için tahrip etmeyen bir yöntem var mı? Kalıntıların veya diğer örneklerin
durumu DNA’nın varlığına işaret ediyor mu? Kalıntıların tahrip edilmesi farklı paydaşları
nasıl etkiliyor? Olası sonuçların etik, yasal ve sosyal içerikleri, varsa yaşayanlar için,
nedir? Ayrıca, gelecekteki herhangi bir olası test için bir miktar örnek saklanmalıdır.
Böylece ilk çalışma zamanında olmayan yeni yöntemlerin uygulanması veya sonuçların
doğrulanması sağlanabilir (Kaestle and Horsburgh, 2002).
İnsanlarla ilgili her çalışmada olduğu gibi, biyoarkeoloji alanında da etik, yasal ve
sosyal konuları göz önüne almak gerekir. Geçmişe ait DNA çalışmaları, ölmüş insanların
hem fiziksel kalıntıları hem de kültürleri ile ilgili olduğundan, fiziksel antropoloji ve
arkeoloji arasında devamlı ve akıcı bir bağ olduğunu göstermektedir. Antropolojik aDNA
çalışmalarında araştırmacıların karşılaştığı etik konuların çoğu, yüzyıllardır iskelet
antropologları, hatta özellikle arkeologlar tarafından düşünülmektedir. Yaşayan insanlar ve
toplumlar için arkeolojik ve fiziksel antropolojik araştırmalarda etik, yasal, sosyal
konuların farkına varılması, çalışmalarda kültürel antropolojinin önemini arttırmaktadır.
Bu sebeple tüm bu alanların bilgileri, birbirine fayda sağlayacak şekilde ilgili ve iç içedir
(Kaestle and Horsburgh, 2002; Walker, 2008).
Amerika Birleşik Devletleri, Avustralya ve İsrail’de iskeletlerin analizine kültürel,
dini veya politik sebeplerle itirazlar; örnekleri araştırmak için gerekli izinleri engellemekte,
90
aDNA araştırmalarını etik, yasal ve sosyal konular açısından önemli hale getirmektedir
(Lalueza-Fox, 1997; O’Rourke et al., 2000; Walker, 2008). Müze örnekleri ile ilgili
çalışmalarda ise etik ve yasal sorunların yanında örneklere erişim izni de önemli bir
konudur (Stodder, 2008).
Geçmişe ait DNA konusunda çalışan araştırmacıların yerel yasal düzenlemelerden,
sınırlamalardan haberdar olması gerekir. Dünyada bazı profesyonel kurum veya kuruluşlar;
biyomedikal ve sosyal bilimler araştırmacıları tarafından kullanılmak üzere, geçmişe ait
insan kalıntıları ile çalışmalarda ortaya çıkan etik sorunları çözmekle doğrudan ilgili
bilgiler içeren kılavuzlar geliştirmişlerdir (Walker, 2008). Ancak araştırma materyallerini
çalışmak için tek bir strateji önerilemez. Bununla birlikte, aDNA araştırma projelerinin
başlatılmasından önce, tartışma ortamının yaratılması ve gerekli izinlerin elde edilmesi,
tarafların sonraki anlaşmazlıklarını engelleyecek ve ileride yapılacak araştırmaları
kolaylaştıracaktır. Araştırmacılar toplumun emanetinde olan bu örnekleri korumak için
bilimsel ilkeleri kullanmak zorundadır. aDNA analiz sonuçları, atasal veya ata soyundan
gelenlerle ilişkilerinin mantıklı bir şekilde gösterildiği veya ifade edildiği zaman kavramını
genişletmeye yarayabilir. Bu konular gittikçe daha fazla önem kazanmakta veya
karmaşıklaşmakta ve deneysel düzeneklerle eşit dikkat gerektirmektedir (O’Rourke et al.,
2000).
Günümüzde yaşayan insanlarla ilgili biyolojik çalışmalarda, yasal veya kurumsal
düzenlemeler doğrultusunda katılımcıların çeşitli düzeylerde aydınlatılmış rızaları alınır.
Ancak bu, ölmüş bireylerde mümkün olamayacağından, örneklerde antropolojik veya
arkeolojik çalışmalar genellikle kamu kurum ve kuruluşlarının iznine bağlıdır. Ölülerin
hakları ile ilgili felsefi tartışmaların geçmişi ise çok eskidir ve çoğu tartışma, gizliliğin ve
91
şerefin korunması veya ölünün isteklerine saygı duyulması gibi haklar üzerinde
odaklanmıştır. Holm (2001) aDNA araştırmaları açısından bu konuları tartışmıştır.
Eski DNA çalışmaları; yaşayan toplumların sosyal, siyasal ve yasal durumlarını
etkileyebilir ve kendilerinin ataları veya kökenleri hakkındaki inanışlarıyla çelişebilir.
Hayatta olan insanlarla yapılan çalışmalarda olduğu gibi, aDNA çalışmalarının sonuçları
araştırmaya katılmamış olsalar bile grup üyeleri üzerinde etkilidir. Genetik deliller; sosyal,
siyasal ve hukuksal alanda büyük önem kazanma potansiyeline sahiptir (Kaestle and
Horsburgh, 2002). aDNA çalışmaları, geçmişte ve günümüzdeki bireyler ve gruplar
arasında biyolojik bağların kanıtı olduğu için, bu tip deliller arazi parsellemek için hak
talebinde bulunmak veya bir hakkı reddetmek amacıyla kullanılabilir. Birçok aşiret bunun
için aDNA uzmanlarıyla anlaşmalar yapmaktadır (Tallbear, 2000; Lehrman, 2001).
Biyoarkeolojik örneklerde DNA araştırmalarının bir başka etik, yasal ve sosyal
içerik örneği; geçmişten kalan Amerika yerlisi bireylerin ülkelerine iade edilme kararları
veya kültürel aidiyetin belirlenmesidir. Yerli Amerikalı mezarlarını koruma kanunu,
kültürel aidiyet için hem genel anlamda biyolojik delilleri, hem de moleküler genetik
analizleri kabul eder (Kaestle and Horsburgh, 2002).
ESKİ DNA ÇALIŞMALARININ ADLİ BİLİMLERE KATKISI
Adli bilimler, olay yerinde bulunan örneklerin analizini gerektirir. Çoğunlukla
sınırlı miktarda ve bozulmuş yapıda olan biyolojik delillerden, ancak uygun yöntemler
kullanıldığında sonuç alınabilir. Özellikle iskelet kalıntılarından DNA analizleri, zor ve
zaman alan bir süreç haline dönüşür. Dolayısıyla yüzyıllar boyunca toprak altında çeşitli
çevre şartlarına maruz kalmış arkeolojik kemikler veya dişler için başarıyla uygulanan
92
aDNA analiz yöntemleri, düşük DNA kopya sayısına sahip veya degrade durumda olan
adli örneklerin incelenmesinde de bir yol gösterici olarak kullanılabilir (Capelli et al.,
2003; Ballantyne et al., 2007; Fondevila et al., 2008).
İskeleti bulunan bir bireyin idantifikasyonunda kemikten veya dişten elde edilen
DNA profili, kaybolan kişinin eşyalarından veya akrabalarından elde edilecek olan genetik
bilgilerle karşılaştırılabilir. Bulunan kemik örneklerinin, kaybolan kişiye ait olup olmadığı
belirlenir. Benzer şekilde yıllar önce vefat etmiş bir kişinin anne/baba olup olmadığı; fethi
kabir ile elde edilen kemiklerinin DNA profilinin çocuk/çocuklarınki ile karşılaştırılmasına
dayanılarak ortaya çıkarılır.
Arkeolojik kayıtlardan akrabalık sistemlerinin belirlenmesinde kullanılan
istatistiksel yaklaşım, konvansiyonel akrabalık teorisinden ve adli bilimlerden alınmıştır
(Dudar et al., 2003). İncelenen örnekler, bazen soy ağacı çıkarmaya uygun olmayabilir ve
alel düşmesi meydana gelebilir, bu da özellikle az sayıda veri olduğunda yanlış
yorumlamaya sebep olur. Böyle bir olası durumda, felaket kurbanlarının
kimliklendirilmesinde, kayıp kişilerin belirlenmesinde veya diğer akrabalık analizlerinde
kullanılmak üzere formüller geliştirilmiştir (Buckleton and Triggs, 2006).
Moleküler antropolojide uygulanan mtDNA klonlanmasının, adli bilimlere
uyarlanması mümkündür. Geçmişe ait örnekler, birer karışım olarak kabul edilir ve
kontaminasyonun yokluğunun kanıtlanması gerekir. Moleküler klonlama bu farklı mtDNA
karışımlarını ayırmak için iyi bir yoldur (Lutz et al., 1999; Hatsch et al., 2006). Bunun
yanında tek bir dizin özellikle adli bilimlerde dışlama için yeterli değildir (Lutz et al.,
1999). Ancak rutin uygulamalarda çok sayıda koloni oluşturmak da, sınırlayıcı bir
faktördür. Ayrıca klonlama prosedürleri pahalı kitlerle yürütülmektedir. Bu sebeple adli
93
bilimlerde kullanılmak üzere uygun maliyetli, kısa süren ve pratik yöntemler
geliştirilmiştir. Örneğin, diferansiyel izolasyonla hazırlanmış bir örnekten elde edilen
karışımları analiz ederken, kadına ait olduğu düşünülen kısımda klonlama yapılabilir
(Hatsch et al., 2006).
Adli bilimlerde bir başka yasal konu da, belirli hayvanlara ait olduğu iddia edilen
işlenmiş et ürünleri olabilir. Özellikle yasalarla korunan hayvanlardan elde edilen etlerin
doğrudan veya işlenerek satılması, suç teşkil etmektedir ki; bunun da delillendirilebilmesi
gereklidir. Bu amaçla söz konusu karışık et ürünlerinin içeriklerini belirlemede,
örneklerden yapılacak DNA analizleriyle, hayvan türlerinin belirlenmesi mümkündür.
Ancak işlenmiş et ürünlerinde var olan DNA degrade halde olduğundan, aDNA
yöntemlerinden faydalanılır ve etin ait olduğu hayvan türü veya türleri moleküler düzeyde
tespit edilebilir.
ANADOLU’DA DEMİR ÇAĞI
Demir Çağı, pekçok bölgede değişik tarihlerde başlamış ve bitmiş olsa da
Anadolu'da genel olarak, M.Ö. 13. yüzyılda başladığı, M.Ö. 4. yüzyılda bittiği kabul edilen
ve demirin eritilerek kullanılmasıyla karakterize olan bir dönemdir. Bu dönemde bulunan
demirin bulunup işlenmesi, sanayinin gelişmesine neden olmuştur. Bakır ve tunçun yerini
demirden silah ve eşyalar almıştır. Ticaret hızlanmış, toplumların birbirleriyle ilişkileri
sağlanmıştır. Demir Çağı'na ait Anadolu uygarlıklarından bazıları, Geç Hititler, Urartular,
Frigler, Lidyalılar ve Likyalılar'dır.
94
Van Coğrafyası
Van, Doğu Anadolu Bölgesi’nin beş coğrafik bölümünden biridir ve Van Gölü’nün
varlığından dolayı, bölgenin diğer bölümlerinden ayrılır. Karasal iklim görülür. Kışları
soğuk ve kar yağışlı, yazları ise sıcak ve kuraktır. Ancak göllerin ve barajların varlığı,
iklimin kışın komşu illere göre daha yumuşak olmasını sağlar. Gece-gündüz arası sıcaklık
farkı fazladır. Toprakları verimli, akarsuları bol olduğu için tarih boyu birçok farklı
medeniyet tarafından elverişli bir yerleşim merkezi olarak kullanılmıştır.
Yoncatepe ve Urartu Medeniyeti
Urartular, Doğu Anadolu Bölgesi’nde yaşamış, Demir Çağı (M.Ö. 1200–750/700)
uygarlıklarından biridir. M.Ö. 9. yüzyılın ortalarında Van Gölü çevresinde yaşayan göçebe
topluluklar birleşerek Urartu Devleti’ni kurmuşlardır. Urartu toprakları M.Ö. 8. yüzyıl
ortalarında genişlemiştir. Daha sonra diğer medeniyetlerle savaşlar meydana gelmiş, toprak
kaybedilerek gerileme başlamış ve M.Ö. 612 yılında Urartu Devleti’ne Medler ve İskitler
tarafından son verilmiştir (Çilingiroğlu, 1984).
1995 yılında "Doğu Anadolu Bölgesi'nde Urartu Baraj ve Sulama Sisteminin
Araştırılması" konusunda gerçekleştirilen yüzey araştırması sırasında modern Van kentinin
9 km güneydoğusunda, Yukarı Bakraçlı Köyü sınırları içerisinde Yoncatepe yerleşmesi
saptanmış (Şekil 6) ve arkeolojik kazı alanı (Şekil 7) olarak incelemeye alınmıştır.
Yoncatepe ve yakın çevresi, Urartu Krallığı Dönemi'nde önemli bir yer tutmuştur. Bakraçlı
Köyü içinde bulunan tarihi Yedikilise'nin (Varak Kilisesi) duvarlarında devşirme malzeme
olarak kullanılan ve Urartu Kralı Menua'ya ait çok sayıdaki çivi yazılı yapı kitabesi bunu
doğrulamaktadır (Belli, 1996).
95
Şekil 6. Yoncatepe’nin genel görünümü (Belli, 1996).
Şekil 7. Yoncatepe arkeolojik kazı alanı (Belli, 1996).
96
Yoncatepe Nekropolü
Yoncatepe nekropolünde kazı çalışmaları sonucunda Demir Çağı’na tarihlendirilen
6 adet mezar odası (M1, M2, M3, M4, M5 ve M6) ortaya çıkarılmıştır. Yüzeyden yaklaşık
70–100 cm derinde olan mezarların üst örtüsü çökmemiştir, yapılar ve içinde
barındırdıkları korunmuştur (Belli and Kavaklı, 2001). Bu çalışma kapsamında incelenen
Mezar 2 (M2) ile Mezar 6’nın (M6) genel görünümleri ve içindeki buluntular Şekil 8, 9, 10
ve 11’de görülmektedir. Mezarların tümünde çok sayıda iskelet ortaya çıkarılmıştır.
Kafatası sayısına göre M2’de 40, M6’da 38 kişi olduğu düşünülmektedir. Bireyler
mezarlara yaş ve cinsiyet ayrımı yapılmadan gömülmüştür. Mezarlarda bebek, çocuk,
genç, yaşlı, kadın ve erkek bireylere ait kemikler bir arada bulunmuştur (Belli, 2001).
Şekil 8. Mezar 2’nin genel görünümü (Belli and Konyar, 2001).
97
Şekil 9. Mezar 2’deki buluntular (Belli and Konyar, 2001).
Şekil 10. Mezar 6’nın genel görünümü (Belli and Konyar, 2001).
98
Şekil 11. Mezar 6’daki buluntular (Belli and Konyar, 2001).
Yoncatepe halkı, kendine özgü bir ölü gömme geleneğine sahiptir. Ölülerini
taşlarla örülerek yapılan ve gömünün konulduğu odaya girişini sağlayan bir kapının
bulunduğu dikdörtgen planlı oda mezarlara gömmüşlerdir. Bu yapılara normal koşullarda
bu kadar kişinin konulması mümkün değildir. Erken Demir Çağı'na tarihlendirilen diğer
nekropollerde olduğu gibi, burada da mezar odası dolduktan sonra, her yeni gömü
yapıldığında eskisi geriye doğru itilmiş ve böylece mezarların dip kısmında bir kemik
yığını oluşmuştur. Kemiklerin mezar dibine itilmesi sırasında, kafataslarının büyük bir
özenle çanakların içine konulduğu gözlenmiş, bununla birlikte kemiklerin karıştığı ve
parçalandığı belirlenmiştir. Mezar odalarında normal gömülerin yanında yakılarak
gömülmüş kişilerin kemiklerine de rastlanmıştır. Bu mezarların iki gömü türünün aynı
mezarda kullanılmış olması, aynı kabileye veya aileye ait bireylerin farklı geleneklere veya
dinsel inanışlara sahip olabileceklerine işaret etmektedir (Belli and Konyar, 2001).
99
BÖLÜM 3
GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışmada materyal olarak Van-Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200–
750/700) arkeolojik kazı alanındaki mezar odalarında bulunan insan kemikleri
kullanılmıştır. Yoncatepe kazı alanı, Van kentinin 9 km güneydoğusunda, Yukarı Bakraçlı
Köyü sınırları içinde yer almaktadır. Kazı çalışmaları sonucunda Demir Çağı’na
tarihlendirilen altı adet mezar odası (M1, M2, M3, M4, M5 ve M6) ortaya çıkarılmıştır.
Yüzeyden yaklaşık 70–100 cm derinde olan mezarların üst örtüsü çökmemiş, yapılar ve
içinde barındırdıkları korunmuştur (Belli ve Kavaklı, 2001). Kazı alanından elde edilen
insan kemiklerinin antropolojik çalışması Mergen ve İşcan (2007) tarafından
tamamlanmıştır.
Bu çalışma için oda mezarlardan M2'deki 20, M6’daki 17 insan femur kemiği
parçası, Adli Tıp Enstitüsü ve Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarları’nda
mtDNA HVRI 16147–16294 baz çifti arası bölge açısından analiz edilmiştir.
KEMİKLERİN HAZIRLANMASI
Aşama İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Adli Osteoloji Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.
M2 ve M6 oda mezarlarından çıkarılan, ancak antropolojik ölçüm yapılamayan femur
kemikleri seçildi. Çalışmanın yapılacağı alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu
kullanılarak temizlendi ve birkaç kat alüminyum folyo ile kaplandı. M2'deki 20, M6’daki
17 femurun sıkı kemik dokusundan 3–4 cm örnek, kıl testeresi ile kesilerek
numaralandırılmış falkon tüplere alındı. Kontaminasyonun önlenmesi amacıyla; her örnek
için kullanılan alüminyum folyo, kıl testeresinin ucu değiştirildi. Modern DNA
100
kontaminasyonundan korunmak amacıyla kullanılan eldiven, maske ve bone de her örnekle
birlikte yenilendi.
Kemiklerin toz haline getirilmesi aşamasında, çalışılacak alan %4'lük NaOCl
çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi ve birkaç kat alüminyum folyo ile kaplandı.
Örneğin dış yüzeyinin temizlenmesinde kullanılacak bistürinin her iki tarafı 10'ar dakika
UV'de bekletildi. Folyo üzerine alınan örneğin dış yüzeyi, bistüri ile traşlandı. İç
yüzeyindeki süngerimsi doku uzaklaştırıldı. Kemik parçasının her iki yüzeyi 5'er dakika
UV'de bekletildi. Örnek, kilitli plastik poşete alındı. Bir kat kilitli poşete daha konuldu ve
laboratuvar dışında, birkaç kat karton konulmuş zemin üzerinde, 2 kg’lık bir çekiç
kullanılarak, poşet içindeki kemik parçasının kırılması ve toz haline gelmesi sağlandı. Toz
haline getirilen örneğin bulunduğu poşetler, alüminyum folyo kaplı alan üzerinde
dikkatlice açılarak, 15 ml falkon tüplere aktarıldı. Toz örnekler, 0.5 g tartılarak üç farklı
1.5 ml ependorfa bölündü. İki ependorf izolasyonda kullanılmak, bir ependorf ise ihtiyaç
durumunda dış laboratuvara gönderilmek üzere hazırlandı. Geri kalan toz ise yine ependorf
tüp içine alındı. Tüm örnekler her zaman derin dondurucuda (-20° C) saklandı.
DNA İZOLASYONU
Aşama, İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Moleküler Genetik Laboratuvarı’nın izolasyon
bölümünde QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA) kullanılarak gerçekleştirildi.
1.
Çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi.
2.
Kullanılacak tüm otomatik pipetlerin her iki yüzeyi, pipet uçları, izolasyonu
yapılacak örnek sayısı kadar 15 ml falkon tüp, 1.5 ml ependorf tüp, ayrıca 0.5 M
pH=8 EDTA çözeltisi, 10 dakika UV'de bekletildi.
101
3.
Su banyosu ve termomikser, 55°C'ye gelmesi için açılarak hazırlandı.
4.
15 ml falkona 10 ml EDTA çözeltisi konuldu.
5.
50 µl 10 µg/µl Proteinaz K ve 0.05 g SDS eklendi. Karışım 5 dakika UV'de
bekletildi.
6.
Önceden 0.5 g tartılarak hazırlanmış ependorftaki her kemik tozu örneğine 1 ml
izolasyon çözeltisi eklendi.
7.
Kontaminasyonun tespiti için, her 3 örneğe karşılık 1 negatif kontrol örneği (kemik
tozu içermeyen, sadece izolasyon çözeltisi içeren örnek) de hazırlandı ve izolasyon
sırasında örneklerle birlikte bu tüp de aynı işlemlerden geçirildi.
8.
Örnekler, bir gece 55° C 650 rpm termomikserde bırakıldı.
9.
Ertesi gün, çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak
temizlendi.
10. Kullanılacak tüm otomatik pipetlerin her iki yüzeyi, pipet uçları, izolasyonu
yapılacak örnek sayısı kadar 15 ml falkon tüp, izolasyonda kullanılacak purifikasyon
kitinin kolonları, kit içindeki PE, EB ve PBI çözeltileri, UV'de 10 dakika bekletildi.
11. Termomikserden alınan örnekler, 2000 rpm'de 5 dakika santrifüj edildi.
12. Falkonlara 1 ml PBI çözeltisi konuldu. İçine santrifüjden alınan örneklerin üst
(süpernatant) kısmından 0.5 ml alınıp eklendi.
13. Karışımdan 0.7 ml, kitin sağladığı silika kolonlara aktarıldı.
14. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
15. Kolonların atık tüpleri çıkartılarak, %4'lük NaOCl çözeltisi emdirilmiş kağıt havluya
ters çevrildi ve içindeki sıvı uzaklaştırıldıktan sonra tekrar kolonların altına
yerleştirildi.
102
16. Falkondaki karışım bitene kadar bu işleme devam edildi.
17. Son santrifüjden sonra temizlenen atık kabı tekrar kolonun altına yerleştirildi ve
kolona 0.75 ml PE yıkama çözeltisi eklendi.
18. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
19. Atık kabı temizlenen kolonlar, tekrar 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildi.
20. Atık kabı atılarak, yerine 1.5 ml ependorf tüp yerleştirildi ve kolona 50 µl EB
çözeltisi eklendi.
21. 1 dakika beklendikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
22. Hazırlanan izolat, derin dondurucuda saklandı.
DNA'NIN ÇOĞALTILMASI
Aşama, Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarı’nın PCR bölümünde
gerçekleştirildi. Mitokondriyal DNA'nın HVRI bölgesinde 16147–16294 baz çifti arası
bölgenin çoğaltılması hedeflendi.
1.
Çalışılacak alan %4'lük NaOCl çözeltisi ile kağıt havlu kullanılarak temizlendi.
2.
Kullanılacak tüm otomatik pipetlerin her iki yüzeyi, pipet uçları, izolasyonu
yapılacak örnek sayısından (kontroller dahil) iki fazla sayıda 0.5ml ependorf tüp,
karışım için bir adet 1.5 ml ependorf tüp, ayrıca 10X tampon çözeltisi, MgCl2, dNTP
çözeltisi, 10 dakika UV'de bekletildi.
3. PCR karışımı hazırlandı (örnek başına):
MilliQ su
31 µl
10X tamponu
5 µl
dNTP
4 µl
103
MgCl2
4 µl
BSA
0.5 µl
Primer F+R
2 µl + 2 µl
4. Karışım 5 dakika UV'de bekletildi.
5. 0.2 ml ependorf tüplere 2.5 µl örnek, iki kontrol tüpüne de örnek yerine su konuldu.
6. PCR karışımına 0.25 µl Taq-polimeraz enzimi eklendi ve karışım her tüpe 47.5 µl
olarak paylaştırıldı.
7. PCR aletinde uygun programa konuldu:
ilk aşama:
95º C 7 dakika
44 döngü:
55º C 1 dakika / 72º C 1 dakika / 94º C 1 dakika
1 döngü:
55º C 1 dakika / 72º C 10 dakika / 10º C 15 dakika
Çoğaltılan DNA'nın Tespiti
1. 1 g agaroz tartıldı, erlene konuldu.
2. 50 ml 1X TBE eklendi.
3. Mikrodalga fırında orta derecede 2 dakika kaynatıldı.
4. 1 µl EtBr ilave edilerek, tarak yerleştirilmiş jel kabına döküldü.
5. 15 µl PCR ürünü ve 2 µl yükleme tamponu karıştırılarak jele yüklendi.
6. Karşılaştırma için PstI ile kesime uğratılmış Lambda DNA standart olarak kullanıldı.
7. 45–60 dakika 110 V' elektroforeze tabi tutulan agaroz jel, UV altında incelendi.
104
JELDEN DNA İZOLASYONU
Kesim yapılacak örnek sayısı kadar 1.5 ml ependorf tüp hazırlandı,
numaralandırıldı ve boş ağırlıkları tartılarak not edildi. UV'nin zararlı etkilerinden
korunmak için gözlük, maske, eldiven gibi gerekli önlemler alınarak, UV altında
görüntülenen jel bantları bistüri ile kesildi (Şekil 12).
Şekil 12. Agaroz jelden DNA bantının kesilmesi.
Her jel bantı, ait olduğu ependorf tüpe konuldu. Ependorf tüpler tekrar tartıldı.
Böylece ilk ağırlıkları ile ikinci ağırlıkları arasındaki fark, içerdikleri jel parçasının
ağırlığını verdi. QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, CA) kullanılarak işleme devam
edildi.
1. Ependorfa jel bantının hacminin 3 katı kadar QG çözeltisi eklendi.
2. Jelin erimesi için 50º C su banyosunda 10 dakika bekletildi.
3. Jel hacmi kadar izopropanol eklendi.
4. Karışım kitin sağladığı silika kolonlara aktarıldı.
5. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
6. Kolonların atık tüpleri boşaltılarak, %4'lük NaOCl çözeltisi emdirilmiş kağıt havluya
105
ters çevrildi ve tekrar kolonların altına yerleştirildi.
7. Kolona 0.75 ml PE yıkama çözeltisi eklendi. 1 dakika beklendi.
8. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
9. Atık kabı temizlenen kolonlar, tekrar 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildi.
10. Atık kabı atılarak, yerine 1.5 ml ependorf tüp yerleştirildi ve kolona 50 µl EB çözeltisi
eklendi.
11. 1 dakika beklendikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
12. Kolona 30 µl EB çözeltisi eklendi.
13. 1 dakika beklendikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
14. PCR ürünü, jelden saflaştırılmış halde elde edildi.
DNA'NIN KLONLANMASI
Bu aşama, İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Adli Mikrobiyoloji Laboratuvarı’nda TOPO TA
Cloning® Kit with pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen, CA) kullanılarak gerçekleştirildi. Önce
besiyeri hazırlandı, ardından klonlama işlemi tamamlandı.
Besiyeri Hazırlanması
İki farklı yöntem takip edildi:
I.
20 g hazır Luria-Bertani agara 250 ml deiyonize su eklendi ve otoklavda
sterilize edildi. Daha sonra 55º C'ye soğutulan sıvı besiyerine 400 µl ampisilin
eklendi ve petrilere döküldü.
II.
Mavi-beyaz görüntüleme için özel olarak üretilmiş hazır karışım (FastMedia™
LB Agar Amp IPTG/X-Gal, Fermentas) kullanıldı. Paket içeriği cam şişe içine
106
alındı, üzerine 200 ml deiyonize su eklendi ve mikrodalga fırında orta ısıda
önce 2 dakika, daha sonra hafifçe çalkalanıp 30 saniye tutuldu, tamamen
erimesi sağladı ve petrilere döküldü.
Her iki yöntemde de besiyeri soğuyarak katılaşınca, petrilerin kapağı kapatıldı ve
ters çevrilerek 4º C'de karanlıkta saklandı.
Klonlama İşlemi
1.
Petrilerdeki besiyeri 37º C etüve bırakıldı.
2.
Klonlama için kullanılacak kitin önerdiği üzere, su banyosu 42º C'ye ayarlandı ve
S.O.C. Medium oda sıcaklığına gelmesi için dolaptan çıkartıldı.
3.
Örnekler ve negatif kontroller için yeterli sayıda 0.5 ml ependorf hazırlandı ve
numaralandırıldı.
4.
Kontrol tüpü içinde karışım hazırlandı (örnek başına):
Tuz çözeltisi 1 µl + Vektör 1 µl
5.
Karışım 2 µl olarak tüplere bölündü.
6.
1µl jelden izole edilmiş PCR ürünü eklendi.
7.
30 dakika beklendi.
8.
Bu arada -80º C'den TOP10F’ hücreleri buz içine alındı.
9.
30 dakika sonunda örnek tüplerini içeren spor buza yerleştirildi. Tüplerin alt kısmının
buzda kalması sağlandı. İçine 10µl TOP10F’ hücreleri ilave edildi.
10. 30 dakika beklendi.
11. 30 dakika sonunda tüpler, 42º C su banyosunda 30 saniye bırakıldı. Hemen ardından
buza alındı.
107
12. Her tüpe 250 µl S.O.C. Medium ilave edildi.
13. Etüvde 37º C'de 1 saat çalkalanmaya bırakıldı.
14. Petriler etüvden alındı.
15. Karışım hazırlandı (örnek başına):
X-Gal 20 µl + IPTG 20 µl
16. Karışım (40 µl), petrinin bir kenarına bırakıldı.
17. Etanolde bekletilen yayma aleti (Drigalski spatülü), önce bek alevinden geçirildi,
sonra petrinin bir kenarına bırakılmış X-Gal ve IPTG karışımının besiyerine yayılması
için kullanıldı.
18. Etüvde 37º C'de 30 dakika bekletildi.
19. 30 dakika sonra petriler ve tüpler etüvden alındı.
20. Ependorf içindeki tüm karışım (tuz çözeltisi, vektör, TOP10F’ hücreleri, S.O.C.
Medium) petrinin bir kenarına bırakıldı.
21. Etanolde bekletilen yayma aleti, önce bek alevinden geçirildi ve karışımın besiyerine
yayılması için kullanıldı.
22. Petriler etüvde 37º C'de gece boyu bekletildi.
23. Ertesi gün petriler incelendiğinde, hem mavi hem de beyaz kolonilerin oluştuğu
görüldü.
Kullanılan vektör, LacZ genini içeren, ampisilin dirençli bir vektördür. Lac Z geni,
laktozu glukoz ve galaktoza parçalayan enzim olan β-galaktosidazı üretir. Genin
çalışabilmesi ise, IPTG'nin (İzoPropil β-D-1-TiyoGalaktopiranosid) varlığına bağlıdır. Bir
laktoz türevi olan IPTG, Lac represöre bağlanır ve onu inaktive ederek Lac operonunun
108
çalışabilmesini sağlar. E. coli tarafından metabolize edilemediği için, konsantrasyonun
sabit kalması da önemli bir avantajdır. X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-Dgalaktopiranosid, BCIG), β-galaktosidaz enziminin substratıdır. Enzim, X-Gal'i renksiz
galaktoza ve mavi renkli 4-kloro-3-brom-indigo'ya parçalar. Dolayısıyla, besiyerlerinde
klonlamanın gerçekleştiği hücrelerde hedef PCR ürünü bakteri hücresindeki vektörün Lac
Z gen dizisinin ortasına girip genin çalışmasını durdurmuşsa, enzim üretilemediği için XGal parçalanmamıştır (mavi renk oluşmaz), beyaz koloniler meydana gelmiştir. Eğer
klonlama doğru gerçekleşmezse veya hiç meydana gelmezse, bu durumda Lac Z geni
enzim üretmeye devam etmiştir ve bu enzimler, X-Gal'i parçalayarak mavi renk (mavi
koloniler) oluşmasını sağlamıştır. İstenen, doğru koloniler, beyaz renkli kolonilerdir.
KLONLAMA SONRASI ÇOĞALTMA
Aşama, Uluslar arası Adli Bilimler Merkezi Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi.
Beyaz renkli kolonilerin içerdikleri hedef dizinin hot-start PCR ile çoğaltılması işlemine
geçildi. Böylece PCR sırasında oluşması muhtemel ve çoğalmayı olumsuz yönde
etkileyecek primer-dimer oluşumlarından korunulması hedeflendi.
1. Her örnek için 3–5 koloni seçildi ve yeterli sayıda 0.5 ml ependorf tüpler etiketlendi.
2. PCR karışımı hazırlandı (örnek başına):
MilliQ su
17 µl
10X tamponu
2.0 µl
MgCl2
1.5 µl
Primer F+R
0.5 µl + 0.5 µl
3. Karışım, 0.2 ml ependorf tüplere 21.5 µl olarak paylaştırıldı. Otomatik pipetlerin ucu
109
kullanılarak seçilen koloniler zarar vermeden alındı ve karışım içine aktarıldı.
4. PCR için ikinci karışım hazırlandı (her örnek için):
dNTP 2.0 µl + Taq-polimeraz 0.5 µl
5. PCR aletinde uygun programa konuldu:
ilk aşama:
94º C 10 dakika
25 döngü:
94º C 1 dakika / 55º C 1 dakika / 72º C 1 dakika
son aşama:
72º C 10 dakika / 15º C 15 dakika
6. İlk aşamanın tamamlanmasına 8 dakika kala tüplere 2.5 µl dNTP-Taq karışımı eklendi
ve kapağı kapatılan PCR aleti, programa devam ederek klonlanan ürünleri çoğalttı.
Çoğaltılan DNA Klonlarının Tespiti
1. 1.5 g agaroz tartıldı, erlene konuldu.
2. 75 ml 1X TBE eklendi.
3. Mikrodalga fırında orta derecede 2 dakika kaynatıldı.
4. 1 µl EtBr ilave edilerek, tarak yerleştirilmiş jel kabına döküldü.
5. 5 µl PCR ürünü ve 1 µl yükleme tamponu karıştırılarak jele yüklendi.
6. Karşılaştırma için PstI ile kesime uğratılmış lambda DNA örneği standart olarak
kullanıldı.
7. 30 dakika 135 V elektroforeze tabi tutulan agaroz jel UV altında incelendi.
Doğru eklenmenin gerçekleştiği örneklerde, PCR ürününe geri dönülerek purifiye
etme işlemine geçildi. Kısa eklenme, hiç eklenmeme veya sadece primer-dimer oluşumları
tespit edilen ürünler için ise, yeniden klonlama PCR'ı yapıldı.
110
PCR ÜRÜNLERİNİN SAFLAŞTIRILMASI
QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA) kullanılarak işleme devam edildi.
1. Ependorfta hazır bulunan PCR ürünü üzerine hacminin 5 katı kadar PBI çözeltisi
eklendi.
2. Karışım kitin sağladığı silika kolonlara aktarıldı.
3. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
4. Kolonların atık tüpleri temizlendi.
5. Kolona 0.75 ml PE yıkama çözeltisi eklendi.
6. 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
7. Atık kabı temizlenen kolonlar, tekrar 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj edildi.
8. Atık kabı atılarak, yerine 1.5 ml ependorf tüp yerleştirildi ve kolona 30 µl EB çözeltisi
eklendi.
9. 1 dakika bekledikten sonra 14000 rpm'de 1 dakika santrifüj yapıldı.
10. Saflaştırılmış PCR ürünü hazır hale getirildi.
DİZİNLEME
Dizinleme, Macrogen (Rockville, MD, USA) laboratuvarlarında gerçekleştirildi.
Önce BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA)
kullanılarak çoğaltma yapıldı.
1. PCR karışımı hazırlandı (her örnek için):
Hazır reaksiyon karışımı
9.5 µl
Primer Karışımı
3.5 µl
Örnek
8 µl
111
2. PCR aletinde uygun programa konuldu:
ilk aşama:
96º C 1 dakika
25 döngü:
96º C 15 saniye / 50º C 1 saniye / 60º C 60 saniye
son aşama:
15º C 10 dakika
3. Elde edilen çoğaltılmış ürünler, ABI 310 Genetik Analizör cihazına yüklenerek
yürütüldü.
DİZİNLERİN DEĞERLENDİRİLMESİ
Elde edilen dizinler, önce Chromas yazılım programına aktarılarak işlendi. Hedef
DNA dizilerinin vektörün DNA dizini ile birleştiği kısımlar, vektörün dizin haritası (Ek 2)
kullanılarak belirlendi. İstenen dizin dışında kalanlar seçilerek çıkarıldıktan sonra veri,
BioEdit yazılım programına aktarılarak Cambridge Referans Dizini ile karşılaştırıldı.
112
BÖLÜM 4
BULGULAR
Çalışmada Van-Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200–750/700) kazı alanında
bulunan oda mezarlardan M2'deki 20, M6’daki 17 insana ait femur parçası olası akrabalık
ilişkilerini genetik analizlerle belirlemek amacıyla analiz edildi.
Öncelikle kemiklerden DNA izole edildi. İzolasyon sırasında örneklerin renginde
farklılıklar gözlendi (Şekil 13).
Şekil 13. DNA izolasyonu sırasında örneklerin üst fazında görülen renk farklılıkları.
İzolatlar agaroz jel elektroforezinde yürütüldü (Şekil 14 ve 15). Şekil 14 ve 15’te
oklarla işaret edilen alanlar, izolasyon sırasında tüm işlemlerden geçirilen, ancak DNA
içermeyen kontrol örneklerini göstermektedir.
Daha sonra mitokondriyal DNA'nın HVRI bölgesinde 16147-16294 baz çifti arası
bölge çoğaltıldı. 145 baz çiftlik PCR örnekleri, PstI ile muamele edilmiş Lambda
DNA’dan oluşturulan bir marker ile karşılaştırıldığında; PstI standartının verdiği iki bandın
113
arasında bant vermiş olması beklendi. Bazen amplifikasyon başarısız oldu, sadece primerdimer oluşumu gözlendi (Şekil 16).
Şekil 14. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü (Soldan sağa sırasıyla Marker, M2FD1, M2-FD2, M2-FD3, M2-FD5, M2-FD6, M2-FD7, M2-FD8, M2-FD9, M2-FD10, M2FD12, Kontrol II; M2-FD18, M2-FD19, M2-FD20, M6-FD2, M6-FD6, M6-FD10, M6FD16, M6-FD7, Kontrol I).
Şekil 15. Marker ve izolatların agaroz jelde görünümü (Soldan sağa sırasıyla Marker, M2FD4, M2-FD11, M2-FD13, M2-FD14, M2-FD15, M2-FD16, M2-FD17, M6-FD1, M6FD3, Kontrol III; M6-FD4, M6-FD5, M6-FD8, M6-FD9, M6-FD11, M6-FD12, M6-FD13,
M6-FD14, M6-FD17, Kontrol IV).
114
Şekil 16. Amplifikasyonun başarısız olduğu, sadece primer-dimer oluşumunu gösteren bir
jel görüntüsü. (Sırasıyla: PCR Kontrol I, M2-FD6, M2-FD9, M2-FD10, M2-FD12, Kontrol
II, M2-FD18, M2-FD19, M2-FD20, Kontrol I, PCR Kontrol II).
Amplifikasyona tabi tutulan izolasyon kontrol örneklerinin ve PCR kontrollerinin
bant vermemesi gerekliydi. Ancak bazen her iki kontrolde de DNA varlığına işaret eden
bantlar olduğu görüldü ve kontaminasyon tespit edildi (Şekil 17). Bu sebeple, PCR
aşaması tekrarlandı.
Tüm bunlarla birlikte kontaminasyonun olmadığı, beklenen boyutta doğru ürünlerin
oluştuğu başarılı amplifikasyonlar da yapılabildi (Şekil 18). Bu durumda jelden izolasyon
aşamasına geçildi.
115
Şekil 17. Amplifikasyon sırasında kontaminasyonun olduğunu gösteren bir jel görüntüsü.
(Sırasıyla: PCR Kontrol I, M2-FD6, M2-FD7, Kontrol II, M6-FD2, M6-FD6, M6-FD7,
M6-FD10, M6-FD16, Kontrol I, PCR Kontrol II).
805
514
468-448
339
264-247
164-150
94
Şekil 18. Amplifikasyonun doğru gerçekleştiği bir jel görüntüsü. (Sırasıyla: PCR Kontrol,
Kontrol I, M2-FD6, M6-FD6, M6-FD7).
116
Klonlama aşamasına geçmeden önce üç örnek seçildi ve doğrudan dizinleme
yapıldı (Şekil 19). Çok fazla farklı DNA bulunması ve primerlerin bu DNA’ların hepsini
çoğaltıp dizinlemesi sebebiyle elektroforegramda karışık bir dizin görüntüsü elde edildi.
Dizinleme sonuçlarının doğru olmayacağı belirlendi. Böylece doğrudan dizinlemenin
güvenilir sonuçlar vermeyeceği, bu nedenle klonlamaya mutlaka ihtiyaç olduğu görüldü.
Şekil 19. Amplifikasyon ürünlerinden klonlama yapılmadan önce M6-FD7 örneğinin
saflaştırma sonrası dizinlenmesi.
Her örnek için PCR ürünlerinin klonlaması sırasında oluşan kolonilerden 5 adet
seçildi. Bazı örneklerde koloni oluşumunun zayıflığı sebebiyle, 2–3 koloni alınabildi.
Ürünlerin vektöre doğru bağlanıp bağlanmadığının tespiti, amplifikasyon sonunda jel
elektroforezi ile analiz edildi (Şekil 20). Görüntüde, 201 baz çiftlik klonlama parçasının
arasına yerleşen 147 baz çiftlik PCR örneklerinin, sahip olduğu ağırlıktan (348 baz çifti)
117
dolayı, PstI ile oluşturulan marker’ın verdiği 339 baz çiftlik bantın biraz üzerinde bant
vermiş olması beklendi. Bu ağırlıktaki DNA bantının dışında görülen her bant istenmeyen
üründü. Örneğin; PstI standartının 200–240 baz çifti arasında görülen bantlar, kısa
eklenmeyi; 150–200 baz çifti arası görülen bantlar eklenmenin hiç gerçekleşmediğini
gösterdi. Marker’ın en alt bantı olan 97 baz çiftinin de altında görülenler ise sadece primerdimerlerdi.
339
200
Şekil 20. Klonlamadan sonra gerçekleştirilen amplifikasyonda vektöre doğru bağlanan ve
bağlanmayan ürünlerin tespit edildiği jel görüntüsü.
Klonlama sonunda vektöre doğru bağlandığı belirlenen ürünlerde saflaştırma
yapıldı. Her örnekten seçilen beş koloninin çoğaltılıp jelde yürütülmesi sonucunda, doğru
eklenme olmayan ürünler saflaştırılmadı. Diğerlerinde ise saflaştırmadan sonra her örnek
için 3-5 koloni dizinlendi (Şekil 21).
118
Şekil 21. Klonlama yapılmış M6-FD6 amplifikasyon ürününün elde edilen kolonilerinden
birinin dizinlenmesi.
Klonlamada M13 primerleri ile çoğaltılan bölgenin dizini hem vektöre, hem de
istenen PCR ürününe aitti. Vektörün arasına yerleştirilmiş olan PCR ürününün başlangıç
ve bitiş noktalarının doğru belirlenebilmesi için dizinler öncelikle Chromas programı ile
analiz edilerek veriler üzerinde işlem yapıldı. Vektörün dizin haritası kullanılarak (Ek 2)
PCR ürününün yer aldığı bölgenin dışında kalan kısımlar işaretlenerek çıkarıldı ve dizin
BioEdit programı ile analize hazır hale getirildi (Şekil 22).
Şekil 22. M6-FD6 örneğine ait bir koloni dizininin Chromas programı ile işlenmesi.
119
Tüm örneklere ait dizinler karşılaştırmalı olarak analiz edildi ve aynı örneğe ait
dizinler arasında görülen farklılıklar, kontaminasyon veya DNA hasarı açısından
değerlendirildi. Üç örneğe ait beşer dizinin birbiriyle ve Cambridge diziniyle BioEdit
programı kullanılarak karşılaştırılması Şekil 23, 24 ve 25’te görülmektedir.
Şekil 23. M2FD3 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit
programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması.
120
Şekil 24. M2FD7 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit
programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması.
Şekil 25. M6FD5 numaralı örneğin mtDNA analizinden elde edilen dizinlerin, BioEdit
programı kullanılarak, birbiriyle ve Cambridge diziniyle karşılaştırılması.
121
İncelenen kemik örneklerine göre izolasyon ve amplifikasyon başarısı, dizinlenen
koloni sayısı ve dizin sonuçlarında görülen farklılıklar Tablo 2’de verilmiştir.
Tablo 2. İncelenen kemik örneklerine göre izolasyon ve amplifikasyon başarısı, dizinlenen
koloni sayısı ve dizin sonuçlarında görülen farklılıklar.
İzolasyon
Tespiti
Amplifikasyon
Başarısı
M2-FD-1
+
+
Dizinlenen
Koloni
Sayısı
4
M2-FD-2
+
+
5
M2-FD-3
+
+
5
M2-FD-4
+
+
4
M2-FD-5
-
+
1
M2-FD-6
+
+
3
M2-FD-7
+
+
5
M2-FD-8
+
+
4
M2-FD-9
+
+
4
M2-FD-10
+
+
5
M2-FD-11
+
+
5
M2-FD-12
-
-
-
Örnek Kod
No
M2-FD-13
+
+
5
M2-FD-14
+
+
5
M2-FD-15
+
+
5
M2-FD-16
+
+
5
Cambridge Referans Dizininden Farklılık
3 dizin: 16172C
1 dizin: 16172C + 16223T
3 dizin: 16256T
2 dizin: 16204C
2 dizin: 16193T
1 dizin: 16155G+ 16193T + 16213A
1 dizin: 16193T + 16245T
1 dizin: CRS
3 dizin: 16223T
1 dizin: 16209C
16227G + 16261T
1 dizin: 16256T
1 dizin: 16172C + 16256T
1 dizin: 16227G + 16256T
2 dizin: 16242T
1 dizin: 16172C + 16208T
1 dizin: 16155G + 16208T
1 dizin: 16208T
1 dizin: 16189C
1 dizin: 16204C
1 dizin: 16213A + 16236T
1 dizin: 16236T
2 dizin: 16193T
2 dizin: 16193T + 16245T
3 dizin: 16256T
1 dizin: 16256T + 16261T
1 dizin: 16172C
2 dizin: 16176T
1 dizin: 16162G + 16197T
1 dizin: 16162G + 16257T
1 dizin: 16162G
2 dizin: 16225T
1 dizin: 16183G + 16225T
1 dizin: 16225T + 16256T
1 dizin: 16223T
3 dizin: 16172C
1 dizin: 16172C + 16223T
1 dizin: 16172C + 16261T
2 dizin: 16205T + 16236T
1 dizin: 16205T
1 dizin: 16193T
1 dizin: 16256T
1 dizin: 16155G
2 dizin: 16204C
1 dizin: 16245T
1 dizin: CRS
122
M2-FD-17
+
+
5
M2-FD-18
+
+
3
M2-FD-19
+
+
5
M2-FD-20
+
+
4
M6-FD-1
+
+
3
M6-FD-2
-
-
-
M6-FD-3
+
+
4
M6-FD-4
-
-
-
M6-FD-5
+
+
5
M6-FD-6
+
+
4
M6-FD-7
-
+
3
M6-FD-8
+
+
5
M6-FD-9
-
-
-
M6-FD-10
+
+
5
M6-FD-11
-
-
-
M6-FD-12
+
+
4
M6-FD-13
+
+
5
M6-FD-14
+
+
5
M6-FD-15
+
+
5
M6-FD-16
+
+
4
M6-FD-17
+
+
3
2 dizin: 16223T
1 dizin: 16223T + 16242T
2 dizin: 16172C
1 dizin: 16223T
1 dizin: 16176T + 16223T
1 dizin: 16176T
1 dizin: 16183G + 16204C + 16261T
1 dizin: 16183G + 16204C
2 dizin: 16183G
1 dizin: CRS
1 dizin: 16245A
1 dizin: 16155G
1 dizin: 16155G + 16242T
1 dizin: 16242T
2 dizin: 16162G
1 dizin: 16162G + 16245T
1 dizin: 16155G + 16213A
1 dizin: 16223T
1 dizin: 16256T
1 dizin: CRS
2 dizin: 16218T
1 dizin: 16172C
1 dizin: 16188T
1 dizin: 16244A
1 dizin: CRS
2 dizin: 16189C
1 dizin: 16189C + 16261T
1 dizin: 16173T
1 dizin: 16193T + 16227G
1 dizin: 16227G
3 dizin: 16172C
1 dizin: 16172C + 16205T
1 dizin: 16172C + 16242T
2 dizin: 16225T
2 dizin: 16162G
1 dizin: 16162G + 16225T
2 dizin: 16162G
1 dizin: 16162G + 16237T
1 dizin: 16162G + 16245T
2 dizin: 16189C
2 dizin: 16261T
1 dizin: 16189C + 16245T
2 dizin: 16223T
2 dizin: 16172C
1 dizin: 16172C + 16205T
1 dizin: 16208T
1 dizin: 16208T + 16256T
1 dizin: 16256T
1 dizin: 16236T
1 dizin CRS
2 dizin: 16172C
1 dizin: 16172C + 16155G
1 dizin: 16172C + 16256T
1 dizin: 16223T 1 dizin: 16189C
1 dizin: 16189C + 16261T
123
BÖLÜM 5
TARTIŞMA
İskelet kalıntılarında moleküler genetik analizler, temelde aynı veya benzer
teknikler içerse de, antropoloji ve adli bilimlerde zaman bakımından farklılıklar
taşımaktadır. Örneğin; tarih öncesi toplumlara ait iskelet kalıntıları bin, iki bin veya üç bin
yıllık iken; adli olgularda incelenen kemik veya diş örnekleri daha yakın tarihlidir. Bu
sebeple biyoarkeolojik kalıntıların tanımlanmasında çok eski, eski, tarihi örnek gibi
ifadeler karışabilir. Sivilich (2005), 1800’lü yılların ortalarından elde edilen kemiklerle
yaptığı çalışmada, iki yüz yıllık örnekler için ‘tarihi’ DNA terimini kullanmayı tercih
ettiğini belirtmiştir.
Türkiye’de son on yıl içinde adli bilimlerde insan kemik veya diş örneklerinden
DNA elde edilebilmekte ve birçok olgunun çözümünde kullanılmaktadır (Altunçul, 2001).
Örneğin; Giresun’da bir annenin kaybolduğu olguda köyün yakınlarında bulunan iskelet
kalıntılarının anneye ait olduğunun iddia edilmesi, ancak kızının bunu reddetmesi üzerine
kemiklerden yapılan hem çekirdek DNA’sı hem de mtDNA analizleriyle kayıp kişinin
iddia edilen anne olduğu belirlenmiştir (Altunçul et al., 2003). Ancak olguların her zaman
başarıyla çözümlenemediği, dahil etme olasılığının yükseltilmesinin istendiği, farklı
kurumlar tarafından farklı yöntemlerle tekrarlanmak zorunda kalındığı da bildirilmiştir
(Ozcan et al., 2006, Kalfoglou et al., 2007).
Türkiye’de tarih öncesi toplumlara ait iskelet kalıntılarından DNA analizi
çalışmaları da başlatılmıştır. Van-Yoncatepe arkeolojik bölgesindeki kazılarla elde edilmiş
iskelet kalıntılarında HLA-DQA1 geni tiplenmiştir (İşcan et al., 2007). Güral’ın (2007)
124
bildirdiğine göre; Kapadokya Aşıklı Höyük’te akdeniz anemisini araştırmak için insan
iskeletlerinden DNA örnekleri alınmış, kontaminasyon sebebiyle sonuç elde edilememiş;
Konya Çatalhöyük’te ise akrabalık ilişkilerini araştırmak için analizler yapılmış, ancak
sonuç alınamamıştır. Burdur Ağlasun’daki Sagalassos’ta 1994–1997 kazılarında 24
iskeletin kemik ve diş örneklerinde mtDNA analizi yapılmış, akrabalık ilişkisi ve Avrupa
ile filogenetik yakınlık araştırılmıştır. Hatay Amik ovası’ndaki Tell Kurdu kazılarında 14
bireyin cinsiyetinin yanında HVR1 analizi yapılmış, akrabalık bağları nedeniyle az sayıda
haplotip tespit edildiği ifade edilmiştir (Mekel-Bobrov and Lahn, 2004).
Çalışmada Demir Çağı’na ait Van-Yoncatepe bölgesindeki arkeolojik kazılarda iki
farklı oda mezardan çıkarılmış kemiklerin ait olduğu bireylerin olası akrabalık ilişkilerini
genetik analizlerle belirlemek ve bu arkeolojik toplumun sosyokültürel yapısına bir ışık
tutmak amaçlandı.
Yoncatepe (Urartu Medeniyeti, M.Ö. 1200–750/700) arkeolojik kazı alanındaki
mezar odasından 37 insan femur kemiği parçası, Adli Tıp Enstitüsü ve Uluslar arası Adli
Bilimler Merkezi Laboratuvarları’nda mtDNA HVRI 16147–16294 baz çifti arası bölge
açısından analiz edildi.
Yoncatepe Materyali
Van kentinin 9 km güneydoğusunda, Yukarı Bakraçlı Köyü sınırları içinde yer alan
Yoncatepe’de 1995 yılında "Doğu Anadolu Bölgesi'nde Urartu Baraj ve Sulama Sisteminin
Araştırılması" amacıyla gerçekleştirilen yüzey araştırması sırasında arkeolojik kazı alanı
tespit edilmiş, nekropolde bulunan altı mezar odasında farklı sayılarda iskelet kalıntılarına
ulaşılmıştır (Belli, 1996).
125
Arkeolojik kazı çalışmalarında tespit edilen örneklerin, yapılabilecek olası
moleküler genetik çalışmalar göz önünde bulundurularak toplanması ve saklanması
oldukça önemlidir. Ancak birçok durumda çeşitli sebeplerle bu mümkün olamadığından,
örnekler henüz toplanma aşamasında ya da toplandıktan sonra bir arada tutularak
bilinçsizce kontamine edilmekte, kazı alanında doğrudan güneş ışınlarına maruz
bırakılarak aşırı sıcakta kalmakta, ulaştırıldıkları inceleme birimlerinde doğru
saklanamamaktadır. Ancak bazı çalışmalarda örneklerin derin dondurucularda saklanarak
korunması veya moleküler genetik analizlerin kazıdan sonra hemen başlatılması gibi
uygulamaların başarılı sonuçlar verdiği görülür. Schweitzer ve araştırıcılarının (2008)
yaptığı çalışmada, kemikler kazı alanından uzaklaştırılmasını takiben yirmi dört saat içinde
–20º C’ye konulmuştur. Bu saklama koşullarında DNA’nın korunduğu, başarılı analiz
sonuçlarından anlaşılmaktadır (Hummel, 2003). Pruvost ve meslektaşları (2007) ise yeni
kazılarak alınmış kemiklerle gerçekleştirdikleri çalışmada iki kat daha fazla özgün DNA
elde ettiklerini belirtmişlerdir. Nielsen ve Thuesen (1998) de kazı alanında DNA
izolasyonunu tamamladıklarında daha başarılı sonuçlar elde ettiklerini bildirmektedir.
Yoncatepe kemik örnekleri bu bakımdan değerlendirilirse, 1995’te başlatılan kazılarla
çıkarıldığı, daha sonra tümünün bir arada oda sıcaklığında tutulduğu belirtilmelidir. Bu
durumun kontaminasyon ve DNA korunması açısından çalışmada olumsuz etkisi olduğu
söylenebilir.
Arkeolojik kazılarda görev alanlar, toplayacakları ve/veya saklayacakları
örneklerde moleküler genetik analizler yapılma olasılığının farkında olmalıdır. Ayrıca
arkeologlar kurdukları hipotezlerde bu analizlerin kendilerine daha net ve ayrıntılı veri
sağlayacağı konusunda bilgi sahibi olmalı, bunu talep etme hakkını kullanmalıdır. Bir
126
çalışmada, 28. Uluslar arası Kazı, Araştırma ve Arkeometri Sempozyumu’na (29 Mayıs–2
Haziran 2006, Çanakkale) katılan yirmi dokuz kazı başkanı ve sorumlusuna anket
uygulanmış; katılımcıların %86’sı kazılarında DNA analizi yapılmadığını, %4’ü yasaya
aykırı olduğu için analiz yapılmasını istemediğini bildirmiştir. Anketi cevaplayanların
%56’sı analizlerin nasıl yapıldığı konusunda bilgili olmadığını, %52’si ise DNA analizleri
ve arkeolojide DNA’nın rolü ile ilgili yayınları takip etmediğini belirtmiştir. Ancak hepsi,
arkeolojide DNA analizleri hakkında bilgi sahibi olmak istediğini de ifade etmiştir (Güral,
2007).
İklim ve sıcaklığın, arkeolojik kemiklerin hem fiziksel hem de moleküler
korunmasında etkili olduğu bilinir. Yoncatepe kazı alanından elde edilen kemikler bu
açıdan değerlendirildiğinde; yüzeylerinde pürüz veya yapısal bozukluk bulunmamasının,
kemiklerin iklim ve hava şartlarına karşı dayanıklı olduğunu gösterdiği ifade edilmektedir
(Mergen, 2006). Gerek aynı materyal ile daha önce yapılan araştırmalar (İşcan et al.,
2007), gerekse bu çalışma, Van ikliminin kemiklerdeki DNA korunmasında da olumlu
etkileri olduğunu düşündürmektedir. Bölgede görülen karasal iklim, kışların soğuk ve kar
yağışlı, yazların ise sıcak ve kurak geçmesine sebep olur. Yıllık ortalama sıcaklık ise,
Devlet Meteoroloji İşleri Genel Müdürlüğü verilerine göre 8–10º C arasındadır. DNA’nın
soğuk ve kuru ortam koşullarında daha iyi saklandığı çeşitli araştırmacılar tarafından da
belirtilmiştir. Höss ve meslektaşları (1996), soğuk ortamlardan veya buzdan toplanan
örneklerde DNA hasarının az olduğu; Wayne ve meslektaşları (1999), DNA’nın soğuk ve
kuru ortam koşullarında en iyi şekilde korunduğunu, biyokimyasal çalışmalarla bu sürenin
100.000 yıldan fazla olmadığını belirtmişlerdir. Ricaut ve meslektaşlarına (2005) göre,
soğuk ve kurak iklim şartlarında DNA daha iyi saklanmaktadır. Bollongino ve
127
meslektaşları (2008), tarih öncesine ait sığır kemiklerinden mtDNA analizi çalışmalarında;
Türkiye’den de örnekler incelemişlerdir. Kendi sınıflandırmalarıyla, Yakın Doğu grubu
içinde Çatalhöyük (Konya, Çumra), Çayönü (Diyarbakır, Ergani), Fikirtepe (İstanbul,
Kadıköy) ve Mezraa-Teleilat (Şanlıurfa, Birecik); Güney Doğu Avrupa grubu içinde ise
Bulgaristan, Macaristan, Romanya, Slovenya ve Slovakya ile birlikte Türkiye’den
Aşağıpınar (Kırklareli) ve Hocaçeşme (Edirne, Enez) alanlarından elde edilen materyal
kullanmışlardır. Araştırmacılar, bu bölgelerden aldıkları toplam yirmi üç örnekten sadece
dördünde tekrarlanabilir DNA sonuçları elde ettiklerini, çalışmada incelenen 291 örnekte
bu oranın %46 olduğunu bildirmişlerdir. Veriler, DNA korunmasının Orta Avrupa’dan
(%67) Yakın Doğu’ya (%7) doğru düştüğünü, yüksek sıcaklık ve nemin, çalışmaya dahil
edilen Yakın Doğu grubundaki örneklerde daha hızlı diyageneze sebep olduğunu
göstermektedir. Bollongino ve meslektaşları (2008), bu çalışmalarında soğuk, kuru,
karanlık, anaerob ve biraz alkali ortamlarda en iyi DNA korunmasının sağlandığını ifade
etmişlerdir.
İklim ve sıcaklık dışında, kemiklerin gömülü bulunduğu alanın denizden
yüksekliğinin DNA eldesinde önemli olduğu, yüksek alanlarda bulunan kemiklerde,
DNA’nın daha iyi korunduğu bildirilmiştir (Smith et al., 2001). Yoncatepe, 2.051 metre
yükselti ile şimdiye kadar Türkiye’nin en yüksek rakımlı kazı alanıdır (Belli, 1996).
Çalışma bulgularından anlaşılacağı üzere, Yoncatepe kemiklerindeki DNA korunmasında
bu faktörün de olumlu etkisi olduğu düşünülmektedir.
Kemiklerin Hazırlaması
Kazı sırasında DNA analizi için örnek almak, kazı stratejisinin bir parçası olarak
128
görülmelidir (Nielsen and Thuesen, 1998). Örnekler, yapılacak her türlü inceleme için kazı
sonrasında temizlenmeli, üzerindeki topraktan arındırılmalıdır. İskelet örneklerini
incelemeye hazırlamak için su veya kimyasal maddelerle yıkama gibi birçok yöntem
kullanılmaktadır (Rennick et al., 2005). Ancak bunlar kemiğe zarar verebilir, özellikle
moleküler çalışmalarda kontaminasyona neden olabilir. Bu sebeple antropolog ve
patologlar hangi kemik hazırlama tekniklerinin genetik analizleri olumsuz etkileyebileceği
konusunda bilgi sahibi olmalıdır. Yoncatepe iskelet kalıntıları, kazı sonrasında muhafaza
edildikleri İ.Ü. Adli Tıp Enstitüsü Osteoloji Laboratuvarı’nda antropologlar ve arkeologlar
tarafından diş fırçası ve yumuşak fırça ile yüzeylerindeki topraktan temizlenerek
antropometrik ölçümlere hazırlanmıştır. Bu aşamada herhangi bir yıkama yapılmamıştır
(Mergen, 2006). Böylece örneklerde var olan DNA’nın daha fazla kontamine olmasının
önlendiği, moleküler genetik çalışmalara katkı sağlandığı düşünülmektedir.
Çalışmada DNA analizi için Yoncatepe nekropolünün iki oda mezarından (M2 ve
M6) elde edilen ve çeşitli sebeplerle ölçüm yapılamayan femur örnekleri seçilmiştir. Yaş
ve boy tahmini ile cinsiyet tayini için yapılan antropometrik ölçümlerde, her kemik tek bir
kişi olarak ele alınmıştır. Çünkü oda mezarlarda kemikler karışık halde bulunduğu için
aynı bireye ait hem üst ve alt ekstremite hem de sağ ve sol kemikleri bulmak, dolayısıyla
her bireyin tam iskeletini oluşturmak mümkün olmamıştır. Bununla birlikte bazı kemik
ölçümlerinde sağ ve sol kemiğin aynı milimetre değerleri vermesine bağlı olarak tek bir
kişiye ait olduğu da söylenebilmiştir (Mergen, 2006). Farklı kemiklerin aynı DNA profilini
güvenilirlikle göstermesi, aynı kişiye ait olduğunu belirleyecektir. Bu güvenilirlik, çok
sayıda örnekte her türlü analizin yapılması ile sağlanabilir.
Eldeki iskelet kalıntılarından femurların seçilmesinin nedeni; DNA eldesinde daha
129
fazla başarı sağladığının ve sıkı dokudan örnek alındığı durumda kontaminasyonun en aza
indirgendiğinin bilinmesidir. Çok sayıda araştırmacı, femur ile çalışmıştır (Tuross, 1994;
Cipollaro et al., 1998; Rennick et al., 2005; Gilbert et al., 2005; Opel et al., 2006;
Fondevilla et al., 2008). Nelson ve Melton (2007), yüz onaltı iskelet örneğinde femur,
tibia, fibula, humerus, pelvis gibi farklı kemiklerden DNA profili elde etmede en fazla
başarının (%92) femurda sağlandığı bildirmiştir. Çalışmada kemiklerin kompakt kısımdan
parça alınarak analize başlanmıştır. Sıkı dokuda daha fazla kemik hücresi olduğundan,
üstelik bu kısım süngerimsi doku gibi kontaminasyona açık olmadığından, DNA analizinde
başarı sağlar (Yang et al., 1998; von Wurmb-Schwark et al., 2003).
Kemik parçalarının hazırlanması sırasında, farklı kalınlıklar ve sertlikler
gözlenmiştir. Kimi kemikler kolayca el ile kırılıp ufalanırken, kimilerinin çok sert olduğu
ve zor kesilebildiği gözlenmiştir. Hedges’e (2002) göre, kemiklerin sertlik derecesi DNA
eldesiyle ilgilidir. Çalışmanın sonuçları, bunu doğrulamaktadır. Kolay kırılabilen
kemiklerden DNA eldesinde sorunlar görülmüş, daha sert örneklerde ise başarıyla DNA
izole edilebilmiştir.
DNA izolasyonundan önce, örneklerin yüzey kontaminasyonunun giderilerek
(dekontaminasyon), mekanik veya kimyasal yollarla parçalanması gerekir. Kemik
örneklerinin yüzey kontaminasyonunun giderilmesi amacıyla, dış kısmın kazınması en sık
uygulanan yöntemdir. Bunun dışında kontaminant DNA’nın kimyasal yıkımı, yüzeyin UV
ışığına maruz bırakılması veya yöntemlerin kombinasyonu da dekontaminasyon amacıyla
kullanılmaktadır. Watt (2005), yüz altı aDNA yayınını incelediği araştırmasında
dekontaminasyon için %18 oranında fiziksel yöntem ve hipokloritin kullanıldığını, yine
aynı oranda (%18) fiziksel yöntem ve UV ile dekontaminasyon yapıldığını, %16 oranında
130
da üçünün birlikte (fiziksel yöntem, hipoklorit ve UV) uygulandığını tespit etmiştir. Kemp
ve Smith’e (2005) göre, analiz edilecek örnek, dış kısmının kazınmasından sonra sodyum
hipokloritte tutulur ve UV’ye bırakılır. Opel ve meslektaşları (2006), kemik örneklerini
önce zımparalamış, ardından %5 çamaşır suyu ile fırçalamış, hemen distile su ve %95
etanol ile yıkayarak analize hazırlamışlardır. Kemik veya diş örneğini %6 sodyum
hipokloritte 15 dakika bekletmek yüzey kontaminasyonunu gidermede yeterli, pratik ve az
maliyetlidir (Kemp and Smith, 2005; Dissing et al., 2008). Ancak Rennick ve
meslektaşlarının (2005) araştırmasına göre çamaşır suyu ile temizlenen kemik
örneklerinden DNA eldesinde, su ve deterjan/karbonat ile temizlenmiş olanlara göre
istatistiksel olarak önemli bir azalma görülmüştür. Gilbert ve meslektaşları (2005),
örnekleri klorite batırmanın bulaşmış DNA’yı degrade etmediğini belirtmişlerdir. Kemik
örneklerinin yıkanmadığı, ancak yeni kazılarak alındığı bir çalışmada ise yıkanmışlara göre
iki kat daha fazla özgün DNA elde edilmiştir (Pruvost et al., 2007). Bu çalışmada kemik
örneklerinin dış yüzeyi kazındıktan sonra, hipoklorit ile yıkama veya silme uygulanmamış,
örneklerin her iki yüzeyi doğrudan 5’er dakika UV’de tutulmuştur.
İskelet örnekleri, DNA izolasyonundan önce kimyasalların yüzey alanıyla yeterince
etki etmesini sağlamak için, fiziksel olarak parçalanmalıdır. Kemikler, bir öğütücü,
değirmen, havan veya çekiç yardımıyla toz haline getirilir. Örnekleri toz haline getirme
sırasında modern DNA ile kontaminasyonun yaygın olduğu bilinir (O’Rourke et al., 2000).
Bu sebeple çalışmada yüzey kontaminasyonu giderilip UV’ye maruz bırakılmış kemik
örnekleri; ayrı plastik poşetler içinde, ikinci bir poşetle birlikte folyoya sarılı halde çekiç
ile kırılarak toz haline getirilmiş, paketlerin her biri ayrı folyo kağıdı kaplanmış alanda ayrı
eldiven ve maskelerle dikkatle açılarak, UV’de bırakılmış tüpler içine alınmıştır.
131
DNA İzolasyon Yöntemi
Çalışmada kemikten DNA izolasyonunda birçok yöntem var olmasına rağmen,
daha saf, temiz ve yoğun DNA verdiği için silika temelli purifikasyon kiti kullanılmıştır.
Yang ve meslektaşları (1998), fenol-kloroform ekstraksiyonu ve bir çeşit silika temelli
saflaştırma kitinin farklı kombinasyonlarının karşılaştırılması amacıyla gerçekleştirdikleri
çalışmada; proteinaz K parçalamasından sonra tek başına silika kolon purifikasyonu
kullanımının, fenol-kloroform ekstraksiyonuna göre daha iyi sonuçlar verdiği göstermiştir.
Rohland ve Hofreiter (2007), farklı izolasyon yöntemlerini karşılaştırmalı olarak incelemiş,
otuz iki örnekten yirmi sekizinde silika yöntemi ile başarılı sonuç aldığını belirtmiştir.
Yoncatepe kemiklerinin DNA izolasyonunda da silika temelli izolasyon yöntemi
uygulanmıştır.
Çok sayıda araştırmacı silika jel temelli DNA izolasyon kiti ile EDTA
dekalsifikasyonunu birlikte uygulamakta ve başarı sağlamaktadır (Cano and Poinar, 1993;
Tuross, 1994; Zierdt et al., 1996; Krings et al., 1997; Yang et al., 1998; Bouwman et al.,
2006). Bu çalışmada da silika temelli izolasyon öncesinde, EDTA dekalsifikasyonu
yapılmıştır. Kalsifiye bir doku olan kemiklerde, daha iyi sonuç almak için kalsiyumun
uzaklaştırılması gerektiği tartışmalıdır. Bazı araştırıcılar dekalsifikasyonu gereksiz
bulmakta (Fisher, 1993), bazıları ise bu aşama tamamlanmadığı takdirde sonuç alamadığını
belirtmektedir (Sivilich, 2005). Ancak sıklıkla dekalsifikasyon uygulanmakta (Hummel
and Herrmann, 1991; Tuross, 1994; O’Rourke et al., 1996; Imaizumi et al., 2002) ve hem
nükleer hem de mtDNA tiplemesinde belirgin bir başarı sağlandığı ifade edilmektedir
(Imaizumi et al., 2005). EDTA, Mg+2 ve Ca+2 gibi bivalent katyonları kelatlaştırarak
DNAz’ları inaktifleştirir. Loreille ve meslektaşları (2007) EDTA yıkamalarında DNA
132
kaybı olduğu tartışmalarına bunun söz konusu olmadığı cevabını vermekte ve her zaman
güvenle kullanılabileceğini belirtmektedir. Yoncatepe kemikleri de dekalsifikasyona tabi
tutulmuş, izolasyon çözeltisi EDTA ile hazırlanarak kullanılmıştır.
DNA izolasyonunda silika kolonlardan geçirme aşamasına kadar izolatların
renginde farklılıklar tespit edilmiştir. Bu renk farklılığının topraktan geldiği bilinmektedir
(Imaizumi et al., 2005). İzolatlardaki renklenme ile her zaman değil ama sıklıkla PCR
inhibitörlerinin varlığı belirlenebilir, renk genellikle hafif sarımsı veya kırmızımsı
kahverengi olur (Kemp et al., 2006).
Modern DNA ile kontaminasyona en açık olan, örnek hazırlama ve DNA
izolasyonu aşamalarında; kontaminasyon olmadığından emin olunması, alınan veya
alınacak sonuçların güvenilir olması gerekir. Bu sebeple izolasyon sırasında tüm
işlemlerden geçirilen, ancak DNA içermeyen kontrol örnekler kullanılmıştır. İzolatların
agaroz jel elektroforezinden sonra görüntülenmesinde, bu kontrollerde bant bulunmaması
izolasyon sırasında herhangi bir kontaminasyonun olmadığını göstermiştir. Analiz
sırasında örnek içermeyen kontrollerin kullanılması, aDNA'nın güvenilirliğinin veya
gerçek/özgün olma özelliğinin belirlenmesi için önerilen kriterlerden biridir (Pääbo et al.,
2004).
İncelenen otuz yedi izolat, agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildiğinde bazı
örneklerde bant görülmemesi, izolasyonun başarısız olduğunu veya DNA’nın olmadığını
düşündürmektedir. Ancak bu örneklerden ikisi (M2-FD5 ve M6-FD7 izolatları) bant
vermemiş olmasına rağmen, amplifikasyonda sonuç vermiştir. Bu durum, örneklerde var
olan DNA’nın az miktarda olması sebebiyle kimi zaman agaroz jel ile tespit
edilemeyeceğini göstermektedir (Sambrook and Russell, 2001).
133
Amplifikasyonda Karşılaşılan Sorunlar
Geçmişe ait DNA çalışmalarında başlangıçtaki örnek miktarının tespit edilmesi
çoğaltma stratejilerinin belirlenmesi adına yararlı olabilir (Handt et al., 1996; Swango et
al., 2006). Ancak Chilvers ve meslektaşları (2008), başlangıçtaki örnek miktarını, özgün
aDNA olduğunun garantisini vermediği için Real-Time PCR ile ölçmeyi tercih
etmediklerini belirtmişlerdir. Bu çalışmada da başlangıç miktarının tespiti yapılmadan
araştırmalar başlatılmıştır. Ancak izolatların agaroz jel elektroforezinde yürütülmesi, bazı
istisnalar hariç, genel bir fikir vermiştir.
Yüksek polimorfizminden dolayı mtDNA’nın ileri değişken bölgesi (HVR), aDNA
çalışmaları için uygundur (Hummel, 2003). HVRI (16024–16365) 341 baz çifti, HVRII
(73–340) ise 267 baz çifti uzunluğundadır ve bu iki uzun bölgenin çoğaltılması, aDNA
çalışmalarında bir veya iki amplifikasyonla sağlanamaz. Ayrıca elde edilecek sonuçların
birbiriyle karşılaştırılarak doğrulanabilir olması gerekir. Bu iki önemli sebeple, belirlenen
bölge içinde üst üste çakışan parçalar oluşturulur (Krings et al., 1997; Imaizumi et al.,
2005; Bouwman et al., 2006, 2007, 2008; Dissing et al., 2007; Gao et al., 2007). Bu
parçalardan biri de HVRI içinde 147 baz çiftlik (16147–16294) kısımdır. Bu bölge, daha
önce diğer araştırmacılar (Bouwman et al., 2006, 2008; Chilvers et al., 2008) tarafından da
çalışılmış bir kısım olduğundan güvenle tercih edilmiştir (Ek 1).
Amplifikasyon ürünleri agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildiğinde incelenen 37
örneğin tümünde bu bölgenin başarılı amplifikasyonunun sağlanamadığı görülür. DNA
degradasyonundan dolayı meydana gelen kısa parçaların, çapraz bağların oluşturduğu
Maillard ürünlerinin veya diğer inhibitörlerin PCR’ı engellemiş olması muhtemeldir.
Pääbo (1989) 140 baz çiftinden daha uzun parçalarda amplifikasyonun başarısız olduğunu;
134
O’Rourke ve meslektaşları (2000) ise, eski DNA'nın eldesi ve amplifikasyonunun, 300–
500 baz çiftinden az uzunluktaki örneklerde mümkün olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmada
başarıyla çoğaldığı gözlenen otuz iki örnekteki DNA’nın kontaminasyon değil, özgün
DNA olduğunun kesin olarak belirlenmesi bu noktada mümkün değildir. Devam eden
aşamalarda, özellikle klonlama sonucunda elde edilen kolonilerin dizinlenmesi, bu
durumun yorumlanmasında yardımcı olmuştur.
Amplifikasyon ürünlerinin elektroforezi sonunda UV ile görüntülenen agaroz jelde
mavi floresans görülmüştür. Birçok araştırmacı aynı gözlemde bulunmuş, bunun nedeninin
nükleik asitleri bağlayan Maillard ürünleri ve humik asit, fulvik asit gibi diğer bileşikler
olduğunu belirtmiştir (Pääbo, 1989; Tuross, 1994; Hanni et al., 1995; Kalmar et al., 2000;
Kolman and Tuross, 2000).
Çalışmada amplifikasyon ürünlerinin elektroforezinde her zaman primer-dimerlerin
oluştuğu gözlenmiştir. Geçmişe ait DNA çalışmalarında, hedef örneğin miktarı düşük
olduğu zaman, özellikle yüksek primer konsantrasyonlarında çoğaltma sırasında primerler
hedef dışı moleküllere yanlış bağlanabilir ve elektroforezde aşırı primer-dimer meydana
gelir. Birçok araştırmada primer-dimer varlığı bildirilmiştir (Gerstenberger et al., 1999;
Ariffin et al., 2007; Dissing et al., 2007; Rohland and Hofreiter, 2007). Bunun yanında
PCR sırasında kontaminasyonu gösteren negatif kontrollerde bantlarla karşılaşıldığında,
sorunun kaynağını tespit amacıyla yürütülen PCR malzemelerinde primerlerin kontamine
olduğu belirlenmiştir. Kolman ve Tuross’un (2000) belirttiğine göre, ticari olarak satın
alınan primerler sıklıkla kontamine bulunur. Araştırmacılar bu durumda rutin olarak
254nm’de 20 dakika radyasyonla primerlerin dekontamine edilebileceğini, bu uygulamanın
primerlerin kullanımını bozmayacağını belirtmektedir. Çalışmada, primer
135
kontaminasyonunu gidermede bu yol tercih edilmemiş, onun yerine PCR malzemelerinden
Taq DNA polimeraz ve örnek DNA dışında hazırlanan karışım, her türlü kontaminasyonu
önlemek için kısa süre UV’ye tabi tutulmuş ve başarılı sonuçlar alınmıştır. Bu stratejinin
dNTP’ler UV’yi absorbe ettiği için etkisiz olabileceği de bildirilmektedir (Leonard et al.,
2007).
Amplifikasyon sırasında kontaminasyonun tespiti için birden fazla sayıda PCR
kontrolü kullanılmıştır. Bu yöntem, aDNA'nın güvenilirliği veya gerçek/özgün olma
özelliğinin belirlenmesi için önerilen bir kriterdir (Pääbo et al., 2004). Çalışmada
kontaminasyon olasılığından dolayı pozitif kontrol kullanılmamıştır (Willerslev and
Cooper, 2005).
Klonlamanın faydası
Geçmişe ait DNA örneklerinde çoğaltılan DNA parçalarını doğrudan dizinleyen
araştırmacılar olsa da (Anzai et al., 1999; Ariffin et al., 2007), kontaminasyon sebebiyle
bunun güvenilir ve geçerli bir sonuç veremeyeceği, dizinleme öncesi klonlama yapmanın
tek uygun çözüm olduğu çeşitli araştırmacılar tarafından ifade edilmiştir (Hummel, 2003;
Hebsgaards et al., 2005; Ho et al., 2007). Yoncatepe kemiklerinin DNA analizinde
amplifikasyon sonunda jelden izole edilerek saflaştırılan ürünlerden bazıları, bunu test
etmek için önce doğrudan dizinlenmiş, ancak muhtemelen çok sayıda farklı DNA olması
sebebiyle güvenilir ve geçerli bir dizin elde edilememiştir. Klonlama yapılarak doğru
kolonilerin seçilip saflaştırıldıktan sonra dizinlenmesi ise, net bir dizin eldesi sağlamıştır.
Doğru ve güvenilir sonuçlar için klonlamanın gerekli olduğu anlaşılmıştır.
Çalışmada kullanılan mavi-beyaz tarama yöntemi, doğru klonlamanın olup
136
olmadığını belirlemede kolaylık sağlamıştır. Yöntem, klonlanmış PCR ürünlerini
arttırmada bir ön tarama metodudur ve aDNA çalışmalarında sıklıkla tercih edilmektedir
(Reese et al., 1996; Lutz et al., 1999; Bouwman et al., 2006; Caramelli et al., 2007; Dissing
et al., 2007).
Klonlama sonrası çoğaltma
Klonlanmadan sonra meydana gelen beyaz renkli kolonilerin seçilerek PCR ile
çoğaltılması, yanlış pozitif klonların dizinlenmesini önler. Ayrıca kolonilerin PCR’ı
istenen ürünün dizinleme için yeterli miktarda olmasını sağlar (Capelli and Tschentscher,
2005). Çalışmada her örnek için elde edilen kolonilerden dizinleme için beş adet
seçilmiştir. Dizinleme için uygun koloni sayısı konusunda araştırmacılar farklı fikirler öne
sürmektedir. Bower ve meslektaşları (2005), eski örnekte %70 var olan dizini %95’in
üzerinde güvenilirlikle belirlemek için en az on iki olmak üzere, ortalama yirmi, pratik
açıdan en fazla otuz koloni analiz edilmesi gerektiğini belirtmiştir. Römpler ve
meslektaşları (2006) en az üç klonun dizinlenmesi gerektiğini bildirmiştir. Millar ve
meslektaşları (2008), binomial dağılım kullanarak ve %99 kesinlik sınırı hesaplanarak,
genomun en az sekiz kere dizinlenmesi gerektiğini savunmaktadır. Koloni dizinlerinin
birbiriyle kıyaslanması ve güvenilirlik aralığının belirlenmesi için web temelli bir program
mevcuttur: ‘Consensus Confidence Program’ (www.mcdonald.cam.ac.uk). Araştırmacılar
elde ettikleri en az on dizini, burada analiz ederek örneklerinin güvenilirlik aralığını
değerlendirebilir veya kaç koloniyi daha dizinlemesi gerektiğini belirleyebilir. Program,
dizinlerin özgünlüğü hakkında bir bilgi vermemekte, PCR sonrasında en fazla çoğalan
dizinle ilgili veri sağlamaktadır (Bower et al., 2005).
137
Klonlamadan sonra elde edilen ürünlerin çoğaltılması için hot-start PCR
yapılmıştır. Böylece hem primer-dimer oluşumu azaltılır, hem de primerlerin ve/veya
enzimlerin ilk döngüde denatürasyon sıcaklığına ulaşmasından önce DNA örneğine
bağlanması engellenir (Chou et al., 1992). PCR döngülerinde denatürasyon ve son uzama
aşamaları 10’ar dakika tutulmuştur. Pääbo’ya (1989) göre, denatürasyon süresini (5–7
dakika) ve son uzama süresini (> 1 dakika) arttırmak elde edilen ürün miktarını ve
kesinliğini arttırabilir.
Dizin bulgularının genel değerlendirmesi
Degrade yapısından dolayı aDNA’da değişmiş bazların varlığı, PCR ürünleri
klonlandığında ve birçok klon dizisi karşılaştırıldığında aralarında çok sayıdaki farklılığın,
modern DNA amplifiye edildiğinde görülenden çok daha fazla olması ile belirlenir (Pääbo
et al., 2004). Çalışmada her örnek için hazırlanan klonlardan elde edilen dizinler birbiriyle
ve referans dizin ile karşılaştırıldığında, bazı bazların değiştiği görülmüştür. Bu yanlış
kodlama lezyonları (‘miscoding lesions’), bazların türevlerine degradasyonu sonucu ortaya
çıkar (Axelsson et al., 2008).
DNA’daki sübstitüsyon mutasyonları iki tiptir: Transizyonlar, iki halka pürinin
(A
G) veya tek halka pirimidinlerin (C
T) yer değiştirmesidir. Benzer şekilde bazlar
birbirinin yerini alır. Transversiyonlar ise, pürinlerin pirimidin bazlarına (C
A
T, A
G, T
G,
C) değişikliğidir, bu da halkanın farklılaşmasına sebep olur. Transizyonların
transversiyonlardan daha sık görülmesi beklenir. Çünkü transizyonların amino asit
sübstitüsyonu ile sonuçlanması muhtemel olmadığından, dönüşümün devam etmesi söz
konusudur ve sıklıkla toplumlarda tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) olarak
138
transversiyonlardan daha fazla görülür (Comas et al., 1996, Mergen et al., 2004). Bunu
doğrulayacak şekilde, bu çalışmadaki dizinlerde de gözlenen transizyonlar daha fazladır.
Hatta en fazla C
T ve G
A değişimi görülmüş, A
G ve T
C dönüşümüne ise daha
az rastlanmıştır. Bunun sebebi, C’nin U ve T’ye hidrolitik deaminasyonunun daha yüksek
oranda olmasıdır (Lindahl, 1993). G’nin A’ya değişimi ise, Taq DNA polimerazla birleşen
sitozin kalıntılarına sebep olan hipoksantini üreten adenin kalıntılarının deaminasyonu ile
meydana gelir (Gilbert et al., 2003). Gilbert ve meslektaşları (2003, 2005) klonlarda çok
sayıda C-T ve G-A değişiminin gözlendiğini bildirmiştir.
aDNA’daki bu tip hatalı kodlama lezyonları, dizinlerin doğru belirlenmesini
karmaşıklaştırır. Bu olayı ortadan kaldırmak için, eski DNA örneğindeki hasarların sebep
olduğu yanlış birleşimleri, herhangi bir PCR’da oluşan Taq DNA polimeraz hatalarından
ayırt etmek gereklidir. Bunu yapmanın bir yolu, az sayıda örnek molekül içeren DNA
izolatlarından çok sayıda amplifikasyon yapmak ve PCR ürünlerini klonlamaktır.
Klonlardan elde edilen DNA dizinlerinin karşılaştırılması, aynı örnek preparatında bir
amplifikasyonda meydana gelip diğerinde olmayan nükleotid farklılıklarını ortaya çıkarır
(Pääbo et al., 2004).
Mutasyon bulgularının değerlendirmesi
Her örnek için dizinlenen 3–5 koloni, birbiriyle ve Cambridge referans diziniyle
karşılaştırılmış, kontaminasyon veya DNA hasarı hakkında bilgi edinilmiştir. M2-FD3 için
dizinlenen beş koloniden dördünde 16193T görülmesi, bunun muhtemelen kontaminasyon
değil, örneğin taşıdığı bir mutasyon olabileceğini; diğer kolonilerde tek başına görülen
16155G, 16213A ve 16245T bulguları, DNA hasarını göstermektedir. M2-FD7 örneğinin
139
üç dizininde 16208T, diğer iki dizininde 16242T olması, belirgin bir kontaminasyonu ifade
etmekte, bununla beraber 16208T içeren iki örnekte 16155G veya 16172C bulunması
DNA hasarını yansıtmaktadır. Ayrıca 16242T taşıyan dizinlerde herhangi bir DNA hasarı
görülmemesi, bunun modern DNA kontaminasyonu olduğu olasılığını arttırmaktadır. M6FD5 örneğinin dizinlenen beş kolonisinde de farklı değişimlerin (16172C, 16188T,
16218T, 16244A) görülmesi, kontaminasyon veya hasar hakkında bilgi vermemekte; ancak
bir dizinin Cambridge referans dizini ile tamamen aynı olması, kontaminasyonu
düşündürmektedir.
İncelenen iki mezardan M2’de 1, 6, 9, 14 ve M6’da 1, 8, 12, 16 için dizinlenen tüm
klonlarda aynı baz değişiminin (sırasıyla 16172C, 16256T, 16193T, 16172C, 16162G,
16172C, 16162G ve 16172C) görülmesi, bunun kontaminasyon olmayabileceğini,
dolayısıyla mutasyon olma olasılığının yüksek olduğunu gösterir. Ancak bu örnekler için
dizinler incelenirse, hasarlı bölgelerin var olduğu da anlaşılır.
Mezar M2’de 2, 4, 7, 10, 11, 13, 15, 17, 19 ve M6’da 6, 10, 13, 14 numaralı
örneklerde belirli baz değişiklikleri, her biri için dizinlenen kolonilerinin yarısından
çoğunda (dört dizinden üçünde veya beş dizinden dördünde) görülürken, az bir kısmında
(dört dizinden birinde veya beş dizinden ikisinde) yer almamakta veya farklı değişimler
tespit edilmektedir. Bu durum, kontaminasyonun bir kanıtıdır. Çoğu dizinde görülen baz
değişiklikleri ise, olası bir mutasyonu ifade edebilir. Ancak yine de daha fazla sayıda
koloninin dizinlenmesi durumu netlikle açığa çıkaracaktır. Örneğin M2-FD2’de beş
dizinden üçünde 16256T görülmüş, diğer iki dizinde ise sadece 16204C tespit edilmiştir ki;
bu da belirgin bir kontaminasyonun varlığına işaret etmektedir. Örneğe ait gerçek DNA
hakkında bilgi sahibi olmak için, daha fazla koloninin dizinlenmesi gerekir. Böylece hangi
140
mutasyonun örneğe ait olduğu, hangisinin kontaminant DNA olduğu anlaşılabilir.
Oda mezarlardan M2’de 8, 16, 18, 20’de ve M6’da 3, 5, 7, 10, 15, 17’de aynı
örneğe ait dizinlerde farklı bazlarda değişiklik görüldüğünden, örneklere ait olduğu
düşünülebilecek mutasyonu belirlemek veya kontaminantı tespit edebilmek mümkün
değildir. Klonlama sonrası daha fazla sayıda dizinleme yapılması bu örnekler için de
faydalıdır.
Yoncatepe kazı alanındaki iki farklı mezardan elde edilen kemiklerin 147 baz
çiftlik mtDNA analizi, şu noktaları açığa çıkarmıştır: M2 mezarına ait 20 kemik
örneğinden M2-FD1 ve M2-FD14’ün 16172C mutasyonunu taşıması sebebiyle aynı anne
soyundan kişilere ait olabileceği söylenebilir. İncelenen kemik parçalarının önce aynı
bireye ait olma ihtimali düşünülmüş, antropolojik incelemelere başvurulmuştur. Morfolojik
özellikler (yüzey rengi, fiziksel hasar-pürüz durumu) göz önüne alındığında, iki kemik
örneğinin aynı olamayacağı belirlenmiştir, çünkü M2-FD14’ün üzerinde var olan erozyon
M2-FD1’de görülmemektedir.
Hem M2-FD3 hem de M2-FD9, 16193T mutasyonu göstermektedir. Bu örneklerin
ait olduğu bireylerin anne tarafından akraba olması mümkün olabileceği gibi, alınan
örnekler aynı bireylere de ait olabilir. Morfolojik özellikler (yüzey rengi, fiziksel hasarpürüz durumu) bu noktada kesin ve yeterli bir bilgi sağlayamamıştır.
M2-FD2, M2-FD6 ve M2-FD10 ise, 16256T mutasyonunu taşımaktadır. Bu
örneklerden M2-FD10 erken çocukluk döneminde bir bireye aittir, bu sebeple M2-FD2
veya M2-FD6 ile aynı iskelete ait olmadığı kesindir. Her ne kadar M2-FD2 ve M2-FD6
anne tarafından akraba olabilirse de, aynı bireylere de ait olabilir. Morfolojik özellikler, bu
iki kemik için yeterli bir ayırım yapmayı sağlamamıştır. Ancak M2-FD10, M2-FD2
141
ve/veya M2-FD6 ile aynı anne soyundan gelebilir. M2-FD2 ve M2-FD6’nın aynı kişiye ait
olması durumunda, bu profil ile M2-FD10 arasında muhtemel bir anne-çocuk, teyze-çocuk
veya dayı-çocuk ilişkisi mevcuttur. M2-FD2 ve M2-FD6 anne tarafından ilişkili iki farklı
(yetişkin) birey ise, bu üç profil anne-teyze-çocuk; anne-dayı-çocuk veya teyze-dayı-çocuk
olabilir.
M6’dan alınmış 17 kemik örneğinden M6-FD1 ve M6-FD12, 16162G; M6-FD6,
M6-FD13 ve M6-FD17, 16189C; M6FD8 ve M6-FD16 ise 16172C mutasyonlarına
sahiptir. Farklı örneklerin aynı mtDNA mutasyonlarını taşıması, anne tarafından akraba
olduklarını gösterir. Ancak bu çalışmadaki materyal kapsamında kesin bir veri değildir,
çünkü incelenen kemik parçaları aynı bireylere ait olabilir. M6-FD1 ve M6-FD12, yüzey
rengi, hasarsız-pürüzsüz dış görünüşü, örneğin korunma kalitesi ve iyi durumda olması
açısından benzerdir. Bu bilgiler, iki kemik örneğinin aynı olabilme ihtimalini
kuvvetlendirmektedir. Ancak tam bir uyuşma da söz konusu değildir. M6-FD6, M6-FD13
ve M6-FD17, farklı distal uçlara sahip olup, 6 ve 13’te bulunmayan kondil, 17’de
mevcuttur. Bu veriler söz konusu üç örneğin aynı olmadığını gösterdiğinden, aynı anne
soyundan bireyler olma olasılığı artmaktadır. M6-FD8 ve M6-FD16 ise, iki sağ femur olup
aynı bireye ait olamayacağı kesinleşmektedir ki, bu da iki örneğin aynı anne soyundan
olabileceğini gösterir.
M2 ve M6 mezarlarından elde edilen kemiklerin mtDNA HVRI 16147–16294
bölgesi açısından analiz sonuçları birbiriyle kıyaslandığında, 16172C mutasyonu M2’den 1
ve 14’te, M6’dan 8 ve 16’da görülmüştür. İki farklı mezardaki bu bireyler arasında anne
soyundan bir akrabalık bağı var olabilir.
Tüm bu muhtemel sonuçlar, Yoncatepe arkeologlarının hipotezlerini büyük
142
olasılıkla desteklemektedir. Yoncatepe toplumunun ölü gömme geleneği olarak, bir mezar
dolduktan sonra, ölülerin diğer mezara konulmaya başlanması; bir ailenin farklı
zamanlarda ölen bireylerinin farklı mezarlarda olması anlamına gelir. Benzer şekilde aynı
veya birbirine yakın zamanlarda ölen aile bireyleri ise aynı mezarda yer almış olabilir.
Mutasyonların haplogrup düzeyinde değerlendirmesi
Mitokondriyal DNA haplogrup çalışmaları, farklı sayıda canlı bireyden elde edilen
ağız içi epitel, kan veya saç ile gerçekleştirildiği için, kontaminasyon veya degradasyon
gibi örnekle ilgili sorunlar indirgenmiş olur ve var olan mutasyonlar kolaylıkla tespit
edilerek grup belirlemesi yapılabilir. Ancak biyoarkeolojik materyal kullanıldığında,
kontaminasyon (özellikle modern DNA kontaminasyonu) olasılığı yüksektir, ayrıca
degradasyondan dolayı mutasyonların belirlenmesinde zorluklar ortaya çıkar. Bu sebeple
tarih öncesi örneklerde haplogrup analizlerinin güvenilirlikle yapılması zordur ve teknik
olarak zaman alıcı, zahmetli olmakla birlikte yanlış sonuçlar vermesi mümkündür.
Bununla birlikte, farklı noktalarda mutasyonların bir arada görülmesinin farklı gruplara
işaret edebileceği, bunların en yakın kesinlikle belirlenmesinde tüm ileri değişken bölgenin
analiz edilmesi ve tespit edilen SNP’lerin bir arada değerlendirilmesi gerektiği de göz
önünde bulundurulmalıdır. Bu çalışmada haplogrup tespiti amaçlanmamaktadır. Sadece
incelenen örneklerin analiz edilen mtDNA bölgelerinde var olması muhtemel baz
değişikliklerinin haplogruplar açısından genel anlamda bir değerlendirilmesi sunulmuştur:
M2-FD3, M2-FD16, M2-FD19, M6-FD3, M6-FD15 gibi örneklere ait dizinlerde
hasarlar ve mutasyon olabilecek değişiklikler ile birlikte hiçbir değişiklik içermeyen, CRS
ile uygunluk gösteren dizinler görülmüştür. CRS dizini, Avrupa popülasyonu için yaygın
143
bir tiptir (Torroni et al., 1996). Fernandez ve meslektaşları (2006), İspanya’nın çeşitli
arkeolojik bölgelerinde otuz dokuz kemik ve diş örneği ile yaptıkları çalışmada, birçok
örneğin ortak Avrupa motifi olan CRS dizini gösterdiğini ve bunun akrabalığın zayıf bir
kanıtı olabileceğini bildirmişlerdir. Adli bilimlerde mtDNA için HVRI ve HVRII
dizinlemelerinde bazı Avrupa toplumları için ayırım gücü bu sebeple düşük kalmaktadır ve
benzer haplogruplar içinde idantifikasyon amacıyla kodlayan bölge SNP’lerinin
kullanılması önerilir (Pereira et al., 2006).
Çalışmada incelenen mtDNA HVRI bölgesi içinde (16147–16294) belirlenen baz
değişikliklerine (16162G, 16172C, 16183G, 16261T) genel olarak bakıldığında, H
haplogrubunu temsil ettikleri görülür. Ayrıca referans dizin olan CRS de H haplogrubuna
aittir. Bu durumda, örneklerin H haplogrubuna ait olduğu söylenebilir. Kontaminasyon
açısından incelenirse, kazı sırasında veya laboratuvar aşamasında bulaşmaya sebep olan
bireylerin de yaygın H haplogrubunu göstermesi muhtemeldir.
Polimorfizmlerden 16189C ve 16256T ise U haplogrubuna özgüdür. Bu
haplogrubun Avrupa’da nadir görüldüğü bilinmektedir (Tambets et al., 2000; Mergen et
al., 2004).
Mezar 2’ye ait 1, 4, 13, 14, 17 ve 18’de; Mezar 6’ya ait 3, 14 ve 17’de bazı
dizinlerde 16223T değişimi görülmüştür. Aynı örneğin çok sayıda dizininde görüldüğünde
örneğe ait bir mutasyon, az sayıda tespit edildiğinde ise kontaminasyon veya hasar olarak
değerlendirilmiştir. M haplogrubunu yansıtan 16223T değişimi, Asya’da yaygın olarak
görülmektedir (Calafell et al., 1996; Richards et al., 1996). Çalışma materyalinde
belirlenen 16223T polimorfizmi, örneklerin M haplogrubuna ait olma olasılığı ile birlikte
muhtemel bir modern DNA kontaminasyonu anlamına da gelebilir.
144
BÖLÜM VI
SONUÇ
Farklı bilimsel alanlardaki geniş uygulama çeşitleri, biyoarkeolojik örneklerden
DNA analizlerinin 1990’larda araştırma odağı olmaktan, çeşitli bilim dallarına bilgiler
sunan bir araştırma aracı haline gelerek ilerlediğini göstermektedir. Arkeolojik iskelet
kalıntıları için başarıyla uygulabilen aDNA analiz yöntemleri, düşük kopya sayısına sahip
veya degrade durumda olan adli örneklerin incelenmesinde bir yol gösterici olarak
kullanılabilir. Bu sebeple adli bilimlerin moleküler antropoloji ile işbirliği, disiplinler arası
çalışmaları tercih eden bilimsel dünyasında önem kazanmaktadır.
Arkeolojik kazı çalışmalarından elde edilen örneklerin moleküler incelemelere tabi
tutulması arkeolojik verilere katkı sağlar. Yapılabilecek olası moleküler genetik
çalışmalarda başarıya ulaşmak adına materyalin doğru toplanması ve uygun koşullarda
saklanması oldukça önemlidir. Bu sebeple arkeologlar ve paleontologlar için DNA
çalışmalarını göz önünde bulundurarak doğru koşullarda örnek toplama ve saklama
konularında öneriler geliştirilmesi gerektiği açıktır. Kazı sırasında moleküler analizler için
alınacak bir miktar örneğin soğuk koşullarda saklanarak, en kısa zamanda çalışılacak
laboratuara ulaştırılması yeterli olacaktır. Örneklerin alınmasında ve saklanmasında dikkat
edilmesi gereken hususlar hakkında ayrıntılı bilgi sahibi olan kazı başkanları, yürüttükleri
çalışmalarda bu konudaki düzeni ve kontrolü sağlayabildiklerinde, laboratuarda doğru ve
net bilgiler elde edilebilir.
Bu çalışmada ulaşılan sonuçlar, anne tarafından akrabalıkları göstermede
kullanılabilen bir araçtır; ancak bu yönde kesin ve güvenilir veriler elde etmek için mtDNA
145
üzerinde daha fazla bölgenin çalışılması gereklidir. Her ne kadar çalışmada kontaminasyon
açısından maksimum önlem alınmış olsa da, ilk kez yapılan bu analizlere bağlı kalmamak
önemlidir. Analizler öncelikle araştırmacı tarafından tekrar edilmeli, daha sonra bir dış
laboratuvar tarafından gerçekleştirilmelidir.
Çalışmada kemik örneklerinden elde edilerek incelenen 147 baz çiftlik (16147–
16294) mtDNA HVRI’de görülen başarı, ileriki araştırmaların geliştirilmesi için umut
vericidir. Böylece hem HVRI’deki bu bölge, hem de HVRII için birbiriyle çakışan farklı
bölgeler benzer şekilde analiz edilebilecektir.
146
BÖLÜM IX
KAYNAKLAR
Adachi N, Dodo Y, Ohshima N, Doi N, Yoneda M, Matsumura H. 2003. Morphologic and
genetic evidence for the kinship of juvenile skeletal specimens from a 2000 year old
double burial of the Usu-Moshiri site, Hokkaido, Japan. Anthropol Sci 111(3):347–363.
Adachi N, Suzuki T, Sakaue K, Takigawa W, Ohshima N, Dodo Y. 2006. Kinship analysis
of the Jomon skeletons unearthed from a double burial at the Usu-Moshiri site, Hokkaido,
Japan. Anthropol Sci 114:29–34.
Akkaya MS, Bilgiç H. 2002. Arkeolojik Buğday DNA’sı: Hekzaploid buğday tanısında
Çatalhöyük’ten ilk örnek. 24th International Symposium of Excavation, Survey and
Archaeometry.
Akkaya MS. 2003. Anadolu kökenli antik buğday tohumlarından elde edilen DNA'nın
karakterizasyonu Projesi, ODTÜ, AFP-BAP.
Al-enizi M, Hadi S, Goodwin W. 2008. The development of visual and chemical methods
for predicting the likelihood of obtaining a DNA profile from degraded bone samples,
Forensic Sci Int-Gen Suppl Ser 1:2–3.
147
Alakoç YD. 2007. Diş dokularından DNA analizi ile cinsiyet tayini ve sonuçların
odontometrik veriler ile karşılaştırılması. Doktora tezi. Ankara Üniversitesi, Sağlık
Bilimleri Enstitüsü, Ankara.
Alonso A, Martin P, Albarran C, Garcia P, Garcia O, Fernandez de Simon L, GarciaHirschfield J, Sancho M, de la Rua C, Fernandez-Piqueras J. 2004. Real-time PCR designs
to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number in forensic and ancient DNA
studies. Forensic Sci Int 139:141–149.
Alt KW, Pichler S, Vach W. 2009. Reconstruction of genetic kinship relations based on
discrete traits in skeletal remains. http://www.biostat.sdu.dk/~wv/skeletal.html
Altunçul H. 2001. Kemik dokudan DNA çekitleme ve tipleme yöntemleri. Doktora Tezi.
İstanbul Üniversitesi, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul.
Altunçul H, Abacı Kalfoğlu E, Eryılmaz G, Atasoy S. 1999. Identification and Family
Relationship Estimation of the Skeleton of a Missing Person in Izmir, Turkey. Proceedings
of 51th American Academy of Forensic Sciences Meeting, Orlando, USA, p 20.
Altunçul H, Rolf B, Abacı-Kalfoğlu E, Eisenmenger W, Atasoy S. 2003. Maternity
Estimation From Skeletal Remains: A Case Report. Forensic Sci Int 136:62.
148
Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC et
al. 1981. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290:457–
465.
Anderung C, Persson P, Bouwman A, Elburg R, Götherström A. 2008. Fishing for ancient
DNA. Forensic Sci Int-Gen 2:104–107.
Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. 1999.
Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial
DNA. Nat Genet 23:147.
Anzai T, Naruse TK, Tokunaga K, Honma T, Baba H, Akazawa T, Inoko H. 1999. HLA
genotyping of 5000–6000 year old ancient bones in Japan. Tissue Antigens 54:53–58.
Ariffin SHZ, Wahap RMA, Zamrod Z, Sahar S, Razak MFA, Arifin EJ, Senafi AS. 2007.
Molecular archaeology of ancient bone from 400 year old shipwreck. Asian-Pac J Mol Bio
Biotech 15(1):27–31.
Arndt A, Van Neer W, Hellemans B, Robben J, Volckaert F, Waelkens M. 2003. Roman
trade relationships at Sagalassos (Turkey) elucidated by ancient DNA of fish remains, J
Archaeol Sci 30(9):1095–1105.
149
Arslan S, Açıkkol A, Korkmaz M, Özgün-Başıbüyük G. 2008. Oylum Höyük
Popülasyonunda Genetik Cinsiyet Tayini. 3.Ulusal Biyolojik Antropoloji Sempozyumu,
27–28 Ekim 2008, Ankara, p 24.
Asamura H, Fujimori S, Ota M, Fukushima H. 2007a. MiniSTR multiplex systems based
on non-CODIS loci for analysis of degraded DNA samples. Forensic Sci Int 173(1):7–15.
Asamura H, Sakai H, Ota M, Fukushima H. 2007b. Mini Y-STR quadruplex systems with
short amplicon lengths for analysis of degraded DNA samples. Forensic Sci Int-Gen 1:56–
61.
Ayan D, Beder-Şen R, Yurtkuran S, Ünal G. 2002. Akraba Evliliğinin Kültür Birikiminde
ve Toplum Hayatındaki Bazı Görünümleri: Dil, Din ve Tıp. Aile ve Toplum Eğitim Kültür
ve Araştırma Dergisi, 5(2):70–77.
Axelsson E, Willerslev E, Gilbert MTP, Nielsen R. 2008. The effect of ancient DNA
damage on inferences of demographic histories. Mol Biol Evol 25(10):2181–2187.
Ballantyne KN, van Oorschot RAH, Mitchell RJ. 2007. Comparison of two whole genome
amplification methods for STR genotyping of LCN and degraded DNA samples. For Sci
Int 166: 35–41.
150
Belli O. 1996. Doğu Anadolu Bölgesinde Urartu Baraj ve Sulama Sisteminin Araştırılması,
1995. 14. Araştırma Sonuçları Toplantısı, Anıtlar ve Müzeler Genel Müdürlüğü II, Ankara,
139–169.
Belli O. 2001. Van Yoncatepe kazıları, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Yayınları No:
4285, İstanbul Üniversitesi, İstanbul.
Belli O, Kavaklı E. 2001. 1999 Yılı Van-Yoncatepe kalesi ve nekropolü kazısı. Kazı
Sonuçları Toplantısı 22:369–384.
Belli O, Konyar E. 2001. Excavations at Van-Yoncatepe Fortress and Necropolis. Journal
of the Institute of Archaeology of Tel Aviv University 28(2):169–219.
Bilgiç H. 2002. Türkiye’den Yabanıl ve İlksel Buğday Türlerinin Mikrosatelit Belirteçleri
ve Arkeolojik DNA Analizine Dayalı Genetik İlişkileri. Doktora tezi. Orta Doğu Teknik
Üniversitesi, Ankara.
Bilgiç H, Akkaya MS. 2000. Biomolecular Studies on Ancient Wheat. 32nd International
Symposium of Archaeometry, 15–19 May 2000, Mexico City, Mexico, p 120.
Bini C, Pappalardo G. 2005. mtDNA HVI length heteroplasmic profile in different tissues
of maternally related members. Forensic Sci Int 152:35–38.
151
Blouin MS. 2003. DNA-based methods for pedigree reconstruction and kinship analysis in
natural populations. Trends Ecol Evol 18:503–511.
Bollongino R, Tresset A, Vigne JD. 2008. Environment and excavation: Pre-lab impacts
on ancient DNA analyses. Gen Palaeontol 7:91–98.
Boljuncic J. 2007. DNA analysis of early mediaeval individuals from Zvonimirovo burial
site in Northern Croatia: Investigation of kinship relationships by using multiplex system
amplification for short tandem repeat loci. Croat Med J 48:536–546.
Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PME, van der
Noordaa J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin
Microbiol 28:495–503.
Bouwman AS, Chilvers ER, Brown KA, Brown TA. 2006. Identification of the authentic
ancient DNA sequence in a human bone contaminated with modern DNA. Am J Phys
Anthropol 131:428–431.
Bouwman AS, Brown KA, Prag JNW, Brown TA. 2008. Kinship between burials from
grave circle B at Mycenae revealed by ancient DNA typing. J Archaeol Sci 35(9):2580–
2584.
152
Bower MA, Spencer M, Matsumura S, Nisbet RER, Howe CJ. 2005. How many clones
need to be sequenced from a single forensic or ancient DNA sample in order to determine a
reliable consensus sequence? Nucleic Acids Res 33(8):2549–2556.
Brenner CH. 2009. Kinship analysis by DNA when there are many possibilities.
http://dna-view.com/downloads/lattice.ppt
Brown TA. 2006. Gene Cloning and DNA Analysis - An Introduction. Oxford: Blackwell
Publishing.
Brown TA, Allaby RG, Brown KA, O’Donoghue K, Sallares R. 1994. DNA in wheat
seeds from European archaeological sites. Experientia 50:571–575.
Buckleton J, Triggs C. 2006. Dealing with allelic drop out when reporting the evidential
value in DNA relatedness analysis. Forensic Sci Int 160:134–139.
Buckley M, Anderung C, Penkman K, Raney BJ, Götherström A, Thomas-Oates J, Collins
MJ. 2008. Comparing the survival of osteocalcin and mtDNA in archaeological bone from
four European sites. J Archaeol Sci 35:1756–1764.
Bujdoso G, Sotonyi P, Laszik A, Baur MP. 2003. Family relationship proven by
chromosomal and DNA examinations. Int Congr Ser 1239:19–23.
153
Burger J, Hummel S, Herrmann B, Henke W. 1999. DNA preservation: A microsatelliteDNA study on ancient skeletal remains. Electrophoresis 20:1722–1728.
Burton J. 2008. Bone chemistry and trace element analysis. In: Katzenberg MA, Saunders
SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton, 2nd edition, New Jersey:
John Wiley and Sons Inc. p 443–460.
Butler JM, Shen Y, McCord BR. 2003. The development of reduced size STR amplicons
as tools for analysis of degraded DNA. J Forensic Sci 48(5):1054–1064.
Butler JM. 2005. Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR
Markers. 2nd Edition. New York: Elsevier Academic Press.
Calafell F, Underhill P, Tolun A, Angelicheva D, Kalaydjieva L. 1996. From Asian to
Europe: mitochondrial DNA sequence variability in Bulgarians and Turks. Am J Hum
Genet 60:35–49.
Capelli C, Tschentscher F, Pascali VL. 2003. Ancient protocols for the crime scene?
Similarities and differences between forensic genetics and ancient DNA analysis. Forensic
Sci Int 131:59–64.
Capelli C, Tschentscher F. 2005. Protocols for ancient DNA typing. Methods Mol Biol
297:265–278.
154
Cano RJ, Poinar HN. 1993. Rapid isolation of DNA from fossil and museum specimens
suitable for PCR. BioTechniques 15:432–435.
Caramelli D, Lalueza-Fox C, Capelli C, Lari M, Sampietro ML, Gigli E, Milani L, Pilli E,
Guimaraes S, Chiarelli B, Marin VT, Casoli A, Stanyon R, Bertranpetit J, Barbujani G.
2007. Genetic analysis of the skeletal remains attributed to Francesco Petrarca. Forensic
Sci Int 173(1):36–40.
Carlyle SW, Parr RL, Hayes MG, O’Rourke DH. 2000. The context of maternal lineages in
the Greater Southwest. Am J Phys Anthropol 113(1):85–101.
Cattaneo C, Craig OE, James NT, Sokol RJ. 1997. Comparison of three DNA extraction
methods on bone and blood stains up to 43 years old and amplification of three different
gene sequences. J Forensic Sci 42:1126–1135.
Cattaneo C. 2007. Forensic anthropology: developments of classical discipline in the new
millennium. Forensic Sci Int 165:185–193.
Cavalli-Sforza LL, Feldman MW. 2003. The application of molecular genetic approaches
to the study of human evolution. Nat Genet 33:266–275.
155
Chilvers ER, Bouwman AS, Brown KA, Arnott RG, Prag AJ, Brown TA. 2008. Ancient
DNA in human bones from Neolithic and Bronze Age sites in Greece and Crete. J
Archaeol Sci 35(10):2707–2714.
Chobe LP, Chadha MS, Banerjee K, Arankalle VA. 1997. Detection of HEV RNA in
faeces by RT-PCR during the epidemics of Hepatitis E in India (1976–1995). J Viral Hepat
4:129–133.
Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W. 1992. Prevention of pre-PCR
mispriming and primer dimerization improves low copy number amplifications. Nucleic
Acids Res 20(7):1717–1723.
Christensen AF, Belcher WR, Bettinger S. 2007. Analysis of commingled remains using
archaeology, anthropology and DNA: A case study from North Korea. Proceedings of the
59th American Academy of Forensic Sciences Meeting, 19–24 February 2007, San
Antonio, TX, 377–378.
Cinnioglu C, King R, Kivisild T, Kalfoglu E, Atasoy S, Cavalleri GL, Lillie AS, Roseman
CC, Lin AA, Prince K, Oefner PJ, Shen P, Semino O, Cavalli-Sforza LL, Underhill P.
2004. Excavating Y chromosome haplotype strata in Anatolia. Hum Genet 114(2):127–
148.
156
Cipollaro M, Di Bernardo G, Galano G, Galderisi U, Guarino F, Angelini F, Cascino A.
1998. Ancient DNA in human bone remains from Pompeii archaeological site. Biochem
Bioph Res Co 247:901–904.
Clisson I, Keyser C, Francfort HP, Crubezy E, Samashev Z, Ludes B. 2002. Genetic
Analysis of human remains from a double inhumation in a frozen kurgan in Kazakhstan
(Berel site, Early 3d Century BC). Int J Leg Med 116:304–308.
Coble MD, Hill CR, Vallone PM, Butler JM. 2006. Characterization and performance of
new MiniSTR loci for typing degraded samples. Int Congr Ser 1288:504–506.
Colson IB, Richards MB, Bailey JF, Sykes BC, Hedges REM. 1997. DNA analysis of
seven human skeletons excavated from the Terp of Wijnaldum. J Archaeol Sci 24:911–
917.
Comas D, Calafell F, Mateu E, Perez-Lezaun A, Bertranpetit J. 1996. Geographic
Variation in Human Mitochondrial DNA Control Region Sequence: The Population
History of Turkey and its Relationship to the European Populations. Mol Biol Evol
13(8):1067–1077.
Cooper A. 1994. DNA from museum specimens. In: Herrmann B, Hummel S, editors.
Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. p 149–165.
157
Cooper A, Drummond AJ, Willerslev E. 2004. Ancient DNA: Would the real Neandertal
Please stand up? Curr Biol 14:431–433.
Culjkovic B, Savic D, Stojkovic O, Romac S. 2003. Poly (A) tailing of ancient DNA: a
method for reproducible microsatellite genotyping. Anal Biochem 318:124–131.
Cunha E, Pinheiro J, Vieira DN. 2006. Identification in forensic anthropology: Its relation
to genetics. Int Congr Ser 1288:807–809.
Çilingir C. 2009. Crop processing in the early bronze age houses of İkiztepe: Identification
and analysis of archaeobotanical remains. Yüksek Lisans Tezi. Orta Doğu Teknik
Üniversitesi, Ankara.
Çilingiroğlu A. 1984. Urartu ve Kuzey Suriye siyasal ve kültürel ilişkiler. Ege Üniversitesi
Yayınları, İzmir.
Çöloğlu SA, İşcan MY. 1998. Adli Osteoloji. İstanbul Üniversitesi Rektörlük Yayınları
No.4150, İstanbul.
Dissing J, Binladen J, Hansen A, Sejrsen B, Willerslev E, Lynnerup N. 2007. The last
Viking King: A royal maternity case solved by ancient DNA analysis. Forensic Sci Int
166:21–27.
158
Dissing J, Kristinsdottir MA, Friis C. 2008. On the elimination of extraneous DNA in
fossil human teeth with hypochlorite. J Archaeol Sci 35:1445–1452.
Dixon LA, Dobbins AE, Pulker HK, Butler JM, Vallone PM, Coble MD, Parson W et al.
2006. Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs—results of a
collaborative European (EDNAP) exercise. Forensic Sci Int 164:33–44.
Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 1991. Touchdown PCR to
circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res 19(4):4008.
Drancourt M, Aboudharam G, Signoli M, Dutour O, Raoult D. 1998. Detection of 400year-old Yersinia pestis DNA in human dental pulp: an approach to the diagnosis of
ancient septicemia. Proc Natl Acad Sci USA 95:12637–12640.
Drobnic K. 2006. A new primer in a SRY gene for sex identification. Int Congr Ser
1288:268–270.
Dudar JC, Waye JS, Saunders SR. 2003. Determination of a kinship system using ancient
DNA, mortuary practice and historic records in an Upper Canadian pioneer cemetery. Int J
Osteoarchaeol 13:232–246.
Egeland T, Mostad P, Mevag B, Stenersen M. 2000. Beyond traditional paternity and
identification cases. Selecting the most probable pedigree, Forensic Sci Int 110(1):47–59.
159
Ehrlich HA. 1989. PCR technology, Principles and Applications for DNA Amplification.
New York: Stockton.
Eilert KD, Foran DR. 2007. Polymerase Resistance to PCR inhibitors in bone, Proceedings
of the 59th American Academy of Forensic Sciences Meeting, 19–24 February 2007, San
Antonio, TX, 135–136.
Essen-Möller E. 1938. Die Beweiskraft der Ahnlichkeit im Vaterschaft nachweis theoretische Grundlagen. Mitt Anthrop Ges 68:9–53.
Evett IW, Weir BS. 1998. Interpreting DNA Evidence: Statistical Genetics for Forensic
Scientists, Sunderland, MA: Sinauer Associates.
Fernandez E, Oliver A, Turbon D, Arroyo-Pardo E. 2006. mtDNA analysis of ancient
samples from Casstellon (Spain): Diachronic variation and genetic relationships. Int Congr
Ser 1288:127–129.
Fily ML, Crubezy E, Courtaud P, Keyser C, Ebrard D, Ludes B. 1998. Paleogenetic
analysis of the skeletons from the sepulchral cave of Elzarreko Karbia (Bronze Age,
Basque Country). C R Acad Sci Paris 321:79–85.
Finkler K. 2005. Family, kinship, memory and temporality in the age of the new genetics,
Soc Sci Med 61:1059–1071.
160
Fisher DL. 1993. Extraction, evaluation, and amplification of DNA from decalcified and
undecalcified United States Civil War bone. J Forensic Sci 38:60–68.
Fischer MD. 2009. Representing anthropological knowledge: Calculating kinship
http://www.era.anthropology.ac.uk/Kinship/index.html
Fondevila M, Phillips C, Naveran N, Fernandez L, Cerezo M, Salas A, Carracedo A, Lareu
MV. 2008. Case report: Identification of skeletal remains using short amplicon marker
analysis of severely degraded DNA extracted from a decomposed and charred femur.
Forensic Sci Int-Gen 2:212–218.
Fortea J, de la Rasilla M, Garcia-Tabernero A, Gigli E. 2008. Excavation protocol of bone
remains for Neandertal DNA analysis in El Sidron Cave (Asturias, Spain). J Hum Evol
55(2):353–357.
Fountain D, Ralston M, Higgins N, Gorlin JB, Uhl L, et al. 1997. Liquid nitrogen freezers:
a potential source of microbial contamination of hematopoietic stem cell components.
Transfusion 37:585–591.
Fung WK, Chung Y, Wong D. 2002. Power of exclusion revisited: probability of
excluding relatives of the true father from paternity. Int J Leg Med 116:64–67.
161
Fung WK, Carracedo A, Hu YQ. 2003. Testing for kinship in a subdivided population.
Forensic Sci Int 135:105–109.
Fung WK. 2003. User-friendly programs for easy calculations in paternity testing and
kinship determinations. Forensic Sci Int 136:22–34.
Fung WK, Hu YQ, Chung Y. 2006. On statistical analysis of forensic DNA: theory,
methods and computer programs. Forensic Sci Int 162:17–23.
Gamba C, Fernandez E, Oliver A, Tirado M, Baeza C, Lopez-Parra AM, Arroyo-Pardo E.
2008. Population genetics and DNA preservation in ancient human remains from Eastern
Spain. Forensic Sci Int-Gen Suppl Ser 462–464.
Gao SZ, Yang YD, Xu Y, Zhang QC, Zhu H, Zhou H. 2007. Tracing the genetic history of
the Chinese People: Mitochondrial DNA analysis of a Neolithic population from the Lajia
site. Am J Phys Anthropol 133:1128–1136.
Gerstenberger J, Hummel S, Shultes T, Hack B, Herrmann B. 1999. Reconstruction of a
historical genealogy by means of STR analysis and Y haplotyping of ancient DNA. Eur J
Hum Genet 7:469–477.
Gibbon VE, Penny CB, Strkalj G, Ruff P. 2009. Brief Communication: Minimally Invasive
Bone Sampling Method for DNA Analysis. Am J Phys Anthropol 139:596–599.
162
Gilbert MTP, Hansen AJ, Willerslev E, Rudbeck L, Barnes I, et al. 2003. Characterization
of genetic miscoding lesions caused by postmortem damage. Am J Hum Genet 72:48–61.
Gilbert MTP, Rudbeck L, Willerslev E, Hansen AJ, Smith CI, Penkman KEH et al. 2005.
Biochemical and physical correlates of DNA contamination in archaeological human bones
and teeth excavated at Matera, Italy. J Archaeol Sci 32:785–793.
Gilbert MTP, Hansen AJ, Willerslev E, Turner-Walker G, Collins M. 2006. Insights into
the processes behind the contamination of degraded human teeth and bone samples with
exogenous sources of DNA. Int J Osteoarchael 16:156–164.
Gill P, Ivanov PL, Kimpton C, Piercy R, Benson N, Tully G, Evett I, Hagelberg E, and
Sullivan K. 1994. Identification of the remains at the Romanov family by DNA analysis.
Nat Genet 6:130–135.
Golenberg EM. 1994. DNA from plant compression fossils. In: Herrmann B, Hummel S,
editors. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. p 237–256.
Goloubinoff P, Pääbo S, Wilson AC. 1993. Evolution of maize inferred from sequence
diversity of an Adh2 gene segment from archaeological specimens. Proc Natl Acad Sci
USA 90:1997–2001.
163
Gökçümen O. 2004. Popülasyon Tarihini Açıklamada Antik DNA Yaklaşımı: Anadolu’da
Gerçekleştirilebilecek Çalışmalara Örnekler. 26. Uluslar arası Kazı, Araştırma ve
Arkeometri Sempozyumu. 24–28 Mayıs 2004, Konya.
Götherström A, Liden K. 1996. A modified DNA extraction method for bone and teeth. J
Nord Archaeol Sci 9:53–56.
Götherström A, Collins MJ, Angerbjörn A, Liden K. 2002. Bone preservation and DNA
amplification. Archaeometry 44(3):395–404.
Graw M, Weisser HJ, Lutz S. 2000. DNA typing of human remains found in damp
environments. Forensic Sci Int 113:91–95.
Gross DR. 1992. Discovering Anthropology. California: Mayfield Publishing Company.
Gugerli F, Parducci L, Petit RJ. 2005. Ancient plant DNA: review and prospects. New
Phytologist 166:409–418.
Güral D. 2007. Arkeolojide Biyolojik Yöntemler: aDNA. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul
Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, İstanbul.
Hagelberg E, Skyes B, Hedges R. 1989. Ancient bone DNA amplified. Nature 342:485.
164
Hagelberg E, Bell LS, Allen T, Boyde A, Jones SJ, Clegg JB, Hummel S, Brown TA,
Ambler RP. 1991. Analysis of ancient bone DNA: Techniques and applications and
discussion. Philos T Biol Sci 333:399–407.
Haimes E. 2006. Social and ethical issues in the use of familial searching in forensic
investigations: Insights from family and kinship studies. J Law Med Ethics 263-276.
Handt O, Richards M, Trommsdorff M, Kilger C, Simanainen J, et al. 1994a. Molecular
genetic analyses of the Tyrolean ice man. Science 264:1175–1178.
Handt O, Höss M, Krings M, Pääbo S. 1994b. Ancient DNA: methodological challenges.
Experientia 50:524–529.
Handt O, Krings M, Ward RH, Pääbo S. 1996. The retrieval of ancient human DNA
sequences. Am J Hum Genet 59:368–376.
Hanni C, Brousseau T, Laudet V, Stehelin D. 1995. Isopropanol precipitation removes
PCR inhibitors from ancient bone extracts. Nucleic Acids Res 23:881–882.
Hansen AJ, Mitchell DL, Wiuf C, Paniker L, Brand TB, Binladen J, Gilichinsky DA, Ronn
R, Willerslev E. 2006. Crosslinks rather than strand breaks determine access to ancient
DNA sequences from frozen sediments. Genetics 173(2):1175–1179.
165
Hatsch D, Amory S, Keyser-Tracqui C, Hienne R, Crubezy E, Ludes B. 2006. High
throughput mitochondrial DNA cloning in forensic and anthropological issues, Int Congr
Ser 1288:118–120.
Hebsgaard MB, Phillips MJ, Willerslev E. 2005. Geologically ancient DNA: fact of
artefact? Trends Microbiol 13(5):212–220.
Hedges REM. 2002. Bone diagenesis: An overview of process. Archaeometry 44(3):319–
328.
Herrmann B, Hummel S. 1994. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag.
Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder OA, Wilson AC. 1984. DNA sequences from
quagga, an extint member of the horse family. Nature 312:282–284.
Ho SYW, Heupink TH, Rambaut A, Shapiro B. 2007. Bayesian estimation of sequences
damage in ancient DNA. Mol Biol Evol 24(6):1416–1422.
Hofreiter M, Serre D, Poinar HN, Kuch M, Pääbo S. 2001. Ancient DNA. Nature Rev Gen
2:353–359.
Holm S. 2001. The privacy of Tutankhamen—utilising the genetic information in stored
tissue samples. Theor Med 22:437–449.
166
Horai S, Hayasaka K, Murayama K, Wate N, Koike H, Nakai N. 1989. DNA amplification
from ancient human skeletal remains and their sequence analysis. Proc Jpn Acad B
65:229–233.
Horai S, Kondo R, Murayama K, Hayashi S, Koike H, Nakai N. 1991. Phylogenetic
affiliation of ancient and contemporary humans inferred from mitochondrial DNA. Philos
Trans R Soc London Ser B 333:409–418.
Höss M, Pääbo S. 1993. DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based
purificiation method. Nucleic Acids Res 21(16):3913–3914.
Höss M, Jaruga P, Zastawny TM, Dizdaroglu M, Pääbo S. 1996. DNA damage and DNA
sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Res 24(7):1304–1307.
Hummel S. 2003. Ancient DNA Typing: Methods, Strategies and Applications. Germany:
Springer-Verlag.
Hummel S, Herrmann B. 1991. Y-chromosome-specific DNA amplified in ancient human
bone. Naturwissenschaften 78:266–267.
Hummel S, Herrmann B. 1994. Y-Chromosomal DNA from Ancient Bones. In: Herrmann
B, Hummel S, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from
Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: Springer-
167
Verlag Inc. p 205–210.
Hummel S, Nordsiek G, Herrmann B. 1992. Improved Efficiency in Amplification of
Ancient DNA and Its Sequence Analysis. Naturwissenschaften. 79:359–360.
Hummel S, Schultes T, Bramanti B, Herrmann B. 1999. Ancient DNA profiling by
megaplex amplifications. Electrophoresis 20:1717–1721.
Hunter DEK, Whitten P. 1993. Finding Anthropology. In: Introduction to Anthropology.
New York: Harper Collins College Publishers. p 3–8.
Imaizumi K, Saitoh K, Sekiguchi K, Yoshino M. 2002. Identification of fragmented bones
based on anthropological and DNA analyses: Case report. Leg Med 4:251–256.
Imaizumi K, Noguchi K, Shiraishi, Sekiguchi K, Senju H, Fujii K, Yoshida K, Kasai K,
Yoshino M. 2005. DNA typing of bone specimens – the potential use of the profiler test as
a tool for bone identification. Leg Med 7:31–41.
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods
and Applications. New York: Academic.
İşcan MY. 1988. Rise of forensic anthropology. Yearb Phys Anthropol 31:203–230.
168
İşcan MY. 2001. Global forensic anthropology in the 21st century. Forensic Sci Int 117:1–
6.
İşcan MY, Altunçul H. 2002. İskelet kalıntılarında kimlik tayini. İstanbul Baro Dergisi
76(3):734–749.
İşcan MY, Altunçul H, Belli O, Konyar E. 2007. Eski İnsan Kalıntılarından DNA
Çekitlemesi. Adli Bilimler Dergisi 6:71–78.
İşcan MY, Loth SR. 1997. The scope of forensic anthropology. In: Eckert WG, editor,
Introduction to forensic sciences. Second Edition, Florida.
Jackes M, Sherburne R, Lubell D, Barker C, Wayman M. 2001. Destruction of
microstructure in archaeological bone: a case study from Portugal. Int J Osteoarchaeol
11:415–432.
Jans MME, Kars H, Nielsen-Marsh CM, Smith CI, Nord AG, Arthur P, Earl N. 2002. In
situ preservation of archaeological bone: a histological study within a multidisciplinary
approach. Archaeometry 44(3): 343–352.
Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL. 1985. Hypervariable ‘Minisatellite’ regions in human
DNA. Nature 314:76–79.
169
Johnson PH, Olson CB, Goodman M. 1985. Isolation and characterization of
deoxyribonucleic acid from tissue of the wooly mammoth, Mammuthus primigenius.
Comp Biochem Physiol 81:1045–1051.
Jones M. 2003. Ancient DNA in pre-Columbian archaeology: a review. J Archaeol Sci
30:629–635.
Kaestle FA, Horsburgh KA. 2002. Ancient DNA in anthropology: Methods, applications,
and ethics. Yearb Phys Anthropol 45:92–130.
Kalfoglou EA, Kocias Y, Ozcan SS, Petridis G, Yükseloglu EH, Atasoy S. 2007. A
Decade for Searching the Father. 22nd Congress of the International Society of Forensics
Genetics, 22-25 August 2007, Copenhagen, Denmark.
Kalmar T, Bachrati CZ, Marcsik A, Rasko I. 2000. A simple and efficient method for PCR
amplifiable DNA extraction from ancient bones. Nucleic Acids Res 28:12–67.
Katzenberg MA. 2008. Stable Isotope Analysis: A tool for studying past diet, demography
and life history. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. 2nd edition, New Jersey: John
Wiley and Sons Inc. p 413–441.
Katzenberg MA, Saunders SR. 2008. Biological anthropology of the human skeleton,
Second edition, New Jersey: John Wiley and Sons Inc.
170
Kemp BM, Monroe C, Smith DG. 2006. Repeat silica extraction: a simple technique for
the removal of PCR inhibitors from DNA extracts. J Archaeol Sci 33:1680–1689.
Kemp BM, Smith DG. 2005. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the
surface of bones and teeth. Forensic Sci Int. 154:53–61.
Keyser-Tracqui C, Crubezy E, Clisson I, Gemmerich I, Ludes B, Giscard PH. 2003.
Megaplex analysis of a Mongolian population from the Egyin Gol site (300BC–300AD).
Int Congr Ser 1239:581–584.
Kimura B, Brandt SA, Hardy BL, Hauswirth WW. 2001. Analysis of DNA from
ethnoarchaeological stone scrapers. J Archaeol Sci 28:45–53.
Kolman CJ, Tuross N. 2000. Ancient DNA analysis of human populations. Am J Phys
Anthropol 111:5–23.
Kottak CP. 2001. Antropoloji: İnsan çeşitliliğine bir bakış. Ankara: Ütopya Yayınevi.
Krings M, Stone A, Schmitz RW, Krainitzki H, Stoneking M, Pääbo S. 1997. Neandertal
DNA sequences and the origin of modern humans. Cell 90:19–30.
171
Krings M, Geisert H, Schmitz RW, Krainitzki H, Pääbo S. 1999. DNA sequence of the
mitochondrial hypervariable region II from the Neandertal type specimen. Proc Natl Acad
Sci USA 96:5581–5585.
Krogman WM, İşcan MY. 1986. The human skeleton in forensic medicine. Springfield, IL:
Charles C Thomas.
Kurosaki K, Matsushita T, Ueda S. 1993. Individual DNA Identification from ancient
human remains. Am J Hum Genet 53:638–643.
Larcombe LA, Nickerson P, Hoppa RD, Matheson C. 2005. Detection of single nucleotide
polymorphism in the IL-6 promoter region of ancient nuclear DNA, Infect Gen Evol
5:117–122.
Lalueza-Fox C. 1997. Ancient DNA studies and new bioethic problems. Hum Evol
12(4):287–290.
Lee HC, Pagliaro EM, Berka KM, Folk NL, Anderson DT, et al. 1991. Genetic markers in
human bone I: deoxyribonucleic acid (DNA) analysis. J Forensic Sci 36:320–330.
Lehrman S. 2001. Drawing DNA lines of ethnicity. Geneletter. www.geneletter.com
Leonard JA, Shanks O, Hofreiter M, Kreuz E, Hodges L, Ream W, Wayne RK, Fleisher
172
RC. 2007. Animal DNA in PCR reagents plagues ancient DNA research. J Archaeol Sci
34:1361–1366.
Lleonart R, Riego E, Sainz de la Pena MV, Bacallao K, Amaro F, Santiesteban M, Blanco
M, Currenti H, Puentes A, Rolo F, Herrera L, de la Fuente J. 2000. Forensic identification
of skeletal remains from members of Ernesto Che Guevara’s guerrillas in Bolivia based on
DNA typing. Int J Leg Med 113:98–101.
Lindahl T. 1993. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362:709–
715.
Loreille OM, Diegoli TM, Irwin JA, Coble MD, Parsons TJ. 2007. High efficiency DNA
extraction from bone by total demineralization. Forensic Sci Int-Gen 1(2):191–195.
Lutz S, Weisser HJ, Heizmann J, Pollak S. 1999. Mitochondrial heteroplasmy among
maternally related individuals. Int J Leg Med 113:155–161.
Marks J. 2002. What is molecular anthropology? What can it be? Evol Anthropol 11:131–
135.
Marota I, Basile C, Ubaldi M, Rollo F. 2002. DNA Decay Rate in Papyri and Human
Remains From Egyptian Archaeological Sites. Am J Phys Anthropol 117:310–318.
173
Matheson CD, Toy TH. 2001. Genetic sex determination of 9400 year old human skull
samples from Çayönü Tepesi, Turkey. J Arcaheol Sci 28:569–575.
Meissner C, Bruse P, Mueller E, Oehmichen M. 2007. A new sensitive short pentaplex
(ShoP) PCR for typing of degraded DNA. Forensic Sci Int 166:121–127.
Mekel-Bobrov N, Lahn BT. 2004. Ancient DNA analysis of human remains from Tell
Kurdu. In: Tell Kurdu Excavations 2001. Anatolica 30:72–74.
Mergen B. 2006. Erken Demir Çağı’nda cinsiyet ve boy gelişimi. Yüksek Lisans Tezi.
İstanbul Üniversitesi, Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul.
Mergen B, İşcan MY. 2007. Kitle mezarlarında bulunan uzun kemiklerden cinsiyet tayini.
Adli Bilimler Dergisi 6(1):7–16.
Mergen H, Öner R, Öner C. 2004. Mitochondrial DNA sequence variation in the Anatolian
Peninsula (Turkey). Indian Acad Sci J Genet 83(1):39–47.
Merriwether DA, Rothhammer F, Ferrell RE. 1994. Genetic variation in the New World:
ancient teeth, bone, and tissue as sources of DNA. Experientia 50:592–601.
Meyer E, Wiese M, Bruchhaus H, Claussen M, Klein A. 2000. Extraction and
amplification of authentic DNA from ancient human remains. Forensic Sci Int 113:87–90.
174
Millar CD, Huynen L, Subramanian S, Mohandesan E, Lambert DM. 2008. New
developments in ancient genomics. Trends Ecol Evol 23(7):386–393.
Mitchell D, Willerslev E, Hansen A. 2005. Damage and repair of ancient DNA Mutation
Res 571:265–276.
Mitomap. 2009. http://www.mitomap.org/cgi-bin/tbl5gen.pl
Motoc M, Verdeş D, Corina S, Felicia S, Monica N. 2009. Procedures for obtaining
biological samples from ancient bones for DNA analysis.
http://cmpicsu.upt.ro/zat/Motoc_Samuila_Sfrijan.pdf
Mullis K, Faloona E, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. 1986. Specific enzymatic
amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp
Quant Biol 51:263-273.
Mullis KB, Faloona FA. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalysed chain reaction. Methods Enzymol 155:335–350.
Mundorff AZ, Bartelink EJ. 2007. DNA preservation of skeletal elements from the world
trade center disaster: some recommendations for mass disaster management. Proceedings
of the 59th American Academy of Forensic Sciences Meeting, 19–24 February 2007, San
Antonio, TX, 385.
175
Nelson K, Melton T. 2007. Forensic mitochondrial DNA analysis of 116 casework skeletal
samples. J Forensic Sci 52(3):557–561.
Nicholson GJ, Tomiuk J, Czarnetzki A, Bachmann L, Pusch CM. 2002. Detection of bone
glue treatment as a major source of contamination in ancient DNA analyses. Am J Phys
Anthropol 118:117–120.
Nielsen H, Engberg J, Thuesen I. 1994. DNA from arctic human burials. In: Herrmann B,
Hummel S, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from
Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: SpringerVerlag. p 122–140.
Nielsen H, Thuesen I. 1998. Paleogenetics. In: Cockburn A, Cockburn E, Reyman T,
editors. Mummies, Disease & Ancient Cultures. Cambridge: Cambridge University Press.
P 355-363.
Nielsen-Marsh CM, Hedges REM. 1999. Bone porosity and the issue of mercury intrusion
porosimetry in bone diagenesis studies. Archaeometry 41(1):165–174.
Nielsen-Marsh CM, Richards MP, Hauschka PV, Thomas-Oates JE, Trinkaus E, Pettitt PB,
Karavanic I, Poinar H, Collins MJ. 2005. Osteocalcin protein sequences of Neanderthals
and modern primates. Proc Natl Acad Sci USA 102:4409–4413.
176
Nielsen-Marsh CM, Smith CI, Jans MME, Nord A, Kars H, Collins MJ. 2007. Bone
diagenesis in the European Holocene II: taphonomic and environmental considerations. J
Archaeol Sci 34:1523–1531.
Oota H, Saitou N, Matsushita T, Ueda S. 1995. A genetic study of 2,000-year-old human
remains from Japan using mitochondrial DNA sequences. Am J Phys Anthropol 98:133–
145.
Oota H, Saitou N, Matsushita T, Ueda S. 1999. Molecular genetic analysis of remains of a
2,000-year-old human population in China—and its relevance for the origin of the modern
Japanese population. Am J Hum Genet 64:250–258.
Opel KL, Chung DT, Drabek J, Tatarek NE, Jantz LM, McCord BR. 2006. The
Application of Miniplex Primer Sets in the Analysis of Degraded DNA from Human
Skeletal Remains. J Forensic Sci 51(2):351–356.
O’Donoghue K, Brown TA, Carter JF, Evershed RP. 1996. Application of high
performance liquid chromatography/mass spectrometry with electrospray ionization to the
detection of DNA nucleosides in ancient seeds. Rapid Commun Mass Spectrom 10:495–
500.
O’Rourke DH, Carlyle SW, Parr RL. 1996. Ancient DNA: methods, progress, and
perspectives. Am J Hum Biol 8:557–571.
177
O’Rourke DH, Hayes MG, Carlyle SW. 2000. Ancient DNA studies in physical
anthropology. Ann Rev Anthropol 29:217–242.
Ovchinnikov IV, Gotherstrom A, Romanova GP, Kharitonov VM, Liden K, GoodwinW.
2000. Molecular analysis of Neanderthal DNA from the Northern Caucasus. Nature
404(6777):490–493.
Ozcan SS, Petridis G, Yukseloglu EH, Kalfoglu EA, Atasoy S. 2006. Old bone material,
power of exclusion and the conventional systems in identification. 4th Congress of the
Balkan Academy of Forensic Sciences, 8-11 June 2006, Stara Zagora, Bulgaria.
Pääbo S. 1985. Molecular cloning of ancient Egyptian mummyDNA. Nature. 314: 644–
645.
Pääbo S. 1989. Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and
enzymatic amplification. Proc Natl Acad Sci USA 86:1939–1943.
Pääbo S. 1990. Amplifying ancient DNA. J Biol Chem 265:4718.
Pääbo S, Poinar H, Serre D, Jaenicke-Despres V, Hebler J, Rohland N, Kuch M, Krause J,
Vigilant L, Hofreiter M. 2004. Genetic analyses from ancient DNA. Ann Rev Genet
38:645–679.
178
Parducci L, Suyama Y, Lascoux M, Bennett KD. 2005. Ancient DNA from pollen: a
genetic record of population history in Scots pine. Mol Ecol 14:2873–2882.
Parr RL, Carlyle SW, O’Rourke DH. 1996. Ancient DNA analysis of Fremont
Amerindians of the Great Salt LakeWetlands. Am J Phys Anthropol 99:507–518.
Parsons TJ, Weedn VW. 1996. Preservation and recovery of DNA in postmortem
specimens and trace samples. In: Haglund WD, Sorg MH, editors. Forensic Taphonomy:
The Postmortem Fate of Human Remains. Boca Raton, FL: CRC Press. p 109–138.
Parsons TJ, Huel R, Davoren J, Katzmarzyk C, Milos A, Selmanovic A, Smajlovic L,
Coble MD, Rizvic A. 2007. Application of novel mini-amplicon STR multiplexes to high
volume casework on degraded skeletal remains. Forensic Sci Int-Gen 1(2):175–179.
Pereira L, Richards M, Alonso A, Albarran C, Garcia O, Behar DM, Golge M, Hatina J,
Al-Gazali L, Bradley DG, Macaulay V, Amorim A. 2006. Evaluating the forensic
informativeness of mtDNA haplogroup H sub-typing on a Eurasian scale. Forensic Sci Int
159:43–50.
Pilli E, Fox CL, Capelli C, Lari M, Sampietro L, Gigli E, Milani L, Guimaraes S, Chiarelli
B, Marin VTW, Casoli A, Stanyon R, Barbujani G, Caramelli D. 2008. Ancient DNA and
forensics genetics: The case of Francesco Petrarca. Forensic Sci Int-Gen Suppl Ser 1:469–
470.
179
Pizzamiglio M, Marino A, Coli A, Floris T, Garofano L. 2006. The use of mini-STRs on
degraded DNA samples. Int Congr Ser 1288:498–500.
Poinar HN, Cano RJ, Poinar GO. 1993. DNA from an extinct plant. Nature 363:677.
Poinar GO, Poinar HN, Cano RJ. 1994. DNA from amber inclusions. In: Herrmann B,
Hummel S, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from
Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: SpringerVerlag Inc. p 205–210.
Poinar HN, Höss M, Bada JL, Pääbo S. 1996. Aminoacid racemization and the
preservation of ancient DNA. Science 272:864–866.
Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding G, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP,
Possnet G, Pääbo S. 1998. Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground
sloth Nothrotheriops shastensis. Science 281:402–406.
Poulakakis N, Tselikas A, Bitsakis I, Mylonas M, Lymberakis P. 2007. Ancient DNA and
the genetic signature of ancient Greek manuscripts. J Archaeol Sci 34:675–680.
Prado VF, Castro AKF, Oliveira CL, Souza KT, Pena SDJ. 1997. Extraction of DNA from
human skeletal remains: practical applications in forensic sciences. Genetic Anal-Biomol
E. 14:41–44.
180
Pruvost M, Schwarz R, Bessa Correia V, Champlot S, Braguier S, Morel N, FernanezJalvo Y, Grange T, Geigl E-M. 2007. Freshly excavated fossil bones are best for
amplification of ancient DNA. Proc Natl Acad Sci USA 104:739–744.
Purzycka JK, Olewiecki I, Soltyszewski I. 2006. Efficiency comparison of seven different
Taq polymerases used in hemogenetics. Int Congr Ser 1288:719–721.
Ramos MD, Lalueza C, Girbau E, Perez-Perez A, Quevedo S, et al. 1995. Amplifying
dinucleotide microsatellite loci from bone and tooth samples of up to 5000 years of age:
more inconsistency than usefulness. Hum Genet 96:205–212.
Raoult D, Aboudharam G, Crubezy E, Larrouy G, Ludes B, Drancourt M. 2000. Molecular
identification by “suicide PCR” of Yersinia pestis as the agent of Medieval Black Death.
Proc Natl Acad Sci USA 97:12800–12803.
Reese RL, Hyman M, Rowe MW, Derr JN, Davis SK. 1996. Ancient DNA from Texas
pictographs. J Archaeol Sci 23:269–277.
Reinheird KJ, Ambler JR, Szuter CR. 2007. Hunter-Gatherer Use of Small Animal Food
Resources: Coprolite Evidence. Int J Osteoarchaeol 17:416–428.
181
Renfrew C. 2003. Archaeogenetics: Towards a population prehistory of Europe. In:
Renfrew C, Boyle K, editors. Archaeogenetics: DNA and the population Prehistory of
Europe. Cambridge: McDonald Institute for Archaeological Research.
Rennick SL, Fenton TW, Foran DR. 2005. The effects of skeletal preparation techniques
on DNA from human and non-human bone. J Forensic Sci 50(5):1–4.
Riancho JA, Zarrabeitia MT. 2003. A windows-based software for common paternity and
sibling analyses. Forensic Sci Int 135:232–234.
Ricaut FX, Kolodesnikov S, Keyser-Tracqui C, Alekseev AN, Crubezy E, Ludes B. 2004.
Genetic analysis of human remains found in two eighteenth century Yakut graves at AtDabaan. Int J Leg Med 118:24–31.
Ricaut FX, Keyser-Tracqui C, Crubezy E, Ludes B. 2005. STR-genotyping from human
medieval tooth and bone samples. Forensic Sci Int 151:31–35.
Ricaut FX, Kolodesnikov S, Keyser-Tracqui C, Alekseev AN, Crubezy E, Ludes B. 2006.
Molecular genetic analysis of 400-year-old human remains found in two yakut burial sites.
Am J Phys Anthropol 129:55–63.
182
Richards M, Corte-Real H, Forster P, Macaulay V, Wilkenson-Herbots H, Demaine A et
al. 1996. Paleolithic and Neolithic lineages in the European mitochondrial gene pool. Am J
Hum Genet 59:185–203.
Richards MB, Sykes BC, Hedges REM. 1995. Authenticating DNA extracted from ancient
skeletal remains. J Archaeol Sci 22:291–299.
Rogers SO, Bendich AJ. 1985. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh,
herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol Biol 5:69–76.
Rohland N, Hofreiter M. 2007. Comparison and optimization of ancient DNA extraction.
BioTechniques 42:343–352.
Rollo F, Venanzi FM, Amici A. 1994a. DNA and RNA from ancient plant seeds. In:
Herrmann B, Hummel S, editors. Ancient DNA, New York: Springer-Verlag. p 218–236.
Rollo F, Asci W, Antonini S, Marota I, Ubaldi M. 1994b. Molecular ecology of a Neolithic
meadow: the DNA of the grass remains from the archaeological site of the Tyrolean
Iceman. Experientia 50: 576–584.
Römpler H, Dear PH, Krause J, Meyer M, Rohland N, Schöneberg T, Spriggs H, Stiller M,
Hofreiter M. 2006. Multiplex amplification of ancient DNA. Nat Protoc 1(2):720–728.
183
Ruano G, Fenton W, Kidd KK. 1989. Biphasic amplification of very dilute DNA samples
via booster PCR. Nucleic Acids Res 17(13):5407.
Rudin N, Inman K. 2002. An introduction to forensic DNA analysis. 2nd edition, Florida:
CRC Press.
Saferstein R. 2004. Criminalistics: An introduction to forensic science. 8th edition, New
Jersey: Pearson Prentice Hall.
Salas A, Lareu MV, Carracedo A. 2001. Heteroplasmy in mtDNA and weight of evidence
in forensic mtDNA analysis: a case report. Int J Leg Med 114:186–190.
Salo WL, Aufderheide AC, Buikstra J, Holcomb TA. 1994. Identification of
Mycobacterium tuberculosis DNA in a pre-Columbian Peruvian mummy. Proc Natl Acad
Sci USA 91:2091–2094.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd edition. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. p 5.2–6.6.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chain terminating
inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74:5463–5467.
184
Santure SK, Harn AD, Esarey D. 1990. Archaeological Investigations at the Morton
Village and Norris Farms 36 Cemetery: Reports of Investigations, No 45. Springfield:
Illinois State Mus.
Schneider PM, Bender K, Mayr WR, Parson W, Hoste B, Decorte R, Cordonnier J, Vanek
D, Morling N, et al 2004. STR analysis of artificially degraded DNA – results of a
collaborative European exercise. Forensic Sci Int 139(2-3):123–134.
Scholz M, Hengst S, Broghammer M, Pusch CM. 2001. Intrapopulational relationships in
ancient societies: a multidisciplinary study. Z Morphol Anthropol 83(1):5–21.
Schwartz TR, Schwartz EA, Mieszerski L, McNally L, Kobilinsky L. 1991.
Characterization of deoxyribonucleic acid (DNA) obtained from teeth subjected to various
environmental conditions. J Forensic Sci 36:979–90.
Schweitzer MH, Avci R, Collier T, Goodwin MB. 2008. Microscopic, chemical and
molecular methods for examining fossil preservation. C R Palevol 7:159–184.
Scoot GR. 2008. Dental Morphology. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors.
Biological Anthropology of the Human Skeleton. 2nd edition. New Jersey: John Wiley and
Sons Inc. p 265–298.
185
Sensabaugh GF. 1994. DNA typing of biological evidence material. In: Herrmann B,
Hummel S, editors. Ancient DNA. New York: Springer-Verlag. p 141–148.
Shanks OC, Hodges L, Tilley L, Kornfeld M, Larson ML, Ream W. 2005. DNA from
ancient stone tools and bones excavated at Bugas-Holding Wyoming. J Archaeol Sci
32:27–38.
Shapiro B. 2008. Engineered polymerases amplify the potential of ancient DNA. Trends
Biotechn. 26(6):285–287.
Sivilich M. 2005. Determining familial relationships using historic DNA from urban and
rural historic burials in Indiana. Master’s thesis. Indiana State University, USA.
Smith BC, Fisher DL, Weedn VW, Warnock GR, Holland MM. 1993. A systematic
approach to the sampling of dental DNA. J Forensic Sci 38:1194–209.
Smith CI, Chamberlain AT, Riley MS, Cooper A, Stringer CB, Collins MJ. 2001. Not just
old but old and cold? Nature 410:771–772.
Smith CI, Nielsen-Marsh CM, Jans MME, Arthur P, Nord AG, Collins MJ. 2002. The
strange case of Apigliano: early ‘fossilization’ of medieval bone in southern Italy.
Archaeometry, 44:405–416.
186
Smith CI, Chamberlain AT, Riley MS, Stringer C, Collins MJ. 2003. The thermal history
of human fossils and the likelihood of successful DNA amplification. J Hum Evol 45:203–
217.
Somel M. 2003. Characterization of DNA from ancient wheat samples from the fertile
crescent. Yüksek Lisans Tezi. Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Ankara.
Stewart TD. 1979. Essentials of forensic anthropology. Springfield, IL: Charles C.
Thomas.
Stodder ALW. 2008. Taphonomy and the nature of archaeological assemblages. In:
Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton.
2nd edition, New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 71–114.
Stone AC. 2008. DNA analysis of archaeological remains. In: Katzenberg MA, Saunders
SR, editors. Biological Anthropology of the Human Skeleton. 2nd edition. New Jersey:
John Wiley and Sons Inc. p 461–483.
Stone AC, Milner GR, Paabo S, Stoneking M. 1996. Sex Determination of Ancient Human
Skeletons Using DNA. Am J Phys Anthropol 99:231–238.
Stone AC, Stoneking M. 1993. Ancient DNA from a pre-Columbian Amerindian
population. Am J Phys Anthropol 92:463–471.
187
Stone AC, Stoneking M. 1998. mtDNA analysis of a prehistoric Oneota population:
implications for the peopling of the NewWorld. Am J Hum Genet 62:1153–1170.
Stone AC, Stoneking M. 1999. Analysis of ancient DNA from a prehistoric Amerindian
cemetery. Philos Trans R Soc London Ser B 354:153–159.
Stoneking M. 2000. Hypervariable sites in the mtDNA control region are mutational
hotspots. Am J Hum Genet 67:1029-1032.
Stout SD. 1978. Histological Structure and its preservation an ancient bone. Curr
Anthropol 19(3):601–604.
Stuart BL, Dugan KA, Allard MW, Kearney M. 2006. Extraction of nuclear DNA from
bone of skeletonized and fluid-preserved museum specimens. Syst Biodivers 4(2):133–
136.
Swango KL, Timken MD, Chong MD, Buoncristiani MR. 2006. A quantitative PCR assay
for the assessment of DNA degradation in forensic samples. Forensic Sci Int 158:14–26.
Tallbear K. 2000. Genetics, culture and identity in Indian country. 7th International
Congress on Ethnobiology, Athens, Georgia, October 23–27, 2000.
http://www.iiirm.org/publications/Genetics/ISEPaper.pdf.
188
Tambets K, Kivisild T, Metspalu E, Parik J, Kaldma K, Laos S, Tolk HV, Golge M,
Demirtas H, Geberhiwot T, Papiha SS, Stefano GF, Villems R. 2000. The Topology of the
Maternal Lineages of the Anatolian and Trans-Caucasus Populations and the Peopling of
Europe: Some Preliminary Considerations.
www.ebc.ee/EVOLUTSIOON/publications/Tambets2000.pdf.
Taubenberger JK, Reid AH, Frafft AE, Bijwaard KE, Fanning TG. 1997. Initial genetic
characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus. Science 275:1793–1796.
Taylor GM, Widdison S, Brown IN, Young D. 2000. A medieval case of lepromatous
leprosy from 13–14th century Orkney, Scotland. J Archaeol Sci 27:1133–1138.
Taylor JW, Swann EC. 1994. DNA from herbarium specimens. In: Hummel S, Herrmann
B, editors. Ancient DNA: Recovery and Analysis of Genetic Material from
Paleontological, Archaeological, Museum, and Forensic Specimens. New York: SpringerVerlag. p 166–181.
Tefferi A. 2006. Genomics Basics: DNA structure, gene expression, cloning, genetic
mapping and molecular tests. Semin Cardiothorac Vasc Anesth 104:282–290.
Torroni A, Huoponen K, Francalacci P, Petrozzi M, Morelli L, Scozzari R et al. 1996.
Classification of European mtDNA from an analysis of three European populations.
Genetics 144:1835–1850.
189
Tuross N. 1993. The other molecules in ancient bone: noncollagenous proteins and DNA.
In: Lambert J, Grupe G, editors. Molecular Archaeology of Prehistoric Human Bone.
Berlin: Springer. p 275–294.
Tuross N. 1994. The biochemistry of ancient DNA in bone. Experientia 50: 530–535.
Underhill PA, Jin L, Lin AA, Mehdi SQ, Jenkins T, Vollrath D, Davis RW, Cavalli-Sforza
LL, Oefner PJ. 1997. Detection of numerous Y chromosome bilalelic polymorphisms by
denaturing high-performance liquid chromatography. Genome Res 7: 996–1005.
Von Wurmb-Schwark N, Harbeck M, Wiesbrock U, Schroeder I, Ritz-Timme S,
Oehmichen M. 2003. Extraction and amplification of nuclear and mitochondrial DNA
from ancient and artificially aged bones. Leg Med 5:169–172.
Von Wurmb-Schwark N, Schwark T, Harbeck M, Oehmichen M. 2004. A simple duplexPCR to evaluate the DNA quality of anthropological and forensic samples prior short
tandem repeat typing. Leg Med 6:80–88.
Walker PL. 2008. Bioarchaeological ethics: A historical perspective on the value of human
remains. In: Katzenberg MA, Saunders SR, editors. Biological Anthropology of the
Human Skeleton. 2nd edition. New Jersey: John Wiley and Sons Inc. p 3–40.
190
Wallace DC. 1994. Mitochondrial DNA sequence variation in human evolution and
disease. Proc Natl Acad Sci USA 91:8739–8746.
Watt KE. 2003. Decontamination techniques in ancient DNA analysis. Master’s Thesis.
Simon Fraser University, Canada.
Wayne RK, Leonard JA, Cooper A. 1999. Full of sound and fury: the recent history of
ancient DNA. Ann Rev Ecol Syst 30:457–477.
Wenk RE. 2004. Testing for parentage and kinship. Curr Opin Haematol 11:357–361.
Willerslev E, Cooper A. 2005. Ancient DNA. Proc Biol Sci 272:3–16.
Wilson MR, Polanskey D, Butler J, Dizinno JA, Replogle J, Budowle B. 1995. Extraction,
PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts.
Biotechniques 18:662–669.
Wisely SM, Maldonado JE, Fleischer RC. 2004. A technique for sampling ancient DNA
that minimizes damage to museum specimens. Conserv Genet 5:105–107.
Yang DY, Eng B, Waye JS, Dudar JC, Saunders SR. 1998. Technical Note: Improved
DNA Extraction From Ancient Bones Using Silica-Based Spin Columns. Am J Phys
Anthropol 105:539–543.
191
Yang DY, Watt K. 2005. Contamination controls when preparing archaeological remains
for ancient DNA analysis. J Archaeol Sci 32:331–336.
Yang H, Golenberg EM, Shoshani J. 1997. A blind testing design for authenticating
ancient DNA sequences. Mol Phylogenet Evol 7(2):261–265.
Yao Y, Zhang Y. 2003. Pitfalls in the analysis of ancient human mtDNA. Chinese Sci Bull
48(8):826–830.
Zhang Y, Yu LJ, Qian R. 2004. The eastern Pompeii–the Lajia site. Silk Road 4:11–14.
Zierdt H, Hummel S, Herrmann B. 1996. Amplification of human short tandem repeats
from Medieval teeth and bone samples. Hum Biol 68:185–199.
Zink AR, Molnar E, Motamedi N, Palfy G, Marcsik A, Nerlich AG. 2007. Molecular
history of Tuberculosis from ancient mummies and skeletons. Int J Osteoarchaeol 17:380–
391.
192
EKLER
193
EK I
Mitokondriyal DNA HVRI 16147–16294 baz çifti arasındaki CRS dizini
LOCUS
NC_012920
16569 bp mtDNA circular PRI 8-JUL-2009
DEFINITION:
Homo sapiens mitochondrion, complete genome.
ACCESSION
AC_000021
VERSION
AC_000021.2 GI:115315570
PROJECT
GenomeProject:30353
SOURCE
mitochondrion Homo sapiens (human)
ORGANISM
Homo sapiens
1 gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt
…
16141 acttgaCcac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta
16201 caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc
16261 cctcacccac taggatacca acaaacctac ccaCccttaa cagtacatag tacataaagc
…
16561 atcacgatg.
(http://www.mitomap.org/bin/view/MITOMAP/HumanMitoSeq).
194
EK II
TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen, CA) içinde yer alan ve çalışmada
kullanılan klonlama vektörünün (pCR®2.1-TOPO®) gen haritası
195
EK III
Çalışmada Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Ticari Kitler
Agaroz
BIOMATIK
Ampisilin
BIOMATIK
Borik asit
BIOMATIK
Etilen Diamin Tetra Asetik asit (EDTA)
BIOMATIK
İzopropil-β-D-tiyo-galaktosid (IPTG)
BIOMATIK
Lambda DNA
BIOMATIK
Luria-Bertani agar
BIOMATIK
Proteinaz K
BIOMATIK
PstI
BIOMATIK
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)
BIOMATIK
Trisbaz
BIOMATIK
X-Gal
BIOMATIK
10X Taq Buffer +(NH4)2SO4 -MgCl2
FERMENTAS
BSA 100X (10 mg/mL)
FERMENTAS
dNTP Set (25 µmol, 100mM)
FERMENTAS
MgCl2 (25 mM)
FERMENTAS
Taq DNA polimeraz-rekombinant (5 u/µl)
FERMENTAS
QIAquick Gel Extraction Kit
QIAGEN
QIAquick PCR Purification Kit
QIAGEN
TOPO TA Cloning® Kit (with pCR®2.1-TOPO® vector)
INVITROGEN
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
APPLIED BIOSYSTEMS
196
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı: ŞEYDA ŞEBNEM ÖZCAN
Doğum Yeri, Tarihi: Ankara, 22.11.1980
Ünvanı: Araş. Gör.
Öğrenim Durumu
Derece
Lisans
Y. Lisans
Doktora
Alan
Biyoloji Bölümü
Adli Tıp Enstitüsü
Adli Tıp Enstitüsü
Üniversite
Marmara Üniversitesi
İstanbul Üniversitesi
İstanbul Üniversitesi
Yıl
2002
2005
Yüksek Lisans Tezi
Biyolojik Leke ve İskelet Kalıntılarının Kimliklendirilmesi: Sorunlar ve Çözüm Önerileri,
2005, Danışman: Prof. Dr. Ersi Abacı Kalfoğlu
Meslek Deneyimi
Temmuz 2009
Misafir Araştırmacı (Botanik Bölümü, Smithsonian
Institution, Washington DC, ABD)
Ocak – Nisan 2008
Misafir Araştırmacı (Biyomoleküler Arkeoloji Araştırma
Birimi, Manchester Disiplinler Arası Araştırma Merkezi,
Manchester Üniversitesi, İngiltere)
Ocak – Mart 2005
Misafir Araştırmacı (Genetik Bölümü, Stanford Üniversitesi,
CA, ABD)
Temmuz 2003 – devam
Araştırma Görevlisi (Adli Tıp Enstitüsü, İstanbul
Üniversitesi)
Araştırma Alanları
Adli Genetik, Biyoarkeoloji, Biyoarkeolojik Örneklerde DNA Analizi, Biyolojik Deliller,
Cinsel Suçlar, Çevre Suçları, Olay Yeri İncelemeleri, Popülasyon Genetiği.
197
Yayınlar
SCI, SSCI kapsamındaki uluslararası hakemli dergilerde yayınlanan makaleler:
1. S. Sebnem Ozcan, Gabriel Petridis, E. Hulya Yukseloglu, Yani Kocias, Ersi Abaci
Kalfoglu, Sevil Atasoy (2009) A new approach in the identification of degraded
paternity samples. Forensic Science International: Genetics Supplement Series,
Volume 2, Issue 1, 174–175.
2. Ersi Abaci Kalfoglu, Reza Dashti, Gabriel Petridis, E. Hulya Yukseloglu, S.
Sebnem Ozcan, Mansur Beyazyürek, Sevil Atasoy (2009) The Relevance between
Dopamine D3 Receptor Gene Variations and Drug Addiction. Forensic Science
International: Genetics Supplement Series, Volume 2, Issue 1, 489–490.
3. S. Sebnem Ozcan, Hulki Akin, Hakan Bayram, Musa Bas, Ahmet Yildiz, Atalay
Ozdemiroglu (2009) Utilization of Police Dogs: A Turkish Perspective. Policing:
An International Journal of Police Strategies & Management, 32: 2, 226–237.
4. R. J. King, S. S. Ozcan, T. Carter, E. Kalfoğlu, S. Atasoy, C. Triantiphyllidis, A.
Kouvatsi, A. A. Lin, C-E. T. Chow, L. A. Zhivotovsky, M. Michalodimitrakis, P.
A. Underhill (2008) Differential Y-chromosome Anatolian Influences on the Greek
and Cretan Neolithic. Annals of Human Genetics, 72, 205–214.
5. Rehat Faikoglu, Hülya Yükseloglu, Sebnem Özcan, Gabriel Petridis, Itır Tari, Ersi
Abaci Kalfoglou (2007) The gynaecologist as an expert witness in cases of sexual
abuse. Reproductive Biomedicine Online, 15: 1, 41–42.
6. Seyma Uysal, Gavril Petridis, Sebnem Ozcan, Rehat Faikoglu, Devrim Barcak,
Hulya Yukseloglu, Ersi Abacı-Kalfoglou, Sevil Atasoy (2006) The Use of DNA
Microsatellite Loci for "Caretta Caretta" Identification. J. Environ. Sci. Health,
Part A, Vol. A 41, No.9, 1981–1987.
7. Ersi Abacı Kalfoglou, Rehat Faikoglu, Sebnem Özcan, Gabriel Petridis, Hülya
Yükseloglu, Sevil Atasoy (2006) DNA analysis as a tool for breast cancer
malpractice determination: An interdisciplinary approach. Oncology Reports, 16:
1, 203–206.
Uluslar arası bilimsel toplantılarda sözlü veya poster olarak sunulmuş ve özeti
yayınlanmış, tez konusu ile ilgili bildiriler:
1. S. Sebnem Ozcan MS, Gabriel Petridis MS, E. Hulya Yukseloglu PhD, Ersi Abaci
Kalfoglu PhD, Sevil Atasoy PhD. “Old bone material, power of exclusion and the
conventional systems in identification”. 4th Congress of the Balkan Academy of
Forensic Sciences, 8–11 Haziran 2006, Stara Zagora, Bulgaristan.
2. E. Abaci-Kalfoglou, S. Ozcan, G. Petridis, H. Yukseloglu, Y. Kocias, S. Atasoy.
“Extraction/Isolation Techniques for Ancient mtDNA Analyses”. International
Congress on Biomedical Sciences in Archaeology, 24–26 Eylül 2008, Heraklion,
Yunanistan.
3. S. S. Ozcan, M. Y. İşcan, E. Abaci-Kalfoglou. “Ancient DNA analysis for the
kinship determination of Urartu burials”. International Congress on Biomedical
Sciences in Archaeology, 24–26 Eylül 2008, Heraklion, Yunanistan.
198
4. S. S. Ozcan, M. Y. İşcan. “The intersection between forensic evidence and
archaeological specimen”. 6th Meeting of Balkan Academy of Forensic Sciences,
18–21 Haziran 2008, Kavala, Yunanistan.
5. Gavril Petridis MS, S. Sebnem Ozcan MS, Ersi Abaci Kalfoglou PhD, Yani
Kocias PhD, E. Hulya Yukseloglu PhD, Sevil Atasoy PhD. “The Application of
mini-STRs in DNA analysis from skeletal remains of a father and son in the same
grave”. 5th European Academy of Forensic Sciences Congress, 8–11 Eylül 2009,
Glasgow, UK.
6. S. Sebnem Ozcan, Gabriel Petridis, E. Hulya Yukseloglu, Yani Kocias, Ersi Abaci
Kalfoglou, Sevil Atasoy. “A new approach in the identification of degraded
paternity samples”. 23rd Congress of the International Society of Forensics
Genetics, 15-18 Eylül 2009, Buenos Aires, Arjantin.
Projeler
Proje Yürütücüsü, “Biyolojik Leke ve İskelet Kalıntılarının Kimliklendirilmesi: Sorunlar
ve Çözüm Önerileri” Yüksek Lisans Tez Projesi, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel
Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği, Proje Numarası: T-658/17032005.
Proje Yürütücüsü, “Arkeolojik Toplumlarda Akrabalık İlişkileri: Bir Moleküler
Antropolojik Yaklaşım” Doktora Tez Projesi, İstanbul Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel
Araştırma Projeleri Yürütücü Sekreterliği, Proje Numarası: 2571.
Yurt içi kaynaklı projede yardımcı araştırıcı “Biyomoleküler Arkeoloji ve İdantifikasyon”,
İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi Bilimsel Yayın Projesi No. 3080,
13–31 Temmuz 2009, Smithsonian Institution, Washington DC, ABD.
Yurt içi kaynaklı projede yardımcı araştırıcı, “Türkiye’de Ağır Ceza Mahkemelerinde
görülen dava dosyalarının incelenmesi yoluyla suç analizi”, İ.Ü. Bilimsel Araştırma
Projeleri Koordinasyon Birimi Bilimsel Yayın Projesi No. 3079.
Burslar
TÜBİTAK 2214- Yurt Dışı Araştırma Burs Programı;
“Kouphovouno, Laconia’da bulunan Orta Tunç Çağı definleri arasındaki genetik
bağlantılar”, 26 Ocak – 26 Nisan 2008, Manchester Interdisciplinary Biocentre, The
University of Manchester, İngiltere.
199